Caracterización de Metabolitos Secundarios Apartir de Tejidos Vegetales

CARACTERIZACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS APARTIR DE TEJIDOS VEGETALES
TESINA QUE PARA OBTENER EL TITULO DE T.S.U en Qumica rea Biotecnologa
Presenta Jairo Arturo Vargas Villegas
Asesor interno M. en C. Alma Yolanda Vzquez Snchez Asesor Externo Dr. en C. Eugenio Snchez Arreola
Xicotepec de Jurez, Puebla. Septiembre 2012
UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
NDICE
NDICE ........................................................................................................ I NDICE DE FIGURAS ...............................................................................IV AGRADECIMIENTOS ................................................................................V DEDICATORIAS .......................................................................................VI RESUMEN ...............................................................................................VII SUMMARY ..............................................................................................VIII 1. INTRODUCCIN ................................................................................... 1 2. GENERALIDADES DE LA UNIVERSIDAD DE LAS AMRICAS PUEBLA.................................................................................................... 4 2.1 Misin ................................................................................................ 5 2.2 Visin................................................................................................. 5 2.3 Organigrama de la Institucin ......................................................... 6 2.4 Ubicacin .......................................................................................... 7 3. REVISIN DE LITERATURA ................................................................ 9 3.1 Cultivo de Clulas y tejidos vegetales............................................ 9 3.1.1 Reguladores de Crecimiento Vegetal ........................................ 11 3.1.2 Obtencin de Callos ................................................................... 12 3.1.3 Medios de Cultivo ........................................................................ 13 3.1.3.1 Macronutrientes ....................................................................... 14 3.1.3.2 Micronutrientes ........................................................................ 15 3.1.3.3 Vitaminas .................................................................................. 15 3.2 Cintica de Crecimiento Celular ................................................... 16
I UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
3.3 Metabolitos secundarios ............................................................... 17 3.3.1 Induccin a los Metabolitos Secundarios ................................. 17 3.4 Cromatografa ................................................................................. 18 3.4.1 Tipos de Cromatografa .............................................................. 19 3.4.2 Cromatografa Lquido-Slido (CLS) ......................................... 20 3.4.3 Cromatografa Lquida de Alta Presin ..................................... 22 3.4.3.1 Proceso de Derivatizacin ....................................................... 24 3.5 Antecedentes .................................................................................. 26 4. JUSTIFICACIN .................................................................................. 32 5. OBJETIVOS ........................................................................................ 33 2.1 Objetivo General ............................................................................. 33 2.2 Objetivos particulares .................................................................... 33 6. MATERIALES Y MTODOS................................................................ 34 6.1 Obtencin de la materia Vegetal ................................................... 34 6.2 Formacin de Callos ...................................................................... 34 6.3 Obtencin de los Metabolitos Secundarios ................................. 35 6.3.1 Obtencin de los Extractos ........................................................ 35 6.4 Determinacin de los Metabolitos Secundarios .......................... 36 7. RESULTADOS Y DISCUSIN ............................................................ 37 7.1 Resultados ...................................................................................... 37 7.1.1 Obtencin de la Materia Vegetal ................................................ 37 7.1.2 Formacin de Callos ................................................................... 38 7.1.3 Obtencin de Extractos .............................................................. 39 7.1.4 Determinacin de Metabolitos Secundarios ............................. 40
II UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
7.2 Discusin ........................................................................................ 42 8. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS................................................. 44 8.1 Conclusiones .................................................................................. 44 8.2 Perspectivas ................................................................................... 44 9. FUENTES CITADAS ............................................................................ 45 10. ANEXOS ............................................................................................ 50 11. GLOSARIO ........................................................................................ 54
III UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
INDICE DE FIGURAS Figura 1. Organigrama de la universidad de las Amricas Puebla. ................... 6 Figura 2. Mapa de Ubicacin de la Universidad de las Amricas Puebla. ......... 7 Figura 3. Funcin de los RCV en cultivos de clulas y tejidos vegetales. ...... 11 Figura 4. Fases del crecimiento Vegetal. ........................................................ 17 Figura 5. Propiedades de los disolventes ms comunes. ................................ 21 Figura 6. Partes fundamentales en las que se compone un HPLC. ................ 23 Figura 7. Representacin Cromatografca dela fase inversa. .......................... 24 Figura 8. Heterotheca inuloides y Gnaphalium Oxyphyllum. .......................... 37 Figura 9. Formacin de Callos......................................................................... 39 Figura 10. Maceracin. .................................................................................... 40 Figura 11. Muestra lista para HPLC. ............................................................... 41 Figura 12. Anlisis de HPLC para H. inuloides. ............................................... 41 Figura 13. Anlisis de HPLC para G. Oxyphyllum. .......................................... 42
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AGRADECIMIENTOS
Al creador por haberme guiado en cada uno de los pasos que di, algunos buenos y algunos malos pero al final de todo el objetivo se cumpli. A mis padres por ser pilares fundamentales durante toda mi vida, por haberme llevado por el camino del bien y estar conmigo siempre. A mis amigos por esas voces de conciencia en todo momento por todos aquellos momentos de diversin y mas A mis pachis Cesar, Jos, Oscar y Tonys por que mas que ser amigos son como mis hermanos ms a ya de las voces de conciencia fueron los que estuvieron en las buenas en las malas A mi alma mater la universidad Tecnolgica de Xicotepec de Jurez, en especial a la M. en C. Alma Yolanda Vzquez Snchez por ser pieza clave en la realizacin de este trabajo, asesorndome, aconsejndome y dndome nimos para seguir A la Fundacin Universidad de las Amricas Puebla por brindarme esta magnifica oportunidad de realizar este trabajo, tambin al Dr. en C. Eugenio Snchez Arreola por el asesoramiento y los conocimientos obtenidos. Cabe destacar mi ms sincero agradecimiento a mis compaeros del laboratorio de investigacin fitoquimica, Adriana, Priscilla Osnat, Ana y Fanny por el apoyo y la entraable amistad creada durante mis 4 meses de estancia en UDLAP.
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DEDICATORIAS
A mis padres y Hermana mi gratitud eterna A mi Familia por el apoyo incondicional A mis profesoras, Alma, Zaira y Marcela mi admiracin y gratitud A mis amigos Coco, Mariela, Lupita, Cesar, Oscar y Jos Antonio por el apoyo incondicional y por estar siempre a mi lado A Carmen Animas Hernndez por ensearme que: los Caminos de Dios son Misteriosos pero Siempre a Nuestro Favor.
VI UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
CARACTERIZACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS A PARTIR DE CELULAS VEGETALES

Vargas Villegas Jairo-Arturo , Vzquez Snchez Alma-Yolanda , Snchez Arreola Eugenio
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I.
RESUMEN
Actualmente el cultivo in-vitro es una de las herramientas biotecnolgicas ms importantes ya que gracias a l se han podido rescatar especies vegetales en peligro de extincin. Gracias a estos mtodos de propagacin la medicina tradicional mexicana ha retomado un importante papel en la ciencia actual ya que resulta ser ms viable la sustraccin e identificacin de principios biolgicamente activos. Si bien el gordolobo (G. Oxyphyllum) y rnica (H. Inuloides) no estn en peligro de extincin, resulta interesante el estudio de sus partes activas ya que ambas plantas poseen una gama de beneficios extraordinaria ya sea como desinflamatorio y cicatrizante (H. inuloides), y para afecciones respiratorias para (G. oxyphyllum). Por lo cual el presente trabajo tuvo como objetivos inducir la callogenesis de ambas especies vegetales utilizando tcnicas de desinfeccin como la asepsia superficial y microbiolgica, as como la utilizacin de
reguladores de crecimiento (auxinas, citocininas) vegetal, puntos clave para la induccin a callo. Los resultados obtenidos indican que la auxina cido -
naftalenactico induce callogenesis en explantes de hojas de plantas silvestres adultas de H. inuloides y esta auxina en combinacin con las citocininas cinetina y 6-bencilaminopurina induce callogenesis en G. oxyphyllum. Obteniendo as, el establecimiento del cultivo in vitro de callos de H. inuloides y G. oxyphyllum a partir de explantes de hojas de plantas silvestres adultas.
Palabras clave: Cultivo in-vitro, G. Oxyphyllum, H. Inuloides, Reguladores de Crecimiento Vegetal, HPLC
Jairo Arturo Vargas Villegas. T.S.U. en Qumica rea en Biotecnologa, Universidad Tecnolgica de Xicotepec de Jurez. Domicili conocido col. Tierra Negra C.P. 73080. Xicotepec de Jurez Puebla. E-mail: lordfiere@hotmail.com 2 Asesor Interno de Estada. M. en C. Alma Yolanda Vzquez Snchez. Profesor de Asignatura de la carrera de T.S.U. en Qumica rea Biotecnologa, T.S.U. Procesos Agroindustriales, Universidad Tecnolgica de Xicotepec de Jurez. Domicilio conocido col. Tierra Negra CP. 73080. Xicotepec de Jurez Puebla. 3 Asesor Externo Doctor en Ciencias Eugenio Snchez Arreola, profesor investigador y jefe del departamento de investigacin fitoquimica del dapartamento de ciencias qumico Biolgicas, Universidad de las Amricas Puebla. Santa Catarina Mrtir, Cholula Puebla C.P. 72810,San Andrs Cholula Puebla.
VII UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
CARACTERIZACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS A PARTIR DE CELULAS VEGETALES

Vargas Villegas Jairo-Arturo , Vzquez Snchez Alma-Yolanda , Snchez Arreola Eugenio
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II. ABSTRACT
At present the culture tissue is one of the most important biotechnological tools and because of this, plant species in danger of extinction have been rescued. As a result of these extended methods, Mexican traditional medicine has regained an important role in current research since the subtraction and identification of biologically active principles turns out to be more feasible. Although Gordolobo (G. Oxyphyllum) and rnica (H. Inuloides) plants are not in danger of extinction, the study of their active parts turns out to be interesting since according to the traditional Mexican medicine both plants possess a great amount of extraordinary benefits such as anti-inflammatory, cauterizer (H. inuloides), and against respiratory affections (G. oxyphyllum). That is the reason that the present work had the purpose to induce the callogenesis of both vegetable species using disinfection techniques such as superficial and microbiological asepsis, as well as the utilization of plant growth regulators like auxins and citocininas, which they are key points to callosity induction. The obtained results indicated that the auxin acid -naftalenacetic induces callogenesis in wild adult plant leave implants of H. inuloides and this auxin in combination with the citocininas cinetina and 6-bencilaminopurine induces callogenesis in G. oxyphyllum. Concluding this way the establishment of in vitro callosity cultivation of H. inuloides and G. oxyphyllum from wild adult plant leave implants.
Keywords: culture tissue, G. Oxyphyllum, H. Inuloides, plant growth regulators, HPLC
Jairo Arturo Vargas Villegas. T.S.U. en Qumica rea en Biotecnologa, Universidad Tecnolgica de Xicotepec de Jurez. Domicili conocido col. Tierra Negra C.P. 73080. Xicotepec de Jurez Puebla. E-mail: lordfiere@hotmail.com 2 Asesor Interno de Estada. M. en C. Alma Yolanda Vzquez Snchez. Profesor de Asignatura de la carrera de T.S.U. en Qumica rea Biotecnologa, T.S.U. Procesos Agroindustriales, Universidad Tecnolgica de Xicotepec de Jurez. Domicilio conocido col. Tierra Negra CP. 73080. Xicotepec de Jurez Puebla. 3 Asesor Externo Doctor en Ciencias Eugenio Snchez Arreola, profesor investigador y jefe del departamento de investigacin fitoquimica del dapartamento de ciencias qumico Biolgicas, Universidad de las Amricas Puebla. Santa Catarina Mrtir, Cholula Puebla C.P. 72810,San Andrs Cholula Puebla.
VIII UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
1. INTRODUCCIN
El concepto original de cultivo de tejidos vegetales se ha extendido moderadamente para abarcar tanto el cultivo asptico de tejidos como el de clulas y rganos, dentro de un grupo de tcnicas que se fundamentan en varios principios. Entre estos principios, los mas importantes sin duda son la totipotencialidad celular propuesta por Haberlandt (1902) y la hiptesis del balance hormonal sugerida por Skoog et al. (1957). Aun cuando estos principios han sido cuestionados por diferentes autores como Trewavas (1981,1982) y Firn (1980) todos ellos parecen encontrar cierto grado de fundamentacin en la mayora de los modelos biolgicos empleados en el estudio de la morfognesis in-vitro. Las tcnicas de cultivos aspticos han contribuido no solo a un mejor
entendimiento de los eventos de diferenciacin celular sino al aprovechamiento de tales eventos en la explotacin ms eficiente de las plantas. En este ultimo aspecto vale la pena mencionar los siguientes usos de las tcnicas de cultivo invitro: A) Mejoramiento gentico; B) obtencin de plantas libres de virus y de otros patgenos; C) conservacin de germoplasma; D) micropropagacin. (Murashige, 1974). En la actualidad el cultivo in-vitro se practica con xito en especies hortcolas (Murashige, 1978), ornamentales (Hughes, 1981), y ms recientemente en especies leosas (Thorpe, 1983). En algunas especies esta metodologa ha mostrado importantes ventajas en comparacin con los sistemas convencionales de propagacin; los ms importantes son: Incremento acelerado del nmero de plantas derivadas por genotipo. Reduccin del tiempo de multiplicacin. Posibilidad de reproducir grandes cantidades de plantas en una superficie reducida, a bajos costos y tiempo econmicamente costeables. Mayor control de la sanidad del material que se propaga.
1 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Facilidad de transporte del material in vitro de un pas a otro, con menos restricciones aduanales. Posibilidad de multiplicar rpidamente una variedad de la cual solo existen pocos individuos. (Murashige, 1974).
La reciente re-valoracin del conocimiento tradicional abri una puerta para el rescate y promocin de la medicina tradicional, incluyendo modelos tradicionales de dichas practicas con nuevos modelos que incluyen estudios fotoqumicos avanzados para la sustraccin e identificacin de los principios biolgicamente activos y as finalmente de ponerla al da, mantenerla como una prctica
socialmente viva, darle reconocimiento oficial pleno, imprimirle una actualidad tcnica eficiente, y de integrarla como un mtodo pleno de posibilidades salutferas en la prctica de la medicina contempornea.
rnica Mexicana (Heterotheca inuloides) Heterotheca inuloides es la planta medicinal con nombre popular de rnica ms conocida y utilizada en Mxico; en Mxico por lo menos se les conoce con el nombre de rnica a 15 plantas diferentes. El gnero Heterotheca contiene
alrededor de siete especies nativas de Norteamrica, incluyendo Mxico. Pertenece a la familia de las Compuestas (Asteraceae). Es una de las plantas medicinales ms utilizadas en Mxico. Su uso medicinal es muy similar a la especie europea (Arnica Montana), se preparan numerosas pomadas y ungentos para aplicarse externamente en caso de golpes e inflamaciones. Los antiguos mexicanos la utilizaban frecuentemente para aplicaciones en forma de cataplasma en hemorroides, rozaduras en bebes, ronchas y llagas de cualquier origen. (Martnez, 1969).
Gordolobo (Gnaphalium Oxyphyllum) Planta mexicana de amplia distribucin, existen ms de cuarenta especies y crecen naturalmente en las montaas elevadas (Baytelman B. 1980). El gordolobo es conocido tambin con el nombre nhuatl de tzonpotnic. Esta especie es utilizada en varias regiones de Amrica por ser de mucha utilidad en la medicina tradicional. Existen otras plantas del mismo nombre, poco diferentes en forma, con casi las mismas propiedades. Es una planta que mide entre 35-75 cm. De altura su tallo es velludo, sus hojas son angostas, largas, verdes por la parte de arriba, el envs es velludo y blanquizco, sus flores son de color blanco en forma de estrella localizadas en la punta del tallo y no es espinosa (Argueta et al, 1994). Es utilizada en las afecciones de las vas respiratorias como expectorante, generalmente en tos seca infecciones de garganta, gripa, asma, bronquitis, en los trastornos gstricos (ulceras, dolor de estomago, parsitos), en heridas, quemaduras, clicos, dolores generalizados en la teraputica del cncer, hidropesa, citica y lumbago siendo utilizada toda la planta incluidas las flores. Su distribucin es amplia, comprendiendo los estados de Baja California, Durango, Hidalgo, Michoacn, Morelos, Puebla, Sonora y Tlaxcala ya que la situacin
climatolgica de estos estados es favorable creciendo en los climas clidos, semiclido y templados entre los 20 y 1875 Metros Sobre el Nivel del Mar
(MSNM). Su crecimiento se desarrolla en suelos de cultivo, riego y temporal as como en cualquier suelo (Argueta et al, 1994; Martnez, 1979).
2. GENERALIDADES DE LA UNIVERSIDAD DE LAS AMRICAS PUEBLA

La Universidad de las Amricas Puebla ofrece programas de estudio en una gran variedad de reas del conocimiento a travs de cinco escuelas: Artes y Humanidades (EDAH), Ciencias (EDEC), Ciencias Sociales (EDCS), Ingeniera (EDEI) y la de Negocios y Economa (EDNE). En total, se ofrecen 48 programas de licenciatura, 30 programas de maestra (incluidas 10 maestras por Internet) y 4 programas de doctorado. Asimismo, cuenta con 300 convenios de cooperacin internacional, que incluyen programas de doble diploma con universidades de alto prestigio tanto de Europa como de Estados Unidos, en donde los alumnos reciben el diploma de la UDLAP as como el de la universidad anfitriona. Actualmente, la UDLAP se encuentra clasificada como Institucin de Nivel VI, el mximo reconocimiento que otorga la Southern Association of Colleges and Schools (SACS). Esta clasificacin acredita que los estudios realizados en la UDLAP cumplen a plenitud con los ms altos estndares de calidad internacional. La UDLAP participa activamente en diversas asociaciones universitarias nacionales e internacionales y mantiene con ellas una comunicacin permanente. De estas asociaciones recibe informacin y asesora para todo tipo de procesos de la institucin. La Universidad busca la excelencia acadmica de sus egresados y una alta calidad en las investigaciones que realizan sus profesores e investigadores. En tal sentido, orienta sus esfuerzos a brindar un servicio educativo de alto nivel, lograr la formacin integral de sus estudiantes, mantener un ambiente multicultural basado en el respeto y promover la comprensin internacional. Dado su carcter, se organiza legalmente como una fundacin. Todos sus programas acadmicos guardan la debida acreditacin ante la Secretara de
Educacin Pblica y tienen plena validez oficial por parte de las autoridades educativas del Estado de Puebla. Asimismo, sus programas estn reconocidos por diversas universidades de Amrica Latina, Europa y el sistema educativo de los Estados Unidos de Norte Amrica. El estudiante puede realizar parte de sus estudios fuera del pas y ampliar sus horizontes o acceder a la prctica profesional en el extranjero. De esta manera, el mbito de formacin y desarrollo profesional ofrecido por la universidad es ms extenso y variado que el de otros centros educativos de nivel superior en la Repblica.
2.1.
MISIN
Formar profesionistas bien informados, crticos, creativos, innovadores y altamente capaces en lo tcnico, pero sobre todo, conscientes de la alta responsabilidad social que les exige lograr una distribucin equitativa de los beneficios que la globalizacin produce.
2.2.
VISIN
Ser reconocida mundialmente como la institucin lder en programas acadmicos, cientficos, culturales y de propuesta de poltica pblica que respondan a los retos presentados por la globalizacin
2.3.
ORGANIGRAMA DE LA INSTITUCIN
Fig.1 Organigrama institucional UDALP . Tomado de http://www.udlap.mx/internas/html/esp/organigrama2.aspx#
2.4.
UBICACIN
La universidad de las americas puebla se encientra ubicada en la ex hacienda Santa Catarina Martir,San Andrs Cholula,Puebla C.P 728010.
Fig 2. Ubicacin . tomado de : http://www.udlap.mx/internas/mapaudlap.aspx
El presente trabajo fue realizado en el laboratorio de investigacion fitoquimica del departamento de ciencias quimico biologicas de la Universidad de las Amricas Puebla, bajo la direccion del Dr Eugenio Sanchez Arreola profesor investigador titular.
3. REVISION DE LITERATURA
3.1.
CULTIVO DE CLULAS Y TEJIDOS VEGETALES
Las plantas son fuente de diversas sustancias de inters para el hombre, en las que se incluyen compuestos llamados metabolitos secundarios que son utilizados en la industria como colorantes, saborizantes, fragancias y frmacos, entre otros. De manera general, en las plantas, la acumulacin de estos compuestos ocurre slo en ciertas pocas del ao y en algunos rganos, lo que puede limitar su abastecimiento. Por ello, el cultivo de clulas y tejidos vegetales (CCTV) ha sido considerado como una alternativa biotecnolgica para la produccin de metabolitos secundarios (Verpoorte et. al., 2002). Despus del desarrollo comercial para la produccin de la chiconina con cultivos de clulas de Lithospermum erytrorhizon, varios son los trabajos sobre el establecimiento de cultivos de clulas y tejidos vegetales y la identificacin de compuestos con potencial para su produccin industrial (Zhao et al., 2005). El CCTV es un conjunto de tcnicas que presenta en comn el hecho de que un explante (semilla, rgano, tejido o clula viva) se inocula aspticamente en un medio artificial de composicin qumica definida y se incuba en condiciones controladas. Lo anterior se basa en el principio de totipotencia celular, el cual establece que a partir de una clula vegetal, es posible regenerar un individuo frtil con las mismas caractersticas del individuo original, manteniendo su informacin gentica para realizar todas las funciones de una planta completa (Kieran et al., 1997). Inicialmente las tcnicas de cultivo de clulas y tejidos vegetales fueron concebidas y empleadas como herramienta de investigacin bsica, para estudiar la bioqumica y fisiologa vegetal. Sin embargo, estas tcnicas evolucionaron a tecnologas comerciales para la micropropagacin, el mejoramiento gentico de
Especies y la produccin de metabolitos secundarios de inters industrial (Rodrguez-Monroy et al., 1999). El CCTV ofrece varias ventajas sobre la recoleccin de plantas silvestres y el desarrollo de cultivos en campo, entre las cuales se pueden mencionar: 1) La independencia de las condiciones ambientales; 2) Establecer condiciones para la obtencin de productos homogneos; 3) Establecer un sistema de produccin definido, en el lugar donde se requiere del producto; 4) Obtencin de productos en menor tiempo (Doran, 1999; Sajc et al., 2000). Para establecer un cultivo vegetal in vitro, se parte de la seleccin de la planta de inters y de la colecta de material biolgico (ejemplares completos y semillas). La eleccin del explante apropiado para el establecimiento de cultivos de clulas y tejidos vegetales est basada en el objetivo del cultivo. Si lo que se quiere es obtener plntulas aspticas (libres de virus), el explante ideal es el meristemo (dependiendo de la especie de 0.2 0.5 mm de longitud) o la germinacin de semillas en condiciones aspticas. Para inducir respuesta de callognesis y/o morfognesis, las clulas meristemticas de los tejidos obtenidas de plntulas en condiciones aspticas, se hacen crecer de forma desdiferenciada (masa amorfa denominada callo) o diferenciada (organognesis o embriognesis), mediante la aplicacin de reguladores de crecimiento vegetal (CIAT, 1991).
3.1.1. REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL Los reguladores de crecimiento vegetal (RCV) son sustancias orgnicas que a bajas concentraciones influyen en los procesos fisiolgicos de las plantas (Fig. 1)
Fig. 3: Funcin de los reguladores de crecimiento vegetal en los cultivos de clulas y tejidos vegetales. (Frankenberger y Arshadm, 1995). Los RCV cuando son producidos por las plantas (endgena) se les denominan fitohormonas, las cuales actan como mensajeros qumicos que regulan el crecimiento y desarrollo de la planta. Tambin regulan las respuestas a las seales ambientales (Morgan, 1990). El trmino regulador de crecimiento vegetal se refiere a un compuesto sinttico o natural que se aplica (exgena) para alterar el crecimiento y desarrollo de las plantas o cultivos de clulas y tejidos vegetales. El trmino fitohormona y regulador de crecimiento vegetal se utiliza
alternativamente, particularmente cuando se refiere a auxinas, citocininas, giberelinas y cido abscsico (Frankenberger y Arshadm, 1995).
3.1.2. OBTENCIN DE CALLOS Las clulas vegetales poseen dos caractersticas que las hacen especiales: la totipotencia, capacidad inherente de una clula para generar una planta completa y la desdiferenciacin, capacidad para volver al estado meristemtico de una clula diferenciada, situacin que no ocurre en clulas animales. Para que una clula vegetal exprese su totipotencia debe experimentar una desdiferenciacin y luego una nueva diferenciacin de acuerdo a las condiciones ambientales del cultivo. Esto puede lograrse si se colocan partes pequeas de un tejido u rgano de la planta (explante) en un medio de cultivo apropiado con los nutrientes y reguladores de crecimiento, los cuales manipulados convenientemente pueden generar callos o desarrollar yemas o embriones (Skoog y Miller, 1957). Los callos se pueden definir como masas de tejido parenquimtico indiferenciado en crecimiento activo. Son agregados celulares amorfos que surgen del crecimiento desorganizado de explantes sobre un medio de cultivo especfico en condiciones aspticas. Estos agregados celulares no se corresponden con ningn tejido particular de la planta completa. El trmino cultivo de callos fue escogido debido a que la proliferacin celular se pensaba era inducida por la herida del explante durante la escisin. Sin embargo se ha encontrado que es inducido por reguladores de crecimiento de la planta en el medio de cultivo slido. Las hormonas y los reguladores de crecimiento en general son los responsables de la distribucin de los compuestos que la planta biosintetiza y que determinan el crecimiento activo de todos los rganos (Whahby, 2007); su manera de actuar es debida a una respuesta compleja sobre factores como la mitosis, polarizacin, formacin de los primordios y desarrollo de los meristemos. Una vez formados los callos, puede presentarse una variacin somaclonal, normalmente durante los repetidos subcultivos de mantenimiento de los callos. Este es un perodo crtico porque debido a esta variacin somaclonal la produccin de metabolitos puede variar de subcultivo en subcultivo (Bourgaud et al., 2001). Despus de cierto
Tiempo se alcanza una estabilidad gentica y cada callo puede ser considerado un agregado celular homogneo. Uno de los usos principales del cultivo de callos es la obtencin de suspensiones celulares. En muchos casos, para obtener suspensiones celulares finas, es adecuado aumentar la friabilidad (callo disgregado y esponjoso) del tejido calloso por incremento de la concentracin de la auxina o disminucin de la citoquinina en el medio de crecimiento. Dependiendo de la especie utilizada el ciclo de subcultivo a partir de callo es de 4 semanas de acuerdo con la especie. Callos con crecimientos ms rpidos debern subcultivarse cada dos semanas para renovacin de las clulas. Para crecimientos muy lentos no es conveniente demorar los subcultivos por ms de seis semanas.
3.1.3. MEDIOS DE CULTIVO
Son muchos los medios de cultivo utilizados en suspensiones celulares vegetales que suministran los elementos esenciales para el desarrollo y mantenimiento celular. El medio de cultivo ms utilizado es el medio MS; ste tiene altos niveles de nitrgeno inorgnico y de sales minerales, mientras que otras formulaciones, como NN (Nietsch et al., 1967) tienen niveles muy bajos de nitrgeno inorgnico y el medio White (1943) tiene bajo contenido de sal. En general, hay una tendencia a usar niveles ms bajos de NH4+ que de NO3- en medios para cultivos de tejidos vegetales. La cantidad de NH4+ en el medio MS es casi la mitad que de NO3-, mientras otras formulaciones, tales como SH (Schenk y Hildebrandt, 1972), B5 (Gamborg et al., 1968) y GD (Gresshoff y Doy, 1974), contienen niveles an ms bajos de NH4+. La fuente de carbono comnmente utilizada es la sacarosa en concentraciones de 3%, este azcar es fosforilado y luego forma un compuesto complejo con una molcula transportadora que facilita su ingreso a la clula a
travs de la membrana plasmtica (Vsquez y Torres, 1995). La adicin de vitaminas mejora ostensiblemente el crecimiento de los cultivos vegetales y las hormonas son necesarias para el alargamiento, crecimiento y divisin celular. 3.1.3.1. MACRONUTRIENTES
Los macronutrientes proveen los seis principales elementos, nitrgeno (N), fsforo (P), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg) y azufre (S), requeridos para el crecimiento de las plantas. La concentracin ptima de cada nutriente para alcanzar las mximas ratas de crecimiento vara considerablemente entre especies. Los medios de cultivo deben contener suficiente nitrgeno inorgnico para un adecuado crecimiento de la clula vegetal. Las clulas vegetales pueden crecer solo en nitratos, pero resultados considerablemente mejores son obtenidos cuando el medio contiene tanto nitrato como amonio (Roca y Mrogiski, 1991). Los nitratos son normalmente suministrados en el intervalo de 25-40 mM, mientras que concentraciones tpicas de amonio varan entre 2 y 20 mM. Concentraciones superiores a 8 mM pueden ser letales para el crecimiento celular de algunas especies. Las clulas pueden crecer en un medio de cultivo conteniendo amonio como nica fuente de nitrgeno, si uno o ms de los cidos del ciclo del cido tricarboxlico, como citrato, succinato o malato, estn presentes en
concentraciones de aproximadamente 10 mM. Cuando las fuentes de nitrgeno, nitrato y amonio, estn presentes en el medio de cultivo, los iones amonio sern utilizados ms rpidamente que los iones nitrato. El potasio es requerido para el crecimiento celular de muchas especies vegetales. La mayora de los medios de cultivo contienen potasio en forma de nitrato o cloruro, a concentraciones de 20-30 mM. Las concentraciones ptimas de P, Mg, S y Ca varan entre 1-3 mM cuando son satisfechos todos los otros requerimientos para el crecimiento celular; en ocasiones son necesarias concentraciones ms altas si existen deficiencias en otros nutrientes.
3.1.3.2.
MICRONUTRIENTES
Los minerales esenciales para el crecimiento de tejidos y clulas vegetales incluyen hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), boro (B), cobre (Cu), y molibdeno (Mo). El hierro puede ser el ms crtico de todos los minerales. Pueden ser usados citrato y tartrato de hierro en medios de cultivo, pero estos compuestos son difciles de disolver y frecuentemente precipitan luego de que los medios son preparados. El empleo del complejo EDTA-hierro puede superar este problema; sin embargo estos complejos no son completamente estables, particularmente en cultivo lquido, y pueden precipitar luego de unos pocos das. Cobalto (Co) y yodo (I) tambin pueden ser adicionados a ciertos medios, pero no se han establecido los requerimientos estrictos de estos elementos para el crecimiento celular. Sodio (Na) y cloro (Cl) tambin son utilizados en algunos medios de cultivo pero no son esenciales para el crecimiento celular. Cobre (Cu) y Co son adicionados normalmente a medios de cultivo en concentraciones de 0.1 M, Fe y Mo a 1 M, I a 5 M, Zn a 5-30 M, Mn a 20-90 M, y B a 25-100 M. Sin embargo, el crecimiento est ms limitado por las otras variables, especialmente por las hormonas, que por los microelementos (Roca y Mrogiski, 1991). 3.1.3.3. VITAMINAS
Las vitaminas son requeridas por las plantas como catalizadores en varios procesos metablicos. Las clulas y tejidos vegetales cultivados in vitro, requieren algunas vitaminas y se consideran factores muy importantes en el crecimiento celular. Las vitaminas ms frecuentemente utilizadas en medios de cultivo de clulas y tejidos vegetales incluyen tiamina (B1), cido nicotnico, piridoxina (B6), y myo-inositol. La tiamina es indispensable para los cultivos celulares en concentraciones de 0.1 a 10.0 mg/L. El cido nicotnico es utilizado normalmente en concentraciones de 0.1-5.0 mg/L; la piridoxina es utilizada entre 0.1-10.0 mg/L. La vitamina que es bsicamente requerida por todas las clulas vegetales para el crecimiento es la tiamina. El cido nicotnico y la piridoxina son con
frecuencia adicionados a los medios de cultivo, pero no son esenciales para el crecimiento celular en muchas especies. El myo-inositol es comnmente incluido en muchas soluciones de vitaminas ya que ha mostrado estimular el crecimiento en ciertos cultivos de clulas. Su presencia en el medio de cultivo no es esencial, pero en pequeas cantidades estimula el crecimiento celular en muchas especies. Otras vitaminas como biotina, cido flico, cido ascrbico, cido pantotnico, vitamina E (tocoferol), riboflavina, y cido p-aminobenzoico han sido incluidas en algunos medios de cultivo. El requerimiento de estas vitaminas por cultivos de clulas vegetales es generalmente despreciable, y no son consideradas factores limitantes del crecimiento. Son generalmente adicionadas al medio de cultivo solo cuando la concentracin de la tiamina est por debajo del nivel deseado o cuando es deseable crecer clulas a muy bajas densidades de poblacin. (Villegas et. Al. 1992).
3.2.
CINTICA DE CRECIMIENTO CELULAR
Para mantener una suspensin celular en crecimiento continuo, es necesario identificar el momento apropiado en que los componentes del medio de cultivo se agotan y deben ser renovados, as como remover las sustancias txicas excretadas por las clulas durante su metabolismo. Por tanto se hace necesario, bien sea, un subcultivo en medio fresco o un cambio de determinado volumen del medio de cultivo para continuar los procesos fisiolgicos normales. La etapa apropiada puede ser determinada a partir de una curva de crecimiento celular con respecto al tiempo, que depende a su vez de la cantidad de inculo utilizado para iniciar las suspensiones y de la composicin del medio de cultivo. (Hurtado 1988). La curva de crecimiento tpica de clulas en suspensin presenta las siguientes fases, (Figura 4):
Figura 4. Fases del crecimiento celular. I Latente, II Aceleracin, III Exponencial, IV Desaceleracin, V Estacionaria, VI Muerte. (Hurtado 1988). Dependiendo de la especie, la mayora de los cultivos de clulas vegetales en suspensin alcanzan su mxima densidad celular entre 18 y 25 das, aunque puede haber cultivos bastante activos, que la alcanzan entre los 6 y 25 das (Hurtado 1988). 3.3. METABOLITOS SECUNDARIOS
Los productos naturales, llamados metabolitos secundarios, son compuestos generalmente de bajo peso molecular, restringidos con frecuencia a familias o a gneros especiales de plantas. No son importantes para el metabolismo primario de la planta, pero en muchos casos son de gran importancia para la supervivencia de la planta en su ambiente; generalmente se forman despus de que el crecimiento ha cesado (fase estacionaria) de all que una de las estrategias utilizadas es el cultivo en dos fases, una para el crecimiento y otra para la produccin. (Ibrahim et al., 2007). 3.3.1. INDUCCIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS Para que las tcnicas de cultivo de clulas vegetales lleguen a ser econmicamente viables, es importante desarrollar mtodos que permitan la obtencin de cantidades apreciables de los compuestos tiles de las clulas cultivadas en suspensin. Hasta este momento, varias estrategias se han
desarrollado para mejorar la produccin de metabolitos secundarios con el empleo de clulas vegetales. Las clulas del cultivo de tejidos acumulan normalmente grandes cantidades de compuestos secundarios solamente bajo condiciones especficas. Eso significa que la maximizacin de la produccin y de la acumulacin de metabolitos secundarios por las clulas cultivadas de tejidos vegetales requiere la manipulacin de los parmetros del ambiente y el medio de cultivo, seleccionar lneas celulares de alta produccin, el medio precursor alimenticio y la elicitacin. Numerosas investigaciones han sido realizadas para estudiar el efecto de algunos factores fsicos y qumicos tales como el pH, concentracin de los nutrientes en el medio de cultivo, empleo de fitohormonas, temperatura, aireacin, luz y agitacin, sobre el crecimiento de clulas en suspensin y la produccin de metabolitos secundarios (Bourgaud et al., 2001) en diferentes especies vegetales; especficamente se ha estudiado el efecto de algunos de los factores mencionados anteriormente (Ibrahim et al., 2009). Aunque la mayora de los factores mencionados han sido exitosos para mejorar y aumentar la produccin de metabolitos secundarios en diferentes especies vegetales, los mejores resultados obtenidos para la transformacin de plantas superiores, especialmente de Nerium oleander, es el derivado del mecanismo inductor de tumores de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes (Ibrahim et al., 2007). Los cultivos de clulas u rganos transformados tienen el potencial de incrementar la produccin de metabolitos secundarios. 3.4. CROMATOGRAFIA
La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de los componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos. a) Retencin. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un slido o un lquido anclado a un soporte slido.
b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase mvil, que puede ser un lquido o un gas. El fenmeno de migracin de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase estacionaria, impulsados por la fase mvil, recibe el nombre de elucin. La mezcla a separar se deposita sobre la fase estacionara, mientras que la mvil atraviesa el sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad, dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. (Koh, 2006). 3.4.1. TIPOS DE CROMATOGRAFA. Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase mvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografa: a) Cromatografa slido-lquido. La fase estacionaria es un slido y la mvil un lquido. b) Cromatografa lquido-lquido. La fase estacionaria es un lquido anclado a un soporte slido. c) Cromatografa lquido-gas. La fase estacionaria es un lquido no voltil impregnado en un slido y la fase mvil es un gas. d) Cromatografa slido-gas. La fase estacionaria es un slido y la mvil un gas.
Segn el tipo de interaccin que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase mvil y estacionaria podemos distinguir entre: a) Cromatografa de adsorcin. La fase estacionaria es un slido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar. b) Cromatografa de particin. La separacin se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y mvil, que son ambas lquidas. c) Cromatografa de intercambio inico. La fase estacionaria es un slido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase mvil. (ASTM, 1979) 3.4.2. CROMATOGRAFA LQUIDO-SLIDO (CLS). La fase estacionaria est constituida por un slido polar poroso y que esta finamente granulado. La superficie especfica contiene centros polares aptos para la adsorcin de las molculas polares presentes en la fase mvil. Al disminuir el tamao de las partculas, el nmero de centros activos por unida es mayor, y la capacidad de adsorcin se incrementa. El adsorbente ms utilizado es gel de slice aunque tambin se emplea almina activada. En el caso del gel de slice la interaccin se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si, y los grupos funcionales polares de los compuestos orgnicos. (ASTM, 1979). La fase mvil est constituida por un disolvente en el que los componentes de la mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. La velocidad de elucin de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase mvil y se puede utilizar un gradiente de polaridad aumentando con el tiempo la proporcin del disolvente ms polar. La retencin se realiza en base a la competencia que se establece entre el soluto a separar (S) y las molculas de la fase mvil (M) por
adsorberse a los centros activos polares (X) de la fase estacionaria. As las molculas de soluto se adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y van siendo desplazados por las molculas polares presentes en la fase mvil. (ASTM, 1979)
Fig. 5. Propiedades de los disolventes ms comunes. (ASTM, 1989)

3.4.3. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PRESIN (HPLC) La cromatografa engloba a un conjunto de tcnicas de anlisis basadas en la separacin de componentes de una mezcla y su posterior deteccin. Las tcnicas cromatogrficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido, o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra con un flujo constante de presin proporcionado por una bomba, hasta llegar al punto donde es introducida la muestra. Siguiendo el flujo de presin la lleva a una columna donde se encuentra la fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. (Koh, 2006). Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase estacionaria y con la fase mvil. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Despus de haber pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado, pasan por un detector que genera una seal que puede depender de la concentracin y del tipo del compuesto, sus partes lo describe la figura 6. El papel esencial de las bombas es impulsar a la fase mvil con presin y flujo constante, el proceso de inyeccin de la muestra en la actualidad es automtica, las columnas que se utilizan normalmente son de acero inoxidable y los detectores su papel fundamentalmente es de indicar el momento de aparicin de los diferentes componentes que constituyen la muestra, calificarlo cuantitativamente como cualitativamente. (Koh, 2006).
Figura 6. Partes fundamentales en las que se compone un HPLC. Tomado de: Skoog, Leary. 2000. El uso de la cromatografa ha demostrado ser muy significativo para el estudio del cido lipico, un tipo de cromatografa utilizado fue el HPLC-fase inversa (figura 4), porque trabaja con las polaridades de los compuestos que se van analizar en el futuro, ya que la fase mvil es mas polar que la fase estacionaria. La fase mvil es agua con un componente menos polar como puede ser: agua/metanol,
agua/ACN. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, tal es el caso del cido lipico que es un compuesto apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente. (Koh, 2006). En este tipo de estudios, los proveedores recomiendan que se filtre y se desgasifique todo componente antes de ser introducido a un sistema de HPLC, esto con el propsito de evitar daos futuros. En el anlisis de cido lipico todos los solventes, el agua de HPLC, junto con la fase mvil deben ser pasados a travs de un filtro de 4 y desgasificados al bajo vaco, antes de su uso. (Koh, 2006). Se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar y una fase estacionaria apolar. El efecto hidrofobico disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil.
Fig. 7 Representacin de cromatografa de fase inversa. Tomado de: Skoog, Leary. 2000.
3.4.3.1.
PROCESO DE DERIVATIZACIN
Derivatizacin pre-columna. Esta acoplada con cromatografa de fase reversa en lugar de cromatografa de intercambio catinico, fue originalmente introducida como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor velocidad de anlisis, las ventajas de la metodologa de la derivatizacin precolumna incluyen simplicidad, velocidad y alta sensibilidad. Por ello, si se requiere mxima sensibilidad de deteccin, un reactivo fluorescente combinado con la derivatizacion pre-columna es el mtodo ms indicado, Cmo desventaja est la necesidad de garantizarse la completa reaccin del reactivo derivatizante y la posibilidad de interferencia con la separacin por exceso del reactivo, el medio de reaccin o la produccin de diferentes derivados de un componente. Adems la estabilidad del derivado puede ser un importante factor durante la derivatizacin pre-columna, la demora entre la derivatizacin y la inyeccin llega a ser fundamental para los resultados obtenidos. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. (Snyder, 1997).
3.5.
ANTECEDENTES
El rnica mexicana (Heterotheca inuloides) es una planta de 1 m de altura con pelos en el tallo. Las hojas a veces son mas largas y anchas. Las flores estn agrupadas en una cabezuela con cerca de 150 flores todas colocadas en un disco, parecidas a las margaritas; las brcteas que rodean la cabezuela estn ordenadas de mayor a menor y son velludas como el tallo. Es originaria de
Mxico. Presente en climas clido, semiclido semiseco y templado desde el nivel del mar hasta los 2400 m y desde los 2000 a los 3100 MSNM. Cultivada en los huertos familiares, asociada a bosques de encino, de pino y bosques tropicales caducifolio y perennifolio, matorral junperos. (Barquin Zamora, 1991). El complejo de plantas medicinales mexicanas conocidas como "rnica" se compone de varias especies de plantas: Heterotheca inuloides, conzattii Mentezlia, pringlei Zexmenia, y especies de Haplopappus. entre otros. La planta de este complejo, Heterotheca inuloides (Asteraceae), comnmente denominado como rnica mexicana, acahual, cuauteteco y xochihuepal, es ampliamente xerfilo, pradera semirida y bosque de
utilizado en medicina popular para el tratamiento tpico de las contusiones y magulladuras y para el tratamiento de las heridas de la piel y lesiones.(Camacho R. 1985). Esta especie es muy valorada y utilizada con frecuencia en diferentes partes de Mxico, (Nicholson M. 1993, Lozoya, et-al 1987).algunos de sus usos son
similares a las de rnica montana. (Willuhn, Rttger 1980). Su principal cualidad medicinal es que acta como cicatrizante, desinfectante, desinflamante, y/o analgsico. Abundan las referencias de su uso en el tratamiento de heridas, lo cual implica colocar las hojas como emplasto o cataplasma, o con el cocimiento de
las hojas y/o ramas, lavar y aplicar fomentos sobre stas. En ocasiones, el cocimiento se hace junto con ramas de gordolobo (sp. n/r), en este caso, adems de realizar el lavado se ponen por un rato las plantas cocidas sobre las heridas y se da un mejoral al paciente; esta curacin se hace durante tres das. O simplemente se esparcen las hojas tostadas y pulverizadas. (Barquin Zamora, 1991). En caso de golpes internos o externos y contusiones, en los que hay dolor, se le usa a manera de t, aunque para stos dos ltimos, tambin se aplica en maceracin o en forma de pomada, que se hace con la planta molida revuelta con manteca. Asimismo, en diversas lesiones cutneas, infectadas o no, como granos, llagas, moretones, ronchas, infecciones y rozaduras de beb, se lavan o se aplican compresas con su cocimiento. Como analgsico en casos de el dolor de lcera, de estmago o de la boca del estmago, de pulmn, (por pulmona), de pecho, muscular, renal (V. dolor de rin) o de reumas, se bebe la infusin de la planta como agua de tiempo, o se emplea en fomentos calientes si se padece dolor de muelas. (Chino, Jacques, 1986). Para problemas gastrointestinales como ardores de estmago, gastritis o lceras, se bebe el cocimiento, ya sea en ayunas o despus de cada alimento. Para tratar lceras del hgado se toma la infusin de las flores y hojas durante un mes, o ms tiempo si continan las molestias; asimismo se usa cuando se tiene sensacin de boca amarga, disentera, piorrea, falta de apetito, para el hgado, limpiar el estmago y descongestionar la vescula. En afecciones respiratorias, como bronquitis, tos, pulmona o dolor de pulmn, se toma la infusin de la planta junto con cuachalalate, durante nueve das. En la atencin del postparto se administra, por va oral, el t elaborado con rnica y raz de capitaneja, mismo que se ocupa cuando se padece hemorragia vaginal, michicahues de mujer (V. cachn) y para propiciar la fertilidad femenina, as como en padecimientos cardiovasculares como almorranas, lceras en las vrices, afecciones del corazn y como tnico cardaco. Se menciona que tambin es til para darlo a los nios que se orinan en la cama,
en padecimientos de los riones, e irritacin de la vejiga, contra el cncer, para los nervios y lavar los ojos. (Gmez, Chong 1985). Qumicamente, el rgano ms estudiado de Heterotheca inuloides, y casi el nico, es la flor. Contiene un aceite esencial en el que se han identificado los sesquiterpenos cadaleno, trihidro-cadaleno, 4-metoxi-iso-cadapeno, calacoreno y epxido de cariofileno.(Bohlman, Zdero 1976). La parte mas estudiada es la flor, para la que se reporta: Aceite esencial: Sesquiterpentenos (cadaleno, trihidro-cadaleno, 4-metoxi-isocadapeno,
calacoreno, epxido de carifileno, 2-3-epoxi-7-hidroxi-beta-calacoreno, 4 hidroxi2-iso-propil-4-7-dimetil-nafa-talenona, 7-hidroxi-3,4dihydrocadeleno, 7-
hidroxicadeleno, beta-cariofileno, beta-catiofileno 4,5-alfa-oxido). Flavonoides (astragalin, cariatn, eterdimetilico de eriodictiol, lutein, tetrametil-eter de quercetagenin dimetil-eter, tetrametil-eter, alfa-arabinosido, beta-glucoronido, betagluconido-dimetil-ster de quercitn, iso-quercitn, rutin, trifolin). Componente fenlicos (cido cefeico, clorognico , protocatquico). Cumarinas (umbeliferona, cariolan-1,9 beta-diol). Triterpenos (alfa-y beta-amirina, cicloartenol, lanosterol). Esteroides (avenastenolo,campesterol, beta-sitosterol, alfa-espinasterol,
estigmastenol, estigmasterol). Partes areas: Sesquiterpenos (cadaleno, 4-hidroxi2-isp-propil-4-7-dimetil-naftalenona). Flovonoides (quercetna). Flavonas
(apigenina, kaempferol,luteolina). (Jerga, 1987). En un estudio de fines del siglo pasado se describe que de las flores de esta planta se han obtenido, una resina, aceite esencial, grasa, una sustancia colorante amarilla, tanino, cidos glico, oxlicom, goma, almidn, un principio amargo y un alcaloide.(Jerga,1990). Dentro de los estudios que se le han hecho, en el rea microbiolgica se sabe que ejercen fuerte actividad antimicrobiana sobre (Argueta et al, 1994):
Bacillus subtilis
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Candida albicans
Staphylococcus aureus
De los cuales de destacan los siguientes compuestos: Sesquiterpenos: 7-hidroxi3,4-dihidrocadalina y 7-hidroxicadalina muestrando una potente activada contra G (+), siendo el primero el ms notable contra cepas de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), a una concentracin mnima bactericida (MBC) de 12.5 microgramos/ml. (Kubo, 1994).
Adems de poseer actividad
anti-inflamatoria in vivo e in vitro, acta
como
inhibidora de la actividad de la Tirosinasa, como analgsica, antioxidante y tiene actividad citotxica contra varios lneas tumorales slidas (Delgado et al, 2001; Gene et al, 1998; Haraguchi et al, 1996; Haraguchi et al, 1997; Kubo et al, 1994; Kubo et al,1996; Kubo et al, 2000; Segura et al, 2000).
GORDOLOBO Planta erecta bianual o perenne de vida corta con uno o varios tallos ascendentes, ramificadas desde la base, de 30 a 75 cm de altura, cubiertos con pequeas cerdas lanosas largas y entrecruzadas; hojas numerosas, lanosas, apiadas,
oblongo-lineares, espatuladas de la base, hojas de 1 a 2 cm de ancho por de 5 a 12 cm de largo, pecioladas con la base prolongada sobre el tallo extendida hacia abajo, submembranosa con lana fina en la parte de abajo, glabros y verde
opacos en la parte de arriba, aguda a
acuminada-apiculada
en el pice
marchitndose pronto de la base. Cabezuelas pocas a muchas, pequeas, de 3 a 4.5 mm, al momento de abrirse la flor, ms o menos globosas muy agrupadas, Arregladas en panculas en la punta de las ramas, los (Shreve y Wiggins, 1964). Florece de marzo a diciembre. Es la tos, el padecimiento para el cual se emplea con mayor frecuencia a esta especie en algunos estados del centro de la Repblica Mexicana (Hidalgo; Morelos, Puebla, Tlaxcala, Michoacn y Sonora). Asimismo, es muy til en problemas pectorales, infecciones en la garganta, bronquitis, asma, y para descongestionar los bronquios. En trastornos gstricos interviene en el tratamiento de las lceras, dolor de estmago y parsitos intestinales (V. lombrices). (Barquin Zamora, 1991). Se emplea toda la planta con flores, por ejemplo, para la tos, que es debida al catarro fro muy intenso, se ingiere el cocimiento de la planta o se prepara un cocimiento en leche junto con otras plantas del mismo gnero y se toma en ayunas durante nueve das; si la tos es crnica slo se hierven las flores en leche para tomarse tres veces al da; en ocasiones se hierven las ramas con las hojas junto con ocote (sp. n/r).Tambin se ocupa en la teraputica del cncer, heridas, fiebre, hidropesa, citica y lumbago.(Cedillo,1990). Historia. En el siglo XVI, Francisco Hernndez comenta: la raz es calorfica y secante, triturada y tomada purga los humores flemticos con seguridad y sin molestia por el conducto superior. Para el siglo XX, Maximino Martnez la reporta como: antirreumtico, antitusgeno; contra bronquitis, y dolor de garganta; es emoliente. La Sociedad Farmacutica de Mxico la describe como antirreumtico y emoliente. (Martinez, 1944). frutos son aquenios
Para esta
especie
se reportan:
diterpenos,
flavonoides, compuestos
acetilenicos, carotenoides. En estudios recientes se reporta cido ent-Kaur-16-en19-oico, zoapatlin, beta-sitosterol, y estigmasterol (Villagmez-Ibarra et al, 2001). En un estudio realizado a tres especies mexicanas de Gnaphalium, para la especie oxyphyllum se reporta que el extracto hexnico de las flores exhibe un amplio espectro de actividad contra Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium y Escherichia coli, a una concentracin de 50 mg/ml (Rojas et al, 2001; Villagmez-Ibarra et al, 2001).
4.
JUSTIFICACIN
En los ltimos aos el cultivo de tejidos vegetales ha tomado un auge importante en el desarrollo de nuevas tecnologas de preservacin y conservacin de
especmenes vegetales en peligro de extincin, dada la viabilidad de este mtodo se han podido determinar propiedades qumicas relevantes para la industria en general sin alterar el dbil equilibrio ambiental, la demanda de dicha materia vegetal y la rpida obtencin de esta. Dadas las propiedades medicinales de la rnica y el gordolobo resulta muy importante enfocar una investigacin cuyo objetivo sea la preservacin de dos especies vegetales de importancia en la medicina tradicional mexicana y a su vez la comparacin de los metabolitos secundarios entre el cultivo in-vitro y la in-vivo.
5.
OBJETIVOS
5.4.
OBJETIVO GENERAL:
Aplicar la tcnica de cultivo in-vitro a plantas de inters medicinal, en este caso rnica (Heterotheca Inuloides) y Gordolobo (Gnaphalium oxyphyllum).
5.5.
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Inducir la callogenesis en explantes de rnica (Heterotheca Inuloides) y Gordolobo (Gnaphalium oxyphyllum). Comparar los extractos de gordolobo y rnica con los extractos obtenidos de los callos mediante un anlisis de HPLC.
6.
MATERIALES Y METODOS
6.4.
OBTENCION DEL MATERIAL VEGETAL
Los explantes fueron obtenidos de hojas jvenes de Gordolobo ( Gnaphalium oxyphyllum) y rnica Mexicana (Heterotheca inuloides) respectivamente,
completamente sanas, que no presentaron lesiones de patgenos externos. El material vegetal seleccionado se obtuvo de dos fuentes, la primera el Jardn Etnobotnico Francisco Pelez R. se encuentra ubicado en la 2 sur #1700, en San Andrs Cholula, Puebla, Mxico. La segunda en el mercado de flores y plantas de Tenango de las Flores, Huauchinango Puebla. 6.5. FORMACION DE CALLOS
En los cultivos in vitro se ha generalizado el uso de las auxinas para la formacin de races en tejidos no diferenciados, las citocininas para la formacin de brotes adventicios y la combinacin de auxinas y citocininas en una misma concentracin para la formacin y proliferacin de callos (Rayen et al., 1999). Sin embargo, los tejidos de las distintas especies vegetales presentan diferencias en su capacidad de respuesta por la edad, la etapa fenolgica, el tipo de explante, as como por la cantidad de hormonas endgenas y protenas receptoras. Por lo que es necesario realizar estudios que conlleven a conocer el tipo y la dosis de RCV para la induccin callos, brotes y races para cada tipo de especie. Con el mtodo de desinfestacin utilizado en el presente trabajo, se obtuvo un 85% de explantes de hoja libre de contaminacin, el cual consisti en lavar los explantes dos veces en agua de grifo para despus ser sumergidos en una solucin de tween 20 al 5 % durante 5 minutos finalizando con un enjuague de agua de grifo para la desinfeccin superficial.
Para la desinfeccin microbiolgica los explantes fueron tratados con una solucin de ampicilina al 5% durante 30 minutos para despus ser aclarados tres veces en agua bidestilada estril. Adems se llevo acabo una segunda desinfeccin superficial la cual fue realizada con Ca (ClO)2 finalizando con 3 aclarados de agua bidestilada doblemente estril. Inicialmente, se contempl tambin el uso de entrenudos como explantes, sin embargo la contaminacin de este material fue del 100%, por lo que se descartaron. El medio de cultivo basal utilizado fue el medio MS (Murashige y Skoog, 1962) para el caso de los micronutrientes y para los macronutrientes se utilizo la metodologa propuesta por (Villegas et. Al. 1992), adems con una concentracin de 30 g/l de sacarosa como fuente de carbono y solidificado con agar con una concentracin de 8 g/l, esterilizado en autoclave durante 20 minutos a 120C y 15 psi. El medio fue complementado con una combinacin de hormonas de acuerdo con el diseo experimental propuesto por (Villegas et. Al. 1992). Despus de haber obtenido los explantes se procedi a sembrarlos en frascos de 100 ml conteniendo cada uno 20 ml de medio. Una vez sembrados los explantes, los frascos se taparon con papel aluminio y parafilm, se rotularon con la fecha de siembra y el medio de cultivo usado. Los frascos fueron expuestos a temperatura ambiente (18-20C) en cuartos oscuros y sometidos a revisin visual peridica para establecer la formacin de callos friables y posibles contaminaciones. 6.6. OBTENCIN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS
6.6.3. Obtencin de los extractos De ambas plantas se pesaron 50 gr y una vez pesado, se licuaron en seco para lograr una mayor rea de contacto, se saturo la materia vegetal con etanol de 96 y se dejo macerar por 48 horas, una vez transcurrido el tiempo se filtro el
macerado y se evaporo el solvente en un rota vapor marca BCHI modelo B-480 a una temperatura de 52C. Posteriormente se pesaron 100gr y se aforo con 10 ml de MeOH.
6.7.
DETERMINACIN DE LOS MEABOLITOS SECUNDARIOS
Para determinar la eventual presencia de los metabolitos secundarios de H. inuloides y G. oxyphyllum se realizo un anlisis HPLC de los dos extractos cuyos solventes de la fase mvil fueron los mismos variando las proporciones la primera MeOH 70% y H2O 30% y la segunda MeOH 80% y H2O 20%. Del extracto anterior se tomaron 10 ml de la solucin y se filtro con un microfiltro de 0.45m, para despus tomar 20l e introducirlos al anlisis de HPLC marca WATTERS serie 410. Los extractos utilizaron una columna XTERRA Rp 5m (4.6 * 250 mm).
7.
7.4.
RESULTADOS Y DISCUSIN
RESULTADOS 7.4.3. OBTENCIN DE LA MATERIA VEGETAL
Con el objetivo de localizar poblaciones H. inuloides y G. Oxyphyllum se utilizaron dos estrategias. La primera consisti en revisar la coleccin de ejemplares de nuestras dos especies del Jardn Etnobotnico Francisco Pelez R. (San Andrs Cholula, Puebla), cuya revisin fue exitosa ya que ambos ejemplares se encontraron en existencia, dada la disponibilidad geogrfica de dichas especies la produccin de ambas especies (H. inuloides y G. Oxyphyllum) se distribuyen en toda la republica mexicana excepto en sus pennsulas lo que posibilita hallarlas en los estados de Puebla, Tlaxcala, Hidalgo, Guerrero, D.F. y Edo de Mxico. La segunda estrategia consisti en entrevistas con colectores y vendedores de plantas del mercado de plantas de Tenango de las Flores,( Huauchinango Puebla), Hermilo Amador(Xicotepec, puebla), Hidalgo(Puebla capital). Los resultados arrojaron que H. inuloides es comercializada en la mayor parte de los mercados visitados tanto en su presentacin fresca como en la seca, a diferencia de G. Oxyphyllum que solo fue conseguido en Jardn Etnobotnico
Francisco Pelez R. (San Andrs Cholula, Puebla).
Fig. 8. H. inuloides (izquierda) y G. Oxyphyllum.(derecha) Fuente. Propia

7.1.2. FORMACIN DE CALLOS En los cultivos in vitro se ha generalizado el uso de las auxinas para la formacin de races en tejidos no diferenciados, las citocininas para la formacin de brotes adventicios y la de auxinas y citocininas en una misma concentracin para la formacin y proliferacin de callos (Rayen et al., 1999). Sin embargo, los tejidos de las distintas especies vegetales presentan diferencias en su capacidad de respuesta por la edad, la etapa fenolgica, el tipo de explante, as como por la cantidad de hormonas endgenas y protenas receptoras. Por lo que es necesario estudios que conlleven a conocer el tipo y la dosis de RCV para la induccin callos, brotes y races para cada tipo de especie. Con el mtodo de desinfestacin utilizado en el presente trabajo, se obtuvo un 85% de explantes de hoja libre de contaminacin. Inicialmente, se contempl tambin el uso de entrenudos como explantes, sin embargo la contaminacin de este material fue del 100%, por lo que se descartaron. Los primeros cambios en los explantes de hoja se observaron a partir de las 4 semanas de sembrarlos. Estos consistieron en la formacin de callos, (Figura 9 A) con un alto rendimiento a la induccin, sin embargo estas estructuras al ser resembradas en medio fresco no crecieron. Para un segundo intento de siembra se utilizo una combinacin (ANA en compaa con KIN o BAP) donde se formaron callos con un rendimiento medio de induccin, stos aparentemente presentaron crecimiento al resembrarse, sin embargo se oxidaron. En el intento 3 (ANA) se desarrollaron callos (Figuras 9 B y9 C ). En este medio se formaron brotes con un alto rendimiento de induccin (Figura 9D y9 E). En otro intento, los explantes se necrosaron (Figura 9F).
Fig.9 Obtencin de callos. Fuente: Propia.
7.1.3. OBTENCIN DE LOS EXTRACTOS De ambas plantas se obtuvo un extracto etanolico cuyo peso final despus de pasar por el arrastre de vapor fue de 3.46 gr en las siguientes figuras se
observaran las fases, desde el inicio de la maceracin hasta el producto final.
Fig. 10 A. maceracin de los extractos por 48 horas.

Fig. 10 B. filtracin de los extractos. (Izquierda), C) evaporacin por arrastre de vapor (derecha).
Fig. 10 D. extracto final cuyo peso final fue de 3.46 g.
7.1.4. DETERMINACIN SECUNDARIOS
DE
LOS
METABOLITOS
Para la determinacin de los metabolitos secundarios, se realizo un anlisis de HPLC cuyas muestras de la planta se muestran en las siguientes figuras
Fig.11 Muestra lista para el anlisis de HPLC
Fig. 12. Analisis de HPLC respectivo para H. inuloides .
Fig. 13 analisis de HPLC respectivo para G. Oxyphyllum Las figuras 12 y 13 muestran graficas de HPLC, donde los picos mas altos muestran un alto contenido de solvente, y los picos diferenciados muestran la presencia de metabolitos, cabe destacar que se necesita hacer un anlisis mas extenso en cuanto a HPLC se refiere ya que se debe de cuantificar la cantidad de metabolitos contenidos en cada pico.
7.2.
DISCUSIN
Para la realizacin de la presente investigacin, la bsqueda de las especies vegetales jugo un papel importante, ya que su disponibilidad fue escaza, comenzando desde la identificacin de las especies cuyas presentaciones no eran las adecuadas para nuestro estudio, por lo cual se recurri a mercados y jardines botnicos. Para la induccin a la callogenesis se tomo de primera mano aportes realizados por skoog, 1974 tomando en cuenta que se utilizara como primera metodologa lo descrito para el medio MS, a falta de resultados se profundizo en la utilizacin de cada micro y macro nutrientes hasta llegar a la parte de los RCV donde las combinaciones de la hormonas de crecimiento dieron lograron aclarar las dudas sobre las cuales los explantes no desarrollaban tejidos, una vez obtenida la
Combinacin necesaria se procedi a seguir averiguando el por que una vez iniciado el proceso de callogenesis los callos de ambas especies vegetales no se desarrollaban y/o el tejido necrosaba. El problema radico quiz en la edad del explante y en la agresividad de los agentes desinfectantes. En el caso del anlisis de HPLC la comparacin entre los cultivos in-vitro y la planta silvestre no se pudieron llevar acabo ya que el volumen total de los callos obtenidos era menor de 50gr cantidad mnima requerida para empezar la extraccin de los metabolitos y su posterior anlisis , otro factor importante fue la juventud de estos, dado que aun no tenan un tamao y masa apropiada para una mejor obtencin de los metabolitos, ya que de haber sido posible se hubiera hecho aparte de un a HPLC comparativo para ambas plantas resonancias magnticas que especificaran la relacin que existe entre la planta in.vitro y la in-vivo.
8.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
8.4. CONCLUSIONES
La auxina cido -naftalenactico induce callogenesis en explantes de hojas de plantas silvestres adultas de H. inuloides. Esta auxina en combinacin con las citocininas cinetina y 6-bencilaminopurina induce callogenesis en G. oxyphyllum esta conclusin esta basada en los cambios de la combinacin de los RCV a lo largo de la investigacin. Se estableci el cultivo in vitro de callos de H. inuloides y G. oxyphyllum a partir de explantes de hojas de plantas silvestres adultas.
8.5.
PERSPECTIVAS
El presente trabajo tuvo por objetivos particulares la comparacin de metabolitos secundarios entre las especies H. inuloides y G. oxyphyllum, este objetivo no fue cumplido ya que como se discuti en apartados anteriores los callos no alcanzaron la madurez necesaria adems de que los callos no reunieron el peso mnimo para ser analizados y comparados. Se recomienda que una vez alcanzada tanto la madurez necesaria como el peso se realice una maceracin en hexano en un lapso de 24-48 horas. Una vez transcurrido este tiempo se propone realizar una destilacin por reflujo, que consiste en calentar el solvente por medio de un nido a una temperatura de entre 55-60c con un refrigerante colocado de manera vertical, de tal manera que el solvente evaporado por accin de la condensacin regrese al matraz, todo esto durante 4 horas para su posterior evaporacin por arrastre de vapor, repitiendo este proceso 3 veces, una vez concluidos los tres reflujos y evaporaciones se prepare la muestra para su anlisis en HPLC y su posterior comparacin.
9.
FUENTES CITADAS
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10. ANEXOS
Reactivos Stocks o soluciones madre para los micronutrientes del medio de cultivo MS y segn el protocolo de Villegas et-al, 1992 para los macronutrientes. Micronutrientes -Solucin de fosfato de potasio (K3PO4) Para 100 ml 0.17 gr de K3PO4 Disolver en 50 ml de agua destilada y despus aforar con agua destilada. Almacenar en refrigeracin. -Solucin de Nitrato de Amonio (NH4NO3 ) Para 100 ml 0.165 gr de NH4NO3 Disolver en 50 ml de agua destilada y despus aforar con agua destilada. Almacenar en refrigeracin. - Solucin de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) Para 100 ml 0.37 gr de MgSO4.7H2O Disolver en 50 ml de agua destilada y despus aforar con agua destilada. Almacenar en refrigeracin.
-Solucin de cloruro de calcio di hidratado CaCl.2H2O
Para 100 ml 0.14 gr de CaCl.2H2O Disolver en 50 ml de agua destilada y despus aforar con agua destilada. Almacenar en refrigeracin. - Solucin de nitrato de potasio (KNO3) Para 100 ml 0.190 gr de KNO3 Disolver en 50 ml de agua destilada y despus aforar con agua destilada. Almacenar en refrigeracin. -Micronutrientes segn Villegas et-al,1992 Para 100 ml 0.083 gr de Yoduro de Potasio (KI) 0.223 gr de Sulfato de Manganeso Monohidratado (MnSO4) 0.63 gr de Acido Brico (B2O3) 0.86 gr de sulfato de Zinc Heptahidratado (ZnSO4.7H2O) 0.25 gr de Molibdato de Sodio (Na2MoO4) 0.25 gr de Sulfato de cobre Pentahidratado (CuSO4.5H2O) 0.025 gr de Cloruro de Cobalto (CoCl2)
Se disuelven todos los solidos en 50 ml de agua y se afora a 100 ml con agua destilada. Almacenar en refrigeracin. -Vitaminas MS Para 100 ml 0.1 mg de Acido Nicotnico 0.1 mg de Tiamina 0.1 mg de Piridoxina Los solidos se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml. -Quelatos Para 100 ml 0.372 gr sal de Sodio dihidratado( C10H14N2Na2O8.2H2O). 0.278 gr Sulfato de hierro II (FeSO4). Los solidos se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml. -Mionositol Para 100 ml 1 gr de Mionositol (C6H12O6 ) Los solidos se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml.
-Hormonas -B.A (benzyl amino purina) 52 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Para 100ml 10 mg de BA Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml -A.N.A. acido naftalenacetico Para 100 ml 10 mg de ANA Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml. -stocks de desinfeccin -Cloruro de calcio (CaCl2) Para 100 ml 2.5 gr de CaCl2 Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml. -Tween 20 5 ml de tween 20 Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100ml -Stock de Ampicilina 0.5 gr de ampicilina Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml
11. GLOSARIO
ANA: Acido -naftalenacetico. Asepsia: trmino mdico que define al conjunto de mtodos aplicados para la conservacin de la esterilidad. BA: 6-bencilaminopurina. Callo: masa de tejido parenquimtico indiferenciada en crecimiento activo. CCTV: Cultivo de clulas y tejidos vegetales. GD: Medio de cultivo Gresshof & Doy. Genotipo: totalidad de la informacin gentica que posee un organismo en particular, en forma de ADN. Junto con la variacin ambiental que influye sobre el individuo, codifica su fenotipo. De otro modo, el genotipo puede definirse como el conjunto de genes de un organismo y el fenotipo como el conjunto de rasgos de un organismo. Germoplasma: conjunto de genes que se transmite por la reproduccin a la descendencia por medio de gametos o clulas reproductoras. El concepto de germoplasma se utiliza comnmente para designar a la diversidad gentica de las especies vegetales silvestres y cultivadas de inters para la agricultura y, en ese caso, se asimila al concepto de recurso gentico. HPLC: High Pression Liquid Cromatography Metabolitos secundarios: compuestos qumicos sintetizados por las plantas que cumplen funciones no esenciales en ellas, de forma que su ausencia no es fatal para la planta, ya que no intervienen en el metabolismo primario de las plantas. Los metabolitos secundarios de las plantas intervienen en las interacciones
ecolgicas entre la planta y su ambiente.Tambin se diferencian de los metabolitos primarios en que cada uno de ellos tiene una distribucin restringida en el Reino de las plantas, a veces a slo una especie o un grupo de ellas, por lo que muchos de ellos son tiles en Botnica Sistemtica. Micropropagacin: conjunto de tcnicas y mtodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas asexualmente en forma rpida, eficiente y en grandes cantidades. La micropropagacin se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por ingeniera gentica, mutagnesis o mejoramiento gentico. Se utiliza tambin la micropropagacion para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente. MS: Medio de cultivo Murashige & Skoog. MSNM: Metros Sobre el Nivel del Mar. RCV: reguladores de crecimiento Vegetal. SH: Medio de cultivo Schenk &Hilderbrandt. Totipotencialidad: Trmino utilizado en biologa para referirse a clulas que poseen la capacidad de dar origen a varios tipos celulares, incluso pudiendo una sola de estas clulas dar origen a millones de clulas, tejidos, rganos, hasta incluso embriones.

Caracterización de Metabolitos Secundarios Apartir de Tejidos Vegetales

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Caracterización de Metabolitos Secundarios Apartir de Tejidos Vegetales

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CARACTERIZACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS APARTIR DE TEJIDOS VEGETALES

TESINA QUE PARA OBTENER EL TITULO DE T.S.U en Qumica rea Biotecnologa

Presenta Jairo Arturo Vargas Villegas

UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

III UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

IV UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

V UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

VI UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

CARACTERIZACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS A PARTIR DE CELULAS VEGETALES

VII UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

CARACTERIZACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS A PARTIR DE CELULAS VEGETALES

Keywords: culture tissue, G. Oxyphyllum, H. Inuloides, plant growth regulators, HPLC

VIII UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

1 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

2 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

3 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

2. GENERALIDADES DE LA UNIVERSIDAD DE LAS AMRICAS PUEBLA

4 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

5 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

Fig.1 Organigrama institucional UDALP . Tomado de http://www.udlap.mx/internas/html/esp/organigrama2.aspx#

6 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

Fig 2. Ubicacin . tomado de : http://www.udlap.mx/internas/mapaudlap.aspx

7 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

8 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

CULTIVO DE CLULAS Y TEJIDOS VEGETALES

9 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

10 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

11 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

12 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

3.1.3. MEDIOS DE CULTIVO

CINTICA DE CRECIMIENTO CELULAR

16 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

18 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

19 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

20 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

Fig. 5. Propiedades de los disolventes ms comunes. (ASTM, 1989)

22 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

24 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

25 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

calacoreno, epxido de carifileno, 2-3-epoxi-7-hidroxi-beta-calacoreno, 4 hidroxi2-iso-propil-4-7-dimetil-nafa-talenona, 7-hidroxi-3,4dihydrocadeleno, 7-

Adems de poseer actividad

anti-inflamatoria in vivo e in vitro, acta

opacos en la parte de arriba, aguda a

30 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

31 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

32 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

33 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

OBTENCION DEL MATERIAL VEGETAL

35 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

DETERMINACIN DE LOS MEABOLITOS SECUNDARIOS

36 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

RESULTADOS 7.4.3. OBTENCIN DE LA MATERIA VEGETAL

Fig. 8. H. inuloides (izquierda) y G. Oxyphyllum.(derecha) Fuente. Propia

38 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

Fig.9 Obtencin de callos. Fuente: Propia.

observaran las fases, desde el inicio de la maceracin hasta el producto final.

Fig. 10 A. maceracin de los extractos por 48 horas.

Fig. 10 D. extracto final cuyo peso final fue de 3.46 g.

40 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

7.1.4. DETERMINACIN SECUNDARIOS

Fig.11 Muestra lista para el anlisis de HPLC

Fig. 12. Analisis de HPLC respectivo para H. inuloides .

41 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas