Citologia e Epitélio Bucal

Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema/MS
Cincias Biolgicas Dezembro 2007

1
UEMS - Unidade de Ensino de Ivinhema Coordenador do Projeto: Jairo Campos Gaona Carga horria total do Projeto: 62 (31 semanas) Incio: 09 de maro 2007 Trmino: 30 de novembro 2007
Participantes
Professor Jairo Campos Gaona/ Coordenador Lucilene Anita Pereira Silva/ Tcnica de Laboratrio Diogo Freitas Souza/Monitor Jaqueline Bogs Cardoso Bonin/Monitora Paulo Sauda Neto/Monitor 1a Srie: Anderson Pereira Dos Santos Claudia Macedo Nazaro Deisiany Mayara Betineli Da Costa Ftima Aparecida Rodrigues Jaqueline Resende Lira Marcelo Fernando Pereira Stela Moreira Zancanaro Suelen Nunes Venncio 2a Srie: Jos Caccia Lucas Murilo Souza Santos Farias
SUMRIO Preparo das Solues ............................................................................................................................4 Roteiro de aula pratica No 01: Microscpio e Epitlio Bucal. ................................................................6 Roteiro de aula N 02: Anlise de Clulas Animais (sangneas) e Vegetais. ........................................7 Roteiro de aula pratica N 03: Observao de Protozorios. ..................................................................9 Roteiro de aula prtica N 04: Fungos, Algas e Lquens. .....................................................................11 Roteiro de aula pratica N 05: Diferenciao de Paredes Celulares de Clulas Vegetais. .....................13 Roteiro de aula prtica N 06: Plastos e Amido. ..................................................................................15 Roteiro de aula pratica N 07: Anlise de Plastos. ...............................................................................17 Roteiro de aula pratica N 08: Diviso Celular e Cromossomos (mitose).............................................18 Roteiro de aula prtica N 09: Mitose - Procedimento II. ....................................................................19 Roteiro de aula prtica N 10 e 11: Cromossomos de Insetos. .............................................................21 Roteiro de aula pratica No 12: Bactrias ..............................................................................................23 Roteiro de aula prtica N 13: Fungos.................................................................................................25 Roteiro de aula prtica N 14: Observao de Gros de Plen. ............................................................27 Roteiro de aula prtica N 15 e 16: Meiose. ........................................................................................29 Roteiro de aula prtica N 17 e 18: Identificao de Material Permanente. ..........................................32 Roteiro de aula prtica N 19: Ciclo celular - Mitose & Meiose Laboratrio virtual. ........................33 Roteiro de aula prtica N 20: Lipdios. ..............................................................................................34 Roteiro de aula prtica N 21 e 22: Incluso em Parafina e Basofilia...................................................36 Roteiro de aula prtica N 23: Lminas Permanentes. .........................................................................39 Roteiro de aula prtica N 24: Cromossomos de insetos II ..................................................................42 Roteiro de aula prtica N 25: Decalque, Reao de Feulgen & Verde Janus.......................................44
Preparo das Solues

cido Clordrico 1 M 8,4ml de cido clordrico concentrado 100ml de gua destilada q.s.p. Colocar 50ml de gua destilada em um balo volumtrico, adicionar o cido clordrico, homogeneizando a mistura. Completar para 100ml com gua destilada, agitar bem. gua sulfurosa 1g de metabissulfito de potssio 200 ml de gua destilada 10 ml de HCl 1N Pesar 1g de metabissulfito de sdio adicionar 10 ml de HCl 1N, completar para 200ml com gua destilada e colocar em frascos. lcool Etlico 50% 50,25ml de lcool etlico absoluto 99,5% 49,75 ml de gua destilada lcool Etlico 70% 70,35ml de lcool etlico absoluto 99,5% 29,65ml de gua destilada lcool Etlico 80% 80,40ml de lcool etlico absoluto 99,5% 19,6ml de gua destilada lcool Etlico 95% 95,47ml de lcool etlico absoluto 99,5% 4,53ml de gua destilada Azul de Metileno 1% 1g de azul de metileno 100ml de gua destilada q.s.p. Colocar 50ml de gua destilada em um bquer adicionar o azul de metileno. Misturar bem com uma baqueta. Completar o volume de gua destilada para 100ml e fazer a homogeneizao da soluo. Filtrar. Azul de Toluidina 0,5% 0,5g de azul de toluidina 5,0g de borato de sdio 100ml de gua destilada Dissolver o borato de sdio em +/- 80ml de gua destilada em agitador magntico com aquecimento. Adicionar o azul de toluidina continuar agitando por 30 minutos. Completar o volume para 100 ml e agitar com aquecimento por mais 30 minutos. Filtrar antes do uso. Carnoy (3:1) 75ml de lcool etlico absoluto 25ml de cido actico glacial. Eosina Amarela 0,5%/Eosina Azul de Metileno 0,5% (Soluo aquosa) 0,5g de eosina amarelada ou eosina azul de metileno 100 ml de gua destilada q.s.p. Pesar 0,5g de eosina colocar em um bquer e adicionar 100ml de gua destilada. Fucsina cida 1 g de fucsina cida 1 ml de cido actico 300 ml de gua destilada
HCL 5 N 70ml de gua destilada 50ml de HCl 12 N Hematoxilina de Ehrlich (aprox. 0,7 %) 2 g de hematoxilina 100 ml de lcool 96 % 10 ml de cido actico 100 ml de glicerina pura 3 g de almen de potssio 100 ml de gua destilada Dissolver a hematoxilina em lcool. Dissolver o almen em gua destilada. Adicionar a soluo de hematoxilina, aos poucos, sob agitao. Acrescentar aos poucos a glicerina e o cido actico. Filtrar. Amadurecer durante mais ou menos 2 a 3 meses. Utilizar vidro claro para armazenar a hematoxilina e tampar somente com gaze. Orcena Actica 1-2% 5ml de cido actico 0,1g de orcena 5ml de gua destilada Dissolver a orcena em gua destilada aquecida, adicionar o cido actico e filtrar. Parafina Histolgica-ponto de fuso 56-58 C Derreter a parafina em estufa termosttica temperatura entre 58 a 60 C. Filtrar em papel de filtro n 2. A parafina deve ser mantida liquefeita em estufa com temperatura ajustada 2 C acima do seu ponto de fuso. Reativo de Schiff 100ml de gua destilada 1g de fucsina bsica 4g de metabissulfito de sdio 1ml de HCl concentrado 200mg de carvo ativo Levar 100ml de gua destilada ebulio. Retirar do fogo e juntar a de fucsina bsica. Resfriar at 60 C e filtrar. Acrescentar o de metabissulfito de sdio. Dissolver bem. Adicionar o HCl. Deixar 24 horas em repouso, no escuro. Juntar o carvo ativado. Agitar durante uns 5 minutos e filtrar em papel duplo. Conservar em geladeira em vidro mbar. *Para ativar o carvo: filtrar com gua destilada e colocar em estufa a 60 C. Soluo de Lugol (1/20) 1ml de lugol 20ml de gua destilada Soluo salina 0,9 0,9g de NaCl 100 ml de gua destilada q.s.p. Sudan IV 600mg de Sudan IV 200ml de etanol 70% Aquecer o etanol adicionar o Sudan IV, dissolver completamente, deixar em repouso por uma noite, filtrar. Verde Janus B a 0,7% 0,7g de Verde Janus 100g de lcool 70% q.s.p. Pesar 0,7g de Verde Janus adicionar o lcool 70% e homogeneizar bem.
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema MS Curso Cincias Biolgicas Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica Roteiro de aula pratica No 01: Microscpio e Epitlio Bucal.
Introduo: O microscpio sendo a principal ferramenta no estudo da citologia e citogentica tem uma grande importncia na rea das cincias biolgicas e suas aplicaes nas reas agrrias, medicas e do uso na anlise de materiais diversos (fsica, geologia), sendo indispensvel o seu conhecimento para qualquer pessoa que queira atuar nessas reas. O principal objetivo dessa prtica ensinar os princpios bsicos do microscpio e suas principais funes, para que os acadmicos possam se familiarizar com seu uso e potencialidades e utilizar o conhecimento de forma a aproveitar melhor o aprendizado. Materiais e Equipamentos Instrumental Lminas, microscpio ptico, lamnulas, palitos para retirar amostras da bochecha, papel filtro. Qumicos Azul de metileno 1%. Biolgicos Amostras de mucosa bucal. Procedimentos Depois de enxaguar bem a boca, retire uma amostra raspando suavemente a bochecha interna com um palito e descarte a primeira amostra. Retire no mesmo local uma segunda amostra de clulas da mucosa bucal (sem lastimar a bochecha). Para coletar o material forar a bochecha para dentro, com auxilio do polegar para que a parte interna fique exposta facilitando a raspagem. Ao fazer a secunda raspagem passe a amostra para a lmina, por meio de esfregao, segundo o desenho. Deixe a amostra secar por 20 segundos. Pingue uma gota de azul de metileno na concentrao de 1% sobre a amostra. Deixe agir o azul de metileno de dois a cinco minutos sem lamnula, no deixe secar. Em seguida coloque a lamnula sobre azul de metileno e retire o excesso do azul utilizando papel filtro ou papel higinico. Leve a amostra ao microscpio ptico e observe o material nas objetivas de 40X e 100X. Resultados Desenhe o que foi observado no microscpio ptico. Diference a clula dos outros materiais observados. Observe e diferencie as partes constituintes das clulas, como: ncleo, membrana plasmtica, e citoplasma. Discuta os resultados com bibliografia, relate e conclua. Bibliografia AMABIS JM, MSRTHO GR. Curso bsico de biologia, v.1. Clulas e tecidos. So Paulo: Moderna, 1985. JORDO BQ et al. Prticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998.
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema MS Curso Cincias Biolgicas Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica
Roteiro de aula N 02: Anlise de Clulas Animais (sangneas) e Vegetais. Introduo A clula, unidade fundamental da vida, apresenta morfologia caracterstica fcil de ser diferenciada ao microscpio fotnico. Clulas animais e vegetais diferenciam molecular e estruturalmente refletindo em uma morfologia prpria. Para que o aluno venha se familiarizar com uso do microscpio de luz, necessrio que o mesmo aprenda a diferenciar os tipos de clulas, sejam elas vegetais ou animais. Esta aula tem como principal objetivo analisar as clulas vegetais e sanguneas, levando em considerao as suas caractersticas morfolgicas especficas, forma e estrutura. Materiais e Equipamentos Instrumental Microscpio ptico, lminas, lamnulas, rolha ou isopor, bisturi ou lmina de barbear, algodo, luvas descartveis, pina, placa de petri. Qumicos lcool. Biolgicos Folhas vegetais (frescas), amostra sangnea. Procedimento A (observao de clulas sangneas) Limpar o local utilizando algodo umedecido em lcool. Utilizar a lanceta picadora para retirar a amostra sangunea. Colocar uma gota pequena do sangue na extremidade direita da lmina. Com a outra mo segurar a lamnula contra o sangue formando um ngulo de 45. Deslocar a lamnula da direita para esquerda em um s movimento, firme, porem suave e uniforme, preservando o ngulo inicial entre as duas, lmina e lamnulas. Secar ao ar, agitando a lmina. Levar a lmina ao microscpio ptico para a analise e observao. Procedimento B(observao das clulas vegetais) Pegue a rolha (ou isopor) e faa um corte longitudinal utilizando um bisturi ou uma gilete. Aps cortar a rolha, pegue a folha (fresca) e coloque entre as suas metades da rolha fazendo assim uma espcie de sanduche. Faa um corte transversal com a gilete na rolha que contem a folha (obs: cortar o mais fino possvel, sem desfragmentar a folha). Com a pina, coloque o filete de folha na lmina. Leve a amostra ao microscpio para observao em 10 e 40x. Resultados Procure observar ao microscpio (40, 100x) as caractersticas das clulas sangneas e vegetais. Diferencie estruturas. Desenhe as clulas observadas. Quais as diferenas observadas entre as clulas vegetais e sangneas. Compare os dois resultados e Discuta!!! Bibliografia: AMABIS JM, MARTHO GR. Curso bsico de biologia, v.1. Clulas e tecidos. So Paulo: Moderna, 1985. JORDO BQ et al. Prticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. http://www.coralx.ufsn/parasitologia/laboratorio/esfregaco.html.
Figura 1: procedimento de coleta da amostra sangnea.
Figura 2: procedimento de corte da folha vegetal.
Figura 3: observao da clula vegetal no microscpio ptico.
Roteiro de aula pratica N 03: Observao de Protozorios. Introduo A biologia, sendo um campo amplo de pesquisa possibilita o estudo de seres multicelulares e unicelulares. A diversidade biolgica abrange grande nmero de organismos unicelulares, com diferentes histrias evolutivas (filogenia) agrupados de forma artificial como Protistas (Algas e Protozorios). Essa aula tem como principal objetivo reconhecer ao microscpio indivduos do Reino Protista, mas especificamente, protozorios e suas principais caractersticas morfolgicas e estruturais. Materiais e Equipamentos Instrumental Microscpio ptico, lmina, lamnula, papel de filtro, placa de petri, conta gotas. Qumicos lcool 70%, cido actico 50%, leo de imerso. Biolgicos Amostra de gua, arroz e alface. Procedimentos Colete uma amostra de gua no tratada (rios, riachos, lagos ou outra). Coloque essa a mostra em uma placa de ptri, uma com alface e outra com arroz. Deixe a cultura em descanso por uma semana. Utilizando um conta gotas retire uma amostra de gua da cultura em descanso. Com o mesmo conta gotas pingue uma gota da amostra em uma lmina. Em seguida, coloque uma lamnula sobre a mesma. Retire o excesso de gua com o papel filtro. Leve a lmina em um microscpio ptico e observe o material nas objetivas de 10, 40 e 100x. Obs: Colocar uma gota de cido actico 50% ou lcool 70% para fixar o material. Resultados Desenhe o que foi observado no microscpio ptico. Identifique os diferentes tipos de protozorios encontrados. Observe as estruturas dos protozorios. Discuta os resultados com a bibliografia, relate e conclua. Bibliografia AMABIS JM, MARTHO GR. Curso bsico de biologia, v.1. Clulas e tecidos. So Paulo: Moderna, 1985. JORDO BQ et al. Prticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. NEEDHAM JG, NEEDHAM PR. Gua para el estdio de los seres vivos de las guas dulces. Barcelona: Revert, 1978. RUPPERT ED, Fox RS, Barnes RD. Zoologia de Invertebrados. 7th ed. So Paulo: Rocca, 2005. http://www.ruhr.de/postnuke/html/index. php http://upsidedownhippo.com/
Figura 1: Paramecium sp
figura 2: Bursria sp
Estrutura do fitoflagelado, Euglena Gracilis
Estrutura de um esporozorio (Fonte das figuras: Ruppert & Barnes, 6a ed, 1996) Exemplos de Ciliados: e
Estrutura de um Paramecium
Sarcodina:
10
Roteiro de aula prtica N 04: Fungos, Algas e Lquens. Introduo Tendo em vista as caractersticas evolutivas dos seres vivos, os eucariotes como as algas e os fungos so organismos adaptados a ambientes aquticos e terrestres, possuindo nas suas estruturas internas e externas caractersticas que os diferenciam de outros grupos como protozorios, plantas e animais. Apesar dos fungos possurem parede celular como as algas e as plantas eles diferem por possurem uma composio diferente na parede, no ter pigmentos fotossintetizantes, no armazenar amido como substncia de reserva e no ter grandes vacolos. J as algas so confundidas freqentemente com vegetais por possurem estruturas morfolgicas semelhantes, mas existem caractersticas especficas das algas que diferenciam do Reino Plantae (vegetal), como por exemplo, clorofilas diferentes e estruturas moleculares especficas das suas clulas, capacidade de locomoo, a formao de colnias e muitas delas ser comumente unicelulares, as algas multicelulares na formam os tipos de tecido vascular encontrados nas plantas. Esta aula tem como objetivo principal observar e diferenciar as principais caractersticas de fungos e algas, possibilitando aos alunos um maior conhecimento sobre os mesmos. Materiais e Equipamentos Instrumental Placa de ptri, microscpio ptico, lmina, lamnula, papel filtro, conta gotas, pina, lupa. Qumicos cido actico e/ou ltico 45%, azul de metileno 1%. Biolgicos Amostra de fungos (po e/ou outros alimentos embolorados), algas (lodo de riacho, gua de estanques sem tratamento) e lquens (encontrados sobre rochas, muros abandonados ou em plantas). Procedimentos A(algas) Colete uma amostra de alga (em rios e riachos). Obs.: para coletar a alga retire o lodo que fica nas margens e superfcie dos rios ou riachos. Com auxlio de uma pina fina retire um filamento de alga e coloque sobre a lmina. Com o auxilio de um conta gotas, pingue uma gota de gua sobre a amostra. Em seguida coloque uma lamnula sobre a amostra. Retire o excesso de gua com o auxilio do papel filtro. Leve a amostra ao microscpio ptico e observe o material nas objetivas 10x 40x e 100x. Procedimentos B(fungos) Faa uma cultura de fungo (bolor de po, extrato de tomate, queijo ou outros alimentos) Colete uma amostra da cultura. Com o auxilio de uma pina, pegue a amostra e coloque em uma placa de ptri. Em seguida leve a placa de ptri at a lupa. Observe o material. Coloque uma sub-amostra (pouco) em uma lmina adicione uma gota de azul de metileno 1%, azul de toluidina 0,25% ou lugol e cobrir com uma lamnula para observar ao microscpio nas objetivas 10x 40x. De uma folha vegetal mofada ou embolorada peguei uma amostra com uma fita adesiva (durex) colocando a fita sobre a folha e retire o material, depois colocar fita sobre uma lmina contendo uma gota de cido ltico ou acido actico 45% segurando pelos extremos da lmina, observe ao microscpio nas objetivas 10x 40x. Procedimentos com Liquens Pegue amostras de diferentes liquens e observe na lupa. Com uma pina retire uma pequena sub-amostra e coloque em uma lmina, com a pina e/ou com agulhas finas separe o material em pequenas partes, adicione uma gota de azul de metileno e cobra com uma lamnula, observe ao microscpio nas objetivas 10x 40x, diferencie as clulas dos fungos e das algas. Resultados Desenhe o que foi observado, coloque os aumentos totais usados na lupa e no microscpio.
11
Identifique as diferentes estruturas, do que foi observado, compare com a bibliografia. Quais so as diferenas na composio da parede celular de fungos e algas. Discuta os resultados com a bibliografia, relate e conclua. Bibliografia: MADIGAN MT, MARTINKO JM, PARKER J. Microbiologia de Brock - 10 ed. - Pearson - Prentice Hall, So Paulo, 2004 (2003 em ing). NEDER RN. Microbiologia: Manual de laboratrio, So Paulo: Nobel, 1992. PELCZAR Jr. MJ, Microbiologia: Conceitos e Aplicaes, vol 1, So Paulo: editora Makron Books 1996. RAVEN PH, EVERT RF, EICHORN SE. Biologia Vegetal. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007 (2005 em ing). TRABULSI LR, Microbiologia, 3 edio, So Paulo: editora Atheneu, 2002. VALENCIA HA. Manual de prticas de microbiologia bsica. Coleccin Notas de clase, Facultad de Ciencias, Bogot: Universidad Nacional de Colombia, 2004.
Figura 1: algas Fonte: www.planetarios.com
Micrasterias sp, alga verde. Fonte: Madigan et al., 2004.
Ciclo de vida de um cogumelo. Ciclo de vida de um bolor. Figura 2: fungos Fonte:www.enq.ufsc.Br Fonte: Madigan et al., 2004.
Figura 3: liquens. Fonte: Raven et al., 2005.
12
Roteiro de aula pratica N 05: Diferenciao de Paredes Celulares de Clulas Vegetais. Introduo Entre vrios componentes de uma clula vegetal, a parede celular uma estrutura de suma importncia para o vegetal, que uma matriz extracelular constituda principalmente por celulose. Essa parede celular tem funes especificas e essenciais como absoro, transporte e secreo de substncia. Alm de ajudar nas atividades de proteo contra agentes patognicos (fungos, bactrias e vrus) e outros parasitas como insetos e nematdeos. Esta prtica tem como principal objetivo, a observao e diferenciao dos vrios tipos de parede celular, e verificar a propriedade citoqumicas da basoflia do azul de toluidina. Basofilia: a capacidade de colorao de substancia com carter bsico. Acidofila: a capacidade de colorao de substancias de carter acido. Materiais e Equipamentos Instrumental Microscpio ptico, lmina, lamnula, lmina de barbear, isopor, placa de petri, pina, conta gotas. Qumicos Azul de toluidina 0,20%, gua destilada. Biolgicos Caule de abbora (Cucrbita sp.), cebola (Allium cepa), folhas de Pingo de ouro (Duranta repens), Roseira (Rosa sp), corao roxo Tradescantia e outros vegetais. Procedimentos Cucrbita sp Faa com o auxilio de uma lmina de barbear, um corte transversal bem fino do caule da abbora. Coloque sobre uma lmina com a pina e coloque uma gota de azul de toluidina a 0,20%. Aguarde um minuto e cubra com a lamnula, evitando a formao de bolhas de ar. Leve at o microscpio ptico e observe na objetiva de 10x e 40x. Esquematize na objetiva de 40x. Epiderme da cebola Retire um fragmento da epiderme superior de uma das camadas foliares do bulbo de cebola. Faa uma preparao a fresco e com gua, examinando ao microscpio nas objetivas de 10 e 40x. Depois substitua a gua da preparao por azul de toluidina e observe no microscpio. Resultados Cucrbita sp Na observao analise com ateno a parede celulsica das clulas dos seguintes tecidos que compem esse corte; epiderme, colnquima, esclernquima, parnquima e feixes vasculares. Analise as observaes e discuta com bibliografia. Epiderme da cebola Que estruturas celulares se mostram basfilas. Observe, esquematize e descreva o que foi observado. Resultados & Discusso A partir das observaes explique o que foi observado desde o ponto de vista qumico e estrutural. Bibliografia: Raven, PH et al. Biologia vegetal, 5 ed, Rio de janeiro: Guanabara Koogan, 1996. Jordo, B Q, Pratica de Biologia celular, Londrina, UEL, 1998. Rodrigues AN, Estelita MEM. Anatomia da raiz de Cyperus giganteus Vahl (Cyperaceae) em desenvolvimento. Rev. bras. Bot.vol.27 no.4: So Paulo Oct./Dec.2004
13
Pele de cebola ou Tradescantia. Corte transversal de caule. Fontes: http://www.scielo.br/img/fbpe/sa/v53n1/a10f9.gif, http://www.didier-pol.net/1thcmont.gif
14
Roteiro de aula prtica N 06: Plastos e Amido. Introduo: O amido principal produto de reserva vegetal geralmente encontrado em rgo de reserva nutritiva, como razes do tipo tuberoso e gros, tm diferentes formas que varia de acordo com cada estrutura especfica. Entre varias adaptaes, os vegetais desenvolveram as substncias de reservas tanto para auxiliar no desenvolvimento embrionrio como tambm em fontes de energia. No desenvolvimento embrionrio essas reservas (amido) localizam-se tanto no pericarpo, aleurona e endosperma dos frutos e gros (milho, cevada, soja e feijo entre outros). Como fonte de energia os vegetais armazenam suas substncias energticas (amido) nos parnquimas de reservas, que permeado pelo tecido vascular dando origem s razes tuberosas (cenoura, batatadoce, beterraba). Estas substancias de reserva encontram-se dentro de plastos, como os cloroplastos que se apresentam de cor verde pela clorofila, outros podem ser leucoplastos (brancos ou sem cor) e cromoplastos. O objetivo da prtica reconhecer estruturas de reserva (gros de amido) em tecidos vegetais, morfologia e diferena entre espcies. Materiais e Equipamentos Instrumental Microscpio fotnico, Lmina, Lamnula, Lmina de barbear, Bisturi, Pina. Qumicos Azul de toluidina 0,2 % (soluo cida que vai corar substncias bsicas), gua destilada, azul de metileno, eosina amarela 0,5 %, eosina azul 0,5 % Biolgicos Tubrculos: batatas, mandioca, cenoura e beterraba. Gros: cevada, feijo, milho, soja e trigo. Procedimentos: Corte o tubrculo ou a raiz ao meio e com lmina de barbear faa uma pequena raspagem, retire somente o leite da raspagem e coloque sobre a lmina sobre a mesma coloque uma gota de gua destilada e coloque a lamnula e leve ao microscpio fotnico. (gros, cortar ao meio e retirar a parte central em pequenas partculas e fazer como nos procedimentos anteriores). Observar sem corante: formatos e tamanhos diferentes e as birrefrigncias (propriedade fsica) nas diferentes objetivas, os leucoplastos = branco e os cromoplastos=amarelo, laranja, vermelho. Resultados Desenhe o que foi observado no microscpio Identifique os diferentes tipos de amido. Observe as estruturas dos amidos. Discuta os resultados com bibliografia, relate e conclua. Bibliografia Raven PH, Evert RF. Biologia Vegetal. 5 ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1992. Esau K. Anatomia das Plantas com Sementes. So Paulo: Edigard Blcher Ltda, 1976. Vidal WN, Vidal MRR. Botnica Organografia: Quadros sinpticos ilustrados de Fanergamos. 4 ed, Viosa: UFV, 2000.
Figura 1. Gro de amido, mostrando o hilo ou cicatriz ao centro, Fonte:
15
http://www.cerelab.com.br/images/AmidoMilho.jp
http://www.scielo.br/img/revistas/pab/v38n1/a04fig01.gif
16
Roteiro de aula pratica N 07: Anlise de Plastos. Introduo As clulas vegetais tm organelas especificas (plastos) que as clulas animais no possuem, essas organelas so responsveis pela absoro de energia luminosa e outras funes, entre eles temos os cloroplastos, amiloplastos que armazenam amido. Assim podemos denominar essas organela de plastos, que possuem pigmentos diferentes, cromoplastos ou leucoplastos (incolores). Os plastos so relacionados com a reserva de alimentos ou com a colorao de muitos rgos vegetais como; flores, frutas, folhas.e tubrculos. Os leucoplastos tm uma funo mais nutritiva que de colorao, podendo ser encontrados em rgos de reserva com tubrculos (razes ou caules). Os plastos tm vrias cores como: vermelho (eritroplastos), amarelo (xantoplastos) e os verdes (cloroplastos). Os eritroplastos tm essa colorao por possurem uma grande quantidade de carotenos, j s xantoplastos tm uma colorao amarelada por possurem uma grande quantidade de xantofila e os cloroplastos que o mais predominante entre eles, tem uma colorao mais esverdeada por possuir uma alta concentrao de clorofila. Material e Equipamentos Instrumental Microscpio fotnico, lmina, lamnula, pina, pincel, papel filtro, bisturi, lmina de barbear, placa de ptri. Qumico gua destilada e soluo de lugol. Biolgico Tubrculos (Daucus escarota, Solanum tuberosum), folhas e flores (Rosa sp. ou Hibiscus syriacus) Procedimentos Folha e flor Pegue uma flor ou folha (Rosa sp e/ou Hibiscus syriacus) Faa um corte transversal numa ptala. Passe o corte para uma lmina, adicione uma gota de gua destilada. Coloque uma lamnula, levando essa amostra ate o microscpio fotnico, para analisar nas objetivas de 10 e 40x. Depois da observao no microscpio adicione um pouco de lugol para analisar no microscpio novamente. Tubrculos Faa um corte transversal no tubrculo cenoura ou batata (Daucus escarota e Solanum tuberosum). Coloque o corte em uma lmina com gua e observe no microscpio fotnico. Depois de analisar sem soluo de lugol, adicione uma gota para observao. Resultados Analise o que foi observado, e esquematize na objetiva de 40x. Diferencie os diferentes tipos de plastos encontrados e esquematize citando suas diferenas. Quais os plastos mais abundantes nas folhas e ptalas das flores. Quais os plastos predominantes nos tubrculos. Bibliografia http://www.maristas.org.br/colegios/assuncao/pags/site_colegio/espaco/citologia_paulo/212/citologia_11030216/ plastos.htm http://www.maristas.org.br/colegios/assuncao/pags/site_colegio/espaco/citologia_paulo/213/citologia_11030354/ plastos.htm Jordo, B Q, Pratica de Biologia celular, Londrina, UEL, 1998. Raven PH, Evert RF. Biologia Vegetal. 5 ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996.
www.luc.edu/depts/biology/111/elodea.jpg
micol.fcien.edu.uy/atlas/50.jpg 17
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul

Unidade de Ensino de Ivinhema MS Curso de Cincias Biolgicas
Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica

Roteiro de aula pratica N 08: Diviso Celular e Cromossomos (Mitose I). Introduo Todos os indivduos no inicio do seu desenvolvimento embrionrio so formados por apenas uma clula que da origem a todas as outras clulas do organismo - pluricelulares. Essa nica clula comea a sofrer mitose, que um processo constante nos organismos, esse processo de diviso constante provoca o crescimento dos indivduos. Durante este processo tambm ocorre diferenciao celular, que possibilita a transformao das clulas, de modo que realize outras funes orgnicas. A mitose um processo de diviso celular que forma clulas-filhas com o mesmo numero de cromossomos da clula me. Desse modo a mitose forma clulas idnticas s clulas que as originaram. Esse processo est dividido em quatro etapas para facilitar o entendimento, e essas etapas ocorrem nesta ordem e so: prfase, metfase, anfase e telfase. Materiais e Equipamentos Instrumental Microscpio ptico, lminas, lamnulas, lmina de barbear, estilete, bquer, lupa. Qumicos Soluo de lcool actico 3:1, soluo de cido clordrico molar (1M), lcool 95%, soluo de orcena actica 1,5%. Biolgicos Meristemos apicais de raiz do broto de feijo e raiz do broto da cebola. Procedimentos Pegue as pontas das razes (cebola ou feijo) e coloque em uma soluo de lcool actico 3:1 onde deve permanecer para fixao, durante 15 minutos. Passe-as em seguida para uma soluo de cido clordrico e lcool 95%, em quantidades iguais (1:1). Onde permaneceram por 10 minutos. Em seguida passe as razes para uma outra soluo de lcool actico onde deve ficar mais cinco minutos. Leve ate a lupa para cortar as coifas e faa um corte de cerca de 2mm das pontas, dissocie os corte, com uma lamnula esmague antes de levar ate ao microscpio fotnico. Coloque-as em uma lmina com orcena actica 1 a 2%. Resultados Observe ao microscpio os aspectos dos cromossomos e as fases da diviso. Descreva as modificaes sofridas pelo ncleo celular durante o processo. Esquematize as modificaes de acordo com as etapas do processo. Discuta os resultados e o seu significado para os organismos. Bibliografia JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro j. Biologia celular, 8 ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4 ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006 (2004).
Mitose. Foto: Lucilene.
www.todabiologia.com/citologia/mitose2.jpg
18

Unidade de Ensino de Ivinhema MS Curso de Cincias Biolgicas Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica Roteiro de aula prtica N 09: Mitose - Procedimento II. Introduo A diviso e a reproduo uma propriedade fundamental das clulas. As clulas se reproduzem atravs da duplicao de seus contedos e posterior diviso em duas clulas filhas, este processo a garantia de uma sucesso contnua de clulas idnticas com o mesmo contedo. Nos organismos multicelulares, apesar de inmeras variaes existentes, os diferentes tipos celulares apresentam um nvel de diviso tal que timo para o organismo como um todo, porque o que interessa a sobrevivncia do organismo como um todo e no de uma clula individual. Como resultado as clulas de um organismo dividem -se em nveis diferentes. Algumas clulas, como os neurnios quase nunca se dividem. Outras, como as epiteliais, dividem-se rpida e continuamente. O estudo clssico da diviso celular estabelece duas etapas no ciclo celular; de um lado aquela em que a clula se divide originando duas clulas descendentes e que caracterizada pela diviso do ncleo (mitose) e a diviso do citoplasma (citocinese). A etapa seguinte, em que a clula no apresenta mudanas morfolgicas, compreendida no espao entre duas divises celulares sucessivas e foi denominada de interfase (com trs fases G1, S, G2). A mitose (do grego: mitos = filamento) um processo de diviso celular, caracterstico de todas as clulas somticas vegetais e animais. um processo continuo que dividido em 5 fases: Prfase, metfase, anfase, telfase, nas quais ocorrem grande modificaes no ncleo, e a citocinese na qual apresenta-se a diviso do citoplasma. Prfase: caracteriza-se pela contrao dos cromossomos, que tornam-se mais curtos e grossos devido ao processo de enrolamento ou helicoidizao. O nuclolo se desorganizam (desaparecem) e os centrolos ou centrossomos, que foram duplicados durante a interfase, migram um par para cada plo celular. Metfase: O envoltrio nuclear desaparece por completo. Nesta fase os cromossomos duplos ocupam o plano equatorial do aparelho mittico. Os cromossomos adotam uma orientao radial, formando a placa equatorial. Os cinetcoros das duas cromtides esto voltados para os plos opostos. Ocorre um equilbrio de foras. Anfase: Inicia-se quando os centrmeros tornam-se funcionalmente duplos. Com a separao dos centrmeros, as cromtides separam-se e iniciam sua migrao em direo aos plos. O centrmero precede o resto da cromtide. Os cromossomos so puxados pelas fibras do fuso e assumem um formato caracterstico em V ou L dependendo do tipo de cromossomo. A anfase caracteriza-se pela migrao polar dos cromossomos. Telfase: A telfase inicia-se quando os cromossomos-filhos alcanam os plos. Os microtbulos (MT) cinetocoricos desaparecem e os MT polares alongam-se. Os cromossomos comeam a se desenrolar, num processo inverso a Prfase. Estes cromossomos agrupam-se em massas de cromatina que so circundadas pr cisternas de Retculo endoplasmtico (RE), os quais se fundem para formar um novo envoltrio nuclear. Citocinese: o processo de clivagem e separao do citoplasma. A citocinese tem inicio na anfase e termina aps a telfase com a formao das clulas filhas. Em clulas animais forma-se uma constrio, ao nvel da zona equatorial da clula me, que progride e estrangula o citoplasma. Esta constrio devida a interao molecular de actina e miosina e microtbulos. Reaparecem os nuclolos. Como resultado de uma diviso mittica teremos duas (2) clulas filhas com numero de cromossomos iguais a da clula me. Objetivo: diferenciar as etapas do ciclo celular e as fases da mitose em tecidos vegetais. Materiais e Equipamentos Instrumental Lminas, lamnulas, lmina de barbear ou bisturi, estilete, pinas, bquer, tubo de ensaio pequeno, placa de petri, papel de filtro, microscpio ptico, lupa. Qumicos Soluo de lcool etlico absoluto-cido actico glacial (3:1), soluo de cido actico 45%; Corantes: soluo de orcena actica 1% e/ou aceto-carmim 1%. Biolgicos Meristemos apicais de raiz do broto de feijo e raiz do broto da cebola.
19
Procedimentos Pegue as pontas (dois a trs mm) das razes (cebola e/ou feijo) e coloque em uma soluo de lcool actico 3:1 onde deve permanecer para fixao em placa de petri, durante 10 a 15 minutos. Passe-as em seguida para uma soluo de cido actico 45% em tubo de ensaio, onde permanecero por 5 minutos. Adicione umas gotas de corante e aquea na lamparina, evitando que ferva, deixe repousar 2 min e aquea de novo levemente. Coloque uma ou duas pontas das razes em uma lmina com uma gota de corante, coloque uma lamnula sem deixar formar bolhas de ar, esmague cuidadosamente o material com ajuda de um lpis at o material espalhar; com ajuda de papel filtro pressione a preparao com o polegar sem deixar escorregar a lamnula nem quebrar ela. Levar ao microscpio fotnico, observao nas objetivas de 10, 40 e 100x. Resultados Observe ao microscpio o tecido e identifique as clulas em mitose e em interfase. Diferencie, caracterize e desenhe as fases da mitose. Qual etapa do ciclo celular mais freqente?, explique. Nas metfases conte o nmero de cromossomos Anlise os dados da cebola e do feijo, discuta as diferenas. Bibliografia ALBERTS B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Clula, 4a ed, Edit Artes Mdicas, Porto Alegre, 2004 (2002 ing.). CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Clula. 2a ed, So Paulo: Manole, 2007. DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006 (2004). GONZLEZ T, SPINEL C (ED). Prticas de Laboratrio: Biologa Celular. Notas de clase, Facultad de Ciencias, Bogot: Universidad Nacional de Colombia, 2004. JORDO BQ et al. Prticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. Citologia Prof Cynara. http://www.cynara.com.br/citologia.htm
Anexo - Fases da mitose. I interfase, II Prfase, III Prometfase, IV Metfase, V e VI Anfase, VII Telfase, VIII Citocinese. Fonte: pt.wikipedia.org/wiki/Mitose
20
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema MS Curso de Cincias Biolgicas Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica
Roteiro de aula prtica N 10 e 11: Cromossomos de Insetos. Resumo Os cromossomos so partculas microscpicas formadas por cromatina (DNA + Protenas), eles podem ser visualizados quando a cromatina est altamente condensada nas fases de mitose ou de meiose durante o ciclo celular de clulas somticas ou reprodutivas. Insetos apresentam tecidos como crebro e gnadas para anlise fcil e rpido de cromossomos. A prtica permitir observar e identificar cromossomos em diferentes rgos de insetos. Introduo Os cromossomos so arranjos de cromatina (ADN e protenas) que contm a informao gentica dos organismos (os genes). Essa cromatina pode estar altamente condensada e dessa forma podem ser visualizados os cromossomos em algumas etapas especficas do ciclo celular (mitose, endomitose ou meiose). Cromossomos em estas etapas podem ser mitticos, politnicos (muitas fitas) ou meiticos, e podem ser facilmente observados em diferentes tecidos de insetos (gnglio cerebral, ovrios, testculos, glndulas salivares e tbulos de Malpighi entre outros) e em diferentes fases ou estgios de vida (larva, pupa/ninfa e adulto) dos insetos. Insetos geralmente apresentam tecidos com clulas diplides (2n - ou com dois conjuntos de cromossomos), mas tambm podem apresentar tecidos com muitos conjuntos de cromossomos (poliploidia ou endopoliploidia). Os insetos Diptera (borrachudos, moscas, mosquitos entre outros) so cromossomicamente incomuns, pois tm menor nmero de pares de cromossomos, geralmente 2-10, do que os nmeros usuais em outros insetos. Em muitos tecidos de insetos, alm de ciliados, mamferos e plantas, as clulas perdem a capacidade de se dividir (mitose) em uma dada fase inicial do desenvolvimento, e os cromossomos continuam a replicar-se por um processo de endomitose sem a diviso do ncleo. Tais clulas so chamadas endopoliplides, podendo conter em seus ncleos os chamados cromossomos politnicos. Os cromossomos politnicos corados tm padro caracterstico de bandas escuras, alternadas com regies plidas no coradas, as interbandas. Materiais e Equipamentos Instrumentos Agulhas de disseco, lminas, lamnulas, lmina de barbear ou bisturi, estilete, pinas finas, bquer, tubo de ensaio pequeno, placa de petri, papel filtro, microscpio fotnico, lupa. Qumicos Soluo carnoy: lcool etlico absoluto-cido actico glacial (3:1), soluo de cido actico 50% (1 gua: 1 de cido actico glacial); Corantes: soluo de orcena actica 1-2% Biolgicos Larvas, pupas e/ou adultos de insetos (mosquitos) ninfas e/ou adultos (gafanhotos). Procedimentos Pegue o material biolgico (larvas, pupas/ninfas e/ou adultos dos insetos) e com ajuda de pinas e/ou agulhas de ponta fina, retire com cuidado a parte posterior do corpo (dois ltimos segmentos abdominais) expondo os tbulos de Malpighi, os ovrios (alongados) ou os testculos (mais pequenos e arredondados). Coloque os rgos (tecido) retirado em uma lmina com soluo carnoy (1-2 gotas) onde deve permanecer para fixao 5 minutos. Passe em seguida o material para uma soluo de cido actico 50% na mesma lmina, onde permanecero por mais 5 minutos. Passe o material (na mesma lmina) para uma gota de corante orcena e deixe repousar 2 a 5 min, dissecando (cortando) o tecido em pequenos fragmentos com ajuda das agulhas. Coloque uma lamnula sem deixar formar bolhas de ar, e esmague cuidadosamente o material com ajuda de um lpis at o material espalhar; com ajuda de papel filtro pressione a preparao com o polegar sem deixar escorregar a lamnula nem quebrar ela. Levar ao microscpio fotnico e observar nas objetivas de 10, 40 e 100x.
21
Resultados Observe ao microscpio o tecido e identifique as clulas com seus ncleos. Diferencie, caracterize e desenhe os cromossomos. Que caractersticas (tamanho, forma) podem ser apreciadas?, explique. Identifique fases diferentes e conte o nmero de cromossomos Anlise os dados, discuta as observaes. Bibliografia ALBERTS B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Clula, 4a ed, Edit Artes Mdicas, Porto Alegre, 2004 (2002 ing.). CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Clula. 2a ed, So Paulo: Manole, 2007. Campos J, Andrade CFS & Recco-Pimentel SM. Malpighian tubule polytene chromosomes of Culex quinquefasciatus (Diptera, Culicinae). Mem. Inst. Oswaldo Cruz 98(3):383-386, 2003. http://www.scielo.br/pdf/rsp/v37n4/16789.pdf Campos G J, Recco-Pimentel SM & Andrade CFS. Polytene chromosome analysis of a population of Simulium pertinax (Diptera: Simuliidae). Rev. Bras. Genet. 19:47-52, 1996. DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006 (2004). GONZLEZ T, SPINEL C (ED). Prticas de Laboratrio: Biologa Celular. Notas de clase, Facultad de Ciencias, Bogot: Universidad Nacional de Colombia, 2004. JORDO BQ et al. Prticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. Cromossomos metafsicos:
Simulium pertinax (borrachudo) Aedes aegypti (mosquito) Cromossomos politnicos:
Drosophila melanogaster (mosca da fruta)
Culex quinquefasciatus (mosquito pernilongo)
22
Roteiro de aula pratica No 12: Bactrias Introduo As bactrias apresentam uma estrutura celular bastante simples. Diferente do que ocorre com as clulas animais e vegetais, elas nem sempre apresentam as mesmas caractersticas, com isso, apresentam variaes em sua forma, tamanho, virulncia. Esta forma de vida unicelular e procarionte pode ser encontrada isolada ou em colnias. Muitas bactrias possuem estruturas extracelulares como flagelos ou clios, organelas de locomoo presentes nas bactrias mveis. Muitas delas podem possuir esporos (formaes que conferem resistncia s bactrias), devido ao meio ambiente inadequado sua condio de vida, esta uma forma delas se manterem vivas at encontrarem sua condio ideal de sobrevivncia. H ainda aquelas que no possuem esporos, estas so chamadas de vegetativas. De forma geral, as bactrias apresentam entre suas organelas: cpsula, membrana plasmtica, ribossomos, parede celular, DNA, flagelo e plus. Elas podem ser classificadas em dois grupos: gram-positiva ou gram-negativas. As gram-positivas possuem uma parede celular mais espessa e constituio qumica formada por poliptdeos, acares aminados (glucozamina, cido murmico) e fosfato de ribitol. As bactrias classificam-se morfologicamente de acordo com a forma da clula e com o grau de agregao: Quanto forma: Coco de forma esfrica ou subesfrica (do gnero Coccus); Bacilo em forma de bastonete (do gnero Bacillus); Vibrio em forma de vrgula (do gnero Vibrio); Espirilo de forma espiral/ondulada (do gnero Spirillum); Espiroqueta - em forma acentuada de espiral. Objetivo Observar e caracterizar a morfologia celular de bactrias (procariotes) e identificar e diferenciar estruturas de parede celular de bactrias Gram e Gram +. Material e Equipamentos Instrumentos Agulhas de diseco, bastonetes de vidro, lminas, lamnulas, estilete, pinas finas, placas de petri, conta gotas, papel filtro, microscpio fotnico, lupa; lamparina. Qumico Soluo carnoy: lcool etlico absoluto-cido actico glacial (3:1), soluo de cido actico 50% (1 gua: 1 de cido actico glacial); Corantes: Azul de metileno 1%, Azul de toluidina 0,6%, soluo de orceina actica 1-2%, soluo de iodo 1%, leo de imerso. Biolgico Amostras de epitlios bucais; Culturas de bactrias com vrios dias em condies de laboratrio. Bactrias Com ajuda de um bastonete ou agulha esterilizada na lamparina, colete uma amostra pequena da cultura e coloque espalhando em uma camada fina sobre a lmina, tipo um esfregao. Deixe secar ao ar, 1 a 2 min. Passar a lmina sobre a chama para fixao, sem deixar esquentar (no deve fumacear ou ferver) Depois de esfriar uns 2 min, cobrir a lmina com corante 1 a 3 min. Lavar com gua, escorrer e deixar secar ao ar. Levar ao microscpio, use as objetivas de 40 e 100x para observao. Colorao de Gram Cobrir o esfregao fixado pelo calor (depois de esfriar) com cristal violeta, por 1 min. Adicionar a soluo de iodo por 3 min. Descorar rapidamente com lcool 70% por aprox 20 seg. Contracorar (corar de novo) com safranina por 1-2 min.
23
Mtodo de Colorao de Gram (fonte: Madigan et AL., 2004):
Resultados Desenhe e compare os resultados com os colegas. Com ajuda da bibliografia, discuta os resultados, caracterize morfolgica e estruturalmente as bactrias e diferencie, caracterize usando as obejtivas de 40 e 100x. Bibliografia: MADIGAN MT, MARTINKO JM, PARKER J. Microbiologia de Brock - 10 ed. - Pearson - Prentice Hall, So Paulo, 2004 (2003 em ing). NEDER RN. Microbiologia: Manual de laboratrio, So Paulo: Nobel, 1992. PELCZAR Jr. MJ, Microbiologia: Conceitos e Aplicaes, vol 1, So Paulo: editora Makron Books 1996. RAVEN PH, EVERT RF, EICHHORN SE. Biologia Vegetal. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007 (2005 em ing). TRABULSI LR, Microbiologia, 3 edio, So Paulo: editora Atheneu, 2002. VALENCIA HA. Manual de prticas de microbiologia bsica. Coleccin Notas de clase, Facultad de Ciencias, Bogot: Universidad Nacional de Colombia, 2004.
Anexo - Bactrias (morfologia):
24
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema- MS Curso Cincias Biolgicas Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular-Citologia & Citogentica
Roteiro de aula prtica N 13: Fungos. Introduo Na natureza h diferentes tipos de fungos. Podemos dizer que eles so uma forma de vida bastante simples. Com relao s diferenas, existem aqueles que so extremamente prejudicais para a sade do homem, causando inmeras enfermidades e at intoxicao. Encontramos tambm os que parasitam vegetais mortos e cadveres de animais em decomposio. Temos tambm os que so utilizados para alimento e at aqueles dos quais se pode extrair substncias para a elaborao de medicamentos, como, por exemplo, a penicilina. H alguns tipos de fungos que surge atravs dos esprios, clulas quase microscpicas que encontramos flutuando no ar. Os esprios ao carem em solo mido e ambiente ideal para o crescimento de um novo fungo se desenvolvem rapidamente. Por no possuir clorofila, que essencial para garantir a alimentao das plantas, esta forma de vida age como parasita, se alimentando da comida de outras formas de vida. Os fungos so decompositores e colonizadores do solo, parasitas e at patgenos. Podemos dizer que eles so uma forma de vida bastante simples. Com relao s diferenas, existem aqueles que so extremamente prejudicais para a sade do homem, causando inmeras enfermidades e at intoxicao. Encontramos tambm os que parasitam vegetais mortos e cadveres de animais em decomposio.
Temos tambm os que so utilizados para alimento e at aqueles dos quais se pode extrair substncias para a elaborao de medicamentos, como, por exemplo, a penicilina. H alguns tipos de fungos que surgem atravs dos esporos, estruturas microscpicas que encontramos flutuando no ar e que quando germinam formam clulas eucariticas com parede celular composta por quitina principalmente. Por no possuir clorofila, que essencial para garantir a alimentao das plantas, esta forma de vida age como parasita, se alimentando da comida de outras formas de vida.
Objetivo: Diferenciar estruturas de fungos (eucariotes). Materiais e Equipamentos Instrumental Cultura de Fungos e bactrias: boca, nariz, barba, ouvido e rosa. Qumicos Violeta de metila, lugol 1/20, safranina, lcool etlico, gua destilada, azul de metileno, azul de toluidina e cido actico. Biolgicos Placa de ptri, microscpio ptico, pina, lupa, conta gotas, pipeta, papel de filtro, leo de imerso, lmina, lamnula, lamparina. Procedimento I Anlise macroscpica I (a olho desarmado) Observar as UFCs (unidades formadoras de colnias de fungos) com a placa de petri ainda fechada (parte superior com a tampa para baixo). Quantificar (por contagem) as UFCs, caso seja possvel (quando no existe sobrecrescimento de UFCs). Observar cada UFC quanto a: (i) aspecto (filamentoso, no-filamentoso), (ii) colorao (branca, verde, negra, castanha, outros). Com a placa de petri ainda fechada, inverter a placa e observar fundo da mesma, tentando correlacionar as UFCs que foram vistas por cima com as observadas por baixo. Procedimento II Faa uma cultura de fungos em placa de petri com mdio Batata-Destrose-Agar (BDA) Com ajuda de um bastonete, agulha ou pina esterilizado na lamparina, colete uma amostra pequena da cultura e coloque em uma lmina espalhando, adicione uma gota de cido actico 50% por 1 min e depois uma gota de azul de metileno 1%, az, de toluidina, Lugol e/ou orcena e cobrir com uma lamnula para observar ao microscpio nas objetivas 10, 40 e 100x. Preparo da lmina para observao ao microscpio
25
Retirar, com auxlio de uma pina e um estilete, pequena quantidade do miclio e/ou estruturas reprodutivas de uma UFC. Colocar o material retirado sobre uma lmina previamente limpa e seca Colocar, com o auxlio de um conta-gotas, 1 gota de gua destilada Desfiar suavemente o material sobre a lamnula, utilizando duas pinas (uma delas para manter parte do material firme e a outra para puxar outra parte do material). Discusso Observe os diferentes tipos de bactria (bacilo, coco, vibrio, espirilo, espiroqueta). Esquematize o material encontrado. Diferencie os diferentes tipos de fungos e esquematize-os. Bibliografia MADIGAN MT, MARTINKO JM, PARKER J. Microbiologia de Brock - 10 ed. - Pearson - Prentice Hall, So Paulo, 2004 (2003 em ing). NEDER RN. Microbiologia: Manual de laboratrio, So Paulo: Nobel, 1992. PELCZAR Jr. MJ, Microbiologia: Conceitos e Aplicaes, vol 1, So Paulo: editora Makron Books 1996. RAVEN PH, EVERT RF, EICHHORN SE. Biologia Vegetal. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007 (2005 em ing). TRABULSI LR, Microbiologia, 3 edio, So Paulo: editora Atheneu, 2002. VALENCIA HA. Manual de prticas de microbiologia bsica. Coleccin Notas de clase, Facultad de Ciencias, Bogot: Universidad Nacional de Colombia, 2004.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Col%C3%B4niasBact%C3%A9rias.jpghttp://pt.wikipedia.org/wikihttp://pt.wikipedia.o rg/wiki/Imagem:Col%C3%B4niasBact%C3%A9rias.jpghttp://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Col%C3%B4niasBact%C3% A9rias. http://www.uefs.br/disciplinas/bio221/fungos_assexuais_pratica.rtfhttp://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabal hos_pos2003/const_microorungos.htm
Anexos - Fungos:
Aspergillus sp
Penicilum sp
26

Unidade de Ensino de Ivinhema MS Curso de Cincias Biolgicas Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica Roteiro de aula prtica N 14: Observao de Gros de Plen. Introduo O plen o conjunto dos minsculos gros produzidos pelas flores das plantas angiospermas (ou pelas pinhas masculinas das gimnosprmicas), que so os elementos reprodutores masculinos ou microgametfitos, onde se encontram os gametas que vo fecundar os vulos, para os transformar em sementes e frutos.Os gros de plen so normalmente arredondados, embora os dos pinheiros sejam alados, e podem ser muito pequenos, apenas alguns micrometros. O mais pequeno gro de plen conhecido o do Myossotis com cerca de 6 m (0,006 mm) de dimetro. A forma e ornamentao dos gros de plen tpica de cada famlia ou mesmo de cada espcie de plantas.O plen contm uma grande proporo de protenas (16 a 40 %) contendo todos os aminocidos conhecidos, assim como numerosas vitaminas, principalmente as vitaminas C e PP, sendo a principal fonte de alimentao das abelhas. Outro importante produto fabricado com plen a gelia real. Esta composio do plen pode ser responsvel pelas alergias que lhe so atribudas. Pesquisas recentes indicam que o plen o alimento mais completo e valioso da natureza, pois alm de conter todos os aminocidos essenciais ao organismo humano, tambm rico em oligoelementos minerais, fibras, hormnios vegetais e vitaminas (conforme mencionado anteriormente). Objetivo Observar gros de plen em natura e corados de diferentes espcies; comparar as caractersticas. Material e Mtodos Instrumental Microscpio fotnico, Lmina, Lamnula, estilete da ponta fina, pincel. Material Qumico leo de imerso, corantes (orcena, azul de metileno e azul de toluidina). Material biolgico Flores de azalia, lrio, espirradeira, hibisco, maracuj, cravo-de-defunto, margarida, rosa, pinos. Procedimentos Colocar uma gota de gua sobre uma lmina e, com o auxilio de estilete da ponta fina, esmagar sobre a lmina a antera de maneira a liberar os gros de plen na gota dgua. O recolher os gros com um pincel. Remover os fragmentos grandes da antera. Cobrir a gota dgua com lamnula. Observar os gros de plen ao microscpio e desenha-los. Fazer ainda, outra preparao utilizando outro tipo de flor. Observar na objetiva de 10, e 40X. Coloque uma gota de leo de imerso sobre a lamnula e observe na objetiva de 100 X. Aplique um corante lateralmente embaixo da lamnula e observe se aparecem mudanas. Identifique estruturas, se necessrio faa um esmagamento com cuidado. Obs: o plen da flor de Pinus no precisa ser esmagado somente passar um pincel ou estilete da ponta fina sobre as anteras. Dependendo do desenvolvimento da antera possvel observar clulas em meiose. Bibliografia OLIVEIRA F et al. Praticas de morfologia vegetal. So Paulo: Atheneu, 2000. RAVEN PH, EVERT RF, EICHHORN SE. Biologia Vegetal. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. http://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%B3len
27
Anexos:
Figura 1: esquema de um gro de plen
Figura 2:gro de plen
Fonte: http://www.universitario.com.br/celo/topicos/subtopicos/botanica/anatomia_vegetal/flor/flor.html
Figura 3:diferentes tipos de gros de plen. Fonte: http://www.iac.sp.gov.br/bragantia/volume/5901/1078.pdf
28
Roteiro de aula prtica N 15 e 16: Meiose. Resumo O objetivo desta prtica visualizar a meiose, um processo especial de diviso celular dentro do ciclo celular dos organismos eucariticos, no qual so formados gametas ou esporos (clulas haplides) a partir de clulas diplides. Podem ser usados tecidos reprodutivos de fungos, vegetais, e/ou animais. As fases do processo de meiose sero diferenciadas, caracterizadas, analisadas e comparadas com as fases do processo de mitose. Introduo Organismos simples podem reproduzir-se atravs de divises simples. Este tipo de reproduo assexuada simples e direta e produz organismos geneticamente iguais. A reproduo sexual por sua vez envolve uma mistura de genomas de dois indivduos, para produzir um indivduo que difere geneticamente de seus parentais. O ciclo reprodutivo sexual envolve a alternncia de geraes de clulas haplides, com geraes de clulas diplides. A mistura de genomas realizada pela fuso de clulas haplides que formam clulas diplides. A meiose a diviso celular, essencial para a formao de gametas, que ocorre em clulas diplides e leva formao de clulas haplides. A meiose permite a recombinao gnica, de tal forma que cada clula diplide capaz de formar quatro clulas haplides geneticamente diferentes entre si. Isso explica a variabilidade das espcies de reproduo sexuada. Na mitose, quando o DNA dos cromossomos homlogos duplicado pelo processo de replicao na interfase do ciclo celular, cada um desses cromossomos replicado dando origem s cromtides irms que so ento separadas durante a anfase e migram para os plos celulares. Desta maneira na mitose cada clula filha recebe uma cpia do cromossomo paterno e uma cpia do cromossomo materno. A meiose (do gr. meioum = diminuir) ocorre nas clulas produtoras de gametas. Os gametas femininos e masculinos (vulos e espermatozides) so produzidos nos ovrios e nos testculos (as gnadas femininas e masculinas). A meiose precedida por um perodo de interfase (G1, S, G2) com eventos semelhantes aos observados na mitose, e num determinado momento da fase G2 do ciclo celular ocorrem alteraes que levam as clulas a entrar em meiose e darem origem a clulas haplides (n), ou seja, clulas que possuem a metade do nmero de cromossomos da espcie diplide. Podemos definir meiose como sendo o processo pelo qual nmero de cromossomos reduzido a metade. O gameta dotado de uma cpia do cromossomo materno ou paterno. A meiose um processo que envolve duas (2) divises celulares com somente uma duplicao de cromossomos. A meiose ocorre apenas nas clulas das linhagens germinativas masculinas e femininas e constituda por duas divises celulares: Meiose I e Meiose II. Podemos ter diferentes tipos de meiose: gamtica (animais, alguns protistas e algas), esprica (em plantas e em muitas algas) e zigtica (fungos e algumas algas). Fases: Na primeira diviso meitica, durante a prfase I os cromossomos homlogos divididos longitudinalmente emparelham e podem trocar material gentico num processo nomeado "crossing over" que aumenta a variabilidade dos descendentes, comea o desenvolvimento do complexo sinaptonmico, h formao de quiasmas (forma de cruz) e sntese de molculas. O invlucro nuclear e os nuclolos dissociam-se. Durante metfase I, os cromossomos homlogos dispem-se no plano equatorial da clula. Na anfase I no ocorre a diviso dos centrmeros, migrando os cromossomos homlogos inteiros para um dos plos. Durante a telfase I os cromossomos desfazem a formao espiral ou iniciam, diretamente a segunda diviso meitica das clulas. Na segunda diviso meitica, A prfase II mais rpida que a prfase I, formando-se o fuso acromtico. Na metfase II os cromossomos dispem-se na placa equatorial e ligam-se as fibras ao fuso enquanto as bolas se dispersam em relao ao tempo equatorial. Durante a anfase II os cromossomos filhos migram para os plos opostos. Na telfase II os cromossomos desfazem a formao espiral e reaparecem os nuclolos, o citoplasma divide-se em quatro clulas haplides originadas a partir da clula que deu incio ao processo. Objetivo: visualizar, caracterizar e diferenciar as etapas (fases) da meiose em fungos, vegetais e/ou animais. Materiais e mtodos Instrumental Lminas, lamnulas, lmina de barbear ou bisturi, estiletes, pinas, placa de petri, papel filtro, microscpio fotnico, lupa, lamparina de lcool.
29
Qumicos Carnoy (lcool etlico absoluto e cido actico glacial 3:1), soluo de cido actico 50%; Corantes: soluo de orcena actica 1%, e/ou aceto-carmim 1%, e/ou carmin propinico. Biolgicos Fungos, anteras imaturas de inflorescncias ou flores de diferentes plantas (ex., milho), e insetos. Procedimentos Colha o material biolgico e fixe-o em carnoy (3:1) por 5-10 min. Retire vrios botes de diversos pontos da inflorescncia, remova as anteras (ou os fungos ou as gnadas de animais invertebrados ou vertebrados) colocando sobre a lmina e com auxilio dos estiletes e/ou pinas libere as clulas sobre uma gota de corante. Cubra com lamnula e esmague (bata) suavemente sobre esta, com a ponta do estilete ou de uma caneta. Com as plantas e fungos, aquea o preparado brevemente na lamparina sem deixar ferver, duas ou trs vezes. Com ajuda de papel filtro pressione e remova o excesso de corante. Levar ao microscpio fotnico, observao nas objetivas de 10, 40 e 100x. Pode vedar a lamnula com esmalte incolor, passando duas ou trs vezes. Resultados Observe ao microscpio o material biolgico e identifique as clulas em meiose e em interfase. Diferencie, caracterize e desenhe as fases da meiose. Qual etapa do ciclo celular mais freqente no tecido observado? Explique. Nas metfases I II conte o nmero de cromossomos Anlise os dados de diferentes materiais biolgicos (animais, fungos e plantas), discuta as diferenas. Discusso Por que o nmero de cromossomos deve ser reduzido na meiose? (Milho, 2n=20 cromossomos, n=10). Por que o processo de meiose permite variabilidade gentica? Bibliografia: ALBERTS B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Clula, 4a ed, Edit Artes Mdicas, Porto Alegre, 2004 (2002 ing.). CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Clula. 2a ed, So Paulo: Manole, 2007. DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006 (2004). GONZLEZ T, SPINEL C (ED). Prticas de Laboratrio: Biologa Celular. Notas de clase, Facultad de Ciencias, Bogot: Universidad Nacional de Colombia, 2004. JORDO BQ et al. Prticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. RAVEN PH, EVERT RF, EICHHORN SE. Biologia Vegetal. 7a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007 (2005 em ing). Citologia Prof Cynara. http://www.cynara.com.br/citologia.htm
Anexos: http://pt.wikipedia.org/wiki/Meiose
30
Fases da mitose e da meiose. I interfase, II Prfase, III Prometfase, IV Metfase, V e VI Anfase, VII Telfase, VIII Citocinese. Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Mitose e Raven et al, 2005.
31

Unidade de Ensino de Ivinhema MS Curso de Cincias Biolgicas Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica Roteiro de aula prtica N 17 e 18: Identificao de Material Permanente. Resumo As caractersticas morfolgicas e estruturais das clulas e dos tecidos permitem a identificao de material. Com uso de lminas permanentes ser identificado material histolgico presente no laboratrio. Introduo As clulas conformam os tecidos que por sua vez constituem os diversos rgos do corpo, nos mamferos essas clulas e a matriz extracelular (modificao de superfcie celular produzida pelas clulas) estruturam o tecido. A matriz quase inexistente em alguns tecidos, porm, em outros abundante e contm macromolculas importantes do ponto de vista estrutural e funcional. Apesar da complexidade do organismo dos mamferos, h apenas quatro tipos bsicos de tecidos: epitelial, conjuntivo, muscular e o nervoso. O tecido conjuntivo caracteriza-se pela riqueza e material extracelular produzido por suas clulas. O tecido muscular formado por clulas alongadas especializadas na contrao, enquanto o tecido nervoso formado por clulas com prolongamentos especializadas em receber, gerar e transmitir os impulsos nervosos. Os epitlios so constitudos por clulas geralmente polidricas, justapostas, entre as quais se encontra pouca substncia extracelular. Geralmente as clulas epiteliais aderem-se firmemente umas s outras, formando camadas celulares contnuas que revestem a superfcie externa e as cavidades do corpo (boca, fossas nasais, tubo digestivo, entre outros). Objetivo Visualizar, caracterizar e diferenciar lminas permanentes de diferentes tecidos. Com auxilio de livros, atlas (de biologia celular e histologia) e arquivos eletrnicos sero diferenciadas, caracterizadas e identificadas lminas permanentes presentes no laboratrio. Materiais e mtodos Instrumental Lminas permanentes, microscpio fotnico, lupa, computador. Biolgicos Lminas permanentes de diferentes tecidos. Procedimentos Separar o material (lminas) por semelhana, usar a lupa. Levar ao microscpio fotnico, observao nas objetivas de 10, 40 e 100x. Anlise da morfologia celular e da estrutura tecidual. Caracterize as clulas, faa um desenho. Identificao compare o material com livros e arquivos eletrnicos. Marcar as lminas identificadas. Resultados e Discusso Observaes ao microscpio do material biolgico, identificando clulas e tecidos. Diferencie, caracterize e desenhe as estruturas mais relevantes. Separar e marcar o material para ser includo na coleo. As caractersticas observadas esto relacionadas com as imagens bibliogrficas? Bibliografia: CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Clula. 2a ed, So Paulo: Manole, 2007. CAMBELL MK, FARRELL SO. Bioqumica: vol 2, biologia molecular. So Paulo: Thomson Learning, 2007. DE ROBERTIS EMF, HIB J, PONZIO R. Biologia Celular e Molecular (De Robertis). 14a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2003. GENESER F. Histologia. 3a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2003. JUNQUEIRA LC, CARNEIRO J. Histologia Bsica, 10a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. KHNEL W. Atlas de citologia, histologia e anatomia microscpica, para teoria e prtica, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1991. SOBOTTA J, WELSCH U (edt). Sobotta / Atlas de histologia citologia, histologia e anatomia microscpica. 6a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2003.
32
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema MS Curso de Cincias Biolgicas - 2007 Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica
Roteiro de aula prtica N 19: Ciclo celular - Mitose & Meiose Laboratrio virtual. Resumo Nas prticas 8/9 e 14/15 foram abordados os eventos mitose e meiose respectivamente. O objetivo desta prtica verificar as fases e diferenas desses dois processos no ciclo celular dos organismos eucariticos. Para tanto sero usados locais da internet com tutoriais sobre esses assuntos. http://www.biologia.arizona.edu/ Introduo Animaes grficas permitem visualizar de forma resumida os processos celulares, facilitando o entendimento de diferentes atividades da fisiologia (funcionamento) celular. Objetivo Visualizar, caracterizar e diferenciar as etapas (fases) da mitose e meiose. Materiais e mtodos Instrumental Computadores e acesso rede (internet). Procedimentos Procure na rede o local: http://www.biologia.arizona.edu/ Entrar em: Biologia Celular Depois em: Ciclo celular e mitose Acompanhe as pginas (3) at o final entrando em pgina seguinte No final da pgina de mitose, tem uma animao, execute ela! Volte na pgina inicial - Biologia Celular - e entre em: Meiose Siga as pginas at o final e entre nas animaes No final tem uma comparao de fatos entre mitose e meiose, veja!! Resultados Revise os contedos das pginas eletrnicas e seus conceitos. Do observado, faa desenhos resumo. Trabalhe a guia de exerccios tanto de mitose como da meiose! Discusso Troque informaes com os colegas e monitores, faa perguntas, discuta! Revise outros locais na rede e compare as pginas e animaes Bibliografia Bionet Biologia Celular, UFMT. http://www.ufmt.br/bionet/principal.htm Citologia Prof Cynara. http://www.cynara.com.br/citologia.htm KIMBALL JW. Kimballs Biology Pages. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/ http://cellbio.utmb.edu/cellbio/ http://celulas.no.sapo.pt/inicial_central.htm http://hivmedicine.aidsportugal.com/hivmedicine2003/pathogen.htm http://io.uwinnipeg.ca/~simmons/Cell%20Tour/index.htm http://kentsimmons.uwinnipeg.ca/cm1504/15pptfall05/Cell%20Tour_files/frame.htm http://www.cofc.edu /~delliss/IntroBioPage%20F'06/Intro%20Bio%20ppt/ http://www.ibiblio.org/virtualcell/; http://microbes.limnology.wisc.edu; www.sbmicrobiologia.org.br; www.splammo.net; www.unb.br/ib/cel/microbiologia/index.html; http://cromatina.icb.ufmg.br/ http://www.biologia.arizona.edu/; http://pt.wikipedia.org/wiki/Meiose
33
Roteiro de aula prtica N 20: Lipdios. Introduo. Os lipdeos so substncias caracterizadas pela baixa solubilidade em gua e outros solventes polares, e alta solubilidade em solventes apolares. So vulgarmente conhecidos como gorduras e suas propriedades fsicas esto relacionadas com a natureza hidrfoba das suas estruturas, sendo todos sintetizados a partir da acetil-CoA. Na verdade, todas as relevncias do metabolismo lipdico advm desta caracterstica hidrofbica das molculas, que no uma desvantagem biolgica (mesmo o corpo possuindo cerca de 60% de gua). Justamente por serem insolveis, os lipdios so fundamentais para estabelecer uma interface entre o meio intracelular e o extracelular, francamente hidrfilos. Todos os seres vivos possuem a capacidade de sintetizar os lipdios, existindo, entretanto, alguns lipdios que so sintetizados unicamente pelos vegetais, como o caso das vitaminas lipossolveis e dos cidos graxos essenciais. Cutina, Suberina e outras deposies de lipdios podem ser visualizadas pelos corantes Sudo, tipo Sudan black ou Sudan IV (Cortelazzo, 2007 em Carvalho & ReccoPimentel, 2007). Materiais e mtodos Instrumental Lmina, lamnula, microscpio fotnico, lmina do tipo gilete, placa de petri, pincel fino. Qumicos gua, lcool, corantes: Sudan Black, Sudan IV. Biolgicos Laranja e limo (Citrus sp.); outros materiais vegetais (cortes transversais). Procedimentos Pegue a laranja ou limo, e faa um corte bem fino com o auxilio de uma lmina (gilete), de maneira que a luz ultrapasse o material. Ou tambm cortes de galhos, razes, ou hastes finos. Coloque o material sobre uma placa de petri e em seguida pingue uma gota de sudan IV. Com o auxilio de um pincel, pegue o material e coloque sobre uma lmina. Para poder visualizar, coloque uma lamnula sobre a lmina e leve ao microscpio fotnico nas lentes de 10x, 40x e 100x. Resultados e Discusso Identifique o que foi observado. Esquematize (desenhe) o que foi observado nas objetivas de 40x e 100x. Bibliografias: CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Clula. 2a ed, So Paulo: Manole, 2007. Rodrigues AN, Estelita MEM. Anatomia da raiz de Cyperus giganteus Vahl (Cyperaceae) em desenvolvimento. Rev. bras. Bot.vol.27 no.4: So Paulo Oct./Dec.2004. Disponvel em: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-84042004000400003 http://www.geocities.com/capecanaveral/launchpad/9071/Lipidios.html http://www.dbc.uem.br/docentes/praticas. www.qmc.ufsc.br/quimica/pages/especiais/revis... Anexo: Cyperus giganteus ou "piri", (Fonte: Rodrigues & Estelita, 2004). Nessa regio observa-se a deposio da lamela de suberina, na endoderme, e a lignificao do parnquima medular (figuras 14, 15). Em regies subseqentes, as clulas da hipoderme se impregnam de substncias lipoflicas e fileiras de clulas braciformes, do crtex interno, colapsam em arranjo radial finalizando a diferenciao do aernquima (figuras 15, 16). As clulas da endoderme adquirem espessamento e sofrem lignificao e impregnao por substncias fenlicas (figura 16). A raiz madura apresenta cerca de 30 polos de protoxilema; estando tambm presentes alguns idioblastos na regio medular.
34
35
Roteiro de aula prtica N 21 e 22: Incluso em Parafina e Basofilia. Introduo Para o preparo de lminas permanentes de material includo em parafina necessrio que previamente seja adequadamente coletado (fresco) e processado. O processamento consiste de vrios passos: fixao (preservao da qumica e morfologia celular, impede a autlise ou degradao bacteriana do material biolgico e facilita a colorao); lavagem (caso tenha sido fixado com compostos da famlia do formol); desidratao (em sries de lcool e xilol); diafanizao ou clareamento (em xilol ou leo de cedro); embebizao e incluso (em resina ou parafina); corte; desparafinizao (em xilol ou quente); reidratao (em sries de lcool e em gua); colorao; desidratao (em sries de lcool e xilol) e montagem . Basofilia: a capacidade de colorao de substncia (corante) com carter bsico, ou a afinidade de um substrato por corantes bsicos. Corantes basoflicos (ou acidfilos) coram compostos cidos como DNA, RNA, a ribonuclease, cidos mucopolissacardeos na matriz extracelular e os petidoglicanos da parede das bactrias entre outros. Entende-se a basofilia como o fenmeno citoqumico no qual um substrato carregado negativamente, chamado aninico, reage eletrostaticamente com um corante carregado positivamente, dito catinico. Exemplos destes corantes temos Azul de Toluidina, Azul de Metileno e Azul de Alcian. A hematoxilina, embora no seja um corante, pode ser considerada um complexo de corantes que comportam-se como corante catinico. Esses corantes reagem com os elementos ionizveis nos tecidos que apresentam os grupamentos aninicos, como os grupamentos: fosfato (PO42-) dos cidos nuclicos, sulfato (SO42- e SO3-) dos glicosaminoglicanos cidos sulfatados da matriz extracelular e os grupamentos carboxila (CO2-) das protenas e glicosaminoglicanos cidos carboxilados (Carvalho & Recco-Pimentel, 2007). Material e Equipamentos Instrumental Lmina, lamnula, microscpio ptico, lminas de barbear, placa de petri, pincel fino. Qumico Azul de toluidina 0,20%, azul de metileno 0,1% filtrados, gua destilada; cido actico 45%, soluo Carnoy, 100 mL de cada soluo alcolica. Biolgico Minhocas, ou vsceras (fgado, rim, corao) de aves ou camundongos. Procedimentos Sacrificar as minhocas em ter etlico (frasco com um chumao de algodo embebido com ter, 4-5 min). Cortar o material biolgico em pedaos pequenos (3-6) mm. Fixar em Soluo Carnoy, 10 a 20 min com trs trocas, ideal 2-4 h com trocas constantes (at ficar limpo). Retirar do fixador e enxugar rapidamente em toalha de papel. Desidratar em banhos seriados de lcool 80, 90, 100, 5 a 10 mim cada banho; + dois banhos de xilol de 1 min. Embeber na Parafina liquida a 56oC (5 min, permitindo a impregnao) e incluir na parafina formando blocos de 1 cm2 e deixar esfriar a temperatura ambiente (pode colocar no freezer, 5 a 10 min). Fazer cortes muito finos com a gilete o com bisturi sobre placa de petri. Coletar 2-3 cortes e colocar sobre lmina, com a lmina levemente inclinada adicionar 2 a3 gotas de xilol 2 a 3 vezes para retirar a parafina ou levar a estufa aquecida a 50-60 graus 2 a 5 min para fixar o tecido na lmina. Aplicar o procedimento de hidratao-colorao-deshidratao que est a seguir. Sem meio de montagem (blsamo, entellan, euparal, ou permount) use esmalte transparente, coloque 2 gt e uma lamnula. Obs: para poder visualizar, leve ao microscpio ptico nas lentes de 10x, 40x e 100x; tirar fotos com mquinas digitais. Prtica de Basofilia Materiais
36
Lminas com cortes em Parafina do tecido fixado em Carnoy (figado, rim, outro); Sries gradativas de etanol, 50, 70, 80, 95 e 100% (v/v); Hematoxilina Mayer; Soluo Scott; Eosina; Azul de Toluidina; Xilol; Lamnulas e meio de montagem (Entellan, Permount, Blsamo de Canad ou Esmalte transparente); Microscpio. Procedimento Pegue uma lmina com corte. Previamente os cortes em parafina foram montados sobre lminas, e desparafinizados com xilol. As lminas sero acondicionadas em jarras Coplin (caixas de vidro) contendo xilol. As lminas sero removidas do xilol e transferidas s solues indicadas a seguir (deixando em cada soluo o tempo indicado em parnteses): Obs: No permita que as lminas sequem em qualquer etapa do procedimento. Transfira as lminas seqencialmente s jarras Coplin contendo: Etanol Absoluto (1 min). Etanol 95% (1 min). Etanol 80% (1 min). Etanol 70% (1 min). Etanol 50% (1 min). gua destilada (1 min). Hematoxilina (3 min). gua destilada ou corrente continuamente (2 a 3 min). Soluo Scott (3 min) opcional (se tiver). Eosina (30 segundos). Mergulhe 2X em etanol 95%. Mergulhe 2X em Etanol Absoluto. Mergulhe 5X em gua corrente. Core com azul de Toluidina (10 segundos). Mergulhe rapidamente em gua destilada. Mergulhe 1X em etanol 95%. Mergulhe 5X em dois banhos Etanol Absoluto. Coloque em Xilol I (2 minutos). Coloque em um segundo Xilol II (2 minutos). Remova as lminas do Xilol II, adicione uma gota de meio de montagem e coloque uma lamnula. Examine as lminas com objetivas de baixo aumento (10X) e maior (40X) do microscpio ptico. No use o leo de imerso o meio de montagem pode tomar vrios dias para secar completamente e as lminas devem ser tratadas cuidadosamente. Informe-se dos cuidados com as lminas. *Obs, seja particularmente cuidadoso para no sujar as lentes com o meio de montagem.
Regio Hiperbasoflica do fgado de um rato Desenhar cada lmina e comparar com preparaes comerciais de material corado por basofilia. Notas: Esta tcnica foi elaborada originalmente para a anlise de mastcitos (no tecido conjuntivo), para demonstrar a colorao diferencial das clulas. A tcnica resultar em clulas com o citoplasma rosa e o ncleo azul a roxo. Esta a cor padro em clulas animais, as clulas de plantas usualmente coram em verde com ncleos vermelhos. Com o corante basoflico, o colgeno (um material extracelular) cora em rosa, e os eritrcitos (hemcias) coram em vermelho. O procedimento uma modificao de colorao Hematoxila & Eosina padro usada pela maioria dos citlogos. O procedimento adiciona o uso de azul de toluidina, um corante metacromtico. Isto , o corante tem cores diferentes dependendo da natureza qumica de sua polimerizao. Colorao intensa com estes corantes conhecida como hiperbasofilia, e freqentemente usada em diagnstico clinico de patologias. Resultados e Discusso
37
Identifique o que foi observado. Esquematize (desenhe) o que foi observado nas objetivas de 40x e 100x. Relate e discuta. Bibliografia: (Pegar Livros de biologia celular, histologia e zoologia na biblioteca) AMABIS JM, MARTHO GR. Curso bsico de biologia, v.1. Clulas e tecidos. So Paulo: Moderna, 1985. CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Clula. 2a ed, So Paulo: Manole, 2007. http://homepages.gac.edu/~cellab/index-1.html http://homepages.gac.edu/~cellab/chpts/chpt2/ex2-2.html http://homepages.gac.edu/%7Ecellab/chpts/chpt2/figure2-4.html JORDO BQ et al. Prticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. RUPPERT ED, Fox RS, Barnes RD. Zoologia de Invertebrados. 7a ed. So Paulo: Rocca, 2005. VIDAL BC, MELO ML S. Biologia celular. Livraria Atheneu, Rio de Janeiro e So Paulo, 1987.
38
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema MS Curso Cincias Biolgicas - 2007 Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica
Roteiro de aula prtica N 23: Lminas Permanentes. Resumo Verificar o contraste de colorao em tecidos e na descrio da morfologia celular, por meio do uso de metodologia de fixao, hidratao, colorao e desidratao para lminas permanentes de tecidos animais. Esse tipo de tcnica permite exame adequado em biologia celular e histologia. Introduo A hematoxilina um composto que se obtm da planta leguminosa Haematoxylum campechianum, conhecida tambm pelo nome de Pau Campeche. um produto natural que ao ser oxidado resulta numa substncia de cor azul-prpura escura denominada hematena. utilizada em histologia para colorir os componentes aninicos (cidos) dos tecidos, aos quais d uma colorao violeta. Colore intensamente os ncleos das clulas, devido ao fato de que estes contm cidos nuclicos ricos em radicais cidos. As estruturas que a hematoxilina colore so chamadas basoflicas. Como obtida da planta e logo deve sofrer o processo de oxidao, sua capacidade de tingimento muito limitada. Portanto, deve combinar-se com ons metlicos, especialmente os sais de ferro (III) o alumnio (II), que atuam como mordentes. Ainda que a hematoxilina seja um sal neutro, se caracteriza por ser um corante bsico, j que o componente cromgeno reside no complexo catinico (bsico) da mesma. de se notar que a colorao histolgica pela hematoxilina no indica tanto a constituio qumica dos componentes celulares, seno a densidade de cargas eltricas negativas dos mesmos.
Estrutura da hematoxilina A Eosina Amarelada um corante vermelho arosado com leve tom amarelado com fluorescncia rseoalaranjada quando em soluo alcolica ou aquosa, bord escuro quando slido, resultante da ao do bromo sobre a fluorescena. usado em conjunto com outros corantes (tal como o Orange G, o Verde Luz Amarelado e a Fucsina cida) na colorao de citoplasma, colgeno e fibras musculares para exame sob o microscpio. um corante cido que confere cor vermelha em tais coloraes. Na clula, sua estrutura aninica (-) liga-se a estruturas acidfilas ou eosinfilas corando o citoplasma e outras estruturas que tm afinidade com a poro bsica (protenas citoplasmticas, hemoglobina, mitocndrias, alguns grnulos de armazenagem e secreo) estruturas catiognicas (+). A Eosina Azul de Metileno tem um muito leve tom azulado. Os dois corantes so intercambiveis, e comum o uso de um pelo outro. Essa aula tem como principal objetivo, verificar o contraste de colorao em tecidos e na descrio da morfologia celular, por meio do uso de metodologia de fixao, hidratao, colorao e desidratao para lminas permanentes de tecidos animais. Esse tipo de tcnica permite exame adequado em biologia celular e histologia.
Eosina Amarelada
Eosina Azul de Metileno
39
Material e Equipamentos Instrumentos Lmina, lamnula, microscpio, lminas de cortar novas, Bquer, placa de petri, pincel fino, estufa Qumico Parafina histolgica; gua destilada (H2Od); cido actico 45%; Soluo Carnoy: lcool etlico absoluto-cido actico glacial (3:1); sries de etanol, 50, 70, 80, 95 e 100% (v/v) (100 mL de cada soluo alcolica), Xilol; Corantes como Azul de toluidina 0,20%, pH 4,0 (C15H16ClN3S); azul de metileno 0,1% (C16H18ClN3S. 3H2O) filtrados, e hematoxilina e eosina. Biolgico Vsceras frescas de aves (corao, rim e fgado de frango), retirar e fixar rapidamente em Carnoy. Procedimentos Sacrificar o material biolgico em ter etlico (frasco com um chumao de algodo embebido com ter, 4-5 min). Retirar e/ou cortar o material biolgico com uso de bisturi (navalha ou lmina de barbear) em pedaos pequenos (3-6) mm, caso seja muito grande o material. Fixar em Soluo Carnoy, 10 a 20 min - trs (3) a cinco (5) trocas, use mais se necessrio; ideal 2-4 h 4oC. Retirar o material do fixador e enxugar com cuidado rapidamente em toalha de papel. Desidratar em banhos seriados de lcool 80, 90, 100, 5 a 10 mim cada banho; + dois banhos de xilol de 1 min. Incluir o material na Parafina a 58oC (use um Bquer para derreter a parafina) formando blocos de ~1,5 cm2 e deixar esfriar a temperatura ambiente 5 min, depois coloque em geladeira (ou freezer, 20 a 40 min) Fazer cortes muito finos com a gilete o com bisturi sobre placa de petri. Coletar 2-3 cortes e colocar sobre lmina, com a lmina levemente inclinada adicionar 2 a3 gotas de xilol para retirar a parafina ou levar a estufa aquecida a 50-60 graus 2 a 3 min para fixar o tecido na lmina. Aplicar o procedimento de hidratao-colorao-desidratao do corte: Importante: no deixe que a lmina com o corte seque durante todo o processo. 1. Goteje duas ou trs gotas de cada soluo sobre a lmina(s) de forma seqencial, deixando o tempo indicado (em parnteses), logo retire inclinando levemente em um Baker de descarte: o Etanol Absoluto (1 min) o Etanol 95% (1 min) o etanol 80% (1 min) o etanol 70% (1 min) o etanol 50% (1 min) o gua destilada (1 min) o Corar com Hematoxilina (3 min) o Pingue gua destilada ou corrente continuamente (2 a 3 min) o Corar com Eosina (30 segundos) o Etanol 95%, duas vezes (2X) o Uma gota de Etanol Absoluto, duas vezes (2X) o Uma gota de gua, cinco vezes (5X) o Contra-corar com azul de toluidina (10 seg) o Passe gua destilada rapidamente o Uma gota de etanol 95%. o Uma gota de etanol Absoluto, dez vezes (10X) o Coloque etanol Absoluto (1 gt) por (20 seg) o Retire e adicione Xilol (1 gt) (2 min) no deixe secar o Coloque de novo Xilol (2 min) 2. Retire o xilol, adicione uma gota de meio de montagem ou de esmalte* e uma lamnula. 3. Examine as lminas com as objetivas de pouco aumento (10X) e maior aumento (40X) do microscpio. No use a lente para leo de imerso (100X) at que a preparao tenha secado completamente - o meio de montagem pode tomar vrios dias at secar suficientemente, as lminas devem ser tratadas adequadamente. Deixe as lminas em local arejado na posio horizontal. *Sem meio de montagem (entellan ou permount) use esmalte transparente, coloque 2 gt e uma lamnula.
40
Obs, para poder visualizar, leve ao microscpio fotnico nas lentes de 10x, 40x e 100x; tirar fotos com maquinas digitais. Seja particularmente cuidadoso para no sujar as lentes do microscpio com o meio de montagem ou esmalte. Resultados e Discusso (a) Identifique o que foi observado; (b) Esquematize (desenhe) o que foi observado nas objetivas de 10, e 40x; c) Relate e discuta; aps 5 a 7 dias observe na objetiva de 100X. Bibliografias AMABIS JM, MARTHO GR. Curso bsico de biologia, v.1. Clulas e tecidos. So Paulo: Moderna, 1985. CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Clula. 2a ed, So Paulo: Manole, 2007. http://homepages.gac.edu/~cellab/index-1.html http://homepages.gac.edu/~cellab/chpts/chpt2/ex2-2.html http://homepages.gac.edu/%7Ecellab/chpts/chpt2/figure2-4.html http://pt.wikipedia.org/wiki/Hematoxilina http://pt.wikipedia.org/wiki/Eosina JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. RUPPERT ED, Fox RS, Barnes RD. Zoologia de Invertebrados. 7a ed. So Paulo: Rocca, 2005. VIDAL BC, MELO ML S. Biologia celular. Livraria Atheneu, Rio de Janeiro e So Paulo, 1987.
41
Roteiro de aula prtica N 24: Cromossomos de insetos II Resumo Os cromossomos so estruturas celulares microscpicas, eles podem ser visualizados quando a cromatina est condensada nas fases de mitose ou de meiose do ciclo celular, e tambm em clulas endomitticas com cromossomos politnicos. A prtica permitir comparar e identificar cromossomos com tcnicas citolgicas de Orcena e citoqumicas de Feulgen (reativo de Schiff). Introduo Os Insetos apresentam rgos como crebro, gnadas, glndulas salivares e tbulos de malpighi entre outros, para anlise fcil e rpida dos cromossomos. Em muitos tecidos de insetos, alm de ciliados, mamferos e plantas, as clulas perdem a capacidade de se dividir (mitose) em uma dada fase inicial do desenvolvimento, e os cromossomos continuam a replicar-se por um processo de endomitose sem a diviso do ncleo. Tais clulas so chamadas endopoliplides, podendo conter em seus ncleos os chamados cromossomos politnicos. Tcnicas de citologia com uso de orcena coram DNA e protenas, j tcnicas citoqumicas como Feulgen so especficas e coram aldedos e cetonas, e desta forma DNA denaturado. A reao de feulgen tem duas etapas essenciais, a hidrolise e a ligao do cido apurnico com o reativo de Schiff. O processo de hidrolise (com o HCl) desnatura o DNA abrindo a dupla hlice e hidrolisa a ligao das purinas (adenina e guanina) com a pentose, liberando neste acar o aldedo para reagir com o reativo de Schiff. A hidrolise tem um tempo ideal dependendo da temperatura e da concentrao do HCl, passado este tempo inicia-se uma perda gradual de pirimidinas e despolimerizao do cido apurnico (Mello & Vidal, 1978; Vidal & Mello, 1987). Objetivo: Comparao de tcnicas citolgicas e citoqumicas para cromossomos de insetos. Materiais e mtodos Instrumentos Agulhas de disseco, lminas, lamnulas, lmina de barbear ou bisturi, estilete, pinas finas, Becker, tubo de ensaio pequeno, placa de petri, papel filtro, microscpio fotnico, lupa. Qumicos gua, Soluo salina 0,9, carnoy: lcool etlico absoluto-cido actico glacial (3:1), soluo de cido actico 50% (1 gua: 1 de cido actico glacial); cido ltico; HCL 5 N (70ml de gua + 50ml de HCl 12 N); Corantes: soluo de orcena actica 1-2%; Reativo de Schiff (1g de Fuchsina bsica + 200 cc de gua destilada fervendo, esfriar at 50oC, + 2 a 4g de metabisulfito de K ou Na, dissolver bem, + 10 ml de HCl 1N: 8,25 ml 12N + gua at 100 ml de soluo, 1 a 3 horas no escuro (ideal 24 horas), + 200 mg carvo ativado, filtrar e manter em geladeira e no escuro). Biolgicos Larvas, pupas e/ou adultos de insetos dptera (mosquitos) e himenpteros (abelhas) ninfas e/ou adultos de ortptera (gafanhotos), outros. Procedimentos Colete o material biolgico (larvas, pupas/ninfas e/ou adultos dos insetos) fresco ou fixado. 1. Orcena Utilizando-se larvas, pupas e adultos podero ser feitas lminas para obteno dos cromossomos de gnglios cerebrais, glndulas salivares, ovrios (alongados), testculos (mais pequenos e arredondados) e/ou tbulos de Malpighi, pela tcnica convencional de colorao com Orcena Actica (OA). Disecte os insetos em gua ou em soluo salina 0,9% para a retirada dos rgos. Coloque os rgos (tecidos) retirados em uma lmina com gua por 2-5 min (hipotonia). Com ajuda de uma agulha ou pina passe o tecido para uma lmina com soluo fixadora carnoy (1-2 gotas) onde deve permanecer para fixao rpida 2-3 min. Pode dar um banho adicional (ou no) de cido actico 50-100% 2-5 min Colorao com OA 1-2% 2-3 min. Transfira o material para uma gota de cido actico glacial - cido ltico P.A. 85-90%(1:1 v/v) ou uma soluo de cido actico 50%, 2 a 5 min, dissectar (cortar, dissecar) o tecido em pequenos fragmentos com ajuda das agulhas de ponta fina. Coloque uma lamnula sem deixar formar bolhas de
42
ar, e esmague cuidadosamente o material com ajuda de um lpis at o material espalhar; com ajuda de papel filtro pressione a preparao com o polegar sem deixar escorregar a lamnula nem quebrar ela. Levar ao microscpio fotnico e observar nas objetivas de 10, 40 e 100x. 2. Reativo de Schiff (reao de Feulgen) As larvas, pupas e/ou adultos sero dissecadas em fixador de Carnoy fresco. Com ajuda de pinas e/ou agulhas de ponta fina, exponha as glndulas salivares na parte superior do corpo, ou retire com cuidado a parte posterior do corpo (dois ltimos segmentos abdominais) dos insetos expondo os tbulos de Malpighi, e a seguir coloque esse material em gua destilada por 20 min. Depois passe para HCl 5N de 30 min a 45 min temperatura ambiente (20 a 25oC). Aps a hidrlise, o material ser lavado duas vezes (2 min) em gua destilada ou corrente. Colocar em reativo de Schiff por 0,5 a 1 h. Substitudo o reativo por gua sulfurosa (1g de metabissulfito de potssio em 200 ml de gua destilada, mais 10 ml de HCl 1N) por 10 min. Finalmente lavar o material biolgico com gua corrente, 2 vezes, 5 min. Remover o rgo de interesse sobre uma lmina com cido actico 50% ou cido ltico 50% e colocar lamnula para a observao ao microscpio. Obs, se necessrio ser feita uma recolorao com orcena actica a 1-2% por 3 min. O excesso de corante ser retirado com cido actico a 50% e realizado o esmagamento das clulas (quando necessrio) Resultados -Observe ao microscpio o material processado, identifique as clulas, ncleos e cromossomos. -Diferencie, caracterize e desenhe os cromossomos nas duas tcnicas. -Quais so as diferenas observadas. -Anlise os dados, explique e discuta as observaes. Bibliografia ALBERTS B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Clula, 4a ed, Edit Artes Mdicas, Porto Alegre, 2004 (2002 ing.). CARVALHO HF, Recco-Pimentel SM. A Clula. 2a ed, So Paulo: Manole, 2007. Campos J, Andrade CFS & Recco-Pimentel SM. Malpighian tubule polytene chromosomes of Culex quinquefasciatus (Diptera, Culicinae). Mem. Inst. Oswaldo Cruz 98(3):383-386, 2003. http://www.scielo.br/pdf/rsp/v37n4/16789.pdf Campos G J, Recco-Pimentel SM & Andrade CFS. Polytene chromosome analysis of a population of Simulium pertinax (Diptera: Simuliidae). Rev. Bras. Genet. 19:47-52, 1996. DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006 (2004). French, W. L., Baker, R.H. & Kitzmiller, J.B. Preparation of mosquito chromosomes. Mosquito News 22 (4): 377-383, 1962. JORDO BQ et al. Prticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. MELLO ML S, VIDAL BC. A reao de Feulgen. Cincia e Cultura, 30 (6): 666-676, 1978. VIDAL BC, MELLO ML S. Biologia celular. Livraria Atheneu, Rio de Janeiro e So Paulo, 1987. Cromossomos metafsicos: Cromossomos politnicos:
Aedes aegypti (Orcena)
Culex quinquefasciatus (Orcena)
43
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema MS Curso de Cincias Biolgicas Projeto de Ensino: Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica
Roteiro de aula prtica N 25: Decalque, Reao de Feulgen & Verde Janus. Resumo Os tecidos moles como fgado so usados para decalques (inprinting). A prtica permitir usar decalques com tcnicas de Reao de Feulgen para componentes cidos como ADN e Verde Janus para mitocndrias. Introduo Para visualizar as clulas de rgos com tecidos moles (que desprendem) como fgado, bao e testculos entre outros, preparaes de lminas pela tcnica de decalque ou inprinting (imprimir) permitem a anlise citolgica fcil e rpida. O decalque consiste em encostar levemente um fragmento do rgo com tecido fresco sobre uma lmina. A reao de Feulgen a mais usada em citoqumica, especfica e estequiomtrica. Pode identificar poliploidia, perdas e modificaes no DNA. As mitocndrias podem ser facilmente diferenciadas de outras organelas usando-se o corante verde janus. Esse corante pode ser uma substncia redox, capaz de assumir caractersticas de um composto reduzido ou oxidado, em contato com a mitocndria, pode ser oxidado (perda de eltrons) para uma forma corada pelo citocromo c oxidase, um dos componentes da cadeia respiratria (Pimentel, 2007). Obs. O indicador verde Janus B muda de colorao de acordo com a quantidade de oxignio
presente. Em presena de oxignio - o indicador oxida-se a cor azul, na ausncia de oxignio - reduz-se a cor rosa.
Objetivo Aplicar tcnicas citolgicas e citoqumicas em decalques de camundongo Mus musculus. Materiais e mtodos Instrumentos Agulhas de disseco, lminas, lamnulas, lmina de barbear ou bisturi, estilete, pinas finas, beaker, tubo de ensaio pequeno, placa de petri, papel filtro, microscpio fotnico. Qumicos gua; soluo salina 0,9; Carnoy (3:1); cido actico 50%; cido ltico; HCL 12 e 5 M; tampo fosfato pH 7,0; verde janus; Reativo de Schiff. Biolgicos Camudongo, Mus musculus. Procedimentos Anestesie o camundongo em um frasco de vidro com um chumao de algodo embebido em ter etlico, 6 a 10 min com tampa fechada. Com ajuda de um bisturi, retire com cuidado o fgado do camundongo em placa de petri (obs. outros rgos devem ser aproveitados ou fixados para uso posterior). Corte fgado em cinco fragmentos, se possvel mantenha em uma soluo de tampo fosfato pH 7,0. 1. Decalque: Com ajuda de uma pina encoste (imprima) o fragmento de forma firme, mas levemente, cinco vezes sobre uma lmina. Deixe secar, at ficar levemente mido, 1 a 3 min. Fixar em carnoi 3:1, 1 min (pingue umas gotas cobrindo os decalques). Retirar o carnoi e cobrir com lcool 70%, 5min (ou aplique o verde janus 0,7% em lcool). Retirar o lcool e Secar ao ar, 5 min (guardar em freezer se necessrio). 2. Verde Janus: 8 a 10 lminas com decalques de fgado de camundongo, aps ter retirado o carnoi. Adicione o corante verde janus 0,7%, cobrindo os decalques por 2 a 3 min. Retire o corante e passe gua rapidamente. Secar ao ar, passar em xilol (com a lmina inclinada pingar umas gotas). Observar ao microscpio em 10 e 40 x. Montar em meio de montagem (Blsamo de Canad, Entellan ou esmalte transparente) e lamnula. 3. Reao de Feulgen (Reativo de Schiff):
44
Pegue 8 a 10 lminas com decalques de fgado de camundongo. Depois passe para HCl 5N de 40 a 45 min temperatura ambiente (20 a 25oC). Retire da hidrolise e Passe HCl 0,1 M, frio. Aps a hidrlise, o material ser lavado duas vezes em gua destilada ou corrente. Colocar em reativo de Schiff por 40 min a 1 h. Passe o material por 3 banhos de gua sulfurosa (18 ml H2Od: 1 g de metabissulfito de potssio: 1 ml de HCl 1M), isto via retirar o excesso de corante no ligado ao substrato. Lavar o material biolgico com gua destilada, 3 vezes, 2 min. Secar, passar xilol (pingar algumas gotas). Observao ao microscpio.* Montar em meio de montagem e colocar lamnula. * Obs: se necessrio ser feita uma recolorao com orcena actica a 0,5 a 1% por 2 min. O excesso de corante ser retirado passando duas vezes gua, secar, e passar xilol antes de montar. Resultados -Observe ao microscpio o material processado, identifique as clulas, ncleos e mitocndrias. -Diferencie, caracterize e desenhe o material biolgico observado. -Quais so as diferenas observadas nas duas tcnicas. -Anlise os dados, explique e discuta as observaes. Bibliografia ALBERTS B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Clula, 4a ed, Edit Artes Mdicas, Porto Alegre, 2004 (2002 ing.). Pimentel ER. Mitocndria. Em: Carvalho HF, Recco-Pimentel SM. A Clula. 2a ed, So Paulo: Manole, 2007. DE ROBERTIS EMF, HIB J. Bases da Biologia Celular e Molecular, 4a ed, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006 (2004). JORDO BQ et al. Prticas de Biologia Celular. Londrina: UEL, 1998. JUNQUEIRA LC, Uchoa LC, Carneiro J. Biologia Celular, 8a ed, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2005. MELLO ML S, VIDAL BC. Prticas em Biologia celular. Rio de Janeiro: Edgar Blucher, 1980. VIDAL BC, MELLO ML S. Biologia celular. Livraria Atheneu, Rio de Janeiro e So Paulo, 1987.
45

Citologia e Epitélio Bucal

Загружено:

Сведения о документе

Исходное описание:

Оригинальное название

Авторское право

Доступные форматы

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

Доступные форматы

Citologia e Epitélio Bucal

Загружено:

Авторское право:

Доступные форматы

Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica

Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul Unidade de Ensino de Ivinhema/MS

Cincias Biolgicas Dezembro 2007

Preparo das Solues

Figura 1: procedimento de coleta da amostra sangnea.

Figura 2: procedimento de corte da folha vegetal.

Figura 3: observao da clula vegetal no microscpio ptico.

Estrutura do fitoflagelado, Euglena Gracilis

Figura 1: algas Fonte: www.planetarios.com

Micrasterias sp, alga verde. Fonte: Madigan et al., 2004.

Figura 3: liquens. Fonte: Raven et al., 2005.

Pele de cebola ou Tradescantia. Corte transversal de caule. Fontes: http://www.scielo.br/img/fbpe/sa/v53n1/a10f9.gif, http://www.didier-pol.net/1thcmont.gif

Figura 1. Gro de amido, mostrando o hilo ou cicatriz ao centro, Fonte:

Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul

Projeto de Ensino Prticas de Biologia Celular Citologia & Citogentica

Mitose. Foto: Lucilene.

Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul

Simulium pertinax (borrachudo) Aedes aegypti (mosquito) Cromossomos politnicos:

Drosophila melanogaster (mosca da fruta)

Culex quinquefasciatus (mosquito pernilongo)

Mtodo de Colorao de Gram (fonte: Madigan et AL., 2004):

Anexo - Bactrias (morfologia):

Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul

Figura 1: esquema de um gro de plen

Figura 2:gro de plen

Figura 3:diferentes tipos de gros de plen. Fonte: http://www.iac.sp.gov.br/bragantia/volume/5901/1078.pdf

Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul

Eosina Azul de Metileno

Aedes aegypti (Orcena)

Culex quinquefasciatus (Orcena)

Вам также может понравиться