SEPARAREA SI PURIFICAREA

PRODUSELOR DE BIOSINTEZA

Scopul procesrilor ulterioare fermentaiei:
-ndeprtea substanelor strine (impuritile)
-reducerea volumului total, concomitent cu concentrarea
produsului util
-purificarea produsului.
Alegerea operaiilor de separare i purificare se face
innd cont de:
-criterii tehnologice:
-natura i proprietile fizico-chimice ale produsului
-locul de obinere al acestuia (intra-sau extracelular)
-criterii economice
Separarea masei celulare este precedat de inactivarea
microorganismelor, care se realizeaz prin modificri semnificative
ale temperaturii, pH-ului sau prin adaos de substane chimice.
Separarea se poate face prin filtrare, centrifugare sau procedee mai
moderne utiliznd uniti de separare cu membrane.

Separarea i purificarea produselor reprezint cheia
instalaiilor biochimice, care influeneaz semnificativ
economicitatea procesului. Una din caracteristicile proceselor
biochimice l constituie concentraia mic a produsului biosintetizat
n substrat i n multe cazuri labilitatea sa structural, ceea ce
impune acordarea unei atenii deosebite etapelor de separare i
purificare. Operaiile de separare i purificare se aleg n funcie de
natura, concentraia din substrat, proprietile fizico-chimice, locul
de obinere (extracelular sau intracelular) al produsului, respectiv
de cantitatea i proprietile substratului care trebuie prelucrat.
Metodele de separare i purificare, condiiile de operare i utilajele
n care se realizeaz trebuie s asigure o eficien maxim la
cheltuieli minime.
CELE MAI UTILIZATE TIPURI DE FILTRE
UTILIZATE IN SEPARAREA BIOMASEI:
FILTRU PRESA
funcionare discontinu;
suprafa mare de filtrare concentrat ntr-un volum de
dimensiuni relativ reduse;
operaia de filtrare este accelerat prin trimiterea suspensiei
sub presiune de 3-4 at;
precipitatul rmne presat pe pnza filtrant iar filtratul se
scurge prin canalele prevzute n plci

Avantaje: obinerea unui precipitat
cu coninut mic de umiditate;
flexibilitatea condiiilor de operare;
suprafa mare de filtrare;
posibilitatea protejrii mpotriva
coroziunii;
costuri de investiie sczute.

Dezavantaje:
manoper voluminoas
uzur rapid a pompelor filtrante
splarea defectuoas a precipitatului

FILTRUL NUCE
funcionare discontinu;
format dintr-un recipient cilindric sau paralelipipedic cu/fr capac;
prevzut la baz cu un grtar sau plac poroas pe care se fixeaz
pnza filtrant;
filtrarea se produce datorit diferenei de presiune create ntre
partea superioar i cea inferioar, care poate rezulta datorit:
o presiunii hidrostatice a lichidului;
o pomprii soluiei;
o realizrii de vid la partea inferioar.

Avantaje:
ndeprtarea avansat a lichidului din
precipitat (desecare avansat)
construcie simpl i exploatare uoar

Dezavantaje:
manoper voluminoas n special la descrcare
i splare
splare defectuoas (posibilitatea apariiei de
fisuri n precipitat)

FILTRE ROTATIVE CU TAMBUR
funcioneaz cu vid;
folosesc n special la filtrarea maselor celulare;
asigur: suprafa mare de filtrare si posibilitatea de
splare si desecare a miceliului pe filtru.

Filtru celular Oliver: 1-tamburul filtrului, 2-celule, 3-pnz filtrant,
4-tuburi de legtur ntre celule, 5-arbore, 6-conduct pentru alimentarea
suspensiei, 7-cuit pentru desprinderea precipitatului, 8-cuv, 9-agitator
pendular, 10-conduct pentru apa de splare
CENTRIFUGAREA
este esenial atunci cnd:
- filtrarea se realizeaz cu dificultate i are durat mare (suspensii
greu filtrabile);
- celulele sau alte materiale aflate n suspensie trebuie s se obin
n stare ct mai uscat;
- este necesar separarea continu i n condiii igienice avansate;
- nu se admit pierderi de lichid n precipitat.
se caracterizeaz prin:
- intensitate variabil datorit modificrii vitezei i distribuiei fa
de axa de rotaie;
- direcie radial a cmpului de fore.
factorii care influeneaz viteza de sedimentare n cmp
centrifugal sunt:
- viteza unghiular de rotaie,
- diferena de densitate dintre celule i faza lichid,
- diametrul (dimensiunea) celulelor,
- vscozitatea fazei lichide.


Centriguga cu camere, ideal
pentru separarea suspensiilor cu
pn la 5 % faz solid, cu
dimensiuni ale particulelor de 0,1
200 m

Centrifuga cu talere ideal la
separarea de emulsii, drojdii etc.

Centrifuga tubulara (supercentrifuga)
realizeaz separri avansate nu numai de
sisteme eterogene lichid-solid,
dar i lichid-lichid sau lichid-lichid-solid

MICROFILTRAREA
este operaia de separare cu membrane a: soluiilor coloidale,
suspensiilor de particule de dimensiuni cuprinse ntre 0,02 i 10m:
-virusuri, bacterii, drojdii
membranele de microfiltrare sunt n general materiale polimerice
cu structur cristalin;
n funcie de modul n care se rein particulele din suspensie se
disting:
- filtrarea de suprafa utilizeaza membrane cu diametrul porilor
mai mic dect diametrul particulelor si
- filtrarea n adncime prin membran cu diametrul porilor mai
mare dect diametrul particulelor solide sau
prin material filtrant cu o structur fibroas sau granular cu
interstiii de dimensiuni mai mari dect diametrul particulelor.

ULTRAFILTRAREA
permite separarea de molecule de dimensiuni mai mari (ex.
zaharuri) din soluie;
se aplic de ex. la filtrarea laptelui n scopul separrii lactozei, sau
a acidului lactic din medii de fermentaie n fermentatoarele cu
recirculare externa.


DISTRUGEREA MEMBRANEI CELULARE
Se impune pentru eliberarea metabolitilor intracelulari, sau in cazul
separarii unor substante celulare (enzime, proteine).
Principalele metode se impart in:
metode fizico-mecanice:
macinare umeda suspensia de celule este supus unei presiuni n
interiorul unei valve unidirecionale i traverseaz un canal ngust
dup care are loc o detent datorit lrgirii seciunii de curgere
- se lucreaz la presiuni mari i n multe cazuri este necesar
recircularea materialului pentru a obine o distrugere de maxim.
90%
- pentru a preveni pierderea din activitatea enzimatic datorit
nclzirii suspensiei pe traseu, se impune rcirea acesteia la
temperaturi de 04C




macinare uscata extrudarea sub presiune a microorganismelor
ngheate la -25C printr-un orificiu foarte mic pentru obinerea de
enzime sau de membrane celulare;
- distrugerea peretelui celular se datoreaz efortului combinat al
forfecrii lichide prin curgere printr-un orificiu ngust i prezena
cristalelor de ghea;
- se poate realiza o distrugere de 90 % a membranelor celulare la o
singur procesare;
cicluri repetate de nghe-dezghe aplicate unei paste de celule
microbiene cu formarea de cristale de ghea, urmat de topire cu
distrugerea ntr-o oarecare msur a membranelor celulare;
- procedeu lent, cu eliberare limitat a materialului intracelular;
- se folosete n combinaie cu alte tehnici.


metode chimice:
- tratare cu solutii de detergenti degradeaza lipoproteinele membranei
celulare;
- tratare cu solutii alcaline produce hidroliza materialului peretelui
celular;
- metode enzimatice utilizare de enzime care provoaca hidroliza unor
legaturi specifice in peretele celular;
- soc osmotic modificarea brusca a concentratiei saline, care provoaca
distrugerea unor tipuri de celule.
EXTRACTIA CU SOLVENTI
- operatie de separare amestecuri lichide omogene, bazata
pe diferenta de solubilitate a componentilor intr-unul sau
mai multi dizolvanti corespunzator alesi;
- cuprinde etapele:
a. contactarea fazelor (mediu solvent)
b. separarea fazelor;
c. recupararea solventului.
Criterii de selectie a solventilor:
-selectivitate, descrisa de coeficientul de repartitie;
-proprietati fizice (,) care sa permita dispersarea
usoara a fazelor;
-posibilitate de recuperare-recirculare;
-siguranta in exploatare;
-accesibilitate si cost redus.

Extractie reactiva: solubilizarea se realizeaza ca urmare a unei
reactii chimice cu agentul de extractie (solubili, de regula, in
faza organica, formand cu solutul un compus solubil la randul
sau in faza organica);
Extractie cu fluide supercritice, tehnica care permite:
- evitarea degradarii produselor extrase datorita conditiilor
blande de operare;
- eficienta sporita datorita proprietatilor fizice (de solvatare,
densitate, viscozitate) deosebite;
- realizarea unei extractii complete si rapide cu o separare
facila a fazei extrase.
Cel mai folosit fluid in extractiile supercritice este dioxidul de
carbon, utilizat pe scara larga in industria alimentara,
chimica, biotehnologie etc.)

Diagrama de faza a dioxidului de carbon
Extractie cu membrane emulsionate lichide - membranele
emulsionate lichide se obin prin formarea unei emulsii ntre
dou faze nemiscibile i apoi prin dispersarea prin agitare a
emulsiei ntr-o a treia faz continu, pentru a realiza procesul
de extractie (pertracie).
Reprezentarea schematic a unei membrane emulsionate lichide
Procesul de transfer de mas cu membrane emulsionate
lichide include urmtoarele etape:
obinerea emulsiei primare;
dispersarea emulsiei primare n contact cu o faz extern
continu, pentru a forma o emulsie dubl cu rol separator;
decantarea, pentru a separa emulsia primar din faza
extern, faza extern constituind rafinatul;
spargerea emulsiei, pentru a recupera faza intern ca
extract i faza de membran pentru recirculare.

Aplicatii: separare din medii de fermentatie de aminoacizi,
acizi carboxilici, antibiotice

Reprezentarea schematic a unui proces de pertracie
cu membrane emulsionate lichide.
ADSORBTIA
procesul prin care unul sau mai muli componeni ai unui mediu
omogen sunt reinui pe un adsorbant (structur solid)
- este o operaie de separare datorit selectivitii adsorbantului,
fracionnd amestecul iniial n efluent i reinut pe solid
- reinutul pe solid se ndeprteaz prin desorbie
- nedestructiv: - cu vapori supranclzii, cu aer cald sau prin
nclzire sau detent si
- destructiv: calcinare
alegerea adsorbanilor se face n funcie de:
o supr afaa specific: raportul dintre suprafaa real de contact
i masa solidului
o capacitate de adsorbie : proprietatea unui adsorbant de a reine
pe suprafaa sa o cantitate determinat de substane adsorbit
tipuri de adsorbani:
- crbune activ, crbune de oase, silicagel, pmnturi decolorante,
alumin (Al
2
O
3
), magnezie activ (MgO 90%, MgCO
3
10 %)

SCHIMBUL IONIC
fac parte din categoria reaciilor de dublu schimb care au loc n
sisteme eterogene: L S (soluie de electrolit schimbtor de
ioni) sau L L (soluie de electrolit schimbtor de ioni lichid).
- ionii din soluia de electrolit nlocuiesc ionii de acelai tip din
structura molecular a schimbtorului de ioni
- funcie de natura ionilor schimbtorii se clasific n:
cationii RH sau RNa - tipuri: - anorganici naturali sau
sintetici: aluminosilicai, zeolii
- crbuni fosili: turb, lignit, sulfonai
- cationii pe baz de lignin, celuloz
- rini - fenolice sau poliesterice sulfonate
- carboxilice
anionii ROH -tipuri: - rini aminice, melaminice
Aplicaii n biotehnologie
separarea streptomicinei pe sulfocationii puternic acizi i
eluarea cu soluie de acid sulfuric sulfat de streptomicin
PURIFICARI CU MEMBRANE
Avantaje:
o consum energetic redus;
o posibilitatea separrii continue;
o condiii simple de operare;
o posibilitatea cuplrii cu procedeele tradiionale;
o costuri reduse de investiie i separare.
Cele mai utilizate n domeniul biotehnologiei sunt:
o microfiltrarea;
o ultrafiltrarea;
o electrodializa
Electrodializa
- permite modificarea compoziiei sau concentraiei soluiei unor compui
ionizabili prin migrarea selectiv a ionilor sub aciunea cmpului
electric
- membranele de electrodializ trebuie s posede grupe ionizabile
(membrane schimbtoare de ioni)
- intensificarea fluxului de substan prin membran: suprapunerea
peste diferena de concentraie (c) a unei diferene de potenial
datorat cmpului electric (U)
Procesul de
membran
Tipul
membranei
Fora motoare Mecanism de
separare
Aplicaii
Microfiltrare
(MF)
Simetric,
microporoas
(0,1 1 m)
Presiune
hidrostatic
(0,1 1 bar)
Curgere
capilar i
adsorbie
Filtrare steril,
limpezire
Ultrafiltrare
(UF)
Asimetric,
microporoas
(0,01 1 m)
Presiune
hidrostatic
(0,5 5 bar)
Curgere
capilar
Separarea
soluiilor de
macromolecule
Electrodializa
(ED)
Cationice i
anionice
Potenial chimic Schimb de
sarcin
ndeprtarea
ionilor din soluie
Membrane
lichide
Lichid Potenial chimic Solubilizare,
difuzie cu
transportor
Separarea ionilor
i a speciilor
biologice
PROCEDEE MEMBRANARE DE SEPARARE
SEPARARI SI PURIFICARI CROMATOGRAFICE
tehnica cromatografic se utilizeaz la izolarea i purificarea unor metabolii
- este de fapt o adsorbie-desorbie selectiv a unor substane prezente ntr-o soluie, care se
realizeaz la trecerea soluiei prin coloana cromatografic
- funcie de mecanismul prin care compuii se rein selectiv pe umplutura cromatografic,
tehnicile cromatografice se pot clasifica n:
cromatografie de adsorbie
- bazat pe adsorbia fizic prin legturi slabe de tip Van der Waals
cromatografie de schimb ionic
- proces reversibil de schimb ionic ntre faza lichid respectiv cea solid
- nu este nsoit de modificri structurale radicale ale fazei solide
cromatografia de permeaie de gel
- separ moleculele pe baza dimensiunilor lor; moleculele de dimensiuni mici ptrund n
structura gelului iar la eluie, moleculele de dimensiuni mari vor fi cele care vor fi
eliminate la nceput
cromatografia de afinitate
- tehnic de separare cu multiple aplicaii, putnd fi utilizat la separarea i purificarea
majoritii moleculelor biologice pe baza funciunii sau structurii lor chimice
- tehnica se bazeaz pe interaciunile specifice dintre materialele biologice i suportul
cromatografic
- s-a utilizat la nceput la izolarea i purificarea proteinelor, enzimelor, dar s-a extins
i pentru diferite substane de diagnosticare, anticorpi, acizi nucleici