Splicing Alternativo y La Progresin Tumoral

Resumen: El splicing alternativo es un mecanismo molecular clave para el aumento de la diversidad funcional de los proteomas eucariotas. Un gran chico de los datos experimentales implica corte y empalme aberrante en varias enfermedades humanas, incluyendo el cncer. Ambas mutaciones en los elementos de corte y empalme que actan en cis y alteraciones en la expresin y / o actividad dad de factores reguladores de empalme afectan drsticamente el perfil de empalme de muchos genes asociados con el cncer. Adems, el perfil de empalme de varios genes cancerassociated se altera en determinados tipos de cncer argumentan a favor de un papel directo de las isoformas de corte y empalme especficos en la progresin tumoral. Descifrando los mecanismos que subyacen a corte y empalme aberrante en el cncer puede ser crucial para entender cmo se controla la maquinaria de empalme e integrado con otros procesos celulares, en particular, la transcripcin y vas de sealizacin. Por otra parte, la caracterizacin de la desregulacin de empalme en el cncer conducir a una mejor comprensin de la transformacin maligna. Variantes de splicing alternativo asociado al cncer pueden ser nuevas herramientas para el diagnstico y clasificacin de los tipos de cncer y podran ser los objetivos de las intervenciones teraputicas innovadoras basadas en enfoques de correccin de empalme altamente selectivos. INTRODUCCIN Durante la evolucin del nmero de genes dej de crecer en paralelo con la complejidad del proteoma. Por lo tanto, el genoma humano contiene slo 20,000-25,000 genes (Genoma Humano Consorcio Internacional de Secuenciacin 2004), un nmero no significativamente diferente de la contadas en organismos menos complejos tales como erizos de mar (23.000) (Erizo de mar de Secuenciacin del Genoma Consorcio 2006) y el nematodo gusano (19 000). Por otra parte, el nmero de genes humanos no es suficiente para dar cuenta de todas las protenas reveladas por el anlisis protemico.Cmo se pueden explicar estas paradojas? Recientes cDNA secuencia y los datos de microarrays han implicado splicing alternativo (AS) como la principal fuente de diversidad funcional y protemica en organismos metazoos. Junto con otros promotores y sitios de poliadenilacin, edicin de ARN y el procesamiento despus de la traduccin, COMO da lugar a un nmero estimado de al menos 100.000 protenas humanas diferentes. El trmino "splicing alternativo" describe cualquier situacin en la que un nico transcrito primario (preARNm) se puede empalmar en ms de un patrn para generar mltiples mRNAs maduros, distintas que conducen a la expresin de isoformas de protenas con diferentes propiedades estructurales y funcionales. El "recordholder" para corte y empalme alternativo es un gen de Drosophila llamado Dscam, con 38.000 variantes de empalme, ms que el nmero de genes de Drosophila. En los seres humanos, al menos, el 70% (y esta proporcin podra ser an ms alto!) De los genes que codifican para las transcripciones que se someten a splicing alternativo, que pone de relieve la importancia de este mecanismo de regulacin de la biologa de la especie. Debido a su capacidad para generar la diversidad de protenas, se espera que corte y empalme alternativo para jugar un papel importante en la regulacin de la expresin gnica, una prediccin que se fundamenta en la observacin de que la generacin de espacio-temporal apropiado de las variantes de corte y empalme est implicado en muchos procesos celulares y de desarrollo (incluyendo la determinacin del sexo, la apoptosis, la gua de axones, la excitacin y contraccin celular y muchos otros). No es de extraar, por tanto, que la desregulacin de los programas de splicing alternativo est estrechamente vinculada a trastornos genticos humanos heredados y adquiridos. De hecho, trabajos en los ltimos aos han empezado a reconocer no apropiado splicing alternativo como un modificador gentico durante la tumorignesis. Muchos de los genes relacionados con el cncer estn regulados por

splicing alternativo. Ellos codifican para protenas implicadas en todos los aspectos importantes de la biologa celular de cncer, incluyendo el control del ciclo celular, la proliferacin, la diferenciacin, las vas de transduccin de seales, la muerte celular, la angiognesis, la invasin, la motilidad y la metstasis. Una firma comn de las clulas cancerosas es una prdida general de la fidelidad de empalme, con la consiguiente reorganizacin de los perfiles de corte y empalme, e incluso cambiar a isoformas de empalme especficos por lo general expresadas en otros tipos de clulas. Todos estos acontecimientos pueden contribuir a la carcinognesis. En particular, hay varios casos de corte y empalme alternativo que se limita a los tipos especficos de cncer, lo que implica claramente que la isoforma de empalme en particular en la progresin tumoral. Eventos de empalme del cncer-especficos pueden ser tambin beneficioso para la terapia, ya que generan nuevos eptopos contra los que es posible producir anticuerpos para inmunoterapia. Por lo tanto, existe un gran inters en el descubrimiento del efecto de corte y empalme alternativo de la complejidad del transcriptoma de clulas cancerosas y en la comprensin de cmo este mecanismo de regulacin contribuye a la tumorignesis. Esta revisin discute (1) los mecanismos bsicos de splicing alternativo, (2) los conocimientos actuales sobre los mecanismos de regulacin que rigen splicing alternativo y la desregulacin en el cncer, (3) las consecuencias biolgicas derivadas de la alteracin de empalme de alguna relacionada con el cncer relevante genes y (4) las variantes de corte y empalme alternativos de cncer asociados con un valor de diagnstico / pronstico claro que puede proporcionar dianas teraputicas potenciales. Splicing alternativo Genomas eucariotas se caracterizan por la presencia de genes "interrumpidas" que consiste en una sucesin ordenada de codificacin (exones) y no codificante (intrn) secuencias. En metazoos, particularmente en los mamferos, interrumpido cuenta los genes para la gran mayora de los genes. Por lo tanto, el empalme de ARN se produce en forma obligatoria, altamente regulado, proceso. A travs de corte y empalme de pre-ARNm, intrones se eliminan con precisin y los exones se unen entre s para reconstituir el marco de lectura y para generar ARNm traducibles que luego se exportan al citoplasma. La maquinaria de empalme (llamado spliceosome), es la mquina molecular ms grande hasta ahora se describe en las clulas se compone de cinco ribonucleoprotenas nucleares pequeas (snRNPs U1, U2, U4, U5 y U6) y ms de 100 polipptidos diferentes. El spliceosome reconoce, mal conservadas, la secuencia de elementos que actan en cis cortos en los lmites exn-intrn (5 'y 3' sitios de empalme tambin conocidos como sitios de "aceptores" "donante" y) y utilizarlos para la reaccin de cortar y pegar ( dos trans-esterificacin secuencial) que elimina el intrn. Mediante el uso de varias combinaciones de donante y aceptor de los sitios de diferentes exones, a travs del proceso de corte y empalme alternativo que es posible producir distintos mRNAs de un preARNm nica. Se han observado cinco patrones de empalme alternativos distintos: 1) un exn regulado (casete), que a veces se incluye y, a veces excluido del ARNm; 2) mltiples cassette exones que son mutuamente excluyentes, es decir, el ARNm maduro siempre contiene slo una de varias posibles opciones exn; 3) en casos raros, todo un intrn se conservan; sitios aceptores 4) donantes alternativa y 5) pueden resultar en exones de diferente tamao (fig. 1). Por ltimo, los promotores alternativos y sitios de poli-adenilacin contribuyen a la heterogeneidad de las transcripciones codificadas por un solo gen. Adems de modificar las protenas caractersticas, corte y empalme alternativo puede afectar a la estabilidad de las transcripciones a travs de la decadencia (NMD) va ARNm nonsensemediated, un mecanismo de CONTROL DE CALIDAD ARNm que depende de la maquinaria de traduccin. Anlisis recientes sugieren que aproximadamente el 35% de todos los eventos de corte y empalme alternativos en las clulas de mamferos generar especies de ARNm que contienen codones de terminacin prematuros (PTC), que pueden ser degradados de manera eficiente a travs de NMD. Curiosamente, Ni han demostrado recientemente que los exones que contienen un codn de parada son particularmente frecuentes y conservadas en los genes para factores de empalme que intervienen

en la eleccin de empalme. Estos exones con frecuencia se superponen elementos ultraconserved en los genomas de mamferos. Desde un punto de vista mecanicista de los diferentes tipos de splicing alternativo puede ser simplemente visto como un problema de reconocimiento de empalme de sitio por el spliceosome donde la decisin entre la inclusin y la omisin de un exn particular depende principalmente en el reconocimiento y la utilizacin de los sitios de empalme que flanquean el exn. Exones empalmados alternativamente se caracterizan a menudo por los sitios de empalme corto y degenerar. La debilidad intrnseca de estos sitios, lo que refleja la afinidad reducida para las protenas spliceosomal, es la causa principal de corte y empalme alternativo. El reconocimiento de los exones alternativos es modulada por una capa adicional de informacin proporcionada por un extensas y complejas redes de elementos que actan en cis auxiliares (sitio de ARN elementos de secuencia no-empalme), se hace referencia como potenciadores y silenciadores de empalme, respectivamente, que promueven e inhiben el exn reconocimiento (Fig. 2A). Estos son los elementos de regulacin cortos (~ 10 nucletidos) que se pueden encontrar aislados o agrupados en el pre-mRNA y estn presentes tanto en los exones (ESEs, Exonic empalme potenciadores y ESSS, silenciadores exonic empalme) e intrones (ISE, Intronic potenciador de empalme y ISS, Intronic empalme silenciadores). Los potenciadores de empalme bestcharacterized son tpicamente ricos en purina y la funcin al proporcionar sitios de unin para serina-arginina (SR) factores, una familia (alrededor de una docena) de las protenas de unin a ARN esenciales y abundante altamente conservadas en las clulas de plantas y animales. Factores SR muestran mltiples papeles en constitutiva de empalme y alternativa, as como en otros aspectos de la expresin gnica. Todos los miembros de esta familia comparten una estructura modular que consta de una o dos copias de un motivo de ARN de reconocimiento N-terminal (RRM), seguido por un dominio C-terminal de longitud variable rico en serina alterna - dipptidos arginina (el dominio RS). Los RRM determinar la especificidad de unin al ARN, mientras que el dominio RS media interacciones especficas entre protenas que son esenciales para la contratacin del aparato de empalme. Sin embargo, dentro de la spliceosome funcional tambin los dominios de RS pueden contactar directamente con el pre-mRNA. El carcter secuencial de estos contactos sugiere que el dominio de las interacciones de RS con ARN promover spliceosome asamblea. Adems, los residuos de serina del dominio RS son objetivos de extensas eventos de fosforilacin que influyen en las interacciones de protenas, y regulan la actividad y la distribucin subcelular de las protenas SR. Aunque se han mostrado varias quinasas, incluyendo SR protenas quinasas (SRPKs) 1 y 2, CLK / STY, de especificidad dual de la tirosina quinasa-regulado, CRKRS, ADN topoisomerasa I, glucgeno sintasa quinasa-3 y AKT, para fosforilar las protenas SR, la las vas de transduccin de seales que regulan splicing alternativo son an poco conocidos. Se han propuesto varios modelos para la funcin de ESEs y factores de SR (Fig. 2B). De acuerdo con uno de estos modelos, las protenas SR ESE enlazados a promover el exn definicin directamente mediante el reclutamiento de la maquinaria de empalme a travs de interacciones especficas protenaprotena mediadas por el dominio RS. Otro modelo predice que la principal funcin de los factores de SR ESE-consolidados es para antagonizar el efecto negativo en el empalme de una protena inhibidora que est enlazado a un elemento silenciador yuxtapuesta (ESS) (modelo de inhibidor). Exn inclusin o saltarse se determina por el equilibrio de estas actividades de la competencia, que a su vez reflejan por las concentraciones relativas de la unin al ARN activador cognado y protenas represoras. Estos modelos de mejora de empalme no son necesariamente excluyentes, ya que pueden reflejar las diferentes necesidades en el contexto de diferentes exones. Silenciadores de empalme identificados hasta la fecha parecen muy diverso. Ellos pueden actuar como sitios de unin para factores que bloquean el acceso de la maquinaria de empalme a un sitio de

empalme. Entre las protenas que interactan con ESS y elementos ISS hay ribonucleoprotenas nucleares heterogneas (hnRNP), un grupo de protenas de unin a ARN inicialmente reconocida como factores que interactan con transcripciones de ARN polimerasa II para formar partculas de hnRNP. En geles bidimensionales se han descrito aproximadamente 30 manchas, denominado con las letras del alfabeto de hnRNP A1 a travs de U. De manera similar a los factores de SR, protenas hnRNP tienen una estructura modular en la que uno o ms dominios de unin a ARN, generalmente en el extremo N-terminal, se asocian a diferentes dominios "auxiliares". Tres tipos de dominios de unin a ARN (RRM, hnRNP K y RGG dominio de homologa de dominio, una regin de la protena rica en repeticiones ArgGly-Gly) se han identificado en las protenas hnRNP y se muestra para proporcionar un cierto nivel de especificidad de unin de ARN. Los dominios auxiliares son muy diferentes en secuencia y controlar la localizacin subcelular y la interaccin con otras protenas. Especificidad de ARN y protena-protena interacciones de unin contribuyen a la asamblea de los complejos de ribonucleoprotena que son los sustratos para la reaccin de empalme subsiguiente. El mecanismo de accin hnRNPs depende de la posicin de sus sitios de unin a lo largo de la pre-ARNm. Adems del modelo de inhibidor descrito anteriormente, unido a hnRNPs ISS que flanquean un exn alternativo puede hacer que el exn a la salida de bucle, lo que resulta en la omisin del exn (Fig. 2C). Por otra parte, factores inhibidores unidos a ESS pueden polimerizarse por el exn y desplazar a las protenas SR ESE determinada (Fig. 2C). Slo en pocos casos los exones empalmados alternativamente son controlados por empalme reguladores especficos de tejido. En la gran mayora de los casos de eventos de empalme parecen ser controlado por la abundancia relativa y / o la actividad de factores SR antagnicas ampliamente expresadas y protenas hnRNP a travs de un mecanismo de combinatoria, con mltiples factores positivos y negativos y los elementos de secuencia que influyen en el resultado final del empalme reaccin. Esto se ejemplifica por los efectos antagonistas sobre pre-mRNA de empalme de SF2/ASF, un factor de SR, y las protenas hnRNP A1: altos niveles de SF2/ASF inducen la inclusin exn mientras que los altos niveles de hnRNP A1 promover la omisin de exn. Curiosamente, el nivel relativo de expresin de hnRNP A1 y SF2/ASF se ha demostrado que cambiar durante el crecimiento de pulmn neoplsico. Otro ejemplo es SRp55 y su factor de antagonista hnRNP E / PTB que el control del perfil de corte y empalme del factor de crecimiento de fibroblastos recepto r (FGFR1). Saltarse de resultados -exn en la produccin de la isoforma FGFR1- que tiene una mayor afinidad por los factores de crecimiento de fibroblastos. El aumento de expresin de esta isoforma se correlaciona con el cncer en el pncreas y el cerebro y con mal pronstico en los tumores de mama y su sobreexpresin promueve la formacin de tumores en ratones desnudos. SRp55 se une a una ESE 69-nucletidos y es necesario para -exn inclusin mientras PTB reconoce una secuencia aguas arriba de la -exn y promueve la omisin de exn y la produccin de FGFR1-. Estudios recientes indican que las vas de sealizacin puede controlar decisiones de empalme al afectar a la distribucin subcelular y / o la actividad de los reguladores de empalme. Muchos factores SR y protenas hnRNP servicio de transporte continua y rpidamente entre el ncleo y el citoplasma, el cual da a conocer una funcin citoplasmtica de estas protenas, por ejemplo, en la traduccin del ARN. En este sentido, Michlewski mostr que el factor de empalme SF2/ASF estimula la iniciacin de la traduccin mediante la contratacin directamente el objetivo mamfero de la rapamicina (mTOR) a un subconjunto de mRNAs. Notablemente, varios tratamientos de estrs perturbar la distribucin ncleocitoplasma de algunos reguladores de empalme. Por ejemplo, la exposicin de las clulas a estmulos de estrs, tales como choque osmtico o la irradiacin con UVC, da como resultado una marcada acumulacin citoplsmica de hnRNP A1, concomitante con un aumento en la fosforilacin de protenas. Estos efectos estn mediados por la MKK (3/6) - ruta de p38 y se correlacionan con los cambios en el patrn de corte y empalme alternativo de un E1A reportero de corte y empalme de pre-ARNm de adenovirus. Por otra parte, varios reguladores de empalme, incluyendo SF2/ASF, son secuestradas en los rganos de

resistencia nuclear despus de los tratamientos que activan la respuesta de choque trmico. Esta capacidad para modular la actividad de los reguladores de empalme se abre la excitante posibilidad de que condiciones estresantes, como aquellos en el microambiente del tumor, puede influir en el perfil de empalme de un nmero de genes y por lo tanto afectar identidad de la clula. Nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen a corte y empalme alternativo todava es limitado. De hecho, hay muchos elementos exonic y intrnica para que los mediadores que actan en trans estn an por identificar y, en la mayora de los casos, circuitos de regulacin que las decisiones de control de corte y empalme y la conexin con las vas de transduccin de seales, no se conocen bien. Descifrando el complejo entramado que subyace alternativa de empalme eleccin sitio regulador sigue siendo un reto importante en esta rea de investigacin. ABERRANTE SPLICING ALTERNATIVO EN CNCER, GENES RELACIONADOS De ancho anlisis del genoma indican que ~ 75% de los genes humanos codifican al menos dos isoformas empalmados alternativamente. Por lo tanto, corte y empalme alternativo parece ser la norma para los genes humanos y no es sorprendente que los defectos de empalme en los genes especficos estn causalmente ligados a trastornos genticos. Wellcharacterized ejemplos son la atrofia muscular espinal, distrofia miotnica, la retinitis pigmentosa, sndrome de Frasier, la hemofilia A, * La talasemia, fibrosis qustica atpica y algunas enfermedades neurodegenerativas. Se ha calculado que aproximadamente el 15% de mutaciones puntuales que causan enfermedades hereditarias hacen alterar el procesamiento de pre-ARNm al afectar cannica 5 'y 3' sitios de empalme, sitios de ramificacin o seales de poliadenilacin. Esta cifra es probablemente una subestimacin ya que no tiene en cuenta las mutaciones en elementos reguladores de empalme (potenciadores y silenciadores) que pueden prevenir la interaccin con los reguladores de empalme (hnRNPs y factores SR). De hecho, al menos el 50% de 50 sustituciones de una sola base que causan la omisin de exn en genes humanos interrumpir potenciadores de empalme. Con frecuencia, los defectos de empalme debido a mutaciones genticas introducen codones de parada prematura y dirigen el ARNm de la degradacin por la va de descomposicin mediada por el antisentido (NMD). El efecto final es que, en lugar de un polipptido truncado, no se produce ninguna protena. En los ltimos aos ha surgido un vnculo entre el desarrollo del cncer y la desregulacin del splicing alternativo. Una caracterstica comn de las clulas cancerosas, de hecho, es la desregulacin general de empalme, que puede conducir a la expresin de las variantes especficas de tumores y que es ms probable es promovida por alteraciones en las vas de sealizacin y por las variaciones en la concentracin, localizacin y actividad de trans -actuando empalme reguladores. Todava se discute si estos cambios en los perfiles de corte y empalme son simplemente un "ruido" que ocurren en las clulas cancerosas o tener un papel directo en la tumorignesis. Como cuestin de hecho, recientes avances en biologa molecular y celular indican que los perfiles de corte y empalme alterados de genes crticos pueden tener un impacto sobre todos los principales aspectos de la biologa de las clulas del cncer. Esto puede ser debido a la inactivacin de onco-supresor o para obtener de la funcin de las protenas implicadas en la susceptibilidad al cncer y en la progresin tumoral.

Las mutaciones que actan en cis

Estos se heredan o mutaciones somticas que afectan el proceso de empalme. De acuerdo con su posicin y el efecto sobre empalme, estas mutaciones se pueden dividir en dos subclases. Subclase I (60% de los casos) de empalme comprende mutaciones en los sitios de ayuste invariantes y abolir completamente reconocimiento de exn. Estas mutaciones se asocian con enfermedades graves.Subclase II se asocia a menudo con un fenotipo relativamente suave e incluye mutaciones en los motivos variantes (tales como el corte y empalme del tracto poli-pirimidina alternativa) y mutaciones intrnicas que generan donante o aceptor de los sitios crpticos. Un ejemplo proviene del gen p53 supresor de tumores, es decir, el gen

ms comnmente mutado en los cnceres humanos. Las isoformas de p53 se originan a travs de splicing alternativo y se diferencian por su funcin de supresor de tumor. Curiosamente, las mutaciones "silenciosas" en el gen p53 se prev que afectar a corte y empalme, ya que crean sitios de empalme en el centro de un exn. Vale la pena considerar, sin embargo, que muchos de deteccin de mutaciones se centraron en los exones e ignoradas regiones no codificantes. A continuacin, se discuten otros ejemplos de mutaciones que afectan empalme de oncogenes y genes supresores de tumores. Las mutaciones en el gen APC resultado en la poliposis adenomatosa familiar, as (FAP). Recientemente, se ha informado de que una forma atenuada de FAP es causada por una insercin de una nica T entre la segunda y la tercera posicin del intrn 4 del gen APC que conduce a la omisin del exn 4 y para la expresin predicho de una protena truncada . Dos mutaciones adicionales en los intrones 3 y 4 tienen el efecto idntico. Tambin mutaciones en elementos reguladores de empalme, como ESE y las secuencias del SEE, pueden perturbar perfiles de empalme. Un buen ejemplo es el gen BRCA1 supresor de tumores que codifica una protena implicada en una variedad de procesos celulares incluyendo la regulacin transcripcional, la recombinacin, la reparacin del ADN y la apoptosis de las clulas. Las mutaciones en el gen BRCA1 son marcadores bien conocidos de susceptibilidad a cncer de ovario y de mama, siendo la ltima la neoplasia maligna ms frecuente entre las mujeres. Mazoyer demostrado que una mutacin sin sentido heredado en el exn 18 interrumpe un elemento ESE (el sitio de unin para el factor de SF2/ASF SR) y provoca la omisin de exn. El anlisis por ordenador con el programa ESEfinder ha identificado 23 ESEs altamente conservadas en los 22 exones del gen BRCA1. Alrededor del 60% de estos motivos contienen sustituciones de nucletidos reportadas en el Breast Cancer Information Core sugiere la posibilidad de que la orientacin de los perfiles de empalme pueden ser los mecanismos a travs de los que las mutaciones afectan la funcin BRAC1. El gen BRCA1 codifica al menos treinta distintas variantes de empalme que son expresados diferencialmente en los tejidos. La mayora de las transcripciones empalmados alternativamente mantener el marco de lectura abierto del ADNc original y tienen el potencial para codificar protenas funcionales. En particular, las clulas de mama y de ovario expresan un conjunto comn de variantes que sugiere la intrigante posibilidad de que comparten algunas vas de regulacin que en su lugar est ausente en lneas celulares de leucemia que muestran un conjunto diferente de isoformas. Muchas mutaciones sin sentido en la regin de codificacin estn asociados con la omisin de exn. Por lo tanto, un punto de mutacin doble en el exn 7 de la neurofibromatosis 1 (NF1) gen altera los sitios de unin de consenso para los factores de SR, SC35 y SF2/ASF, y promueve la omisin de exn. El gen NF1 muestra uno de la tasa de mutacin ms alta entre los genes asociados con trastornos humanos; simplemente sobre la base de la secuencia de ADN, se predijo que el 37% de estas mutaciones genmicas podra determinar defectos de empalme. Sin embargo, cuando esta prediccin se verific mediante el anlisis de los mRNAs maduros, se hizo evidente que hasta el 50% de las mutaciones del gen NF1 estn asociados con defectos de empalme. El mensaje negativo que surge de este anlisis es que todava no somos capaces de inferir el perfil empalme simple de la secuencia primaria del ADN y que no tenemos que depender de ARN e incluso secuencias de la protena para entender los efectos de cualquier mutacin gentica. Similares observaciones se han hecho con una serie de otros genes asociados a tumores como el BRCA2, FHIT, KIT, MLH1, MDM2, MSH2 y LKB1. En particular, todos estos casos, y muchos otros que se describen de forma continua, representan una extensin del concepto segn el cual la progresin del cncer se debe a una serie de mutaciones genticas estables que perturban la estructura, la funcin o la abundancia de protenas crticas. En este sentido, defectos de empalme pueden ser vistos como una de las rutas a travs de mutaciones genticas que causan la tumorignesis. Sin embargo, corte y empalme alternativo de los oncogenes o supresores tumorales tambin podra verse afectada por mutaciones en reguladores de empalme que implica una actividad de estos factores como oncoprotenas o supresores

tumorales, dependiendo de sus funciones antagnicas sobre la seleccin del sitio de empalme. Por ejemplo, el gen SRp55 (SFR6) se encuentra mutado en cnceres de mama y colorrectal. Curiosamente, SRp55 controles el perfil de empalme de varios genes asociados a tumores, entre los que CD44 y KIT. Adems algunas protenas hnRNP se han clasificado como oncogenes. En el 90% de los liposarcomas mixoides humanos, el (12; 16) t translocacin genera una fusin entre el gen hnRNP P2, que codifica una protena multifuncional implicada en la transcripcin, corte y empalme y exportacin de ARNm, y el gen CHOP, que codifica para una CCAAT / protena de unin al potenciador implicado en la eritropoyesis, la diferenciacin de adipocitos, la detencin del crecimiento y G1-S progresin del ciclo celular. El producto de la fusin de hnRNP P2-CHOP contiene el dominio amino terminal de la transcripcin de activacin de hnRNP P2 y el dominio de unin a ADN de CHOP y su sobre-expresin en ratones desnudos resultados en la formacin de tumores.

Los cambios en los factores que actan en trans

Ms interesante, desde nuestro punto de vista, es la observacin, reportado por muchos estudios en los ltimos 20 aos, que la mayora de las alteraciones de empalme asociados con el cncer no se asocian con cambios de nucletidos en los genes afectados, lo que implica modificaciones en la expresin y / o actividad de factores de regulacin de empalme. De hecho, los cambios en el repertorio de los factores de SR y protenas hnRNP se producen con frecuencia en los tumores y se acompaan de alteraciones en la abundancia relativa de los productos de corte y empalme alternativos, una firma tpica de las clulas cancerosas con efectos predecibles sobre el comportamiento celular. Como cuestin de hecho, las lneas de clulas cancerosas muestran un alto nivel de eventos de empalme alternativos que no se han conservado entre el ser humano y el ratn y no se expresan en tejidos normales el fortalecimiento de la idea de que un cambio en el nivel de empalme de los reguladores en clulas de cncer puede afectar gravemente en programas de expresin gnica. Un ejemplo destacado para ilustrar la forma en corte y empalme aberrante en el cncer puede ser modulada por la actividad alterada o expresin de factores de empalme es proporcionado porCD44, una glicoprotena transmembrana involucrados-las interacciones clula-clula y clula-matriz. Varias isoformas de CD44 se generan a travs de la incorporacin de la variable de 10 exones alternativos (v1v10) en su dominio extracelular proximal. Estndar CD44, que carecen todos los exones alternativos, se expresa predominantemente en los tejidos normales, mientras que las isoformas de CD44, en particular, los que contienen variante exones V5, V6 y V7, estn sobre-expresan en diversos tumores y han sido implicados en la invasin de clulas tumorales y la metstasis.La produccin de las diferentes isoformas de CD44 se relaciona con los cambios en la abundancia de las protenas SR y varios factores de empalme (incluyendo hnRNPA1, SRp55, SF2/ASF, Tra-2 beta, YB-1 y Sam68) que han demostrado para regular los exones variantes especficas. Varias lneas de evidencia indican que CD44 empalme est regulada en respuesta a estmulos extracelulares.Por lo tanto, la Materia y col. [68] encontr que la protena de unin de ARN Sam68 (Src asociada en la mitosis 68-kDa) promueve v5 inclusin en respuesta a la activacin de la va de Ras-Raf-Mek-Erk. Aunque los detalles mecanicistas son incompletos, se ha sugerido que la interaccin de fosforilados Sam68 con el exn v5 bloquea la actividad represiva de hnRNP A1, ya sea mediante la prevencin de la interaccin de hnRNP A1 con el elemento de ESS (por impedimento estrico), o contrarrestando el inhibitorio efecto de hnRNP A1 une a la ESS. Recientemente, Cheng y Sharp identificados SRm160 como otro factor de empalme Ras regulado responsable de inclusin de exn v5 en CD44 transcripciones. Es importante destacar, que tambin mostraron que el silenciamiento de SRm160 disminuye la invasividad celular, que une este regulador de empalme a la tumorignesis. Otro buen ejemplo de modulacin de corte y empalme por vas de sealizacin viene del gen de la fibronectina (FN), un componente de la matriz extra-celular y un factor determinante en el control de la proliferacin, la migracin, invasin y metstasis comportamiento de las clulas tumorales. EDA es

una isoforma de empalme FN generado por la inclusin de un solo exn (exn EDA, tambin conocido como EDI o EIIIA). Esta isoforma de empalme est pobremente expresado en tejidos normales de adultos, mientras que est presente en los embriones, as como durante la curacin de heridas y en algunos tumores. La inclusin del exn EDA es desencadenada por la activacin de la quinasa / AKT Ras/PI3- por factores de crecimiento. AKT fosforila directamente la SR protenas 9G8 y SF2/ASF, que a su vez se unen a la exn EDA y promover su reconocimiento por parte del aparato de empalme. La activacin de la misma va por la insulina regula la actividad de otra protena SR, SRp40, y estimula la inclusin de un exn alternativo en la protena quinasa C (PKC) II pre-ARNm. En total, estos resultados apoyan la posibilidad de que la desregulacin de la va de Ras/PI3-kinase/AKT, por ejemplo como resultado de mutaciones en sus componentes, podra tener consecuencias dramticas en el perfil de empalme de cualquier pre-mRNAs regulados por 9G8, SF2/ASF, SRp40 y tal vez otras protenas SR. Una hiptesis atractiva es que los exones que responden a esta va de sealizacin pertenecen a un conjunto de genes que funcionan cooperativamente para modular la fisiologa de la clula de acuerdo con la funcin biolgica de la molcula de sealizacin. La identificacin de estos exones, por lo tanto, ser de vital inters. Una indicacin a favor de esta hiptesis proviene de la observacin de que AKT tambin promueve traduccin de EDA mRNAs obligado por 9G8 fosforilados y SF2/ASF. Por lo tanto, la activacin de una sola va de transduccin de seales controla de manera integrada tanto empalme y la traduccin de los ARNm especficos y estimula la produccin de protenas especficas. El efecto final es un aumento drstico tanto en la velocidad y la fuerza de la respuesta de sealizacin tal como se mide por la produccin de la protena inducida. Aunque estos ejemplos proporcionan ideas interesantes en los efectos de las vas de transduccin de seales en la regulacin de empalme, la caracterizacin molecular sigue siendo escasa y todava no se ha proporcionado la aclaracin de la va completa. Por lo tanto, adems de para ilustrar una funcin de transduccin de seales en el control de empalme, estos casos tambin sugieren la necesidad de estudios adicionales para dilucidar este importante mecanismo de regulacin de genes. Un cuerpo creciente de datos implica corte y empalme alternativo como un mecanismo para el control de la apoptosis o muerte celular programada, un proceso esencial en el desarrollo y en el mantenimiento de la homeostasis celular en los organismos multicelulares. Bcl-X es un miembro de la familia Bcl II que dirige desglose mitocondrial durante la apoptosis. El uso de 5 'sitios de empalme alternativos dentro de exn 2 determina la produccin de dos isoformas de protenas: una forma larga antiapopttica (Bcl-XL) y una protena corta la promocin de la apoptosis (Bcl-XS).Por lo tanto, un cambio en el patrn de empalme de estas transcripciones puede tener efectos profundos sobre la actividad proliferativa de las clulas cancerosas y de su respuesta a los tratamientos pro-apoptticos. Varios factores de empalme, incluyendo Sam68, SF2/ASF, hnRNP F / H y SAP155, contribuyen en el control de la eleccin entre los dos sitios 5'-empalme alternativo.En particular, Sam68 sobre-expresin promueve la produccin de pro-apopttica Bcl-XS y este efecto se revierte a Sam68 fosforilacin. Por el contrario, las protenas hnRNP F / H, mediante la unin a un elemento tramo rico en G, promover el uso de la BclXS - 5 'del sitio de empalme. La relacin de Bcl-X variantes de empalme contribuir a determinar la sensibilidad de las clulas a una amplia variedad de agentes apoptticos y puede tener importancia en la resistencia a las drogas y la capacidad de respuesta quimioteraputico. Por ejemplo, la ceramida lipdica, un mediador / regulador de la apoptosis promueve la expresin de las variantes de empalme proapoptticas Bcl-XS, la eleccin entre los dos sitios 5'-alternativas de empalme est controlada por un elemento sensible a la ceramida (CRCE 1) situado en el exn 2 y obligados por SAP155. Por otra parte, la ceramida es capaz de modular el estado de fosforilacin de las protenas SR en una fosfatasa 1 (PP1) forma-dependiente. Curiosamente, uno de los objetivos es el PP1 SR factor de SF2/ASF, otro importante regulador de la Bcl-X procesamiento pre-mRNAs.

Hay varios ejemplos de eventos de empalme alternativos que controlan la actividad de las protenas implicadas en la motilidad celular y la invasin, un pre-requisito para la formacin de metstasis de cncer. Este es el caso de las isoformas de empalme de la andrgenos y receptores de estrgenos que estn involucrados en carcinomas mamarios. Curiosamente, una isoforma de receptor de estrgeno alfa, debido a la omisin del exn 3 (delta3ER), es un activador ms potente del factor de crecimiento endotelial vascular que el receptor de tipo salvaje. El Rac1b variante de empalme, que se genera por la inclusin de un exn casete 57-nucletidos, se ha demostrado que conducen a un crecimiento celular independiente de anclaje. En particular, Rac1b es hasta reguladas en tumores colorrectales en las diversas etapas de la progresin neoplsica, en comparacin con los tejidos normales adyacentes. Otros ejemplos, que muestran claramente el potencial efecto funcional de corte y empalme aberrante en la tumorignesis, son el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 ( FGFR2 ), la fibronectina y la survivina . Recientemente, se ha utilizado el Ron (recepteur d'origine nantais) proto-oncogn como modelo para investigar la relacin entre el splicing alternativo y la progresin tumoral [40]. Ron, la tirosina quinasa del receptor humano para la protena macrophagestimulating (MSP), es una protena heterodimrica (p185-Ron) compuesta de subunidades y tanto derivadas de la transformacin de un precursor comn. La unin a MSP estimula la actividad tirosina quinasa intrnseca de Ron y resultados en la fosforilacin de su sitio de acoplamiento para el transductor mltiple y adaptador de protenas que conducen a la activacin de cascadas de sealizacin (Fig. 3A ). Junto con Met, el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), Ron pertenece a una subfamilia de receptores de tirosina quinasas (RTK) con los patrones de expresin nicos y actividades biolgicas. Adems de promover el crecimiento celular y la proteccin de la apoptosis, estos receptores de clula de control de la disociacin, la motilidad y la invasin de matrices extracelulares, un proceso conocido como el crecimiento invasivo'''' o'''' dispersin de clulas [84]. Crecimiento invasivo es fisiolgicamente relevante durante el desarrollo, la organognesis y la regeneracin de tejidos, pero tambin es importante para mediar en la invasividad y para promover la progresin maligna.Actualmente, se han identificado seis variantes incluyendo Ron170, 165, 160, 155, 110, y 55 con diversas deleciones o truncamientos en las regiones extracelular o intracelular. Todas estas variantes son constitutivamente activo, pero difieren en sus propiedades bioqumicas y biolgicas. Por otra parte, el perfil de corte y empalme del gen Ron se altera con frecuencia en los cnceres epiteliales, tales como cnceres de colon y de mama, lo que sugiere que la produccin de mltiples isoformas Ron podra contribuir a la patognesis de estos tumores. El exceso de expresin de cualquiera de estas isoformas aumenta la motilidad celular (dispersin actividad similar). Sin embargo, slo Ron160 o Ron155 son capaces de inducir la formacin de foco, sostenido crecimiento independiente de anclaje y la capacidad para formar tumores metastsicos en ratones. Este potencial oncognico se canaliza a travs de la va de la PI3-quinasa / AKT. Transcripciones se reuni tambin sufren splicing alternativo y una isoforma, llamado Met-SM, se origina en la omisin del exn 14, que codifica un segmento de 47 aminocidos en el dominio yuxtamembrana. Esta isoforma se ha demostrado recientemente que desempear un papel importante en el desarrollo y la progresin de los cnceres humanos. Entre los mecanismos que controlan la expresin de las diferentes isoformas de Ron en las clulas cancerosas, el interruptor de constitutiva de corte y empalme alternativo desempea el papel principal. Por lo tanto, la aclaracin de las vas de regulacin que controlan el perfil de empalme de las transcripciones Ron arrojar nueva luz sobre la iniciacin y progresin del cncer. Hemos estudiado en detalle el caso de corte y empalme alternativo que conduce a la produccin de Ron ARNm. Esta transcripcin carece de un exn de 147-pb (exn 11). La protena codificada tiene una 49-amino-cido en la delecin en marco del dominio extracelular que afecta a la maduracin proteoltica y resulta en la acumulacin de una sola cadena de pro-Ron165 en el citoplasma. Por otra parte, la protena eliminado se caracteriza por puentes disulfuro intracelulares aberrantes que facilitan Ron165 oligomerizacin que conduce a la fosforilacin y activacin constitutiva. Hemos demostrado que la eleccin entre la inclusin y la omisin del exn 11 es controlada por dos elementos reguladores

adyacentes, un silenciador y un potenciador, ambos ubicados en el exn constitutiva 12 (Fig. 3B ). La unin de la protena SR SF2/ASF al ESE estimula la omisin del exn 11 y la produccin de Ron. Por lo tanto, la sobreexpresin de SF2/ASF en las clulas que normalmente expresan Ron desencadena la produccin de la Ron165 con dramticas consecuencias sobre las propiedades de la clula. En efecto, de manera similar a lo observado despus Ron sobre-expresin, una expresin aumentada de SF2/ASF afecta profundamente la morfologa celular y provoca la acumulacin nuclear de -catenina, la reorganizacin del citoesqueleto de actina, y la baja regulacin de la E-cadherina, un tumor y supresor de la invasin en los carcinomas humanos. Todos estos cambios morfolgicos y moleculares representan caractersticas de la transicin epitelial a mesenquimal (EMT), que est implicada en la diseminacin metastsica de los carcinomas humanos (Fig. 3B ). En particular, desmontables de SF2/ASF por interferencia de ARN (ARNi) reduce los niveles de Ron y de forma concomitante disminuye la motilidad celular. Del mismo modo, el ARNi dirigido especficamente contra Ron reduce la motilidad celular y revierte parcialmente los cambios morfolgicos inducidos por SF2 / ASF sobre-expresin. Dada la inform sobre regulacin de varias protenas SR, incluyendo SF2/ASF, durante la progresin del tumor, es tentador especular que el factor de empalme SF2/ASF podra promover la transformacin maligna induciendo una Ron mediada EMT. Esta hiptesis es consistente con un informe reciente que muestra que SF2/ASF se comporta como un autntico protooncogn.SF2/ASF es hasta reguladas en un conjunto de tumores humanos y, el gen que codifica para SF2/ASF se amplifica especficamente en algunos tumores de mama, pero no en el tejido de mama normal del mismo paciente. Limitado sobreexpresin de SF2/ASF, comparable a la de las muestras de cncer, dio lugar a la formacin de tumores en ratones desnudos. En particular, varios objetivos de corte y empalme endgenas de SF2/ASF, entre ellos una nueva isoforma oncognico del sustrato mTOR, S6K1, son esenciales para la transformacin SF2/ASFmediated. Adems, ARN de interferencia (ARNi) de SF2/ASF o la oncognico S6K1 isoforma, dio lugar a la reversin del fenotipo transformado. La identificacin de los reguladores de empalme como una nueva clase de proto-oncogenes puede revelar nuevos aspectos de la biologa del cncer y ofrecer nuevas oportunidades para el diagnstico y la terapia. Aunque todos los ejemplos presentados anteriormente, sin duda, demostrar que los cambios en la actividad de corte y empalme de las clulas tumorales est vinculada la progresin del tumor, sin embargo, los mecanismos moleculares responsables de estos cambios permanecen indefinidos. Varias preguntas siguen merecen investigacin. Cules son los eventos que conducen a la desregulacin de la expresin y / o actividad de los miembros de SR y familias hnRNP? Hay una reorganizacin generalizada de la maquinaria de empalme en las clulas de cncer o hace el resultado interruptor de corte y empalme de una desregulacin de un subconjunto de los reguladores de corte y empalme? De qu manera las vas de transduccin de seales que cooperen para afectar a los perfiles de empalme para determinar la conversin maligna?

Firmas splicing alternativo como indicadores de diagnstico / pronstico potenciales y perspectivas de terapias
En las secciones anteriores hemos discutido varios ejemplos que ilustran un vnculo causal entre el empalme y el desarrollo de neoplasia alternativa. Vale la pena notar que en muchos casos isoformas de empalme parecen ser especfica del cncer. Por otra parte, existen evidencias de que en diferentes tejidos de un conjunto diferente de genes se somete a cambios de los perfiles de corte y empalme durante la tumorignesis. Por lo tanto, en los tumores renales, Tropomyosin 1 , Actinin 1 , la integrina 4 , catenina 1 y de crecimiento de fibroblastos receptor del factor 2 cambiar sus patrones de splicing alternativo, mientras que N-glycanase1 no es as, a pesar de sus aparentes alteraciones en los tumores de pulmn y tero. Estos descubrimientos argumentan en contra de la idea de que los cambios en los perfiles de corte y empalme pueden ser resultado de una alteracin generalizada de la maquinaria de empalme en las clulas de cncer y sugieren que slo un conjunto especfico de empalme

reguladores se ven afectados por la tumorignesis de una manera tissuespecific. La identificacin de tissuespecific isoformas especficas de cncer, empalmados alternativamente inmediatamente incit a su uso potencial como diagnstico, pronstico, o biomarcadores predictivos. Aunque los estudios a gran escala an no se han llevado a cabo, los resultados iniciales son prometedores. Una correlacin importante entre aberrante splicing alternativo y la progresin del tumor se ha demostrado para CD44. En particular, las isoformas que contienen el exn v6 de la variante son upregulated frecuentemente en carcinomas de cabeza y cuello o en cnceres avanzados gstrico en la etapa y CD44v6 tumores positivos se asocian a mal pronstico.Tambin, aberrante corte y empalme alternativo de MDM2 se encontraron transcripciones de asociarse con un factor de pronstico pobre para la supervivencia en pacientes con cncer de mama, mientras que HDMX se ha relacionado con sarcoma de tejidos blandos. Por otra parte, la expresin alterada de una variante empalmada del P73 , una protena relacionada con p53, parece ser un marcador de pronstico negativo en pacientes con neuroblastoma. Durante la ltima dcada clsico perfil de la expresin gentica realizado por microarray ha sido una poderosa herramienta para el descubrimiento de nuevos biomarcadores de cncer. Sin embargo, la mayora de las plataformas de gama desarrollado hasta la fecha no han sido diseados para distinguir isoformas de ARNm. Una direccin importante para el futuro ser la aplicacin de todo el genoma pantallas diseado para el anlisis de firmas de corte y empalme alternativos asociados con cncer, pero prcticamente ausente en las clulas normales. Estas micromatrices de splicingsensitive tienen el potencial de identificar mejor sub-clases de tumores. Por otra parte, no requieren que las relaciones causa-efecto entre los perfiles de empalme y los cnceres se identifican (o incluso que existan!), Sino slo que esta asociacin son suficientemente consistentes para ser predictivo. Curiosamente, Li ha utilizado un enfoque para cuantificar simultneamente los cambios en el empalme ("splicing interruptor") y la abundancia de transcripcin (de arriba a abajo-regulacin). La ventaja de esta estrategia de perfiles "bidimensional'' es que funciona con muestras biolgicas parcialmente degradadas, tales como ARN derivados de los bloques de tejido que han sido formalinfixed y embebido en parafina. Estos autores identificaron un conjunto especfico de biomarcadores de isoformas de mRNA del cncer de prstata mediante paneles independientes de muestras de tejido. En particular, informaron de dos variantes de AMACR gen (que codifica una-metilacil-CoA racemasa) resultantes de la utilizacin alternativa del ltimo exn junto con cin poliadenilacin alternativa: una isoforma mostr un mximo de regulacin cuantitativa en el cncer de prstata en comparacin con la prstata normal, tejidos, el otro parecan ser expresado slo en el cncer de prstata. Ms recientemente, la novela de la tecnologa de microarrays se ha utilizado para medir todo el genoma exn expresin en 102 muestras normales y de cncer de tejidos de diferentes etapas de colon, vejiga urinaria, y la prstata. Se identificaron siete genes con variantes especficas de tumores de empalme ( alfa-actinina 1 , Caldesmon , Collagen, type VI alpha 3 , ricos en leucina repetir interaccin protena 2 , fosfatidilinositol-4-quinasa beta polipptido cataltico , Tropomyosin 1 y Vinculina ). En particular, los patrones de empalme tumorspecific de alfa-actinina 1 , caldesmn y Vinculina se encontraron, los componentes clave del citoesqueleto, en los tres rganos que sugieren que pueden representar eventos de splicing relacionadas con el cncer en general. Por otra parte, en el anlisis de protenas in silico predice que estas variantes de empalme del cncer-especficos identificados codifican protenas con funciones potencialmente alteradas, lo que indica que pueden estar implicados en la patognesis y por lo tanto representan nuevos biomarcadores y dianas potenciales. Variantes del cncer-especficas de corte y empalme no slo pueden servir como marcadores de diagnstico y pronstico de tumores, sino que tambin proporcionan objetivos potenciales para el desarrollo de nuevas estrategias teraputicas (Fig. 4 ). Una va prometedora para el desarrollo de medicamentos contra el cncer ms selectivos consiste en la administracin dirigida de compuestos bioactivos para el tumor por medio de molculas (por ejemplo, anticuerpos) que son especficos para los marcadores asociados a tumores. La accesibilidad, as como el patrn de restriccin de la expresin de

la antgeno es un criterio importante en la seleccin de un objetivo para la intervencin bio-molecular. En particular, muchos receptores que median las interacciones clula-clula y clula-matriz son regulados por corte y empalme alternativo y empalmados alternativamente variantes especficas de estas molculas se asocian con muchos tumores malignos humanos. Curiosamente, casi el 90% de eventos de empalme alternativos afecta a las regiones situadas en la superficie expuesta de la protena y para muchas molculas de la membrana celular, los exones alternativos codifican nuevos eptopos que se encuentran generalmente en el dominio extracelular de la protena. Estos eptopos parecen ser ideal para las estrategias de tumor de orientacin. Una vez ms, la protena CD44, discutido en detalle en la seccin anterior, es un ejemplo notable ya que los anticuerpos marcados radiactivamente dirigidos contra el CD44-v6 isoforma parecen ofrecer una herramienta teraputica prometedora y estn actualmente en ensayos clnicos para el tratamiento del cncer de cabeza y cuello. Sin embargo, a pesar de estos avances prometedores, los tumores slidos son con frecuencia relativamente resistentes a las terapias basadas en anticuerpos. Esto es debido, en parte, a la relativa inaccesibilidad de las clulas tumorales y a la escasa penetracin de los anticuerpos en el tejido tumoral. Dado que las clulas tumorales se separan de la sangre por las clulas endoteliales y los componentes de la matriz extracelular que rodea la vasculatura, la captacin del tumor es muy limitado por la capacidad del anticuerpo para cruzar esta capa. Es importante destacar que, los enfoques teraputicos dirigidos contra la vasculatura del tumor neo-han ganado significativa para un nmero de razones: (i) las clulas endoteliales vasculares tumorales son fcilmente accesibles para los medicamentos a travs de la circulacin de la sangre; (ii) existe una creciente evidencia de que la inhibicin o regresin de los vasos del tumor conduce a la muerte celular del cncer ya que se basan en los vasos sanguneos de nutrientes y oxgeno para satisfacer sus necesidades metablicas. Un ejemplo interesante es el EDB isoforma de corte y empalme alternativo de fibronectina (FN). El EDB isoforma se genera a travs de la inclusin de un solo exn que codifica una regin de 91 aminocidos y est presente en los vasos sanguneos de tejidos neoplsicos, mientras que est virtualmente ausente en tejidos maduros / adulto. EDB est implicada en la regulacin de la proliferacin celular endotelial y la morfognesis vascular; un anticuerpo radiomarcado EDB-especfica se encuentra actualmente en ensayos clnicos de fase II para el tratamiento del cncer anti-angiognica. Recientemente, se ha demostrado que el corte y empalme alternativo del dominio extra-A (EDA) de la fibronectina puede representar a otro, igualmente atractivos, objetivo para la entrega basada en anticuerpos de agentes bioactivos a la neovasculatura no slo de tumores slidos, pero tambin de lesiones metastsicas . Del mismo modo, las variantes de corte y empalme podran representar nuevos antgenos especficos de leucemia con uso potencial en enfoques inmunoteraputicos. En leucemias Phpositive, la (9; 22) t translocacin genera la Bcr / Abl protenas de fusin, cuya activacin de la tirosina quinasa constitutiva es responsable de la aparicin del fenotipo de la leucemia. Adems de la principal BCR / ABL transcritos de fusin, se ha informado de que BCR / ABL transcripciones, que surge de corte y empalme alternativo, tambin se producen en un alto porcentaje de la leucemia mielgena crnica (LMC) y leucemia linfoblstica aguda (LLA) de los pacientes. En particular, BCR / ABL transcripciones alternativas que implican ABL exn 4 son muy atractivos porque las protenas de fusin resultantes contienen una novela eptopo inmunognico que es capaz de provocar una respuesta especfica de antgeno de clulas T. Enfoques teraputicos innovadores tambin podran ser diseados para apuntar a la maquinaria de empalme. Por ejemplo, modificaciones post-traduccionales de empalme de los reguladores pueden ser relevantes para la progresin tumoral. SRPK1 es hasta reguladas en tumores de mama y de colon en comparacin con el epitelio normal adyacente, y los niveles de la quinasa aumentar junto con el grado del tumor. Fuerte expresin de la protena SRPK1 tambin fue evidente en la mayora de los de mama y las lneas celulares tumorales de colon. Curiosamente, la baja regulacin de SRPK1 el uso de pequeos ARN de interferencia (siRNA) afecta a la expresin de factores apoptticos clave BAX y BCL2, aumenta la proporcin de las clulas tumorales (pero no de las clulas nontrasformed) sometidas a la apoptosis y amplifica su sensibilidad a los dos quimioteraputicos utilizados frecuentemente agentes tales como

gemcitabina y cisplatino. Estos resultados sugieren que la inhibicin farmacolgica de SRPK1 actividad puede ser eficaz como agente independiente o en combinacin con regmenes quimioteraputicos convencionales. Por otra parte, las pequeas molculas con SRPK-bloqueo de la actividad, tales como inhibidores de Clk1/Sty o inhibidores potentes de la reaccin de corte y empalme, tales como derivados de indol, se pueden utilizar para alterar los patrones de empalme. Curiosamente, los datos recientes muestran que las protenas E (SME) Funciones spliceosomal como supresor del crecimiento de clulas tumorales de manera independiente de p53. Por lo tanto, teniendo en cuenta que una gran parte de los cnceres humanos son defectuosos en la actividad de p53, la orientacin de las PYME en la terapia gnica contra el cncer ser de especial inters. Diferentes enfoques teraputicos estn estudiando actualmente para corregir aberrante de corte y empalme alternativo a nivel del ARN. Estas estrategias pueden o bien alterar los patrones de splicing alternativo de genes especficos o reconocer especies de ARNm particulares para provocar su degradacin (por ejemplo, ARNi, microARN y ribozimas). La correccin de defectos de empalme a travs de la manipulacin de ARNm requiere el uso de estrategias de genetherapy, que a menudo estn relacionadas con problemas tales como la entrega, la toxicidad y la inmunogenicidad . terapia SiARN basada ha demostrado una gran promesa para muchas enfermedades tales como el cncer. Los principales objetivos para la terapia siRNA incluyen oncogenes y genes que estn involucrados en la angiognesis, la metstasis, la supervivencia celular, Antiapoptosis y la resistencia a la quimioterapia. Por otra parte, las ltimas generaciones de antisentido OLIGON ucleotides que contienen modificaciones qumicas aparecen ms estable en comparacin con cadenas principales de nucletidos convencionales. Algunos de estos oligos de evitar montajes ribosmico, y por lo tanto mRNA traduccin, y parece ser bien tolerada en los pacientes. Adems, los oligonucletidos modificados sintticamente dirigidos a travs de la hibridacin especfica de secuencia de los sitios de empalme o secuencias adyacentes pueden bloquear la seleccin inadecuada de exn mediante la inhibicin de la unin de trans factores de accin prolongada. Se han aplicado con xito para corregir corte y empalme aberrante de la -globina , CFTR , distrofina , tau genes y para reprimir la generacin de variantes de corte y empalme relacionadas con el cncer de FGFR1 , Bcl-X , y MDM2. Sola o en combinacin con agentes quimioteraputicos, tales como cisplatino, irinotecan, paclitaxel, fluorouracilo se puede utilizar con soltura en la terapia. Por ltimo, hemos diseado un oligmero de morfolino fosforodiamidato dirigidas a la regin de la Ron potenciador que contiene el sitio de unin SF2/ASF (Mo-SF2) para bloquear estricamente la unin de este factor de empalme y, por lo tanto, la omisin del exn 11. La eficacia de Mo-SF2 se ensay usando clulas de carcinoma gstrico KATOIII humanas caracterizadas por altos niveles de SF2/ASF, Ron y fenotipo invasivo. Hemos encontrado que Mo-SF2 inhibe Ron empalme y corrige la morfologa celular y las propiedades de migracin de las clulas [datos no publicados].

OBSERVACIONES FINALES
Despus de la secuenciacin de la totalidad de los genomas eucariotas, corte y empalme alternativo se ha convertido en la estrategia dedicada a la interpretacin de la informacin gentica. Como ampliamente discutido en esta revisin, de hecho, este mecanismo de procesamiento de cuentas premRNA de una gran parte de la diversidad protemica en eucariotas superiores. Mientras regulacin de la transcripcin determina la presencia y abundancia de transcripciones de genes primarios, corte y empalme alternativo est diseado para manipular el mensaje en respuesta a una serie de estmulos. De esta manera se puede sintonizar las protenas caractersticas, tales como la capacidad de participar a hetero-complejos o la localizacin subcelular, con el fin de satisfacer las necesidades de las clulas. Raramente son los programas de corte y empalme alternativos asociados a "s o no" decisiones; en la mayora de los casos, los productos de corte y empalme co-existir en una sola clula y contribuir a la capacidad celular para hacer frente a un nmero de diferentes estmulos internos y externos. Desde este punto de vista, por lo tanto, este mecanismo parece estar ntimamente conectada a la complejidad

de los organismos metazoos que, una vez ms, pone de relieve la necesidad de entender las reglas combinatorias que subyacen opciones del sitio de empalme como un paso obligatorio para llegar a una visin global de la lgica de la vida cuestin. Descifrar las implicaciones biolgicas de este proceso de regulacin es una tarea difcil que requiere la integracin de una gran cantidad de datos en relacin con los cis secuencias de accin ytrans -actuando factores involucrados, los circuitos de regulacin y vas de sealizacin que modulan las decisiones de empalme sitio y finalmente la consecuencias fisiolgicas y / o patolgicas resultantes de la expresin de las distintas isoformas de empalme. El logro de este resultado ser sin duda acelerada por el desarrollo reciente de nuevos y muy sofisticados bioinformtica y enfoques de biologa de sistemas. Se espera que un avance importante para comprender completamente cmo splicing alternativo impregna los programas de expresin para derivar a partir de la aplicacin de metodologas de alto rendimiento. Durante la ltima dcada, las ciencias biomdicas han sido fuertemente influenciados por las "micas": la genmica, la protemica, transcriptmica y metabolmica. La aplicacin de los enfoques de alto rendimiento para estudiar los perfiles de empalme es slo en su comienzo. Este retraso es sin duda debido a una serie de problemas tcnicos que se derivan de la necesidad de evaluar contempornea para cada gen, el nivel absoluto de los transcritos totales y la abundancia relativa de las isoformas de empalme. Por otra parte, la interpretacin es complicada significativamente por la necesidad de comprender las implicaciones fisiolgicas que resultan de un cambio en los perfiles de corte y empalme. Sin embargo, es fcil predecir que este tipo de anlisis proporcionar informacin crucial para dar a conocer las vas de regulacin que subyacen a la co-regulacin de los perfiles de empalme y para comprender la relevancia de splicing alternativo en el contexto del desarrollo del organismo. La esperanza es que las matrices splicingsensitive guiarn la identificacin de los circuitos que, al igual que la transduccin de seales y las vas de transcripcin, puede ser causalmente vinculados a los programas de desarrollo, organognesis, definicin de esquema corporal y la identidad celular.Otra cuestin pendiente se refiere a la identificacin de la sub-genoma que no experimentan eventos de splicing alternativo. Estos genes identificar cualquier funcin celular crtico particular?Por lo tanto, el cambio de perspectiva, desde la caracterizacin detallada de los mecanismos moleculares a enfoques globales, que se espera que mejore nuestra comprensin de la importancia fisiolgica de corte y empalme alternativo y para aumentar drsticamente la comprensin de las condiciones fisiolgicas y patolgicas importantes, tales como la plasticidad neuronal y la complejidad del cncer. Estamos seguros de que los enfoques de la biologa de sistemas pueden ayudar a la identificacin de los eventos de splicing alternativo que pueden desempear un papel fundamental en la progresin tumoral. Esto ofrecer la oportunidad de desarrollar estrategias innovadoras de intervencin teraputica que se dirigen a variantes especficas de splicing alternativo. AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue apoyado por becas de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), de la Red de la Unin Europea (EURASNET) de Excelencia sobre splicing alternativo (EURASNET) y de la Fondazione Cariplo a GB

Figura (1). cis secuencias de accin necesarios para la reaccin de empalme y los diferentes tipos de eventos de splicing alternativo. (A) de empalme secuencias consenso de un gen eucariota tpica (seales exn / intrn empalme sitio, sitio de sucursal y el tracto polypyrimidine). (B) mRNAs empalmados alternativamente el resultado de la omisin de exn, intrn retencin, el uso de la alternativa 3 '(aceptante) o 5'(donante) y los sitios de la seleccin de los exones que se excluyen mutuamente. En el nivel de protena, corte y empalme alternativo afecta drsticamente a la secuencia de aminocidos por delecin o insercin de dominios, marco-turnos o codones de parada. Splicing alternativo en las regiones no codificantes del ARNm maduro podra repercutir en la estabilidad y la traduccin del ARNm. Figura (2). Cis-y elementos reguladores que actan en trans que el control de corte y empalme alternativo y modelos para la funcin de empalme potenciadores y silenciadores. (A) los exones empalmados alternativamente por lo general se caracterizan por los sitios de empalme dbiles. El reconocimiento de estos sitios depende de elementos reguladores de empalme: potenciadores exonic empalme (ESE) y silenciadores (ESS) y intronic potenciadores de empalme (ISE) y silenciadores (ISS). (B) los elementos ESE estn obligados por los factores de empalme de la familia SR. travs de interacciones con las protenas del aparato de empalme, el dominio RS de factores SR estimula el ensamblaje de la splicesome en el intrn adyacente (a la izquierda).Adems, los factores SR pueden contrarrestar la actividad inhibidora de protenas hnRNP unidos a elementos ESS (derecha). (C) El mecanismo de accin de los elementos de silenciador depende de la su posicin a lo largo de la premRNA. En algunos casos, factores inhibidores (por ejemplo protenas hnRNP) se unen a secuencias que flanquean ISS un exn alternativo y causan un bucle y saltar fuera de este exn (a la izquierda). Alternativamente, los factores inhibidores unidos a ESS pueden polimerizar a lo largo del exn y desplazar las protenas SR ESEbound (derecha).

Figura (3). Representacin esquemtica del receptor Ron y de las vas de sealizacin corriente abajo. ( A ) Ron es un solo paso, disulfuro-ligado / heterodmero . La cadena es una glicoprotena extracelular mientras que la cadena es una subunidad transmembrana que comprende una secuencia extracelular, un segmento trans-membrana corto, una gran porcin citoplsmica con intrnseca dominio de tirosina quinasa (TK) y una cola C-terminal. Se indican residuos y dominios importantes para la actividad de Ron. En particular, el dominio intracelular incluye el sitio cataltico tirosina quinasa (valo blanco) flanqueado por secuencias de yuxtamembrana distintivo y carboxi-terminales. La fosforilacin de tirosinas dos dentro del dominio quinasa regula positivamente la actividad de la enzima, mientras que un residuo de serina en el dominio yuxtamembrana tiene un papel regulador negativo. Dos residuos de tirosina en la regin carboxi-terminal, cuando est fosforilada, forman un sitio de acoplamiento especfico para mltiples transductores de seal y los adaptadores. La activacin de Ron por MSP puede iniciar la sealizacin a travs de muchas de las vas implicadas en la progresin tumoral y la metstasis, tales adhesin, invasin, la movilidad, la proliferacin y la inhibicin de la apoptosis. ( B ) El constitutivamente activa Ron isoforma se genera a travs de la omisin del exn 11. Este evento es controlado por dos elementos de corte y empalme adyacentes, un silenciador y un potenciador, que se encuentra en la parte central y en el extremo 3 'del exn 12, respectivamente. Estos dos elementos reguladores pueden formar un casete de control'''' que ajusta la fuerza del sitio aceptor del intrn 11 y por lo tanto la relacin entre Ron y transcripciones Ron. Factor de empalme SF2/ASF se une directamente al potenciador y rige su actividad. Los altos niveles de SF2/ASF aumentan la fuerza del sitio aceptor del intrn 11, promover la produccin de Ron isoforma y desencadenar cambios morfolgicos y moleculares tpicos de la transicin epitelial a mesenquimal (EMT). La funcin primaria del silenciador podra ser para antagonizar el potenciador y evitar la omisin de exn.

Figura (4). Uso potencial de los enfoques teraputicos que se dirigen a splicing alternativo. Varias estrategias se estn utilizando actualmente para explotar splicing alternativo para el tratamiento de cncer. (A) En muchos casos, las variantes de corte y empalme del cncer-restringidas contienen eptopos nicos que podran ser utilizados como dianas para los anticuerpos especficos conjugados a toxinas de clulas del tumor. (B) Se han encontrado muchos compuestos qumicos que afectan empalme de numerosos genes. Aunque los mecanismos por los cuales los patrones de empalme se alteran son an poco conocidos, varios compuestos son capaces de bloquear la actividad de las quinasas de protenas SR(SRpKs) y, en consecuencia, reducir el estado de fosforilacin de factores de empalme SR. (C oligonucletidos) modificados sintticamente, tales como fosforotioato, morfolino phosphorodiamide y 2'-O-metil, son capaces de bloquear la interaccin de la maquinaria spliceosome con un sitio especfico. Por otra parte, son ms estables y activas de cadenas principales de nucletidos regulares y presentan baja toxicidad in vivo. (D) transcritos de ARNm especfico de cncer que contienen secuencias nicas pueden ser dirigidos utilizando la degradacin mediada por ARNi.