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Tema 1 - Microbiologia Clnica (evolucin histrica, conceptos generales, organizacin de laboratorio)

Microbiologa - la ciencia que estudia los seres vivos no visibles al ojo desnudo(microorganismos; aunque se incluyen metazoos parsitos no microscpicos), que atribuyen el origen de la vida sobre la tierra y el mantenimiento del equilibrio en la biosfera (en vida libre como saprofitos o depredadores con distinto grado de simbiosis => comensalismo, mutualismo o parasitismo), aunque tambin tienen efectos negativos como producir enfermedades; Los virus y viroides => parsitos endo-celulares obligados (no se replica en vida libre); Microbiologa medica => estudia a los microorganismos que afectan al hombre (reino procariota/ bacterias, los eucariotas del reino Fung, los virus y viroides); Parasitologa => estudia los eucariotas microscpicas (protozoos) ymacroscpicas (metazoos) de endo o ectoparsito (los artrpodos estudiados tambin comovectores y reservorios de enfermedades transmisibles);

Microbiologa medica: - Microbiologa general => se estudia conocimientos histricos, clasificacin, estructura y fisiologa de los microorganismos. - Microbiologa especial => se estudia 4 grupos de agentes infecciosos(bacteriologa, virologa, micologa y parasitologa) + recientemente los viroides (moleculas circulares de ARN de bajo peso molecular que carecen de cubierta proteica) y los priones(protenas codificadas por genes celulares y actan como seales reguladoras, responsables de algunas enfermedades neurolgicas graves - Creutzfeldt-Jacob y el Kuru)

Evolucin histrica de la microbiologa - como ciencia especializada no aparece hasta finales del siglo XIX; cuatro periodos :
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-1 => periodo especulativo (desde la antigedad hasta los primeros microscopistas) -2 => desde 1675 hasta la mitad del siglo XIX (descubrimiento de los microorganismos porLeeuwenhoek en 1675 - constructor de lentes holandes que invent el microscpio simple) -3 => periodo de cultivo de microorganismos hasta finales de siglo XIX (Pasteur y Kochlogro cristalizar a la Microbiologa como ciencia experimental bien asentada. -4 => desde principios del siglo XX hasta ahora (se estudian fisiolgica, bioqumica, gentica, ecolgica y surgimiento de virologa, inmunolgia. - Redi, Spallanzani y otros fisicos del siglo XVII demostraron que el microorganismo no se genera espontaneamente (de novo), postularon la teora de la biognesis (ser vivo nace de otro ser vivo). - Pasteur (1822-1895) demostr que la fermentacin era producida por microorganismos en crecimiento. - Se dobl el interes de muchos naturalistas tras la publicacin de los libros de Darwin. - Davaine (1863-1868) encontr grandes cantidades de m.o. en la sangre de las vacas(bacteridios) y Robert Koch (1843-1910) en 1876 aisl con sus tcnicas de cultivo puro el bacilo de antrax (Bacillus anthracis); mas tarde Koch y su colegas confirmaron que las esporas son formas diferenciadas y resistentes de bacilos y demostraron que la enfermedad poda transmitir sucesivamente a ratones sanos inoculndose bacilos obtenidos de cultivo puro; basados en los postulados su maestro Henle, Koch postul siguentes criterios : - el microorganismo debe estar presente en todos los individuos enfermos - el m.o. debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro - la inoculacin del m.o crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar la aparicin de sintomas especficos de la enfermedad en cuestin (cada enfermedad infecciosa esta causada por un tipo de bacteria diferente) - el m.o. debe poder ser re-aislado del hospedador infectado de forma experimental. Las 2 dcadas siguientes, se aislaron una gran variedad de bacterias patgenas; en Francia elInstituto Pasteur se concentro sobre los procesos infectivos, la inmunidad del hospedador y la obtencin de vacunas (vacuna antirrbica ensayada por Pasteur en 1885, contribuye al nacimiento de la inmunolgia).

Conceptos generales y clasificacin - al finales del siglo XIX los microorganismos se agrupan en un nuevo reino fuera de la teora de Darwin => Protistas para los protozoos, las algas microscpicas, los hongos microscpicos y las bacterias como seres microscpicos;Chatton en 1932 clasifica a los seres vivos en 4 reinos => animalia, plantae, protistas inferiores o procariotas (bacterias) y protistas superiores o eucariotas (algas, hongos y protozoos); Whittaker en 1969 agrupa en 5 reinos => animalia, plantae, fungi, procariotas y protista; Magulis en 1992 los agrupa definitivamente por ahora en 2 superreinos /dominios, 5 reinos y 2 subreinos =>
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- Dominio: procaryotae, 1 reino: monera, subreino: archeobacteria y eubacteria (incluyendo todas las bacterias divididas en grupos) - Dominio: eucaryotae, con 4 reinos: protista, fung, animalia y plantae (incluyendo protozoos, hongos, algas, animales y vegetales); protista => son unicelulares eucariontes pero que no cumplen con las caractersticas para estar en algn otro reino organismos de este tipo (p.ej. protozoos)

Diferencias bsicas entre los procariotas y los eucariotas: - clula eucaritica => presenta un ncleo verdadero rodeado por una membrana nuclear con determinado numero de cromosomas que estn constituidos por ADN e hitonas(protenas del ncleo); el citoplasma contiene mitocondrias, cloroplastos, ribosomas y otros orgnulos celulares y todo ello se recubre por una membrana que se prolonga hacia el interior, organizando unos canales en el que forma el retculo endoplasmtico (donde se encuentran los ribosomas - responsables de la sntesis de protenas); la membrana celular puede o no recubrirse de pared celular (carece de peptidoglicano) para proteccin o dar la consistencia a la clula; posee celulosa o quitina.

- clula procaritica => mas primitiva, no esta organizada y no posee verdadero ncleo (ADN no esta rodeado de una membrana - se encuentra libre); no posee mitocondrias, sino mesosomas (repliegues de la membrana celular donde se hallan lasenzimas responsables de la respiracin); tampoco hay cloroplastos, sino cromatforos(contienen clorofilas); los ribosomas se encuentran pegados a la membrana citoplasmtica que estn protegidas por una pared celular (peptidoglicano exclusivo de procariotas, aunque arqueo-bacterias y micoplasmas no lo poseen); las arqueobacterias, las eubacterias y los eucariotas se difieren en => la estructura de RNA polimerasa y en la composicion de los lpidos de su membrana.

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- los virus => un grupo aparte que no se ha integrado en ningn reino y se discute si son o no seres vivos; es incapaces de reproducirse por si mismos, dependen de un husped que les proporcione el mecanismo de la replicacin y sntesis de macromolculas); una vez que han conseguido esto, salen de la clula infectada produciendo su muerte; hay virus que infectan a celulas animales, otros a vegetales y otros a bacterias; un virus se define como => un bloque de material gentico rodeado por una cubierta proteica que le sirve como vehculo de transmisin; algunos pueden llevar una envoltura circundante compuesta de lpidos y carbohidratos; los viroides (30 especies) => agentes infecciosos (de menor complejidad gentica y estructural conocida) que solo afectan a plantas superiores; constituidos por 1 cadena de ARN cclica corta que no codifica protenas; tamao 10 veces menor que los virus (parecen ser una etapa primitiva de los virus); los priones (proteinceous infectious particle) => partculas patgenas de naturaleza proteica sin acido nucleico; identificados en 1982, aunque desde el siglo XVIII se sospechaba de su existencia; las enfermedades "prion" en el hombre (encefalopatas espongiformes transmisibles) afectan al sistema nervioso y se cree que tambin a los musculos.

Organizacin de un laboratorio de microbiologia clnica Estructura (depende del tamao y caractersticas, espacio que dispone y numero de personal): 1. reas/ secciones bsicas: - Seccin de toma de muestras - Seccin de recepcin y registro de muestras - Seccin de siembra de muestras - Seccin de medios de cultivo - rea de almacn 2. reas/ secciones especializadas : - Seccin de bacteriologa (se divide en reas => urocultivos, coprocultivos y parsitos, exudados y anaerobios, hemocultivos) - Seccin de micobacterias - Seccin de micologa - Seccin de antibiticos - Seccin de serologa o inmuno-microbiologa - Otras secciones (virologa o biologa molecular)
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Normas de seguridad e higiene en el trabajo - tratan de evitar el riesgo de infeccin al personal que trabaja en el laboratorio as como su extensin a la comunidad (establecidas por el CDC/ centro de control de la enfermedad) americano y del instituto nacional de salud de ese pas. Niveles de seguridad biologa: Nivel 1 => valido para laboratorios de enseanza que trabajan con microorganismo no patgenos bien conocidos y patgenos oportunistas: - las puertas permanecen cerradas mientras se trabaja - las mesas de trabajo se desinfectan al terminar el trabajo y cuando es necesario (derrame/contaminacin) - todo material contaminado debe ser esterilizado antes de desecharlo - no pipetear aspirando con la boca - no comer, fumar, aplicarse cosmticos, morder los lapices, bolgrafos o tener alimentos en el laboratorio. - lavarse las manos despus de trabajar con microorganismos y al terminar la jornada (uso de guantes). - realizar las tcnicas correctamente, evitando la produccin de aerosoles. - llevar bata durante el trabajo que se quitara al salir del laboratorio. - los materiales que no pueden ser esterilizados en el propio laboratorio, se transportaran en contenedores cerrados para el traslado hasta su descontaminacin; debe existir autoclave para descontaminar en el mismo edificio. - deben existir programas de desinfeccin y desratizacin - el diseo del laboratorio debe permitir una fcil limpieza incluso entre los muebles que deben ser impermeable, resistentes a los cidos, lcalis y al fuego. - cada laboratorio debe tener un lavabo. - si las ventanas se pueden abrir, deben estar protegidas con mosquiteros Nivel 2 => permite el trabajo con microorganismo de peligrosidad potencial moderada (hospitales o centros de salud a nivel primario); ademas de las normas del nivel 1, comprende las siguientes: - es obligatorio el uso de bata o pijamas que no deben usarse fuera del laboratorio, especialmente en el comedor o cafetera o salidas fuera del edificio. - las tcnicas serologcas con Ags sin capacidad infectante pueden realizarse en las mesas de trabajo - el acceso al laboratorio debe estar limitado. - se deben utilizar guantes en todas las tcnicas con productos potencialmente peligrosos o animales. - en un accidente de exposicin a productos contaminados (derrame, pinchazos), comunicar inmediatamente al responsable del laboratorio. - se toma una muestra de suero del personal cuando comienza a trabajar, se archivara como suero base. - existir un manual de normas de seguridad en el laboratorio que todo el mundo debe conocer y donde se exponga lo que debe hacerse ante un accidente. - se trabajara con cabinas de seguridad de nivel I, II o III cuando se realicen tcnicas que suponen produccin de aerosoles como centrifugacin, homogenizacin de muestras, siembra o procesamiento de muestras en general. Nivel 3 => es adecuado para trabajar con microorganismos de alto riesgo y comprende las normas de los niveles 1 y 2 y ademas:

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- todas las actividades con microorganismo o productos potencialmente patgenos se realizaran en cabinas de seguridad; ningn trabajo se realizara en las mesas de trabajo. - se utilizaran batas abiertas por la espalda, que no deben llevarse fuera del laboratorio; utilizar guantes cuando se trabaja con material contaminado o animales que se desinfectaran antes de desecharlos; en las habitaciones donde se tienen los animales se utilizaranmascarillas rgidas. - en el laboratorio no debe haber plantas o animales que no se utilicen en el trabajo. - el laboratorio debe estar aislado de la circulacin general, existiendo una doble puerta de entrada con una habitacin para cambiarse de ropa y con ducha. - las superficies y los muebles deben ser de fcil limpieza; las ventanas deben cerrar hermeticamente; las puertas se cerraran automticamente. - cerca de las puerta de salida existirn lavabos que pueden accionar con el pie, codo o rodilla. - existir un autoclave para descontaminar en el propio laboratorio - existir un sistema de extraccin de aire con circulacin del mismo de la puerta de entrada hacia el interior del laboratorio; regulacin de la entrada y salida del aire acondicionado; el aire de salida de las cabinas de seguridad tipo III saldr directamente al exterior; el de las cabinas tipo I y II se elimina directamente al exterior o al sistema general del edificio pasando previamente por filtros de alta eficacia (HEPA). Nivel 4 => este nivel solo se establece en laboratorios de experimentacin y no en laboratorios de microbiologia clnica; se necesita este nivel cuando se manejanmicroorganismos de altsimo riesgo o que son exticos en ese pas, especialmente virus.

Tema 2 - El Control de calidad de un laboratorio microbiologia clnica


El control de calidad sirve para : - Garantizar la fiabilidad de las tcnicas que se realizan en el laboratorio - Asegurar resultados rpidos y tiles - Estandarizar las tcnicas e interpretar correctamente los resultados - Controlar la calidad de las muestras, estableciendo una buena comunicacin con los clnicos y el personal encargados de obtener muestras - Aumentar la profesionalidad del personal del laboratorio y la confianza de los clnicos en los resultados que reciben. Metodos y reas de control de calidad 1. Control de calidad de las muestras => se debe controlar desde su obtencin, transporte y procesamiento hasta la emisin de los resultados siguiendo normas elaboradas con criterios claros de rechazo y establecer horarios fijos de recepcin de muestras. 2. Medios de cultivo => deben ser empaquetados correctamente en bolsas cerradas para evitar la desecacin, almacenados correctamente y etiquetados con la fecha de caducidad (a 4C dura 8-10 semanas; sin empaquetar a 4C dura 2 semanas; los caldos y agar en tubo con tapn a 4C - 6 meses); los que estn preparados en el laboratorio, siguen un control siguiente: - Control de esterilidad => comprobar con 1 unidad de cada lote (<100) o 3 unidad si es un gran lote mediante incubacin a 37C durante 24 horas; si se contaminan, debe rechazarse.

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- Control de crecimiento => se inocula un medio de cada lote con un inoculo reducido microorganismo control (cepas de coleccin) que asegure el crecimiento o con un inoculo estndar. - Control de medios con caractersticas selectivas => se inocula con el germen que no debe crecer en ello. - Control de las caractersticas bioqumicas => se utiliza un control positivo que produce la reaccin bioqumica esperada. 3. Reactivos de identificacin => se deben marcar con la fecha del primer uso y la caducidad. - Los reactivos de identificacin se deben utilizar siempre con un control positivo y negativo. - No deben utilizarse reactivos caducados o cuyo aspecto no sea el adecuado y debe asegurarse su almacenamiento correcto - Hay que utilizar siempre el lote o el vial cuya caducidad este mas prxima 4. Cepas control => una coleccin de cepas de ATCC dispone de prcticamente todos los microorganismo que se utilizan en controles de calidad. 5. Mantenimiento de las cepas control => se mantiene de manera que no pierdan sus caractersticas tpicas. 6. Control de aparatos => se debe mantener una temperatura ambiente en el laboratorio entre 23-29C y la humedad entre 30-50 %; al final de jornada se limpian los superficies con un antisptico (fenol 5% o glutaraldehido) - Limpieza => las neveras y congeladores se limpian y se descongelan peridicamente (mnimo 1 vez al ao); las cabinas de seguridad, centrifugas, agitadores de tubos se limpian todos los das al acabar el trabajo con antisptico fenol 5%; lasestufas y baos se limpian cada 6 meses. - Temperatura => un control diario de las estufas, baos, neveras y congeladores antes de empezar el trabajo; se usa un termmetro para cada aparato colocado en el interior del mismo - Atmsfera de incubacin => se controla la cantidad de CO2 de las estufas con un indicador que suele estar acoplado con sistema de alarma; se controla la atmsfera anaerobiamediante catalizadores e indicadores de azul de metileno. - Cabinas de flujo laminar => un cambio peridico de los filtros y un control de laslamparas ultravioleta. - Autoclaves => control de esterilizacion (fsico del aparato, qumico - tiras y biolgico esporas) - Microscopios => se limpian con suavidad al terminar la jornada, taparlos con su funda; se limpian cada semana los objetivos con alcohol-eter 50%; se realiza peridicamente un ajuste de condensadores y objetivos.

Tema 3 - Tcnicas de descontaminacin, desinfeccin y esterilizacin


En todo laboratorio de microbiologia se debe tener en cuenta : - todo material para la recogida de muestra debe estar esterilizado - todo material para la realizacin de las pruebas debe estar estril - antes de cualquier esterilizacin, el material debe estar limpio y/o desinfectado - conviene utilizar material desechable - el material de uso asptico debe guardarse separadamente del uso sptico - la limpieza de residuos en el suelo, mesas de trabajo y cualquier superficie se realiza mediante desinfeccin peridica
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- destreza y formacin por parte del personal sanitario de laboratorio (deben trabajar en condiciones de total asepsia) - la manipulacin de todo material debe seguir el protocolo de trabajo con medidas cautelares para la prevencin de accidentes laborales. Fases de la manipulacin del material del laboratorio - Material desechable (jeringas, guantes, lancetas) => se utiliza una sola vez y se desecha o se destruye; material punzante o cortante se desecha en recipientes resistentes a la puncin; si no es punzante, se auto-clavar y se tirar en contenedores especiales. - Material reutilizable (de vidrio, de metal, batas, gorro de tela) despus de su utilizacin se limpia, se desinfecta o se esteriliza (segn los casos) - Todo instrumento se limpia inmediatamente despus de utilizar (segn el protocolo de cada caso), despus se desinfecta o se esteriliza directamente para destruir cualquier forma de vida incluidas formas de resistencia o esporas. - Materiales no esterilizados (pero si se desinfecta - destruir toda forma de vida patgena) que se pueden utilizar => portaobjetos para la tincin, frascos lavadores con agua destilada, frasco de colorantes, etc. Principios bsicos de descontaminacin concepto de limpieza, desinfeccin y esterilizacin - Limpieza => se separa el material entre los de uso asptico y sptico, se limpia; los instrumentos se limpian primero con agua fra (la sangre se adhieren con calor), despus con agua caliente y jabn frotando en los ngulos, se enjuaga y se volver a aclarar con agua destilada; se seca y se comprueba su estado; se protege si es necesario. - Desinfeccin => materiales o superficies inertes (suelo, mesa), se utilizan metodos qumicos (detergentes, hipocloritos, etc.); desinfeccin de manos, piel y mucosas corresponde a tcnicas de antisepsia (se aplica tpicamente antispticos). - Esterilizacin => se usa para la reutilizacin de cualquier material. Tcnicas de descontaminacin fsica A. Tratamientos trmicos por calor seco y hmedo consisten en la esterilizacin o desinfeccin de los grmenes por aplicacin de calor seco o hmedo. 1. Descontaminacin por calor seco (depende de la temperatura, se consigue o no la esterilizacin) - Flameado => exponer un objeto a la llama de un mechero durante un tiempo segn el material de que se trate (p.ej. la asa de siembra) - Incineracin => se usa un horno crematorio para destruir material desechables(jeringas, catteres) - Horno seco => estufas de Pasteur o Poupinel (hornos metlicos de doble pared y bandejas ajustables) mediante resistencias elctricas, esterilizan durante 2 horas a 180 o 3horas y media a 160C; tienen termmetro externo que mide la temperatura en el interior y un selector de temperatura y un reloj; 2. Descontaminacin por calor hmedo - Ebullicin => se utiliza poco porque no es fiable; introducir el material en agua hirviendo (100C) durante 10 minutos como mnimo; no es un mtodo de esterilizacin (no destruyen esporas) - Autoclave => un recipiente cilndrico que se cierra hermticamente; externamente lleva un manmetro que registra la presin en el interior cuando esta en marcha; presenta una vlvula de seguridad que se abrir espontneamente cuando la presin interna supere la elegida o resulte peligrosa, una llave de purga que permite la salida de vapor y un reloj que selecciona el tiempo deseado con alarma que indica el final del proceso; interiormente hay una rejilla que se coloca por encima de una resistencia elctrica cubierta por agua destilada;
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es muy utilizado y se conseguir esterilizacin si sometemos el autoclave a 1 atmsfera durante 20 minutos (120C); en el se puede esterilizar => material metlico, cristal, torundas, compresas, paos, batas, plsticos y gomas reutilizables; el inconveniente=> con el tiempo los objetos metlicos se oxidan. Tcnica => con autoclave apagado y abierto, aadimos agua destilada hasta la rejilla, sin cubrirla (para que el material que deseamos esterilizar no contacte directamente con el agua); las piezas pequeas se colocan en cestas/ cajas; se cierra la tapa y se ajusta a presin; se abrir la llave de purga para que permita la salida de vapor y se ajustara la presin deseada para la esterilizacin y el tiempo (1 atmsfera - 20 minutos); se pondr en marcha el aparato y se espera hasta que salga vapor por la llave de purga; se cerrara la llave de purga y la presin comenzara a subir hasta llegar al nivel programado; a partir de aqu comenzara a contar el tiempo de esterilizacin; una vez realizada la esterilizacin se apagara el interruptor del autoclave y se esperara a que el manmetro baje a 0; cuando la presin este a 0, abriremos la llave de purga para que salga gran parte del vapor que todava se encuentra contenido; esto se realizara con cuidado para evitar descompresiones bruscas que podran originar la apertura de aquellos recipientes tapados con algodn graso; una ves comprobado la salida de vapor, se abre la tapa del autoclave y se extrae el material. - Tyndalizacin => mtodo de esterilizaciones consecutivas (repetidas en 3-4 das hasta que se elimine el germen contaminante); se utiliza cuando existe una contaminacin de algn material o en el propio autoclave; tericamente no se deben alcanzar temperatura >100C y no se debe abrir el aparato o recipiente que se somete a tyndalizacin; objetivo => destruir las esporas cuando germinan y evitar contaminaciones por microorganismos resistentes. - Vapor fluente => utilizar el autoclave siguiendo la tcnica habitual, pero la llave de purga abierta, lo que impedir que se produzca presin y la temperatura nunca sea > 100C; es utilizado para materiales o medios que no deban soportar temperaturas >100C (p.ej. medios muy azucarados, para evitar su caramelizacin); es poco usado en microbiologia. - Uperizacin => mtodo muy utilizado en la industria alimentaria (tratar el medio a una temperatura de 149-150C durante unos instantes (1-5 segundos). No se alteran las propiedades del medio y produce esterilizacin. - Pasteurizacin => no es un mtodo de esterilizacin y es utilizado en la industria alimentaria (calentar el medio a temperaturas entre 62C (15 minutos) y 72C (30 minutos); no destruye las formas de resistencia. Tratamientos a temperatura ambiente 1. Radiaciones ionizantes - las utilizadas en microbiologia son: - Rayos ultravioletas => para mantener la esterilidad de superficies y recintos; tienenpoca penetracion; acta impidiendo y alterando la duplicacin del ADN celular; se debe evitar su presencia en la piel;

- Rayos gamma => para conseguir esterilizacin en fri, producidos por isotopos radiactivos; presentan un poder de penetracin muy alto, constituyendo el mtodo de esterilizacin mas utilizado a nivel industrial (materiales de uso nico o

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desechable p.ej. guantes, jeringas, catteres, prtesis, vlvulas y que pudiera alterarse por calor) 2. Sistemas de filtracin (filtrar a las estructuras que sobrepasen un determinado tamao, segn el tipo de filtro; la efectividad del filtro es proporcional al tamao del poro, pudiendo conseguirse esterilizacin); presencia de presin, vaci y la carga del filtro (+); las bacterias en medios neutros son (-). - Filtros de membrana => filtros de celulosa muy purificada y con un tamao de poro fino o muy fino; existe desde sistemas sencillos hasta sistemas de piezas desmontables que llevan acoplada una bomba de vaci para ejercer succin sobre el medio a filtrar.

- Filtros de vidrio poroso o de fibra de vidrio => se utilizan en casos especficos y tienen mas resistencia que los anteriores.

- Filtros de Chamberland => son de porcelana porosa, mas caros que los anteriores y menos utilizados.

- Filtros de flujo laminar => dispositivos de filtrado donde entra aire contaminado y sale estril; utilizados como mecanismo de esterilizacin en campanas de flujo laminar, en quirfanos y recinto que pretende crear o mantener un ambiente estril; flujo => vertical u horizontal.

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- Ultrasonidos => introducir el material en tanques de distintos tamaos con liquido desinfectante; una vez puesto en marcha el dispositivo, comienza a vibrar a gran velocidad originando pequesimas burbujas que entran en todos los recodos del material consiguiendo eliminar los microorganismos; es poco utilizado, caro y poco practico.

Tcnicas de descontaminacin qumica 1. Metodos qumicos de desinfeccin (desinfectantes que se aplica sobre objetos y superficies y antispticos que se aplica sobre la piel y mucosas); condiciones que cumplir en un buen mtodo de desinfeccin: - matar el mayor numero de grmenes o al menos todos los patgenos - ser econmico - no ser corrosivo, toxico ni irritante para los tejidos - se deber diluir al menos en agua - tener un olor agradable Los mas utilizados: - Detergentes catinicos => diluidos al 1% para desinfeccin de manos; mas frecuente para limpieza y desinfeccin de paredes, suelos, ropa y objetos (sin diluir) - Clorofenoles => muy eficaces y se asocian con los detergentes catinicos para mejorar el grado de desinfeccin. - Compuestos clorados => para desinfeccin de superficies, ropas, urinarios; se suelen usar diluidos en agua (lejias /hipocloritos) - Acido fenico => diluido al 5% para la limpiar objetos y superficies. -Amoniaco Los antispticos mas utilizados: - Alcoholes => limpiar y desinfectar la piel, las manos (etanol), el filo de instrumental y superficies pequeas (metanol) que no tiene contacto con la piel (p.ej. alcohol isopropilico70%) - Mercurio-cromo => contiene mercurio y un buen desinfectante para heridas superficiales (las mantiene secas y protegidas)

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- Derivados yodados => para preparar la piel antes de una intervencin quirrgica, en la puncin lumbar, antes de puncin para hemo-cultivo, etc.; son efectivos y ejercen su accin por oxidacin (p.ej. betadine, ibetane) Metodos qumicos de esterilizacin - los mas empleados son "Oxido de etileno" => en forma de gas (10C) mezclado con CO2, ya que puro es muy oxidante y podra explosionar al mezclarse con O2; presenta un gran poder de penetracin y es muy efectivo y duradero; la esterilizacin se produce a => temperaturas bajas (40C) con humedad relativa alta (4060%) durante un tiempo de 3-8 horas (media de 5); se requiere cmaras o instalaciones especificas para ello, son muy caras; el oxido de etileno se aplica a cualquier material sensible al calor y que no pueda esterilizarse por otros metodos (p.ej. endoscopia, plsticos termo-lbiles, cauchos, material elctrico); el material esta listo para ser utilizado a las 48 horas despus de la esterilizacin; deber conservarse estril en el interior de una bolsa de plstico cerrada por procedimientos termoelctricos y dura 6 meses. Control de esterilizacin - permiten comprobar la eficacia del proceso de esterilizacin 1. controles de esterilizacion de tipo fsico => incluidos en el aparato de esterilizacion (manmetros miden presin; vacuo-metros miden el vaci en el interior; termmetros, grficos que registran los valores parmetros mas significativos del proceso: temperatura, humedad, presin, vaci, tiempo etc.) 2. controles de tipo qumico - comercializados en forma de cinta adhesiva, como indicadores del proceso de esterilizacion (por encima de la temperatura determinada cambian de color), fundamentalmente para el control trmico. 3. sistemas de tipo biolgico - comercializados en forma de capsulas cerradas en cuyo interior hay esporas de resistencia a la esterilizacion conocida; dichas ampollas, tras haber sido sometidas a condiciones de esterilizacion, se incuban a 56C (Bacillus strearathaemophilus) o a 40C (Bacillus subtilis); a cabo de 24-48 horas, se procede a su lectura donde la germinacin y cambio de color indicara si se han producido condiciones de esterilizacion.

Tema 4 - Toma de muestras (recogida, manejo y tratamiento)


Seleccin de la muestra para tener significacin diagnostica - representativa del proceso patolgico y cantidad suficiente (p.ej. no es relevante un esputo poco purulento y contaminado por saliva); recipiente estril adecuado (para un pus de un absceso => anaerobio, estriles); Procedimiento para la toma de muestras: - La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento ATB (al menos informar al laboratorio de ATB que esta recibiendo) - Es muy importante seguir las normas necesarias para evitar la contaminacin externa de las muestras (descontaminar la piel, evitar reas con flora normal, medio de cultivo especficos para el patgeno sospechoso) - La extraccin o recogida de las muestras se debe realizarse en el estado adecuado de la enfermedad (durante la fase aguda o diarreica) - La cantidad recogida debe ser suficiente y es fundamental que se utilice unrecipiente estril y que se envi a laboratorio lo mas pronto posible. Extraccin de sangre para hemocultivos (septicemia)
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La tcnica de extraccin (se hace en un pico febril > 38,5C /antes de la toma de la siguiente dosis de ATB) => smarch en el antebrazo, escoger la vena antes de la desinfeccin (alcohol 70 o clorhexidina alcohlica un rea de 5cm - frotando rigurosamente), yodo-povidona 2% desde el centro hacia afuera en el circulo, dejar secar 1 minuto, ponerse guantes estriles, realiza la extraccin , cambiar la aguja antes de inyectar la sangre en las botellas de cultivo, desinfectar otra vez la piel con alcohol (sensibilidad al yodo), remitir las botellas de hemocultivos inoculadas inmediatamente; se recomienda 3 muestras de 10 ml (cada extraccin para 2 botellas (aerobios y anaerobios) en 24 horas con intervalo de >1 hora (al menos 2-3 extracciones separadas 30 minutes en 24 horas) en sitios diferentespara dilucidar un posible contaminante de la piel; en nios es suficiente extraer 15 ml mximo cada extraccin; pacientes con tubuladora intravenosa/ catter, se toma en la va mas abajo; se extrae lo mas limpio posible para no incluir bacterias saprofitas de la piel;los frascos se marcan con etiqueta del paciente, numero de cama y hora de extraccin. Recogida de LCR (el procesamiento inmediato/ urgente) => se recoge insertando un agua, de forma asptica, en el espacio sub-aracnoideo a nivel lumbar, se recoge en 3-4 tubos estriles con tapa de rosca (tubo 3 o 4 => recuento celular, 1 y 2 =>microbiolgicos y bioqumicos; si solo se llena 1 tubo => microbiologia retirara de forma asptica la cantidad necesaria, el resto => citolgicos y bioqumicos; el volumen de muestra es importante (10 ml) para la deteccin (p.ej.M.tuberculosis y C.neoformans); no se deben refrigerar (temperatura ambiente o estufa a 37) excepto para estudios virales se pueden refrigerarse hasta 24 horas o congelarse a -70C si hay una mayor demora; la muestra bacteriana => turbio (meningococo dentro de leucocitos), virales => transparente; Recogida de otros lquidos estriles - la aspiracin percutnea de liquido sinovial, pleural, pericrdico y peritoneal se hace de forma asptica y se inyecta inmediatamente en un frasco o tubo esterilizadas (transporte anaerobio), antes, se expulsar las burbujas de aire de la jeringa; se puede aadir una pequea cantidad de heparina para evitar la coagulacion. Recogida de muestras del tracto respiratorio superior : - Exudado farngeo => se realiza mediante una torunda de algodn, dacrn o alginato de calcio frotando vigorosamente ambas reas amigdalinas, la faringe posterior y las zonas de inflamacin, ulceracin, exudacin o formacin de capsulas; la lengua se oprime con un depresor para reducir al mnimo la contaminacin del hisopo con secreciones bucales. - Exudado nasal => se realiza introduciendo un hisopo profundamente en cada fosa nasaly rotando suavemente. Tractor respiratorio inferior - el esputo es una muestra menos relevante por la posibilidad de la contaminacin por saliva; una buena muestra => instruir debidamente al paciente para lograr una expectoracin profunda (ayudarle con fisioterapia respiratoria/ clapping, hidratacin o nebulizacin); pacientes con traquestomas => se recoge aspirando(en un frasco de Lukens); las secreciones bronquiales se recoge mediante broncoscopio, instilando una pequea cantidad de SF estril en el rbol bronquial (tambin puede estar contaminado por flora del tracto superior, aunque es mas relevante que esputo); una muestra mas profunda se recoge mediante broncoscopio con lavado broncoalveolar (BAL) para buscar Pneumocistis carinii y hongos; cepillado bronquial es una tcnica mas agresiva en caso de neumonas por aspiracin; muestras de bacterias anaerobias se recoge por una puncin transtorcica, biopsia transbronquial y pulmonar abierta. Recogida de heces (se procesa lo antes posible): - Toma de muestras para coprocultivo - se recoge con un escobilln que se introduce en un tubo estril preparado con un medio de transporte adecuado (Cary y Blair) (tubo con una
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cuchara y liquido rojo/transparente; tambin se puede utilizar frasco de orina estril; medio Cary y Blalir mantiene la viabilidad de los patgenos intestinales); basta con impregnar la torunda en las heces en la parte donde se observa sangre, moco o pus; - Muestras para estudio parasitolgico - se recoge durante 3 das consecutivos, se guardan en la nevera en un recipientes cerrados para evitar la desecacin (temperatura 35C); los huevos, las larvas y los quistes de protozoos permanecen viables varios das; la cantidad de muestra es pequea (1 cucharilla de caf en un frasco con alcohol polivinilico /PVA 1:3); para investigar oxiuros (parsitos) se utiliza preparacin con cita de celofn; se proporcionan al paciente 6 portaobjetos (se toma durante 6 das consecutivos) con cinta adhesiva transparente; se toma la muestra a primera hora de la maana antes de lavarse; se aplica la cinta sobre los margenes del ano con una suave presin, se retira y se coloca de en el porta; Recogida de orina - el frasco estril no debe abrirse antes de la recogida; las partes genitalesse lava solo con agua; se recoge a primera hora de maana para estudio microbiolgico, de forma asptica, se echa el primer chorro, se recoge la segunda mitad unos 20-30 ml. Sondaje vesical (puncion de sonda) y puncion suprapubica - se realiza por el personal de enfermeria Recogida de muestra de tracto genital se utiliza un tubo con escobilln de algodn como medio de transporte; exudado uretral => el hisopo se introduce 2 cm dentro de la uretra y se rota suavemente antes de retirarlo (muestras separadas para el cultivo de gonococos y clamidias o ureaplasmas => se utiliza 2 escobillones,1 para estudio de gonococos 2 para clamidias o ureaplasmas); exudado cervical => se inserta un hisopo especial (como uretral) en el canal cervical y rotandolo y moviendo-lo durante 30" antes de retirar; exudado vaginal => el hisopo se sumerge en el fornix posterior de la vagina; para aislamiento de gonococos pueden ser transportados en elmedio de Stuart modificado o en el medio de Amies con carbn en temperatura ambiente, hasta su inoculacin; para aislamiento de clamidias y micoplasmas, el medio es tampon con sacarosa y ATB; se puede refrigerar si hay demora en el proceso. Procedimiento para muestras en anaerobiosis - se obtiene mejor con una jeringa y aguja, a los que debe expulsarse todo el aire. Transporte de muestras: - Metodos convencionales => el mas utilizado es hisopos en tubos de plstico que llevan incorporados diversos medios de transporte que consiste en un agar semi-solido, pH regulado, carece de nutrientes, pero contiene tioglicolato de sodio como reductor, para prolongar la viabilidad de los microorganismos cuando exista demora entre la recogida y su cultivo; los mas utilizados => (1) Medio de Stuart (los exudados farngeos, conjuntivales, nasales y heridas) que mantiene un pH favorable e impide la deshidratacin de las secreciones durante el transporte y la oxidacin y autodestruccin enzimtica de los patgenos presentes (2)Medio de Cary y Blair (muestras fecales) donde las salmonellas y las shigelas pueden recuperarse hasta 49 das despus de la toma de muestras y Vibrio cholerae hasta 22 das despus. - Transporte de muestras para estudio en anaerobiosis => cuando la muestra se va a procesar dentro de 30 minutos, puede servir como transporte una jeringa con una aguja insertada en un tapn de goma; si la demora va a ser mayor, se usa un tubo /frasco ampolla lleno de CO2 y libre de O2 con N2/ H2 con indicador en agar o caldo; la muestra liquido se

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inyecta a traves del tapn de goma despus de expulsar el aire de la jeringa y aguja; existe tambin un hisopo en un tubo anaerobiosis Envi de muestras (las medidas especiales para un envi por correo a un laboratorio de referencia): - Muestras que contengan virus deben ser refrigeradas inmediatamente y enviarse en una caja con unidades comerciales refrigerantes - La sangre no se enva entera, se separa el suero y se enva en un tubo estril - La muestra <de 50 ml debe ser envasado en un recipiente hermtico irrompible con espacio suficiente entre ambos para retener en caso de rotura; el envase se coloca dentro de otro envase para el envi; el envase externo se identifica con un rotulo rojo y blanco para Agentes biolgicos /Material bio-medico. Manejo inicial de las muestras en el laboratorio - la mayor parte de las muestras para estudio bacteriolgico que vayan a demorarse en su procesamiento deben mantenerse en la nevera a excepcin de LCR; los fragmentos de pelos o raspados de piel y uas para el aislamiento de hongos pueden ser mantenidos a temperatura ambiente durante varios das antes de ser inoculados (protegidos del polvo).

Tema 5 - Procesamiento de las muestras en microbiologia clnica (protocolos de siembra)


Normas bsicas generales (antes de proceder al procesamiento de la muestra): 1. Volante de peticin debe estar bien cumplimentada (filiacin y datos administrativos del paciente, datos clnicos, datos de la muestra, teraputica seguida, determinacin solicitada) 2. Tener constancia de que la obtencin de la muestra ha sido realizada correctamente, siguiendo las normas y criterios establecidos por el laboratorio, as como su recogida, transporte y conservacin. 3. La siembra de dicha muestra se har en los medios idneos para cada caso, bien en placa, por agotamiento y/o mtodo cuantitativo, o bien en tubo. Procesamiento de las muestras 1. Orinas (debe llegar al laboratorio en contenedor estril y ha de conservarse a 4C en menos de 24 horas) [a] Agar sangre, chocolate o Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (medios general y especifico para orinas) => se siembra en 3 direcciones/ cubrir totalmente la superficie (cuantitativa en Cled o AS - para contar colonias; realizar antibiograma); crecern todo tipo de germenes: cocos Gram+, bacilos Gram-, levaduras; en Cled/AS no crecen cocos Gram- (Neisseria, Moraxella, Chlamydia); en AS se comprueba las caractersticas hemolticas o no de las bacterias e.j. Stafilococcus aureus (B hemoltico) y en Cled, las caracterstica lactosa (+) => amarillas o lactosa (-) sin cambio de color => azul verdosas. [b] Agar Mac Conkey (selectivo para bacilos Gram-) => se siembra por agotamiento en cuadrantes (puede ponerse un disco de Colistina en el inoculo para ayudar a la identificacin de E.coli (sensible a colistina - comn en orinas); crecen bacilos Gram=> Enterobacterias y tambin Pseudomonas; observaremos las caractersticas de lactosa (+) => colonias rojas y lactosa (-) sin cambio de color => rosa.
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[c] Agar Citrato de Simmons (solo en algunos protocolos); se siembra enla lengeta del tubo preparado en pico de flauta; las colonias consumidoras decitrato (+) => vira a azul y las que no, permanece verde; se usa para la diferenciacin deEnterobacterias (para diferenciar entre coliformes y coliformesfecales. Los coliformes fecales no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los coliformes no fecales como Enterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podan utilizar el citrato en este medio dando una reaccin alcalina) en base a su capacidad de utilizar el citrato (mediante citrato permeasa) Los grmenes mas frecuentes que podemos encontrar (en orina se identifican especies) : - E. coli (el mas frecuente) => bacilo Gram-, mvil, sensible a Colistina, lactosa (+), indol (+) - Streptococcus faecalis => coco Gram+, catalasa (-), oxidasa (-). - Proteus spp (todas) => bacilo mvil Gram-, resistente a Colistina, lactosa (-), oxidasa (), Triptfano Desaminasa/TDA (+), ureasa (+) tardo. - Stafilococcus aureus => coco Gram+, catalasa (+), coagulasa (+), B hemoltico, oxidasa(). - Candidas spp (todas) => morfologa de levaduras (parece como hemates) - Klebsiella spp => bacilo Gram-, inmvil, sensible a Colistina, ureasa (+), colonias mucosas, lactosa (+), tardo. - Pseudomonas spp => bacilo Gram-, mvil, sensible a Colistina, lactosa (-), oxidasa (+) 2. Coprocultivos (contenedor especifico para coprocultivo "Cary y Blair" / bote de orina;conservada a 4C, procurar procesarla en <24H; se siembran por agotamiento en cuadrantes). [a] Hecktoen o SS => medios selectivos y diferenciales donde crecern el generoSalmonella y Shigella; en Hecktoen las Salmonellas spp => colonias lactosas (-), verdosas y pueden ser SH2/sulfihidrogeno/ acido sulfidrico (+) con fondo negro, sonbacilos mviles, sensible a Colistina; las Shigellas spp => lactosas (-) , SH2 (),bacilos inmviles en fresco y sensibles a Colistina; las colonias lactosas (+) en este medio sern amarillas; en SS las Salmonellas y Shigella sern el del medio (caramelo) y tambin con el fondo negro (Salmonellas SH+ y lactosa- ); colonias lactosa (+) => rojizas; las colonias lactosas+ no son patgenas (coliformes fecales) y no se investigan. [b] Agar Yersinia CIN => para buscar colonias de Yersinia spp (rosa clarito - Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis.) que aparece como lactosa (+),sensible a Colistina y bacilos Gram- e mviles, fermentador de manitol. La inhibicin selectiva de organismos gram negativos y gram positivos se obtiene mediante cristal violeta (inhibidor de Gram+), desoxicolato sdico (inhibidor de Gam+) y los agentes antimicrobianos: cefsulodina, Irgasan (Triclosan) y novobiocina (inhibidor de S.epidermidis).

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[c] Agar Campylosel => crecer Campylobacter spp (bacilos Gram- con flagelos) como colonias pequeas translucidas, sensibles a Nalidixico (especies C. coli y C.jejuni) resistente a Nalidixico el C. fetus, en fresco aparecen en coma/en S, ureasa (+) oxidasa (+) catalasa (+); al hacer la prueba del hipurato C.jejuni seran (+) y C.coli (); P. hipurato => un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimticamente (hipuricasa) el hipurato sdico que da lugar a acido benzoico y glicina un compuesto de color morado.

[d] Caldo Selenito => caldo enriquecido para los gneros Salmonella y Shigella. el selenito de sodio inhibe la flora Gram+ y la mayora de la flora entrica excepto Salmonella spp.

[e] Agar McConkey (solo en algunos protocolos) => los coliformes aparecern como colonias rojas por ser lactosas (+); no es necesario??? [f] Agar TCBS /tiosulfato citrato bilis sacarosa (detectar Vibrio cholerae) => aparecen colonias de color amarillo sacarosa (+), oxidasa (+) y son bacilos Gram- pleomrficos; el extracto de levadura y la peptona proporcionan el nitrgeno y las vitaminas.El citrato sdico, el tiosulfato sdico, la bilis de buey y un pH alcalino fuerte inhiben los organismos Gram+ y suprimir los coliformes (inhibidor para la mayora de las entero-bacterias), favoreciendo el crecimiento de Vibrio cholerae porque este organismo es sensible a los
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entornos cidos. La alta concentracin de sodio favorece el crecimiento de Vibrio cholerae que es halotolerante (tolera el medio salado) y de otras especies de Vibrio, cuya mayora es haloflica. La sacarosa (+) es un carbohidrato fermentable, y el cloruro sdico estimula el crecimiento. El tiosulfato sdico es una fuente de azufre y acta con el citrato frrico como indicador para detectar la produccin de cido sulfhdrico/SH2. El azul de bromotimol y el azul de timol son indicadores de pH. En Mc, Vibrio Cholerae es lactosa (-).

3. Exudados vaginal y uretral (la muestra llegara en uno o varios escobillones; se siembra por agotamiento en cuadrantes). [a] Agar Sangre (medio general) => buscamos Streptococcus B hemoliticos del grupo B(S.agalactiae), que aparecern como colonias pequeas translucidas con un halo de B hemlisis alrededor de la colonia; son cocos Gram+, catalasa y oxidasa (-), anaerobio facultativo, prueba de ltex (+). [b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias muy pequeas grisceas que crecen bien por ser grmenes exigentes en su crecimiento que requieren factor X y/o V (proceden de la degradacin de la Hb); tambin podemos colocar discos de factor X y/o V y mirar el satelitismo; al fresco como coco-bacilos inmviles, Gram-; oxidasa y catalasa variable. [c] Agar Thayer Martin o New York => buscamos N.gonorrhoeae o N.meningitis que aparecern como colonias de color gris; son diplococos Gram-, catalasa (+), oxidasa (+) que fermentan la glucosa pero no el resto de los azucares. [d] Agar Gardnerella => buscamos Gardnerella vaginalis, como colonias B-hemolticas y al fresco como bacilo pequeo, Gram variable, anaerobio facultativo, oxidasa (-) y catalasa (-). La presencia de sangre humana favorece el crecimiento de las especies estudiadas, ya que producen -hemlisis alrededor de las colonias. La -hemlisis en agar con sangre humana es altamente indicativa de presencia de G.vaginalis. Los antibiticos incluidos en el medio inhiben la mayora de los contaminantes Gram- y de las levaduras.

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[e] Vagicult o Roiron (medio liquido) => yTrichomonas (protozoo unicelular flagelado).

crecen levaduras

(Candidas

spp)

[f]

Agar

Sabouraud (se de

puede

incluir

para

detectar Candidas

spp)

[g] Medio

deteccin

de Micoplasmas y Chlamydias

4. Semen - la muestra llegara en contenedor estril/ bote de orina; se siembra por agotamiento en cuadrante en medios: Cled, McConkey , Agar Sangre, Agar chocolate, Thayer Martin o New York, Roiron, y cultivo de Clamydias, buscando en cada caso los mismos grmenes que en el caso del exudado vaginal. 5. Esputo - la muestra ha de llegar en contenedor esteril y conservarse menos de 24H a 4C; antes de sembrar se observa por el microscopio si la muestra es valida/ no esta contaminada por saliva; se siembra por agotamiento en cuadrantes; solo se siembra cuando en el Gram, el cociente leucocitos/ celulas epiteliales sea > 2,5 (recuento en fresco/al microscopio); si es < a 1,5 es dudoso. Cuando sean muestras de UCI o provenientes de neumonas se siembran siempre. [a] Agar Sangre => buscamos colonias de Streptococcus pneumoniae oBranhamella catharralis; S.pneumoniae >> colonias verdosas (alfa hemlisis) y al fresco como coco Gram+, catalasa (-), sensible a la Optoquina; Branhamella catarralis >> colonias blancogrisceas y al fresco como cocos Gram-, oxidasa (+), catalasa (+) que no utiliza ningn azucar (no es fermentadora), pero reduce los nitratos a nitritos/ nitratasa+ (lo que le diferencia del genero Neisseria que ademas es fermentadora de glucosa y maltosa). [b] Agar chocolate => buscamos Haemophilus spp como colonias puntiformes translucidas, que al fresco como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable; agar chocolate polyvitex (contiene factor V/ NAD y factor X /hemina procedente de
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ladegradacin

de

Hb) Gram-.

[c] Agar McConkey => donde creceran Enterobacterias y otros bacilos

[d] Medio de Lowestein-Jensen (o Coletsos) => para rescatar Mycobacterium tuberculosis, bacilos acido alcohol resistente (Zhiel Neelsen+) de crecimiento muy lento; los niveles bajos de la penicilina y el cido nalidxico tambin estn presentes en el medio de LJ para inhibir el crecimiento de lo Gram+ y Gram-, con el fin de limitar el crecimiento de especies de micobacterias solamente. Presencia de verde malaquita en el medio inhibe las floras mayora acompaante; que se desinfecta y se solidifica mediante un proceso de espesamiento; el Glicerol mejora el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis. [e] Medio Legionella => muestras de UCI; la Legionella pneumophila es bacilo Gram-(en realidad, se tie muy mal, aerobio exigente, movil; en general, no fermenta ni oxida los azucares, sino que utiliza los aminoacidos; es hipurato+ => un procedimiento cualitativo para determinar la capacidad de las bacterias de hidrolizar enzimticamente ( hipuricasa) el hipurato sdico; necesita L-cisteina para crecer y tambin iones frricos Fe. La inhibicin del crecimiento de las bacterias Gram+, la mayora de las bacterias Gram-, levaduras y mohos, a travs de una combinacin optimizada de 3 antibiticos. Las colonias que crecen en medio Agar Legionella y no crecen en medio AS deben considerarse, con alta probabilidad, colonias de Legionella.

6. Cepillado bronquial (la muestra vendr en el cepillo y se conservara a 4C < de 24H);se siembra en los mismos medios que en el caso anterior (esputo) aadiendo ademas: agar sangre anaerobios (ASA) o medio AKV (agar sangre kanamicina-vancomicina), selectivopara bacilos Gram- anaerobios y Bacteroides (bacilo Gram-, anaerobio estricto). 7. Exudado faringeo y oral (la muestra viene en torunda, se sembrara por agotamiento en cuadrante). [a] Agar sangre => crecera todo tipo de grmenes (medio general enriquecido) [b] Agar chocolate => crecera todo tipo de grmenes [c] Agar Mac Conkey => creceran las Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco exigentes. [d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/ inhibe los Gram- => para deteccion de Streptococcus B-hemoliticos, Enterococcus y Staphylococcus?? [e] Agar Sabouraud (solo en orales) => deteccion de Candidas spp. 8. Exudados varios - abscesos heridas ... (se sembrara por agotamiento en cuadrantes. La muestra ha de llegar en tubo estril y se conservara a 4C menos de 24H. [a] Agar sangre => crecer todo tipo de grmenes [b] Agar chocolate => idem
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[c] Agar Mac Conkey => crecern las Entero-bacterias y otros bacilos Gram (-) poco exigentes. [d] Agar CNA /agar sangre (de cordero) colistina nalidixico, medio selectivo para Gram+/ inhibidor Gram- => crecern bien los Steptococcus B-hemolticos. [e] Agar ANA (agar sangre anaerobios/ASA, aunque tambin puede utilizarse agar AKV, agar sangre kanamicina y vancomicina) => medios selectivos para bacilos Gramanaerobios (estrictos) y Bacteroides. [f] Caldo Tioglicolato => crecen bien todo tipo de bacterias aerobias o anaerobias; permite el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricional-mente exigentes. Adems, se observa que las bacterias estrictamente aerobias, crecen en la parte superior, mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las profundidades del medio.

RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENO EN TIOGLICOLATO En base a la relacin de las bacterias con el oxgeno, estas se pueden clasificar en : 1. Aerobio estricto: Un organismo el cual requiere utilizar el oxgeno como aceptador terminal de electrones , puede tolerar un nivel del oxgeno equivalente o mayor de una atmsfera de aire (oxgeno del 21%), y tiene un tipo terminantemente respiratorio de metabolismo (Mycobacterium tuberculosis, Bacillus). 2. Anaerobio o Aerobio facultativo : Un organismo que puede crecer bien en ausencia del oxgeno y en la presencia de un nivel de oxgeno equivalente a una atmsfera del aire (oxgeno de 21%) => Enterobacterias, Vibrio spp, Haemophilus spp.. 3. Microaeroflico (anaerobio aerotolerante): Un organismo que es capaz de un crecimiento oxgeno-dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del oxgeno equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de <21%) => Campylobacter fetus, Pseudomonas y Neisseria. 4. Anaerobio estricto : Un organismo que es incapaz de crecimiento oxgeno-dependiente y no puede crecer en la presencia de una concentracin de oxgeno equivalente a una atmsfera de aire (oxgeno de 21% - nada de O2). (Clostridium botulinum). 5. Anaerobios aero-tolerantes: Pueden crecer con o pero su metabolismo es siempre fermentativo sin oxgeno ( Lactobacillus)

9. Liquido cefalorraqudeo - se siembra por agotamiento en cuadrante del sedimento del tubo centrifugado a 1500 rpm a 3000 rpm durante 20 minutos, si en el tubo hay mas de 1 ml de muestra. Sino, vortear el tubo. La muestra se ha de procesar de inmediato y si no es posible, conservarse a 37C. [a] Agar sangre => buscamos Neisseria meningitidis, como pequeas colonias no hemolticas y al fresco se ve como diplococos, Gram-, oxidasa (+), catalasa (+), fermentador de glucosa y maltosa (la fermentacin de este azucar le diferencia del gonococo; tambin puede crecer Streptococcus pneumoniae (neumococo) que aparecen como colonias verdosas (Alfa hemolisis) y al fresco como cocos Gram+, catalasa (-), sensible a la optoquina.
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[b] Agar chocolate => dem y ademas pueden crecer Haemophilus spp como colonias puntiformes translucidas, que al fresco aparecer, como coco-bacilos, Gram-, catalasa y oxidasa variable. [c] Agar Thayer-Martin => medio selectivo para Neisserias, crecern bien los meningococos /N.meningitidis. [d] Medio tioglicolato (caldo) => medios para anaerobios y aerobios. (f) Ademas se har una extensin para Gram. 10. Otros lquidos estriles (sinovial, pleural, pericardio...) - se siembran por agotamiento; la muestra ha de llegar en tubo estril y su conservacin no se ha de demorar mas de 24H a 4C. [a] Agar sangre => crecern casi todo tipo de microorganismos, con caractersticas hemolticas de algunos de ellos. [b] Agar chocolate => crecern casi todo tipo de grmenes, sobre todo exigentes. [c] Agar McConkey => crecern Enterobacterias y otros bacilos Gram- poco exigentes. [d] Agar CNA => agar columbia colistina nalidixico (sangre de cordero), selectivo para Gram (+) [e] Agar ASA => agar sangre anaerobios selectivo para bacilos Gram- anaerobios yBacteroides. 11. Cateteres y sondas - se siembra mediante la tcnica de Maki (rodamiento del cateter) [a] Agar chocolate => crecern casi todo tipo de grmenes, y podrn crecer bien algunos exigentes como el Haemophillus. [b] Agar sangre => crecern bien casi todo tipo de grmenes y podr verse sus caractersticas hemolticas si las tuvieran. [c] Caldo tioglicolato => si se observa crecimiento se har un pase por Agar chocolate. [d] Tambin puede ponerse en una placa de agar MacConkey. 12. Hemocultivos - la muestra se introduce en el vial de hemocultivos, conservando a 37C en el Bactec (detecta CO2) hasta su identificacin.

Tema 6 - Medios de Cultivo en bacteriologa clnica (Clasificacin y Preparacin)


Medios de cultivo - compuesto por distintos nutrientes requeridos para cultivar grmenes como las bacterias, hongos y parsitos segn sus necesidades nutricionales de cada uno; en funcin de sus requerimientos, existen grandes diferencias entre los medios de cultivo que nos sirven para diferenciar cada tipo de microorganismo que podr crecer en unos medios de cultivo y no en otros. Funcin de medios cultivo : - separar y aislar distintas especies microbiales presentes en una muestra. - paso previo para el estudio de identificacin de un microorganismo problema. - conocer el metabolismo en funcin del nutriente o sustrato que utiliza (lactosa) o metabolito que produce (indol). - estudios macroscpicos => visualizar las caractersticas de las colonias en medios slidos. - realizar antibiogramas determinando la sensibilidad (mayor/menor) de la bacteria problema a distintos antibiticos. pruebas de CMI (concentracin minima inhibitoria) conservar las especies microbiales o muestras.
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Requerimientos energticos y no energticos de los medios de cultivo - fuente de energia (fuente de carbono y de nitrogeno) y fuente no energtica (azufre, fsforo, iones metlicos, factores de crecimiento, f. de arranque y inhibidores) necesarios para el desarrollo (crecimiento) de cultivos microbiales; fuente de carbono => acido acetico, alcohol, citrato sdico, azucares (mono o disacridos incluso almidn => glucosa, lactosa, maltosa), CO2 (bacterias fotosintetizantes y quimiolitotrofas); conocer el tipo de azucar utilizado => til para su identificacin bioqumica y clasificacin taxonmica; fuente de nitrgeno (menos energtica) => protenas completas (gelatina - determinar actividad proteoltica/gelatinasa; extractos de carne y sales de amonio), pptidos/polipeptidos (peptonas - extractos de levadura, casena - trpsica de casena/triptfano => formacin de indol) o aminocidos y otros => nitratos, nitrogeno organico, amoniaco, sales de amonio, aminoacidos; conocer la fuente nitrogenada => util para clasificacin taxonmica; fuente de azufre => sulfatos, tiosulfatos, aminoacidos (metionina, cisteina, tiamina); fuente de fosforo => fosfatos; iones metalico => hierro, potasio, sodio, magnesio y en concentraciones mas bajas => cinc, manganeso, cobre, cobalto, etc; Otros requerimientos no energticos : Factores de crecimiento => componentes que muchas bacterias no son capaces de fabricar por si solas para su crecimiento (aminocidos => cisteina; factor X y factor V procedente de la degradacin Hb; vitaminas, bases puricas y pirimidicas); factores de arranque => sustancias que permite a la bacteria salir de su fase de latencia y comenzar su fase de crecimiento exponencial (fuentes de energa => glucosa; iones metlicos que estimula el crecimiento); factores inhibidores => componentes que bloquar el proceso metablicos de algun microbio; muy tiles para la identificacin y tipificacin bioqumica de las bacterias (azida sodica => impide Gram-; antibiticos => inhibidores y destructores; colorantes laeosina azul de metileno utilizado por medio Levine; cristal violeta en medio Mac-Conkey => impide Gram+). Condiciones que ha de cumplir un medio de cultivo : 1. Una composicin de nutrientes adecuada (requerimientos energticos y no energticos) 2. Condiciones fsico-qumicas apropiadas: - Temperatura optima/ideal (segn la especie microbiana => psicrfilas <20C;mesfilas 18-45C; termfilas > 45C; las bacterias patgenas del hombre 35-37C; fuera de estas no crecen o crecen mucho mas despacio;) e.j.: Yersinia 22C, Campylobacter 45C (los dos son gastrointestinales) - Grado de humedad (cantidad de agua que necesita para crecer) - pH adecuado es en general cercano a la neutralidad +/- 7(estabilizante de pH => buffers o tampones que facilitan el crecimiento); pH acido => Tiobacilos (cerca a 0); pH alcalino => bacilos ureasa positivo/ Proteus (en torno a 8) y Vibrio cholerae (pH 9) - Presin osmtica en general isotnia (300 miliosmoles) - Presencia o ausencia de oxigeno; la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias son facultativos que se desarollan bien con y sin O2; existen pocos anaerobios estrictos; bacterias microaeroflica => produce mas CO2. Principales tipos de medios de cultivo - segn su proporcin de agua / su consistencia (slidos, lquidos, caldo) - segn su uso / su utilizacin (para aislamiento, crecimiento en general /recuento, identificacion, mantenimiento de cepas, para antibiogramas) - segn su origen del que proceden (naturales, sintticos y semi-sintticos, complejos) - segn su presentacin (deshidratados o liofilizados, slidos en placa petri, slidos en tubo, lquidos en tubo, semi-slidos en tubo, doble fase en frasco o tubo).
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Medios de cultivo segn su proporcin en agua: - Medios slidos > 15% de agar; para aislamiento, identificacin, elaboracin de antibiogramas) =>1881 Koch utiliza la gelatina (inconveniente => se funde a 24oC y existen bacterias gelatinasa positiva que destruiran tal medio); posteriormente Hesse su alumno usa el agar (medio inerte). - Medios lquidos/caldos => contiene agua, fuente de carbono, sales minerales y algunos lleva factores de crecimiento, vitaminas, peptonas y aminocidos. - Medios semisolidos => agar semi-slidos (<5% de agar) Medios de cultivo segn su uso o utilizacin: - Medios para aislamiento => {a} medios enriquecidos (componentes basicos + caseina soja, triptofano para microorganismo exigente; e.j. agar sangre/chocolate {b} medios selectivos (componentes basicos + componentes que impiden el crecimiento de algn tipo bacteriano para seleccionar) e.j. medio Rothe (para aislar Streptococcus faecalis /Gram+)contiene azida sdica que impide Gram-; la mayoria de medios selectivos son tambin medios diferenciales {c} medios diferenciales (= medios selectivos + sustancias resalta las caracteristicas microbiales de algunas; e.j. medio Levine (contiene eosina y azul de metilenoque inhibe Gram+ y algunas Gram-, facilita a las enterobacterias y lactosa (para las fermentadoras) - Medios para crecimiento en general => liquida o solida sirve para el crecimiento de la mayor parte de las bacterias (componentes basicos + sales y agua) ; e.j. el caldo comun (contiene extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro sodico y agua); el caldo Tioglicolato. - Medios de identificacin (= medios diferenciales) => sirve para clasificar taxonmicamente el microoganismo; e.j. agua peptonada = indol positivo; caldo Stuart urea-indol = ureasa; glucosa = fermentacin de glucosa (sacarolitico = sacarosa positivo). - Medios de mantenimiento de cepas => mantener las cepas vivas durante periodos de tiempo relativamente largos a temperaturas bajas para impedir su crecimiento; e.j. leche descremada congelada - Medios para antibiogramas; e.j. Proctor (antibiogramas fungicas), Mueller Hinton(a.b.bacterianas), Wilkins-Chapman (a.b. bacteriana anaerobicas). Medios de cultivo segn su origen - Medios naturales => poco utilizados, se preparan artesanalmente, constituidos por ciertos tejidos, liquidos organicos (leche, huevo, patata, suero sanguineo) - Medios semi-sintticos => parte de su composicion son extractos naturales (levadura, malta, patata, sagre, leche) + constituyentes sintticos - Medios sintticos => estructuras sintticas mas o menos puras y qumicamente definidas disueltas en agua destilada (los mas utilizados en bacteriologia y en general); contiene: fuente de carbono o azucar, fuente de nitrgeno inorgnica como iones NO-3, NH+4 o orgnica como peptona, aminocidos, aminas, etc., compuestos minerales como oligoelementos, factores de crecimiento (vitaminas, aminoacidos, bases puricas o pirimidnicas). - Medios complejos => son los primeros que se utilizaron en bacteriologa; en actualidadse uss mas en parasitologa y virologa; se preparan de forma compleja (tejidos animales/carne de musculo, higado, corazon, yema de huevo, azucares, pepetonas, vegetales, etc. Medios cultivo segun deshidratados Medios ya Medios solidos en Medios solidos de Medios su o placa en presentacion liofilizados preparados Petri tubo
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Medios Medios Medios

de

liquidos semisolidos doble

en en fase en

tubo tubo frasco

Principales medios utilizados en microbiologa 1. Agua peptonada (peptona en medio acuoso con pH 7 a 37C 24-48 horas) => determinacin de la produccin de indol debido a su alto contenido en triptfano; tras laadicin de 5/6 gotas de reactivo Kovacs en hidrxido potsico (KOH 40%) => anillo rojo en la superficie indicara indol positivo.

2. Medio Chapman (selectivo y diferencial) => aislamiento de Staphylococcus (halfilos)S.aureus (coagulasa+); Comp: alto contenido de cloruro sdico 75 gr (agar manitol salado); 15 gr de D-manitol (diferencial => azucar utilizado por algunos estafilococos), 25 gr de rojo fenol (indicador positivo de pH a 37C 24-48 horas => amarillo dorado); es orientativa, se debe completar la prueba con pruebas bioqumicas (coagulasa/latex); S.epidermidis no fermentan el manitol, por tanto el color sigue rojizo o purpureo.

3. Agar de Thayer y Martin (Agar New York City) => no permite el crecimiento de muchos microorganismos, pero si permite aislar gonococos y meningococos (Neisseria); Comp: agar chocolate/ sangre calentado + formula polyvitex (vitaminas y aminocidos) + VCAT (vancomicina => inhibe los Gram+, colistina => inhibe los coliformes /Gram,anfotericina => antifngico, trimetropinsulfametroxazol => antibitico de amplio espectro).

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4. Agar chocolate Polyvitex => medio general enriquecidos donde crecen la mayora de bacteria y Haemophyllus); Comp: agar chocolate + formula polyvitex (vitaminas y aminocidos) incluyendo factores X (hemina) y V (NAD/ nicotinamida adenina dinucletido) proporcionados por la hemoglobina y PolyViteX.

5. Medio base Christensen (lquidos y slidos) => para la prueba de la ureasa; ureasa+ de rojo => rosa; grmenes con ureasa+ => Proteus y Helicobacter pilory

6. Medio citrato de Simmons (agar solido) => prueba de citrato (como fuente de energa) para la investigacin de bacilos Gram- (la diferenciacin entre coliformes y coliformes fecales. Los coliformes fecales (E.coli) no fueron capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono ni a las sales de amonio como fuente de nitrgeno. Los coliformes no fecales comoEnterobacter aerogenes o Salmonella enteritidis podan utilizar el citrato en este medio dando una reaccin alcalina); Comp: citrato sdico, azul de bromotimol (indicador pH, de que el citrato esta consumido /se alcalina; verde => azul); grmenes con citrato permeasa =>Klebsiella pneumoniae, Salmonella, Enterobacter aerogenes.

7. Medio Clark y Lubs (caldo/ liquido) => para diferenciar entero-bacterias medianteprueba de Voges-Proskauer (produccin de acetona/ acetil metil carbinol => por reduccin a 2,3 butanodiol o por oxidacin a diacetilo); y prueba de Rojo de Metilo (acidificacin del medio con pH <4,5 y cambio de color a rojo); grmenes con VP+ => Klebsiella pneumoniae yEnterobacter aerogenes; grmenes con RM+ => Proteus, E.coli y Salmonella.
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8. Medio Cled/Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient (solido) => recuento e identificacin de grmenes en las vas urinarias; Comp: lactosa en alta cantidad, azul de bromotimol (indicador del consume lactosa verde => amarillo); las colonias mas frecuente => E.coli (amarilla L+), Proteus (azul L-), Klebsiella (amarilla azulada y muy mucosa (L+), Pseudomonas aeruginosa (verde L-), Streptococcus faecalis (amarilla L+), Staphylococcus aereus (amarilla L+).

9. Agar sangre (se comercializa con nombre TSA => tripticasa, soja, agar) => investigacin de microorganismos hemolticos (consume hemates); es un medio general enriquecida; Comp: sangre de cordero (agar columbia) o caballo o ternero => estriles y desfibrinadas; alfa hemlisis/ neumococo (parcial) => halo verdoso/difuso alrededor de la colonia; beta hemlisis/ Streptococcus B-hemoltico y Staphylococcus aureus que causan anginas (total) => halo transparente; gamma hemlisis/ Pseudomona causa gastro intestinales (no hemolizar) => sin halo.

10. Medio eosina azul de metileno /EMB (Medio Levine) => selectivo y diferencial, para aislamiento de entero-bacterias Gram- (E.coli, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Proteus,

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Klebsiella) Comp: alto contenido de lactosa (indicador fermentadora), eosina azul de metileno(indicador de pH y inhibidor los Gram+ y las floras de Gram- fastidiosas).

11. Medio de agar Hektoen (diferencial y selectivo) => aislamiento de entero-bacterias patgenas Gram-; Comp: sales biliares (inhibe Gram+), lactosa (indicador de L+ => amarillo/naranja) sacarosa, peptona, tiosulfato sdico y citrato frrico amoniacal (indicador de la produccin SH2/H2S => puntos negro), azul de bromotimol, fuschsina cida (indicadores de pH); en condicin normal es verde => fermentacion de lactosa/acidificacin => vira a amarillo/naranja (caractersticas de fermentadora L+Escherichia, Serratia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter y Vibrio cholerae); cuando se consume lactosa + peptona (se acidifican primero, y despus se basifican) => verde; cuando se consume azufre/ disulfurasas+ => precipita el hierro y la colonia se vuelve negro (caracterstica de Salmonella y Proteus vulgaris).

12. Medio Kliger o KIA (Kliger Iron Agar) => medio solido en tubo (color caramelo); muy semejante y mas utilizado es TSI (triple sugar, iron) + 10 gr de sacarosa; muy utilizado para la identificacin de entero-bacterias, pruebas de la lactosa, glucosa, gas y SH2; Comp: lactosa (indicador de L+), peptonas, glucosa, citrato frrico amoniacal y tiosulfato sdico(componentes para producir SH2), rojo fenol (indicador de pH); los grmenes productor deSH2+ => Proteus, Salmonella y Citrobacter; los productores del gas CO2+ => Salmonella y Citrobacter y E.coli.

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13. Medio MacConckey (color rosa) => aislamiento e identificacin de entero-bacterias Gram-/ poco exigentes; Comp: sales biliares (inhibidor Gram+), lactosa (indicador L+), cloruro sodico, rojo neutro, cristal violeta (inhibidor los cocos de Gram+); L+ (consumidor de lactosa) => rojo (E.coli y Enterobacter aerogenes), L- (no fermentador)=> Salmonella, Shigella y Pseudomonas; Gram- exigentes => Neisseria, Haemophyllus.

14. Medio Mueller Hinton (general) => para la realizacion de antibiograma por el mtodo de Bauer-Kirby

15. Medio Ornitina Movilidad/ MIO (preparado en tubo/ semisolido) => identificacin de la movilidad bacteriana (entero-bacterias), capacidad para descarboxilar la ornitina (orinitina descarboxilasa /est dada por un color prpura/ alcalinidad del medio y la produccin de indol (al aadir reactivo de Kovacs); La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de inoculacin; el germen que da resultado positivo de los 3 pruebas => E.coli.

16. Medio caldo F-Selenito (selectivo) => medio enriquecido con fosfato para el
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aislamiento de Salmonella; Comp: selenito sdico (inhibidor de flora Gram+ y Gramexcepto Salmonella); despus tambin se hace cultivo con agar SS.

17. Medio agar S-S (color caramelo) => aislamiento de las bacterias patgenas importantesSalmonella y Shigella; Comp: lactosa (indicador fermentadora de L), tiosulfato sdico y citrato de hierro (indicador de SH2), sales biliares y verde brillante (inhibidor bacillos Gram+), rojo neutro (indicador de pH); L+ (coliformes - E.Coli y Klebsiella) => rojas o rosadas; L- y SH2- => incoloras (tpico de Shigella); L- y SH2+ con la precipitacin de hierro => negro (tpico de Salmonella).

18. Medio Agar XLD (agar xilosa-lisina-desoxicolato) => se utiliza para el aislamiento y diferenciacin de bacilos entricos Gram-, especialmente del gnero Salmonella y especialmente Shigella (entero-bacterias patgenas); Comp.: xilosa (la fermentan los entricos menos Shigella), sacarosa y lactosa, desoxicolato de sodico (inhibe Gram+); se puede utilizar para la identificacin de lactasa+, lisina descarboxilasa+ => Salmonellaque alcaliniza el medio y SH2+ (tiosulfato sdico + citrato de hierro amoniacal).

19. Medio

caldo

Columbia =>

caldos

para hemocultivos.

20. Medio Castaeda (caldo y solido) => bsqueda de grmenes Brucella, Vibrios y Pasteurella en sangre (hemocultivos). 21. Medio de Lowenstein-Jensen (selectivo) => cultivo de Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias; Comp: fcula de patata, verde malaquita => inhibidor de la mayora de grmenes; la prueba se confirma con tincin de acido alcohol resistencia (Con la tincin de
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Ziehl-Neelsen las micobacterias se observan como bacilos de color rojo); micobacterias patgenas crecen muy lenta (+ 7 das); los niveles bajos de la penicilina y el cido nalidxicotambin estn presentes en el medio de LJ para inhibir el crecimiento de Gram+ y Gram-, con el fin de limitar el crecimiento => nico de micobacterias.

22. Medio Sabouraud => para el aislamiento e identificacin de hongos micelares y levaduriformes. 23. Medio Sabouraud gentamicina tetrazolium => para el aislamiento e identificacinde Candida (levaduriformes); La gentamicina inhibe el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram- y Gram+.

24. Medio Schaedler con vitamina K3 (caldo o agar solido) => para cultivo deanaerobios (estrictos y facultativos); La presencia de factores de crecimiento como el extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3 y la adicin de sangre de cordero permite el crecimiento incluso de las especies ms exigentes. El agente reductor (L-cistina) y la elevada concentracin de dextrosa en el medio favorecen el crecimiento de especies anaerobias p.ej. Lactobacillus, Streptococcus, Clostridios y Bacteroides. 25. Medio CPS cromognico (agar/ solido) => es un medio de aislamiento y de identificacin destinado a las muestras urinarias; permite realizar (1) el recuento microbiano (mtodo de inoculacin estandarizado); (2) identificacin de: Escherichia coli, Enterococcus del grupo D, KES (Klebsiella, Enterobacter, Serratia), Proteeae (Proteus, Providencia, Morganella); la concentracin elevada de agar evita el crecimiento invasivo de Proteus; el medio se inocua directamente a partir de la orina, respetando tcnicas adecuadas de toma de muestras y su transporte; permite la identificacion directa de: a. E.coli => coloracin espontanea (rosa a burdeos) de las colonias productores de Bglucuronidasa (B-GUR) y coloracin azul revelada por el reactivo indol cuando la cepa
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genera triptofanasa. b. Enterococcus y KES => coloracin espontanea azul-verde de las cepas que producen Bglucosidasa (B-GLU). c. Proteeae => coloracin marrn revelada por el reactivo TDA cuando la cepa genera triptfano desaminasa (sin reactivo es incoloro). Modo operativo - dejar atemperar las placas a temperatura ambiente; inocular la muestra con el asa calibrada de 10ul => sumergir el asa en la orina, mantenerlo verticalmente; descargar el asa al realizar una estra sobre un radio de la placa; realizar estras perpendiculares muy apretadas sobre toda la superficie de la placa; incubar en la estufa con la tapa hacia abajo a 37C en aerobiosis; se examinan los cultivos despus de 24 horas de incubacin. Lectura e interpretacin: Recuento - estimar la concentracin bacteriana comparando la densidad de las colonias presentes sobre la mitad superior de la placa con la del esquema; <1000 (negativo), entre 1000 100.000 (dudoso), mas de 100.000 (positivo) Identificacin observar las colonias (1) Colonias de color rosa a burdeos o translucidas con centro rosa a burdeos=> presuncin de E.coli; confirmar mediante una deteccin de indol (depositar una colonia sobre un disco de papel previamente embebido de una gota de reactivo R1 del envase ID Indol TDA) => indol+ da una coloracin azul (E.coli); la ausencia de color azul (indol-) se debe proceder a la pruebas de API. (2) Colonias de color azul-verdoso y observacin de cocos Gram+ mediante examen directo => Enterococcus; si no cumple esta condicin, se debe proceder a las pruebas de API. (3) Colonias de color azul-verdoso y observacin de bacilos Gram- mediante examen directo => grupo KES; la identificacin se debe proseguir mediante pruebas bioqumicas (ureasa+ => Klebsiella; ornitina descarboxilasa+ => Enterobacter; gelatinasa+ => Serratia). (4) Colonias incoloras a marrn-anaranjado => efectuar TDA (depositar sobre algunas colonias idnticas, una gota de reactivo R2 del envase ID Indol TDA), observar la coloracin despus de unos 30 segundos => TDA+ da una coloracin marrn +/- oscuro; efectuar indol => indol+ da color azul (Proteus, Providencia o Morganella); ausencia de coloracin azul es indol- (Proteus mirabilis); TDA- da una coloracin amarilla y la identificacin se debe proceder a las pruebas de API.

Tema 7 - Metodos de Siembra (cultivo de las cepas)


Sembrar - cultivar la muestra utilizando tcnica y medios adecuados para conseguir el objetivo (identificar el microorganismo).

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Preparacin de inculos (pequea parte de muestra) - Muestras viscosas o concentradas (anlisis cuantitativo) => suspender un cultivo joven y puro o un producto patolgico (muestra biolgica) en 5 ml de solucin diluyente (caldo de cultivo, suero fisiolgico estril o agua destilada estril. - Ajustar con la escala con un gradiente de turbidez (tecnica de Kirby-Bauer) => tubos numerados como patrn de referencia segn la concentracin de microorganismos; se ajusta mediante comparacin visual aproximada o mediante la absorbancia de espectrofotometra;escala de Mcfarland => una serie de tubos con precipitacin blanco de sulfato de bario por reaccin de acido sulfrico + cloruro de bario (escala 0,5 = 1,5 x 10.6/ml de microorganismos en el inoculo; escala 1 = 3 x 10.6 /ml; escala 2 = 6 x10.6./ml.

Metodos de inoculacin y aislamiento de microorganismos 1. Metodos de siembra inoculacin: {a} En medio liquido; con asa => se sumerge el asa cargada en el medio y se agita; con pipeta => se vierte el contenido de la pipeta sobre el medio de cultivo y se homogeneiza; con escobilln = con asa. {b} En medio solido (en placa): - Inoculacin previa al vertido en placa (tcnica de Barry - no se utiliza mucho) => 0,1 ml de inoculo + 25 ml de medio cultivo => fundido/ atemperado a 45-55C para no esterilizar => homogeneizar => verter en la placa de Petri. - Inoculacin sobre la superficie del medio solidificado (tcnica de Kirby-Bauer) => se prepara el inoculo en un tubo estril; se introduce un escobilln estril impregnando; se elimina el exceso presionando el escobilln con movimiento de rotacin contra las paredes del tubo; se siembra la placa emplenando la tcnica de los tres giros distribuyendo uniformemente el inoculo; se deja secar la placa 4-5 minutos en posicion semiabierta e invertida, quedando lista para ser utilizada (en los antibiogramas). {c} En medio solido (en tubo): - Siembra por estria en superficie inclinada => se toma la muestra con el asa /hisopo; se introduce en el tubo que contiene el medio; desde el fondo y en progresin ascendente se desliza el asa en movimiento de zig-zag (se utiliza para pruebas bioqumicas y renovar cepas). - Siembra en picadura (para ver la movilidad de los grmenes en la zona de puncin + pruebas bioqumicas) => se toma la muestra con la aguja o hilo; se punciona en el centro del medio introduciendo la punta de la aguja hasta 2-3 mm del fondo del tubo; se extrae la aguja por la misma linea que se introdujo; medio solido inclinado => puede realizarse tambien una siembra en estra por la superficie del medio con la misma aguja; agar semisolido => puede usar el asa en lugar de la aguja.

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2. Metodos de siembra - aislamiento (para obtener cepas puras/ bien aisladas) : {a} Siembra en estria o zig-zag => se deposita el inoculo en el extremo superior de la placa; se siembra con el asa o con hisopo, a partir del inoculo, con un movimiento en zig-zag cada vez mas amplio de lado a lado de la placa; el estriado ha de hacerse sin presionar el medio, suavemente, sin levantar el asa y sin flamearla; las colonias mas aisladas las obtendremos en la zona mas distal del inoculo, es decir al acabar la siembra. {b} Siembra en tres direcciones => se deposita el inoculo en el extremo superior de la placa dejando deslizar hacia el centro para ello inclinaremos la placa (tambin se puede arrastras con el asa); mediante asa o escobilln, haremos movmientos laterales de un lado a otro de la placa, dejando las estrias muy juntas; giramos la placa 90 y realizamos la misma operacin, sin flamear o cambiar de asa; volvemos a girar la placa haciendo lo mismo; al final nos queda una placa muy bien tapizada. Se realiza en urinocultivos para el contaje de las colonias. {c} Siembra en estra multiple => se deposita el inoculo en un extremo de la placa; con el asa se reparte en varios tramos, siguiendo el borde de la placa; entre cada tramo se ha de flamear o cambiar el asa; los segmentos seguidos describen un poliedro regular y el ultimo tramo se efectua hacia el interior en el que se obtendran colonias aisladas. {d} Tcnica por agotamiento en cuadrantes (lo que usamos) => es muy similar a la anterior pero sin flamear el asa y estriando mas los cuadrantes, aprovechando mas la placa. {e} Tcnica de los 4 cuadrantes => se divide la placa en 4 cuadrantes (pueden rotularse por la parte posterior); se deposita el inoculo en el extremo superior de uno de los cuadrantes y se siembra en estra; sin flamear el asa, se realiza la misma operacion sucesivamente en los otros 3 cuadrantes; en cada uno de ellos se sembrara el inoculo que queda adherido al asa, tras la siembra del anterior; en el ultimo de los cuadrantes sembrado, se encuentran las colonias aisladas. {f} Tcnica de los tres giros => se siembra en estra la mitad de la placa; flamear el asa; se gira la placa 90, sembrando en estra la mitad superior de la misma; se repite la operacin, es decir se ha de flamear el asa, se gira la placa y se estra; la colonia aisladas aparecer en la zona sembrada en ultimo lugar.

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Tema 8 - Caractersticas biolgicas de la bacteria (Morfologa)


Bacterias - organismos unicelulares de tamao 0,2-2 um, relativamente sencillos, cuyamaterial gentico no esta rodeado por una membrana nuclear especial (procariotas). Estructura - constituidos por elementos obligados (presentes en todas las bacterias eindispensables para su vida => pared celular, membrana plasmtica, citoplasma, ribosomas y la regin nuclear); elementos facultativos (son elementos de supervivencia y virulenciaque pueden estar o no presentes en la bacteria => capsula, flagelos, pelos/pilis, endosporas e inclusiones citoplsmicas)

Pared celular - es el limite externo de la clula con estructura rgida, parecida a la pared celular de las clulas vegetales; funciones => protegerse de cambios externos adversos,mantener la morfologa de la clula, proporciona la resistencia a los antibiticos, dar un paso selectivo de algunas sustancias, proporciona la especificidad de grupo y de tipo (clasificacin), implicada en la patogenicidad; dar el color en la tincin de Gram, violeta oscuro => Gram+ y color rosa => Gram-. Estructura y composicion de la pared celular - Gram+ => mono-estratificada y gruesa, compuesta por mureina (peptidoglicano - mono-capa, 50% peso seco/mucha cantidad), polisacridos, protenas y cidos teicoicos; Gram- => biestratificada y fina (1 capa es mureina en poca cantidad y 2 capa formada por polisacridos protenas, fosfolipidos y lpidos, no tiene cidos teicoicos); las bacterias que no son sensibles a la tincin de Gram => BAAR/ acido alcohol resistentes (micobacterias); las que sin pared celular => los de genero mycoplasma/ patgenas; la que tienen (formas S), pero la pierden (formas L).

Membrana plasmtica - estructura delgada que se extiende por dentro de la pared celular, encerrando al citoplasma; funciones => acta como barrera selectiva, interviene en ladegradacin de nutrientes y produccin de energa, en algunas se encuentran pigmentos y enzimas para la fotosntesis; estructura y composicin => fosfolpidos, protenas y
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glicolpidos; mesosomas => plegamientos hacia dentro de la membrana plasmtica, irregulares (no existen en las celulas eucariticas), se encargan de dirigir la duplicacin del ADN bacteriano y realizar la respiracin. Citoplasma - es todo lo que hay en el interior de la membrana plasmtica; funcin => engloba los orgnulos celulares (regin nuclear, ribosomas, inclusiones/depsitos de reserva, vacuolas); no tienen ni aparato golgi, ni retculo endotelial plasmtica, ni mitocondria;composicion => 80% de agua, enzimas, iones y principios inmediatos. Regin nuclear - una zona en el interior del citoplasma donde se acumula el acido nucleico;funciones => el acido nucleico transmite la informacin gentica de la clula sobre estructuras y funciones celulares; estructura y composicion => es un ncleo difuso que contiene 1 molcula ADN bicatenario, formando N cromosomas (enroscada en forma de anillo); plsmidos => estructuras que pueden existir ademas de ADN cromosmico (formadas por moleculares de ADN extra-cromosmico bicatenario, pueden estar libres o unidos al ADN cromosmico /episomas), se replican independientemente, se transmite por conjugacin, portan genes muy importantes que determinan la resistencia a antibiticos, tolerancia a metales txicos y sntesis de enzima. Ribosomas - son orgnulos celulares muy abundantes (presentes en eucariotas y procariotas) dan aspecto granuloso a su citoplasma; funciones = > sntesis de protenas;estructura y composicion => en grupos de 3 o 4 unidos por un filamento de ARN mensaje (polirribosomas), cada ribosoma tiene 2 subunidades de 30 y 50 Svedberg (velocidad relativa de sedimentacin), procariotas - 70S y eucariotas - 80S; comp: 60%ARNr y 40% protenas. Elementos facultativos (algunos no tienen - variables) - son elementos de supervivencia y virulencia Inclusiones citoplsmicas - aparecen en el citoplasma y no tienen una estructura uniforme; funciones => depsitos de reserva e intervienen en funciones de regulacin; Tipos: (1) Grnulos de reserva => lipdicos, corpsculos metacromticos (fosfato inorgnico), polisacridos (glucgeno y almidn), grnulos de azufre; (2) Vacuolas => acmulos de gases o lquidos rodeados de membrana (donde se fija CO2). Flagelos - largos apndices filamentosos frecuentes solo en los bacilos (su presencia es rara);funciones => responsable de la movilidad (elementos patognico: facilitar la difusin de las bacterias a traves de las membranas); estructura => tres partes (filamento, codo y corpsculo basal); tipos =>montricas (1 solo flagelo en un extremo), loftricas (2 o mas en un extremo), anftricos (un grupo de flagelos en un extremo y otro grupo en el otro extremo), pertricos (flagelos distribuidos en toda la superficie de la bacteria); Pelos /pilis o fimbrias - elementos rgidos constituidos por una protena (pilina); cortos, muy numerosos, distribuidos sobre la superficie, mas frecuentes en Gram- que en Gram+;funciones => capacidad de fijacin a superficies (pelos comunes), proporcionan pelos comunes y sexuales (son morfolgicamente iguales), sistema de intercambio de informacin gentica por conjugacin (pelos sexuales). Endosporas - solo en bacilos (Bacillus aerobio estricto y Clostridium anaerobio estricto); una forma de resistencia que adoptan algunas bacterias ante situaciones adversas (deficiencia nutricional, desecacin, frio, temperaturas elevadas, agentes qumicos); se forman por un proceso de esporulacin /esporognesis, pueden permanecer latentes durante
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cientos de aos y volver a una forma vegetativa por un proceso germinacin; localizacin => zona central, subterminal o terminal (depende de su tamao, pueden o no deformar el bacilo); la espora=> clula en reposo con capacidad de resistencia a la desecacin, calor y agentes qumicos;esporulacin => la produccin de estructuras, enzimas y metabolitos nuevos y la desaparicin de muchos componentes celulares; Morfolgicamente comienza con el aislamiento del ncleo y elementos energticos mediante el crecimiento en vaginante de la membrana; los elementos esenciales para la vida quedan protegidos en esa nueva estructura (endosporas); la bacteria queda en estado latente esperando una condicin externas favorables para resurgir. Capsula - estructura que rodea la pared bacteriana; se visualiza con tincin negativa (tinta china); funciones => regula el intercambio de agua, iones y nutrientes, sirve como almacn externo de nutrientes, defensa frente a Acs, fagos y celulas fagocticas (elemento virulencia),protege de la desecacin (contiene agua), formacin de colonias (habitualmente engloba mas de una bacteria); estructura y composicin => polisacridos y protenas.

Tamao y Morfologa de las Bacterias - 0,2 - 2 um; es preciso utilizar el microscopio ptico; la morfologa => informacin primaria sobre el tipo de bacteria, pero no de forma concluyente (viene dada por la rigidez de la pared; formas => esfrica/coco, coco-bacilo, bastoncillo/cilndrica/bacilo, helicoidal/espirilo, en coma/vibrio, espiral/espiroqueta, estrella y cuadrangular /forma de hifas de hongos (actinomyces/ streptomyces - productor de muchos ATB, ATF y inmunosupresores); agrupacin de los cocos => aislados, en parejas/diplococos (granos de cafe - tpico de neisserias/meningitis), en cadenas/estreptococos, tetradas o tretacocos (4 celulas => micrococcus/micrococacceae), en racimos/estafilococos, en formas cubicas de 8 elementos/sarcinas (sarcinas ventriculi tolerancia al medio cida/ estomago); agrupacin de los bacilos => aislados, en parejas/diplobacilos, en cadena/estreptobacilos, algunos se parecen a cocos/cocobacilos(E.coli), en forma empalizada/letra china (corynebacterium - algunos son saprofitos de la piel y tambin causante de difteria). Aroma tpicos => Pseudomonas aureginosa (olor a jabn); Haemophyllus (olor asemen/yeso); Citrobacter (olor a ftido); Proteus (olor a amoniacal); Klebsiella y E. coli (olor a levadura de pan).

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Tema

Fisiologa

de

las

bacterias

Morfologa macroscpica - estudio de la forma y estructura de las colonias (masas constituidas por muchos millones de bacterias, se aprecian a simple vista y originadas a partir de una bacteria en el medio solido); reconocible en funcin de => 1. caractersticas o tipo de medio de cultivo solido donde se ha desarrollado (un microorganismo puede dar lugar a distintos tipos de colonias) 2. tipo de microorganismo (mayor movilidad => colonias extendidas y planas); la verificacin de las colonias (siempre en medios slidos sembrndolo por estra) => en placa y en tubo con agar inclinado. Las colonias en placa sembrndolo por estra El tamao y el aspecto de cada colonia son bastante constante para cada genero y especies, hecho que se puede utilizar como caracterstica diferencial; tamao => 1-2 mm (E.coli); 46mm (stafilococcus en agar sangre); extendidas en forma de velo invadiendo toda la superficie del medio (Proteus en AS); puntiformes +/- 0,5 mm o inferiores (stafilococos en AS); forma => segn el espesor (planas, elevadas, semiconvexas, cncavas semicncavas, semiesfricas, en meseta); segn los bordes (lobuladas, onduladas, rizoides, redondeadas, filamentosas, especuladas); superficie de la colonia/ elevacin/ aspecto => lisa, rugosa (con capsulas), plana, acuminada, umbilicada, mucosa, seca; consistencia de la colonia=> duras, viscosas, mucosas, secas, muy secas, cremosas; transparencia y coloracin=> debido a la elaboracin de algn tipo de pigmento, formacin de alguna sustancia por parte de la bacteria o la utilizacin de algn sustrato del medio que se acidifique o basifique; la presencia o no de halos de transparencia => generado por la prueba de la gelatinasa (+) en placa y tambin por la actividad hemoltica de ciertas bacterias con hemolisinas (estreptococos hemolticos tipo alfa, beta y gamma).

Las colonias en tubo, con agar inclinado - sembrndolo por estra Las colonias presentan las mismas caractersticas que en placa, pero su visualizacin es mucho peor (menor superficie); aspecto => filiforme, rizoide, arborescente, filamentoso, difuso, perlado, equinulada, arrosariada.
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Morfologa microscpica - estudio de la estructura fina de las bacterias 1. Estudio de su forma como clula procariota individual : oval/esfrica => coco/cocoidea; cilndrica/bastn => bacilo; espiral/helicoidal => espirilo/sacacorchos /espiroquetas; filamentosa/forma de hifas de hongos => filamentosas (actinomyces/ streptomyces), formas intermedias => vibrio, coco-bacilos; bacterias helicoidales => Borrelia (poca espiras y amplitud), Treponema (tiene mas espiras) y Leptospira (muy apretadas y enroladas). 2. Estudio de su agrupacin bacteriana (no todas las formas bacterianas se agrupan, p.ej. los espirilos y los actinomicetos) => los mas frecuentes son las formas cocoideas y las bacilares son menos frecuentes; las cocoideas => diplococos (parejas /granos de caf => neisserias y neumococos); estreptococos (paralelos/cadenas => streptococcus); tetradas o tretacocos (4 celulas => micrococcus/micrococacceae); estafilococos (racimos => staphylococcus/ micrococcus); sarcinas (cuboidales de 8 celulas o mas; sarcina ventriculi y tambin stafilococcus); las bacilares => diplobacilos/parejas, estreptobacilos/ cadenas y formas irregulares/en empalizada/letra china (corinebacterium). TAXONOMA CLASIFICACIN DE LAS BACTERIAS La clasificacin definitiva de las bacterias esta aun por establecer; los que se utilizan actualmente deben considerarse como provisionales o transitiva; la mas utilizada suelen ser recogidas de las manuales BERGEY'S en la 9 edicin de Bergey's Manual of Determinative Bacteriology de 1994, se agrupan a las bacterias en 35 grupos, situados en 4 categoras mayores: 1. Eubacterias Gram- (bacterias verdaderas) con 16 grupos; en esta categora se incluyen a la mayor parte de las bacterias que provocan a la patologa humana. Espiroquetas: Familia Leptospiraceae (genero - Leptospira) Familia Spirochaetaceae (genero - Borrelia, Treponema) Helicoidales /vibrioides aerobias - microaerfilas mviles (crecen mejor a bajas presiones de oxgeno): Familia Campylobacteriaceae (genero - Campylobacter, Helicobacter) Bacilos y cocos aerobios - microaerfilos (crecen mejor a bajas presiones de oxgeno): Familia Pseudomonadaceae (genero - Pseudomonas, Stenotrophomonas) Familia Alcaligenaceae (genero - Bordetella) => bacilos y coco-bacilos Familia Legionellaceae (genero - Legionella) Familia Neisseriaceae (genero - Neisseria) => diplococos - Familia Moraxellaceae / Familia Branhamaceae (genero - Moraxella, Branhamella) => diplococos Otros generos => Brucella (cocobacilos) Bacilos anaerobios y facultativos:
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- Familia Enterobacteriaceae (genero - Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Hafnia [coliformes] Morganella, Proteus, Providencia, Salmonella, Shigella, Yersinia/peste) Familia Vibrionaceae (genero - Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas) Familia Pasteurellaceae (genero - Haemophilus) Otros generos => Gardnerella Cocos Gramanaerobios => genero - Veillonella - Familia Rickettsiaceae (genero Coxiella, Ehrlichia, Rickettsia) - son parsitos intercelulares obligados, altamente pleomrficas cocos/bacilos/hilos - Familia Chlamydiaceae (genero Chlamydia) - son parsitos intercelulares obligados de forma esfrica. 2. Eubacterias Gram+ con 13 grupos (17-29); en este grupo hay los que provocan patologia humana (la mayoria). Cocos => genero - Staphylococcus y Streptococcus Bacilos esporulados => genero - Bacillus (aerobio) y Clostridium (anaerobio) Bacilos regulares no esporulados => genero - Lactobacillus y Listeria Bacilos irregulares no esporulados: Familia Corynebacteriaceae (genero - Corynebacterium) Micobacterias : Familia Mycobacteriaceae (genero - Mycobacterium) 3. Micoplasmas (Mollicutes / bacterias sin pared) de 1 solo grupo (30) ; dentro de este grupo, los que provocan patologa humana => genero Mycoplasma/ Mycoplasma pneumoniae y Ureaplasma. 4. Arqueobacterias con 5 grupos (31-35); todas las bacterias de este grupo no provocan patologia humanas (viven en las situaciones extremas => termofilas/ termogenas) Taxonoma => la ciencia de la clasificacin que agrupa y separa los organismos de acuerdo con su caractersticas fenotpicas, estructurales o genticas para facilitar su estudio; la misin => construir un esquema racional, para clasificar y nombrar los organismos; el sistema jerrquico de la taxonoma se ha formado gradualmente a partir del sistema binomial / binominal / binaria de nomenclatura genero y especie establecida por Linneo en 1758 (un botnico); la taxonoma no es una ciencia esttico, goza de gran dinamismo y esta en la relacion con los avances de los procedimientos empleada para su estudio; el termino de sistemtica se utiliza como sinnimo de taxonoma; los grupos de taxonoma van de dominio - imperio - reino - tribu - divisin - clase - orden - familia - genero y especie. Para la asignacin de una bacteria, se siguen las normas recogidas por el cdigo internacional de nomenclatura bacteriana y adquieren validez cuando ha sido publicado por el Intl Journal of Systematic Bacteriology; bien en un articulo o bien dentro de los sistemas en las listas de las bacterias aprobadas que incluyen sus nmeros; una especie bacteriana, viene definida por un nombre genrico de un nombre especifico latinizado o helenizado y concuerdan gramaticalmente; la inicial de genero va con letra maysculas y el de especie con minsculas; tanto el nombre de genero o especie se escriben con letra cursiva/ italica o en su defecto, subrayado; en la denominacin de un especie, la palabra que define genero puede ser abreviada a su inicial seguida de un punto (p.ej. E.coli o E.coli); los nombres de las bacterias no se eligen de manera arbitraria, sino que pueden ser descriptivos, p.ej. Staphilococcus aureus (cocos en forma de racimos - dorados); o pueden dar homenaje a un autor p.ej. Pasteurella, Bacilo de Koch, tambin puede dar referencia a un acontecimiento p.ej. Legionella; el nombre generico es nico; para referirse a un especie o varios especies
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no determinadas su genero => E.spp/ sp; algunas de las categoras taxonomia superiores, se forman aadiendo las palabras que las asignan distintas terminaciones, p.ej. aceae; para el orden => ales (sufijo) p.ej. Mycoplasmatales; todas las categoras taxonoma se expresa en cursiva o itlica. FLORAS BACTERIANAS Flora Normal de la especie humana => la poblacin de microorganismos comensales que normalmente coloniza la piel y las membranas mucosas de las personas adultas sanas; la piel y las mucosas colonizadas por microorganismos dinmicos => cambios cualitativos y cuantitativos constantemente; 2 poblaciones: 1. La flora residente (FR) => un numero relativamente fijo de especies de microorganismos (comensales y oportunistas) en una zona definida (si se producen alteraciones, suelen ser temporales); permanecen intactas; encuentran condiciones fisiolgicas y nutritivas adecuadas; no es esencial para la vida, pero es normalmente beneficiosa (produce vitamina K en el intestino y ayudan en la absorcin de nutrientes y impide la colonizacin de microorganismos potencialmente patgenos. 2. La flora transitoria (FT) => microorganismos no patgenos o potencialmente patgenos, que colonizan la piel o las mucosas en periodo corto de tiempo; tiene poca importancia, pero si la flora residente se altera, la flora transitoria puede multiplicarse y producir infecciones. La supresin de FR => vaci ecolgico => ocupacin de microorganismos ambientales o de otras zonas de cuerpo => infecciones. FR oportunistas => los que tienen acceso a lugares estriles; algunos ejemplos: - Streptococcus viridans son comensales del tracto respiratorio superior y de la boca, si alcanza el torrente sanguneo => si vlvula cardaca daada => posible endocarditis; - Bacteroides son comensales del intestino grueso => si apendicitis perforada => posible peritonitis o bacterimia. - Infecciones de pacientes inmunodeprimidos por causas diversas (cncer, leucemias, linfomas, SIDA) - E.coli es comensal del colon => lugar estril (o no habitual) a traves de uretra => infeccin urinaria Las causas de las interpretaciones errneas => no se toma en cuenta al microorganismo como patgeno o se le descarta (como mero contaminante); la omisin o inclusin de una especie en una de las categoras no implica que no pueda ser aislada en otra zona del cuerpo o que en condiciones especiales, pueda producir enfermedad. Flora normal de la piel, boca y vas respiratorias superiores - Las principales (en faringe y traquea) => Staphylococcus epidermiditis (coagulasa),Staphylococcus aureus (coagulasa+) en pequeas cantidades, Micrococcus spp, Neisseria de especies no patgenas, Estreptococos A-hemolticos y no hemolticos, las anaerobias facultativas, Candidas. - FT/no residente se elimina o se disminuye => pH acido, los cidos grasos de las secreciones sebceas, lisozima, el sudor y el lavado diario con jabones desinfectantes; se disminuye de forma temporal => la repoblacin es muy rpida. - Al nacer => la boca y faringe son estriles; tras 12 horas => Streptococcus viridas (las mas abundantes en la boca), posteriormente => estafilococos (S.epidermiditis), diplococos Gram-, difteroides (Corynebacterium); salida de dientes => espiroquetas de Bacteroides, Fusobacterium e Actynomicetes, vibrios anaerobios, Lactobacilos y levaduras; Adulto normal=> las principales (mira arriba!!) Los bronquios, bronquiolos y alvolos suelen ser estriles.
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Flora normal del tracto intestinal - Al nacer => estril, posteriormente => colonizado por microorganismos de los alimentos dependiendo de la dieta (p.ej. la leche materna => Estreptococos y Lactobacilos y el bibern => flora mixta con menos Lactobacilos) . - Adulto normal => el esfago contiene lo que previenen de la saliva y comida; en el estomago hay poco (pH acido protegen la clera y salmonelosis - excepto Helicobacter pilorique puede causar ulcera pptida, tiene ureasa que alcalina/neutralizar el acidez: degradar la urea => amoniaco); el intestino delgado superior contiene Lactobacilos y enterococos;intestino delgado inferior (leon y ciego) contiene la flora fecal; el colon contiene >100 especies 96-99% anaerobios facultativo y estricto => Bacteroides spp, Fusobacterium spp, Lactobacilos/ Bifidobacterium spp, Clostridium spp , cocos Gram+ anaerobios (Peptostreptococcus spp). - La utilidad/beneficio => sintetiza la vitamina K, transformacin de los pigmentos biliares en cidos biliares, absorcin y metabolismo primario de nutrientes. - La administracin de anti-microbianos orales => la posible proliferacin de cepas resistentes al anti-microbiano administrado y pueden ser diseminada. - La administracin de ATB por va parenteral en una ciruga intestinal => necesario para reducir al mnimo posible el numero de microorganismo, evitar trauma en el acto quirrgico y infeccin peritoneal e diseminada. Flora normal de la uretra - Los mas frecuentes son estafilococos, enterococos, Corynebacterias, Neisserias no patgenas, enterobacterias (la mayora son pobladores de la piel que recubre esta zona). - En los cultivos de orina, se deben limpiar con cuidado la zona perineal antes de tomar una muestra. Flora normal de la vagina - Al nacer, esta colonizada por Lactobacilos aerobios (produce pH acido), posteriormente el pH acido se convierte en neutro y aparece flora mixta de cocos y bacilos, hasta la pubertad. - En la pubertad esta colonizada por Lactobacilos aerobios y anaerobios que produce cidos por su metabolismo de hidratos de carbono => cambio a pH acido (proteccin a los otros microorganismos potencialmente patgenos. - En la mujer adulta esta colonizada ademas de los anteriores (Lactobacillus acidophillus aerobios y anaerobios), estreptococos anaerobios (hemoliticos o no hemoliticos) y otros; el moco cervical contiene lisozima con actividad bactericida. - En la menopausia la flora vaginal cambia, aparece de nuevo una flora mixta de cocos y bacilos. - La administracin de antibiticos de amplio espectro, puede eliminar las especies protectoras, producindose una multiplicacin excesiva en la vagina de levaduras (candidas) u otras causantes de vaginitis. Flora normal de la conjuntiva del ojo Predomina los difteroides (Corynebacterium xerosis), Staphylococcus epidermidis y estreptococos no hemolticos; pueden estar presentes otras especies; el control de la flora lo ejercen las lagrimas, por su contenido en lisozima.

Tema 10 - Examen Microscpico (observacin de microorganismos vivos)


Nociones de microscopia (repasar apuntes de 1 curso)
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Microscopio instrumento que permite amplificar la imagen de un objeto o de un ser pequeo (micros: pequeo y scopein: ver); inventado 1610 por Galileo, el primer cientfico italiano observando el exterior de una abeja o Jansen, el holands. Fundamento Si se sita entre el ojo y el objeto un sistema ptico capaz de aumentar el angulo visual, se podr ver el objeto con mayor amplitud y claridad. El sistema de lentes produce una imagen aumentada de una muestra diminuta. El objetivo - pequea lente de proyeccin que aumenta y proyecta la imagen primaria del objeto hacia el extremo superior del tubo del microscopio (imagen area). El ocular (lupa) - aumentando la imagen area. La imagen final - se forma en la retina del ojo. La imagen virtual (el ojo percibe la imagen final en el plano virtual). Aumento es el numero de veces que se ve el tamao de un objeto por encima de su valor real. En el microscopio ptico compuesto, se calcula multiplicando el aumento individual del objetivo por el aumento individual del ocular. Objetivo - x4, x10, x40, x100. Aumento ptico ocular x5, x10 Resolucin la capacidad del microscopio para mostrar los detalles ms finos de un objeto. Poder de resolucin (limite de resolucin o distancia resoluble) la distancia minima entre dos puntos que permite distinguirlos como tales (la capacidad de microscopio para distinguir 2 puntos separados aunque estn muy prximos entre si). Disminuir la distancia resoluble = aumentar el poder de resolucin = aumentar la apertura numrica (AN) = disminuir la longitud de onda de la luz empleada = aumentar el ngulo alpha en el espacio objeto = aumentar el ndice de refraccin (IR) en el espacio objeto (rellenar el espacio existente entre la muestra y el objetivo con una sustancia de mayor ndice de refraccin, como aceite). Numero de campo dimetro de la imagen observada a travs del ocular (en mm). Profundidad de foco el espesor de la muestra que es posible tener enfocado por completo >< aumento y AN (apertura numrica) de la lente. El contraste para mejorarlo, disminuye el cono de iluminacin (se controla mediante el diafragma de apertura) procedente del condensador. Partes de un microscopio ptico compuesto: Parte mecnica sistema de soporte o esttico (pie, brazo, cabezal); sistema de ajuste (anillo de ajuste de las dioptras, tornillo de fijacin del cabezal, tornillos reguladores de la platina, tornillo de elevacin del condensador, tornillos de centrado del condensador, tornillo de seguridad del condensador, control del diafragma de apertura del condensador, anillos de enfoque macro-mtrico y micromtrico, control de ajuste de la claridad/ la luz). Parte ptica sistema de iluminacin (fuente de luz - lampara halogena de intensidad graduable; condensador - dispositivo que contiene una lente que concentra la luz, generada en la lampara, hacia la preparacin; diafragma de apertura - el control adecuado del cono de iluminacin que atraviesa la muestra y entra en el objetivo = se ajusta AN); lentes (objetivos - generan imagen real, invertida y aumentada del objeto; oculares - captan la imagen formada por el objetivo y la amplian)

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Material necesario para la visualizacin microscpica portaobjetos esmerilado y biselado, cubreobjetos 22x22, lquido de inmersin (se usa sin cubreobjetos) es imprescindible cuando se observa muestra desecada con objetivo de 100x (tradicionalmente aceite de madera de cedro, actualmente aceites sinttico) Tipos de microscopios: Microscopio de campo oscuro si dentro de la muestra hay elementos transparentes, con un indice de refraccin diferente al del medio que los circunda, la luz es difractada e incide sobre el objetivo y pueden ser visualizados; permite la observacin de seres microscpicos transparentes y no teidos (Treponema pallidum preparacin en fresco). Microscopio de fluorescencia consta de una fuente de luz muy intensa (lmpara de Hg a alta presin), emite una radiacin que puede incidir en la muestra desde abajo, tras atravesar un condensador de campo oscuro (iluminacin transmitida); se emplea un tipo especial de liquido de inmersin (glicerina); Tipos de fluorescencia: Fluorescencia primaria fluorescencia natural (auto fluorescencia) - vitamina A-tiamina, vitamina B-riboflavina; Fluorescencia secundaria - colorantes fluorescentes: auramina (demostrar la presencia del bacilo de Koch en esputos), naranja de acridina (detectar Gardnerella vaginalis en los exudados vaginales; Fluorescencia terciaria inmunofluorescencia - fijacin del fluorocromo (colorante) como rodamina y ficoeritrina al elemento investigado (a traves de Ac marcado). Fuente de luz => Filtro primario => Muestra Fluorescente => Filtro secundario => Luz fluorescente de exitacion (UV) Observador Microscopios electrnicos de transmisin (TEM) una gran amplificacin y permite la observacin de elementos que son demasiado pequeos como para ser vistos en un microscopio ptico, pero no sirve para observar elementos vivos, a causa del vaco que ha de establecerse dentro del tubo y es muy costoso (solo se usa en lab de investigacin). El poder de resolucion en microscopio electronico es x1000 > que microscopio ptico; emplean electrones en lugar de unas fotones; microscopio ptico < 200 nm - fotones: 400 700 nm longitud de onda. Microscopio electrnico de barrido (MEB) no tiene tanto poder de resolucin como el de transmisin, pero sin embargo, proporciona una enorme profundidad de campo y genera unas imgenes que producen una gran sensacin de tri dimensionalidad. 1973 se comercializo el 3 modelo que une las caracteristicas de los 2 anteriores (la gran resolucion de los TEM y la gran definicion y contraste de los MEB. Examen en fresco de bacterias vivas (Gota pendiente) - para conocer la movilidad y la disposicin bacteriana en una muestra se debe observar los grmenes vivos a partir de
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cultivos jovenes (lleva pocas horas), que permiten visualizar mejor su movilidad y su preparacin en fresco. Condiciones que debe cumplir para este fin: cantidad de muestra adecuada (ni mucho ni poco) la muestra recogida en condiciones de esterilidad - adecuadamente distribuida en el portaobjetos (amplia y homognea) cantidad de agua o colorante adecuada - para la fijacin por calor => no debe calentarse demasiado (no quemar el dorso de la mano y la gota +/-consumida) => para hacer tincion - seguir el mtodo o tcnica adecuada, se trabaja con limpieza y orden, evitando cualquier contaminacin. Tcnicas para observar los microorganismos vivos - examen en fresco, entre portaobjetos y cubreobjetos, sobre gota pendiente en porta excavado (no lo hacemos) y con tincin vital. Examen en fresco - suspender el microorganismo en agua destilada o SSF colocandolo en un portaobjetos y posteriormente visualizarlo por microscopio su morfologa (cocos o bacilos), disposicin/agrupacin y motilidad; Material => portaobjetos, microscopio, portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa de siembra, mechero Bunsen o de alcohol (para flamear el asa de siembra), muestra de microorganismo problema, agua destilada estril, vaselina (opcional). Tcnica - Mtodo de examen en fresco entre portaobjetos y cubreobjetos : preparar portaobjetos y cubreobjetos limpios y desengrasados - depositar una gota de agua estril en el portaobjetos (50ul/lambdas) - con el asa de siembra esterilizada por flameado, tomar un poco de muestra del microorganismo y suspenderla en la gota. - homogeneizar la muestra, colocar con cuidado sobre la suspensin un cubreobjetos, evitando que se formen burbujas de aire al caer el cubre sobre la suspensin. observar al microscopio con objetivo de 40 aumentos. Mtodo de examen en fresco sobre gota pendiente en porta excavado : - colocar en el centro de un cubreobjetos una gota de la suspensin microbiana con una asa de siembra estril. - colocar vaselina en los bordes del pocillo del porta excavado - invertir el cubre sobre el porta excavado, colocandolo encima del rea cncava del portaobjetos. - la vaselina adherir el cubre al porta formando una cmara evitando su evaporacin y corrientes de aire. se invertir la preparacin observar al microscopio con objetivo de 40 aumentos. Resultados - es importante no confundirlos con los movimientos brownianos que se producen cuando se desplaza el medio liquido y hace que todos las bacterias siga dicha corriente en dicha direccin; el sellado con vaselina evita este problema. Coloracin vital - es una tcnica intermedia entre los exmenes en fresco y las tcnicas de tincin despus de fijacin previa???; consiste en teir las muestras bacterianas con colorantes muy diluidos, permite al microorganismo acumular parcialmente dichos colorantes; la dilucin debe ser muy altas para que no resulten toxicas para las bacterias, evitando la muerte de tales grmenes; material => microscopio, asa de siembra estril, portaobjetos, cubreobjetos, mechero, papel de filtro, una suspensin de muestra problema,
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aceite de inmersin, altas diluciones de colorantes para disminuir su toxicidad (rojo neutro en solucin acuosa al 1:1.000 o 10 lambas : 10 ml y azul de metileno en solucin acuosa al 1:1.000 o 1:500). Tcnica (se puede hacer igual como en fresco) - colocar sobre el portaobjetos limpio y desengrasado una gota de suspensin muestra junto con otra gota del colorante diluido utilizado; mezclar bien ambas gotas con el asa de siembra y colocar el cubre objetos con cuidado para evitar que se formen burbujas de aire; observar al microscopio con objetivo de inmersin; resultados => los microorganismos se visualizaran vivos y ligeramente coloreados de rojo, en el caso de haber utilizado como colorante el rojo neutro o de color azul si se utiliza el azul de metileno.

Tema

11

Las

tinciones

en

bacteriologa

La morfologa bacteriana (es incolora) puede ser estudiada por visualizacin de los microorganismos => vivos sin teir (observar su posible movilidad) y teidos mediante colorantes con una concentracin que matan la bacteria y no permiten observar su movilidad, pero mejora notablemente la visualizacin de su morfologa y estructuras. Ventajas de las tcnicas de tincin: - observar mas adecuadamente su morfologa y permite diferenciar entre los distintos tipos - dar informacin complementaria de sus estructuras internas y/o externas que no se observa en fresco. - al conocer sus caractersticas tintoriales, nos orienta hacia un grupo u otro en la clasificacin bacteriana. Factores que afectan a toda tcnica de tincin : - pureza del colorante (a + impurezas => + error y - calidad en la tincin). - concentracin del colorante (valores ideales oscilan entre 0,2 y 2%) - pH del colorante (en general son neutro +/- 7 o entre 6,8-7,4) conservacin del colorante elaboracin (no lo hacemos /vienen preparadas) - tcnica empleada (material limpios y seguir los pasos de la tcnica) temperatura (en general la ambiental) cantidad de muestra (representativa y homognea) - realizar correctamente el frotis (fijarlo bien, en general por calor => coagula las proteinas bacterianas, para que no se arrastre con el colorante mordientes y decolorantes) - soluciones mordientes (ayudar a fijar el colorante a las estructuras microbianas, p.ej. lugol en la Gram) tiempos de tincin (segn el colorante que usemos) Principales tcnicas de coloracin - clasificacin de colorantes => [1] segn su origen (naturales y artificiales) [2] segn su comportamiento qumico (cidos, bsicos y neutros). Colorantes naturales - extrado de plantas como la hematoxilina (del tronco de una planta que por oxidacin produce hematena; el azul de ndigo (de una leguminosa); extrado de animales como el carmin (de una cochinilla) Colorantes artificiales - preparados artificiales y obtenidos de alquitrn de hulla(colorantes anilina cidos, bsicos y neutros en forma de sales) p.ej. cristal violeta, violeta de genciana, fucsina bsica, acido pcrico, azul de metileno, etc. Colorantes segn su comportamiento qumico - se unir de forma mas estable a la estructura que tie, dependiendo de su estructura fsico-qumica; constituido por un anillo bencnico que unen distintos radicales => radical cromforo; a+ numero de radicales =>
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+poder colorante de la solucin; [1] colorantes cidos o aninicos : la carga del radical colorante es (-) => colorantes citoplasmticos que son bsicos (los componentes citoplasmticos captan muy bien los colorantes cidos) => las eosinas, las auraminas. [2] colorantes bsicos o catinicos : la carga del ion cromforo es (+) => colorantes de la zona nuclear que son cidas o ligeramente cidas => fucsina bsica, cristal violeta o violeta de genciana, azul de toloudina, azul de metileno o las tioninas. [3] colorantes neutros : es una sal compuesta de un colorante acido y un colorante bsico => el eosina azul de metileno; es hidro-solubles (posee las propiedades de colorantes cidos y bsicos). [4] colorantes indiferentes : insolubles en agua y solubles en alcohol, no predomina ni la carga+ ni (-), pero tampoco es de carcter neutro => colorantes de los lpidos como Sudan III, Negro Sudan, etc. En bacteriologa es frecuente la utilizacin de => fucsina fenicada, violeta de genciana, azul de metileno (son colorantes bsicos) y de aadir un mordiente que ayude a fijar dicho colorante; los colorantes cidos se utiliza como un contraste y los colorante neutros e indiferente como coloraciones particulares; el proceso de tincin => reaccin de intercambio de iones entre colorante y sitios activos de la superficie o del interior de la clula (los iones teidos/colorantes reemplazan iones de los componentes celulares) y esto permite contrastar mucho mas el germen con respecto al medio que le rodea. Preparacin de un frotis - realizar una extensin y fijar la muestra problema para posterior coloracin y visualizacin al microscopio; poner en un portaobjetos, a traves de un asa de siembra una cantidad de microorganismo problema suspendido en medio liquido estril, extendindolo adecuadamente hasta formar una fina pelcula homognea que posteriormente se fijara generalmente con calor cuando sea requerido, segn el mtodo de tincin que se utilizara posteriormente; material => portaobjetos, asa de siembra o platino, agua estril, muestra problema; tcnica => pequea cantidad de la muestra liquida se deposita y se extiende homogneamente en el centro del portaobjetos con el asa de siembra para tener una capa fina (segn la viscosidad, se puede diluir con unas gotas de agua estril); si la muestra es solida (una colonia), se deposita primero una gota de agua estril y se aade con el asa de siembra una pequea cantidad de la colonia, se extiende homogneamente; dejar secar al aire; se fija mediante el flameado (en algunos casos se podr hacer con alcohol) para coagular las protenas y los grmenes quedan adheridos al portaobjetos. Tcnica de tincin los pasos: -realizar un frotis y fijacin por calor (generalmente), con la intensidad de calor adecuada que soporte el dorso de la mano. -coloracin segun el tipo de tincion (generalmente con colorantes basicos que tien estructura acida) -decoloracin que permite diferenciar distintos grupos bacterianos (genero Micobacterium son resistentes a la decoloracion cida/BAAR); Gram- decoloradas con el alcohol 96/alcohol acetonas, alcohol acido, acidoclorhidrico => micobacterias -lavado siempre entre paso y paso con agua destilada para evitar interferencias entre un producto y otro. -coloracin de contraste (generalmente cido), se aplican al final para las estructuras decoloradas con el decolorante, p.ej. safranina. -observacin al microscopio Tipos de tinciones bacterianas :
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(1) Tincin simple => fijacin previa, se utiliza 1 solo colorante, permite la visualizacin de la morfologa y la agrupacin bacteriana; clasificacin => tinciones simples con colorantes bsicos, cidos y neutros; se basa en => la afinidad de los colorantes que suelen ser de tipo bsico (azul de metileno, violeta de genciana, azul de toloudina => 1-2 minutos, dan color azul a las celulas o fucsina fenicada diluida => da color rojo a los componentes celulares. (2) Tincin negativa => es un tincin simple (1 solo colorante => tinta china o solucin acuosa de nigrosina al 1%) con diferencias que no necesita fijacin previa (no mata las bacterias), permite observar caractersticas estructurales de la bacteria ademas de su morfologa sobre un fondo oscuro, como es la presencia de capsulas p.ej. los neumococos; se basa en => colorante acido cargado negativamente, los microorganismos no se tien (se quedan claros y brillantes sobre un fondo teido oscuro); para obtener una capa fina (para dejar pasar el paso de luz del microscopio y evitar a formarse grietas al secarse el colorante) se puede hacer una extensin con el borde de otro portaobjetos; resultado => se observan las capsulas (si las tienen) en forma de un halo mas claro que rodea el cuerpo de la bacteria.

(3) Tinciones diferenciales => fijacin previa (en general por calor), se utiliza 2 colorantes(el ultimo es de contraste), permite visualizar su morfologa y caractersticas estructurales (composicion de la pared bacteriana, su resistencia a la decoloracin cida (t.Gram y t.ZhielNeelsen). (4) Tinciones estructurales => fijacin previa (en general por calor), se utiliza al menos 2 colorantes, nos permite observar su morfologa y caractersticas estructurales como esporas, flagelos, cilios, capsulas, corpsculos metacromticos (utiliza 1 solo colorante???). Tincin diferenciales de Gram => descubierto en 1883 por Cristian Gram, cuando trabajaba con material de biopsias y utilizada a partir de 1886 como tincin diferencial; es mas empleado en bacteriologa, para clasificar 2 grandes grupos (Gram+ y Gram-); distinto comportamiento debido a la distinta composicion de la pared de las celulas bacterianas; se emplea como el primer colorante bsico (cristal violeta o violeta de genciana) que teir de color azul violeta todas las bacterias, posteriormente un mordiente el lugol que aumenta la afinidad del primer colorante a las celulas (lo fijara), finalmente un agente decolorante que decolora solamente un tipo de bacterias (Gram-) que sern teidas con el colorante de contraste o segundo colorante (la safranina) de color rosa-rojo; si se quedan con el color azul violeta sern Gram+.

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Material de la tincin Gram => portaobjetos, pinzas de madera, asa de siembra, mechero de Bunsen, pipeta Pasteur, asa de tincin (punte), frasco lavador, muestra problema, aceite de inmersin, colorantes para la tincin de Gram. Tcnica: - realizar la preparacin de frotis => extender 1 gota de agua destilada estril + una colonia de la bacteria problema por la superficie de la portaobjeto fijacin por el calor, pero no quemar las bacterias - aplicar el colorante cristal violeta durante 1,5 minuto o violeta de genciana durante 2 minutos - lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de colorante - aadir un mordiente, el lugol durante 1 minuto (solucin iodoiodura de potasio con OH de 96 o con acetona a 5/1 o con OH 50%) vuelve a lavar con agua el exceso decolorar con solucin decolorante (alcohol 90) lavar abundantemente con agua cubrir el portaobjetos con la safranina durante 1 minuto - lavar con agua para arrastrar los restos de colorantes y dejar secar al aire observar con objetivo de inmersin (100x). Tincin de grmenes del acido alcohol resistentes (BAAR + criptococo) A. Tincin de Ziehl-Neelsen Este mtodo fue desarrollado por Ehrlich en 1882 trabajando con bacilo de Koch y mejorado posteriormente por Ziehl-Neelsen; objetivo => diferenciar del resto, las bacterias tipos BAAR (bacterias acido alcohol resistentes, p.ej. Mycobacterium), debido a su gran cantidad de componentes miclicos (lipoideos y cereos/cera) que forman parte de la pared de este tipo de bacteria (los colorantes convencionales no penetran en el interior de estas bacterias); De ah se necesitan colorantes altamente concentrados y la presencia de calor que facilite su penetracin al interior de dichas bacterias; una vez teidas, su decoloracin posterior no es posible (resiste incluso a decoloraciones cidas); dicha tincin se emplea principalmente para el diagnostico y estudio de enfermedades como tuberculosis y la lepra. Material => es el mismo que esta descrito en la tincin simple, pero en cuanto los reactivos:1 colorante - solucin fenicada de fucsina bsica (carbo fucsina), 2 colorante de contraste - solucin hidro-alcohlica de azul de metileno fenicado, 3 decolorante - alcohol acido al 3%(97% alcohol). Tcnica => preparacin de frotis y fijacin calor; cubrir el frotis con fucsina fenicada bsica 5 minutos aplicando en este tiempo calor, hasta la emisin de vapores, evitando que se caliente demasiado o que se seque el colorante; lavar abundantemente con agua destiladahasta arrastrar el colorante; decolorar con alcohol acido para arrastrar restos del colorante (10-30 segundos); lavar abundantemente con agua destilada; cubrir el frotis con colorante de contraste /azul de metileno fenicado 30 segundos sin necesidad de calentar, para teir aquellas bacterias que no son resistentes a la decoloracin (se han decolorado) y resaltar el color rojo de los BAAR+; lavar, secar, rotular y observar con objetivo de inmersin.
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Resultados => con el 1 colorante, BAAR- y BAAR+ (ambas) se tien de rojo; con el decolorante, BAAR- se decoloran y BAAR+ no se decoloran; con el 2 colorante (de contraste), BAAR- setien de azul y BAAR+ permanecen de color rojo/ acido alcohol resistencia+ (bacilos Mycobacterium y algunos Nocardia) B. Mtodo de Kin Youw modificado (coloracin en fri) Reactivos => 1 colorante: fucsina fenicada (con fenol) de KinYouw, decoloracin a 3%, 2 colorante: azul de metileno fenicado (con fenol); tcnica => idntica, salvo para la fucsina de KY, dejamos actuar 5 minutos sin calentamiento; existen otras tcnicas de tincin de los BAAR => tincin de auramina o de rodamina que usan microscopio de fluorescencia. Tincin de espiroquetas (para las espiroquetas) Tincin estructurales => tincin de esporas, de flagelos, de cilios (similar a flagelos, pero corto y se extiende por todo el cuerpo, como pilis), de corpsculos metacromticos y de capsulas. Tincin especiales => tincin de auramina y de naranjo de acridina.

Tema 12 - Pruebas bioqumicas para la deteccin del metabolismo hidrocarbonado de las bacterias.
Metabolismo - conjunto de reacciones qumicas que tiene lugar en las celulas vivas; necesitan energa que se obtiene por oxidacin (perdida de electrones) de sustancias introducidas en forma de alimentos; la gran mayora de las bacterias (hetertrofas) se nutren de sustancias orgnicas que proceden de otros seres vivos y otras (auttrofas cianobacterias) se nutren de sustancias orgnicas que sintetizan ellas mismas a partir de sustancias inorgnicas; 3 etapas en metabolismo => 1-catabolismo/hidrlisis/degradacin de sustancias nutritivas => compuestos mas sencillos + energa en forma de ATP (adenosin trifosfato) 2-anfibolismo/metabolismo intermedio del producto del catabolismo => compuestos de bajo peso molecular 3-anabolismo/metabolismo biosinttico de sustancias simples => biosntesis de macromolculas /moleculas complejas + gasto de energa. Enzima - catalizadores biolgicos (protenas); cada enzima afecta solo a un sustrato especifico. Reduccin => captan electro nes. Catabolismo de hidratos de carbono - oxidacin de azucares para obtener la energa es muy importante, aunque tambin se catabolizan lpidos y protenas; la 1 etapa de la degradacin de la glucosa => oxidacin de esta para formar acido pirvico (gluclisis); 2 procesos => la respiracin (necesita O2) o la fermentacin (no necesita O2); la gluclisis (no precisa O2) se produce en 3 vas, en funcin de la dotacin enzimtica. 1 va glucoltico/ ruta de Embden-Meyerhof Parna (EMP) fue descubierto porPasteur => se obtiene 2 moleculas de ATP mediante fosforilacin por cada molcula de glucosa que se oxida; este proceso se puede realizar en presencia o no de O2; a partir de la formacin de acido pirvico, las bacterias que usan esta va, normalmente utilizan la va fermentativa para acabar transformando este acido pirvico en cidos mixtos; degradacin/ hidrlisis de glucosa (6C) => acido pirvico + 2 ATP (fosforilacin) => cidos mixtos (fermentacion); son 9-10 reacciones qumicas con un enzima diferente en cada una; utilizados por las bacterias fermentadoras que poseen deshidrogenasas (Clostridium,
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Enterobacter,

Salmonella)

2 va de las pentosas fosfato /va fosfoglucnica (va HMP) - es una ruta mixta y va alternativa; este ciclo rompe los azucares de 5 carbonos /pentosas y tambin glucosa,mediante sucesivas reacciones y produce => pentosas intermedias (precursores de sntesis de cidos nucleicos y ciertos aminocidos) de gran utilidad para las celulas; ademas de la gluclisis via EMP, muchas bacterias utilizan HMP como una va alternativa para la oxidacin de la glucosa => produce acido lctico o acido mixto + 1ATP (p.ej.Enterobacterias/ E.coli); esta va es un hbrido de la va ED y la EMP, ya que en las primeras etapas, la oxidacin de la glucosa es similar a la via ED y en las etapas posteriores es similar a la va EMP, es decir: proporcionan a las bacterias no oxidativas un medio de oxidar la glucosa a acido pirvico puro, porque no tienen las enzimas necesarios para comenzar la va EMP, apareciendo en los sistemas analticos como fermentadoras. 3 va de Entner-Doudoroff (va ED/ va aerobia => requiere O2) - es otra va por la cual la glucosa se oxida a acido pirvico; por cada molcula de glucosa se producen 1 molcula de ATP para ser utilizada por la clula en reacciones bio-sintticas; esta va requiere enzimas especficos y solo los microorganismos que las poseen pueden utilizarla sin seguir la va de las pentosas fosfato ni la gluclisis; los microorganismos que la utilizan sonPseudomonas y Neisseria (aerobio estricto), por carecer de las deshidrogenasas necesariaspara oxidar el acido pirvico al acido lctico u otros cidos; los hidrogeniones se transfieren al ciclo de Krebs y se acabaran obteniendo agua; oxidacin de glucosa => acido pirvico + 1ATP (no producen acido lctico ni acido mixto) Respiracin - es un proceso fosforilacin oxidativa de generacin de ATP y se caracteriza por el aceptor final de electrones generalmente es una molcula inorgnica (O2); la glucosa se degrada => acido pirvico se sigue oxidando por la va de la respiracin o la fermentacin (en funcin del sistema enzimtico que tienen) => ATP + CO2 + H2O; durante la respiracin, cualquier molcula orgnica puede ser degradada /oxidada con un mayor rendimiento que en la fermentacin. Respiracin aerbica - cuando el aceptor final de Hidrgenos (electrones) es el O2; en la respiracin, el acido pirvico producido por la gluclisis se escinde en 2 partes: una parte se unen con CoA => forman acetil CoA que entra en el ciclo de Krebs donde se liberan electrones y protones (H+); la otra parte para biosntesis??? Cadena de transporte de electrones (se encuentra en la membrana citoplasmtica de las celulas procariticas y en las membranas internas de las mitocondrias en las celulas eucariticas) - los electrones se mueven desde los coenzimas reducidos hasta una molcula inorgnica como O2 en la respiracin aerbica o hasta una molcula inorgnica diferente del oxigeno NO3- ion nitrato, SO2-4 ion sulfato, etc.; las moleculas transportadoras de electrones son 3 tipos => [1] flavoprotenas - realizan reacciones de oxidacin reduccin, [2] citocromos - protenas con un grupo prostticos (Fe) en forma oxidada, [3] ubiquinonas o coenzima Q - transportadores no proteicos de bajo peso molecular. Respiracin anaerbica - cuando el aceptor final de electrones (H-) es una sustancia inorgnica distinta del O2, tal como iones nitratos NO-3, sulfatos SO2-4, carbonatos CO23. (Pseudomonas y Bacillus ) Fermentacin - proceso que se inicia a partir de acido pirvico formado en la gluclisis de EMP /HMP, en cual el aceptor final de los electrones es un compuesto orgnico y no requiere O2; caractersticas principales => (1) no precisa O2, pero se puede ocurrir en su presencia, (2) no necesita el ciclo de Krebs ni cadena transportadora de
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electrones, (3) utiliza1 molcula orgnica como aceptor final de electrones, (4) libera energa a partir de azucares y otras moleculas orgnicas (aminocidos, cidos orgnicos, purinas, pirimidinas), (5) libera solamente 2 moleculas de ATP por cada molcula del sustrato inicial, (6) los productos finales pueden ser acido lctico, etanol y CO2, acido propinico, acido actico, CO2 y agua, acido butrico, etc. (compuesto orgnico); cuando el aceptor final de electrones es el lactato, se producir acido lctico y en general cuando el aceptor final sean otras sales orgnicas, se formaran cidos mixtos p.ej. acido succnico, que son responsables de la cada de pH en las pruebas empleadas, para la identificacin bacteriana; ademas, las bacterias que tienen la dotacin enzimtica apropiada, pueden seguir degradando estos cidos mixtos hasta CO2 y otros compuestos orgnicos; es til el anlisis de los productos finales para identificar as los microorganismos; la mayor parte de la energa producida en la fermentacin queda almacenada en los productos finales; las fermentadoras => Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, Escherichia, Salmonella, Enterobacter. Prueba de la B-D Galactosidasa (ONPG) - se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de fermentar lactosa, mediante 2 enzimas => Lactosa Permeasa (esta en la membrana celular y es capaz de transportar la lactosa a traves de ella) y B-DGalactosidasa (esta en el interior de la clula y es capaz de desdobla la lactosa en glucosa y galactosa). Clasificacin de los microorganismos segun su capacidad de fermentar o no la lactosa : - fermentadores activos de lactosa en 24 horas (poseen ambos enzimas) - no fermentadores de lactosa (carecen de ambos enzimas, no degradan la lactosa, no penetra en la clula) - fermentadores tardos de lactosa (poseen el enzima B-D-Galactosidasa, permeabilizar la lactosa ligeramente cuando la concentracin es alta en 2-15 das).

La aplicacin fundamental es la diferenciacin de Enterobacteriaceae =>Escherichia (+) es fermentadora activo, Proteus (-) es no fermentadora y Klebsiella (+) es una fermentadora tarda de lactosa, es decir lactosa (-) y ONPG (+); para detectar la enzima BD-Galactosidasa => se utiliza un compuesto similar a la lactosa (orto-nitrofenol): al liberarse al medio alcalino por la accin de BDG produce un color amarillo. Material => 1 tubo de ensayos estriles, bao mara o estufa a 37C, asa de siembra, solucin fisiolgica esteril, discos de ONPG, microorganismo problema Tcnica => una suspensin densa (con muchas colonias) de un cultivo puro en 0,5 ml de suero fisiologico estril se aade un disco de ONPG y mezclar durante unos segundos, incubar a 37C durante 30-60 minutos (en general se vira antes de 30 minutos) Resultados => en ONPG+ se produce una coloracin amarillo y en ONPG- no se produce color (incoloro).

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Tema 13 - Pruebas bioqumicas para la deteccin del metabolismo proteico de las bacterias
Principal productor de energa => catabolismo de la glucosa y las oxidaciones de proteinas y lpidos (estan relacionados entre si); la hidrlisis de protenas/ protena+agua (mediante enzimas proteolticos extracelulares, secretadas por ciertas bacterias que sirve para su tipificacin/tipacin) => polipptidos y aminocidos; las pruebas bioqumicas investigan fundamentalmente la capacidad de un microorganismo de producir la hidrlisis de la gelatina; catabolismo de protenas/ protelisis se realiza mediante proteinasas/proteasas y peptidasas (desaminacin) para obtener => ion amonio NH4+ (+) acido orgnico; acido orgnico entrar al ciclo de Krebs y ion amonio NH4+ es secretado de la clula. Produccin de acido sulfhdrico - tcnica con indicador incorporado al tubo/a la placa => algunos microorganismos actan metabolizando protenas con aminocidos azufrados (cistina, cisteina) y liberan azufre en forma de gas acido sulfhdrico SH2; el gas es detectado a traves del medio que contiene fuente de hidrgeno (azucar) fuente de azufre(tiosulfato sodio, cistina, cisteina) y un indicador de pH (sales de hierro /citrato frrico amoniacal) => un precipitado negro); se observara la liberacin del gas SH2 por algunos microorganismo que poseen enzimas desulfurasas (activada por la fermentacin de la glucosa => acidifica/produce cidos/baja el pH) que actan sobre los aminocidos azufrados; la temperatura de incubacin (estufa) tiene que oscilar entre 35-36C (superior a 37 se inhibira la produccin de SH2).

Material => tubo de cultivo (KIA/kliger iron agar y TSI/triple sugar iron), agujas y asas de siembra, estufa de cultivo, muestras de problema; si se realiza en placa de cultivo (Hektoen y SS); Tcnica => a partir de un cultivo puro y reciente de microorganismo problema se tomara una muestra con una aguja; sembrar en picadura (tubo de KIA o TSI) o con agotamiento en cuadrante (Hektoen o SS); incubar durante 18-24 horas; si la tcnica se realiza con Brucella(microaerofila), se debe incubar con una atmsfera de CO2. Resultados => SH2 positivo (Salmonela y Proteus) se observa a lo largo de la linea de inoculacin ennegrecimiento del medio; SH2 negativo (Brucella y Shigella) no se ennegrece el medio. Bacteria con enzimas desulfurasas (activada por la fermentacin de azucar) + indicador de pH/sales de Fe + fuente de S + (H+) => H2S gas + indicador pH => precipitado negro insoluble/ puntos negros (FeS) Prueba de las descarboxilasas - enzimas que actan sobre el grupo carbxilo de los aminocidos Lisina, Ornitina, Arginina para formar => aminas (alcalinas) y se desprende CO2 (el proceso se realiza en anaerobiosis) => se realiza mediante el sistema multiprueba (API - buscar el cdigo en el libro); estas pruebas se aplican para la identificacin de Enterobacteriaceas; se investiga la alcalinizacin del medio inicialmente de color purpura,
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se observara el viraje del color del indicador del pH; la presencia del enzima investigado supondr la alcalinizacin del medio (sigue el mismo color como el inicio); cada pocillo contiene indicador de pH y amino acido correspondiente al enzima a investigar; cada descarboxilasa acta sobre un aminocido especifico; en cada reaccin se desprende CO2 y se alcaliniza el medio: L-lisina + LDC/lisina descarboxilasa => Cadaverina + CO2 L-ornitina + ODC/ornitina descarboxilasa => Putrescina + CO2 - L-arginina + ADH/arginina deshidrolasa => L-citrulina + NH3 (descarboxilacin) => Putrescina +CO2

Material => pruebas de API, pipeta Pasteur. Reactivos => caldo de Moller para descarboxilasas (lleva pequea cantidad en su composicion una pequea cantidad de glucosa, peptonas y los indicadores rojo cresol y purpura de bromo cresol, pH6); aminocidos ensayados en forma L, muestra de problema y papel parafina. Tcnica => se aade una gota del inoculo (suspensin microbiana) en cada pocillo de la prueba de API; se incuba a 35C durante 18-24 horas. Resultados => durante las primeras horas de incubacin, el caldo vira a amarillo, por la fermentacin de glucosa que lleva el medio; pero si el aminocido es descarboxilado, el pH vuelve a subir, ya que se forma aminas alcalinas que es de color purpura (descarboxilasa+); si se queda amarillo sera descarboxilasa-; grmenes con descarboxilasa+ (Escherichia no es 100% descarboxilasa+ de Lisina, Arginina y Ornitina): - Lisina => Klebsiella, Serratia, Salmonella - Ornitina => Serratia, Proteus, Salmonella - Arginina => Salmonella, Pseudomonas

Tema 14 - Pruebas bioqumicas para la deteccin de la actividad enzimtica de las bacterias


Pruebas oxidasa - esta denominacin se le da de forma genrica al enzima citocromo oxidasa que participa en la transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el oxigeno; oxidasa => enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato al oxigeno; los aerobios o anaerobios facultativos obtienen su energa por la respiracin y la almacenan en forma de ATP, el oxigeno es reducido a partir de un sustrato orgnico que procede de la nutricin con la intervencin de un sistema de transporte de electrones denominado cadena respiratoria, producindose agua o perxido de hidrgeno segn la especie microbiana; los citocromos son hemo-protenas que contiene Fe y actan como ultimo eslabn de la cadena respiratoria aerobio, transferindo H+ al O2 con formacin de H2O; este sistema se encuentra en los organismos aerobios y anaerobios facultativos, carenciandolo de ello los anaerobios estrictos; se observara el cambio de color de un indicador de pH incoloro cuando
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esta reducido (p-fenilendiamina=> formar indofenol de color violeta oscuro) y coloreado cuando se oxida; Aplicacin => detectar en el microorganismo estudiado el enzima citocromo oxidasa; diferenciar entre Enterobacteriaceas (oxi-) de Pseudomonadacea (oxid+); diferencia entre gneros Moraxella (oxi+), Neisseria (oxi+) de Acinetobacter (oxi-).

Material => placa sembrada con microorganismo problema, asa de plstico, papel de filtro, porta, reactivo oxidasa de Kovacs. Tcnica => mezclar una pequea muestra pura con el reactivo en el papel de filtro que se sita por encima de una porta, esperar 30-60 segundos y se observar el posible cambio de color; otra manera: se aade directamente el reactivo oxidasa de Kovacs sobre las colonias de la placa Petri con agar sangre y tambin en otro medio; si son oxidasa positivo toman un color marrn y en seguida pasan a negro parduzco. Resultados => oxidasa+ aparece un color purpureo en el papel, si se desarrolla el color a los 10-60" se considera oxidasa retardado positivo, despus de 60" es negativo; oxidasa- no se produce color. Pruebas de catalasa La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayora de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromo; es un enzima fundamental que acta sobre el perxido de hidrgeno /H2O2 (es un producto final de la degradacin aerobica oxidativa de los hidratos de carbono); si se acumula H2O2, estos grmenes moriran; fundamento: si el microorganismo tiene el enzima catalasa y se pone en contacto con H2O2 => se descompone en H2O + O2; aplicacin => diferenciacin de Streptococcus (-) de Staphylococcus (+) y Micrococcus (+);

Material => portaobjeto, pipeta Pasteur, asas de siembra de plstico (las de platino catalizar la reaccin) Reactivo => H2O2/ agua oxigenada, microorganismo de problema Tcnica => se coloca una gota de H2O2 (agua oxigenada) en un porta objeto, simultneamente, con una asa se aade una colonia del cultivo del microorganismo de 1224 horas, homogeneizar y observar. Resultados => catalasa+ forma burbujas de O2 inmediatamente; catalasa- no aparecen burbujas; se podrn observar falsos positivos si se utilizaran medios de cultivo agar sangre o otros que lleven hemates (los hemates contiene catalasa).
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Pruebas de Nitrato reductasa o Nitratasa (se realiza con multiprueba de API) La nitratasa (nitrato reductasa) es el enzima que cataliza el proceso en cual el nitratos son reducidos a nitritos (presentes en algunos microorganismos anaerobios o anaerobios facultativos que utilizan nitrgeno como ultimo aceptor de electrones en el proceso metablico/ respiracin anaerbica); depende de la especie bacteriana se trate, se pueden producir diversos productos finales; reaccin: nitrato/NO-3 + nitratasa => nitrito/NO2 =>N2 (nitrgeno molecular/ gas nitrgeno) o otros => amoniaco / oxido ntrico / oxido nitroso / hidroxil amina; la prueba detecta los productos finales liberados al medio mediante un reactivo colorimtrico API; aplicacin => diferenciacin de especies de Haemophilus y Neisserias; cuando no se forma color (rojo) al aadir los reactivos, puede significar => [1] no se ha reducido el nitrato, se comprueba aadiendo polvo de zinc que acta como reductor y si hay un cambio al rojo, es nitratasa (-) y si no hay cambio de color, sera nitratasa (+); [2] la reduccin de nitratos ha sido llevada hasta la formacin de N2, se observa con la aparicin de grietas o burbujas; [3] la reduccin de nitratos ha formado otros productos nitrogenados (oxido ntrico, amoniaco, hidroxil-amina, etc.);

Material => multiprueba de API; reactivo => Nit A y Nit B, Zinc en polvo, microorganismo; el medio no debe contener azufre ya que si el microorganismo es productor de H2S (acido sulfhdrico) este impide la formacin de color; tcnica => hacemos un inoculo a partir de un cultivo puro reciente de 12-24 horas, inoculamos el medio; incubar a 37C durante 12-24 horas, agregar 1 gota de Nit A y 1 gota de Nit B, observar si hay un cambio o no antes de 30 segundos (se interpreta rpido, ya que el color puede desaparecer); si no se forma color, se aade al tubo un poco de polvo de Zinc; resultados => hay 2 posibilidades de que sean Nitratasa+ (Haemophilus y Branhamella Catarallis): [1] cuando aparece color rojo o rosado fuerte al aadir el reactivo A y B que indica la reduccin de nitratos a nitritos; [2] al aadir polvo de zink no se desarrolla color indica formacin de otros productos nitrogenados;Nitratasa- => cuando se forma color rojo o rosado al aadir polvo de zinc en menos de 30 segundos. Prueba de Ureasa (se hace en manual y con el sistema API) - detecta la presencia de la ureasa en los microorganismos cuando se observa la alcalinizacin de un medio liquido; la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea => carbonato amnico, que sube el pH, con lo que el medio se alcaliniza; aplicacin => diferenciar Proteus (+) de otras Enterobacteriaceas / E.coli (-) o positivo retardado (+) como Klebsiella;

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Material => tubos de cultivo, asas, pipeta Pasteur, estufa de cultivo o bao mara. Reactivo => caldo urea de Stuart/ urea-indol (de color mbar) y microorganismo de problema Tcnica => con el asa estril se toma una muestra de cultivo puro reciente 18-24 horas; inoculamos el microorganismo en un tubo con caldo urea de Stuart; incubar 37C; la reaccin se produce entre 1-4 horas Resultados => en ureasa (+) el caldo de color mbar vira a rosa fuerte durante el tiempo de reaccin (1-4 horas); en ureasa (-) no vira el indicador; algunas cepas de Klebsiella, Enterobacter, Brucella, requieren 6 das de incubacin. Prueba de Coagulasa (se hace con el kit comercial que contiene Acs anti coagulasa) observar la coagulacion del plasma en forma de grumos o precipitacin al ponerse en contacto el microorganismo con el reactivo (si se utiliza el plasma en la prueba); la coagulasa es un enzima producido por microorganismos capaz de coagular en plasma; aplicacin => diferenciar Staphylococcus aureus (coco Gram+, catalasa+, beta hemoltico + y coagulasa+) de otro Staphylococcus; esta prueba solo se hace si el germen es coco Gram+, catalasa+, beta hemoltico +; tcnica => (usando el kit comercial /prueba de ltex) seguir la instruccin de la casa comercial que hacen el reactivo; resultados => coagulasa+ se observa en forma de grumos (si se utiliza un plasma como reactivo => se observara la formacin de un hilo de fibrina en la reaccin) y en coagulasa- no se forma grumos.

Prueba de Triptfano Desaminasa (TDA) - se basa en la capacidad que tienen algunas bacterias de desaminar el triptfano por la accin de TDA, produciendo => acido indol pirvico que reacciona con citrato frrico amoniacal y el cloruro frrico que lleva el medio produciendo un color marrn (determina la presencia de la enzima TDA); tcnica => en un medio liquido de TDA (color mbar); se puede utilizar el reactivo urea-indol; aadimos 1 sola colonia de un cultivo puro y 1 gota de reactivo TDA del API, incubar a 37C entre 1824 horas, y leer; resultado => el color marrn/caf indica la presencia de TDA+ y sera negativo si no hay cambio de color; los gneros que tienen TDA+ => Proteus, Providencia y Morganella.

Tema 15 - Pruebas bioqumicas simultaneas (macrotcnicas, micro-tcnicas, sistemas rpidos, otros mtodos)
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Macrotcnicas - sistemas multiprueba que permiten realizar varias pruebas bioquimicas simultneamente, facilitando notablemente la identificacin del microorganismos: Kliger Iron Agar (KIA) Triple Sugar Iron (TSI) - Agar Sulfuro Indol Motilidad (ASIM) Motility Indol Agar (MIA) IMVIC Lisina Iron Agar (LIA) Motilidad Indol Ornitina (MIO) KIA (Kligler Iron Agar) - se pueden realizar 3 pruebas a la vez : - utilizacin de azucares (fermentacion glucosa 0,1% y lactosa 1%) produccin de gas (CO2) produccin de acido sulfhdrico (SH2) Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Fundamento => cuando el microorganismo fermenta los azucares, se acidifica el medio porque se forman cidos orgnicos; si el medio no tienen azucares como fuente de hidratos de carbono, utilizara protenas que alcalinizan el medio por la formacin de aminas; las protenas en condiciones de aerobiosis (en el pico) se metabolizan mejor por la va de descarboxilacin oxidativa de los aminocidos que en anaerobiosis (en el fondo); la glucosa se metaboliza mejor que lactosa (la molcula es mas pequea/sencilla); para metabolizar la lactosa, el microorganismo debe tener B-D galactosidasa y lactosa permeasa. Material => tubos de cultivo, asa y aguja de siembra, estufa de cultivo Reactivo => tubo con agar KIA en pico de flauta (color rojo anaranjado), microorganismo Tcnica => es importante tener un tubo de control; se recoge una colonia puro y joven con un aguja; inocular por picadura y estra un tubo de cultivo con medio KIA en pico de flauta; incubar 18-24 horas a 37C; la reaccin se ha de observar justo despus de terminar el periodo de incubacin (suficiente tiempo para la fermentacin del azucar); si se lee despus de 24 horas, se puede dar un falso alcalino, porque el germen habra utilizado la peptona y el medio se alcaliniza; el pH esta ajustado a 7,4 (neutro) e indicador rojo fenol a 6,8 (cualquier cambio de pH va a virar el medio); Resultados => se observaran los 3 parmetros: cambios de pH/color, produccin de gas CO2 (grietas en el medio/ se desplaza) y produccin de acido sulfhdrico SH2 (precipitado negro); siempre se compara con un tubo de control no inoculado.

Cambios de pH - [a] resultado final de la fermentacin solo de la glucosa => K/A zona superficial roja (reaccin alcalina de las aminas) y zona profunda amarillo (reaccion cida);despus de la fermentacin de la glucosa, el medio de cultivo inicialmente es amarillo entero, pero posteriormente la parte del pico se alcalina/rojo (haba poca cantidad de glucosa) por la descarboxilacin oxidativa de los aminocidos (que forman la peptona) que se produce mejor en aerobiosis; la fermentacin de glucosa en el pico es inicialmente mediante la va EMP, utiliza tanto para los aerobiosis y anaerobiosis, dando un intermedio clave (acido pirvico), que a su vez el acido pirvico es degradado mediante el ciclo de
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Krebs por los aerobiosis o anaerobiosis facultativos dando CO2 + H2O y ATP; en cambio, en el fondo, el acido pirvico es degradado hacia acido lctico y acido mixtos que mantiene el pH acido de manera estable.; son caractersticas de Morganella, Providencia y Shigella; tambin P.mirabilis, S.typhimurium, S.enteritidis, S.flexneri. [b] en la fermentacin de glucosa y lactosa => A/A zona superficial y profunda son amarillas (caractersticas de E.coli y K.pneumoniae); [c] no metabolizan ni lactosa ni glucosa (pero si la peptona) => K/K todo el tubo es de color rojo (si se trata de anaerobiosis) o si se trata de aerobiosis, la zona profunda es de color naranja (se alcalina mas la zona con mas O2 => Pseudomonas, P.aeruginosa) [d] si no se consume ni glucosa, ni lactosa ni peptona => no hay cambio de color en el tubo (grmenes inertes). Produccin de gas CO2 - aparecen burbujas, agrietamiento o desplazamiento del medio del fondo del tubo, debido a la formacin de hidrgeno y de anhdrido carbnico (CO2) Produccin de acido sulfhdrico SH2 - se manifiesta por el color negro de la capa profunda o un anillo negro cerca de la parte superior de la capa profunda o un precipitado negro en la capa profunda (que puede enmascarar la acidificacin del medio => fermentacin de la glucosa activa la desulfurasas); SH2+ => Proteus y Salmonella. TSI (Triple Sugar Iron) - identificacin de Yersinia enterocolitica como sacaroltica (tambin Proteus, Lactobacillus y Clostridium), ya que el medio lleva el 3er hidrato de carbono (sacarosa al 1%); los fundamentos y la interpretacin de los resultados son los mismos que en el mtodo anterior, pero es imposible saber si el azucar utilizado es uno u otro o ambos.

Agar sulfuro-indol-motilidad/ ASIM o motility-indol-agar (MIA) - tal como indica su nombre, sirve para determinar la motilidad de los microorganismos, la produccion de indol y la formacion de acido sulfhidrico; la forma de realizarla es la siguiente => se siembra en picadura y se incuba a 37C durante 18-24 horas; la motilidad se vera por la zona del inoculo con un zig-zag (en la picadura); la produccion de indol se vera con un cambio de color a violeta purpura (el medio es de color violeta clarito); la produccion de SH2 se vera por un cambio a negro.

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IMVIC (Indol - Motilidad - rojo de Metilo - Voges-Proskauer - Citrato) - se emplean en la identificacin de la familia enterobacteriaceas; se hacen de una en una y conjuntamente; Prueba de indol => estudia el metabolismo proteico/ la capacidad de degradar el triptfano (aminocido) y de formar segn la bacteria: indol y productos indlicos (escatol, acido indol-actico), mediante triptofanasa (enzima intracelular). Material => tubos de ensayo, asa de siembra, pipeta Pasteur, estufa de cultivo, mechero. Reactivo => caldo urea-indol de la casa Biomerieux, reactivo indol de Kovacs, microorganismo. Tcnica => Mtodo de Kovacs: en el tubo con 500 lambdas de reactivo urea-indol, se siembra el microorganismo problema, incubar a 37C durante 4 horas, aadir al cultivo 2 gotas de reactivo indol de Kovacs (debe ser siempre fresco), agitar suavemente el tubo y dejar unos segundos en reposo. Resultado => en indol+, aparece un anillo rojo en la superficie del medio (E.coli); en indol-, no hay cambio de color (Klebsiella pneumoniae)

Prueba de rojo de Metilo => muchas enterobacteriaceas con importancia clnica ( E.coli, Proteus mirabilis, Yersinia, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Sighella, Vibrio) son anaerobios facultativos, que para tener energa para sus reacciones metablicas, utilizan la fermentacin acido-mixta de los hidratos de carbono producindose => acido succnico, acido actico, alcohol etlico (cidos mixtos); en RM positivo, aparecen un color rojo fuerte en la superficie y en RM negativo, no hay cambio en la superficie del medio. Material => igual que anterior Reactivo => Medio de Clark y Lubs en tubo (liquido amarillo), solucin de rojo de metilo y microorganismo Tcnica => (a) en el tubo del medio Clark y Lubs se siembra el microorganismo problema (b) actualmente se utiliza la modificacin de Barry que es poner un inoculo abundante en 0,5 ml de reactivo de Clark y Lubs y dejar incubar entre 18-24 horas (c) a este cultivo se le aaden unas 5 gotas de indicador rojo de metilo que es rojo a pH 4,5 y amarillo a pH 6,3; el medio cambiara de color cuando el pH sea inferior a 4,5.
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Resultados => RM+ superficie del medio rojo fuerte y RM- => color amarillo en la superficie del medio

Prueba de Voges Proskauer (2 microbilogos) - lo podemos hacer en el API => la fermentacin butanodilica/ butilengliclica/ acetonica (acetil metil carbinol) que es una va alternativa de metabolismo de acido pirvico, se produce => un metabolito neutro (producto intermediario), en presencia de aire y hidrxido potsico 40%/KOH (por oxidacin) se forma => diacetilo y aadiendo alfa naftol, se forma un complejo rojo; por reduccin, la acetona forma => 2,3 butanodiol; Material => multiprueba API y resto igual Reactivo => Medio de Clark y Lubs (liquido amarillo), solucin de alfa naftol (VP2),solucin de hidrxido potsico al 40% o hidroxilo sdico al 40% (KOH), microorganismo problema. Tcnica => en un tubo de ensayo que contenga un medio de Clark y Lubs se siembra el microorganismo problema, se incuba 24 horas a 37C, se aade 0,2 ml (200 lambdas) solucin KOH 40%, luego 0,6 ml de la solucin alfa naftol, agitar e inclinar casi horizontalmente el tubo para que se favorezca la oxidacin de la acetona, reposar el tubo 10 minutos e interpretar los resultados. Resultados => en VP positiva (+), p.ej. Klebsiella pneumoniae y Enterobacter aerogenes, antes de 1 hora aparece coloracin rojo rosada en la superficie del medio; VP negativa () p.ej.E.coli y Proteus, la superficie del medio queda de color amarillento o cobrizo (la reaccin de los reactivos al mezclarse); la mayora de enterobacteriaceas en VP dan reacciones opuestas a la reaccin de RM (VP+ => RM- o VP- => RM+); las bacterias VP+ producen menor cantidad de cidos mixtos que sern insuficientes para bajar pH del medio con rojo metilo, por ello, cuando una bacteria es RM- => VP+.

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Prueba del Citrato => se investiga la capacidad del microorganismo de utilizar el citrato como nica fuente de carbono y sales de amonio inorgnicas como fuente de nitrgeno, por el crecimiento de colonias y el viraje de color del indicador incorporado en el medio causado por la alcalinizacin; los microorganismos que utilizan el citrato, tambin utilizan las sales de amonio; citrato sdico es una sal de acido ctrico que es uno de los metabolitos del ciclo de Krebs y algunas bacterias pueden obtener energa por una va diferente a la de la fermentacion de los hidratos de carbono, utilizando al citrato como nica fuente de carbono;la alcalinizacin del medio es producido por la formacin de amoniaco a partir de las sales de amonio que haba y la formacin de carbonatos y bicarbonatos se debe a la degradacin del citrato. Material => igual que anterior Reactivos => medio solido de Citrato de Simmons en tubo con azul de bromotimol (agar inclinado) y microorganismo de problema Tcnica => inocular un tubo de Citrato de Simmons con microorganismo mediante escobilln, solo la lengeta y guardar otro tubo que sirve de control negativo; incubar 24-48 horas a 37C dejando los tubos destapados para que se desprenda el CO2, leer los resultados a las 18-24 horas de incubacin. Resultados => en Citrato (+) p.ej. Enterobacter aerogenes, aparece color azul intenso en la superficie del medio y crecimiento de colonias en la lengeta; en Citrato (-) p.ej. E.coli, no aparece cambio de color (verde) ni crecimiento.

Micro-tcnicas 1. Sistema en Tiras (API Biomerieux) El material y reactivos necesarios para la realizacin de estas pruebas se encuentran comercializados en kits; fundamento => los medios deshidratados en micro-tubos se rehidratan mediante una suspensin de 5 ml de agua estril con 1 colonia bacteriana y se incuban; el proceso metabolismo del microorganismo, genera cambios del color en el medio
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de cultivo o al aadir reactivos y esos cambios se interpretan mediante tablas de lectura o ordenadores (se deben seguir rigurosamente las instrucciones del fabricante); principalmente se utiliza para la deteccin de Enterobacteriaceas, bacterias aerobios nofermentativas, anaerobios, levaduras, estafilococos; despus de utilizar todo debe ser incinerado o descontaminado en autoclave o sumergido en un germicida.

2. Sistemas en Tubos (entero-Tube BBL) Se utiliza para identificacin de Enterobacteriaceas y otras aplicaciones; fundamento => un tubo en forma de lpiz con numerosos compartimentos (normalmente son 8 con diferentes medios, donde pueden leer hasta 11 caractersticas); este tubo se inocula (con 1 colonia del medio y alambre de la inoculacin atraviesa todas las cmaras) y se incuba, produce cambios de color en cada compartimento; mediante un cdigo numrico o colorimtrico, se puede identificar al microorganismo.

3. Sistema rpidos metodos automatizados Cuando las muestras son procesadas a traves de metodos automatizados se logran excelentes resultados en tiempo muy cortos (se deben seguir las normas dadas por los
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fabricantes); - Para deteccin primaria del crecimiento (espectrofotometra infrarroja) => detecta los niveles de anhdrido carbnico (CO2), p.ej. BACTEC - Para identificacin (fotometra) => VITECK (crecimiento, identificacin y antibiograma)

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Tema 16 - Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos


Antibiograma - estudio de la sensibilidad del microorganismo patolgico a los antimicrobianos; se debe hacer antes de establecer el tto de una infeccin microbiana; diferentes metodos de antibiograma => (1) por difusin que daran resultados cualitativos de resistencia, sensibilidad o intermedios a los diferentes ATB (2) por dilucin nos dar resultados cuantitativos en base a 2 conceptos (CMI/ Concentracin Mnima Inhibitoria y CMB/ CM Bactericida) (3) por deteccin enzimtica, consiste en detectar la enzima del germen que confiere resistencia a los ATB p.ej. deteccin de betalactamasa, adenilasa, acetilasa, etc. Clasificacin de las sustancias anti-microbianas : (a) un microorganismo es sensible => cuando ATB alcanza niveles plasmticos => a CMI en el lugar de la infeccin; CMI => la mnima cantidad de ATB capaz de inhibir el crecimiento de un germen; CMB => la mnima cantidad de ATB que matara al germen; normalmente CMI es suficiente para combatir una infeccin y los mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar el microorganismo, siendo por tanto la CMI es el termino mas utilizado. (b) un microorganismo es resistente => cuando la concentracin mxima de ATB que se puede localizar en el lugar de la infeccin no es suficiente para eliminar el germen, es decir, la concentracin de ATB necesario para destruir el germen no se puede elevar mas
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por

efectos

txicos secundarios.

(c) microorganismo de sensibilidad intermedia => no esta afectado por dosis normales de ATB dadas a intervalos normales, pero con una dosis alta en el lugar de la infeccin sin llegar a dosis que produzcan efectos txicos, puede eliminar el germen.

Casos clnicos => Pseudomonas que da problemas respiratoria/ urinaria y es resistente a casi todos los ATB, se dar una dosis toxico o una combinacin de ATB por va endovenosa. Normas bsicas => no efectuar un antibiograma directamente del producto patolgico, ni tampoco utilizar mezclas de grmenes (se debe realizar un aislamiento por agotamiento en placa), excepto para muestras de orina ambulatoria (normalmente es una infeccin monomicrobiana); para elegir un ATB se deber ensayar aquellos que son tiles clnicamente y se encuentran disponibles en el mercado farmacutico. Factores a tener en cuenta => (1) caractersticas tintoriales del germen (Gram+o-) (2)lugar de la infeccin (especialmente las vas urinarias y meningitis); es importante porque es necesario que la CMI sea alcanzable en los lquidos corporales para que sea efectivo (3)bacteria investigada. La seleccin de ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas de sensibilidad Normalmente se selecciona un ATB representativo de cada grupo para realizar las pruebas de sensibilidad; habitualmente se acepta que no es necesario hacer pruebas de sensibilidad para un ATB cuando no se han descrito resistencias en esas especies, p.ej. Streptococcus pyogenes.

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1. Betalactmicos => todo el grupo tiene en comn que presenta un anilla betalactmico y el mecanismo de accin consiste en inhibir la formacin de peptidoglicano de la pared celular; son bactericidas. a. Penicilinas - tiene espectro desigual => aveces es mas efectivo a uno pero no a otro. * Penicilina G sodica la forma oral es P V * Amoxicilina - infeccin del tracto respiratorio inferior: bronquitis aguda y crnica, neumonas bacterianas y bronconeumona, producidas por estreptococo, estafilococo sensible,neumococo y H.influenzae. Gastrointestinal: fiebre tifoidea o paratifoidea. Genitourinaria: cistitis, uretritis, pielonefritis, bacteriuria, gonorrea, aborto sptico, sepsis puerperal. De piel y tejido blando (incluida infeccin de herida quirrgica), por estreptococo, estafilococo sensible y E. coli. * Amoxicilina + acido clavulanico (es un inhibidor de las betalactmasas producida por algunas bacterias) b. Cefalosporinas - actualmente se ha desarrollado la 4 generacin (semisintticos; bacteriostticas frente a cocos Gram+ y bacilos Gram-) * Cefotaxima (indicado para gonorrea; profilaxis quirrgica; epiglotitis y meningitis porHaemophilus) * Cefuroxima (efectividad contra Neisseria gonorrheae y otras bacterias productoras de penicilinasa; es activa contra Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y estreptococo beta-hemoltico; son susceptibles Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis) 2. Derivados de betalactmicos: * Aztreonam - se utiliza comnmente frente a las infecciones causadas por Pseudomonas aeruginosa, pero su espectro abarca a las enterobacterias (incluida Escherichia coli), como p.ej. Klebsiella, Haemophilus, Citrobacter y Proteus. 3. Aminoglicosidos => en general su mecanismo de accin es la inhibicin de la sntesis de protena en diferentes fases segn el ATB; en general derivan de los hongos y son potentesbactericidas; son de amplio espectro y provocan toxicidad renal y audio vestbular en alta dosis o a las personas susceptible. * Estreptomicina (tratamiento de infecciones causadas por grmenes sensibles, como:Mycobacterium tuberculosis, Salmonellas, enterococos, estreptococos, neumococos y algunos Gram- como Haemophilus influenzae; es eficaz en infecciones del tracto respiratorio) * Gentamicina (Acta sobre bacterias Gramaerobias, incluyendo enterobactericeas,Pseudomonas y Haemophilus. Acta tambin sobre estafilococos (S.aureus y S.epidermidis) * Tobramicina (Infecciones del tracto respiratorio inferior como neumona, bronconeumona y bronquitis aguda causadas por P.aeruginosa, Klebsiella sp., Enterobacter sp., Serratia sp., E.coli y S.aureus) * Neomicina (es activo in vitro contra Escherichia coli, Klebsiella y contra flora anaerbica intestinal) 4. Lincosamidas => inhibe la sntesis proteica * Clindamicina (es un buen ATB frente anaerobios) - Su actividad antibacteriana es similar a la de eritromicina (macrolidos) en contra de estafilococos y estreptococos; adems es efectiva en contra de anaerobios, en especial Bacteroides fragilis. 5. ATB polipeptdicos y glucopeptdicos => su mecanismo de accin es inhibir la
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formacin de peptido glicano de la pared celular (bactericidas) a. Activos frente a Gram+ * Bacitracina - es utilizado para la identificacin del estreptococo del grupo A a cual es sensible; es bactericida; se utiliza tpicamente para infecciones cutneas (por su efecto de nefrotoxicidad) acta sobre cocos y bacilos Gram+ (Neisseria y Treponema pallidum) * Vancomicina - por su alta toxicidad renal y ptica, se reservan para infecciones de Gram+ resistentes; es bactericida; tiene accin ante cocos Gram+ y bacilos Gram+ b. Activos frente a Gram- => ambas (polimixinas) se usan tpicamente sobre Gram-, tambin se usa como ATB de identificacin; tienen accin ante enterobacterias (exceptoProteus, Providencia y Serratia), Pseudomonas aeruginosa, Vibrio, Pasteurella, Haemophillus y Bordetella; son ATB de segunda eleccin (para bacilos Gramresistentes a otros ATB) * Polimixina B * Polimixina E (Colistina) c. Activos frente a Mycobacterium tuberculosis

6. Otros * Fosfomicina - es un ATB de origen espaol de un amplio espectro que acta sobre la pared celular (se usa en infeccin urinaria) * Acido fucsidico - acta sobre la sntesis proteica y destaca su accin sobre Staphylococcus aureus. 7. Tetraciclinas - son bacteriostticas y su mecanismo de accin es inhibir la sntesis de las protenas; no se deben administrar a menores de 8 aos por tener efecto secundarios sobre la denticin y los huesos; tambin pueden producir toxicidad sobre el tracto gastrointestinal y el higado; son de amplio espectro; origen biolgico o semisinttico; activas frente a cocos y bacilos Gram+ y Gram- aerobios; son frmacos de eleccin en brucelosis, clera, granuloma inguinal (ETS). * Tetraciclina * Doxiciclina - es el tratamiento de fiebre tifus, fiebre Q, erupciones pustulosas por Ricketsias y fiebre de las montaas rocosas por Ricketsias, infecciones del tracto respiratorio causadas por Mycoplasma pneumoniae; el tratamiento de infecciones causadas por Gram-: chancroidecausado por Haemophilus ducreyi, plaga debida a Yersinia pestis (anteriormente Pasteurella pestis), tularemia debida a Francisella tularensis (anteriormente Pasteurella tularensis), clera causada por Vibrio cholerae (anteriormente Vibrio comma), infecciones por Campylobacter en fetos causadas por Campylobacter fetus (anteriormente Vibrio fetus), brucelosis causada por especies de Brucella (junto con estreptomicina), bartonelosiscausada por Bartonella bacilliformis, granuloma inguinal causado por Calymmatobacterium granulomatis. 8. Cloranfenicol - es de amplio espectro; inhibe la sntesis proteica y es toxica a nivel medular; es de origen sinttico, bacteriosttico, acta frente a Gram+ y (especialmenteHaemophilus influenzae y Salmonella) 9. Macrolidos y similares - inhiben la sntesis proteica; amplio espectro; se dan cuando es alrgica a penicilina; son bacteriostticos y bactericidas en alta dosis . a. Eritromicina (un buen ATB frente neumnia atpica, legionelosis, difteria, tos ferina) b. Azitromicina - para tratar ciertas infecciones causadas por las bacterias, como la bronquitis; neumona; enfermedades de transmisin sexual (ETS); y las infecciones en los odos, pulmones, piel y garganta; no tienen ningn efecto sobre los resfriados, la gripe y otras infecciones virales.
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c. Claritomicina - interfiere la sntesis de protenas en las bacterias sensibles; faringitis, amigdalitis, sinusitis, bronquitis aguda, reagudizacin de bronquitis crnica, neumona bacteriana (adquirida en la comunidad), infeccin de piel y tejidos blandos leve-moderada, foliculitis, celulitis, erisipela, infeccin localizada o diseminada por Mycobacterium avium oM.intracellulare, infeccin localizada por M.chelonae, M. fortuitum y M.kansaii. Prevencin de infeccin diseminada por M.avium complex en pacientes con VIH de alto riesgo 10. Quimioterpicos de sntesis a. Sulfamidas (es bacteriosttico, de origen sintetico; inhibe la sntesis de acido flico; activo frente Gram+ y -, Clamidias, Nocardia) b. Trimetropin+sulfametoxazol (cotrimoxazol) - inhibe la sntesis de acido flico; elimina las bacterias que provocan infecciones, incluyendo las infecciones que afectan las vas urinarias, los pulmones (neumona), odos e intestinos c. Quinolonas (6) - inhiben la replicacion del ADN bacteriano son buenos ATB de amplio espectro, pero se ha abusado mucho. d. Norfloxacina - infecciones de las vas urinarias y la prstata; inhibe la replicacin del ADN bacteriano. La norfloxacina pertenece a una clase de antibiticos llamados fluoroquinolonas; tomar norfloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle tendinitis. e. Ciprofloxacina - inhibe la replicacin del ADN bacteriano; para tratar o prevenir determinadas infecciones bacterianas, tambin se usa para tratar o prevenir el ntrax (una infeccin grave que se puede propagar en forma intencional como parte de un ataque bioterrorista) en quienes han estado expuestos a los grmenes del ntrax suspendidos en el aire; tomar ciprofloxacina aumenta el riesgo de que desarrolle tendinitis. 11. Quimioterapia antituberculosa actualmente se emplea: * Rifampicina - ATB sistmico, antituberculoso, bactericida. Inhibe la sntesis de ARN bacteriano. Tuberculosis en todas sus formas (asociado a otros tuberculostticos). Brucelosis.Erradicacin de meningococos en portadores asintomticos, no enfermos. Alrgicos o con contraindicaciones a otros antibiticos o quimioterpicos. Infecciones causadas porestafilococos (S.aureus, S.epidermidis, cepas polirresistentes) y por enterococos (S.faecalis, S.faecium). * Isoniacida - para tratar la tuberculosis, y para prevenirla en personas que han tenido contacto con las bacterias de la tuberculosis. Elimina slo las bacterias activas (en crecimiento). Debido a que las bacterias pueden estar en un perodo de incubacin (sin crecimiento) durante largos perodos, la terapia con isoniazida (y otros medicamentos para evitar la tuberculosis) debe hacerse durante mucho tiempo (por lo general entre 6 y 12 meses). * Etambutol - el tratamiento de tuberculosis pulmonar; debe ser usado en conjuncin con otros frmacos antituberculosos. 12. * * * * Quimioterapia antimictica : Nistatina Miconazol B. Fluconazol

Amfotericina

13. Quimioterapia anti-viral * Aciclovir - antiviral activo frente al virus herpes humano, inhibe la replicacin de ADN viral, interfiriendo con el ADN polimerasa viral. * Ribavirina - La ribavirina se utiliza con un medicamento interfern, para tratar la hepatitis
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C en personas que no han sido tratadas con interfern antes. La ribavirina pertenece a una clase de medicamentos antivirales llamados anlogos de nuclesidos. Esta acta impidiendo que el virus que provoca la hepatitis C se propague dentro del cuerpo.

Pruebas de sensibilidad anti-microbiana - tcnicas que investigan la actividad antimicrobiana de distintos quimioterpicos frente al microorganismo estudiado; sus principales aplicaciones: - contribuir a la identificacin de los microorganismos (p.ej. sensibilidad del neumococo/S.pneumonia a la optiquina; del S.pyogenes a la Bacitracina) - constituye una base fundamental para la instauracin de una terapia adecuada. Son tcnicas estandarizadas y se ha demostrado que existe un paralelismo entre los resultados de sensibilidad obtenidos in vitro con los efectos teraputicos in vivo; la prueba mas utilizada es la difusin en medio solido a excepcin de los grandes laboratorios que utilizan sistemas multiprueba o mtodos automatizados (Vitec, Pasco...) Antibiticos - un grupo de compuestos qumicos teraputicamente muy tiles y que antaose caracterizaban por ser subproductos metablicos de un microorganismo siendo casi siempre letal para otros grmenes (p.ej. a los hongos); actualmente la mayora son sintetizados en el laboratorio; uno de los primeros es descubierto en 1927, cuando Alexander Flemming descubri la penicilina extrayendo-lo de un hongo (Penicillium notatum) siendo en 1929 cuando efectu los primero ensayos de sensibilidad anti-microbiana (se contaminaron las placas sin querer por un hongo); en 1939 Rose y Miller intentaron estandarizar las mltiples variantes de los anlisis de sensibilidad microbiana por difusin en placa y posteriormente en los aos 50, Kirby-Bauer y Anderson estandarizaron la tcnica que se utiliza actualmente por difusin en medio solido o en placa. Los a. 1. 2. 3. 4. b. principales de Prueba Prueba Prueba de Prueba pruebas dilucin de difusin de en para en hacer un antibiograma : Manuales y liquido disco enzimtica Kirby-Bauer) Automatizadas

medio solido elucin en deteccin medio solido (de

Trminos utilizados en las pruebas anti-microbianas : - Microorganismo sensible o sensibilidad => es inhibido por un ATB a dosis habituales - Microorganismo de sensibilidad intermedia => el germen "in vitro" no es claramente sensible al ATB, pero si lo seria "in vivo" incrementando la dosis habitual sin llegar a dosis toxicas - Microorganismo resistente o resistencia => no es sensible al ATB a dosis habituales y es necesario administrar dosis toxicas - CMI (cantidad mnima inhibitoria) => es la menor concentracin de un ATB capaz de
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inhibir el crecimiento bacteriano de una cepa dada - CMB (cantidad mnima bactericida) => es la menor concentracin de un ATB con la que no quedan bacterias vivas de una cepa dada Tcnicas manuales de realizacin de las pruebas de sensibilidad anti-microbiana a. Pruebas de dilucin (es una tcnica de centros de investigacin /lenta /engorrosas) => se basan en el estudio al unisono de diferentes concentraciones de ATB, lo que les da un carcter cuantitativo en base a los conceptos CMB y CMI; 2 tipos => en medio liquido y solido; se utilizan 10 tubos con grmenes en caldo nutritivo o agar y a cada tubo se le aade una cantidad prefijada de ATB diluido seriadamente, excepto en el tubo de control; se incuban 18-24 horas a 37C y se examina la turbidez que indica crecimiento de grmenes; en el tubodonde no hay turbidez se ha inhibido el crecimiento de los grmenes; con estos datos estudiamos la CMI y la CMB de los antibiticos. b. Pruebas de elucin en disco (disolver) => se realiza introduciendo discos de un ATB en tubos con caldo nutritivo; el ATB se disuelve en el caldo alcanzando una concentracin final conocida, posteriormente se inocula un volumen de una suspensin microbiana y se sigue la misma metodologa descrita antes obtenindose resultados cuantitativos o cualitativos en base a sensibilidad, sensibilidad intermedia o resistencia (no se utilizan habitualmente). c. Pruebas enzimticas de deteccin => fundamentalmente se detectan las betalactamasas; un reducido numero de bacterias son resistentes a las penicilinas y cefalosporinas(ATB B-lactmicos) debido a que producen un enzima (b-lactamasa) capaz de inactivar estos ATB, p.ej. los gonococos, pneumococo y algunos estreptococos; consiste en observar el crecimiento de los grmenes en presencia de dichos ATB; se toma la colonia sospechosa y mezclar-la con un sustrato que si cambia de color nos indica que la colonia es B-lactamasa (+), por lo tanto es resistente a los ATB B-lactamico; se denomina Prueba de NITROCEFIN. d. Prueba de difusin en medio solido (antibiograma clsico) => estandarizadodesde los aos 50 (se hace igual en todo el mundo) por Kirby-Bauer y Anderson en todos sus pasos y es mas utilizado actualmente en forma manual; fundamento => depositar discos impregnados de ATB sobre cultivos de microorganismos en placa; la difusin del ATB a traves del medio produce un halo de inhibicin del crecimiento cuyo dimetro sera proporcional a la potencia del ATB dando resultados cualitativos de resistencia, sensibilidad o sensibilidad intermedia a los ATB; material => placas de Petri (9cm), pinzas metlicas estriles o dispensador automtico, pie de rey o regla milimetrada, medio Mueller-Hinton, discos de ATB, suspensin microbiana al 0,5 escala Mc Farland (10 elevado 8 u.f.c./ml; escala Mc Farland => el 0,5 se prepara aadiendo 0,5 ml de Cl2Ba 0,04 M a 99,5 ml de acido sulfrico 0,36M); una placa llena => mas de 10 elevado 6. Tcnica => el medio Mueller-Hinton se vierte en placas con un espesor de 4 mm; la siembra utilizada preferentemente (a) la de Kirby-Bauer: se introduce un escobilln en el inoculo preparado al 0,5 Mc Farland (no tenemos) y se siembra en 3 direcciones y se deja aproximadamente 4 minutos la placa semi-abierta e invertida antes de colocar los discos; (b)la de Barry: se hace una inoculacin previa al vertido de las placas, se aaden 0,1 ml del inoculo a 25 ml del medio Mueller-Hinton fundido y se vierte en placa (no se usa mas)

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Eleccin de ATB => se debe seleccionar un ATB representativo de cada grupo excepto en los casos donde existan diferencias significativas en los espectros de actividad o resistencia; los aspectos importantes que prevalecen a la hora de seleccionar un ATB => las caractersticas tintoriales del germen (Gram+o-), el lugar de la infeccin (orina, meningitis) y la bacteria investigada. Concentracin de los discos => tiene que estar perfectamente estandarizada sigundose las normas de la Federacin de Drogas y Alimentos/ FDA => la actividad del disco debe estar entre 65% y 150% y de la OMS => entre 75% y 135%; siempre se debe utilizar un control para controlar la actividad de los discos; en general, se escogen discos con una concentracin que producen un halo de inhibicin entre 20 y 30 mm para organismos tipificados como sensibles y de menos de 10 mm para los resistentes. Implantacin de los discos (papel de filtro grueso de un dimetro 6mm que van impregnados con una concentracin determinada de ATB); Manual => se saca el disco de ATB con unas pinzas estriles y se deposita en la placa, la distancia mnima entre los discos es de 24 mm para evitar la superposicin de los halos, deben estar situados a 15 mm del borde como mnimo (se colocan 8 discos) una vez depositado el disco se presiona ligeramente con la punta de pinzas; Automtica => se utilizan dispensadores automticos que son unos dispositivos de plstico del tamao de una placa de Petri con unos orificios gua que permiten la colocacin simultanea de todos los discos en el lugar adecuado, y con una pinza se presionan ligeramente los discos para que al girar o invertir la placa no se caigan los discos. Incubacin => 18-24 horas a 35-37C (mximo 48 horas) Lectura e interpretacin del antibiograma => los resultados se expresan segn el halo de inhibicin que aparece alrededor de cada disco; el halo se mide con una regla calibrada o pie de rey midiendo los dimetros, y segn cual sea clasificaremos al germen como sensible (la dosis habituales es eficaz), intermedio (se deben incrementar las dosis habituales sin llegar a dosis toxicas) o resistente (ATB es totalmente ineficaz); Observacin al mtodo: 1. preservar la estandarizacin en todos sus pasos 2. puesto que la difusin del ATB es casi instantnea no debe moverse ningn disco una vez que se ha puesto en contacto con la superficie del agar 3. los discos se tienen que conservar en la nevera 4. procurar que la lectura se haga a las 18-24 horas, evitndose el exceso de incubacin 5. Aunque el medio elegido es el Mueller-Hinton, se pueden emplear medios enriquecidos como AS (estreptococo), agar chocolate (Haemophylus) para grmenes exigentes 6. de vez en cuando hay que colocar controles de calidad 7. cuando el germen sea anaerobio el mtodo es diferente Mtodo automatizados de identificacin y susceptibilidad - actualmente existen diferentes metodos automatizados para realizar el antibiograma; los mas utilizados se basan
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fundamentalmente en la medida bien fotomtrica o bien turbidimtrica del efecto de un ATB sobre el crecimiento de una bacteria en medio liquido comparndolo con el de la misma bacteria en un medio sin ATB; otros metodos se basan en tcnicas de impedancia elctrica microcalorimetra bioluminiscencia, radiometra ... Los metodos fotomtrico y turbidimtrico p.ej. sistema Vitec, se resume : - se utilizan unas tarjetas desechables del tamao de un naipe donde se inyecta la muestra ya diluida mediante un modulo inyector; la tarjeta presenta unas perforaciones donde lleva incorporadas diferentes medios selectivos liofilizados; - la tarjeta se sella y se coloca en un modulo incubador y de lectura, leyndose de manera automtica los resultados cada hora; los datos los almacena un ordenador que los compara con valores umbrales ya almacenados; el ordenador puede dar resultados a las 4 horas (lo normal entre 4 -13 horas) El sistema Microscan utiliza un sistema semejante al de dilucin en caldo pero en miniatura utilizando paneles con caldo de Mueller-Hinton deshidratado (como API); tras la inoculacin y re-hidratacin con una suspensin estandarizada del microorganismo y suincubacin a 35C por un mnimo de 16 horas, la CIM o una sensibilidad cualitativa (sensible, intermedio o resistente) para el organismo en prueba se determina observando la menor concentracin ATB, que muestre inhibicin de crecimiento; esta deteccin puede hacerse manualmente mediante un visualizador de micro-dilucin o mediante un lector conectado a un ordenador; viene en tripletes de un ATB con diferentes concentraciones. Agentes antimicrobianos (ATB) activos frente a Gram- => Cefuroxima, Cefotaxima, Colistina, Tobramicina, ; frente a Gram+ => Eritromicina, Tetraciclina, Vancomicina, Meticilina, Clindamicina, Doxicilina; frente a ambos Gram+ y - => Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina, Cotrimoxazol, Cloranfenicol, Imipenem, Amoxicilina+acido clavulonico.

Clasificacin

de

los

antibiticos

segn

su

efecto

bacteriano
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Bactericidas => Penicilinas, Cefalosporinas, Aminoglucsidos, Rifampicina, Quinolonas, Monobactmicos, Polimixinas. Bacteriostticos => Tetraciclinas, Eritromicina, Sulfonamida, Novobiocina, Cloranfenicol Clasificacin de los antibiticos segn su mecanismo de accin sobre la estructura bacteriana I. Inhibicin de la sntesis de la pared celular Penicilinas Cefalosporinas Vancomicina Fosfomicina Tercoplanina Bacitracina II. Lesin en la permeabilidad de la membrana celular Poliomixinas Colistinas Nistatina Anfotericn B III. Inhibicin de la sntesis proteica Cloranfenicol Tetraciclina Aminoglucsidos Lincomicinas Eritromicina IV. Inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos Quinolonas Sulfonamidas Rifampicina Trimetropn

Nota: (*) Penicilina semisinttica resistente penicilinasa

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Estudio de la orina
Funcin del rin: - La eliminacin de nuestro organismo de una importante cantidad de residuos metablicos, muchos de ellos intiles, y de otros que incluso pueden comportarse como txicos. - La regulacin de la composicin de los fluidos de nuestro organismo facilitando as, tanto la supervivencia de las clulas como el optimo desarrollo de todos los procesos metablicos. - El control hormonal de la presin arterial (adrenalina, noradrenalina) - El control de los niveles orgnicos del calcio (mineral corticoides aldosterona, 1,25 dihidroxicolecalciferol) - El control de la eritropoyesis (eritropoyetina) Nefronas - son unidades funcionales bsicas consiste de 2 partes => el glomerulo (dentro de la cavidad "capsula de Bowman") y la red tubular. El glomerulo - rodeado de una cavidad (capsula de Bowman) y dispone de una extensa red vascular; filtrar/ depurar el plasma 25 ml de sangre por minuto (150 litros de plasma/ dia); se filtra agua, urea, creatinina, aminocidos, cido rico, glucosa, protenas de bajo pm. La red tubular - el filtrado por el glomerulo es recogido en la capsula de Bowman y se dirige hacia la red tubular donde se lleva a cabo un proceso de reabsorcin selectiva => reabsorber agua, ciertos elementos tiles para el organismo y que deben ser recuperadas (glucosa, agua, sodio, cloruro, potasio, bicarbonato, urea, aminocidos, proteina) y permite la secrecin de otras que, por su toxicidad, deben ser posteriormente eliminadas mediante la miccin (amonio, urea, hidrogeniones/H+); se elimina 1 ml de orina por minuto (1500 ml

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diarios); la red tubular esta formada por => tbulo contorneado proximal, asa de Henle, tbulo contorneado distal y tbulo colector. Mecanismo de la funcin renal: - Filtracin glomerular => filtra el plasma desde los capilares que lo envuelven hasta la capsula de Bowman. - Reabsorcin tubular => el producto de la filtracin glomerular se modifica su composicion al atravesar la red tubular. - Secrecin tubular => transporte de sustancias, desde la red capilar hacia los tbulos renales; destaca la secrecin activa de iones H+, que permite la regulacin del equilibrio acido-base en el organismo. Procedimiento de la recogida de muestra (el personal facultativo determina el tipo de muestra necesaria para el anlisis) => informar a la persona del objeto del anlisis; indicar el tipo de muestra deseada; orientar acerca de la tcnica de obtencin de la misma; indicar las pautas de almacenaje y transporte adecuado (si se toma fuera del laboratorio); insistir en la importancia de la limpieza en general y de la higiene antes de la recogida (evitar la contaminacin involuntaria); describir el tipo y caractersticas mas adecuadas delrecipiente a utilizar; tener en cuenta la capacidad del paciente para evacuar la vejiga de forma voluntaria y la necesidad de utilizar tcnicas invasivas para obtener la orina en condiciones adecuadas. Recogida de muestras de orina - Miccin espontanea => paciente responsable de la misma para obtener muestra sin contaminacin; prevencin : eliminar la primera porcin de la miccin y asegurar el lavado minucioso previo de los genitales; indicaciones: anlisis fisico-qumico, estudio del sedimento, concentracin de creatina y microbiologia (en ocasiones). - Cateterismo vesical/ sondaje (realizada por personal enfermera) => pacientes que presentan dificultades de la miccin, mujeres para evitar la contaminacin vaginal. - Puncin supra-pbica (realizada por personal facultativo) => diagnostico de infeccin por microorganismos extraos en nios. Tipos de muestras para un anlisis de orina (sin supervisin - miccin espontanea): - Primera orina de la maana => se recomienda porque la concentracin de solutos es variable a lo largo del da y esta en relacin con la ingesta de liquidos. - Orina tomada al azar => muestra valida para cultivos microbiologicos - Orina minutada (fraccionada, de 2 horas, de 24 horas) => gran utilidad para el paciente diabeticos Anlisis de orina - procedimiento tcnico encaminado a examinar los componentes que la integran, su cantidad y la proporcin en que se encuentran; su estudio proporciona gran informacin acerca de mltiples alteraciones orgnicas y de muy diversa etiologa (rion, procesos metablicos) => permite detectar alteraciones patolgicas, estados fisiolgicos particulares no patolgicos (embarazo) y un buen funcionamiento renal. Objetivos: - obtener informacin del estado general del rion y las lesiones que pudieran afectarlo - detectar la existencia de una alteracin a nivel de las vas urinarias - teniendo en cuenta aquellos productos que se eliminan va urinaria, detectar alteraciones funcionales de otros rganos - detectar las alteraciones metablicas de diversa etiologia - se intenta encontrar sustancias o componentes que normalmente no se encuentran en la orina
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- detectar alguna alteracin en la concentracin (por defecto o por exceso) de componentes que habitualmente se encuentran en la orina Tipos de anlisis de orina => anlisis elemental, completo, rutinario, anormales y sedimento. Parmetro bioqumico => Densidad - Bilirrubina - Cuerpos cetnicos - Protenas Urobilinogeno - Glucosa - Hemoglobina - Nitritos - pH - Hemates - Leucocitos (actualmente se utiliza determinacin por qumica seca / tiras reactivas). Anlisis general de una muestra de orina : - Fsico/macroscpico => cantidad, aspecto/turbidez, color, olor, densidad, pH - Qumico/anormales => protenas, glucosa, cuerpos cetnicos, sangre/hemoglobina, bilirrubina/ pigmentos biliares, urobilingeno/ urobilina, nitritos - Microscpico => estudio de estructuras cristalinas/cristales y de formas amorfas en suspensin, estudio citolgico, estudio bacteriolgico. - Microbiolgico => urinocultivo, identificacin del germen (pruebas bioqumicas), ATB (antibiograma). - Parasitolgico => tcnicas especificas de visualizacin macroscpica de parsitos; estudio microscpico de parsitos en la muestra de orina: parsitos enteros o parte de ellos, huevos, formas de resistencia (quistes). El orden cronolgico de un anlisis general=> caractersticas fsicas macroscpica sedimentacin (a 1500 rpm durante 10-15 minutos) - pruebas bioqumicas (tiras reactivas); la muestra sobrante se debe guardar hasta que la analtica haya concluido; hay que revisar los resultados del sedimento concuerdan con las pruebas qumicas y comprobar las anomalas detectadas han sido confirmadas. Examen fsico - macroscpico Es orientativo => para diagnosticar una patologa, hay que confirmar con otros anlisis complementarios; hay que tener en cuenta situaciones fisiolgicas (menstruacin, grado de hidratacin, etc.) que pueden alterar las caractersticas de la muestra; 1)- Cantidad / diuresis normal 1200-2000 ml/24H; alteracin => oliguria/inferior, poliuria/superior, anuria/falta de eliminacin (<300 ml/24H) 2)- Aspecto / turbidez; recin emitida: clara y transparente; almacenada: sedimento blanco/fosfatos y carbonatos, sedimento rojizo (uratos desaparecer al calentar la orina a 60C); 3)- Color amarillo / mbar (en funcin de la concentracin) 4)- Olor aromtico, ligeramente amoniacal 5)- Densidad 1.010-1.030 (se determina mediante tiras reactivas); 6)- pH normal 5,5-6 (ligeramente cida); pH alcalino => posible contenido de grmenes con ureasa. Pruebas bioqumicas cuantitativas Protenas en condiciones normales las protenas se encuentran 130-150 mg/da en funcin del volumen de orina eliminado; en recin nacidos 2-8 mg/100 ml;cantidad de protena (con peso molecular menor)=> (a) albumina 1/3 del total (fisiolgica); (b) globulinas; (c) protena de Tamm-Horsfall (T-H) es muco-protena viscosa que no se encuentra en el plasma - se forma en el tubulo contorneado distal, constituye la matriz de los cilindros; (d) transferrina; (e) IgA. Proteinuria => eliminacin de proteina en orina superando los VN
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- intensa (>4 g/da) indica un dao renal grave; se dan en sndrome nefrtico, glomerulonefritis (aguda y crnica), congestin venosa renal; - moderada (de 0,5 - 4g/da) indica un dao renal menos graves; se dan en pielonefritis con hipertensin, nefropata diabtica, mieloma multiple. - leve (<0,5 g/da) se dan en riones poliqusticos, lesiones renales incipientes. de patrn glomerular => pierde su selectividad en la filtracin. de patrn tubular => cuando hay lesin tubular - de forma intermitente o transitoria => puede ser fisiolgica (hay que comprobarlo) - de forma persistente => suele cursar con hematuria y su pronostico es peor. Glucosa - la orina normal carece casi por completo de glucosa (filtrado y absorbido); normoglucemia => 6-120 mg/dl; umbral renal 160 mg/dl; glucosuria => aumento de la concentracin de glucosa en orina por encima de los VN, causada por (1) aumento de la glucemia por encima de umbral renal (2) alteracin renal (tubulopata) Cuerpos cetnicos (compuesto por acido acetilacetico/diacetico, acido beta-hidroxibutirico, acetona) - en personas sanas, los CC se sintetizan en el hgado y se metabolizan por completo, de forma que en la orina aparecen en concentraciones mnimas (indetectables); cetonuria=> aparicin de cuerpos cetnicos detectables en orina; la presencia de cetonuria y el aumento de cetonemia implica que no se realiza correctamente el catabolismo oxidativo de los cidos grasos; las causas de cetonuria: - sobrecarga de lipidos en la dieta - diabetes mellitus (coma diabetico) - vmitos (en nios y embarazadas) - bajo consumo de hidratos de carbono o alteracin en su metabolismo - ayuno prolongado Hemoglobina - no aparece en orinas normales; hemoglobinuria => presencia de Hb en orina (si la cantidad es alta, se puede ver a simple vista); causas => enfermedad renal de vas altas, anemias hemolticas, reacciones transfusionales, infecciones (malaria, paludismo) Pigmentos biliares (bilirrubina y biliverdina) - se forman en bazo, higado y MO por degradacin fisiolgica de Hb; 2 tipos => BB-Albumina / indirecta y BB-Glucurnico /directa; aparece BB en orina, siempre que aumente la BB directa en sangre por causas => enfermedad obstructiva (ictericia obstructiva/ acumulacin en sangre), lesiones hepticas(hepatitis, hepato-toxicidad). Urobilingeno - BB directa con la bilis, pasa al intestino delgado donde por accin de la flora bacteriana se transforma en urobilingeno o estercobilingeno (se elimina en mayora con las heces y la orina en menor concentracin); la cantidad de urobilingeno aumenta en la orina en las hepatitis y las anemias hemolticas; la determinacin de urobilingeno debe realizarse rpidamente en orina, ya que se transforma en urobilina + O2(falso negativo). Nitritos - su aparicin en la orina indica crecimiento bacteriano (bacteriuria), de germenes capaces de reducir los nitratos ingeridos con la dieta, hasta nitritos (entero-bacterias); un resultado negativo de la prueba de los nitritos, no indica ausencia de microorganismos, ya que puede haber bacterias que no son productores de nitritos o ausencia de nitratos ingeridos en la dieta.

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Examen microscpico de orina - sedimento urinario - estudio de elementos o estructuras de origen y composicion variados que aparecen suspendidos en la orina que proporciona ayuda para el diagnostico y evolucin de las enfermedades renales; la muestra debe examinarse antes de transcurridas 3-4 horas desde su recogida (algunas estructuras como celulas y cilindros se lisan fcilmente; obtencin del sedimento: homogeneizar bien la muestra, verter 10 ml en un tubo de centrifuga (fondo cnico), centrifugar a 1500 rpm durante 10 minutos; decantar el sobrenadante (quedando solo 1 ml), re-suspender el sedimento residual, montar un fresco (una gota entre porta y cubreobjetos, evitando la formacin de burbujas), observar al microscopio a 40x, intensidad lumnica media y condensador a media altura; tambin se puede observar a 10x en el permetro de cubre si hay los cilindros hialinos. Estructuras organizadas - Hemates: pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; en gran numeroindica infeccin, traumatismos, neoplasias y litiasis renal; presencia normal de 12/campo o como una contaminacin menstrual; pueden confundirse con levaduras y cristal de oxalato clcico monohidratado; con tincin Gram se diferenciar => los hemates son teidos de rojo, levaduras de violeta y cristales incoloros; es importante distinguir entre macro-hematuria (se ve en el sedimento de color rojizo) y microhematuria (nicamente se detecta al microscopio), tambin si el color rojo observado macroscpicamente procede de hemates o Hb (al centrifugar el sedimento, el color rojizo de Hb permanece).

- Leucocitos (neutrfilos): pueden proceder de cualquier parte del sistema renal; >50% de ellos se lisan al permanecer mas de 2-3 horas a temperatura ambiente; presencia normal de 1-2/campo (varn) y 1-3/campo (mujer); cifra superior de normal en el sedimento => piuria (>5 leucocitos/campo indica => infeccin renal en cualquier nivel);

- Espermatozoides: formados por 2 partes cabeza y cola; frecuente en un sedimento del varn (eyaculaciones recientes, poluciones nocturnas, etc.), y en mujer despus de haber mantenido relaciones sexuales. - Bacterias: la composicion de orina es un excelente medio de cultivo para los microorganismos; la mayora de ocasiones son fruto de una contaminacin de la flora
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saprofita alojada en zonas prximas al meato urinario => anal, perineal, vaginal (sobre todo en mujeres); su presencia en el sedimento, no debe ser tenida en cuenta salvo que vaya acompaada de piuria (aumento de leucocitos). - Levaduras : su presencia en la gran mayora debido por una contaminacin, salvo acompaada de una piuria; en personas diabticas, debido a la glucosuria, parecen facilitar el crecimiento mictico; su identificacin es sencilla, por su forma ovoidea, frecuentemente con presencia de celulas en gemacin; su tamao es ligeramente mayor que los hemates (pueden confundirse); su aumento en la orina se trata de vaginitis causada por Candida albicans. - Parsitos: (1) Protozoos: normalmente se trata de Trichomonas vaginalis (frecuente en sedimentos de mujeres con vaginitis que puede ser asintomtico y mas raro en los de hombres); aspecto piriforme de mayor tamao que los leucocitos y una gran motilidad (por sus flagelos); su identificacin es mas complicada cuando la motilidad esta mermada (al ser de un tamao semejante al de los leucocitos); la piuria que le acompaa puede hacer pensar (errneamente) en una infeccin bacteriana y se descarta esta posibilidad al obtener urocultivos negativos; (2) otros parsitos: su aparicin es siempre el resultado de una contaminacin de la muestra de orina con materia fecal;

Celulas epiteliales : el rbol urinario esta revestido por 3 tipos de epitelio => (1)columnar /tubular /renales /cuboideo (capsula de Bowman, tbulos distal, proximal y colector) (2) transicional o urotelio (pelvis renal, urteres, vejiga y uretra) y (3) escamoso (uretra y vejiga); una escasa descamacin es normal, pero se puede aumentar por causas => microorganismos, productos qumicos, cuerpos extraos, procesos degenerativos, procesos invasivos-destructivos. - Celulas tubulares /renales /cuboideas: son de tamao 1/3 mayores que los leucocitos; su forma normal es redonda con ncleo grande y cntrico; un sedimento normal 0-1/campo; aumentado en pielonefritis y glomerulonefritis.

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- Celulas de transicin (segunda capa de vejiga) : el epitelio transicional espluriestratificado (3 capas => basal, intermedia y superficial); las celulas son de tamao 2-4 veces mayor que leucocitos; su forma es redondeada, piriforme o raqueta con un ncleo pequeo; un sedimento normal 0-2/campo; su aumento exige un estudio citolgico mas completo (p.ej. tincin de Papanicolau), por posibilidad de un carcinoma en cualquier punto entre la pelvis renal y la vejiga.

- Celulas del epitelio escamoso: son planas y tienen abundante citoplasma con nucleo centrico y pequeo; a veces sus bordes aparecen doblados, replegados; un sedimento normal 0-1/campo.

Cilindros : se forma en tbulos colectores y distales; es un resultado de la consolidacin de las protenas en los tbulos de las nefronas; es normal encontrarse algunos (sobre todo hialinos) en el sedimento; se desintegra en la orina a pH alcalino y en presencia de bacterias (con ureasa); la matriz de todos ellos es una muco-protena (Tamm-Horsfall) segregada en la orina; causantes de su formacin => (1) disminucin del pH de la orina, (2) aumento de la densidad o concentracin de solutos, (3) un grado de estancamiento de la orina (disminucin del filtrado glomerular); el lugar de la nefrona en que se forman, determina su tamao y forma => cilindros estrechos (contorneados) proceden de los tbulos distales y cilindros anchos se originan en los tbulos colectores. - Cilindros hialinos: se pueden encontrar en grandes cantidades en orinas normales (deshidratacin y estrs fsico) y tambin en nefropatas; su aparicin en el sedimento no tiene significacin clnica (1-2/campo); para visualizar su escasa refringencia, hay que
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evitar un exceso de iluminacin; normalmente sus contornos se aprecian con suficiente nitidez y uno de sus extremos es romo (un dedo de guante); existe tambin cilindros granulo-hialinos, muy semejante a los hialinos, pero con algunas incrustaciones en su estructura (sin significacin clnica);

- Cilindros granulosos: predomina la estructura granular y desaparece el aspecto hialino;2 tipos => cilindros granulosos finos (semejante a los hialinos en tamao y forma; tienen mayor refringencia debido a la masiva pequeos grnulos de inclusin) y cilindros granulososgruesos (estructura totalmente diferente a los hialinos; son de mayor tamao, aspecto rgido y mayor refringencia; sus borden son contrastados y angulados; en orinanormal 0-1/campo; el aumento de su presencia indica una nefropata.

- Cilindros celulares: la presencia de ellos en la orina nunca es normal; tipos: (1) Epiteliales - la matriz del cilindro engloba celulas epiteliales que se han desprendido de la luz tubular; gran variedad de nefropatas, lesiones del epitelio tubular (debidas adiversos txicos industriales, medicamentos y virus) puede causar la formacin de este cilindros. (2) Hemticos (eritrocitarios) - aparecen en sedimentos con hematuria; es un signo de lesin a nivel del parnquima renal (vasculares o pielonefritis); la cantidad de estos cilindros suele ser escasa y dificulta su localizacin. (3) Leucocitarios - fcil de reconocer porque los leucocitos presentes en su matriz se conservan estables durante el trayecto por los tbulos; su presencia normalmente acompaada por piuria intensa e indica infeccin localizada en el parnquima renal(pielonefritis) o lesiones de tipo inflamatorio (glomerulonefritis aguda). (4) Bacterianos - se parecen a los granulosos toscos; generalmente unidos a piuria y muy probablemente se trate de una pielonefritis.

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- Cilindros grasos: cilindros granulosos o celulares con pequeas inclusiones lipdico (gotitas de grasa); muy refringentes y tonalidad amarillenta donde se localizan dichas inclusiones; indica una nefropata todava no manifestada.

- Cilindros creos: son muy refringentes, rgidos, de apariencia dura, superficie rugosa y brillante (como la cera de las velas), los extremos angulados y generalmente de gran tamao; su presencia es un sntoma claro de una alteracin renal importante; suelen estar inmersos en una cilindruria (presencia de la mayora de los diversos tipos de cilindros).

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Estructuras no organizadas Cristales: en general son productos finales del metabolismo que adoptan formas cristalinas segn la condiciones fsico-qumicas de la orina (la pH sobretodo, densidad, temperatura, etc.) y se excretan a nivel urinario; se diferencian en 3 grupos: (1) Cristales endognos normales - no corresponden a alteraciones metablicas ni funcionales, muy frecuente en el sedimento y pueden aparecer en orinas recin emitidas. (2) Cristales endognos patolgicos - reflejan trastornos metablicos o afectacin grave de algn rgano o sistema y muy raras veces aparecen en orina. (3) Cristales exgenos aparecen en la orina tras la introduccin en el organismo (va enteral o parenteral) diversas sustancias (contrastes radiolgicos/ contraste radiopaco va endovenosa y medicamentos p.ej. sulfonamidas, etc.)

- Cristales de acido rico: en orinas cidas; son birrefringentes; de formas variadas (p.ej. agujas); color entre marrn rojizo, el amarillo e incluso incoloros; indica una situacin patolgica o concentraciones elevadas de acido rico; un sedimento normal 02/campo.

- Cristales de oxalato clcico mono-hidrato y di hidratado: en orinas cidas y ligeramente neutras; menos frecuente; de forma prismas incoloros -casi nunca aislados-unidos por un punto intermedio (pesas de gimnasia), la mas frecuente es de forma sobre; tambin los hay

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de forma redondeados, finamente estriados, incoloros y con una depresin central (radios de bicicleta); un sedimento normal 0-2/campo.

- Uratos amorfos: en orinas cidas; se presentan como un precipitado amorfo, coloreado debido a la presencia de pigmentos urinarios de color amarillo-naranja (color ladrillo); no tiene mucha importancia clnica.

- Cistina: en orinas cidas; tiene significacin clnica por si solos => aparecen comoconsecuencia de cistinuria; aspecto incoloro con forma de placas hexagonales, regulares finasy transparentes; es imprescindible una vez observados en el sedimento, confirmar la concentracin de cistina en la orina.

- Leucina y tirosina: en orinas cidas; raramente se observan; son productos finales del metabolismo proteico y suelen aparecer juntos en situaciones clnicas graves=> destruccin o necrosis tisular importante, fundamentalmente de tejido heptico (hepatitis, cirrosis, etc.); los cristales de tirosina forman manojos de agujas finas y los de leucina son como grnulos esfricos de estras radiales y concntricas, de aspecto oleoso o graso y muy refringentes; ambas son de color amarillo o marrn.

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- Cristales de bilirrubina: en orinas cidas; de pacientes con bilirrubinemia (bilirrubina alta en sangre); de forma agujas con color marrn-rojizo (flecha verde).

- Uratos amoniacos: en orinas muy alcalinas; de color amarillo/marrn muy intensa; predomina la forma esfrica de distinto tamao; no tienen mucha importancia clnica, peropueden estar asociados a infecciones del tracto urinario, por bacterias con ureasa+.

- Carbonato clcico: en orinas alcalinas o neutras; no es frecuente y no tiene mucha importancia clnica (procedencia de ingesta vegetales); de forma amorfo o granular, en ocasiones como pequeos lazos y raramente como pequeas esferas incoloras;

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- Fosfato clcico (hipurato clcico): en orina alcalina o neutra; no es frecuente; de forma prismas largos y afilados (agujas), en ocasiones se agrupan formando rosetas o estrellas, tambin como placas granulares, amorfas e incoloras (similares a acido rico); no tiene mucha importancia clnica, pero puede ser ligada a hipertrofia de prstata o algunas infecciones urinarias crnicas; clculos urinarios contienen fosfato clcico.

- Fosfato triple (amnico-magnesico-clcico): frecuente en orinas alcalinas o neutras; de forma tapa de atad, aunque tambin puede verse como octaedros (muy variable); no tiene mucha importancia clnica.

- Cristales de creatina : raramente encontrados en orinas de adultas, pero es frecuente en orinas de nios y nias antes de la pubertad; es un metabolito de la degradacin endgena del tejido muscular (su aumento => distrofias musculares, poliomielitis, etc.); de forma pseudo-hexagonal caracterstica. - Fosfato amorfo: en orinas alcalinas; de semejante forma a uratos amorfos, pero de color blanquecino.

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Informe del sedimento urinario 1. debe preceder por el estudio de "anormales" en orina (tiras reactivas => pH, densidad y caractersticas patolgicas) 2. deben observarse al microscopio optico (40x) al menos 10 campos. 3. debe proporcionar una visin del valor medio de cada elemento o estructura, obtenido en todos los campos observados. 4. debe ser "escueto" y "conciso" (solo hay que poner lo verdaderamente importante) 5. debe seguirse un orden => hay que informar primero el examen realizado de citolgico, segundo el de qumico y por ultimo el de microbiolgico. Examen citolgico: - celulas hematolgicas => se redactan con nmeros y abreviaturas (p.ej. 6-8 L/C = no.leucocitos por campo); se informa si existe piuria y hematuria y si se forma acmulos. - celulas epiteliales => se redactan con adjetivos: escasas (algunas 1-3) - moderada (3-4) abundante (6-8) - intensa (muy abundante 10-12); las importantes son las renales y las de transicin; las celulas escamosas (de las vas bajas), se informan cuando son abundantes. - cilindros: se redactan al igual que las celulas; es importante identificarlos e indicar en el informe el tipo de cilindro. Examen qumico (en un sedimento de orina normales, es frecuente no incluirlos en el informe): - cristales => se redactan con adjetivos; cuando son muy abundante, se habla de "diatesis". - compuestos amorfos => se redactan con adjetivos Examen microbiolgico: - bacterias => se redactan con adjetivos; es necesario especificar el tipo de m.o. y su movilidad - levaduras => se informa con adjetivos. Examen microbiolgico de una muestra de orina - en condiciones normales carecen totalmente de flora bacteriana; la infeccin del tracto urinario es frecuente y la mayora de m.o. patgenos proceden de la flora intestina => Bacilos Gram- (E.coli, Proteus spp, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae); Cocos Gram+ (Streptococcus grupo D y Staphylococcus); Levaduras (Candida spp.); la toma de muestra debe ser obtenida en condiciones aspticas en un recipiente estril, evitando en todo momento la contaminacin;
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el

paciente

debe

ser

instruido

de

la

forma

mas

adecuada.

Anlisis de microbiolgico (urinocultivo) 1. Preparacin de un "inoculo" 2. Sembrar en medio Cled (la ausencia de electrolitos, impide la invasin por proteus);McConkey (un medio selectivo y diferencia para m.o. Gram-); agar Cetrimide (eficaz para la bsqueda de pseudomonas) 3. Incubar a la temperatura optima de crecimiento de los m.o. buscados (generalmente a 37C) 4. Realizar el recuento tras la incubacin (presumible-mente han crecido los causantes de la infeccin) => menos de 10.000 mo/ml de orina es negativo; mas de 100.000 mo/ml hay infeccin urinaria; entre 10.000 y 100.000 mo/ml el diagnostico es incierto; puede haberse infeccin no detectada por causas => un tratamiento ATB instaurado, una obstruccin a nivel de las vas renales o la muestra recogida por una puncin suprapbica (sin pasar por la uretra, donde esta la infeccin). 5. Una vez determinada la infeccin, hay que resembrar en medios selectivos, para proceder la identificacin (tipacin) del germen causal de la misma.

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Tema 17 - Cocos aerobios y anaerobios facultativos (patologa e identificacin)


Gram+ => Micrococaceae (Staphylococcus - Micrococcus Planococus); Streptocococeae (Streptococcus Pediococcus Aerococcus);Peptococaceae Gram- => Neisseriaceae (Neisseria Branhamella Stomatococcus Gemella -

Moraxella)

Staphylococcus => cocos Gram+ inmviles, aerobios y anaerobios facultativos, tamao +/1 um; en forma de racimos, catalasa+, gelatinasa+, nitratasa+, fermentadores de muchas azucares (via EMP); no capsulados y resiste al calor; crecen en medios generales y medios con alto contenido de NaCl (halfilo); resistentes a agentes externos, distribuidas ampliamente en la naturaleza, flora normal de las mucosas y la piel, causante de la intoxicaciones alimentarias, heridas, etc. Especies importantes (existe >25 especies y varios sub-especies/ cepas) (1) S. aureus (saprofito de >40% de fosas nasales y 10% de vaginas) => estafilococo dorado (pigmento amarillo); coagulasa+; fermenta el manitol; sensible a la novobiacina. - 30 Ags (propiedades antifagocitarias y producen estructuras pigenas/ caractersticas en las lesiones: polisacrido A es el mas importantes - inducen la formacion de Acs; protena A - un potente agente antignico) => se subdividen en tipos segn sus
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caracteres antignicos; - Produce toxinas (hemolisinas - lisan eritrocitos y leucocitos; t.exfoliativa/ exotoxina causa eritemas en la piel; leucopidinas - destruyen pmn y macrfagos; enterotoxina - anula la accin del jugo gstrico y acta en el centro del vomito, nauseas y diarreas); - Fermentos/enzimas (coagulasas - activa la protrombina; fibrinolisinas o estafiloquinasasactivador del plasmingeno; penicilinasas o beta-lactamasa - romper el anillo b-lactamico de las penicilinas creando resistencia); - Hemolisinas alfa provoca hemlisis beta en AS; hemolisina beta provoca hemlisis alfa en AS; - Enterotoxinas tipo A, B (causan intoxicaciones alimentaria) y D causa enterocolitis; La accin patogena directa => procesos inflamatorios, forunculos, supurativos y de necrosacin (en heridas y quemaduras); indirecta => afecta al tubo digestivo por la enterotoxina (gastroenteritis con nauseas, vmitos y diarreas, duracin 1-2 das, se trata con sueros orales o anti-diarreicos); la bacteria no llega al intestino (solo su toxina), por eso no se encuentra en las heces; crece muy bien con la temperatura veraniega y en las cremas; infeccin generalizada (septicemia) => formacin de cogulos o trombos intravenosos, artritis, pleuritis, endocarditis, osteomielitis o meningitis en los debilitados (periodo de incubacin 1-6 horas).

(2) S.epidermidis y (3) S.saprophyticus son estafilococos oportunistas; distribuidas en el medio ambiente, la piel y mucosas; son patgenas en debilidad; S.saprophyticus puede tener pigmento dorado y puede fermentar Manitol; S.epidermidis sensible a la novobiocina (lo que le diferencia a S.saprophyticus). Aislamiento de los estafilococos: - Muestra procede de las heces => medios selectivos Chapman, ricos en NaCl(carcter halfilo), contiene manitol (diferencia S. aureus del resto de Staphylococcus); Otros tipos de muestras => medio AS (observar caractersticas de las colonias color, hemlisis, etc). Pruebas bioqumicas : - Los estafilococos degradan muchas azucares (glucosa, sacarosa, fructosa, manosa, etc.); produce gelatinasa+, catalasa+, nitratasa+, crecen muy bien a 37C, hemolisina alfa y beta, coagulasa+ (S.aureus). Diagnstico bacteriolgico: - Toma muestra con torunda estril o por puncin segn los casos en total asepsia; tincin Gram; aislamiento en medio Chapman/manitol salado y AS, tras la incubacin observar las colonias; pruebas bioqumicas - coagulasa (S.aureus), fermentacin de glucosa, catalasa, gelatinasa, hemolisinas alfa y beta (cepas patgenas),
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fibrinolisinas, fermentacin del manitol (S.aureus); estudio de la sensibilidad a la novobiocina(diferenciar S.epidermidis de S.saprophyticus) - Diferenciacion del genero Staphylococcus y Micrococcus (en principio no es patogeno) => Staphylococcus sensible a bacitracina y eritromicina; Micrococcus a veces pueden daroxidasa+. - Estafilococos coagulasa- es un grupo heterogneo (+ importante son S.epidermidis yS.saprophyticus) 80% en el pasado no causan infecciones importantes, pero cada vez esta tomando mas importancia; ademas muestra resistencia a varios ATB alternativa de penicilina (meticilina y cloxacilina); pueden producir infecciones urinarias, bacteriemias (por la implantacin de cateteres i.v.) y endocarditis.

Streptococcus => cocos Gram+, tamao pequeo, capsulados, anaerobios facultativos, se agrupan en cadenas, fermentador de glucosa, son saprofitos, oportunistas y algunos patgenos; poseen Ags (polisacrido C - segn sus caractersticas, se clasifican engrupos A-V de Lancefield; protena M antifagocitarias, la posee el grupo A) Clasificacion A. segn el tipo de hemolisis (capacidad de romper hemates - produce hemlisis alrededor de sus colonias en AS) => gamma hemoltico, alfa hemolticos/ hemlisis parcial (decoloracin parda verdosa S.viridans);beta hemolticos/ hemlisis total (halos de transparencia grandes entorno a su colonia) -grupos A, B, C, D (enterococo) G y F; estreptococo NO Beta-hemolticos - grupo D, S.viridansy S.pneumoniae (alfa y gamma) B. segn sus caracteres bioqumicos (sensibilidad a bacitracina, optoquina, tolerancia a NaCl, degradacin de bilis esculina y factor CAMP): Sensible a bacitracina (grupo A) Crecimiento en NaCl 6,5% (grupo D enterococos) - Factor CAMP => potenciar la accin hemoltica de S.aureus (lo produce grupo B) - Pruebas de bilis esculina - hidrolisan este compuesto (grupo D enterococos) Sensible a optoquina (S.pneumoniae /neumococo) - Hidrlisis de hipurato sdico (grupo B) C. segn los caracteres antignicos (a traves de reacciones serologcas especificas => aglutinacin, precipitacin, inmunofluorescencia, etc.) => los Ags en la pared celular (pptido glicano - toxica y facilita la unin de ellos a las clulas epiteliales invadidas; polisacrido C - distintas caractersticas que confiere la agrupacin de los estreptococos (grupos de Lancefield); - Grupo A (la + importantes) => la mayora son Beta-hemolticos y patogenos al hombre; protena M se presenta como pelos en el permetro de la pared celular (anti96/168

fagocitaras). - En las capsulas del grupos A y C se encuentra enzima hialuronidasa(caractersticas antifagocitaras) Accin patgena e Inters clnico: (1) Streptococcus del grupo A (S.pyogenes) => causan 90% de las infecciones estreptoccicas; muy sensibles a los agentes externos; son floras de la mucosa nasal y farngea; poseen polisacrido C (proporciona la especificidad de grupo) y protena M(facilita la adherencia a las clulas invadidas y proteccin a la fagocitosis); son Beta-hemolticas, sensibles a la bacitracina y variable a optoquina - Poseen hemolisinas estreptoccicas/ estreptolisinas (O y S); estreptolisina S(poco antignico) => holoprotena toxica responsable de hemlisis en medio AS;estreptolisina O (muy antignico) => hetero-protena exotxica muy activa de efecto hemoltico frente a glbulos rojos y leucocitos (pmn y macrfagos => alterando la estructura celular); induce a la formacin de Acs ASLO. - Produce toxina eritrognica responsable del exantema de la fiebre escarlatina; - Enzimas estreptoquinasas (activador de plasmingeno => plasmina en fibrinolisis); induce a la formacin Acs; se utiliza en el hospital en procesos trombo-gnicos. - Enzima desoxirribonucleasa estreptoccica (despolimeriza ADN); son antignicas y se distingue en 4 grupos (A-B-C-D). - Enzima Hialuronidasa (hidroliza el acido hialurnico del tejido conjuntivo); facilita su invasin. - Proteinasa estreptoccica (origina procesos inflamatorios y necrosacin) Patogenicidad de S.pyogenes (grupo A) => Infecciones en la piel o mucosas (+frecuentes anginas/faringitis sobre todo a nios/contacto directo, otitis y sinusitis) 95% de infecciones naso-faringeas son producidas por estreptococos del grupo A; infecciones NO supuradas/ inmunolgica => fiebres reumticas (complicaciones de tto no adecuados), glomerulonefritis, endocarditis, meningitis, sepsis.

(2) Streptococcus del grupo B (S.agalactiae) => saprofito del hombre en rino-faringe, urogenital, vaginal e intestinal; produce infecciones oportunistas; hipurato+(degrada el hipurato sdico) es lo que le diferencia del grupo A; posee factor CAMP (potenciar la accin hemoltica de S.aureus); puede origina meningitis e infecciones pulmonares en el neonato, infecciones del tracto respiratorio, mucosas, piel, etc; son Beta-hemoliticos, resistente a la bacitracina;

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(3) Streptococcus del grupo C => es el mas proximo al grupo A; sonBeta hemolticos (tambin alfa y gamma) y muy sensible a los agentes externos; resistente a la bacitracina; crecen en medios salinos (NaCl 6,5%); posee enzima hialuronidasa; saprofito del hombre en la rinofaringe; puede producir mastitis en vacas, muermo en caballos y sepsis ??? en el hombre. (4) Streptococcus del grupo D => son alfa, beta y gamma hemolticos; resistentes a agentes externos y ATB; - los enterococos => S.faecalis y S.faecium; son saprofitos del intestino del hombre; crecen bien en NaCl 6,5% (a diferencia de los NO enterococos); hidrolizan la bilis esculina; son alfa-beta-gamma hemolticos; resistente a la bacitracina; puede producir infeccin urinaria e herida. - los No enterococos => S.bovis, S.equinus y S.anginosos (afecta vacas y caballos);hidrolizan la bilis esculina; resistente a la bacitracina; (5) Streptococcus del grupo G, F y E => saprofitos de la rinofaringe, vias genitales e intestino en el hombre; pueden producir infecciones en vias urinarias, heridas; resistente a la bacitracina; son alfa y beta-hemolticos; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%) (6) Streptococcus Alfa hemoliticos (S.viridans) => no son capsulados; producen alfa y gamma hemolisis; saprofitos de la orofaringe, mucosa bucal, placa dental (caries); resistente a la optoquina; (7) Streptococcus pneumoniae (neumococo) => es un grupo a parte; diplococos, Gram+ y son capsulados; muy sensibles a medios externos; son alfa y gamma hemolticos;sensibles a optoquina; crecen variable en medios salinos (NaCl 6,5%); saprofito en aparato respiratorio; puede producir neumonias, inflamaciones sinusitis, otitis y meningitis (mas frecuente en adultos);

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Aislamiento: - toma de muestra con total asepsia de la rino-faringe con hisopo estril, una muestra del pus (si hubiera); se analiza de inmediato (estreptococos son sensibles a medios externos); - un frotis para la tincin de Gram; si se sospecha S.pneumoniae se realiza una tincin negativa con tinta china y prueba de "Quellung" (determinar Ags de la capsula); se produce una reaccin de Quellung cuando un Acs tipo especfico se une al polisacrido capsular del neumococo y causa un cambio en el ndice refractivo de la cpsula hacindola aparecer hinchada y ms visible. - la siembra en AS-CNA (posibles hemlisis - estreptococos son resistentes a nalidixico que inhibe el crecimiento de otros grmenes); realizar hemocultivos si se sospecha endocarditis o sepsis; las colonias son grisaceos, redondos de bordes lisos y pequeos; medios selectivo y diferencial con NaCl 6,5% => permite el crecimiento de enterococos del grupo D. Pruebas bioqumicas : - pruebas de catalasa-, hemolisis en AS, sensibilidad o no de optoquina y bacitracina; hidrolisis de hipurato (positivo en el grupo B), utilizacin de bilis esculina. identificar los grupos antignicos segn el tipo de sustancia polisacrido C (clasificacin de Lancefield) por metodo serolgicos => prueba de ltex (romper la capsula para sacar la sustancia; reaccin inmuno-complejo Ag-Ac). - los Gram+ en general son sensibles a la vancomicina excepto algunos cocos Gram+, catalasa- que no son estreptococos (Pediococcus es resistente a la vancomicina). Pruebas serologcas / inmunologicas : - la bsqueda en el suero (dilucin seriadas) del paciente de Acs frente a toxinas y enzimas de estreptococos (sobre todo grupo A) => ttulos de Acs antiestreptolisinas O (ASLO); para saber si la infeccin es aguda o creciendo; en caso de fiebres reumticas con ttulos de ASLO negativos, se determinan los ttulos de Acs antiestreptoquinasas (ASK), antihialuronidasas(ASH); pruebas de hinchamiento capsular con suero antineumococico polivalente (prueba de Quellung) muy utilizado para determinar S.pneumonia => se aaden Acs contra Ags capsulados, si hay aglutinacin es signo de que esta estreptococo. Neisseria => cocos Gram-; en forma de diplococos (granos de caf), aerobios; son saprofitos de mucosas (genitales, faringe, fosas nasales) y cavidades del hombre y los animales;citocromo-oxidasa y catalasa+; utilizan azucares con metabolismo oxidativa y fermentativa; producen pigmentos carotenoides; nutricional-mente exigentes; sensibles a medios externos. Especies mas importantes - 4 gneros => Neisseria, Branhamella (B.catharralis), Acinetobacter y Moraxella. (1) Neisseria meningitidis (meningococo) => es una especie patgena para el hombre; son parsitos obligados del hombre (no se encuentran libre en la naturaleza); es difcil de
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cultivar si hay competicin (acompaadas por otros grmenes); son capsulados; utiliza glucosa y maltosa; posee fimbrias (facilita su adherencia) y capsulas (contiene polisacridos con comportamientos serolgicos diferentes A,B,C, etc.); crecen a 35-37C; son muy sensibles a medios externos; producen meningitis epidmico (contagio por gotas de flugge en contacto ntimos); otros causantes de meningitis => Haemophyllus influenzae, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Pseudomona aeroginosa, Micobacteria, Neisseria meningitidis, Cryptococcus neoformans y otros. (2) Neisseria gonorrhoeae (gonococo) => idnticas caractersticas que meningococo; utiliza glucosa como fuente de carbono; requieren medios enriquecidos con CO2 510% para potenciar su crecimiento a 35-37C; son muy sensibles a medios externos y son parsitos estrictos del hombre y produce gonorrea (no se encuentra libre en la naturaleza); (3) Neisseria saprofitas => saprofitos de la rino-faringe y genitales; son poco exigentes y crecen a 22-35C en medios generales; resistentes a medios externos y no son patgenos para el hombre. Accin patgena e inters clnico Neisseria meningitidis (meningococo) => diplococos /granos de caf; coloniza las mucosas y vas respiratorias (sobre todo superiores); 5-30% son portadores sanos en rino-farngeo; afectan a nios de 6 meses hasta 5 aos (causas mas importantes de mortalidad infantil); tambin afectan nios mayores y adultos jvenes de 6 hasta 25 aos;estructura antignica => componentes de su capsula (polisacrido), las fimbrias (facilitar la adherencia y la invasin) y protenas de la membrana (toxica sobre las celulas invadidas); Cuadro clnico - comienza con una rino-faringitis de sintomatologa leve (sobre todo en nios - en adultos se forman Acs anti meningococo) evoluciona a forma severa, se complica con bronquitis; si el meningococo pasa a la sangre, originara micro-focos en la piel conerupciones petequiales (1-2mm) en el tronco e extremidades inferiores, cefaleas, fiebres altas, artralgias; puede pasar a LCR con fiebres muy altas, cefaleas fuertes, rigidez de nuca, vmitos, diarreas, etc.; se agravan hasta la muerte sin tto efectivo y rpido; el examenLCR es turbio, purulento con abundantes meningococos (debido a acumulacin de pmn con meningococo dentro (celulas CLUE); tto con penicilina (G) - el tto del portador es rifampicina.

Neisseria gonorrhoea (gonococo) => idnticas caractersticas que el meningococo; su afinidad particular es sobre las mucosas uro-genitales, con fimbrias (adherencia a las celulas epiteliales dificultando la fagocitosis); posee endo-toxina que inactiva Acs prximos; produce gonorrea en hombres y mujeres (ETS); Cuadro clnico - tras un contacto sexual, los gonococos se adhieren a la superficie de la mucosa gracias a las fimbrias y protenas de la membrana; posteriormente se penetran a
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tejidos sub-epiteliales y empiezan a multiplicarse, liberando endo-toxina con efecto toxico a la uretra, cuello del tero, ano (donde colonicen), produce la destruccin de celulas del epitelio y supuracin (secrecin purulenta) y dolor a la miccin; en las mujeres puede ir acompaada por uretritis, vaginitis y 20% salpingitis de las trompas (produce esterilidad en mujeres); 50% de los casos son asintomticos con lo que la ausencia de tratamiento conduce a la cronificacin; puede provocar bacterimia dando artritis supurativos; tto => penicilina o sus derivados; en neonatos provoca gonococia ocular que conduce a la ceguera - se previene instilando gotas de nitrato de plata - mtodo de "Crede" y (contra Chlamydia es mas efectivo) eritromicina???

Aislamiento caracteres bioqumicos diagnostico N.meningitidis - toma de muestra de LCR (puncin lumbar), sangre y/o exudado faringeo; se deben examinar de lo antes posible (sensibilidad al medio externo); se transporta en un medio de Thayer-Martin modificado a 37C (en caliente); si la muestra de LCR es turbio o purulento, se divide en 2-3 tubos; 1er tubo se centrifuga y sobre el sedimento se realizan frotis Gram; 2nd tubo se utiliza para la siembra en AS, agar chocolate, Mueller Hinton y Thayer-Martin; 3er tubo se realiza un hemocultivo y recuento celular; meningococo crecen dando colonias transparentes diminutas y no hemolticas; las placas se incuban a 37C enambiente de CO2 5-10%. - Pruebas bioqumicas => catalasa+, oxidasa+, prueba de la utilizacin de glucosa y maltosa por oxidacin (aerobio), lactosa-, nitratasa-. - Estudios serolgicos => inmunofluorescencia directa del LCR o el suero, contrainmunoelectroforesis y tcnica ELISA. Existe sistema de multi-prueba para Neisseria y Haemophylus. N.gonorrhoeae - toma de muestra a partir de la uretra (hombre), recto en homosexuales y uretra, cuello de tero y recto (mujer), se realizan en el laboratorio (sensibilidad a medio externo), por la maana antes de la primera miccin (al ser posible); se procede de inmediato al estudio directo y la siembra en medios especficos o se transporta en medio TM modificado. - se realiza la tincin (Gram- en forma de granos de caf); en el frotis se ven los pmn con diplococos dentro; la siembra se har en AS, agar chocolate, Thayer-Martin (con factores de crecimiento y ATB vancomicina, anfotericina, colistina y trimetropin que inhibe el crecimiento de otros grmenes); en TM los gonococo son colonias pequeas de color gris y los meningococo son blanquecinas se incuba a 35-37C y atmsfera enriquecida de CO2 5-10%; - Pruebas bioqumicas => utilizacin de azucares por va oxidacin (glucosa+, lactosa, maltosa+ para meningococo, y sacarosa); oxidasa y catalasa son positivos, nitratasa-. - Pruebas serologcas => hemo-aglutinacin, inmunofluorescencia indirecta, ELISA (mas utilizadas) - Sistema de identificacin multiprueba para Neisseria y Haemophylus.

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Neisseria saprofitos (Neisseriaceas) - normalmente son flora de oro-faringe/ naso-faringe; son especies de bajo patogenicidad, aunque a veces implicadas en meningitis y otros; no requieren medios especiales para su crecimiento. - Branhamella catharralis / Moraxella catharralis => hoy en da la clasificacin es confusa (la tendencia - dentro de la familia moraxellacea), otros autores tienden a diferenciarla y la clasifican como familia Branhamellaceae; es Gram-, oxidasa+, catalasa+, nitratasa+ (reducen nitratos a nitritos), no fermentan azucares, crecen bien en medios generales (AS, agar chocolate y Thayer Martin), son aerobias o 5% de CO2; flora normal de naso-faringe, pero a veces se asla como agente causal en septicemias e infecciones otorrinolaringolgicas (sinusitis, otitis). - Acinetobacter => anteriormente clasificada dentro de la familia Gram- no fermentadoras (pero oxidasa- => bacteria inerte) junto con Pseudomonas; actualmente esta incluido dentro de la familia Moraxellaceae; son microorganismos que pueblan fundamentalmente suelos y aguas y presentes en medios hospitalarios (infeccin nosocomial); la especie mas importante => A.calcoaceticus (causan neumonas, infecciones urinarias y sepsis); crecen en Mac, AS y otros; en AS producen colonias grises con halos de hemlisis, oxidasa-, catalasa+, son cocobacilos Gram- (se pueden confundir con Neisserias por su tamao). - Moraxella => coco-bacilo, Gram-, no fermentador, inmvil, oxidasa+, catalasa+, difcil de distinguir con Neisseria; en general los no fermentadores son muy difciles de distinguir y requiere numerosas pruebas bioqumicas para etiquetarlos.

Tema 18 - Entero-bacterias y (patologa e identificacin)

vibrios

Entero-bacterias bacilos o coco-bacilos Gram-, aerobios y anaerobios facultativos, mviles (flagelacin pertrica) o inmviles, fermentadoras de glucosa (con o sin produccin de CO2), oxidasa-, catalasa+; algunos usan metabolismo fermentativo y otros usan metabolismo oxidativo; la mayora son nitratasa+; algunos son sulfuhidratasa+ (Proteus y Salmonella), indol+ (E.coli); son saprofitas/ flora del tracto gastrointestinal del hombre y de los animales; tambin se encuentra en el agua y en el suelo; resistentes a medios externos; son potencialmente patgenos en individuos debilitados y produce infecciones oportunistas; algunos son patgenos siempre donde sea se encuentra, otras depende de la muestra donde se asla y el resto se cuestiona su papel. Caractersticas antignicas: - Ag somtico / Ag O => es lipo-polisacrido, termo-estables, se encuentra en la pared bacteriana, es una endo-toxina (la parte polisacrido es muy antignico y la parte lipdica es inactiva bioqumica-mente).
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- Ag capsular / Ag K => se encuentra en la capsula bacteriana, es polisacrido, es antifagocitaras (relacionado con la virulencia de ciertas especies como E.coli K-1 y Salmonella thyphi). - Ag flagelar /Ag H => es caracterstico de las cepas mviles, es proteico y responsable de la accin patgena de la bacteria. Clasificacin segn su capacidad para fermentar la lactosa: - Fermentadoras rpidas de lactosa (coliformes) => Escherichia, Enterobacter y Klebsiella(tarda a veces) - Fermentadoras lentas de lactosa / ONPG+ (coliformes) => Citrobacter, Serratia, Hafnia, Yersinia (patgeno) y Shigella sonnei. - NO fermentadoras de lactosa (no coliformes) => Salmonella, Shigella, Proteus, Morganella, Providencia y Edwardsiella. Salmonella - entero-bacterias no coliformes, mviles con flagelacin pertrica; bacilos Gram-; en general provocan infecciones entrico febriles (gastroenteritis, entero-colitis o fiebres tifoideas o para-tifoideas). Especies importantes - S.typhi, S.choleraesuis, S.enteritidis, S.paratyphi A,B y C, S.arizonae. Accin patgena e inters clnico - Ag somtico O, Ag flagelar H y Ag capsular VI (en S.typhi - Ag termolbil con poderprotector frente a los cidos /cida gstrica, resistencia y anti-fagocitaras) - endo-toxina y enterotoxina (efecto irritante y citotxico sobre el tracto intestinal) Cuadros clnicos 1. Infecciones entricas (S.typhi - fiebres tifoideas o S.paratyphi A,B o C - paratifoideas); Las fiebres tifoideas son transmitidas al hombre va oral (alimentos crudos, poco hechos, mal conservados y aguas contaminadas), llega al estomago, resiste la acidez gstrica,pasa al intestino delgado (leon), penetra por endocitosis destruyendo parte de las celulas de la mucosa intestinal; una vez dentro las salmonellas son fagocitadas por macrfagos ytransportadas por diferentes vas y provoca bacterimia => todo sucede en el periodo de incubacin (8-15 das); comienzo brusco de signos y sintomas => los macrfagos les transportan hacia el bazo, higado y MO, produciendo multiplicacin de nuevas salmonellas, volver al intestino generando placas ulceradas, necrosacin de placas de Peyer y en casos mas graves originar perforacin y hemorragias. Las fiebres para-tifoideas son mucho mas leve con un periodo de incubacin de entre 7-10 dias con bacterimia y estado febril que dura varias semanas; no hay perforacin intestinal ni hemorragias ni invasin de salmonellas a otros rganos; cuadros clnicos => dolores de cabeza, fiebres altas, anorexia, astenia/ cansancio; preciso un tratamiento que dura 9-10 das. 2. Infecciones gastrointestinales y enterocolitis (S.enteritidis la mas frecuente,S.choleraesuis, S.typhimurium y otras); periodo de incubacin 12-36 horas; se transmite por alimentos contaminados con una concentracin de salmonellas de 10 millones a mil millones/ml, depende de tipo de la cepa; el alimento les facilita su llegada a pasar el estomago y llegar al intestino delgado colonizando el leon y el ciego, se penetran por fagocitosis al epitelio y se multiplican originando una inflamacin que genera cuadros diarreicos con dolor abdominal (perdidas de electrolitos y agua), fiebres altas,

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nauseas, vmitos; re quiere untratamiento de re-hidratacin que dura 6 das - las floras se encargan de eliminarlas.

Aislamiento pruebas bioqumicas diagnostico de Salmonella Salmonelosis => toma muestra de las heces (coprocultivo), anlisis del alimento sospechoso; medios de cultivo SS, McConkey, caldo selenito; pruebas bioqumicas: ONPG, TDA-, Citrato+ (S.cholera-suis y S.enteritidis, tambien son CO2+ y Ornitina descarboxilasa+), SH2+, fermentacion de azucares: Glucosa+, Trehalosa+ (S.typhi yS.enteritidis), etc. Fiebres tifoideas y para-tifoideas => toma muestra de diferentes localizacin segn la fase de enfermedad; en la fase de incubacin se busca en heces (coprocultivos), en orina(urocultivo), sangre (hemocultivo); en la fase inicial de la enfermedad / periodo febril, se realiza hemocultivo; en el periodo posteriores o finales se busca en heces (coprocultivo); medios adecuados; se realiza las pruebas bioqumicas, reacciones de aglutinacin cuantitativa (ttulos) de Ags O, H y VI a traves de sueros especficos monovalentes y polivalentes, especialmente para Ag VI (pruebas inmunolgicas). Mucaptest => prueba inmunolgica utilizando suero polivalente (Acs anti O y anti H), un resultado positivo dara unas colonias fluorescentes (posible Salmonella).

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Shigella - bacilo Gram- inmvil, no fermentador de lactosa (excepto S.sonnei) ; son patgenas para el hombre, provoca afecciones graves y contagiosas sobre el tracto gastrointestinal (disentera bacilar) especialmente en ambientes de salubridad baja. Accin patgena e inters clnico - se debe a la produccin de sustancias toxicas, Ags O y K, plsmidos (facilita la invasin), adhesinas (adherencia a las celulas que invaden),exotoxina con propiedades cito-toxicas (tipo A - origina necrosis celular, ulceras, hemorragias y perforacin), neuro-toxicas y entero-invasivas (tipo B - adherencia a las celulas del epitelio gastrointestinal); al llegar al intestino del hombre va oral (puede resistir el acido gstrico, por la alta cantidad ingerido y tambin protegido por los alimentos), ejerce su accin toxica, pasar al colon originando necrosis con signos y sintomas caractersticas (las toxinas deS.disenteriae no suelen pasar a la sangre); cuadros diarreicos van acompaados dedolor clico, nausea, vmitos, malestar general y fiebres muy altas con deposiciones sanguinolentas con moco y pus. Aislamiento pruebas bioqumicas, diagnostico de Shigella Toma muestras de heces recin emitidas en los primeros das de la enfermedad (hay mayor numero de shigellas), eligiendo restos de moco y sangre si los hubiera; el estudio riguroso(teniendo en cuenta que Shigella se destruye en medios cidos y a temperaturas <4C; medios de cultivos SS, McConkey, Hektoen, Yersinia CIN, Campylosel, TCBS;pruebas bioqumicas TDA, KIA (K/A para Shigella y A/A para S.sonnei), ONPG (positivo para S.sonnei), fresco, ureasa-, VP-, nitratasa+, manitol (positivo para Shigella y negativopara S.disenteriae); pruebas de aglutinacin cuantitativa (titulo) para demostrar Acs en el suero del paciente a traves de sueros especficos mono y polivalentes.

Escherichia - entero-bacterias bacilar o coco-bacilar Gram- mviles, fermentadoras de glucosa y lactosa, produce CO2, aguantan temperaturas altas (la diferencia de otros coliformes), resistente a medios externos, fcil de encontrar en el agua, alimentos (indicativo de contaminacin fecal reciente); saprofito de flora aerobia y
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anaerobia facultativa del tubo digestivo; puede provocar trastornos gastrointestinales de diarrea, infecciones urinarias, meningitis en neonatos y excepcionalmente bacterimia; la especie mas importante para el hombre es E.coli (segn la cepa puede tener Ag somtico O, capsular K y flagelar H, fermentos y endo-toxinas). Accin patgena e inters clnico - los cuadros clnicos son variables segn el tipo de toxina que originen; algunas cepas de E.coli forman Ag O y K anti-fagocitaras y resistencia a bactericidas y ATB (alto poder invasivo); otras cepas forman endo-toxinas, causante de cuadros febriles y diarreicos; otras cepas tienen un mecanismo de accin anlogo al de Shigella con menor gravedad; a veces la entero-toxina que producen es parecida a la deVibrio cholerae que causa perdida masiva de agua y electrolitos. - si la cepa de E.coli forma una entero-toxina citotxica parecida a Shigella => cuadros diarreicos en brotes epidmicos que afectan a nios y lactantes (E.coli entero-patgena) - si forma una entero-toxina semejante a Vibrio cholerae => procesos diarreicos en nios, adultos, originndose espordica-mente brotes epidmicos (diarrea del viajero E.colientero-toxgena) - si forma una entero-toxina citotxica similar a S.disenteriae => procesos diarreicos graves, hemorragico espordicamente en brotes (E.coli entero-hemorragica) - si presenta ciertos plsmidos que incrementan su capacidad de invasin => cuadros diarreicos graves que afectan a nios, adultos con brotes epidmicos en casos aislados (E.colientero-invasiva) Las cepas de E.coli se distingue con sueros antignicos; E.coli tambin puede provocar infecciones urinarias (cistitis, pielonefritis, etc), infecciones biliares, heridas, meninges (meningitis en neonatos). Aislamiento, pruebas bioqumicas diagnostico Toma de muestra representativa de alimento, agua, heces, exudado; frotis de Gram; medios de cultivo Mc, Levine; pruebas bioqumicas => lactosa+, indol+, citrato-, sensible a la Colistina.

Yersinia - entero-bacterias muy patgenas para el hombre (Y.pestis - causante la peste bubnica); son coco-bacilos Gram-, mviles a 25Ccon flagelacin pertrica e inmviles a 37C, fermentadores de glucosa (ONPG variable),capsuladas (Y.pestis) y oxidasa-. Especies mas importantes - Y.pestis (agente etiolgico de la peste bubnica en el hombre) trasmitida a traves de ratas y pulgas, originando enfermedad grave febril, epidmico de alta mortalidad; Y.pseudotuberculosis afecta animales y excepcionalmente al hombre; Y.enterocolitica (sacarosa+ en medio TSI); los 2 ltimos afectan mas a animales que al hombre (nios) => originando estados febriles y diarreicos.
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Accin patgena e inters clnico de Y.pestis => cuadros agudos y febriles con alta inflamacin de los ganglios linfticos, hemorragias internas, petequias difusas en la piel, en ocasiones septicemia y neumnia; es muy contagiosa, se origina en lugares de salubridad baja; la muerte se produce por shock sptico (fracaso multi sistmico) o por neumnia; factores de virulencia : - La toxina murina (liberada al medio cuando muera la bacteria) => protena que bloquea la utilizacin de O2 por parte de las celulas. - Endo-toxinas (liberadas en el transcurso de la enfermedad) => origina el proceso febril - Ag V con propiedades anti-fagocitaras - Coagulasas y fibrinolisinas Y.pestis llega al hombre a traves de la picadura de pulga (infectada por ratas con peste),atraviesa los vasos linfticos, pasa a los ganglios donde se multiplica originando bubones,pasa a la sangre y se disemina por el bazo, higado, pulmones, piel, mucosas, se multiplica provocando lesiones pigenas (toxina murina), hemorrgicas, necrtica y edematosa; en casos graves aparece coagulacion intravascular diseminada (CID) (por la accin de lascoagulasas) o ditesis hemorragica (por la accin de las fibrinolisinas), colapso circulatorio, toxema generalizada y muerte; formas clnicas: 1. Peste bubnica (la mas frecuente); tras el periodo de incubacin de 3-7 das despus de la picadura, aparecen signos y sintomas con escalofros, vmitos, formacin de bubones en las ingles axilas y/o zonas submaxilares (los tejidos circundantes aparecen inflamados); sin tratamiento se agrava hasta la muerte. 2. Peste pulmonar (es la complicacin de peste bubnica); se produce afeccin pulmonar grave con insuficiencia respiratoria, cianosis; es altamente mortal. 3. Peste septicmica es estadios ltimos de la peste en cual quiera de sus formas y es generalmente mortal. Aislamiento pruebas bioqumicas diagnostico Toma de muestra de exudados purulentos del bubn (por aspiracin), de sangre, LCR, tejido pulmonar, ndulos linfticos o esputo, heces, segn los casos; la tincin Gram-, nigrosina (visualizacin de capsulas); medios de cultivo => Mc, Yersinia CIN (colonias muy pequeas); pruebas bioqumicas => mvil a 22C y inmvil a 37C, Lactosa, ONPG+,ureasa+, indol y TDA-, oxidasa-, nitratasa+; a veces Y.pestis y Y.pseudotuberculosis son ONPG variable; Y.enterocolitica es sacarosa+.

Entero-bacterias oportunistas - bacilos Gram- aerobios y anaerobios facultativos, poco exigentes nutricional-mente, ampliamente distribuidos en el medio ambiente; son saprofitos de la flora gastrointestinal, resistente a medios externos y ATB; no son patgenos al no ser si el husped es debilitados, pueden provocar infecciones hospitalario; en la mayora son lactosa+, bacilos Gramcoliformes;
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Principales especies de coliformes/ lactosa+ (Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Klebsiella y Hafnia) y no coliformes /lactosa- (Proteus, Morganella y Providencia). 1. Escherichia => Gram- aerobias y anaerobias facultativas, fermentadoras rpidas de lactosa y glucosa, produce CO2, indol+, citrato-, sensible a Colistina, mviles. 2. Enterobacter => fermentadora rpida de lactosa, produce CO2, produce acetona de la glucosa (VP+), citrato+, mvil, ornitina-descarboxilasa+, son comensales de flora intestinal; puede provocar a individuos debilitados diarreas, infecciones del tracto respiratorio, heridas, etc; especies importantes: E.aerogenes y E.cloacae. 3. Serratia => fermentadora lenta de lactosa (ONPG+) y la glucosa,produce acetona (VP+), mviles, citrato+, ADNasa+, ornitinadescarboxilasa+, saprofitas del hombre y tambin en el medio ambiente (agua y otros lquidos), resistentes a ATB y desinfectantes; provoca infecciones urinarias y sepsis a personas debilitadas. 4. Citrobacter (huelen a peste) => fermentadora lenta de lactosa (ONPG+), mvil, fermenta la glucosa y VP- RM+, citrato+; son comensales del tubo digestivo del hombre y puede provocar infecciones urinaria, respiratoria, sepsis, bacterimias, meningitis a los individuos debilitados; especies importante => C.freundii. 5. Klebsiella => inmviles, fermentadoras tarda de lactosa, utiliza glucosa yproduce acetona (VP+), citrato+, ureasa+; son comensales del tracto gastrointestinal y vas respiratorias superiores; puede provocar neumonas, rinitis, infecciones urinarias; especies importante => K.pneumoniae (sub especies VP+ y VP-) y K.oxytoca (indol+). 6. Hafnia => mviles a 22C y inmviles a 37C, fermentadora lenta de lactosa (ONPG+),citrato+, utiliza glucosa y produce acetona (VP+); provoca infecciones hospitalarias. 7. Proteus, Morganella y Providencia => NO fermentan la lactosa, pero si glucosa y produce CO2, RM+; mviles, TDA+ (diferenciar del resto entero-bacterias), pueblan aguas residuales, el suelo, materia orgnica y son comensales en la flora intestinal del hombre; pueden provocar infecciones hospitalarias; especies importantes: - Proteus mirabilis (indol-, ureasa+, TDA+, SH2+), P.vulgaris (indol+, ureasa+, TDA+) - M.morganii (ureasa+, indol+, TDA+) - Providencia rettgeri (ureasa-, indol+, TDA+) P.mirabilis puede provocar infeccin urinaria, descompone la urea de la orina quegenera precipitacin de sales clcicas => formacin de clculos renales; tambin puede provocar infecciones gastrointestinales, toxinfecciones alimentarias, heridas, etc.

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Accin patgena e inters clnico - si el husped se encuentra debilitado (postoperatorio, tratamiento inmunosupresores) los saprofitos podran ser patgenos; las infecciones mas frecuentes => - tipo urinario (40% de las infecciones hospitalarias - pacientes sondados, encamados, intervencionados quirrgica-mente) provocado por E.coli, P.mirabilis, P.vulgaris, Klebsiella y Enterobacter, provocando cistitis (de las vas bajas) y pielonefritis (de las vas altas); son infecciones agudas con fiebre, dolor lumbar, polaquiuria o anuria y disuria; es frecuente en los anlisis de orina piuria, bacteriuria y proteinuria; - tipo abdominal son poco frecuente => abscesos y peritonitis debido a perforacin intestinal. - tipo respiratorio (20% de las infecciones hospitalarias) afectando vas respiratorias altas, neumonas y bronco-neumonas (pacientes con afecciones crnicas) Aislamiento pruebas bioqumicas diagnostico - Toma de muestra segn las afecciones o procesos patolgicos en condiciones de total asepsia Examen directo (fresco y tincin Gram) - Aislamiento en medios especficos/ selectivos (Hektoen, Mac) que inhiben los Gram+ - Pruebas bioqumicas e inmunolgicas

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Familia Vibrionaceae - Genero Vibrio, Aeromonas y Pleisomonas (los patogenos) Especie mas importante y patgeno del genero Vibrio - V.cholerae => bacilos Gramanaerobios facultativos de morfologa curva (pleomrficos), mviles (flagelacin loftrica), crecen bien en medios generales y pH alcalino (sensibles al medios cidos), oxidasa+ (la diferencia de la enterobacteriaceae), halfilo, catalasa+, afectan al tracto gastrointestinal del hombre; es el agente causal del clera => provoca diarreas graves hasta llegar a la deshidratacin (diarreas masivas), shock hipovolmico, coma y muertepor deshidratacin (puede perder hasta 10-15 lt/da de agua y electrolitos); se diferencia dePseudomonas por la diferencia en el patrn de fermentacion de azucares. Accin patgena e inters clnico: - Ag somtico O (polisacridos) se utiliza para su tipacin - Ag flagelar H (no tiene valor para su tipacin - comn a todas las cepas) - Exotoxina / entero-toxina proteica (el principal efecto patgeno del clera - provoca diarrea masiva) - Adhesina (protena que tiene afinidad por los azucares) que permite adherirse a la pared intestinal Para formar cuadros graves es necesario su penetracin por va oral (agua o alimentos contaminados con el bacilo, p.ej. productos marinos crudos), eludir el medio acido del estomago (sucede cuando se ingieren >100 millones de grmenes - en el caso de epidemias donde se encuentra 1 milln/ ml de agua). Aislamiento caracteres bioqumicos diagnostico - Toma de muestra a partir de las heces diarreicas, vmitos, procedindose de inmediato a su identificacin (sensible a medios externos); medio de transporte Cary-Blair. - Aislamiento en medios de cultivo especficos TCBS que impide el crecimiento de gran
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parte de microorganismos => produce colonias amarillas por la fermentacion de la sacarosa sobre el medio verde y tambin se siembre en el Mc. - Pruebas bioqumicas => oxidasa+, catalasa+, sacarosa+ (produce un tipo de acido dbiles que no bajara mucho el pH) Pruebas serologcas para determinar el titulo de Acs. Aeromonas - bacilo Gram- no fermentadoras de la misma familia; el especie mas importante Aeromonas hydrophila; catalasa+ y oxidasa+, VP+, lactosa-, ureasa-, indol+, SH2-, mviles; no son halfilo (a diferencia de Vibrio) implicadas en procesos diarreicos. Plesiomonas - tiene las mismas caractersticas bioqumicas que Aeromonas (excepto en pruebas de VP y ornitina descarboxilasa); el especie mas importante Plesiomonas shigelloides(se propone a incluirla a la familia enterobacterias); hay que hacer API para distinguirla de Aeromonas (Plesiomonas ornitina descarboxilasa+)

Tema 19 - Bacilos y cocobacilos aerobios y anaerobios facultativos (patologa e identificacin)


Pseudomonas - bacilos pequeo (coco-bacilo) Gram-, mviles (flagelacin), en generalaerobios estrictos, catalasa y citocromo oxidasa positivos, en generalmetabolismo glucdico oxidativo; ampliamente distribuidos en el agua y suelo, pasando de aqu a los animales y al hombre; son oportunistas en el ambiente hospitalario (pacientes inmunodeprimidos), en ocasiones resultan muy graves (resistente a muchos ATB hay que combinar varios). Los especies mas importantes : - P. aeroginosa => presenta pigmentos fluorescentes, saprofita en la piel, tubo digestivo??, puede provocar cuadros graves en individuos debilitados y es mortal si se produjese septicemia; - P. maltophilia (ahora se llama Stenotrophomonas maltophilia) se llama as, porqueoxida maltosa (no oxida la glucosa); cogen cada vez mas importancia; oxidasa variable. Accin patgena e inters clnico - Pseudomonas aeroginosa - Ag somtico O (polisacridos), Ag flagelar H (proteico), Ag mucoide M (produce exotoxinas => enterotoxina responsables de cuadros diarreicos y toxina eritrodrmica). 111/168

Sustancia => (1) piocina (pigmento azulado de accin bactericida), (2) fluoresceina(pigmen to verde amarillo) y (3) pigmento melnico (tie de color marrn los cultivos). - Cuadros graves o muy graves (de carcter oportunista) => sinusitis crnicas, infecciones del aparato respiratorio (neumonas, faringitis, bronco-neumonas); puede producir endocarditis en drogadictos y paciente con SIDA; enterocolitis, pielonefritis y meningitis en neonatos; en grandes quemaduras, agravando la lesin o provoca infeccin de heridas quirrgicas; en casos mas graves puede originar bacterimia (quemaduras graves). Aislamiento caracteres bioqumicos diagnstico bacteriolgico - Toma de muestra de cualquier producto patolgico, especialmente de carcter purulento en total asepsia. - Examen directo (tincin Gram); si el pus es azulado se sospechara de P.aeroginosa. - Aislamiento en medios generales (el bacilo piocinico es fcil de cultivar) a temperatura 37C; es importante estudiar la presencia de pigmentos que se difunden en el medio; lapiocianina es un pigmento responsable de la coloracin azul verdosa que puede adquirir el medio y el olor a jabn de las colonias son las caractersticas de P.aeroginosa. - Pruebas bioqumicas de citocromo oxidasa+, catalasa+, gelatinasa+, utilizacin de la glucosa va oxidativa (aerobio). - Pruebas serologcas para buscar Acs anti Pseudomonas.

Brucella - bacilos pequeos (coco-bacilos) Gram- inmviles, aerobios estrictos, algunas crecen mejor en atmsferas ricas en CO2 (5-10%), su crecimiento es lento, catalasa+, oxidasa+, nitratasa+, ureasa+, sensibles a medios cidos y se destruyen fcilmente a temperatura de pasteurizacin. Especies mas importantes (en funcin del husped en el que anidan): - Brucella melitensis afecta a cabras y ovejas; afecta al hombre a traves de sus leches no esterilizada, quesos frescos, carne cruda o poco hecha. - Brucella abortus afecta a bvidos (la mayora de los casos de brucelosis en Espaa - en menor proporcin B.melitensis)
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Accin patgena e inters clnico - depende de su estructura antignica; Brucella es capaz de mantenerse latente en el interior de la celulas que la han fagocitado y posteriormente, empezar a multiplicarse con la consiguiente produccin de endo-toxina;penetran en el hombre a traves de heridas y va digestiva (alimentos procedentes de animales infectados (leche no esterilizada, quesos frescos, carne cruda o poco hecha); posteriormente,pasaran a los ganglios linfticos, donde sern fagocitadas por neutrfilos (en la sangre) y macrfagos (en los tejidos) y se distribuyen por todo el organismo, volver a pasar al torrente circulatorio originando bacterimia (brucelosis aguda o fiebres de Malta); se caracteriza por artralgias difusas (dolores de articulaciones), sudoracin abundante, esplenomegalia y otras distintas formas clnicas dependientes de la localizacin de Brucella (orquitis, neumnia brucelar, etc); las fiebres son ondulantes con tendencia a las recidivas(frecuente entre los 3 y 6 meses subsiguientes a la infeccin por Brucella);

Bordetella - bacilos o coco-bacilos Gram- aerobios estrictos, inmviles (algunas son mviles), capsulados; son parsitos estrictos (no se encuentran libres en la naturaleza); se transmite por las gotitas de flugge o contacto directo. Especies mas importantes: - Bordetella pertussis (bacilo Bordet y Gengou) => la mas patgena y es elagente etiolgico de la tosferina - B.parapertussis => aislada en casos benignos de tosferina y no es estrictamente patgena - B.bronchiseptica => afecta mas a animales que al hombre; aislada en el hombre excepcionalmente en casos benignos de tosferina. Accin patgena e inters clnico (Bordetella pertussis) - se infectan a traves de gotitas (flugge) que se producen al hablar; tras periodo de incubacin de 1-2 semanas, empiezan a multiplicarse en la superficie de las celulas epiteliales ciliadas de la traquea, bronquios y bronquiolos, originando inflamacin en estas zonas, paralizacin de sus cilios y consiguiente necrosacin; presenta una fuerte accin tusgena (tos seca) que puede llegar a agotar debido a la accin de la toxina proteica y incremento de las mucosidades queobstruyen los bronquios (bronco-constriccin) lo que facilita un dficit en la ventilacin pulmonar; puede originar cianosis, taquicardia y vmitos alimenticios; es altamente contagiosa, pero ya existe vacunas de la tosferina.

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Haemophilus bacilos muy pequeos Gram- aerobios y anaerobios facultativos, inmviles y patgenos para el hombre y muchos animales; sensibles a medios externos, desecacin, el calor y muchos antispticos; necesita medio de cultivo especifico con sangre como AS o agar chocolate (contiene factores X/hemina o ferroprotoporfirina y factor V/NAD o nicotinamida-adenina-dinucleotido necesarios para el proceso de respiracin). Especies mas importantes (clasificadas en funcin de los factores que necesitan): - Haemophilus influenzae (bacilo de Pfeiffer) es el agente etiolgico de 10-15% de lasmeningitis en nios de corte edad en Espaa y de neumonas en ancianos; requiere ambosfactores V y X. - H.parainfluenzae es agente causales en ciertas meningitis, afecciones respiratorias y septicemias; tambin son saprofitos en fosas nasales y boca; requiere solo factor V. - H.ducreyi es agente etiolgico del chancro blando (enfermedad venrea /ETS); requiere solo factor X. Accin patgena e inters clnico (Haemophilus influenzae): - Es capsulada (su capsula esta formada por polisacridos distintos de A-F) en Espaa es mas frecuente la del tipo B. - Posee endo-toxina que es responsable de lesiones en la traquea y bronquios en procesos neumnicos - Suelen afectar a las vas respiratorias originando neumonas, bronquitis aguda en ancianos y adultos debilitados. - Puede producir meningitis en nios de corta edad; se transmite por va area y mas frecuente en invierno y primavera; comienza como infeccin de las vas respiratorias altas yposteriormente se extiende via sangre hasta el sistema nervioso produciendo meningitis purulenta con mortalidad alta sin tratamiento a tiempo. - Existe vacuna para H.influenzae tipo B. Aislamiento caracteres bioqumicos diagnostico de Haemophilus: - Toma de muestra a partir del exudado farngeo, esputo o lquidos purulentos (en caso de infeccin de vas respiratorias), LCR por puncin lumbar (en caso de sospecharmeningitis). Examen directo (tincin Gram, tincin negativa) - Se cultiva en agar chocolate o AS de conejo/caballo, se aaden discos que contengan factores V y X, ATB como la bacitracina que inhibe a otros grmenes; se formaran satelitismo segn sus necesidades de los factores; incubar en la atmsfera rica en CO2. - Pruebas bioqumicas => indol+, ureasa+, nitratasa+, oxidasa variable (segn la cepa),fermentacion de glucosa positiva, ONPG-.

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- Tcnicas inmunolgicas => determinar el Ags capsular (se realizan por la urgencia del diagnostico)

Legionella - la especie mas importante para el ser humano, es Legionella pneumophila(el agente etiolgico de la legionelosis / neumnia atpica por Legionella); un coco-bacilo o bacilo Gram-, aerobio estricto, requiere medios muy especficos para crecer (agar legionella),catalasa+, oxidasa+, en ocasiones puede presentarse de forma filamentosa; en general son mviles, pero algunas cepas son inmviles. Accin patgena e inters clnico - se transmite va area a partir de aerosoles procedentes de aguas contaminadas o sistemas de aire acondicionado o humidificadores contaminados con Legionella; tras el periodo de incubacin (+/- 1 semana) se produce fiebres altas, astenia, malestar generalizado, tos, anorexia, dolor pleural agudo, disnea (un cuadro tpico de una neumnia atpica); se conoce como la enfermedad de los legionarios; el pronostico sera mas severo en ancianos o adultos debilitados aunque con el tratamiento preciso suele remitir sin problema.

Bacillus - de la familia Bacillaceae; el genero Bacillus son bacilos esporulados aerobios o anaerobios facultativos con tamao entre 1-7 micras Gram+ y en su mayora mviles; otro genero de la misma familia es Clostridium son bacilos esporulados y anaerobios estrictos, que origina en su mayora potentes exotoxinas responsables de cuadros clnicos graves. Especies mas importantes de Bacillus: - Bacillus anthracis (agente etiolgico del ntrax o carbunco) - Bacillus cereus (responsable en muchas ocasiones de trastornos gastrointestinales) - otros bacilos son comensales para el hombre o saprofitos del suelo, agua, etc., y que depende del estado inmunitario, puede producir diferentes cuadros clnicos (p.ej. Bacillus subtillis). Accin patgena e inters clnico de Bacillus anthracis :
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- Es un bacilo grande, habitualmente se presenta en forma de cadenas cortas o en parejas, formando fcilmente esporas sobre todo en los cultivos viejos; es inmvil, presenta capsulas(los patgenos) y exotoxina proteica que proporcionan propiedades antifagocitaras. - En general, el cuadro clnico que produce es el carbunco animal o humano; en el humano tiene lugar tras un primer contacto a partir de animales infectados que tras periodo de incubacin de 2-3 das surge una pstula maligna (color negro en la mano) en el punto de contagio (las manos y cabeza); comienza con una ppula eritematosa que se complica a vescula pruriginosa que se convierte en ulcera o escara, que sin tratamiento puede necrosarse y extenderse en superficie y profundidad; los casos no tratados, podran ser graves, ya que existe el riesgo de septicemia intensa que en pocas horas podra originar la muerte; lo mas habitual son las formas benignas que curan con facilitad tras un tratamiento. - En casos excepcionales pueden aparecer formas internas como el carbunco pulmonar ante la inhalacin de polvo contaminado con esporas de Bacillus anthracis que da lugar a neumonas graves; tambin puede producirse carbunco intestinal por la ingestin de alimentos contaminados con las mismas esporas y originara diarreas, vmitos, dolor tipo clico, fiebre, etc.

Acinetobacter - (tambin esta descrito en genero de Moraxella/ Neisseriaceas) este genero engloba especies que pueblan la flora de suelos y agua, al igual que Pseudomonas, son bacilos Gram- no fermentadoras, capsuladas y presentes en ambiente hospitalarios donde afectan a pacientes inmunodeprimidos; la especie mas frecuente es Acinetobacter calcoaceticus que produce infeccin urinaria, neumonas y sepsis; crecen bien en Mc y AS que da colonias grises y B-hemolticas; se diferencian de Pseudomonas en que Acinetobacter es oxidasa-; son fcilmente confundible con Neisserias porque es bacilo muy pequeo (coco-bacilo); tambin es muy resistente a los ATB.

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Tema 20 - Corinebacterium (patologa e identificacin)


Genero Corinebacterium - pequeos bacilos inmviles a temperatura corporal, se comportan como Gram+, suelen agruparse en formas geomtricas parecidas a letras chinas o abecedario (empalizadas); presenta granulaciones metacromticas, catalasa+, anaerobios facultativos y pueden dar lugar a un velo superficial en medios lquidos; presentan ciertos rasgos comunes con Mycobacterium en su pared bacteriana que es muy rica en cidos miclicos, arabinosa y galactosa, aunque la tincin de BAAR (Zhiel-Nielssen) paraCorinebacterium resulta negativa; la especie mas importante es Corinebacterium diphteriae. Accin patgena e inters clnico de Corinebacterium diphteriae - el bacilo diftrico llega al hombre por va respiratoria a traves de gotitas de saliva (pflugge) u objetos recientemente contaminados invadiendo la oro-faringe y las amgdalas; desde aqu se extiende, liberando toxinas y enzimas inhibiendo la sntesis proteica celular, originando necrosis en las celulas epiteliales que invade; este epitelio necrosado junto con leucocitos y fibrina formara una pseudomembrana que cubre las amgdalas, que puede llegar a provocar una obstruccin respiratoria si se extiende por la naso-faringe y laringe; tal pseudomembrana se encuentra fuertemente adherida a las mucosas, de forma que si se intenta arrancar, originaria al paciente una fuerte hemorragia; en general los signos y sintomas de la difteria suelen ser de tipo respiratorio; en casos excepcionales, por va linftica podra pasar a la sangre difundindose al resto del organismo.

Tema 21 - Mycobacterium y Nocardia (patologa e identificacin)


La familia Mycobacteriaceae engloba un solo genero Mycobacterium; son pequeos
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bacilos finos rectos y a veces incurvados, excepcionalmente pueden encontrarse algo filamentosos; son inmviles con una pared tpica y caracterstica no encontrada en ninguna otra familia excepto Nocardia (altamente enriquecida con cidos miclicos y componentes creos que se tie muy difcilmente - responde a Gram+), se necesitan colorantes con alta capacidad tintorial para su penetracin; una vez teidos son altamenteresistentes a la decoloracin cida (AAR+ o acido alcohol resistencia positivo) lo que les diferencia del resto de microorganismos; son muy distribuidos en la naturaleza, pueden sersaprofitos del agua y suelo y puede provocar infecciones graves al hombre y en ocasiones crnicas como la lepra; necesita gran cantidad de oxigeno para sobrevivir (aerobias estrictas). Las especies mas importantes del genero Mycobacterium (3 importantes grupos): (1) Bacilos de Mycobacterium cultivables en medios artificiales, de crecimiento lento(>1semana hasta 3 semanas); en funcin de los cuadros clnicos se subdividen en 2 grupos: a. especies que producen tuberculosis al hombre y a los animales (Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis). b. especies de micobacterias atpicas de crecimiento lento, podran presentar un poder patgeno para el hombre distinto al de la tuberculosis y la lepra (Mycobacterium avium y Mycobacterium marinum). (2) Micobacterias de crecimiento rpido (<1semana); no tiene inters clnico (no son patgenos) para el hombre. (3) Bacilos de Mycobacterium no cultivables sobre medios artificiales y patgenos para el hombre (Mycobacterium leprae) y ciertos roedores (Mycobacterium lepraemurium) Los micobacterias tambin se pueden clasificar en funcin de la produccin de pigmentos, de las morfologas de las colonias y de la velocidad del crecimiento.

Accin patgena e inters clnico Mycobacterium tuberculosis - responsables de tuberculosis en el hombre Muy rica en componentes lipdicos en su pared celular dotndole un carcter tintorial especifico AAR+ que servir para su identificacin y clasificacin; contiene protenas que provocan la formacion de Acs (reaccin de la tuberculina /test de Mantoux); es capaz decrecer en el interior de las celulas que constituyen el sistema retculo endotelial, se multiplican dentro de ellas sin ser destruida; en el frotis de baciloscopia se puede observar forma cordones microscpicos. Llega al hombre por inhalacin (excepcionalmente por ingestin de alimentos contaminados con Mycobacterium o a traves de las heridas de la piel); produce una lesin primaria en el pulmn y mas concretamente a nivel de los alvolos pulmonares, provocando unaintensa reaccin inflamatoria que da lugar a exudacin; estos bacilos pueden llegar hasta los vasos linfticos y de aqu a los ganglios, retornando a la circulacin venosa y originandofocos metstasis en distintos rganos; sin tratamiento se va desarrollando evolucionando hacia una necrosis "caseosa" (parecida a queso de
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caverna); despus de 6 semanas o mas va evolucionando hacia una destruccin y desintegracin de las celulas pulmonares con la formacin de una masa solida, homognea, parecida al queso (caverna tuberculosa); provocara fiebres mas o menos variables, sudoracin por la tarde, adelgazamiento progresivo, tos dbil o intensa (a veces con esputos muco-purulentos) y en fases mas avanzada,hemoptisis; en general cualquier parte del organismo podra verse afectada a causa de diseminacin (gastrointestinales, genito-urinarias, pericrdicas, etc.) Mycobacterium leprae - productoras de la lepra en el hombre Se multiplica con extraordinaria lentitud y su clnica es bastante insidiosa y no ha podido ser cultivado en ningn medio in vitro, por lo que se conocen poco sus caractersticas microbiolgicas; su nico reservorio es el hombre con autentica predileccin por las terminaciones nerviosas; es un bacilo inmvil, rectilneo, se tie con Zhiel-Nielssen (AAR+); suelen encontrarse en la mucosa nasal, en la dermis y en biopsias de lesiones en individuos con lepra; La va de entrada es a traves de lesiones en la piel, se propagan a los nervios superficiales prximos, concretamente a las celulas de Schwam; de aqu propagarse via linftica al sistema venoso y disemina a otros rganos (lepra lepromatosa); se multiplica mejor en las partes mas fras del organismo (la cara, extremidades) invadiendo los nervios mas superficiales; el bacilo se multiplica en el interior de los macrfagos de la piel y las celulas de Schwam, originando inflamacin y perdida de sensibilidad; en estado grave tambin aparece en rganos mas profundos y su pronostico es mas complicado; su periodo de incubacin es muy difcil de determinar, puede durar muchos aos; su periodo de invasin es muy insidioso, sintomas raros y no asociables a lepra (picor, hormigueo y perdida de sensibilidad en las manos/pies; a partir de aqu, de forma lenta y progresiva aparecen lesiones cutneas (maculas prominentes en extremidades y cara); su periodo durara toda la vida y su evolucin mas o menos grave depender del grado de inmunidad del husped; tto => ATB sistemico. Micobacterias atpicas - producido por Mycobacterium avium y Mycobacterium marinum Las micobacterias atpicas son m.o. patgeno para el hombre, frecuentemente de carcter pulmonar, a veces confundido con Mycobacterium tuberculosis ya que la sintomatologa es similar => tras una invasin, se producen formacin de tubrculos y consiguiente necrosis caseosa con formacin de cavernas, diseminacin y cuadros de fibrosis pulmonar con rara aparicin de focos extrapulmonares; la gravedad de lesiones depende del estado inmunolgico del paciente; los grmenes invadir especialmente individuos inmunodeprimidos; la va de entrada es muy variable (respiratoria o mucosas).

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Aislamiento caracteres bioqumicos diagnostico a)Aislamiento de Mycobacterium tuberculosis - Muestras puede proceder de esputo, aspirado bronquial, aspirado gstrica; LCR e orina; la muestra de esputo han de someterse a una descontaminacin, homogenizacin y concentracin (mediante centrifuga) previa al cultivo; LCR, orina, etc. se puede sembrar directamente, pero lo mejor seria centrifugarlo antes. - Se realizara un examen microscpico del frotis previa tincin de Zhiel-Nielssen (AAR); tambin se pueden utilizar tinciones fluorescentes (auramina, rojo de tiacina, naranja de acridina), cuando se sospecha que hay pocos bacilos (todo se trabaja bajo la campana de flujo laminar). - Para aislar el bacilo de Koch de muestras estriles (LCR, orina) se utilizaramedios lquidos como Proskauer-Beck; si pretendemos hacerlos crecer en medios slidos (esputo), existe medios especficos como Lowenstein-Jensen o Coletsos, que contienen huevo, aminocidos, sales minerales y verde malaquita (inhibe los grmenes contaminantes) cuyo crecimiento es lento (2-4 semanas); tambin existe agar Middlebrook que se suele emplear junto con el anterior para completar su identificacin; Micobacterias son muy exigentes en su crecimiento => incubar a 37C, en la oscuridad, en el ambiente con CO2 de 5-10% (en 1 semana) y en atmsfera normal a partir de la 2 semana; los tubos desenroscados hasta que se evaporen el agua (sin secar el medio); la mayora tardan entre 3-6 semanas en crecer (algunos aun mas); si hay crecimiento, se har la identificacin de su morfologa mediante tincin de Zhiel-Nielssen y pigmentos. - Pruebas bioqumicas => la mas importante es la prueba de la niacina+ (todas las micobacterias producen cido nicotnico durante su crecimiento; M.tuberculosis no metabolizan el cido nicotnico y por ello lo acumulan y es excretada al medio, sobre todo en medios con base de huevo, del cual puede ser extrada y detectada); es nitratasa+ y catalasa+(solo algunas cepas de Mycobacterium tuberculosis no tienen la catalasa; en general tienencatalasa termolbil (a temperatura alta no tienen catalasa). - Pruebas serologcas => la mas utilizada es la tcnica ELISA; actualmente la identificacin se hace con el PCR, posteriormente se realiza la hibridacin con las sondas genticas (ADN) de M.tuberculosis marcadas. - Pruebas de alergia /la prueba de la tuberculina (Mantoux); tuberculina es un extracto proteico de bacilo tuberculoso; es solo toxico para individuos que han estado en contacto con dicho germen, originando una reaccin intradrmica en la cara anterior del brazo intensa; este eritema endurado (ppula de >10mm es positivo) se debe leer hacia 48-72 horas (se mide la ppula no la zona roja); despus de las 4-6 semanas posteriores al contacto, la prueba del Mantoux dar de por vida positiva. b)Aislamiento de Mycobacterium leprae - Muestras a partir de heridas sospechosas en piel y otras localizaciones. - Se realiza una tincin de Zhiel-Nielssen o AAR, que deber dar positiva - No podr ser cultivada en medios de cultivo - Se realizara un diagnostico serolgico (un estudio de la inmunidad celular y humoral del individuo)
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- Pruebas cutneas: (depende del resultado, se hace los 3 pruebas o solo algunos). 1. reaccin de la lepromina => para conocer el tipo de lepra que posee ese individuo (prueba de intra-dermorreaccin /Ag de bacterias inactivadas); Las personas que no tienen lepra tendrn poca o ninguna reaccin de la piel al Ag. Los pacientes con un tipo particular de lepra, llamado lepra lepromatosa, no tendrn ninguna reaccin de la piel al Ag; una reaccin positiva de la piel se puede observar en pacientes con lepra tuberculoide y lepra dimorfa tuberculoide. 2. test de pilocarpina => para buscar la ausencia de sudoracin de la piel lesionada despus de una inyeccin de clorhidrato de pilocarpina. 3. test de la histamina => inyectar histamina de tal forma que en una piel sana aparecer una reaccion alrgica caracterstica, mientras que en las lesiones lepromatosas esto no sucede debido a que los nervios perifricos estn lesionados y no aparecer ninguna reaccin alrgica. c)Aislamiento de Micobacterias atpicas - Recogida de muestra de los lugares sospechosos en total asepsia - Tincin de Zhiel-Nielssen (positiva); tincin fluorescencia con auramina, rojo de tiacina, naranja de acridina. - Cultivos en medios Lowenstein-Jensen, Coletsos o caldo Middlebrook, donde se puede observar el aspecto de las colonias, su velocidad de crecimiento y la presencia de pigmentos. - Pruebas bioqumicos: niacina- (la diferencia de Mycobacterium tuberculosis), catalasa+, nitratasa+. Pruebas serologcas de ELISA Actualmente en grandes laboratorios, se utilizan medios de cultivos radiomtrico (Bactec TB)de deteccion mas rapida que contiene liquido de soporte (agar Middlebrook) con ATB para inhibir los demas grmenes y el sustrato marcado con un istopo del carbono C14; las micobacterias al crecer metabolizan el sustrato y liberan gas CO2 marcado radioactivamente que es detectada automticamente por el Bactec y una vez que se ha detectado crecimiento en alguno de los medios, se realiza la tincin de Ziehl-Neelsen para ver si lo que ha crecido son BAAR o no.

Baciloscopias - las extensiones para baciloscopias se deben hacer previamente a la descontaminacin (CHNa 2-4%) de las muestras y homogenizacin (N-acetil cisteina) , posteriormente su concentracin por centrifugacin; la preparacin del frotis del esputo ha de hacerse seleccionando la parte mas purulenta que es donde hay mas micobacterias; cuando se lleva acabo la tincin de los frotis, se debe evitar el contacto fsico entre las portas para evitar contaminacin cruzada; es importante cuantificar el numero de bacilos encontrados ya que esta directamente relacionado con el grado de contagiosidad del paciente y con la gravedad de la infeccin.

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El genero Nocardia - corresponde a actinomicetos aerobios que forman micelio vegetativoque tiende a fragmentarse originando estructuras bacilares o coco-bacilares; Gram+ inmovil,aerobios estrictos y AAR+ (tiene caractersticas anlogas al Mycobacterium) poseen gran cantidad de acidos micolicos de cadena larga en su pared bacteriana; poseen ademas glicolpidos y fosfolpidos que sirve para su identificacion y diferenciacin; algunas especies son patgenas para el hombre. Accin patgena e inters clnico Gran parte de nocardiosis son infecciones de carcter oportunista; no produce toxinas, pero contiene en su pared bacteriana alta proporcin de lpidos que le confiere una resistencia a los sistemas de defensa (macrfagos, linfocitos, etc.); tiene capacidad de crecer y multiplicarse en el interior de los tejidos (macrfagos) como parsito intracelular y solo crece cuando las defensas del individuo se encuentran bajas; las manifestaciones clnicas mas frecuentes son: A. Nocardiosis pulmonar - causada sobretodo por Nocardia asteroides que produce lesiones pulmonares con abscesos, inflamacin diseminada semejante a la tuberculosis; pueden surgir reas de necrosis y diseminarse por sangre a otros rganos provocando septicemia. B. Micetomas (lesiones granulomatosas) de carcter crnico originadas en eltejido subcutneo donde se producen tumefaccin, abscesos y pstulas y/o ndulos que al abrirse presentan exudados sero-sanguinolentos; generalmente causados por Nocardia brasiliensis y es frecuente en las extremidades inferiores y superiores; presenta periodos de remisin y es caracterstico de climas tropicales;

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Tema 22 - Bacterias anaerobias (patologa e identificacin)


Anaerobias - todas aquellas bacterias incapaces de crecer y/o mantenerse en contacto con O2 a la presion atmosfrica; presentan un metabolismo anoxibitico => incapaz de utilizar O2 de la atmsfera como aceptor final de electrones; en su lugar utilizan sustratos orgnicos como aceptores finales de electrones(respiracin anaerbica /fermentacion); la presencia de O2 puede ser (1) bactericida /toxica /letal directa o bacteriosttico (crecern de nuevo cuando las condiciones son favorables); (2) inhibir ciertos sistemas enzimticos o la funcin reguladora primordial del metabolismo celular; (3) generan producto txicos al interaccionar sus componentes propios con O2; los anaerobios son las bacterias predominantes en la flora normal humana y en algunas partes p.ej. boca o intestino estn en proporcin de 1000:1 con respecto a la flora aerobia, por tanto, la mayora de la infeccin que provoca los anaerobios son endgenas; dentro de los anaerobios se distingue => anaerobios estrictos y anaerobios aero-tolerantes/microaeroflicos (puede crecer a 2-8% de O2). Genero Clostridium - bacterias anaerobias esporuladas; son bacilos Gram+, anaerobios estrictos, forman esporas a nivel terminal o subterminal, presentan flagelacin pertrica, mviles, no presentan capsulas excepto Clostridium perfringes; ampliamente distribuidas en el suelo, agua, etc. y altamente resistente a medios externos; responsable de infecciones e intoxicaciones muy graves (ttanos, botulismo, gangrena gaseosa, etc.); las especies mas patgenos actan mediante la formacin de toxina con poder toxico sobre el husped; algunos podran formar parte de la flora normal del hombre y animales.

Las especies mas importantes A. Clostridium que originan toxinas cuyo mecanismo de accin es neurotoxico =>Clostridium tetanii - el agente etiolgico de ttanos y Clostridium botulinum agente etiolgico del botulismo.
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B. Clostridium que originan toxinas que actan sobre tejidos provocando histotoxicidad =>Clostridium perfringes - agente etiolgico de la gangrena gaseosa; para su penetracin en el organismo se requieren lesiones previas. C. Clostridium que originan toxinas que actan sobre el tracto digestivo (clostridios enterotoxicos) => Clostridium difficile - responsable de trastornos gastrointestinales no graves. D. Clostridium responsables de cuadros purulentos (clostridios pigenos) => Clostridium perfringes; es frecuente la presencia ademas, de otras bacterias anaerobias. Accin patgena e inters clnico A. Clostridium que ejercen accin neuro-toxica sobre las personas (C.tetanii y C.botulinum) Clostridium tetanii - es un bacilo Gram+ pequeo, formadora de esporas (aspecto de tambor o cerilla), habitan la tierra y el intestino del hombre y animales; produce 3 toxinas responsables del cuadro tpico del ttanos que son transportadas va sangunea o humoral hasta SNC bloqueando la liberacin de neurotransmisores, originan hiperactividad de las neuronas motoras que da lugar a convulsiones y parlisis espstica o espasmo muscular a nivel perifrico; se ve alterado el sistema muscular variando el ciclo de contraccinrelajacin de forma que este entra en fase de contraccin y no se recupera (rigidez tetnica / episttonos). Para que se produzca el ttanos es necesario una serie de condiciones tales como que el microorganismo germine (condiciones adecuadas de anaerobiosis); tras una herida profunda (cortante, punzante, mordeduras, araazos, partos, abortos, quemaduras, ulceras por decubito) o herida superficiales (rozaduras) se pueden infectar y formar costra que facilita la infeccin anaerobia; en las condiciones favorables de anaerobiosis, las esporas deClostridium tetanii en el ambiente pasan a la herida, germinan y tras un periodo de incubacin (5-7 das), se origina su accin patgena; es rara que se produzca de forma local en la zona de entrada; la forma generalizada es mas habitual y mas grave; es importante la deteccin precoz y medidas profilcticas (vacunacin se renueva cada 10 aos).

Clostridium botulinum - bacilos Gram+ anaerobios estrictos, grandes, mviles por su flagelacin y presentan esporas; es capaz de formar neuro-toxinas peligrosas y potentes sobre las personas que originan parlisis o debilidad muscular; las esporas son distribuidas ampliamente en el aire, suelo, ciertos alimentos (conservas, pescados, etc.); si las condiciones en el ambiente son de anaerobiosis, germinaran; su accion patgena sobre el organismo seraneuro-paralizante y con una dosis de 10 elevado a -8 (10 nanogramos) de su toxina es suficiente para causar la muerte (es el veneno mas potentes hasta ahora), que solo se producen en condiciones adecuadas de anaerobiosis, temperatura en torno a 30C, pH neutro o ligeramente acido y permiten que germine la espora; sus toxinas son de carcter proteico y termolbiles (se destruyen a temperatura 100C durante 5 minutos o 70C de 30-60 minutos).
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El mecanismo de accin de las toxinas botulnicas => a traves de los alimentos contaminadosllega esta neuro-toxina al tubo digestivo del hombre y producir toxinfeccin alimentariainicialmente; de aqu via sangunea y linftica llega hasta sistema nervioso perifrico donde acta en las terminaciones nerviosas, originando parlisis en el musculo esqueltico y otras manifestaciones neurolgicas como visin borrosa, fotofobia, sequedad de boca, lengua y faringe, disfagia, disartria (dificultad al hablar), debilidad de los musculos (flacidez) incluyendo los respiratorios que puede llegar mortal por fallo respiratorio y arritmias cardacas (depende de la cantidad de toxina o del germen); su periodo de incubacin en torno 18-36 horas despus de la ingestin del alimento contaminado y los cuadros mas graves se originan en un periodo de incubacin inferior a 24 horas. B. Clostridium que ejercen accin histo-toxica en mltiples tejidos Clostridium perfringes - ejercen un efecto toxico importante pero no actan sobre SNC; son Gram+, anaerobia estricta, la nica especie capsuladas, ampliamente distribuida en el suelo; de aqu a traves de heridas profundas, puede pasar al hombre produciendo gangrena gaseosa; tambin puede encontrarse en la flora intestinal; capaz de formar toxinas que actan sobre los tejidos, entero-toxina, hemolisina, neuroaminidasa. El mecanismo de accin => tras la va de entrada (heridas) en condicin anaerobiosis adecuadas, germinan las esporas y proliferan; es frecuente que se contaminen con otro tipo de bacterias aerobias que consiguen agotar el oxigeno aumentando las condiciones de anaerobiosis, se disminuye el pH aumentando el acido lctico y facilitando la liberacin de las enzimas proteolticas y sustancias toxicas; se producirn los efectos lesivos y graves sobre los tejidos extendindose a los vecinos, se rompern las estructuras celulares a nivel de sus membranas, se destruirn las celulas hemticas, las celulas endoteliales, las membranas de las celulas musculares originando procesos de dermo-necrosis con dao tisular (gangrena). Ademas de provocar la gangrena gaseosa a traves de heridas infectadas, C.perfringes es tambin el agente etiolgico de una toxo-infeccin alimentaria producida por la ingestin de carne contaminada provocando cuadros diarreicos y dolor abdominal leve; existen otros casos mas excepcionales y graves que da lugar a cuadros diarreicos muy acuosos y sanguinolentos, vmitos y estado de shock producido por C.difficile.

Aislamiento caracteres bioqumicos diagnostico - Toma de muestra representativa, adecuada y estril en medios especficos de transporte anaerobiosis con sustancias reductoras (bolsas generadoras de CO2) que crean atmsferas sin O2 o en una jeringa sin aire (tapando la aguja). - Se har un examen directo (tincin de Gram) donde se pueden apreciar las formas de esporas (palillos de tambor); tambin se puede realizar tincin de esporas. - Se cultivaran en medios de cultivos especficos como ASA (agar sangre
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anaerobio); incubacin a 37C en 48 horas en condicin anaerobisis, utilizando unacampana con un sobre generador de gas CO2, da lugar a la liberacin de H y CO2; el O2 que existe en el anterior de la campana, se une al H, forman H2O que se depositan en forma de gotitas en las paredes, tambin hay que introducir un indicador de anaerobiosis (una tira reactiva). - Pruebas bioqumicas => cuando existe crecimiento en el medio anaerobio, se monta directamente el API en un recipiente/ una caja, tambin anaerobio.

Bacterias anaerobias no formadoras de esporas - crecen en ambientes de bajo potencial oxido reductor o ambientes microaerfilos; son ampliamente distribuidos en la naturaleza y muy pocas capaces de producir cuadros patgenos graves al hombre; gran parte de ellos forman parte de la flora gastrointestinal, vaginal o bucal del hombre, no ejerciendo efecto patgeno alguno. Las especies mas importantes A. Bacilos Gram+ no esporulados: - Lactobacillus => microaerfilos, crecen mejor en anaerobiosis; son flora habitual de laboca, vagina e intestino del hombre; son de gran utilidad a nivel industrial (produce acido lctico para los yogures); no intervienen en ningn proceso patgeno para el hombre. - Propionibacterium => son anaerobios, pueden crecer en ambientes microaerfilos; forman parte de la flora normal intestinal, tracto urinario y piel. - Bifidobacterium => es flora intestinal del hombre y no son patgenos. B. Bacilos Gram- no esporulados: - Bacteroides => son flora intestinal, vaginal y bucal del hombre y se ha asociado en ocasiones a procesos gastrointestinales, especialmente Bacteroides fragilis que acta comooportunista. - Fusobacterium => solo la especie Fusobacterium nucleatum se asocia a algunosprocesos patgenos en el aparato respiratorio y tracto genital femenino, de carcter oportunista. C. Cocos Gram+ no esporulados: - Ciertos Streptococcus anaerobios que se encuentran frecuentemente en la floragastrointestinal y bucal; no son patgenos. - Peptococcus => no produce efecto patgeno sobre el hombre D. Cocos Gram- no esporulados: - Veillonella => forma parte de la flora intestinal y bucal y no son patgenos para el hombre. Accin patgena e inters clnico Salvo excepciones, no son relacionados con procesos patgenos y la patogenicidad que pudiera desencadenar alguno de ellos depende sobre todo de las circunstancias del husped (oportunistas); pueden producir infecciones post-quirrgicas, complicaciones
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de

escaras

ulceras

por

decubito,

complicaciones

de

herida

en

general.

Aislamiento caracteres bioqumicos diagnostico Toma de muestra en condiciones adecuada (anaerobiosis) Examen directo (tincin de Gram) - Se aislaran en medios anaerobiosis (ASA/ANA - agar sangre anaerobio) Pruebas bioqumicas se realiza con API en condicin anaerobia

Tema 23 - Espiroquetas (Treponema, Borella y Leptospira); patologa e identificacin


La familia Espiroquetaceas (con inters clnico para el hombre) - Treponema, Borrelia y Leptospira; corresponden a especies bacterianas cuya morfologa es filamentosa, helicoidal o espiral con filamentos axiales relacionados con su movilidad; presenta una pared celular fina y flexible de lipo-polisacrido y lipo-proteica donde se encuentran la mayora de Ags especficos de estas; son Gram- (difcilmente se tie), tambin se pueden visualizar por el microscopio de contraste de fases; presentan un metabolismo oxidativo y/o fermentativo(aerobias o anaerobias facultativas); difundidas en las aguas, el suelo y como agentescomensales en las mucosas del hombre y animales. La familia Espiroquetaceae se divide en 5 generos : - Genero Espiroqueta => espiroquetas mas grandes y no existen especies patgenas para el hombre. - Genero Cristispira => son de tamao algo menor que el Espiroqueta y no es patgeno para el hombre. - Genero Treponema => son espiroquetas muy helicoidales, muy finas, pequeas y mviles; son microaeroflicas y presentan un metabolismo fermentativo; existen especies patgenas para el hombre - Treponema pallidum (el agente etiolgico de la sfilis). - Genero Borrelia => son espiroquetas mas grandes que Treponema; son microaeroflicas y presentan pocas espiras que son amplias e irregulares; su metabolismo es fermentativo y son difciles de cultivar en medios artificiales; pueden provocar fiebres recurrentes al hombre transmitido por artrpodos. - Genero Leptospira => son espiroquetas largas, muy finas y con numerosas espiras, profundas y regulares; es difcil su visualizacin aunque se suele utilizar microscopia de contraste de fases; son aerobias con un metabolismo oxidativo; se cultivan con facilidad en medios artificiales; ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en las aguas; pueden parasitar al hombre provocando leptospirosis.

Genero Treponema - son espiroquetas pequeas, finas con un numero de espiras entre 5127/168

20 distribuidas de forma regular, con gran movilidad; se tie difcilmente con Gram y se tie mejor con Giemsa o tincion de plata y se visualiza con la microscopia de campo oscuro y de contraste de fases; no crece en medios de cultivo in vitro y requiere un medio de cultivo in vivo para crecer (testculo de conejo); crece bien en situaciones de bajo potencial oxido-reductor (microaerofila), presentando en ocasiones una respiracin anaerobia y un metabolismo fermentativo; el especie patgena para el hombre es Treponema pallidum que transmite la sfilis por contacto directo; existen dentro del genero Treponema especies comensales de las mucosas, tracto urinario, vaginal, tubo digestivo, etc. que no son patgenos para el hombre y se pueden cultivar. Treponema pallidum es la especie mas importante por su difusin cosmopolitana; es el agente causal de sfilis; no son capaces de vivir fuera del organismo humano, ya que mueren por desecacin; su transmisin es por contacto directo (va sexual) y si no se detecta a tiempopuede durar toda la vida; mecanismo de accin: - Periodo primario de la sfilis => comienza tras un primer contacto con lesiones ricas en treponemas presentes en las mucosas; periodo de incubacin 10-90 das (termino medio de 21 das) aparece en la zona genital un chancro primario con abundantes treponemas, se van diseminando va hemtica y linftica a otras localizaciones convirtiendo-se en unaenfermedad sistmica; es frecuente su multiplicacin en ganglios prximos a la zona genital originando pequeas tumoraciones (adenopatias); transcurrido un tiempo corto de 26 semanas estos signos desaparecen espontneamente y entra en una fase silente. - Periodo secundario o sfilis florida => surge despus de un tiempo entre 2 meses y 2 aos de la fase silente; de forma sbita se produce una espiroquetemia en general muy florida por las manchas en la piel y en las mucosas, muy ricas en treponemas y altamente infecciosas; tambin puede surgir excepcionalmente una forma eruptiva como lesiones en otros rganos, fiebre en ocasiones, pstulas o ppulas muy ricas en treponemas; este cuadro clnico de carcter sistmico remite a las pocas semanas (2-6 semanas), volviendo a entrar en una nueva fase de latencia. - Periodo terciario o sfilis terciaria => surge tras la fase de latencia entre 3-30 aos, una forma muy grave con mal pronostico; el numero de treponemas en sangre es muy escaso y muy abundante en ganglios, bazo, huesos, sistema nervioso (neuro-sfilis) y aparato cardiovascular; es frecuente la formacin de granulomas, necrosis, gomas, parlisis general progresiva, aneurisma artico, etc. Resumen de la evolucin de sfilis => Incubacin 10-90 das (termino medio 21 das) Periodo primario (2-6 semanas) - fase silente (2 meses - 2 aos) - Periodo secundario/ sfilis florida (2-6 semanas) - fase latente (3-30 aos) - Periodo terciario/ Neurosfilis forma muy grave con mal pronostico. Aislamiento - caracteres bioqumicos - diagnostico del genero Treponema pallidum - Treponema pallidum se asla muy difcilmente, no crece en medios in vitro, solo lo hace en medios in vivo (testculos de conejo) y el diagnostico de la infeccin se establece durante los periodos primario y secundario mediante muestras de exudados, condilomas, etc. - Examen directo al microscopio de campo oscuro o microscopio de contraste de fases o microscopio de fluorescencia de una tincin de Giemsa o tincin Nitrato de plata (sales de plata; es una tcnica difcil de efectuar, reservada a los laboratorios especializados, til en la deteccin de Pneumocytis carinii, Legionella, Treponema, hongos, Rickettsias). - Pruebas serologcas => se realiza la prueba de la presencia de Acs anti Treponema pallidum en el suero del paciente con Ags especficos de Treponema pallidum que presentan una sensibilidad y fiabilidad del 100%; los resultados dependen del periodo de sfilis en el que se encuentre; tambin se incluyen las inmunofluorescencia

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indirecta, as como las de hemo-aglutinacin pasiva partiendo de hemates tratados con Treponema pallidum que es muy sensible y econmica.

Diagnostico serolgico de las sfilis - existe 2 tipos de pruebas (no treponmicas y treponmicas) a) No treponmicas => son de gran sensibilidad y fcil de hacer; se usa para prueba de screening y si resulta (+), hay que confirmar con pruebas treponmicas; tambin se utiliza como un seguimiento de la enfermedad; se le llama tambin prueba de WASSERMANN; consiste en enfrentar el suero del paciente con sustancia lipdica "cardiolipina" que no es Ags treponmicos; si existen Acs anti Tp en el suero, reaccionaran con la cardiolipina (+); pero al no ser la cardiolipina un Ags treponmicos, puede dar lugar falsos positivo con otras enfermedades; 2 tipos de pruebas => VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) y RPR (reagina plasmtica rpida) son pruebas de aglutinacin con partculas de carbn (darn grumitos grises). b) Treponmicas => se utilizan como prueba confirmativas con varias tcnicas: (1) FTA(tcnica fluorescencia de Acs anti Tp) enfrentando Ags de Tp con posibles Acs anti Tp en el suero del paciente; (2) FTA abs donde previamente se absorben posibles Acs naturales anti Tp saprofitos; (3) TPHA (Tp Haemagglutination Assay) que tiene como base hemaglutinacin y sencillo de realizar (no se necesita microscopio fluorescencia); (4) tambin se puede utilizar pruebas de ELISA para detectar IgM y IgG; todas son pruebas muy especificas; no se utilizan para el seguimiento, porque sera siempre resulta (+). Genero Borrelia - son espiroquetas de mayor tamao con espiras mas amplias e irregulares con extremos afilados y son mviles; las especies patgenas para el hombre y los animales,originan fiebres recurrentes endmicas y epidmicas; es microaeroflica con un metabolismo fermentativo; se tien con facilidad de Gram- y se puede cultivar in vitro, pero requiere medios muy especficos; las especies mas importantes del genero Borrelia, se transmiten por piojos y por garrapatas. Accin patgena e inters clnico - las fiebres recurrentes son una enfermedad muy cosmopolita, en ocasiones endmica a condiciones de salubridad muy baja; tras la picadura del vector, ya sea garrapata o piojo, pasan las borrelias a la sangre del husped, ayudadas por el rascado que provoca el aplastamiento del piojo /garrapata, que dar lugar a microtraumas en la piel y facilitan el paso de dichas borrelias; despus de unos7 das de incubacin se originan fiebres, dolores musculares, cefalea, etc; clnica que dura unos 10 das y luego desaparecer, produciendo posteriormente recurrencias; no es una enfermedad grave y es fcil de tratar, especialmente con tetraciclinas.

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Genero Leptospira - son espiroquetas muy finas con espiras regulares, muy numerosas y apretadas, con sus extremos ligeramente incurvados y mviles; se tien dbilmente con Gram, tambin se pueden teir con Giemsa; su metabolismo es oxidativo (crecimientoaerobio); existe en la naturaleza leptospiras saprofitas y parsitas; puede originar de forma casual leptospirosis en el hombre con cuadros febriles; el reservorio son animales, consideradas como zoonosis.

Tema 24 - Rickettsias, Chlamydias y Micoplasmas (patologa e identificacin)


Genero Rickettsia - son parsitos celulares estrictos (porque su dotacin enzimtica es muy escasa) de los artrpodos (crecen muy bien en el citoplasma); son coco-bacilos Gram-; producen en el hombre enfermedades transmitidas por piojos, garrapatas, pulgas y caros. Especies mas importantes de la familia Rickettsiaceae - hay 3 gneros importantes =>Rickettsia, Rochalimaea y Coxiella (Coxiella burnetti es coco-bacilo Gram+ que origina la fiebre Q). Accin patgena e inters clnico: (1) Tifus exantemtico epidmico - producido por R.prowazekii; mediante la picadura de piojo; tras el periodo de incubacin de 1-2 semanas, aparecen escalofros, fiebres altas (40C), cefaleas, dolores generalizados, ndulos inflamatorio de los capilares, arteriolas, vnulas, la piel y musculos (dificulta la corriente sangunea y en casos graves puede provocar gangrena en las extremidades); es frecuente la formacin de maculas rosadas y posteriormente ppulas y petequiales. (2) Tifus murino o endmico - producido por R.typhi mediante la picadura de la pulga, garrapatas y caros; tras el periodo de incubacin de 4-15 das, se produce fiebres altas, cefaleas, artralgias y mialgias generalizadas con un cuadro clnico leve sin complicaciones ni recidivas como el tifus exantemtico. (3) Fiebres manchadas de las montaas rocosas - producida por R.rickettsiitrasmitidas por las garrapatas; tras el periodo de incubacin de 3-6 das, aparecen fiebres altas, mialgias generalizadas y una mancha negra en la zona de la picadura; en Espaa la especie mas extendidas es R.conorii, el agente de la fiebre botonosa o exantemtica mediterrnea, transmitida al hombre por la garrapata (sobre todo del perro); tras el periodo de incubacin de 2-6 das provoca una mancha negra a modo de botn en el lugar de la picadura, fiebre, artralgias, mialgias generalizada y manchas maculo-papulosas; no se
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suelen

complicar

responden

bien

al

tratamiento.

(4) Fiebre Q - producida por Coxiella burnetii mediante inhalacin de esta u otras(presencia de artrpodos), la va de entrada no se conocen hasta la fecha; tras el periodo de incubacin de 3 semanas, se produce un estado febril con mialgias generalizadas ycuadro clnico leve. Aislamiento caracteres bioqumicos diagnostico del genero Rickettsia Se toma 2 muestras de sangre en estadios febriles (cuando hay mas Rickettsia): - La 1 se centrifuga para obtener un sedimento sanguneo (concentracin alta de Rickettsia); se usa para realizar varias tinciones p.ej. May-Grunwald-Giemsa (las rickettsias aparecen de color purpura), tincin Gram (resulta negativo para Rickettsia y positiva para Coxiella burnetii), tincin inmunofluorescencia y estudios de microscopia electrnica (para observar); el sedimento tambin se usa para sembrar en medios de cultivo celular o embriones. - De la 2 se obtiene sueros para pruebas serologcas (buscando ttulos de Acs), con tecnicas inmunofluorescencia, seroaglutinacin o ELISA.

Genero Chlamydia se consideran mas prximos a virus que a bacterias; son parsitos intracelulares estrictos (carecen de mecanismo biosinttico auto-suficiente) del hombre y animales; son cocos pequeos de Gram-, inmviles; poseen ADN y ARN y su multiplicacin es por divisin binaria (a diferencia de virus); es capaz de vivir en medios intracelulares durante mucho tiempo sin presentar una sintomatologa clara lo que facilita la cronificacin de procesos infecciosos. Especies mas importantes dentro de la familia Chlamydiaceae: - Chlamydia psittaci => parsito intracelular de animales y excepcionalmente del hombre(tras la inhalacin de heces de pjaros infectados), provocando brotes neumnicos de distinta gravedad. - Chlamydia trachomatis => parsito intracelular del hombre, provocandoinfecciones sistmicas o locales de distinta gravedad y afectando especialmente a los genitales y a los ojos. Accin patgena e inters clnico se multiplican en el citoplasma de

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la clula que parsita, presentando un ciclo con 2 tipos celulares diferentes: - En 1er periodo formara una clula densa o corpsculo elemental con gran resistencia a la sequedad, lo que permitir la dispersin de Chlamydia; es la forma infectiva. En 2nd periodo formara una clula mas grande de menor densidad o corpsculo reticulado, que es responsable de la divisin binaria y por tanto de crecimiento clamidias. El proceso del ciclo => la forma infectiva (corpsculo elemental) penetra en la clula que va a parasitar ayudado por los Ags especficos, se produce infeccin celular, se forma una vescula citoplasmtica que bloqueara los mecanismos de defensa de la propia clula; a partir de aqu este corpsculo elemental aumenta su tamao, su pared se hace mas fina y permeable permitiendo el paso de complejos enzimticos, ATP y otras sustancias que van a necesitar de la clula que parasitan; el citoplasma de la clamidia se hace mas denso y esponjoso y aparece la segunda forma, donde comienza a multiplicarse por divisin binaria. Cuadros clnicos de Chlamydia trachomatis: - Tracoma => tras un contacto directo se produce una infeccin crnica en el epitelio conjuntival y corneal, siendo frecuentes las recadas y sobre infecciones con evolucin lenta hacia la ceguera; frecuente en edades infantiles. - Conjuntivitis neonatal => aparece entre la primera y la segunda semana despus del nacimiento; surge una conjuntivitis purulenta al neonato, asociada a infecciones genitales por clamidias en la madre; puede evolucionar positivamente o hacia lesiones anlogas al Tracoma. - Linfogranuloma venreo => es una infeccin que se trasmite por contacto venreo. Aislamiento caracteres bioqumicos diagnostico del genero Chlamydia Debido al elevado riesgo de infeccin en el laboratorio al manipular clamidias se suelen utilizar metodos indirectos (serolgicos) a veces tambien se realiza examenes citologicos en cultivos especficos. Se toman muestras de secreciones oculares y/o genitales - Se realiza un examen directo que incluyen una tincin de Giemsa y de Gram. Se realizan tcnicas citolgicas - Se realizaran exmenes indirectos mediante tcnicas serologcas (la mas frecuente ELISA) que son mas seguras y fiables; existe un kit para buscar clamidias.

Genero Micoplasma - es uno de los microorganismos mas pequeos existentes en bacteriologa y se caracteriza por no contener pared celular => sensible a
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la presin omotica del medio (se lisan facilmente), su morfologa es pleomorfismo y resistente a ciertos antibiticos cuya mecanismo de accin se establece en la pared bacteriana; se dividen por divisin binaria y vivir de forma independiente y crece bien in vitro a partir de medios artificiales enriquecidos; se encuentra extendidos en la naturaleza; son comensales de la mucosa del hombre; existe especies patgenas como Micoplasma pneumoniae que afecta al aparato respiratorio. Especies mas importantes dentro de la familiaMicoplasmataceae estn los gneros Micoplasma y Ureaplasma; solo unas 10 especies pueden producir algn efecto patgeno en las membranas celulares de las mucosas oro-farngeas y uro-genitales; la mas importante para el hombre es Micoplasma pneumoniae(produce neumonas); el Ureaplasma urealyticum es otra especie patgeno que se asocia a ETS junto con el Micoplasma hominis. Accin patgena e inters clnico - Su infectividad se relaciona con su adherencia (debido a una glicoprotena especifica) a los epitelios de las mucosas; su pleomorfismo puede adoptar formas filamentosas y alargadas que aumenta la superficie de contacto a las estructuras epiteliales a las que se une; una vez adherida, los cilios de las celulas epiteliales que tapizan la mucosa se paralizan y provoca alteraciones metablicas en dichas celulas epiteliales. - Cuadros clnicos => cuadro pulmonares y mas raramente cuadros genitales o urogenitales, siendo Micoplasma pneumonia es mas importante como el agente causal mas frecuente de las neumonas atpicas. - En casos excepcionales se han podido aislar Micoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum en procesos uretrales y genitales como salpingitis, vaginitis, prostatitis, cervicitis, etc. (son casos muy raros) Aislamiento caracteres bioqumicos diagnostico - Se toman muestras de la mucosa farngea, secreciones uretrales, exudados, muestras de esputo, de sangre, etc segn la patologa. - Se realiza un frotis de la muestra que se puede observar en campo oscuro con nigrosina, al microscopio de contraste de fases o con la tincin de Giemsa (se tie dbilmente). - Se siembra en medios especficos y con un alto grado de humedad para evitar la desecacin. - Se realiza pruebas bioqumicas => fermentacion de glucosa, prueba de arginina, ureasa, etc.; existe un kit de la deteccin micoplasmas. - Metodos serolgicos son mas rpidos, mas fiables y mas utilizados en la actualidad (inmunofluorescencia y ELISA).

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Genero Campylobacter - son bacilos Gram- cortos con forma de coma, espiral o alas de gaviota (en cultivos jvenes); son microaeroflicos, mviles por un nico flagelo polar; no fermentan los carbohidratos, oxidasa+ y catalasa+; habitan el tracto gastrointestinal de muchos animales; en el hombre se asocian a infecciones gastrointestinales (via de entrada oral/ digestiva), fundamentalmente, y cada vez en mayor grado a infecciones extraintestinales (meningitis, endocarditis, artritis sptica), especialmente en pacientes con SIDA. Especies clnicamente importantes para el hombre - C.jejuni, C.coli y C. laridis sonagentes etiolgicos de diarrea; C.fetus subsp. fetus produce septicemia en pacientes inmuno-suprimidos. Aislamiento a partir de "heces" - la siembra inmediata en medios selectivos a la toma de muestra; si se tiene que posponer, se utilizaran medios de transporte especiales (Cary-Blair o Campy-Thio) donde se mantiene viables; el cultivo de campylobacter tiene que cumplir 3 requisitos => (1) empleo de medios selectivos p.ej. "Campylosel" contiene sangre de cordero con ATB y antifngico o "Skirrow" contiene sangre de caballo con ATB (2) uso de atmsfera reducida de O2/ microaeroflica se consigue mediante sistema de evacuacin-reemplazo hasta lograr 5% de O2, 10% de CO2 y 85% de N2 o campanas anaerobios con sobres comerciales que generan la atmsfera deseada. (3) temperatura de 42C en aislamiento inicial entre 24-48 horas (para inhibir la flora fecal acompaante), despus pasa a 37C el 3 da; las placas han de incubar hasta 72 horas antes de descartarse como negativas; a esta temperatura se consigue el mximo aislamiento deC.jejuni y C.coli. Si pretende aislar otras especies de campylobacter distintas a C.coli y C.jejuni => ha de emplear medios selectivos sin cefalosporinas, incubacin a 37C, atmsfera microaeroflica, incubacin de 7 das. Identificacin - los campylobacter termoflicos dan lugar a colonias grises, incoloras, mucosa y no hemolticas; se les hace una tincin Gram (bacilos Gram- con forma de S en cultivo joven y en cultivo viejo pueden dar formas cocoideas); se monta un fresco para observar la movilidad; son oxidasa y catalasa positivos; para diferenciar entre las especies se puede montar un API o se realizan varias pruebas => (1) crecimiento a distintas temperaturas, (2) sensibilidad al acido nalidixico y a la cefalotina (3) hidrlisis del hipurato (se introduce una tableta dentro de un tubo inoculado, dar + si cambia a color amarillo). Campylobacter jejuni => crecimiento a 42C, hipurato+, sensibilidad a Nalidixico y resistente a Cefalotina Campylobacter coli => crecimiento a 42C, hipurato-, sensibilidad a Nalidixico y resistente a Cefalotina Campylobacter fetus => no crecen a 42C, hipurato-, resistente a Nalidixico y sensible a Cefalotina Campylobacter laridis => crecimiento a 42C, hipurato-, resistente a ambos Nalidixico y
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Cefalotina Patogenia y patologia - C.jejuni es la especie con mayor frecuencia se asocia a infeccion en el hombre (gastroenteritis con eliminacin de sangre en heces), se adquiere por via oral (comida y bebidas contaminadas) o por contacto con animales infectados; sensible a pH gstrico (debe ingerirse una concentracin elevada de ellos para que se produzca infeccion); se multiplica en el intestino delgado, invade el epitelio y produce inflamacin; en ocasiones puede pasar al torrente circulatorio y desarrollarse un cuadro de fiebre entrica; la diarrea acompaada de dolor abdominal agudo, dolor de cabeza y fiebre; la infeccin es autolimitada resolviendose en una semana sin necesidad de ATB; los casos graves se trata con eritromicina.

Helicobacter Pylori - se aislaron por 1 vez (1982) del estomago de pacientes con lesiones gstricas y ulcera pptica; son bacilos curvados Gram- con forma de espiral y gran actividad ureasa; se les denomino Campylobacter pyloridis, posteriormente se rectifico a Campylobacter pylori y cuando demostraron que difera morfologicamente del genero Campylobacter, se propuso la creacin de un nuevo genero Helicobacter que se incluyo la especie de Helicobacter pylori; se trata de una especie de reciente descubrimiento, implicada en procesos de infeccin gstrica. Metodos de deteccin de H.pylori - Metodos directos => las muestras mas idneas para el aislamiento de H.pylori son las biopsias de las zonas pliegues de la mucosa gstrica del antro, cuerpo y fundos; se remitirn directamente al laboratorio para proceder a su cultivo inmediato en medios especficos para H.pylori; una porcin de la biopsia se invertir en la realizacin de un frotis para la tincin Gram o Giemsa. - Incubacin => las placas deben incubarse en condiciones reducidas de O2 (5%), de 10% CO2 y 85% N2. Se consigue mediante sistema de evacuacin-reemplazo o usando jarras de anaerobios con sobres comerciales que generan dicha atmsfera; la temperatura optima es de 37C (no se desarrolla a 25C, 30C ni 42C); en aislamiento primario, es conveniente incubar las placas hasta 7 das; Las colonias son de 1-2 mm de dimetro, translucidas y poco hemolticas. - Identificacin => son oxidasa+, catalasa+, ureasa+, hipurato- (algunas cepas son capaces de virar la urea de Christensen en minutos); es sensible a la cefalotina y resistente al nalidixico (algunas cepas pueden ser sensibles); no son fermentadora de carbohidrato; crece a 37C. Metodos indirectos : - Prueba de la urea rpida (de Christensen) => un trozo de biopsia se inocula en un medio con alta concentracin de urea y un indicador de pH. - Prueba de la urea respiratoria => el paciente ingiere urea marcada y tras un periodo de
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tiempo se mide el nivel de CO2 espirado; se puede emplear urea marcada con C13, que se detecta con un espectrofotmetro de masas y urea marcada con C14 detectada con un contador de centelleo (un mtodo diagnostico rpido y no invasivo, pero requiere un equipo especial par al lectura). - Prueba serologa => para detectar Acs utilizando la tcnica de ELISA. Patologa existen pruebas claras de que H.pylori esta implicado en diversas patologas gstricas, pero se cuestiona como la causa de dichas infeccin; parece claro que es agente etiolgico de gastritis aguda; se piensa que tambin pueda tener un papel en la gastritis crnica activa; en las ulceras ppticas se asla 100% de pacientes con ulcera duodenal y 77% de ulcera gstrica; parece ser que su presencia no es suficiente para desarrollar la ulcera; no esta claro el papel que desempea en la dispepsia no ulcerosa, en el reflujo gastro-esofgico y en el carcinoma gstrico; hasta 50% de la poblacin adulta de >60 aos es portadora de este microorganismo; se desconoce su modo de transmisin; se ha propuesto una posible adquisicin del mismo por contacto con animales, regin periodontal y transmisin persona-persona (ninguno estn demostrados) Sensibilidad antibitica - H.pylori es sensible in vitro a un gran numero de ATB, pero, el tratamiento in vivo es difcil; nunca se emplea mono-terapia porque no es eficaz, suelen administrarse varios frmacos juntos y aun as no se consigue erradicar al m.o. por lo que son frecuentes las recadas tras la supresin de la terapia.

Tema 25 VIROLOGA CLNICA (caractersticas generales de los virus)


Introduccin - virus es un parsito intracelular estricto que requiere infestar una clula para sintetizar sus componentes y ensamblar nuevos viriones; son de muy pequeos tamaos (filtrables) y se caracteriza por su mecanismo de replicacin, organizacin y composicion; virologa clnica se remonta al siglo XX y la composicion de un virus fue determinada por Schlesinger en 1933; en los ltimos aos se han descubierto otros agentes infecciosos mas simples como los viroides y los priones; - los viroides => moleculas circulares de ARN de bajo Pm sin cubierta proteica que causan enfermedades a las plantas, infectar a los hombres y animales; - los priones => son protenas que parecen estar codificadas por genes celulares y actan como seales reguladoras en las celulas que invaden, resistentes a los procesos fsico-qumicos que inactivan a los virus y no producen respuesta inmune o inflamatoria en el husped; provocan prurigo lumbar de las ovejas y cabras (scrapie), encefalopata espongiforme en las vacas y enfermedades neurodegenerativastransmisibles en el hombre (p.ej. CreutzfeldtJacob /encefalopata espongiforme progresiva y sndrome de Gerstman-Straussler136/168

Streinker y el kuru); la patogenia (de todas) se caracterizan por desordenes progresivos como ataxia (dificultad motrica), demencia, deterioro cognitivo y motor; tras un periodo de incubacin largo (meses o aos), aparecer los sintomas clnicos; el tropismo de la infectividad es SNC, seguido por el bazo y ndulos linfticos; en el cerebro se detecta acumulacin anormal de protena-prion en el genoma del husped; los priones son resistentes a las proteasas e induce una degeneracin neuronal.

Concepto de virus - es un bloque de material gentico (ADN o ARN) rodeado de una cubierta protena (cpside) que le sirve como vehculo para su transmisin; algunos presenta membrana lipdica (envuelta) que se adquieren de la membrana citoplasmtica de la clula infectada durante el proceso de salida; los virus envueltos tienen un matriz proteica que sirve como puente entre la nucleocpside y la envoltura; carecen de organelas citoplasmticas para crecer y multiplicarse, por lo que necesitan la maquinaria de una clula husped, pero si poseen algunos enzimas (nucleasas, transcriptasas, etc.); virines la partcula viral completa (genoma + nucleocpside); se clasifican por el tipo de husped que parasitan (virus animales, vegetales, bacterifagos)

Estructura y morfologa de los virus - son de tamao entre 20-25 nm hasta 200-300 nm; su observacin requiere un microscopio electrnico. - Estructura del genoma => ADN o ARN mono-catenario o bicatenario; la mayora de
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virus ARN tienen genomas mono-catenaria excepto los reovirus/rotavirus (bicatenario); los virus ADN suelen ser bicatenario, excepto parvovirus (mono-catenario); los genomas (core o ncleo) pueden ser moleculas lineales o circulares nicas o segmentadas en varios fragmentos. - Estructura de la cpside => su funcin es de proteger el genoma del medio extracelular y facilitar la entrada al interior de la clula; estn compuestas de subunidades proteicas repetidas (capsmeros) que a su vez estn compuestas de moleculas proteicas (protmeros); segn la disposicin que adopten los capsmeros /la cpside, se clasifican en virus de simetra helicoidal (normalmente son virus ARN), icosaedrica (20 caras triangulares y 12 vrtices) y compleja. - Estructura de la envoltura => los lpidos de la envoltura es lipoprotica y procede de la membrana clula infectada, pero las protenas suelen ser virales desplazados a las protenas celulares originales; en algunos casos, las protenas incluyen una matriz (protena M) que contacta/ engancha con la nucleocpside; los virus envueltos tienen estructuras glucoproticas (espculas) importantes para los procesos de adsorcin y penetracin al interior de la clula.

Ciclo vital de los virus - las estrategias de replicacin varan dependiendo de la estructura del virus y de su material genmico, pero en general conlleva pasos de => adsorcin/ adherirse - penetracin - decapsidacin - replicacin - ensamblaje - liberacin. - Adsorcin => la unin de la partcula viral a la superficie de la clula; no requiere energa y no depende de la temperatura; intervienen moleculas proteicas de la superficie del virin (protenas de unin) y protenas de la superficie de la membrana de
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la clula diana (protenas receptoras); en los virus envueltos, la protena de adherencia viral son las espculas de la capa externa de la envoltura. - Penetracin => tras ser adherido, se penetra el virin completo o solo el genoma y las polimerasas entran en el citoplasma celular, esto se lleva a cabo por 3 mecanismos: penetracin directa, endocitosis o fusin; penetracin directa => la membrana solo permite la entrada del genoma viral (ocurre en virus sin envuelta p.ej. fagos); endocitosis=> los viriones adsorbidos, quedan rodeados por la membrana citoplasmtica de la clula husped formndose una vescula endosmica (mecanismo mas utilizados de losvirus sin envuelta); fusin => utilizado por los virus envueltos; existen 2 maneras de fusin: en los paramyxovirus, su envuelta se fusiona con la membrana citoplasmtica directamente y la nucleocpside se libera al interior del citoplasma; en el resto de virus envueltos, la envoltura viral se fusiona con la membrana celular formndose una vescula endosmica que posteriormente libera la partcula viral hacia el citoplasma. - Decapsidacin => se degrada la cpside viral para que el genoma viral pueda liberarse e iniciar la transcripcin y la traduccin; en la mayora la penetracin y la decapsidacin se produce a la vez.

- Replicacin => es la fase donde se produce la sntesis de todas las macro-moleculas virales; la clula husped debe proporcionar la energa y los medios suficientes que a veces puede afectar su propio metabolismo celular, pero en otros casos apenas se alteran; es esencial que los ARNm transcriban la informacin viral y la replicacin de la informacin gentica y que posteriormente mediante los componentes celulares se traducen para fabricar protenas que se necesitan. a. Replicacin de virus ADN bicatenario => tras la adsorcin y la penetracin, el ADN viral es liberado y penetra en el ncleo + ARN polimerasas celulares => ARNm transcrito y traducido para la sntesis ADN viral; para el proceso de traduccin => ARNm emigra al citoplasma celular y es traducido para formar las protenas de la cpside => que posteriormente son transportadas al ncleo para ensamblar el virin completo que sern liberados por lisis celular; la excepcin dar al virus ADN poxvirus (grande y de simetra compleja) que realiza el proceso de transcripcin y traduccin en el citoplasma celular utilizando su propia ARN polimerasa dependiente del ADN viral, ya que no pueden utilizar ARN de la clula husped que se localiza en el ncleo. b. Replicacin de virus ADN mono-catenario (fagos, parvovirus) => necesitan un intermediario replicativo para formar ADN bicatenario que puede transcriben el ARNm (ARN polimerasa celular necesita como plantilla una ADN bicatenario); como resumen: ADN mono-catenario + ADN polimerasas de la clula husped => produce ADN
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bicatenario + ARN polimerasas celulares => forma ARNm c. Replicacin de virus ARN mono-catenario de polaridad (+) => ARN viralpenetrado en el citoplasma de la clula husped es reconocida de inmediato como ARNm por los ribosomas, los cuales la captan e inician su traduccin a protenas virales y tambin un enzima RNA polimerasa (transcriptasa); RNA polimerasa producida + ARN viral (se utiliza como molde) => replicacin del ARN viral (todo ocurre en el citoplasma independientes del ADN del husped). d. Replicacin de virus ARN mono-catenario de polaridad (-) => su ARN de polaridad (-) complementa el ARNm que es de polaridad (+); mediante su propio ARN polimerasas sintetizara el ARNm que despus le servir de molde para la sntesis de nuevo ARN de polaridad (-) y tambin para la traduccin de sus protenas utilizando la maquinaria celular. e. Un caso especial de Retrovirus => virus ARN mono-catenario de polaridad (+) queposeen un enzima transcriptasa de reversin (transcriptasa inversa / retro-transcriptasa); su genoma ARN + retro-transciptasa => produce ADN de polaridad (-) + (la misma) retrotranscriptasa => origina ADN bicatenario que se integran al ADN celular y permanece alli durante tiempo prolongado; En un momento dado el ADN integrado se reactiva y es transcrito a ARNm vrico por la polimerasa del husped y entonces, se completa el ciclo replicativo.

- Ensamblaje y liberacin => se puede producir tanto en el ncleo como en el citoplasma, tras la replicacin del genoma viral y la transcripcin de las protenas virales, los viriones se ensambla y se libera de la clula husped; consiste en la unin ordenada del acido nucleico y de las protenas para formar la nucleocpside, dando lugar a un virin viable; la liberacin de los virus sin envuelta (desnudos) se produce por lisis celular; en caso de virus envueltos, salen al exterior por gemacin de una zona de la membrana nuclear o citoplasmtica (depende si son virus ADN o ARN); la zona de la membrana por donde se producir la gemacin, adquiere primero las espculas y las protena de la matriz (codificadas por el virus), que atrae a la nucleocpside, fusionndose a la membrana, formndose la envuelta y liberndose el virin al exterior; en caso de poxvirus(mas grandes y complejos), estos pueden sintetizar sus propias envueltas; en caso deretrovirus, el virus no se libera de la clula sino que se integra en su genoma y permanecer as largo tiempo o de por vida; el proceso de ensamblaje y liberacin es a veces ineficaz, formndose partculas no infectivas.

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Taxonoma vrica - los virus se dividen en familias, genero, especie o tipo y segn su forma del genoma, tamao, forma, estructura, sintomatologa clnica que producen, tropismo celular, etc; segn el tipo de genoma que contienen y su estructura => se clasifica en virus ARN y virus ADN. Virus ARN 1. De simetra cubica o icosaedrica sin envuelta - mono-catenario de polaridad (+) que utiliza su propio ARN como mensajero (pueden ser inmediatamente traducidos por la clula husped ya que no se necesita transcribir ARNm) con la excepcin de Reoviridae(bicatenarios) que utilizan su propia ARN polimerasa para transcribir ARNm; todos se ensamblan en el citoplasma de la clula husped y son resistentes al ter. - Familia Reo-viridae => tamao intermedio (60-80 nm de dimetro), los nicos bicatenarios; el mas importante para el hombre es el Rotavirus (provoca problemas diarreicos), tiene forma redonda.
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- Familia Calici-viridae => son pequeos (35-39 nm), tienen poca importancia en microbiologa clnica; el mas importante /patgeno para el hombre es el virus de Norwalk(productor de gastroenteritis) y el virus de Hepatitis E (su inclusin no es definitiva)

- Familia Picorna-viridae => son pequeos (20-30 nm); los gneros mas importantes son losEnterovirus (>70 enterovirus que incluyen el Poliovirus, Echovirus, Cosxackievirus y el virus de la hepatitis A) y los Rhinovirus (>100 rhinovirus).

2. De simetra cubica o icosaedrica con envuelta - mono-catenario de polaridad (+), todos se ensamblan en el citoplasma de la clula husped y son sensibles al ter. - Familia Retro-viridae => son grandes +/- 100nm, de elevado Pm, contienen trazas de ADN y poseen transcriptasa inversa (retro-transcriptasa) en su dotacin; adquieren su envoltura en la membrana citoplasmtica de la clula husped; se engloban todos los virus ARN tumorales; se divide 3 subfamilias: Oncoviridae (causan tumores y canceres), Spumaviride yLentiviridae (dentro de esta estara VIH).

- Familia Toga-viridae => son de 40-70 nm y adquieren su envoltura en la membrana citoplasmtica; se incluyen la mayora de los arbovirus (transmitidos por artrpodos - los arbovirus pertenecen a numerosas familias como Togaviridae, Flaviviridae, Arenaviridae, Reoviridae); se incluyen tambin los no arbovirus: Alphaviruscon virus Sindbis su principal tipo, Pestivirus con el virus de la diarrea mucosa como su principal tipo y Rubivirus con rubeolavirus su principal tipo.

- Familia Flavi-viridae => son de 40-50 nm y adquieren su envoltura en las membranas


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intra-citoplasmticas (antes se incluyen dentro de la familia Togaviridae y los han separado por su menor tamao y por el lugar de su ensamblaje que ocurre en el retculo endoplasmtico); incluyen 2 gneros de importancia clnica: (1) Flavivirus (antes llamados arbovirus del grupo B) que destaca el virus de la fiebre amarilla y del dengue; (2) virus de la Hepatitis C; actualmente se incluye de manera no definitiva al virus de la hepatitis G.

3. De simetra helicoidal - todos son envueltos, mono-catenario de polaridad (-) que utiliza su propia transcriptasa (ARN polimerasa) para transcribir ARNmensajero; se ensamblan en el citoplasma y son sensibles al ter. - Familia Rhabdo-viridae => de forma bala o bastn; el dimetro del cilindro +/- 70nm con longitud de 175nm; adquieren su envuelta en la membrana citoplasmtica; el genero mas importante es virus de la rabia.

- Familia Paramyxo-viridae => de tamao 150-300nm, son pleomrficos predominandoformas esfricas rugosas y filamentosas; adquieren su envuelta en la membrana citoplasmtico; se incluyen 3 gneros: Paramyxovirus (virus de la parotiditis/paperas, parainfluenza tipos 1,2,3,4A,4B...), los Morbilivirus (virus del sarampin, entre otros) y los Pneumovirus (virus sincitial respiratorio - causan bronquiolitis en nios pequeos).

- Familia Orthomyxo-viridae => morfolgicamente semejante a la familia Paramyxoviridaepero mas pequeos 80-120nm, parecidos tambin a la familia Rhabdoviridae (los 3 proceden de un ancestro comn); adquieren su envoltura en la membrana citoplasmtica; se incluyen2 gneros: los virus de la influenza o de la gripe tipos A, B y C.

- Familia Arena-viridae => de tamao 50-300nm, adquieren su envoltura de la


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membrana citoplasmtica; algunos producen infecciones virales "lentas"; el mas importante es virus de la fiebre de Lassa (en Africa).

- Familia Bunya-viridae => de tamao 80-100nm, de forma esfrica, adquieren su envoltura en el aparato de Golgi; la mayora de los gneros son arbovirus.

- Familia Corona-viridae => de tamao 80-130nm, morfolgicamente se parecen a Orthomyxovirus, pero sus proyecciones en la superficie a modo de ptalos o "corona solar"; adquieren su envoltura en las membranas intra-citoplasmticas; la mayora de los gneros son virus respiratorios de vas altas.

Virus ADN a. De simetra cubica o icosaedrica sin envuelta - su genoma es ADN bicatenario con excepcin de Parvo-viridae (mono-catenario); todos se ensamblan en el ncleo y sonresistentes al ter - Familia Adeno-viridae => de tamao mediano 70-90nm; se conocen 34 tipos que afectan al hombre y mucho de ellos afectan el tracto respiratorio.

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- Familia Parvo-viridae => de tamao muy pequeo 18-26nm con genoma ADN monocatenario; la mayora no tienen importancia clnica, excepto parvovirus B19, pertenece al genero Parvovirus que causa eritema infeccioso.

- Familia Papova-viridae => son de tamao pequeos 45-55nm con ADN de tira circular; el genero mas importante es el Papilomavirus o virus de las verrugas con 66 tipos depapilomavirus humanos (PVH); los Papovavirus en general producen enfermedades latentes y crnicas y algunos son oncognicos.

b. De simetra cubica o icosaedrica con envuelta - son bicatenarios y todos se ensamblan en el ncleo con excepcin de Irido-viridae que se ensamblan en el citoplasma. - Familia Herpes-viridae => de tamao medio +/-100nm, adquieren su envoltura en la membrana nuclear y son sensibles al eter; de los 80 virus que existen, solo 8 tienen inters clnico para el hombre y se divide en 3 subfamilias: (1) Alphaherpesviridaecon gneros importantes el virus Herpes simples tipo 1 y 2 y el virus Varicella-zoster; (2)Betaherpesviridae con gneros Citomegalovirus al citomegalovirus humano (Herpesvirus humano tipo 5) y al Herpesvirus humano tipo6, y al genero Roseolovirus con elherpesvirus humano tipo 7; (3) Gammaherpesvirus que incluyen virus de Epstein-Barr(herpesvirus humano tipo 4) que provoca enfermedad de Beso, pertenece al generoLimphocriptovirus.

- Familia Hepadna-viridae => de tamao 40-50nm, adquieren su envoltura en el citoplasma, son resistentes al ter y poseen un genoma ADN parcialmente bicatenario; el mas importante es el virus de la hepatitis B.

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- Familia Irido-viridae => de tamao grande 130-300nm, sensibles al ter, adquieren su envoltura en la membrana citoplasmtica y tambin se ensamblan en el citoplasma (a diferencia de otros); no tienen importancia clnica para el hombre, pero si en veterinariacomo el virus de la fiebre porcina africana.

c. De simetra compleja - Familia Pox-viridae => son virus animales mas grandes 230x400nm de forma ladrillo o ovoide; se caracteriza como la nica familia de virus ADN que se replica y ensambla en el citoplasma, pues contienen una RNA polimerasa ADN dependiente (no necesita la maquina nuclear), de hecho su replicacin es posible en celulas a-nucleadas (sin ncleo); sonresistentes al ter y poseen una doble envuelta (una la adquieren en el aparato Golgi y la otra en la membrana citoplasmtica; los mas importante son virus de la viruela, virus de la vacuna o vaccinia y virus del molluscum contagiosum.

Principales familias de virus de inters clnico 1. Virus ARN (mono-catenario) 1.1. Familia Reo-viridae (tamao mediano 60-80nm - icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el citoplasma) - contiene 6 gneros, nicamente cabe destacar Rotavirus)
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Rotavirus (forma de rueda - el nico bicatenario) => descubiertos en 1973 en nios con gastroenteritis; el nico con importancia clnica (agente causal degastroenteritis espordica y epidmica en lactantes y nios; la infeccin suele ser asintomtica en neonatos; afecta principalmente a nios entre 6-24 meses; la prevalencia mxima en invierno y raramente en verano; periodo de incubacin 1-3 das, precediendo los vmitos a la diarrea que suele mantenerse de 4-5 das; el virus se detecta en heces (dura bastante horas fuera del husped) 1.2. Familia Calici-viridae (pequeos 35-40 nm - icosaedrica - sin envuelta - de polaridad+) - se ensamblan en el citoplasma) => tiene poca importancia en clnica, posibles agentes causales de gastroenteritis en cualquier da del ao y a cualquier edad; es el agente Norwalk (virus que causan gastroenteritis en EEUU) que ahora esta dentro de Parvovirus Parvoviridae; se incluye de forma no definitiva el virus de Hepatitis E. 1.3. Familia Picorna-viridae (virus muy pequeos 20-30nm - icosaedrica - sin envuelta de polaridad+) - es una familia importante y una de las que mayor numero de virus presenta, destacando 2 gneros Enterovirus y Rhinovirus. Enterovirus - se asocian con distintos sndromes clnicos como parlisis, meningitis asptica, encefalitis, miocarditis, pericarditis, pleurodinia, herpangina, infecciones agudas del tracto respiratorio y fiebre aftosa; son habitantes transitorios del tracto digestivo humano; existen >70 sero-tipos, siendo el tipo 72 es el virus de la Hepatitis A; todos se diseminan por va fecal-oral y la mayora son asintomticas; los mas importantes sonPoliovirus, Echovirus y Coxsackievirus; - Los virus de poliomielitis /Poliovirus son tres (tipos 1,2 y 3), mas temidos normalmente por la parlisis flcida (de cintura para-bajo) y deformidades aunque son complicacin infrecuente; la vacuna es de Sabin (virus atenuados), tambin Salk (virus inactivados); la vacuna de poliomielitis se administra a los nios de 2-4-6-18 meses.

- Los virus Echo y Coxsackie tienen distintas manifestaciones (muy ubicuo/ de todo tipo). Para el diagnostico debe recurrirse al cultivo; el aislamiento de un enterovirus de heces o de faringe no indica necesariamente una relacion causal con el cuadro clnico, y deben descartarse otras causas; por el contrario si se trata de LCR. Rhinovirus - agentes etiolgicos mas frecuentes del resfriado comn (rinitis agudas); existen >100 tipos 1.4. Familia Toga-viridae y Familia Flavi-viridae (toga=envuelta - icosaedrica - de polaridad+ - se ensamblan en el citoplasma); ambos son de forma icosaedrico, virus de RNA mono-catenario con envuelta; se incluyen la mayora de los arbovirus; losv.Togaviridae (pequeo 40-70 nm, adquiere su envuelto en la
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membrana citoplasmtica de la clula mientras los v.Flaviviridae (40-50 nm, lo adquieren de retculo endo-plasmtico; dentro de Togaviridae estn los arbovirus y los gneros no arbovirus como Alphavirus(sindbis), Pestivirus y Rubivirus (rubeola) dentro de Flaviviridae esta el virus Hepatitis C y otros que producen enfermedades como fiebre amarilla, dengue, de genero flavivirus que pertenecen a los arbovirus tipo B (transmitidos por artrpodos). Virus de la Rubeola del genero Rubivirus (no es un arbovirus) - descrito hace >200 aos; consta la importancia como agente causal de malformaciones congnitas desde la epidemia de 1940 en Australia (un oftalmlogo australiano constato un elevado numero decataratas congnitas y ceguera asociados a esta enfermedad); la infeccin suele ser benigna y auto-limitada; sintomas => procesos respiratorios superiores leves, erupcin eritematosa y linfadenopata sub-occipital y retro-auriculares; en adultos se puede complicar con artritis transitoria o artralgias; rara vez produce encefalitis o purpura trombocitopnica; muy importante la infeccin en gestantes por posibles aparicin de sordera neuro-sensitiva, alteraciones cardacas, cataratas, retraso del crecimiento y sintomas encefalticos; la incubacin dura 1421 das; diagnosticopor mtodo serolgico (tcnica de ELISA) para detectar IgG y sobre todo IgM en las embarazadas y un resultado positivo indica inmunizacin frente al virus; actualmente es poco frecuente debido a la vacuna obligatoria que se incluye en latriple vrica (paperas, sarampin y rubeola) que se pone a los nios de15 meses (suele dar inmunidad permanente) y una dosis de recuerdo a los 6 aos (solo las nias); a los 11 aos solo se dan vacuna de varicela. Clnica de Rubeola => empieza con eritema en la cara y se extiende hacia abajo (es un eritema maculo papuloso); es menos llamativo que de la sarampin; dura +/- 3 das y puede haber enantema palatino.

1.5. Familia Retro-viridae (de tamao grande +/- 100nm - icosaedrica - con envuelta - de polaridad+ - se ensamblan en el citoplasma) => poseen enzima transcriptasa inversa / retrotranscriptasa; a esta familia pertenece el virus de la inmuno-deficiencia humana VIHque se estudia aparte. 1.6. Familia Orthomyxo-viridae (de tamao 80-120nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) - en1918 tras la Guerra Mundial, mato mas personas que la propia guerra; esta compuesta por los distintos tipos de virus influenza/ Gripe (tipo A, B y C). Virus Influenza /la gripe espaola (empez en Espaa) - causan gripe, infeccin respiratoria aguda epidmica normalmente durante mes de noviembre-abril; la va de transmisin es area, periodo de incubacin 1-4 das, seguido de clnicas tipo respiratorias superior, mas grave en los ancianos; se realizan campaas de vacunacin todos
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los aos (sobre todo a los ancianos y pacientes bronco-pulmonares), ya que presentan gran variabilidad antignica segun el serotipo que causa la epidemia (tiene gran poder mutagnico); existe 3 tipos => A, B y C (A y B causan epidemias de importancia); los influenza A se subdividen segn la diferente composicion antignica (en la envoltura) de la hemaglutinina y la neuraminidasa; el diagnostico es clnico; recientemente se introduce metodos de diagnostico de muestras clnicas de antgenos virales; el de mayor importancia clnica es virus respiratorio sincitial (VRS); para el diagnostico rpido se usa la inmuno-fluerescencia directa en aspirados naso-faringeos, esputos o biopsia de pulmn;existe un kit con Ags virales para detectarlos. 1.7. Familia Paramyxo-viridae (de tamao grande 150-300nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) => morfolgicamente parecida al de anterior/ Orthomyxoviridae; todos ellos son causas importantes de enfermedad respiratoria en los nios; se incluyen 3 gneros Paramyxovirus (virus de la parotiditis/paperas y parainfluenza), Morbilivirus (virus del sarampin), Pneumovirus (virus sincitial respiratorio) Virus Parainfluenzae (VPI) del genero Paramyxovirus - los 5 tipos de VPI producen infecciones del tracto respiratorio, siendo el 1 y el 2 los principales causantes de laringotraqueobronquitis, el 3 de bronquiolitis y neumnia en nios (segundo agente despus del VRS), el 4 y el 5 causan infecciones mas suaves; el diagnostico es clnico. Virus respiratorio sincitial (VRS) del genero Pneumovirus - es la causa mas importante de neumnia y bronquiolitis en nios y recin nacidos; produce un amplio espectro de infecciones, siendo la mas frecuente es el resfriado comn con abundante rinorrea; VRS esmuy contagioso y se manifiesta en forma de brotes invernales; la inmunidad no es completapor lo que se dan las re-infecciones (mas suaves); Es importante que la excrecin de virus se mantenga durante 2 o 3 semanas (mas tiempo para los inmunodeprimidos), por lo que al ingresar un nio en el hospital durante 1 o 2 semanas, puede ser contagioso todava (es el agente mas frecuente de infeccin nosocomial en pediatra); las infecciones graves se trata con la ribavirina (inhibe la sntesis del ARN viral); el diagnostico rpido es la inmunofluorescencia en secreciones respiratorias. Virus del Sarampin - causa una enfermedad aguda, febril, exantemtica, de gravedad variable que afecta a nios de 5-9 aos, se contagia por va respiratoria y conjuntival;sintomas clnico => los primeros das como un catarro naso-oculo-faringolaringeo, luego aparece fiebre, cara rubicunda, congestin de mucosa y a los 34 das aparece "manchas Koplik" (manchas blanquecinas diminutas delante del 1 y 2 molar) dura un par de das; empieza aparecer exantema, primero retro-auricularmente, despues se extiende a todo el cuerpo, las palmas y las plantas de los pies mas tenue en zonas distales, sube a la fiebre y el exantema tenue se hace muy eritematoso; tras 2-3 das mejora bruscamente y desapareciendo los signos en el orden del aparecimiento (dar inmunidad permanente); el diagnostico es por metodos serolgicos.

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Virus de la parotiditis - es una enfermedad endmica con incidencia todo el ao; es rara en nios < 1 ao, gracias a la inmunidad de la madre; afecta a nios de 5-14 aos, se transmite por va area y por objetos introducidos a la boca (dar inmunidad permanente); clnica => tras 24horas de clnica inespecifica, aparecern dolor y tumefaccin de retro-parotidia y odo, aumento de fiebre, puede haber afectacin de nervio facial leve y bilateral; complicacin => meningitis, orquitis, pancreatitis o artritis; diagnostico es por va serolgico; el diagnostico es por metodos serolgicos.

1.8. Familia Rhabdo-viridae (de tamao grande en forma de bastn, dimetro 70nm y longitud 175nm - helicoidal - con envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) => caracterstica tpica de su morfologa es forma de "bala"; el mas importante es el causante de la rabia o hidrofobia (se atraganta con el agua). Virus de la rabia - causa enfermedad infecciosa aguda del SNC, de gran importancia histrica por los trabajos de Pasteur; existe la obligacin de vacunar todos los aos a perros y gatos, ya que es una zoonosis en la que el hombre es un eslabn irrelevante; existen 2 formas epidemiolgicas => urbana (lo adquieren perros y gatos no inmunizados) y salvtica (los zorros); normalmente el virus esta presente en la saliva de animales rabiosos, transmitindose por mordeduras (son fuentes de infeccin humana); el diagnostico sola realizarse postmortem, mediante la observacin de los cuerpos de Negri (cerebro); tambin se pueden cultivar en laboratorio; clnica de animales => cambian de carcter, se vuelven caprichosos, pierden apetito, ingerir objetos no engullibles autllan con ronca, irritabilidad creciente y muerden a personas y animales; mueren en 2 semanas; clnica de humanos => la incubacin 1-3 meses depende del lugar de la mordedura; el virus se propaga por los nervios a una velocidad 1mm/hora; comienza con la alteracin del sueo, dolor de la mordedura, tambin parestesias/ hormigueos de la zona, trastornos respiratorios (en la voz), posteriormente aparece espasmos farngeos tras la ingestin de lquidos o solo de verlo (hidrofobia), salivacin espumosa y espasmos en las extremidades (basta con pequeos estmulos de luz o ruidos, para provocar lo); las personas suelen morir por parlisis en pocas horas tras la afectacin de bulbo-raqudeo; el cuadro normal es de 3-6 das, despus mueren.
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1.9. Familia Corona-viridae (de tamao 80-130nm - helicoidal - envuelta - de polaridad (-) y se ensamblan en el citoplasma) => adquieren su envoltura (con proyecciones a modo de ptalos/ corona solar) en las membranas intra-citoplasmticas; escasa importanciaen patologa, nicamente causan el resfriado comn y pueden estar involucrados en cuadros de gastroenteritis. 2. VIRUS ADN (bicatenario) 2.1. Familia Parvo-ridae (de tamao muy pequeo 18-26nm - icosaedrico - sin envuelta se ensamblan en el ncleo - resistentes al eter) => son de tamao muy pequeo y sonlos nicos que presentan ADN de una sola hebra (mono-catenario); algunos tienen importancia en veterinaria y solo destaca uno como patgeno humano (Parvovirus B19). Parvovirus B19 (estaban incluidos en virus Norwalk) - fue vinculado al eritema infecciosoen 1983; es benigna y afecta nios en edad escolar; presentan una erupcin eritematosa en las mejillas (cara enbofetada) y un exantema en extremidades y tronco (respeta a las palmas, las plantas y los labios); los adultos son propensos a artropata asociada, que se resuelve en 2-4 semanas; diagnostico por mtodo serolgico y metodos de ELISA.

2.2. Familia Papova-viridae (de tamao pequeo 45-55nm - ADN de tira circular icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el ncleo - resistente al ter) => son unos viruses oncognicos (efecto cancergeno), producen enfermedades latentes y crnicas, causantes verrugas genitales o condilomas (se asocian a carcinoma de crvix) y papilomas(Papilomavirus/ virus Papiloma humano); el diagnostico es de tipo clnico y serolgico; prevencin => se vacunan a las nias de < 14 aos. 2.3. Familia Adeno-viridae (de tamao mediano 70-90nm - icosaedrico - sin envuelta - se ensamblan en el ncleo - resistente al ter) => producen principalmente patologa al tracto respiratorio, ocular y gastroenteritis; las infecciones respiratorias solo son significativas en nios <6 aos; el diagnostico se realiza mediante clnicas y tcnicas serologcas. 2.4. Familia Hepadna-viridae (de tamao pequeo 40-50nm - ADN parcialmente bicatenario - icosaedrico - envueltos - se ensamblan en el ncleo - resistentes al ter) => su envuelta se adquiere en la membrana citoplasmtica y se ensamblan en el ncleo; en esta familia se encuentra virus hepatitis B que se estudiara a parte.
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2.5. Familia Herpes-viridae (de tamao medio +/-100nm - icosaedrico - envueltos - se ensamblan en el ncleo - sensibles al ter) => adquiere su envuelta de la membrana nuclear y se ensamblan en el ncleo; destaca 3 subfamilias => Alphaherpesviridae (VHS 1y2, virus Varicella-Zooster), Betaherpesviridae (CMV y Roseolovirus), Gammaherpesvirus (VEB/Limphocriptovirus); todos los virus producen infecciones latentes, capaces de reactivarse. Virus Herpes Simple (VHS) - producen infecciones latentes que se reactivan con o sin lesiones que sirven de fuente de infeccin para individuos susceptibles (los virus de Herpes no se cura, solo se acantona y se puede reactivar); existen 2 tipos => VHS-1 (tropismo por lesiones por encima de la cintura y suele ser leve) y VHS-2 (se encuentra principalmente en los genitales, transmitindose por va venrea); cada individuo tiene un tropismo estable;suele ser bucal, comienza con hormigueo y luego aparecen vesculas, costra y desaparece en +/- 1 semana; VHS-1 se transmite por secrecin oral, infeccin a nivel perioral, tambin otras zonas como los ojos; VHS-2 normalmente daran infeccin genital y se contrae por va sexual; en EEUU en ciertas capas sociales, es la enfermedad venrea mas frecuente; en mujer gestante se puede transmitir al bebe va placenta o canal de parto o en los primeros das de vida; en general estos virus tienen capacidad oncognicos como VEB (virus Epstein-Barr), puede producir cncer cervical; el diagnostico se realiza mediante la tincin de Giemsa de celulas raspadas de lesiones herpticas, para observar las caractersticas de las celulas gigantes multi-nucleadas; tambin se cultivan en SHELLVIAL.

Citomegalovirus (CMV) - producen infeccin asintomtica, pero con gran importancia en huspedes inmuno-comprometidos; las infecciones se pueden clasificar en congnitas, peri-natales o pos-natales (antes o despus del parto); es la causa mas frecuente de infeccin congnita; el CMV se ha detectado en saliva, orina, leche materna, semen, por lo que su transmisin es variada; tambin se transmite por transfusiones o trasplantes; en pacientes inmuno-competentes, normalmente son asintomtica, si da clnica va a ser semejante a mononucleosis infecciosa (virus Epstein-Barr), comofiebre, adenopatias, hepatomegalia; en paciente inmunodeprimidos es diferente, en general dar fiebre, neumonitis, colitis, esofagitis, hepatitis, infeccin congnita y perinatal, puede dar retraso mental, ictericia y sordera; el diagnostico => por serologa buscando Acs anti CMV (metodos ELISA), cultivo en SHELL-VIAL (artificial) ya que no se pueden cultivar en celulas vivas. Virus Varicela-Zster (VVZ) - la varicela y el herpes zster representan diferentes manifestaciones clnicas de un mismo virus; la varicela es mas frecuente en nios y se caracteriza por fiebre y exantema vesicular generalizado; es una infeccin primaria mientras su re-activacin producir el herpes zster, aparece normalmente en adultos (cuando hay una disminucin de la inmunidad) que consiste en una erupcin dolorosa circunscrita de lesiones vesiculares, acompaada de inflamacin de las races dorsales de los
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nervios raqudeos o de los ganglios sensitivos craneales; los estadios son => macula ppula - vescula - umbilicacin - costra; caractersticamente existe estados evolutivos todos mezclado a la vez y prurito sobre todo en el tronco y cara (menos en las extremidades); el diagnostico sera tipo clnico y tambin por los distintos metodos en laboratorio => examen directo previa tincin Giemsa por microscopio electrnica, por serologa (ELISA) y por cultivo celular.

Virus de Epstein-Barr (VEB) - es uno de los virus humanos mas ubicuos, linfotrpico y oncognico; la infeccin primaria suele pasar en la infancia, aumentando su seroprevalencia 60-70% en jvenes y 80-90% en adultos; el sndrome clnico mas frecuente es lamononucleosis infecciosa (enfermedad de beso) que presenta fiebre, adenopatias, faringitis y linfocitosis con linfocitos atpicos; VEB tambin se ha asociado a carcinoma naso-farngeo y al linfoma de Burkitt; diagnostico => la prueba de Paul Bunnell es la deteccin de Acs heterofilos y tambin por mtodo de ELISA.

Herpesvirus Humano 6 (HHV-6) - es un virus de muy reciente aparicin, se ha aislado en sndromes linfo-proliferativos y se ha vinculado al exantema sbito (elevacin brusca de la temperatura hasta 40C de 2-4 das, seguida de un descenso rpido que coincide con la aparicin de un exantema maculo-papular que persiste 1-2 das; el diagnostico sera clnico y serolgico. Herpesvirus Humano 7 - se descubri en 1989 (reciente); tiene tropismo por los linfocitos T, provocando exantema sbito; se investiga si tiene relacion con sndrome de fatiga crnica (que lo padecen sobre todo mujeres mayores). 2.6. Familia Pox-viridae (ADN bicatenario - doble membrana) - son de tamao grande 230-400nm, con forma de ladrillo, se replica en citoplasma y se ensamblan en el citoplasma;el mas importante es el virus de la viruela, virus de Moluscum Contagiosum y virus de la Vaccinia; - Viruela se contagia por inhalacin y tras 15 das aparece fiebre, mialgias

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y erupcin ppula vesicular dura y luego evoluciona a pstulas y a la curacin; a veces puede provocar muerte por exantema hemorragica o una sobre infeccin bacteriana.

- Virus de la Vaccinia es muy prximo al virus de la viruela; en individuos inmunodeprimidos puede provocar complicaciones, pero en los inmuno-competentes es auto-limitado; es importante en los principios de la vacunacin (Jennen); ltimamente se investiga su utilizacin como vector para actuar como vacuna contra virus de Hepatitis B, Herpes simple y VIH, ya que su genoma es susceptible de poder insertarle secuencias de genes que codifiquen protenas de otros virus y que se expresaran posteriormente cuando el virus se replique, con lo cual tendramos Acs contra estos virus.

- Virus de Moluscum Contagiosum - provoca enfermedad cutnea benigna, contagiosa que pueda adquirir por compartir objetos o contacto sexual; aparece en epidermis lesiones nodulares blancas de aspecto nacarado de 2-10 mm que son indoloras; cualquier traumatismo provoca su contagio; desaparece entre 2 meses y 1 ao.

Esquema de Virus Respiratorio

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HEPATITIS VIRAL - es una enfermedad sistmica que afecta fundamentalmente el Hgado; se conocen 7 virus de la hepatitis, denominados A,B,C,D,E,F y G que pertenecen cada uno a familias y gneros distintos, pero que tienen todos un tropismo heptico (no tienen relacin taxonmica); existen adems otros virus que producen hepatitis, comoCitomegalo virus y el virus de Epstein-Barr; se pueden clasificar segn la principal va de transmisin y la tendencia a la cronicidad en 2 grandes grupos(1) transmisin fecal-oral y no cronifican: VHA, VHE y VHF (2) transmisin parenteral y pueden cronificar: VHB, VHC, VHD y VHG. Virus de la Hepatitis A (VHA) - aislado en 1973, pero se sospech mucho antes; virus ARN de la familia Picornaviridae (de pequeo tamao 20-30nm, icosadrica, sin envuelta, polaridad+) dentro del gnero Enterovirus, el tipo 72; la mayora de infecciones son aguda sin cronificarse (<1% fulminante); se encuentra en las heces durante el periodo de incubacin(hasta 2 semanas). Transmisin - se disemina por la ruta fecal-oral (estrecho contacto persona-persona) con la implicacin de agua y alimentos que pueden causar brotes epidmicos; la mayor excrecin del virus en heces se da en las semanas previas a la aparicin de la ictericia, sobre todo en la fase tarda de la incubacin; otras vas de transmisin del virus son posibles pero poco probables; existe casos durante todo el ao, con un pico en otoo. Sintomatologa clnica suele ser menos grave que la hepatitis B; en general, la infeccin es asintomtica y la gravedad aumenta con la edad; el periodo de incubacin 20-45 das, a continuacin suele aparecer fiebre, mialgias, fatiga, ictericia, anorexia, dolor de cabeza o dolor en epigastrio y aumento de las transaminasas (GPT, GOT) y hepatomegalia. Diagnostico requiere la confirmacin del laboratorio; se observ el virus por la primera vez por Feinstone en 1973 y es cultivable, pero se utiliza la serologa basada en la respuesta inmunitaria; el mtodo ms utilizado es ELISA detectando Acs IgMVHA en su fase aguda; tambin se pueden detectar Ags virales en heces (detectar Acs total de IgG y IgM no tiene utilidad clnicamente); IgM suele durar 6 meses; IgG confiere inmunidad y la mayor parte de nuestra poblacin de >40 aos los tienen; hasta la fecha no se han descrito casos de cronicidad.
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Prevencin las medidas ms importantes son la higiene personal, lavado y desinfeccin de manos y objetos contaminados; no es necesario el estricto aislamiento del paciente mientras se mantiene las medidas de desinfeccin-esterilizacin, cloracin y nivel higinico-sanitarias; inmunizacin pasiva => se dispone una inmunoglobulina eficaz tanto paraprofilaxis pre-exposicin (se estudia la relacin coste-eficacia antes de utilizarla/ solo si viajan a zonas endmicas) como post-exposicin; inmunizacin activa => existe una vacuna con buenos resultados (virus inactivados) que se pone al mes, 6 meses y al ao (3x).

Virus de la Hepatitis B (VHB) es un virus ADN de la familia Hepadnaviridae (ADN parcialmente bicatenario, icosadrica con envuelta, resistentes al ter), de gran importancia socio-sanitaria y distribucin mundial (250 millones portadores asintomtico 1% desarrollan cirrosis heptica o carcinoma hepato-celular que son complicaciones ms importantes); primeros casos se describieron en 1833 en Bremen (Alemania), por la administracin de la vacuna de la viruela que contiene suero humano, pero hasta los aos 40-50 no se distingui de la hepatitis A; en 1965 Blumberg descubri el Ag Australia y se identific el virus. Estructura se distinguen una serie de estructura del virus que dan lugar a los marcadores serolgicos: -Ag de superficie => HBsAg o Ag Australia (marcador de infecciosidad, codificado por el gen S) que induce a la formacin de HBsAc o anti-HBs que confiere inmunidad. -Ag del core o nucleo-cpside => HBcAg codificado por el gen C que no se detecta en sangre pero si su HBcAc (marcador epidemiolgico que se mantiene de por vida); IgMHBcAc se detecta como marcador ms fiable de hepatitis B aguda. -Ag soluble => HBeAg que induce al HBeAc (HBeAg es el marcador de pronstico de la enfermedad, ya que se correlacionan con el nivel de replicacin del virus; HBeAc es unmarcador de buena evolucin). -Adems se distinguen su genoma ADN y una polimerasa. - El virin completo se denomina partcula de Dane, ya que existen formas incompletas en sangre (como p.ej. HBsAg). Infeccin por VHB la mayora son sub-clnicas/ asintomtica (50-80%) y solo se detectan en controles serolgicos; la mayora de las infecciones sintomticas son auto limitadas y se resuelven en menos de 6 meses (Hep.aguda); la lesin heptica puede ser nula o leve o llegar a casos de hepatitis fulminante (> de 6 meses se pueden cronificar); lasintomatologa clnica es similar a la de Hepatitis A; un periodo de incubacin es de 1-6 meses; entre 510% de las infecciones se hacen persistentes y se mantiene de por vida (como portador asintomtico o sintomtico); en la mayora de ocasiones la funcin heptica y la histologa son normales, pero en otras ocasiones dan lugar a sndromes hepatitis crnica persistentes
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(HCP) y hepatitis crnica activa (HCA); HCP es menos progresiva que HCA (puede ser ms grave y desembocar en cirrosis).

Epidemiologia existen reas hiper-endmicas, endemia media y baja (Espaa est en baja); el nico reservorio importante es el hombre que transmite el virus por contacto ntimo (va sexual, parenteral y vertical-perinatal) y mediante objetos personales o materiales de hospitales (familiares y personal sanitario corre un mayor riesgo); la existencia de HCP presenta un reservorio estable para el virus y asegura su supervivencia indefinida que se detecta en lquidos corporales (sangre, heces, orina, bilis, lagrimas, semen, leche materna, sudor, secreciones vaginales, LCR, liquido sinovial y sangre de cordn); Marcadores en la infeccin aguda auto-limitada (en el orden de aparicin): -HBsAg (aparece antes del 1 mes y desaparece antes de 6 mes) -HBeAg (aparece el 1 mes y desaparece antes del 3 mes) -DNA viral (aparece despus del 1 mes y desaparece al 3 mes) -Anti HBc (aparece entre 1-2 mes; Anti-HBc IgM desaparece antes del 5 mes => Hepatitis aguda) -Anti HBe (aparece al 3 mes) -Anti HBs (aparece antes del 7 mes) Prevencin es la medida ms eficaz para combatir la infeccin; es un virus muy contagioso cuando hay exposicin parenteral; existe inmunizacin pasiva (gammaglobulina hiper-inmune eficaz en situaciones de pre y post-exposicin ) y inmunizacin activa (vacuna de HBsAg que se administra universalmente a 0-1-6 meses que produce respuesta inmunitaria de 90-95%).

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Virus de la Hepatitis D (VHD) descubierto en 1977; es un virus ARN incompleto /defectivo que requiere HBsAg para su replicacin (adquieren su envuelta del virus B y si no hay infeccin de por VHB no la hay por VHD). Tipos de infeccin : 1-Coinfeccin => infeccin simultneamente por ambos virus (VHB y VHD); el curso natural de VHB no se modifica; al resolverse la infeccin de VHB, re resuelve tambin la de VHD; clnicamente la hepatitis es ms grave y la tasa de hepatitis fulminantes es mayor (hasta 20%). 2-Sobreinfeccin => cuando el VHD sobre infecta a portadores crnicos de VHB; aqu si se modifica el curso natural de VHB y la mayora de las sobreinfecciones (70%) desembocan en hepatitis crnica y acaban en cirrosis entre 15-20 aos. El pronstico de VHD depende de marcadores de replicacin del virus (anti-HBe) => puede acabar en hepatitis crnica o cirrosis; cuando no hay marcadores de replicacin => puede evolucionar a la curacin.

Virus de la Hepatitis C (VHC) es de reciente descubierto (1988 - aunque se sospech desde hace mucho tiempo) del que quedan an muchos interrogantes por resolver; en actualidad se sabe que VHC es responsable del 80-90% de los casos de hepatitis posttransfusional y del 20-50% de los hepatitis espordica; es un virus del tamao medio dentro de la familia Flaviviridae (virus ARN icosadrica pequeo de tamao 40-50nm con envuelta, de polaridad+ y sensibles al ter); se distingue regiones para la envoltura (E), el core (C) y otras no estructurales (NS). Infeccin por VHC se diseminan fundamentalmente por la va parenteral; es la causa ms frecuente de hepatitis post-transfusional, hepatitis espordica y ampliamente distribuido entre ADVP (adicto a la droga de va parenteral), pacientes en dilisis y hemoflicos; se puede transmitir por contacto sexual o convivencia con portadores (menor importancia que Hep.B);la clnica es similar a la de la hepatitis B; 25% cursan con ictericia y la tasa de mortalidad es <1%; el curso es indolente y prolongado; el inicio no es muy brusco, es frecuente las recurrencias, 50-70% tienden a cronificar y 20-25% acaban desarrollando cirrosis. Prevencin tratar todo tipo liquido corporal como potencialmente infeccioso; todava no se dispone inmuno-profilaxis; un paciente con VHC negativa no significa que no lo padece, porque la sensibilidad de las tcnicas ms utilizadas no es 100% fiable; si se sufre un accidente en el laboratorio o en la prctica clnica con sangre anti-VHC+, se debe realizar un protocolo de seguimiento serolgico de la persona; existen evidencias de que VHC puede estar implicada en cncer heptico.

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Virus de la Hepatitis E (VHE) se descubri en 1983 y es responsable de la epidemias por transmisin fecal-oral en India, Paquistn, frica del Norte y Mjico (pases de baja salubridad); el curso es corto y parece ser que se puede transmitir parenteralmente, pero no transfusional-mente; el virus todava no est catalogado, se parece ms a los calcivirus da lafamilia Calciviridae (virus ARN icosadrica de tamao pequeo 35-40nm sin envuelta, de polaridad+); clnica => aunque no se cronifica al igual que VHA, tiene un pronstico peor (la mortalidad 1-2%), ms grave en gestantes del 3 trimestre del embarazo (mortalidad de 20%); la habitual va de transmisin es a travs del agua de bebida.

Virus de la Hepatitis G (VHG) se transmite por va parenteral; esta relacionado con virus de la familia Flaviviridae (virus ARN icosadrica de tamao pequeo 40-50nm, con envuelta de polaridad+); provoca aisladamente un cuadro benigno, pero puede dar una coinfeccin con el VHB y VHC con mayor tendencia a la cronicidad. Virus de la Hepatitis F (VHF) se transmite por va entrica (fecal-oral) SEROLOGIA DE LAS HEPATITIS VIRICAS (1993) Marcadores serolgicos para el diagnstico de la hepatitis A la mayora de infecciones son aguda sin cronificarse (<1% se fulmina); se encuentra en las heces durante el periodo de incubacin (hasta 2 semanas); su deteccin con fines diagnsticos no se emplea rutinariamente. -Ac Anti-VHA IgM => siempre es positivo en el inicio de la sintomatologa clnica (hasta 3-6 meses); se usa como marcador de infeccin aguda; en Ag viral es detectado solamente en el hgado y no se utiliza para el diagnstico. -Ac Anti-VHA IgG => su presencia demuestra un contacto previo con el virus (se mantiene durante largos periodos de tiempo). Marcadores serolgicos para el diagnstico de la hepatitis B la evolucin clnica es variable (desde asintomtica y anictrica hasta una enfermedad aguda que se puede
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complicar hacia la cronicidad, la cirrosis o forma fulminante fatal); es evidente su relacin con el carcinoma hepato-celular; la determinacin cualitativa y cuantitativa de ciertas protenas virales (Ags) y de los Acs nos sirve para evaluar la situacin actual y pronosticar el futuro de la infeccin. -Ag de superficie HBs Australia (HBsAg) => se sintetiza en el citoplasma del hepatocito; debido a que los hepatocitos fabrica un exceso de estos, una parte es liberada a la sangre y puede ser detectada durante el periodo de incubacin (es el 1 marcador que aparece, incluso 2-6 semanas antes de que aparezca los sntomas, aunque pueda haber de 5-10% de hepatitis aguda sin este marcador), en la fase aguda de la enfermedad y en el estadio crnico; si la evolucin es favorable desaparecer a los 3-6 meses de la enfermedad; por el contrario, si se mantiene ms de 6-8 semanas despus o si no existe una disminucin significativa de su ttulo, es indicio de mal pronstico y de evolucin a la cronicidad. -Ac anti-HBs => es el indicador de recuperacin de la enfermedad y el ultimo en aparecer(+/- a los 3 meses de su evolucin); persiste durante mucho tiempo neutralizando al virus y confiriendo proteccin; en los individuos vacunados es el nico marcador presente. - Ac anti-HBc => Ag HBc pertenece a la cpside y no se detecta serolgicamente, ya que no se encuentra libre, sino en el virus entero; solo se detecta Anti-HBc; es el 1 Ac que aparece en la enfermedad, detectable con los primeros sntomas de la enfermedad en la fase aguda y en la crnica (entre 3-5 semanas despus de Ag Australia y es el 4 marcador en hacerse positiva); puede significar una infeccin pasada o curada dada la larga persistencia de estos Acs en el suero (su positividad confirmada en solitario no asegura la proteccin frente a la enfermedad). -Ag e (HBeAg) => es parte del Ag core; proteolticamente degradado y antignicamente diferente; es el 2 marcador, detectable en la fase aguda y en algunas formas de enfermedad crnica en las que histolgicamente se corresponde con hepatitis crnica activa (HCA); su valor clnico se funda en su excelente correlacin con la presencia de replicacin viral y viremia; la sangre con HBeAg (+) se debe considerar como infecciosa; su estudio es obligatorio en todos los sueros de HBsAg (+). -Ac anti-HBe => es el 5 marcador; su aparicin indica buena evolucin y una baja infectividad del paciente; en la mayora de los casos es detectable poco antes de que desaparezca HBsAg, pudiendo encontrarlo (+) durante varios aos despus de la infeccin. -DNA viral libre (VHB-DNA) => es el 3 marcador; su deteccin en el suero mediante la hibridacin no es una tcnica de rutina, a pesar de tratarse de un marcador muy sensible tanto de la presencia del virus como de su actividad replicativa; el VHB-DNA es positivo en un elevado nmero de pacientes HBeAg (+).

Marcadores serolgicos para el diagnstico de la hepatitis D 1- Antgeno delta (HDcAg) => aparece fugazmente en sangre en la primo infeccin y su utilizad clnica es muy limitada. 2- Anticuerpos Anti-Delta (Anti-HD IgM) => es el marcador ms importante que aparece despus de la aparicin del Ag y se mantiene positivo a bajos ttulos a un tiempo limitado si
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la evolucin es favorable; persistir su positividad a ttulos altos en casos que evolucionan a la cronicidad. 3- Anticuerpos Anti-Delta IgG (Anti-HD IgG) => aparecen ms tarda y se mantiene positivo durante largos periodos de tiempo; su deteccin indica solamente contacto con el virus. Esquema evolutivo: -Coinfeccin de VHB y VHD = Ag Australia (+), Anti-HBc IgM (+) y AntiHD IgM (+) -Sobre infeccin de VHD en paciente con VHB = Ag Australia (+), Anti-HBc IgM (-) y Anti-HD IgM (+) 4- RNA Viral (HD-RNA) => la positividad por tcnicas de hibridacin o PCR indica presencia del virus. Marcadores serolgicos para el diagnstico de la hepatitis C -Anticuerpos Anti-VHC => se detecta empleando Ags sintticos o recombinantes; pruebas confirmatorias de Acs Anti-VHC => se detectan por mtodo Western Blot para ver las bandas. -RNA viral (VHC-ARN) => no se suele hacer porque la epidemia es corta. Marcadores serolgicos para el diagnstico de la hepatitis E se estn comercializando pruebas que detectan Ag y Acs especficos (IgG y IgM) mediante tcnica de ELISA. DIAGNOSTICO DE LA INFECCION A-Hepatitis Aguda Marcadores de rutina (los que se suelen pedir al laboratorio): VHA => anti-VHA IgM VHB => HBsAg o Ag Australia y HBc IgM VHC => anti-VHC (totales) VHD => anti-VHD IgM (en pacientes ADVP) Criterios generales de interpretacin : -La presencia de anti-VHA IgM => es diagnostica de infeccin aguda por VHA. -La presencia de HBsAg y anti-HBc IgM => es diagnostica de infeccin aguda por VHB; -La presencia simultnea de anti-VHD IgM y anti-HBc IgM asociada a hepatitis aguda => se considera diagnostica de coinfeccin aguda por ambos VHB y VHD; la presencia de anti-VHD IgM y HBsAg en ausencia de anti-HBc IgM => indica sobre infeccin por VHD en un portador crnico de VHB. En cualquier caso, dada la situacin epidemiolgica actual en Espaa, no parece recomendable la bsqueda rutinaria de la infeccin delta en pacientes ADVP. -La seroconversin de anti-VHC es un criterio fiable para un diagnstico de infeccin aguda por VHC (cambio de negativo a positivo); la seroconversin suele retrasarse mas de 3 meses desde el comienzo de los sntomas, por lo que requiere el estudio de muestras de seguimiento al menos hasta el 6 mes; no se ha demostrado que la deteccin de anti-HVC IgM sea de utilidad en el diagnstico de la hepatitis C aguda. Criterios de interpretacin en pacientes ADVP las tasas de seropositividad para VHB (anti-HBc total) y VHC (anti-VHC) en individuos ADVP superan el 80%; entre los ADVP crnicamente infectados por VHB (positivos para HBsAg), la seropositividad para VHD (anti-VHD total) se aproxima a dicho porcentaje; es frecuente que los ADVP se hallen crnicamente infectados por uno o ms de dichos agentes en un episodio de hepatitis aguda, resultando imposible precisar su etiologa.

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B-Hepatitis Crnica Marcadores de rutina: VHB => HBsAg y anti-HBc total (IgM + IgG) VHD => anti-VHD total (en pacientes ADVP positivos para HBsAg) VHC => anti-VHC Criterios de interpretacin : -La presencia de HBsAg y anti-HBc total asociada a hepatitis crnica => es diagnostica de hepatitis B crnica; la presencia adicional de anti-VHD total => indica una sobre infeccin crnica por ambos VHB y VHD. -La presencia de anti-VHC asociada a hepatitis crnica => es altamente indicativa de hepatitis C crnica, aunque no es un diagnostico seguro; la deteccin de ARN viral en suero mediante PCR ayuda a establecer el diagnostico, pero un resultado negativo aislado no lo descarta, ya que la viremia es intermitente en muchos casos; dado el alto costo de mtodos de confirmacin de anti-VHC, se considera que una re comprobacin del resultado positivo mediante un segundo mtodo de cribado (mtodo screening con tcnica de ELISA) que utilice Ags obtenidos por tecnologa diferente, es suficiente para establecer la presencia de anti-VHC en pacientes con hepatitis crnica. VIH o SIDA Descubrimiento del virus se sospech desde 1981 en 5 casos de neumona porPneumocystis carinii en varones homosexuales previamente sanos y va aumentando el nmero de casos y se fue asociando esta inmunodeficiencia adquirida al sarcoma de Kaposi; en junio de 1982 se contabilizaron 439 casos y en EEUU se emite un informe para definir los casos de SIDA; en febrero del mismo ao Montagnier expone la hiptesis de un retrovirus linfotropico pudiera ser el agente causante del sndrome; en Mayo de 1983 se aislo por primera vez el virus por Montagnier en Francia a partir de un ganglio linftico de un paciente con linfadenopatia persistente (LAV) y Gallo en EEUU de un enfermo de SIDA (HTLV-III).

El virus es un virus ARN de la familia Retroviridae, subfamilia Lentiviridae (=incubacin lenta >10 aos) con tipos 1 y 2; esta familia de virus se caracteriza por sintetizar ADN a

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partir de ARN viral, mediante una retro-transcriptasa; consta de nucleo-cpside y envoltura; es muy sensible a los agentes qumicos y calor; sus principales genes son: a) Estructurales: -Gen GAG (Core) => protenas 24 -ENV (Envoltura) => glicoprotenas 41, 120 y 160 -POL (Polimerasa) => es importante b) Reguladores => genes que regulan la replicacin viral y el papel de todos ellos no est completamente dilucidado

Patogenia en la infeccin aguda, el virus se une principalmente a receptores CD4 gracias a gp41 y gp120; por lo tanto, sus clulas diana fundamentalmente son los linfocitos T4 (aunque tambin se unir a los linfocitos B que tiene CD4, a los macrfagos, a las clulas cerebral, y a los precursores de hemates); este episodio se manifiesta como un cuadro pseudogripal; es importante saber que la respuesta inmunitaria en forma de Acs frente al virus se puede demorar 6-8 semanas (periodo de ventana +/- 3 semanas); a continuacin el ARN se copia a ADN por accin de la transcriptasa inversa, se pone en circulacin y se integra en el ADN de la clula (periodo de latencia); latencia o crecimiento es clave de la patogenia de la enfermedad; normalmente la fase de latencia se prolonga durante periodos largos de tiempo (2-8 aos incluso ms), pero en un momento dado puede progresar la enfermedad con un progresivo deterioro de la inmunidad hasta desarrollar el SIDA; el ciclo biolgico se resumen=> Entrada de virus transcripcin de ARN al ADN integracin en la genoma de T4 formacin de nuevos viriones tras periodo de latencia (al salir, el virin tomara en su salida parte de la membrana celular para utilizarla como su envuelta, esto hace que se destruye los T4, se paraliza el sistema inmunolgica y acaba provocando el SIDA.

Epidemiologia las vas de transmisin del virus => por sangre, sexual y vertical-perinatal; en Espaa la tasa de transmisin por sangre es importante (el principal grupo afectado sonlos UDVP/ ADVP y homosexual), a diferencia de Francia o EEUU, donde los mas afectados son homosexuales; en cuanto a las tasas de transmisin madre-hijo oscilan 1550%, cobrando una especial importancia en frica; la transmisin al personal sanitario o similar es 0,2% y requiere contacto con mucosas de la sangre o liquido corporal infeccioso (o tambin de lquidos donde se haya cultivado al virus).
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Sintomatologa clnica de SIDA desde que una persona se infecta hasta que se desarrolle la enfermedad, suele transcurrir 6-10 aos; el estudio de la evolucin de SIDA puede realizarse por las manifestaciones clnico que van apareciendo o por marcadores bioqumicos (el descenso de la cifra de linfocitos T4); a partir del 1996 la determinacin de la cantidad de virus circulante en la sangre de la persona infectada (carga viral) se ha convertido en principal marcador de la evolucin de la enfermedad. Fases de la enfermedad (1) fase de la infeccin aguda => la mayora de los pacientes experimentan al cabo de unas 3 semanas de haber infectado con el virus una serie de sntomas pseudogripales como fiebre, cefalea, eritema, adenopatas y sensacin de mal estar, desaparecen despus de 1-2 semanas; durante esta fase, el VIH se multiplica a gran velocidad; en un primer momento se produce un descenso de la cifra de linfocitos (total), pero dentro de poco alcanzan las cifras normales en respuesta de una activacin del sistema inmunolgico; los individuos son altamente contagiosos durante esta fase; (2) fase asintomtica que puede durar 10 aos o incluso mas; durante este periodo, el virus continua replicndose, causando destruccin progresiva del sistema inmune; durante esta fase, el recuento de los linfocitos es normal; (3) fase sintomtica precoz, se suele iniciar el desarrollo del sntoma clnico caracterstica de la enfermedad; apareciendo infecciones oportunistas de carcter leve p.ej. de tipo viral =>CMV, Herpes zoster, de tipo bacterianas => Mycobacterium, Legionella, infestacin de parsitos => Pneumocystis carinii, Cryptosporidium, algunos hongos => Aspergillus yCndida; (4) fase avanzada en la que aparecen infecciones y tumores, definitorios del SIDA (sarcoma de Kaposi) que adems, puede complicarse con un cuadro neurolgico (demencia del SIDA)con alteraciones motoras y del rea cognitiva, debido a la accin directa del virus sobre SNC;la supervivencia media de los pacientes con la SIDA ya desarrollado suelen ser 18-125 semanas, dependiendo del tipo de infeccin que tenga; en ningn caso habr supervivencia cuando estn en esta fase.

Diagnstico de laboratorio de la infeccin por VIH en Espaa fundamentalmente serolgico, por la importancia y las implicaciones que conlleva; se realiza mediante tcnicas de ELISA en primera instancia (tcnica de cribado), aplicando a los positivos, mtodos de confirmacin => Western Blot (WB), inmunofluorescencia (IFI) o radioinmunoprecipitacion (RIPA).

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**) El Western Blot es ms utilizado y permite diferenciar los Acs frente a las distintas protenas del virus; tiene distintos criterios para la interpretacin de los resultados (OMS, CDC, Cruz Roja) y los resultados se clasifiquen en: -Positivos => lo ms aceptado es que haya bandas de envoltura (g41, gp120 y gp160) y adems bandas del core (p24, p31 y p66) o de la polimerasa o de ambos. -Indeterminados => se detecta la presencia de alguna banda frente a alguna protena del virus (solo algunas protenas del core en pacientes con lupus y factor reumatoide). -Negativo => ausencia de banda o que no se corresponde a ninguna del virus (a estas personas se hace un seguimiento durante 6 meses, para descartar que no sean falsos negativos). La tcnica de WB consiste bsicamente en la incubacin de unas tiras de nitrocelulosa en los que sean transferido las protenas de los virus, bsicamente las estructuras con el suero del problema durante un tiempo que oscila 2-4 horas hasta los 18 horas; tras cual se revela la presencia de Acs frente a diferente protenas del virus mediante diferentes tcnicas inmuno-enzimticas dependiendo del fabricante; el resultado ser la aparicin de bandas coloreadas de mayor o menor intensidad en el lugar de la tira donde estn situadas las protenas de VIH contra las cuales existen Acs en el suero del problema; la lectura puede hacerse de manera manual, comparando las bandas con un control (+) o de manera automatizada por densitometra; recordar en valores absolutos, la cifra de CD4 900-1500 linfocitos/m3 de sangre (en valores relativos 35-45%); las de CD8 600-900 linfocitos/m3 de sangre; cuando la cifra de CD4 disminuye por debajo de las 200-400 linfocitos/m3 de sangre, ser indicativo de SIDA.

*) Los mtodos de cribado (ELISA) son ms sensibles y ms especficos, siendo lo ms novedoso los de 3 generacin con capacidad de detectar IgG e IgM, acortando el periodo de ventana. *) Tambin existen mtodos rpidos, aplicables en situacin de urgencia como la aglutinacin con partculas de ltex o los que utilicen Ags fijados a soportes solidos o membranas (se llamaDot-Blot). *) Las tcnicas de centros especializados => cultivo y PCR; la PCR es una tcnica con mucho futuro que presenta una enorme sensibilidad y especificidad, pero no estn al alcance de la mayor parte de los laboratorios; una importancia aplicacin de estas tcnicas es el diagnostico de hijos y madres portadoras del VIH. *) Marcadores de monitorizacin o seguimiento de la enfermedad (deteccin del Ag p24); en fases tardas, se puede observar el declinar de los Acs anti p24 que se pueden utilizar con el mismo fin. *) De todos modos, el que ms se utiliza para un diagnstico de SIDA es el recuento celular de los linfocitos CD4 o T4 (o el cociente respecto a los T8).
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MTODOS DIAGNSTICOS EN VIROLOGA CLNICA Objetivo de laboratorio - proporcionar el diagnstico etiolgico y orientar correctamente el tratamiento en el menor tiempo posible; de manera simultanea se intenta practicar 2 tipos de diagnostico => - D directo (visualizar o aislar el germen mediante el cultivo e identificarlo => en virologa clnica no es posible, por las caractersticas fsicas y biolgicas del virus, porque se ha de hacer mediante la deteccin de sus componentes, p.ej. Ags o cidos nucleicos). - D indirecto (la identificacin de los componentes de la respuesta inmune especifica/ Acs generados). Metodos de diagnostico directos : a) Examen directo de la muestra (macroscpica /a simple vista) => aspecto purulenta (en una infeccin viral nunca hay pus), presencia de sangre, moco, etc. b) Microscpia => con la Microscpia ptica solo se puede identificar los cambios celulares (efecto citoptico) sufrido por las celulas infectadas y con la Microscpia electrnica se puede visualizar el virus (en laboratorios de experimentacin). c) Cultivo => los virus se multiplican exclusivamente en el interior de las celulas vivas, por ello debemos preparar previamente un soporte celular que permita su crecimiento in vitromediante siguientes tcnicas: - cultivo de rganos => las secciones de algunos rganos pueden ser viables varias semanas y nos permiten cuidadosamente aislar por ej. virus sincitial respiratorio (VRS) mediante secciones de tejido respiratorio. - cultivo de tejidos => fragmentos de tejidos en suspensin (cultivar adenovirus en un tejido adenoideo) - cultivos celulares => celulas aisladas obtenidas por disociacin mecnica y con enzimas proteolticas a partir de tejidos; las celulas disociadas y separadas se colocan en un frasco de cristal o de plstico; las celulas se adhieren a las paredes del frasco y se cubren con medios nutritivos para mantenerlas viables; en condiciones optimas, las celulas se multiplican hasta que cubran la pared formando una capa continua de crecimiento sobre las que se podrn replicar los virus del problema; tipos de cultivos celulares: *) cultivos primarios => es el primer pase in vitro, tomados directamente de un organismo vivo; las celulas se siembran en un frasco con medio de crecimiento, conservan el numero de cromosomas, tienen un periodo de vida corto y permiten el crecimiento de gran variedad de virus (p.ej. celulas del rion de conejo y mono, embrin de pollo). *) lineas diploides => son celulas de un solo tipo (somticas) que se pueden cultivar durante un tiempo limitado, conservan el numero de cromosomas (46) y con ventaja de quese mantiene durante mas tiempo que cultivo primario. *) lineas celulares continuas => se cultivan in vitro indefinidamente y tiene un cariotipo heteroploide (numero menor que las celulas somticas); se originan de tejido maligno o por mutacin de una clula diploide; el cultivo se multiplican de forma indefinida y suelen presentar aberraciones en el numero de cromosomas; estas celulas se pueden mantener a 70C o -90C indefinidamente (p.ej. lineas celulares Hep-2 y Vero). *) Shell-vial => es una tcnica de cultivo celular que se ha desarrollado en los ltimos aos y que permite obtener el crecimiento de numerosos virus y ciertas bacterias en un corto periodo de tiempo (24-48 horas); sobre un vial se coloca una mono capa de celulas con 1ml de medio de crecimiento, y sobre ello se coloca 0,2 ml de la muestra problema; el mtodo se basa en la centrifugacin (suave) de la muestra sobre la mono capa, y tras un corto periodo de incubacin se pone de manifiesto la expresin de los Ags virales en la mono capa mediante tincin inmunolgica; la ventaja => la rapidez de obtencin de resultados en 24166/168

48 horas, detectamos los Ags a las pocas horas de iniciarse la infeccin; tiene una sensibilidad superior al cultivo celular, porque inoculamos el mismo volumen de muestra en un rea mas pequea y mas fcil la observacin al microscopio de fluorescencia. Identificacin del crecimiento en el cultivo celular - las mas frecuentes y disponibles en el laboratorio: 1). Efecto citoptico - los virus al multiplicarse provocan cambios en la clula donde se replican que se manifiesta por una modificacin en la morfologa celular que se pueden observar (p.ej. inclusiones dentro de las celulas, hinchazn del citoplasma, formacin de celulas gigantes multi-nucleadas) en la clula sin teir o teidas (se ve mas detalladas); cada virus presenta un tipo de efecto citoptico caracterstico que puede ser identificado en menos de 1 semana (p.ej. enterovirus, herpesvirus, adenovirus o poxvirus tienen como efecto citoptico la destruccin o lisis celular en 24-48 horas; la fusin celular/ formacin de sincition son caracterstico de herpes virus, CMV, virus herpes zster, etc.) 2). Formacin de cuerpos de inclusin - son cambios histolgicos que se producen en las celulas por los componentes virales o por variaciones en las estructuras celulares; pueden localizarse en el ncleo, en el citoplasma o en ambos y se clasifican segn su tincin en eosinfilos o basfilos; cada virus produce unos cuerpos de inclusiones caractersticos. 3). Hem-adsorcin - es la capacidad que adquieren las celulas infectadas por un virus para adherir a su superficie los hemates de diversas especies (p.ej.aves, carnero). 4). Hem-aglutinacin - la capacidad que adquieren las celulas infectadas por el virus de aglutinar diversos tipos de hemates, por la formacin en su membrana de este tipo de protenas, las hemaglutininas. 5). Deteccin mediante metodos inmuno-enzimticos o por inmunofluorescencia, de los Ags virales mediante Acs especficos para los cuerpos de inclusin celular. Las muestras para el aislamiento de virus se deben recoger lo antes posible, no despus de los 3-7 primeros das del inicio de la enfermedad; se pueden conservar a 4C durante 24 horas y si no, se deben congelar a -70C porque muchos virus son lbiles a -20C; las muestras que se utilizan con mayor frecuencia son secreciones nasales, frotis farngeo, exudado conjuntival, lquidos vesiculares, raspados de piel, heces, orina, LCR, etc. d) Deteccin de los componentes estructurales virales - las tcnicas mas usadas que permiten detectar Ags en suero y lquidos orgnicos (cuando existe una alta concentracin viral, sera fcil detectarlos) son: - Aglutinacin en ltex => a las moleculas de ltex se les une varias molculas de Acs conocidos y cuando se pone en contacto con una solucin que contiene el Ag (la muestra problema) se origina una aglutinacin que puede visualizarse; es una tcnica sencilla, sensible, re-producible y barata. Su sensibilidad depender de la pureza del Ac utilizado. - Contra-inmunoelectroforesis => esta basada en el principio de que los Ags virales (o bacterianos en su caso) suelen tener carga (-) y los Acs (+), en medio alcalino; con este fundamento se colocan las soluciones de Acs conocidos y del Ag problema en unas cavidades realizadas en un gel de agarosa de tal manera que puedan difundir libremente; se colocan unas mechas en los extremos de la capa de agarosa, que conectan con unas cubetas que contienen un buffer con una composicion diferente dependiendo del sistema Ag-Ac; cuando se aplica una corriente elctrica, las molculas de Ags con carga (-) migran hacia el nodo que esta en el extremo opuesto de la placa; los Acs son arrastrados por el buffer levemente alcalino y, en el punto en que ambas lineas se encuentran, se forma una banda de precipitacin visible; es una tcnica de alta sensibilidad pero laboriosa, que precisa una alta concentracin de Ag y Ac.
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- Enzimoinmunoensayo => se basa en la deteccin de Ags mediante el empleo de un Ac unido a una enzima, que mantiene la capacidad de canalizar la reaccin Ag-Ac; el enzima utilizado puede ser peoxidasa de rabano, Beta-galactosidasa o fosfatasa alcalina; la presencia del inmuno-complejo es detectada por una reaccin coloreada que se produce al aadir el sustrato; el empleo de enzimas tiene una serie de ventajas : *) el enzima se une al Ac pero deja libre los lugares de unin al Ag *) el enzima no se modifica con la reaccin Ag-Ac y queda unido al inmuno-complejo junto con el sustrato amplificando la reaccin y aumentando la posibilidad de deteccin *) los conjugados con enzimas son muy estables *) la lectura de la reaccin se realiza en un espectrofotmetro y la cantidad de sustrato liberado es directamente proporcional a la cantidad de Ag fijado en la reaccin *) la lectura tambin puede hacerse cualitativamente de forma manual, "de visu". La reaccin tiene lugar en 2 fases => en la 1- en unos pocillos sobre los que se ha fijado un Ac especifico; al agregarle la muestra que puede contener los Ags, se unen formando el complejo Ag-Ac; posteriormente se hace un lavado para eliminar el resto de Ags no unidos a los Acs de la placa y otras partculas que pudieran interferir, en la 2- se agrega un Ac marcado con un enzima que se une a los sitios de unin del Ag y al aadirse un sustrato, da lugar a una reaccin coloreada, que procederemos a medir en un espectrofotmetro; es una tcnica que necesita varias horas para su realizacin. - Radioinmunoanalisis => tiene el mismo fundamento que el ELISA, pero en vez de unir un enzima al Ac, se le une un radioistopo, y lo que se mide en ultima instancia es la radiactividad que estar en proporcin directa a la cantidad de Ag que haba en la muestra problema; es una tcnica con la misma sensibilidad que el ELISA, pero es mas costosa y se necesita trabajar con material radioactivo, lo que plantea problemas en cuanto al personal y las instalaciones; esta tcnica se utilizo por primera vez para detectar el Ag de superficie del virus de la hepatitis B. - Inmunofluorescencia directa (IFD) => el Ag unido a una fase solida, en este caso un portaobjetos, se pone en contacto con el Ac marcado con una sustancia fluorescente (p.ej. isocianato de fluoresceina, rodamina, europio, etc.); tras un periodo de incubacin, se lava para eliminar el exceso de Acs y se observa al microscopio de luz ultravioleta; esta tcnica nos permite demostrar no solo la reaccin Ag-Ac, sino tambin la localizacin exacta donde se produce (superficie celular, citoplasma, ncleo...).

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