LP 5. Cultivarea bacteriilor: medii de cultur, cultura pur, studiul caracterelor de cultivare.

OBIECTIVE: 1. De a discuta scopurile cultivrii bacteriilor. 2. De a prezenta mediile de cultur utilizate pentru cultivarea bacteriilor: definiie, condiiile de baz ale unui mediu de cultur, criterii de clasificare, e emple. De a discuta indicaiile utilizrii mediilor de cultur solide vs. lic!ide "mbo#ite vs. simple difereniale$selective vs. simple %. &e!nica "nsm'nrii "n ( cadrane. )binerea culturii pure. Descrierea caracterelor de cultur ale bacteriilor pe diferite medii. 1. Scopurile cultivrii: *edical + dia#nosticul etiolo#ic al infeciilor bacteriene + testarea sensibilitii la antibiotice ,e discut cu studenii necesitatea obinerii -culturii pure. Cultur pur = constituit din bacterii de acela/i fel 0 etapa indispensabil identificrii i testrii sensibilitii la antibiotice 1ndustrial - obinerea de anti#ene, vaccinuri, produse de biosintez, bioconversie sau fermentare ! "efiniie #ediul de cultur 0 soluie apoas a unor substane nutritive 2nutrieni, factori de cre/tere3. Nutrieni 0 substane ale cror soluii pot traversa membrana citoplasmatic. Alimente 0 material crud din care deriv nutrienii, prin di#estie. Factori de cretere 0 metabolii eseniali pentru cre/tere: aminoacizi, baze azotate, vitamine. Bacterii fastidioase = dependente de numero/i factori de cre/tere + + + + + + + + Condiii pe care trebuie s le $ndeplineasc un %ediu de cultur : s fie nutritiv. s asi#ure presiunea osmotic 2"n #eneral, medii izotone3 /i p4 2"n #eneral, 5+5,53 2similare celor din mediul intern3. s fie steril, pentru a cultiva e clusiv microor#anismele din produsul investi#at. s fie transparent 6 faciliteaz urmrirea culturii. s permit separarea, unele de altele, a microor#anismelor dintr+un produs microbian. Condiiile fi&ico-c'i%ice necesare cultivrii: presiunea osmotic - ma7oritatea bacteriilor pato#ene cresc "n medii izotone cu mediul intern al or#anismului #azd + bacterii !alofile 2 82 9 :aCl3 pH + ma7oritatea bacteriilor necesit un p4 optim "n 7ur de neutralitate 25+5,53 + bacterii acidofile 25+5,53 $ bazofile 2;,5+<3 temperatura: + bacterii psi'rotrofe se multiplic rapid la 2=+%=>C /i cultiv lent la temperatura fri#iderului + bacterii psi'rofile 2=+2=>C3 + bacterii %e&ofile 225+(5>C3 + bacterii ter%ofile 25=+5=>C3

atmosfera de incubare: + bacterii strict aerobe 0 se dezvolt doar "n prezena o i#enului + bacterii strict anaerobe 0 se dezvolt doar "n absena o i#enului + bacterii facultativ anaerobe 0 cultiv at't aerob, c't /i anaerob + bacterii %icroaerofile 0 cultiv numai "n prezena unor concentraii reduse de ) 2 2593 + bacterii carbo(ifile 0 necesit pentru cre/tere cantiti de C) 2 mai mari dec't cele din aer 25+1=93 Clasificarea %ediilor de cultur 2criterii, repartizarea mediilor, e emple3

a. dup proveniena nutrienilor: + empirice 6 in#rediente de ori#ine animal sau ve#etal + sintetice 6 in#rediente c!imic pure ? studiul necesitilor nutritive ale bacteriilor b. n raport de valoarea nutritiv: +simple + bacterii nepretenioase nutritiv + "mbo#ite + bacterii pretenioase nutritiv c. dup consisten: + lic!ide 6 produse patolo#ice monobacteriene + solide 6 produse patolo#ice pluribacteriene + semisolide 6 studiul mobilitii /i conservarea tulpinilor bacteriene. d. dup scopul utilizrii: - de i&olare uzuale + satisfac e i#enele nutritive pentru o #am lar# de specii bacteriene difereniale + conin substratul pentru anumite enzime bacteriene /i un indicator care atest atacarea acestui substrat un caracter metabolic difereniaz "ntre ele bacterii cu aspect al culturii identic pe mediile simple. selective + medii solide - in!ib dezvoltarea bacteriilor de contaminare a prelevatelor + frecvent sunt /i difereniale de "mbo#ire + medii lic!ide + favorizeaz multiplicarea bacteriilor a cror izolare o urmrim + in!ib selectiv flora de asociaie. - de identificare 6 studiul activitii bioc!imice a bacteriilor "n scopul "ncadrrii "ntr+un #en$specie. - de conservare. %. Cultivarea i i&olarea bacteriilor $n cultur pur

Te'nicile u&uale de cultivare a bacteriilor : "nsm'narea bacteriilor pentru obinerea culturii pure 6 se efectueaz demonstrativ "nsm'narea prin epuizare "n ( cadrane, pe #eloz simpl . )ns%*nare = depunerea "n mediul de cultur a materialului bacterian, inoculum. Cultur = totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare Colonie 0 mas de cultur, vizibil cu oc!iul liber pe suprafaa unui mediu de cultur solid, rezultat prin multiplicarea unei sin#ure celule bacteriene sau a unui #rup de celule, numit unitate for%atoare de colonii+@AC. Colonie = clon bacterian, "ECI cultur pur

+ + + + + + +

"escrierea caracterelor de cultur: condiii optime de cultivare: bacterii cultivabile vs. necultivabileB e i#ene nutritive: bacterii pretenioase vs. nepretenioase nutritivB temperatura optim de cultivare: psi!rotrofe $ psi!rofile $ mezofile $ termofileB atmosfera optim de cultivare: strict aerobe $ strict anaerobe $ facultativ anaerobe $ microaerofile $ carbo ifileB p4: neutru $ bacterii acidofile $ bacterii bazofileB presiune osmotic: bacterii care cultiv pe medii izotone$ bacterii !alofile. aspectul culturii pe medii lichide solide 2sublinierea diferenelor3: forma de cultur , /i forma de cultur C pe mediu lic!id $ solid: Aorma de cultur *ediu lic!id + tulbur omo#en mediile lic!ide + cultiv sub form de #run7i, ls'nd mediul supernatant clar *ediu solid + suprafaa neted, lucioas + contur circular + suprafaa uscat, ru#oas + mar#ini nere#ulate

S .

aspectul coloniilor: diametru, circumferina, relief, suprafa, culoare, transparena, consisten, aderena la mediuB modificri ale mediilor de cultur induse de cultivare 2se prezint comparativ mediile sterile cu cele "nsm'nate3 !emoliza pe a#ar+s'n#e: alfa $ beta $ #amma reacii pe medii difereniale za!arate producerea de pi#ment difuzibil "n mediu producerea unui miros particular. )n sala de lucrri practice se -sesc: medii ne"nsm'nate: a#ar nutritiv 2"n plac, "n pant3, mediu semisolid 2"n coloan3, bulion nutritiv, bulion selenit 2mediu de "mbo#ire3, a#ar s'n#e 2mediu "mbo#it, mediu diferenial3, CLDD 2mediu diferenial3, *cConEeF 2mediu slab selectiv /i diferenial3, GDCL$4eEtoen 2medii moderat selective /i difereniale3, medii de identificare &,1, *1@, ,immons, mediu LoHenstein Iensen. a#ar nutritiv /i bulion nutritiv "nsm'nate cu bacterii S 2!. coli3 /i . 2". cereus3. a#ar nutritiv 6 caracterul invaziv al #roteus 2vluri concentrice3. a#ar nutritiv 6 producerea de pi#ment difuzibil "n mediu de ctre #seudomonas aeru$inosa. a#ar nutritiv 6 colonii pi#mentate diferit 2comparativ, %.aureus, %.saproph&ticus, %arcina lutea3. a#ar s'n#e 6 colonii , /i ne!emolitice. a#ar nutritiv 6 !.coli $ %almonella $ %hi$ella 2colonii foarte asemntoare3. CLDD + !.coli $ %almonella $ %hi$ella 2colonii lactozo +$ colonii lactozo+3.

+ + + + +

+ + + + + + +

+ + + + + + + +

*cConEeF + !.coli $ %almonella $ %hi$ella 2colonii lactozo 2+3 $ colonii lactozo2+3, fr evidenierea producerii de 42,3. GDCL$4eEtoen + !.coli $ %almonella $ %hi$ella 2colonii lactozo 2+3 $ colonii lactozo2+3 productoare de 42, $ colonii lactozo2+3 fr 42,3. tuburi cu mediu semisolid "nsm'nate cu !.coli /i 'lebsiella. medii de tria7 bioc!imic: &,1, *1@, "nsm'nate cu !.coli /i #roteus. mediu ,immons, "nsm'nat cu !.coli /i 'lebsiella. medii pentru incubarea "n anaerobioz 2a#ar nutritiv "n plci Petri, "nsm'nate semicantitativ "n patru cadrane, cu amestec reductor3. bulion selenit, "nsm'nat. a#ar nutritiv "n pant, "nsm'nat, pentru efectuarea demonstraiei.