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HISTOQUMICA Y CITOQUMICA Histoqumica es el estudio qumico de los tejidos independientemente del mtodo de anlisis empleado.

En la prctica se emplea la palabra para designar el mtodo junto con el auxilio de los microscopios pticos (MO) y electrnico (ME). Esta tcnica permite la identificacin y localizacin de compuestos o radicales qumicos en las clulas y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que dan productos insolubles que son coloreados o electrodensos y visibles por el MO y el ME . A. PRINCIPIOS BSICOS. 1. QUE LOS COMPUESTOS QUE DEBEN SER ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES. Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser estudiados por medio de la fijacin del tejido. - Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustancias hidrosolubles como el glucgeno. - Hay que evitar los fijadores cidos en las tcnicas de visualizacin del fosfato clcico. Los fijadores ms utilizados son: - Formaldehdo para el MO . - Glutaraldehdo para el ME. 2. EL PRODUCTO DE LA REACCIN DEBE SER INSOLUBLE para evitar la difusin . 3 .EL MTODO UTILIZADO DEBE SER ESPECFICO PARA LA SUSTANCIA O GRUPO QUMICO QUE SE ESTA ANALIZANDO. En algunas reacciones la intensidad del color producido es proporcional a la concentracin de la sustancia analizada.En este caso se puede medir dicha sustancia con un histofotmetro. B. PRINCIPALES SUSTANCIAS DE INTERS BIOLGICO DEMOSTRABLE HISTOQUMICAMENTE. 1. IONES IN HIERRO DETERMINACIN - EL in frrico se demuestra por la reaccin con la mezcla de FERROCIANURO POTSICO Y CIDO CLORHDRICO que forma un precipitado azul oscuro de ferrocianuro frrico. - Esta reaccin se usa para localizar los macrfagos del SRE y diagnosticar enfermedades en las cuales hay depsitos de hierro en los tejidos .

FOSFATO

Reaccionan con NITRATO DE PLATA y se forma fosfato de plata que es reducido por hidroquinona y forma un precipitado negro. Esta reaccin se usa para el estudio del hueso.

2. LPIDOS. Se usan colorantes que se disuelven en las grasas como el SUDAN IV y el SUDAN NEGRO.Los tejidos se sumergen en soluciones alcohlicas saturadas de colorantes muy liposolubles y debilmente solubles en alcohol. Se usa para el diagnostico de enfermedades metablicas que producen depsitos intracelulares. 3. CIDOS NUCLICOS. CIDO NUCLICO DNA DETERMINACIN

Se usa la reaccin de FEULGEN que consiste : - Hidrlisis del DNA con cido clorhdrico para extraer las bases pricas y dejar en libertad los grupos aldehdicos del azucar. - El reactivo de SCHIFF (fuchsina bsica con anhdrido sulfuroso) reacciona con el aldehdo y forma un precipitado rojo. Esta reaccin presenta proporcionalidad entre la intensidad del color producido y el contenido en DNA del ncleo.

RNA

Tiene gran afinidad por los colorantes bsicos (basoflia) lo que hace que se tia intensamente con el AZUL DE TOLUIDINA o de METILENO.

4. PROTENAS. Su identificacin se basa en mtodos de deteccin de aminocidos. - Reaccin de aminobenceno. - Reaccin de Sakaguchi que detecta la arginina de las protenas bsicas como las histonas y protaminas. 5. POLISACRIDOS. Se encuentran unidos a protenas o en forma libre. En el caso de ser un polmero, antes hay que tratar la muestra con un enzima glucogenoltico para que libere los azucares. La reaccin ms usada es la del PAS (cido peridico-schiff). El cido oxida a los azucares en posicin 1-2 y deja grupos aldehdos libres que reaccionan con el reactivo de SCHIFF dando un compuesto insoluble y coloreado. De este modo se demuestra la presencia de: - Glucgeno en el hgado y msculo.

- Depsito intracelular de glucgeno en enfermedades congnitas. - Glucosaminoglicano o mucopolisacrido que forman parte de los proteoglicanos. - Glucoprotenas. Los azucares cidos tambin reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN. 6. CATECOLAMINAS. El formoaldehdo reacciona con las catecolaminas produciendo compuestos fluorescentes. 7. ENZIMAS. Su localizacin se basa en la produccin de un precipitado fuertemente coloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimtica. ENZIMA FOSFATASA CIDA DETERMINACIN Se usa el mtodo de GOMORI que consiste en incubar cortes de tejidos en una solucin que contengan GLICEROL FOSFATO SDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 . La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da un precipitado insoluble.Despus se aade sulfito de amonio que da color negro y electro denso al precipitado. Se usa para localizar lisosomas. DESHIDROGENASAS Se usan cortes no fijados junto con un compuesto qumico soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL.El tetrazol es reducido y forma un precipitado coloreado llamado FORMAZAN. Se usa para detectar mitocondrias. PEROXIDASA Promueve la reduccin de ciertos sustratos, transfiriendo iones hidrgenos desde el perxido de hidrgeno al sustrato que se reduce. Como sustratos se usa el perxido de hidrgeno y el tetraclorato 3,3diamino-bencidina que cuando se reduce forma un compuesto coloreado, insoluble y electrodenso.

B. FLUORESCENCIA. Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda determinada y emite luz en otra longitud de onda mayor. En microscopa se suele usar la excitacin con luz ultravioleta. 1. COMPUESTOS FLUORESCENTES.

- Compuestos naturales constituyentes de las clulas: vitamina A, riboflavina(B2) y las porfirinas. - Colorantes con afinidad por las estructuras celulares como el Naranja de acridina que se une a los cidos nuclicos: - DNA: fluorescencia verde amarillenta. - RNA: fluorescencia roja amarillenta. Esta prueba se usa en el diagnostico precoz del cncer (clulas ricas en RNA). 2. INMUNOCITOQUMICA (INMUNOFLUORESCENCIA). Sirve para identificar protenas especificas. Se basa en la reaccin Ag-Ac. Al Ac se le puede marcar con un compuesto fluorescente. Es la mtodo ms usado para la deteccin de autoanticuerpos en enfermedades autoinmunes. PREPARACIONES PERMANENTES Describiremos primero las preparaciones histolgicas permanentes (laminas) para el estudio al microscopio ptico. Con este instrumento los objetos se examinan por transparencia, siendo pocas las estructuras que se examinan directamente (mesenterio, cola de renacuajo) y que pueden ser observadas in vivo, sin fijar y teir, como sucede en las preparaciones permanentes. Los pasos que se siguen para obtener una preparacin permanente son: 1. Fijacin 2. Inclusin 3. Corte con microtomo 4. Coloracin A. FIJACIN. - Se hace a fin de evitar la autolisis y destruccin celular. - Los tejidos deben ser tratados inmediatamente despus de ser cortados. - Tiene por fin endurecer los tejidos, volvindolos mas resistentes a las etapas subsiguientes de la tcnica histolgica.Hay que conservar la morfologa y la composicin qumica de los componentes de los tejidos. - Suele durar unas 12 horas. La fijacin puede ser realizada por procesos:

MTODO FSICO

CARACTERSTICAS - Calor, como en bacteriloga. - Fri, como en el criostato.

QUMICO (uso de fijadores que inmovilizan las protenas de los tejidos).Es la ms usada en Histologa.

Fijadores: - Cloruro de mercurio y cido pcrico precipitan protenas. - Formaldehdo, tetraxido de osmio y glutaraldehdo apenas causan coagulacin y se usan en ME. Mezclas fijadoras: - Liquido de BOUIN: pcrico/formol/actico glacial - Liquido de HELLY: dicromato potsico/cloruro de mercurio/formol

Este paso es ESENCIAL, puesto que las protenas son las principales responsables de la estructura celular y se degrada despus de la muerte celular. Habitualmente se hace una doble fijacin con una solucin tamponada de: - Glutaraldehdo. - Tetraxido de osmio. B. INCLUSIN. - Da consistencia firme a los tejidos para que se puedan obtener cortes suficientemente finos. - Las sustancias ms usadas para este fin son: - GELATINA, CELOIDINA, PARAFINA para la MO. - RESINA EPOXI para la ME. Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de la inclusin:

TRATAMIENTO DESHIDRATACIN

CARACTERSTICAS Se extrae el agua de los tejidos con baos de concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a 100%). Sustitucin del etanol por un liquido miscible en etanol y parafina.Se usa xilol, benzol o toluol que dejan a la pieza translcida. - Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 C en el interior de una estufa. - Debido al calor , el xilol o toluol se evaporan y los espacios que dejan libre son ocupados por la parafina. - Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se deja solidificar. - Inconvenientes: - Destruyen muchas enzimas - Eliminan compuestos liposolubles

ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIN

INCLUSIN O IMPREGNACIN

C. CORTE CON MICROTOMO. - Los bloques de parafina son seccionados por la cuchilla del microtomo, obtenindose cortes de 3 a 8 micras de espesor. Estos cortes son extendidos en agua caliente y despus se llevan a un portaobjetos. - Para el microscopio electrnico se requieren cortes de 0.02 a 0.1 micra. El material se incluye en plsticos bastante duros del tipo epoxi y para cortarlos se usa un ultramicrotomo equipado con navaja de cristal o diamante. - El microtomo de CONGELACIN SE USA PARA ESTUDIAR LOS LPIDOS DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES, ya que los solventes orgnicos los eliminan. Usa nieve carbnica para congelar el tejido. - CRIOSTATO es un microtomo de congelacin ms elaborado que permite la obtencin rpida de cortes sin pasar por todas las etapas anteriores, cuando se usa parafina.Son muy utilizados en hospitales cuando se requiere un diagnostico rpido de un material patolgico. El criostato es tambin muy til en histoqumica , pues no inactiva las enzimas, pero dificulta la difusin de las molculas. - MTODO DE CONGELACIN-DESECACIN: Se mantiene la actividad enzimtica. Se congela a -150 C y despus se deshidrata lentamente a vaci.

D. COLORACIN. - Aumenta el contraste de las estructuras y hace a los tejidos visibles y diferenciables unos de otros. - Se realiza normalmente con MEZCLAS QUMICAS DE COLORANTES. - La mayora de los colorantes se comportan como cidos o como bases y tienden a formar sales con los radicales ionizables de los tejidos. - Los componentes de los tejidos pueden ser: SUSTRATO BASFILO (tejidos que se tien fcilmente con colorantes bsicos). ACIDFILO (tejidos que se tien fcilmente con colorantes cidos). COLORANTE BSICO (azul de toluidina y azul de metileno, hematoxilina). QCIDO (orange G, eosina y la fuschina cida). EJEMPLOS Nucleoprotenas y glicoprotenas cidas.

Protenas bsicas del citoplasma.

La doble coloracin por la hematoxilina y la eosina es la ms utilizada en la tcnica histolgica. OJO: Los colorantes no proporcionan datos sobre la naturaleza qumica de los componentes a los que se unen. TCNICA COMPONENT ES NCLE O CITOPLASM A FIBRAS COLGENA S FIBRAS ELSTICA S Irregular RETICULIN A

Hematoxilin a-eosina

Hematoxilina

Azul

Eosina Hematoxilina frrica Tricromo Masson Fuchina-cida y Panceau Verde luz

Negro

Rosa -

Rosa -

Irregular -

Rojo

Verde

Fuchinaresorcina Impregnaci n argntica

Fuchina y resorcina Sales de plata

Prpura

Castao

Negro

Los factores que influyen en la tincin son: - Pureza y concentracin del colorante. - pH y temperatura. - Tiempo. E. METACROMASIA. Hay ciertos tejidos, como la matriz cartilaginosa, que al usar colorantes como el azul de toluidina, se modifica el color azul por unin al tejido, pasando a prpura. A este fenmeno se le denomina metacromasia. Los colorantes metacromticos suelen ser bsicos, como el azul de toluidina y tionina. Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromticamente, denominados cromotropos, son principalmente: - Glucosaminoglicanos sulfatados, fuertemente cidos de la matriz cartilaginosa y los mastocitos del tejido conectivo. - Nucleoprotenas. F. MANIPULACIN EXPERIMENTALES DE CLULAS VIVAS. Las tcnicas de tincin pueden ser: - VITALES: no provocan la muerte. Se usan colorantes relativamente no venenosos que son retenidos selectivamente por algunas clulas del organismo. Se inyecta al animal vivo. - SUPRAVITALES: se agrega el colorante a las clulas o tejidos que permanecen vivos despus de ser separados del organismo. Ejemplos: - El carmn y azul tripn se usan para el estudio de la fagocitosis. - El rojo neutro para identificar los distintos tipos de leucocitos. - El verde jano tie las mitocondrias. - La alizarina se une a la matriz sea recin formada y se ha usado para el estudio de la formacin del hueso.

G. CRIOFRACTURA. Permite el estudio de la ultraestructura de las clulas sin los posibles artefactos producidos por la fijacin y la inclusin (ej: membrana plasmtica). Sirve para el examen de cortes ultrafinos. Fases: 1. Congelar el tejido a temperatura muy baja. 2. Fracturar con una cuchilla de metal afilada. El tejido fracturado se mantiene a muy baja temperatura y en alto vaco, as se elimina el agua por sublimacin. La superficie fracturada muestra elevaciones y depresiones correspondientes a las diversas estructuras de los tejidos. 3. Hacer una rplica al molde de la superficie fracturada depositando una capa de carbono. 4. Depositar una capa de metal pesado sobre la superficie de carbono para dar un aspecto sombreado. 5. Llevar la muestra a presin atmosfrica normal y destruir el tejido por una sustancia que no ataque el molde (cido fuerte, hipoclorito sdico). 6. Colocar la rplica en una rejilla de cobre y llevarla al ME.

RADIOAUTOGRAFIA Se basa en el efecto de las radiaciones sobre las emulsiones fotogrficas que contienen bromuro de plata (microdetectores de radiactividad). Los cationes de plata que son alcanzados por la radiacin se transforman en plata metlica que aparece negra al microscopio ptico (MO). Fases: 1. Inyectar el istopo radiactivo al rgano en estudio. 2. Poner un corte de rgano en contacto con la pelcula de emulsin fotogrfica. 3. Dejar un perodo de exposicin y revelar la pelcula. Los puntos negros que aparecen corresponden a los sitios del rgano que contienen el istopo.

La cantidad de grnulos de plata es proporcional a la radiactividad presente y as permite tambin la medida de la cantidad relativa de dicha sustancia. a) Tcnica de emulsin liquida: - Se sumergen las preparaciones biolgicas en la emulsin calentada y fundida. - Retirar las lminas y queda sobre su superficie una fina pelcula de emulsin.

- Secar y guardar al abrigo de la luz, generalmente a baja temperatura. - Proceso de revelado semejante al usado para placas fotogrficas en una cmara oscura. - Llevar al microscopio (ME MO). b) Aplicaciones: con el uso de istopos radiactivos de C, H, N, S, P, es posible marcar las molculas de numerosos compuestos que intervienen en el metabolismo. De esta forma se localiza el proceso metablico y su velocidad, como la secrecin de grnulos de zimgeno.