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RESUMEN Una proteasa de serina, streblin, fue purificada 4,6 veces con 75% de recuperacin a partir del ltex

de una planta, Streblus asper. Este es el primer informe de identificacin y purificacin extincin ( de una proteasa de serina del gnero Streblus de la familia Moraceae. Streblin, tiene una masa molecular de 64 kDa y el coeficiente de ) es 5,29. Streblin es una protena bsica con un valor pI de 9,2 que acta de manera ptima a pH 9,0; tal actividad ptima a pH alto no ha sido reportado para la mayora de las serina proteasas aisladas de plantas y la enzima es estable en un amplio intervalo de pH (3,0 a 12,5 ). La enzima tambin es termoestable, retener la actividad completa en 15-85 C y acta de manera ptima a 65 C. Adems, es altamente estable en la presencia de diversos desnaturalizantes en el que la resistencia de SDS es la propiedad ms llamativa de la enzima purificada. Streblin fuertemente coagulada la leche desnatada. La fcil disponibilidad de ltex, los procedimientos de purificacin simples, alta estabilidad de streblin frente al pH, o la autodigestin, y en diversas condiciones de hacer la enzima un buen sistema para explorar la qumica biofsica de proteasas. Adems de su alta capacidad de coagulacin de leche, que podra ser utilizado en la industria del queso, as como otras industrias de alimentos y biotecnolgicas.

INTRODUCCIN Las enzimas proteolticas representan aproximadamente el 60% de todas las ventas de la enzima, debido a sus especificidades de sustrato y actividades generales ms de una amplia gama de pH y la temperatura. Adems, han sido ampliamente utilizados en productos farmacuticos, medicinales, alimenticios, de detergentes, de cuero y biotecnolgicos industrias (Nallamestty, Kundu, y Jagannadham,2003). Como cardosins son probablemente las proteasas de plantas que se han encontrado con ms xito en la fabricacin de queso, Macedo, Malcata, y Oliveira (1993) revisaron exhaustivamente fundamental y los aspectos de la fabricacin de queso de la Serra aplicado. En la industria alimentaria, las proteasas se utilizan para la coagulacin de la leche en la industria del queso, as como para la mejora de las propiedades funcionales y nutricionales de protenas, hidrlisis de gelatina, protena de soja, casena y protena de suero de leche (Sumantha, Larroche, y Pandey, 2006 ). Tambin se utilizan en la elaboracin de la cerveza, elaboracin de queso, y pan de fabricacin (Pande, Dubey, Yadav, y Jagannadham, 2006). Del mismo modo, extractos de Centaurea calcitrapa degradan las casenas de la leche de diferentes especies, lo que

sugiere que tales extractos de plantas se pueden utilizar como una alternativa a los cuajos animales comerciales, especialmente en la fabricacin de caprina y ovina quesos de leche (Tavariaet al., 1997). El extracto de la fruta de la Opuntia ficus-indica es al parecer un buen sustituto para el cuajo animal, ya que exhibe tanto la coagulacin y las actividades caseinolticas (Pintado et al., 2001). Las enzimas proteolticas de origen vegetal son muy adecuadas para las industrias farmacutica y de los alimentos, ya que son activos en un amplio rango de temperatura y pH, y poseen una amplia especificidad de sustrato y alta estabilidad en condiciones extremas (Patel, Singh, y Jagannadham, 2007). Aparentemente, la mayora de las proteasas de plantas aisladas y caracterizadas han sido clasificados como proteasas de cistena, que se utilizan ampliamente en varios procesos en la industria alimentaria (Uchikoba, Yonezawa, Y Kaneda, 1998). El principal inconveniente en el uso de proteasas de cistena es que su actividad se reduce fcilmente por los iones de oxidacin del aire y de metal. Por lo tanto, la aplicacin de estas enzimas requiere reductores y agentes quelantes y, por lo tanto, no son econmicos o conveniente (Tomar, Kumar, y Jagannadham, 2008). Por el contrario, las proteasas de serina planta son a la vez estable y activa bajo condiciones duras de temperaturas elevadas y pH elevado, as como en la presencia de surfactantes o agentes oxidantes. Por lo tanto, es ms til y econmico para aplicaciones industriales (Sharma, Kumari, y Jagannadham, 2009). Por lo tanto, la bsqueda de nuevos potenciales proteasas de serina planta todava contina, a fin de que stos susceptible de aplicacin industrial y econmica, as como para entender su papel fisiolgico en las plantas. Tiol proteasas de ltex de la planta, tales como bromelina, calotropins, ficina y papana, se utilizan comnmente en varios procesos en las industrias de alimentos y productos lcteos, pero su actividad proteoltica se inhibe por iones de oxidacin de aire o de metal. Por lo tanto, estas proteasas requieren agentes reductores y quelantes para su actividad, lo que restringe su aplicacin comercial. Por el contrario, diferentes proteasas de serina proteasas, incluyendo plantas, no necesitan este tipo de co-factores (Singh, Kumar, Rao, y Jagannadham, 2010). Las proteasas de serina son uno de los mayores grupos de enzimas proteolticas que participan en numerosos procesos de regulacin. En las plantas, se encuentran ampliamente distribuidos entre los diferentes grupos taxonmicos y se encuentran para estar involucrado en un nmero de procesos fisiolgicos, tales como la degradacin de la protena y el procesamiento, la microesporognesis, simbiosis, la respuesta hipersensible, la transduccin de seales y la diferenciacin, y la senescencia (Antao y Malcata, 2005). A pesar de ser la clase ms grande de proteasas en las plantas, las funciones y papeles

reguladores de serina proteasas de plantas, son poco conocidos, probablemente debido a la falta de identificacin de sus sustratos fisiolgicos. Una vez que cree que es poco frecuente en las plantas, en los ltimos aos, varias proteasas de serina se han aislado y purificado a partir de diferentes partes de las plantas de varias especies de plantas, incluidas las semillas, ltex y frutas (Mohamed Ahmed, Morishima, Babiker, y Mori, 2009). Los estudios en esta direccin se llevan a cabo en el presente documento, la utilizacin de una nueva proteasa, streblin, a partir del ltex de Streblus asper, una planta medicinal importante. S. asper Lour (Familia: Moraceae) es un rbol pequeo. Varias partes de esta planta se utilizan en Ayurveda y otras medicinas populares para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la filariasis, lepra, dolor de muelas, la diarrea, la disentera y el cncer. La investigacin llevada a cabo utilizando diferentes in vitro e in vivo de las tcnicas de apoyo a la evaluacin biolgica mayora de estas reclamaciones (Rastogi, Dinesh, Kulshreshtha, y Rawat, 2006). 2. Materiales y mtodos 2.1. Materiales Ltex se recogi en 0,01 M de tampn de Tris-HCl, pH 8,0, por incisiones superficiales en los tallos de S. asper encuentra en Varanasi, India, y se congel a - 20 C durante 24 h. El ltex se descongel y se centrifug a 20.000 g durante 40 min para eliminar la goma y otros materiales insolubles. El sobrenadante se someti a cromatografa de intercambio aninico, para el que una columna de DEAE se adquiri de Pharmacia. BSA, lisozima de huevo de gallina, azocasena, azoalbumin, hemoglobina, DTNB, TDT, GuHCl, urea, o-fenantrolina, EDTA, EGTA, SBTI, HgCl2, PCMB, NEM, PMSF, acrilamida, N, N-bisacrilamida de metileno y CBB R 250, se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (Estados Unidos).CBB T 250 fue de Eastman Kodak. TFA se obtuvo de Applied Biosystems. Anfolitos portadores Ampholine eran de LKB. Todos los dems productos qumicos eran de la mayor pureza disponible. 2.2. Seguridad La acrilamida es una potente neurotoxina y cancergeno, y itwas manejarse con guantes de seguridad. El manejo de fenol y TCA se hace con cuidado, debido a su naturaleza altamente corrosiva para la piel. El resto de los experimentos se llevaron a cabo con la mxima precaucin y cuidado.

2.3. La purificacin de la proteasa, streblin La cromatografa se realiz a temperatura ambiente. El sobrenadante, obtenido en el paso anterior, se someti a cromatografa de intercambio aninico en una columna de flujo rpido de DEAE-Sepharose pre-equilibrada con 0,01 M de tampn Tris, pH 8,0. La columna se lav con el mismo tampn hasta que no se detect protena en el eluyente. Las protenas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-0,8 M en el mismo tampn a una velocidad de flujo de 2,5 ml / min, y se recogieron fracciones de 2,53 ml. Las absorbancias a 280 nm, as como la actividad caseinoltica de las protenas en todas las fracciones, se determinaron. Las protenas unidas se eluyeron en dos picos con actividad caseinoltica. Las fracciones activas y homogneos de pico uno se combinaron, se concentraron y se almacenaron a 4 C para experimentos adicionales. La enzima puro as obtenido se denomin como streblin y ensay el contenido de protenas, as como la actividad de la proteasa (Fig. 1).

2.4. La concentracin de protenas La concentracin de protena, en diferentes etapas de purificacin, se determin espectrofotomtricamente la absorbancia a 280 nm, as como por el mtodo de Bradford (1976), usando BSA como estndar. 2.5. Ensayo para la actividad de la proteasa La actividad hidrolizante de la proteasa se determin utilizando sustratos naturales desnaturalizados tales como la casena y azoalbumin (sustrato cromognico). Enzima, a una concentracin de 15 l g en un volumen total de 0,5 ml de tampn Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, se incub a 37 C durante 10 min. Un volumen igual de solucin de casena al 1% (w / v), preparado en el mismo pH, se aadi a la solucin de enzima, haciendo que el volumen final de 1 ml, y la mezcla de reaccin se incub adicionalmente durante 30 min a 37 C. La reaccin se detuvo mediante la adicin de 0,5 ml de TCA al 10% y la mezcla se dej reposar durante 10 min a temperatura ambiente. Pptidos solubles se separaron por centrifugacin durante 10 min, utilizando una centrfuga de mesa. La absorbancia de los pptidos solubles en TCA en el sobrenadante se midi a 280 nm. En el caso de azoalbumin (0,6%, w / v) como sustrato, 0,5 ml de sobrenadante, despus de precipitacin con TCA, se mezcl con un volumen igual de 0,5 M de NaOH y se incubaron durante 15 min. El desarrollo del color se midi espectrofotomtricamente la absorbancia a 440 nm. Con la hemoglobina (1% w / v) como sustrato, la actividad se determina de la

misma manera que para la casena. Un ensayo de control, sin la enzima, se llev a cabo y se utiliza como blanco en todas las mediciones espectrofotomtricas. Una unidad de actividad enzimtica se define como la cantidad de enzima, en condiciones de ensayo dadas que dieron lugar a un aumento de 1 unidad de absorbancia a 280 o 440 nm por minuto de la digestin. El nmero de unidades de actividad por miligramo de protena se tom como la actividad especfica de la enzima.

La figura.1. Perfil de elucin de streblin en intercambiador aninico: columna de DEAESepharose se pre-equilibr con tampn de Tris 10 mM, pH 8,0. Las protenas no unidas se lavaron con el tampn de equilibrado y se eluy la columna con un gradiente de sal lineal de desde 0,00 hasta 0,80 M de NaCl, pH misma. Las fracciones de 3 ml se recogieron a una velocidad de flujo de 4 ml / min y se ensayaron para contenido de protena ( ) y la actividad proteoltica (o). Las fracciones de la piscina I (70-140) se combinaron como se indica por una flecha horizontal. 2.6. Electroforesis La homogeneidad y la integridad de la enzima, durante todas las etapas de purificacin, se evaluaron mediante SDS-PAGE. Para la determinacin de masa molecular, enzima purificada se someti a electroforesis en 12,5% de SDS-PAGE bajo ambas condiciones reductoras y no reductoras. Las bandas de protenas en el gel se visualizaron mediante tincin con 0,2% CBB R-250. Marcadores de masa molecular utilizados fueron la fosforilasa b (97,40 kDa), albmina de suero bovino (66,0 kDa), ovoalbmina (43,0 kDa), anhidrasa carbnica (29.0 kDa), inhibidor de tripsina de soja (20,1 kDa), y la lisozima (14,3 kDa). El peso molecular de la enzima se extrapol a partir de la trama de peso

molecular de registro frente a la movilidad electrofortica de los marcadores de peso molecular. 2.7. Zymography Un zimograma se realiz para visualizar la actividad proteoltica (en ejecucin). Para zimografa, 1,2% de casena se incluy en 12,5% en gel de poliacrilamida. El gel se hizo funcionar a 200 V durante 1 h y empapado en 2,5% de Triton X-100 para el desplazamiento de la SDS. Los geles se incubaron a continuacin en tampn de reaccin (50 mM de tampn Tris, pH 8.0, 1 mM de CaCl2) por 15 h a 37 C y despus se tieron con CBB R-250. Los geles se destieron durante la noche con 40% de metanol y cido actico al 10% hasta que las bandas claras aparecieron contra un fondo azul. La regin sin teir de gel se refleja la actividad proteoltica de las proteasas. 2.8. Punto isoelctrico El punto de la enzima purificada isoelctrico se determin mediante enfoque isoelctrico en geles de tubo, como se describe para procerain (Dubey Y Jagannadham, 2003). Anfolinas, en el intervalo de pH de 9.0-11.0, se han utilizado para generar el gradiente de pH. Un gel de poliacrilamida al 5% que contiene 2% anfolina deseada fue echado en geles de tubo. Andico y tampones cmara catdica fueron 0.01 M cidos-iminodiactico y 0.01 M de etilendiamina, respectivamente. Los tampones se vacan con gas nitrgeno antes de la electroforesis. El gel se someti a un pre-carrera a una corriente constante de 1 mA por varilla durante 2 h a desarrollar el gradiente de pH. Una muestra de protena (100 g), que contiene 10% (v / v) anfolina y 25% de glicerol, se carg en el gel y electroforesis a una corriente constante de 2 mA por varilla durante 4 h. Las bandas de protenas se tieron con 0,04% (w / v) de CBB G-250 disuelto en 6% (w / v) de cido perclrico. 2.9. El contenido de carbohidratos Restos de carbohidratos unidos a la superficie de la protena son una herramienta importante para regular su estabilidad (Van Teeffelen, Broersen, y Jongh, 2005). El contenido de carbohidratos de streblin se determin por el mtodo del cido sulfrico fenol (Hounsell, Davies, y Smith, 1997). El contenido de carbohidratos de streblin fue extrapolada de la curva de calibracin generada en condiciones similares, con galactosa como estndar.

2.10. Coeficiente de extincin El coeficiente de extincin de streblin se determin por un mtodo

espectrofotomtrico (Yadav, Pande, y Jagannadham, 2006). El coeficiente de extincin se determin utilizando la frmula, = 10 (5,690 N w + 1,280 N y + 120 N c) / M, donde n W, n y, n c son el nmero de triptfano, tirosina, y residuos de cistena en la protena; M es la masa molecular de la protena y 5,690, 1,280, 120 son los respectivos coeficientes de extincin de triptfano, tirosina y cistena residuos. Los nmeros totales de triptfano, tirosina y cistena residuos en la protena se determinaron como se describe a continuacin.

2.11. El triptfano y la tirosina contenidos Los nmeros totales de residuos de triptfano y tirosina en la protena purificada se determinaron (Yadav et al., 2006). Un espectro de absorbancia de la enzima purificada en 0,1 M de NaOH se registr desde 300 hasta 220 nm, utilizando un espectrofotmetro Beckman DU 640B. Valores de absorbancia a 280 y 294,4 nm se obtuvieron a partir de los espectros. Para los clculos, la frmula, W = (A 280 - x y) / (w -

y), se utiliz en donde, w es el contenido de

triptfano estimado en moles por litro; Un 280 es la absorbancia a 280 nm de la Los espectros de la protena; w y Y son coeficientes de extincin molar de triptfano y tirosina en 0,1 M de NaOH a 280 nm ( = 5225 W y y = 1,576), respectivamente. La tirosina total y contenido de triptfano en la protena, x se calcul utilizando 294,4 = 2375. El nmero de un residuo de aminocido particular por molcula de la protena se calcul a partir de la relacin de las concentraciones molares de los residuos de aminocidos a la de la protena total. 2.12. Medicin del contenido de cistena libre y total Libres y totales de residuos de cistena de streblin se determinaron mediante el mtodo DTNB. Para la determinacin del contenido de cistena libre, la enzima se activ con 0,05 M B-ME en 0,05 M de Tris-HCl, pH 8,0 a 37 C durante 30 min y se dializ extensivamente durante 24 h contra 500 ml de cido actico 0,1 M, con cuatro cambios en el dializado. Despus de la dilisis, 50 l de la muestra de enzima dializada se tomaron en 700 l de 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,3, y la muestra se dej en reposo durante 10 min para

alcanzar el pH. Posteriormente, 50 l de 5 mM de solucin de DTNB se aadi y la mezcla de reaccin se mezcl a fondo. El anin TNB liberado, despus de la reaccin del grupo sulfhidrilo con DTNB, se monitoriz espectrofotomtricamente. El nmero de residuos de cistena libres se evaluaron utilizando el coeficiente de extincin de TNB de 14150 M - 1 cm - 1 a 412 nm. Para la estimacin del nmero total de residuos de cistena, la enzima se desnaturaliz en 6 M de GuHCl y se reduce con 0,05 M de DTT en 0,05 M de Tris-HCl, pH 8,0. El exceso de DTT en la mezcla de reaccin se elimin por dilisis frente a 500 ml de 0,1 M de cido actico con cuatro cambios de la dializado (Riddles, Blakeley, y Zerner, 1983). Se estimaron los grupos tiol liberados como se describe en el caso de la estimacin de cistena libre. Los nmeros de enlaces disulfuro en la protena se dedujeron por comparacin del nmero de residuos de cistena libre y total. Para validar las mediciones, tambin se determinaron los contenidos similares de la papana, ribonucleasa A, y la lisozima. 2.13. pH y la temperatura ptimos La actividad proteoltica de streblin se examin en el intervalo de pH 0,5 a 13 para determinar el pH ptimo. Los tampones utilizados fueron 0,05 M de KCl-HCl (pH 1.0-1.5), 0,05 M de glicina-HCl (pH 2.0-3.5), acetato de sodio 0,05 M (pH 4,0-5,5), fosfato de sodio 0,05 M (pH 6,0-7,5), 0,05 M de Tris-HCl (pH 8,0-10,0), y 0,05 M de glicina-NaOH (pH 10,5-13). Debido a la insolubilidad de la casena por debajo de pH 4,0, ensayos de la enzima a pH ms bajo se llevaron a cabo usando hemoglobina como sustrato. Una solucin de sustrato de azoalbumin (0,6% w / v) o la hemoglobina (1% w / v) se prepar en los respectivos tampones de pH, y la actividad fue tomada en el mismo pH que en el mtodo descrito anteriormente a 37 C. Del mismo modo, tambin se estudi el efecto de la temperatura sobre la actividad, para determinar la temperatura ptima de la enzima streblin. La casena se utiliz como sustrato. La enzima se incub en el rango de temperatura de 15-100 C, durante 15 min en 0,05 M de tampn de Tris-HCl, pH 9,0, y una alcuota se utiliz para la medicin de la actividad a la misma temperatura. A cada temperatura, un ensayo de control se llev a cabo sin enzima.

2.14. Estabilidad Estabilidad de una enzima dicta su utilidad y aplicabilidad comercial. La estabilidad de streblin se evalu en un amplio intervalo de pH y temperatura y en presencia de desnaturalizantes qumicos. Streblin se incub durante 24 h en tampones dadas en el intervalo de pH de 0,5 a 13 y se ensay para actividad residual. Los diferentes tampones utilizados ya fueron mencionados en la seccin anterior. Del mismo modo, la enzima se incub a varias concentraciones de los desnaturalizantes, urea y de GuHCl, durante 24 h y se ensay para actividad residual; la enzima se incub a diferentes temperaturas en el rango de 15-100 C, durante diversos perodos de tiempo, y una parte alcuota se utiliz para determinar la actividad residual. Aunque la enzima se incub en un rango de temperaturas, las mediciones de la actividad se llevaron a cabo a pH 9 y 37 C. En todos los casos anteriores el residuo actividades de las muestras pretratadas se midieron por el ensayo de proteasa estndar descrito anteriormente. 2.15. Ensayo para la actividad amidoltica hacia sustratos sintticos La hidrlisis enzimtica de diferentes sustratos de p-nitroanilida de peptidilo sintticos por la proteasa purificada fue estudiado por un mtodo espectrofotomtrico. Los sustratos utilizados en este estudio fueron N - -benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPA), L-AlaAla-p-nitroanilida, N-succinil-Phe-p-nitroanilida, L-Glu-p-nitroanilida , L-Ala p - nitroanilida, y L-Leu-p-nitroanilida. En todos los casos, una accin 1 - solucin 12 mM del sustrato sinttico se prepar en DMSO disolviendo la cantidad requerida de sustrato en el volumen mnimo y se complet hasta el volumen requerido con tampn Tris-HCl 0,01 pH 8,0 a 30 C. La mezcla de reaccin contena aproximadamente 15-20 g de enzima en 0,5 ml de tampn Tris-HCl, pH 8.0, y 0,5 ml de peptidil p-NA. Despus de 60 min de incubacin a 37 C, la reaccin se termin por adicin de 0,2 ml de 30% de cido actico y la liberacin de p-NA se determin por absorbancia a 410 nm, usando el coeficiente de extincin de 8800 M - 1 cm - 1 para p-nitroanilida como una medida de la hidrlisis. 2.16. Efecto de los inhibidores sobre la actividad de streblin Se estudi Efecto de inhibidores de la proteasa en la actividad proteoltica de la enzima. Los inhibidores utilizados fueron STT, IAA, PMSF, EDTA, EGTA, PCMB, ofenantrolina, NEM, HgCl2 y SBTI. Un ensayo de control de la actividad de la enzima se hizo sin inhibidores y la actividad resultante se tom como 100%. La enzima se incub

con un inhibidor durante 30 minutos a temperatura ambiente y una alcuota se utiliz para la medicin de la actividad. El ensayo se realiz como se describi anteriormente.

2.17. La autodigestin Las proteasas, en general, son propensos a la autodigestin, y el grado de autolisis depende de la concentracin de enzima, el pH y la temperatura. Diferentes concentraciones de streblin, que van de 0,01 a 0,1 mg / ml se incubaron con 0,05 M de Tris-HCl, pH 8,0 a temperatura ambiente. Una parte alcuota que contena 5 g de enzima se utiliz para la determinacin de la actividad de la proteasa despus de 1, 7 y 14 das de incubacin, como se describi anteriormente con casena como sustrato. Actividad de la enzima despus de la primera 10 min de activacin se tom como 100% para el clculo de las actividades residuales. 2.18. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de reaccin Se estudi el efecto de aumentar la concentracin de sustrato sobre la velocidad de reaccin de la hidrlisis enzimtica, usando casena como sustrato a pH 9,0 y 37 C. Se utilizaron diez microgramos de la enzima, y la concentracin de casena era en el rango de 1-500 M. Los ensayos se realizaron como ya se ha descrito en las mediciones de la actividad proteoltica. Un espacio en blanco se utiliz en las concentraciones de sustrato especficas sin la enzima. Se obtuvo una representacin de Lineweaver-Burk y se calcul el valor de la constante de Michaelis-Menten (Km). 2.19. Pptido masiva de huellas dactilares Para la huella dactilar de masa de pptido, la banda de protena diana se escindi del gel y se someti a en-gel de digestin con tripsina. La espectrometra de masas se llev a cabo por el Instituto Jalma de la lepra y otras enfermedades microbianas, Agra, en un espectrmetro de masas MALDI / TOF-TOF. Las listas de los picos obtenidos se sometieron a los resultados de bsqueda de la mascota(http://www.matrixscience.com) programador para la identificacin de protenas.

2.20. Ensayo para la actividad de coagulacin de la leche La actividad de coagulacin de la leche-se determin de acuerdo con los mtodos descritos por Otani, Matsumori, y Hosono (1991) con una ligera modificacin. El sustrato (10% de leche desnatada en 0,01 M de CaCl2) se prepar y el pH se ajust a 6,5. El sustrato (2,0 ml) se pre-incubaron durante 5 min a 37 C, y se aadi 0,2 ml de extracto de enzima, y se observ la formacin de la cuajada, mientras que manualmente girando el tubo de ensayo de vez en cuando. El punto final se registr cuando partculas discretas eran perceptibles. Una unidad milkclotting se defini como la cantidad de enzima que coagula 10 ml de sustrato en 30 min. Actividad de coagulacin de la leche se defini como MCA (unidades) = 2400 / T x S / E T = tiempo necesario para la formacin de cuajada fragmento (s) S = volumen de solucin de sustrato (2,0 ml) E = volumen de solucin de enzima (0,2 ml)

3. Resultados y discusin 3.1. La purificacin de la enzima Una nueva proteasa de serina se purific a partir del ltex de S. asper hasta la homogeneidad, usando la cromatografa de intercambio aninico. Las protenas unidas a la columna dieron como resultado un perfil de elucin que consta de dos picos con la mayor parte de la actividad que aparecen en pico I (fig. 1). Protena en la mayora de las fracciones de primer pico era homognea en SDS-PAGE. Estas fracciones homogneas se combinaron (70 - 140) y se concentraron para su uso posterior. El rendimiento de la protena purificada fue de 75% con actividad especfica 6,92 U / mg y 4,6 veces la purificacin. La protena purificada fue nombrado streblin, de acuerdo con la nomenclatura de las proteasas. La actividad proteoltica observado en slo un pico sugiere la existencia de una sola proteasa en el ltex de S.asper. Esa sola proteasa es una caracterstica poco comn, como el ltex planta consta de varias proteasas, por ejemplo, Euphorbia dupifera (Lynn y Clevette-Radford, 1988), Euphorbia milli (Moro et al, 2008;. Yadav et al., 2006) y otros. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer informe de identificacin y purificacin de una proteasa serina del gnero Streblus de la familia Moraceae. El simple purificacin deS. asper, junto con la fcil disponibilidad de una gran

cantidad de ltex, hace que la produccin a gran escala de enzima posible, y permite as la exploracin de industrial, as como aplicaciones biotecnolgicas. 3.2. La homogeneidad y propiedades fsicas de la proteasa Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostr que la enzima, en condiciones reductoras y no reductoras, se altamente purificado como una nica banda, lo que sugiere la naturaleza monomrica de la enzima (Fig. 2a). La masa molecular de la enzima purificada se calcul como 64 kDa por SDS-PAGE, utilizando la trama de la movilidad relativa frente masa molecular (fig. 3), el cual casi coincida con la banda de albmina de suero bovino (BSA). El coeficiente de extincin de la enzima se promedi a un valor de 5,29 por mtodos espectrofotomtricos y se utiliza para todas las dems aplicaciones prcticas. La masa molecular de la enzima era similar a la de la cucumisina serina proteasa planta conocida (Yamagata, Ueno, y Iwasaki, 1989), y con otras proteasas de serina-cucumisina como (Asif-Ullah, Kim, y Yu, 2006; Rudenskaya et al, 1998.; Uchikoba et al., 1998). La masa molecular de la enzima purificada fue tambin similar a las de las endoproteasas-subtilisina como de la planta de tomate (Messdaghi y Dietz, 2000; Tornero, Conejero, y Vera, 1996). Las masas moleculares de las serina proteasas de plantas, hasta ahora conocidos, varan desde 19 hasta 110 kDa, sin embargo, la mayora se encuentran entre 60 y 80 kDa (Antao y Malcata, 2005). Como se muestra en la figura. 2 b, zimograma actividad tincin en 12,5% de SDS y no reductoras en gel de poliacrilamida, usando casena como sustrato, estableci que se obtuvo una banda bien resueltas en SDSPAGE, correspondiente a la actividad de la proteasa. Aunque el gel zimograma contena 0,1% de SDS y la muestra se trat con 1% de SDS, la enzima an se muestra la actividad, lo que indica que era resistente a SDS desnaturalizante. Resistencia a DSS es la propiedad ms llamativa de las enzimas purificadas entre todas las proteasas de serina planta reportados excepto para cucumisina (Yamagata et al., 1989).

Como se muestra en la figura. 2 c, la enzima purificada fue aparentemente resuelve como una nica banda en el enfoque isoelctrico con un punto isoelctrico (pI) de 9,2, lo que indica que es una protena bsica. Noda, Koyanagi y Kamyia (1994) encontr resultados similares para una serina proteasa planta de Cucumis melo L. con un punto isoelctrico bsico (pI) de 9,5. En contraste, la mayora de las serina proteasas aisladas recientemente de plantas tienen puntos isoelctricos en el intervalo de 4,0-7,0

(Singh et al., 2010). Una sola banda obtenido en SDS-PAGE, y la actividad de zimograma electroforetogramas IEF demostr su alta pureza. 3.3. Deteccin de carbohidratos Streblin contiene alrededor de 9-10% de hidratos de carbono, determinado por el mtodo del cido sulfrico fenol (Hounsell et al., 1997) por extrapolacin de la curva de calibracin generada en condiciones similares con galactosa como el estndar. Adems, la presencia de un resto de carbohidrato se confirm mediante tincin de la protena con el reactivo de Schiff, que apareci como un color magenta (Fig. 2d). El resultado demostr que la enzima purificada era una glicoprotena. El resto glycocarbohydrate puede ser parte de la arquitectura funcional de la enzima purificada, y podra ser responsable de su estabilidad trmica. Se necesita ms trabajo para dilucidar la naturaleza de la unin entre el carbohidrato (s) y protena en la enzima purificada y su funcin. Muchas proteasas de plantas son glicoprotenas aunque la ventaja biolgica de tales glicosilacin todava no est claro. Sharma et al. (2009) concluyeron, despus del tratamiento TFMS, que la glicosilacin es esencial para la actividad proteoltica de la protena. 3.4. Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de streblin La actividad hidrolizante de streblin se control a diferentes temperaturas en el rango de 15-100 C y pH 0,5 a 13. La temperatura y el pH ptimo para la actividad de streblin fueron 65 C y pH 9,0, respectivamente (Fig. 4 A y B). La actividad de la enzima aument a medida que la temperatura aument de 15 a 75 C. Sin embargo, la actividad disminuy de manera constante como la temperatura subi por encima de 85 C. Haba 100% y 80% la actividad retenciones despus de 15 min de incubacin a 75 y 85 C, respectivamente. La termoestabilidad de la enzima se encontr que era de hasta 90 C (Fig. 4 A). El perfil de temperatura de la enzima purificada fue similar a las de la subtilisina / serina proteasas de plantas-cucumisina como (Tabla 1). La enzima purificada fue estable en un amplio rango de pH (3,0 a 12,5) condiciones y retuvo toda su actividad dentro del mismo intervalo de pH cuando se incubaron durante 1 h (Fig. 4 B). Por otra parte, en el pH 3,0-12,5 gama, ms de 55% de la actividad se conserv despus de 15 min de incubacin a 37 C. La proteasa purificada actu de manera ptima a un pH de 9,0. Tal actividad ptima a pH alto no ha sido reportado para la mayora aislados serina proteasas de la planta. La estabilidad de las protenas y las enzimas es por lo general un factor que limita su utilidad en muchas aplicaciones. La

estabilidad de streblin en lo que respecta a su pH es ms comparable al de otras proteasas de serina-cucumisina como (Tabla 1). A este respecto, la enzima aislada es nico, y por lo tanto podra ser adecuado para usos en la industria bajo condiciones alcalinas. Estas caractersticas son importantes, porque la mayora de las enzimas son catalticamente inestable a valores de pH alcalinos, lo que limita su utilidad en la industria alimentaria, especialmente el queso de decisiones coagulantes (Lamas, Barros, Balcao, y Malcata, 2001). Una excepcin a esta regla general es representado por el extracto acuoso y asprtico proteasas de la flor de Cynara cardunculus, que se han empleado con xito para la fabricacin de quesos tradicionales de ovino y caprino de leche (Sousa y Malcata, 2002).

La figura. 4. (a) Efecto de la temperatura, sobre la actividad (

) y estabilidad (o) del

streblin. Para la temperatura ptima, 10 g de streblin fueron activados a la temperatura requerida durante 15 min; se aadieron 0,5 ml de sustrato a la misma y la actividad se midi a la misma temperatura. Para los experimentos de estabilidad, 15 g de la enzima se incubaron a la temperatura requerida durante 15 min, y la actividad se midi a 37 C y pH 9,0. (b) Efectos de pH, sobre la actividad ( ) y estabilidad (o) del streblin. Para pH ptimos, 10 g de enzima activada en 0,5 ml de tampn, de pH requerido, se utilizaron y se determin la actividad usando los sustratos preparados en correspondientes tampones. La estabilidad se determina por (durante la noche) incubar 15 LG de la enzima a temperatura ambiente y la actividad (da siguiente) se determin como se describe en el texto.

3.5. Estabilidad Retencin de la actividad completa en 40% de metanol, 45% de acetonitrilo y 70% dioxano es un reflejo de la alta estabilidad de streblin en disolventes orgnicos. La proteasa es estable en 3 M de GuHCl y pierde su actividad lentamente a partir de entonces. Tambin mantiene su actividad mxima en 6.5-8.0 Murea. La alta estabilidad de streblin en diversas condiciones duras hace que sea un excelente sistema para estudios biofsicos para dilucidar la relacin entre su estructura y funcin. Estabilidad de streblin, bajo diferentes condiciones se presentan en la Tabla 2. La estabilidad de una enzima en los extremos de condiciones es el factor decisivo para su utilidad industrial. Streblin mostr una notable estabilidad en condiciones en que la mayora de las enzimas pierden su actividad. Se conserva la actividad en un amplio intervalo de temperaturas de hasta 90 C durante 15 min (fig. 4a), as como el pH 3,0 a 12,5 (Fig. 4b).

3.6. Efecto de los inhibidores Diferentes inhibidores, especficos para diferentes clases de proteasas se utilizaron para determinar la clase de la proteasa purificada (Tabla 2). La inactivacin de la enzima producido en presencia de PMSF, cido caproico 6-amino, benzamidin-HCl y, un poco, con SBTI, mientras que IAA, NEM, E-64, o-fenantrolina, el EDTA y EGTA no tuvieron efecto sobre su actividad. Como la enzima se inhibi exclusivamente por inhibidores de la proteasa de serina, esto indica que es una serina proteasa. PMSF inhibi fuertemente la enzima y la inhibicin de 95,5% se produce a una concentracin de 60 M de PMSF. SBTI fue menos eficaz como inhibidor de la inhibicin completa no se logr (slo 70% de inhibicin) en el rango de concentracin utilizado de 0,1 mM. Esto indica que puede que no sea una serina proteasa similar a la tripsina y la determinacin estructural de residuos del sitio activo puede proporcionar evidencia ms concluyente. La falta de inhibicin de la actividad de los inhibidores proteicos, tales como SBTI, abundante en alimentos ricos en protenas como la soja, hace que la enzima proteasa potencial para la industria alimentaria. Inhibidores de metaloproteasa, por ejemplo, o-fenantrolina, EDTA y EGTA, no mostraron efectos significativos sobre la actividad de streblin, descartando la posible de que sea un metalloprotein. Del mismo modo, los inhibidores de la proteasa de cistena, por ejemplo, IAA, STT, NEM y PCMB, tambin mostraron ningn efecto significativo sobre la actividad proteoltica de la enzima purificada.

3.7. Especificidad de sustrato Streblin hidroliza sustratos desnaturalizadas naturales, tales como la casena, la hemoglobina, azoalbumin y azocasesin, con notable actividad. Sin embargo, no muestra ninguna actividad significativa para los sustratos sintticos usados en el estudio actual, por ejemplo, L-Ala-Ala-p-nitroanilida, L-Ala-p-nitroanilida, L-Leu-p-nitroanilida, N - una benzoil-DL-arginina p-nitroanilida (PABA), N-succinil-Phe-p-nitroanilida y L-Glu p nitroanilida. Para la serina proteasa planta ms estndar, es decir, cucumisina, la longitud hexapptido tiene una alta tasa de hidrlisis y se escinde de manera deseable en el lado C-terminal de residuos de aminocidos carboxilo, tales como cido glutmico y cistena carboximetilada, y el lado N-terminal de alanina (Yonezawa, Kaizuka, Uchikoba, y Arima, 2000). Como los sustratos sintticos mencionadas anteriormente no tienen estas caractersticas, esta puede ser la posible razn de la inercia de streblin hacia ellos.

3.8. Residuos de aminocidos especficos El contenido total de cistena de streblin se encuentra para ser 7 con 1 residuo de cistena libre (valor medido 0.98), formando as tres puentes disulfuro. Las proteasas de serina, como euphorbian l, yeuphorbian 1 y euphorbian y 3, tienen 7, 9 y 10 residuos de cistena, respectivamente (Lynn y Clevette-Radford, 1988). El nmero total de triptfano y tirosina residuos de streblin, tal como se determina por el mtodo de Goodwin y Moore, son 3 y 7, respectivamente. Estos valores son inusualmente y excepcionalmente bajos en comparacin con los valores reportados para otras proteasas de serina. En este punto, la determinacin del nmero especfico de estos residuos es necesaria para el clculo del coeficiente de extincin de la enzima. Sin embargo, estamos en el proceso de generacin completa de aminocidos de datos de secuencia que se inform de otros lugares. 3.9. La autodigestin La autodigestin del streblin se monitoriz a temperatura ambiente en el rango de concentracin de protena 0,01-0,1 mg / ml a pH 9,0. En cada caso, la prdida de actividad fue inversamente proporcional a la concentracin. La enzima retiene ms del 95% de la actividad despus de 1 da de incubacin, incluso a bajas concentraciones (0,01 mg / ml) y la prdida de actividad aument con el tiempo de incubacin de 1 da a da 7, mientras que, a mayores concentraciones, la enzima era completamente

activa. Despus de 14 das de incubacin, se produjo una disminucin general de la actividad residual en cada concentracin en el intervalo elegido. En concentraciones ms altas, la enzima era completamente activa despus de 1 da de incubacin y se mantiene la tendencia hasta 7 das de incubacin con alguna disminucin en la actividad residual despus de das 14. Por lo tanto, streblin mostr excepcionalmente alta resistencia a la autodigestin. Esto, a su vez, indica su alta estabilidad, y por tanto su posible aplicacin en las industrias de alimentos, textiles y biotecnolgicas. La mayora de las proteasas aislados estudiados se someten a la autodigestin a bajas concentraciones de protena. 3.10. Efecto de la concentracin de sustrato La naturaleza de la cintica hiperblica era tpicamente con sustratos naturales (casena) y, a concentraciones ms altas del sustrato, la actividad de la enzima alcanz la saturacin. El efecto de aumentar la concentracin de sustrato sobre la velocidad de reaccin de streblin sigui la ecuacin de Michaelis-Menton. El valor de K m, como se estima a partir de la representacin de Lineweaver-Burk, fue de 27 0,5 M con la casena como sustrato. 3.11. Anlisis de huellas dactilares Misa La protena se digiri enzimticamente con tripsina y se resolvi en masas de pptido. El pptido masa determinada se registraron en contra de las bases de datos relevantes en los resultados de bsqueda de la mascota. La ausencia de cualquier resultado positivo con el fragmento de cualquiera de los conocidos de la proteasa serina planta confirm la singularidad de la streblin. 3.12. Milk-coagulacin El streblin enzima fuertemente coagulada la leche desnatada y form una cuajada blanca y firme. Se determin la relacin entre la actividad coagulante a la actividad proteoltica de streblin. Se encontr que la relacin de la actividad de coagulacin de la leche a la actividad proteoltica de streblin era 2306 U / OD 660 nm. Ms recientemente, una enzima de coagulacin de la leche se extrae de la hoja de S. asper porIshak et al. (2006), en apoyo de esta. La capacidad de esta proteasa para producir leche cuajada podra hacerlo til como un nuevo coagulante de la leche, aunque ms estudios sobre las cualidades de ambos cuajada de la leche y el queso formado se deben realizar en el futuro para

confirmar su utilidad en la industria lctea y la industria alimentaria. Sin embargo, el cuajo de ternero utilizado para la produccin de queso es una enzima relativamente caro debido a su limitada disponibilidad y consideraciones ticas asociadas con su uso, por lo tanto, la bsqueda de nuevas enzimas procedentes de otras fuentes an contina (Tavaria et al,. 1997). 4. Conclusin Para nuestro conocimiento, este es el primer informe de la purificacin y caracterizacin de una nueva serina proteasa, llamado streblin, a partir del ltex de una planta medicinal valiosa, S. asper. En comparacin con otros procedimientos de purificacin llevadas a cabo previamente, tuvimos xito en el desarrollo de un procedimiento de purificacin simple en este estudio. El procedimiento es econmico y, combinado con la disponibilidad de la planta de ltex, posiblemente podra ser utilizado para la produccin a gran escala de la enzima, lo que permite un amplio estudio de sus diversos aspectos y aplicaciones, por lo tanto probables, as como estudios sobre la estructura-funcin relacin de la enzima. Por otra parte, la alta estabilidad de streblin contra la autodigestin en diversas condiciones, la disponibilidad de materias primas y su fuerte capacidad de coagulacin de la leche, podra allanar el camino para su uso en la industria del queso, as como otras industrias alimentarias y biotecnolgicas. Agradecimientos Agradecemos al Dr. Deepa Bisht y el Sr. Prashant Sharma, Jalma Instituto de la lepra y otras enfermedades microbianas, Agra, UP, India, por la huella de masas peptdicas. Tambin agradecemos a CSIR de apoyo financiero en forma de un miembro asociado de Investigacin. Tambin se reconoce la asistencia financiera del ICMR a Ritu Tomar en forma de JRF y SRF. Apndice A. Datos complementaria Datos suplementarios asociados con este artculo se pueden encontrar, en la versin en lnea, en doi: 10.1016/j.foodchem.2010.09.108.