You are on page 1of 50

KROMATOGRAFI

Marcellino Rudyanto

Kelemahan pemisahan metode klasik (kristalisasi, distilasi, sublimasi, dll.):


Tak dapat digunakan untuk pemisahan skala kecil. Tak dapat digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa yang kelarutannya hampir sama. Tak dapat digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa yang titik didihnya berdekatan.

Kromatografi

(chroma = warna, graphein = gambar) Dasar pemisahan: perbedaan distribusi komponen- komponen campuran pada fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam: kolom, lempeng, kertas. Fasa gerak: cairan atau gas.

Berdasarkan proses pemisahan:


Kromatografi adsorpsi Kromatografi cair padat Kromatografi gas padat Kromatografi partisi Kromatografi cair cair Kromatografi gas cair Kromatografi pertukaran ion Elektroforesis Kromatografi permeasi gel

Teknik-teknik kromatografi yang umum


Fasa diam Padat Fasa gerak Teknik Cair K. Adsorpsi K. Fasa Balik K. Permeasi Gel Senyawa yang dipisahkan Molekul2 aromatik dan alifatik Senyawa2 organik polar Makromolekul

K. Pertukaran Ion Molekul2 bermuatan, asam amino


Cair Cair Cair Gas K. Partisi K. Gas Cair Senyawa2 yang tak tahan suhu tinggi atau asam Senyawa organik yang mudah menguap

Lingkup bahasan
Jenis kromatografi yang akan dibahas dibatasi pada: kromatografi adsorpsi. Pembahasan kromatografi adsorpsi dibatasi pada: kromatografi kolom (KK) dan kromatografi lapisan tipis (KLT). Pembahasan difokuskan pada aspek praktis

(landasan teori harap dipelajari sendiri!!).

Fasa Diam
Syarat fasa diam: Tidak larut dalam fasa gerak. Tidak bereaksi dengan zat yang akan dipisahkan. Tidak berwarna. Komposisi seragam.

Fasa Diam
Bahan yang sering digunakan sebagai fasa diam: Silika (SiO2) dan Alumina (Al2O3). Bahan fluoresen: seng sulfida (ZnS). Bahan perekat: gipsum (CaSO4). Contoh: Silika Gel GF254 , Silica Gel 60H G = mengandung gipsum F254 = fluoresensi di bawah sinar 254 nm H = tanpa perekat

Fasa Gerak (Eluen)


Semakin polar eluen, semakin cepat solut turun (KK) atau naik (KLT).

Mengapa? Mengapa?

Gunakan pelarut yang telah didistilasi.


Kebanyakan pelarut untuk kromatografi bersifat mudah menguap dan mudah terbakar. Hindari api!

Deret eluotropik
Silika Paling tdk polar Sikloheksana Pentana Karbon tetraklorida Toluena Kloroform Dietil eter Etil asetat Asam asetat Paling polar Metanol Alumina Pentana Sikloheksana Karbon tetraklorida Toluena Dietil eter Kloroform Etil asetat Metanol Asam asetat

Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)


Adsorban (fasa diam) berupa lapisan tipis pada permukaan datar penyokong (gelas, aluminium, plastik). Eluen bergerak dari bawah ke atas karena gaya kapiler.

KLT dapat digunakan untuk:


Uji kemurnian Identifikasi zat Memantau reaksi Mencari eluen yang cocok untuk kromatografi kolom Pemisahan-pemurnian (KLT preparatif)

Pembuatan lapisan tipis:


Adsorben (+perekat) diaduk dengan air hingga homogen (terbentuk slurry). Slurry dituang merata pada permukaan penyokong. Atau: setangkup gelas obyek dicelupkan pada slurry. Dikeringkan dengan pemanasan pada suhu 120 C (oven).

Pelat beli jadi (aluminium, kaca, plastik)

1. Potong pelat sesuai ukuran yang dikehendaki 2. Ukur 1 cm dari tepi 3. Beri garis dan tandai tempat penotolan (permukaan jangan sampai rusak)

Aplikasi sampel
Sampel dilarutkan dalam pelarut organik paling non polar yang dapat melarutkannya. Dengan bantuan pipa kapiler, larutan sampel ditotolkan pada permukaan lapisan tipis, yakni pada garis dasar kira-kira 1 cm dari salah satu ujung lempeng. Penotolan jangan sampai melukai permukaan lapisan tipis perlu latihan! Perhatikan banyaknya sampel yang ditotolkan jangan sampai overload (perlu pengalaman).

Aplikasi sampel

1. Tambahkan beberapa tetes pelarut pada sampel 2. Aduk hingga sampel larut 3. Celupkan salah satu ujung kapiler

Aplikasi sampel

13

3. Totolkan, jangan sampai merusak permukaan 4. Cuci kapiler dengan pelarut 5. Keringkan dengan kertas tisu atau kertas saring

Pipet mikro (alat penotol)

Penotolan

(a) Setelah penotolan (b) Setelah elusi

Bejana pengembang
Dapat dibuat dari gelas beker dan cawan petri atau gelas arloji sbg tutup. Dapat pula digunakan botol mulut lebar sesuai ukuran. Pada dinding dalam bejana didirikan kertas saring. Mengapa? Bejana diisi dengan eluen setinggi kurang lebih 0,5 cm. (Tinggi permukaan harus < tinggi penotolan!).

Bejana pengembang

Kiri: gelas beker + cawan petri Kanan: botol mulut lebar

Bejana pengembang
1 2

1. Macam-macam bejana pengembang 2. Tinggi eluen 0,5 cm 3. Kertas saring pada dinding

Mengembangkan kromatogram
Masukkan lempeng dengan bantuan pinset, sandarkan pada dinding bejana. Garis dasar harus lebih tinggi dari permukaan eluen. Biarkan eluen naik hingga 1 cm dari tepi atas. Angkat lempeng, beri tanda batas elusi dengan pinsil. Uapkan pelarut dalam lemari asam.

Mengembangkan kromatogram

Pengembangan (elusi)

Menampakkan noda
Noda dapat ditampakkan dengan: Sinar ultraviolet senyawa yang Awas: jangan memandang lampu UV! Uap iodin (I2) : masukkan lempeng dalam wadah tertutup berisi kristal I2. Pereaksi warna Lempeng besar semprotkan lempeng kecil celupkan

bagaimana?

Menampakkan noda dengan sinar UV

!!!!!!!! Awas jangan memandang langsung lampu UV

Faktor retensi (Rf)


Jarak tempuh noda Rf = Jarak tempuh eluen

Penotolan ganda

KLT dua dimensi

KLT dua dimensi

Kiri: komponen-komponen stabil Kanan: komponen mengalami dekomposisi

Elusi berulang-ulang

Digunakan hanya pada KLT preparatif. Digunakan bila kombinasi pelarut yang lain tidak memperbaiki pemisahan.

Noda berbentuk aneh


(a) Zat mengandung gugus asam atau basa kuat. (b) Permukaan adsorben rusak pada penotolan. (c) Senyawa ditotolkan sebagai larutan dalam pelarut sangat polar.

Kromatografi Kolom
KK adalah jenis kromatografi yang paling sering digunakan untuk pemisahan dan pemurnian. Tidak memerlukan alat-alat canggih, tetapi hasil pemisahan baik. Perkembangan: kromatografi kolom kilat (flash), kromatografi kolom kilat kering (dry flash).

Peralatan kromatografi kolom

Macam-macam kolom

Pemilihan eluen
Sistem pelarut yang cocok untuk eluen ditentukan dengan KLT. Untuk pemisahan yang efektif diperlukan sistem pelarut yang memberikan selisih harga Rf antara dua komponen sebesar 0,3.

Pembuatan kolom (packing)


Adsorben yang diperlukan: 25 50 x berat campuran yang akan dipisah. Ukuran kolom yang diperlukan: Silika l = 6w / d2 Alumina l = 2w / d2 Packing: Cara basah: slurry dalam eluen Cara kering Hati-hati: jangan ada gelembung udara dalam kolom.

Packing cara kering

1. Memasang kapas atau glass wool 2. Memasukkan adsorben 3. Pra-elusi, sampai tidak ada gelembung udara
Packing cara basah: adsorben dibuat slurry dengan eluen, kemudian dimasukkan ke kolom

Memasukkan sampel (loading) Sampel cair dapat langsung dimasukkan dengan bantuan pipet. Sampel padat dilarutkan pada eluen atau (lebih baik) pada pelarut paling non polar yang dapat melarutkannya (wet loading). Dry loading: sampel dilarutkan, dicampur dengan adsorben, kemudian pelarut diuapkan, kemudian padatan dimasukkan ke kolom.

Wet loading

Dry loading

Elusi
Elusi kontinyu: menggunakan satu macam eluen. Elusi gradien: menggunakan beberapa macam eluen, mulai yang kepolarannya paling rendah. Kecepatan elusi dan volume tiap fraksi: tergantung berbagai faktor perlu

pengalaman !

Elusi
Idealnya, begitu dimulai elusi tidak dihentikan sampai selesai. Elusi dimonitor dengan KLT. Lakukan uji KLT setiap 5 fraksi. Gabungkan fraksi-fraksi yang mengandung satu komponen, uapkan pelarutnya.

Elusi

Analisis fraksi-fraksi dengan KLT

Membuang adsorben bekas pakai


Adsorben yang telah digunakan lebih berbahaya karena mengandung zat-zat teradsorpsi yang tidak keluar bersama eluen Keluarkan seluruh pelarut, bila perlu dengan penghisapan. Tuang adsorben ke dalam wadah yang ditentukan.

PERHATIAN !!!
Adsorben (silika, alumina) bila terhirup akan mengganggu pernafasan gunakan MASKER pada saat memindahkan adsorben. Glass wool: tajam, dapat menembus kulit jangan dipegang dengan tangan telanjang! Pelarut organik: kebanyakan mudah terbakar, beberapa beracun!