BAB IV METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Desain Penelitian Penelitian ini merupakan studi eksperimental in vivo pada hewan coba tikus wistar (Rattus novergicus) untuk mengetahui efek pemberian tablet effervescent pigmen mawar (Rosa damascena Mill.) terhadap gambaran steatosis sel hepar yang telah diinduksi karbonetraklorida (CCl4) 4.2 Waktu dan Tempat Penelitian 4.2.1 Waktu Penelitian dilaksanakan pada bulan September sampai 4.2.2 Tempat Penelitian dilakukandi $aboratorium %armakologi %&'() dan $aboraturium *istoP+ %&'(). 4. !ampel dan Pen"ulan"an Sampel yang digunakan untuk penelitian ini adah tikus putih ,antan(Rattus novergicus) strain -istar yang sehat berumur .'/ minggu. Perhitungan besarnya pengulangan pemeriksaan pada sampel adalah mengikuti rumus sebagai berikut ( +nshory0M.0!""/). (t'#)(r'#)1#2 (2'#)(r'#)1#2 r'#1#234 r 14.526# ovember !"##.

44

r 1 4052 )ila t 3 ,umlah perlakuan0 r3 ,umlah ulangan0 maka penelitian ini ,umlah pengulangan yang favorable adalah 40520 sehingga ,umlah sampel hewan coba yang digunakan untuk tiap kelompok perlakuan sebanyak 2 ekor tikus. (ntuk keperluan analisis dalam penelitian ini !2 ekor tikus yang dibagi dalam 2 taraf perlakuan. (ntuk masing'masing perlakuan ditambah # ekor tikus sebagai cadangan makan dibutuhkan sebanyak 4" ekor tikus. 4.4 Va#ia$el Penelitian 4.4.1 Va#ia$el $e$as 7ariabel bebas dalam penelitian ini adalah dosis tablet effervescent dari pigmen bunga mawar yaitu #0!! gr0 !044 gr0 dan 40/. gr. 4.4.2 Va#ia$el Te#"antun" 7ariabel tergantung dalam penelitian ini adalah gambaran steatosis sel hepar tikus. 4.4. Va#ia$el %&nt#&l 7ariabel kontrol dalam penelitian ini adalah dosis CCl 40 kandang tikus0 makanan0 dan minuman tikus. 4.' De(inisi Ope#asi&nal 8osis tablet effervecent pigmen mawar (Rosa damascena Mill.) yang dimaksud dalam penelitian ini adalah dosis yang akan diberikan sebagai perlakuan yaitu #0!! gr0 !044 gr0 dan 40/. gr.

45

 9nduksi CCl4 yang dimaksud dalam penelitian ini adalah pemberian CCl4 sebagai perlakuan yaitu dosis "0#5./ ml:#4. g)):4hari pada 4 group0 selain tikus kontrol. Steatosis adalah salah satu ,enis kerusakan hepar yang berupa akumulasi lemak dalam sel hepatosit. 4.) Dasa# Penentuan D&sis 4.).1 D&sis Ta$let Effervecent Pi"men Ma*a# +Rosa damascena Mill., )erdasarkan penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh $in'*ua -u et al (!"#")0 didapatkan bahwa pada penggunaan dosis ekstrak antosianin dari blueberry sebesar #"0 !" dan 4"mg:kg)) mampu memberikan efek perlindungan tikus yang diinduksi inflammatory bowel disease. *asil penelitian tersebut menyatakan bahwa pada dosis 4"mg:kg)) ekstrak antosianin memberikan perlindungan terhadap induksi inflammatory bowel disease. Penelitian lain men,elaskan bahwa mawar merah sebanyak 42 g menghasilkan #;044 mg pigmen antosianin (Sa<ati0 !""5). )ila rata'rata berat tikus #4. g maka batas aman pemberian antosianin pada tikus adalah sebagai berikut3 #" mg:kg )).#4. g = > mg:#4. g)).#""" g > = #04. mg:#4. g)) 4" mg:kg )).#4. g = > mg:#4. g)).#"""g > = 2044 mg:#4. g)) 8ari perhitungan di atas0 maka batas aman penggunaan pigmen antosianin pada tikus adalah #04.'2044 mg:#4. g)): hari. ?ablet effervecent pigmen mawar (Rosa damascena Mill.) dibuat dari #"" ml pelarut0 42 gr mawar0dan bahan

46

tambahan pangan lain. Setelah diolah sedemikian rupa menghasilkan 4 tablet dan berat total 2 gr:tablet (+@mi0 !"#"). )erdasarkan pertimbangan tersebut dosis yang dipilih adalah dosis 9 #0!! mg0 dosis 99 !044 mg0 dan dosis 999 40/. mg. Penelitian sebelumnya tingkatan dosis yang ada belum menimbulkan efek toksik dan kematian bagi tikus0 sehingga membuka peluang untuk peningkatan dosisnya karena sensitivitas tikus sangat rendah disbanding dengan sensitivitas manusia0 maka kebutuhan dosis tikus yang terlalu sedikit dapat dikalikan #" kali (Aaniswara0#;;2)0 ,uga bentuk sediaan yang berupa tablet dengan kandungan antosianin sebesar 40/2 mg0 maka dosis yang digunakan ialah 3 1. 8osis 9 #0!! mg:#4. g)). Mengingat berat total tablet sebesar 2 g:tablet dengan kandungan pigmen antosianin sebesar 40/2 mg: tablet. Maka dosis 9 menggunakan #:4 tablet. 2. 8osis 99 !044 mg:#4. g)). Mengingat berat total tablet sebesar 2 g:tablet dengan kandungan pigmen antosianin sebesar 40/2 mg: tablet. Maka dosis 99 menggunakan #:! tablet. 3. 8osis 999 40/. mg:#4. g)). Mengingat berat total tablet sebesar 2 g:tablet dengan kandungan pigmen antosianin sebesar 40/2 mg: tablet. Maka dosis 999 menggunakan # tablet. 4.).2 D&sis T&sik --l4 8alam literatur disebutkan bahwa dosis toksik CCl 4 konsentrasi 2" B pada binatang percobaan adalah #04 ml:kg:4hari (Camamoto et al.,#;;.). Pada penelitian ini rata'rata berat tikus adalah !""gr. Sehingga dosis toksik tiap ekor adalah3

47

#04 ml.#4.gr = > ml.#"""gr > = "0#5./ ml Sehingga dalam penelitian ini dosis toksik yag dibutuhkan adalah "0#5./ ml:ekor:4hari. &arena sifat CCl4 yang tidak larut dalam air maka perlu diencerkan dengan minyak ,agung dengan perbandingan #3# (Camamoto et. al,#;;.) 4.. Alat dan Ba/an Penelitian 4...1 Alat #. +lat perawatan tikus3 bak plastik berukuran 42 cm D 4202 cm D #402 cm dengan tutup kandang terbuat dari kawat. $alu alat sonde0 botol air0 sekam0 dan penimbangan berat badan dengan neraca Sartorius. !. +lat pembuatan tablet effervescent 3 kotak plastik beserta tutup0 kain saring0 kertas whatman no 4#0 gelas ukur0 sarung tangan karet0 timbangan0 blender kering0 loyang0 pengering vakum0 ayakan ." mesh0 press hydrolic0 cetakan tablet (terdiri 3 landasan dari ba,a berlapis chrom stainlees steel (ukuran pan,ang = ; cm0 lebar = 5 cm)0 cincin : ring dari logam stainlees steel (ukuran diameter dalam = !05 cm0 tinggi = ! cm)0 dan as penumbuk dari ba,a berlapis chrom stainlees steel dengan (ukuran pan,ang = #" cm0 diameter luar = !0. cm. 4. 4. 2. +lat pembuatan dan pemberian larutan CCl43 pipet0 beaker glass0 spatula. +lat bedah tikus 3 spet0 kapas0 tabung reaksi0 pinset0 scaple0 gunting. +lat untuk pengamatan mikroskopis 3 mikroskop cahaya

48

4...2 Ba/an 1. )ahan perawatan tikus3 air0 sekam0 pakan tikus0 tablet effervescent pigmen mawar merah lokal (Rosa damascena Mill.). 2. )ahan pembuatan tablet effervescent3 bunga mawar dengan varietas lokal )atu dan varietas hibrida )elanda segar. )ahan teknis antara lain kitosan0 alginat0 asam tartrat0 aEuades0 maltodekstrin0 asam sitrat0 sodium bikarbonat dan sukrosa. 3. )ahan pembuatan dan pemberian larutan CCl43 CCl40 minyak ,agung0 spet0 kapas0 alkohol. 4. 5. )ahan bedah tikus 3 alkohol0 kapas0 ether. )ahan untuk pemeriksaan mikroskopis hepar 3 preparat mikroskopis dari hepar tikus dengan pengecatan *F 4.0 P#&sedu# Penelitian 4.0.1 Pen"el&laan dan Pemeli/a#aan Tikus puti/ #. Menimbang berat badan tikus0. !. Memasukkan tikus ke dalam kandang yang dibuat dari bak plastik dengan penutup kawat ram yang dibingkai dengan kayu.dan mengadaptasian tikus putih ,antan selama # minggu. 4. Memberi alas pada kandang berupa sekam dengan ketebalan secukupnya dan melakukan penggantian sekam setiap 4 hari sekali. 4. Memberi minum dengan aEuades setiap hari yang ditempatkan pada botol minum ukuran #"" ml dan terdapat pipa dengan bola katup tempat keluarnya air minun. ?empat ini diletakkan di atas kawat penutup kandang.

49

2. Memberi pakan yang berupa )G# sebanyak #"B dari berat badan tikus untuk setiap harinya. .. Mengelompokkan secara acak men,adi 2 kelompok. $alu memberi tanda pada ekor menggunakan spidol. Huga memberi label pada kandang tikus sesuai perlakuan yaitu label kontrol0 CCl40 8osis 90 8osis 990 dan 8osis 999. 5. Memberikan tablet effervescent pigmen mawar merah dan CCl4 secara sonde sesuai dengan perlakuan selama #4 hari. 4.0.2 Pem$uatan Ekst#ak dan Bu$uk da#i Bun"a Ma*a# Proses pembuatan bubuk pigmen mawar adalah sebagai berikut3 1. )ahan utama yakni mahkota bunga mawar merah disiapkan terlebih dahulu0 dipilih dua varietas bunga mawar yang banyak tersedia di masyarakat khususnya daerah )atu Malang yaitu lokal dan hibrida )elanda 2. Selan,utnya mahkota bunga ditimbang sebanyak 42 g0 dan dimasukkan ke dalam blender dan ditambahkan pelarut yaitu aEuades ;2 ml0 dan asam sitrat 2 gram0 setelah itu dihancurkan 3. *ancuran disimpan dalam lemari pendingin selama 4" menit pada suhu #"IC'#!I C supaya pigmen antosianin yang terekstrak lebih maksimal 4. 8ipisahkan filtrat dan ampas mawar dengan penyaringan menggunakan kain saring dan pemerasan. 8isaring menggunakn penyaringan vakum (kertas -hatman 4#) dan ditambahkan #'!B petroleum eter untuk dipisahkan senyawa non antosianin 5. 8itambahkan bahan filler maltodekstrin sebanyak 4"B 6. 8ikeringkan dalam oven pada suhu 2"oC0 kurang lebih selama #! ,am

50

7. Setelah dikeringkan kemudian dihancurkan dengan menggunakan blender 8. &emudian diayak dengan menggunakan ." mesh. 4.0. Pem$uatan Ta$let Effervescent Ma*a# +Ta/ap II, )ubuk pigmen mawar yang telah diperoleh dibuat men,adi tablet effervescent dengan cara sebagai berikut3 #. 8ilakukan pencampuran #"" g bubuk ekstrak mawar kering dengan #2 gram (#2B) asam sitrat0 4" gram (4"B) sodium bikarbonat dan kopigmentasi (kitosan0 alginat dan asam tartrat) sebesar 2 gram (2B)0 dengan menggunakan blender agar dihasilkan granula inti yang homogen !. Setelah didapatkan granula inti0 kemudian dilakukan pencampuran kedua yaitu pencampuran masing'masing granula inti dengan gula sebesar 5" gr (5"B) 4. Selan,utnya dilakukan proses pengayakan dengan ukuran ." mesh untuk menghasilkan ukuran yang sama 4. &emudian dilakukan pengepresan men,adi bentuk tablet dengan tebal J "0/ cm0 diameter J !05 cm0 dan bobot J 2 gram 2. ?ablet effervescent mawar dikemas dengan pengemas +luminium foil. 4.0.4 Pem$e#ian Ta$let Effervescent Pi"men Ma*a# Me#a/ #. Mengambil tablet effervescentsesuai dengan perlakuan menggunakan sonde. !. Memegang tikus dengan tangan kiri dengan menggunakan kain pelindung. 4. Memegang sonde dengan tangan kanan kemudian memasukkan sonde ke mulut tikus dengan hati'hati.

51

4. Menekan sonde sehingga keluar cairan ke dalam mulut tikus lalu menarik sonde dari mulut tikus perlahan'lahan. 4.0.' Pem$uatan dan pem$e#ian La#utan --l4 #. Mengambil CCl4 dengan pipet ukur sebanyak 2ml:hari !. Melarutkan CCl4 dengan minyak ,agung senyak #3# di dalam beaker glass0 yaitu untuk CCl4 sebanyak 2 ml dan minyak ,agung 2ml dengan konsentrasi 2" B0 kemudian menagduk hingga tercampur rata. 4. Mengambil larutan CCl4 dengan dosis "0!." ml:!""g)):4 hari. 4. Penyuntikan dilakukan secara subkutan menggunakan spet. 4.0.) Pen"am$ilan p#epa#at mik#&sk&pis /epa# tikus #. Membius tikus dengan kloroform kemudian dilakukan pembedahan pada tikus !. 8ilakukan pengambilan organ hepar tikus lalu dibuat preparat mikroskopis dengan pengecatan *F 4.0.. Pen"amatan mik#&sk&pis sel /epa# tikus Pengamatan mikroskopis pada hepar tikus menggunakan mikroskop dengan perbesaran #"">0 pengamatan dilakukan secara sub,ektif dengan menghitung prosentase steatosis sel hepar dalam tiga lapangan pandang0 yang dimulai dari vena sentralis sampai sepertiga portal dan lapangan pandang lobulus tersebut dibagi secara ima,iner men,adi 4 @ona0 yaitu @ona # 3 di sekitar sepertiga portal0 @ona 4 3 di sekitar vena sentralis0 dan @ona ! 3 diantara keduanya. *asil yang didapat dikonversikan ke prosentase steatosis sel hepar dalam satu lobulus.

52

4.0.0 Alu# %e#an"ka %e#1a Penelitian Pengumpulan tikus putih ,antan galur wistar ) Rattus novergicus) Seleksi sesuai dengan kriteria 9nklusi dan Fkslusi

Fksplorasi pakan tikus dan pengkondisian lingkungan awal bagi tikus 5 hari dan penimbangan )) awal

A Diet Normal

B Diet Normal

C Diet Normal

D Diet Normal

E Diet Normal

Penelitian terhadap !2 tikus putih ,antan galur wistar) Rattus novergicus)

Diet Normal

Diet Normal+ CCl4 dosis 0,1768 ml/136 BB/3 !ari

Diet Normal+ ta"let effervescent #i me$ ma%ar dosis 1,22 r+ CCl4 dosis 0,1768 ml/136 BB/3 53 !ari

Diet Normal+ ta"let effervescent #i me$ ma%ar dosis 2,23 r/!ari+ CCl4 dosis 0,1768 ml/136 BB/3 !ari

Diet Normal+ ta"let effervescent #i me$ ma%ar dosis 4,46 r + CCl4 dosis 0,1768 ml/136 BB/3 !ari

Kbservasi #4 hari

Pengamatan mikroskopis sel hepar

A$alisa Data

4.2 P#&sedu# Pen"umpulan dan Analisis Data 4.2.1 Pen"umpulan Data Pengumpulan data pada penelitian ini adalah sebagai berikut 3 a. 8iberikan sonde tablet effervescent pigmen mawar merah (Rosa damascena Mill.) dengan dosis berbeda'beda tiap kelompoknya yang diinduksi karbon tetraklorida (CCl4) yang keseluruhannya selama #4 hari. b. Setelah perlakuan selesai selama #4 hari0 kemudian dibedah0 dan diambil heparnya. 4.2.2 Analisis Data +nalisa data secara statistik menggunakan oneway +nova dan $S80 dengan dera,at kepercayaan (L) sebesar "0"2. 8ari hasil +nova0 nilai yang dianalisa adalah

54

nilai % (%hitung) dan nilai P. Hika nilai %hitung M %tabel berarti nilai rata'rata kelompok berbeda dan ,ika nilai %hitung N %tabel berarti nilai rata'rata kelompok adalah sama. Hika P N "0"2 berarti perbedaan tersebut adalah signifikan dan ,ika P M "0"20 berarti perbedaan tersebut tidak terlalu berpengaruh atau tidak signifikan. +nalisa data dengan $S8 digunakan untuk mengetahui kelompok mana yang berbeda secara signifikan.4.2. 3ad*al %e"iatan P#&"#am Ta$el 4en5ana %e#1a dan 3ad*al Penelitian Min""u %e"iatan ke61 Pemilihan dan O pengacakan sampel +daptasi Pemberian tablet effervescent pigmen mawar merah 6 diinduksi karbon tetraklorida (CCl4) Monitoring Pengamatan mikroskopis sel hepar +nalisis data O O O O O O O O O ke62 ke6 ke64 ke6' Min""u Min""u Min""u Min""u

55