Henry

Laboratorio
en el

Diagnostico Clinico
Homenaje a

Todd-Sanford & Davidsohn

John Bernard Henry, M.D.

Distinguised Service Professor Director. Pathology 200 College of Medicine Dircelo): Transfusion Medicine and Transfusion Medicine Fellowship Program Attending Pathologist, University Hospital Siale University of New York Upstate Medical University Syracuse, New York

Frederick R. Davey, M.D.

Prolessor and Chair. Department ot Pathology. State University ot New York Upstate Medical University. Syracuse. New York

Matthew R. Pincus, M.D , Ph.D.

Prolessor ol Pathology. State University of New York Downstate Medical Center; Chair. Department ot Pathology and Laboratory Medicine. Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York

Chester J. Herman, M . D , Ph.D.

Professor ot Pathology, Emory University School ol Medicine: Director. Pathology. Grady Health System, Atlanta. Georgia

Gregory A.Threatte, M.D.

Professor ot Pathology; Director ot Core Laboratories and Outreach. Upstate Medical University. Syracuse, New York

Richard A. McPherson, M.D.

Prolessor ot Pathology; Chair. Division ot Clinical Pathology. Department ot Pathology. Medical College ot Virginia. Virginia Commonwealth University; Director. Clinical Pathology. Medical College ot Virginia Hospitals, Richmond. Virginia

Gail L. Woods, M.D.

Prolessor ot Pathology; Director. Clinical Microbiology. University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas

Contenido

Seccin I. Patologa clnica / Medicina de laboratorio

Gregory A. Tetrault, M.D., John Bernard Henry, M.D.

1. L a b o r a t o r i o clnico: o r g a n i z a c i n , objetivos y p r c t i c a
John Bernard Henry, MD,Anthony S Kurec,
M
S.HIASCPI

3 50 60 79 92 108 138 148

DiM.WiUam

Dcnwyler.M.7

2 . L a b o r a t o r i o s d e consulta m d i c a
Gregory A. Threatte, M o

...

3. Principios de i n s t r u m e n t a c i n

. .

Andy N.D. Nguyen. MSM. MD.. Robert L Sunheimer, M S , MriASCPiSC, John Bernard Henry, M D.

4. A u t o m a t i z a c i n d e l l a b o r a t o r i o clnico
Rodney S. Markin, /no, cft.O.

5. I n t e r p r e t a c i n de los resultados de l a b o r a t o r i o
Motthew R. Pincus, M D, pii D, Naif Z. Abraham.]r.. M a. i o.

6. I n f o r m t i c a , t r a t a m i e n t o de i m g e n e s e i n t e r o p e r a b i l i d a d
Raymond D.Aller, A I O , Ulysses J. Balis, MD

7. Estadstica e x p e r i m e n t a l
Gregory A. Tetrault. M.D.

8. G a r a n t a de calidad d e l l a b o r a t o r i o clnico
Gregory A. Tetrault, M.D.

Seccin II. Qumica clnica

Mathew R. Pincus, M.D., Ph.D., John Bernard Henry, M.D.

9. Evaluacin de la funcin r e n a l , b a l a n c e de a g u a , e l e c t r l i t o s , e q u i l i b r i o cido-base y gases sanguneos

D. Roben Dufour, M D

159

10. I n t e r m e d i a r i o s m e t a b l i c o s , ionesinorgnicos y m a r c a d o r e s b i o q u m i c o s del m e t a b o l i s m o d e l h u e s o

Elena Nkolova Hrstova, M D, John Bernard Henry. M D

180 21 I 224 249 264 281 304 335

11. H i d r a t o s de c a r b o n o
Paul . Knudson, Mo, Ruth S.Weinstock, M.R.PhO,John Bernard Henry. MD

12. Lpidos y d i s l i p o p r o t e i n e m i a
Paul S. Bachorik, BiO, Margo A. Denke. MD . van A. Stem, M D PhD. re A P. Bosyl M. Rifikind, MD.FR.CP

13. P r o t e n a s especficas
Richard A. McPherson. M o

14. E v a l u a c i n de la f u n c i n y el d a o h e p t i c o
D. Roben Dufour. M D

/5. E n z i m o l o g a clnica
D. Roben Dufour, MD. John A. Loa, n D.,John Bernard Henry, MD

16. Evaluacin de la f u n c i n e n d o c r i n a
Joan H. Howanitz. Mo,John Bernard Henry. M o

17. Toxicologa y m o n i t o r i z a c i n t e r a p u t i c a de f r m a c o s
Matthew R. Pincus, M o, Hi a, Naif Z. Abraham Jr., M.D.. PhD.

III

Seccin III. Orina y otros fluidos

Gregory A. Threatte, MD.. John Bernard Henry, M.D.

18. E x a m e n bsico de la o r i n a
Christine Fller, M), Gregory A. Threatte, M D, John Bernard Henry, M.D

367 403 425 432 446

19. L q u i d o c e f a l o r r a q u d e o , sinovial y lquidos serosos del o r g a n i s m o

Gregory P. Smith, M.D., Carl R. Kjeldsberg, M.D

20. L a b o r a t o r i o en a n d r o l o g a y la e v a l u a c i n de la f e r t i l i d a d
Siddhartha Sarkar, Pi-.D.John Bernard Henry. M.D

21. T r a t a m i e n t o en el l a b o r a t o r i o de las tecnologas de r e p r o d u c c i n asistida

AndrVan Steirteghem.MD.PhD.

22. A s p e c t o s d e l l a b o r a t o r i o en el t r a t a m i e n t o de la gestacin
Robert Wenk, M D . . M S , Miriam Blitzer. Hi..

23. D i a g n s t i c o de l a b o r a t o r i o de las a l t e r a c i o n e s gastrointestinales y pancreticas

David G. Heisig. M.D.. Gregory A. Theatte. MD., John Bernard Henry, M.D.

462

Frederick R. Davey, MD.,

John Bernard Henry, M.D.

24. E x a m e n bsico de la sangre

Michael W. Morris.
M S , DLMIASCPISH.,

479
M D

Frederick R. Davey.

25. H e m a t o p o y e s i s
Frederick R. Davey. Mo, Robert . Hutchison. MD

520 542 586 623 . . 642 660 718 . . 776 806

26. T r a s t o r n o s e r i t r o c i t a r i o s
M. Torek Elghetany, M D, Frederick R. Dovey, M D

27. A l t e r a c i o n e s de los leucocitos

Robert . Hutchson, M D, Frederick R. Davey, M.D

28. P l a q u e t a s en sangre
Jonathan L Miller, MO .Ph .D.

29. C o a g u l a c i n , fibrinlisis e h i p e r c o a g u l a c i n
Elizabeth M. Van Cott, M D , Michael Laposata, M D , P h D .

30. I n m u n o h e m a t o l o g a
WendyV. Beadlyng, M s. MTIASCPISRB, Laura Cooling, MD.MSI ,ohn Bernard Henry, Mo

31. M e d i c i n a transfusional
Leonard I. Borat, MD.MBA, Eduardo Delaflor Weiss, M D , John Bernard Henry, MO

32. H e m a f r e s i s
Jeffrey L Winters, M D . Alvaro A. Pineda, M D

33. A l m a c e n a m i e n t o de tejidos y clulas m a d r e

Charlene A. Hubbell. 6 s. MTIASCPISB. John Bernard Henry, M D

Seccin V. Inmunologa e inmunopatologa

Richard A. McPherson, M.D., John Bernard Henry, M.D.

34. V i s i n g e n e r a l d e l s i s t e m a i n m u n e y de los t r a s t o r n o s inmunolgicos

Richard A. McPherson, M.D.

817 821

35. I n m u n o e n s a y o s e i n m u n o q u m i c a
Ybshiro Ashihara, PII.D., Yosushi Kasahara, Pii.o., D.M.SC., Roben M. Nakamura, M
D

36. E x a m e n d e l a b o r a t o r i o d e l s i s t e m a i n m u n e c e l u l a r

850

He/ene MA Paxton. M.SMTIASCPI, Susanna Cunningham-Rundles, . Maurice R.G. 0 Gorman, M.Sc...D/ABMUI

Contenido

37. E v a l u a c i n del f u n c i o n a m i e n t o de las i n m u n o g l o b u l i n a s y la i n m u n i d a d h u m o r a l

Richard A. McPherson, MD

878 892 914

38. C o m p l e m e n t o y cininas: m e d i a d o r e s de la i n f l a m a c i n
Ene Wagner, pto. Haixiang Jiang, Mo.fto. Michael M Frank. MD

39. C i t o c i n a s y m o l c u l a s de a d h e s i n
HD o n s Massey, MD. FI D. DO S . Richard A. McPherson, M D

40. A n t g e n o l e u c o c i t a r i o h u m a n o : c o m p l e j o m a y o r de histocompatibilidad del h o m b r e

Armead H. Johnson. iD. Carolyn Katovich Hurley. f i D . Roben]. Haraman. cwrMC.usn.MD,udnh A.Wade. 8 k

927 949 963

41. C o m p l e j o m a y o r de h i s t o c o m p a t i b i l i d a d y e n f e r m e d a d
julio C Delgado. M o, Edmond j.Yunis, MD

42. T r a s t o r n o s i n m u n o d e f i c i t a r i o s
Charlotte Cunnmgham-Rundles. MD.fhD.

43. Evaluacin clnica de l a b o r a t o r i o de las e n f e r m e d a d e s r e u m t i c a s sistmicas

Carlos Alberto Yon Mhlen,
MO.F*D..

974 990 1000 1016

Roben M. Nakamura.

M O

44. Vasculitis
Rex M. McCallum. MD. David] Bylund. MD.

45. E n f e r m e d a d e s a u t o i n m u n e s organoespecficas
David / Bylund. M D. Roben M. Nakamura. M D

46. E n f e r m e d a d e s alrgicas
Henry A. Homburger.MD.

47. D i a g n s t i c o y m a n e j o d e l c n c e r m e d i a n t e m a r c a d o r e s t u m o r a l e s serolgicos
Jomes T.Wu. rto

1028

Gail L. Woods, M.D., John Bernard Henry, MD

48. Infecciones vricas

Michael Coste/lo, w D, Margaret Yungbluth, MD

1045 1072 1088 1119 1131 1144 1158

Fred W.Westenfeld.
MIIASCPISM

49. Infecciones causadas p o r c l a m i d i a s , rickettsas y m i c o p l a s m a s

Gail L Woods, D . David H. Walker, MD

50. B a c t e r i o l o g a m d i c a
barbara S. Reisner, i* o. Gail L Woods, M O

51. P r u e b a s de sensibilidad in vitro a los a n t i m i c r o b i a n o s

Michael B. Smitli. MD, Gail L. Woods. Mo

52. Infecciones p o r e s p i r o q u e t a s
Michael 8. Sm;(i, M D . Randall T. Hoyden, MD . David H. Persing. M D . m D., Gail L Woods. M D

53. M i c o b a c t e r i a s
Gail L Woods. MD

54. E n f e r m e d a d e s m i c t i c a s
Washington C.Wmn.jr,
MD.MRA,

55. P a r a s i t o l o g a m d i c a
Thomas R. Fritsche, Mr>,mo,ames W. Smith, MD.

1196 1241

56. P a t o l o g a m o l e c u l a r de e n f e r m e d a d e s infecciosas
Martn G. Cormican, MD, Michael A. Pfaller, M.D

57. M a n e j o y r e c o g i d a de m u e s t r a s p a r a el diagnstico de las e n f e r m e d a d e s infecciosas

Gail L. Woods, MD

1254

Contenido

Chester, J. Hermn. M.D.. Ph.D., John Bernard Henry. MD.

58. I n t r o d u c c i n a la p a t o l o g a m o l e c u l a r
Chester / Hermn. MD..PII.D, John Bernard Henry. * I . D

1273 1275 1287 1296 1304 1333 1344 1355 1372

59. Diagnsticos m o l e c u l a r e s : tcnicas y principios bsicos

Ehzabelli R. Unger.
PIo.
MD,

Margaret A. Piper.

PhD.MP.H.

60. R e a c c i n en c a d e n a de la p o l i m e r a s a y o t r a s tecnologas de amplificacin

james C. Zimring, MD. PID. Frederick S. No/te, no.

61. Tecnologas de la h i b r i d a c i n en serie

jacques Scnrenzet. M o Jonathan R. Hibbs. M D . David H. Persing. MD.PhD.

62. A p l i c a c i o n e s de la c i t o g e n t i c a en la p a t o l o g a m o d e r n a
Constance K. Stein, PhD.

63. O r g a n i z a n d o un l a b o r a t o r i o de diagnstico m o l e c u l a r
Andrea Ferreira-Gonzalez. PhD, DavidA.WHkinson. MD.PhD.. Coreton T. Garren, MD..PI.D.

64. O n c o p r o t e n a s y d e t e c c i n t u m o r a l p r e c o z

Motthew R. Pincus, M D Hi D, Paul W Brandl-Rauf. M D , Ph o. D . P H . William Koslosky, M o., William Appruzzese, PhD.

65. T c n i c a s m o l e c u l a r e s en el diagnstico de neoplasias h e m a t o p o y t i c a s

David S.Viswanatha, MD, Ridiard S. Larson, M D , PhD

66. D i a g n s t i c o m o l e c u l a r de las e n f e r m e d a d e s genticas

Wayne W. Grody. MD.. PhD, Walter W. Noli, MD.

67. P r u e b a s d e p a t e r n i d a d : e m p l e o d e l A D N , p o l i m o r f i s m o y o t r o s m a r c a d o r e s genticos
Herbert F. Polesky, M D.

1390 1402

68. P r u e b a s forenses d e i d e n t i d a d m e d i a n t e anlisis d e l A D N

Vctor W. Weedn. M o) D, Rlionda K. Roby, M P H

1. Soluciones fisiolgicas, t a m p o n e s , indicadores cido-base, m a t e r i a l e s de r e f e r e n c i a e s t n d a r y t a b l a de conversin de t e m p e r a t u r a s 2. Pesos ideales, superficie c o r p o r a l e ndice de m a s a c o r p o r a l ( I M C ) 3 . C l c u l o a p r o x i m a d o d e l v o l u m e n sanguneo t o t a l ( V S T ) 4. Tabla p e r i d i c a de los e l e m e n t o s 5 . U n i d a d e s del s i s t e m a i n t e r n a c i o n a l ( S I )
H. Peter Lehmann. Pt 0, jolin Bernard Henry, MD

1417 1420 1424 1425 1426

.. ...

VI

Autores

Naif Z. A b r a h a m , Jr., M.D.. Ph.D. Staff Pathologist. Veterans Affairs Medical Center; Assistant Professor. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York R a y m o n d D. Aller, M.D. Clinical Professor. Department of Pathology and Laboratory Medicine. Emory University School of Medicine. Atlanta. Georgia: Vice President. Medical Affairs and Informatics. MDS Laboratory Services (United States). Nashville. Tennessee W i l l i a m A p p r u z z e s e , Ph.D. Staff Member and Clinical Assistant Professor. Department of Environmental Sciences. Columbia College of Physicians and Surgeons. New York. New York Yoshihiro A s h i h a r a , Ph.D. General Manager. Research Laboratories. Incorporated. Tokyo. Japan Fujirebio

M a r t i n G . C o r m i c a n , M.D. Professor of Bacteriology (Medical Microbiology). Department of Bacteriology. Clinical Sciences Unit, National University of Ireland, Galway; Consultant Microbiologist. University College Hospital Galway. Galway. Ireland M i c h a e l C o s t e l l o , Ph.D. Technical Director. Advocate Shared Services Laboratory. Park Ridge, Illinois C h a r l o t t e C u n n i n g h a m - R u n d l e s , M.D.. Ph.D. Professor, Departments of Medicine. Pediatrics, and Immunobiology. Mount Sinai School of Medicine. New York. New York S u s a n n a C u n n i n g h a m - R u n d l e s , Ph.D. Professor of Immunology: Vice. Chair of Academic Affairs, Department of Pediatrics; Director. The Immunology Research Laboratory, Weill Medical College of Cornell University, New York. New York F r e d e r i c k R. Davey, M.D. Professor and Chair, Department of Pathology. State University of New York Upstate Medical University. Syracuse. New York J u l i o C. D e l g a d o , M.D. Instructor. Department of Pathology. Harvard Medical School; Assistant Medical Director. HLA Laboratory. Dana-Farber Cancer Institute, Boston. Massachusetts M a r g o A . D e n k e , M.D. Associate Professor. University of Texas Southwestern Medical Center. Dallas. Texas W i l l i a m K. D e t t w y l e r , M.T. Senior Consultant. Health Systems Concepts. Incorporated. Longwood. Florida D. R o b e r t D u f o u r , M.D. Professor of Pathology. George Washington University Medical Center, Washington. DC; Clinical Professor of Pathology. Uniformed Services University of the Health Sciences. Bethesda. Maryland; Chief. Pathology and Laboratory Medicine Service. Veterans Affairs Medical Center. Washington. DC. M . T a r e k E i l g h e t a n y , M.D Associate Professor and Vice Chairman. Department of Pathology. University of Texas Medical Branch, Galveston. Texas A n d r e a F e r r e i r a - G o n z a l e z , Ph.D. Associate Professor. Medical College of Virginia. Virginia Commonwealth University; Technical Director of Molecular Diagnostics. Medical College of Virginia Hospitals, Virginia Commonwealth. University. Richmond. Virginia

Paul S. B a c h o r i c k , Ph.D. Professor (retired). The Johns Hopkins University School of Medicine. Baltimore. Maryland Ulysses J . Balis, M O Instructor in Pathology. Harvard Medical School and Massachusetts General Hospital. Boston. Massachusetts W e n d y V. B e a d l i n g , M.S., M T < A S C P ) S B B Assistant Professor. Department of Clinical Laboratory Science, State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York M i r i a m Blitzer, Ph.D. Professor and Chief, Division of Human Genetics. Department of Pediatrics. University of Maryland, Baltimore. Maryland L e o n a r d I. B o r a l , M . D . M.B.A. Associate Professor of Clinical Laboratory Medicine and Pathology, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark; Staff Pathologist, Jersey Shore Medical Center, Neptune. New Jersey Paul W. B r a n d t - R a u f , M . D , Ph.D., D.P.H. Professor. Department of Environmental Sciences. Columbia College of Physicians and Surgeons, New York, New York D a v i d J . B y l u n d , M.D. Laboratory Director. Scripps Reference Laboratory. San Diego. California Laura C o o l i n g , M . D . M.SC. Assistant Professor. Department of Pathology. University of Michigan Medical School; Assistant Director, Blood Bank and Transfusion Medicine, University of Michigan Hospitals. Ann Arbor. Michigan

vii

M i c h a e l M. F r a n k , M.D. Samuel L. Katz Professor and Chairman of Pediatrics, and Professor of Immunology and Medicine, Duke University Medical Center, Durham. North Carolina T h o m a s R. F r i t s c h e , M.D . Ph.D. Associate Professor, Department of Laboratory Medicine, University of Washington; Head, Clinical Microbiology Division. University of Washington Medical Center. Seattle. Washington C h r i s t i n e E. Fuller, M D . Fellow, Department of Pathology, Washington University School of Medicine; Fellow. Department of Pathology, Barnes- Jewish Hospital, St. Louis, Missouri C a r l e t o n T. G a r r e t t , M.D ., Ph.D. Professor of Pathology, Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University; Medical Director, Molecular Diagnostics Laboratory, Department of Pathology, Medical College of Virginia Hospitals, Richmond. Virginia W a y n e W . G r o d y , M.D., P h . D Professor. Divisions of Molecular Pathology and Medical Genetics, Departments of Pathology and Laboratory Medicine and Pediatrics, UCLA School of Medicine: Director, Diagnostic Molecular Pathology Laboratory, UCLA Medical Center, Los Angeles, California R o b e r t J . H a r t z m a n , C A P T , M C , U S N , M.D. Director, C. W. Bill Young Marrow Donor Recruitment Program and Research Program, Naval Medical and Research Insitute, Bethesda. Maryland R a n d a l l T. H a y d e n , M.D. Director. Clinical Microbiology, St. Jude Children's Research Hospital. Memphis, Tennessee D a v i d G. H e i s i g , M.D. Associate Professor of Medicine. Department of Medicine, State Universit of New York Upstate Medical University Syracuse. New York J o h n B e r n a r d H e n r y , M.D. Director, Pathology 200, College of Medicine; Distinguished Service Professor; Director, Transfusion Medicine & Transfusion Medicine Fellowship; Hemapheresis. HLA, Progenitor Cell and Parentage Testing Laboratories; Attending Pathologist, University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York C h e s t e r J. H e r m a n , M.D.. Ph.D. Professor of Pathology, Emory University School of Medicine; Director. Pathology, Grady Health System, Atlanta. Georgia

J o n a t h a n R. H i b b s , M.D. Director, Bacteriology Laboratory Wadsworth Center. New York State Department of Health. David Axelrod Institute, Albany, New York H e n r y A . H o m b u r g e r , M.D. Professor of Laboratory Medicine, Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Medicine. Rochester, Minnesota J o a n H . H o w a n i t z , M.D. Vice Chair, Department of Pathology. State University of New York at Brooklyn; Director of Laboratories. Kings County Hospital Center, Brooklyn. New York E l e n a N i k o l o v a H r i s t o v a , M.D. Resident in Anatomic and Clinical Pathology. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York C h a r l e n e A. H u b b e l l , B.S MT<ASCP)SBB Adjunct Assistant Professor, Clinical Laboratory Science, College of Health Professions; Supervisor, Histocompatibility, Immunogenetics and Progenitor Cell Bank, State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York C a r o l y n K a t o v i c h H u r l e y , Ph.D. Professor. Department of Microbiology. University Medical Center. Washington.

Georgetown DC

R o b e r t E. H u t c h i s o n , M.D. Professor of Pathology. Director of Clinical Pathology, and Director of Hematopathology, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York H a i x i a n g J i a n g , M . D , Ph.D. Assistant Research Professor. Department of Pediatrics. Duke University Medical Center, Durham, North Carolina A r m e a d H. J o h n s o n , Ph.D. Professor, Department of Pediatrics, Georgetown University Medical School, Washington. DC Y a s u s h i K a s a h a r a , Ph.D., D.M.SC Visiting Professor. Kyorin University School of Public Health: Research Fellow. Keio University of Medicine. Tokyo, Japan C a r l R. K j e l d s b e r g , M.D. Professor and Chair. Department of Pathology, University of Utah: University Hospital (Laboratory Services) Chairman and Pediatric Pathology (Laboratory Services) Chairman. University of Utah Hospital and Primary Children s Medical Center. Salt Lake City, Utah

viii

Autores

Paul E. K n u d s o n , M.D. Associate Professor of Medicine, Division of Endocrinology. Diabetes and Metabolism: Joslin Diabetes Center. State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York W i l l i a m K o s l o s k y , M.D. Consultant. Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York A n t h o n y S. K u r e c ,
M.S., H ( A S C P ) D L M

R i c h a r d A . M c P h e r s o n , M.D. Professor of Pathology; Chair. Division of Clinical Pathology, of Virginia. Department of Pathology. Medical College Virginia Commonwealth University; Director.

Clinical Pathology. Medical College of Virginia Hospitals. Richmond. Virginia J o n a t h a n L. Miller, M . D . Ph.D. Professor of Pathology; Director of Academic Aftairs. Department of Pathology: Director of Special Hematology Laboratory. Syracuse, New York M i c h a e l W. M o r r i s , Professor.
M.S.. D L M I A S C P I S H

Clinical Associate Professor. Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Professions: Administrator for Pathology Marketing and University Pathologists Laboratories, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse. New York M i c h a e l L a p o s a t a , M.D.. Ph.D. Professor. Department of Pathology: Director of Clinical Laboratories. Harvard Medical School. Boston, Massachusetts R i c h a r d S. L a r s o n , M.D.. Ph.D. Assistant Professor, Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine; Laboratory Director, University Hospital Rapid Response Laboratories. University Hospital. Albuquerque. New Mexico H. Peter L e h m a n n , Ph.D. Professor Emeritus. Department of Pathology. Louisiana State University Medical Center. New Orleans. Louisiana J o h n A. Lott, Ph.D. Professor. Department of Pathology, The Ohio State University; Director of Clinical Chemistry, The Ohio State University Hospitals, Columbus. Ohio R o d n e y S. M a r k i n , M . D . Ph.D. Professor and Vice Chair, Department of Pathology and Microbiology: Associate Dean for Clinical Aftairs. College of Medicine, University of Nebraska Medical Center. Omaha. Nebraska H. D a v i s M a s s e y , M . D , Ph.D., D.D.S. Chief Resident in Pathology. Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia Rex M. M c C a l l u m , M.D. Associate Clinical Professor of Medicine. Division of Rheumatology. Allergy and Clinical Immunology. Duke University School of Medicine; Vice Chair for Clinical Services. Department of Medicine. Duke University School of Medicine and Hospital. Durham. North Carolina

University Hospital,

State

University of New York Upstate Medical University.

Department of Clinical Laboratory Science;

Manager. Department of Pathology. University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York R o b e r t M . N a k a m u r a , M.D. Professor. Departments of Immunology and The Scripps Experimental and Molecular Medicine.

Research Institute: Senior Consultant and Chairman Emeritus, Department of Pathology. Scripps Clinic and Research Foundation. La Jolla. California A n d y N.D. N g u y e n , Associate Professor. Director.
M S M E , M.D.

Department of Pathology.

University of Texas Medical School at Houston; Hematology Laboratory and Chemistry Memorial Hermann Hospital. Laboratory. Lyndon B. Johnson Hospital; Director. Coagulation Laboratory. Houston, Texas W a l t e r W . N o l l , M.D Professor of Pathology. and Molecular Genetics Dartmouth-Hitchcock Lebanon. Dartmouth Medical School. Diagnostic Laboratories, Center, Hanover. New Hampshire; Director. Clinical Chemistry Medical

New Hampshire

F r e d e r i c k S. N o l t e , Ph.D. Associate Professor. Medicine, Laboratory Director, Laboratories, Atlanta. Pathology and Laboratory Clinical Microbiology and Emory Medical Georgia Emory University School of Medicine;

Molecular Diagnostic Laboratories.

M a u r i c e R . G . O ' G o r m a n , M Sc.. Ph.D.. D(ABMLi) Associate Professor-Pediatrics. Northwestern Diagnostic The University Medical School; Director.

Immunology and Flow Cytometry Laboratories. Children's Memorial Hospital. Chicago. Illinois

ix

Autores

H e l e n e M.A. P a x t o n , M.S., M T I A S C P ) Vice President of Manufacturing. Regulatory Affairs and Research and Development, PanBio InDx, Incorporated. Baltimore. Maryland D a v i d H. P e r s i n g , M.D.. Ph.D. Medical Director. Infectious Disease Research Institute; Vice President, Diagnostics Research. Corixa Corporation, Seattle. Washington M i c h a e l A. Pfaller, M.D. Professor. Department of Pathology; Director, Molecular Epidemiology and Fungus Testing Laboratory, University of Iowa College of Medicine. Iowa City, Iowa M a t t h e w R. P i n c u s , M . D , Ph.D. Professor of Pathology. State University of New York Downstate Medical Center; Chair. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York A l v a r o A . P i n e d a , M.D. Professor of Laboratory Medicine and Director of Transfusion Medicine Fellowship Program. Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Medicine: Consultant. Transfusion Medicine. Mayo Clinic. Rochester. Minnesota M a r g a r e t A. Piper, Ph.D.. M . R H . Senior Consultant. Technology Evaluation Center. BlueCross BlueShield Association, Chicago, Illinois H e r b e r t F. Polesky, M.D. Professor (retired), Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Minnesota School of Medicine, Minneapolis. Minnesota: Formerly Director, Memorial Blood Centers of Minnesota, Minneapolis, Minnesota B a r b a r a S. R e i s n e r , Ph.D. Assistant Professor, Department of Pathology: Associate Director. Clinical Microbiology Laboratory, University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas Basil M. R i f k i n d , M.D., F.R.C.P. Special Assistant for Clinical Studies,

S i d d h a r t h a Sarkar, Ph.D. Clinical Professor, Department of Pathology: Director. Andrology Service. University Hospital, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York Jacques Schrenzel, Assistant Professor. Consultant. Division University Hospital. M.D Geneva University Medical School: of Infectious Diseases, Geneva Geneva, Switzerland

G r e g o r y P. S m i t h , M.D. Assistant Clinical Professor. Department of Pathology. University of Utah; Staff Pathologist, Department of Pathology. St. Mark's Hospital. Salt Lake City. Utah J a m e s W . S m i t h , M.D. Professor Emeritus. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana M i c h a e l B. S m i t h , M.D. Assistant Professor; Associate Director, Clinical Microbiology and Laboratory Information System. University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas C o n s t a n c e K. S t e i n , Ph.D. Associate Professor of Pathology and Pediatrics; Director of Cytogenetics and Associate Director of Molecular Diagnostics. University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York E v a n A . S t e i n , M . D , Ph.D.. F.C.A.P Voluntary Professor. Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati. Cincinnati, Ohio: President and Chief Executive Officer, Medical Research Laboratories, Highland Heights, Kentucky R o b e r t L. S u n h e i m e r , M.S., M T ( A S C P ) S C Associate Professor in Clinical Laboratory Science. State University of New York Upsate Medical University, Syracuse, New York G r e g o r y A. Tetrault, M.D. Medical Director, Shared Laboratory Services. Chesapeake, Virginia

L.C..

National Institutes

G r e g o r y A . T h r e a t t e , M.D. Professor of Pathology; Director of Core Laboratories and Outreach, Upstate Medical University, Syracuse, New York E l i z a b e t h R. U n g e r , Ph.D., M.D. Acting Chief, Human Papillomavirus Section. Centers for Disease Control and Prevention; Clinical Associate Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University School of Medicine. Atlanta. Georgia x

of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute. Division of Heart and Vascular Diseases, Bethesda. Maryland R h o n d a K. Roby, M . R H Senior Forensic Specialist, Human Identification, Applied Biosystems. Foster City, California

Autores

E l i z a b e t h M . V a n C o t t , M.D. Director, Coagulation Laboratory, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Boston. Massachusetts A n d r e V a n S t e i r t e g h e m , M.D.. Ph.D. Full Professor, Medical School; Scientific and Laboratory Director. Center for Reproductive Medicine, Medical School and University Hospital, DutchSpeaking Brussels Free University. Brussels. Belgium D a v i d S . V i s w a n a t h a , M.D Assistant Professor. Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine; Staff Hematopathologist. University of New Mexico Health Sciences Center. Albuquerque. New Mexico C a r l o s A l b e r t o Von M i i h l e n , M.D.. Ph.D. Full Professor of Rheumatology and Internal Medicine, Pontifical Catholic University School of Medicine, Porto Alegre, RS, Brazil J u d i t h A. W a d e , B Sc. Professor, Department of Surgery, and Faculty of Medicine, University of Toronto; Formerly Head, Histocompatibility Laboratory, Toronto Hospital University Health Network, Toronto. Ontario. Canada Eric W a g n e r , Ph.D. Immunologist, Ste-Justine Hospital, Quebec, Canada

R o b e r t E. W e n k , M.D.. M.S. Clinical Professor of Pathology. Pennsylvania State University, Hershey, Pennyivania; Clinical Associate Professor of Human Genetics, University of Maryland; Attending Pathologist, Division Head of Clinical Pathology, Sinai Hospital, Baltimore. Maryland F r e d W. W e s t e n f e l d , M T ( A S C P > S M Clinical Faculty. University o Vermont: Microbiology Manager (Chief Technologist) Fletcher Allen Health Care. Burlington. Vermont D a v i d S. W i l k i n s o n , M . D . Ph.D. Professor and Chairman, Department of Pathology; Professor of Health Administration. Medical College of Virginia Campus. Virginia Commonwealth University. Richmond, Virginia W a s h i n g t o n C . W i n n , Jr., M . D , M.B.A. Professor of Pathology. University of Vermont College of Medicine; Director, Clinical Microbiology Laboratory, Fletcher Allen Health Care. Burlington, Vermont J e f f r e y L. W i n t e r s , M.D. Assistant Professor. Department of Pathology and Laboratory Medicine; Associate Director of the Blood Bank. University of Kentucky Chandler Medical Center: Associate Medical Director. Central Kentucky Blood Center; Director of Transfusion Service. Cooper Drive Division of the Veterans Affairs Medical Center, Lexington, Kentucky Hemapheresis Gail L. W o o d s , M.D. Professor of Pathology; Director. Clinical Microbiology, University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas J a m e s T . W u , PhD Professor of Pathology, University of Utah Health Science Center; Director of Special Chemistry Laboratory. Associate Regional University Pathologists (ARUP). Salt Lake City. Utah M a r g a r e t Y u n g b l u t h , M.D. Associate Professor of Clinical Pathology, Northwestern University Medical School. Chicago: Staff Pathologist, St. Francis Hospital. Evanston, Illinois E d m o n d J . Y u n i s , M.D. Professor, Department of Pathology. Harvard Medical School: Director. HLA Laboratory, Dana-Farber Cancer Institute. Boston. Massachusetts J a m e s C. Z i m r i n g , M . D . Ph.D. Pathology Resident, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University. Atlanta. Georgia

Montreal.

D a v i d H. W a l k e r , M.D. Professor and Chairman. Department of Pathology; Director, World Health Organization Center for Tropical Diseases. University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas Victor W . W e e d n , M . D , J.D. Principal Research Scientist and Director of Biotechnology and Health Initiatives, Carnegie Mellon University, Pittsburgh. Pennsylvania R u t h S. W e i n s t o c k , M . D , Ph.D. Professor of Medicine; Chief, Endocrinology. Diabetes and Metabolism; Medical Director. Joslin Diabetes Center. State University of New York Upstate Medical University; Chief. Endocrinology Veterans Affairs Medical Center, Syracuse, New York E d u a r d o D e l a f l o r W e i s s , M.D. Attending Pathologist and Director, Transfusion Service, Monmouth Medical Center, Long Branch, New Jersey

CAPTULO 33

A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CLULAS M A D R E

811

de la sangre perifrica tanto de pacientes como de donantes normales e incluso de placenta o sangre de cordn.

Clulas madre de sangre perifrica

El impulso para el desarrollo de tecnologas que permitieran la recogida de CMH de sangre pentrica fue su uso potencial para trasplante autlogo, en que el riesgo de contaminacin de la mdula con clulas tumorales es alto. Debido a la relativa facilidad de recogida de mdula sea por hemafresis, las clulas madre obtenidas de sangre perifrica se usan de forma creciente en el entorno alognico. Un rea de gran importancia puede ser la donacin de no familiares o voluntarios, en la que ms individuos pueden prestarse de forma voluntaria para los programas nacionales de donacin de mdula cuando la hemafresis se ofrece como opcin frente a la recogida tradicional de mdula sea. El procedimiento e instrumentacin utilizados para la recogida de clulas madre de sangre perifrica se describen el Capitulo 32. De forma clara, la mayor ventaja de las clulas madre obtenidas de sangre perifrica frente a la mdula sea es el tiempo de injerto de neutrfilos y plaquetas, con una media de 8 a 12 das para las clulas madre de sangre perifrica frente a las dos a cuatro semanas de la mdula sea (Gianm, 1989). Esta rpida recuperacin claramente reduce la morbimortalidad asociada por neutropenia/trombopenia graves, asi como los costes asociados a la estancia hospitalaria, soporte transfusional. tratamiento de complicaciones y dems. Se saba que las CMH estaban presentes en sangre perifrica tras la recuperacin de la quimioterapia (Richman. 1976). pero quedaba pendiente el desarrollo de sistemas de hemafresis que permitieran una recogida segura de un adecuado nmero de estas clulas para proporcionar el injerto al receptor tras la quimioterapia (Kessmger. 1988). En la mayor parte de pacientes para trasplante autlogo. se ha establecido actualmente la recogida de un gran volumen de afresis I14-201/ procedimiento) como un procedimiento eficaz para recoger un nmero adecuado de CMH en un razonable nmero de procedimientos para proporcionar una recuperacin hematopoytica adecuada. Las CMH son morfolgicamente indistinguibles de otras clulas mononucleares de la mdula sea o sangre perifrica, por lo que resulta esencial la recogida de un nmero adecuado de clulas para asegurar el injerto medular en el receptor. El objetivo tradicional para las recogidas de muestras de mdula sea persegua obtener un nmero suficiente de clulas nucleadas que permitiera asegurar un nmero mnimo de clulas madre. Los injertos de mdula sea pueden tambin ser evaluados para la actividad de clulas madre mediante el uso de tcnicas de unidades formadoras de colonias (UFCs) (Iscove. 1971). Una muestra de clulas mononucleares del injerto se cultiva en medio de metilcelulosa con suplementos de factores de crecimiento hematopoyticos y aminocidos esenciales durante 10 a 14 das. Al final de este periodo, se examinan las placas buscando el nmero y caractersticas de las CFU, incluyendo Unidades Formadoras de Colonias Eritroblsticas (BFU-E), Unidades Formadoras de Colonias Granulociticas (CFU-GM) y Unidades Formadoras de Colonias mixtas de granulocitos, eritrocitos, monocitos y megacanocitos (CFU-GEMM). Los grupos celulares que contienen ms de 50 clulas se valoran como una colonia. Las muestras con ms de 1 x 10 UFC por kg de peso del receptor se consideran adecuadas. A medida que la recogida de clulas madre evolucion hacia el uso de procedimientos de hemafresis de sangre perifrica, se hizo necesario desarrollar un mtodo que se
:

pudiera realizar en el mismo da y que determinara el nmero de muestras de hemafresis necesarias. El mtodo ms aceptado para valorar las muestras de clulas madre de sangre perifrica es la cuantificacin del nmero de clulas con antigeno CD34 por citometria de flujo. El antigeno CD34 se encuentra limitado a las clulas primitivas de todas las estirpes (Civin, 1989). La recogida de productos de hemafresis utilizando el recuento de clulas CD34como ndice de la eficacia del injerto se ha mantenido para el injerto hematopoytico (Berenson. 1991). La estandarizacin de la valoracin de las clulas CD34 y la disponibilidad de los anlisis de citometria de flujo han ocasionado que la medida de las clulas CD34+ se utilice por la mayor parte de los programas para determinar el nmero y adecuacin de las muestras de clulas madre de sangre perifrica (Sutherland, 1994). Generalmente, las muestras de clulas madre de sangre perifrica con mas de 3 x 10 clulas CD34+ por kg de peso corporal del receptor se consideraban adecuadas para conseguir el injerto de neutrfilos entre 8 y 10 das.
f

La recogida de CMH en el paciente no "movilizado' o donante requerira mltiples procedimientos de recogida y afresis, dado que el nmero de CMH en sangre perifrica se encuentra entre 1/10 y 1/100 del nmero de clulas en la mdula. En consecuencia, se requieren terapias de "movilizacin" para aumentar el numero de CMH circulantes y mejorar la eficiencia de la recogida por hemafresis. Richman (1976) descubri que mientras hay una cada en el nmero de clulas CD34+ circulantes despus de la quimioterapia, esto era seguido por un aumento entre 4 y 5 veces en el porcentaje de clulas CD34+ a medida que el recuento absoluto de neutrfilos comenzaba a recuperarse, a menudo entre 1 4 y 21 das despus de la terapia. Este aumento en clulas CD34+ circulantes es mayor con agentes quimioterpicos como citoxano y etopisida. Si la recogida por hemafresis se realiza en este periodo ventana, se pueden recuperar grandes nmeros de CMH con un limitado numero de procedimientos, incluso aunque el recuento total de leucocitos sea menor de 10.000'ul. Como el periodo de aumento de clulas CD34+ circulante es breve (dos a tres das), son crticos un estrecho control del recuento de leucocitos y clulas CD34+ circulantes del paciente, as como el control de los tiempos de recogida por hemafresis. Adems, algunos investigadores han sealado que la recogida de CMH en la fase de recuperacin tras quimioterapia reduce la probabilidad de contaminacin por clulas tumorales en el producto de afresis. El uso de factores de crecimiento hematopoytico como el Factor Estimulante de Colonias de Granulocito-Macrfago (GM-CSF) y el Factor Estimulante de Colonias de Granulocito (G-CSF) produce igualmente un aumento significativo en el nmero de clulas CD34+ en sangre perifrica (Siena, 1989). Dosis de 5 a 1 0 ug/kg de peso corporal durante 4 a 5 das causan un aumento de 5 a 10 veces en el nmero de CMH en sangre perifrica. El uso de G-CSF aislado ha probado ser ms eficiente que el cebado con quimioterapia para la recogida de clulas CD34*. L a combinacin de cebado con quimioterapia y el uso de factores de crecimiento (en especial G-CSF) provoca la mxima movilizacin de clulas madre pluripotenciales en sangre perifrica, as como la necesidad de menor nmero de procedimientos de hemafresis para recoger una dosis de CMH para trasplante, una estrategia empleada por la mayor parte de los programas de trasplante autognico. Se ha investigado el uso de G-CSF en el donante alognico sano para movilizar CMH y. salvo efectos leves como dolor seo y cefalea, resulta bien tolerado (Anderlmi. 1997). De forma creciente, los programas de trasplantes

Tabla 33-6 Comparacin de las tuentes y productos de clulas madre hematopoyticas. Lugar de recogida y complicaciones Sangre de cordn (CMSC) Tipo de donante Producto Lugar de recogida Complicacin principal Sangre de cordn umbilical Clula madre de sangre de cordn Cordn umbilical de placenta en el nacimiento Insuficiencia de clulas madre Autlogas (CMMO + CMSP) Paciente Mdula sea o CMSP Mdula intraoperatona o hemafresis Recurrencia de la enfermedad original Alognicas (CMMO + CMSP) Donante compatible familiar o no Mdula sea o CMSP Mdula intraoperatona o hemafresis Enfermedad injerto contra husped
cofdon

CMSP= clulas madre en sangre perifrica; CMMO= clulas madre en medula Osea; CMSC= c l u l a s madre en sangre d e

812

S E C C I N IV

H E M A T O L O G A , C O A G U L A C I N Y M E D I C I N A TRANSFUSIONAL

estn utilizando sangre perifrica como fuente de CMH en lugar de mdula sea, tanto para trasplantes alognicos como autognicos.

Sangre de cordn umbilical

Durante muchos aos, se saba que gran cantidad de unidades formadoras de colonias o clulas madre estaban presentes en la sangre del cordn umbilical, pero no fue hasta 1989 que se realizaron los primeros ensayos para utilizar clulas recuperadas de cordn umbilical de placenta para el trasplante hematopoytico (Gluckman. 1989). El xito aparente de muchos de estos trasplantes precoces de sangre de cordn ha dado lugar a la organizacin de diferentes bancos de clulas de cordn en EE.UU. y en Europa en un intento por proporcionar otra fuente de clulas madre para los pacientes que necesitan un trasplante alognico. Adems, como las clulas madre se obtienen de sangre del cordn, parece haber un mayor grado de tolerancia para algunos tipos de incompatibilidad HLA entre donante y receptor sin que aparezcan los grados 3 4 de la GVH. Como consecuencia, el trasplante podra estar disponible para algunos pacientes que de otra forma no tienen donante HLA compatible (Cairo, 1997). Las clulas madre de cordn umbilical se obtienen por canulacin de los vasos placentarios, con la placenta todava in tero o ms frecuentemente, despus del parto o por expresin directa de la sangre del cordn de la placenta despus del mismo. El nmero de CMH recuperadas es directamente proporcional al volumen de sangre de cordn recogido, lo que depende del tamao del nio/placenta y tambin de la experiencia del personal que recoge la muestra (Wagner. 1992). Volmenes entre 40 y 150 mi son frecuentes en centros con experiencia. Esto permitir obtener, aproximadamente, una muestra de 4 a 11 x 10 clulas nucleadas. Las muestras de volumen insuficiente (<40 mi) se suelen descartar. Generalmente, las muestras de sangre de cordn umbilical no se procesan para reducir el volumen, congelndose directamente en DMSO y almacenndose en nitrgeno lquido. Los trabajadores de banco con entrenamiento especfico no sufren distraccin por el cuidado de la madre y/o el nio en la sala de partos, y reducen el riesgo de contaminacin bacteriana de la sangre del cordn.
6

macin de rosetas para eliminar poblaciones celulares no deseadas, en especial las clulas T. En fecha reciente se han utilizado anticuerpos monoclonales dirigidos a un receptor especfico de clula junto con complemento o ligadas con inmunotoxmas como el ricino para producir una lisis de la poblacin de clulas tumorales contaminantes. Ademas, con la llegada de la tecnologa de esferas inmunomagnticas (immunomagnetic bead technology). los anticuerpos monoclonales se pueden ligar a una de estas esteras. El complejo anticuerpo-esfera-clula tumoral se elimina al pasar la suspensin celular por un campo magntico donde la poblacin de clulas n o deseadas quedar retenida y las CMH son eluidas y recogidas. Las tcnicas de seleccin positiva se dirigen a la presencia selectiva del marcador CD34 en las clulas madre hematopoyticas y la disponibilidad de anticuerpos monoclonales dirigidos al mismo. Mientras la tecnologa original utilizaba una columna a la que se ligaban anticuerpos monoclonales. en el momento actual se utilizan tcnicas de esferas inmunomagnticas. La fraccin de clulas mononucleares obtenidas bien de la mdula sea, bien por hemafresis de clulas madre, se incuba con el monoclonal anti-CD34 u otros monoclonales de inters. Se aade una suspensin de esferas inmunomagnticas marcadas con un segundo anticuerpo. Este ltimo se liga al monoclonal anti-CD34 creando un complejo esfera-clula diana marcado. Cuando la suspensin celular se somete a un campo magntico, el complejo clula CD34-esfera magntica quedar retenido y la suspensin de clulas mononucleares que contiene tanto clulas tumorales no deseadas como clulas T CD3+ ser desechada. Las clulas madre CD34+ son entonces liberadas de las esferas magnticas mediante un agente liberador y las esferas se eliminan mediante un nuevo campo magntico, dejando una suspensin celular que contiene aproximadamente un 90% d e clulas CD34-. La reduccin del numero total de clulas T CD3+ llega hasta una reduccin de 3.5 log,,. La mediana de recuperacin para las clulas CD34+ es de aproximadamente el 50% de la cantidad inicial de clulas CD34+ presentes en el producto obtenido por hemafresis. Aunque todavia est permitido el uso para la seleccin positiva de clulas CD34+. esta tecnologa tambin se encuentra bajo activa investigacin para aplicaciones de seleccin negativa.

Una cuidadosa seleccin de la historia mdica y pruebas a la madre son esenciales para asegurar la calidad del producto de sangre de cordn, asi como la ausencia de enfermedad gentica. Adems de las pruebas de laboratorio habituales para enfermedades de transmisin serolgica, se realizan ms pruebas para enfermedades bacterianas y vricas. Mientras el almacenamiento de la sangre de cordn umbilical resulta una alternativa para grados menores de histocompatibilidad y. en consecuencia, una oferta real para un mayor nmero de pacientes, presenta como limitacin la necesidad de aumentar el nmero de CMH adecuadas para receptores de mayor tamao, asi como la de optimizar los costes de inicio y mantenimiento de bancos de clulas de cordn.

Deplecin de clulas T
Las tcnicas para reducir el nmero de linfocitos CD3+ en los injertos hematopoyticos alognicos, generalmente de mdula, se han dirigido a reducir la incidencia y severidad de la reaccin del injerto contra el husped (GVH). Muchas de las tcnicas descritas para depurar clulas tumorales, como la seleccin positiva de clulas CD34+, han sido tambin aplicadas para la reduccin de clulas T en el injerto (Tabla 33-8). Otras tcnicas especficamente dirigidas a las clulas T han incluido aglutinacin con l e c t m a de soja, formacin de rosetas E. combinaciones de ambas y diluciones a contracorriente. La lectina de soja produce una aglutinina especifica frente al receptor CD2 del linfocito. Aadiendo un paso de formacin de rosetas con eritrocitos de oveja, se consiguen eliminar las clulas T restantes no aglutinadas por la lectina de soja Este mtodo produce una deplecin de clulas T de 2 a 3 log., (Reisner, 1982).

Depuracin
Una vez recogidas las clulas madre hematopoyticas. bien de mdula o de sangre perifrica, a menudo resulta ventajoso realizar un procesado ulterior de las CMH recogidas con el objeto de reducir una posible contaminacin por clulas tumorales o, en los trasplantes alognicos. reducir el nmero de clulas T CD3+. Se han realizado dos aproximaciones no excluyentes entre s. La primera desarrolla tcnicas que persiguen eliminar las clulas tumorales, tambin llamadas tcnicas de depuracin o seleccin negativa. La segunda utiliza mtodos para separar y recoger tan slo las clulas madre hematopoyticas CD34-. descartando la fraccin celular restante que. presumiblemente, contiene clulas tumorales contaminantes: estos mtodos se denominan habitualmente tcnicas de seleccin positiva (Tabla 33-7). Las tcnicas originales de depuracin empleaban una variedad de mtodos especficos e inespeclicos para eliminar la poblacin celular no deseada En aquella poca se utilizaban frmacos citotxicos como la 4-hidroxiperoxiciclofosfamida (4-HC) y etopisida (VP-16) para eliminar las clulas tumorales contaminantes (Yeager, 1986). Estos mtodos son los equivalentes in vitro de altas dosis de quimioterapia, por lo que el mayor efecto negativo es el dao a las CMH. Otras tcnicas incluyen el uso de lectinas y/o for-

Tabla 33-7 Mtodos de depuracin de clulas madre Seleccin positiva Seleccin de clulas CD34. Columnas en fase slida Esteras magnticas Seleccin negativa Farmacolgicos 4-hidroperoxiciclofosfamida (4-HC) Etopsido (VP-16) Inmunolgicos Clulas tumorales + AcMo + toxina" Clulas tumorales + AcMo + lase slida" T o x i n a = complemento ricino, oros '" Fase slida = esleras magnticas.

CAPTULO 33

A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CLULAS M A D R E

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Tabla 33-8 Mtodos de deplecin de linfocitos Leclinas Lectina de soja con formacin de rosetas E Centrifugado a contracorriente Inmunolgicos Anticuerpos + complemento Anticuerpos + lase slida Seleccin positiva

dios ms recientes tambin han demostrado un papel de las clulas asesinas naturales (NK) en la reaccin "injerto contra leucemia". Otros han empleado combinaciones de tcnicas como la seleccin de CD34+ y dilucin a contracorriente para crear dos poblaciones celulares, una rica en clulas CD34+ y otra rica clulas N K con deplecin de clulas T, aprovechando el hecho de que las clulas N K parecen tener efecto antitumoral pero no contribuyen a la GVH (Skiera, 1999).

Criopreservacin de injertos hematopoyticos

Los injertos de CMH de origen autognico y muchas muestras alognicas se criopreservan y almacenan antes de su uso. El protocolo ms frecuente utiliza DMSO al 10% como agente protector, congelacin a ritmo controlado y almacenamiento en nitrgeno liquido, tanto en fase liquida como vapor. El uso de DMSO proporciona una importante mejora en la viabilidad tras la descongelacin frente a agentes como el glicerol. Dado que existe una toxicidad asociada con la infusin de productos de clulas madre con DMSO, otros investigadores se han dirigido al uso de bajas concentraciones, adicin de hidroxietilalmidn u otros aditivos, pero el DMSO se sigue usando en la mayora de los programas. Al intentar lavar los productos despus de la descongelacin para reducir la cantidad de DMSO presente, se produjo una prdida significativa de clulas madre. Las estrategias se dirigen en ese momento a reducir el volumen del producto antes de su congelacin, reduciendo de esta forma la cantidad necesaria de DMSO.

La dilucin a contracorriente es un mtodo utilizado para la deplecin de clulas T que utiliza la separacin caracterstica de clulas en un campo de centrifugado, de acuerdo con el tamao y densidad de las diversas poblaciones celulares. Una de las ventajas del sistema es que no se aaden agentes quimioterpicos o anticuerpos a la poblacin de clulas madre hematopoyticas, por lo que no se deteriora su funcin celular. Los concentrados de capa leucoctica a partir de mdula sea se introducen en la centrfuga a diferentes velocidades de giro, permitiendo la recogida de fracciones celulares de diferentes tamaos y densidades. El sistema posee una alta eficiencia en la separacin de la fraccin rica en CFU-GM de la fraccin de linfocitos CD3+. Como no se provocan cambios en las clulas, la fraccin CD3+ puede ser cuantificada y parcialmente aadida de nuevo a la faccin CFU-GM para proporcionar una dosis controlada de clulas CD3+. si se desea clnicamente (Noga, 1990). La recuperacin celular es alta y. como los medios de dilucin son biocompatibles. los productos se pueden redifundir sin etapas de lavado adicional. La principal desventaja del procedimiento es el coste del equipo necesario y la necesidad de personal experimentado. La introduccin de tcnicas con esferas inmunomagnticas para la seleccin positiva de clulas CD34+ ha llevado al uso de estas tcnicas en el trasplante alognico para la deplecin resultante de clulas T CD3+, en especial de muestras obtenidas de clulas madre de sangre perifrica. La tecnologa con esferas inmunomagnticas se aplica con facilidad a las clulas madre obtenidas por hemafresis as como a los productos de mdula sea de gran volumen. Muchos centros han comunicado xitos con estos nuevos mtodos en la reduccin de clulas T CD3+ en trasplantes alognicos. en especial cuando donante y receptor no son totalmente HLA-compatibles (HensleeDowney, 1997). Otra ventaja adicional tanto de las tcnicas de depuracin como de seleccin positiva es que ambas producen un volumen significativamente inferior de clulas madre para congelacin, recuperacin y reinfusin al paciente. Esto reduce de forma importante la toxicidad asociada con la difusin de productos que contienen DMSO, al tiempo que reduce los costes derivados de la congelacin y almacenamiento para el laboratorio de clulas madre. En el momento actual, las tcnicas autorizadas para la depuracin y/o seleccin positiva para reducir la contaminacin por clulas tumorales son costosas, y se necesitan datos adicionales para valorar la eficacia clnica de estos procedimientos en la reduccin de clulas tumorales. Algunos centros han comunicado un mejor pronstico mediante el empleo de una combinacin de ambas, depuracin y tcnicas de seleccin positiva (Clarke, 1998). Las tcnicas de seleccin tanto positiva como negativa producen una prdida concomitante de hasta un 50% en el nmero original de clulas CD34+, tanto por toxicidad de diversos agentes (quimioterpicos, complemento), atrapamiento de complejos en esferas magnticas, o prdida durante etapas necesarias de lavado. Para solucionar este problema, el nmero de clulas CD34+ recogidas en la hemafresis inicial y en la extraccin de mdula sea debe aumentarse para contrarrestar la prdida posterior durante el procesado. Esto puede ser difcil de cumplir en pacientes que son difciles de "movilizar". La principal desventaja de la deplecin de clulas T es el aumento resultante en la incidencia de recidivas. Los pacientes con formas leves de GVH parecen tener una menor incidencia de recidiva que aquellos pacientes que no muestran GVH. La presencia de la poblacin de clulas T del donante parece ser crtica en la reaccin "injerto contra leucemia", en el reconocimiento de los antigenos del husped por las clulas del donante que genera una respuesta inmune que elimina las clulas tumorales de husped. Estu-

Reinfusin de productos de clulas madre

Independientemente de la fuente del injerto de clulas madre, las CMH se infunden al paciente de forma similar a la transfusin de cualquier producto sanguneo. Las clulas madre pluripotenciales. dotadas d e un receptor de membrana nico, se dirigirn al espacio medular, reinjertndose y replicndose. Los productos que han sido criopreservados con DMSO, en su mayor parte son descongelados e inmediatamente remfundidos sin lavar. Las CMH recogidas por hemafresis sin procesado ulterior pueden contener gran cantidad de eritrocitos. La criopreservacin con DMSO no conserva la integridad de la membrana del glbulo rojo, por lo que estos productos contienen una gran cantidad de hemoglobina libre cuando se recuperan. Las reacciones en el receptor oscilan desde leves caracterizadas por nusea, escalofros o cefalea, hasta reacciones ms graves, que pueden incluir hipotensin, sepsis, insuficiencia renal o incluso parada cardaca (Stroncek, 1991). Estas reacciones se muestran en la Tabla 33-9. Los receptores de clulas madre criopreservadas generalmente reciben premedicacin con antihistaminicos y/o antiemticos. Tambin la hidratacin y el uso de diurticos estn indicados para reducir los efectos secundarios producidos por la administracin de hemoglobina libre y el volumen de lquido infundido.

Tabla 33-9 Reacciones adversas observadas en pacientes transfundidos con productos de clulas madre criopreservadas Frecuentes Escalofros Nuseas Vmitos Fiebre Cefalea Disnea Inlrecucntes Insuficiencia renal Parada cardiaca Hipotensin Sepsis Factores asociados Volumen de tejido reinfundido Tipo y cantidad de crioprotector reinlundido Volumen de eritrocitos incompatibles (productos alognicos) Contaminacin bacteriana

814 BIBLIOGRAFA

SECCIN IV

HEMATOLOGA, COAGULACIN Y MEDICINA TRANSFUSIONAL

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S E C C I N

Inmunologa e inmunopatologa
Richard A. McPherson, M.D. John Bernard Henry, M.D.

C A P T U L O

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" Visin general del sistema inmune y de los trastornos nmunolgicos

RICHARD A. MCPHERSON, M.D. CLULAS LINFOIDES Linfocitos T Linfocitos B Clulas presentadoras de antgeno Clulas NK CLULAS NO LINFOIDES Neutrfilos y eosinfilos Basfilos y mastocitos FACTORES HUMORALES Inmunoglobulinas Complemento Citocmas 819 819 817 ANTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MECANISMOS DE DAO INMUNOLGICO APLICACIONES CLNICAS DEL ANLISIS INMUNOLGICO BIBLIOGRAFA 820 820 820 820

El sistema inmunolgico est estructurado para reconocer, responder y destruir a una amplia variedad de organismos invasores como las bacterias, virus, hongos y parsitos, que de otro modo, seran capaces de promover infecciones dainas para el cuerpo. El descubrimiento de los componentes del sistema inmune a menudo ha venido del estudio de infecciones serias y de las reacciones especficas que emplea el cuerpo para combatir los organismos patgenos. En general, esta funcin inmunolgica se puede resumir como la bsqueda de antigenos extraos que no pertenecen al cuerpo y su destruccin. En este proceso, el sistema inmune mantiene una vigilancia de la aparicin de antgenos nuevos extraos en clulas tumorales y trata de destruirlas dejando ilesos los antgenos normales presentes en clulas sanas. Los estados de enfermedad pueden surgir debido a que diversos aspectos de la funcin inmunolgica se vean afectados. stos incluyen reacciones de hipersensibilidad, varias inmunodeficiencias, trasplantes alognicos de rganos o tejidos, la enfermedad de injerto contra husped: la bsqueda de la tolerancia en los trasplantes contina. Este capitulo resalta los componentes del sistema inmune y sus funciones y algunas de las afecciones clnicas de la inmunidad mas significativas.

Linfocitos T
Los linfocitos T se diferencian en el timo. Tras su origen en la mdula sea, pasan de la corteza a la mdula timica y durante este proceso sufren la maduracin. Este proceso implica una seleccin, de modo que las clulas que reaccionan con antgenos propios se eliminarn, mientras que s e retienen otras clulas capaces de reconocer antgenos mediante interacciones con molculas del complejo de histocompatibilidad (MHC) (von Boehmer, 1994; Nossal. 1994). Los linfocitos T constituyen entre un 60% y un 70% de todos los linfocitos en la sangre, y se encuentran tambin en zonas paracorticales de ganglios linfticos y dentro de las vainas periartenolares del bazo. Durante su maduracin, sufren una programacin gentica, en la cual el gen para el receptor de antgeno de la clula T (TCR) se reordena para dar receptores proteicos que son invariantes en su especificidad antignica, durante toda la vida de ese linfocito y de sus clulas descendientes. La mayora (>95%) de los linfocitos T tienen receptores de antgeno compuestos por subunidades u y |5 unidas por puentes disulluro, formando un heterodmero que se encuentra en la membrana exterior asociado al complejo molecular CD3 (CD3 es un marcador para clulas T). Las subunidades proteicas </. y \i del TCR poseen regiones variables, de unin y constantes (la cadena a tambin contiene una regin de diversidad), con sus correspondientes secuencias en el gen del TCR, el cual sufre un reordenamiento que produce una elevada especificidad en la unin de un determinado antgeno. Las protenas CD3 asisten en la Iransduccin de la seal al interior de la clula cuando un antgeno se une al TCR en la superficie linfocitana (Janeway. 1994; Weiss. 1994). Un pequeo porcentaje de linfocitos T presentan un TCR compuesto por subunidades y y que interaccionan de forma similar con CD3: estas clulas se encuentran generalmente en la superficie de mucosas de los tractos grastrointestinal y respiratorio. Las proliferaciones de clulas T se pueden dividir en neoplsicas (clnales) o benignas (policlonales). segn su ADN muestre de forma predominante una sola forma de reordenamiento

CLULAS LINFOIDES
Las clulas linfoides del cuerpo incluyen las clulas de los ganglios linfticos, bazo, clulas de las superficies mucosas y clulas circulantes de la sangre. Derivan de clulas madre hematopoyticas multipotentes. que se producen progresivamente desde el saco vitelino en el embrin, al hgado en el feto, y la mdula sea en el nio y durante las fases adultas (Weissman, 1994). Las diferentes clulas linfoides se identifican por la presencia de marcadores proteicos nicos presentes en su superficie y que permiten a esas clulas desempear determinadas funciones.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

gnico de su TCR, o un espectro completo de estos reordenamientos, tal y como ocurre normalmente en una poblacin linfocitaria heterognea. El anlisis de linfocitos T mediante citometria de flujo emplea una variedad de marcadores de superficie. El CD4 se encuentra en un 60% de clulas CD3-; estos son linfocitos T cooperadores/inductores que dirigen la funcin de otras clulas del sistema inmune secretando citocinas que estimulan varias funciones. Existen dos subpoblaciones de clulas CD4+: T 1, que secreta interleucma 2 (IL-2) e interfern-y (IFN-y); y T2. que secreta IL-4 e IL-5. Las clulas T1 facilitan las actividades de los macrfagos como la hipersensibilidad y la produccin de anticuerpos con accin opsonizante; las clulas T,,2 dirigen la sntesis de otros anticuerpos: El marcador CD8 se encuentra en un 30% dlas clulas T (asi, la relacin de clulas CD4 y CD8 en sangre es tpicamente 2:1). Estas clulas T CD8+ presentan actividad citotxica y supresora en la respuesta inmune.
H

clulas B se produce tanto en la mdula sea, donde tiene lugar una seleccin negativa y positiva, como en localizaciones perifricas. La estimulacin antignica de las clulas B desencadena la formacin de clulas plasmticas que secretan inmunoglobulinas como base de la especificidad en la inmunidad humoral. El complejo receptor de antigeno de la clula B utiliza la inmunoglobulina M (IgM) como componente de unin al antgeno. La especificidad antignica de las inmunoglobulinas deriva del proceso de reordenamiento, en el que tanto la cadena pesada como la ligera se reestructuran. La cadena pesada se divide en regin variable, de diversidad, de unin y constante, mientras que el gen de la cadena ligera tiene regiones variables, de unin y constantes. La maduracin de la respuesta mediada por anticuerpos implica el cambio de IgM a otra cadena pesada (normalmente IgG) debido a otro reordenamiento gnico, aunque el tipo de cadena ligera de una clula B permanece fijado. Las clulas B tambin presentan en su superficie receptores para el complemento (CD21. que es tambin el receptor para el virus de Epstein-Barr [EBV] y hace que estas clulas sean susceptibles de una infeccin por EBV) y para la regin Fe de las inmunoglobulinas: tambin presentan COI9 y CD20. que se usan a menudo para la identificacin inmunolgica de las clulas B.

El mecanismo de reconocimiento antignico es diferente entre los dos subtipos de linfocitos T. Las molculas CD4 se unen a las molculas de MHC de clase II presentes en las clulas presentadoras de antigeno, mientras que las molculas de CD8 interaccionan con molculas de MHC de clase I. De acuerdo con esto, las clulas CD4+ reconocen antigenos slo en el contexto de MHC de clase II, y las clulas CD8+ los reconocen slo a travs de MHC de clase I.

Clulas presentadoras de antgeno Linfocitos B

Los linfocitos B constituyen aproximadamente entre un 10% y un 20% de los linfocitos perifricos en sangre, y adems se pueden encontrar en la mdula sea, ganglios linfticos, bazo y otros tejidos linfticos. En el bazo y ganglios se agregan para formar los folculos Imfoides. La diferenciacin de Los macrfagos funcionan como fagocitos mononucleares en procesos de inflamacin, y tambin procesan los antgenos ingeridos y los presentan asociados a molculas de MHC en su superficie (Fig. 34-1). Las clulas T no se activan con antgenos solubles y. por tanto, la presentacin de antgenos de este modo es necesaria para la estimulacin de clulas T y la induccin de la

Figura 34-1. Interacciones celulares del sistema inmune. Las clulas presentadoras de antigeno (APC) procesan antigenos (Ag) extemos o miemos y presentan los fragmentos peptdicos del antgeno, asociados a una molcula de MHC, a las clulas T . En la clula T, un TCR especfico, junto con el correceptor CD4 o CD8. reconoce el complejo antigeno-MHC. La activacin celular tiene lugar a travs del complejo CD3 y la activacin de tirosin-cmasas (TK). El receptor de la clula B est compuesto por una molcula de Ig unida a la m e m b r a n a que se encuentra formando un complejo con otras protenas de membrana, y el correceptor CD19/21. Cuando se produce el reconocimiento antignico. las T K celulares tambin se activan. La activacin coeslimuladora de clulas T o B la proporcionan los receptores celulares al unirse a sus ligandos (los ligandos B7 o B7.2 para la coestimulacin de la clula T a travs de las molculas CD28 y CTLA-4. y el ligando gp39 para la molcula CD40 de la clula B). (Adaptado de Paul W, Seder R: Lymphocytic responses and cytokines. Cell 1994; 76:229; y Weiss A. L i t t m a n D: Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 1994; 76:263, con permiso).

CAPTULO 34

VISIN GENERAL DEL SISTEMA INMUNE Y DE LOS TRASTORNOS I N M U N O L G I C O S

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inmunidad celular (Germain, 1994). Los macrfagos tambin secretan citocinas como la IL-1 para modular los procesos inflamatorios, y pueden lisar directamente clulas tumorales en su papel de inmunovigilancia. y adems, son tambin clulas efectoras en algunos tipos de inmunidad celular (por ej. la hipersensibilidad retardada). Las clulas dendriticas (que se encuentran en tejidos linfoides y regiones intersticiales de otros rganos) y las clulas de Langerhans (presentes en la epidermis) poseen numerosas extensiones citoplasmticas enriquecidas en molculas de MHC de clase II. Por tanto, son muy eficientes en la presentacin antignica (aunque probablemente no sean fagocrticas) y se consideran muy importantes para esta funcin en todo el sistema inmune.

Clulas NK
Las clulas N K (linlocitos citoliticos naturales) constituyen un 10%-15% de los linfocitos en sangre perifrica. No son clulas T ni B y anteriormente se las llam a b a clulas nulas. Las clulas N K tienen la funcin de lisar otras clulas sin necesidad de una previa sensibilizacin. Pueden atacar clulas tumorales. infectas con virus y otras; por tanto, forman la defensa inicial frente a clulas aberrantes. Las clulas N K se caracterizan por los marcadores de superficie CD16 y CD56, los cuales se emplean habitualmente para su identificacin. CD16 es el receptor para la regin Fe de la IgG y por tanto las clulas N K son capaces de lisar selectivamente aquellas clulas que se encuentran recubiertas de anticuerpos (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos [ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity], importante en algunas reacciones de hipersensibilidad). Las clulas N K tambin secretan cilocinas como el IFN-y. Curiosamente, las clulas N K se pueden reconocer en una preparacin de un frotis de sangre tenido, c o m o linfocitos grandes y granulosos.

linas en sangre son la IgM, IgG y la IgA: estos anticuerpos provienen de la exposicin continuada a multitud de antgenos extraos y pueden permanecer durante aos mediante una secrecin continuada para sustituir a aquellas molculas que se pierden mediante la limpieza normal de protenas circulantes. En las superficies mucosas, el principal tipo de anticuerpo es la IgA en una forma dimrica especial que resulta de su secrecin a ese lugar (vase Captulo 37). Las otras inmunoglobulinas son la IgD (que reside en la superficie de clulas B donde puede estar involucrada en la transduccin de la seal inmunolgica. pero no adquiere concentraciones importantes como molculas libres en la sangre) y la IgE (que funciona a travs de su unin a la superficie de basfilos y estimula la secrecin de sustancias vasoactivas de esas clulas en presencia de alrgenos especficos). Las inmunoglobulinas de la sangre funcionan unindose a los antigenos invasores en la superficie de clulas extraas, bacterias, virus, etc. y facilitando su destruccin mediante efectores inespecficos como el complemento y las clulas NK. La monitonzacin de enfermedades mediante el anlisis de inmunoglobulinas incluye un anlisis cualitativo para la deteccin clonal frente a la policlonal (p. ej., para el diagnstico de mieloma mltiple) y anlisis cuantitativo tanto para concentraciones totales de IgM, IgG e IgA (para detectar posibles deficiencias selectivas o combinadas o la sobreproduccin de tipos de inmunoglobulinas) y para ttulos de anticuerpos especficos frente a antigenos individuales (como las isohemaglutininas, neumococos, Haemophilus. ttano, difteria u otros microorganismos)

Complemento
Este conjunto de protenas que interaccionan entre si tiene el papel de destruir enzimticamente las dianas (p. ej.. clulas, bacterias) a las que les dirigen los anticuerpos u otros medios (vase Captulo 38). La medida de los componentes del complemento tiene dos utilidades fundamentales en el diagnstico clnico: detectar deficiencias congnitas (que son relativamente infrecuentes) que pueden suponer una predisposicin a ciertas enfermedades como infecciones o la progresin hacia enfermedades autoinmunes) y para detectar reducciones adquiridas que reflejan una actividad en el momento de anlisis de una enfermedad autoinmune sistmica como puede ser el lupus eritematoso sistmico.

CLULAS NO LINFOIDES
Estas clulas no estn programadas genticamente para reconocer antgenos especficos o interaccionar con clulas linfoides en la induccin de una respuesta inmune. En su lugar, son electores de reacciones inmunes desencadenadas por diversos factores.

Neutrfilos y eosinfilos
Los neutrfilos llegan a las regiones de inflamacin por la accin de quimioatrayentes; entonces vierten sustancias txicas y enzimas de sus granulos que digieren indiscriminadamente estructuras celulares; los neutrfilos tambin ingieren restos celulares al igual que los eosinfilos. retirndolos de los tejidos.

Citocinas
Estas sustancias solubles son el medio por el que se regulan las respuestas inmunes celulares; son mediadores que actan a corto plazo y que son elaborados por algunas clulas y difunden a otras clulas donde actan (Paul, 1994). Muchas citocinas son pleiotrpicas en el sentido de que pueden aduar sobre muchos tipos celulares diferentes. Pueden actuar de forma endocrina estimulando clulas a una cierta distancia; pueden actuar sobre clulas que se encuentran en el espacio inmediato (estimulacin paracrina); tambin pueden estimular a las propias clulas que las han secretado (autocrina). Las acciones especficas de las citocinas incluyen la hematopoyesis mediante los factores estimulantes de colonias (CSFs) que inducen la produccin de granulocitos y macrfagos. respuestas de inmunidad natural (mediante IL-1. factor de necrosis tumoral-i/ [TNF-u], interferones e IL-8), estimulacin de la multiplicacin y activacin de linfocitos (mediante IL-2 y otros), y la activacin inespecifica de clulas inflamatorias (vase Captulo 39). Todava se estn descubriendo nuevas citocinas a medida que van apareciendo ms detalles sobre la comunicacin clulaclula. El uso clnico de las citocinas incluye tanto la supresin de la respuesta inmune en el trasplante de rganos alognico mediante frmacos como la ciclosponna que inhibe la produccin de IL-2, y la estimulacin de la respuesta inmune en terapias frente al cncer o a infecciones. Estos ltimos tratamientos son en su mayora experimentales, aunque trabajos recientes han demostrado que el pretratamiento con anticuerpos frente al TNF-u puede prevenir las reacciones de Jarisch-Herxheimer que resultan del tratamiento con antibiticos de infecciones de Borrelia recurrentis en ovejas (Fekade. 1996). Este modelo probablemente presagia un conjunto de nuevas terapias mediante las cuales las respuestas inmunes se estimularn o inhibirn selectivamente de acuerdo con las necesidades clnicas concretas.

Basfilos y mastocitos
Los basfilos (y su equivalente en los tejidos, los mastocitos) presentan en su superficie receptores que se unen a IgE. La unin de IgE en la membrana de los basfilos no es especfica del antgeno que reconoce la IgE. sino que es el resultado de la suma de la accin de la cantidad total de IgE y los basfilos disponibles. Cuando el antgeno (o alrgeno) entra en contacto con su IgE especifica presente en la superficie del basfilo. la clula se activa y secreta sustancias como las histaminas que median algunas hipersensibilidades. Asi, la especificidad de un basfilo est dirigida por la IgE que tiene unida a su superficie desde la sangre; tericamente, un basfilo podra tener mltiples molculas de IgE diferentes en su superficie y podra, por tanto, reaccionar con muchos alrgenos diferentes.

FACTORES HUMORALES Inmunoglobulinas

Las molculas de anticuerpo pueden estar unidas a la superficie de clulas B para estimular la secrecin de ms inmunoglobulinas: tambin pueden circular por la sangre y aparecer en las superficies mucosas de los tractos respiratorio y gastrointestinal, donde es probable que entren en contacto con microorganismos patognicos. Las principales inmunoglobu-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

ANTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
El MHC (tambin denominado complejo antignico leucocitario humano. HLA) se encuentra codificado en el cromosoma 6 e incluye molculas de la Clase I (HLA A, B y C). molculas de la Clase II (HLA DP. DQ. y DR) y las molculas de la Clase III que incluyen algunos componentes del sitema del complemento y el TNF-u y TNF-|i (vase Captulo 40). Las funciones de los antigenos de las clases I y II ya se han analizado brevemente en cuanto a su participacin en la presentacin antignica a clulas T. Estos antgenos fueron descubiertos y su naturaleza altamente polimrfica fue descrita en esludios de tolerancia inmunolgica y en el rechazo de trasplantes de rganos alognicos. En consecuencia, una de las utilidades clnicas ms importantes del tipo HLA reside en el emparejamiento de donantes potenciales de rganos o tejidos con receptores que necesitan dicho trasplante. Otra aplicacin clnica significtiva es el tipo de pacientes afectados y de miembros de sus familias para establecer el riesgo de desarrollar algunas enfermededades que se encuentran asociadas a tipos de HLA concretos (p. ej., la espondilitis anquilosante con HLA B27) (vase Captulo 41). Otra aplicacin ms del tipo HLA es el suministro de plaquetas compatibles a pacientes que se han hecho refractarios a las transfusiones de plaquetas debido a la formacin de anticuerpos anti-HLA tras ser expuestos a mltiples donantes (p. ej., tras las transfusiones de apoyo empleadas en los casos de quimioterapia o trasplantes de clulas progenituras hematopoyticas (HPC) (vase Captulo 31).

te a virus, hongos, protozoos, parsitos y tambin microbios intracelulares como mycobacterias. Los pacientes con el sndrome de la mmunodeficiencia adquirida (sida) son susceptibles a infecciones por estos y otros agentes oportunistas cuando pierden sus clulas T CD4+.

APLICACIONES CLNICAS DEL ANLISIS INMUNOLGICO

Las principales reas de aplicacin clnica de los ensayos inmunolgicos son las enfermedades autoinmunes, el trasplante de rganos/tejidos y su rechazo, las inmunodeficiencias y las alergias La enfermedad autoinmune puede ser sistmica (vase Capitulo 43), estar restringida a rganos especficos (vase Captulo 45) o puede implicar vasculitis (vase Captulo 44). Muchos de los ensayos se basan en tcnicas que emplean anticuerpos antinucleares seguido de un ensayo confirmatorio con autoantigenos especficos como puede ser el ADN de doble hebra. Otros autoanticuerpos se pueden identificar mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta que emplean secciones de rganos para identificar autoanticuerpos especficos como aquellos que se dirigen frente al msculo liso, mitocondnas. clulas parietales y dems. Los avances tecnolgicos han proporcionado fuentes purificadas de muchos autoantgenos importantes que formarn parte de ensayos futuros para autoanticuerpos ms especficos y que permitan una automatizacin ms eficaz. La terapia inmunosupresora para el rechazo de trasplantes alognicos y las mmunodeficiencias se basan en la bsqueda de subpoblaciones linfocitarias con una particular importancia de las clulas T y de las CD4+. Ademas, los estados de inmunodeficiencia congnita requieren un anlisis ms detallado de los elementos celulares y humorales del sistema inmune, comenzando generalmente con una batera de ensayos convencionales para analizar la presencia y (uncin de linfocitos. inmunoglobulinas y complemento, y pasando, cuando es necesario, a ensayos muy esotricos en la bsqueda de desrdenes menos frecuentes (vanse Captulos 36 y 42).

MECANISMOS DE DAO INMUNOLGICO

Las respuestas inmunologas pueden daar tejidos normales adems de los organismos invasores que han desencadenado una respuesta. Estas respuestas se clasifican en cuatro tipos de hipersensibilidad. El tipo I es de naturaleza anafilctica o alrgica: est mediada por la IgE unida a la superficie de basfilos y mastocitos. Cuando antgenos especficos (o alrgenos) se unen a la IgE de superficie, los basfilos se estimulan y liberan la histamina y otras Los trastornos alrgicos se evalan tpicamente a travs de ensayos en la sustancias vasoactivas que son los mediadores inmediatos de las reacciones piel, medida de la concentracin total de IgE en suero, y la cuantificaaon d e alrgicas. Estrategias clnicas para el tratamiento de asma y alergias han la reactividad especfica de la IgE en suero con alrgenos comunes de la empleado distintos aspectos de la secuencia de eventos, desde contrarrestar comida, el polen y otros factores ambientales (vase Capitulo 46). los efectos de la histamina hasta la desensibilizacin. Un estudio reciente A medida que surjan nuevos descubrimientos sobre las funciones inmunoemple con xito un anticuerpo monoclonal humanizado frente a la IgE para lgicas y aparezcan nuevas terapias, los laboratorios de diagnstico clnico el tratamiento de estos individuos (Milgrom, 1999): esta terapia podra, en el probablemente tengan la oportunidad de ofrecer medidas de muchos mas futuro, basarse en parte sobre las medidas de la concentracin de IgE en factores y actividades, para establecer diagnsticos correctos y monitorizar y suero. ajustar los tratamientos. El tipo II ocurre cuando los anticuerpos se unen a antgenos presentes en la superficie celular; el dao puede ocurrir mediante la unin y activacin del complemento (p. ej., hemolisis inmune), mediante la citotoxicdad BIBLIOGRAFA celular dependiente de anticuerpos (p. ej.. la lisis de clulas tumorales o de parsitos) o interferencia con funciones celulares por parte de los antiFekade D. K n o x K. Hussein K, et al: Prevention ol Jansch-Herxheimer reactions Dy treatment with antibodies against t u m o r necrosis lactor c. N Engl J M e d 1996: cuerpos (p. ej., autoanticuerpos frente a los receptores de acetilcolina en la 335:311. miastenia gravis). Germain R: MHC-dependent antigen processing and peptide presentation ProviEl tipo III resulta de la formacin de inmunocomplejos, entre antgenos exding ligands for T lymphocyte activation. Cell 1994. 76:287. J a n e w a y C. Bottomly K: Signis and signs for lymphocytic responses. Cell 1994: genos como bacterias o virus y anticuerpos; o entre autoantgenos endge76:275. nos y autoanticuerpos. El dao tisular tpico ocurre en rganos que contienen Milgrom H. F i c k RB. Su JO, et al. Treatment of allergic a s t h m a with monoclonal antinumerosos vasos sanguneos pequeos donde los inmunocomplejos circuIgE antibody N Engl J M e d 1999. 341:1966 lantes se depositan o en lugares donde se producen de forma natural los anti- Nossal G: Negative selection of lymphocytes Cell 1994; 76:229 Paul W, Seder R. Lymphocyte responses and cytokines. Cell 1994; 76:241 genos endgenos. von B o e h m e r H: Positive selection of lymphocytes Cell 1994: 76:219. El tipo IV est mediado por clulas, tambin se denomina hipersensibilidad Weiss A. Littman D: Signal Iransduction by lymphocyte anligen receptors. Cell 1 9 9 4 ; retardada, y depende del funcionamiento de las clulas T CD4+ o de la cito76:263. toxicidad de clulas T CD8+. El tipo IV es la base de la reaccin inmune frenWeissman I: Developmental switches in the i m m u n es y s t e m Cell 1994; 76:207.

CAPTULO

35

Inmunoensayos e inmunoqumica
Yoshihiro Ashihara, Ph.D. Yasushi Kasahara, Ph.D., D.M.Sc. Robert M. Nakamura, M.D.
INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA Caractersticas generales de la reaccin antgeno-anticuerpo Caractersticas de los antgenos Caractersticas de los anticuerpos Cintica de la reaccin antigeno-anticuerpo VISIN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS Tipos de inmunoensayos Qumica de conjugacin Caractersticas de la fase slida INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMTRICOS Origen y principios de la reaccin de precipitina INMUNOENSAYOS DE PARTCULAS Principio de aglutinacin de partculas Resumen RADIOINMUNOENSAYO Origen Principios y mtodos del ensayo Resumen INMUNOENSAYO ENZIMTICO Origen y clasificacin Inmunoensayos enzimticos heterogneos Inmunoensayos enzimticos homogneos Resumen INMUNOENSAYO FLUORESCENTE Origen y clasificacin Inmunoensayo fluorescente heterogneo Mtodo fluoroinmunomthco 839 833 830 825 824 823 821 Ensayo inmunofluoromtrico por particin radial Fluoroinmunoensayo en tiempo real Inmunoensayo fluorescente homogneo Ensayo de polarizacin de la fluorescencia Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia de excitacin Inmunoensayo de fluorescencia protegida INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE Origen Inmunoensayo quimioluminiscente usando esteres de acridinio como marcadores Inmunoensayo electroquimioluminiscente AUTOMATIZACIN INSTRUMENTAL Y MODULACIN DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO Sistemas de ensayo homogneos Sistemas de inmunoensayo heterogneos Secuencia prctica del inmunoensayo en el sistema analtico Instrumentacin y puntos clave para un inmunoensayo heterogneo Nuevos sistemas para la prxima generacin (sistemas modulares) SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RPIDOS PARA SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIN AL PACIENTE 845 Origen Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de ensayo por inmunofiltracin) Tiras reactivas Instrumentos inmunocromatogrficos Resumen BIBLIOGRAFA 848 842 841

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA Caractersticas generales de la reaccin antgeno-anticuerpo

Los ligandos inmunolgicos se basan en la afinidad entre molculas, como la enzima y el sustrato, la hormona y su receptor, el antgeno y el anticuerpo, y juegan un papel importante en los seres vivos. Las caractersticas de reconocimiento especfico de los inmunoensayos (reacciones antgeno-anticuerpo) han pasado a ser ampliamente utilizadas c o m o herramientas analticas, a pesar de la amplia gama de mtodos disponibles para el anlisis clinico en un laboratorio.

Los inmunoensayos se pueden utilizar para la deteccin tanto de antigeno como de anticuerpos. Para la deleccin de antigenos, el anticuerpo especfico correspondiente debe prepararse como uno de los reactivos. Lo contrario se aplica para la deteccin de anticuerpos. La sensibilidad de los inmunoensayos se ha mejorado mediante el desarrollo de nuevos tipos de sistemas para la deteccin de la seal y la tecnologa de fase slida. Los inmunoensayos se han optimizado para detectar menos de 0,1 pg.'ml de antgeno presente en la sangre. Se pueden aplicar a la deteccin de haptenos como molculas pequeas: protenas y complejos proteicos como las macromolculas: y tambin para cualquiera de los anticuerpos frente a alrgenos, agentes infecciosos y antigenos autlogos.

822

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGIA

Caractersticas de los antigenos

Los antgenos se pueden definir como cualquier sustancia que puede representar sitios antignicos (eptopos) para producir los correspondientes anticuerpos, desde molculas pequeas como los haptenos y hormonas, hasta macromolculas como protenas, glcoprotenas, glicolipidos y otros productos naturales. Algunos compuestos qumicos artificiales tambin pueden ser antgenos actuando como haptenos. Los antgenos deben tener al menos un epitopo. Los epitopos que pueden ser reconocidos por anticuerpos incluyen secuencias de aminocidos de peptidos presentes en protenas y estructuras proteicas de grandes dimensiones como los sitios neoantigenicos.

2. La produccin de anticuerpos monoclonales puede producir una cantidad ilimitada de reactivo homogneo con una afinidad y especificidad m u y constante. 3. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante la inmunizacin con un antgeno sin purificar. Los anticuerpos monoclonales presentan ciertas limitaciones para su uso. que son las siguientes: 1. Reactividad insuficiente para la precipitacin o aglutinacin debido a que la formacin del entramado del inmunocomplejo es dbil o no ocurre cuando se emplean anticuerpos monoclonales. 2. Los antigenos con mltiples eptopos heterogneos son ms difciles de caracterizar inmunoqumicamente con un solo anticuerpo monoclonal.

Caractersticas de los anticuerpos

La inmunoglobulma. una protena plasmtica importante, se refiere a anticuerpos en el contexto de funciones biolgicas de inmunoglobulmas especficas de antgeno. Los anticuerpos, por tanto, se producen en respuesta a estimulaciones antignicas. Los anticuerpos se componen de molculas funcionales y heterogneas que unen antgenos mediante un dominio de unin al antigeno. Hay cinco tipos (isotipos) de inmunoglobulina: IgG, IgM. IgA. IgD e IgE. La IgG a su vez se divide en cuatro subtipos, y tanto la IgA como la IgM presentan dos subgrupos. Todas las molculas de anticuerpo conocidas presentan una cadena pesada con una cadena ligera K- O /.. La estructura molecular de los anticuerpos se compone de regiones constantes y regiones variables. El dominio hipervarable (sitio de unin al epitopo) puede ensamblarse para interaccionar con una amplia variedad de eptopos (determinantes antignicos). En un laboratorio de medicina se pueden distinguir dos categoras de anticuerpos: anticuerpos como reactivos o anticuerpos como analitos. Los anticuerpos como analitos a menudo se clasifican por los subtipos IgG. IgM o IgA. Los anticuerpos como reactivos se preparan a partir de antisueros obtenidos a travs de la inmunizacin con un antgeno purificado.

Produccin de anticuerpos mediante tecnologa recombinante

Skerra y cois. (1998) han desarrollado un sistema de expresin para el fragmento F de los dominios variables de un anticuerpo especifico para la tosforilcolina empleando tecnologa recombinante en Escherichia col. Esta tcnica hace posible producir un anticuerpo quimrico fusionado con una enzima. Ha aparecido una tcnica lamada phage display (una traduccin podra ser muestra de fagos) para la produccin de anticuerpos (Wmter. 1994). En este mtodo fragmentos de anticuerpo de una especificidad de unin previamente determinada se construyen de un repertorio de genes V de anticuerpo, eliminando asi la necesidad de inmunizacin y generacin de hibridomas. Los genes V se pueden ensamblar in vilro. El fago seleccionado del repertorio por unin al antgeno y los fragmentos de anticuerpo se expresa en bacterias infectadas Adems, la afinidad de la unin de los anticuerpos se mejora mediante mutacin. En un futuro prximo esta tcnica permitir el uso de anticuerpos especficos de alia avidez.
v

Anticuerpos

policlonales Cintica de la reaccin antigeno-anticuerpo

Determinados aspectos del equilibrio o de la ley de accin de masas de la qumica se pueden aplicar a la reaccin antgeno-anticuerpo. La cintica de una reaccin Ag-Ab reversible es la siguiente (Steward. 1986): K Ag + Ab AgAb K
2

Un anticuerpo policlonal se puede obtener mediante la inmunizacin con un antgeno, que presenta varios eptopos. En otras palabras, se generan anticuerpos especficos frente a cada epitopo. La avidez de un anticuerpo policlonal por un antgeno complejo generalmente es mayor que la de un simple anticuerpo monoclonal. Para la inmunizacin con molculas relativamente pequeas, como los haptenos o las hormonas, pueden ser necesarias protenas transportadoras o carner.

Anticuerpos

monoclonales
Donde Ag representa el antigeno libre, Ab representa los sitios de anticuerpo libres. AgAb representa la concentracin del complejo antigeno-anticuerpo, y K' y K son las constantes de asociacin y disociacin, respectivamente. El ritmo de formacin del complejo antigeno-anlicuerpo se representa de la siguiente forma: K'|Ag][Ab]-K^[AgAb|

Los anticuerpos monoclonales (Kehler. 1975) se han desarrollado empleando las siguientes biotecnologas: fusin somtica de clulas, seleccin del hibridoma resultante y dilucin lmite para obtener monoclonales. Se definen c o m o anticuerpos homogneos uniformes dirigidos a epitopos especficos. Una linea celular establecida permite la secrecin de todas las inmunoglobulinas especificas que reaccionan frente a un solo antgeno. Los anticuerpos monoclonales han permitido el anlisis de molculas, epitopo por epitopo. gracias a su estrecha especificidad. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales no tienen la habilidad de reconocer la molcula completa, en comparacin con los anticuerpos policlonales. Para los anticuerpos monoclonales. distintos antgenos con un epitopo comn parecen el mismo antgeno. El anticuerpo CA199 (Magnan, 1983) como marcador tumoral puede detectar las distintas formas y tamaos moleculares que poseen epilopos comunes formados por carbohidratos. Los anticuerpos monoclonales permiten la identificacin de isoenzimas. subtipos, isotipos de proteina y cambios conformacionales de las molculas, puesto que pueden distinguir la mnima diferencia entre molculas. Los anticuerpos monoclonales pueden dar reacciones cruzadas con distintos antgenos. Estas reacciones cruzadas se pueden explicar por la probable existencia de la misma secuencia de aminocidos, hidratos de carbono o lpidos en distintas molculas. La tecnologa de los anticuerpos monoclonales ha permitido el desarrollo de sistemas de inmunoensayo m u y tiles y prcticamente ideales para un laboratorio de diagnstico clnico. Los mtodos de produccin y las aplicaciones de los anticuerpos monoclonales se han analizado exhaustivamente (Nakamura. 1983: Zola, 1987). Las ventajas de los anticuerpos monoclonales son las siguientes: 1. Los anticuerpos monoclonales constituyen un reactivo m u y bien definido.

y en el equilibrio el ritmo neto es cero. Asi. *' _ [AgAb] K ~[Ag][Ab]~

? 11

(constante de asociacin en el equilibrio o constante de afinidad). K es el parmetro limitado a las reacciones de sitio en sitio, a pesar de que los antgenos y los anticuerpos a menudo poseen mltiples dominios de unin en la molcula. La constante de asociacin para mltiples reacciones antgeno-antcuerpo se puede denominar avidez en lugar de afinidad. El valor de K se puede obtener de las siguientes ecuaciones y de datos experimentales:
a a

[Ab] = [Ab],-[AgAb] donde [Ab] es la concentracin del anticuerpo en el equilibrio y [Ab]. representa la concentracin total de anticuerpo inicial.

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

823

"([Ab],-B)F

donde F es el anlgeno libre o analito, y B es el antgeno unido o analito. Una representacin de Scatchard se produce cuando la cantidad de antgeno unido (B) se representa en eje el X y la relacin de los analitos B/F se representa en el eje Y. Dos parmetros que se pueden determinar de una representacin de Scatchard son la constante de disociacin o afinidad, de la pendiente de la lnea, y la concentracin de los sitios de unin al anticuerpo por el punto de corte de la recta con el eje X (Scatchard. 1949).

VISIN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS

puestos cromforos, fluorforos. y ms tarde, compuestos quimioluminiscentes. Dependiendo del sustrato elegido, el mtodo de ensayo se puede definir como un inmunoensayo enzimtico fluorescente o quimioluminiscente (Thorpe. 1984). Los inmunoensayos fluorescentes (FIA) emplean fluorforos como sondas. Los fluorforos requieren de una longitud de onda ptima para que su excitacin produzca una emisin de luz detectable. La sensibilidad del FIA normalmente desciende debido al fondo inespecfico presente en las muestras biolgicas. Existen fluorforos que poseen un retraso en la emisin de fluorescencia de 100 ns (nanosegundos) y son apropiados para el uso en un FIA en tiempo real. El empleo de un nuevo tipo de compuestos fluorescentes ha resultado en una mejora del FIA, como puede ser la eliminacin del ruido de fondo. Se han introducido instrumentos sofisticados de modo que se pueden detectar concentraciones bajas de analitos (10 M) mediante FIA.
1 5

Tipos de inmunoensayos
Una breve clasificacin y una lista de las caractersticas de vanos inmunoensayos aparecen en la Tabla 35-1. Los inmunoensayos de precipitacin proporcionan el mtodo ms sencillo por el que los antgenos y anticuerpos reaccionan entre ellos sin necesidad de una seal de deteccin. El complejo antigeno-anticuerpo en un gel o en fase lquida puede observarse cualitativamente c o m o un precipitado a simple vista, y cuantitativamente mediante un detector. El inmunoensayo de aglutinacin de partculas (Kasahara, 1992b) emplea partculas inertes como sonda, en lugar de la precipitacin directa de los complejos antgeno-anticuerpo. Los anticuerpos o antgenos unidos a partculas c o m o eritrocitos, ltex o un sol metlico reaccionan con el analito de la muestra. Como resultado de esta reaccin inmune, las partculas grandes presentan un patrn de aglutinacin significativo que puede verse a simple vista. Y a l o w (1959) describi el desarrollo de un RA empleando istopos radiactivos como sonda. Este avance permiti la deteccin cuantitativa de niveles residuales de analitos y contribuy al avance de la investigacin bsica y la medicina clnica. L a insulina, por ejemplo, se cuantific mediante un RA, y sustituy al inmunoensayo de la insulina. El RA se puede preparar como un procedimiento en fase slida para una separacin fcil de la sonda libre de la unida. Desde el desarrollo de los RA, la bsqueda de sondas alternativas a los istopos radiactivos se ha intensificado, con el objetivo de desarrollar inmunoensayos no isotpicos empleando enzimas, sondas fluorescentes y otros grupos de respuesta. El inmunoensayo enzimtico (EIA), que emplea enzimas como sondas, se desarroll al principio de la dcada 70 (Engvall. 1971; Van Weeman. 1971) y rpidamente obtuvo una gran popularidad. Las enzimas pueden amplificar las seales dependiendo de la actividad cataltica de la enzima. En un intento de mejorar los sustratos y aumentar la sensibilidad, se han introducido com-

Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean compuestos quimioluminiscentes como sonda. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen molculas sintetizadas qumicamente y productos naturales como la aequorina. A diferencia de los fluorforos. la mayora de los compuestos quimioluminiscentes requieren una estimulacin qumica, en lugar de energa lumnica, para generar la emisin de luz. La reaccin de reduccin-oxidacin es un proceso comn a todos los ensayos quimioluminiscentes. La amplificacin de la seal no se espera de las sondas quimioluminiscentes porque las molculas quimioluminiscentes generan un solo fotn por descomposicin molecular. Han aparecido una serie de compuestos innovadores para la quimioluminiscencia que han resultado tiles para su aplicacin en inmunoensayos. Un metal quelado con grupos tri-bifenilo emite luz a travs de una reaccin continua de reduccin-oxidacin en la superficie de los electrodos (Blackburn, 1991). En los diversos tipos de ensayos mencionados anteriormente, los principales factores que afectan a la sensibilidad de un ensayo son la constante de asociacin (afinidad o avidez) del reactivo, la intensidad de la seal de las sondas y la relacin seal/fondo de la seal de deteccin reducida por el fondo de la propia reaccin o por una reaccin inespecifica. Los istopos de yodo 1 2 5 ( l) requieren unos 7 millones de molculas para generar 1 fotn/segundo, basado en el clculo de la vida media de istopos radiactivos (Bounaud. 1987). Los sustratos quimioluminiscentes de enzimas pueden incrementar el nmero de eventos en una orden de magnitud 6 veces mayor que el l. Esto se atribuye a la capacidad de amplificacin cataltica que poseen las enzimas.
,25 l2S

Qumica de conjugacin
En funcin del ensayo elegido, el mtodo de conjugacin que une una molcula con otras, como enzimas (o cofactores) a antgenos (o anticuerpos) o antgenos (anticuerpos) a una fase slida puede variar. La reaccin de acopla-

Tabla 35-1 Clasificacin de los inmunoensayos y sus caractersticas Seal de deteccin Inmunoensayos de precipitacin Inmunoensayos de partculas No necesarias Clulas sanguneas. partculas artificiales (gelatina. partculas de ltex, etc.) Radioistopos ('1, H) Enzimas
3

Separacin B/F* No necesaria No necesaria

Deteccin de la seal A simple vista, turbidez. nefelometra A simple vista, analizador de patrones, espectrofotometra. cmputo de de partculas Cmputo de fotones Espectrofotometra. fluorimetria. cmputo de fotones Cmputo de fotones Cmputo de fotones

Sensibilidad ~10 |jg/m |t -5 ng/mM

Radiommunoensayos Inmunoensayos enzimticos Inmunoensayos fluorescentes Inmunoensayos quimioluminiscentes

Necesaria Necesaria Necesaria Necesaria

-5 pg/ml -0,1 pg/m|6(CL-EIA) -5 pg/ml

1 1

Fluorforos Compuestos quimioluminiscentes

-5 pg/ml

libre Los ensayos homogneos que se incluyen no requieren la 'Paso de lavado para la separacin do la sonda unida en el inmunocompleo de la sonda que queda separacin B/F. Dalos de Ritchie (1978) Datos de A u x (1988). 'Oatos de Isomura (1994) 'Datos de Sgoulas (1989)
:

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

cuerpos conjugados con una sonda. Las placas de microtiter o de tiras pueden causar un "efecto de borde". Este efecto puede explicarse por las distintas cinticas de la reaccin inmune o la actividad enzimtica con las vanado nes de la temperatura. Puede existir una diferencia en la temperatura entre los pocilios que se encuentran en el borde de la placa y los que se encuentran en el centro. Una diferencia de unos 2 C puede observarse con un termmetro infrarrojo entre los pocilios del borde y los centrales a temperatura ambiente. La forma y tamao de la fase slida son factores crticos que afectan a la cintica de la inmunorreaccin y a la capacidad de unin del anticuerpo o antgeno de la fase slida. Partculas esfricas magnticas o de ltex de 3.000 A de dimetro, poseen una superficie total mayor para la inmunoabsorcin de lo que se obtiene normalmente con otras lases slidas. L a mayor superficie total ayuda a reducir la duracin de la reaccin inmunolgica (Nishizono. 1991). miento aplicada se debera llevar a cabo en condiciones que eviten la reduccin de las propiedades biolgicas de la protena. En el mtodo del glutarakJehido (Avrameas, 1978). el glutaraldehido, con dos (o posiblemente ms) grupos aldehido como agente de acoplamiento, se ha empleado para la conjugacin de grupos amino proteicos. Este mtodo se basa en reacciones mixtas, incluida la condensacin aldlica a elevado pH (la pKa del residuo NH es de 8.6 a 10.8). En este mtodo, mostrado en la Figura 35-1. el conjugado resultante presenta formas diferentes por la existencia de mltiples dianas de unin. El mtodo de la oxidacin con periodato (Nakane. 1966) para la conjugacin de anticuerpos, emplea la peroxidasa de rbano, que contiene grupos de hidratos de carbono en su molcula. Los mtodos mencionados anteriormente no son apropiados para la regulacin de reacciones especificas de diana, como ocurre cuando se requiere la estereoespecificidad configuracional del conjugado. Como se muestra en la Figura 35-2, se han desarrollado mtodos de conjugacin nuevos (Kato. 1975; Kitagawa. 1978) empleando un reactivo de conjugacin sofisticado, el ster de m-maleimidobenzil-N-hidroxisuccinimda (MBS). El MBS es un reactivo bivalente que consiste en un ster activo y la maleimida. que pueden reaccionar con un grupo NH, y un grupo SH, respectivamente. El grupo carboxilo tambin puede ser utilizado como una diana especfica para la conjugacin con un residuo a- o i-NH presentes en una proteina empleando N-hidroxisuccinimida (NHS) como reactivo de conjugacin. El reactivo NHS tambin conjuga protenas o el grupo carboxilo introducido en una fase slida. Las partculas que se emplean en los ensayos de aglutinacin de partculas se enumeran en la Tabla 35-2 El fenmeno de la aglutinacin de partculas (aglutinacin directa) causado por una reaccin inmune, se observ por primera vez en un ensayo para detectar la presencia de antigeno tras la incubacin con el suero de un paciente infectado. La aglutinacin de eritrocitos tras la incubacin con el suero dio lugar al descubrimiento de los grupos sanguneos ABO. Los inmunoensayos de partcula se basan en el principio de aglutinacin y emplean como reactivo un anticuerpo o un antigeno unido a una partcula inerte, en lugar de la precipitacin directa de un complejo antigeno-anticuerpo. Como sonda, la partcula puede aumentar significativamente la sensibilidad del inmunoensayo. independientemente de si la aglutinacin resultante se detecta a simple vista o mediante instrumentos espectrofotomtricos para su cuantificacin. Los entreoos, partculas de gelatina. Iiposomas. soles de metal, y varios tipos de partculas de ltex, incluyendo el ltex modificado con xido de nierro o tintes, funcionan c o m o fases slidas tiles en estos ensayos. El dimetro de las partculas empleadas en reacciones de aglutinacin vara entre 7 pm y 0,01 pm. N o existe una nica teora que explique las reacciones de aglutinacin (Kasahara, 1992a) debido a la gran variedad de lamao de las partculas empleadas. Para partculas mayores de 3 pm a 5 pm de dimetro, no se observa a temperatura ambiente el movimiento browniano de partculas dispersas actuando de acuerdo con el coeficiente de difusin. Sin embargo, la teora de la energa potencial de la interaccin entre partculas, o la teoria de la reaccin de coagulacin de coloides, se pueden aplicar a partculas pequeas c o m o pueden ser las micropartculas de ltex. La IgM, por ser multjvalente, se estima que es unas 750 veces ms eficiente en una reaccin de aglutinacin que una molcula bivalente de IgG. La distancia entre partculas en una floculacin debe ser m e n o ro igual a 120 Adebido a la longitud de la molcula de anticuerpo. En resumen, los factores importantes a tener en cuenta en una inmunorreaccin de fase slida son las propiedades de la superficie de las partculas, como su carga e hidrofobicdad, y la estabilidad de la dispersin.

Caractersticas de la fase slida

Todos los inmunoensayos heterogneos que emplean conjugados con sondas, incluidos los radioistopos, requieren al menos un paso para diferenciar el anligeno que ha reaccionado para formar un inmunocomplejo (unido), del que permanece sin reaccionar (libre). La inmovilizacin de antigenos o anticuerpos en una fase slida se realiza mediante uniones covalentes o mediante adsorcin tsica a travs de interacciones no covalentes. Se han empleado como lase slida, partculas de gel hechas de agarosa. poliacrilamida. cuentas de plstico o placas de poliestireno. y tambin partculas recubiertas de oxido de hierro que pueden separarse en un campo magntico. A menudo se utiliza la cara interna de un tubo o un pocilio de microtiter. como fase slida. Con estas fases slidas relativamente grandes, puede ser necesaria la agitacin de la mezcla de reaccin para acortar el tiempo necesario para que tenga lugar la reaccin inmune. El fenmeno prozonal o efecto de gancho, se debe a una elevada concentracin de analito, y es probable que se observe en un inmunoensayo de un solo paso cuando se emplean cantidades limitadas de anticuerpo en fase slida, o cuando se usan anti-

INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMTRICOS Origen y principios de la reaccin de precipitina

El precipitado que se forma cuando grandes complejos de antigeno se combinan con anticuerpos para formar un entramado insoluble se ha utilizado ampliamente en la identificacin y cuantificacin de las reacciones de precipitina. La aplicacin de las tcnicas de precipitina posee las ventajas de la sensibilidad, especificidad y sencillez. La limitacin que supone la sensibilidao de estos ensayos requiere de una importante consideracin. Incluso en las

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INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA

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Tabla 35-2 Partculas empleadas como sonda en el inmunoensayo de aglutinacin de partculas Mtodo de ensayo Eritrocitos humanos humana (VIH) Eritrocitos de ave Mezcla de eritrocitos animales (HBV) Ltex Ltex (color) Microcpsulas Parliculas de gelatina Parliculas pohpeptdicas Partculas de silicato Partculas de oro Soles de metal Hemaglutinacin directa (Landsteiner) I lemaglutinacin eritrocito-anticuerpo: placa de microtiter/portaobietos Hemaglutinacin directa Hemaglutinacin pasiva: placa de microtitor Hemaglutinacin pasiva indirecta: placa de microtiter Aglutinacin pasiva indirecta: portaobjetos Aglutinacin pasiva indirecta: turbidimetra Aglutinacin pasiva indirecta Inmunocromatografa Aglutinacin pasiva: placa de microtiter Aglutinacin pasiva: placa de microtiter Aglutinacin pasiva indirecta: cmara CCD Aglutinacin pasiva e indirecta Aglutinacin pasiva: placa de microtiter/cmara CCD Fotometria mejorada con aglutinacin indirecta Aglutinacin indirecta Suministro Grupo sanguneo ABO Anticuerpo para el virus de la Anticuerpo Irenle virus de la gripe humano Anticuerpos de T allldum Antigeno de superficit del virus de la Hepatitis I Gonadotropma corinica Ferriti na Gonadotropma corinica humana (hCG) Anticuerpo para T pallidum Anticuerpos para HIV. T. pallidum Hemoglobina humana (hHb) Anticuerpo para T pallidum, y para HBs Anticuerpo para T pallidum Estrgeno total hCG. hHb id Biosensor

De Kasahara Y Principles and applications ot particle immunoassay En Nakamura RM Kasahara Y. Rechnitz GA (ed ). Imnu Technology lor the 1990s Washington DC American Society lor Microbiology. 1992b. pags. 127-147. con permiso

mejores condiciones de mejora de la sensibilidad que ofrecen nuevas tcnicas de difusin de luz. el lmite inferior de sensibilidad de ensayos de inmunoprecipitina se mantiene en el orden de 0.1 a 0.5 mg/dl. Este umbral de sensibilidad es suficiente para la cuantificacin de las principales protenas sricas. La reaccin de precipitma forma la base de muchas tcnicas inmunoquimicas cuantitativas y cualitativas que se emplean en los laboratorios clnicos (Kabat. 1961). Los factores que afectan a la reaccin de precipitina fueron investigados detalladamente por Heidelberg en 1935, quien encontr que las proporciones relativas entre reactivos, condiciones de temperatura, pH y fuerza inica del medio, y las caractersticas de avidez y afinidad del anticuerpo, son todas de igual importancia para la formacin del precipitado inmune. En cuanto al patrn de formacin de precipitma cabe notar que existe un punto en que la precipitacin es mxima u ptima, denominado punto de equivalencia. La adicin continuada de antgeno una vez que se ha alcanzado el punto de equivalencia produce un efecto solubilizador del precipitado. El rango apropiado para la determinacin de analitos debera de llegar hasta la zona de equivalencia. La optimizacin de la concentracin del anticuerpo que se va a emplear como reactivo es necesaria, al igual que la optimizacin de las soluciones tamponadas. Los mtodos de precipitacin ms tpicos son los siguientes:

INMUNOENSAYOS DE PARTCULAS Principio de aglutinacin de partculas

La reaccin de aglutinacin se puede emplear para detectar anticuerpos presentes en individuos que han sido sensibilizados con antigenos especficos (aglutinacin directa o pasiva) (Figura 35-3B). La aglutinacin inversa emplea un anticuerpo especfico que se emplea para detectar antgenos solubles en el individuo (Figura 35-3A). Un dominio de unin a haptenos (para drogas, hormonas o partculas pequeas) no forma una estructura entrecruzada, y por tanto no se aglutina a no ser que se inmovilice en una fase slida. Como se muestra en los paneles A y 6 de la Figura 35-4. cuando se emplea una partcula o un transportador inmovilizado con un hapteno como reactivos, puede darse una inhibicin de la reaccin de aglutinacin que permite la deteccin del hapteno. Este ensayo se basa en el principio de competitividad, en el que la aglutinacin de partculas de hapteno con una cantidad limitada de anticuerpo, libre o unido a partculas, se inhibe debido a la presencia de hapteno libre presente en la muestra. Adems, partculas marcadas pueden reaccionar con reactivos fijados a una fase slida de la membrana. Este tipo de ensayo ha sido m u y popular como un mtodo sencillo para la deteccin cualitativa de gonadotropma corinica humana (hCG) y otros analitos.

Mtodos cualitativos del ensayo de precipitacin

Inmunodifusin sencilla (Williams. 1970) Inmunodifusin doble (Garvey, 1977) Inmunodifusin doble en dos dimensiones (Williams, 1970) Reaccin de electroinmunodifusin (Ritzmann, 1975) Inmunoelectroforesis (Rose. 1973)

Hemaglutinacin
Las pruebas de hemaglutinacin (Boyden, 1951) son sencillas en su realizacin y no requieren un equipamiento especial. Por este motivo, tanto los pases desarrollados como los que se encuentran en vas de desarrollo, han adoptado una variedad de ensayos de hemaglutinacin. Una de las pruebas de hemaglutinacin ms extendidas es la que se emplea para la deteccin de anticuerpos contra Treponema pallidum. comercializado como Serodia-TP por Fujirebio, Inc (Tokio. Japn). En Estados Unidos, el ensayo de hemaglutinacin para Treponema pallidum se aprob en 1981 por el Center for Disease Control (CDC). Tambin fue recomendado por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) gracias a su superioridad Irente a otros tipos de ensayo en cuanto a su especificidad y sensibilidad (Kasahara. 1992b). En el ensayo de aglutinacin de Treponema pallidum. el reactivo consiste en eritrocitos sensibilizados y desensibihzados de oveja, y una solucin diluyeme del suero para la reconstitucin de clulas sensibilizadas liofilizadas como control positivo Se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos y semicuantitativos mediante el uso del siguiente protocolo de dilucin del suero, empleando una placa de titer como recipiente de la reaccin: empleando una

Mtodos semicuantitativos del ensayo de precipitacin

Inmunodifusin radial sencilla (Manzini. 1965: Fahey, 1965) Electroinmunodifusin en una sola dimensin (Axelsen. 1975) (electroforesis 'cohete")

Inmunoensayos

nefelomtricos

Se han desarrollado vanas tcnicas de anlisis por inmunoprecipitina que emplean sistemas de dispersin de la luz (Ritchie. 1978). La formacin de los complejos inmunolgicos se ha asociado a la cantidad de dispersin de luz y se ha empleado como la base para la cuantificaon del antgeno Se han diseado instrumentos sofisticados que rpidamente miden la dispersin de la luz. Las medidas de dispersin de la luz generalmente se denominan turbidimetrias o nefelometras.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

A n t g e n o o haptcno conjugado en una p a r t c u l a

Anticuerpo en la muestra

Figura 35-3. Principios del inmunoensayo de aglutinacin pasiva de partculas para la deteccin de antgenos de mltiples eptopos [A) o de anticuerpos (B). (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for 1990s. Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. con permiso.)

pipeta de 25 uj, poner cuatro gotas (100 ul) del diluyeme de suero en el pocilio 1 (Fig. 35-5) y una gota en los pocilios 2 y 4 del ensayo cualitativo (los pocilios del 2 al 8 se van a utilizar para el ensayo cuantitativo). Los patrones de aglutinacin resultantes se muestran en la Fig. 35-6. Los patrones negativos, que indican que la reaccin inmune no ha tenido lugar, muestran partculas en floculacin condensadas con una estructura entrecruzada en el fondo del pocilio. Por el otro lado, los patrones positivos indican que la reaccin inmune ha tenido lugar, y muestran un patrn de aglutinacin de partculas extendido. Las partculas aglutinadas no se pueden sedimentar ms para obtener una condensacin como en los patrones negativos, porque se pierde su forma global en la aglutinacin. En las filas primera y segunda, se emplearon el suero y las clulas no sensibilizadas (control negativo), respectivamente. Los individuos 1 y 2 muestran resultados negativos. Los individuos 3 a 8 muestran resultados negativos o positivos, dependiendo de la dilucin de la muestra. Se obtiene un resultado positivo para los individuos 7 y 8 hasta una dilucin de 1:2.560 (filas 3 a 8). Existen tote de hemaglutinacin para la deteccin de anticuerpos frente al virus de la hepatitis (HBV), hepatitis tipo (HCV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1/2), la tiroglobulina, microsomas tiroideos y otras sustancias. Ensayos de hemaglutinacin inversa se emplean para la deteccin del antgeno de superficie de HBV. la a-fetoprotena (AFP), hemoglobina humana, etc. La sensibilidad de las pruebas de hemaglutinacin es de aproximadamente 50 ng/ml para la deteccin de antgeno (analito). Kemp (1988) desarroll un nuevo ensayo de hemaglutinacin que emplea un anticuerpo monoclonal especfico para el antgeno de superficie de los eritrocitos humanos. Este anticuerpo puede reconocer un eptopo comn a diferentes tipos de eritrocitos y a clulas anormales, como las que se encuentran en casos de anemia falciforme. Tal y como se muestra en la Figura 35-7, los eritrocitos de las muestras se emplean como partculas de fase slida, y la aglutinacin resultante puede observarse a simple vista. Los anticuerpos bivalentes se

conjugan qumicamente para que un anticuerpo reaccione especficamente con los eptopos de superficie del eritrocito, y el otro es especfico para el antigeno diana o analito. El ensayo se aplica para la deteccin de anticuerpos frente a VIH, adems de para la deteccin de varios antigenos. A diferencia de otras formas de aglutinacin convencionales, no requiere la separacin de plasma o suero. Este ensayo es simple y ahorra tiempo, y adems, presenta ventajas en cuanto a la seguridad, porque elimina la necesidad de la separacin del suero en el caso de muestras peligrosas positivas para VIH o HBV.

Aglutinacin de partculas de gelatina

El desarrollo de una partcula especial de gelatina con una superficie muy hidroflica que es capaz de evitar la unin inespecfica de materiales presentes en la muestra ha supuesto una alternativa a los eritrocitos (Ikeda, 1984). La partcula se prepara por separacin de fases y entrecruzamiento tridimensional a 40'C y pH ptimo. La partcula resultante se tija con formaldehdo o glutaraldehido, y su dimetro es de unas 3 um. Las propiedades fsicas de las partculas de gelatina en comparacin con las de los eritrocitos se muestran en la Figura 35-8. Una partcula de gelatina carece de antigenicidad y est, por tanto, libre de los problemas asociados con el empleo de anticuerpos heteroflicos cuando se emplean eritrocitos como partculas. Este tipo de partcula artificial requiere una menor dilucin del suero para evitar las uniones inespecificas y garantiza una deteccin ms sensible que en el caso de los glbulos rojos. Otras partculas sintticas (Hirayama, 1991) compuestas de cido L-glutmico y sus derivados han sido desarrolladas por Mirayama (1991) como alternativa a las partculas de gelatina. Estas partculas sintticas se pueden teir de cualquier color porque las partculas son incoloras, al igual que las de gelatina. El ensayo de aglutinacin de partculas de gelatina se emple inicialmente para la deteccin de anticuerpos frente al virus linfotrpico humano de tipo I (HTLV-1), que se descubri inicialmente c o m o un
f

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA

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Menos agregados y de menor tamao

Figura 35-4. Principios del inmunoensayo de inhibicin de partculas para la deteccin de antgenos con un solo epitopo (haptenos), empleando partculas de antigeno con anticuerpos libres (A) o fijados (8). (De N a k a m u r a RM, Kasahara Y. Rechnitz GA |eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

Figura 35-5. Ensayo de hemaglutinacidn para la deleccidn del antigeno de T. pallidum (Serodia-TP, Fujireblo, Inc, Tokio, Japon) basado en prolocolos de ensayos semicuantitativos (De Nakamura RM. Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1 9 9 0 s Washington. DC. American Society for Microbiology. ASM Press. 1992. con permiso)

retrovirus humano. Este ensayo de aglutinacin (Ikeda, 1984) rpidamente se hizo muy popular para la deteccin de VIH. HBV y HCV gracias a su alta sensibilidad y especificidad, a su sencillez y a que no es necesario un control m u y estricto de la temperatura. L a aglutinacin de partculas de gelatina puede sustituir cualquier ensayo basado en la hemaglulmacin, con la excepcin de ensayos que emplean los eritrocitos de la muestra como partculas.

Aglutinacin con ltex

La aglutinacin con ltex (Galvin. 1984). utilizando partculas de ltex, se ha utilizado para la deteccin de vanos analitos. como la hCG para las pruebas de embarazo, y la deteccin cuantitativa de otras protenas plasmticas con o sin instrumentacin. El procedimiento de este ensayo cualitativo es sencillo. Por ejemplo, es posible que uno solo tenga que mezclar unas gotas del ltex sensibilizado con el reactivo y la muestra empleando un palito, sobre un cubre negro. Dos o tres minutos ms larde, se puede detectar a simple vista la aglutinacin de fase invertida, como resultado de la inmunoreaccin. La aglutinacin con ltex se adapt para ensayos cuantitativos empleando mtodos de deteccin lumnica basados en la turbidimetria (absorcin de la luz) o nefelometra (dispersin de la luz). Con eslas tcnicas, la aglutinacin de ltex adquiere una mayor sensibilidad de subnanogramos por mililitro, mientras que la sensibilidad del ensayo midiendo la precipitacin intacta del complejo antgeno-anticuerpo es menor de 0.5 ug'ml.

longitud de onda empleada. La mayora de los reactivos de ltex disponibles de forma comercial con un dimetro inferior a 1 pm. se aplican a analizadores qumicos automticos empleando principios de medida fotomtncos. Para mejorar todava ms la sensibilidad, se trat de mejorar los reactivos y la instrumentacin, as como optimizar el tamao de la partcula, seleccionar la longitud de onda apropiada, y mejorar el software del sistema informtico que integra los datos. Ahora existen sistemas automatizados que emplean partculas de ltex, y pueden procesar unas 200 muestras por hora con una sensibilidad de subnanogramos por mililitro.

Inmunoensayo por contaje de partculas

El inmunoensayo por cmputo de partculas (PACA: parde-counting immunoassay) (Masson. 1986) emplea el contaje celular ptico para obtener el descenso en partculas libres despus de la inmunoreaccin. En el formato PACA, se puede medir tanto el ritmo del ensayo, es decir, el ritmo en el que decrece el nmero de partculas libres, o el valor final cuando ha finalizado la reaccin. La medida del ensayo al final de la reaccin puede emplearse para obtener una sensibilidad del nivel de nanogramos por mililitro; sin embargo, se requiere un mayor tiempo de incubacin.

Inmunoensayos con otras partculas

Se han desarrollado inmunoensayos de dispersin cuasi-elstica empleando la medida del cambio en la respuesta a la distribucin del tamao de la partcula (Yarmush. 1987). Esla tcnica utiliza un haz de lser para medir la reduccin en la media del coeficiente de difusin de las partculas como resultado de la reaccin inmune. Otros mtodos miden la variacin de anisotropa angular de la luz dispersada con el incremento del tamao medio de la partcula.

Ensayo de turbidimetha con ltex

La absorcin de luz (prdida de luz mediante su dispersion en la superficie de una partcula) es proporcional al dimetro de la partcula y depende de la

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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Figura 35-6. Patrones de hemaglutinacin para detectar anticuerpos anti-I pallidum (A) e interpretacin c o m o positivo o negativo a la dilucin linal del suero (6). (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC. American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. con permiso.]

Glbulos rojos del dolanle

Reactivos bivalentes

Unin pero un aglutinacin

Figura 35-7. Representacin esquemtica de un ensayo basado en la aglutinacin autloga de eritrocitos, empleando eritrocitos presentes en la muestra como partculas. (De N a k a m u r a RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Panculas ,ic

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inirocitosdco\cia

Figura 35-8. Micrograta electrnica (x25.000) y propiedades tsicas de las partculas de gelatina en comparacin con los eritrocitos de oveja. (De Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA[eds]: Immunochemical Assays and Biosensor T e c h n o l o g y lor the 1990s. Washington. DC. American Society (or Microbiology. ASM Press. 1992. pg. 139, con permiso. |

Las partculas con dimetros parecidos a la longitud de onda consiguen una variacin angular de la dispersin de la luz dependiente del tamao.

se ha descrito en el apartado Cintica de la reaccin de antigeno-anticuerpo, de la siguiente ecuacin. B/F = K([Ab].-B)

a

Resumen
La hemaglutinacin indirecta y la aglutinacin de partculas de gelatina son ensayos que, realizados en placas de microtiter, han sido m u y populares en procesos de determinacin cuantitativa y cualitativa de diversos analitos. Estos ensayos no requieren instrumentos adicionales ni un control estricto de la temperatura. Lo ms importante es que estos ensayos garantizan una sensibilidad igual o mayor que la del inmunoensayo enzimtico convencional en lo que se reliere a la deteccin de anticuerpos frente a agentes infecciosos. El ltex como fase slida proporciona unas importantes ventajas cinticas, como un menor tiempo de nmunorreaccin. Por este motivo, ha sido posible adaptar el ltex para su uso en instrumentos sofisticados, aplicando principios diferentes y dando como resultado un ensayo con una sensibilidad de unos 3 rdenes de magnitud mayor que en los ensayos de inmunoprecipitacin convencionales. El ltex es susceptible de presentar interferencias de factores desconocidos en las muestras. Para eliminar este problema, se han utilizado varios absorbentes tanto en el reactivo como en el medio de incubacin. La gran ventaja del inmunoensayo de partculas es su simplicidad, ya que no requiere la separacin de los reactivos libres de los unidos.

el eje Y es la relacin B.'F. que es proporcional a la cantidad de anticuerpo libre [Abj de [Ab],-B, igual al antgeno libre [Ag). As. la K, representa la pendiente de la representacin. En esta figura, la constante de afinidad K, es 8.1 x 10 L'M para el anticuerpo especifico para la ciclosponna. Las emisiones radiactivas, como los rayos gamma del l, se pueden medir en trminos de cuentas por minuto (CPM) utilizando un contador de centelleo gamma. Los radioistopos ms frecuentes y sus propiedades se muestran en la Tabla 35-3. La eleccin de la sonda afecta considerablemente al protocolo del ensayo. Por ejemplo, una de las sondas ms utilizadas, el l , necesita un tiempo relativamente corto para el conteo. pero no puede almacenarse mucho tiempo debido a que tiene una vida media corta. Sin embargo, el tritio ( H) requiere un tiempo mayor para el conteo. y por tanto incrementa la duracin del ensayo. La mayo9 ;: Ia 1

RADIOINMUNOENSAYO Origen
Desde que apareci la tcnica del RA. el uso de radioistopos como sonda, que se desarroll en primer lugar por Yalow y Berson (1959]. se ha mejorado de una forma espectacular en cuanto a sensibilidad y precisin. Se han introducido diversas variaciones del mtodo en el laboratorio clnico. Hay dos tipos principales de RIAs, competitivos y no-competitivos, que requieren pasos de lavado para separar la sonda unida de la que permanece libre (conjugados). El ensayo competitivo sigue la ley de accin de masas, que especifica la reaccin entre analitos y protenas de unin, receptores y anticuerpo. El tactor clave en la optimizacin del ensayo es la afinidad de unin del anticuerpo. La representacin de Scatchard de la relacin entre anticuerpo unido y libre, frente a la concentracin del analito, se emplea frecuentemente para evaluar la funcin del anticuerpo. La Figura 35-9 muestra la representacin de Scatchard para la determinacin de la ciclosponna. Tal y como

Ciclosponna (pg/ml) Figura 35-9. Representacin de Scatchard de las caractersticas de unin de anticuerpos a la ciclosporina (K = 8,1 x 10 L'M).
a 9

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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Tabla 35-3 Propiedades de los radioistopos empleados como sonda en los radioinmunoensayos Actividad especifica

da de los RA actualmente emplean el l para realizar el proceso de conjugacin y mantener la actividad biolgica de los reactivos. Un mtodo muy utilizado de conjugacin de protenas con l es el mtodo de la cloramma-T (Hunter. 1962). La lirosina. en particular, posee una mayor reactividad con el yodato debido a la presencia de un grupo hidroxi en la posicin para del anillo aromtico. L a seal puede medirse en trminos de CPM como emisiones de radiacin gamma. A diferencia de las enzimas, el empleo de istopos como sonda, con un radio de Stokes pequeo, no suele afectar a la actividad antignica, debido a la falta de alteraciones alostricas cuando se conjugan istopos con antgenos pequeos (haptenos).
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na competitivamente tanto con el conjugado c o m o con el antigeno. Entonces, el complejo inmunolgico es capturado por un segundo anticuerpo especfico para el primer anticuerpo, asociado a una fase slida. Cuando el segundo anticuerpo se asocia a una fase slida fina, el complejo inmunolgico de la segunda reaccin puede separarse como un precipitado, del resto de las molculas que no han reaccionado. Para la determinacin de un anticuerpo, el anticuerpo unido a una sonda y el anticuerpo de la muestra reaccionan competitivamente con el antgeno (analito) fijado a la fase slida. Cuanto mayor sea la pendiente de la curva estndar, ms precisos son los datos que aporta. Los mtodos competitivos requieren cantidades menores de anticuerpo o antgeno (analito) que los ensayos de tipo sandwich descritos ms adelante. Los ensayos no competitivos, originalmente demostrados por Miles (1968), han cobrado mayor popularidad en los ltimos tiempos. Los ensayos radioinmunomtricos (IRMA) o ensayos de sandwich (Fig. 35-12), tienen una relacin alternativa entre el analito y el anticuerpo. El ensayo competitivo clsico consigue una respuesta inmunolgica con una mnima cantidad d e anticuerpo, y el ensayo de sandwich emplea una gran cantidad de anticuerpo en la fase slida. La tecnologa de los anticuerpos monoclonales ha hecho posible la elaboracin de grandes cantidades de anticuerpos especficos a un coste moderado, permitiendo la explotacin del ensayo de sandwich. El ensayo d e sandwich emplea un exceso estequiomtrico de anticuerpo y es ms sensible que un ensayo competitivo. Cuando se elimina por completo el fondo, la sensibilidad terica ltima del ensayo de sandwich es de una molcula de analito, lo cual es posible cuando la cantidad de anticuerpo utilizada en el ensayo se acerca al infinito. Como se muestra en la Figura 35-12, el anticuerpo en la fase slida primero se une al antgeno (analito) de la muestra. Despus de la separacin B'F, el conjugado reacciona con el antgeno (analito) fijado a la fase slida, y la seal se puede medir despus de la eliminacin de los conjugados libres mediante un paso de lavado. Este ensayo requiere antgenos con ms de dos determinantes antignicos. Cuando se emplean dos anticuerpos diferentes (es decir, un anticuerpo asociado a la fase slida especfico para un determinante antignco, y un anticuerpo conjugado especfico para otro determinante antignico), el protocolo de ensayo puede simplificarse haciendo el sandwich en un solo paso. As, la fase slida puede mezclarse con el antgeno de la muestra y con el conjugado simultneamente. No se produce interferencia porque ambos anticuerpos, tanto el de la fase slida como el conjugado, son capaces de reconocer distintos determinantes antignicos. En este ensayo la seal generada es proporcional a la concentracin del analito presente en la muestra, al igual que en el ensayo de sandwich en dos pasos. Este mtodo de ensayo se puede aplicar a la deteccin de anticuerpos con un formato de ensayo que emplea antgeno en la fase slida y antgeno aco-

Principios y mtodos del ensayo

Se han desarrollado varios mtodos (exceso de antigeno) basados en la unin competitiva (Ekins, 1960) a anticuerpos, entre antgenos con y sin sonda (analitos presentes en la muestra), para una amplia gama de analitos. Un mtodo competitivo convencional se muestra en la Figura 35-10. En un principio, una cantidad conocida de antigeno acoplado a una sonda y el antgeno de la muestra se mezclan y reaccionan con una cantidad constante de anticuerpo unido a una fase slida, como puede ser partculas de sefarosa o la cara interna de tubos de plstico. Despus de que la reaccin inmune alcance el equilibrio, la mezcla se lava para eliminar los conjugados que no han reaccionado y se separan los antgenos del complejo inmunolgico que permanece atrapado en la fase slida. El paso de lavado aparece como separacin B/F {bound: unido/free: libre). Aplicando el principio de la competilividad, la representacin del porcentaje de antigeno unido frente a la concentracin logartmica del analito produce la curva estndar que muestra la Figura 35-10. La representacin de CPM sobre la curva estndar nos da la concentracin del analito. Otro mtodo que emplea anticuerpos se muestra en la Figura 35-11. El primer anticuerpo es especfico para un determinado antgeno (analito) y reaccio-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

->Conccnir;icit>ii de analto

Figura 35-11. Principio de un ensayo de RA competitivo empleando un segundo anticuerpo para la separacin B'F (unido/libre). piado a una sonda. Para un formato en dos pasos, se puede emplear el antgeno en la fase slida y un anticuerpo especfico para el anticuerpo diana acoplado a una sonda. Empleando el formato de sandwich, la sensibilidad del ensayo es elevada (Espinosa. 1987). Un ejemplo es utilizar IRMA para la determinacin de la hormona estimulante del tiroides (TSH): el nivel de sensibilidad del ensayo es inferior a 0.07 pU/ml de TSH, en comparacin con unas 0,7 iiU/ml de un ensayo competitivo convencional de antgeno asociado a una sonda.

Resumen
Comparado con otros inmunoensayos, los RIAs resultan ventajosos p o r varios motivos: 1) precisin y elevada sensibilidad, 2) facilidad en la conjugacin del istopo, 3) deteccin de la seal sin optimizacin y 4) estabilidad frente a la interferencia ambiental del ensayo, entre otros. Las desventajas del RA son la corta vida en almacn de los reactivos y la necesidad de proteccin frente a la radiactividad nociva. Adems, como se discute ms adelante,

Figura 35-12. Principio de un ensayo de RA de tipo sandwich empleando la fase slida, tambin conocido c o m o ensayo inmunorradiomtrico (IRMA).

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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Tabla 35-4

Comparacin del radioinmunoensayo. el nmunoensayo enzimtico heterogneo y el inmunoensayo enzimtico homogneo Pasos de la reaccin inmune Pasos de la reaccin enzimtica Pasos para la deteccin de la seal

Ensayo Radioinmunoensayo Muestra* Analito o Ab marcado Inmunoensayo enzimtico heterogneo Muestra+ Analito o Ab -Enzima marcado Inmunoensayo enzimatico homogneo Muestra* Analito o Ab Enzima o coladores marcado

Reaccin inmune con pasos de lavado para la separacin

No necesarios

Emisin radiactiva (rayos y)

Reaccin inmune con pasos de lavado para la separacin

Reaccin enzimtica con reactivos adicinalos

Densidad ptica Fluorescencia Luminiscencia

La reaccin inmune y/o sistmica se desarrolla en una sola solucin, que incluye el reactivo para el revelado de la serial enzimtica

La reaccin inmune y/o sistmica se desarrolla en una nica solucin que incluye el reactivo para el revelado de la seal enzimtica

Densidad ptica Fluorescencia Luminiscencia

los RA no pueden aplicarse a inmunoensayos homogneos, debido a que las seales de los istopos no pueden modular las reacciones antgeno-anticuerpo.

INMUNOENSAYO ENZIMTICO Origen y clasificacin

Los inmunoensayos cuantitativos que emplean enzimas como sonda se desarrollaron como una alternativa a los radioistopos (Engvall. 1971: Van Weeman. 1971; Avrameas. 1971). Los ms utilizados son el ensayo inmunoabsorbente enzimtico (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), el EIA y la tcnica del inmunoensayo de multiplicacin enzimtica (EMIT: enzyme-multiplied immunoassay technique), que es una marca registrada de SYVACo. (D. Behring Inc., Cupertino, CA 95041) (Rubenstein, 1972). Esencialmente, los EIA heterogneos son similares a los RA, excepto que emplean enzimas como sonda. Las enzimas hacen posible desarrollar EIA homogneos, eliminando los pasos de lavado para la separacin B/F que de otro modo son necesarios. La Tabla 35-4 compara las caractersticas de los EIA homo y heterogneos con los RA. Mejoras en los EIA han aportado muchos formatos innovadores con diferentes grados de rapidez, sensibilidad, simplicidad y precisin. Las ventajas y desventajas de los EIA se listan en la Tabla 35-5 (Nakamura, 1992).

ma y por la seleccin de la medida de la seal, entre los que la quimioluminiscencia es el mtodo ms sensible. El lormato del ensayo de los EIA heterogneos, al igual que los RA. se puede dividir entre ensayos competitivos y no competitivos (vase Fig. 35-14). Los ensayos competitivos (exceso de analito) usan conjugados de antigenoenzima (Fig. 35-13A). mientras que los ensayos no competitivos (exceso de reactivo) incluyen los ensayos inmunomtricos de sandwich de dos dianas y los ensayos indirectos para medir anticuerpos (Figs. 35-13Sy Q. Los ensayos inmunomtricos de sandwich han aumentado su popularidad para la determinacin de antigenos como hormonas, marcadores tumorales. protenas plasmticas y agentes infecciosos. Los ensayos indirectos para la medida de anticuerpos (Fig. 35-13C) se han adoptado para la deteccin de anticuerpos frente a agentes infecciosos (p. ej., VIH. HBV. HCV) y autoanticuerpos

Tabla 35-5 Ventajas y desventajas de un inmunoensayo enzimtico A. Ventajas t Se pueden desarrollar ensayos sensibles gracias al efecto de amplificacin de las enzimas. 2 Los reactivos son relativamente baratos y pueden tener una larga vida de almacenaje 3. Se pueden desarrollar mltiples ensayos simultneamente. 4 Se puede desarrollar una amplia variedad de configuraciones del ensayo 5. El equipamiento no es necesariamente caro y est ampliamente disponible. 6 No existen riesgos radiactivos durante el mareaje ni el desecho de los residuos. B. Desventajas 1. La medida de la actividad enzimtica puede ser ms compleja que la medida de la actividad de algunos tipos de radioistopos 2. La actividad enzimtica se puede ver afectada por algunos componentes del plasma 3. Los ensayos homogneos, actualmente, poseen una sensibilidad de 10' M y no son tan sensibles como los radiommunoensayos. 4. Los EIA homogneos para molculas proteicas grandes se han desarrollado, pero requieren reaclivos inmunoqumicos compiojos
J

Inmunoensayos enzimticos heterogneos

El principio de los ensayos de EIA heterogneos es similar al de los RA. excepto que es la actividad enzimtica, no la radiactividad, la que se mide. Los EIA requieren un proceso secundario para obtener seales mediante la reaccin cataltica de las enzimas. Como fase slida para separar los conjugados libres de los unidos, pueden utilizarse placas de microliter, partculas de plstico, tubos de plstico, partculas magnticas y ltex con filtros, entre otros. El uso de pequeas partculas magnticas y de ltex permite acortar el tiempo de mmunorreaccin, reduciendo asi el tiempo total que requiere el ensayo. El desarrollo de sustratos que escindan las enzimas, estuvo marcado por la introduccin de sustratos colorimtricos y fluoromtncos, y ms tarde de suslralos quimioluminiscentes. que incrementan la sensibilidad de la seal. Algunas de las enzimas ms utilizadas en vanos EIA heterogneos son la peroxidasa de rbano, la fosfatasa alcalina, la (5-galactosidasa, la glucosa oxidasa. la ureasa y la catalasa. Las enzimas ms utilizadas junto con sus caractersticas aparecen en la Tabla 35-6. La sensibilidad del ensayo cuando se utilizan enzimas puede determinarse por la tasa de recambio de cada enzi-

EIA = inmunoensayo enzimtico De Nakamura RM Kasahara Y Heterogeneous enzyme immunoassays En Nakamura RM. Kasahara Y Rechnitz GA (eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC. American Society lor Microbiology. 199?. pags 149-167, con permiso

834

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 35-6 Caractersticas de las enzimas tpicas empleadas como sonda en los inmunoensayos enzimticos Caractersticas Fuente Tamao molecular (daltons) Actividad especfica Tasa de renovacin" Medida de la enzima Medida de alta sensibilidad Mtodo de mareaje de la enzima Peroxidasa (EC 1.11.1.7) Rbano ca. 40.000 250 U/mg 10 000 Colorimetria, fluorimetria. luminometria Luminometra Oxidacin del periodato (mtodo de Nakane) Enzima f5-galactosidasa (EC 3.2.1.23) E. coli ca. 530.000 600 U/mg 318000 Colorimetria, fluorimetria, luminometra Fluorimetria Mtodo de la dimaleimida, reactivo de entrecruzamiento' Fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1) Intestino bovino 140 000 1.000 U/mg 250 000 Colorimetria, fluorimetria, luminomelria Luminometria Mtodo del glutaraldohdo, reactivo de enlrecruzamiento

' Nmero de molculas del sustrato producidas por una molcula de enzima en una reaccin de un minuto; nmero de molculas/MU El reactivo contiene grupos qumicamente reactivos c o m o el maleimida y el succinimida.
1

>

Un EIA heterogneo (Fig. 35-13) consta de los siguientes pasos: 1. La fase slida unida a los reactivos se mezcla con el analito. independientemente de si el ensayo se basa en el formato competitivo o no competitivo. 2. Despus de la adicin del conjugado y la incubacin, hay unos pasos de lavado con una solucin tamponada que contiene un detergente, uno o dos pasos despus de la inmunorreaccin. La reaccin inmunolgica debe alcanzar determinados niveles para obtener un ensayo preciso y estable.

3. La fase slida, con el complejo inmune que contiene el antgeno conjugado a una enzima o un anticuerpo, se incuba a temperatura constante con la solucin de sustrato enzimtico. 4. La reaccin enzimtica se detiene (no es necesario en el ensayo de tasas) y el producto de la reaccin se mide con varios detectores dependiendo del sustrato empleado.

Ensayo

enzimtico

colorimtrico

En este ensayo, la reaccin enzimtica se realiza utilizando sustratos cromognicos para desarrollar un color mediante la reaccin cataltica principal. Por ejemplo, la peroxidasa de rbano, catalizando el ABTS [sal de diamonio de 2,2'-azino-di(3-etil-benzotiazolina-6-sulfonato)] con H 0 para dar un color verde, y la fosfatasa alcalina, especifica para el p-nitrofenil fosfato para dar un color amarillo. Ambas enzimas son los tipos ms utilizados en los inmunoensayos enzimticos colorimtricos. Un espectrofotmetro se utiliza para medir la densidad ptima del cromgeno resultante. Existen diversos instrumentos posibles que permiten medir la densidad ptica en tubos o placas de microtiter pasando desde un sistema completamente automatizado que hace desde el pipeteo de la muestra hasta la impresin de los resultados, hasta instrumentos manuales ms sencillos. Cuando la reaccin EIA se hace sobre una membrana de nitrocelulosa (mtodo de transferencia Western) u otras membranas, se emplean sustratos que generan tintes insolubles. Un test de embarazo para la hCG en un formato de inmunoensayo que se vende sin receta, a menudo utiliza derivados de la benzidina que reaccionan con la peroxidasa, o derivados del indoxil fosfato que reaccionan con la fosfatasa alcalina para generar precipitados coloreados. El precipitado de color que se acumula en la fase slida por la accin de la enzima puede detectarse a simple vista. Tericamente, la medida de la densidad ptima est limitada por un rango de entre O y 2.0. Asi, la determinacin de la densidad ptica de analitos que requieren un amplio rango puede resultar problemtica, incluso cuando se emplean un exceso de conjugado y fase slida con suficiente capacidad de captura en un ensayo de tipo sandwich.
2 2

Los esfuerzos para mejorar los EIA, un punto clave en el desarrollo de los inmunoensayos no isotpicos, han sacado a la luz diversas desventajas de los RIAs, como son los residuos radiactivos, radilisis de los analitos marcados, y la corta vida media del l. Ishikawa (1989) desarroll un EIA ultrasensible que puede detectar 3 fmoles de una IgG especfica. Para alcanzar este nivel de sensibilidad, se requieren varios pasos tediosos, c o m o la transferencia del inmunocomplejo de una primera fase slida a otra distinta para reducir las seales de fondo.
l25

Inmunoensayo

enzimtico

fluorescente

L-

E N S A Y O de anticuerpo

Figura 35-13. Principios del inmunoensayo enzimtico (EIA) empleando la fase slida: (A) ensayo de sandwich competitivo y (S y C) no compe'itivo.

Los EIA fluorescentes son idnticos a otros EIA excepto en que utilizan sustratos fluorescentes. En un EIA fluorescente, el fluorforo se genera por la reaccin enzimtica. Despus de la excitacin del fluorforo a su longitud de onda de excitacin ptima, se emite luz a una longitud de onda caracterstica. Instrumentos como un fluormetro requieren una fuente de suministro de la luz de excitacin y un fotomultiplicador como detector de la emisin de flores-

CAPTULO

35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

835

AMI'I'I)

AMIM)

Interim diario ( I

ESTADIO SI

Figura 35-14. Adamaniil 1,2-dioxetano tenil fosfato (AMPPD): un sustrato quimioluminiscente para la deteccin de la fosfatasa alcalina (ALP). La eliminacin hidroltica del grupo fosfato por la ALP genera una luminiscencia por intercambio electrnico iniciada qumicamente (CIEFL: chemically initiated electron exchange lummiscence) con la descomposicin del AMPPD mediante la liberacin de dioxetano fenolato (AMPD) rico en electrones. La transferencia de carga del fenolato al anillo de dioxetano tiene lugar mediante la formacin del intermediario de transferencia de carga (CT) y la consiguiente rotura del perxido cclico. Tiene lugar una liberacin de energa con emisin de luz.

cenca. Pueden existir sustancias que emitan fluorescencia ya presentes en la muestra. Estas sustancias aumentaran la seal de fondo, lo cual puede interferir en la sensibilidad del ensayo. As. se debe prestar atencin a la eleccin de sustratos para los EIA para evitar estos factores. Comparado con los EIA colorimtricos, los ensayos fluorescentes generan una intensidad de seal que es al menos de un orden de magnitud mayor.

Inmunoensayo

enzimtico

quimioluminiscente

Los inmunoensayos enzimticos quimioluminiscentes (CL-EIA) emplean sustratos quimioluminiscentes que reaccionan con varias enzimas que se emplean c o m o sonda La reaccin enzimtica quimioluminiscente genera luz. similar a la bioluminiscencia. e implica el uso de sustratos naturales como la luciferin-adenosina trifosfato (ATP). Durante los ltimos 20 aos, se ha prestado mucha atencin a la aplicacin de la quimioluminiscencia en los inmunoensayos. y se ha desarrollado una variedad de sistemas que combinan enzimas y sustratos. Sistemas actuales que emplean derivados del luminol con un potenciador para la peroxidasa. o derivados del dioxetano para la fosfatasa alcalina, consiguen inmunoensayos m u y sensibles. Estos ensayos son efectivos como herramientas en el diagnstico prctico. La reaccin de oxidacin enzimtica de anlogos del luminol se ha utilizado desde hace mucho en los CL-EIA. El empleo de peroxidasa con H,0- es un mtodo frecuente que se puede cambiar por una enzima productora de H.O, como la glucosa oxidasa o la uncasa. El descubrimiento de los potenciadores por parte de Thorpe (1985) para la quimioluminiscencia basada en luminol mejora notablemente la sensibilidad del ensayo. Los potenciadores incluyen derivados del fenol y compuestos aromticos. Por ejemplo, la luminol-peroxidasa con p-iodofenol c o m o potenciador consigue un incremento de la emisin de luz de unas 2.800 veces en una mezcla de reaccin optimizada. Este ensayo puede detectar la TSH a 0.04 mU/iil utilizando suero como muestra. Sin embargo, las reacciones oxidativas. como para el luminol. pueden tener interferencias por mltiples factores que causan un aumento de las seales inespecficas de fondo (ruido). Bronstein (1989a) desarroll un sustrato quimioluminiscente para la fosfatasa alcalina que difiere considerablemente de otros compuestos. Este nuevo sustrato se conoce como AMPPD (disodio 3-(4-metilespiro-[1,2-dioxetano3,2'-triciclo-[3.3.1.1]decano]-4-yl)fenil fosfato), un derivado del dioxetano de adamantilo. No requiere molculas adicionales para la emisin de luz quimioluminiscente, a diferencia del luminol, que requiere compuestos oxidativos externos a las molculas de luminol. AMPPD es una molcula nueva que constituye un sustrato completo porque est compuesta por un grupo adamantilo c o m o estabilizador de toda la molcula, la unin de dioxetano como fuente de energa, el ster de fosfonlo como diana de escisin para la enzima, y un grupo fenilo para la quimioluminiscencia. todos incluidos en una sola molcula. La estructura de la molcula y el proceso de reaccin para la generacin de luz se muestran en la Figura 35-14. La escisin del enlace fosfoestrico del AMPPD por la fosfatasa alcalina desencadena la luminiscencia por

intercambio de electrones iniciado quimicamente (CIEEL: chemically nitiated electrn exchange luminiscence). mediante la liberacin del grupo dioxetano rico en electrones. Una quimioluminiscencia con una longitud de onda mxima de 477 nm se puede detectar desde unos pocos minutos hasta unas cuantas horas, dependiendo de la concentracin de sustrato. El sistema de ensayo de la fosfatasa alcalina con el AMPPD tiene una sensibilidad de menos de 10 ' moles (Bronstein, 1989b. 1991: Kricka. 1991). El CL-EIA utiliza el AMPPD como sustrato para la fosfatasa alcalina, que se usa como sonda enzimtica. El CL-EIA se puede llevar a cabo en un instrumento totalmente automatizado. Este nuevo sustrato hizo posible el desarrollo de sistemas de inmunoensayo quimioluminiscentes extremadamente sensibles. Se usan partculas frricas de 0.3 pm de dimetro c o m o tase slida para acortar el tiempo de mmunorreaccin a unos 30 minutos y para proporcionar una mayor superficie de inmunoabsorcon. L a relacin entre la seal quimioluminiscente y la concentracin de analitos es lineal hasta unos siete rdenes de rango dinmico. La sensibilidad del CL-EIA (Nishizono, 1991) era 10 veces mayor que la de un RA convencional cuando se ensay la AFP; se detect un nivel de 30 pg/ml de AFP en un tiempo de ensayo de 30 minutos. As. los nuevos sistemas de EIA quimioluminiscentes son una definitiva mejora sobre los RA en trminos de sensibilidad, eficiencia temporal y simpleza del proceso y estn ganando en popularidad en el mercado.
2

Inmunoensayos enzimticos homogneos Origen

Existen dos opciones para evitar procesos tediosos en el ensayo. Uno es disear instrumentos totalmente automatizados con acceso a tipos heterogneos de reactivos, y el otro es desarrollar reactivos innovadores que no requieren pasos de lavado complicados, como los que requieren los EIA heterogneos. Las enzimas y sus cofactores son sondas ventajosas en los E I A homogneos porque la actividad enzimtica se puede modular fcilmente cambiando los factores presentes en el microambiente de la reaccin Ag-Ab. Este no es el caso cuando se utiliza el decaimiento de un radioistopo como seal. Actualmente, los EIA homogneos son menos sensibles que sus equivalentes heterogneos. Los EIA heterogneos convencionales tienen una sensibilidad equivalente a la de los RA en muchas aplicaciones, mientras que los EIA homogneos (Nakamura, 1998) mantienen una sensibilidad de uno o dos rdenes de magnitud inferior. Los EIA homogneos pueden necesitar reactivos inmunoqumicos complejos, pero los sistemas de ensayo son rpidos y sencillos, y se pueden adaptar a instrumentos convencionales. H a y varios tipos de EIA homogneos En cada uno de estos ensayos, la interaccin antigeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima o de la sonda acoplada a la enzima en presencia de sustrato. La modulacin de la actividad enzimtica refleja el grado de reaccin inmunoqumica. En la Tabla 35-7 aparece una lista de las caractersticas de los EIA homogneos tpicos. Los EIA homogneos se pueden clasificar en ensayos de unin competitivos o no

836

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

Tabla 35-7 Clasificacin y caractersticas de un inmunoensayo enzimtico homogneo tpico Nombre y tipo de ensayo Competitivo' EMIT SLFIA ARIS Inmunoensayo de canalizacin enzimtica Inmunoensayo de enzima biolmilada y avidina CEDA No competitivo' Inmunoensayo de anticuerpo hbrido Conjugado Antigeno con hsozima. G6PD Antigeno con sustrato Anigeno con grupo prosttico Antigeno con G6PD y hexocinasa Antigeno con avidina Antigeno con fragmentos de p-galaclosidasa Tipo de modulacin Inhibicin alostnca Inhibicin alostnca Inhibicin alostnca Facilitacin mediante proximidad Inhibicin alostrica Inhibicin aloslrica

Anticuerpos hbridos especficos para el Inhibicin alostrica antgeno y el inhibidor Inmunoensayo de unin proximal Anticuerpo con G6PD y hexocinasa Cascada de suslratos por proximidad Anticuerpo con amilasa Inhibicin alostrica EIHIA Anticuerpo con |J-galactosidasa y anticuerpo Electo de cargas Inmunoensayo enzimtico mejorado frente al succinil Anticuerpo con peroxidasa Estabilizacin AEST La negrita indica que el nombre de la enzima est escrito y la enzima descrita en detalle en el texto G6PD-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. De Kasahara Y: Homogeneous enzyme immunoassays En Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA (eds). Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s Washington, DC, American Society lor Microbiology. 1992a. pags. 169-82. con permiso.

competitivos. Los ensayos competitivos generalmente consisten en antigenos sin embargo, la unin de anticuerpos especficos para haptenos a su ligando acoplados a una enzima que funciona como sonda. Sin embargo, en otros for- causa la inhibicin de la actividad enzimtica. Los haptenos libres presentes matos de ensayo, el antgeno (analito) se puede conjugar al sustrato o a un en la muestra o en el estndar liberan esta inhibicin compitiendo por la unin grupo prosttico de la enzima. Por el contrario, los ensayos de unin no coma los anticuerpos. Asi, la actividad enzimtica es proporcional a la concentrapetitivos emplean un conjugado compuesto por un anticuerpo acoplado a una cin de haptenos libres. Como regla general, el anticuerpo inhibe a la enzima enzima. De entre los distintos tipos de mtodos mencionados, se presta espeinduciendo o impidiendo cambios conformacionales necesarios para la activicial atencin a cinco EIA homogneos. dad enzimtica (Rowley, 1975). La excepcin al mecanismo de inhibicin es el ensayo EMIT para la troxina, que emplea la malato deshidrogenasa. En este ensayo, el conjugado de tiroxina-malato deshidrogenasa es inactivo enziInmunoensayo de multiplicacin enzimtica mticamente, pero pasa a una conformacin activa cuando se une al anticuerpo anti-tiroxina (Ullman, 1979). Se cree que la tiroxina conjugada inhibe EMIT, el primer EIA homogneo, fue desarrollado por Rubenstein (1972). la enzima mediante su unin al dominio cataltico, aumentando asi la K "apaEl sistema de EMIT est esquematizado en la Figura 3 5 - 1 5 . En el EMIT, la rente" del sustrato. El anticuerpo reactiva a la enzima sacando a la tiroxina del conjugacin de las enzimas a haptenos no afecta a la actividad enzimtica;

Forma inactiva del compi ej o enzimtico

Enzima

Forma activa del con jugado enzima-analito Figura 35-15. Diagrama del sistema de inmunoensayo por multiplicacin enzimtica (EMIT) La actividad de una enzima que acta c o m o sonda est inhibida por la unin del anticuerpo con el antigeno (analito) conjugado con la enzima. El analito normalmente es un hapteno. Como enzimas se suelen usar la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y la lisozima. En el ensayo, la actividad enzimtica es proporcional a la concentracin de analito. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]; Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA

837

Haz de excitacin
Figura 35-16. Inmunoensayo con el sustrato marcado con una sonda fluorescente (SLFIA: substrate-labeled fluorescent immunoassay). El sustrato, la |>galactosilumbeliferona. se conjuga con el antigeno (analito) y forma un sustrato no fluorescente El sustrato puede ser escindido por la enzima (1 gaiactosidasa para formar un producto fluorescente. Sin embargo, cuando el conjugado sustrato-antigeno reacciona c o n un anticuerpo especifico para el antigeno, no se produce la escisin del complejo con la enzima (J-galactosidasa En este ensayo, la concentracin del antigeno (analito) es directamente proporcional a la medida de la intensidad de lluorescencia. (De N a k a m u r a RM. Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor Ihe 1990s. Washington. DC. American Society tor Microbiology A S M Press, 1992. con permiso.)

dominio cataltico. En el ensayo EMIT, la malato deshidrogenasa y la glucosa6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) han resultado las ms tiles porque tienen menos probabilidad de verse afectadas por componentes del suero. Estos ensayos generalmente miden drogas a concentraciones de miligramos por litro. Sin embargo, el ensayo de la digoxina posee un limite de sensibilidad m u y inferior, en un rango de 0,8 a 2 ug'l.

Inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado

El inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado (SLFIA: substratelabeled tluorescent immunoassay) (Burd. 1977) emplea como conjugado un sustrato fluorognico caracterstico, el umbeliferil (i-galactsido, unido a un antigeno (analito). El producto fluorescente que se produce por la accin de la |Vgalactosidasa es la umbelilerona. La enzima fi-galactosidasa no puede actuar sobre el complejo sustrato-antigeno cuando reacciona con un anticuerpo especifico. El antigeno libre (analito) presente en la muestra compite con el antigeno conjugado con el sustrato para formar el complejo inmunologa) (Fig. 35-16). La concentracin del antigeno en la muestra es proporcional a la intensidad de fluorescencia del producto fluorescente resultante. Se puede emplear el SLFIA para detectar drogas y haptenos, y tambin para protenas c o m o la IgG y la IgM. Una desventaja de este mtodo es que no se utilizan las propiedades de amplificacin de la enzima, y por tanto, el sistema de ensayo tiene una sensibilidad limitada en un rango de concentracin molar de analito de 10"' a 10 .
,c

piten por una cantidad limitada del anticuerpo especfico. En el equilibrio, el nivel de conjugado libre es proporcional a la cantidad de antigeno (analito) presente en la muestra. La apoenzima se combina con la forma libre del conjugado, pero no con la que est unida al anticuerpo, para reactivar la actividad de la glucosa oxidasa de forma proporcional a la cantidad de conjugado libre en la mezcla. La enzima activa se genera en este proceso, y adems, se ha incluido un mecanismo de amplificacin dentro de este ensayo. Se ha utilizado el ARIS para analizar la presencia de leolilma y de IgG (Morris. 1981. 1985). Este ensayo, que emplea el conjugado de FAD. se ha adaptado rpidamente a la medida de protenas de elevado peso molecular (p. ej., tiroglobulma [TBG]) (Schroeder. 1985). y para otros haptenos c o m o la fenitoma o diversas hormonas.

Inmunoensayo homogneo de inhibicin enzimtica

El inmunoensayo homogneo de inhibicin enzimtica (EIHIA). desarrollado por Ashihara (1988), consiste en un anticuerpo conjugado con una enzima y un sustrato insoluole. Este ensayo es el ms apropiado para la determinacin d e antgenos (analitos) grandes. El EIHIA puede ser homogneo porque el complejo inmunolgico del conjugado con un antgeno grande bloquea la reaccin enzimtica con el sustrato slido (Fig. 35-18). La u-amilasa se h a utilizado como sonda enzimtica para la deteccin de ferritna y AFP. La reaccin inmune del analito con el anticuerpo conjugado con enzima puede alcanzar su mximo en unos 10 minutos: asi. el EIHIA basado en un ensayo de unin n o competitiva requiere un tiempo de incubacin menor para alcanzar un nivel de deteccin sensible. Empleando este mtodo, el rango de medida de la femtina en suero es de 10 a 800 ng/ml y para la AFP es de 5 a 200 ng.ml. Se ha utilizado la dextranasa como enzima alternativa (Nishizono, 1988). Tambin se h a aplicado el EIHIA en un formato sobre pelcula seca (Ashihara. 1991). La pelcula seca consiste en tres capas principales, cada una de ellas con una zona de revelado para la reaccin inmunolgica y enzimtica. una zona de barrera, y una zona de revelado de color. Se utiliza un inhibidor especifico de la amilasa h u m a n a presente

Inmunoensayo de reactivacin de la apoenzima

El inmunoensayo de reactivacin de la apoenzima (ARIS) es un ensayo homogneo desabollado por Morris (1981) empleando el grupo prosttico, que consiste en un dinucletido de flavm adenna (FAD), conjugado al antigeno (analito) y la apoenzima glucosa oxidasa. Tal y como se muestra en la Figura 35-17, el antigeno (analito) y una cantidad constante del conjugado analito-FAD. com-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Forma activa Figura 35-17. Inmunoensayo de reactivacin apoenzimtica (ARIS). Se emplea el antigeno unido al dinucletido de tlavin adenina (FAD). La apoenzima es la apoglucosa oxidasa, que requiere FAD c o m o cofactor para su actividad. En el ensayo, la concentracin de antigeno (analito) es proporcional a la actividad enzimtica generada. (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz G A [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.) en suero para prevenir el londo que puede dar el suero. El ensayo para la deteccin de la protena C reactiva del suero (CRP) se completa en 6 minutos, simplemente aplicando la muestra sobre la superficie empleando instrumental qumico seco. Sin embargo, la sensibilidad del sistema sigue siendo inadecuada para su aplicacin en analitos como pueden ser los marcadores tumorales. aplicacin de la tecnologa de ADN recombinante a los inmunoensayos homogneos por Henderson (1986). Microgenics Corp. (Concord, CA) fue capaz de sintetizar una protena de p-galactosidasa dentro de un polipptido de gran tamao (una enzima aceptora [EA]) y de un polipptido pequeo (una enzima donante [ED]). Las EA y las ED se reconstruyen para formar tetrmeros con actividad enzimtica. En el ensayo (Fig. 35-19), un hapteno antgeno (analito) est unido a la ED. y el anticuerpo especfico para ese analito se usa para inhibir el ensamblaje espontneo de la enzima activa. Los antgenos (analitos) presentes en el suero del paciente compiten con los analitos en el conjugado de analito-ED por la unin al anticuerpo, modulando la cantidad de |-galactosidasa activa que se forma. La seal generada por los sustratos de la enzima es

Inmunoensayo mediante clonacin de donadores de enzimas

El inmunoensayo mediante clonacin de donadores de enzimas (CEDA: cloned enzyme donor immunoassay) se consigui por primera vez mediante la

Forma activa

Forma inactiva Figura 35-18. Inmunoensayo homogneo de inhibicin enzimtica (EIHIA). La enzima es la a-amilasa de Bacillus subtilis o la dextranasa de Chaetomium gracile. conjugada con el anticuerpo especfico para un antgeno de alto peso molecular. El antgeno de elevado peso molecular puede ser la ferritina o la a-fetoproteina. La enzima ct-amilasa es inactiva cuando el conjugado enzima-anticuerpo ha reaccionado c o n el antgeno especifico. L a forma activa de la enzima puede reaccionar con un sustrato insoluble. La concentracin de antigeno es directamente proporcional a la actividad enzimtica de la reaccin del ensayo. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: I m m u n o c h e m i c a l Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. A S M Press. 1992, c o n permiso.)

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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Figura 35-19. Inmunoensayo de donadores enzimticos clonados (CEDA). Los aceptores de enzimas se asocian con los donadores de enzimas para formar un tetrmero de p-galactosidasa activa. El anticuerpo inhibe la asociacin del aceptor enzimtico con el conjugado de antigeno-donador enzimtico. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press. 1992, con permiso.)

directamente proporcional a la concentracin de analito presente en el suero del paciente. El ensayo de la digoxina es un ensayo colorimtrico que no requiere pretratamiento ni prediluciones del suero. El sistema de ensayo es apropiado para su uso en analizadores qumicos automatizados.

Resumen
Los EIA pueden aplicarse a todos los sistemas antgeno-anticuerpo, incluyendo aquellos que implican a protenas sricas, hormonas, drogas, otros antgenos y anticuerpos dirigidos frente a patgenos. Los EIA heterogneos que emplean sustratos cromognicos pueden tener una sensibilidad comparable a la de los RA, y han ganado en aceptacin para su aplicacin en varios inmunoensayos. Algunos EIA heterogneos emplean sustratos sofisticados que generan luz quimioluminiscente y pequeas partculas c o m o fase slida, y son lo suficientemente sensibles para detectar menos de 1 pg'ml de analito. Su sensibilidad es, pues, mucho mayor que la de los RA. Adems, la manipulacin del ensayo se encuentra muy simplificada en los instrumentos totalmente automatizados. En comparacin con los EIA heterogneos, los EIA homogneos poseen ciertas limitaciones en cuanto a sensibilidad, rango de aplicacin y su aplicacin en analitos de gran tamao. Adems, la elevada seal de fondo (ruido) y la relativamente baja seal del ensayo son inevitables debido a la eliminacin de los pasos de lavado para separar conjugados unidos de los libres. Los EIA homogneos son ventajosos porque estn basados en un formato sencillo de ensayo y se pueden adaptar a la instrumentacin automtica preexistente. En este momento, los EIA heterogneos con instrumentos totalmente automatizados, siguen siendo la mejor eleccin en cuanto a sensibilidad y simplicidad, y en cuanto a motivos de seguridad, debido a que no requieren el uso de radioistopos.

tisulares. Los ensayos inmunofluorescent.es en secciones tisulares se encuentran ahora muy establecidos en los laboratorios de anatoma patolgica. Durante los ltimos aos, se han desarrollados muchos procedimientos de FIA para detectar concentraciones de drogas, hormonas y una amplia variedad de protenas y polipptidos (Nakamura. 1992a). Al principio de su desarrollo, los FIAs analticos se vieron dificultados por el descenso de la sensibilidad debido a la fluorescencia de fondo presente en las muestras biolgicas. Gradualmente, la sensibilidad de los mtodos fluorimtricos fue mejorando, y se hizo posible la deteccin de analitos a concentraciones de 10 M. Tambin se consiguieron avances gracias a la mejora de la instrumentacin y la introduccin de sustratos nicos con unas reacciones inmunoqumicas y enzimticas ms ptimas.
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La seleccin del fluorocromo que se va a emplear c o m o sonda es importante. La sonda debera ser estable y debera poseer un coeficiente de extincin molar y rendimiento cuntico elevados. Tambin debera emitir en longitudes de onda apropiadas sin interferir con las reacciones del ligando con su anticuerpo. Cuando se irradian la mayora de los fluorforos o molculas fluorescentes con una longitud de onda apropiada, un electrn de la molcula sulre una transicin al estado excitado. A medida que el electrn vuelve a su situacin inicial, se libera energa fsica en forma de un fotn de menor energa (mayor longitud de onda) que el de la luz excitadora. El espectro de fluorescencia muestra una longitud de onda de mxima emisin, caracterstica de un determinado compuesto fluorescente. Una de las sondas tpicas, el isotiocianato de fluorescena (FITC), tiene un intervalo de tiempo inferior a 1 ns entre excitacin y emisin, mientras que otros compuestos (p. ej., el europio) presentan una fluorescencia retardada con un intervalo de varios cientos de nanosegundos. Los diversos FIA se pueden clasificar en: 1) heterogneos y homogneos: 2) de ligando o anticuerpo marcado; 3) competitivos o no competitivos, y 4) de fase slida o no slida. Se discutirn los mtodos ms empleados.

INMUNOENSAYO FLUORESCENTE Inmunoensayo fluorescente heterogneo Origen y clasificacin

Coons (1941) fue el primero en introducir el uso de compuestos fluorescentes como sondas inmunoqumicas para detectar antigenos en secciones Los protocolos de FIA heterogneos incluyen un paso de lavado para separar las sondas fluorescentes unidas de las libres. El procedimiento de este ensayo es similar al de los inmunoensayos enzimticos heterogneos y los

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

radioinmunoensayos. La mayora de los ensayos comerciales disponibles emplean un sistema con el antgeno unido a una lase slida o un anticuerpo. El ensayo puede o no ser competitivo, una propiedad que comparte con los RIAylosEIA.

Mtodo fluoroinmunomtrico
El analito reacciona en solucin con un exceso de anticuerpos marcados. Los anticuerpos marcados residuales se unen al exceso de antgeno unido a una tase slida. La matriz de tase slida se lava y la intensidad de fluorescencia se relaciona inversamente con la concentracin de analito. Este mtodo es adaptable para el ensayo de haptenos y protenas complejas. El FIA en fase slida se desarroll para el anlisis serolgico de anticuerpos trente a la rubola, toxoplasmosis, antgenos vricos y anticuerpos antinucleares. Los mtodos de FIA heterogneos para la determinacin de antigeno se desarrollaron para protenas sricas y hormonas, incluyendo inmunoglobulinas. Cortisol, progesterona y tiroxina. La principal ventaja de los FIA heterogneos es la reduccin significativa de la interferencia de sustancias fluorescentes presentes de forma natural en muestras de pacientes, debido a la eliminacin fsica de los tactores de interferencia en el paso de separacin.

de excitacin de luz polarizada vertical, los compuestos fluorescentes en solucin emiten fluorescencia parcialmente polarizada. El principio de polarizacin de la fluorescencia fue aplicado por primera vez a los procedimientos de inmunoensayo por Dandliker (1970. 1973). La luz polarizada que se transmite a travs de la muestra puede excitar la sonda fluorescente independientemente de su unin al anticuerpo. Sin embargo, como se muestra en la Figura 35-20. el movimiento trmico aleatorio da lugar a que pequeas molculas que contienen un hapteno se muevan libremente en la solucin perdiendo su orientacin polarizada. Cuando el antgeno sondado se une a un anticuerpo con una masa molecular superior a los 160 kDa, el movimiento molecular se reduce lo suficiente como para aumentar la seal polarizada. Estudios que emplean anticuerpos marcados o fragmentos de anticuerpos no detectaron cambios en la polarizacin al mezclar antgeno y anticuerpo marcado, aunque la reaccin inmune hubiese tenido lugar. Este mtodo es el ms til para la medida de antigenos pequeos y haptenos (Jolley, 1981). Abbott Laboratories ha adaptado este enfoque para el ensayo de muchas drogas y frmacos en el TDx (Abbott Diagnostics, Abbott Park. IL). Desarrollaron un analizador de nueva generacin, el IMx. para medir molculas de gran tamao molecular como los marcadores tumorales. hormonas y antgenos relacionados con infecciones o anticuerpos (Fiore. 1988). Combinaron dos principios en el ensayo, la polarizacin de la fluorescencia y el inmunoensayo enzimlico con microparticulas (MEIA). La demanda de capacidades de acceso directo impuls a Abbott a desarrollar un analizador de acceso directo, de alto rendimiento y totalmente automatizado, denominado AxSYM. Este sistema es ampliamente utilizado en laboratorios clnicos (Smith, 1993).

Ensayo inmunofluorimtrico por particin radial

En los mmunoensayos por particin radial, se emplea una cromatografa radial y el ensayo se realiza sobre unos filtros de fibra de vidrio (Giegel. 1982). El procedimiento se ha automatizado para el ensayo de hCG y otros diversos analitos presentes en el suero (Rogers, 1986).

Fluoroinmunoensayo en tiempo real

Esta metodologa hace uso de una instrumentacin especial y de sondas fluorescentes especiales para aumentar la sensibilidad del ensayo. Implica el uso de sondas fluorescentes que presentan una fluorescencia retardada con un perodo de tiempo de unos 100 ns o ms entre la excitacin y la emisin. Debido a que la mayora de las sustancias responsables de la fluorescencia de fondo poseen un periodo de decaimiento corto, la medida de la fluorescencia retardada reduce significativamente los efectos de la fluorescencia de fondo. Esto se consigue con un fluorimetro en tiempo real, un instrumento especial que produce pulsos rpidos de luz que excitan al fluorforo. La fluorescencia se mide un poco despus de la excitacin. As, el efecto del fondo inespecfico, que generalmente decae en menos de 10 ns. puede descartarse (Halonen, 1973: Soini, 1983). Los fluorforos que presentan fluorescencia retardada y que se han empleado en estos ensayos (Soini. 1979) incluyen los siguientes: 1. Derivados pirnicos con un periodo de decaimiento de casi 100 ns. 2 Algunos metales raros quelados que poseen un periodo de decaimiento m u y largo de casi 50 ps a 100 ps. Incluyen el europio (Eu '), samario (Sm ') y terbio (Tb ).
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Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia de excitacin

El mtodo de transferencia de la fluorescencia de excitacin (FETI) (UHman, 1976) emplea dos sondas, la fluorescena como donador de fluorescencia y la rodamina como aceptor. El sotiocianato de fluorescena (FITC) tiene un mximo de emisin de 525 n m y la tetraetilrodamma posee un fuerte pico de absorcin a 525 nm. Asi. cuando el antigeno marcado con FITC y el anticuerpo marcado con rodamina se unen, se produce un apagamiento (quenching) de la lluorescenca del FITC. Este fenmeno implica una transferencia de energa de una sonda electrnicamente excitada a una sonda aceptora. La tasa de transferencia de la energa es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre las molculas donadora y aceptora. Para que se produzca una reduccin apropiada de la fluorescencia con el apagamiento, la distancia entre donador y aceptor debe ser de unos 50 a 70 A. Este mtodo resulta til para el ensayo de antigenos con determinantes antigenicos multivalentes. Porciones separadas de un anticuerpo especifico se marcan con fluorescena y rodamina. La mezcla de anticuerpos marcados con fluorescena y rodamina reduce la intensidad de seal de la fluorescena ajustando la proporcin y la cantidad de donador y aceptor para que puedan reaccionar en proximidad para permitir la transferencia de energa. Estos problemas se han superado empleando nuevos compuestos fluorescentes. Se han conseguido mejoras en el mtodo FETI usando un marcador fluorescente como el criptato trisbipiridnico de europio (III) [Eu ] como donador y un fluorforo como la aloficocianina como aceptor (Alpha. 1987: Malhis. 1995). Estos compuestos transitorios poseen un elevado desplazamiento de Stokes en el que el Eu excitado a 337 nm transfiere energa a travs de una molcula aceptora a una excitacin de 620 nm y finalmente emite luz fluorescente a 665 nm en un formato en tiempo real. Mathis (1993) ha desarrollado la transferencia de energa mediante la resonancia de fluorescencia (FRET) empleando un metal quelante de criptatos y lo ha aplicado a la deteccin de AFP y del antgeno carcinoembrinico (CEA) en el suero. CIS Bio International (Cedox. Francia) desarroll un inmunoensayo homogneo automatizado, KRYPTOR. para la deteccin de marcadores tumorales como el CEA. CA 19-9. CA 125 y AFP empleando la emisin del criptato amplificada en tiempo real (TRACE). La sensibilidad para la AFP era de 0.25 ng.'ml con nueve minutos de incubacin
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Los fluoroinmunoensayos en tiempo real se han desarrollado para medir muchos analitos, incluyendo la hCG, IgG, Cortisol, insulina y otros.

Inmunoensayo fluorescente homogneo

Por definicin, estos inmunoensayos se hacen en muestras homogneas. No requieren la separacin de los conjugados unidos y libres y. normalmente, no son sensibles a las interferencias de fondo de las muestras. Los FIA homogneos tambin poseen la ventaja de ser rpidos Sin embargo, cuando se comparan con los ensayos heterogneos, presentan ciertas desventajas. Los FIA homogneos tienen una sensibilidad limitada de aproximadamente 10 molar con una instrumentacin estndar. Pueden existir impurezas marcadas que aumenten las interferencias de fondo. Los ensayos requieren un antigeno marcado o anticuerpo especifico relativamente puros, y una instrumentacin especial para alcanzar una mayor sensibilidad.
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Ensayo de polarizacin de la fluorescencia

Una lente polarizante o un prisma pueden resolver la luz en rayos de un solo plano. Cuando se observa desde un ngulo recto con respecto al haz

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Baja p o l a r i z a c i n Figura 35-20. Principio del inmunoensayo de lluorescencia polarizada (FPIA). A. en la ausencia de anlgeno, el conjugado marcado con una molcula fluorescente (F) se une al anticuerpo. Debido a su gran tamao molecular de ms de 160 kDa. la rotacin molecular del F unido se ve reducida y se mantiene la polarizacin 8. en la presencia de antgeno. hay menos conjugado unido ai anticuerpo, de m o d o que puede rotar libremente en la solucin, dando lugar a una disminucin de la seal polarizada.

Inmunoensayo de fluorescencia protegida

En este ensayo (Nargessi. 1979). el antgeno proteico se marca con fluorescena y a continuacin se hace reaccionar con un anticuerpo especfico para el antgeno. El anticuerpo especifico inhibir estricamente la reaccin de un segundo anticuerpo especfico para la fluorescena. que funciona absorbiendo la fluorescencia de la fluorescena cuando se une al fluorforo. La habilidad del anticuerpo especfico para la fluorescena de interaccionar con la fluoresceina cuando est unida a la superficie del antigeno se ve disminuida. El procedimiento se puede emplear para el ensayo de concentracin de anticuerpos o de antgenos (analtos) en un sistema homogneo.

tro-CLIA. se pueden aplicar para los ensayos de diagnstico prctico, y sus caractersticas se describen a continuacin

Ensayo quimioluminiscente usando esteres de acridinio como marcadores

En este mtodo (Weeks. 1983). los esteres de acridinio (Fig. 35-21) se conjugan directamente con molculas proteicas. Los esteres de acridinio pueden reaccionar oxidativamente con el H-0 en condiciones alcalinas, para producir intermediarios muy energticos que se descomponen en el fragmento excitado, generando luz. La emisin de luz por parte de los esteres de acridinio es muy rpida, en unos 5 a 10 segundos despus del inicio de la reaccin de oxidacin. La quimioluminiscencia de tipo flash, como se conoce este proceso, posee una relacin entre el espectro de emisin y el tiempo de reaccin con una pendiente mucho ms acusada que la quimioluminiscencia de tipo resplandor generada mediante enzimas. La sensibilidad de este ensayo es mayor que la de un RA, y lleva menos tiempo. La solubilidad de los esteres de acridinio y la estabilidad de los conjugados con protenas durante periodos de almacenaje se han mejorado mediante la modificacin de la molcula y la qumica de la conjugacin. Esta tecnologa probablemente aporte mejoras para los ensayos de algunos haptenos y de hormonas.

INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE Origen

Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean como sonda molculas que generan quimioluminiscencia, como pueden ser derivados del luminol. esteres de acridinio, o derivados del nitrofenil oxalato y tri-bipridil rutenio [Ru(bpy).'i con tripropilamina (TPH) para la electroquimioluminiscenca. Bsicamente, el mtodo del ensayo no difiere del de los inmunoensayos heterogneos. RA y FIA. La generacin de luz por derivados del luminol requiere OH iHfi. como iniciador qumico, o H,0 con la peroxidasa como iniciadores de la quimioluminiscencia potenciada. Los esteres de acridinio estimulados qumicamente con OH H O muestran un rendimiento cuntico quimioluminiscente relativamente elevado comparado con el luminol. Otras molculas quimioluminiscentes incluyen la acuorina. un compuesto natural (Ador. 1998). Las sondas de compuestos quimioluminiscentes producen luz elelroquimicam e n t e en la superficie de electrodos y se pueden aplicar en formatos de ensayo homogneos. Tanto los CLIA que usan esteres de acridinio. como los elec; ;

Inmunoensayo electroquimioluminiscente
El ECLIA emplea compuestos electroqumicos como sondas que generan luz electroqumicamente, asociada al ciclo reactivo de la reaccin de oxidacin-reduccin. Con la optimizacin de las soluciones de reaccin, la seleccin del mtodo de conjugacin apropiado y el desarrollo de compuestos como el Ru(bpy), y el TPA, se hizo posible aplicar la tecnologa quimioluminiscente a los inmunoensayos (Blackburn, 1991).
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Protena Figura 35-21. Mecanismo del inmunoensayo quimioluminiscente con un ster de acridinio basado en la descomposicin oxidativa.

El Ru(bpy), * tiene un sitio de reaccin para la conjugacin de analitos usando un reactivo de activacin como el NHS. El Ru(bpy), -, conjugado con los anticuerpos, se puede aplicar a ensayos de tipo sandwich para molculas grandes. El conjugado genera luz en la superficie de electrodos de oro. El Ru(bpy), - en una fase slida y el TPA se oxidan en la superficie de los electrodos para formar Ru(bpy)/' y TPA ', respectivamente. El TPA-' pierde electrones de forma espontnea. El Ru(bpy) - puede generar una emisin de luz de 620 nm cuando vuelve a Ru(bpy)., - como estado basal a travs de una reduccin con TPA'. La eficacia de generacin de la luz (rendimiento cuntico) depende de la proximidad entre el electrodo y el conjugado, y por tanto, de la difusin del conjugado. Los conjugados libres pueden generar ms luz que los conjugados fijados a una fase slida como resultado de una reaccin inmune. Esto permite un acceso fcil al formato de ensayo homogneo, pero un ruido de fondo relativamente alto interfiere con la sensibilidad del ensayo, al igual que en otros ensayos homogneos. El protocolo de ensayo para la determinacin de analitos es el siguiente: microparticulas magnticas cubiertas de anticuerpo como fase slida se mezclan con la muestra para permitir la reaccin inmune. Despus de lavar para separar los conjugados libres de los unidos, una solucin con la fase slida se introduce en un detector que posee un electrodo para medir la quimioluminiscencia. El limite de deteccin de un ECLIA se ha descrito de 0,2 ng/ml a 0,4 ng/ml para el CEA y de 0,4 ng/ml para la AFP. Este ensayo no requiere instrumentos complicados. Otra ventaja es que el ECLIA requiere menos tiempo para la deteccin de la seal que los FIA y otros CLIA.
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eran de alto rendimiento, sensibles y de acceso directo. Los antgenos asociados con el inicio de una enfermedad infecciosa, citocinas y factores de crecimiento como la calcitonina, existen en concentraciones m u y bajas en el suero, necesitando as un sistema de deteccin m u y sensible para poder medir estos analitos (Nishizono, 1991: Isomura. 1994, 1999). De entre los muchos mtodos, los ensayos quimioluminiscentes y sus enzimas son los sistemas de ensayo ms sensibles capaces de detectar analitos presentes en concentraciones m u y bajas. Los instrumentos totalmente automatizados de los que se dispone ahora son tambin capaces de utilizar inmunoensayos enzimticos fluorescentes. Estos sistemas de ensayo se clasifican en varios grupos basndose en la generacin y deteccin de las seales y el tipo de fase slida. Con respecto a la deteccin de la seal, el AIA1200, 600 (Toso, Tokio. Japn) y el AxSYM (Abbott, Abbott Park, IL) emplean un mtodo de fluorescencia del inmunoensayo enzimtico que usa la fosfatasa alcalina con un sustrato especifico, el 4-metilumbeliferil fosfato. Hay tres tipos de sistemas disponibles para los inmunoensayos enzimticos de quimioluminiscencia. Lumipulse (Fujirebio. Tokio, Japn). Access (Sanofi Diagnostics Pasteur. Caska, MN) y IMMULITE (Diagnostic Products Corp.. Los Angeles, CA) han utilizado un sustrato quimioluiminiscente estable, el fenilfosforiladamantildioxetano, para la fosfatasa alcalina (Nishizono, 1991; Patterson, 1994: Babson, 1991). El ster de acridinio como sonda quimioluminiscente se ha aplicado en el ACS 180 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY). En el ELECSYS 2010 (Roche Diagnostics. Indianapols. IN), se usa el Rufbpy)/' como sonda quimioluminiscente (Erler, 1998).

AUTOMATIZACIN INSTRUMENTAL Y MODULACIN DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO Sistemas de ensayo homogneos

A pesar de que muchos inmunoensayos homogneos se han desarrollado para protocolos manuales descritos en este captulo, la mayora de ellos no han sido automatizados todava. Para el mtodo EMIT, se pueden adaptar analizadores qumicos genricos automatizados (Boyd, 1985). Algunos instrumentos estn disponibles para los inmunoensayos fluorescentes homogneos, pero estos sistemas no son intercambiables entre s. El sistema CIS Bio KRYPTOR se ha desarrollado con caractersticas especiales, incluyendo el uso de un detector de fluorescencia en tiempo real, y usa un mtodo de dos longitudes de onda para la correccin interna del estndar de intensidad de fluorescencia a 620 nm y 665 nm, haciendo posible que se aumente la sensibilidad del lmite de deteccin.

Secuencia prctica del inmunoensayo en el sistema analtico

La demanda de mercado esperaba una instrumentacin capaz de realizar un gran nmero de ensayos con capacidad de acceso directo. Para cumplir estas necesidades, es necesario mejorar los reactivos y evitar el tedio que implican los inmunoensayos heterogneos. Para simplificar el sistema para su posterior aplicacin en un sistema de ensayo totalmente automatizado, se disearon cartuchos individuales de reactivos previamente empaquetados, o reactivos ya dispensados en cubetas de reaccin. Un sistema genrico para los inmunoensayos con sondas heterogneas est esquematizado en la Figura 35-22. El operador selecciona los componentes del ensayo mediante un programa de ordenador y carga los cartuchos de reactivos o las botellas para cada ensayo. Para un analito concreto, los cartuchos y la cubeta de reaccin se introducen de forma automtica en el instrumento. Las muestras se transportan a la posicin apropiada para la dispensacin. El ensayo est diseado para emplear bandejas de reaccin o rotores que automatizan los pasos de mezclado y separacin, que dependen del funcionamiento de la primera y segunda inmunoreaccin, y la reaccin de generacin de la seal. Todos los pasos de la reaccin tienen lugar de forma secuencial en la lnea de reaccin y las seales generadas se miden mediante un detector. Los resultados del ensayo se imprimen en los siguientes 20 a 40 minutos y se envan automticamente a travs de la red al ordenador pertinente. El sistema puede tratar entre 60 y 200 ensayos por hora, procesando de 10 a 20 analitos en cada muestra en este sistema de acceso directo.

Sistemas de inmunoensayo heterogneos

Hasta el principio de los aos 80, la mayora de los inmunoensayos heterogneos se hacian de forma manual. Entonces Boehnger-Mannheim (que se fusion con Roche Diagnostics en 1998) desarroll un analizador de acceso directo totalmente automatizado, el ES-600, basado en los inmunoensayos enzimticos colorimtricos que empleaban la peroxdasa de rbano como enzima (Wu. 1987). Al final de los 80, muchas compaas trataron de desarrollar sistemas de inmunoensayo enzimtico totalmente automatizados, que

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Instrumentacin y puntos clave para un inmunoensayo heterogneo

Aunque el principio del ensayo es bastante similar en muchos instrumentos, pueden existir grandes diferencias entre los instrumentos con respecto al formato de la loma de muestras, control de la temperatura, la separacin BF, el arrastre, flujo de los desechos y dems. Asi. debemos prestar atencin a lo bien que funciona el instrumento despus de su puesta en marcha.

Cubeta de reaccin
En un sistema de inmunoensayo. es muy importante disear las caractersticas de la cubeta con cuidado para obtener datos reproducbles. Los fabricantes emplean estas cubetas para posibilitar un maneto rpido de los reactivos y del acceso directo. Se ha introducido un tipo de cubeta en un solo paso que contiene los reactivos y la unidad de reaccin en el sistema Lumipulse. El sistema Immulite emplea una unidad de reaccin para la separacin B.'F. El

Figura 35-22. Breve diagrama de un sistema de inmunoensayo totalmente automatizado en un laboratorio clinico de automatizacin.

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Tabla 35-8 Nueva generacin de sistemas de inmunoensayo heterogneos AIA-21 (TOSOH) Paquele de reactivos Cubeta de reaccin Principio de la reaccin Sustancia marcada Sustrato enzimtico Detector de la seal Formato del ensayo Pretratamiento Flujo de la reaccin Duracin del ciclo (seg) Duracin de la reaccin (min) Temperatura de la reaccin Numero mximo de analitos Capacidad (ensayos/hora) Fase shda Tiempo del primer resultado (min) Separacin B/F Mtodo de muestreo Aulodilucin de la muestra Liotilizado y empaquetado en porciones Recipiente de reaccin Inmunoensayo enzimtico fluorescente Fosfatasa alcalina 4-metilumbeliterl tosalo Fluorescencia S-1. S-2, competitivo Si Rotatoria 30 10 o 40 min 37C 20 120 Partcula magntica (bcad> 50 Campo magntico Pipeteando la sonda S ACS:CENTAUR ARCHITECT (ABBOTT) (BAYER DIAGNOSTIC) Paquete de reactivos (en solucin) Cubeta desechable Inmunoensayo quimioluminiscente Ester de acndinio Ninguno Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo S Rotalona 15 7 5-36 37"C 30 240 Partcula magntica 8-40 Campo magntico Chip desechable Si Solucin en una botella Cubeta desechable Inmunoensayo quimoluminiscente Ester de acndinio Ninguno Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo S Rotalona 18 29 37"C 25 200 Partcula magntica 30? Campo magntico Sonda fija Si ADVIA IMS (BAYER DIAGNOSTICS) Particulas secas en la cubeta de reaccin Recipiente de reaccin Inmunoensayo quimioluminiscente Fosfatasa alcalina? Foslato de dioxelano? Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo ? Rotatoria 36 20 37"C 36 100 Partcula magntica
?

Campo magntico Pipeteando la sonda (tcnica del aceite) Si

AxSYM (Abbott Laboratories) emplea otra unidad de reaccin nica que consiste en pocilios para el reactivo, la incubacin y para la muestra dentro de una misma cubeta. El programa combina el contenido de esta cubeta en una unidad rnatricial. Esta ltima puede emplearse para captar la fase slida de ltex, seguida de una separacin B'F y de una segunda reaccin inmune de anticuerpo marcado con la fase slida.

Tipo de toma de muestra y dispensacin de fluido

En general, el sistema por el que se dispensan los fluidos puede ser de dos tipos diferentes, un chip desechable o una punta fija. La contaminacin entrecruzada de muestras debe evitarse en todos los sistemas de ensayo. Con el chip desechable se pueden prevenir por completo estas contaminaciones. En el caso del sistema con punta fija, aunque la muestra original se divida en varias alcuotas pequeas, la contaminacin entrecruzada sigue ocurriendo. As, el sistema del chip desechable es la mejor forma de evitar la contaminacin y de minimizar los desechos biopeligrosos. Por otro lado, el coste de emplear estos chips para el ensayo es superior al del sistema de punta fija. Tambin deben tomarse en consideracin las consecuencias medioambientales de los chips desechables.

fase slida. Los sistemas I M x y AxSYM emplean micropartculas de ltex como fase slida y emplean una membrana porosa para atrapar el ltex para la separacin de particulas de la fase slida de la lquida. Diagnostics Product Corp.. Los Angeles. CA ha desarrollado una unidad para los sistemas de separacin B/F, en la que la solucin de reaccin sale de una unidad interior a una exterior de desechos, mientras que la fase unida permanece en un lecho de fase slida (0,5 cm). Una ventaja de estos formatos, es que evitan la contaminacin entrecruzada y el arrastre de una mezcla de reaccin a la siguiente, y no requieren un proceso excesivo de lavado. Todos los dems sistemas emplean particulas magnticas (magnette partiles y magnelic beads) en las que se puede conseguir una separacin rpida y fcil, mediante la aplicacin de un campo magntico.

Nuevos sistemas para la prxima generacin (sistemas modulares)

La Tabla 35-8 compara varios sistemas de inmunoensayo de alto rendimiento comercial que se han introducido en los ltimos aos. Muestra las especificaciones instrumentales de cada analizador. Reduciendo los tiempos de incubacin y de reaccin, se puede obtener un resultado rpido en unos 1 0 a 25 minutos. As, es posible una mquina de alto rendimiento que realiza de 120 a 200 ensayos por hora. Adems, varios fabricantes han demostrado un nuevo concepto de sistema, que alinea los distintos sistemas analticos que se necesitan en un laboratorio clnico. Muchos laboratorios clnicos han introducido un sistema de transporte de muestras que se conecta con distintos instrumentos analticos controlados de forma independiente. Sin embargo, algunos analizadores no son aplicables a este sistema porque la velocidad del instrumento o la duracin de su ciclo no se puede armonizar fcilmente con el resto de software y hardware. Para solucionar estos problemas. ARCHITECT (Abbott Laboratories) es un ejemplo de una mquina de nuevo concepto, en el que un sistema de ordenadores puede controlar varios analizadores de inmunoensayo conectados a un analizador qumico. El ADVIA IMS. basado en un concepto similar, ha sido introducido por Bayer Diagnostics (Tarrytown. NY), que puede realizar qumica clnica e inmunoensayos en una misma plataforma. Hay otras combinaciones basadas en este concepto todava en desarrollo, que harn posible la simplificacin del laboratorio clnico a un coste final inferior.

Arrastre
El arrastre de una muestra a la siguiente de un analito a una concentracin extremadamente alta, puede a veces dar lugar a diagnsticos clnicos errneos. Un tubo de plstico desechable para la muestra es la forma ms sencilla de evitar este problema. Por el contrario, el sistema de punta fija tiene varias ventajas econmicas c o m o se ha mencionado antes. Asi, la mayora de las tcnicas que conciernen a la ingeniera de las muestras se han concentrado en minimizar el arrastre de la muestra mediante pasos de lavado y mantenimiento de la punta. Ahora, hay varias puntas fijas que permiten limitar el arrastre a menos de un orden de 10'. Incluso con un arrastre tan bajo, algunas muestras todava crean problemas (p, ej., una muestra fuertemente positiva para un antgeno de superficie de la Hepatitis B [HBsAg]. seguida de una muestra negativa). En este caso, se puede emplear un sistema de software para comprobar dicho resultado, mediante un reanlisis automtico de los valores positivos semanales que han seguido a resultados fuertemente positivos.

Separacin B/F y sistemas de lavado

En un inmunoensayo heterogneo, el conjugado unido debe separarse de la sonda libre. Esta separacin B'F depende de las caractersticas de la

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SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RPIDOS PARA SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIN AL PACIENTE Origen
Una fuerte demanda para un ensayo que pueda realizarse en casa (p. ej., hCG para el diagnstico del embarazo) ha simplificado el formato de los inmunoensayos: el ensayo debe ser sencillo, rpido y reproducible. Teniendo en cuenta estas metas, se han desarrollado muchos ensayos de hCG y esto h a dado como resultado una primera generacin de formato de ensayo de inmunoensayo enzimtico de flujo.

Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de ensayo por inmunofiltracin)

La Figura 35-23 ilustra esquemticamente un instrumento tpico de inmunoensayo de flujo, el ICON hCG (Hybritech Incorporated, San Diego. CA), que consiste en una membrana porosa con anticuerpo anti-hCG inmovilizado y un parche absorbente bajo la membrana (Valkirs. 1985). El principio del ensayo y el procedimiento se describen a continuacin. Varias gotas de la muestra de orina se aplican sobre la membrana. La orina es absorbida por el parche y entonces se aade el tampn de lavado por goteo y a continuacin una solucin con un anticuerpo anti-hCG conjugado con la loslatasa alcalina.

Tiras reactivas
Tambin se h a desarrollado un formato en tiras reactivas que reduce el coste de los materiales en comparacin con el formato del ensayo de flujo En este formato, la tira del ensayo contiene un rea con un punteado de anticuerpo en la punta de la tira. El ensayo puede llevarse a cabo de la siguiente manera: 1) se introduce la tira en un recipiente que contiene la muestra; 2) se introduce la tira en un recipiente de lavado: 3) a continuacin se introduce la tira en una solucin de marcado: y 4) finalmente se introduce la tira en un revelador de color si es necesario.

La inmunocromatografa consiste en la separacin B. F y generacin de la seal simultneas, seguidas de un flujo lateral sobre un material poroso, como una membrana de nitrocelulosa o una lmina de libra de vidrio. A travs de la accin capilar de la membrana, el analito de la muestra puede migrar del extremo proximal al distal. donde existe un parche absorbente para mantener una velocidad de flujo capilar constante. La zona de carga de muestra, la de mareaje y la de deteccin se encuentran entre los dos extremos. El mtodo inmunocromatogrfico se clasifica en varios formatos. La Figura 35-24 muestra los formatos inmunocromatogrficos tpicos El extremo proximal se usa como puerto de carga de la muestra, y est conectado a un parche que contiene el antigeno o anticuerpo marcado, debajo del cual hay una membrana de nitrocelulosa en contacto con el parche que funciona como una zona de deteccin. El extremo distal de la membrana se encuentra unido a un parche absorbente que funciona como una fuente de fuerza capilar. La muestra, cargada por goteo, reconstituye el anticuerpo o antigeno conjugado con un coloide de oro o ltex coloreado, que forma un inmunocomplejo con el analito que se detecta, y este complejo migra a la zona de deteccin. El anticuerpo o el antigeno inmovilizado en la zona de deteccin puede captar el complejo y formar una linea roja o azul positiva. El exceso de sustancia de mareaje migra hasta el parche absorbente. La fase mvil en una migracin es la propia muestra. Muestras muy coloreadas debido a una elevada concentracin de bihrrubina o hemoglobina, por tanto, pueden interferir en la lectura de los resultados a simple vista. En este formato, la seal que debe detectarse se produce en la zona de deteccin con una zona donde se concentran partculas coloreadas. Yamauchi y sus colaboradores (1997) han establecido un nuevo formato en plataforma en el que se puede llevar a cabo el EIA de forma automtica, incluyendo un paso de lavado. El instrumento aparece de forma esquemtica en la Figura 35-25. En este formato, la posicin de cada una de las zonas es completamente diferente a la del resto de las mmunocromalografas mencionadas anteriormente. El extremo proximal tiene una solucin de revelado, que hace posible que se lleve a cabo el proceso de lavado espontneamente mediante el flujo capilar. La muestra se aplica sobre un parche que est en el centro del instrumento y contiene un conjugado marcado seco. El extremo distal se conecta a un parche absorbente. Se aaden dos gotas de la muestra al parche para que reaccione con el conjugado despus de su reconstitucin. La mezcla de reaccin que contiene el inmunocomplejo formado por el analito y el anticuerpo marcado puede extenderse a ambos extremos. Cuando se abre el recipiente que contiene la solucin de revelado, el sustrato deshidratado se reconstituye y pasa a ser el sustrato de la enzima soluble en la zona de deteccin. En este momento, el flujo se dirige hacia el extremo distal. Los componentes del suero y el exceso de conjugado que no ha reaccionado se lavarn hacia el parche absorbente. Si la muestra contiene el analito, el anticuerpo inmovilizado captura el complejo en la zona de deteccin para formar una linea coloreada. Este mtodo presenta algunas ventajas que difieren de otros instrumentos inmunocromatogrficos que se revelan con la muestra. En estos instrumentos, un suero hemolitico o lipmico puede interferir en la evaluacin del resultado del ensayo a simple vista debido a un elevado color de fondo. Sin embargo, el tipo de instrumento anterior con un reservorio conectado puede no tener interferencias de estos componentes coloreados. Este instrumento ha sido til en la deteccin de HBsAg. anticuerpos anti-HB (Yamauchi. 1997) y anticuerpos frente a T. pallidum (Hasegawa, 1995). La mayora de los componentes, como la membrana, el parche absorbente y el compartimento para la muestra tienen su sitio dentro de un molde de plstico.

Instrumentos inmunocromatogrficos
Con el fin de eliminar pasos de adicin de reactivos en estos dos formatos, se han conseguido importantes mejoras empleando tcnicas inmunocromatogrficas. que han dado lugar a un inmunoensayo simple y rpido.

Membrana de nylon

Resumen
Los instrumentos de inmunoensayo rpidos y sencillos se resumen en la Tabla 35-9. Estos instrumentos se pueden clasificar en tres tipos principales (de flujo, Figura 35-23. Inmunoensayo de flujo, Seccin transversal de un Hybritech ICN de impregnacin o tiras reactivas y de inmunocromatografia) y combinaciones y vista superior del instrumento. Los anticuerpos de captacin se encuentran inmovilizados en el centro de una m e m b r a n a de nylon que posee un parche absorben- de estos tres formatos. La mayora de los instrumentos inmunocromatogrficos te para absorber el fluido de la muestra que no ha reaccionado, el conjugado mar- emplean conjugados marcados directamente, coloides de metal o ltex coloreado. Estos tipos de formato resultan apropiados para la migracin del inmunoc a d o y el tampn de lavado. El ensayo puede llevarse a cabo de forma secuencial. complejo, junto con la migracin de la solucin de muestra. Sin embargo, muparecido a un inmunoensayo enzimtico en dos pasos.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 35-24. Tira reactiva para un ensayo inmunocromatogrfico tpico mediante adicin de la muestra. El desarrollo del ensayo se muestra en la parte inferior de esta ligura. Generalmente, el extremo proximal funciona c o m o porcin de carga de la muestra y consiste en un parche que contiene el anticuerpo o antgeno marcado con ltex coloreado o coloides de oro. El analto de la muestra forma un complejo con el conjugado y migra a la zona de deteccin, inmovilizando asi el anticuerpo de captura para forma una linea coloreada positiva. El conjugado y la muestra sobrante migran al extremo distal de la tira.

chos de estos instrumentos requieren un gran volumen de muestra, de 100 iil a 200 ul. Por otra parte, aunque se necesita revelador, el instrumento de tipo EIA permite que el ensayo se desarrolle empleando una menor cantidad de muestra, 25 ul. La corriente actual de ensayos rpidos para POCT se orienta hacia ensa-

yos que emplean instrumentos de inmunocromatografa porque una persona con prctica, como puede ser un usuario en su propia casa o una enfermera, puede realizar el ensayo correctamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a diferencia de otros instrumentos de inmunoensayo (Kasahara, 1997).

Figura 35-25. Instrumento inmunocromatogrfico que emplea EIA. Se aplica un mtodo de amplificacin sensible a la inmunocromatografa empleando una enzima. La muestra se aade en la zona de carga de la muestra en el centro de la tira. En este mtodo, se emplea una solucin de revelado como fase mvil, que puede servir como tampn de lavado. El dibujo de la derecha de la figura muestra una carcasa de plstico y los resultados de un ensayo para anticuerpos TP.

Tabla 3 5 - 9 Especificaciones sencillas y rpidas para los instrumentos de inmunoensayo Principio del ensayo Nombre del kit ... . (analito) _. Tipo de muestra Volumen de muestra (ul) 5C 150-200 Fase mvil Tiempo de reaccin (min) 5 15 5 3 5-10 5-15 15 5-10 15-20 5-20 -15 15 Sensiblilidad Alojamiento Fabricante

Formato inmunocromatogrfico Un paso Helisal One Step (Helicobacter pylori) (todo en uno) Biocard Troponin I test Clearview hCG II QuickVue One-Step hCG CARD-I-KIT Troponin I TROPT Troponin T Determine HBsAg BioSign Tumor HBs Insta test EASY-SURE HBsAg
Toot

Sangre Suero Orina Orina Suero Sangre Sangre/suero Sangre/suero Sangre/suero Suero Sangre Sangre

Plasma Suero Orina Orina Suero Plasma Plasma/suero Revelador Plasma/suero Suero Revelador Plasma

Igual que ELISA 0.1 ng/ml 25 mlU/ml 25 mlU/ml 0,1 ng/ml 0.1 ng/ml 1 ng/ml?

MP"' MP MP MP MP MP TS' 'IF MF TC' MP MP

1

?
3 gotas (75?) 4 gotas (100?) 150 50 50 200 100-150 1 gota colgante

Cortecs Diagnostics Ltd. ANI Biotech oy Unipath Limited QU1DEL AboaTech Ltd. Roche Diagnostics' Abbott Princeton BioMeditech Corp. Morningstar Diagnostics West Wind Plus, Inc. Craig Medical Distribution. Inc. Biosite Diagnosticst

0.5 ng/ml 1 ng/ml >4 ng/ml

PSA RapidScreen Test Triage Cardiac (Myoglobin CK-MB Troponin-I) AMRAD ICT Hepatitis B Espline HBs-Ag TestPack PLUS hcG EASY-SURE HIV 1/2

Sangre/suero Plasma/suero Suero/orina Plasma/suero

?
25 25 40

Sangre/suero Revelador Suero/orina Revelador

5-15 15 5 10

2 ng/ml 0.5 ng/ml 50 mlU/ml

ccMP MP CC

Dos pasos

Amrad Corporation Ltd. Fujirebio Inc. Abbott West Wind Plus. Inc.

Mtodo inmunocromatogrfico de tiras reactivas AimStick PBD Orina

Volumen de la inmersin
22

Orina

20 mlU/ml

Craig Medical Distribution Dainabot Hybritech, Inc. Nyco Diagnostic Morningstar Diagnostic Orgenics

Dainascreen HBsAg Formato de flujo ICON-II hCG NycoCard CRP Chagas dobule-spot test Combinacin de inmunocromatografia y flujo DoubleCheck HBsAg

Plasma/suero Suero Plasma de sangre completa Suero/plasma

Plasma/suero + solucin del conjugado Tampn, etc. Tampn, etc.

15

3,1 ng/ml

rs
TC MP

50 1 gota

2 10

10 ug/'ml 1

Suero/plasma

Tampn. etc.

15

2 ng/ml

MP

MP = reprsense moldes de plstico (moling plstic): TS = representa tiras reactivas {test strip): TC = representa una tapeta de reaccin ((es cara). CC = epresenta un tariete'o (cara case) Datos de T o w t (1995) t Datos de Bruni (1999)

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BIBLIOGRAFIA

SECCIN V

INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOLOGIA

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CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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Examen de laboratorio del sistema inmune celular

Helene M.A. Paxton, M.S., MT(ASCP) Susana Cunningham-Rundles, Ph.D. Maurice R.G. O'Gorman, M.Sc, Ph. D., D(ABMLI)
CRITERIOS CLNICOS PARA LA EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA LA INTERPRETACIN Decisin de analizar Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria Significado clnico de las pruebas de inmunodeficiencia Efecto de la edad en la respuesta inmune Malnutricin y respuesta inmune Cncer APROXIMACIN METODOLGICA A LAS PRUEBAS DE INMUNIDAD CELULAR 853 Fases de estudio: fase de exploracin Fases de estudio: fase de confirmacin Fases de estudio: estudios analticos de la inmunidad PROLIFERACIN LINFOCTICA COMO MTODO IN VITRO DE EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR Inmunologa celular Metodologa: determinacin de la activacin y la proliferacin linfoctica en la evaluacin de la inmunodeficiencia celular El conocimiento dei sistema inmune se ha mejorado enormemente gracias a la deteccin de determinadas anomalas en pacientes con sospecha de dficit inmunitario. Estos avances han surgido de estudios de la diferenciacin y funcin de las clulas inmunes normales, de la delecin experimental de genes, y de anlisis detallados de sndromes de inmunodeficiencia humanos. Los nuevos abordajes experimentales han ayudado a dilucidar los mecanismos y las bases funcionales de la desregulacin inmune en pacientes con mutaciones genticas primarias (congnitas) del sistema inmune o de infecciones congnitas secundarias (adquiridas). Por ello, en general, las deficiencias inmunes no se pueden distinguir por la presentacin clnica de las infecciones: la informacin gentica est convirtindose en un importante componente para las pruebas e interpretacin diagnstica. La misin de la inmunologa clnica de laboratorio es transformar las nuevas lneas de investigacin en pruebas altamente estandarizadas y clnicamente relevantes para cada paciente en concreto. Los estudios del sistema inmune celular humano se han centrado principalmente en tres reas: 1) deficiencia inmune primaria, que muestra el impacto de los defectos congnitos inmunes sobre la defensa del husped; 2) enfermedades autoinmunes, donde es indudable el efecto de una actividad inmune excesiva o inapropiada; y 3) deficiencias inmunolgicas adquiridas, en las cuales la infeccin daa directamente el sistema inmune, como en la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Adems, los defectos inmunes celulares de enfermedades con caractersticas de mala funcin inmunolgica, como las infecciones crnicas, el cncer, la malnutricin o las lesiones traumticas, proporcionan informacin esencial en la defensa del husped mediada por la inmunidad. El concepto general de inmunidad" a menudo se ha confundido con el de inmunidad humoral; esto es. la presencia de anticuerpos potencialmente protectores frente a un agente infeccioso introducido por una infeccin natural o por una inmunizacin. Debido a que la inmunologa, como actualmente se utiliza en un laboratorio clnico, es una ciencia relativamente nueva (Moulin. 1989,1991), se ha tomado la epidemia del VIH para demostrar el impacto real de este poderosa y cambiante rama del sistema inmune. A diferencia de la inmunidad humoral, la funcin inmune celular es fundamentalmente compleja y difcil de medir. Las pruebas de inmunidad humoral bsicas miden la produccin de anticuerpos especficos elaborados en cierto momento c o m o respuesta a una infeccin por un virus o microbio especfico; en contraste, los anlisis de la inmunidad celular miden las respuestas actuales. En la historia de los esfuerzos para diagnosticar las alteraciones inmunes primarias, como las deficiencias de los complejos principales de histocompatibilidad (MHC) clase I y II, o el sndrome del linfocito desnudo (BLS) (Tourame. 1979; Villard. 1997; Peijnenburg. 1999), se ha demostrado la importancia de la evaluacin estandarizada en el laboratorio clnico de las deficiencias inmunes. El descubrimiento y el estudio de nios con trastornos relativamente raros pero m u y importantes, como el dficit de adhesin leucocitario (LAD) (Springer. 1984: Etizoni, 1994) han llevado a desarrollar procedimientos metodolgicos, a medida que se iba demostrando en estudios recientes cmo se presentan estos defectos de adhesin (Phillips. 1995; Marquardt, 1999). Nuevos estudios desde la identificacin de la enfermedad granulomatosa crnica (CGD) (Barnes, 1970), muestran que este es un grupo de enfermedades heterogneas con alteracin en la actividad de la cadena respiratoria fagoci855 RECEPCIN Y ANLISIS Inmunofenotipificacin: aplicacin a las muestras de rutina y leucmicas Anlisis del ADN Citometra de flujo cuantitativa: mediciones de intensidad de fluorescencia CONTROL DE CALIDAD Y GARANTA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO CELULAR BIBLIOGRAFA 865 FUNCIN GRANULOCITICA EN LA INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS 851 METODOLOGA: CITOMETRIA DE FLUJO Y DE IMAGEN Hardware y otras herramientas

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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

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tica. Los estudios de citometria de flujo introducidos por O'Gorman (1993) han sido tiles en la identificacin del fenotipo de las familias (Atkinson, 1997). Actualmente, los pacientes con estos trastornos inmunitarios congnitos pueden ser candidatos al transplante (Godthelp. 1999; Stary, 1996; Leung, 1999) o, en el futuro, a la terapia gnica (Malech, 1999). Como la mayora de los linfocitos en sangre perifrica son clulas en reposo, la reaccin inmune celular debe reproducirse o generarse en el sistema de anlisis. El sistema debe ser capaz de provocar la respuesta, mantener la reaccin proporcionando todos los elementos disponibles in vivo asi c o m o de conseguir un punto final medible. El campo de la inmunologa clnica cambi radicalmente durante los aos 80, debido al impacto de los importantes esfuerzos de investigacin, incluyendo el uso de anticuerpos monoclonales para identificar clulas inmunes, el descubrimiento de la regulacin de las citocinas de la respuesta inmune, y sobre todo por la tremenda necesidad de comprender y controlar la aparicin epidmica del VIH. La aparicin del VIH ocurri casi de forma paralela a la posibilidad de identificar las clulas T CD4+. Los primeros anlisis de la inmunodeficienca funcional celular en el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) estaban basados inicialmente en el anlisis de la respuesta prolilerativa de los linfocitos (Siegal, 1981; Masur, 1981) y, desde entonces, han evolucionado en abordajes funcionales (Perfetto, 1997; Rosenberg, 1977; Zhou. 1998). En este capitulo se presentan las pruebas inmunolgicas celulares actuales a la luz de tendencias futuras. La evaluacin de la inmunidad celular est cambiando desde los anlisis simples y puntos finales fijos hacia un anlisis integrado de la funcin celular en varios niveles que reflejen las interacciones celulares como un proceso dinmico.

teriormente. esto puede hacer pasar por alto el diagnstico de una enfermedad inmune primaria. Los cambios inmunolgicos pueden acompaar a muchas entidades clnicas incluyendo los tumores malignos y el tratamiento de la hemofilia, de neoplasias, de enfermedades hematolgicas como la anemia de Fanconi, la hemofilia, la trombocitopenia inmune, los trastornos linfoproliferativos c o m o la histiocitosis, y las hemoglobinopatas como la anemia de clulas falciformes. la talasemia, adems de un amplio grupo de anomalas cromosmicas c o m o el sndrome de DiGeorge. el sndrome de Down, el sndrome de Bloom, la disqueratosis congenita de William, la epidermlisis ampollosa, y el sndrome de Duncan (trastorno linfoproliferativo ligado al cromosoma X). Las enfermedades autoinmunes como las enfermedades reumticas, la enfermedad mixta del tejido conectivo, la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistmico, la esclerosis lateral amiotrfica, la esclerosis mltiple y la miastenia gravis pueden asociarse con cambios inmunes celulares y se tratan ms adelante en los Captulos 43 y 45.

Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria

Las caractersticas principales de la inmunodeficiencia primaria, o inmunodeficiencia supuestamente adquirida por infeccin con VIH. debe distinguirse de los cambios inmunes asociados a otras condiciones clnicas descritas. Incluso a menudo las lesiones traumticas como las quemaduras o los accidentes que originan una gran prdida de sangre o un dao visceral producen un periodo de vulnerabilidad a las infecciones. Adems, otras situaciones como las enfermedades premalignas o las infecciones subyacentes no diagnosticadas pueden producir cambios inmunes que pueden parecer fenotipicamente idnticos a la inmunodeficiencia primaria. Mientras que la infeccin por el VIH puede diagnosticarse rpidamente mediante una determinacin directa, el laboratorio de inmunologa clnica se emplea frecuentemente como un campo de pruebas antes de obtener del paciente o del tutor legal el consentimiento informado para el anlisis del VIH. Esto se basa en la observacin de que entre los adultos VIH-positivos. casi siempre se observa un cociente CD4/CD8 invertido. Por lo tanto, c o m o resultado de la epidemia actual de sida, el cociente CD4'CD8 invertido ha llegado a considerarse como un marcador de la infeccin por el VIH. Sin embargo, hay un cierto nmero de enfermedades que afectan al sistema inmune que pueden producir un cociente CD4,'CD8 invertido o un nmero de clulas CD4 tan extremadamente bajo como el VIH. stas incluyen, aunque no slo estn limitadas a estos, al sndrome de DiGeorge, el timoma benigno, el comienzo de la infeccin por el virus de la hepatitis C (VHC), la enfermedad de Kawasaki, la malnutricin calrico-proteica y las neoplasias. En la Tabla 36-2 se muestran algunos ejemplos de inversin del cociente CD4'CD8 no relacionados con el VIH y con un nmero bajo de CD4. El lactante del caso n." 3 presentaba mltiples abscesos spticos del tracto gastrointestinal (Gl) y se crea que tena un trastorno de la inmunodeficiencia primaria. Sin embargo, esta evaluacin se hizo despus de un episodio de casi ahogamiento en una baera en la que se encontraron indicios de un destapacaos. Las lesiones del tracto Gl por custicos produjeron lesiones mltiples e inusuales y un desequilibrio del conjunto de linfocitos T perifricos. El desequilibrio del conjunto de linfocitos T perifricos, pero no el dao del tracto Gl. se resolvi rpidamente. Esle caso tambin muestra la necesidad de llevar a cabo una prueba de confirmacin tan pronto como sea posible cuando el paciente est estable. Los trastornos de la inmunidad primaria casi siempre se presentan en el contexto de una infeccin o de cambios hematolgicos. Los trastornos p o r inmunodeficiencia se tratan con detalle en el Captulo 42. La evaluacin de laboratorio a menudo requiere de una valoracin por etapas, no solo para minimizar la extraccin de sangre, sino para elegir adecuadamente entre las pruebas disponibles con vistas a un diagnstico diferencial. Puede parecer que determinados diagnsticos de presuncin se sospechan con demasiada frecuencia, por ejemplo, el sndrome de Wiskott-Aldrich, aunque ste necesita descartarse en casos de trombocitopenia inexplicada. Sin embargo, un sndrome de Wiskott-Aldrich puede pasarse por alto si slo se valora la respuesta a mitgenos en lugar de la respuesta frente a antgenos. y con el tiempo el defecto inmune puede llegar a ser ms importante, de forma que sean necesarias pruebas de seguimiento.

CRITERIOS CLNICOS PARA LA EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA LA INTERPRETACIN Decisin de analizar
Aunque en teora la interpretacin de las pruebas inmunolgicas comprende desde el abordaje diferencial minucioso hasta el cribado, en trminos prcticos, la respuesta inmune del paciente se estudia en el contexto de la presentacin clnica. Sin embargo, como las pruebas inmunolgicas pueden ser caras y lentas, la eleccin de la prueba a menudo depende de la sospecha clnica. C o m o hay pocas pruebas de la inmunidad celular, si es que existe alguna, que sean total y especficamente diagnsticas, la interpretacin debera realizarse con precaucin. La responsabilidad del laboratorio de inmunologa clnica es establecer un nmero suficiente de pruebas, realizarlas de forma sensata para conocer la naturaleza y la extensin de la alteracin inmune y considerar un rango de posibles causas cuando se realice su interpretacin. Normalmente, la decisin de analizar la respuesta inmune en un paciente surge por una de las razones descritas en la Tabla 36-1. El aumento o la inexplicable susceptibilidad a la infeccin, el aumento de la gravedad de infecciones habituales, o la reaccin inusual a la inmunizacin son motivos para realizar una valoracin inmune. Las infecciones inusuales, especialmente por agentes oportunistas o las infecciones graves que no responden al tratamiento, y ciertos estados alrgicos o atpicos tambin pueden requerir un anlisis inmunolgico. En estos ltimos aos, la posibilidad de la infeccin por el VIH ha reemplazado a la posible deficiencia inmune primaria como principal diagnstico de presuncin. Sin embargo, como se tratar pos-

Tabla 36-1 Presentacin de una posible inmunodeficiencia Infecciones bacterianas frecuentes Reaccin sistmica a virus inusualmente grave Desarrollo de la infeccin debida a un organismo inusual como hongos o protozoos Reaccin sistmica despus de la vacunacin con virus vivos Historia familiar de infecciones recurrentes Exposicin al virus de la inmunodeficiencia humana

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 36-2 Cociente invertido CD4/CD8 y CD4 bajo en inmunodeficiencia no VIH Conjunto de linfocitos Caso estudio 1. Inicial 2. Inicial 3. Inicial 1 semana 4. Inicial 3 anos 5. Inicial a los 5 meses 6. Inicial al ao 7. Inicial 8. Inicial 9. Inicial 10. Inicial al da Edad 3 aos 6 aos 3 meses %CD3 56 73 29 43 89 93 83 76 36 51 0 64 65 72 %CD4 26 18 15 25 62 36 51 18 25 42 0 20 26 1 8 45 %CD8 29
L'-

ABS # 209 330 762 2.846 B74 272 2.734 96 304 2.794 0 No hay dalos No hay datos No hay datos No hay datos

Diagnstico Deficiencia idiopatica de CD4 Disqueratosis Inmunodeficiencia congnita R/0 Lesin caustica gastrointestinal Aplasia de glbulos rojos Sndrome de Noonan Sindrome de Williams Sindrome de DiGeorge Talasemia Neutropenia inmune Melanoma uveal Posthipertermia

6 aos 3 meses 4 meses 1 semana 12 aos 8 aos 50 aos

IO 15 32 57 31 48 7 12 24 33 47 51 35

ABS * = Numera absoluto de linfocitos T CD4.

Significado clnico de las pruebas de inmunodeficiencia

Un tema al que a menudo se enfrenta el director del laboratorio clnico es cmo evaluar el significado clnico potencial de la respuesta inmune alterada in vitro. Los estudios de trastornos relativamente bien definidos han demostrado que hay muchas diferencias significativas en el impacto clnico. Sin embargo, el uso de nuevas estrategias de pruebas puede ayudar en la clasificacin de los pacientes segn el nivel y extensin del defecto. Por ejemplo, los estudios del sndrome de DiGeorge (DiGeorge, 1974), clsicamente una trada de aplasia tmica y paratiroidea y defectos conotruncales. mostraban que existan diferencias importantes en la gravedad de las infecciones que se asociaban con hallazgos relativamente similares de reduccin del nmero de linfocitos T maduros y una pobre respuesta a mitgenos originada por la hipoplasia tmica. Inicialmente. se observ un alto grado de muertes asociadas a este sndrome, pero con las nuevas tcnicas quirrgicas y mtodos anestsicos, se ha visto que un nmero significativo de nios parecen desarrollarse normalmente sin infecciones graves (Bastan, 1989). Sin embargo, algunos nios desarrollaron infecciones que no respondan al tratamiento y, finalmente, mortales y n o hubo ningn modo de predecir la evolucin. Recientemente, ha sido posible utilizar anlisis del fenotipo linfoctico ms exacto y analizar los niveles de los defectos inmunes en el sndrome de DiGeorge. Utilizando anlisis longitudinales durante muchos meses y una aproximacin paramtrica mltiple, parece que la gravedad puede predecirse mediante un bajo y consistente nmero de clulas T CD4, por la inversin del cociente CD4/CD8, y por la produccin disminuida de la linlocina interleucina-2 (IL-2) (Cunninghan-Rundles. 1994). La investigacin del significado de las deleciones monosmicas del cromosoma 22q11.2, que son la principal causa del sndrome de DiGeorge, del sndrome velocardiofacial y del sndrome de la anomala conotruncal de la cara, ilustran la importancia de la nueva informacin gentica. Slo el sndrome de DiGeorge fue descrito originalmente como un trastorno de inmunodeficiencia. Los nuevos estudios orientados a la frecuencia de la inmunodeficiencia en los otros sndromes clnicos asociados con la microdelecin del cromosoma 22q 11.2 han mostrado que en ms del 75% de los pacientes existe evidencia de compromiso inmune (Sullivan, 1998). La gravedad de la inmunodeficiencia no se correlaciona con ninguna caracteristica fenotpica particular. La funcin de las clulas T puede ser tan importante o ms importante en la infeccin por el VIH que la prdida de las clulas CD4^ o la tasa de prdida. En algunas enfermedades asociadas con virus, hay una considerable incertidumbre sobre lo estrecha que es la asociacin entre el dlicit inmune detectado ex vivo y la funcin inmune in vivo (Landay. 1991; Lloyd. 1992). Mientras que los estudios recientes sugieren que la respuesta ortosttica alterada (Rowe. 1999) puede explicar algunas formas del sndrome de fatiga crnica o que un aumento de las concentraciones plasmticas del factor de necrosis tumoral a (TNF-a) pueden ser un marcador de enfermedad (Moss. 1999), no existe un conocimiento claro de la causa y el efecto.

Efecto de la edad en la respuesta inmune

Los estudios recientes demuestran que el sistema inmune cambia durante proceso de envejecimiento (Gillis, 1981; Inkeles. 1977: Bogdan. 1994). Aunque hay una considerable variacin en esto y muchas veces es una consecuencia del estado nutricional alterado (Mazari. 1998), es esencial que el laboratorio clnico proporcione resultados considerando distintos grupos de edad. El estudio de pacientes peditricos presenta hallazgos particulares para el diagnstico de laboratorio en la inmunodeficiencia. El desarrollo del sistema inmune en el nio no est completo al nacer y, adems, los nios n o han estado expuestos a una amplia variedad de agentes ambientales anormales y pueden ser vulnerables a las infecciones (Zola. 1996). La exposicin congnita a un virus o la prematuridad aislada pueden asociarse con anomalas inmunes. Diferencias claves en la respuesta inmune peditrica incluyen una marcada linfocitosis al nacimiento, una elevacin de las clulas B, un aumento del cociente CD4+/CD8+, y la existencia de pocas clulas asesinas naturales (NK) (Fletcher, 1992: Yabuhara, 1990: Cunningham-Rundles. 1993). Estas diferencias se reflejan en las claras diferencias en el intervalo de normalidad de las subpoblaciones linfocitarias y deben tenerse en cuenta a la hora de evaluar los resultados (Denny, 1994). Tambin, hay una importante diferencia en la respuesta a varios activadores comparado con los adultos. La respuesta neonatal de los nios prematuros a ciertos activadores microbianos puede ser ms potente que la de los adultos o que la de los nios nacidos a trmino debido a los rpidos cambios en la regulacin inmune (Veber, 1991: Cunningham-Rundles, 2000) o debido a diferencias fundamentales en la programacin perinatal (Prescott, 1998).

Malnutricin y respuesta inmune

Aunque generalmente se cree que la malnutricin es relativamente rara en los pases desarrollados, aumenta la evidencia que sugiere que la malnutricin es relativamente frecuente, especialmente en ciertos grupos de edad (Pennington. 1996). La malnutricin se asocia con la inmunodeficiencia y origina una vulnerabilidad importante a las infecciones (Chandra. 1993; Cunningham-Rundles, 1996). Por ejemplo, el dficit de zinc puede presentarse como una inmunodeficiencia marcada que puede relacionarse con el dficit primario de la captacin de zinc en el tracto Gl, con una acrodermatitis enteroptica o con un dficit del zinc de la dieta (Moynalhan, 1974; Prasad. 1963). Las personas con hipogammaglobulinemia y malabsorcin asociada que alecta a las concentraciones de zinc pueden mostrar una respuesta proliferativa in vitro pobre e infecciones que se resuelven con el aporte del zinc (Cunningham-Rundles, 1981). Esto est asociado con el hecho de que el zinc es necesario para la actividad biolgica de la hormona tmica, necesaria en la produccin de las clulas T luncionalmente maduras (Dardenne, 1982) y para la activacin de las clulas T (Cunningham-Rundles, 1996. 1998). Hay una

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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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evidencia creciente de que el desequilibrio de los micronutrientes altera la respuesta inmune (Cunningham-Rundles. 1998. 2000) por efectos especficos en la respuesta inmune. La malnutricin puede ser un factor que aumente la complejidad de muchos casos clnicos. La interaccin de las infecciones con el metabolismo alterado secundariamente a la respuesta de fase aguda puede provocar cambios transitorios en los oligoelementos que produzcan la supresin transitoria de la respuesta inmune. El estrs fsico puede tener efectos similares y provocar un aumento de la vulnerabilidad a las infecciones en el contexto de la inmunosupresin (Cunningham-Rundles, 1999). sle es un proceso bidireccional. La alteracin del crecimienlo puede ser el primer signo de la infeccin por el VIH en un nio VIH+ (Peters, 1998). Por ello, como por otras razones, la evaluacin inmune debe ser un proceso continuo en el contexto del tratamiento o de otros anlisis.

un tipo especial de linfocito T de memoria con capacidad de proliferacin reducida capaz de ayudar a la clula B (Kagnotf, 1993; Marsh. 1993). Tanto los linfocitos T de la lmina propia como los linfocitos T mtraepiteliales se desarrollan de forma relativamente independiente del timo y funconan de forma diferente a las clulas T de sangre perifrica en el uso de la va de transduccin del CD2 en lugar de la va del receptor de clulas T/CD3. Actualmente, las pruebas de la inmunidad mucosa no se realizan habitualmente en los laboratorios de inmunologa clnica y. con raras excepciones, las clulas inmunes a estudiar corresponden al compartimiento de sangre perifrica. Por esta razn, el uso de pruebas cutneas in vivo y el examen de la respuesta inmune humoral en las vacunas halladas previamente es til para el inmunlogo celular, ya que proporcionan otra forma de evaluacin. En cualquier caso, la utilizacin de aproximaciones sucesivas y la repeticin de anlisis son muy informativas.

Cncer
La inmunodeficiencia primaria est asociada con el aumento de la incidencia de cncer (Cunningham-Rundles. 1987), y cada vez est ms claro que hay tumores que se desarrollan asociados a la infeccin por VIH (Davis. 1984; Chintu, 1995; Krown. 1996). En el paciente con cncer, la inmunodeficiencia generalizada o la reduccin en la respuesta ante un estmulo antignco puede asociarse al desarrollo de una neoplasia primaria, ocurrir durante las metstasis o estar causada por los efectos secundarios del tratamiento. La reduccin en la respuesta inmune frente a los activadores no especficos estudiados ex vivo en ensayos de proliferacin se correlaciona con el estado de la entermedad y tiene un significado pronstico en la supervivencia (Heimdal. 1999). A menudo se observa en los pacientes con cncer no tratado un cociente CD4/CD8 invertido y un aumento de la actividad celular supresora (Livisnton. 1987). Los estudios experimentales han demostrado que los tumores pueden suprimirse inmunolgicamente pero conducen la respuesta inmune hacia una respuesta no protectora (Lee. 1997). El desarrollo de nuevos mtodos nmunoterapeticos est aumentando, sugiriendo que la respuesta a antgenos especficos del tumor ser ms utilizada en el futuro (Stockert, 1998). Los ensayos sobre la respuesta inmune tambin pueden utilizarse en el seguimiento y evaluacin de la respuesta a los tratamientos como la IL-2 (Lissoni, 1999) y las vacunas contra el cncer (Hsueh, 1998). En general, la quimioterapia producir una supresin transitoria de la respuesta inmune que se resolver en un corto periodo de tiempo, mientras que la radiacin puede tener efectos a largo plazo (Katz. 1993). La evaluacin de la respuesta inmune en el paciente con cncer requiere de la utilizacin de pruebas muy seleccionadas y el uso discriminante de pruebas y activadores, que refleje los procesos relevantes, as como especificidad en la respuesta.

Fases de estudio: fase de exploracin

La evaluacin de la funcin inmune en un paciente con una posible inmunodeficiencia habitualmente se lleva a cabo en etapas. La primera consiste en una exploracin de las posibles reas de deficiencia y se resume en la Tabla 36-3. Estos estudios de exploracin deben acompaarse de un anlisis de citometria de fluyo apropiada de las subpoblaciones de linfocitos y, en nios, debe incluir del uso de marcadores de clulas B para evaluar posibles cambios en estas, que pueden aparecer transitoriamente en los neonatos y reflejarse con una baja poblacin de clulas T. Tambin se recomienda el empleo de un marcador de clulas NK en nios de ms de 3 meses de edad, ya que los niveles de esta poblacin pueden estar disminuidos o ausentes al nacimiento (Zola. 1983). Como existe frecuentemente una limitacin en la sangre que va a ser extrada para estos estudios es esencial que la primera evaluacin incluya paralelamente un recuento sanguneo completo (CBC), en la muestra de sangre. Es esencial que se lleve a cabo el recuento diferencial. La etapa de exploracin incluir un panel de pruebas para evaluar la respuesta mitognica y frente a anligenos proliferativos. La respuesta proliferativa de linfocitos frente a un grupo de activadores contina siendo una de las herramientas ms sensibles para evaluar la funcin normal, y cuando esta incluye un activador apropiado de clulas T y B puede ser utilizado especficamente para definir las reas defectuosas. Aunque esto no se hace siempre, se recomienda la utilizacin de distintas concenlraciones de cada activador. Adems, el tipo de tubo elegido para extraer la sangre es importante. El uso de tubos que contienen heparina de litio o cido etilenediamintetraactico (EDTA) no se recomienda para ningn estudio de funcionalidad de linfocitos. Deben utilizarse tubos con heparina sdica (sin conservante) o con citrato dextrosa (ACD). La sangre extrada en tubos heparinizados tambin puede emplearse para el anlisis por citometria de flujo, aunque el tiempo para la preparacin de la muestra y su anlisis es critico (Nicholson, 1993). La pregunta sobre cundo debe extraerse la sangre es importante. En general, la mayora de los datos se han obtenido con sangre extrada por la maana y hay efectos circadianos que pueden influir en los resultados. Cuando esto no puede hacerse, es m u y til continuar manteniendo la uniformidad del tiempo de extraccin para cada paciente individual. Este hecho es ms crtico cuando se mide el nmero absoluto de los distintos linfocitos T en la monitonzacin de la enfermedad por VIH o como parte de un ensayo clnico (Malone. 1990). Los estudios funcionales necesitan llevarse a cabo en sangre fresca anticoagulada siempre que sea posible (o sangre almacenada a temperatura ambiente en oscuridad durante menos de 24 horas) antes de que las clulas Tabla 36-3 Exploracin bsica en los estudios inmunolgicos Recuento sanguneo completo y anlisis dilerencial Anlisis de las subpoblaciones linlocitanas (numero y porcentaje de clulas B y T) por citometria de flujo Activacin de linfocitos in vitro frente a mitgenos y activadores microbianos Inmunoglobulinas sricas, incluyendo subtipos de inrnunoglobulinas si hay evidencia de infecciones clnicas por bacterias encapsuladas En algunos casos, los niveles de inmunoglobulinas son normales pero se producen anticuerpos no fijadores heterogneos, por tanto, se necesitan estudios adicionales

APROXIMACIN METODOLGICA A LAS PRUEBAS DE INMUNIDAD CELULAR

Los estudios en humanos se han basado en la observacin de las clulas inmunes de sangre perifrica ya que el compartimento perifrico es ms accesible y ms fcil de medir, pero esta aproximacin puede no reflejar los sucesos regionales (Cunningham-Rundles, 1994a). Los conocimienlos sobre las diferencias entre la respuesta inmune sistmica y mucosa pueden explicar finalmente muchas paradojas actuales que surgen cuando se compara la respuesta inmune medida in vitro o ex vivo con la defensa del husped in vivo (Xu-Amano, 1993). La funcin de la inmunidad sistmica celular parece estar regulada a travs de los distintos patrones de funcionalidad de las citocinas tipo T coadyuvantes, de modo que cuando se producen las cilocinas T coadyuvantes tipo 1 (Th1), IL-2, e interfern-y (IFN-y). se favorece la defensa inmune celular del husped. Cuando se producen las citocinas T coadyuvantes tipo 2 (Th2), IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10, se induce la respuesta de los Imfocitos B (Barnes, 1993; Yamamura, 1991). En contraste con la inmunidad sistmica, la actividad primaria de la respuesta inmune mucosa es proteger la mucosa bloqueando la entrada de microorganismos, toxinas y antigenos a travs de la secrecin y el transporte de la inmunoglobulina A (Ig A) a la luz del intestino, un proceso mediado por

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

mononucleares se destruyan. Cuando la sangre se enva por avin u otro transporte a un laboratorio en otro lugar es extremadamente importante incluir un control paralelo de la muestra extrada de una persona sana que sirva como un estndar interno en el proceso de evaluacin.

Tabla 36-5 Causas de anergia en la prueba cutnea Falta de historia antignica apropiada cuando el panel no incluye activadores ubicuos Inmunodeficiencia primaria inlecciones vricas Malnutricin Enfermedades granulomatosas Neoplasias

Fases de estudio: fase de confirmacin Aspectos generales

Una vez que se ha llevado a cabo el cribado de cada individuo y se observen evidencias de posibles lagunas, estas pruebas deben confirmarse repitiendo pruebas sobre aspectos especficos de las primeras series. Como poco, debe realizarse un prueba positiva o negativa (rango normal y rango anormal). Pueden aadirse pruebas adicionales que proporcionen el punto de partida de estudios analticos. Es importante organizar apropiadamente la extraccin de sangre cuando el paciente se encuentre en el estado ms estable clnicamente. Se recomienda realizar por duplicado los estudios bsales antes de llevar a cabo una intervencin, o incluso en la fase de confirmacin. En algunos casos de posible inmunodeficiencia puede haber un secuestro de clulas inmunes, que se refleja en porcentajes bajos de linfocitos T en el compartimento perifrico, como se muestra en la Tabla 36-2. Caso #3. La etapa de confirmacin tambin debe incluir una cuidadosa reevaluacin de la historia mdica de los pacientes y de la historia familiar. Los estudios que se deben utilizar en esta etapa de confirmacin se muestran en la tabla 36-4.

Persistencia

timica

El roentgenograma de la silueta trmca puede no ser suficiente, ya que el timo tiende a la deplecin por estrs (Haynes, 1998). Aunque es difcil determinarlo con seguridad, se ha visto que el tamao real del timo evaluado por resonancia magntica nuclear (MRI) se correlaciona con el nmero de linfocitos CD4+ en la infeccin por VIH (Vigano' A, 1999). Estudios recientes sugieren que el timo humano puede considerarse como un rgano compuesto por tejido linfoide central y perifrico. Haynes (1998) ha postulado que la atrofia epitelial del timo puede resultar en parte de las atocinas o de otros tactores producidos por las clulas inmunes perifricas del espacio tmico penvascular. Como se describe en la seccin especfica sobre la evaluacin por citometria de flujo de las subpoblaciones de linfocitos T. la expresin de antgenos de maduracin normales adquiridos durante el desarrollo tmico ser suficiente para identificar la presencia de un timo funcionante.

neas de hipersensibihdad retardada ha mostrado una buena correlacin global entre la falta de reactividad, llamada anergia, y la inmunodeficiencia (Mass. 1998) pero no ha sido til como herramienta analtica para determinar la razn de la falta de respuesta. La prueba cutnea no es muy cuantificable. El empleo de la prueba cutnea con derivados proteicos purificados (PPD) para evaluar la posible presencia de Mycobactenum tuberculosis es una excepcin, aunque los individuos anrgicos no responden y. adems, hay falsos positivos en las personas que han sido vacunadas con el bacilo de Calmette-Gurin (BCG). Las causas de falta de respuesta en la prueba cutnea se muestran en la Tabla 36-5. Algunos estudios se han basado en una prueba cutnea con inmunizacin de novo utilizando dinitrofluorobenceno (DNFB) que se lleg a utilizar ampliamente pero ya no se considera de utilidad debido a la ambigedad del mecanismo de respuesta subyacente. La introduccin del prueba de la ventana cutnea" proporciona una medida ms cuantitativa e informativa de la respuesta inmune in vivo debido a que la reaccin puede emplearse para determinar una respuesta tumoral autloga (Black. 1998). Sin embargo, aunque con algunas reservas, la importancia de las pruebas cutneas c o m o demostracin convincente de que los defectos inmunes que suceden in vitro pueden tener un significado pronstico in vivo, no debe ser infravalorada.

Fases de estudio: estudios analticos de la inmunidad

Los estudios analticos se resumen, de forma general, en la Tabla 36-6. Aunque la descripcin completa de estos abordajes no se encuentra entre los objetivos de este anlisis, en general estos estudios son vlidos para definir el mecanismo subyacente del defecto inmune y proceder en una serie de etapas. Aunque hay diferentes modos posibles de hacerlo, un buen mtodo es evaluar el nivel general del defecto siguiendo el plan general de evaluar la presencia de los tipos celulares y las proporciones relativas de cada uno a la vista de las reas de funcin general disminuida y entonces poner en marcha los estudios de la funcin efectora.

Pruebas cutneas
En este momento puede ser importante la utilizacin de un panel de pruebas cutneas. Este abordaje en la evaluacin de la inmunidad celular sirvi en un principio como punto de partida para el desarrollo de las pruebas funcionales de la inmunidad celular y mide la respuesta de hipersensibilidad retardada directamente in vivo. La experiencia con las pruebas cut-

Funcin inmune diferencial

Hay dos tipos principales de clulas implicados en la inmunidad (Haynes, 1990; Paul, 1993): 1) linfocitos T (clulas T) y 2) linfocitos B (clulas B). Los linfocitos T se definen por la expresin del receptor del linfocito T el cual se une al antigeno y a CD3, un determinante de superficie asociado con el receptor de clulas T que es esencial para su activacin

Tabla 36-4 Estudios analticos de confirmacin y de primera etapa Roentgenograma de la sombra timica Prueba cutnea Actividad de las clulas asesinas naturales (si el nio tiene 6 meses 0 ms) Produccin de citocinas en respuesta a la activacin con T-coadyuvante 1, T-coadyuvante 2 (IL-2, interfern-y, IL-4 y otros) Cultivo mixto de linfocitos con el paciente como estimulador y con el paciente como respondedor Respuesta a la inmunizacin Prueba para la presencia de anticuerpos especficos segn la edad Respuesta de anticuerpos naturales frente a isohemagiulimnas (sustancias de grupo sanguneo anti-A y anti-B) si el paciente es del grupo sanguneo A, B o O Prueba para el dficit de actividad de las enzimas adenosn deaminasa y purma nucletico fosforilasa

Tabla 36-6 Estudios analticos e inmunorreguladores Desarrollo de los antgenos de la activacin durante la respuesta a la estimulacin, como el antigeno Tac, el receptor de transterrina, regulacin del MHC de clase II sobre las clulas T , receptores solubles y otros Respuesta do activacin precoz (p. ej, canales de calcio) Inmunorregulacin Respuesta a IL-1, IL-2, interferones Desarrollo de funciones efectoras Sntesis de inmunoglobulinas in vitro Actividad citotoxica de las clulas T Anlisis de clulas supresoras/factores de supresin Activacin de genes, anlisis del ciclo celular Respuesta a la inmunizacin: inmunizacin de novo

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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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Tabla 36-7 Fenotipificacin inmunolgica de las subpoblaciones de linlocilos Panel bsico de sangre perifrica (sangre, glbulos rojos Usados*) CD45/CD14 Inmunoglobulinas control de isofipo de ratn CD3/CD19 CD3/CD4 CD3/CD8 CD3-/CD56 y 16 Clulas mononucleares aisladas, panel de activacin' CD45/CD14 Inmunoglobulinas control de isotipo de ratn CD3/CD25 (IL-2R) CD3/HLA-DR
' Si el CD3 est bajo, entonces repetir y aadir CD2. Posteriormente, pueden aadirse monoclonales trente al receptor de las clulas T acoplado con CD3. Tambin pueden evaluarse los marcadores de monocitos. Esto tambin puede realizarse utilizando reactivos de tres o cuatro colores empleando CD45 como iniciador ' Despus de 2 das de cultivo, extraer las clulas y lavarlas antes de teirlas con los anticuerpos monoclonales escogidos: analizar las clulas control que no contienen activador, despus analizar las clulas activadas. Los activadores pueden incluir mitgenos. IL-2 y/o mleilern-y.

conocidas como clulas que pueden matar inespecficamente (naturalmente) a las clulas infectadas por virus y bacterias y que evitan las metstasis de las clulas tumorales. Sin embargo, las clulas NK tambin regulan funciones de las clulas T y B y la hemalopoyesis. Estas funciones de las clulas NK son, probablemente, dependientes de su capacidad para producir linfocinas, particularmente IFN-y. Las clulas N K son importantes para la activacin de las clulas fagociticas independientes de antgeno durante las fases precoces de la infeccin y para favorecer el desarrollo de las clulas Th1 especficas de antgeno. El sistema N K est por naturaleza activado y no tiene que ser inducido por antgenos para destruir. Sin embargo, cuando se presentan con anticuerpos especficos, estas clulas pueden matar especficamente. La evaluacin funcional de esta poblacin celular puede llevarse a cabo de forma adecuada utilizando un anlisis rpido de liberacin de cromo conocido como un ensayo de citotoxicidad NK empleando K-562s como dianas) o mediante citometra de flujo. Los estudios futuros estarn encaminados a detectar cmo las clulas N K ligan la inmunidad innata y la adaptativa (Peritt, 1998).

Desarrollo de la respuesta inmune

Si se ha determinado que la poblacin de clulas est esencialmente intacta en ausencia de activacin, la cuestin de un fallo intrnseco puede estudiarse mediante muchos abordajes diferentes que incluyen el anlisis expandido de marcadores de superficie de linfocitos, entre ellos los determinantes del receptor antignico de las clulas T (TCR) y los antgenos de activacin como el CD25. el CD38 y el HLA-DR (Tabla 36-7). La ausencia de regulacin del MHC de clase II en respuesta al IFN-y es un ejemplo. Aunque las poblaciones celulares pueden expresar un antgeno de diferenciacin normal de referencia, tambin pueden coexpresar otros inapropiadamente. lo cual puede ser la clave de la anormalidad funcional. Por ejemplo, las clulas T CD8+ que coexpresan CD38 no son funcionalmente iguales que las clulas CD8 que no expresan este marcador y se encuentran expandidas en la enfermedad por VIH (Giorgi, 1989). La ausencia de expresin de ciertas molculas, como el CD28. tambin es un indicador importante. En algunos sndromes de inmunodeficiencia primaria, la regulacin del receptor de IL-2 en respuesta a la IL-2 puede ser anormal. Los receptores pueden no estar translocados normalmente o los receptores pueden estar alterados prematuramente (Cunningham-Rundles. 1990). El desarrollo de la respuesta puede ser anormal cinticamente, debido al retraso del reclutamiento secundario durante la fase de amplificacin. Esto debe ser comprobado mediante estudios peridicos. En algunos casos, n o pueden fabricarse citocinas o pueden estar funcionalmente alteradas. Las funciones efectoras pueden haberse perdido o estar alteradas. Esta evaluacin puede requerir un abordaje detallado. Los intentos de restaurar la respuesta aadiendo citocinas pueden ser tiles, aunque pueden no mostrar la lesin al compensar y no solucionar la deficiencia real. Las nuevas estrategias de anlisis pueden utilizar sangre en lugar de clulas mononucleares aisladas (Bocchieri, 1995). Este sistema proporciona una excelente visualizacin, ex vivo, de la respuesta inmune, ya que las relaciones reales entre las clulas no se alteran. Adems, este sistema puede utilizarse para medir la produccin de citocinas (Petrovsky, 1995; De Grote, 1998; Suni, 1998). Se aconseja al laboratorio de inmunologa clnica elegir estudios analticos bsicos, que normalmente se realizan de rutina, de modo que exista una base para la comparacin. El establecimiento de los valores de referencia y el mantenimiento del control de calidad de los reactivos del laboratorio, especialmente para ciertos elementos variables, es esencial para la exactitud y sensibilidad de estas pruebas.

Los lintocitos T tienen receptores diferentes, clonalmente variables, para un amplio grupo de antgenos, requieren la maduracin tmica para su funcin normal y median la inmunidad celular. Los linfocitos B se identifican por las inmunoglobulinas de superficie (detectadas mediante anticuerpos monoclonales como el CD19 o el CD20) y tras una activacin adecuada se diferencian en clulas plasmticas que secretan anticuerpos especficos, mediando, de este modo, la inmunidad humoral. La falta de un timo normal comprometer la funcin de los linfocitos T y afectar a la activacin de los linfocitos B dependientes de los linfocitos T. El fallo a nivel de la mdula sea puede afectar tanto a la respuesta inmune de los linfocitos T como a la de los linfocitos B. aunque pueden estar implicadas relaciones especificas. Esto se describe con ms detalle posteriormente en la Proliferacin linfoctica como mtodo In Vitro de evaluacin de la inmunidad celular. L a distincin entre respuesta inmune especfica y no especifica es una necesidad fundamental de la respuesta inmune, ya que el sistema debe ser capaz de distinguir entre lo propio y lo extrao. En general, esto se logra medanle la incorporacin del sistema de autoantigenos del complejo molecular MHC en la fase de reconocimiento antignico. El antigeno debe ser procesado y presentado en el contexto del reconocimiento del propio MHC y conducir al desarrollo de la memoria inmune. La funcin del procesamiento antignico se lleva a cabo por las clulas presentadoras de antgeno (APCs), siendo el monocito la mejor estudiada. Esta respuesta dispara la activacin y la proliferacin de los linfocitos. y puede incluir la produccin de clulas electoras y la activacin de los linfocitos B para producir anticuerpos. Este tipo de inmunidad, a menudo denominada inmunidad adaptativa. se mantiene como "memoria" y se desencadena tpicamente despus de inmunizaciones o infecciones naturales (Owen, 1993). La falta de expresin del antgeno MHC de clase II puede detectarse en los linfocitos por citometra de flujo utilizando anticuerpos monoclonales contra el HLA-DR o el HLA-DQ y es el mejor marcador de dficit de MHC de clase II (Tabla 36-7). Un segundo tipo fundamental de inmunidad puede describirse como la inmunidad innata, que no tiene memoria, y no aumenta con contactos repetidos. Esta inmunidad est mediada por las clulas fagociticas. algunas de las cuales, como el monocito. tambin pueden procesar y presentar antgenos, y las clulas NK. A diferencia de las clulas fagociticas. las clulas NK no estn desarrolladas funcionalmente al nacer, debido, probablemente, a que la atocina clave, el IFN-y, que es necesaria para el desarrollo y la maduracin de este sistema, est tambin disminuida al nacer. Esta tercera rama est representada por las clulas NK. que no son ni clula B ni exactamente clulas T por no tener ni inmunoglobulinas de superficie ni el receptor de clulas T. Estas clulas, antes llamadas clulas "K", clulas "nulas" o "tercera poblacin", ha eludido la clasificacin convencional por anlisis de linaje celular. Actualmente, el CD56 es considerado el marcador ms definitivo de la clula N K (Trinchieri. 1998). Las clulas N K han sido ms

PROLIFERACIN LINFOCTICA COMO MTODO IN VITRO DE EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR Inmunologa celular Activacin y proliferacin linfoctica

Aunque el sistema inmune se divide clsicamente en componentes humoral y celular, esta separacin n o es absoluta, ya que hay una considerable interdependencia entre las clulas B y las clulas T.

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SECCIN V

INMUNOLOGA INMUNOPATOIOGA

El parmetro funcional de la inmunidad celular ms frecuentemente medido es la proliferacin linfocitaria. La medida de la activacin/proliferacin de los linfocitos ha evolucionado sustancialmente desde finales de los aos 50 e inicio de los 60. cuando la divisin celular se determinaba por el recuento del nmero de linfocitos que se haban transformado en blastos. Estos mtodos fueron reemplazados por la cuantificacin de la incorporacin de precursores marcados de los cidos nucleicos (timidma tritiada) en el cido desoxirribonucleico (ADN) recin sintetizado. Aunque este "anlisis en masa' permanece como el procedimiento de laboratorio ms frecuentemente utilizado para medir la proliferacin celular, recientemente han aparecido nuevos reactivos y nuevos procedimientos para evaluar la activacin y proliferacin linfocitaria. Estos incluyen la disponibilidad comercial de marcadores de proliferacin de la superficie celular, la posibilidad de medir el porcentaje de clulas en fases especificas del ciclo celular, la cuantificacin de citocinas y de receptores de citocnas asociados a clulas y la posibilidad de evaluar el nmero de divisiones celulares en linfocitos marcados con 'tinciones de seguimiento". En esta seccin se revisan los acontecimientos moleculares implicados en la activacin y en la proliferacin de los linfocitos T y se revisan algunos de los nuevos mtodos que se han desarrollado para evaluar las funciones del sistema inmune celular.

Determinacin de las vas bioqumicas de la activacin linfocitaria

Tras la interaccin especfica del mitgeno o el antigeno/MHC con los receptores apropiados de los linfocitos. tienen lugar muchos procesos celulares que incluyen cambios en el transporte de membrana, redistribucin del sistema del ciloesqueleto (polarizando el linfocito hacia la APC) y la activacin de mltiples vas de sealizacin. Estos cambios conducen finalmente a la diferenciacin de la clula T. a la secrecin de citocinas. a la proliferacin, a la anergia o a la apoptosis. Las investigaciones actuales estn desvelando las complejas rutas moleculares y bioqumicas que conducen a la clula T activada por estas rutas. Constantemente se estn descubriendo alteraciones especificas en estas vas y subyacen en muchas de las enfermedades de la inmunodeficiencia primaria. Desgraciadamente, las alteraciones en los anlisis de proliferacin en masa indican solo que no hay divisin celular o que esta es limitada y no proporcionan informacin sobre las alteraciones subyacentes de la activacin del linfocito. Se requieren ensayos ms sofisticados para investigar las alteraciones subyacentes de las clulas T.

superficie celular sin el CD3 (Weiss. 1991) y no tiene capacidad de sealizacin por si mismo. La estructura de reconocimiento antignico est compuesta por cadenas estructuralmenle divergentes a y \i (o menos frecuentemente por las cadenas y y 6) y el complejo de transduccin CD3 est formado por cinco cadenas polipeplidicas invariantes, a. p\ e. y un dmero de cadena zeta. Cada una de las protenas del CD3 contienen un residuo llamado residuo inmune de activacin de la tirosina (ITAM). que se une al dominio SH2 de la proteina tirosma cinasa. La cadena f (que existe como un homodmero f una cadena i con una n, o una cadena y con una Fe e Rl y) contiene 3 ITAM y es el componente ms significativo del complejo TCR. estando implicado en la transduccin de la seal desde el TCR (Weiss 1994). Inicialmente descritos por Reth (1989). estos residuos juegan un papel esencial en los acontecimientos iniciales que siguen a la activacin de las clulas Tflrving. 1991). Las molculas CD4y CD8 de la superficie de las clulas T tambin estn unidas de forma no covalente al complejo TCR Se unen a las molculas del HLA Clase II y I. respectivamente, sobre la APC y tambin estn implicadas en la transduccin de las seales de activacin Una vez procesado el antigeno, este es presentado a las clulas T en el contexto de los antigenos del MHC. En general, las clulas T CD4+ responden a antgenos exgenos procesados y presentados en el contexto de MHC de Clase II y las clulas T CD8+ responden a antigenos endgenos procesados y presentados en el contexto de MHC de Clase I, Los CD4 y los CD8 tambin estn asociados con la tirosina cinasa implicada en los acontecimientos precoces tras la activacin de las clulas T. Adems de estas interacciones y las interacciones de las molculas estimuladoras, otro grupo de molculas (molculas de adhesin), presentes tanto en la APC como en las clulas T respondedoras, se unen unas a otras y sirven para aumentar la avidez de la unin. Las molculas coestimuladoras identificadas en las APC incluyen el B7 (CD80) (Linsley. 1991a). el B7.2 (Azuma. 1993). el antigeno estable al calor (HSA) (Liu. 1992) y otros (Foletta. 1998; Wingren. 1995) Sobre las clulas T. la CD28 es la principal molcula estimuladora y se une al B7: la CTLA-4. por otra parte, se une tanto al B7 como al B7.2 y est implicada en la disminucin de modulacin de la activacin de las clulas T (Linsley, 1991b). El receptor en las clulas T para el HSA no ha sido identilicado. La presentacin del antigeno en presencia de reactantes que bloquean las molculas coestimuladoras lleva a una respuesta anrgica (tolerancia) en posteriores exposiciones a ese antgeno especifico pero no afecta a las respuestas a otros antgenos (Tan, 1993). La posibilidad de hacer no inmunognicos a tumores inmunognicos transplantados transfirindoles el gen 87 (Townsend. 1993: Chen. 1992; Baskar, 1993: Janeway. 1994) sugiere que las molculas coestimuladoras juegan un papel importante en la activacin de las clulas T in vivo.

Activacin de los linfocitos T inducida por antigenos

La activacin de los linfocitos T inducida por los antigeno/MHC implica una serie de acontecimientos complejos y definidos que difieren sutilmente entre la activacin de una clula T nativa frente a la activacin de una clula T de memoria. El antigeno es procesado por las clulas B o por los monocilos provocando el ensamblaje de pptidos inmunognicos en los productos de los genes del MHC de clase I o II El complejo pptidoMHC es presentado a las clulas T que portan el receptor apropiado de esa clula T. Adems, la APC expresa una serie de molculas de adhesin y coestimulacin que interactan con los receptores ligando/antagonista apropiados de la superficie de la clula T. La unin aislada del receptor de la clula T no es suficiente para la activacin de la clula T lo que ha conducido al "modelo de las 2 seales" para la activacin de la clula T (Brestcher, 1992). La primera seal que ocurre por la va TCR/CD4/CD8 modula la transicin de la clula T en las primeras etapas de la activacin (p ej.. de G a G.). La 2- seal se produce por la via de los coestimuladores. ms concretamente por el CD28 y en menor medida por LFA-3. CD2, CD5 y CD7. y lleva a la induccin de la IL-2 y de otros genes de citocinas requeridos para la proliferacin y diferenciacin de la clula T hacia clulas efectoras.
0

Transduccin de seales despus de la estimulacin antigeno-especfica

La presentacin del antigeno a las clulas T conduce a la agregacin del complejo del TCR-CD3 y a la activacin de la protena tirosina cinasa (PTK), El TCR por si mismo tiene un pequeo dominio ciloplasmtico sin actividad de transduccin conocida. Es la cadena asociada del complejo CD3, que contiene residuos ITAM y que se ha demostrado que coprecipita la actividad de la protena tirosina cinasa Dos clases bien conocidas de familias citoplasmticas de PTK estn implicadas en las etapas mas precoces que siguen a la agregacin del receptor de clulas T, Src y Syk/ZAP-70. Las cascadas de sealizacin que se originan a partir del complejo TCR-CD3 y la va d e la coestimulacin por CD28 son bien conocidas (Foletta, 1998). La activacin de las tirosina cinasas asociadas al TCR. ZAP70. p59- y p56 originan la activacin de tres vas. p2T , calcio calicreina. y proteina cinasa C (PKC). La activacin del p21" activa las prolena cinasas activadas por mitgenos (MAPK) que fosfonlan muchos factores de transcripcin regulando de este modo la expresin gentica. La activacin de la tirosina cinasa tambin activa a la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidil inositol y origina la generacin de los segundos mensajeros diacil glicerol (DAG) e inosilol trifosfato (IP3). El DAG activa la proteina cinasa C. y el IP, origina un rpido y sustancial aumento del calcio ciloplasmtico. El aumento del calcio libre activa la fosfatasa calcineurina dependiente de calmodulma.
1b

Reconocimiento de las clulas T, activacin y transduccin de la seal

El complejo TCR est compuesto por una estructura de reconocimiento del antgeno heterodimrica (esto es. el TCR) y un complejo de transduccin no unido covalentemente que es el CD3. El TCR no puede expresarse en la

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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

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Estos procesos tambin conducen a la induccin de protenas de unin al ADN y a la transcripcin de numerosos genes incluyendo la IL-2 y el receptor de IL-2 requeridos para la proliferacin de la clula T. Para ms informacin sobre las vas de transduccin molecular tras la activacin del TCP. y el CD28, consultar a Wiss (1994). Zhao (1997), Foletta (1998) y Halloran (1999). La comprensin de las vas que conducen a la activacin de la clula T ha llevado al descubrimiento de los defectos moleculares de muchas enfermedades de inmunodeficiencia adquirida y puede ayudar finalmente a proporcionar estrategias teraputicas para corregir esos defectos. Por ejemplo, se han publicado mutaciones en la proteina tirosina cinasa ZAP70 y estn asociadas con la forma autosmica del sndrome de la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) en humanos (Eider, 1998). Las mutaciones en la cadena comn y de los receptores de interleucina IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 originan anomalas de la transduccin y estn asociadas con la forma ligada al cromosoma X del SCID (Noguchi, 1993). Es interesante hacer notar que otras formas de SCI adquiridas autosmicamente estn asociadas con las mutaciones en la protena tirosina Jak3 de la familia de protenas Jano. la nica molcula de sealizacin asociada con la cadena comn y (Russell. 1995). A medida que se van descubriendo ms anomalas subyacentes que conducen a la inmunodeficiencia de clulas T. se ha propuesto que los trastornos deben clasificarse empleando un extenso sistema que identificar los trastornos de acuerdo con las alteraciones en la diferenciacin, la maduracin y la funcin (Gelfand. 1993). Estas designaciones podran comenzar a enfocarse en los defectos fisiolgicos o bioqumicos propiamente dichos y pueden finalmente proporcionar nuevas opciones teraputicas. Para una revisin de las alteraciones moleculares especficas que originan alteraciones en la activacin y proliferacin de la clula T. consultar a Arnaiz-Villena (1992), Gelfand (1993) y IUIS (1999).

estos individuos seronegativos de alto riesgo han desarrollado una inmunidad protectora mediada por clulas como resultado de una baja dosis de inmunizacin o de infeccin.

Metodologa: determinacin de la activacin y la proliferacin linfocitica en la evaluacin de la inmunodeficiencia celular

Los defectos del desarrollo, las alteraciones genticas congnitas y las infecciones adquiridas provocan estados de inmunodeficiencia severa. Adems, las quemaduras graves, los traumatismos y las intervenciones teraputicas tambin originan mmunodeficiencias. Los anlisis en masa pueden emplearse para determinar si un individuo tiene o no una disminucin de la respuesta proliferativa de las clulas T y han estado disponible durante algn tiempo pero estn limitados por una baja reproducibilidad y por la limitada informacin que aportan. El desarrollo de las nuevas tecnologas ha permitido la produccin de una variedad de reactivos que pueden emplearse para evaluar mltiples actividades a lo largo de la via de activacin de la clula T. Estos reactantes incluyen anticuerpos monoclonales especficos como marcadores de la activacin de la clula T. reactivos y sistemas para la deteccin de citocinas intracelulares. y marcadores de seguimiento y precursores no radioactivos del ADN desarrollados para evaluar la proliferacin linfocitica.

Procedimientos empleados para evaluar la activacin y la proliferacin de la clula T

El procedimiento ms frecuentemente utilizado in wVopara evaluar la inmunidad celular es una simple prueba cutnea. Una prueba cutnea positiva para la deleccin de una respuesta de hpersensibilidad implica una inmunidad celular y una quimiotaxis de monocitos intacta (Borut. 1980). Aunque las pruebas cutneas se llevan a cabo fcilmente, los resultados negativos son difciles de interpretar, especialmente en nios pequeos, y las pruebas cutneas no son tan sensibles como los ensayos de estimulacin de linfocitos in vitro (Borut. 1980). Otras variables, m vivo, de la inmunidad mediada por clulas son la sensibilidad por contacto, la formacin de granulomas y el rechazo alognico. Los linfocitos son los nicos en los que se expresan receptores de superficie capaces de identificar virtualmente cualquier molcula o sustancia extraa (antigeno). La diversidad estructural de estos receptores se origina por el reordenamiento diferencial de los genes del receptor de la clula T. En general, solo hay un nmero limitado de linfocitos circulantes capaces de reconocer un antigeno. In vivo, cuando un linfocito reconoce un antigeno extrao, las clulas proliferan rpidamente de forma clonal para generar un gran nmero de clulas tanto efectoras como de memoria. Los primeros mtodos empleados para evaluar la proliferacin linfocitica incluan el recuento manual del nmero de clulas antes y despus de la estimulacin. Desgraciadamente, estas tcnicas requieren mucho tiempo y presentan muchos problemas tcnicos. En los ltimos aos se han desarrollado nuevos mtodos que miden los diferentes acontecimientos celulares que ocurren en la ruta de la divisin celular. Hay que subrayar que los mtodos que miden los sucesos iniciales en la activacin del linfocito T pueden o no correlacionarse con la divisin celular.

Respuestas de la clula T
Recientemente, se ha preterido la designacin de la respuesta de la clula T tipo I frente a la respuesta de citocinas tipo II para aquellas respuestas de la clula T que originan unos patrones de secrecin de citocinas que se sabe que estn implicados en la inmunidad celular frente a los patrones de secrecin de citocinas observados en la inmunidad humoral, respectivamente. Las respuestas tipo I se caracterizan por la secrecin de citocinas que se sabe que aumentan la inflamacin (promflamatorias) e inducen la activacin y la proliferacin de las clulas T y los monocitos, a saber, IL-2, IFN-y, e IL-12. Las respuestas tipo II se caracterizan por la secrecin de citocinas que suprimen la inflamacin (antiinflamatorias) y estimulan a las clulas B a dividirse y diferenciarse en clulas secretoras de inmunoglobulinas (esto es, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13). Hay evidencias que sugieren que la secrecin de las citocinas del tipo I regulan la secrecin de las citocinas tipo II y viceversa (Paul. 1994). Por ejemplo, en presencia de IL-4, tanto in vivo (Chtelain, 1992) como ih vitro (Seder, 1992:1993). las clulas T no se diferencian en clulas secretoras de IFN-y (es decir, este ambiente favorece el desarrollo de una respuesta inmune humoral). Se ha propuesto que las cantidades relativas de IL-4 e IL-12 presentes durante la estimulacin de las clulas T nativas dirigirn la respuesta hacia un lado o hacia otro (Paul, 1994). Muchos factores estn implicados en la regulacin del tipo de respuesta de la clula T que sigue a la estimulacin antignica. Adems del ambiente de citocinas, hay evidencias que sugieren que la dosis de antgeno influye en el tipo de respuesta (Bretscher. 1992: Madreas, 1995). La respuesta predominante que se desarrolla Iras la activacin de la clula T tiene implicaciones clnicas significativas. Se ha postulado que el desarrollo de una respuesta de tipo I a la infeccin por el VIH puede conducir a una inmunidad protectora (Clerici, 1994). Claramente, una respuesta tipo II no es protectora, ya que la mayora de las personas infectadas seroconvierten y eventualmente fallecen por intensa inmunodepresin. Clerici y Shearer (1993,1994) argumentan que la exposicin repetida a una dosis baja de VIH-1 puede originar una inmunidad protectora celular tipo I. Los resultados de estos grupos indican que entre el 39% y el 75% de las clulas mononucleares de la sangre perifrica (PBMC) de los individuos de alto riesgo (varones homosexuales, adictos a droga va intravenosa y nios nacidos de madres VIH positivas) seronegativos para VIH-1 y negativos para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), secretan IL-2 en respuesta a la protena env in vitro. Estos cientficos proponen que

Ensayo de incorporacin de timidina tritiada H (ensayo TdR)

Muchos laboratorios evalan la capacidad proliferativa de los linfocitos calculando el grado de incorporacin de nuclesidos radiactivos del ADN (timidina tritiada) durante un pulso de 4 a 24 horas tras una incubacin prolongada de cultivos celulares de mononucleares de sangre perifrica con mtgenos (tres a cuatro das) o con antgenos (5 a 10 das). En general, solo un nmero limitado de clulas T responden a un antigeno in vitro; por lo tanto, las clulas deben cultivarse durante 5 a 10 das para detectar la respuesta. Los mitogenos, por otra pane, inducirn la rpida proliferacin de hasta el 100% de las clulas T. Por esta razn, la proliferacin puede detectarse en tres o cualro dias proporcionando con ello una herramienta de cribado efectiva. La transformacin linfocitaria in vitro en respuesta a un rmtgeno fue descrita por pri-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

mera vez por Nowell (1960). Los mitgenos son, en general, los estimuladores ms potentes, ya que activan una gran proporcin de linfocitos en relacin con los aloantigenos y los antigenos.

Citometria de flujo en la evaluacin de la activacin y la proliferacin linfocitaria

Los anlisis en masa, adems de sus inherentes problemas tcnicos, no proporcionan informacin sobre las subpoblaciones celulares especficas que estn respondiendo. La citometria de flujo con su potencial multiparamtrico inherente se ha convertido en el instrumento de eleccin para el anlisis de la inmunologa celular. La figura 36-1 ilustra algunos de los acontecimientos celulares que ocurren a lo largo de la ruta de activacin/proliferacin de la clula T que pueden medirse por citometria de flujo. Para una revisin extensa de la citometria de llujo y de los mtodos empleados para evaluar la activacin y la proliferacin linfoctica. vase Bauer (1993) y Shapiro (1995). Otro mtodo basado en la citometria de flujo que ha alcanzado un uso importante en los laboratorios clnicos es la medida de los linfocitos en varas fases del ciclo celular. En general, los anlisis del ciclo celular se llevan a cabo midiendo el nivel de intensidad fluorescente emitida por las sondas de ADN. El marcador empleado ms frecuentemente es el yoduro de propidio. que interacciona estequiomtricamente con el ADN (esto es. la cantidad o intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN de la clula). Utilizando complejos modelos matemticos, es posible medir el porcentaje de clulas con un contenido en ADN entre 2- y 4 , que se correlaciona con el porcentaje de clulas en fase "S" del ciclo celular. En general, los linfocitos de sangre perifrica se encuentran en la fase de reposo del ciclo celular, con menos del 5% de las clulas en la fase "S"
C

FLUORESCENCIA

I.O

lKH26

Figure 36-2. Empleo de marcadores de seguimiento PKH26 en linfocitos perifricos estimulados y no estimulados por mitgenos tras cinco dias en cultivo. La proliferacin celular se indica p o r la dilucin d e la intensidad fluorescente en c a d a generacin sucesiva. (Modificada de Shapiro HM: Practical F l o w Citometry. 3* ed. Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pg. 3 1 3 . Copyright Wiley-Liss. 1995. Reimpreso c o n permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.) ware necesario para el anlisis junto con los marcadores de rastreo (Sigma Immunochemicals. St. Louis. MO). Una evaluacin de 14 de los marcadores utilizados ms frecuentemente inform que dos de los marcadores. PKH26 y el ester succinimidilco del diacetato de carboxifluoresceina (CSFE). eran los ms adecuados por su capacidad para cuantificar la proliferacin de los linfocitos (Parish, 1999). Este ensayo puede proporcionar la evaluacin ms fiable de la respuesta proliferativa celular en sistemas de cultivo in vitro con ventajas importantes sobre los anlisis en masa habituales, permitiendo la medicin de subpoblaciones especficas de linfocitos. Los indices de CSFE parecen correlacionarse ms estrechamente con los anlisis con TdR que la medida de las clulas CD69* (ngulo. 1998). La medida de la proliferacin linfocitaria empleando las sondas marcadas PKH26 y el CSFE ha sido desarrollada, optimizada y analizada para su empleo en aplicaciones clnicas (Allsopp, 1998; ngulo. 1998). La posibilidad recientemente desarrollada de medir la produccin de atocinas asociadas a las clulas a nivel de una sola clula tiene un importante potencial como herramienta clnica en la evaluacin de la respuesta celular inmune. Bsicamente, las clulas son estimuladas, ya sea c o m o PBMC o como sangre completa, durante cuatro a seis horas en presencia de reactivos que bloquean el transporte de membrana (breleldina A o monensma) para evitar la secrecin de atocinas. Entonces, se marcan las clulas con anticuerpos monoclonales especficos de cada subpoblacin, se fijan, se permeabilzan y se marcan con anticuerpos monoclonales fluorescentes especficos para el estudio de la citocina de inters (Jung, 1993; Prussia 1995). El ensayo se ha desarrollado en presencia de anticuerpos estimuladores para la deteccin sensible de respuestas antignicas en cultivos de sangre tras periodos relativamente cortos de incubacin (Suni, 1998). Se ha prestado especial atencin al desarrollo de anticuerpos que reconozcan las formas de nacientes de las citocinas (dentro del aparato de Golg) y la optimizacin del tiempo de cultivo para detectar la mxima respuesta de las atocinas (Mascher, 1999). Los estudios clnicos han comenzado a demostrar la utilidad potencial de esta tcnica. Por ejemplo, los pacientes que sufren quemaduras m u y graves y que muestran una deriva hacia la respuesta de citocinas Th2 pueden tener un riesgo mayor de desarrollar fracaso multorgnico (Zedler. 1999). Esto puede ser m u y ventajoso, ya que no hay pruebas actuales que indiquen qu pacientes sufrirn esta complicacin potencialmente

Algunos laboratorios han reemplazado los ensayos de incorporacin de timidina tritada por anlisis de induccin de marcadores de superficie celular combinados con una medida del porcentaje de clulas en vanas fases del ciclo celular tras la activacin (Cost. 1993). Recientemente, se han desarrollado marcadores que se integran de forma estable en las membranas de los linfocitos vivos. Tras eliminar el exceso de marcador, se estimula la divisin de los linfocitos. Con cada divisin sucesiva la cantidad de marcador por clula se reduce a la mitad. La fluorescencia emitida por las clulas tras el cultivo puede modelarse permitiendo la estimacin del nmero de divisiones celulares (Fig. 36-2). Esta metodologa se ha estandarizado recientemente en un equipo analtico que incluye el soft-

Figura 36-1. Curso temporal de los acontecimientos implicados en la activacin de los linfocitos T, que pueden detectarse por citometria de flujo (Modificada de Shapiro HM: Practical Flow Otometry. 3- ed. Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pag 397 Copyright <g Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley 8 Sous, Inc.)

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EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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mortal. Se estn realizando actualmente muchos estudios que evalan la utilidad clnica de esta prometedora nueva tecnologa. Se ha informado la expansin de esta tcnica para incorporar la capacidad de medir simultneamente la proliferacin y la sntesis especfica de citocinas a nivel de una sola clula pero todava no ha sido evaluada en un marco clnico (Mehta, 1997). Ciertamente, se estn desarrollando nuevas tcnicas que miden los diferentes acontecimientos implicados en la activacin de la clula T. Hay mtodos y reactivos disponibles para medir los acontecimientos precoces de fosforilacin/desfosforilacin hasta la transduccin de seales, la transcripcin de los genes y la divisin celular. Segn se adapten estos mtodos a la actividad clnica diaria, podremos disponer de un arsenal de estos para evaluar muchos de los procesos implicados en la activacin y proliferacin de los linfocitos. Aunque un elevado nmero de estas nuevas tecnologas todava estn en manos de los laboratorios de investigacin, los mtodos se estn simplificando y adaptando constantemente para su uso y evaluacin en los laboratorios clnicos.

FUNCIN GRANULOCTICA EN LA INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS

Tanto los monocitos como los granulocitos derivan de un precursor comn. Los granulocitos son extremadamente importantes en la respuesta inflamatoria precoz, y las alteraciones en sus funciones conducen a deficiencias importantes en la inmunidad celular. Estas suceden en cualquier punto de una serie de procesos necesarios para la funcin de los granulocitos, incluyendo la dificultad en abandonar la vasculatura (diapdesis), el movimiento hacia el agente agresor (quimiotaxis. quimioquinesia). la opsonizacin del agente agresor (fagocitosis) y la destruccin por la va de la generacin de radicales txicos del oxgeno.

sean ms relevantes y tiles en el laboratorio clnico (Weinberg. 1993). Recientemente, la FDA aprob el anticuerpo monoclonal obtenido por ingeniera gentica trastuzumab (Herceptin) para el tratamiento de pacientes con cncer de mama metasttico cuyos tumores sobreexpresan el gen HER2meu y al mismo tiempo aprob una prueba diagnstica en la que se usan mtodos de inmunohstoqumica (IHC) para la deteccin de la proteina HER2/'neu, que es la diana del anticuerpo. Otra prueba que utiliza la FISH para detectar la amplificacin de la expresin gnica de la proteina HER2/neu se est utilizando en laboratorios especialmente entrenados. Cada prueba complementa a la otra, poseyendo cada una distintas dificultades tcnicas y sensibilidad. El IHC suele producir falsos negativos debido a la existencia de artefactos y necesita ser revisado por otro mtodo. Con el FISH existe la posibilidad de falsos positivos (la expresin gnica no tiene por qu equipararse necesariamente con la amplificacin gnica). Como sucede en muchas tcnicas, incluyendo el anlisis del ciclo celular en el ADN. cada uno de los nuevos marcadores y de las nuevas tcnicas deben ser definidos, evaluados y correlacionados con los resultados del paciente antes de otorgarle o no una utilidad clnica absoluta. Se ha introducido el desarrollo de instrumentacin que combina la fuerza de la citometria de flujo y las ventajas estticas del anlisis de imagen. Esos instrumentos, conocidos como citmetros de exploracin por lser, realizan las mediciones tradicionales de citometria de flujo de dispersiones hacia adelante, dispersiones laterales y fluorescencia en las clulas en suspensin o fijadas en el portaobjetos. La experiencia con estos sistemas determinar si este abordaje ofrece ventajas de las que no se dispone con la citometria de flujo actual y con las configuraciones de sistemas de imagen (MartinReay, 1994) (Fig. 36-3). Los citmetros de exploracin por lser y los anlisis de imagen no se desarrollan en este captulo. Los avances combinados en el procesamiento por pulsos electrnicos, pticos y en el almacenamiento de datos junto con los avances en la tecnologa de los ordenadores y del software han permitido que la tecnologa de la citometria de flujo llegue a ser una rutina en el laboratorio. Adems, la amplia posibilidad de anticuerpos monoclonales agrupados, que incluyen ms de 150 (Kishimoto, 1998), marcados con muchos colores, directamente conjugados y en formato preformado ha permitido la deteccin simultnea de mltiples antigenos de superficie as como de constituyentes citopiasmticos y nucleares. La posibilidad de desarrollar anlisis multiparamtricos es la mayor fuerza de la citometria de tiujo. Actualmente, la determinacin tanto de los marcadores fenotpicos como de los intracelulares es una rutina en muchos laboratorios. Los principales fabricantes han desarrollado el arte de la citometria de flujo convirtindolo en una ciencia de rutina en los laboratorios (ciencia de "caja negra") para desgracia de muchos. Como se ha descrito, este fenmeno es el resultado del uso de la citometria de flujo en la fenotipificacin de las poblaciones de las clulas T para la monitorizacin de los pacientes con VIH (Shapiro, 1993: Centers for Disease Control [CDC], 1992; Calvelli, 1993). Antes de la aparicin de la epidemia del VIH, la utilidad de la citometria de flujo en el laboratorio le principalmente para la caracterizacin de las leucemias y de otras enfermedades hematolgicas malignas y para el anlisis del ADN de tumores en la fase de sntesis (fase S) y el ndice de ADN (DI). Aunque la tecnologa de la citometria de flujo puede ser ms "caja negra", la epidemia de VIH ha aportado la citometria de flujo a un nmero mucho mayor de instituciones y laboratorios [College of American Pathology [CAP]. 1990-2000). Esto ha permitido a esta tecnologa ser una parte integral de muchos diagnsticos y un importante complemento en el tratamiento de los pacientes. A pesar de su simplificacin, persisten muchas cuestiones relacionadas con la regulacin de la FDA, la competencia de los anlisis y la gestin y reproducibilidad de los datos. Eslo es particularmente cierto en lo referente al anlisis del ADN (CAP, 1990-2000). No es el propsito de este captulo describir todos los matices de la citometria de flujo o de la citometria de imagen. Todas las citometras de flujo actuales pueden utilizarse adecuadamente como rutina en la fenotipificacin y anlisis del ADN. La mayora de los problemas de los laboratorios son la imposibilidad de estandarizar los reactivos de control de calidad y los calibradores y la prdida de mtodos rpidos y fiables para la transferencia y almacenaje de datos, compatibles con los sistemas de informacin del laboratorio. Se insta a los lectores a que consulten las numerosas referencias para una seleccin apropiada del citmetro de flujo o de imagen referente en cuanto a sus muchas configuraciones y capacidades (Shapiro, 1993, 1995).

METODOLOGA: CITOMETRA DE FLUJO Y DE IMAGEN

El empleo de la citometria de flujo (anlisis celular basado en el lser) se ha convertido en el estndar de la prctica del laboratorio clnico en el estudio de respuesta inmune celular, como se indic previamente (Kamientsky. 1969; Hertzenber, 1976). Las determinaciones de la inmunocompetencia e nmunomodulacn de los marcadores y receptores de superficie especficos, la caracterizacin de la lnea por medio de la fenotipificacin inmune de los linfomas y de las leucemias, la definicin de malignidad empleando sondas especficas de cromosomas, as como el estudio de la heterogeneidad tumoral por las mediciones multiparamtricas del ADN son estudios frecuentemente realizados en muchos laboratorios, como se estableci previamente, y se detallan en Keren (1989a. 1989b), as como en muchas otras referencias mencionadas a lo largo de este texto. La clasificacin de los tipos celulares por estos medios significa la posibilidad de definir las funciones biolgicas y efectoras en las bases moleculares y permite establecer las relaciones de estas mediciones con procesos y definiciones de enfermedades. Estas son unas pocas de las aplicaciones que son posibles empleando las tecnologas basadas en el lser. Se utilizan dos tecnologas principales. En la primera, conocida como citometria de flujo, se contabilizan las partculas y se determinan las caractersticas fsicas y qumicas de las partculas que pasan a travs de un flujo de lquido en una suspensin de clulas aisladas. En la segunda, conocida como anlisis esttico, las partculas son estacionarias y la plataforma o el lser se mueven como en un anlisis de imagen (Martin-Reay. 1994). La tecnologa del anlisis de imagen se est haciendo un hueco poco a poco en el laboratorio para la evaluacin de citospines preparaciones de contacto {louch preparations). en preparaciones cromosmicas. y en secciones titulares para ciertas aplicaciones, como la hibridacin n situ fluorescente (FISH) y de DNA. Los avances en la disponibilidad de las sondas fluorescentes para la FISH y la representacin cromosmica en los aos recientes har que estos anlisis

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 36-3. El empleo de citmetro de exploracin por lser (LSC) produce dalos que son comparables a los datos de la citomelra de flujo: sin embargo, debido a que la mquina se basa en cortes, hay algunas diferencias clave. A diferencia de la citomelra de flujo, en la que toda la informacin de cada clula se encuentra en un solo pulso electrnico para cada parmetro, la LSC emplea cientos de mediciones para calcular y extraer los parmetros para cada clula. Tambin es posible obtener parmetros derivados. El valor celular es la cantidad total de fluorescencia por clula, pero los parmetros derivados, como el rea celular y el valor pico, son tambin importantes. La figura muestra los datos de una preparacin con cytospin de clulas HL-60 que fueron marcadas con yoduro de propidio (Pl). Se muestra el histograma de un solo parmetro del valor rojo, as c o m o las tres posibles combinaciones de los parmetros rojos derivados. De particular inters es la agrupacin de clulas localizada debajo de la letra c. La muestra tue teida con hematoxilina y eosina. y las clulas de las reas m a r c a d a s (videsupca) fueron trasladadas. Se muestran las lotos digitales de las primeras 20 clulas trasladadas a cada regin. Las clulas en la regin c estn en mitosis. mientras que las clulas en la regin d, b. y a se corresponden a clulas a travs de las etapas G.a, G,b. y G;m del ciclo celular. (Cortesa de CompuCyte. Cambridge, MA.)

Ms importante para los mdicos es la comprensin de la tecnologa, las fortalezas y las debilidades en el control y garanta de la calidad, en la preparacin de la muestra y en la interpretacin de los datos.

Hardware y otras herramientas Fuente luminosa y procesamiento de la seal

La citomelra de flujo actual rara vez se utiliza para realizar una clasificacin, y esta propiedad persiste con los elementos de investigacin en los laboratorios altamente especializados. La citometra de flujo clnica emplea

ahora helio-nen o diodos lser y lser de ion de argn refrigerados por aire o un nico ion de argn refrigerado por aire con emisin a 488 nm (Bogh. 1993). El lser actual tiene una salida de pocos milivatios, entre 10 y 20 mW, y dura ms de 6.000 horas. Esos lseres, comparados con los previos refrigerados por agua, son fciles de mantener, no requieren precauciones especiales de seguridad y son ms baratos de sustituir. Si un laboratorio est interesado en desarrollar cinco o ms colores de anlisis empleando sondas de Hoescht estimuladas con radiacin ultravioleta, entonces es necesario emplear grandes lseres refrigerados por agua de 5 W combinados con los lseres refrigerados por aire, aunque los nuevos instrumentos con nuevos lser estn eliminando la necesidad de los lseres relrigerados por agua. La

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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

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mayora de los citmetros de lujo multifacticos clnicos utilizan un lser simple de ion argn refrigerado por aire con un minimo de cuatro tubos lotomultplicadores. Las configuraciones instrumentales ms Irecuentes incluyen el Becton-Dickmson FACScan que est siendo reemplazado por el FACS-Calibur (tiene un mdulo de clasificacin con capacidades limitadas) y el FACS Vantage para ocho o ms parmetros y categonzacin de alta velocidad. El Coulter Protile II y el Odho Cytoron, instrumentos de laboratorio habituales, ya no se fabrican y han sido sustituidos sobre todo por el Coulter XLs o el FACSCalibur. Beckman Coulter contina con el Coulter XL y software mejorado para el tratamiento de datos. Adems, el ASTRA de Beckman Coulter aade a la categonzacin de alta velocidad, ocho parmetros adicionales para el laboratorio de investigacin. La introduccin del XL como ltima tecnologa en citometra de flujo con el empleo de seales de procesamiento de pulso digital (Coulter, 1994; Shapiro, 1995). con convertidores de analoga digital de alta resolucin (ADCs). invalida el uso de los amplificadores logartmicos (log amps). Este es un importante avance ya que elimina cuestiones de alineacin y baja sensibilidad en los lmites bajos (umbral) en la medicin de la intensidad de fluorescencia. En la citometria de flujo tradicional, las mediciones de la fluorescencia se realizan en una escala lineal pero tienen que ser convertidas a logaritmos para que la escala sea razonable (para colocar todos los puntos de inters). Este proceso en los instrumentos no digitales se lleva a cabo con el empleo de ACD con amplificadores logartmicos. Desgraciadamente, esta conversin de la seal lineal por medio del ADC a los amplificadores logartmicos ocasiona un ruido que origina un aumento de los coeficientes de variacin de procesamiento de la seal (CV) al aumentar la seal fluorescente Esto hace que cada medicin tenga diferente sensibilidad ya que el CV de la seal de conversin aumenta con un mayor nmero de canales (Shapiro. 1995a). Aunque muchos tcnicos que utilizan una citometria de flujo clnica realmente no entienden la causa de la sensibilidad variable de los amplificadores logartmicos en sus instrumentos, se enfrentan a los resultados o a la falta de respuesta en ciertas regiones de su escala logartmica. La linealidad es particularmente importante en la medicin del contenido del ADN (como las mediciones del ADN se hacen en una escala lineal, los problemas de la amplificacin logartmica se eliminan pero entran en juego otros factores electrnicos similares) ya que el valor DI depende de su exactitud. Ademas, la alineacin se est haciendo cada vez ms importante en la medida cuantitativa de la fluorescencia de la proliferacin y la activacin (Auer. 1994; Shapiro, 1995) as como est afectando al valor pronstico de los valores de la fase S en ciertos cnceres. El laboratorio debe realizar medidas de linearidad. sensibilidad y resolucin, y controles de calidad antes de desarrollar trabajos clnicos. Los controles de calidad diarios se definen posteriormente en este captulo. Se remite de nuevo a los lectores a revisar referencias apropiadas para ampliar con detalle (Bauer. 1993: Shapiro, 1995).

en estos sistemas para proporcionar seguridad y una mxima sensibilidad con el uso de sistemas basados en lser de baja potencia iBogh. "993). Todos los trminos empleados en la definicin de estos sistemas son confusos, incluyendo la tasa del flujo, la cubierta de presin, el tamao de la parte central, la velocidad resultante de la partcula, el CV resultante, etc El factor ms importante que ha de comprender un trabajador de laboratorio es que en el anlisis del ADN, las clulas son analizadas con un flujo bajo para aumentar el tiempo que permanece la partcula en el haz, lo que permite una mayor sensibilidad y un mejor CV. En la inmunotipificacin. la sensibilidad no es un problema especial, y el flujo de la partcula puede aumentarse. Muchos sistemas clnicos estn comprometidos en acomodar las dos aplicaciones ms frecuentes: la inmunotipificacin y el anlisis del ADN (Shapiro, 1993, 1995a: Goetzman. 1993). Los citmetros de flujo de investigacin tienen mucha mayor flexibilidad y el operador puede controlar el flujo de la muestra, la presin diferencial y el tiempo

Colores y ms colores: aplicaciones de los fluorocromos

Muchos laboratorios todava emplean los fluorocromos ms frecuentes, el isotiocianato de fluorescena (FITC: 530 nm de emisin) y el ficoeritrin (PE; 575 nm de emisin) en la medida del ADN (Shapiro. 1995b). El FITC y el PC se conjugan directamente por el anticuerpo de inters y simultneamente se aaden a la muestra del paciente. Ya no se requiere del uso de un anticuerpo secundario como una IgG de carnero antirratn (GAM) marcada con fluorescena para tener una mayor sensibilidad, y por lo tanto se minimiza la fluorescencia de fondo. Muchos de los anticuerpos utilizados en la clnica en el estudio del VIH son premezclados y prediluidos para su empleo con sangre completa. El Pl puede utilizarse simultneamente con el anlisis de superficie realizado en el anlisis multiparamtrico del ADN, aunque esto requiere la conservacin de la membrana celular (Clevenger, 1993). Existen ms tinciones disponibles en el laboratorio clnico que permiten mediciones simultneas de cuatro colores con anticuerpos monoclonales marcados directamente y excitados en un lser a 488 nm. Esta disponibilidad est revolucionando el desarrollo actual de la citometria de flujo en la prctica de laboratorio Estas tinciones con una emisin roja o roja lejana incluyen el tndem PE Texas Red (625 nm de emisin), el tndem PE-Cy-5 (675 nm de emisin) y la alolicocianina (675 nm de emisin), por nombrar unos pocos (Fig. 36-4). Los primeros tndem eran problemticos ya que el exceso de PE libre en la solucin conduca a un exceso de fluorescencia de fondo. Estn surgiendo nuevas tecnologas para la sntesis de estas tinciones, resolviendo muchos de los problemas tcnicos, y constantemente se estn aadiendo nuevas tinciones para el empleo en el laboratorio clnico (Clevenger. 1993). Con la disponibilidad de las tinciones rojas y rojas lejanas, se puede desarrollar un anlisis de la poblacin de VIH en un nico tubo con gran seguridad. Un tubo con 100 pL de sangre completa se lie simultneamente con CD45, PE-Cy-5. CD3 PE-Texas Red. CD8 FITC y CD4 PE. Con el nuevo procesamiento de seal digitalizado. la compensacin (wde inlral se lleva a cabo fcilmente, y se realiza el anlisis empleando el CD45 c o m o un agente iniciador mediante dispersin lateral (SSC) y el anlisis simultneo de CD3. CD4 y el CD8 (Fig. 36-5). Otro fenmeno interesante es que estas nuevas tinciones han permitido el empleo de la fluorescencia c o m o un iniciador en lugar de los parmetros habituales de dispersin de luz. Esto es posible porque no hay espectro de colores rojo lejano en los componentes de la mayora de las clulas o no tienen competicin autofluoresceme en estado natural como se encuentra con el FITC. Adems, pueden excitarse a una longitud de onda que minimiza la autofluorescencia de los constituyentes celulares como la riboflavina. Por tanto, cuando ocurre un suceso raro (presencia celular <0.1% de la poblacin total) empleando un iniciador fluorescente, se pueden analizar muchas clulas rpidamente Este mtodo tambin se emplea para marcar leucocitos en sangre no lisada utilizando fluoresceina como iniciador. Se utiliza un marcador que marca el ncleo o el citoplasma de los leucocitos y no el de los eritrocitos. Los mtodos de evaluacin de sucesos raros son cada vez ms frecuentes y ms fiables para el laboratorio clnico. Se han realizado y evaluado algunas investigaciones. En la evaluacin de la enfermedad residual mnima (MRD) incluyen la PCR. la citometria de flujo combinada con sondas nucleares, la citometria de flujo

Flujo celular
En el laboratorio se utilizan dos flujos celulares frecuentes, pero como la mayora de los instrumentos clnicos se utilizan en la medicin de las clulas CD4 en la monitonzacin de la enfermedad por VIH, la mayora de los sistemas clnicos utilizan un sistema cerrado como precaucin de riesgo biolgico. El primero, conocido como un flujo celular de corriente en aire o de flujo en aire, permite que el punto de medida ptico se encuentre directamente sobre la corriente de muestra. Este tipo de flujo celular minimiza la distancia entre la cmara de flujo y la punta del inyector de la muestra y por lo tanto minimiza el arrastre entre muestras y el tiempo de lavado de muestra necesario entre las mismas. Esta cmara permite una mayor variabilidad del grado de flujo de la muestra que en un sistema cerrado (Shapiro. 1993: Bogh. 1993). Otras ventajas de las puntas en la corriente en aire son importantes en la clasificacin celular y no se consideran aqu. En el sistema cerrado, a menudo referido como punta de cuarzo o clula de flujo, el punto focal est dentro de la cmara. Las desventajas de estos sistemas de cuarzo son la fineza del cuarzo y por ello la difraccin del haz del lser o la dispersin de la seal. Adicionalmente. la seccin cuadrada tan relativamente amplia (200/ pm) hace que sea ms difcil controlar el flujo. El xito de estas clulas de flujo de cuarzo en el sistema clnico depende de la iluminacin y de las pticas de recogida. Los fabricantes conocidos han avanzado mucho

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INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

Figura 36-4. Sondas fluorescentes frecuentes empleadas en la citometra de flujo multicolor multiparamtrica (De Shapiro HM: Practical Flow Cytometry. 3- ed. Nueva Cork, Wiley-Liss, 1995. pg. 245. Copyright Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.)

con la utilizacin de mltiples marcadores que delinen el fenotipo leucmico y varias aplicaciones del FISH. Los datos sugieren que la remisin real de la mdula sea en la leucemia mieloide nunca ocurre realmente como se ha demostrado en el anlisis de citometra de flujo; simplemente es un tema de nivel de sensibilidad y de deteccin del suceso (Campana. 1995.1999). Esto

obviamente tiene grandes implicaciones cuando se correlacionan los resultados de la citometra de flujo frente a los criterios morfolgicos de remisin y prediccin de recidivas. Sigue evalundose cmo afectar esto a las estrategias de tratamiento en varias enfermedades hematolgicas malignas. Adems, el empleo de la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) es ms habi-

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EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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tual. La deteccin de las seales de RT-PCR en pacientes que se encuentran en remisin clnica todava no est clara, mientras que la deteccin del MRD por amplificacin de la PCR de los genes del receptor antignico se ha correlacionado consistentemente con los resultados del tratamiento (Campana, 1999). El empleo de fluorescencia multicolor ha permitido que el concepto del anlisis mulliparamtrico llegue a ser una realidad en muchos laboratorios. Los parmetros pueden evaluar 1) diferentes poblaciones funcionales de una poblacin celular particular empleando unas sondas fluorescentes mtracelulares; 2) el empleo de muchos colores para identificar pequeos grupos de

otros sucesos no identificables de otra forma (como en el MRD): (3) el estatus de activacin celular en una etapa particular de la enfermedad (p. ej., el empleo del HLA-DR y el CD38 en los CD4 y CD8s en la estadificacin del VIH empleando un abordaje en ancla): (4) asi como observar la expresin de la superficie celular y el DI o fase S de una poblacin particular de clulas al igual que definir la fase S CD19 en la leucemia aguda. Obviamente, las posibles combinaciones son casi infinitas y su sofisticacin est aumentada por la disponibilidad de marcadores especficos y sondas de ADNARN (Fig. 36-6). A continuacin se expone un anlisis sobre algunas de esas investigaciones y tcnicas.

4 C O L O R (1)45/4/3/8

Figura 36-5. A. Empleo de la atometra de flujo de cuatro colores en el desarrollo del panel de m o n i tonzacin del VIH. El mtodo d e m u e s t r a el e m p l e o del CD45 c o m o estrategia de c o m i e n z o y el empleo del CD45 y la dispersin de luz en el desarrollo de una diferenciacin en tres partes (H-6). El empleo de la citometria de flujo de cuatro colores permite que las poblaciones de clulas T sean medidas en el m i s m o tubo y que todas las clulas sean contadas. El histograma 7 se incorpora en la regin F contenida en el histograma 1 (FALX frente a SSC). En el histograma 1. el e m p l e o de l a regin Q define los desechos. Si estos son m a y o r e s del 1 5 % del total de sucesos, n o r m a l m e n t e se t o m ac o m o una muestra inaceptable. Esta investigacin permite analizar t o d o s los parmetros y c o m p a r a r l o s entre si. (Los anticuerpos monoclonales directamente conjugados fueron de clones Coulter o ( S e c t o r Dickinson para el FTIC PE. Coulter para el ECD y de Callag Corporation para el Cy-5-CD45.) La ilustracin contina en pgina siguiente

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INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 36-5. Continuacin. B. panel de monilorizacin del VIH c o m o en A, excepto que en este caso los paneles incorporan el empleo de un parmetro de recuperacin lintoctico calculado con FALS trente a SSC y CD45 y Irente a SSC. Adicionalmente, en H:2 se demuestra el empleo de una entrada-T. Estas estrategias de recepcin permiten calcular y comparar mltiples valores del CD3 trente a otros.

ID Pcnt 11 1.7 12 71.2 13 1.4 14 25.6

Figura 36-6. El empleo de la citometra de flujo multiparamtrica permite la deteccin simultnea d eu n a superficie fluorescente (CD20 positiva) y por lo tanto la definicin de la linea celular y despus la posibilidad simultnea de medir la intensidad de yoduro de propidio y as la medicin del contenido total de ADN. para identificar las clulas leucmicas especficas marcadas c o m o CD20. Esta tcnica evita la necesidad de aislar la poblacin de inters antes de la tincin del ADN y puede hacerse simultneamente c o n la tincin de la mdula sea para la evaluacin leucmica. Otras poblaciones, c o m o las citoqueratinas y otros m a r c a d o r e s de estirpe celular, pueden ser identificadas en t u b o s adicionales. La muestra de mdula sea fue teida con CD20 FITC (Coulter, Miami, FL) y despus fijada empleando metanol, permeabilizada usando Tritn X al 0.1%, y teida con solucin d e yoduro de propidio (Pl) y ARNasa estndar. L o s linfocitos d e sangre perifrica fueron utilizados c o m o control normal no ciclico (no se m u e s t r a n los dalos).

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RECEPCIN Y ANLISIS Inmunofenotipificacion: aplicacin a las muestras habituales y leucmicas

El anlisis de las poblaciones celulares con la citometra de flujo emplea una combinacin de parmetros que. cuando se aplican, definen una poblacin especifica de clulas. La citometria de flujo emplea parmetros similares a aquellos que se han empleado durante muchos aos en hematologa, incluyendo el tamao (por dispersin de luz hacia delante), la granulacin citoplasmtica (dispersin lateral), las afinidades por marcadores especficos y otros, y las combina con las herramientas inmunolgicas ya mencionadas. Estas incluyen mltiples marcadores fluorescentes unidos a anticuerpos o sondas, mediciones de ADN realizadas empleando bien Pl o 4'6-diamidin-2fenolindol (DAPI) y otros marcadores nucleares. La clave es la deteccin simultnea de estos parmetros por los sistemas analticos actuales. Durante muchos aos, la citometria de flujo del laboratorio clnico slo poda emplear tres mediciones simultneas incluyendo la dispersin de luz hacia adelante (FALS) frente al SSC, frente al FTIC o al PE. La tincin de las poblaciones celulares estaba limitada por la no disponibilidad de anticuerpos monoclonales conjugados directamente, necesitndose la utilizacin de un reactante GAM secundario o el empleo de anticuerpos marcados con botina. La definicin de poblaciones positivas o negativas en los casos con gran tondo hizo necesario el uso de un algoritmo de resta canal por canal para diferenciar lo positivo de lo negativo (Bagwell. 1993). En los casos en los que la poblacin celular tiene un lmite definido entre negativo y positivo, se colocaba un cursor de modo que no ms del 2% de los acontecimientos considerados como negativos cayeran a la derecha del cursor, diferenciando los acontecimientos positivos empleando un control isotpico emparejado. Aunque esta investigacin pareca razonable en aquel momento (Lewis, 1993) y funcion bien con grupos celulares brillantes, se ha hecho bastante incmoda a la hora de identificar clulas leucmicas o de desarrollar anlisis de marcadores de activacin celular. Las clulas leucmicas eran particularmente problemticas, porque cada leucemia tiene su propia intensidad fluorescente "relativa" y los controles isotpicos pueden tener poca relevancia. La aplicacin de reglas estrictas y rpidas a los cursores de posicin conduca a una infraestimacin de los grupos positivos. El fallo de esta lorma de actuacin se hace especialmente dramtico en el anlisis de la monoclonalidad de la expresin de cadenas ligeras K y A. A menudo se perdan diferencias pequeas pero significativas. Se ha cuestionado en muchos casos el empleo de isotipos de control en ciertas situaciones, tanto por las aberraciones tcnicas asociadas con su utilizacin como por los costes aadidos al laboratorio. Los nuevos algoritmos de software tienen la capacidad de realizar mediciones de intensidad y de definicin de grupos basndose en los significados de las intensidades de las poblaciones, incluyendo las intensidades fluorescentes relativas asi como la cuantilicacin del MESF real [vide intra). Claramente, ha de considerarse la necesidad de recordar lo que estamos midiendo y comprender la biologa de la poblacin de inters cuando se disea un protocolo de anlisis. Afortunadamente, algunos software sofisticados y los mejores reactantes nos han permitido utilizar entradas multiparamtncas para identificar las poblaciones, antes que intentar hacer estimaciones de la expresin fluorescente empleando valores cursor. Muchos investigadores han empleado la investigacin mulliparamtrica para definir grupos u otras poblaciones de inters (Shapiro, 1995c; Loken, 1987; Terstapen, 1988,1990; Verwer, 1993; Porter, 1999). Estas investigaciones tienen muchas formas, y algunas de ellas se revisan aqu. Con la llegada de la florescencia multicolor surgi la necesidad de analizar el nmero de clulas que expresaban uno o ms colores al mismo tiempo en una poblacin celular particular identificada por las regiones FALS y SSC. Cuando se desarroll este mtodo por primera vez. los cientficos estaban pensando bsicamente en clculos matemticos y recuento de todas las clulas y en el nmero de estas clulas que expresaban uno o ms colores. Se desarroll una investigacin binaria para este anlisis, conocida como prisma (Coulter. Hialeah, FL). Las regiones de anlisis tenan una entrada difcil y fueron introducidas en el instrumento por el operador. Estas regiones no se podan redefnir posteriormente utilizando listas de anlisis de modos,

provocando una frustracin importante. La tcnica fue modificada con posterioridad para permitir ms recepciones, y otros fabricantes con el software realizaron esta aproximacin binaria con base postanallica Loken entonces identific las poblaciones de la mdula sea empleando el CD45 frente al SSC. una investigacin nica para identificar las poblaciones heterogneas presentes en la mdula sea (Fig. 36-7). Estos y otros iBorowitz. 1992) desarrollaron el concepto de patrones que identifican estados leucmicos especficos. Shapiro emple una va de estimulacin para definir la evolucin de este concepto (Shapiro, 1995c). Despus Loken promocion el empleo del anlisis de entrada dual-paramtrico con CD45 y CD14 en la regin linloci tica del FALS frente al SSC en sangre perifrica (Loken, 1990). Muchas agencias aceptaron y promovieron esta investigacin en la mayoria de los paneles de citometria de flujo para el VIH para minimizar el efecto de los monocitos contaminantes en la poblacin Imfoctica ya que podran interferir con el recuento real de linfocitos CD4. porque los monocitos tienen receptores CD4 en su superficie (Passlick. 1989). Las agencias que iniciaron este tipo de anlisis incluan los Centros para el Control y Prevencin de Enfermedades (CDC. 1992), el Instituto Nacional de Enfermedades Alrgicas e Infecciosas, la Divisin de SIDA (NIH, DAIDS) (Calvelli, 1993). el Estado de Nueva Cork, el Comit Nacional para la Estandarizacin del Laboratorio Clnico (NCCLS. 1992) y el CAP (1990-2000). Desgraciadamente, aunque esta investigacin solucion muchos problemas, no asegura que cada tubo en el panel tenga los mismos contenidos que el tubo que contiene el CD45 y el CD14, y la correccin purificada corregida puede ser sobreestimada, conduciendo a valores incorrectos del CD4 Estos temas fueron revisados durante una conferencia convocada por el CDC. un ao despus de que se publicaran las lneas para el desarrollo del recuento del CD4 en el VIH (Steizer. 1993; CDC. 1993). Otros anlisis de esta investigacin se han desarrollado por el ACTG Flow Advisory Comittee en el programa DAIDS Proficiency CD4.CD8 iCDC. 1 9 9 3 ; Kagan, 1993) y por el CAP en su programa de anlisis de competencia (Homberger, 1993). Una nueva investigacin de recepcin fue evaluada en los paneles del VIH que siguieron a la investigacin original de Loken para identificar los grupos de la mdula sea (Loken. 1990). El empleo del CD45 como parmetro de entrada ha simplificado el anlisis de la mdula sea, las leucemias y los paneles de VIH. En las revisiones de mdula sea y leucemia, el CD45 normalmente se establece como un tercer o cuarto color y se empareja con la dispersin luminosa anterior o la dispersin lateral; esto permite la identificacin de una pobla cin potencial de blastos (malignos) La poblacin de blastos entonces se identifica empleando un panel de monoclonales utilizando los tres parmetros de color disponibles (Fig. 36-7). En el VIH. el mtodo de CD45 en tubo, con cuatro colores, permite la identificacin de una regin grande de linfocitos iniciados, que son introducidos secundariamente para el CD45. Esto tambin puede hacerse sin la utilizacin de los parmetros de dispersin luminosa, como se describi previamente (tambin puede hacerse empleando un panel de dos tubos, tres colores). Recientemente, nuevos productos (Becton-Dickinson y Beckman Coulter) aaden gotas precontadas ai tubo de contenido monoclonal y esto permite el recuento absoluto de irfo citos (conocido como flujo diferencial) para realizarse al mismo tiempo que la fenotipificacin. Esto elimina la necesidad de realizar un recuento hematologa) cuando se desarrollan las enumeraciones de clula T y elimina los problemas del deterioro de los glbulos blancos al empaquetarse y permite un diferencial exacto para obtener el nmero de clulas T exacto. Estos mtodos estn siendo incorporados en los ensayos ACTG VIH y en oros laboratorios. Otra estrategia de recepcin es el empleo de dos o tres identilicadores de una poblacin particular de inters. Esta investigacin, frecuentemente conocida como puerta de entrada (anchor gating), utiliza las propiedades particulares de algunas clulas para investigar otro tipo de parmetros. Cuando se aplican especficamente a linfocitos T, se considera como una puerta-T (Mandy. 1992). El empleo de una puerta de entrada (Paxton, 1995) es de especial utilidad cuando se buscan los marcadores de actividad, como en las poblaciones de VIH CD3 CD8 que expresan CD38 y HLA-DR o para buscar la expresin de CD45Ra y CD45Ro frente a CD3CD4 o CD3CD8. La ventaja de este mtodo es que es intuitivo y que cada color acta como un control de calidad para la otra poblacin (Fig. 36-8). Adems, tenemos la posibilidad de identificar la expresin de marcadores biolgicamente relevantes en relacin

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INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
3: P
4:

k ENTRADA Bl STIC A

ENTRADA DF. MEDULA OSEA 45 (1)34 C"D33 (1)45

Figura 36-7. Mdula sea utilizando entrada de CD45 frente a la tradicional entrada de imagen luminosa: (paneles H1-H3): H1: FALS frente a SSC. H2: entrada linftica. FTIC frente a PE, identificando la poblacin de blastos CD34/CD33 doble positiva (61,1% de todos los linfocitos se identifican c o m o blastos). H3: Entrada total. CD34/CD33 doble positivo (43,6% del total de acontecimientos identificados c o m o blastos). H4: Blastos identificados por el CD45 frente al FALS son iguales a 46,5% (letra regin k). con un 74,8% CD34/CD33 doble positivo. Paneles H5, H6, H7: Dispersin lateral identificada p o r marcador fluorescente de inters (PE-CD33, FITC-CD34. Cy-5 [tricolor] CD45). (Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente fueron obtenidos tanto de Coulter c o m o de Becton-Dickmson para los clones FITC- y PE marcados. Coulter para los clones ECD marcados y Caltag Crp. [S. San Francisco, CA] para los clones Cy-5 marcados.)

con las poblaciones funcional o biolgicamente relevantes. Esta evaluacin es buena por si misma para cuantificar la fluorescencia (vanse histogramas 2 y 3. respectivamente). Aunque el concepto de fluorescencia cuantitativa no es nuevo, s lo son las tcnicas para medir los equivalentes de fluorescencia o los umbrales de fluorescencia u otros similares. Las mediciones cuantitativas de la fluorescencia se describirn tras el anlisis y entrada del ADN. Otra investigacin para la puerta de entrada se encuentra en la recogida de CD34, que emplea el CD34 y el CD45 teidos con o sin ADD como una evaluacin de viabilidad en la identificacin y enumeracin de los progenitores celulares CD34. Estos mtodos tambin utilizan gotas para enumerar el nmero de clulas recubiertas. Estos mtodos tienen gran utilidad en los protocolos de trasplante de mdula sea en los que los progenitores celulares se extraen de la sangre del cordn, de la mdula sea o de sangre perifrica y, posteriormente, se reinfunden (p. ej., The Internacional Society for Hematolherapy and Graft Engineering [ISHAGE] (Fig. 36-9). Esta investigacin se ha convertido en el patrn para muchos laboratorios que realizan trasplantes. La Figura 36-9 delinea dos mtodos estndar, el ISHAGE y el protocolo Miln para desarro-

llar la enumeracin de CD34. Un sistema comercial llamado ProCount (Becton-Dickinson) utiliza una investigacin similar y reactivos para automatizar el proceso. Adicionalmente. se ha diseado un mtodo capilar llamado ensayo Steller, un procedimiento sin lisado ni lavado para el IMAGN 2000 (BectonDickinson).

Anlisis del ADN Generalidades

Conceptualmente, la realizacin del anlisis del ADN debera ser ms simple que el anlisis de inmunotipificacin, pero la revisin de los datos publicados y sus capacidades pronosticas asi como los progresos por los laboratorios sobre las pruebas de competencia indican otra cosa (Nicholson, 1993; Coon, 1994; Trinidelli Danesi, 1997). Se convoc una conferencia de consenso de ADN y los resultados se publicaron en Cytometry (Shankey. 1993). Esta publicacin fue una revisin histrica de los principales tipos de

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tumores (en muestras en fresco, congeladas y en parafina) y del valor clnico de la medida de la ploidia por DI y el valor de la fase S. Estos parmetros fueron analizados en trminos de efectividad como marcadores pronsticos. L a conferencia CAP #26 de 1994 se bas en los marcadores previos y en marcadores indirectos de algunos tumores potenciales adicionales. En cada caso, el DI y la fase E fueron menos predecibles como marcadores pronsticos de lo que se esperaba. Esto fue atribuido a la variabilidad en la realizacin tcnica y al anlisis de estos ensayos (tanto en la preparacin de instrumentos c o m o de muestras) y en el riesgo inherente de la heterogeneidad tumoral y por lo tanto el muestreo apropiado del tumor. Se realizaron recomendaciones especficas en cada tipo de tumor para las medidas apropiadas de control de calidad que deben realizarse y de la ausencia de involucin apropiada de los histogramas.

Preparacin de la muestra
Los mtodos de preparacin del ADN son razonablemente simples y baratos de realizar. Existen muchas referencias para los mtodos originales, asi

como muchas modificaciones. Los mtodos ms frecuentes, desarrollados por Krishan. Vmdelov, Crissman. Steinkamp y otros (Rabinovitch, 1993; Vindelov, 1994), son aquellos que utilizan tejidos frescos o congelados y aquellos que utilizan bloques de parafina con preparaciones de Hedley (1983). En cada caso, ya estn las clulas enucleadas o conservada la membrana celular, el marcador Pl de ADN es el que ms frecuentemente se utiliza en la mayora de los laboratorios clnicos y ya se ha descrito. La tincin Pl es directa a condicin de que se sigan el tiempo, la saturacin y los parmetros de extraccin del ARN Las medidas de las alteraciones macroscpicas del cariolipo se realizan comparando el pico (intensidad fluorescente, captacin de Pl) del tumor frente al calibrador diploide. Los factores que afectan esta medicin incluyen el CV del pico tanto del calibrador como del posible tumor, el ndice GyG, o la linealidad del instrumento, linealidad medida por el paquete de software de deconvolucion (Bagwell. 2000) y el porcentaje del tumor presente (muestreado) en la muestra. Es frecuente ver que los laboratorios publican el resultado de un tumor diploide en una muestra que "no" contiene tumor. Los tumores con valores casi diploides necesitan reglas de interpretacin estrictas, como la definicin de tetraploidia. Surgen ms pro-

Figura 36-8, La citometra de flujo con cuatro colores para realizar estudios funcionales permite el estudio recproco de poblaciones celulares, c o m o sucede con el estudio CD45Ro (definido c o m o memoria) y el CD45Ra (definido funcionalmente c o m o nave) en un determinado subgrupo d e clulas T. Esta figura demuestra la definicin de un ancla (Patxon. 1994) de CD3CD4 (regin E) evaluada en los histogramas 5. 6 y 7 para la expresin de RARO. Los histogramas 2. 3 y 8 determinan RARO y las clulas no CD4. Esto se puede utilizar c o m o una determinacin comparativa de los CD3 CD4 sin necesidad de un segundo tubo. La fluorescencia en cinco colores debera permitir el uso simultneo de CD8. que debera medirse y compararse con los CD4. Obsrvese la ausencia clara de tincin no especfica actualmente disponible utilizando directamente clones conjugados. El procesamiento digital pulsado permite la cuantificacin directa de estos marcadores en equivalentes de fluoresceina y la comparacin de un punto y otro en el tiempo en un estudio longitudinal mediante histogramas simples con parmetros, c o m o es el caso de los histogramas 2, 3, 6 y 7. (Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente a travs de CD45Ra y CD45Ro s e obtuvieron de Coulter y Becton-Dickinson. Todos los ensayos se realizaron utilizando los mtodos de lisado de sangre completa estndares).

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Figura 36-9. Protocolos ISHAGE/Miln para la enumeracin del CD34. Arriba, la enumeracin de las clulas CD34+ en sangre del cordn por anlisis de citometria de flujo utilizando el protocolo ISHACGE (filas de arriba y del medio) o el protocolo Miln (fila de abajo). Se define la estrategia de entrada para el ISHAGE. La estrategia utiliza la entrada secuencial para excluir los acontecimientos no CD34+ en la regin celular dim CD45 y para excluir las clulas muertas empleando 7AAD (no mostrado) (fila superior). La fila del medio muestra el protocolo ISHAGE con un isotipo control. El protocolo Miln utiliza un isotipo conlrol (diagrama de puntos del centro, abajo) para establecer los cuadrantes, el inferior derecho se usa para excluir los sucesos putativos C034+. (De Sutherland DR Anderson L, K e e n e y M, y cois: The I S H A G E guidelmes lor CD34+ cell determination by flow cytometry. J H e m a t o t h e r 1996; 3:213, con permiso.)

blemas en la definicin de los agregados, dobletes, detritus, tratamiento de cortes y restos de ncleo y la poblacin en fase S. La sigla, descriptiva y semicuantitativa, de BAD se utiliza en el paquete de software de anlisis para moldear los efectos de fondo, agregados y dobletes (Ravinovitch, 1993, 1994) (Figs. 36-10 y 36-11). El impacto de este parmetro en el anlisis es controvertido.

Las mediciones resultantes de la fase S y del DI utilizando un modo de anlisis paramtrico simple (slo Pl) estn sujetas a estos algoritmos de deconvolucin. llevando a una gran variabilidad entre los laboratorios (Coon, 1994). Los algoritmos de deconvolucin para el ADN se han estu diado de forma extensa (Coon. 1994: Rabinovilch. 1993. 1994. 1999: Wheeless, 1991: Shankey, 1993; Bagwell, 2000), pero muchos modelos

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EXAMEN DE LABORATORIO D E L SISTEMA INMUNE CELULAR

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empleados para el anlisis necesitan un mayor estudio. El documento de consenso del ADN hizo recomendaciones especificas aplicables a ciertos tipos de tumores y sugiere que los laboratorios desarrollen anlisis en concordancia, pero incluso con estas pautas existe un nivel de ambigedad en la interpretacin y rendimiento en el laboratorio clinico. Estas ambigedades contribuyen a la discordancia de los resultados en estudios comparativos asi como en las pruebas de competencia (Coon. 1988, 1994; Wheeless. 1991). La dilicultad de llegar a un consenso hace que la interpretacin de los resultados sea ms difcil para los laboratorios nuevos y para ios el nicos que estn intentando comparar los resultados de su laboratorio con la bibliografa reciente en el tratamiento de sus pacientes Esto es especialmente cierto en la clasificacin de los valores de la fase S. Las medidas de la (ase S estn sujetas a los efectos de los restos y modelacin de los agregados como describieron Rabinovitch (1993. 1994. 1999), Bagwell ( 1 9 9 3 . 2000), Shankey (1993). Coon (1988), Wheeless, (1991) y otros. El rea entre 2C y 4C est sujeta a interferencias por artefactos. Adems, es de importancia clave que la decisin con res-

pecto al modelo matemtico usado para un tumor determinado se mantenga constante y que los datos del modo de lista se conserven sin cambios por si se necesitan ms anlisis. Debido a la dificultad en el anlisis del histograma del ADN. algunos han propuesto que las mediciones del ADN las realicen solo laboratorios expertos. La actualizacin de la FDA no ha aclarado ningn mtodo y todava se considera como una prueba en investigacin. Desgraciadamente, durante muchos aos la prctica clnica sugera otra cosa. Mltiples artculos proponen realizar las mediciones de ADN conjuntamente debido al alto grado de variabilidad y de prdida de significado pronstico (ASCO. 1996). Poste riormente. varios grupos han conseguido avances significativos para resolver algunos de los temas en el anlisis (Rabinovitch. 1996) (Figs. 36-12 y 36-13). Est en desarrollo un patrn o gua de la NCCLS para su emplee por los laboratorios. En cualquier caso, deben hacerse estrictos controles de calidad para permitir mediciones significativas del ADN que puedan servir como marcadores pronsticos y como medidas de la actuacin y prctica mdica.

Figura 36-10. Empleo de diferentes tcnicas de entrada para el anlisis del ADN A. Pico tradicional frente a su integracin con la correspondiente excusin de dobletes. El histograma de un parmetro (inserto) demuestra la intensidad lineal del yoduro de propidio (Pl) demostrando un pico diploide (2N) y un pico aneuploide G -G c o n el correspondiente G..M. B. Nuevo mtodo d e entrada (K.D. Bauer. c o m u n i c a c i o n e s personales [1994]) utilizando el cociente del pico trente a la medicin integral y al FL3 (rea) Este mtodo est siendo evaluado para m a y o r consistencia en la eva luacin d e los valores de la fase S C. Pico frente a integral demostrando que el 66.8% de los acontecimientos s e encuentran en la puerta de la poblacin (pico frente a integral, puerta b).

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4(H)

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
DIPLOID CVCLE

80818589.H83 FL3 HP's "A"

Figura 36-11. A y 8, El empleo de tcnicas con modelado informtico en dos tipos diferentes de muestras. En A. se demuestra una linea celular fijada. Esta preparacin muestra pequeos restos y una buena recuperacin de la poblacin aneuploide. Ambas poblaciones demuestran un buen CV. El valor de la fase S es constante para una linea celular de la muestra. En B. se demuestra una seccin de una muestra en parafina con la presencia de restos y un pico casi diploide aneuploide. El CV es bueno, y los restos son minimos. La muestra demuestra una fase S del 9%. (Cortesa de Multicycle Software, Phoenix Flow System. San Diego. CA.)

Se utilizan otros enfoques empleando sondas de ADN y ARN como los deri- un modelo esttico o un dibujo en el tiempo de todas las clulas analizadas. La integracin del rea para el nmero de clulas entre 2C y 4C en el histovados de la timidina, la bromodesoxiuridina (BrdU). diversos abreviados, y grama del ADN no es capaz de dar ninguna informacin respecto a las cluotros (Fig. 36-14) y naranja de acridina (ARN) para mejorar la calidad de los las "detenidas" en S (las clulas en realidad detienen la sntesis de ADN) o modelos en la estimacin de las propiedades proliferativas y cinticas de un de medir el nmero de clulas normales infiltrantes que pueden estar tambin determinado tumor. Es importante recordar que las medidas de la proliferaproliferando. El valor de la fase S a menudo puede ser mayor que la capacicin no son iguales que las medidas de la cuantificacin de la fase S, que son
c

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EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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Contenido de A D N / D A P 1 Figura 36-12. Representacin mulliparamtrica del contenido de ADN (escala vertical) Irente a la fluorescencia de la citoqueratina (escala horizontal) que muestra una poblacin celular citoqueratina-positiva con menos de 2N de contenido de A D N El estroma celular citoqueratina negativo se emplea para establecer la referencia 2N. permitiendo esto la identificacin de las clulas hipodiploides. El histog r a m a sin entrada convencional en el panel inferior demuestra la imposibilidad de asignar un contenido de ADN a la poblacin celular mixta del t u m o r y de clulas estromales (Glogovac, 1999).

sito de este captulo desarrollar este tema. Aunque se estn realizando muchos estudios, las mediciones de la apoptosis todava no son parte de la rutina del laboratorio clnico. Como se mencion anteriormente, el anlisis de laboratorio del ADN se ha controlado mucho, y en algunas regiones, estos esludios ya no se reembolsan. Muchos investigadores de este campo han votado por la exclusin sistemtica de esta prueba del laboratorio, aunque tiene cierta utilidad en ciertos tumores. Bagwell y otros, estn estudiando retrospectivamente la reevaluacin de un grupo de casos de cncer de mama para tratar de desarrollar un modelo pronstico unificado para los pacientes con cncer de m a m a con ganglios negativos En el anlisis se incluyen un total de 350 histogramas de ADN unvariantes de tres centros de cncer de Suecia (Bagwell, 2000). El estudio est tratando de identificar y corregir los factores que pueden haber disminuido la utilidad de la fraccin de la fase S como describieron las recomendaciones de la Sociedad Americana de Oncologa Clnica (ASCO), para desarrollar un modelo pronstico para el cncer de mama ganglio-negativo, para identificar posibles avances en los mtodos de la citometra de lujo y para demostrar la utilidad de estas tcnicas. Otro estudio de Rabinovitch (comunicacin personal. 2000) y col. se ha publicado recientemente sobre 630 muestras de tumores de mama fijadas con formol de mujeres menores de 45 aos empleando un anlisis bivariante de citoqueratina'ADN (Figs. 36-12 y 36-13). Este anlisis se desarroll para aumentar la capacidad de detectar poolaciones tumorales mezcladas donde los ndices de supervivencia pueden disminuir y sus tumores hipodiploides o tetraploides pueden haberse perdido en el anlisis convencional del ADN. Se espera que estos estudios y otros hagan resurgir lo que puede ser una herramienta pronostica y diagnstica til que previamente quiz fue infravalorada por su complejidad.

Citometra de flujo cuantitativa: mediciones de intensidad de fluorescencia

La definicin de los tipos celulares en trminos mmunolgicos c o m o las clulas efectoras implica la propiedad de estas clulas de regular, y a sea aumentado o disminuyendo, las funciones moleculares especificas a travs de receptores de superficie. Conocidas como fenotipos inmunolgicos (Poncelet, 1993). estas clulas necesitan otras propiedades mediles para definir sus papeles biolgicos en la maduracin y en los procesos de enfermedad. Uno de los fenmenos observados es la diferente expresin de antgenos de superficie celular (CD) en trminos cuantitativos relativos y absolutos. Antes de la disponibilidad de las medidas absolutas, los trminos descriptivos como brillante u oscuro, bimodal. y dems, eran utilizados en la bibliografa para describir un fenmeno visual de diferentes densidades antignicas. Aunque descriptivos, estos trminos son dificiles de definir y de estandarizar entre los laboratorios y entre los pacientes. Tambin pueden perder precisin a la hora de definir un hecho y no pueden emplearse objetivamente para monitorizar el tratamiento de los pacientes o la definicin (tipo celular) mediante la medida de la expresin de CD y el solapamiento de la expresin. La evidencia sugiere que las diferencias cuantitativas en la expresin antignica en la leucemia linfoctica crnica y en otras leucemias puede ser importante para determinar el pronstico (Poncelet. 1985). Estas medidas tambin se emplean en la definicin del MRD y en la investigacin del efecto o activacin viral en la enfermedad por VIH (Poncelet, 1991). El porcentaje de clulas especficas presentes a menudo no aporta una imagen clnica real. Esto es particularmente cierto en los casos de leucopenia y cuando la poblacin de blastos es un porcentaje relativamente pequeo del total de clulas presentes. La citometra de flujo cuantitativa (QFCM) se define como la cuantificacin de la intensidad fluorescente (Fl) determinada por la capacidad de unin del anticuerpo de un anticuerpo conjugado con un fluorocromo. y es una medida indirecta de la cantidad de antgeno celular de superficie por cada clula individual (Stelzer. 1997). Los investigadores (Poncelet. 1985, 1986; Schwartz, 1994; Vogt. 1991. 1994) han descrito el empleo de granos de polieslireno o lneas celulares mezcladas con cantidades saturantes de anticuerpo para determinar el nmero de absoluto de receptores o de determinantes amgameos por clula, tambin denominados densidad antignica (Poncelet. 1993). Las unidades ABC se definen como la medida de la capacidad retal/va de unin del anticuerpo.

dad proliferativa real debido a artefactos de la heterogeneidad tumoral. El histograma de un parmetro proyecta resultados razonables cuando se trata de una poblacin celular asincrnica, relativamente homognea. El mareaje por pulsos se utiliza ms frecuentemente en grandes entornos acadmicos y ms a menudo para medir la efectividad de la irradiacin y quimioterapia obteniendo medidas reales de las clulas G,. G.. as como de los compartimentos G + M. lo que no es posible empleando medidas paramtricas simples de la fase S. Pueden utilizarse otras tcnicas con sondas nucleares y citoplasmticas asi como marcadores de superficie para separar la poblacin de inters de la mezcla de tipos celulares. Este tipo de anlisis multiparamtrico es muy til para medir la lase S en las neoplasias hematolgicas malignas (Fig. 36-6). Puede identificarse la poblacin especifica de blastos por el FITC fluorescente y por el FALS. y estos hechos pueden analizarse por el contenido de ADN y de la lase S empleando el Pl. Los mtodos de tincin estn alterados para conservar las propiedades de la superficie nuclear o las propiedades nucleares (Clevenger. 1993: Ramaekers, 1993: Carothers, 1994; Bauer, 1994: Rabinovitch. 1996: Poder. 1999). Estos mtodos normalmente incluyen la tincin del marcador de superficie de inters (p. ej.. KI-67. ciclina B1. citoqueratina. CD10) con el anticuerpo monoclonal. fijacin en alcohol (o fijacin comercial y permeabilizacin reaclante) y tratamiento con un detergente para permitir la entrada de Pl u otro marcador nuclear. Los mtodos de tincin se modifican selectivamente para conservar las propiedades de membrana y ncleo especificas de la sonda de inters (Bauer, 1994).

Esludios de inters del ADN

Se ha publicado mucho en la bibliografa sobre la apoptosis (a menudo definida como muerte celular programada) y su relevancia en los parmetros tradicionales del ADN y en otras consideraciones fenotipicas. No es el prop-

Figura 36-13. A Diagramas de contorno bivariantes de clulas de t u m o r e s tijados en parafina analizadas con ADN (Pl) frente a tincin de citoqueratina (FITC). Al Una poblacin aneuploide de CK+ de cncer de mama: A2, Un cncer de m a m a mulliploide con una poblacin hipodiploide y casi Iriploide aneuploide. Vase que el contenido diploide de ADN se identifica por la localizacin de la poblacin celular CK. A3. Un ganglio linttico axilar con metstasis de adenocarcinoma de m a m a . La presencia de la poblacin celular muy pequea ce clulas aneuploides (2%) es ambigua en los datos no m e t i d o s (vase Fig. 36-128): sin embargo, en la presentacin bivariabte. las clulas CK+ aneuploides son clar a m e n t e evidentes. A4, Tincin con citoqueratina de clulas de t u m o r prosttco extradas de biopsias fijadas en parafina. La exclusin de las clulas C K del estroma en el anlisis del ciclo celular del ADN incluye la medicin del 2,6% a 3.9% de la fase S. 8, Histograma de ADN de un ganglio axilar con metstasis de adenocarcinoma de m a m a mostrando un dato sin entrada (lnea gruesa y lnea de puntos mostrando 1 0 x en la escala vertical) y el dato de la citoqueratina del ADN introducido (lnea d e guiones) L a presencia de clulas aneuploides e s ambigua en los datos no metidos: si se reconocen c o m o una poblacin aneuploide, representan solo el 2% de las clulas, concordando con la a b u n d a n c i a histolgica de linfocitos. (De Glogovac JK, Pierce R. P a l a n c a BJA. Rabinovitch PS: Cytokeratin Immunofluorescence in D N A analysis of paraffin extracted cells. Clin Immunol. Newslett, 1996; 16:157-161. c o n permiso.)

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EXAMEN DE LABORATORIO D E L SISTEMA INMUNE C E L U L A R

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Este mtodo no necesita igualar los ndices de fluoresceinaprotena (F P). ya que las clulas y el modelo se han teido con el mismo anticuerpo. El empleo de mediciones de intensidad fluorescente debera proporcionar al usuario un medio para evitar esta situacin. El empleo de lineas celulares o microgrnulos para construir una curva de calibracin estndar sigue ciertos supuestos (modilicado de Poncelet. 1986): 1. Los anticuerpos en condiciones de saturacin deben unirse a la super ticie celular a travs de una interaccin monovalente. 2 El nmero de lugares antignicos por clula puede inferirse de la cantidad de anticuerpo unido. 3. La intensidad fluorescente puede determinarse utilizando una curva de calibracin con clulas de diferente expresin antgnica o con gra-

nulos recubiertos de diferentes cantidades de mmunoglobulinas de ratn a las concentraciones de saturacin del anticuerpo. Estas medidas estn sujetas a la variacin de la capacidad de unin de los anticuerpos monoclonales especficos con la inmunoglobulina de ratn, asi como a las interacciones del poliestireno con los clones especficos. Puede que estas medidas no se puedan transferir de un laboratorio a otro y pueden no ser las mismas para los diferentes monoclonales fabricados de la misma especificidad (Schwartz. 1994: Paxlon. 1995). 4. Se puede utilizar la intensidad de fluorescencia media del canal de estas partculas, determinada por citometra de flujo, para estimar la molcula del fluorocromo soluble equivalente (MESF) de una determinada clula.

Figura 36-14. Este histograma demuestra el empleo del anlisis multiparamtrico del ADN empleando BrdU c o m o sonda nuclear. Fue realizado empleando una lnea celular CEM de crecimiento exponencial que fue marcada con BrdU y despus con un anticuerpo FITC anti-BrdU y teida para el contenido de ADN con yoouro de propidio (Pl). L a figura de abajo demuestra un control negativo (linea celular no ciclada o linlocitos de sangre perifrica |PBL|) utilizados para validar la uncin con BrdU. Los controles negativos son obligados para el xito de la interpretacin de estos anlisis Estos estudios proporcionan una mejor comprensin de las clulas que estn en el ciclo y en qu fase del ciclo celular estn.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

5. Estas medidas, si se llevan a cabo de torma indirecta utilizando una fuente constante de inmunoglobulinas antirratones de cabra (GAM). son independientes de las subclases de anticuerpo empleado para detmir el antigeno. 6. Estas determinaciones pueden realizarse empleando monoclonales conjugados directamente a saturacin utilizando patrones de granulos apropiados. Debe tenerse ms cuidado para evitar problemas espaciales relativos al tamao de la molcula de tluorocromo y los ndices de fluorescena'protena. Se puede obtener ms informacin recurriendo al documento consensuado de 1997 de U.S.-Canad que revisa los parmetros necesarios para la estandarizacin (Stelzer. 1997). Aunque precoces en su desarrollo, los fenotipos cuantitativos nos ayudarn a definir programas de software de anlisis de grupos para la cuantificacin e identificacin celular estableciendo la intensidad fluorescente media de los canales como medida de separacin de clulas con diferentes fenotipos tuncionales.

CONTROL DE CALIDAD Y GARANTA DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO CELULAR

En este captulo, se han tratado de resaltar las reas donde los mdicos asi como los laboratorios deben prestar particular atencin a los mtodos utilizados y a las interpretaciones realizadas en la evaluacin de la respuesta celular. La garanta de la calidad y el control de calidad de los parmetros no estn bien definidos en esta rea del laboratorio, y existen pocos estndares absolutos cuando se compara con los anlisis qumicos o las determinaciones de anticuerpos humorales. El xito del laboratorio celular reside en su aproximacin al problema y en la evaluacin longitudinal de la condicin que va a ser diagnosticada. Se seal claramente que los estudios de base necesitan repetirse si la evaluacin original se lleva a cabo en un momento de estrs inmunolgico. Los parmetros bsicos de las variaciones diurnas en las poblaciones de linfocitos son obvios pero a menudo se olvidan o se pasan por alto. Malone (1990) concluy que la variabilidad en las medidas del CD4 de los recuentos absolutos se debe en un 50% a la biologa y en otro 50% se debe a otros problemas tcnicos. Los factores que afectan la evaluacin longitudinal de las cantidades absolutas de CD4 en un ensayo clnico han sido revisadas por Fei (1993). Adems. Fahey (1990) revis el valor pronstico tanto humoral como celular de los anlisis en VIH. En otros ensayos clnicos celulares, la variabilidad es inherente al ensayo debido a la falta de formatos y mtodos estandarizados asi como a los reactivos. Adems, la calibracin de los instrumentos y la sensibilidad no estn bien monitorizados. Los ensayos con linfocitos T citotxicos son particularmente difciles de estandarizar. Los ensayos histricos como la proliferacin mitognica son tambin difciles, con variabilidad entre los laboratorios. Por lo tanto, los laboratorios que ofrecen estas pruebas inmunologas deben tener una amplia base de dalos mediante la cual se pueda interpretar el resultado individual del paciente. Los laboratorios celulares deben establecer rangos normales para sus ensayos y tener cuidado en que los rangos normales de adultos no se apliquen en los ensayos peditricos. Esto es particularmente problemtico porque los rangos normales peditricos son difciles de determinar debido a la falta de nios disponibles en el primer ao de vida, y la correcta interpretacin de los resultados del laboratorio depende de ellos. Deben hacerse cuidadosamente las comparaciones de los datos entre los laboratorios. Siempre que est disponible, un laboratorio de inmunologa celular debe utilizar los estndares adecuados en el desarrollo de la citometra de flujo y en el anlisis del ADN y tener presentes las regulaciones federales y estatales con respecto al laboratorio, incluyendo la Ley de 1988 (Human Health and Services Clinical Laboratory Improvement Acf). Adems, deben participar en pruebas de capacidad, cuando estn disponibles, y estar incluidos en programas de formacin incluyendo evaluaciones de competencia para todo el personal implicado en la prueba. Todos los ensayos desarrollados en el labora-

torio deben incluir un control normal y. cuando sea posible, controles durante el proceso para establecer la validez del ensayo. Las muestras enviadas deben ser cuidadosamente controladas en cuanto a la exposicin al calor y al fro y el tiempo desde que se extraen al paciente Debe acompaar a las muestras una historia clnica para que se puedan realizar estudios particulares de modo que el director del laboratorio pueda realizar la correcta aproximacin a la prueba. Se ha publicado un documento de consenso con recomendaciones sobre el anlisis inmunofenotipico de las neoplasias hematolgicas por citometra de flujo (Braylan, 1997). Este documento fue minuciosamente desarrollado por los proveedores de la comunidad mdica interesados en cubrir los procedimientos de laboratorio, la seleccin de anticuerpos para la identificacin de neoplasias, el anlisis de datos y la interpretacin, informes mdicos e indicaciones, en ausencia de equipos estandarizados y otros artefactos. La FDA ha puesto en marcha la Analyte Specific Regulation |ASF. 1998). que elimina reactivos como los monoclonales para su empleo en la investigacin. Esta regla no permite a los fabricantes decir a los empleados del laboratorio cmo emplear sus reactivos. No pueden especificar las instrucciones de uso. La regla ASR proporciona unos reactivos estables, bien definidos, fabricados en buenas condiciones. Todos los laboratorios que utilizan estos reactivos c o m o una prueba de fabricacin casera" deben desarrollar sus propios ensayos clnicos y estudios de validacin y deben emplear una declaracin de descargo de responsabilidad en su informe final. El documento de consenso permite al laboratorio desarrollar sus anlisis de un modo consistente y la definicin del significado clnico a un gran nmero de laboratorios e instituciones. El documento no es un patrn pero concuerda con otro estndar NCCLS que est actualmente en uso. El laboratorio celular se enfrenta con una mayor dificultad de trabajo de interpretacin ya que los datos no son fcilmente estandarizabas. Adems, la garanta de la calidad de la muestra y la evaluacin realizada dependen de la cuidadosa documentacin de los parmetros biolgicos y logisticos que pueden influir en el resultado. El futuro de las pruebas utilizadas en la evaluacin de los componentes celulares de la respuesta inmune residen en el desarrollo de nuevos mtodos que conduzcan a una mejor estandarizacin. BIBLIOGRAFA Allsopp , Nicholls SJ. Langhorne J: A flow cytometric m e t h o d to assess antigen-specific proliferative responses of difterent subpopulations of fresh and cryo preserved h u m a n peripheral blood m o n o n u c l e a r cells J I m m u n o lM e t h o d s 1998: 214:175-186. Analyte Specific Regulation. Medical Devices: Classificalionreclassification: restricted devices: analyste specific reagents. Fed Reg Nov. 21,1997; 66243-62260. Anderson DC. 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EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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7

C A P T U L O

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S Evaluacin del funcionamiento de las > inmunoglobulinas y la inmunidad humoral

Inmunoglobulina D 878 Inmunoglobulina E Resumen IMPORTANCIA CLNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS Patognesis 880 881 DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES Inmunoelectroforesis Inmunofijacin Prevencin de las enfermedades y terapia BIBLIOGRAFA 891 888 886

Richard A. McPherson, M.D.

PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ANTICUERPOS Molculas de anticuerpo Interaccin antgeno-anticuerpo BASE GENTICA DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS PROPIEDADES GENERALES DE LAS INMUNOGLOBULINAS Inmunoglobulina M Inmunoglobulina G Inmunoglobulina A

Los anticuerpos son las molculas electoras de la inmunidad humoral (mediada por clulas B). Son inmunoglobulinas que reaccionan y se unen especficamente a los antigenos que estimularon su produccin. Las inmunoglobulinas constituyen un 20% de las protenas plasmticas de un individuo sano. La actividad de los anticuerpos se asocia a las protenas con menor velocidad de migracin en una electroforesis. las y-globulmas. Este capitulo se centra en la discusin de las propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas, su evaluacin en el laboratorio y su importancia clnica.

PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ANTICUERPOS Molculas de anticuerpo

Hay una gran cantidad de trabajo realizado y publicado sobre las propiedades estructurales de los anticuerpos (Padlan, 1991; Poljak, 1991; Tedford, 1991). Una molcula de inmunoglobulina es una glucoproteina en lorma de "Y". Presenta dos dominios de unin al antigeno en las puntas de la "Y" (regin Fab) y zonas de unin para componentes del sistema del complemento y/o varios receptores de la superficie celular en la cola de la "Y" (regin Fe). Cada molcula de inmunoglobulina est compuesta por 2 cadenas pesadas (H: heavy) y dos cadenas ligeras (L: lighf) idnticas entre si. Estas cadenas polipeptidicas se mantienen unidas mediante interacciones no covalentes que se encuentran estabilizadas por puentes disulfuro. Los dominios de interaccin con el antigeno estn compuestos por partes de ambas cadenas. Cada una de las cadenas de inmunoglobulina, tanto H como L, consta de una regin variable de unos 110 residuos de aminocidos en el extremo amino-terminal (las puntas de la "Y"), que forma el dominio de interaccin con el anligeno, unido a una regin constante. La regin conslante de la cadena H es unas 3 o 4 veces ms grande que en la cadena L. Cada cadena est compuesta por repeticiones de dominios plegados de forma semejante: una cadena L tiene un dominio de regin variable (V ) y un dominio de regin constante (CJ. mientras que la cadena H tiene un dominio de regin variable (V,.) y 3 4 dominios de regin constante (C ) (Fig. 37-1). La variabilidad de la secuencia de aminocidos en
H

las regiones vanables de ambas cadenas. H y L, se reduce principalmente a 3 pequeas regiones hipervariables. las cuales se asocian en el extremo aminoterminal de la molcula para formar el sitio de unin al antigeno. Cada dominio de unin al antgeno tiene slo el tamao suficiente para unir un determinante antignico del tamao de cinco o seis residuos de azcar. Las cadenas pesadas pueden ser de cinco isotipos distintos (y, a, p. 8, e) y las cadenas ligeras de dos (,- y X), donde algunos de los isotipos presentan subtipos. Por ejemplo, las cadenas y presentan los subtipos y y , y y y.. Los isotipos se torman como resultado de variaciones en las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras. Estas denominaciones isotipicas forman la base de la nomenclatura de los anticuerpos. Debido a que la cadena pesada por s sola determina las funciones efectoras. las inmunoglobulinas se denominan haciendo referencia al isotipo de su cadena pesada empleando una letra de nuestro alfabeto (IgG. IgA, IgM, IgD e IgE).
2 3

Los anticuerpos tienen dos dominios idnticos de interaccin con el antigeno. El dominio de interaccin con el antigeno est compuesto por los aminocidos de un tipo de cadena H y de un tipo de cadena L. Asi. la molcula monomrica compuesta por 4 cadenas (vase Fig. 37-1) posee dos sitios idnticos de asociacin con el antgeno, y se dice que son molculas bivalentes. Estas molculas son capaces de entrecruzar molculas de antigeno, si cada una de ellas presenta 3 o ms determinantes antignicos, formando un complejo macromolecular. y una vez que este complejo supere un determinado tamao, precipitar (Davies. 1983). Este entrecruzamiento es importante fisiolgicamente porque facilita ia internalizacin del antgeno. c o m o puede ser el expresado por bacterias o por leucocitos lagociticos. Tambin interviene en la activacin del sistema del complemento. Adems, este entrecruzamiento puede ser necesario para desencadenar la produccin de anticuerpos (por la accin de linfocitos B) por parte del antgeno. La eficiencia con la que el anticuerpo se une al antgeno y produce entrecruzamiento se ve aumentada gracias a una regin m u y flexible (regin de bisagra) que se encuentra donde los brazos de la "Y" se unen a la cola, permitiendo que vare la distancia que separa los dos dominios de unin al antgeno. La multivalencia afecta a la avidez con que un anticuerpo puede unir determinados tipos de antgeno. Un antigeno particulado (como una bacteria o un virus) presenta repeticiones de determinantes antignicos en su superficie.

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

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(denominado asi porque en primates no humanos cristaliza con facilidad). Por otro lado, el corte con pepsina produce un fragmento F(ab\, lamado asi porque consta de dos fragmentos F(ab'), cada uno de ellos un poco ms grande que un fragmento Fab, unidos covalentemente; el resto de la molcula est cortada en fragmentos ms pequeos de varios tamaos (Fig. 37-1). Como los fragmentos F(ab'),son bivalentes, todava pueden entrecruzar antigenos y formar precipitados. Esto no ocurre con los fragmentos Fab puesto que son univalentes. Ninguno de estos fragmentos (subundades de anticuerpos) tiene las dems propiedades biolgicas de las molculas intactas de anticuerpos puesto que carecen de la cola (la regin Fe) que media estas propiedades. Sin embargo, los fragmentos monovalentes Fab es la forma de anticuerpo monoclonal que se emplea teraputicamente (Digibind) para unir digoxina, neutralizando asi niveles txicos y facilitando la eliminacin de la sustancia del cuerpo. Cada clon de clulas B produce molculas de anticuerpo con un nico dominio de unin al antgeno. Inicialmente, las molculas se insertan en la membrana plasmtica, donde funcionan como receptores de superficie para el antgeno. Cuando un antigeno se une a los anticuerpos en la superficie celular, activan a las clulas B, las cuales se multiplican, diferencian en una clula plasmtica, y sintetizan una gran cantidad de anticuerpo soluble con el mismo dominio de interaccin con el antgeno, que se secreta a la sangre. Los anticuerpos humorales protegen a los humanos y animales de infecciones, inactivando virus y toxinas bacterianas mediante sus dominios V,/V y reclutando el complemento y diversas clulas para matar e ingerir los microorganismos invasores mediante sus dominios C en la regin Fe de la molcula. Las propiedades biolgicas de los diversos dominios de inmunoglobulinas se resumen en la Tabla 37-1.
t L

IKKK'

OKIH

Figura 37-1. Representacin esquemtica de la molcula de inmunoglobulina G. Se muestran las posiciones relativas de los puentes disulfuro intercatenarios e intracalenarios que determinan los lazos Cada uno d e los lazos determina un dominio de cadena pesada y ligera que reciben un determinado nombre. Se indican las regiones de corte enzimtico ms probables en la regin "bisagra" por parte de la pepsina y papaina. Los fragmentos resultantes de la accin de la papaina se laman Fab y Fe. Los fragmentos producidos por la pepsina son Fe' y Fab'2 (2 fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro). La digestin de Fab con pepsina en las condiciones adecuadas libera el fragmento F (V y V asociados de forma no covalente). La porcin de la cadena pesada que forma parte del fragmento Fab se denomina Fd.
v H L

Interaccin antgeno-anticuerpo
La unin de un antgeno a un anticuerpo es reversible. La afinidad y el nmero de sitios de unin contribuyen a la fuerza de la interaccin antgeno-anticuerpo. Esta unin reversible es el resultado de muchas fuerzas no covalentes relativamente dbiles, incluyendo uniones hidrofbicas y de hidrgeno, fuerzas de van der Waals e interacciones inicas. Estas fuerzas dbiles son efectivas slo cuando la molcula del antigeno est lo suficientemente cerca para permitir que algunos de sus tomos puedan insertarse en las regiones complementarias de la superficie del anticuerpo. Las regiones complementarias de un anticuerpo de cuatro cadenas son sus dos dominios de interaccin con el antgeno idnticos entre s, mientras que la regin correspondiente del antgeno es lo que se denomina el determinante antignico (epitopo). La mayora de las macromoleculas antgnicas presentan vanos determinantes antignicos distintos; si dos 3 ms de ellos son idnticos, se dice que el antigeno es multivalente. La afinidad de una molcula de anticuerpo refleja la fuerza con que el determinante antignico se inserta en un solo sitio de unin al antigeno, y es independiente del nmero de determinantes antignicos. Sin embargo, la avidez total de un anticuerpo por un antgeno multivalente. como un polmero con

Una molcula de anticuerpo puede interaccionar con una sola partcula de tal forma que ambos dominios de interaccin antignica se encuentren unidos a determinantes antignicos de esa misma partcula, en lugar de encontrarse en dos partculas adyacentes. Cuando se produce este tipo de unin, la energa efectiva de la interaccin o avidez, es mucho mayor que la que presenta una unin monovalente a dos partculas. Se ha demostrado que este mecanismo es m u y importante desde un punto de vista fisiolgico, en la neutralizacin de virus por anticuerpos que poseen baja afinidad por la unin. El efecto protector de las inmunoglobulinas no se debe simplemente a su habilidad para unir antgenos. Intervienen en una gran variedad de actividades biolgicas mediadas por la cola de la "Y", la regin Fe de la molcula. Esta parte de la molcula de anticuerpo determina lo que ocurrir con el antgeno una vez que se haya unido. Inmunoglobulinas con la misma capacidad de interaccin con el anlgeno pueden presentar una variedad de regiones Fe distintas, por tanto, diferentes propiedades funcionales, como puede ser activar el sistema de complemento y unirse a receptores de Fe presentes en la superficie de macrfagos, facilitando asi la fagocitosis de antgenos. Debido a que posee una localizacin expuesta y una estructura flexible, la regin bisagra es atacada por diversas enzimas proteoliticas. Como su nombre indica, esta regin confiere una cierta flexibilidad a la molcula, permitiendo que adopte la estructura en forma de "Y". Esto permite que un anticuerpo se una a una sola partcula (p. ej. una bacteria) mediante sus dos regiones de unin al antgeno o. alternativamente, puede estirarse al mximo para unir dos partculas. Las propiedades que aporta la regin bisagra a las molculas de inmunoglobulina estn relacionadas con su alto contenido en prolina y residuos de aminocidos hidroflicos. Los puentes disulfuro que se establecen entre las cadenas H en molculas de IgG. IgA y en IgD se encuentran en la regin bisagra (Fig. 37-1). Las enzimas proteoliticas papaina y pepsina escinden las molculas de anticuerpo en diferentes fragmentos caractersticos que permiten un entendimiento de la relacin estructura-funcin de la proteina. El corte con papaina produce dos fragmentos Fab (Iragment antigen-binding. fragmento de unin al antgeno) idnticos, cada uno de ellos con un dominio de unin al antigeno, y un fragmento Fe

Tabla 37-1 Dominio C3

Propiedades biolgicas de los dominios de inmunoglobulina (IgG) Funcin conocida o probable

C,,2 C..1/C

V H T V ,

1. Reacciones citotrpicas que implican (a) Macrfagos y monocitos (b) Mastocitos heterlogos (c) Clulas citotxicas (K) (d) Clulas B 2. Ensamblaje no covalente de las cadenas pesadas y ligeras 1. Unin al complemento (C1q) 2. Control del ritmo catablico 1. Ensamblaje no covalente de las cadenas ligeras y pesadas 2. Ensamblaje covalente de cadenas ligeras y pesadas. 3. Espaciadores entre interacciones entre dominios que conllevan unin del antgeno y funciones electoras 1. Unin al antgeno 2. Formacin de enlaces no covalentes entre cadenas pesadas y ligeras

De Dornngion KJ Painter RH Biological activities of the constant region of immunoglobulin G. En Mandel TE, el al (eds) Progress in Inmunology III Ciudad de Canberra. Australian Academy of Science. 1977. con permiso

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA Dadas las condiciones de valencia que permiten la formacin de grandes agregados, el tamao de los complejos antgeno-anticuerpo que se forman depende criticamente de las concentraciones molares relativas de los dos reactivos. Si hay un exceso de antgeno o de anticuerpo es poco probable que se formen grandes complejos (Fig. 37-2). El tamao y composicin de los complejos antgeno-anticuerpo no slo son importantes para las reacciones de precipitacin in vilro. tambin son cruciales para determinar el destino de los complejos en el organismo. Los complejos formados en equivalencia o en exceso de anticuerpo presentan mltiples regiones Fe expuestas en la superficie y por tanto se unen con fuerza a los receptores Fe de los macrfagos, los cuales los ingieren y degradan. Los complejos pequeos, formados en exceso de antgeno, slo presentan una regin Fe por complejo. As, se unen pobremente a los receptores Fe de los macrfagos y se destruyen con menos eficiencia. En lugar de ser destruidos se pueden depositar en pequeos vasos sanguneos de la piel, rones, articulaciones y cerebro, donde pueden activar el sistema del complemento, causando inflamacin y destruccin del tejido. Aunque parece que los complejos antgeno-anticuerpo tienen una apariencia muy rgida, los anticuerpos son entidades dinmicas que sufren fluctuaciones estructurales (Karplus, 1983; Wilson, 1991). Cambios conformacionales pueden ser necesarios para la unin. Estos ajustes incluyen desplazamientos laterales de las cadenas de hasta 2 a 3 A, rotaciones de anillos aromticos, cambios conformacionales e incluso pequeas rotaciones entre dominios V y V (Bhat, 1990; Standfield, 1990; Herrn, 1991).
H L

subunidades repetidas, se define como la fuerza total de unin de todos los sitios de unin juntos. Una molcula de IgG tpica se une con al menos 10.000 veces mayor fuerza a un antgeno multivalente si ambos dominios de interaccin con el antigeno estn implicados, que si slo interviene uno de ellos. Por el mismo motivo, si la afinidad de los dominios de interaccin con el antgeno entre molculas de IgG e IgM es la misma, la molcula de IgM (debido a que es un pentmero y por tanto posee 10 dominios de interaccin con el antgeno) poseer una avidez mucho mayor por un antgeno mullivalente que una molcula de IgG (que posee dos dominios de interaccin con el antgeno). Esta diferencia de avidez es importante en vista del hecho de que los anticuerpos producidos al comienzo de una respuesta inmune, generalmente poseen afinidades mucho menores que los que se producirn ms adelante. El aumento en la afinidad media de los anticuerpos producidos con el transcurso de tiempo desde la inmunizacin se denomina maduracin de la afinidad. Esto ocurre porque la respuesta humoral frente a un antgeno es heterognea, esto es, se producen anticuerpos con distintos dominios de unin al antgeno por parte de los clones de linfocitos B de respuesta. Debido a su elevada avidez total, IgM (el principal tipo de Ig producida al principio de una respuesta inmune) puede funcionar incluso cuando cada uno de sus dominios de interaccin slo tiene una baja afinidad. El tamao del complejo antgeno-anticuerpo se determina por la valencia del antgeno y las concentraciones relativas del antgeno y el anticuerpo. La reaccin de precipitacin de antigeno-anticuerpo se basa en el entrecruzamiento de antgenos multivalentes por anticuerpos bivalentes. Si slo est presente un tipo de anticuerpo (una respuesta monoclonal), molculas con un solo determinante antignico no pueden entrecruzarse. Si un antgeno es bivalente, puede formar pequeos complejos cclicos o cadenas lineales con el anticuerpo, mientras que un antgeno con tres o ms determinantes antignicos puede formar complejos tridimensionales que precipitan con facilidad. Sin embargo, la mayora de los antisueros producidos frente a un antgeno contienen una variedad de anticuerpos diferentes (una respuesta policlonal) que reaccionan con diferentes determinantes del antgeno y pueden cooperar en el entrecruzamiento del antgeno. Por el contrario, anticuerpos homogneos (monoclonales) slo pueden precipitar molculas que presentan repeticiones idnticas de determinantes antignicos.

BASE GENETICA DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS

Se estima que un individuo puede producir al menos entre 10 y 10 molculas de anticuerpo diferentes. Han evolucionado mecanismos genticos especiales para producir una gran cantidad de molculas de inmunoglobulina, que se desarrollan durante la respuesta a un antgeno sin la necesidad d e involucrar un nmero excesivo de genes (Edward, 1993).
6 9

Figura 37-2. L a s concentraciones del antgeno y del anticuerpo influencian el tamao de los complejos antgeno-anticuerpo que s e forman. Los complejos de mayor tamao se forman cuando a m b a s molculas estn presentes en aproximadamente la misma concentracin molar (zona de equivalencia), mientras que los complejos ms pequeos se forman cuando existe un gran e x c e s o de antigeno. Ntese que los pequeos complejos formados en exceso de antigeno presentan pocas molculas de anticuerpo por complejo: por este motivo, no son eliminados eficientemente p o r los macrfagos de los fluidos extracelulares.

CAPTULO 37

EVALUACIN D E L FUNCIONAMIENTO DE L A S INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

881

Figura 37-3. Organizacin y reagrupamiento de los genes de cadenas pesadas de inmunoglobulinas (exones) en el c r o m o s o m a 12 de ratn. Cada gen V tiene tambin una secuencia lder que no aparece en la representacin Los genes de la regin constante se identifican mediante el isolipo de la cadena pesada, y existe ms de un gen para los isotipos C, y C A diferencia de los genes de C,, y C,. los genes C estn c o m puestos por mltiples exones, tal y c o m o se ilustra para el gen C (dominios C,-C,...). Los sitios de recombmacin se encuentran en el e x t r e m o 5' de c a d a uno de los genes C y t a m p o c o se muestran. La linea continua representa las secuencias intermedias (intrones) entre genes o segm e n t o s gnicos. Cada cadena pesada est codificada por cuatro segmentos gnicos diferentes. V, D. J. y C. (Reproducido de M a r c u KB: I m m u noglobulin heavy-chain constant region genes. Cell 1982; 29:719, con permiso. Copyright de Cell Press).
M

Las inmunoglobulinas se producen mediante 3 grupos de genes que codifican para las cadenas K, K y H. respectivamente Los grupos de genes que codifican para las cadenas ligeras y pesadas se encuentran en cromosomas diferentes. En cada grupo, distintos segmentos gnicos que codifican para diferentes partes de las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas se pueden poner en contacto mediante procesos de recombinacin especficos que tienen lugar durante la diferenciacin de clulas B. Los grupos de genes de cadenas ligeras contienen uno o ms genes constantes (C) y juegos de segmentos variables (V) y de genes de unin (J). El grupo de genes de la cadena H contiene un juego de genes C. y juegos de genes V. genes de diversidad (D) y segmentos J. Para generar una molcula de anticuerpo, un segmento gnico V se recombina con otro segmento gnico J , dando lugar a un gen V para la cadena ligera; y un segmento V se recombina con un segmento D y otro J para generar un gen V para la cadena pesada (Fig. 37-3). Cada uno de los segmentos gnicos generados se cotranscribir con el segmento de la regin constante correspondiente para producir un ARN mensajero que codifica para la cadena polipeptidica completa. Mediante la combinacin de los diferentes segmentos gnicos que codifican para las regiones V, y V. los vertebrados pueden producir miles de cadenas ligeras distintas y miles de cadenas H diferentes que pueden asociarse para dar lugar a millones de molculas de anticuerpo diferentes.
H

una mayor afinidad de los anticuerpos que se producen en un segundo contacto con el antigeno que en la respuesta inicial. Asi. este proceso de hipermutacin somtica puede dar lugar a la presencia en individuos inmunizados de anticuerpos de alta afinidad que resultan mucho ms efectivos. Todas las clulas B producen inicialmente anticuerpos IgM. Ms adelante algunas pasan a producir otros tipos de anticuerpos (isotipos) que poseen el mismo dominio de unin al antgeno (idiotipo) que la IgM original (exclusin allica) (Fig. 37-4 y Tabla 37-2). Este cambio de lipo en combinacin con la exclusin allica permite que los mismos dominios de unin al antgeno (la misma cadena V y L) se distribuyan entre anticuerpos con distintas propiedades biolgicas (funciones efectoras secundarias). As. este mecanismo de organizacin gmea permite la construccin d e molculas de inmunoglobulina con una variedad de especificidades. La diversidad de los anticuerpos depende de la presencia de mltiples segmentos gnicos, su reagrupacin en diferentes secuencias, la combinacin de distintas cadenas pesadas y ligeras en la construccin de molculas de inmunoglobulina, y de mutaciones somticas.

Este repertorio inicial de molculas de anticuerpo se puede expandir incluso ms mediante la hipermutacin somtica, la cual se activa mediante la exposicin al antgeno. As, el papel que juega el antgeno en presencia de la mutacin somtica parece derivar en un refinamiento de la respuesta inmune y a una diversidad prcticamente ilimitada de molculas de anticuerpo. Mutaciones somticas puntuales tienen lugar en clulas B (no en clulas germinales) durante toda la vida de un animal o un humano (Tonegawa, 1983). Las hipermutaciones somticas se encuentran, en su mayora, confinadas a los genes de las regiones variables de las cadenas H y L y a los intrones contiguos. Se estima que tendr lugar, aproximadamente, una mutacin en la regin V de la cadena H o L. en cada clula individual con cada divisin celular. Esto no slo aumenta la diversidad de anticuerpos, sino que tambin puede causar un cambio en la afinidad con la que el anticuerpo se une a su ligando. Aquellas clulas B resultantes que puedan unir al antgeno con mayor avidez presentan una ventaja sobre otras clulas B que no son capaces de unir al antgeno con tanta avidez. A medida que decae la concentracin de antgeno, aquellas clulas B que presentan receptores con mayor avidez dominan la poblacin de clulas involucradas en la respuesta. Esto origina

PROPIEDADES GENERALES DE LAS INMUNOGLOBULINAS

(Spielgelberg. 1974: Carayannopoulos. 1993) Los diversos tipos de inmunoglobulinas humanas y sus propiedades estn resumidos en las Tablas 37-3 y 37-4.

Inmunoglobulina M
Esta glucoprotena es el principal tipo de anticuerpo secretado a la sangre en las primeras fases de una respuesta humoral primaria. Normalmente, la IgM se secreta en forma de pentmero compuesto por cinco unidades de cuatro cadenas cada una. una macroglobulina con una velocidad de sedimentacin de 19S y una masa molecular de 900 kDa. Sin embargo, en trastornos autoinmunes humanos, como puede ser el lupus entrematoso sistmico (SLE), la forma monomrica de 7S se puede detectar en cantidades apreciables en el suero. La deficiencia selectiva de IgM es un trastorno poco frecuente asociado con una ausencia de IgM y niveles normales del resto de inmunoglobulinas. El origen de este trastorno es desconocido.

882

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 37-4. Estructura de las cadenas pesada y ligera mostrando las posiciones y longitudes de las regiones hipervariables del dominio V\ (denominados Lv1. Lv2. Lv3) y del dominio V (denominados Hv1. Hv2. Hv3). Los residuos de aminocidos se enumeran empezando por el extremo amino-terminal. En algunas cadenas pesadas, se ha observado una regin hipervariable adicional (N84-N91). En el diagrama tambin se ilustra la regin donde pueden encontrarse la mayora de las vanantes de inmunoglobulina. Los determinantes idiotipicos se encuentran exclusivamente en los dominios V, y V. y el marcador isotipico en las regiones constantes de ambas cadenas. L o s marcadores alotipicos pueden aparecer a lo largo de ambas cadenas.

Debido a que la forma pentamrica de la IgM tiene un total de 10 dominios de unin al antigeno, resulla ms eficiente que su forma monomrica 7S o la IgG en el entrecruzamiento del antgeno y en la activacin del sistema del complemento una vez unido al antigeno. Asi, esta elevada eficiencia en la unin y activacin del complemento, unido a su temprana

aparicin durante el transcurso de una infeccin, hace de la IgM un agente especialmente potente para combatir las invasiones microbianas. Cada pentmero de IgM contiene una copia de otra cadena polipeptdica. denominada cadena J (del ingls joming). con un tamao molecular de 15 kDa. Este polipptido accesorio se produce por parte de las clulas secretoras de

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGIOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

883

Tabla 37-4

P r o p i e d a d e s de las i n m u n o g i o b u l i n a s h u m a n a s
IgM IgG IgA IgD

A Fisiolgicas Concentracin mg/ml en suero de un adulto normal 1.2-4.0 8.0-16.0 0.4-2.2 0.03 17-450 ng/ml Unidades internacionales/ml 69-322 92-207 54-268 <100 Porcentaie de la inmunoglobulina total 13 80 6 0.002 Porcentaje de distribucin intravascular 41 48 76 75 51 Ritmo de sintesis mg/kg/dia 2,2 35 24 0.4 0,003 Ritmo de catlisis en suero, %/da 10,6 6 24 37 90 (o vida media/dia) (5-6) (18-23) (5-6.5) (2.8) (2,3) Biolgicas Capacidad de aglutinacin +4 +2 + Capacidad de fijacin del complemento por la va clsica 4 Hipersensibilidad anafilctica homologa +4 + Anafilaxis helerloga en conejillo de Indias Fijacin a baslilos y mastocitos homlogos +4 + Unin citolilica a macrfagos 1 + Transporte Iransplacentario + Unin al tactor reumatoide Presencia en secreciones externas + +4 +2 Otras propiedades caractersticas: IgM - Se produce en el inicio de la respuesta inmune, es la primera defensa electiva frente a la bacteremia. IgG Combate los microorganismos y sus toxinas en los fluidos extravasculares IgA -Defiende las superficies externas del cuerpo. IgD -Presente en la superficie de hnfocitos inmunocompetentes importante para la activacin de clulas B y/o la inmunorregulacin

IgM Se trata de una glucoproteina acidica con un elevado contenido en residuos de cisteina y. por tanto, se asocia mediante puentes disulfuro al extremo carboxilo-terminal de dos regiones Fe de molculas monomricas de IgM adyacentes. Se cree que la oligomerizacin se inicia en este punto. La IgM es adems, el primer tipo de anticuerpo secretado por las clulas B durante su desarrollo. Los precursores inmediatos de las clulas B. llamadas clulas pre-B. sintetizan cadenas u., pero no cadenas ligeras, que acumulan en el interior de las clulas. A continuacin las clulas pre-B empiezan a sintetizar cadenas ligeras que se combinan con las cadenas u para formar molculas de IgM monomricas. El conjunto formado por las dos cadenas pesadas y las dos cadenas ligeras se inserta en la membrana plasmtica, donde funciona como receptor para el antigeno. En este momento, las clulas se han convertido en linfocitos B y pueden responder al antgeno. Quizs debido a su gran tamao, el pentmero de IgM secretado no se encuentra de modo significativo en los espacios intersticiales; se encuentra confinado a la sangre y no atraviesa la placenta. La IgM es un componente minoritario de las inmunogiobulinas secretadas en superficies mucosas y en la leche materna. Filogenticamente, la IgM es la inmunoglobulina ms primitiva, y la mayora de las variantes de los genes de la cadena LI parecen haber evolucionado para dar genes de cadenas pesadas de otros tipos de inmunogiobulinas. Otras propiedades fsicas y biolgicas de la IgM y de otros tipos de inmunoglobulinas se citan en las Tablas 37-3 y 37-4.

necesitan al menos dos molculas de IgG para la activacin del complemento, en comparacin con una sola molcula de IgM, que contiene cinco regiones Fe Las molculas de IgG son los nicos anticuerpos que pueden pasar de la madre al feto. Clulas placentarias que se encuentran en contacto con la sangre materna poseen receptores que se unen a la regin Fe de la IgG y median su paso hasta el feto. Los anticuerpos primero penetran por un proceso de endocitosis mediada por receptores y despus se transportan a travs de la clula para liberarse posteriormente por exocitosis a la sangre fetal. Otros tipos de anticuerpos no pueden unirse a estos receptores y. por tanto, no pueden atravesar la placenta. La habilidad de la IgG para cruzar la placenta confiere una linea de defensa fundamental frente a la infeccin durante las primeras semanas de vida del nio. Normalmente, el embrin humano empieza a recibir cantidades significativas de IgG materna por va transplacentaria a las 12 semanas de gestacin. La cantidad aumenta de forma constante hasta que, al nacer, el suero del cordn contiene una concentracin de IgG comparable a la del suero materno. Salvo que existan trastornos inmunolgicos. los niveles de IgG de un adulto se alcanzan en el sptimo ao de vida y a partir de este momento permanecen constantes. Los anticuerpos IgG tienen un elevado coeficiente de difusin que les permite difundir a espacios extravasculares del cuerpo con mayor facilidad que otros tipos de Ig. Como la IgG es la principal representante de las Ig en estos espacios, es la principal encargada de neutralizar toxinas bactenanas y de unirse a microorganismos para facilitar su fagocitosis. Ademas, solo los anticuerpos IgG que se encuentran recubriendo clulas diana, como pueden ser clulas tumorales, pueden desencadenar su muerte extracelular mediante ADCC; las clulas NK responsables de la ADCC presentan receptores para Fe de IgG. Existen cuatro subtipos de IgG humana, de 1 a 4. Las cuatro subclases reflejan la existencia de cuatro cadenas H distintas no genticamente (y1 a y4). que son similares pero no idnticas en cuanto a su secuencia de aminocidos y propiedades generales. Por ejemplo. lgG1 es el subtipo dominante en adultos humanos. La lgG3 es la ms efectiva en su unin al complemento, seguida de lgG1 e lgG2. La lgG4 en la mayoria de los casos es incapaz de unirse al complemento por la va clsica. Todos los subtipos excepto la lgG2 pueden atravesar la placenta. Un resumen de las propiedades fsicas y biolgicas de la IgG se encuentra en las Tablas 37-3 y 37-4. y de los subtipos en la Tabla 37-5.

Inmunoglobulina G
La IgG es el isotipo mejor estudiado tanto a nivel estructural como funcional (Burton. 1985). Los anticuerpos de este tipo constituyen la principal inmunoglobulina en sangre. Se producen copiosamente durante la respuesta inmune secundaria. La regin Fe de las molculas de IgG se une a receptores especficos de clulas lagocficas, como macrfagos y leucocitos polimorfonucleares. incrementando asi la eficiencia con que las clulas fagociticas pueden ingerir y destruir microorganismos infecciosos que se han recubierto con anticuerpos de IgG en respuesta a la infeccin. Estos anticuerpos unidos a clulas diana tambin pueden guiar a linfocitos NK (Natural Killer) a destruirlos mediante un proceso de citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC del ingls antibody-dependenl cell-mediated cytotoxicty. La funcin mejor conocida de la IgG es la activacin del complemento por la va clsica. La regin Fe de la IgG puede unirse, y por tanto activar al primer componente del sistema del complemento, que desencadena un ataque bioqumico que mata a los micoorganismos Se

Inmunoglobulina A
Los anticuerpos de esta clase constituyen el principal tipo de anticuerpo presente en las secreciones (leche, saliva, lgrimas y secreciones respiratorias

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 37-5 Propiedades de las subclases de inmunoglobulinas G IgGI A. Fisiolgicas Porcentaje de IgG total en suero Ritmo de sntesis, mg/kg/dia en suero Ritmo de catlisis en suero, %/da (vida media, da) Relacin K/X Marcadores alotpicos (tipo de Gm) B. Biolgicas Capacidad de fijacin del complemento por la via clsica Capacidad de adhesin a piel heterloga Transporte transplacentario Receptor en macrfagos Capacidad de reaccin con protena A Actividades dominantes: Toxoide antitetnco Toxode antidiftrico Antitiroglobulma Anti-ADN Anti-Fth Anli-lactor VIII Anlidextrano Anlilevano Anti-cido teicoico Nmero de puentes disulfuro entre cadenas pesadas en la regin de bisagra Posicin de los puentes disulluro de las cadenas ligeras sobre las cadenas pesadas 66*8 25 8 (23) 1,4-2,4 a, z, f, x igG2 23 8 ? 6,9 (23) 1,0-1,1 n igG3 7,3 3.8 3,4 16.8 (7) 1.1-1,3 bo, bi, bz. g. st. etc +3 lgG4 4.2 2.6 ? 6.9 (23) 5,0-7,0

+2

+ +
+

+ + + +
+ +

+
-

+
+2 +2 +2 +2 +2

+
+

+ +
+2

2 N214

+ 4 N131

5 N131

2
N131

e intestinales). Existe en forma de un monmero de cuatro cadenas (como la IgG) o formando un dmero de dos unidades monomricas. Las molculas de IgA presentes en las secreciones son dmeros que llevan una sola cadena J. similar a la asociada con la IgM pentamrca, con una cadena adicional glicopolipeptdica llamada el componente secretor (SC) de 70 kDa. Los dmeros de IgA recogen el SC de la superficie de clulas epiteliales que recubren el intestino, tos bronquios o los conductos galactforos, salivares o lacrimales. El componente secretor se sintetiza en las clulas epiteliales e inicialmenle se expone en la superficie extema de estas clulas, donde acta con un receptor que une los dmeros de IgA. El complejo resultante de la unin del dmero a su receptor se internaliza por endocifosis mediada por receptor, y se transfiere a travs del citoplasma de la clula epitelial en forma de vescula membranosa, la cual se fusiona con la membrana plasmtica en el lado luminal de la clula

epitelial. La porcin extramembranal del receptor se escinde por accin enzimtica y se secreta como parte de la molcula de IgA secretora ([(/. ,L,,)/J(/.) al lumen. El extremo amino-terminal del receptor del dmero de IgA que permanece unido a este dmero es el SC (Fig. 37-5). As, la molcula secretora completa de IgA es un producto sinttico de dos tipos celulares, clulas plasmticas y clulas epiteliales. Adems de su papel en el transporte, el SC tambin puede proteger las molculas dimricas de IgA de la digestin por parte de enzimas proteolticas presentes en las secreciones. En los humanos se han clasificado los anticuerpos de IgA en dos subtipos, lgA1 e lgA2, en funcin de la estructura antignica y la variacin en la disposicin de los puentes disulfuro intercatenarios. As como la lgA2 es un componente menor del suero, este subtipo es la forma dominante en las secreciones. Adems, la IgA secretada alcanza los niveles de un adulto antes que
?

Figura 37-5. M e c a n i s m o por el cual el componente secretor m e d i a el transporte de la molcula dimrica de IgA a travs de una clula epitelial. T o d o el complejo se transporta desde el fluido extracelular al interior del lumen del tubo epitelial. El componente secretor s e sintetiza en la clula epitelial c o m o una glucoprotena transmembranal y funciona c o m o un receptor en su superficie basolaleral para unir el dmero de IgA. El complejo IgA-receptor penetra en la clula en una vescula endoctic que cruza la clula y es exocitada en la superficie apical L a escisin del receptor libera el dmero de I g A para su secrecin a la superficie exterior (luminal). La porcin del receptor que permanece unida al dmero de IgA se denomina el componente secretor. Este mecanismo de transporte es responsable de la deposicin de I g A en diversas secreciones exocrinas (p. ej., saliva, leche, bilis, lgrimas y sudor) y en capas mucosas que protegen el revestimiento de los conductos nasofarngeos, intestinales y del tracto genitourinario.

CAPTULO 37

EVALUACIN D E L FUNCIONAMIENTO DE L A S INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

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la IgA en suero. El sistema de IgA en el tracto intestinal humano, por ejemplo, puede estar plenamente desarrollado a los dos aos de edad, mientras que los niveles de IgA en suero no alcanzan las concentraciones de un adulto hasta los 12 aos de edad. Debido a su presencia cerca de las membranas extemas, la IgA secretada constituye u n a primera linea de defensa frente a microorganismos del ambiente exterior Se ha postulado que la IgA inhibe la adhesin de microorganismos a la superficie de las clulas mucosas, previniendo asi. su entrada en los tejidos. Una propiedad de la IgA secretada que es importante en este aspecto es su multivalencia. que se asocia a una gran avidez por la unin de antgenos; esto puede resultar especialmente relevante en la neutralizacin de virus. La actividad antiviral de anticuerpos de IgA se ha demostrado en individuos a los que se le ha suministrado cualquiera de las vacunas para la polio. La IgA secretada tambin puede combinarse con determinados antgenos de la comida, impidiendo su absorcin al torrente sanguneo y reduciendo asi la incidencia de reacciones alrgicas. Por eiemplo. las inmunodeficiencias de IgA pueden desencadenar incrementos en tos niveles e incidencias de anticuerpos humorales dirigidos contra antgenos derivados de la comida y microorganismos intestinales. La IgA posee las siguientes propiedades efectivas: fija el complemento mediante la va alternativa; a travs de un receptor especfico de Fe presente en macrfagos puede funcionar como una opsonina para la fagocitosis; y puede inducir la degranulacin de eosinfilos mediante un receptor especifico, que ha implicado a la IgA en respuestas antiparasitarias. Las propiedades fsicas y biolgicas de la IgA estn enumeradas en las Tablas 37-3 y 37-4.

Inmunoglobulina E
De los diversos tipos de inmunoglobulinas. la IgE est presente en la menor concentracin en suero (Tabla 37-4). Posee la habilidad de unirse a la piel humana (anticuerpo homoertotropico) y de iniciar aspectos de la reaccin alrgica (anticuerpo reagnico) La actividad biolgica de la IgE se basa en su propiedad de unirse mediante su regin Fe a basfilos y a su equivalente en los tejidos, los mastocitos L a IgE puede ser importante tambin en la respuesta inmune humoral durante enfermedades parasitarias, ya que a menudo se encuentran elevados los niveles de esta inmunoglobulina en suero de pacientes que presentan una infeccin por helmintos. La IgE puede jugar un papel en el paso de leucocitos, anticuerpos y componentes del complemento a los locos de inflamacin desencadenando una reaccin de hipersensibilidad inmediala. Los anticuerpos de IgE representan un claro ejemplo de la naturaleza biluncional de las molculas de anticuerpo Su porcin Fe se une a las clulas diana mientras que su porcin Fab se une al alrgeno (vase Capitulo 46 para el papel de la IgE en enfermedades alrgicas y ensayos relacionados) Los niveles de IgE en suero en determinadas condiciones se muestran en la tabla 37-6. Al igual que la IgA, la IgE se produce principalmente en el revestimiento de los tractos respiratorios e intestinales y forma parte del sistema secretor externo de anticuerpos. Una deficiencia de IgE se ha asociado de forma poco consistente con la deficiencia de IgA en individuos inmunodeficienles que presentan una excesiva susceptibilidad frente a infecciones. La IgE no atraviesa la placenta y los complejos de IgE-antigeno no se unen al complemento por la va clsica (Tabla 37-4).

Inmunoglobulina D
A pesar de ser un componente minoritario del suero, la IgD es una de las principales inmunoglobulinas de membrana presentes en la superficie de una proporcin elevada de linfocitos B, especialmente en recin nacidos. Durante el transcurso de la diferenciacin de las clulas B. estas clulas sintetizan y presentan en superficie tanto molculas de IgD como de IgM. Aunque esto aparentemente contradice la regla de "una clula, una inmunoglobulina", los dominios de unin al antgeno (idiotipos) de ambas molculas y de sus cadenas ligeras son idnticos. Slo difieren en sus regiones C. La IgD asociada a la membrana puede funcionar como uno de los receptores con que las clulas B unen el antigeno y se estimulan para sufrir la proliferacin clonal. Existen evidencias que sugieren que las clulas B que presentan IgM pueden responder a ciertos antgenos T-independientes y que la adquisicin de IgD se requiere por parte de las clulas B para poder responder a la ayuda de clulas T necesaria para las respuestas a antigenos T-dependientes. Adems, si las molculas de IgD se eliminan selectivamente de clulas B que presentan tanto IgD como IgM. aprovechando que la cadena 8 es mucho ms sensible a la accin de la papaina, estas clulas pasan a ser susceptibles de convertirse en tolerantes. El papel exacto de la IgD en una respuesta inmune sigue sin conocerse, pero la opinin general es que enciende, apaga o modula la divisin o la diferenciacin de clulas B. La IgD generalmente se detecta en suero a los seis meses de edad, y su concentracin a lo largo de toda la vida es m u y baja. Sin embargo, en estados de enfermedad la concentracin de IgD puede variar enormemente. En infecciones crnicas, los niveles en suero de IgD se elevan, al igual que los del resto de las inmunoglobulinas. Hasta la fecha, no se ha asociado un incremento especfico de IgD con una enfermedad en concreto. Pacientes con alergias y enfermedades autoinmunes no presentan variaciones de las concentraciones normales de IgD. Generalmente, la IgD est ausente en individuos con hipogammaglobulinemia. Hasta la lecha, la IgD no tiene asignado un papel biolgico especfico como anticuerpo humoral. Se ha descrito la actividad de la IgD frente a un cierto nmero de antigenos. La IgD de superficie, que tiene protenas semejantes a las de la IgM de superficie, es un marcador de clulas B maduras, y su papel c o m o receptor est aceptado a pesar de que la naturaleza y finalidad de la seal que Iransmile siguen siendo controvertidas (Carsetti. 1993; Roes. 1993). La IgD no une al complemento, no atraviesa la placenta y no se une a clulas a travs de su regin Fe. La forma secretada de IgD. al igual que la del resto de las inmunoglobulinas. carece del pptido transmembranal en la regin carboxi-terminal que ancla la molcula en la superficie de las clulas B. Las Tablas 37-3 y 37-4 enumeran otras propiedades de la IgD. Tabla 37-6 Niveles de IgE en suero en determinadas afecciones
Elevado

Dermatitis atpica Mieloma de IgE Hiper-lgE e inlecciones recurrentes Sndrome de Wiskott-Aldrich Enfermedad de Hodgkin (especialmente en lases tardas) Aspergilosis broncopulmonar Pnfigo Parsitos (como la ascariasis) Lepra Sida
De normal a elevado

Rinitis alrgica Asma alrgica Alveolitis extrnseca alrgica Fibrosis quistica Aspergiloma Alergias a medicamentos Enfermedad heptica grave Urticaria alrgica Enfermedad de Kawasaki Periarteritis nodulosa
Normal

Linfangiectasia intestinal Bronquiolitis Pnligo Tiroiditis Fallo renal crnico

De normal a disminuido

Leucemias Mieloma mltiple Deficiencia de IgA

Disminuido

Ataxia-telangiectasia Hipogammaglobulinemia ligada al sexo Hipogammaglobulinemia congenita Hipogammaglobulinemia adquirida Deficiencia de IgE
Modificado a partir de Waldmanri TA Strober W, Polmar SH. Terry WD en Ishizaka K Daylon DH Jr (eds) Tue Biological Role ol the Immunoglobulin E System. Washington DC. US. Governrnenl Printing Oltice 1975 y Arbesman CA tvi Ishi/aka K. Daylon DH. Jr (eds): The Biological Role ol the Immunoglobulin E System, Washington. DC. U S. Government Printing Ottice, 1975

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAKXOGI'A

Tabla 37-7 Concentraciones d e inmunoglobulina e n suero Edad (Aos) 5-9 10-14 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75+ Media de IgG (mg/ml) Media de IgA (mg/ml)

Hiperinmunoglobulinemia
NIVELES D EI N M U N O G L O B U L I N A SE NS U E R O Una interpretacin vlida de los niveles de inmunoglobulinas en suero requiere un reconocimiento de las variaciones biolgicas que existen a lo largo de la vida de los individuos. Las vanables ms importantes son la edad, sexo y raza. Estudios en un grupo de individuos sanos de raza blanca (3.212) de u n a sola comunidad (Tecumseh, MI) mostraron que la concentracin media de IgG e IgA aumenta con la edad, con diferencias pequeas pero significativas entre sexos. Las mujeres presentaban niveles mayores en suero de IgG y menores de IgA (Tablas 37-7 y 37-8) A pesar de que estas diferencias entre sexos para la IgG y la IgA son estadsticamente significativas, su significado biolgico no resulta evidente. Los niveles de IgM en estos sujetos permanecieron relativamente constantes con la edad. Sin embargo, las mujeres lenan niveles medios de IgM (1,06 mg/ml) superiores a los hombres (0,77 mg/ml). Vanos estudios han descrito que los niveles de inmunoglobulinas son m a s elevados en personas con pieles pigmentadas. En la Tabla 37-8 se muestran los resultados obtenidos en una poblacin birracial de individuos sanos del condado de Evans. Georgia. Los individuos de color tenan niveles mayores de las tres inmunoglobulinas principales (IgM. IgG e IgA) que los blancos. La mayor diferencia se encontr en la IgG. No se detectaron diferencias entre individuos urbanos y rurales en este estudio. Individuos blancos de Rochester, Nueva York, tenan niveles en suero de IgG e IgM similares a los de individuos blancos de la Georgia rural. Un estudio trirracial en Durban, Natal, Sudfrica, demostr que varones adultos bantes tenan niveles significativamente mayores de IgM (32% ms), IgG (40% ms) e IgA (32% ms) en suero que individuos blancos de esta comunidad que nacieron en el mismo ao y pertenecan al mismo grupo sanguneo ABO. Varones asiticos sanos mostraban aproximadamente un 20% ms de IgG. un 23% ms de IgA. y un 7% ms de IgM que individuos comparables de raza blanca. Un estudio de individuos del rea metropolitana de Washington, D.C. demostr que individuos de color tenan niveles significativamente mayores de IgG que individuos blancos pero niveles similares de IgA e IgM (Tollerud. 1995). Los grupos control empleados en estos estudios se hicieron atendiendo a la edad. sexo, raza y tambin a diversos factores ambientales (Cassidy, 1974; Lichtman, 1967). Los incrementos de '/-globulinas a menudo se detectan primero tras una electreforesis de protenas del suero, una medida de las protenas totales o de albmina y fracciones de y-globulinas. Los valores de referencia para las diversas inmunoglobulinas varan con la edad, sexo y raza (Tablas 37-7 y 37-8). Los incrementos de inmunoglobulinas pueden ser monoclonales o policlonales. Las inmunoglobulinas monoclonales de un nico individuo son idnticas estructuralmente, y se cree que son el resultado de la expansin clonal de una sola clula linfoide productora de inmunoglobulinas, y por tanto, son especficas para un solo antigeno. Las inmunoglobulinas policlonales de un m i s m o individuo son estructuralmente diferentes entre ellas en una o ms caractersticas importantes: por tipo, IgG, IgA o IgM policlonales: por su cadena ligera; o por su especificidad antignica. Las inmunoglobulinas policlonales provienen de la expansin clonal de varias clulas linfoides productoras de distintas inmunoglobulinas. I N M U N O G L O B U L I N A SP O L I C L O N A L E S Los aumentos policlonales de inmunoglobulinas se han asociado con diversos estados patolgicos (Tabla 37-9) (Buckley, 1977; Cushman. 1973). La electroforesis de protenas sricas es a menudo suficiente para estable-

Varn blanco Mujer blanca Varn blanco Mujer blanca 10,28 10.41 10,55 10,69 10.83 10.98 11.12 11.27 11,42 11,57 11,72 11.88 12,04 12.20 12.36 11.05 11.13 11 20 11 28 11.35 11.43 11.50 11.58 11,66 11,74 11,81 11.89 11,97 12.05 12.13 1.09 1,16 1,23 1,32 1.40 1,50 1.59 1.70 1.81 1.93 2.06 220 2.34 2.49 2.66 1,10 1.15 1.21 I.28 1.35 1.42 1,49 1.57 1,65 1,74 1,83 1.93 2.03 2.14 2.26

Los dalos se obtuvieron de 3 213 muestras de suero recogidas de un grupo de sujetos no praseleccionados de una sola comunidad sana (Tecumserv MI) (Cassidy. 1974).

Resumen
En humanos existen cinco tipos diferentes de anticuerpos (IgM. IgG, IgA, IgD e IgE). cuatro subtipos de anticuerpos IgG (lgG1, lgG2. lgG3 e lgG4) y dos subtipos de IgA (lgA1 e lgA2). Cada uno de estos isotipos de anticuerpo posee una determinada cadena H (n, y, a. 8, e, y y, y . y y n, a. respectivamente). Las cadenas H contienen la regin F e del anticuerpo, que determina qu otras protenas se unirn al anticuerpo y por tanto, las propiedades biolgicas del tipo y subtipo. Cualquiera de las cadenas L (K- O X) pueden asociarse con cualquiera de las cadenas H.
3

Las diferencias estructurales entre los cinco tipos de inmunoglobulinas corresponden a las diferencias funcionales en sus lugares de produccin y accin, sus niveles relativos de sntesis en respuestas inmunes primarias y secundarias, y sus papeles como efectores fisiolgicos. Por ejemplo, la IgG predomina tanto en sangre como en los fluidos intersticiales, mientras que la IgM est principalmente confinada a la sangre, y la IgA secretada se encuentra fundamentalmente en superficies epiteliales. La IgD e IgE se encuentran principalmente unidas a clulas, la IgD en clulas B. y la IgE en basfilos y mastocitos.

IMPORTANCIA CLNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS

Las inmunoglobulinas juegan papeles muy importantes en la patognesis, diagnosis, prevencin y terapia de las enfermedades.

Patognesis
La hiperinmunoglobulinemia es una destacada caracterstica del mieloma mltiple y de la macroglobulinemia de Waldenstrom. Anticuerpos contra antgenos nativos pueden aparecer en enfermedades autoinmunes. tal y como se describe en los Captulos 43 y 45. La hipo- y agammaglobulinemia es a menudo una de las caractersticas ms destacadas de algunas inmunodeficiencias (vase Captulo 42).

Tabla 37-8 Sexo Hombres

Concentracin de le G en suero en una poblacin birracial Edad (Aos) 15-34 35-54 55-74 15-34 35-54 55-74 N. de muestras 17 17 20 19 19 20 Media de la raza blanca ( SE) (mg/ml) 11.2(7.3) 10.8 (5.9) 10,9(7.4) 10,6 (6,3) 12,3(3.4) 10,9 (6.1) N. de muestras 21
"

Media de la raza negra ( SE) (mg/ml) 13.4 (6.5) 13,5 (9,0) 13,3 (5.8) 15,6 (8.0) 15,4 (6,4) 14.2 (9,6)

20 I8 15 16

Mujeres

Estos datos son representativos de habitantes de Evans County, Georgia (Lichtman. 1967)

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

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Tabla 37-9

Hiperinmunoglobulinemias policlonales: algunas enfermedades asociadas Tipo de inmunoglobulina

Afeccin Inmunodeliaenaas Hiperinmunoglobulina E e infecciones recurrentes Sndrome de Wiskott-Aldrich Disgammaglobulinemia tipo 1 Hiperinmunoglobulina A e infecciones recurrentes Sida Infecciones Infecciones congnitas (sfilis. toxoplasmosis, rubola, citomegalovirus) Mononucleosis infecciosa Tripanosomiasis Parasitismo intestinal Varias infecciones helmnticas Larva migrans visceral Granulomatosis crnica infantil Lepra Infecciones crnicas en general Enfermedades hepticas Hepatitis crnica activa Hepatitis aguda Cirrosis biliar Hepatitis lupoide Trastornos pulmonares Sndrome de hipersensibilidad pulmonar Sarcoidosis Beryliosis Trastornos autommunes Lupus eritematoso sistmico Artritis reumatoide Muchos estados autoinmunes como la tiroiditis Escleroderma Enfermedad de la aglutinina fra Prpura anafilctica Otras Sndrome do Down Amiloidosis Adiccin a narcticos Enfermedad de los lbulos renales

igE igA, igE IgM igA Todos los tipos IgM IgM o todas IgM o todas Todos los tipos igE Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos, con preferencia de IgG Predomina IgG Predomina IgG Predomina IgM Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos igA o todos Todos los tipos Todos los tipos IgM IgA Todos los tipos Todos los tipos IgM Todos los tipos

La incidencia de las inmunoglobulinas monoclonales (componentes M) en estudios de una poblacin no seleccionada se estima en 0,9% (Bachman. 1965: Axelsson. 1968; Cohn 1985). En labratenos clnicos se encuentra una incidencia mucho mayor de resultados positivos, puesto que los sueros son preseleccionados. El mieloma mltiple, la macroglobulmemia de Waldenstrm y neoplasias de clulas B son algunas de las enfermedades asociadas con un aumento en el nivel de inmunoglobulinas monoclonales. Antes se crea que las gammapatias monoclonales eran poco frecuentes en casos de leucemia linfoctica crnica o de linterna Imfocitico bien diferenciado. Actualmente se ha demostrado que cuando se combinan la inmunofijacin y la electroforesis de alta resolucin para estudiar muestras de estos pacientes, la mayoria de ellos presentan una gammapata monoclonal (Keren. 1988). Tambin se ha demostrado la existencia de gammapatias en pacientes con linterna de Burkitt y leucemia linfoctica aguda de clulas B. Aunque generalmente se desconocen las especificidades antignicas de las gammapatias monoclonales, algunas causan neuropatas paraproteinmicas. Este sndrome clnico generalmente se debe a la interaccin de una paraproteina de IgM con una glucoproleina asociada a la mielina (MAG), ganglisidos (por ej. GM. en la neuropata motora y GD, en la neuropata sensorial) u otros glicoesfingolipidos (Ropper, 1998). El trmino de gammapata monoclonal de significado indeterminado (MGUS: monoclonal gammopathy of undetermmed signiticance) fue acuado por Kyle para categorizar individuos en los que se ha demostrado un componente monoclonal en el suero pero que carecen de otras caractersticas que permitan el diagnstico de un cncer (Kyle. 1982). Individuos con MGUS pueden tener hasta un 10% de sus clulas plasmticas en la mdula sea. Esto es considerablemente menos que la plasmacitosis de mdula sea que se asocia con el mieloma mltiple. Aproximadamente un 20% de individuos con MGUS desarrollarn un trastorno linfoproliferativo de clulas B, siendo el ms comn de ellos el mieloma mltiple, en un periodo de 10 aos. Algunos de los otros casos pueden desarrollar leucemia linfoctica crnica, amiloidosis. linterna linfoctico diferenciado y otras patologas que afectan a la proliferacin de clulas B. La mayoria de los casos de MGUS no progresan hacia ninguna otra patologa clnica. Pacientes con MGUS poseen cantidades del componente M de entre 300 y 3.000 mg'dl y normalmente no presentan la protema de Bence Jones en la orina. Se recomienda que estos pacientes tengan un seguimiento mediante electroforesis de protenas sricas cada 6 a 12 meses para determinar si el proceso progresa o retrocede. Una consideracin especial es el MGUS que se observa en pacientes Irasplantados que han recibido inmunosupresores que afectan a las funciones de clulas T incluyendo la modulacin de la respuesta B. Estas gammapatias monoclonales pueden ser transitorias hasta en un 75% de los casos (Radl, 1985). Pueden ocurrir tanto en forma monoclonal como oligoclonal (Stanko, 1989). y pueden coincidir con infecciones por citomegalovirus o por el virus de Epstein-Barr (Drouet, 1999). Su progresin probablemente se estimula por los elevados niveles de interleucina-6 circulantes (Nickerson, 1994).

cer esta condicin. La inmunoelectroforesis, inmunofijacin y determinacin de las inmunoglobulinas individuales o cadenas ligeras de inmunoglobulina pueden ayudar a confirmar una distribucin policlonal o un aumento de uno o ms tipos de inmunoglobulina. El aumento de las inmunoglobulms sricas puede deberse a un descenso del catabolismo y un aumento de la sntesis. Los mecanismos de control de estos sucesos no se conocen bien. Las consecuencias de una elevacin de inmunoglobulinas son desconocidas. La mayor parte de las inmunoglobulinas no parecen estar dirigidas frente a un solo determinante antignico o grupo de ellos. Adems, la mayora de los autoanticuerpos no son monoclonales sino policlonales, En general, los incrementos persistentes de carcter policlonal en y-globulinas, se relacionan con una estimulacin antignica de naturaleza crnica, o con una prdida de la regulacin de las inmunoglobulinas.

Tabla 37-10

Alteraciones asociadas a inmunoglobulinas monoclonadas

Inmunoglobulinas

monoclonales

L a s inmunoglobulinas monoclonales o los fragmentos de inmunoglobulinas se han asociado con diversos estados patolgicos (Tabla 37-10) (Atkinson, 1977; Benbassat, 1976: Schaefer, 1978; Wells, 1974; Kelly, 1985). Estas inmunoglobulinas tambin se han llamado inmunoglobulinas de heterogeneidad restringida.

Mieloma mltiple Macroglobulinemia de Waldenstrom Leucemia linfoctica crnica Otras leucemias : Linfomas I Gammapata monoclonal "benigna" j Sndrome de escape capilar sistmico Amiloidosis i Enfermedad heptica crnica como la hepatitis activa, o la cirrosis biliar primaria Trastornos autoinmunes, incluidas la artritis reumatoide. el lupus eritematoso sistmico. la tiroiditis. la anemia perniciosa, la poliarteritis nodulosa o el sndrome de Sjogren Enfermedad de Gaucher | Varios tipos de cncer Esferocitosis hereditaria I Infeccin por VIH, incluido el sida

888

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA Se recomiendan los siguientes tipos de antisuero: antisuero completo humano; anti-lgG (cadenas y). anti-lgM (u), anti-lgA (a), anti-K y anti-A (Fig. 37-6). Es importante darse cuenta de que no todos los antisueros son semejantes en cuanto a fuerza y especificidad y es posible que un componente M no se detecte con un antisuero y, sin embargo, pueda encontrarse con un segundo antisuero. Asi, cada lote de antisuero debe compararse con un suero control para su actividad mediante una difusin en gel, y para su especificidad con suero humano completo mediante IEP. La interpretacin de una IEP puede requerir una considerable experiencia, pero generalmente uno busca una variacin de una linea normalmente uniforme, como puede ser porque se curva, presenta engrasamiento o tiene diferente movilidad. Ejemplos de IEP se muestran en la Figura 37-6. La IEP es una tcnica til pero tiene sus limitaciones. Puede identificar la presencia de cadenas pesadas y ligeras pero no asegura que lo que hay es efectivamente una molcula de inmunoglobulina compuesta por dos cadenas pesadas y dos ligeras. Tambin es posible, aunque poco frecuente, que existan anticuerpos monoclonales por debajo del lmite de deteccin del sistema empleado. El umbral de deteccin puede determinarse diluyendo un anticuerpo monoclonal conocido y probndolo en IEP. Debido a que protenas monoclonales pertenecientes a las IgM, IgA. IgD e IgE pueden estar presentes en cantidades relativamente pequeas en comparacin con la IgG, la cadena ligera de la inmunoglobulina no-lgG puede no ser detectada mediante IEP. La incapacidad para detectar las cadenas ligeras de inmunoglobulinas presentes en menor concentracin en presencia de una mayor concentracin de IgG, s e denomina efecto sombra (umbrella eflecl). Por tanto, pueden ser necesarios otros procedimientos para descartar la enfermedad de Franklin o de cadena pesada. Es posible que el suero que se est testando y el anticuerpo que se est utilizando no estn a la concentracin adecuada y que no se detecte el componente M. Finalmente, puede ser que el antisuero que se est usando no detecte los determinantes disponibles de un componente M concreto. Si uno tiene una importante sospecha, puede ser til utilizar un segundo antisuero de distinto origen.

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES
La evaluacin en el laboratorio de los niveles y funciones de inmunoglobulinas puede ayudar en el diagnstico y tratamiento de las patologas. El empleo de pruebas de fijacin del complemento, de hemaglutinacin y otros inmunoensayos pueden detectar un aumento o cambio en la titracin de anticuerpos frente a determinados antigenos, como los que estn presentes en microorganismos. Las peticiones de examinar un suero para la presencia de protena monoclonal generalmente vienen de un mdico que reconoce en un paciente los sntomas clnicos y signos de este tipo de trastorno, o del examen clnico de una electroforesis de proteina srica que sugiere la presencia de una protena monoclonal. A menudo la sospecha del mdico de la existencia de una discrasia de clulas plasmticas viene con la deteccin de anemia (con una o ms citopenias), niveles elevados de proteina total en el suero con un aumento de las globulinas, y proteinuria: otras detecciones pueden incluir hiperuricema, hipercalcemia, un incremento de fosfatasa alcalina, dolor seo o lesiones lticas del tejido seo en radiografas. Si efectivamente existe un componente M en la electroforesis de protenas sricas, una medida cuantitativa de inmunoglobulinas por inmunodifusin radial, nefelometra u otra tcnica apropiada puede identificar la inmunoglobulina especifica si slo se encuentra elevado uno de los tres tipos principales de inmunoglobulina. Obviamente, esto no determina la cadena ligera de una inmunoglobulina monoclonal ni detecta los mielomas de cadena ligera. Las gammapatas biclonales pueden ser confusas. El empleo de inmunoglobulinas cuantitativas resulta til en la monitorizacin del transcurso de la enfermedad y su tratamiento y puede ayudar a distinguir la condicin benigna de la maligna. Niveles de IgG monoclonal de 2 g/100 mi o de IgA de 1 g/100 mi (Isobe, 1971) o superiores sugieren una condicin maligna. En muchas inmunoctopatas malignas, la concentracin de inmunoglobulinas no monoclonales se encuentra reducida. Asi, una deficiencia de inmunoglobulinas policlonales sugiere la malignidad. Paradjicamente el paciente que posee una inmunocitopata maligna es inmunodeficiente a pesar de que posee grandes cantidades de inmunoglobulinas "sin sentido" producidas por un clon de clulas linfoides mal controlado.

Inmunofijacin
La IFE prcticamente ha sustituido a la IEP en el laboratorio clnico debido a su rapidez, sensibilidad y facilidad en la interpretacin; ambos procedimientos son comparables en cuanto a sensibilidad. La IFE adems posee la ventaja de dar un resultado ms rpido ya que no requiere la difusin a travs de gel. Muestras de suero del paciente se someten por duplicado a una electroforesis en gel de alta resolucin antes de aadir un antisuero monoespecfico directamente sobre las protenas separadas. Se lava el gel, y los complejos antigeno-anticuerpo se tien y miden directamente (Fig. 37-7). De vez en cuando, la concentracin de una protena monoclonal en el suero de un paciente es tan alta que excede la capacidad de los anticuerpos para lormar complejos que precipiten por IFE. Este fenmeno se corresponde con la zona de exceso de antigeno indicada en la Figura 37-2. El resultado es un halo de complejos precipitados (donde las concentraciones se aproximan a la equivalencia) con una zona central clara donde existe el exceso de antgeno. Aunque este resultado parece atpico, se puede interpretar y comprobar de forma directa repitiendo el IFE con una mayor dilucin del suero del pctenle (Keren, 1999). Cualquiera de las dos tcnicas puede aplicarse a otros fluidos corporales, siendo la orina el ms comn. Se pueden detectar cadenas ligeras monoclonales en la orina (protena de Bence Jones) de ms de la mitad de los pacientes con mieloma mltiple (Isobe. 1971; Wells. 1974). Cadenas ligeras policlonales pueden detectarse en pacientes con otros trastornos, normalmente formando parte de molculas de inmunoglobulina completas. La deteccin de la protena de Bence Jones por calor se describe en el Capitulo 18. L a IEP/IEF de orina es ms especfica y ms sensible que otros ensayos de Bence Jones ms antiguos. Se pueden realizar IEP/IEF en muestras de orina con suficiente proteina o tras concentracin por liofilizacin o mediante membranas selectivas (Minicon, Amicon). La medida de la viscosidad del suero se estudia en el Captulo 27.

Inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis (IEP) y la electroforesis con inmunofijacin (IFE) son muy tiles en la deteccin de protenas monoclonales. Asi, en pacientes que presentan signos sospechosos, sntomas o especialmente cuando se detectan signos hematopatolgicos en sangre perifrica, mdula sea o ganglios linfticos, un IEP puede dar un diagnstico. El que una electroforesis de proteina srica deba preceder a una IEP o IFE depende de la disponibilidad relativa de estas tcnicas y de la sofisticacin de cada laboratorio. Por ejemplo, una electroforesis en agarosa de protenas sricas detecta la mayora de los componentes M. Sin embargo, la electroforesis en papel o acetato de celulosa no es tan sensible. Otro modo de seleccionar sueros para IEP o IFE es revisando las determinaciones electroforticas de las protenas sricas. Otra manera de abordar el anlisis sugerida por Keren y sus colaboradores (Keren, 1988) consiste en determinar los valores del suero y la relacin K/X conjuntamente con una electroforesis de alta resolucin. La inmunofijacin del suero se realiza si no se detectan anomalas en la electroforesis, ni hipergammaglobulinemia, ni hipogammaglobulinemia. y si la relacin K/X no se encuentra dentro de los valores de referencia. Tambin se recomienda la inmunofijacin del suero cuando la relacin K/X es normal pero aparece una banda no identificada en la electroforesis. L a IEP es una tcnica sensible y relativamente sencilla empleada para detectar componentes M y sus cadenas pesadas y ligeras. Permite una semicuantificacin de la concentracin de las inmunoglobulinas. El suero de pacientes se debe comparar con sueros "normales" o un grupo normal". Por ejemplo, de muestras de 100 a 200 mi de individuos sanos, se hacen porciones de 1 mi que se congelan rpidamente en hielo seco y acetona y se conservan a -70 C. El suero control que no se ha utilizado no se vuelve a congelar sino que se tira tras mantenerlo durante 3 dias a 4 C.

EVALUACIN D E L FUNCIONAMIENTO DE L A S INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

I
v

Figura 37-7. Presencia de inmunoglobulinas demostrada mediante inmunofijacin del suero Se sometieron por duplicado muestras de suero de un paciente a una electroloresis en geles de agarosa a pH 8.6. Las protenas separadas reaccionan con un antisuero monoespecilico, los geles se lavaron, fijaron y tieron. SP o SPE = muestra que no ha sido lavada o que no se ha sometido a reaccin con el antisuero: G o IgG = muestra que ha reaccionado c o n anti-lgG: A o anti-lgA = muestra que ha reaccionado c o n IgA: M o anti-lgM = muestra que ha reaccionado con anli-IgM. K o anti- = muestra que ha reaccionado con anti- ;Loanti- - muestra que ha reaccionado con anti- . A. "normar. B Componentes M de IgG-K (2). C. Componente M de IgA- . D. componente M de IgM- . E. componente M de cadena F. componente M de cadena .

Prevencin de las enfermedades y terapia

La inmunizacin pasiva es la administracin de anticuerpos preformados obtenidos de otro individuo de la misma especie ( -globulinas homologas) o de una especie diferente ( -globulinas heterlogas); proporciona una proteccin inmediata frente a la infeccin. La inmunidad dura poco y decae a medida que los anticuerpos se utilizan y catabolizan. La proteccin pasiva durante el periodo neonatal se basa en la transferencia de anticuerpos maternos a travs de la placenta o el calostro (Pennington. 1991). Grupos de -globulinas humanas son tiles para la proteccin temporal frente a varias infecciones vricas o bacterianas (Berkman, 1990; Hammarstrm, 1990; Desai, 1991). Dependiendo de la dosis empleada y el momento de administracin, la enfermedad puede modificarse a una forma ms suave o puede prevenirse por completo. El efecto es ms completo y predecible si se usan preparaciones hiperinmunes preparadas a partir del plasma de individuos que estn convaleciendo de la enfermedad en cuestin o que se han inmunizado

frente a ella recientemente. Estas preparaciones contienen una concentracin ms elevada de anticuerpos especficos. Tambin se pueden producir anticuerpos en animales, como pueden ser los caballos, y en el pasado han tenido una importante aplicacin. Sin embargo, la sensibilizacin a protenas externas puede desencadenar reacciones clnicas como la anafilaxis, enfermedad del suero, pirexia y reacciones de Arthus locales. Los anticuerpos monoclonales han revolucionado muchas reas de la medicina, incluyendo la investigacin, diagnstico y terapia. Se han desarrollado anticuerpos murinos, humanos y humanizados (Lefrano, 1990: Mountain, 1992: Morrison, 1992; Ward. 1992; Shin, 1993). Muchos anticuerpos monoclonales. que a menudo reemplazan a los antisueros policlonales. se usan con fines diagnsticos (Vase Cap. 35). Quizs las aplicaciones teraputicas ms importantes se ven en el campo del trasplante y la oncologa (Neame. 1994; Stevenson. 1990: Vitetta, 1993). OKT3. un anticuerpo monoclonal munno frente al receptor CD3 de linfocitos, a menudo se emplea c o m o terapia antirrechazo para bloquear la actividad de linfocitos T citotxicos en

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

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Anticuerpos monoclonales anticitocinas y antimolculas de adhesin de neutrfilos pueden resultar efectivos en condiciones asociadas con inflamacin aguda y liberacin de cilocinas, por ejemplo, inhalacin de cido, isquemia o heridas de reperfusin (infarto de miocardio, choque hemorrgico, reparacin de un aneurisma artico); y anticuerpos que inhiben la adhesin de neutrfilos pueden resultar efectivos en el tratamiento de asma, fibrosis pulmonar, meningitis y malaria cerebral. Parece razonable esperar que una multitud de aplicaciones teraputicas aparezcan en el luluro, en que se disearn anticuerpos monoclonales que modulen las acciones de uno o ms mediadores naturales de inflamacin, infeccin o proliferaciones malignas.

C A P T U L O

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Complemento y cininas: mediadores de la inflamacin

Eric Wagner, PhD. Haixiang Jiang, M.D., PhD Michael M. Frank, M.D.
ESTRUCTURA Y FUNCIN DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO Nomenclatura C3: molcula central de las vas de activacin del complemento Va clsica Va alternativa Va de la lectma fijada a maosa Componentes finales del complemento Anafilotoxinas Regulacin de la activacin del complemento Receptores del complemento Biosntesis del complemento Gentica del complemento Complemento e inmunidad adquirida DEFICIENCIAS GENTICAS DEL COMPLEMENTO EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD DEL COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD Enfermedades reumatolgicas Enfermedades infecciosas Enfermedades renales BIBLIOGRAFA 910 903 903 902 Enfermedades dermatolgicas 892 Enfermedades hematolgicas Enfermedades neurolgicas Enfermedades cardiovasculares Biocompatibilidad Trasplante de rganos UTILIDAD CLNICA DE LOS INHIBIDORES DEL COMPLEMENTO ENSAYOS DEL COMPLEMENTO Principios generales Evaluacin funcional de la va clsica Manejo de las muestras Preparacin de eritrocitos Preparacin de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos Ensayo del complemento hemoltico total Ensayo de la va alterna Niveles del complemento mediante ensayos antignicos Prueba de fijacin del complemento CININAS Y SISTEMA DE GENERACIN DE CININAS 910 906 906

ESTRUCTURA Y FUNCIN DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO

El trmino "complemento" se refiere a un grupo de glicoprotenas circulantes que funcionan facilitando la inflamacin y realizan un importante papel en la defensa del husped. El dao tisular incontrolado es una posible complicacin de la activacin del complemento, y existen una gran variedad de glicoproteinas circulantes as c o m o protenas tisulares de unin a membrana que funcionan regulando la actividad del complemento y disminuyen la agresin del complemento. La existencia de este sistema de protenas fue inferido en los ltimos aos del siglo xix cuando qued claro que el suero fresco tena la posibilidad de lisar bacterias Gram negativas y vibriones clera en presencia de anticuerpos especficos. A medida que las tcnicas para la purificacin y la identificacin de protenas se hicieron ms sofisticadas con los aos, qued claro que haba un sistema muy complejo con muchas protenas interaccionando. En general, el sistema funciona identificando clulas y microorganismos extraos y destruyndolos Esto ocurre por lisis directa, por opsonizacin (el proceso de cubrirlos con pptidos especficos del complemento reconocidos por receptores especficos de los fagocitos para producir su ingestin) o provocando infla-

macin con la atraccin de clulas fagocitos. Tambin ha quedado claro que el complemento juega un papel para facilitar la respuesta inmune. El sistema de protenas del complemento es ms antiguo filogenticamente que la inmunidad adquirida (anticuerpo) y est presente en muchos organismos primitivos. Presumiblemente, proporciona un nivel de inmunidad natural y defensa del husped incluso en ausencia de anticuerpos. Esto lo hace a travs de la va de la de lecitina unida a manosa (MBL) y la va alternativa del complemento, que se tratan mas adelante. Los anticuerpos proporcionan un nivel de especificidad aumentado y aumentan la eficacia mediando la defensa del husped. En otras obras se puede encontrar una detallada historia del descubrimiento del complemento y de las diferentes vias del complemento (Frank. 1998).

Nomenclatura
Hay tres vias pnncipales de activacin del complemento en el suero humano: la va clsica, la va alternativa y la via de la MBL (o va de la MBLectina). La Figura 38-1 muestra la secuencia de reaccin de cada va. La Tabla 38-1 proporciona informacin especifica sobre cada proteina del complemento plasmtica La nomenclatura para las protenas del sistema del complemento

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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C5b678(9)n

Complejo de alague de membrana

Figura 38-1. Los componentes de las vas clsica, MBIecitina y alternativa convergen para formar una convertasa que degrada al C3. En la via clsica, el complejo antigeno-anticuerpo se une y activa secuencialmente al C1,C4y C2. En la va de la MBIectina, la interaccin de la MBL con un carbohidrato en la superficie de un microorganismo origina la formacin de un complejo enzimtico (MBL-MASP-l-MASP-2, llam a d o M en la figura) que se une y activa al C4 y al C2. En la via alternativa, el C3 sufre la hidrlisis de su enlace tiol-sler. lo que induce un cambio en su conformacin. Entonces se une al factor B (B), que es degradado por el factor D (D) para formar una convertasa que es estabilizada por la properdina (P). El C3b, el producto de degradacin del C3, tambin tiene un residuo tiol-ester degradado y es capaz de activar la via alternativa. La convertasa con C3b de todas las vas contina secuencialmente mediante la unin con los componentes de aparicin final hasta que la secuencia de activacin se completa.

generalmente sigue dos convenciones (WHO. 1968: IUIS-WHO. 1981). Por razones histricas, las nueve protenas de la va clsica se nombran por la letra C seguida del nmero que cuenta su orden de aparicin en la secuencia de reaccin. Una excepcin importante es C4, que aparece antes que C2. Las molculas que son parte del complejo C1 se denominan Clq, Clr y Cls. Las protenas que reaccionan nicamente en la va alternativa son llamadas factores y se denominan con una letra mayscula (p. ej., factor B. factor D). Adems, los fragmentos de las protenas del complemento resultantes de la ruptura proteoltica se denominan con una letra en minscula (p. ej.. C4a, C4b) donde a representa el fragmento pequeo y b representa el fragmento grande. La excepcin a esta regla es C2, donde C2a es el fragmento grande y C2b es el fragmento pequeo. Los posteriores fragmentos degradantes de los fragmentos grandes del complemento en un componente son denomina-

dos con una letra en minscula (p. ej., C3c, C3d). Los componentes que han perdido su actividad normalmente se denominan con un prefijo con i minscula (p. ej.. iC3b, iC4b). Las cadenas polipeptdicas de la protena nativa del complemento se denominan con letras griegas (r/.. |5. y) excepto para el Clq, cuyas cadenas son denominadas A, B y C. Los componentes simples o complejos multicomponentes que tienen actividad enzimtica se denominan con una barra sobre el componente o los componentes. Las protenas de la recientemente descrita va MBLectina son denominados con las abreviaturas de los nombres de las protenas (p. ej., MBL para lectina lijada a maosa, MASP para la proteinasa srica asociada a la MBL). Las protenas reguladoras son denominadas con un ltulo o una letra descriptiva (p. ej.. protena unida a C4, factor H). Las protenas reguladoras de unin a la membrana han sido denominadas con nmeros CD y ttulos descriptivos (p. ej., protena

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

Tabla 37-8

Protenas del c o m p l e m e n t o en el plasma h u m a n o P e s o molecular (kDa) 185 460 85 85 205 102 93 24 55 (monomoro) 200-400 93 7 C 190 110 too 150 70 105 550 88 150 84 70 20 Localizacin c r o m o s o m i c a 19p13.3-p132 1p34.1-36.3 12p13 12p13 6p21.3 6p21 3 6p2t 3 Desconocido Xpl 1 4-p 11 2 10p11 2-q21 3q27-28 1p36 3-36.2 9q33 5p13 5p13 1p32 (cadenas u y ) 9q22 3-q32 (cadena y) 5p13 11q11-q13.1 1q32 4q25 1q32 17q11 Desconocido Desconocido Concentracin (mg'ml) 1 200-1.300 150 50 50 300-600 20 200 2 25 0.002-10 1,5-13 Desconocida 80 45 90 55 60 240 250 35 300-450 500 50 -5,4

Proteina Comn a todas las vias C3 Via clsica C1q Cir C1S C4 C2 Via alternativa Factor B Factor D Properdina Va MBLecitina MBL MASP-1 MASP-2 Complejo de ataque a la membrana C5 C6 C7 C8 C9 Protenas de control C1inh C4bp Factor I Factor H Proteina S Clusterin Factor J

En presencia de un a c e p t o r adecuado, el tiol-ster interno p u e d e no sufrir la hidrlisis y degradarse, p e r op u e d er e a c c i o n a r con un nuclefilo en u n a clula diana p a r af o r m a r una unin a m i d a o ster con el s u s t r a t o diana del c o m p l e m e n t o de ataque. De e s t em o d o ,l a activacin del C3 con la c o n s i g u i e n t e degradacin del tiol-ster p u e d e originar una unin c o v a l e n t e de l a molcula de C3 a ia superficie de la clula diana. C3: molcula central de las vas de activacin As queda cubierta una diana con C3b. pudiendo interaccionar con las cludel complemento las q u ee x p r e s a nr e c e p t o r e sd e C3b. E s t a s incluyen t o d o sl o s fagocitos, l o s La protena la m a d a C3 es f u n d a m e n t a lp a r a la funcin de las tres vias de linfocitos B y una poblacin de linfocilos T, activacin del c o m p l e m e n t o (la via de la MBLectina, la via alternativa y la va El C3, c o n su c a d e n a a' unida c o v a l e n t e m e n t e a la diana y la c a d e n a \i clsica) y la comprensin del C3, su m e c a n i s m o de accin y sus funciones es unida debido a la unin disulfuro intracatenaria. se d e n o m i n a C3b (Fig. 38-2). esencial p a r ac o m p r e n d e r la activacin y la funcin de t o d a s las vias del c o m Es la f o r m a en la q u e el C3 contina la c a s c a d a del c o m p l e m e n t oc o n d u c i e n plemento. do a la lisis. Adems, de e s t a forma, la molcula p u e d ei n t e r a c c i o n a r con las El C3 es una molcula de dos cadenas sintetizada en m u c h a s clulas, pard o s glicoproteinas circulantes, l o s factores H e I. s i e n d o la s e g u n d au n a enzit i c u l a r m e n t e en los hepatocitos. f o r m a d a a partir de una molcula de c a d e n a m a proteoltica que degrada el C3 de la sangre. En la interaccin con los f a c nica, el pro-C3, y liberado a la circulacin. Las dos c a d e n a s (a y p) estn tores H e I. un pequeo fragmento, el C3f, de 3 kDa. es liberado, s i g u i e n d o estabilizadas p o rp u e n t e s disulfuro m t r a c a t e n a r i o ,yh a y un p u e n t e disulfuro d o s degradaciones adicionales de la c a d e n a a en u n ac u r v a disulfuro d e n t r o intercatenario estabilizando la interaccin de la c a d e n a a y la p (Fig. 38-2). de la c a d e n aq u ec o n e c t a las p o r c i o n e sa m i n oyc a r b o x i t e r m i n a l de la c a d e Las i n t e r a c c i o n e s hidrofbicas son tambin importantes, y la reduccin de los na a' (Fig. 38-2). Debido a las diferentes u n i o n e s disulfuro, la mayora del p u e n t e s disulfuro i n t r a c a t e n a n o no origina la separacin de las c a d e n a s en C 3 bp e r m a n e c e unido a la diana del c o m p l e m e n t o . ausencia de agentes que rompan la interaccin hidrofbica. Una vez realizada la degradacin del C3b p o r los f a c t o r e s H e I. todava En la c a d e n a a del C3. hay un tiol-ster u n i e n d o el sulfhdrilo de la c i s t e r n a ocurre otro c a m b i o conformacional. E s t a molcula, a h o r a la m a d a iC3b. interen la posicin 988 con un residuo de glutamina de 3 aminocidos. E s t e tiol-ster a c c i o n ap o b r e m e n t ec o n el CR1. el r e c e p t o r C3bC4b. p e r oi n t e r a c c i o n ac o n interno confiere una estructura inestable a la molcula de C3 El tiol-ster interla integrina p\, C R 3 (CDl1b CD18). El i C 3 b ya no p u e d ei n t e r a c c i o n a rc o n las n o est o c u l t o en el c e n t r o hidrofbico de la molcula. P u e d e ser d e g r a d a d o por protenas de la p a r t e final del c o m p l e m e n t op a r a inducir la lisis. la hidrlisis gradual a m e d i d a que el a g u ap e n e t r a en la molcula. Es degradaIgual q u ec o n el C3b. el iC3b facilita la fagocitosis u n i e n d o la d i a n a del c o m do m u c h o ms rpidamente una vez d e g r a d a d a la c a d e n a alfa del C3 con libep l e m e n t o a los fagocitos m e d i a n t el o sr e c e p t o r e s de iC3b. E s t o si n c l u y e n racin del C3a ( f r a g m e n t o de 9 kDa) en el e x t r e m oa m i n o t e r m i n a l de la c a d e t o d o s los lagocilos y los macrfagos, p e r o no i n c l u y e n los linfocilos B o l a s na a. La c a d e n ar e s t a n t e se la m a a'. El C3 nativo, p r e s e n t e en 1 , 2m g ' m l en clulas T. En p r e s e n c i a de CR1, el C3b y el iC3b p u e d e ns u f r i rp o s t e r i o r e s el p l a s m a normal, no i n t e r a c c i o n a con las clulas que e x p r e s a nr e c e p t o r e s de d e g r a d a c i o n e s por el f a c t o r I. En ese caso, una degradacin a d i c i o n a l se proC3. Sufre una gran alteracin c o n f o r m a c i o n a l con la degradacin del tiol-ster d u c e en la porcin amino-terminal de la c a d e n a (/.. Una porcin de 4 1 k D a de interno. El C3 con el tiol-ster hidrolizado interacta con las clulas que e x p r e la c a d e n aau n i d a por enlaces a m i n o o ster a la diana p e r m a n e c e detrs, y s a nr e c e p t o r e s de C3b. e s p e c i a l m e n t eC R 1 (receptor C3b C4b, CD35). es liberado el C3c. q u ec o n t i e n e las p o r c i o n e sa m i n o t e r m i n a lyc a r b o x i t e r

c o f a c t o r de m e m b r a n a .C D 4 6 ) y los receptores del c o m p l e m e n t os o n denom i n a d a s con nmeros que siguen al pretijo CR (para los r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o 1 a 4). L o s otros r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o se d e n o m i n a nc o n smbolos del c o m p l e m e n t os e g u i d o s por la letra mayscula R.

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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mnal del C3b. u n i d a s por un disulfuro entre ellas, y unida por un disulfuro a c o n v e r t a s a de la va alternativa descrita antes, d e g r a d a las molculas adiciola c a d e n a |5 (Fg. 38-2). La porcin r e s t a n t e unida c o v a l e n t e m e n t e a la diana nales del C3 c o n t i n u a n d o la c a s c a d a del c o m p l e m e n t o {vide mira). se d e n o m i n aC 3 d gyp u e d e sufrir una posterior degradacin a C3d. De nueD a t o s recientes sugieren que existe una va M B L e c i t i n a que acta via M B L vo, e x i s t e un r e c e p t o r especfico p a r a el C3d y p a r a el C 3 d g (CR2, CD21). y serin proteasas la m a d a s MASP-1 y MASP-2 ya sea p a r a la degradacin E s t er e c e p t o r est p r e s e n t e en t o d o s los I m f o c i t o s B, en a l g u n o s linfocitos T d i r e c t a del C3 por una de las e n z i m a sM A S Pop a r a la activacin de la va cly en a l g u n a s clulas epiteliales, pero no est p r e s e n t e en los fagocitos. Se s i c a para formar la C3 c o n v e r t a s a de la va clsica. En c u a l q u i e r caso, el C3a analiza c o n ms detalle posteriormente. se degrada de C3. El tiolster es degradado y la molcula entonces es c a p a z de unirse a las dianas. D e b eq u e d a r claro que el C3 sufre una hidrlisis o la El C3 en su configuracin nativa no a c t i v a la via alternativa. Sin embargo, escisin a C3b, una posterior degradacin a iC3b, y despus l ap o s t e r i o r el C3 (H 0) (tambin la m a d o iC3) y el C3b interaccionan con los factores e c e p t o r e s celulares i n t e r a c c i o n a n p r o t e i c o s D, B y properdina de la via alternativa para f o r m a ru n an u e v a enzi- degradacin a 3dg y a C3d. Los diferentes r t a p a s especficas en la va de degradacin. m a , el C3bBb. la convertasa da la va alternativa. Esta enzima es c a p a z de con el C3 en e d e g r a d a rp o s t e r i o r m e n t e el C3 separando la c a d e n a a de las molculas adiD e este m o d o ,e lC 3r e p r e s e n t al a proteina central d el a s tres vias del c o m c i o n a l e s del C3 nativo. La hidrlisis interna gradual del C3 a C3(H-,0). por lo plemento. La proteina no interaccona con ningn r e c e p t o r en su l o r m a natitanto, p u e d em e d i a r la activacin de la va alternativa a c t i v a n d o el C3 a una va. D e b es e r hidrolizada p a r a activar la va alternativa e m t e r a c c i o n a rc o n los configuracin hidrolizada de C3. u n i e n d o los factores B. D y properdina y r e c e p t o r e s de C3b. La separacin del C3a de su c a d e n aap r o d u c e el m i s m o d e g r a d a n d o molculas adicionales de C3. Esto se d e n o m i n a "seal" interna efecto. E s t op u e d e ocurrir a travs de la activacin de c u a l q u i e r a de las tres y se c r e e que es b a s t a n t ei m p o r t a n t e en la activacin inicial del C3 por la va vas del complemento. L a posterior degradacin, c o m o se describi, conlleva alternativa. a una progresiva interaccin con los r e c e p t o r e s en diferentes e t a p a s de las clulas p r e s u m i b l e m e n t em e d i a n d o la fagocitosis por un l a d o y la regulacin El a n t i c u e r p o y los c o m p o n e n t e s de la va clsica originan la produccin de de la r e s p u e s t ai n m u n ep o r el otro. una va clsica C3 convertasa en la superlicie de las dianas, que, c o m o la C3
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Figura 38-2. S e c u e n c i ad e degradacin del C3 e i n a c t i vacin del C3b. El p e s om o l e c u l a ra p r o x i m a d od ec a d a c a d e n aof r a g m e n t o se da en kilodaltons. L a se n z i m a sy c o f a c t o r e sr e s p o n s a b l e s de c a d a degradacin ( d e s i g n a d o s en l e t r a s maysculas) son: A. C3 c o n v e r t a s a : B, f a c t o rHoC R 1+f a c t o r I; C. C R 1+f a c t o r I; D, tripsina, e l a s t a s aop l a s m m a .

896 Va clsica

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

La activacin de la via clsica del complemento, descrita alrededor del ao 1 9 0 0 . fue la p r i m e r a en s e r estudiada. E s t a via es r e s p o n s a b l e de la activacin del c o m p l e m e n t o en la mayora de las clulas sensibilizadas con anticuerpos. L o s detalles de e s t a va estn publicados en otras obras (Volanakis. 1998: Fries, 1987). N u e v e protenas n u m e r a d a sc o m p o n e n la va clsica. La activacin de la via clsica n o r m a l m e n t e requiere la interaccin entre un antg e n o y un anticuerpo fijador de C1. En humanos, solo la inmunoglobulina M (Ig M ) y la Ig G son efectivas en a c t i v a r la via clsica. L a eficacia de la activacin d e la va clsica por las subclases de Ig G es la siguiente: Ig G3>lg G1>lg G2; la Ig G4 no es c a p a z de activar el c o m p l e m e n t o .I n t e r e s a n t e m e n te, un nmero d e molculas, diferentes d e las inmunoglobulinas. tiene la c a p a c i d a dd ea c t i v a r la via clsica a travs de la interaccin d i r e c t a con el C1q. E s t a s incluyen la prolena C reactiva, el c o m p o n e n t e srico del amiloide P, el fi-amiloide. a l g u n a s bacterias g r a m negativas, ciertos virus, el m i c o p l a s m a , protozoos y c o m p o n e n t e s intracelulares c o m o el ADN, las m e m b r a n a s m i t o c o n d r i a l e syl o s filamentos del ciloesqueleto (Gewurtz. 1993). Interesant e m e n t e , las clulas apoptticas se unen al C1q (Korb, 1997) y tienen la capaL ac a p a c i d a dd e las i n m u n o g l o b u l i n a sa g r e g a d a sp a r au n i re l Ciq h ap r o cidad de activar la va clsica. Esto p u e d e ser de importancia crtica en la elip o r c i o n a d o las b a s e s para un nmero de p r u e b a s diseadas p a r ad e t e c t a rl a minacin de las clulas apoptticas de la circulacin. p r e s e n c i ad ec o m p l e j o si n m u n e s solubles e n las m u e s t r a sd es a n g r ed e los pacientes. El C1q r a d i o m a r c a d o se aade a la m u e s t r a de s u e r o o de p l a s m a , N o sc e n t r a r e m o s en la activacin del c o m p l e m e n t oc o m os u c e d e en las diax i s t e n t e sp a r as e p a r a r el Ciq libre del u n i d o a los n a s sensibilizadas a anticuerpos. U n av e zu n i d a la i n m u n o g l o b u l i n a al objetivo, y se usa una de las tcnicas e c o m p o n e n t e sp r o t e i c o s del suero. El Ciq u n i d os u g i e r e la p r e s e n c i a de c o m el C1 se u n e a la i n m u n o g l o b u l i n a y se activa. La n a t u r a l e z ap r e c i s a de la interplejos de i n m u n o g l o b u l i n a s en la m u e s t r a de suero o de p l a s m a (Zubler. 1 9 7 6 ) . accin antgeno-anticuerpo-C1 n o est clara. El C1 es u n a macromolcula d e 740 kDa que c o n s t a de una molcula s i m p l e de C1q c o m p l e j a con dos c a d e n a s C 1 r y dos c a d e n a s C1S unidas t o d a s en p r e s e n c i a de iones calcio. El C1q est Va alternativa f o r m a d op o r seis subunidades, c a d au n ac o n t e n i e n d o tres c a d e n a s polipeptdicas ( d e s i g n a d a s A. B y C). Las tres c a d e n a sf o r m a n una triple hlice p a r e c i d a al La presencia de u n a segunda va de activacin del c o m p l e m e n t o fue colgeno con r e g i o n e s globulares que constituyen la porcin carboxi-terminal de propuesta p o r primera v e zp o r Piilemer (1954) pero fue a c e p t a d ap o r la la molcula. El C1q se u n e a las inmunoglobulinas a travs de sus cabezas glo- comunidad cientfica dos dcadas despus. Esta va de activacin del combulares, m i e n t r a sq u e se u n e a otros a c t i v a d o r e s de la va clsica c o m o la prop l e m e n t o parece s e r importante en la defensa precoz contra los m i c r o o r teina C reactiva y el ADN a travs de su regin p a r e c i d a al colgeno. L a sc a d e ganismos patgenos (Pangburn. 1984). Los anticuerpos pueden activar la n a s C1r y C1S se u n e n a la regin similar al colgeno del C1q. Se s a b e que el via pero n o r m a l m e n t e no s o n necesarios. El comienzo de la via alternativa p r i m e rc o m p o n e n t e de la via clsica, el Ciq. se une al d o m i n i o Cy2 de la Ig G o en la superficie de un a c e p t o rd e p e n d e de la capacidad del g r u p o carbonil al d o m i n i o Cu3 de la Ig M. U n av e zu n i d o a la i n m u n o g l o b u l i n a , el C 1 qa d o p t a del grupo tiolster e x p u e s t o del C3b d e interaccionar ya sea con un grupo un c a m b i oc o n f o r m a c i o n a l que conlleva la autoactivacin de las dos c a d e n a s a m i d a o con uno hidroxilo de la protena o del carbohidrato p r e s e n t e en la C1r. S ec r e e que e s t o origina la degradacin de las dos c a d e n a s C1r p a r ac r e a r superficie del objetivo (Law, 1979). La generacin del C3b se consigue por un s i t i oa c t i v o enzimticamente e nc a d ac a d e n a . El C1r a c t i v a d o se e s c i n d e la denominada C3 convertasa de iniciacin. En el suero, el C3 es hidrolie n t o n c e s en d o sc a d e n a s C1s. E s t e C1 "activado" es u n ap r o t e a s a y tiene a d e -zado a un ndice de 0,2% a 0,4% del depsito plasmtico por hora (Pangms, en a l g u n o ss i s t e m a sm o d e l o , actividad estearasa. El C1s aclivado d e g r a - burn, 1981). El C3 con un tiolster hidrolizado sufre un c a m b i o conformada el s i g u i e n t ec o m p o n e n t e de la c a s c a d a , el C4. El f r a g m e n t om a y o r , C4b, se cional que le permite interaccionar con las protenas que n o interaccionan une a la superficie del a c t i v a d o r ,m i e n t r a s que el f r a g m e n t o pequeo, el C4a, es con el C3 nativo y se d e n o m i n a C3(H,0) (tambin lamado iC3). El 03(^0) l i b e r a d o en la f a s e de fluido. El C 4 a es u n a anafilotoxina y se d e s c r i b e en o t r a entonces tiene la capacidad de interaccionar c o n el factor B en p r e s e n c i a seccin de este captulo. El C4b es a l t a m e n t e n t e reactivo qumicamente durande iones magnesio. El factor B. u n av e z unido al C3(H,0), p u e d e interacte u n o sm o m e n t o s despus de la degradacin del C 4yp u e d e unirse a la s u p e r - cionar c o n el factor D y es degradado p a r a generar la convertasa de inificie del a c t i v a d o r .L a unin a la superficie del a c t i v a d o r es r e l a t i v a m e n t e ineficaz. ciacin C3(H;0)Bb y liberar un pequeo fragmento, el Ba. E s t a degradaPor lo tanto, la mayora del C4b g e n e r a d o es hidrolizado y p e r m a n e c e en la fase cin e sm e d i a d ap o r el factor D, u n a proteasa srica q u ea d o p t au n a de fluido. De c u a l q u i e rm a n e r a ,a l g u n a s de las molculas de C4b g e n e r a d a s se configuracin activa una vez reconocido su sustrato y vuelve a u n a conforu n e n a la superficie del a c t i v a d o rc o m o un g r u p oa l r e d e d o r del l u g a r antgenomacin inactiva una vez que se produce la degradacin proteoltica (Volaanticuerpo-Cl. Un lugar s i m p l e antgeno-anticuerpo-C1 p u e d ee n t o n c e sc o n d u nakis, 1996). L a convertasa de iniciacin C 3 degrada el C3 para g e n e r a r cir a la sedimentacin de m u c h a s molculas de C4b. un C3b m e t a e s t a b l e a un ndice c o n s t a n t e m e n t e bajo en la circulacin. El C 3 bm e t a e s t a b l ep u e d e unirse covalentemente a la superficie del activador En p r e s e n c i a de iones magnesio, el C4b acta c o m o un lugar para la unin y entonces, c o m o el C3(H 0). unirse al factor B. Se ha propuesto q u e la yp o s t e r i o r degradacin del C2. El C1s, en asociacin con el C4b. d e g r a d a el presencia de cido silico en las glicoprotenas y glicolpidos asociados a C2 en d o sf r a g m e n t o s . El f r a g m e n t om a y o r . C2a, p e r m a n e c e unido al C4b, la m e m b r a n a previene la formacin de una C3 c o n v e r t a s a de la va alterm i e n t r a s que el pequeo, el C2b. se libera en la f a s e liquida. Esle c o m p l e j o nativa a u m e n t a n d o la afinidad del f a c t o r H (vase despus en Regulacin m o l e c u l a r( C 4 b 2 a ) es i n e s t a b l e y tiene u n av i d am e d i ar e l a t i v a m e n t ec o r t a debide la activacin del complemento) para el C3b (Kazatchkine, 1979). C o m o do a la desintegracin que resulta de la disociacin de C2a en una f o r m a inacen l a C3 convertasa de iniciacin, el factor D degrada al f a c t o rBp a r a tiva. E s t ec o m p l e j o (C4b2a) representa la c o n v e r t a s aC 3 de la va clsica r e q u e generar la C3 convertasa de unin celular C3bBb. Este c o m p l e j o se desinrida p a r a la unin y degradacin del C3. El C2a en el c o m p l e j oC 4 b 2 a es la tegra rpidamente p e r o es estable una vez unido a la properdina. que proe n z i m a que d e g r a d a el C3 en la siguiente e t a p a de la c a s c a d a de activacin y longa la vida m e d i a de la C3 convertasa de u n o a dos minutos a 18 minudel C 5e nu n ae t a p a posterior. E lC 2 ad e g r a d ae lC 3e nu nf r a g m e n t o grande, tos (Fearon, 1975). Esta C3 convertasa estabilizada rpidamente degrada el C3b, que se u n e a la s u p e r f i c i e del a c t i v a d o r , y un f r a g m e n t o pequeo, el ms C3, que p u e d e unirse a la superficie del activador y e n t o n c e s se conC3a. q u e es liberado en la f a s e de fluido y sirve c o m ou n a anafilotoxina. C o m o sidera c o m o la amplificacin de la C3 convertasa de la va alternativa. E s t a en el c a s o del C4. no t o d o el C 3 b se u n e a la superficie del a n t i g e n o objetivo. amplificacin del C3b depositado en la superficie del a c t i v a d o rp e r m i t el a E na l g u n o ss i s t e m a s modelo, a l r e d e d o r del 5 % del C 3a c t i v a d os eu n ea l objeformacin de una C5 convertasa (C3b-BbP) (Kinoshita, 1988) que tiene la tivo. Adems, en a l g u n o sm o d e l o s , un alto p o r c e n t a j e del C3 del objetivo se une
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al a n t i c u e r p o Ig G c u a n d oe s t ai n m u n o g l o b u l i n a es la iniciadora de la activacin de la va clsica del c o m p l e m e n t o (Brown. 1983). El n u e v oc o m p l e j og e n e r a d o (C4b2a3b) r e p r e s e n t a la C5 c o n v e r t a s a de la va clsica y d i s p a r a la s e d i m e n tacin de los c o m p o n e n t e s finales del c o m p l e m e n t o en la superficie diana. La IgM y la IgG difieren en su c a p a c i d a dp a r aa c t i v a r la va clsica del c o m plemento. P a r e c e que una molcula s i m p l es o b r et o d o de a n t i c u e r p o s Ig M unida por mltiples lugares del anticuerpo a un antgeno p u e d e unir una molcula de C 1 y disparar u n as e c u e n c i ac o m p l e t ad e activacin del c o m p l e m e n t o . L a Ig M. con sus c i n c o sitios de unin antignicos, a d o p t au n a conformacin "bsica" en la superficie antignica p a r a permitir mltiples interacciones con los antgenos. En contraste, la unin del C 1 a la Ig G requiere dos molculas d e Ig G una al l a d o de la otra en la mayora de los e s t u d i o se x p e r i m e n t a l e s (Borsos, 1965). Ya q u e los anticuerpos Ig G se u n e nau n a superficie d i a n a de form a aleatoria y ya que los antgenos p u e d e nn o ser distribuidos d ef o r m a unif o r m e en un o r g a n i s m o diana, p u e d e ser n e c e s a r i a la unin de c i e n t o som i l e s de I g Gs para generar un lugar de unin para el C1. La activacin de la va clsica por el c o m p l e j o Ig G-antgeno tambin p a r e c e facilitar la va a l t e r n a t i v a (vase siguiente seccin) sobre la superficie del activador (Moore, 1981).

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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embrago, es necesaria la insercin de mltiples copias de C9 a travs de la bicapa lipdica a travs de la interaccin inicial con la c a d e n a a del C8 p a r a producir la c o m p l e t a actividad citoltica del M A C (Plumb. 1998). Se c r e e que el c o m p l e j o C5b-8 sirve c o m o un iniciador para la polimerizacin del C9 en Va de la lectina fijada a maosa la m e m b r a n a celular. El MAC, p o r microscopa electrnica, m u e s t r au n a estructura p a r e c i d a a un cilindro h u e c of o r m a d ap o r el e n s a m b l a j e de sus R e c i e n t e m e n t e se h a descrito una tercera via de activacin del c o m p l e c o m p o n e n t e se n presencia d eu ne x c e s od eC 9 (Podack. 1984). E lm e c a m e n t o que utiliza una proteina srica, presente en alrededor d e1 . 5 ug mi. n i s m o por el que el M A Cr o m p e la m e m b r a n a celular todava es c o n t r o v e r la M B L (tambin lamada lectina unida a maosa o protena fijadora d e tido y p u e d e incluir la distorsin d e la bicapa lipdica p a r af o r m a rp a r c h e s maosa). L aM B L est presente en t o d o s los mamferos y pjaros, y peragujereados" (Esser, 1991) o, ms probablemente, la lormaan de un p o r o t e n e c e a la familia d e molculas lamadas c o l e c t m a s (Turner, 1996: Epst r a n s m e m b r a n a con un c e n t r o hidroflico a travs del que los i o n e sp u e d e n tein, 1996). La familia de las colectinas incluye, adems de la MBL, las prop a s a r libremente (Bhakdi. 1991). L a formacin del M A Ci n d u c e la lisis d e tenas del surfactante p u l m o n a r A y D (SP-A, SP-D), la conglutinina bovina ciertas bacterias y virus, y d e eritrocitos heterlogos. L a mayora d el a s y la CL-43 bovina (Epstein. 1996). La M B L est estructuralmente relacioclulas n u c l e a d a s resisten la citotoxicidad inducida p o r el MAC. E s t a pron a d ac o n el C1q. Su estructura primaria es u n ac a d e n a polipeptidica forteccin, e s p e c i a l m e n t e del a t a q u e del c o m p l e m e n t op o r las protenas del m a d a por un ncleo colgeno y un dominio globular carboxi-termmal (Hanc o m p l e m e n t o propias, es m e d i a d ap o r las molculas reguladores a s o c i a d a s sen, 1998). T r e s de las c a d e n a s se asocian p a r a formar la subunidad de la a la m e m b r a n a que previenen la formacin del M A C (vase despus Regumolcula. En el suero, la M B Ls ee n c u e n t r ac o m o una m e z c l ad e dmeros lacin de la activacin del complemento) asi c o m o por la liberacin de proy hexmeros de su subunidad primaria. L aM B Lr e c o n o c e ciertos carbohitenas del c o m p l e m e n t o activadas p o r la s a n g r ed e la superficie celular. L a d r a t o se x p r e s a d o s en la superficie de los m i c r o o r g a n i s m o s (es decir, no lisis d e las clulas n u c l e a d a sm e d i a d ap o r el M A Cp u e d e ocurrir p e r o r e c o n o c e carbohidratos c o m o la galactosa y el cido silico que son los requiere mltiples lesiones por el M A C para producirse (Koski, 1983). Se na azcares terminales expresados en las glicoproteinas de los mamferos) propuesto que la prdida d e cantidades subliticas d eM A Cp u e d ep r o t e g e r (Epstein. 1996). En orden de importancia, los ligandos de la M B L son: a la clula del consiguiente a t a q u e del c o m p l e m e n t o (Reiter, 1992). L a s maosa, W-acetil-glucosalina, -fucosa, rv-acetil-manosamina y glucosa clulas nucleadas estn protegidas en parte de los efectos del M A C debido (Hansen, 1998). E s t op e r m i t e a la M B L discriminar entre lo propio y lo a la eliminacin a c t i v a de la superficie celular a travs de la reparacin de extrao. Se inform que la M B L reaccionaba con un amplio n u m e r o de bacla m e m b r a n au n i d a al r e c a m b i o lipidico (Mold, 1998). La formacin del M A C terias no c a p s u l a d a sG r a m positivas y G r a m negativas, con virus, levadu- tiene un efecto estimulante s o b r em u c h o s tipos de clulas nucleadas. E n t r e ras, micobactenas. parsitos y protozoos (Epstein, 1996). U n a vez reconootros, estos efectos incluyen la produccin de radicales reactivos del oxgec i d os u carbohidrato ligando, l aM B La d o p t au nc a m b i o conformacional q u e no por los neutrfilos y los macrfagos, la liberacin de ecosanoides por las c o n le v a la activacin d ed o s proteasas sricas asociadas a la MBL, la clulas tagociticas. la induccin de actividad p r o c o a g u l a n t ep o r las plaqueM A S P 1 y la MASP-2 (Thiel, 1997). T a n t o la MASP-1 c o m o la MASP-2 t a s y las clulas endoteliales. la actividad proinflamatoria e n las clulas m u e s t r a n homologa estructural con el C1 r y el Cis, sugiriendo similitudes endoteliales y las clulas del msculo liso, la proliferacin d e clulas del c o n el complejo C1 (C1qrs). U n a vez activada, la MASP-2 degrada el C4 msculo liso y de clulas endoteliales. y la iniciacin de las vias d e transpara generar la C3 convertasa C 4 b 2 a (Vorup-Jensen. 1998). La MASP-1 duccin de seales (Mold. 1998; Sims. 1995: Tudesco. 1997: Benzaquen. tiene la c a p a c i d a d de degradar el C3 (Matsushita. 1998). sugiriendo q u e 1994; Kilgore, 1996; Niculescu. 1999, 1993). e s t op u e d ed e s e n c a d e n a r directamente la activacin de la va alternativa (Schweinle, 1989). Despus de la generacin de la C3 convertasa de la va clsica, l a C4b2a, p o r el complejo MBL-MARSP-1-MASP-2, la activacin Anafilotoxinas del c o m p l e m e n t os ep r o d u c ec o m o en la va clsica con el posible reclutam i e n t o de la va alternativa tambin (Suankratay. 1998). La via de la MBLeL a activacin de la va clsica, alternativa o d e la M B L e c t i n a del c o m p l e citina tambin puede dispararse p o r un complejo antgeno-anticuerpo Se m e n t o origina la generacin de los f r a g m e n t o sp r o t e i c o s de! c o m p l e m e n t o demostr que una fraccin de las molculas de Ig G que c a r e c e n de resique tienen i m p o r t a n t e sp a p e l e s en diferentes f u n c i o n e s biolgicas c o m o la d u o s galactosa terminal (llamados Ig G-GO), tal y c o m o se encuentran en opsonizacin. la fagocitosis, l a inmunomodulacin y l a generacin d er e a c el p l a s m a de pacientes con condiciones patolgicas c o m o la artritis reuc i o n e s inflamatorias. L a opsonizacin, la fagocitosis y la inmunomodulacin m a t o i d e . tienen la c a p a c i d a d de interaccionar c o n la M B L y activar la va d e p e n d e ne ns um a y o rp a n ed e los r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t oe x p r e s a d o s clsica (Malhotra, 1995). La M B Lp u e d e jugar un papel en la eliminacin d e en las diferentes clulas del cuerpo, y se discuten en u n a seccin posterior. o r g a n i s m o s diana por los fagocitos a travs de la interaccin con un recepC o m os e discuti previamente, la activacin del c o m p l e m e n t o origina u n a tor especfico p r e s e n t e en estas clulas (Hansen. 1998: T e n n e r . 1995). L a degradacin proteolitica de m u c h a s protenas del c o m p l e m e n t oc o n la consiregulacin d e la va de la M B L e c i t i n ap a r e c es e rm e d i a d a por el Cl inhibiguiente liberacin en la f a s ed e fluido d e pequeos f r a g m e n t o s que t i e n e n d o r (Matsushita. 1 9 9 6 )yp o r la cx-macroglobulina (Terai. 1995). efectos biolgicos. T r e s de e s t o sf r a g m e n t o s liberados s e la m a n anafilotoxinas. S o n el C4a. el C 3 a y el C5a. L a s caraclerislicas e s t r u c t u r a l e syf u n c i o nales de estas molculas se describen en un m l o r m ee x c e l e n t es o b r e el t e m a (Ember. 1998). El C4a e s un pptido d e 8.7 k D a liberado del C 4 una v e z Componentes finales del complemento d e g r a d a d op o r el Cls . El C 3 a es un f r a g m e n t o peplidico de 9 k D al i b e r a d o d u r a n t e la degradacin proteolitica selectiva de la c a d e n a C3r/ p o r el C 2 a en Las tres vas principales d e activacin del c o m p l e m e n t o convergen en la la va de activacin de la C 3 convertasa clsica y MBLectina. Tambin es libeactivacin del C3 y en el e n s a m b l a j e del c o m p l e j o de a t a q u e a la m e m b r a a d op o r la degradacin proteolitica del C3 p o r el pptido enzimticamente na (MAC), q u e est f o r m a d op o r los c o m p o n e n t e s C5 a C9, U n a vez forma- r activo, Bb, en la via de la C3 c o n v e r t a s a alternativa. El C5a es un pptido d e das las c o n v e r t a s a sd e la via clsica, de la M B L e c i t i n a (C4b2a3b) y de l a 1 1k D a liberado de la c a d e n a a del C5 p o r la degradacin i n d u c i d ap o r el C 2 a alternativa (C3b2Bb). el C5 es degradado. El f r a g m e n t og r a n d e (C5b) pueo n v e r t a s a clsica o M B L e c t i n aop o r el B b (y quizs en la de a s o c i a r s ec o n la m e m b r a n a celular e interaccionar c o n el C6. La siguien- en la va de la C5 c M B L e c t i n a ) en la va de la C5 c o n v e r t a s a alternativa. En general, l a s anafilote e t a p a incluye la interaccin del c o m p l e j o C5b-6 con un fluido fase C7 forloxinas se definen p o r sus e f e c t o s biolgicos s o b r e las clulas del msculo m a n d o un c o m p l e j o trimnco con propiedades anfiflicas (alta afinidad p o r liso, los maslocitos, los pequeos v a s o s sanguneos y los l e u c o c i t o s de s a n los constituyentes lipideos de la m e m b r a n a celular) (Podack, 1979). El C5bgre perifrica. Los e f e c t o s especficos m e d i a d o sp o re s t o s pptidos i n c l u y e n 7s e inserta en la b i c a p a lipdica de la m e m b r a n a celular pero no e s sufie los m a s t o c i t o s y los basfilos c o n la c o n s i g u i e n t e liberac i e n t ep a r aq u eo c u r r a la lisis celular. El C8 se a s o c i ac o ne s t ec o m p l e j o tri- la degranulacin d cin de diferentes m e d i a d o r e sc o m ol ah i s t a m i n a o la s e r o t o m n a . Adems, m o l e c u l a r a travs de la interaccin con el C5b expuesto. El complejo C5b-8 inducen la agregacin neulroflica h u m a n a , la contraccin del msculo liso, el p e n e t r a a travs de la b i c a p a lipdica p a r af o r m a r un pequeo poro transu m e n t o de la permeabilidad vascular, la induccin d e la liberacin d et r o m m e m b r a n ayp u e d e originar la lenta lisis de los eritrocitos (Ramm, 1982). Sin a
L 2 ? :

c a p a c i d a d de disparar la activacin de los c o m p o n e n t e s terminales del sist e m a del c o m p l e m e n t o .

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

b o x a n o de l o s macrlagos d e l conejilo de Indias, y la estimulacin de la Reguladores del fluido sanguneo secreccin de m o c op o rl a s clulas c a l i c i f o r m e s (Marn, 1985). Un e f e c t o i m p o r t a n t e de las anafilotoxinas sobre los basfilos es originar vasodilatacin El control del p r i m e rc o m p o n e n t e de la via clsica, el C1. est m e d i a d o a travs de la liberacin de histamina, c o n d u c i e n d o a un a u m e n t o del flujo sanpor el C1 inhibidor (C1inh). El Clinh es una protena a l t a m e n t e glicosilada guneo en el l u g a r de la inflamacin. La funcin del C4a g e n e r a l m e n t e es simid e1 0 5k D aq u e tiene l ac a p a c i d a dd e disociar e lC 1a c t i v a d o (Davis. 1989). lar a la del C3a. S i ne m b a r g o , el C 4 a es m u c h om e n o s efectivo en s u se f e c t o s El Clinh inhibe la autoactivacin del C1. la activacin del C1 en el fluido sanbiolgicos s o b r e una b a s em o l e c u l a r . El C5a es sin d u d a la ms p o t e n t e de las guneo, y la activacin del C1 en la s u p e r f i c i e de los a c t i v a d o r e s de la va clanafilotoxinas h u m a n a s .P o r ejemplo, e le f e c t o del C 5 ae s2 0 0v e c e sm a y o r s i c ap e r on oe nl am a y o r i ad e los c o m p l e j o si n m u n e s (Doekes. 1983). E l Clinh q u e el del C 3 ay3 . 0 0 0v e c e sm a y o rq u e el del C 4 a originando la contraccin es un inhibidor sern p r o t e a s a (serpin) que d i s o c i a el c o m p l e j o C1 a c t i v a d o del msculo liso del leon del conejilo de I n d i a sD e b e observarse, sin e m b a r unindose a las subunidades de C 1 ryC 1 s del complejo. M i e n t r a s el C 1 qp e r go, que la relativa efectividad de e s t o s pptidos es t a n t o especfica de tejido m a n e c e en la superficie del activador, el C 1 r y el C 1 ss o nl i b e r a d o s al fluido c o m od e especie. S eh as u g e r i d oq u ee lC 3 ae s efectivo s e l e c t i v a m e n t es o b r es a n g u i n e oe nf o r m ad ed o sc o m p l e j o sd e Ciinh-Clr-Cls-Clmh (Ziccardi. los eosinfilos localizados en los l u g a r e s alrgicos, m i e n t r a s que el C5a tiene 1979). R e c i e n t e m e n t e ,s ep r o p u s oq u ee l Clinh tiene l ac a p a c i d a dd es e p a r a r e f e c t o en m u c h o s otros tipos celulares (DiScipio. 1999). el c o m p l e j o Clqr s e n t e r o de l a si n m u n o g l o b u l i n a sq u et i e n e nu n ab a j a afinid a dp o r el Clq (Chen, 1 9 9 8 b ) o de objetivos sensibilizados c o n dosis b a j a s de Adems de e s t e papel c o m o anafilotoxina. el C5a tiene otras m u c h a s proIg G h u m a n a (Chen. 1998b). In vitro, el Clinh i n a c t i v a la m a n o s a fijadora de p i e d a d e s biolgicas importantes. L a unin del C5a a los neutrlilos origina un lectina a s o c i a d a a sern proteasas (MASP) (Matsushita. 1996). El Clinh t a m a u m e n t o de la adhesin, la agregacin y la induccin de una r e s p u e s t a oxibin inhibe al f a c t o r Xlla y a la calicrena del s i s t e m a de c o n t a c t o .E s t et e m a dativa, y la liberacin de enzimas lisosmicas. Adems, el C5a es fuertemenser tratado en la seccin C i n m a s y el s i s t e m a de generacin de C i n m a s . Intete quimiotctico p a r a los m o n o c i t o s y los neutrfilos. i n d u c i e n d o la migracin r e s a n t e m e n t e , el Clinh demostr interferir con la proliferacin in vitro de los linde las clulas h a c i a la f u e n t e de activacin del c o m p l e m e n t o . De e s t e modo, f o c i t o s T y con el desarrollo de linfocitos T citotxicos b l o q u e a n d o la d e g r a d a una reaccin inflamatoria de activacin del c o m p l e m e n t o local p u e d e por tancin de la (5-microlobulina a desLys" p\-microlobulina p o rl o sl i n f o c i t o sT to i n d u c i r un a u m e n t o del flujo sanguneo al tejido, la a d h e r e n c i a de los neua c t i v a d o s y por el C1r (Nissen. 1998). Sin e m b a r g o , la r e l e v a n c i a in vivo de trfilos al endotelio local, y la migracin directa de los f a g o c i t o s a los lugares estos hallazgos no est an clara. Se h ai n f o r m a d o una proteina de 20 kDa inflamatorios. Los neutrfilos agregados por el C5a pueden embolizar al pulcon actividad inhibitoria sobre la funcin C1. la m a d af a c t o r J (Lopez-Trascasa. mn, originando c a m b i o s en el intercambio g a s e o s op u l m o n a r e incluso la 1989). Se inform que inhiba la formacin del c o m p l e j o C1 (Lopez-Trascasa. m u e r t e . Se c r e e que m u c h a de la inflamacin de los p u l m o n e sc a u s a d a por 1989) y despus a c t u a b a sobre la va alternativa inhibiendo la degradacin del la formacin del c o m p l e j oi n m u n e est m e d i a d a por el C5a (Ward, 1997). En a c t o r B (Gonzlez- Rubio. 1994) L a defensina, pptido-1 neulrofliu nm o d e l oe x p e r i m e n t a ld e sepsis e n ratas, s eh ad e m o s t r a d or e c i e n t e m e n t e C3 por el f co h u m a n o (HNP-1 ). tambin p u e d e inhibir al C1 en los lugares de inflamacin. que el C5a p u e d eb l o q u e a r las funciones b a c t e r i c i d a s de los neulrfilos si se Se demostr que se una al C1q en el fluido sanguneo y b l o q u e a b a la a c t i v a p r o d u c e en c a n t i d a d e s suficientes, sugiriendo un papel p a r a la activacin del cin del c o m p l e m e n t o mediada por la via clsica (van d e n Berg. 1998). c o m p l e m e n t o en los a l t o s ndices de m o r t a l i d a do b s e r v a d o s en l a sepsis (Czermak. 1999). La a c t i v i d a d del C 4 b es r e g u l a d ap o r el f a c t o rI( a n t e sd e n o m i n a d oi n a c t i v a Los e f e c t o s biolgicos de las anafilotoxinas estn m e d i a d o s por los r e c e p d o r del C3b'4b) (Fries. 1987). El f a c t o rId e g r a d a la c a d e n a a del C 4 bp a r a tores especficos e x p r e s a d o s por los dilerentes tipos celulares. E s t o sr e c e p g e n e r a rd o s Iragmentos. el C 4 c y el C4d; el ltimo f r a g m e n t op e r m a n e c eu n i d o tores se d e s c r i b e n en la seccin de los r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o . a la clula. P a r a la protehsis se n e c e s i t a un cofactor. la protena fijadora de C4 (C4BP). El C 4 B P es una proteina de 570 kDa que tambin p u e d e unirse al C4b unido a partculas y sanguneo, y desplazar al C2a de la via clsica de la C3 Regulacin de la activacin del complemento c o n v e r t a s a C4bza (Gilgli, 1979). Adems, el C 4 B Pc i r c u l a en asociacin con a p r o x i m a d a m e n t ee l6 0 %d el ap r o t e i n aS ,u nc o f a c t o rd e p e n d i e n t ed el a vitaLos graves e f e c t o s de la activacin del c o m p l e m e n t op a r a inducir el dao i n aKp a r a la proteina C m e d i a n d o la degradacin de los f a c t o r e s de la c o a tisular requieren mecanismos de control internos para: (1) limitar la inflama- m gulacin Va y Villa. E s t a asociacin inhibe la actividad del c o f a c t o r de la proteicin diseminada cercana, (2) evitar una excesiva activacin, y (3) proteger las na S (Dahlbck, 1986) y p a r e c e inhibir la activacin del f a c t o r X a travs de las clulas husped de la lesin inadvertida. Se ha implicado un potente sistema i n t e r a c c i o n e s del C 4 B Pt a n t o con la protena S c o m o con el f a c t o r VIII ( K o p p e l de regulacin p a r ac o n t r o l a r la activacin del c o m p l e m e n t o en cualquier etaman. 1995). U n a protena de 120 kDa con s i m i l i t u d e se s t r u c t u r a l e s con el C2 pa de la c a s c a d a de la activacin. Asi existen protenas sanguneas o asop e r of u n c i o n a l m e n t e distinta del C2 f u e aislada, y p u e d et e n e ra c t i v i d a dr e g u l a c i a d a sam e m b r a n a que desarrollan una accin reguladora en la activacin d o r as o b r e el s i s t e m a del c o m p l e m e n t o unindose al C4b ( H a m m e r , 1989). del c o m p l e m e n t o( T a b l a 38-2).
?

Tabla 38-2 Protenas reguladoras del complemento Protenas Fases del fluido Cl inhibidor Factor H Protena fijada a C4 Protena S (vilronectina) Clusterin Factor J Clula asociada CR1 DAF (CD55) MCP (CD46) CD59 (protectina) HRF
Isoterma ms frecuente del CRI CRU receplor del complemento tipo 1. DAF= factor acelerador de la degradacin, MCP= proteina cofactor de membrana. HRF= tactor de restriccin homologo

Peso molecular (kDa) 105 150 550 84 70 20

Objetivo C1 C3b C4 C5b-7 C5b-7 C1. C3. B

Mecanismo de accin Disocia el complejo C1 unindose al C1r y C1s Colador para la inactivacin del C3b por el (actor I Cofactor para la inactivacin del C4b por el factor I Inhibe la insercin del MAC en las membranas celulares Inhibe la insercin del MAC en las membranas celulares Inhibe la formacin del complejo C1 inhibe la degradacin de C3 por el Bb Disociacin de las C3/C5 convertasas cofactor par la inactivacin del C3b y el C4b por el factor I Disociacin de las convertasas C3/C5 Cofactor para la inactivacin del C3b por el factor I Inhibicin de la formacin del MAC Inhibicin de la formacin del MAC

190" 70 45-70 18-20 65

C3b. C4b C3bBb. C4b?a C3b (C4b) C8, C9 C8, C9

CAPITULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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Debido a su papel crucial en las tres vas de activacin del complemento, el C3 est bajo un control rgido. El C3b sanguneo y el C3(H 0) son rpidamente inactivados por el factor I que degrada los tres pptidos unidos de la cadena a' del C3b (Davis. 1982]. generando entonces una lorma inactiva de la molcula, la iC3b. que es incapaz de atraer al C5 o al factor B. Esta degradacin mediada por el factor I requiere al tactor H como cofactor. El factor H es una protena de 150 kDa que se une al C3b y tienen actividad aceleradora de la desintegracin a travs de la va alternativa de la C3 convertasa adems de su actividad de cofactor para la degradacin del C3b mediada por el factor I. Adems de regular al C3b en el fluido sanguineo, el factor H se une al C3b unido a la clula y dispara la degradacin por el factor I. limitando asi la activacin por la va clsica (Ollert. 1995). Una vez que el C3b es degradado en iC3b. que permanece unido a la superficie del objetivo, puede nteraccionar con el receptor del complemento tipo 3 (CR3) presente en las clulas fagocticas y promover la fagocitosis (vase despus en Receptores del complemento).
?

tambin tiene la capacidad de servir como colador para la degradacin mediada por el factor I de iC3b en fragmentos pequeos (Mitomo. 1987). El control del C4b y C3b depositado en la membrana celular se lleva acabo posteriormente por la proteina cofadora de membrana MCP, CD46). Esta protena es expresada en casi todas las clulas, con la importante excepcin de los eritrocitos. Sirve como cofactor para la degradacin del C4b y el C3b en C4c y C4d. e iC3b. respedivamente. mediada por el factor I (Seya. 1986. 1989) pero es incapaz de promover la posterior degradacin del iC3b Se inform que el MCP protege a la clula de la activacin de la va alternativa ms eficazmente que de la activacin de la va clsica (Kojima, 1993). Se ha sugerido que esta protena de 50 a 58 kDa juega un papel significativo en prevenir el dao celular mediado por el complemento en aquellas clulas en las que se expresa (Liszweski, 1992). A diferencia del DAF. no protege a las clulas vecinas (vieintra). Otra proteina asociada a la membrana celular que controla la activacin del complemento a nivel de las C3 y C5 convertasas es el tactor acelerador de la eliminacin (DAF. CD55). El DAF es expresado por todas las clulas de la circulacin, las clulas endoteliales y un nmero de clulas epiteliales iMorgan. 1994b). Esta protena de 70 kDa lunciona. como su nombre implica, acelerando la eliminacin de las C3 y C5 convertasas tanto de la via clsica como de la alternativa. Interesantemente, tiene una mejor capacidad de afectar a la C3 convertasa de la va clsica que a su contrapartida de la va alternativa (Nicholson-Weller. 1982). El DAF media la disociacin del C2a y el Bb de las C3 convertasas (Fujita. 1987). a diferencia del factor H y CR1. que tienen la capacidad de bloquear la unin de C2 a C4b o del factor B a C3b. El DAF est unido a la membrana celular por un enlace glicosil fosfatidilinositol ms que por un dominio hidrofbico transmembrana, que ofrece a la molcula una gran mobilidad y presumiblemente una mejor eficacia como inhibidor del complemento (Davitz. 1987). Notablemente, el DAF no tiene actividad cofadora para la degradacin del C3b y C4b mediada por el fador I. El control de los componentes finales del complemento en la superficie celular se lleva a cabo por dos protenas unidas al glicosil fosfatidilinositol. llamadas factores de restriccin homlogos (HRF) o proteina fijadora de C8 y CD59 (tambin llamado proleclina. HRF-20. inhibidor de membrana de la lisis reactiva y P-18). El HRF es una proteina de 65 kDa expresada en los eritro citos. las plaquetas, los linfocitos T, los linfocitos B. los neulrfilos y los monocitos (Morgan. 1994b). El HRF funciona unindose al C8. inhibiendo la polimerizacin del C9 (Morgan, 1994b). Otra protena que inhibe el complejo de ataque a la membrana es el CD59, El CD59 es una protena de 20 kDa que se encuentra en una amplia variedad de clulas incluyendo todas las clulas circulantes, las clulas endoteliales, las clulas epiteliales, los espermatozoides, los podocitos glomerulares. numerosas lneas celulares (Morgan. 1994b) e incluso las clulas del cerebro (Morgan. 1996). Se demostr que se una tanto a la cadena |i del C8 como al domino b de la del C9 (Chang. 1994). Inhibe la formacin del MAC sobre las clulas husped y acta de un modo intrnseco, esto es, proteger a la clula sobre la que se expresa. El DAF, HRF y CD59 estn ausentes en las clulas de los pacientes con hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN). debido a la unin de su glicosil fosfatidilinositol a la membrana celular (Volanakis. 1998).

Hay un nmero de inhibidores sanguneos de los componentes terminales del complemento que previenen la insercin del complejo de ataque a la membrana en las membranas celulares. La protena S [S-protein). tambin llamada vitronectina, se une al complejo C5b-7. previniendo as su insercin en la membrana celular (Podack. 1977) e inhibiendo la polimerizacin del C9 (Johnson, 1994). Recientemente, se ha publicado que la protena S se une al C5b y al C8 en el complejo C5b-9 (Su, 1996) y se une al receptor de la cabeza globular del Clq (Ljm, 1996). Aunque el papel exacto de la proteina S en la regulacin de la activacin del complemento in vivo es incierta. Peake y col. mostraron que la proteina S forma un complejo con el sC5b-9 cuando el complemento es activado en conejos y que este complejo todava tiene la capacidad de bloquear la lisis mediada por el C9 de los eritrocitos de oveja sensibilizados llevando los componentes 1 al 7 del complemento (Peake. 1996). Clusterin (tambin llamado Sp-40.40 o apolipoprotena J) es otro inhibidor sanguineo de los componentes finales del complemento. Como la vitronectina. clusterin previene la insercin del complejo C5b-7 en la membrana celular (Choi, 1989) y regula el complejo de ataque a la membrana en los niveles C5b-7 y C9 (Berge. 1997). Todava se desconoce el papel in vivo del clusterin. aunque recientemente se public que el clusterin se deposita en las lesiones cerebrales de los pacientes con enfermedad de Alzheimer iVerbeek. 1998). Tambin, se ha publicado recientemente una asociacin significativa entre los niveles bajos de clusterin y algunos signos clnicos del lupus eritematoso sistmico (LES), sugiriendo un control insuficiente de la inflamacin mediada por anticuerpos (Newkirk, 1999).

Protenas reguladoras asociadas a las clulas

Adems de estar regulado en la lase liquida, la activacin del complemento tambin est regulada en la superficie de muchos tipos celulares para limitar la lesin inadvetida a las clulas husped. Algunas de estas protenas no solo se unen a las protenas del complemento sino que actan como receptores. Una de estas protenas es el receptor del complemento tipo 1 (CR1). La estructura del CR1 se describe con ms detalle en la seccin Receptores del complemento. La funcin del CR1 es unirse al C4b y C3b activado y servir como cofactor para la degradacin mediada por el (actor I de estos componentes en sus productos de degradacin inactivos. Adems de servir como colador para la degradacin mediada por el factor I del C3b en iC3b. el CR1 tambin promueve la degradacin posterior del iC3b por el factor I en C3dg. El C3dg puede ser degradado posteriormente en C3d por varias enzimas como la elastasa, la tripsina y la plasmina (Davis, 1984; Ross, 1982). El CR1 tambin tiene una actividad aceleradora de la desintegracin hacia las convertasas C3 y C5 de la va alternativa y la clsica de la activacin del complemento. Al unirse a C4b o C3b. el CR1 tambin desplaza al C2a (va clsica) o al Bb (va alternativa), acelerando entonces la eliminacin de las C3 convertasas. Interesantemente, el CR1 promueve la eliminacin acelerada de la C3 convertasa unida a la superficie de la va alternativa mucho ms eficientemente que de la va clsica (Ross. 1982; Nicholson-Weller, 1982). Debido a que se expresa en los eritrocitos, ms que sobre otros tipos celulares, el CR1 ayuda al trasporte de los complejos inmunes que llevan el C3b a los lugares de degradacin de las clulas de Kupffer del hgado (Cornacoff, 1988). Parece que otro receptor del complemento, el CR2,

Receptores del complemento

Los receptores que se unen a los componentes adivados del complemento han sido descritos en vanos tipos celulares Estos receptores controlan los efectos biolgicos de los pptidos de activacin del complemento y estn unidos a muchas otras funciones celulares (Tabla 38-3). Esto ser descrito para cada receptor del complemento. Los receptores del complemento que han sido mejor estudiados son aquellos que se unen a los fragmentos de degradacin del C3. El receptor del complemento tipo 1 (CR1. CD35, receptor de C3b'C4b) es una glicoprotena de cadena simple de 190 kDa (isoforma ms frecuente). En humanos, se expresa en eritrocitos, fagocitos mononucleares. eosinfilos. linfocitos B, un subgrupo de linfocitos T, podocitos glomerulares, clulas dendrticas foliculares (Ahearn. 1998) y astrocitos (Morgan, 1996). Este receptor del complemento se une tanto al C3b como al C4b. y. en menor medida, al iC3b. Se inform recientemente que el CR1 se una tambin al Clq (Klickstein. 1997). Existen cuatro formas allicas diferentes del CRl que difieren en tama-

900 Tabla 38-3 Receptor CR1 CR2 CR3 CR4 C1qRp' C3aR C5aR

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Receptores celulares para los f r a g m e n t o s proteicos d e l c o m p l e m e n t o Peso molecular (kDa) 190 (isoforma ms frecuente) 140 165 (cadena u) 95 (cadena (5) 150 (cadena a) 95 (cadena |5) 126 48 43 Ligando C3b, C4b. iC3b C3d. C3dg, iC3b iC3b C3d. C3b iC3b. C3b C1q. MBL. SP-A C3a C5a C5a desArg Papel fisiolgico Fagocitosis, aclaramiento del complejo inmune Activacin de las clulas B Fagocitosis, adhesin celular Adhesin celular Fagocitosis Quimiotaxis, degranulacin de los mastocitos del suero, aumento de la permeabilidad vascular Quimiotaxis. degranulacin de los mastocitos del suero. aumento de la permeabilidad vascular

' Tambin han sido descritos otros receptores del Ctq. CR1 = receptor del complemento tipo 1; CR2 = receptor del complemento tipo 2, CR3 = receptor del complemento tipo3 CR4 = receptor del complemento Upo 4; C1qRp = receptor para la regin del colgeno del Ctq; C3aR = receptor de C3a; C5aR = receptor de C5a; MBL = maosa fijadora de lectma: SP-A = proteina surfactante A; C5a desArg = prdida del residuo argiruna terminal del C5a tras la inactivacin por la carboxipeptidasa-N.

o y nmero de lugares de unin. La forma allica ms frecuente (llamada alotipo A o F) est formada por 30 unidades repetidas de 60 a 70 aminocidos, la mayora de las cuales estn altamente conservadas. Estas unidades repetidas son llamadas repeticiones consensuadas cortas (SCR). De estos 30 SCR, 28 estn agrupados en cuatro parejas de repeticin de siete SCR cada uno. Esas parejas repetidas se denominan repeticiones homologas largas (LHR). Como se seal en la seccin Regulacin de la activacin del complemento, el CR1 sirve como cofactor para la degradacin del C3b mediada por el factor I, el iC3b y el C4b y tiene actividad aceleradora de la eliminacin tanto sobre la via de la C3 y C5 convertasa clsica y alternativa. Un papel fisiolgico ms importante del CR1 est relacionado con la fagocitosis de las partculas envueltas por el complemento (partculas opsonizadas). El CR1 puede aumentar la unin de las partculas envueltas con Ig G y C3b o iC3b a los monocitos o los neutrfilos, aumentando entonces la eficacia de la fagocitosis mediada por el receptor Ig G-Fc (Wright. 1985; Sengelov. 1995). El CR1 tambin puede disparar la fagocitosis de los objetivos envueltos por el C3b en ausencia de IgG en los macrlagos activados por varios estimuladores como la libronectma. el acetato forfol mirislato. el interfern-y y la anafilotoxina C5a. El CR1 sobre los eritrocitos regula la funcin C3b sirviendo como cofactor para la degradacin del C3b mediada por el factor I y aumentando la eliminacin de C3 convertasas. Se cree que el CR1 eritrocitario tiene un papel importante en secuestrar el C3b y el complejo inmune relacionado con iC3b. sacndolos del plasma y facilitando su transferencia a los lugares de degradacin en el higado y en el bazo (Birmingham. 1995). Recientemente se propuso que la captacin dependiente del CR1 de los complejos inmunes por los eritrocitos de la circulacin puede servir como mecanismo de inhibicin de la activacin excesiva de las clulas fagocticas o las clulas B (Nielsen, 1997). El CR1 tambin es expresado en las clulas B humanas y en las clulas dendrticas foliculares del bazo y puede tener un efecto inmunorregulador en estas clulas. Este tema se analiza con ms detalle despus, en la seccin Complemento e inmunidad adquirida. Un receptor para el fragmento C3d del C3 se encuentra en las clulas humanas |i las lineas celulares B, las clulas dendriticas foliculares, algunas clulas T perifricas, algunas lineas celulares T, timocitos (Ahearn. 1998) y astrocitos (Morgan, 1996), y es denominado CR2 (CD21). El CR2 es una glicoproteina transmembrana tipo I, de 1 4 0 kDa, que sirve como receptor para el C3d. el C3dg, y se une dbilmente al iC3b. El CR2 tiene la capacidad de servir como cofactor para la degradacin de iC3b unido a los objetivos mediada por el factor I (Mitomo. 1987). El CR2 tambin es el receptor o sitio de unin a travs del cual el virus de Epstein-Barr entra en las clulas B, en la sangre, modalidad independiente del complemento, para causar la mononucleosis infecciosa (Fingeroth. 1984). Se cree que la principal funcin del CR2 es la regulacin de la respuesta inmune de las clulas B ante el antigeno (Carroll, 1998b). Este tema se discute con ms detalle despus, en la seccin Complemento e inmunidad adquirida. Un tercer receptor del complemento, el CR3 (tambin denominado Mac-1, Cd11b'CDi8) es un miembro de la familia de molculas de sdhesin de la |3
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integnna leucoctica. Est formada por dos cadenas polipeptidicas con pesos moleculares de 165 kDa (cadena a) y de 95 kDa (cadena |i) (Ahearn, 1998). Otros dos miembros de la familia de molculas de adhesin de la |i, integrina (LFA-1 y CR4) comparten la misma cadena p* con el CR3. El CR3 se expresa en los fagocitos mononucleares, granulocitos y clulas asesinas naturales (NK) (Ahearn. 1998), y en las clulas microgliales (Morgan. 1996). El CR3 se une al iC3b, y al C3b y el C3d pero con menor afinidad (Brown. 1991). En las clulas fagocticas, el CR3 dispara el proceso fagocitico de un modo paralelo al CR1. El CR3 aumenta la ingesta de partculas recubiertas con Ig G y C3 (Sengelov, 1995; Gaither, 1987). Otro papel importante del CR3 es la adhesin de los monocitos y los neutrfilos a las clulas endoteliales a travs de la interaccin con su contraligando, molcula de adhesin intracelular tipo 1 (ICAM-1). Esto permite la acumulacin de los fagocitos en los lugares de dao tisular donde las clulas endoteliales son activadas. El receptor del complemento tipo 4 (CR4. CD11c/CD18) es una glicoprotena que comparte caractersticas con el CR3. Tambin es un miembro de la familia de molculas de adhesin de las miegrinas con una nica cadena a de 150 kDa. Se expresa en las clulas mieloides. clulas dendriticas. clulas NK. clulas B activadas, algunas clulas T activadas, plaquetas (Ahearn. 1998). y clulas microgliales (Morgan, 1996). El CR4 se une al iC3b. y al C3b en m e n o r medida (Brown, 1991). Sin embargo, el papel exacto del CR4 en trminos de activacin del complemento es desconocido y, como esta glicoprotena es una molcula de adhesin, puede servir para ayudar" a la adhesin de los neutrfilos al endotelio durante el proceso inflamatorio (Sengelov, 1995). Se han descrito varias molculas de superficie celular con actividad receptora para el Clq. Son receptores (ClqR.. C1qRJ, modificadores de la respuesta (gC1qR. proteoglicano condroitin sulfato derivado de las clulas B). y protenas de unin (CR1, cClqR) (Tenner, 1998). El CiqR es una glicoprotena de 126 kDa expresada en las clulas de origen mieloide. en las clulas endoteliales, en las plaquetas y en las clulas microgliales (Nepomucenc, 1998). Se ha mostrado que se une a la regin tipo colgeno del C1q (tenner,1998) y a las colectinas MBL y SP-A (Hansen. 1998). Se demostr que este receptor aumenta la fagocitosis de partculas subptimamente recubiertas con complemento o Ig G mediada por el CR1 y por el receptor Fe. Un segundo receptor, todava pobremente caracterizado, es denominado C1qR , se une al C1q e inicia la generacin de radicales txicos del oxgeno por los neutrfilos, los eosinfilos y las clulas del msculo liso vascular (Tenner. 1998). El receptor para las cabezas globulares del Clq (gCiqR) es una proteina de 33 kDa expresada en las clulas B, en los fagocitos mononucleares, en los neutrfilos, en las plaquetas y en las clulas endoteliales. Se ha informado que induce la quimiotaxis de neutrfilos humanos (Nepomuceno, 1998). Tambin se ha informado que otra molcula de superficie celular se une a la regin tipo colgeno del C1q (cClqR). Esta protena de 56 kDa se expresa en una variedad de clulas, se une la Clq, a la MBL y a la SP-A (Hansen, 1998) y tiene homologa con la calreticulma. Puede inducir la fagocitosis de los objetivos recubiertos con Clq asi como mediar la citotoxicidad, la produccin de anticuerpos y la secrecin de citocinas. El papel del CR1 una
3 o2

CAPITUIO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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v e zu n i d oa lC 1 qe st o t a l m e n t e desconocido. E si m p o r t a n t e realzar q u ee l zados por los h e p a t o c i t o s o por las clulas extraheplicas a m e n u d or e q u i e r e papel e x a c t o que juegan in vivo estas protenas unidas al C1 q asociadas a las un estmulo g e n e r a d o en las r e s p u e s t a s inflamatorias c o m o la interleucina-lu, clulas sigue e s t a n d op o c o claro. la i n t e r l e u c m a 6 o el interfern-y. En oirs o b r a s se p u e d e ver u n am e j o r desC o m o se trat a n t e r i o r m e n t e en la seccin Anafilotoxinas, los f r a g m e n t o s pepcripcin de la regulacin de la sntesis de las protenas del c o m p l e m e n t op o r las tdcos pequeos l i b e r a d o st r a s la degradacin p r o t e o l i t i c a del C4. C3 y C5 t i e d i f e r e n t e s clulas (Collen. 1998) I n t e r e s a n t e m e n t e los d a t o s del h i g a d o y la n e np r o f u n d o se f e c t o se nl ar e s p u e s t a inflamatoria. E s t oi n c l u y ee la u m e n t od e mdula sea h u m a n a (Naughton. 1996) y el t r a s p l a n t er e n a l( T a n g , 1999) la p e r m e a b i l i d a dv a s c u l a r , la degranulacin de los m a s t o c i t o s y la induccin de d e m o s t r a r o n que. a u n q u e el higado es el l u g a r ms i m p o r t a n t e de la sntesis del l aq u i m i o t a x i s .E lr e c e p t o r del C 3 ah u m a n o( C 3 a R )h as i d oc l o n a d or e c i e n t e c o m p l e m e n t o , los l u g a r e s extrahepticos p u e d e nc o n t r i b u i r a ios n i v e l e s de los m e n t e . Es una proteina t r a n s m e m b r a n au n i d a a la protena G. de c a d e n a nica c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t oe ne lp l a s m a . d e4 8k D a( E m b e r , 1998). E lC 3 a Rs ee x p r e s ae n las p l a q u e t a s del conejilo d e Indias, en los m a s t o c i t o s de rata, en los macrfagos alveolares h u m a n o s , en los neutrfilos. en los basfilos y en los eosinfilos (Ember, 1998). Recientemente, Gentica del complemento se ha d e m o s t r a d oq u e se e x p r e s a n en las clulas B de las amgdalas h u m a n a s M u c h o s de los g e n e s que c o d i f i c a n las protenas, los r e c e p t o r e s y las mol(Fisher, 1997) y en varias clulas del c e r e b r oh u m a n oi n f l a m a d o (Gasque. 1998). c u l a s regul a doras del c o m p l e m e n t o h a n s i d o c l o n a d o s y se l e s ha a s i g n a d o S eh ai n f o r m a d oq u ee lC 3 au n i d oas ur e c e p t o r origina q u i m i o t a x i s eosinofilica: u n a localizacin cromosmica ( T a b l a 38-1). I n t e r e s a n t e m e n t e ,e x i s t eu n a la degranulacin de los eosinfilos. los m a s t o c i t o s y las plaquetas: la adheson unin para un nmero de genes que codifican las molculas r e l a c i o n a d a s con de los eosinfilos y las plaquetas; y la supresin de las f u n c i o n e s de las cluo m p l e m e n t o .E s t o s grupos de unin i n c l u y e n los g e n e s del M H Cc l a s e III las B a m i g d a l a r e si n c l u y e n d o la produccin de inmunoglobulinas. D e b i d o a las el c (C2. f a c t o r B y C4), los g e n e s de los r e g u l a d o r e s de la activacin del c o m p l e s i m i l i t u d e se s t r u c t u r a l e se n t r e el C3 y el C4, se pens que el C4a era c a p a z de m e n t o (protena fijadora de C4. CR1. CR2, DAF, MCP y f a c t o r H). y los g e n e s i n t e r a c c i o n a rc o n el C3aR. S i ne m b a r g o ,p a r e c eq u e no es as y el C 4 ah u m a n o o m p l e j o de a t a q u e a la m e m b r a n a (C6. C7 y C9) (Schnein op u e d ei n t e r a c c i o n a rc o ne lC 3 a Rh u m a n o( A m e s . 1997). a u n q u ep a r e c eq u e de las protenas del c der, 1999). Las molculas de c a d a uno de e s t o st r e sg r u p o sm u e s t r a nh o m o i n t e r a c c i o n ac o ne lC 3 a R del conejilo d eI n d i a s (Lienenklaus. 1998). logia estructural, lo que sugiriere que las protenas del c o m p l e m e n t op u e d e n U nr e c e p t o rp a r a la a n a l i l o t o x m a C5a (C5aR) se e x p r e s a en los neutrfilos. derivar de una duplicacin gentica de un nmero limitado de g e n e s ancestralos m o n o c i t o s , los basfilos, los eosinfilos, las plaquetas, los m a s t o c i t o s , las les. Es de inters que e x i s t e n dos g e n e sp a r a el C4. Originan dos isolipos de clulas del parnquima heptico, las clulas del msculo liso v a s c u l a r del pulC4 la m a d o sC 4 A y C4B, los c u a l e ss o np r o d u c i d o sc o nf r e c u e n c i a (O'Neill. mn, las clulas endoteliales vasculares del pulmn y umbilicales, las clulas 1978a: A w d e h , 1980). E s t o s dos p r o d u c t o s gnicos difieren f u n c i o n a i m e n t ey epiteliales bronquiales y alveolares, l o s astrocitos, las clulas microgliales tienen diferente eficacia hemolitica. Una vez e x p u e s t o s al g r u p o tolster de la ( E m b e r . 1998) y las clulas T h u m a n a s (Nataf. 1999). El C 5 a R es una protemolcula. C4A f o r m a un e n l a c ea m i d a con un a c e p t o r de la molcula en su na t r a n s m e m b r a n aa s o c i a d a la proteina G de 43 k D a El C 5 au n i d o al C 5 a R microambiente. m i e n t r a s que la f o r m a C4B f o r m a un e n l a c e ster. Adems, s e i n d u c e una a m p l i a variedad de e f e c t o sd e p e n d i e n d o del tipo de clula diana. descubri que el C4A se une al CR1 con m a y o r afinidad que el C4B (Reily. E s t o s incluyen las quimiotaxis de neutrfilos. eosinfilos. basfilos y fagocitos 1997). Tambin t o d a s las protenas r e l a c i o n a d a s con el c o m p l e m e n t om u e s m o n o n u c l e a r e s ; la degranulacin de los m a s t o c i t o s de las serosas; la protran p o l i m o r f i s m o (es decir, existen mltiples alelos con variables f r e c u e n c i a s duccin de r a d i c a l e s del oxigeno: facilitar la adhesin celular; y la produccin en humanos). El c o m p o n e n t e ms polimrfico del c o m p l e m e n t o es el C4, c o n d el e u c o t r i e n o syp r o s t a g l a n d i n a s en l o s neutrfilos y l o s eosinfilos. E n ms de 35 alelos identificados (Schneider. 1997). L a degradacin de los I t a g varios e s t u d i o s el C5a tambin demostr i n d u c i r la produccin de protenas m e n t o s del C4A y C4B y su unin a los e r i t r o c i t o s origina a los a n t i g e n o sd e de fase aguda, citocinas y anticuerpos ( E m b e r , 1998). g r u p o sanguneo R o d g e r d s y Chido. r e s p e c t i v a m e n t e (O'Neill. 1978b). L a s L o sr e c e p t o r e s de los factores H y B se h a n descrito en m u c h o s tipos de v a r i a c i o n e s allicas del f a c t o ra c e l e r a d o r de la degradacin (DAF) o r i g i n a n el l e u c o c i t o s y estn descritos en otras obras (Fres. 1987). Sin embargo, el sigs i s t e m a de g r u p o sanguneo C r o m e r con el fenotipo I n a b que c a r e c e de DAF. nificado fisiolgico de estos receptores todava no est claro. Las m u t a c i o n e s puntuales, l a si n s e r c i o n e sol a sd e l e c i o n e s de l o s cidos n u c l e i c o sn o r m a l m e n t e van u n i d a s con d e f e c t o s de las protenas del c o m p l e m e n t o (Schneider, 1997). C o m o se d i s c u t e despus en la seccin D e f e c t o s Biosintesis del complemento genticos del c o m p l e m e n t o ,e s t a s son n o r m a l m e n t ep o c of r e c u e n t e se n t r e la poblacin. El p o l i m o r f i s m o de l a s protenas del c o m p l e m e n t o se evala t a n t o S ec a l c u l aq u ee l9 0 %d e los c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o del p l a s m as o n p o r los anlisis f e n o t i p i c o sc o m op o r los genotipicos. Los d e t a le s de e s t o s s i n t e t i z a d o s en el hgado y son protenas de f a s ea g u d a (es decir, su sntesis mtodos no sern di s cuti d os en e s t e captulo y el l e ctor es r e m i t i d o al Capi t up o re lh i g a d oa u m e n t ae nl ar e s p u e s t a inflamatoria p a r aa u m e n t a r los n i v e l e s lo 41 y o t r o s captulos s o b r e el t e m a (Schneider. 1997; M a u f f . 1997). del plasma). El h e p a t o c i t op r o d u c e la gran mayora de los c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o , con la excepcin del C1q. el f a c t o r D, la p r o p e r d i n a y el C7 ( M o r gan, 1997a). El C1q p a r e c e que es s i n t e t i z a d o por las clulas epiteliales, l o s m o n o c i t o s 'macrfagos y los fibroblastos. El principal p r o d u c t o r de f a c t o r D es el adiposito. La p r o p e r d i n a es sintetizada m a y o n t a r i a m e n t ep o rl o sm o n o c i t o sy los macrfagos o c u r r i e n d oa l g o de la sntesis en los l i n f o c i t o s y en los granulootos. L a mayora del C7 del p l a s m a tambin p a r e c e originarse por los m o n o c i t o syl o s macrfagos. a u n q u el o sl e u c o c i t o sp o l i m o r f o n u c l e a r e sp a r e c e que a l m a c e n a n C7. Es de inters que m u c h o s otros tipos celulares han sido descritos c o m os i n t e t i z a d o r e s de los c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o in vitro. Se ha p u b l i c a d o una e x h a u s t i v a lista de clulas que p r o d u c e nc o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o (Morgan, 1 9 9 7 a ) .B r e v e m e n t e , se ha i n f o r m a d oq u el o s linfocitos B y T, los m o n o c i t o s , las plaquetas, los neutrfilos. los macrfagos. los fibroblastos, las clulas endoteliales. las clulas epiteliales, los queratinootos. los m i o b l a s tos. las clulas del msculo liso, los a d i p o c i t o s y las clulas de la sinovial. cereb r oyt r a c t o genital sintetizan u n o o ms c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o .I n t e r e s a n t e m e n t e , los m o n o c i t o s . los macrfagos. las clulas del tejido sinovial y los a s t r o c i t o s del c e r e b r ot i e n e nl ac a p a c i d a dd es i n t e t i z a rt o d o sl o sc o m p o n e n t e s de las vas clsica y alternativa. E s t op u e d et e n e ri m p o r t a n t e si m p l i c a c i o n e s en la inflamacin especifica de tejido, d o n d ed e b ee s t a rp r e s e n t e un m e c a n i s m o l o c a l i z a d o de d e f e n s a del husped para eliminar las partculas extraas eficazm e n t e . La produccin de c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t on o r m a l m e n t e sinteti-

Complemento e inmunidad adquirida Est q u e d a n d o claro q u e el s i s t e m a del c o m p l e m e n t oj u e g a un p a p e l i m p o r t a n t ee ne le s t a b l e c i m i e n t od e las r e s p u e s t a si n m u n e s adquiridas. L a depresin de las r e s p u e s t a s de a n t i c u e r p o s a la estimulacin anlignica se demostr en a n i m a l e s deplecionados transitoriamente de C3 (Pepys, 1974), en a n i m a l e s con d e f e c t o s genticos en el C2. C 4 o C3 (Btger, 1985; Ochs, 1983; O'Neil, 1988), y en p a c i e n t e s con d e f e c t o s genticos en C2, C4, C3 o CR3 (Ochs. 1986). El desarrollo r e c i e n t e de r a t o n e s knockout sin C4, C3. o r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o tipos 1 y 2 (CR1 y C R 2s o np r o d u c t o s de la divisin de un m i s m o gen en el ratn en oposicin a los h u m a n o s )h ap e r m i t i d o u nm e j o rc o n o c i m i e n t o del papel del c o m p l e m e n t oe nl a sr e s p u e s t a sd e antic u e r p o s al antigeno. E s t e efecto ha sido revisado r e c i e n t e m e n t e (Carroll. 1998a: 1998b: Fearon, 1998). El c o m p l e m e n t op u e d e influir en la r e s p u e s t a de a n t i c u e r p o s al antgeno de m u c h a s maneras. Primero, el CR 1 y el CR2 son e x p r e s a d o s en las clulas B y en las clulas dendriticas foliculares (que estn p r e s e n t e s en el bazo). EL CR2 est p r e s e n t e en la s u p e r t i c i e de las clulas B en asociacin con el CD19 y el TAPA-1. Una vez que se ha ligado el r e c e p t o r de la clula B p a r a el antigeno y p a r a el CR2 ( c o m o ocurrir c u a n d o el ant-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

geno esl unido al C3d), disminuye drsticamente el umbral para la activacin de la clula B. Tambin, el complemento ayuda en el atrapamiento de los complejos inmunes por las clulas dendriticas foliculares en el bazo. Esto facilita la formacin de centros germinales donde las clulas B adquieren el fenotipo memoria. Por lo tanto, la prdida de uno de los componentes iniciales de la via clsica de la activacin del complemento o la prdida del CR1 y/o el CR2 conduce a una respuesta inmune inapropiada al antgeno y, en algunos casos, puede conducir a la incapacidad para producir una respuesta de anticuerpos secundaria. El complemento puede jugar un papel en la generacin de clulas B CD5 positivas, las cuales producen anticuerpos "naturales" (Carroll. 1998a). La activacin adecuada de las clulas B en respuesta a antigenos parece depender, en algunos casos, de la activacin de los anticuerpos "naturales" y el complemento (Boes, 1998: Lutz, 1999). Interesantemente, el complemento parece importante en el mantenimiento de la tolerancia de las clulas B a los antgenos propios. Esto parece depender del componente del complemento C4, y del CR1 y del CR2 (Prodeus, 1998). Finalmente, el complemento (especialmente el C3) ayuda a la generacin de una respuesta inmune adquirida al antgeno a travs de las clulas presentadoras de antgeno (APCs). La presencia de productos de degradacin de C3 sobre los antgenos aumenta la captacin del anligeno por las APCs (clulas B y otras APCs profesionales que expresan CR1 y/o CR2), aumentando por lo tanto la eficacia de la presenlacin antgnica a las clulas T con la consiguiente respuesta mediada por las clulas T (Boackle. 1998: Kerekes. 1998).
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DEFICIENCIAS GENTICAS DEL COMPLEMENTO

Los pacientes con deficiencias del complemento genticamente controlados son m u y raros pero son interesantes porque nos permiten determinar el papel de los componentes del complemento en distintos fenmenos biolgicos y en diferentes estados de enfermedad. En general, la ausencia de un componente sigue los principios de la gentica mendeliana simple y es heredada c o m o un rasgo autosmico recesivo. Por ello, los pacientes heterocgticos tienden a tener la mitad de los niveles normales o menos, y los pacientes con defectos homocigticos tienen poca o indelectable actividad del complemento. El gen de la properdina est en el cromosoma X. Se conocen deficiencias para todas las protenas ligadas a la activacin del complemento (Tabla 38-4). Con el descubrimiento reciente de la va de la MBL de la activacin del complemento lleg el sorprendente hallazgo de que el dficit en suero de MBL es bastante frecuente. Se calcula que aproximadamente el 5% de la poblacin tiene una de las tres mutaciones genticas reconocidas que conducen a la deficiencia de MBL (Sumiya. 1997). Se ha descrito una correlacin entre la deficiencia de MBL y las infecciones del tracto respiratorio superior, especialmente entre los 6 y 18 meses de edad, demostrando la importancia de la va de la MBLecitina en la primera infancia (Turner. 1996). Un estudio reciente sugiere que la variacin de genes de la MBL puede estar asociada con al menos un tercio de las inlecciones meningoccicas en la infancia (Hibberd. 1999). Se ha informa?

Tabla 38-4 Deficiencias h e r e d a d a s d e l c o m p l e m e n t o y d e las protenas relacionadas c o n el c o m p l e m e n t o Patrn de herencia Principal correlacin clinica' Proteina Comn a todas las vas C3 Va clsica C1q C1r C1S C4> C2t Va alternativa Factor B Factor D Properdina Via de la MBLectina MBL Complejo de ataque a la membrana C5 C6 C7 Autosmica recesiva Autosmica Autosmica Autosmica Autosmica Autosmica recesiva recesiva recesiva recesiva recesiva Infecciones pigenas recurrentes, glomerulonefritis Glomerulonefritis. LES Glomerulonefritis. LES Glomerulonefritis. LES LES LES, LED. artritis reumatoide juvenil, glomerulonefritis Infecciones por Neisseria meningitidis Infecciones pigenas recurrentes Infecciones pigenas recurrentes, meningococcemia fulminante Infecciones recurrentes Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria. LES Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria, enfermedad de Raynaud Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria Nada Angioedema hereditario, enfermedades autoinmunes' Angioedema, sndrome semejante al Behcet Inlecciones pigenas recurrentes Inlecciones pigenas recurrentes, glomerulonefritis Asociacin entre la expresin baja en eritrocitos y el LES Infecciones pigenas recurrentes, leucocitosis Hemoglobinuria paroxstica nocturna

Autosmica recesiva Autosmica recesiva Ligada al X Autosmica dominante Autosmica recesiva Autosmica recesiva Autosmica recesiva

C8 (cadenas y a-y) Autosmica recesiva C9 Autosmica recesiva Proleinas de control del fluido sanguineo C1inh Autosmica dominante o adquirida C4bp Autosmica recesiva Factor I Autosmica recesiva Factor H Autosmica recesiva Protenas unidas a clulas CR1 Autosmica recesiva ' CR3 Autosmica recesiva" DAF/CD59/HRF Adquirida
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* Vase que algunas personas con deficiencias del complemento, especialmente C2 y componentes del complejo de ataque a la membrana, estn clnicamente bien. Un nmero sustancial de pacientes con defectos en del C5 al C9 han tenido una enfermedad autoinmune. Las deficiencias del Ct al C9 estn asociadas con un CH50 de O. Las deficiencias de Ct. C4 y C2 estn asociadas con LES y los pacientes a menudo tienen prep. LE negativos Las deficiencias de C3 a C9 esln asociadas con una ausencia o una baja actividad bactericida en suero La deficiencia de C3 o C5 est asociada con la ausencia o disminucin de la actividad quimiotctica en suero y puede estar asociada con la ausencia de respuesta leucoctica a la infeccin. i La deficiencia en cualquier gen del C4 (C4A y C4FJ) se denomina "qO", para la cantidad cero Tal deficiencia es designada C4AqO o C4BqO Los pacientes con tales deficiencias tienen una incidencia mayor de lo normal de enfermedades autoinmunes. Los individuos heterozigticos para la deficiencia de C2 tambin tienen un aumento de la incidencia de enleimedades autoinmunes. Aproximadamente el 85% de los casos incluyen aletas silentes, y un 15% incluyen alelos que codifican para la variante adquirida disluncional de la proteina Ct inhibidor. En el angioedema hereditario, el nivel de C1 esta normal o disminuido, el nivel de C3 est siempre normal, y el nivel de C4 esl disminuido. En la enfermedad adquirida, los niveles de Cl y C4 estn disminuidos, el nivel del antignico Cl inhibidor suele ser normal o alto, y el nivel funcional del Cl inhibidor esta muy disminuido. La homocigosis para la expresin numrica ba|a (no ausente) de CR1 en los eritrocitos es detectable in vilro y puede estar asociada con el LES Tambin puedo detectarse un defecto adquirido en el nmero de CRI Niveles bajos, pero no ausentes de CR3 leucocitico son detectables en los padres de la mayora de los nios con delicit de CR3. LES = lupus eritemaloso sislmico. LED = lupus eritematoso diseminado. MBL = lectina fijadora de maosa
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CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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do q u el a s infusiones de M B L purificada corrigen el d e f e c t o y la susceptibilidad Es importante r e c o n o c e r que la medicin de los niveles del c o m p l e m e n t o a las i n f e c c i o n e s en los nios con deficiencias del M B L (Valdimarsson, 1998). srico representa los niveles estticos de protenas que se r e c a m b i a n rpiAdems, se h a sugerido que la deficiencia de M B Lc o n d u c eae n f e r m e d a d e s damente. I n c l u s o en los individuos normales, el ndice fraccional catablico a u t o i n m u n e sc o m o el l u p u se r i t e m a t o s o sistmico (Turner. 1996) y que es un de la mayora de los componentes que han sido m e d i d o s est alrededor del f a c t o r de riesgo p a r a el a b o r t or e c u r r e n t e (Christiansen. 1999). 2 % por hora. M u c h a s de e s t a s protenas se c o m p o r t a nc o m or e a c t a n t e s de u e d e na u m e n t a r drsticamente e n los L a deficiencia e n cualquiera d e los c o m p o n e n t e sd el ac a s c a d a del c o m - fase aguda, y sus niveles en suero p e s t a d o s inflamatorios. Sus ndices d ec a t a b o l i s m op u e d e na u m e n t a re n p l e m e n t o tiene alguna asociacin con la susceptibilidad a infecciones (Figueroa. 1991; Densen. 1998). D e b i d o al papel central q u e el C3 tiene en la opso- varias enfermedades autoinmunes. El hallazgo de una disminucin del nivel del c o m p l e m e n t op u e d e avalar la s o s p e c h a de q u e el s i s t e m a del c o m p l e nizacin, la deficiencia de C3. de otros c o m p o n e n t e s de la va alternativa, o m e n t o participa en el dao tisular, pero no lo prueba. El hallazgo de un nivel de las molculas reguladoras c o m o los factores H e I est a s o c i a d a con un normal de c o m p l e m e n t o en el suero no e x c l u y e la participacin del c o m p l e a u m e n t od el a incidencia d e infecciones. Interesantemente, las deficiencias m e n t o en el dao tisular. Por ejemplo, los p a c i e n t e s con cirrosis biliar tienen de los c o m p o n e n t e s del c o m p l e j o de a t a q u e a la m e m b r a n a (C5-C9) estn un aumento del ndice catablico de C3, y se ha sugerido que el C3 p u e d e a l t a m e n t ea s o c i a d a sc o nu na u m e n t od el a incidencia d e infecciones p o r jugar un papel en el desarrollo de e s t a enfermedad. No obstante, el nivel de Neisseria meningitidis, sugiriendo l ai m p o r t a n c i a de la lisis m e d i a d ap o r el C3 en el suero de los pacientes c o n cirrosis biliar est casi s i e m p r e elevado. c o m p l e m e n t o en el control del m e n i n g o c o c o La vacunacin e m p l e a n d ou n En e s t e caso, el a u m e n t o de la sntesis e n c u b r e el c a t a b o l i s m oa u m e n t a d o . polisacrido c a p s u l a rm u l t i v a l e n t ep a r a Neisseria meningitidis demostr ofreTambin debe reconocerse que la funcin del c o m p l e m e n t o en los diversos c e ra l g u n a proteccin f r e n t e a la infeccin menmgoccica e nl o sp a c i e n t e s c o m p a r t i m e n t o s del c u e r p op u e d es e r diferente. L a actividad del c o m p l e c o n deficiencia del c o m p l e m e n t o (Fijen. 1998). m e n t o en la sangre de pacientes con artritis r e u m a t o i d e seropostiva p u e d e O t r a caracterstica de la deficiencia del c o m p l e m e n t o ,e s p e c i a l m e n t e en los s e rn o r m a l o elevada; sin embargo, la actividad del c o m p l e m e n t o del liquido c o m p o n e n t e s iniciales de la via clsica (C1. C4, C2). es la asociacin c o n u e d e eslar s e v e r a m e n t e disminuida. e n f e r m e d a d e sa u t o i n m u n e sc o m oe l LES. Y aq u ee lc o m p l e m e n t oe si m p o r - sinovial p t a n t e en el a c l a r a m i e n t o de los c o m p l e j o si n m u n e s de la circulacin, p u e d e ser M u c h o s investigadores han i n t e n t a d o identificar qu va de activacin del q u e la deficiencia de los c o m p o n e n t e s iniciales del c o m p l e m e n t oc o n d u z c aa c o m p l e m e n t op r e d o m i n a en la mediacin del dao tisular o en los niveles disu n a degradacin inadecuada de los complejos i n m u n e s con su acumulacin m i n u i d o s del c o m p l e m e n t o en u n a y otra e n f e r m e d a de s t a b l e c i e n d o el" perfil e nl o s tejidos c o m o el rion. R e c i e n t e sd a t o se x p e r i m e n t a l e s que e m p l e a n del c o m p l e m e n t o " . La aproximacin ms s i m p l e a este p r o b l e m a examina los r a t o n e s transgnicos sugieren que la a u t o m m u m d a da s o c i a d a con la deficienniveles de varios c o m p o n e n t e s y da p o rh e c h oq u e los niveles d i s m i n u i d o s de cia de Clq origina un a c l a r a m i e n t oi n a d e c u a d o de las clulas apoplticas que. un c o m p l e m e n t od a d o de una de las vias de activacin del c o m p o n e n t e es a su vez. c o n d u c e al desarrollo de a n t i c u e r p o s autorreactivos (Bofto. 1998). ms frecuente que ocurra c u a n d o la va est activada. P o rl o tanto, si u n C o m o se discuti previamente en la seccin C o m p l e m e n t o e inmunidad adqui- p a c i e n t e tiene niveles disminuidos de C3 y C4 y niveles n o r m a l e s de f a c t o r B, rida, la deficiencia del c o m p l e m e n t o( e s p e c i a l m e n t e de C4 o C R 1C R 2 )t a m - s e g u r a m e n t e estar implicada la va clsica. Si un paciente tiene niveles disbin p u e d e alterar el m e c a n i s m o por el que las clulas B se h a c e n tolerantes m i n u i d o s de C3, factor B y properdina, y niveles n o r m a l e s de C4, probablea los antgenos propios, c o n d u c i e n d o por ello a una a u t o i n m u n i d a d (Prodeus, m e n t e estara activada la va alternativa. De esta manera, la determinacin de 1998). E x i s t e nd e f i c i e n c i a s en l a s molculas reguladoras del c o m p l e m e n t o l o s niveles d eu n nmero limitado d ec o m p o n e n t e sp u e d ep r o p o r c i o n a r u n i d a s a la m e m b r a n a . La deficiencia de C R 3 origina s e v e r a s infecciones pi- m u c h a informacin. E x c e p t u a n d o el c a s o de alteraciones conlroladas gentig e n a syd e f e c t o s en la adhesin l e u c o c i t a n a (Fres. 1986; Morgan. 1991). La c a m e n t e del c o m p l e m e n t o ,u n on u n c an e c e s i t ac o n o c e rl o s niveles d et o d o s d e f i c i e n c i a en la c a p a c i d a dp a r ag e n e r a r el e n l a c e glicosil fosfatidilinositol q u e los c o m p o n e n t e se x c e p t o para objetivos de investigacin. u n ea l g u n a s protenas de control del c o m p l e m e n t o a la m e m b r a n a celular oriUn i m p o r t a n t ea v a n c e en e s t e rea es el e m p l e o de e n s a y o s de enzimas gina HPN. L o sp a c i e n t e sc o n tal e n f e r m e d a d no tienen D A F .C D 5 9yH R F en fijadoras i n m u n o a b s o r b e n t e s (ELISAj p a r ad e t e c t a r los c o m p l e j o se s t a b l e s la superficie de sus clulas y sufren u n a hemolisis intravascular crnica, tromf o r m a d o s en el s u e r o durante la activacin del c o m p l e m e n t o .E s t o se n s a y o s b o c i l o p e n i a y disminucin de la h e m a t o p o y e s i s (Jarva, 1999). L a deficiencia son m u y sensibles y pueden d e m o s t r a r rpidamente q u e va del c o m p l e m e n del C 1 inhibidor origina e la n g i o e d e m a hereditario, u n ae n f e r m e d a d caracteri- to est activada en varios e s t a d o s de e n f e r m e d a d (Morgan. 1994a). z a d ap o r episodios recurrentes de e d e m a subcutneo y s u b m u c o s o . Esta defiEn la activacin, m u c h a s protenas del c o m p l e m e n t oe x p r e s a nn u e v o s c i e n c i ap u e d eh e r e d a r s e o adquirirse tras el desarrollo de a u t o a n t i c u e r p o sc o n antigenos (neoantgenos) que no son e x p u e s t o s en la protena n a t i v a plastra el C1 inhibidor. L o sp a c i e n t e sc o n deficiencia del C1 inhibidor a m e n u d o mtica. El neoantgeno presente en el M A C pero n o presente en los c o m p o m u e s t r a n niveles bajos de C4 y C2. d e m o s t r a n d o una activacin incontrolada n e n t e sn a t i v o s termnales es quizs el ms interesante. El a n t i c u e r p op a r a del C1. Se c r e eq u e el a n g i o e d e m a hereditario es c a u s a d o principalmente p o r e s t e neoantgeno e x i s t e y se ha utilizado p a r a estudiar el nivel de neoantla prdida de la regulacin del s i s t e m ag e n e r a d o r de cininas por el C1 inhibig e n op o r inmunofluorescencia as c o m op o rE L I S A (Falk. 1 9 8 3 ; Sanders. d o r (Cugno. 1998; Davis. 1998). 1985). El nivel de neoantgeno est elevado en sangre y en lquido cefalou c h o s pacientes con activacin consiguiente del c o m p l e m e n L o sp a c i e n t e sc o nh y p o g a m m a g l o b u l i n e m i aoi n m u n o d e f i c i e n c i ac o m b i n a d a rraqudeo en m u g a r e s de s e v e r aam e n u d ot i e n e n disminuidos los niveles de Clq. En parte, e s t o s nive- to (Sanders. 1986). Adems, est presente en los tejidos en los l o m p l e j o terminal. Por ejemplo, est p r e s e n t e en el tejido lesiol e sd i s m i n u i d o sd eC 1 qs e relacionan c o n los niveles b a j o sd eI g Ge nl a circu- depsito del c n a d o en los glomrulos de los p a c i e n t e s con glomerulonefritis (Falk. 1983) y lacin. P a r e c e que el Clq i n t e r a c c i o n a con la IgG en la circulacin y que e s t a en la piel lesionada en los lugares de L E S activo (Biesecker. 1982). A q u e interaccin c o n d u c e , a su vez. a una disminucin del c a t a b o l i s m o del Clq. rencia del C3 depositado en la piel n o r m a l de p a c i e n t e sc o nL E Syc o nt e s t de b a n d a para el lupus positivo, el neoantgeno M A C solo se e n c u e n t r a en las lesiones. EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD DEL COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD E nm u c h o sc o n t e x t o sd e enfermedad, las f u n c i o n e s del c o m p l e m e n t os o n n o r m a l m e n t ep r o d u c i r inflamacin o dao tisular. C u a n d o el c o m p l e m e n t o juega un p a p e l en el desanollo de la enfermedad, a m e n u d o es a c t i v a d op o r un Enfermedades reumatolgicas a n t i c u e r p o anormal, un c o m p l e j oi n m u n eop o rm a t e r i a l extrao. F r e c u e n t e L ae n f e r m e d a d reumatolgica que ha sido evaluada ms e x t e n s a m e n t e m e n t e es i m p o r t a n t ee v a l u a r el nivel de u n oyo t r oc o m p o n e n t e del c o m p l e - en c u a n t o a la contribucin del c o m p l e m e n t o a la actividad de la e n l e r m e d a d m e n t oc o m om e d i d ad el a actividad d eu np r o c e s od ee n f e r m e d a d .P o r ello, l o s es el L E S (Agnello. 1986: Alkinson. 1986). En esta e n f e r m e d a d se f o r m a n p a c i e n t e sc o nL E Sa c t i v op u e d e nt e n e rd i s m i n u i d o s los niveles de C3 y C4, y grandes cantidades d ec o m p l e j o s inmunes. S ee n c u e n t r a ni n m u n o c o m p l e j o s e s t o s niveles d i s m i n u i d o s del c o m p l e m e n t op u e d e ns e g u i r s ec o m ou nm a r c a - circulantes y u n i d o s a tejidos. E s t o si n m u n o c o m p l e j o sa c t i v a n el c o m p l e d o ra p r o x i m a d od el a actividad d el ae n f e r m e d a d . mento, y los productos de activacin del c o m p l e m e n t oc o n t r i b u y e n a que

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

m a t i s m o severo o sepsis incontenible. H a y evidencia de activacin m a s i v a contine la inflamacin. A m e n u d o estn disminuidos los niveles de C3 y C4 del c o m p l e m e n t o en estos pacientes, lo q u e sugiere q u el a sb a c t e r i a syl o s en el LES y, en general, los niveles bajos se encuentran en los pacientes c o n p r o d u c t o sb a c t e r i a n o s activan e lc o m p l e m e n t o( H a m m e r s c h m i d t , 1980). e n f e r m e d a d activa. Algunos sugieren q u e un nivel bajo de C4 es el m e j o r P a r e c e que se activan la va clsica y la va alternativa (Langlois. 1988). Se indicador de que la e n f e r m e d a d contina activa. Sin embargo, hay pacientes f o r m a n factores inflamatorios c o m o el factor activador de neutrfilos y el C5a. c o ne n f e r m e d a d activa q u em u e s t r a n niveles n o r m a l e sd e C4. D ea c u e r d o H a y evidencia de que los neutrfilos infiltran el pulmn, y se c r e e que los procon otros, el nivel de sC5b-9 circulante o de neoantgeno del MAC p u e d e ser ductos oxidativos neutroflicos y las proteasas son responsables d em u c h o un indicador m e j o r de enfermedad activa (Gawryl, 1987). C o m o se trat preu l m o n a rq u e ocurre. viamente, el c o m p l e m e n t op a r e c e jugar un papel esencial en el aclaramien- del dao p to de l o si n m u n o c o m p l e j o s circulantes, particularmente de aquellos q u e contienen isotipos a c t i v a n t e s del c o m p l e m e n t o IgM o IgG. El depsito de C3b sobre el i n m u n o c o m p l e j o procede de la activacin del complemento, que Enfermedades renales p e r m i t e la interaccin con clulas que poseen el receptor de C3b (CR1). Con la unin a los eritrocitos a travs del CR1. se impide que los complejos inmuEl c o m p l e m e n t op a r e c e ser una c l a v e importante en el dao g l o m e r u l a r en nes se difundan del p l a s m a a los tejidos d o n d ep u e d e n originar dao. Los erim u c h a s de las glomerulonefritis (West, 1998). E s t o se d e m u e s t r aam e n u d o t r o c i t o s que u n e nai n m u n o c o m p l e j o s circulan h a c i a el hgado, donde los por el depsito de C3 y otros c o m p o n e n t e s , en o c e r c a de la m e m b r a n ab a s a l i n m u n o c o m p l e j o s son eliminados p o r un p r o c e s o que no disminuye la vida glomerular. Adems, el M A Ch a sido r e c o n o c i d o en el dao g l o m e r u l a r en m e d i a de los hemates (Cornacoff, 1988; Birmingham, 1995). E n las enferpacientes c o n glomerulonelritis y LES. Se ha d e m o s t r a d oq u e los p a c i e n t e s m e d a d e s en las que el c o m p l e m e n t o es activado y estos p r o d u c t o si n m u n o - c o ne n f e r m e d a d del s u e r od e b i d aai n m u n o c o m p l e j o s circulantes tienen lgicamente activados se f o r m a n en la circulacin, el nmero de CR1 por erilesin glomerular. En el anlisis del suero, estos pacientes m u e s l r a n la actitrocito est disminuido. Esto p u e d e resultar de la eliminacin d e algunos d e vacin de las vas clsica y alternativa, o de ambas. Tradicionalmente, se h a l o s CR1 c u a n d o el c o m p l e j oi n m u n e es retirado del eritrocito en el hgado credo que los complejos son depositados en los glomerulus a m e d i d aq u e (Ross, 1985). Adems del LES, se ha publicado que los eritrocitos de paciense filtra el p l a s m aq u e contiene los i n m u n o c o m p l e j o s .U n av e z depositados, t e s con e n f e r m e d a d crnica por aglutininas fras. HPN, a n e m i a hemolhca e s t o sc o m p l e j o s activan e lc o m p l e m e n t o .U np u n t od e vista alternativo e s autoinmune. sndrome de Sjogren y neumona por Mycoplasma pneumoniae q u e los anticuerpos contra las estructuras glomerulares f o r m a ni n m u n o c o m tienen r e d u c i d o el CR1 eritrocitano, sugiriendo que los depsitos i n m u n e s plejos en el rion que luego activan el c o m p l e m e n t op a r ac a u s a r dao local h a n sido eliminados de los eritrocitos en estas e n f e r m e d a d e s (Atkinson, (Daha, 1979). A u n q u e los anticuerpos frente a las estructuras de la m e m 1986: Ross, 1985). brana basal glomerular son c l a r a m e n t e importantes en el sndrome de Goodpasture, su papel global en las glomerulonefritis es ms cuestionable. El L a s protenas del c o m p l e m e n t o actan c o m o reactantes d e fase a g u d ay papel del c o m p l e m e n t o en la e n f e r m e d a d intersticial y tubular est m e n o s los niveles p u e d e nn oe s t a r disminuidos incluso e n situaciones e n las q u e claro; sin embargo, hay quienes c r e e n que el c o m p l e m e n t o tambin funcioocurre la activacin del c o m p l e m e n t o . Se encuentran niveles sricos del c o m ae n estos trastornos. Interesantemente, e na l g u n o sp a c i e n t e sc o ng l o m e p l e m e n t on o r m a l e soa u m e n t a d o s en la artritis r e u m a t o i d e juvenil, en el reu- n rulonefritis con ni v el e s m u y baj o s d e C3. una protei n a l a m a d a factor nefrtim a t i s m o palindrmico. en la seudogota. en la gota, en el sndrome de Reiter co C3 (C3NeF o Nf) estabiliza la va de la C3 c o n v e r t a s a alternativa. E s t e y en la artritis gonoccica. AI m i s m o tiempo, p a r e c e n existir niveles disminuifactor es un autoanticuerpo dirigido contra el Bb q u ea u m e n t a la v i d am e d i a dos del c o m p l e m e n t o en el lquido sinovial en un nmero de otras enfermede l a C3 convertasa de l a via al t ernati v a en ms de 10 v e c e s (Daha. 1 9 7 9 . d a d e s reumatolgicas. incluyendo la artritis reumatoide. Se c r e e que la dis1976). El C 3 N e Fp a r e c e proteger a la C3 convertasa de la va alternativa de minucin d e la actividad hemolitica total del c o m p l e m e n t o (CH50; vase la eliminacin por la disociacin por el f a c t o r H (Fearon, 1980). Se c r e eq u e despus en E n s a y o s del c o m p l e m e n t o ) y la presencia de productos de degrael C 3 N e F es responsabl e de l o s ni v el e s tan baj o s de C3 p r e s e n t e s en e s t o s dacin del C3 y del f a c t o rBr e p r e s e n t a n la activacin intraarticular en el lquip a c i e n t e s pero n os ec r e eq u e juegue u n papel central e ne l desarrollo d el a do sinovial de m u c h o sp a c i e n t e sc o n artritis r e u m a t o i d e seronegativa. LES, nefritis. seudogota, gota, sndrome d e Reiter y artritis gonoccica. Esto n o es cierto
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en fluidos o b t e n i d o s de p a c i e n t e sc o n artritis degenerativa. Enfermedades dermatolgicas Enfermedades infecciosas C o m o en los otros grupos d ee n f e r m e d a d e s sealados, se c r e e que el c o m p l e m e n t ot o m a parte en el dao tisular en una variedad de e n f e r m e d a C o m o se mencion anteriormente y c o m o se evidenci en hallazgos clnides dermatolgicas. Estas incluyen el penfigoide ampollse el penfigoide cos en p a c i e n t e s con deliciencias genticamente controladas del c o m p l e m p o lo s a adquirida, la m e n t o , el s i s t e m a del c o m p l e m e n t oj u e g a un papel crucial en la defensa con- gestacional. el penfigoide cicatricial, la epidermlisis a m p o r t a n t e tra l o s microorganismos. L o s pacientes c o ns e p t i c e m i ap o rG r a m negativos dermatitis herpetiforme y el pnfigo vulgar (Yancey, 1998). Es i s a b e r que los niveles sricos del c o m p l e m e n t o suelen e s t a rn o r m a l e s o eleam e n u d o tienen niveles disminuidos de C3 y de c o m p o n e n t e s de la va altervados en estos estados inflamatorios, y de q u e la i m p o r t a n c i a del c o m p l e nativa, al igual que p a c i e n t e s con ciertas e n f e r m e d a d e s fngicas c o m o la m e n t o es estimada por anlisis de inmunofluorescencia de las biopsias lisus e p t i c e m i a criptoccica. El c o m p l e m e n t op u e d ee s t a r implicado en el dao lares y p o r estudios del liquido de l a ampolla. Adems. G a m m o n y cois. tisular a s o c i a d o con la infeccin crnica. Se s a b e que los p a c i e n t e sc o n (1984) han desarrollado un m o d e l o in vilro til para el e s t u d i o de e n f e r m e hepatitis infecciosa H b s A g positiva tienen una cada precoz en el C3 srico, a d e s cutneas m e d i a d a sp o r anticuerpos anli-membrana basal. E s t o s q u ep o s t e r i o r m e n t e vuelve a la normalidad. E s t op u e d ee s t a ra s o c i a d o con d autores h a nm o s t r a d oc o n c l u y e n t e m e n t e que e lC 5 ae su ne l e m e n t oc l a v e signos de e n f e r m e d a dp o ri n m u n o c o m p l e j o s (esto es, la artralgia). De u n a f o r m a similar, e lc o m p l e m e n t op a r e c e jugar u n papel importante e nm u c h a s en la patognesis del penfigoide ampolloso y de la epidermlisis ampollosa adquirida. El C5a acta c o m o un quimioatrayente necesario p a r a el aflujo d e i n f e c c i o n e s parasitarias, incluyendo la leishmaniasis, la tripanosomiasis, la leucocitos polimorfonucleares a los lugares de dao tisular en e s t a s enfergiardiasis y la malaria. L a discusin detallada d e las interacciones entre el medades. s i s t e m a del c o m p l e m e n t o y los parsitos, las bacterias y los virus no s e e n c u e n t r a dentro de los objetivos de e s t e capitulo y el lector d e b e remitirse a revisiones sobre el t e m a (Frank, 1998; Kozel, 1996: Cooper, 1998; Moffitt, 1994; Fishelson. 1994). Sin embargo, es importante r e c o n o c e r que los nive- Enfermedades hematolgicas les del c o m p l e m e n t o srico en general no son un ndice fiable de actividad d ee n f e r m e d a de n estas condiciones. E nm u c h o s tipos d ea n e m i a hemolitica a u t o i n m u n e ,e lc o m p l e m e n t oj u e g a un papel i m p o r t a n t e en la opsonizacin de los eritrocitos, c o n d u c i e n d o a su Se h a estudiado el papel del c o m p l e m e n t o en el sndrome de dificultad c l a r a m i e n t o por las clulas del s i s t e m a reticuloendotelial. respiratoria del adulto (SDRA), un p r o c e s o frecuente en pacientes con trau- a

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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Sin embargo, incluso en aquellos casos en los que el complemento est claramente implicado, los niveles sricos del complemento suelen ser normales. El complemento es particularmente importante en el aclaramiento de clulas recubiertas con crioaglutininas tipo IgM con especificidad anti-l. Estos autoanticuerpos (aglutininas frias) estn asociados con trastornos linfoprolferativos que siguen a infecciones, o pueden ser hallazgos aislados, especialmente en los ancianos. Las aglutininas fras generalmente se unen ptimamente a temperaturas subfisiolgicas, que se encuentran en algunas reas del cuerpo como la punta de la nariz, los dedos de las manos, y las orejas. Suelen mediar la lisis celular cuando los eritrocitos circulantes vuelven a la temperatura corporal central. No todas las aglutininas fras son anticuerpos IgM. El sndrome de la hemoglobinuria paroxistica fra (HPF), por ejemplo, resulta de crioaglutininas IgG de Donath-Landsteiner. que se unen a las clulas a temperaturas menores de 37 C pero median la lisis una vez calientes. Aunque el anticuerpo es diferente, los efectos fisiopatolgicos son similares. Otros autoanticuerpos que activan el complemento se unen ms eficazmente a temperaturas calientes. En general, estas aglutininas calientes son del isotipo IgG. En algunos casos, estos anticuerpos pueden estar asociados con enfermedades malignas linfoprolferativas y con infecciones virales. La mayora de los anticuerpos IgG reactivos al calor encontrados en la anemia hemolitica autoinmune tienen especificidad Rh y son pobres activadores del complemento en contraposicin con las aglutininas fras y con los anticuerpos frente a los grupos sanguneos anti-A y anti-B. Sin embargo, algunos anticuerpos, como el Tja, activan el complemento y originan la lisis. En una anemia hemolitica adquirida rara, llamada HPN (hemoglobinuria paroxistica nocturna), los pacientes experimentan episodios recurrentes de lisis mtravascular. Se cree que la lisis de los eritrocitos en estos pacientes se lleva a cabo por la va alternativa (Jarva, 1999; Rosse, 1998). aunque los niveles sricos del complemento siempre son normales y el test directo antiglobulina es siempre negativo. El defecto en la HPN es una prdida de protenas de enlace glicosil fosfatidilinositol en la superficie de las clulas de los pacientes originado por mutaciones en el gen fosfalidil glicano A (p/g-A). Entre otras protenas de unin a travs de este enlace de membrana estn el DAF y el CD59. dos molculas que controlan la activacin del complemento a nivel de la C3 convertasa. y el C8 y C9 respectivamente (vase anteriormente en Regulacin de la activacin del complemento). Se cree que la lisis de los eritrocitos en pacientes con HPN se debe a la activacin incontrolada del complemento en la superficie de estas clulas. Recientemente, se inform de que, aunque la prdida de DAF y CD59 de la superficie de los eritrocitos en pacientes con HPN es responsable del aumento de la sensibilidad a la lisis mediada por el complemento, la deficiencia de CD59 origina una mayor sensibilidad a la lisis celular que la deficiencia de DAF (Shichishima, 1999).

temente, el tipo de clula glial ms abundante, el astrocito, demostr sintetizar in vitro todas las protenas del complemento en condiciones inflamatorias (Morgan. 1996). Adems, los astrocitos y las clulas microgliales expresan receptores del complemento n vitro (Morgan, 1997a). Por lo tanto, a pesar de la barrera hematoenceflica. el cerebro tiene la capacidad de preparar una reaccin inflamatoria dependiente del complemento c o m o mecanismo de defensa.

Enfermedades cardiovasculares
Se admite la implicacin del sistema del complemento en la lesin por isquemia'reperfusin miocrdica. Se ha revisado recientemente (Lucchesi. 1997a). El mecanismo por el que el complemento contribuye al infarto agudo de miocardio en los pacientes todava no est claro. Sin embargo, se han demostrado los depsitos de los componentes de las vas clsica y alternativa en el miocardio afectado junto con C5b-9 La produccin de analilotoxmas que acompaan a la activacin del complemento parece ser responsable de la reaccin inflamatoria local. La demostracin ms clara del efecto del complemento, especialmente de los componentes finales (C5b-9). proviene del modelo animal de oclusin de arterias coronarias (Kilgore. 1998). Los conejos con deficiencia genticamente controlada de C6 muestran una significativa reduccin del tamao del infarto en comparacin con los conejos normales. Adems, la infiltracin neutrofilica se redujo significativamente en los conejos con deficiencia de C6. sugiriendo un papel crucial de los componentes finales del complemento en la generacin de inflamacin local. El complemento tambin parece jugar un papel en el desarrollo de lesiones de aterosclerosis (Torzewski. 1997). De nuevo, el mecanismo exaclo por el que el complemento contribuye al desarrollo de las lesiones arteriosclerticas no est claro. Sin embargo, el depsito de los componentes finales del complemento (C5b-9) ha sido demostrado en las ntimas adelgazadas y en las placas fibrosas. La activacin del sistema del complemento est asociada con etapas prelesionales y con la progresin de lesiones arteriosclerticas (Niculescu, 1987; Seifert, 1989). Los conejos con dficit de C6 demostraron ser menos susceptibles que los conejos normales a las lesiones arteriosclerticas inducidas por colesterol (Schmiedt, 1998).

Biocompatibilidad
Muchos de los biomateriales implantados en el cuerpo activan el complemento, particularmente la va alternativa del complemento (Mollnes, 1997) En contacto con la sangre o con los lquidos tisulares. estos materiales pueden activar el complemento y producir inflamacin local o dao tisular. Los materiales deben ser testados sobre su capacidad de activar el complemento antes de ser utilizados ampliamente.

Trasplante de rganos Enfermedades neurolgicas

El papel del sistema del complemento en las enfermedades del sistema nervioso se ha hecho evidente en los aos recientes. Esto es algo sorprendente, ya que la barrera hemaloenceflica bloquea eficazmente la penetracin del complemento en el liquido cefalorraqudeo. La activacin del complemento fue demostrada en enfermedades como la miastenia gravis. la esclerosis mltiple, el lupus cerebral, el sndrome de Guillain-Barr y la enfermedad de Alzheimer (Shm, 1998; Morgan. 1994a, 1997b). El depsito de protenas del complemento fue demostrado en enfermedades tisulares y se demostr la activacin del complemento en el lquido cefalorraqudeo (LCR) de pacientes con muchas de estas enfermedades. Presumiblemente, la inflamacin origina una ruptura de la barrera hematoenceflica con la penetracin local de protenas del complemento. Adems, algunas clulas sintetizan protenas del complemento. Hay evidencia de que la activacin del complemento puede estar implicada en el dao a la mielina, originando de este modo enfermedad tanto del sistema nervioso central como del perifrico. Tambin se demostr que el complemento estaba implicado en la enfermedad de Alzheimer y en la enfermedad de Pick. En la enfermedad de Alzheimer, un pptido derivado del amiloide y denominado [5A4 se une al Clq y activa el complemento en las placas seniles del cerebro enfermo. InteresanEl xito del trasplante de rganos ha creado un gran problema, la escasez de rganos humanos para satisfacer las demandas para un nmero de pacientes que no deja de crecer que lo estn esperando como tcnica quirrgica. Por lo tanto, muchos han propuesto el empleo de donantes animales como el cerdo en este campo como una lgica alternativa a los rganos humanos. Sin embargo, los rganos porcinos vascularizados son susceptibles de una intensa reaccin de rechazo, denominada rechazo hiperagudo. cuando son implantados en primales o en humanos (Platt. 1998; Dalmasso, 1992). Esta reaccin es mediada por anticuerpos que se unen a las clulas endoteliales y la activacin del complemento. Se demostr que la activacin del complemento era crucial en el dao tisular en la reaccin hiperaguda de los xenotransplantes. La activacin del complemento en las clulas endoteliales xenognicas origina su activacin (es decir, las clulas endoteliales adoptan un fenotipo procoagulante), que conduce a trombosis intravascular e intersticial y a hemorragia. Tal intensa reaccin se debe a la incapacidad de las molculas reguladoras del complemento asociadas a las clulas porcinas como el DAF, MCP y CD59 de controlar la activacin del complemento humano. Por lo tanto, el xito de esta prometedora intervencin teraputica recae en la capacidad de controlar la activacin del complemento. El papel del complemento en el rechazo de rganos huma-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA ficiosa no est claro y puede incluir el bloqueo de anticuerpos a travs de las interacciones idiotipo-antiidiotipo, el bloqueo de los receptores Fe para IgG en las clulas lagocticas, la modulacin de las funciones de las clulas T y B y la seleccin de repertorios inmunes. Sin embargo, la IVIG claramente tiene un efecto sobre el sistema del complemento (Frank, 1992). La IVIG ha demostrado interferir en la reaccin de shock dependiente de la via clsica de Frossm a n en los conejillos de Indias (Basta, 1989) y prolongar la supervivencia del xenomjerto cardiaco porcino en primates (Magee, 1995). Adems, el tratamiento con alias dosis de IVIG de pacientes con dermatomiositis inhibi el depsito de C3b y C5b-9 que normalmente se ve en los capilares del endomisio de estos pacientes (Basta, 1994). La IVIG inhibe la activacin del complemento a travs de su porcin Fe. El mecanismo exacto por el que la IVIG bloquea la activacin del complemento en la superficie del objetivo todava no se comprende completamente. Informes han demostrado que la IVIG puede prevenir el dao tisular mediado por el complemento interactuando directamente con el C 1 o previniendo la unin del C4 con la clula diana (Mollnes, 1995; Miletic, 1996).

nos (aloinjertos) es menos aceptado pero parece que la activacin del complemento contribuye de algn modo a los episodios de rechazo agudo y crnico (Baldwin, 1995).

UTILIDAD CLNICA DE LOS INHIBIDORES DEL COMPLEMENTO

La activacin del complemento contribuye indudablemente al dao lisular observado en una variedad de enfermedades humanas. Por lo tanto, el empleo de agentes que bloquean la activacin del complemento debe mostrar su utilidad para limitar el dao tisular. Desgraciadamente, no hay agentes disponibles para el uso en la prctica clnica. Se estn realizando investigaciones para desarrollar inhibidores del complemento que demuestren eficacia y seguridad. Ya que el complemento es fundamental en el control de la infeccin, un inhibidor del complemento adecuado no debera interferir con esta funcin del complemento. Tambin se sabe que el C3a y el C5a son potentes inductores de las reacciones inflamatorias. Por lo tanto, el inhibidor deseable deber actuar a nivel de la C3 convertasa clsica y alternativa para evitar la produccin de estas anafilotoxinas. Se han producido muchos inhibidores recientemente y estn siendo desarrollados actualmente. Nos centraremos solo en aquellos inhibidores que se muestran como promesas en el rea clnica. Para una descripcin ms completa de los recientes inhibidores desarrollados del sistema del complemento, se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Makrides, 1998; Wagner, 1998). Como se discuti previamente, el CR1 es un potente regulador tanto de la via clsica como de la alternativa del complemento. Acelera la desintegracin de las C3 y C5 convertasas de ambas vas y sirve como cofactor para la degradacin del C4b, C3b y iC3b mediada por el factor I. Por lo tanto esta molcula representa un excelente candidato para la inhibicin teraputica del sistema del complemento en los estados de enfermedad. Una forma recombmante soluble del CR1, denominada sCR1, fue producida y demostr mantener todas las propiedades de la protena nativa unida a la membrana. En una variedad de modelos animales de enfermedad humana donde se sabe que la activacin del complemento tiene un papel, el empleo del sCR1 mejora significativamente el proceso de enfermedad. Estos incluyen, entre otros: xenotransplante cardiaco de cerdo en monos cinomolgus (Pruitt. 1994). alveoltis en un modelo de reaccin pulmonar de Arthus (Mulligan. 1992), lesin tisular de isquemia/reperfusin miocrdica (Weisman, 1990), desmielinizacin en un modelo experimental de encefalomielitis alrgica en ratas (Piddlesden, 1994) y glomerulonefritis (Couser, 1995). El sCR1 ha entrado ahora en la fase I de los ensayos clnicos en pacientes con infarto de miocardio y en pacientes con SDRA inducido por quemaduras. Otro inhibidor del complemento que ha entrado tambin en la fase I de los ensayos clnicos es un anticuerpo humanizado de cadena simple contra el C5 humano. La ventaja de tal anticuerpo es que permite el bloqueo de la activacin del complemento sin liberar C5a y depositar C5b-9, lo que se sabe que promueve el potente dao tisular debido a la inflamacin y a la activacin celular. El anticuerpo monoclonal para el C5 demostr en modelos animales interferir en el rechazo hiperagudo de los rganos porcinos en sistemas de perfusin in vilro (Kroshus, 1995), para prevenir el desarrollo de artritis en un modelo de ratn de artritis inducida por colgeno (Wang. 1995), para disminuir la glomerulonefritis en un modelo de ratn de LES (Wang, 1996) y para disminuir el tamao del infarto en un modelo de rata con un modelo de lesin de isquemia/reperfusin miocrdica (Vakeva. 1999). EL anticuerpo anti-C5 humanizado demostr ser un potente inhibidor del sistema del complemento in vitro (Evans, 1995). Los resultados de los ensayos clnicos sugieren que este anticuerpo puede disminuir significativamente el dao al miocardio en los pacientes que sufren un bypass quirrgico cardiopulmonar Rollins, 1998). Las preparaciones de IgG humana purificada para el empleo intravenoso (IVIG) se han empleado en un nmero de enfermedades autoinmunes e inflamatorias como la prpura trombocitopnica idioptica, la enfermedad de Kawasaki, el sndrome de Guillain-Barr y la miastenia gravs (Dwyer. 1992). Sin embargo, el mecanismo exacto por el que la IVIG ejerce su accin bene-

ENSAYOS DEL COMPLEMENTO Principios generales

Estn disponibles los mtodos que permiten asegurar la determinacin de los niveles de cualquiera de los componentes de las vas clsica, alternativa y de la MBLectma, as como muchas enzimas y reguladores del sistema del complemento. Sin embargo, muchos de estos ensayos no estn disponibles en los laboratorios clnicos de rutina y estn restringidos los laboratorios de investigacin. Centraremos nuestra atencin sobre las tcnicas que n o requieren para su realizacin un laboratorio especializado en la investigacin del complemento. Para ms detalles relativos a mtodos que requieren tcnicas ms especializadas se remite al lector a otras publicaciones (Whaley, 1985: Dodds, 1997; Harrison. 1986; Giclas. 1997: Wrzner, 1997). Los ensayos sobre el complemento se pueden dividir en dos lipos: aquellos que miden las protenas del complemento como antigenos en los lquidos biolgicos y aquellos que miden la actividad funcional de un componente dado. Ambos tipos de tcnicas tienen ventajas e inconvenientes. Los mtodos de anlisis antignico (inmunoquimicos) generalmente son fciles de realizar. Estos ensayos antignicos con altamente especficos, requieren menos reactantes especializados, son ms baratos y se realizan en una cantidad de tiempo considerablemente menor. Los anticuerpos para las protenas del complemento humano y para las protenas purificadas del complemento humano estn comercialmente disponibles. El Linscott's Directory ol Immunological and Biological Reagents (1998) es una gua til para conocer los reactantes del complemento disponibles. Son sulicientes en estos ensayos, en los que pueden utilizarse tanto suero como plasma, los mtodos comunes de almacenamiento congelado (-20 C). Por esta razn, los ensayos antignicos son fcilmente adaptables al laboratorio clnico. Por otra parte, los ensayos antignicos no proporcionan informacin sobre la actividad de un componente ya que pueden detectar los productos de degradacin asi como los componentes funcionalmente activos. La presencia en suero de pequeos fragmentos de una proteina con actividad antignica puede confundir los resultados. Algunos ensayos antignicos emplean inmunodifusin radial. En estos ensayos, un fragmento proteico puede difundir ms rpidamente que la molcula pariente, lo cual puede originar niveles falsamente elevados. Como ejemplo, el ensayo antignico ms frecuentemente empleado para el C3 mide su principal producto de degradacin, el C3c. por inmunodifusin radial. Para mediciones seguras del C3c. la muestra debe guardarse a 37 C durante un nmero de das para permitir la completa conversin de C3 en C3c. En realidad, esto no se hace normalmente y por ello representa un motivo de error, aunque el error es pequeo y normalmente no tiene consecuencias clnicas. En general, los ensayos antignicos no son tan sensibles c o m o los ensayos funcionales y pueden no detectar niveles bajos de un componente presente en ciertos lquidos corporales. La sensibilidad de los ensayos antignicos en cierto grado de la concentracin del anticuerpo empleado, y con los ensayos habituales, puede medirse una cantidad de proteina antignica tan pequea como 10 pg/ml.

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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H a y kits disponibles que e m p l e a n la inhibicin de la unin de un sustraTabla 38-5 Amortiguadores e m p l e a d o s frecuentemente e n los to r a d i o m a r c a d op a r ad e t e c t a r varios pptidos del complemento. Estos e n s a y o s del complemento equipos estn disponibles para la medicin del C3a. C4a y C5a. La utilidad Soluciones stock* de estas m e d i c i o n e s todava est debatindose. Est disponible un infor1. Salino tamponado con Verona tslock 5 x VBS) m e detallado sobre los procedimientos de m e d i d a de la actividad ltica funDisolver 85 g de NaCI y 10.19 g de Na-5.5'dielil barbilurato en 1 . 5 I de cional y sobre los niveles antignicos de los c o m p o n e n t e s de la va alteragua destilada. Ajustar el pH a 7.350.05 con CIH IN y llevar hasta 2 l de volumen con aguda destilada Esta solucin es cinco veces la nativa (Minta, 1985). Tambin s eh a n descrito ensayos diseados para concentracin de una solucin isotmca y puede almacenarse a 4"C m e d i r la actividad funcional de los factores proteicos H e I de control en el durante al menos un mes. suero h u m a n o pero requieren reactantes especializados que pueden no 2. cido disodio etilendiaminetertetr actico 0.01 M (stock EDTA) e s t a r disponibles c o m e r c i a l m e n t e (Gaither. 1979). H a n sido desarrollados Disolver 37,2 g de Na-EDTA en alrededor de 600 mi de agua duslila e n s a y o s con ELISA para la medicin de productos de degradacin d e las da. Ajustar el pH a 7.650.05 con NaOH 2 N y llevar hasta I I de voluprotenas del c o m p l e m e n t o o para los complejos formados tras l a activamen con agua destilada El stock EDTA puede utilizarse durante al menos tres semanas con almacenaje a 4"C. cin del complemento. H a y equipos comercialmente disponibles (Quidel. San Diego. CA). Estos m i d e n los productos de degradacin de las prote3. Dextrosa con CaMg ' y gelatina (D5wg++) Disolver 100 g de dextrosa en 1 I de agua destilada. En un tubo sepanas del c o m p l e m e n t oam e d i d a que se generan tras la activacin del c o m rado disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentnp l e m e n t o empleando anticuerpos monoclonales especficos. L a activacin dolo hasta que los granulos de gelatina estn disueltos Aadir la del c o m p l e m e n t o por la va clsica p u e d e medirse siguiendo los niveles de solucin de gelatina a la solucin de dextrosa Aadir 2 mi de la soluC4d en suero frente a los de C4. Tambin, la medicin por ELISA de los cin stock 4 y 2 mi de la solucin stock 5 a la mezcla Ajustar el pH a 7 35+-0.05 con NaOH 1 N y llevar hasta 21 de volumen Esta solucin complejos C1r-Cls-C1 inh proporciona u n a medida de la activacin del puede emplearse durante una semana cuando se almacena a 4 C c o m p l e m e n t o a travs de la via clsica. L a activacin de la va alternativa 4. MgCI. 1 M p u e d em e d i r s ep o rE L I S A evaluando los niveles de los complejos Bb, o Preparar 100 mi de solucin que contenga MgCI, 2 M aproximadaC3BbBP o C3bP en la circulacin (Mayes, 1984). Se inform de que las mente. Medir la gravedad especilica de la solucin y determinar la m e d i c i o n e s de dichos complejos cuantifican tan p o c oc o m o 10 a 20 ng/ml concentracin de MgCI.. del Handbook ol Chemistry and Physics' de C 3 b P en suero. Este ensayo puede tambin emplearse para medir los (tablas de conversin para valores concentrados de soluciones acuoc o m p l e j o s de activacin unidos a la superficie. L a activacin a travs d e sas) A|ustar la concentracin a 1 M aadiendo agua destilada Almacenar a 4C. cualquier via p u e d e monitonzarse midiendo los niveles de iC3b o de la lor5. CaCl 0.15 M m a soluble del complejo de ataque a la membrana. sC5b-9. Adems, los Se preparan 100 mi de una solucin de CaCK.3 M aproximadamente kits de ELISA estn disponibles para m e d i r la generacin de anafilotoxmas Medir la gravedad especilica de esta solucin y determinar el CaCl, en sueroplasma. Y a que el C3a y el C5a son rpidamente convertidos en como se describe arriba Ajustar a 0 1 5 M aadiendo agua destilada s u sf r a g m e n t o s desArg inactivos p o r carboxipeptidasa-N en el suero, estos Almacenar a 4"C. e n s a y o s emplean anticuerpos monoclonales especficos para el C3a-desArg y el C5a-desArg. Debido a su alta sensibilidad, estos ensayos con ELI- Soluciones de trabajo 1. VBS isolnico con gelatina y metales (GVBS++) S A proporcionan una herramienta excelente para evaluar la activacin del Aadir 200 mi de la solucin stock 1 (arriba) a 700 mi de agua destilac o m p l e m e n t oe n los lquidos biolgicos a travs lanto d e la via clsica da en un malraz alorado de 1 I de volumen Aadir 1 mi de la solucin c o m o de la va alternativa. Sin embargo, estos equipos generalmente s o n stock 4 y 1ml de la solucin stock 5. Disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentando como se describi en la solucin stock caros y requieren que el usuario establezca una curva de dilucin estn3. Aadir la solucin de gelatina y ajustar el pH a 7.350.05 Llevar dar. P o r lo tanto, en un solo kit se puede incluir u n a cantidad limitada de hasta 1 I de volumen con agua destilada El GVBS++ debe prepararmuestras. se en Iresco una vez cada semana
2. Dextrosa-VBS Da en iones con metales y gelatina (DGVBStt)

Evaluacin funcional de la va clsica L o se n s a y o s funcionales del c o m p l e m e n t os o nh e r r a m i e n t a s sensibles y p r e c i s a sp a r a proporcionar informacin sobre la actividad de un c o m p o n e n t e . A l g u n o s de e s t o s mtodos p u e d e n utilizarse p a r a cuantificar la actividad del nivel m o l e c u l a r , y otros p a r ae x p r e s a r la funcin del c o m p l e m e n t o en unidad e s arbitrarias. L o s reactantes c o m e r c i a l e s estn disponibles p a r a valorar c a d ac o m p o n e n t ed e las vias clsica y alternativa. Sin embargo, p a r a la m a y o r parte, estos e n s a y o s son desarrollados en un limitado nmero de centros de investigacin. M u c h o se n s a y o s funcionales requieren procedimientos q u er e q u i e r e nt i e m p oyc o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o relativamente m u y purificados, q u es o n ms caros q u e aquellos requeridos p o r los e n s a y o s antignicos. Por l o tanto, se limitar la descripcin d e los e n s a y o s del c o m p l e m e n t o a los mtodos d e referencia para la evaluacin de la activacin t a n t o de la via clsica c o m o de la alternativa. Los a m o r t i g u a d o r e s que se e m p l e a n f r e c u e n t e m e n t e en la mayora de los laboratorios d o n d e se desarrollan los e n s a y o s del c o m p l e m e n t os e describen e nl aT a b l a 38-5. U n od e b e darse c u e n t ad e que la preparacin precisa de estos amortiguadores e s crtica ya que c a m b i o s en la molaridad y en la concentracin del ion m e t a lp u e d e n afeelar a los ttulos obtenidos.

Los amortiguadores de diferentes potencias inicas son preparados mezclando la solucin stock 3 con la solucin de trabaio 1. El DGVBS++ 0,065 u se prepara mezclando tres partes de la solucin citada primero con dos partes de la segunda solucin. El DGVBS+t debe prepararse en Iresco.
3. EDTA-VBS isotmco (EDTA-GVBS)

Preparar el GVBS como en la solucin de trabajo 1 con la excepcin de utilizar 600 mi de agua destilada en lugar de 700 mi Ademas, las soluciones 4 y 5 no se aaden a esta solucin. Aadir 100 mi de la solucin stock 2 y ajustar el pH a 7.35 t 0,05 Llevar a un volumen de 1 i con agua destilada Esta solucin es estable durante al menos una semana a 4C
4. VBS isotnico con glicol etilen bis (b-aminoetil ter) N. N N. N acido tetraacetico e iones Mg- (EGTAGVBS+)

Aadir 50 mi de la solucin stock a 1 a 100 mi de agua destilada en un matraz aforado de 250 mi de volumen Aadir 1.25 mi de la solucin stock 4 Disolver 0 25 g de gelatina en 25 mi de agua destilada calentando como se describi en la solucin de Irabaio 1 y aadir a la solucin. Preparar una solucin stock EGTA aadiendo 0.761 g de E G T Aa 5 mi de agua destilada Disolver E G T A con NaOH 5 NI A|ustar el pH a 7,350.05 con acido actico al 5% y llevar a un volumen de 10 mi con agua destilada Aadir esa solucin stock de EGTA a la solucin de trabajo Ajustar el pH a 7,35t0,05 y llevar a un volumen de 250 mi con agua destilada El EGTA-GVBS+ debe prepararse en Iresco. I"L a s soluciones s t o c k 1. ? y 3 d e b e na l m a c e n a r s e de 20"C a -50"C d u r a n t e un

L o se n s a y o sq u em i d e nl a actividad hemolitica total e nu n am u e s t r a( C H 5 0 ) periodo de lempo indefinido * De W e s tR C (ed) CRC H a n d b o o k Ol C h e m i s t r y and F h y s i c sB o c a Ratn FL. CRC o la actividad funcional de los c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o aislados en Press 1985-t986. con permiso g e n e r a le m p l e a n eritrocitos d e oveja c o m o objetivos d el a lisis m e d i a d ap o re l c o m p l e m e n t o .L o s eritrocitos de oveja s o n ms sensibles a la lisis p o r antic u e r p o sym e d i a d ap o r el c o m p l e m e n t oq u e los eritrocitos de otras especies. a d e c u a d o s estn c o m e r c i a l m e n t e disponibles. La activacin de la via alternaAdems, estos eritrocitos expresan un glicoesfingolpido (antgeno de Forsstiva del c o m p l e m e n t os em i d e fcilmente e m p l e a n d o eritrocitos de conejo. m a n )q u ep r o v o c au n ar e s p u e s t ap o t e n t ed e los anticuerpos e nc o n e j o su n a E s t a s clulas son particularmente sensibles a la lisis i n d e p e n d i e n t e de antiv e zi n m u n i z a d o se s t o sa n i m a l e sc o n eritrocitos d e oveja. L o sa n t i c u e r p o s c u e r p o sm e d i a d ap o r el s u e r oh u m a n o .

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA tos de oveja sensibilizados con anticuerpos (EA) anti-Forssman de conejo. Como se describi anteriormente, este antgeno es altamente inmungenc e induce una respuesta de anticuerpos fuerte y especifica en los conejos inmunizados. El procedimiento para producir este anticuerpo fue descrito con detalle por Mayer (1961). Antes de utilizarlo, la actividad del complemento del antisuero es destruida por la inactivacin con calor a 56 C durante 30 minutos. Los mtodos para la titulacin del anticuerpo y para la preparacin de las clulas ptimamente sensibilizadas se explican en otras obras (Gaither, 1984). Es esencial que se utilice suficiente anticuerpo para sensibilizar a los eritrocitos de oveja de modo que pequeas diferencias en la cantidad de anticuerpo sensibilizado no afecten al titulo. Los eritrocitos de oveja sensibilizados con cantidades ptimas de anticuerpo se denominan EA Los componentes intermediarios de la clula con componentes del complemento unidos a la membrana, que se utilizan en la titulacin funcional individualizada de los componentes, pueden prepararse utilizando componentes de complemento purificados Los mtodos para la preparacin de estos intermediarios celulares ya se han descrito (Gaither, 1984).

Manejo de las muestras

El correcto manejo de las muestras es crtico para el correcto anlisis funcional del sistema del complemento. Par la mayora de los ensayos funcionales, se prefiere el suero al plasma para el anlisis ya que los quelantes del calcio como el EDTA o la heparina pueden ser no complementarios. Cuando las muestras son diluidas ms de 1:100 en los ensayos funcionales, el EDTA del plasma puede emplearse ya que la dilucin sobrepasa el electo quelante. Para obtener el suero para los ensayos funcionales, la sangre debe dejarse coagular durante 30 minutos a una hora a temperatura ambiente y despus en hielo durante al menos una hora. Si se necesitan estudios del fijador de C1q. se de|a la muestra coagular durante dos horas a temperatura ambiente. En este caso, la polimerizacin completa del cogulo parece facilitar la precisin del ensayo. Para separar el suero, se recoge el cogulo y se centrifuga de 0 a 4 C durante 5 minutos. Si se sospecha la existencia de anticuerpos cnoprecipitantes. la centrifugacin y formacin del cogulo de la muestra debe hacerse a 37 C ya que puede ocurrir la fijacin del complemento si la muestra se enfra. En ciertos casos, la congelacin disminuir los ttulos de complemento considerablemente. Aunque las razones de esto son desconocidas, debe tenerse en menEnsayo del complemento hemoltico total te que un ttulo considerablemente disminuido de complemento slo puede reflejar un artefacto de una preparacin srica inadecuada. Si se sospecha El ensayo ms simple sobre la va clsica mide el complemento hemoltico esto, el suero debe prepararse a 37 C invariablemente para evitar la activacin total. La ausencia de cualquiera de los nueve componentes, como ocurre en del complemento. Las muestras de suero o plasma deben dividirse en varios los pacientes con dficit gentico homocigotos. generalmente origina un ttuvolmenes pequeos y almacenarse inmediatamente a una temperatura de lo de complemento hemoltico total (CH50) de cero. Sin embargo, un valor -40 C a -80 C Las proporciones pueden almacenarse durante largos perionormal no excluye niveles disminuidos de los componentes individuales. dos de tiempo a -80 C o durante cortos periodos a -20 C sin prdida de la Cuando la historia y los sntomas de un paciente sugieren una posible defiactividad. Cuando los sueros deban transportarse, deben sellarse bien antes ciencia, deben pedirse los ttulos hemolitico y anlignico de los componentes de empaquetarse en un contenedor con grandes cantidades de hielo seco. individuales. A menudo, el ttulo de CH50 ser una medida funcional adecuada de la actividad del complemento.

Preparacin de eritrocitos
La sangre de oveja estril se obtiene de una solucin estril de Alserver. La sangre anticoagulada se almacena a 4' C durante una semana antes de utilizarse y puede emplearse durante un mximo de seis semanas si se mantiene estril. La edad de las clulas afecta mucho a los ttulos de la mayora de los componentes del complemento, y los ttulos pueden ser falsamente bajos si se utilizan clulas frescas. En condiciones estriles, se extrae aspticamente y se centrifuga a 4 C un volumen de clulas. Se extraen el sobrenadante y la capa leucocitaria. y se remtroducen las clulas en una solucin tampn adecuada. Los detalles del lavado y sensibilizacin de las clulas con anticuerpos se pueden ver en otras obras (Gaither. 1984). En caso de la via alternativa, se extrae aspticamente sangre de coneio en tubos con EDTA y se procesa c o m o la sangre de oveja.

Preparacin de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos

Muchos trabajadores que publican titulaciones funcionales de componentes individuales o el ttulo de complemento hemoltico total emplean eritroci-

El titulo de complemento se expresa en unidades CH50 iei reciproco de la dilucin de la cantidad de complemento que lisa el 50% de EA). Se preparan diluciones seriadas de la muestra y se aaden al EA (Tabla 38-6). En este caso, el punto linal del 50% se determina por la transformacin de los datos de Von Krogh. Esta frmula derivada empricamente convierte la curva dosis-respuesta en forma de S en una funcin lineal. Se calculan los valores de / / 1 - / donde Yes la fraccin de glbulos rojos usados en el test de dilucin. Se construye una grfica en donde se representa el logaritmo del volumen relativo del complemento frente a los valores del logaritmo de V'1-V. Normalmente, se obtiene una lnea recta, y el titulo se calcula determinando el volumen relativo de complemento donde Y/T-Y= 1.0 (o 50% de la tisis) Esle valor se divide p o r el reciproco de la dilucin srica original (1:60 para el suero humanoi para calcular la concentracin de complemento srico que lisa el 50% de las clulas El ttulo de complemento representa el nmero de unidades hemoliticas 50% que estn presentes en 1 . 0 mi de suero no diluido (Mayer. 1961: Rapp. 1970). El suero de los conejillos de Indias con dficit de C4 est disponible comercialmente y es de utilidad para determinar la actividad funcional del C4 en una muestra. El mtodo se describe en otras obras (Gaither, 1984). En un nmero limitado de laboratorios est disponible el suero de humanos y conejillos de

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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Tabla 38-7 Titulacin funcional de la va alterna (ensayo AH50)

'Si una muestra se suero muestra algn grado de hemolisis (color rojizo), se prepara un sel de lubos adicionales (1 a 5) que contengan suero y amortiguador pero no E A la hora de calcular Y los valores de OD obtenidos con esta sene de lubos se sustraen de aquellos de las diluciones del suero de la muestra que estn mezclados con E E G T A GVBS+ = salmo isotnico tamponado con Veronal con gelatina, E G T A y MgCI.; E = eritrocitos; EDTA-GVBS = salino isotnico tamponado con Veronal con EDTA; CB = E solo con lampn; CL = E con agua destilada (lisis completa).
:

I n d i a s con dlicil de C2 y el de c o n e j o s con dficit de C6. E s t o s sueros son u n aa c e p t a b l e alternativa al e m p l e o de intermediarios celulares para titular los c o m p o n e n t e s individuales, ya que solo tienen la prdida de una protena del c o m p l e m e n t o , Ensayo de la va alterna

En e s t e ensayo, el s u e r oh u m a n o( n o r m a l m e n t e diluido primero a 1:5) se diluye s e r i a d a m e n t e y se aade a eritrocitos de conejo que no estn sensibilizados con un anticuerpo especfico en un tampn que contiene iones m a g Prueba de fijacin del complemento n e s i o y cido etilenglicol tetraactico (EGTA) para quelar los iones calcio (los Se dispone de una descripcin detallada de este e n s a y o (Mayer. 1961), y i o n e s calcio son necesarios p a r a la activacin de la via clsica, no p a r a la actiaqu no se detallar. Sin embargo, ya que las reacciones de fijacin del c o m vacin de la via alternativa) (Pangburn, 1988) ( T a b l a 38-7). El ttulo de la va l e m e n t o son de gran importancia en el diagnstico clnico, s e tratarn brealternativa se d e n o m i n aA H 5 0 y representa la dilucin final del suero h u m a n o p vemente. La tcnica de la p r u e b ad e p e n d e de la c a p a c i d a d del c o m p l e m e n t o en el e n s a y o que lisa el 50% de los eritrocitos de conejo. Se crea una grfica del suero fresco de i n t e r a c c i o n a r con c o m p l e j o s antgeno-anticuerpo. En la similar a la descrita p a r a la litulacin del c o m p l e m e n t o hemoltico total para primera e t a p a de la reaccin, el c o m p l e m e n t o es i n c u b a d o con los m a t e r i a l e s d e t e r m i n a r el AH50. El suero h u m a n op u e d ep o s e e rav e c e s anticuerpos que p u e d e nc o n t e n e r el antigeno y el anticuerpo. Si se f o r m a nc o m p l e j o s ant"naturales" p a r a un c a r b o h i d r a t oe x p r e s a d oa m p l i a m e n t e en las clulas d e o ne lc o m p l e m e n t o del m i s m om o d oq u e los o t r a se s p e c i e s diferentes de los h u m a n o s y de los primates. Si se m e z c l au n a geno-anticuerpo, interaccionan c c o m p l e j o s de a n t i c u e r p os o b r e el a n t i g e n o de superficie c e l u l a ri n t e r a c c i o n a n alta concentracin de suero con los eritrocitos de c o n e j os ep u e d e inducir la c o n el c o m p l e m e n t o . El c o m p l e m e n t o es activado, los c o m p o n e n t e ss o n fragaglutinacin, que p u e d e alterar la interpretacin del titulo de A H 5 0 (Tomlinson, m e n t a d o s , y el c o m p l e m e n t o es "utilizado" o "fijado". En la s e g u n d a etapa, se 1997). P o r lo tanto, p u e d e ser til a b s o r b e r el suero con c o n c e n t r a d o de erie z c l a se i n c u b a a 37 C trocitos de c o n e j o lavados en hielo d u r a n t e 15 a 30 m i n u t o sp a r ae x t r a e ru n a aaden las clulas de oveja sensibilizadas (EA). y la m durante u n a hora. Si el s u e r o de la p r u e b ac o n t i e n e el a n t i c u e r p oc o n t r a el cierta proporcin de anticuerpos naturales, d i s m i n u y e n d o asi la aglutinacin antgeno utilizado, el c o m p l e m e n t o se lija y p o r lo tanto no est disponible pac e l u l a r en el ensayo. ra lisar el EA. Por ello, la a u s e n c i a de lisis indica una reaccin positiva, y la lisis c o m p l e t ai n d i c a un resultado negativo. Niveles del complemento mediante H a y dos aproximaciones generales de las pruebas de fijacin del c o m p l e ensayos antignicos m e n t o . En la primera, el s u e r oc o n c e n t r a d o es el que p r o p o r c i o n a el c o m p l e m e n t o , y la cantidad de c o m p l e m e n t o fijado se d e t e r m i n a por la titulacin del P a r a utilizarla en e n s a y o s antignico, la m u e s t r a (ya sea suero o plasma) suero antes y despus de la fijacin. En la segunda, se e m p l e au n a dilucin s ea l m a c e n a congelada (20C o menos). La contaminacin bacteriana puede s u e r oq u e proporciona suficiente c o m p l e m e n t op a r a la lisis de EA o p o c o de originar la desnaturalizacin o la fragmentacin de las protenas, m i e n t r a s i n c o unidades CH50) En este caso, se aaden las q u e el hielo y el deshielo no tienen un electo a d v e r s oi m p o r t a n t es o b r e los ms del suficiente (tres a c clulas sensibilizadas sin dilucin posterior d e la c a n t i d a dd ec o m p l e m e n t o . niveles antignicos. En ciertos e n s a y o s del c o m p l e m e n t o , la m u e s t r a se diluLa incubacin del material del test con el c o m p l e m e n t op u e d eh a c e r s e a 37 C ye en salino para o b t e n e r el ndice correlo de concenlracin para la adecuadurante una hora o t o d a la n o c h e en fri. En general, la incubacin en fri orida cuantificacin. gina ttulos mayores. El c o m p l e m e n t op u e d ea c t i v a r s ep o r un nmero d e L o s anlisis antignicos d e las proteinas del c o m p l e m e n t oh a c e n uso de a g e n t e s diferentes de los c o m p l e j o s antgeno-anticuerpo c o m o las bacterias, una de las m u c h a s tcnicas de precipitacin inmune. La inmunodifusin radial e n d o t o x i n a s y y-globulinas agregadas. P o r lo tanto, s o nn e c e s a r i o sl o sc o n s i m p l e (RID) utilizando el mtodo ya sea de F a h e y o de Mancini es el mtotroles p a t ad e m o s t r a r que ni el suero ni el antgeno aislados fijarn el c o m do e m p l e a d o ms frecuentemente para calcular una cuantificacin especfica plemento. El test de fijacin del c o m p l e m e n t oe s de particular v a l o r en t a n t o d eu n a protena. En a m b o s mtodos, el antgeno se aade a los pocilios en que n o n e c e s i t a que l o s anti g enos o l o s a n t i c u e r p o s estn p r e s e n t e s en su un gel q u ec o n t i e n e anticuerpo, y se f o r m a n anilos de precipitacin. El mtof o r m aa l t a m e n t e purificada. P u e d e n utilizarse tanto antgenos solubles c o m o do de F a h e ye m p l e a un anticuerpo que no est en exceso. El t i e m p o de difuparticulados, y se p u e d e nm e d i rt a n t o los antgenos c o m o los anticuerpos. sin al que los r e s u l t a d o s son ledos es por ello crtico. Los p u n t o s de difusin o m p l e m e n t o es el e m p l e o finales no se alcanzan y p u e d e n levar a m e d i c i o n e si n a d e c u a d a s de los nive-Una aproximacin alternativa al test de fijacin del c de e n s a y o s con ELISA que m i d e n los p r o d u c t o s de fragmentacin de las proles del c o m p l e m e n t o antignico. El mtodo de M a n c i n i utiliza un e x c e s o de tenas del c o m p l e m e n t o o de los c o m p l e j o sf o r m a d o s tras la activacin del a n t i c u e r p o en un gel y es ms sensible y exacto. El mtodo de M a n c i n i se uticomplemento, c o m o se discuti previamente. De cualquier m o d o , estos ensaliza p o rm u c h a s firmas c o m e r c i a l e sp a r a la preparacin de los cristales de

inmunodifusin. Existen disponibles equipos de inmunodifusin radial p a r a todos los c o m p o n e n t e s de la va clsica y alternativa. E s t o s equipos consisten e n cristales cubiertos d eu n a tina c a p ad ea g a r o s aa l2 %q u ec o n t i e n e n anticuerpos monoespecficos. El suero proteico estndar (un pool estabilizad od e suero h u m a n o normal) s e suministra, normalmente, e n soluciones prediluidas. C a d a solucin estndar contiene una cantidad especfica de la protena que s e est m i d i e n d o para su uso en la construccin d e la c u r v ad e referencia.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA efectos vasculares. La des-Arg bradicinina entonces es degradada por la enzima convertidora de angiolensma para formar pptidos de bajo peso molecular que pierden su actividad biolgica. Los inhibidores del sistema de generacin de cininas incluyen el C1 inhibidor, la ,-macroglobulina, y el .-proteasa inhibidor El Cl inhibidor y la -macroglobulina son los principales inhibidores de la calicreina activa, ejerciendo el C1 inhibidor la influencia ms potente. El C1 inhibidor y la ,-proteasa son los dos principales inhibidores del laclor de Hageman activo. El angioedema hereditario resulta de la deficiencia gentica o adquirida del C1 inhibidor. Se cree que las caractersticas clnicas asociadas con esta enfermedad surgen de la prdida del control adecuado del sistema de generacin de cininas por el C1 inhibidor (Cugno, 1998: Davis. 1998) Tambin existen en el plasma los qumingenos de bajo peso molecular y pueden actuar como sustrato de la bradicinina. Los qumingenos no son fciles de degradar por la calicreina del plasma, pero las calicreinas tisulares presentes en las clulas pueden degradar el quiningeno de ba|0 peso molecular a bradicinina con una lisina adicional unida. Presumiblemente, la lisil-bradicinna sufre la misma va de degradacin que la bradicinina, Se ha postulado que la bradicinina juega un papel en una variedad de enfermedades. La bradicinina y la lisil-bradicinina libres se han encontrado en el fluido nasal en la rinitis. Tambin se ha sugerido un papel patognico para la bradicinina en enfermedades que van desde el asma al angiodema hereditario, asi como otras clases de enfermedades edematosas incluyendo la inflamacin. Est claro que no se conoce totalmente el papel exacto del sistema generador de cininas en las enfermedades. Sin embargo, la brad cinina y sus derivados indudablemente son importantes en el edema y el dolor asociados con la inflamacin.

yos utilizan equipos comerciales que generalmente son caros comparados con la prueba de fijacin estndar.

CININAS Y SISTEMA DE GENERACIN DE CININAS

El sistema de generacin de cininas es una va mediadora secundaria presente en el plasma y activa en las superficies celulares que controla la generacin de pptidos que son importantes en la respuesta inflamatoria. Aqu ser descrito brevemente. Para ms detalles, se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Kozin. 1992: Sharma. 1990: Vio. 1998; Margolius. 1995). El pptido biolgicamente activo ms importante generado por este sistema parece ser la bradicinina, un nonapptido con potente actividad en muchos sistemas biolgicos. Es activa en aumentar la permeabilidad vascular, vasodilatacin, hipotensin, induccin del dolor, contraccin de muchos tipos de clulas musculares lisas, y activacin del sistema de la fosfolipasa A, con su funcin de activacin del metabolismo del cido araquidnico celular. Aunque en muchas cosas se parece al sistema del complemento, el sistema de generacin de cininas del plasma es ms simple debido a que est compuesto solo por cuatro protenas plasmticas. Los elementos tisulares tambin generan cininas. Las principales protenas del sistema de generacin de cininas comprendidas actualmente son el factor de Hageman. el factor de coagulacin XI, la precalicrena y el quiningeno de alio peso molecular. El factor XI circula en el plasma como un complejo con el quiningeno de alto peso molecular con una relacin molar de 2:1. La precalicrena tambin circula en un complejo con el quiningeno de alto peso molecular con una relacin molar de 1:1. En contraste, el factor de Hageman circula como una protena plasmtica de cadena simple, no formando complejos. Al igual que en la secuencia de activacin del complemento, la secuencia de generacin de cininas sigue una va especfica. Interaccionando con superficies con carga negativa, como aquellas conseguidas experimentalmente con cristal o naturalmente con muchos materiales activos biolgicamente como el lipido A de la endotoxina de las bacterias Gram negativas, el factor de Hageman es degradado y activado. El factor de Hageman degradado (uHFa) tiene actividad proteoltica y despus activa y degrada las molculas del tactor de Hageman adicionales para generar ms aHFa. La degradacin de la cadena simple del factor de Hageman (peso molecular de 80 kDa) libera las cadenas pesada y ligera (pesos moleculares de 50 y 28 kDa. respectivamente) que permanecen unidas por enlaces disulfuro. El lugar enzimtico activo del factor de Hageman reside en la cadena ligera. Muchas enzimas proteolticas, incluyendo la calicreina. pueden degradar y activar al factor de Hageman. El HFa mteracciona con el complejo del factor XI y el quiningeno de alto peso molecular para activar el factor XI a factor Xla, originando la activacin de la cascada intrnseca de la coagulacin. El HFa tambin interacciona con el complejo quiningeno de alto peso molecular-precalicreina para degradar la cadena simple de la precalicrena en una molcula de dos cadenas, la calicreina. con las cadenas unidas por puentes disulfuro. La precalicrena degradada tiene actividad enzimtica proteoltica localizada en la cadena de menor peso molecular. Todas estas degradaciones ocurren mucho ms eficazmente cuando las protenas se unen a superficies cargadas negativamente, las cuales son crticas para la activacin de la cascada. La calicreina activada degrada al qummogeno de alto peso molecular en muchos lugares, liberando bradicinina. La calicreina activa, generada por la degradacin de la precalicrena, tambin es capaz de degradar posteriormente el HFa a un producto de menor peso molecular con una cadena ligera intacta, la |iHFa. La |iHFa puede degradar y activar al complejo quiningeno de alio peso molecular- precalicrena pero no permanece en la superficie de unin y no interacciona eficazmente con el complejo quiningeno de alto peso molecular-factor XI. La bradicinina tiene una vida media corta ya que se inactiva rpidamente por la carboxipeptidasa-N. la cual elimina la arginina carboxi-terminal para formar des Arg bradicinina. Esta molcula ya no tiene la actividad de la bradicinina de contraer el msculo liso y no puede inducir la salida de lquido vascular cuando es inyectada en la piel Sin embargo, conserva algunos de sus

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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SECCIN V

INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOIOGIA

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CAPTULO 38

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C A P T U L O

39

Gtocinas y molculas de adhesin

H. Davis Massey, M.D., Ph.D., D.D.S. Richard A. McPherson, M.D.

CITOCINAS lnterleucina-1 lnterleucina-2 lnterleucina-3 lnterleucina-4 lnterleucina-5 lnterleucina-6 lnterleucina-7 lnterleucina-8 y las quimiocnas lnterleucina-9 lnterleucina-10 lnterleucina-11 lnterleucina-12 lnterleucina-13

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lnterleucina-14 lnterleucina-15 lnterleucina-16 lnterleucina-17 lnterleucina-18 Factor transformante del crecimiento |i Factor de necrosis tumoral Interfern-y MOLCULAS DE ADHESIN CELULAR Integrinas Selectinas PERSPECTIVAS BIBLIOGRAFA 924 924 922

CITOCINAS
La secrecin y la unin de las citocinas es el equivalente celular a estar "en lnea". El entorno predominante de citocinas en un organismo forma un Internet" de comunicacin entre las clulas. Las seales de las citocinas son recibidas sobre la superficie celular y no slo como simples mensajes, sino tambin como combinaciones complejas e imperceptibles sinrgicas y antagnicas que regulan procesos como la respuesta inmune, la migracin celular y la cicatrizacin de las heridas. Para responder a los mensajes especficos de las citocinas, las clulas despliegan miles de receptores de superficie de citocinas, presentados como mltiples antenas. Utilizando estos receptores, las clulas seleccionan, procesan y responden a combinaciones de citocinas solubles y de unin a sustratos de manera dependiente de la densidad y el estado de activacin de los receptores de superficie. El trmino "citocina" se refiere a los productos solubles de las "clulas" en senlido genrico. Muchos tipos celulares son capaces de producirlas, pero para la mayor parte son la clula T y el macrfago las factoras virtuales de citocinas. y por esta razn muchas familias de citocinas se conocen como interleucinas (IL). Aunque los bioanlisis son a veces el mtodo de referencia para la deteccin de la actividad de las citocinas, normalmente llevan mucho tiempo y son difciles de realizar en un laboratorio de hospital. Los equipos de ensayo con enzima fijada a inmunoabsorbente (ELISA) estn ampliamente disponibles para muchas de las citocinas descritas en el texto. Las tcnicas moleculares (reaccin en cadena de la polimerasa [PCRJ. hibridacin n situ) se emplean en laboratorios ms modernos para identificar la presencia de citocinas con alta sensibilidad y para localizar ms precisamente una citocina de un tipo celular particular. En los aos recientes la lista de citocinas se ha ampliado, pero slo se presentan aquellas para las que se conoce suficiente informacin.

lnterleucina-1
La familia de citocinas de la IL-1 contiene tres protenas: la IL-1r/. y la IL-1|3 (los dos componentes agonistas), y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 RA), un antagonista especfico de receptor que ocurre naturalmente (Dinarello, 1998). Los tres genes separados que codifican estas citocinas proinflamatorias han sido mapeados en el brazo largo del cromosoma 2. La IL-1a y la I L 1 1 5 son sintetizadas como protenas precursoras intracitoplasmticas de 31 kDa que son degradadas para generar las formas biolgicamente activas de 17 kDa. La pro-IL-1a es convertida en su forma activa a travs d e la accin de proteasa extracelulares, aunque la proforma no degradada puede estimular el crecimiento autocrino cuando es liberada por los queratinocitos, por las clulas T colaboradoras tipo II (Th2) o por los timocitos. La pro-IL-l f 5 se convierte intracelularmente en su forma biolgicamente activa por la enzima convertidora de IL-1|i (ICE), una enzima asociada a la apoptosis. Se han descrito dos receptores de IL-1: un receptor tipo I de 80 k D a ampliamente expresado {IL-1 Rl) que transduce la seal cuando se une tanto a IL-1 a como a IL-1 p, y un receptor tipo II de 67 kDa ms restringido (para neutrfilos, monocitos y clulas B) (IL-1RII). El II1-RII no transduce la seal intracelular, incluso cuando se une a su ligando preferido, la IL-1 (5, y por lo tanto se ha descrito como un receptor "seuelo" que acta como un "escondite" para las molculas de IL-1 (i Una vez unido a su ligando el IL-1 Rl se asocia con una proteina accesoria (IL-1 RAcP). Juntos sealizan el ncleo a travs de muchas vas de cinasas de protenas asociadas a macrotbulos (MAP) que activan los factores de transcripcin nuclear incluyendo el factor nuclear (NF) K(. entre otros (O'Neill, 1996). La molcula antagonista IL-IRA es capaz de unir IL-1RI y IL-1 RH. pero no inicia la seal de transduccin intracelular. Como regulador primario de las respuestas inmunes e inflamatorias, la IL-1 exhibe miles de efectos biolgicos (Rosenwasser, 1998). Optimiza el

CAPTULO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

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complejo mayor de histocompatibilidad antgeno.'receptor de clulas T (MHC/TCR) mediando la activacin de las clulas T como un componente importante de seal no conocida, y aumenta la actividad de las citocinas derivadas de la clula T como la IL-2 a travs de la regulacin a la alta del receptor de IL-2. La IL-I estimula la proliferacin de la clula progenitora hematopoytica (CPH) en sinergia con los factores estimulantes de colonias hematopoyticos, y cuando se administra aislada moviliza neutrofilia derivadas de la mdula sea. Las evidencias indican un papel para la IL-1 en promover el crecimiento y proliferacin de algunas lineas celulares leucmicas, pero es citotxica directamente para algunas clulas mlecladas por virus y para algunas clulas tumorales. La capacidad de la IL-1 de estimular el metabolismo del cido araquidnico empleando eicosanoides como la prostaglandina E, y los leucotnenos como intermediarios, y su capacidad para inducir la produccin y liberacin de cantidades de otras citocinas explica gran parte de su actividad proinflamatoria. En los lugares de inflamacin, la IL-1 origina una regulacin a la alta de los receptores de molculas de adhesin sobre el endotelio vascular y estimula la produccin de quimiocinas conduciendo a la acumulacin local de leucocitos. En situaciones de alergia como la hipersensibilidad Tipo 1, la IL-1 puede aumentar la liberacin de histamina de los basfilos y eosinfilos, contribuyendo esto a la broncoconstriccin al estimular al msculo liso vascular. La IL-1 es responsable de la produccin de reactantes de fase agua por el hgado (p. ej.. complemento, pplido C reactivo) a expensas de protenas transportadoras como la albmina. Para pagar el coste de los aminocidos de la sntesis masiva de pptidos, la IL-1 promueve la ruptura muscular, acontecimiento que explica la mialgia que acompaa a algunas enfermedades. La IL-1 contribuye a la dilatacin vascular y a la hipotensin en el choque sptico a travs de la induccin de xido ntrico (NO) en las clulas endoteliales. y tambin puede ser un significativo mediador del choque cardiognico. En el sistema nervioso central (SNC). la IL-1 promueve la fiebre, la aorexia, el sueo de ondas lentas y la letargia, as como la liberacin de corticodes del hipollamo. En los lugares articulares, la IL-1 promueve la proliferacin de clulas sinoviales. el depsito de colgeno, la resorcin del cartlago y el hueso; acciones que tienen implicaciones en enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide (AR). Cuando se administra en humanos en dosis bajas, la IL-1 origina profundas reacciones febriles y hipotensoras similares a las inducidas por las dosis bajas de endoloxinas. Hay un leve aumento acompaante de la hematopoyesis, que puede disminuir el punto ms bajo y acortar el periodo de supresin medular en los que reciben quimioterapia supresora medular (lizumi. 1991). Sin embargo, el efecto beneticioso de la administracin de IL-1 est limitado por su profunda toxicidad. Un nivel elevado de IL-IRA puede ser ms sensible como marcador de actividad de enfermedad que las elevaciones de cualquier isoforma de IL-1. El aumento de los niveles de IL-1 RA se observa tras el infarto de miocardio, los procedimientos de ciruga general, y en personas asintomticas que tienen el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1). Adems, la severidad de la enlermedad a menudo es mejor indicada por los niveles de IL-1 RA que por los niveles de IL-1. Esto puede ser cierto en enfermedades del hgado, en estados autoinmunes y en enfermedades infecciosas (Dinarelio, 1996,1998). L a elevacin del IL-1 RA puede representar un importante esfuerzo para minimizar los intensos efectos txicos de los niveles sistmicos aumentados de IL-1: la inyeccin de IL-1 RA en ratones justo antes de darles endotoxina intravenosa aument la supervivencia. La IL-1 RA administrada a pacientes con choque sptico produjo una mejora de la mortalidad dosis-dependiente medida al da 28, pero este efecto no se observ uniformemente en ensayos posteriores ms grandes (Fisher, 1994). El mejor xito con la terapia con IL-1 RA se obtuvo en un gran estudio doble ciego completado en pacientes con artritis reumatoide. Los resultados indicaron una reduccin dependiente de la dosis de IL-1 RA en el edema articular, y una reduccin significativa en las nuevas erosiones seas (Bresnihan, 1998). Otros ensayos clnicos que evaluaban la eficacia de la administracin de IL-1 RA en la enfermedad injerto contra husped (EICH) cortico-resistente mostraron una mejora en la mayoria de los sujetos (Anlin. 1994).

lnterleucina-2
La IL-2 es una glicoproteina de 15.5 kDa, con 1 3 3 aminocidos, miembro de la familia de las citocinas de cuatro hlices-!/ (Bazam, 1990), con dos puentes disulfuro en su eslructura tridimensional Su gen codificador ha sido secuenciado en el cromosoma 4. La activacin de las clulas T y la liberacin de la IL-2 resulta de la interaccin entre el TCR y el anligeno presentado en asociacin con las molculas de MHC sobre las clulas presentadoras de antigeno (APCs) (Fraser, 1991). El receptor para la IL-2 (IL-2R) es un complejo de membrana tripartito compuesto por una cadena o de 55 kDa, una cadena |5 de 70 a 75 k D ayu n a cadena y de 64 kDa (Waldmann. 1998). El IL-2R existe en tres formas moleculares: un complejo de alta afinidad para las subunidades a. [J. y y. un complejo de afinidad intermedia de las subunidades |i y y, y un receptor de baja afinidad hecho solo de IL-2Ru. Solo el IL-2R</|ly y el IL-2R|iy son capaces de Iransducir la seal tras la unin con el ligando. En las clulas T y en las clulas asesinas naturales (NK). la IL-2 activa vas mtracelulares incluyendo la JAK-1 y la JAK-3 de la familia de las cinasas Jane, que actan a su vez en sus sustratos. STAT-3 y STAT-5. de transductores de la seal y activadores de la familia de Iranscnpcion de los factores de transcripcin. Los genes diana de las vas de sealizacin activadas por IL-2 incluyen el bcl-2. c-myc. c-jun. y c-los (Gmez, 1998). Ya que comparten las cadenas ot y y de las subunidades del receptor, la IL-2 y la IL-15 tienen actividades biolgicas solapadas. Junto con la IL-15. la IL-2 estimula la proliferacin in vitro de las clulas T CD4/CD8+ activadas, las subpoblaciones de clulas T y/5, y las clulas NK (Burln, 1994), mientras que promueve la funcin citoltica de los linfocitos T citxicos (LTCs) y de las clulas asesinas activadas por linfocinas (LAK) (Burton, 1994; Grabstein. 1994). Adems, ambas citocinas pueden inducir la proliferacin de las clulas B estimuladas, y la sntesis de IgM. La IL-2 es tambin quimiotctica para las clulas T (Wilkinson. 1995: Armitage. 1995). In vivo, la IL-2 puede jugar un papel indispensable en el mantenimiento de tolerancia a lo propio, ya que los animales con dficit de IL-2 desarrollan enfermedades de inmunodeficiencia y autoinmunes como la anemia hemolitica y la enfermedad inflamatoria intestinal (vVillerford, 1995). Los ratones sin IL-2R-|5 desarrollan espontneamente activacin de clulas T y diferenciacin celular plasmtica de clulas B. con aumento de los niveles sricos de IgG e IgE (Suzuki, 1995: Wang. 1996). Esto sugiere que la IL-2 puede provocar la induccin a la anergia o a la apoptosis en la muerte celular de clulas T por activacin (AICD). La readministracin de linfocitos infiltrantes de tumor aislados (TIL) que han sido expandidos y activados in vitro con IL-2 y OKT3. con infusiones farmacolgicas de dosis de IL-2. son terapias prometedoras para los tumores malignos inmunogenicos como el melanoma maligno (Goedegebuure. 1995). La actual terapia inmunosupresora para los receptores de alotransplantes incluye los inmunosupresores ciclosporina A, FK-506, y Rapamicina. Estos agentes se unen a las dianas inmunofilinas inlracelulares, creando un complejo frmaco-inmunofilina que bloquea la capacidad del factor nuclear de las clulas T activadas (NF-AT) de activar los genes de la IL-2 necesarios para la proliferacin de las clulas T, y otros genes necesarios para la activacin de las clulas B (Ho. 1996), produciendo asi inmunosupresin.

lnterleucna-3
La actividad de la IL-3 fue detectada por primera vez en cultivos de linfocitos espemeos de ratn, donde induca a la enzima 20-i/-hidroxiesteroide deshidrogenasa (Ihle, 1981). Es una protena de 26 kDa sometida a un estricto control regulador y expresada en una poblacin de clulas restringida que incluye las clulas T activadas, las clulas NK. los mastocitos y algunos megacariocitos (Blalock, 1999). La sntesis adecuada de IL-3 requiere la activacin de las clulas T a travs del complejo TCR'CD3 Esto inicia las vas mtracelulares conduciendo a la activacin del NF-KB, que se introduce en el ncleo para transactivar la expresin del gen IL-3 (Park, 1993: Link, 1992). El receptor de IL-3 (IL-3R) es un miembro de la familia gnica de los receptores de citocinas y tiene una cadena | 5 especfica de ligando asociada no covalentemente con una cadena de transduccin de seal |i. El gen que la codifica ha sido secuenciado en el cromosoma 5 (Blalock. 1999)

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA te en una cadena u especfica de ligando y una cadena |5 de transduccin de seal comn a los receptores para la IL-3 y GM-CSF (Tavernier. 1991). Los dominios intracitoplasmticos de las subunidades </. y \i contiene regiones implicadas en la unin del JAK-2 y el JAK-1. respectivamente, que son necesarios para la transduccin de seales. No se ha descrito completamente la total distribucin tisular del IL-5R. pero parece estar restringida a los baslilos y eosinfilos. La IL-5 es producida por las clulas Th2 que liberan la cilocma cuando son estimuladas apropiadamente. Los mastocitos. las clulas NK. las clulas B, los eosinfilos, las clulas malignas y algunas clulas transformadas por virus son capaces tambin de secretar IL-5. La IL-5 promueve la diferenciacin, la migracin, la activacin, la degranulacin y la supervivencia de los eosinfilos. Estudios en ratones implican a la IL-5 aislada en la estimulacin de la produccin de eosinfilos in vivo (Tominaga. 1991; Dent, 1990). La IL-5 es responsable de la induccin de la acumulacin, activacin y degranulacin de los eosinfilos tras el contacto antignico, posiblemente a travs de su gran actividad quimiotctica, de su capacidad de producir una regulacin a la alta de ciertas molculas de adhesin presentes en los eosinfilos como CD11b. y promoviendo la liberacin de granulos de IgG inducida (Wang, 1989: Walsh, 1991; Fujisawa. 1990). El papel de la IL-5 en la enfermedad humana puede incluir la produccin de dao en la membrana basal observado en el penfigoide ampollse promover la infiltracin eosinfila en los lugares de infestacin parasitaria, y promover la produccin de anticuerpos del receptor de la antitirotropma en la enfermedad de Graves. Adems, la eosinofilia local de la enfermedad de Hodgkin puede estar asociada con la capacidad de las clulas de Reed-Sternberg de liberar IL-5. En las respuestas alrgicas, la IL-5 liberada por los mastocitos lisulares puede servir para promover la acumulacin de eosinfilos en los tejidos (revisado en Lalani. 1999). Actualmente, se emplea el ELISA para la medicin in vilro de la IL-5, y las tcnicas de inmunofluorescencia permiten la localizacin de IL-5 en clulas especificas, mientras que la hibridacin in silu permite la precisa localizacin de la IL-5 en las clulas individuales.

Las clulas diana de la IL-3 incluyen los precursores in vilro de las clulas T y clulas B. La administracin in vivo de IL-3 a dosis farmacolgica origina un aumento de la produccin de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en ratones, mientras que la sobreexpresin de IL-3 mediada por retrovirus en las clulas medulares conlleva el desarrollo de un sndrome meloproliferativo no neoplsico (Metcalf. 1986; Chang, 1989). Se ha sugerido un papel para la IL-3 en el desarrollo de la hipersensibilidad por contacto, ya que los ratones con dficit de IL-3 muestran un desarrollo escaso de la hipersensibilidad retardada del tipo hapteno especfico (Mach. 1998). Adems, evidencias muestran un papel para la IL-3 en el desarrollo normal del SNC (Chiang. 1996).

lnterleucina -4
La IL-4 (Paul, 1991) desarrolla importantes funciones en la regulacin de la produccin de anticuerpos, en la hematopoyesis, en la inflamacin y en el desarrollo de las respuestas T celulares efectoras. Es una protena compleja con muchos puentes disulfuro intramoleculares y muchos lugares de glicosilacin cuyo gen ha sido secuenciado en el cromosoma 5. La produccin de IL-4 est altamente regulada y se restringe a las poblaciones de clulas T activadas, mastocitos, bastilos y eosinfilos. Los efectos biolgicos de la IL-4 estn mediados a travs de receptores de IL-4 de alta afinidad (IL-4R) compuestos por una cadena a. especfica de ligando, y una cadena y de seal de transduccin compartida por muchas otras citocinas incluyendo la IL-7 y la IL-2. El dominio extracelular del IL-4R tiene homologa con el IL-5Ra y con el IL-6R. La IL-4 activa las clulas B y promueve su diferenciacin, reflejando el hecho de que la IL-4 fue descrita por primera vez en los sobrenadantes de cultivos de clulas T activadas y factor de crecimiento de clula B duplicado. Adems de inducir la expresin de CD23 y molculas de MHC en las clulas B, regula la apoptosis de las clulas B y el cambio de isotipo. particularmente de lgG1 a IgE (Brown. 1997). En el conjunto de la hematopoyesis, la IL-4 estimula la formacin de colonias por los precursores eritroides, megacariocticos. mastociticos y granulocito/monocticos, mientras promueve el desarrollo de poblaciones Th CD8+ y CD4+ (Sillaber, 1991; Erard, 1993). En la respuesta inflamatoria, la IL-4 induce la proliferacin de clulas endoteliales, y origina una regulacin a la alta de las molculas de adhesin celular del endotelio. Activando el endotelio de esta forma, la IL-4 permite el aumento de la adhesin leucoctica a la superficie de los vasos de modo que las clulas inflamatorias migran a los lugares de inflamacin local. Adems, la IL-4 es quimiotctica para los eosinfilos y facilita la citotoxicidad de los monocitos y de las clulas T (Tepper, 1989; Crawford. 1993). Se encuentra un aumento de los niveles de IL-4 en enfermedades alrgicas como la dermatitis atpica y en la fiebre del heno, y los ratones transgnicos para la IL-4 desarrollan un trastorno alrgico en el prpado (Tepper, 1989). La IL-4 tambin puede conferir un grado de proteccin ante algunos parsitos extracelulares, y disminuir el dao de las respuestas autoinmunes inhibiendo las respuestas prolongadas de clulas T (Finkelman, 1986; Rapoport, 1993). La IL-4 participa en la inmunidad tumoral ya sea promoviendo a las clulas N K efectoras o la actividad tumorcida de los macrfagos (Bosco, 1990). Al mismo tiempo, la IL-4 est implicada en el crecimiento de las leucemias de clulas T humanas in vilro. Como est asociada con un cambio de las clulas efectoras CD8+ a clulas no citotxicas, la IL-4 puede jugar un papel en la progresin del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (Erard, 1993). Los niveles elevados de IL-4 en las lgrimas y en la sangre de pacientes atpicos determinados por ELISA sugieren un papel para la IL-4 en la enfermedad alrgica y puede servir como marcador de severidad de la enfermedad (Pranos, 1998: Fujishima, 1995).

lnterleucina-6
La IL-6 fue identificada inicialmente en los sobrenadantes de cultivos de clulas T cooperadoras como un agente capaz de inducir la proliferacin de una inmunoglobulna secretada por las poblaciones de clulas B. Sin embargo, sus acciones se extienden a muchas clulas diana y ahora se reconoce como una citocina importante inmune, hematopoytica y proinflamatoria (Hirano. 1998). La IL-6 es secretada como un pptido de 184 aminocidos de alrededor de 21 kDa, dependiendo de su grado de glicosilacin. El gen que codifica la IL-6 ha sido secuenciado en el cromosoma 7 (Hirano, 1986). La molcula de la IL-6 se caracteriza por cuatro asas a-helicoidales conectadas por asas de pptidos interpuestas (Bazan, 1990). El complejo del receptor de la IL-6 (IL-6R) (revisado en Hirano, 1998) es un miembro de la supertamilia de receptores de citocinas y est compuesto de una cadena de unin a especfica de ligando de 80 kDa (IL-6R) y una cadena de sealizacin |i no asociada covalentemente. la gp130. La subunidad (i es compartida por otros receptores incluyendo los de la IL-11 y del GM-CSF, y se marca por cuatro residuos conservados de cisteina y un dominio triptfano-serina-X-triptfano-serina en su regin amino-terminal. Esto puede explicar en la redundancia funcional observada en las actividades de estas citocinas. El complejo IL-6R combinado forma un receptor de alta afinidad para la IL-6. permitiendo la seal de transduccin a travs de las vas de la JAK/STAT. Una variedad de clulas producen IL-6, incluyendo las clulas T y las clulas B, los monocitos y macrlagos, los fibroblastos, los queratinocitos, los sinoviocitos, los condrocitos y las clulas endoteliales. La IL-6 acta sobre las clulas T, los hepatocitos, los progenitores hematopoyticos y las neuronas. Es un potente factor de crecimiento para las lneas celulares del meloma y el plasmocitoma humano, y tienen una accin autoenna y paracrina sobre los mielomas humanos trasplantados al ratn. En los hepatocitos. la IL-6 estimula la produccin de varios reactantes de fase aguda, y en los ratones knockout por IL-6. estn muy disminuidas la liberacin de reactantes de la lase aguda y de Ig.

lnterleucina-5
La IL-5 es un homodmero unido por disulfuros de 45 kDa. 134 aminocidos, que juega un papel central en la maduracin, activacin y supervivencia de los eosinfilos, y en el desarrollo de enfermedad atpica y eosinofilia. El gen IL-5 reside en el cromosoma 5 en un grupo de genes que codifican la IL-3, la IL-4 y el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrfagos (GM-CSF). Estructuralmente, est relacionado con el grupo de citocinas a-helicoidal (Milburn, 1993). El receptor para la IL-5 (IL-5R) consis-

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CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

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En las clulas hemalopoyticas, la IL-6 origina la proliferacin y diferenciacin de clulas T, aumenta la formacin de colonias de progenitores hematopoyticos multipotenciales e induce la maduracin de los megacanocitos. Estimula la formacin de osteoclastos, la proliferacin de las clulas del msculo liso vascular, e induce la produccin del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF). En el SNC, la IL-6 permite la supervivencia de las neuronas colinrgicas, mientras que en el sistema reproductor induce la secrecin de gonadotropina corinica humana (hCG) por el trofoblaslo. Han sido observadas alteraciones en la produccin de IL-6 en pacientes con AR, y se ha demostrado una significativa correlacin entre las concentraciones de IL-6 e IgG en el lquido sinovial de pacientes con AR (Hirano. 1988; Hermana 1989). En los modelos animales, la administracin de IL-6 parece participar en el desarrollo de la glomerulonelritis membranosa proliferatva acelerada, simulando cambios encontrados en pacientes con lupus eritematoso sistmico (LES) (Rytfel. 1994). Otros estudios en ratones transgnicos sugieren un papel para la IL-6 en la aparicin de la diabetes tipo I y en la generacin de los plasmocitomas monoclonales malignos (Suematsu, 1989; Hirano, 1991). La evidencia clnica sugiere que la determinacin de los niveles sricos de IL-6 en neonatos (Kusler, 1998) y en los pacientes con cncer en quimioterapia (de Bont, 1999) puede ayudar a identificar aquellos neonatos con riesgo inminente de sepsis, y aquellos pacientes cuyos episodios febriles se deben a la quimioterapia ms que a la sepsis.

ratoria en los macrfagos Tambin es quimiotctica para los basfilos y para un subgrupo de clulas T CD4/CD8+. Muchos tipos de clulas producen el pequeo peptido IL-8 incluyendo las clulas endoteliales, las clulas epiteliales, los fibroblastos, los neutrfilos. los monocitos. los macrfagos y las clulas T y. dependiendo de la clula de origen, la IL-8 variar en la longitud de aminocidos. Tras la degradacin proteolitica de su secuencia precursora de 99 aminocidos, la IL-8 es secretada por las clulas endoteliales existentes predominantemente como una proteina de 77 aminocidos y como una proteina de 79 aminocidos cuando es producida por los leucocitos mononucleares. La IL-8 es liberada en respuesta a varios estmulos como los lipopoiisacandos (LPS) y los leucotrienos, y aunque puede existir como un homodimero unido no covalentemente, tiene su gran actividad quimiotctica c o m o un monomero (Paohni. 1994). Dos receptores con significativa homologa en los aminocidos median los electos biolgicos de la IL-8: el receptor A de IL-8 (IL8RA) y el receptor B de IL-8 (IL-8RB), que difieren en su afinidad por el ligando. El IL-8RA aparentemente tiene mayor afinidad y especificidad por el ligando, mientras que IL-8RB muestra menor afinidad y especificidad por el ligando y es capaz de unirse a otras protenas quimioatrayentes relacionadas con la IL-8. La inyeccin intradrmica de IL-8 origina una intensa e inmediata infiltracin de neutrfilos alrededor de las venas con un exudado de plasma local. Para alcanzar las reas de inflamacin, sin embargo, los leucocitos deben primero atravesar el endotelio local. Esto est en parte facilitado por la IL-8. que altera la expresin de integrinas neutrofilicas activando el CD11/CD18 a su conformacin de alta afinidad, y dispara la expresin de la L-selectina. La IL-8 puede formar parte del gradiente quimioatrayente regulado a la alta unido a la superficie celular de las clulas endoteliales vecinas a la inflamacin que siguen los leucocitos activados. Como proteina soluble, la IL-8 forma un gradiente quimiotclico en los tejidos, guiando a los leucocitos extravasados a los lugares de inflamacin. Adems de la secrecin de IL-8 inmediatamente tras su produccin, la IL-8 puede ser almacenada en los cuerpos de Weibel-Palade. donde est disponible para la liberacin inmediata independente de su sntesis (Rot, 1996). Interesantemente, aunque acta predominantemente como quimiotctica. el aumento de los niveles de IL-8 en el sistema circulatorio est asociado con la disminucin de la acumulacin de neutrfilos en los lugares de inflamacin, aunque se observa una neutroM a sistmica (Hechtman. 1991). Esto tambin sugiere una (uncin antiinflamatoria para la IL-8. Los estudios han destacado el papel de la IL-8 en varios estados inflamatorios desde la artritis crnica a la sepsis. Algunos han sugerido medir los niveles de IL-8 en orina como medida para monitonzar la severidad de la enfermedad glomerular (Wada. 1994). Desde la identificacin de la IL-8 como la primera quimiocina en 1987. la superfamilia de las quimiocinas ha sido una coleccin de pequeas molculas solubles siempre en aumento importantes para la migracin de los leucocitos a los lugares de inflamacin. Las quimiocinas desarrollan su papel eficazmente y con gran especificidad por medio de la activacin de integrinas leucocitarias, particularmente la LFA-1, la MAC-1 y la VLA-4. para unir el ICAM-1 y el VCAM-1 de las clulas endoteliales. Las quimiocinas son crticas en la hematopoyesis, en la angiognesis, en la activacin de las clulas T y las clulas NK, en la patognesis del VIH y en el desarrollo del SNC La superfamilia se divide actualmente en cuatro familias basadas en la posicin de sus primeras y segundas cuatro cisteinas en la secuencia de aminocidos. La lamilia CXC (familia u) tiene un aminocido que separa las primeras dos cisteinas: la familia CC (familia |i) no tiene aminocidos intercalados; en la familia C (y), los miembros han perdido las cisteinas una y tres; y la familia de quimiocinas CX3C (6) tiene tres aminocidos intercalados. La familia CXC se divide posteriormente en miembros que tienen un residuo E-L-R en su secuencia amino-terminal. y que poseen actividad angiogmca y actividad quimiotctica neutroflica. La familia de quimiocinas CC contiene miembros quimiotcticos para los monocitos, los linfocitos, los eosinfilos, los basfilos, los mastocitos y las clulas NK. Sus miembros pueden tambin regular la hematopoyesis en la cavidad medular, e inducir la degranulacin de los mastocitos y los eosinfilos. La linfotactina es el nico miembro de la familia de quimiocinas C. Tiene su m a y o r expresin en el timo, donde sirve para reclutar precursores de clulas T inmaduros de la mdula sea. An no se ha definido otras funciones para esta qui-

lnterleucina-7
La IL-7 se identific por primera vez como una glicoprotena murina de 2 5 kDa que mostraba electos poliferativos in vilro en las clulas pre-B (amen, 1988). Aunque inicialmente se describi como un factor de crecimiento de las clulas B, despus se encontr que la IL-7 era crtica tanto para la linfopoyesis de las clulas T como B, as como para movilizar las clulas progenituras mieloides (Grzegorzweski, 1994). En humanos, el cido ribonucleico mensajero (ARNm) de la IL-7 ha sido detectado en rganos inmunes y hematopoyticos, como el timo, el bazo, la mdula sea y el hgado fetal (Komschhes. 1995) La atocina activa es producida por los queratinocitos epidrmicos, las clulas epiteliales intestinales y las clulas estromales de la mdula sea y el timo. El receptor de la IL-7 (IL-7R) es un miembro de la superfamila de receptores de la hematopoyetina, teniendo una cadena y en comn con los receptores de las interleucinas, -2. -4, -7. -9 y -15, lo que explica en parte los efectos solapados y redundantes que estas citocinas tienen en las poblaciones de clulas T. El IL-7R ha sido identificad tanto en clulas mieloides como linfoides (Foxwell. 1992) Los ratones transgnicos para la IL-7 desarrollan un aumento del nmero de clulas B y T y de sus progenitores. Los anticuerpos neutralizantes para el IL-7R administrados a ratones originan una gran disminucin del nmero de timocitos, y clulas de linaje B medulares, con disminucin del nmero de clulas B y T en el bazo y en los ganglios linfticos (Peschon, 1994). Los ratones knockout para la IL-7 y el IL-7R muestran an mayores reducciones de las mismas poblaciones celulares. Debido a esta importante funcin linfopoytica, la IL-7 acelera la reconstitucin de las clulas T y B en los ratones irradiados letalmente. con mnimos efectos en el compartimento mieloide. La IL-7 estimula el crecimiento y aumenta la actividad citotxica sobre las clulas T maduras y las clulas T citotxicas, respectivamente. In vitro. las clulas T aisladas de la lmina propia intestinal proliferan en respuesta a IL-7 exgena y muestran un aumento de la capacidad de responder a anticuerpos anti-CD3 y a IL-2, sugiriendo un papel para esta citocina en el aumento de las respuestas inmunes mediadas por clulas (Watanabe, 1995). Se han sugerido papeles clnicos para la IL-7. Estos van desde aumentar los compartimentos de las clulas T de aquellos que padecen SIDA, hasta el tratamiento de cnceres a travs del aumento de la actividad LAK.

lnterleucina -8 y las quimiocinas

La IL-8. un miembro de la superfamilia de las quimiocinas, es responsable de la acumulacin de neutrfilos en los lugares de inflamacin (Hoch. 1996) Induce la traslocacin del calcio, la quimiotaxis, el cambio de tipo, la polimerizacin de la actma. y posiblemente tambin la actividad de 'a cadena respi-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA (CFU-GM) a partir de progenitores CD34+. La IL-9 ejerce su actividad de promover el crecimiento sobre las lneas de mastocitos, y tambin puede regular la diferenciacin de los mastocitos (Eklund, 1993). Se ha sugerido que la IL9 induce la resistencia a parsitos in vitro de las clulas dependientes de los mastocitos, y junto a la IL-4 puede facilitar la produccin de IgE e IgG (Louahed, 1995). Se ha sugerido un papel para la IL-9 en el SNC por su capacidad de mantener el aumento de la extensin neuronal y promover la excitabilidad sobre cultivos de lineas celulares del hipocampo de progenitores de ratones inmortalizados (Mehler, 1993).

miocna. La familia de quimiocinas CX3C tambin tiene un solo miembro en la actualidad, la fractalcina (la neurotactna). Es diferente de las otras quimiocinas en que es relativamente grande, con 373 aminocidos, con el dominio quimiocina encontrado en los primeros 76 residuos. Anclada a las superficies celulares por un tallo tipo-mucina, la porcin extracelular puede ser liberada de la superficie celular para actuar como quimiotctica para los monocitos, las clulas T y las clulas NK in vitro. Se ha sugerido un papel para la fractalcina en el proceso inflamatorio debido a su regulacin a la alta del endotelio en el SNC de ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), en presencia de factor de necrosis tumoral (TNF). Ya que la fractalcina tambin se expresa en el cerebro normal, tambin puede jugar aqu un papel no patolgico. La mayora de las quimiocinas se encuentran en la familia CC, mientras que las familias C y CX3C tienen solo un miembro cada una. Las quimiocinas ejercen sus efectos a travs de la unin a miembros de la superfamilia de receptores de siete dominios transmembrana, una familia de molculas acopladas a la protena G que crece rpidamente. Las clulas no inmunes como los fibroblastos y las clulas del msculo liso vascular pueden tambin producir y liberar quimiocinas para dirigir a las clulas inflamatorias a los lugares de inflamacin, y pueden responder ellas mismas a las quimiocinas. Las quimiocinas pueden promover la progresin de enfermedades. En la sepsis, la IL-8 es central en la acumulacin de neutrfilos en varios rganos, y en la progresin del desarrollo del estado final de enfermedad. Otras quimiocinas incluyendo RANTES (reguladas en activacin clulas T, normales expresadas y secretadas), GROi/. y la MIP-1u son activas en el choque sptico, y puede proporcionar dianas para la intervencin teraputica. En las respuestas granulomalosas, la presencia de MIP-1 se correlaciona con la formacin de granulomas. Del mismo modo, en la EAE, el modelo animal de la esclerosis mltiple, la progresin y la recada de la enfermedad est afectada positivamente por la administracin de anticuerpos neutralizantes para la MIP-1u y la MCP-1.

lnterleucina-10
La IL-10 es una potente atocina antinflamatoria (Fiorentmo. 1989). Es una protena de 160 aminocidos con una masa molecular de 18,5 kDa (Kim, 1992), que contiene cuatro residuos cistena y dos puentes disulfuro que mantienen su estructura helicoidal y su actividad biolgica. La codifica un gen secuenciado en el cromosoma 1. El receptor de IL-10 (IL-10R) es expresado sobre todo en las clulas hematopoyticas, y es una proteina de 90 a 110 kDa cuyo dominio extracelular se une a las molculas dimerizadas de IL-10 (Tan. 1995). La transduccn de seales de la IL-10 est mediada a travs de la va de la JAK/'STAT (Lalani. 1997). Aunque muchos tipos de clula, incluyendo las clulas Th2. las clulas T CD4+ y CD8+, los monocitos y los macrfagos, los mastocitos, los queratinocitos, los eosinfilos, las clulas epiteliales y muchas clulas tumorales son capaces de producir IL-10, es el monocito el que produce la mayor cantidad de IL-10 en la mayora de las situaciones inflamatorias (Lalani, 1997). Ya que puede ser producida de un modo autocrino y regular su propia produccin a travs de mecanismos de retroalimentacin negativos, la IL-10 regula la respuesta inflamatoria necesaria en el foco inflamatorio (Tan, 1995). La IL-10 acta Inhibiendo la produccin de citocinas proinflamatorias como la IL-1et, la IL-B, la IL-6, la IL-8, el TNF-a. el G-CSF. el CM-CSF y las quimiocinas incluyendo la IL-8 y la MIP-1u, suprimiendo la transcripcin de sus genes correspondientes (Goldman, 1997). La IL-10 tambin suprime la liberacin de los radicales libres del oxgeno e inhibe la actividad microbicida dependiente del xido ntrico en los macrfagos (Fleming, 1996). En situaciones alrgicas como el asma, la produccin de IL-5 es crucial en la iniciacin del evento. In vitro, la IL-10 previene la produccin de IL-5 en las clulas T ThO, Th2, y de reposo y regula a la baja la expresin de MHC de Clase II sobre las APCs. Tambin inhibe la expresin de MIP-1u en los neutrfilos, monocitos y macrfagos humanos; inhibe la produccin de qumiotcticos activos en los lugares de inflamacin crnica; y puede nactvar directamente la funcin de los eosinfilos y causar la muerte del eosinfilo. Estos hallazgos sugieren el potencial de la IL-10 para limitar la inllamacin area crnica (Petrolan, 1999). Los estudios con animales tambin han sugerido un papel teraputico para la IL-10 en proporcionar una proteccin mucosa en la enfermedad inflamatoria intestinal, y en disminuir los niveles sricos de IL-8 en los animales con pancreatitis aguda necrotizante. En los modelos de sepsis, los ratones inyectados con IL-10 estaban protegidos frente a inyecciones intraperitoneales de endotoxina que. de otro modo, seran letales. La IL-10 puede servir como factor de crecimiento para muchas lneas celulares malignas como los linfomas de clulas B cultivados de pacientes con SIDA, el linfoma Burkitt y las clulas del mieloma maligno. La produccin de IL-10 en otras enfermedades malignas puede proporcionar una forma de eludir las respuestas locales de las clulas T. Sin embargo, los estudios tambin demuestran la capacidad de la IL-10 de inhibir el crecimiento de las clulas de la leucemia mieloide crnica in vitro (Benjamis, 1992; Kim. 1995). La IL-10 puede participar en la induccin y perpetuacin del LES y la actividad de la enfermedad se correlaciona con los ttulos de IL-10 (Houssiau, 1995). Est implicada en otras enfermedades autoinmunes incluyendo la miastenia gravis, la enfermedad de Graves, el sndrome de Sjgren, la polimiositis, la psoriasis, la esclerosis sistmica, el pnfigo vulgar, el penfigoide ampolloso y la enfermedad de Kawasaki (Lalani, 1997). Adems, la deteccin de IL-10 elevada en suero determinada por ELISA en pacientes con carcinoma de clulas pequeas de pulmn y adenocarcinoma de colon puede ser un predictor til de la progresin de la enfermedad clnicamente indetectable (De Vita. 1999, 2000).

lnterleucina-9
La protena IL-9 humana todava no ha sido purificada, pero a travs de la expresin del ADNc (Renauld, 1990) se cree que la protena madura contiene 144 aminocidos con cuatro lugares de glicosilacin potencial. Su gen se ha secuenciado en el cromosoma 5, donde los genes de otros factores de crecimiento y de los receptores de los factores de crecimiento (IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF y CSF-1R) se agrupan. El ADNc para el receptor de IL-9 (IL-9R) codifica una cadena ot de 522 aminocidos especifica de ligando miembro de la superfamilia de receptores hematopoyticos, que se asocia con una cadena y de sealizacin de transduccin que es compartida con la IL-2, IL-4. IL-7 y la IL-15. El hecho de que haya una subunidad del receptor comn utilizada por estas citocinas puede explicar algunas de las redundancias de la actividad observadas entre ellas. Una vez unida a la IL-9, la cadena y recluta la actividad de la tirosina cinasa JAK-3 (de la familia de las cinasas Jano), mientras que la IL-9Roc se asocia con la JAK-1. Tambin puede presentar un papel para la proteina de adaptacin 4PS/IRS2 (Yin, 1995). En humanos, la expresin de IL-9 est aparentemente limitada a las poblaciones de clulas T CD4+ CD45 RO positiva (clulas T memoria), y a las clulas T CD45-RA+ en presencia de IL-4 e IL-10 (Houssiau, 1995). Se requiere una cascada de citocinas que incluya la IL-2, la IL-4 y la IL-10 para mediar su expresin. Adems, el virus tipo 1 linfotrpico de clulas T humanas (HTLV-1) transformante de clulas T constitutivamente produce IL-9 en respuesta a una ruta de induccin an desconocida. El papel fisiolgico de la IL-9 en las clulas normales lodava no es conocido, pero las clulas T aisladas en fresco en cultivos a largo plazo responden a la larga a una actividad de crecimiento promovida por la IL-9, y en cultivos de clulas T murinas sufren transformacin tumoral (Uyttenhove, 1988). Interesantemente, del 5% al 10% de los ratones transgnicos que sobreproducen IL-9 desarrollan espontneamente linfomas linfoblsticos (Renauld, 1994). y la IL-9 es producida en las clulas tumorales de la enfermedad de Hodgkin y del linfoma anaplsico (Merz, 1991). Lo ltimo muestra la posibilidad de una curva de respuesta autocrina de la IL-9 (Demoulin. 1998). En el sistema hematopoytico. la IL-9 y la eritropoyetina parecen reforzar la maduracin de los progenitores entroides in vitro, y pueden promover el crecimiento de unidades formadoras colonias de granulocitos/macrfagos

CAPTUIO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

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lnterleucina-11
La IL-11 es una citocma pleotrpica con numerosos efectos en muchos tejidos incluyendo la mdula sea, el cerebro, el intestino y los testculos. El ADNc de la IL-11 codifica un precursor polipeptidico de 23 kDa, 199 aminocidos, con una secuencia lder de 21 aminocidos que parecer carecer de lugares potenciales de glicosilacin y de residuos cisteina. El gen codificante se ha secuenciado en el cromosoma 19, y su estructura tridimensional contiene probablemente cuatro residuos (5-hlce (Czupryn, 1995). El receptor de la IL-11 (IL-11 R) est formado por una asociacin no covalente de una cadena i/, especfica de ligando y una cadena p de transduccin de seal, la gpl30. El complejo IL-6R tambin utiliza la subunidad gp130 como cadena de sealizacin, explicando algunos de los solapamientos en las acciones de estas cilocinas (Cherel, 1996). Cuando se asocia con el IL-11R|5 (gp130), la afinidad de unin para la IL-11 es mayor y se genera una seal biolgica a travs de la formacin de homodmeros de gp130. Se cree que estos activan las vas de transduccin incluyendo las cinasas JAK. las cinasas MAPK. las protenas cinasa ribosomales S6, y la familia de cinasas Src (Fuhrer. 1996). El ARNm de la IL-11 ha sido detectado en muchos tejidos estimulados incluyendo los fibroblastos, las clulas epiteliales, los condrocitos. los sinoviocitos, los osteoblastos y las clulas del glioblastoma. Las evidencias indican que la IL-11 es una potente citocina antiinflamatoria (Trepicchio. 1998: Redlich, 1996) que. al igual que la IL-6. puede regulara la baja la funcin efectora macrofgica inhibiendo la expresin de los genes del TNF-a, la IL-1p. la IL-12 y el xido ntrico, a travs de la prevencin de la translocacin nuclear del factor de la transcripcin nuclear NF-Kp" (Trepicchio. 1998). Sus efectos hematopoyticos (Du. 1995) incluyen un papel en la megacariocitopoyesis, y la estimulacin de la eritropoyesis, la proliferacin y diferenciacin macrofgica, y la produccin de inmunoglobulinas por las clulas B. Adems, regula la diferenciacin y maduracin de los progenitores de clulas mieloides en combinacin con el factor de clulas madre (SCF), y puede participar en la linfopoyesis. En cultivos de mdula sea a largo plazo (LTBNMCs). la IL-11 aumenta la celularidad de las clulas estromales adherentes y promueve la hematopoyesis en estos cultivos. En los pacientes en quimioterapia, la terapia con IL-11 mejora la recuperacin de la hematopoyesis y de la funcin inmune, y disminuye la morbilidad de la supresin de la mdula sea por la quimioterapia. La IL-11 tiene tambin extensos efectos no hematopoyticos (Du. 1995). La IL-11 puede funcionar en la inflamacin pulmonar y es producida por la estimulacin alveolar y por las clulas pulmonares epiteliales en grandes cantidades. Los virus respiratorios son potentes estimuladores de la sntesis de IL-11 en el pulmn, y la IL-11 es detectada en las secreciones nasales de nios con infecciones del tracto respiratorio superior (Einarsson, 1996). La IL-11 tambin est implicada en el control del crecimiento de las clulas epiteliales gastrointestinales, ya que muestra una inhibicin reversible de la proliferacin de las lineas celulares madre de las criptas intestinales in vitro. La IL-11 tambin puede ser capaz de conferir proteccin mucosa al epitelio gastrointestinal tras la radiacin y la quimioterapia (Keith. 1994). Otras actividades de la IL-11 incluyen el desarrollo de los osteoclastos in vilro. un papel en la supervivencia tanto de las neuronas sensitivas como motoras, la estimulacin de la liberacin in vivo e in vitro de reactantes de lase aguda y la regulacin del metabolismo de la matriz exlracelular (ECM). En la biologa lumoral, la IL-11 acta sinrgicamente con otras citocinas para promover el crecimiento de las lineas celulares de la leucemia humana y estimula la formacin de la colonia de blastos leucmicos (Hu. 1993; Lemoli. 1995). Se ha detectado un efecto trombootopoytico beneficioso en pacientes con enfermedad de Crohn que reciben IL-11 recombinante (Sands. 1999).

las clulas NK CD56+. el receptor de la IL-12 (IL-12R) es un miembro de la superfamilia de receptores hematopoyticos y tiene una homologa significativa con la gpl 30 y con los receptores del G-CSF y del factor inhibidor de leucemia (LIF). La IL-12 es producida principalmente por los monocitos y los macrfagos, por las clulas dendriticas (APC profesionales) y, en una pequea cantidad, por los neutrfilos y los queratinocitos. Su produccin est regulada a la baja por la IL-10 y el TGF-p. y su sntesis esta aumentada por el IFN-y. La sntesis de IL-12 es inducida rpidamente en las clulas fagociticas por ciertos tipos de bacterias, patgenos intracelulares incluyendo los protozoos y los hongos, y en menor medida los virus. Tambin puede producirse con la interaccin homotipica del antigeno CD40 en las clulas T activadas y en los fagocitos (Trinchieri, 1997). La IL-12 tiene un papel vital como citocina proinflamatoria. En modelos de choque sptico implicando inyecciones intraperitoneales de endotoxina en ratones, se encontr que la IL-12 promueve la sobreproduccin de IFN-y. que por un mecanismo de relroalimentacin positivo induce la liberacin de ms IL-12. Finalmente, la sobreproduccin de IFN-y origina la muerte del animal. El importante papel de la IL-12 en esta serie de eventos sale a la luz por la observacin de que la inyeccin de anticuerpos neutralizantes anti-IL-12 en ratones rescata alrededor del 90% de estos de la muerte (Trinchieri, 1994). Las evidencias sugieren que la IL-10 inhibe la produccin de IL-12 por los fagocitos, y que la IL-12 por si misma estimula la produccin de IL-10, sirviendo por ello como regulador negativo de su propia produccin (Meyaard, 1996). Las evidencias experimentales en animales sugieren un papel exacerbante para la IL-12 en ciertas enfermedades autoinmunes incluyendo la diabetes autoinmune. la artritis, el modelo animal de la esclerosis mltiple (EAE) y l a colitis (Trinchieri. 1997). En situaciones alrgicas, la IL-12 juega un papel paliativo a travs de su capacidad de regular a la baja la produccin de IL-4, IL-5 e IgE. El electo es asombroso en la hiperrespuesta de la va area inducida por antigeno en modelos de ratn (Gavett. 1995). L a IL-12 tiene significativos efectos antitumorales y antimetastsicos en modelos de ratn in vivo (Zitvogel. 1995) que parecen estar mediados por la produccin de IFN-y y por otros mecanismos no especilicos. Sin embargo, se ha notado toxicidad gastrointestinal, heptica y hematolgica en ensayos clnicos con rlL-12 sobre pacientes con carcinoma de clulas renales. Debido a su papel en promover las respuestas de memoria de Th1 a las vacunas, la IL-12 puede ser importante como adyuvante de las vacunas.

lnterleucina-13
La IL-13 es una proteina de 12 kDa. 132 aminocidos, clonada por primera vez de linfocitos T activados y clones de clulas T en 1993, con cuatro lugares de N-glicosilacin y dos puentes disulfuro. Su gen de 4.5 kb se ha secuenciado en el cromosoma 5 en el grupo de genes que contiene la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-9 y el GM-CSF. Se cree que posee una estructura (-helicoidal, con cuatro hlices r* y dos cadenas plegadas p, El receptor de la IL-13 (IL-13R) se expresa en las clulas B. monocitos, basfilos. eosinfilos. mastocilos. clulas endoleliales, fibroblastos, queratinocitos y ciertas clulas tumorales. Aparentemente, no se expresa en linlocitos T humanos La IL-13 y la IL-4 comparten un componente del receptor comn, el gp140, una protena de 65 a 70 kDa que sirve como receptor de baja afinidad (IL-13Ra) para la IL-13, como el receptor tipo II de IL-4 (IL-4Ru). No es sorprendente, entonces, que la IL-13 simula muchas de las acciones biolgicas de la IL-4. Cuando se une a su ligando, el IL-13R y el IL-4R inducen la fosforilacin de la tirosina del JAK-1 en las clulas hematopoyticas. y del JAK-2 en las clulas no hematopoyticas. seguido por la activacin del STAT-6 y de la PI3-cinasa (Keegan, 1996: Burd, 1995). La IL-13 es liberada por las poblaciones clnales de clulas T CD4CD8+ ThO, Th1 y Th2 en respuesta a la estimulacin antignica especfica o a la activacin policlonal, y por los mastocitos, los basfilos y los eosinfilos tras la estimulacin a travs de sus receptores de alta afinidad para la IgE (CD23) (Keegan. 1996). El ARNm de la IL-13 es inducido en las clulas B normales tras la correcta estimulacin, y la protena IL-13 y su ARNm han sido detectados en enfermedades malignas y en clulas B transformadas por el virus de Epstein-Barr (VEB). sugiriendo un posible papel para la IL-13 en el desarrollo de enfermedades malignas de las clulas B (de Vnes, 1998).

Interleucina-12
La IL-12 es una citocina heterodimrica de 70 kDa formada por dos cadenas unidas covalentemete (p35 y p40), que son codificadas por dos genes separados (Trinchieri. 1994). La IL-12 promueve la diferenciacin de las clulas humanas tipo Th1, preparndolas para incrementar la produccin de interfern-y (IFN-y). y aumenta las capacidades citolticas de las NK y de las clulas T (Heufler. 1996). Estudiado inicialmente en las clulas T activadas y en

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA estimula la proliferacin de mastocitos in vitro e m vivo. La IL-15 es quimiotctica para las clulas T, recatndolas a los lugares de inflamacin, y se ha sugerido un papel similar en la sinovial de pacientes con AR (Mclnnes, 1996). Otras evidencias indican un papel para la produccin de IL-15 en las situaciones inflamatorias como la colitis ulcerosa, la hepatitis C y la sarcoidosis. En estas situaciones, la IL-15 puede servir para reclutar los linfocitos activados hacia reas de inflamacin donde sern capaces de liberar citocinas adicionales pronflamatorias y ejercer sus efectos citotxicos (Kirman. 1998).

Sobre los linfocitos |3, monocitos y macrfagos, la IL-13 induce una aumento significativo de la expresin de molculas de MHC Clase II y CD23, sugiriendo un papel para la IL-13 en facilitar la capacidad de presentacin de antigenos de estas clulas a las clulas T. Es quimiotctica para los monocitos. y promueve la proliferacin de las clulas B activadas, e in vitro parece promover la formacin de colonias de megacariocitos y aumentar la proliferacin de clulas progenitoras murinas en la mdula sea. La IL-13 es en su mayor parte una citocina antiinflamatoria, y se ha notado un importante papel para ella en la respuesta alrgica. La IL-13 es capaz de inducir la secrecin de IgE de cultivos de clulas B humanas y de aumentar la expresin de la molcula de adhesin proinflamatona VCAM-1 en las clulas endoteliales. Este hecho y la observacin de que la sntesis de IL-13 est aumentada en situaciones atpicas en el pulmn en los asmticos y en pacientes con sinusitis crnica mientras que est disminuida en respuesta a la administracin de corticoesteroides pone de relieve la importancia de la IL-13 en las situaciones de alergia (de Vries. 1998). Al mismo tiempo, la IL-13 parece atenuar la respuesta alrgica regulando a la baja la capacidad de las clulas endoteliales y de las clulas del msculo liso de la va area de liberar el quimiotctico RANTES de los linfocitos T y de las clulas inflamatorias (Tony.
1994).

Interleucina-16
Reconocida inicialmente como un factor quimiotctico en cultivos de clulas mononucleares de sangre humana perifrica estimuladas con mitgenos (Center, 1982), la IL-16 est reconocida como un quimiotctico promflamatorio de clulas T. Los linfocitos estimulados con mitgenos producen IL-16 como una molcula precursora que es degradada y secretada como una protena de 17 kDa, 130 aminocidos. Solo tras la agregacin en homotetrmeros la IL-16 parece poseer actividad biolgica (Bazan, 1996). Se cree que la IL-16 contiene seis lminas de pliegues (i incluyendo la secuencia de aminocidos, glicina-leucina-glicna-fenilalanma. que se cree que facilita las interacciones proteina-protena como la autoagregacin. El gen que codifica la IL-16 ha sido secuenciado en el cromosoma 15. La superficie de las clulas CD4 parece servir como receptor de superficie para la IL-16 soluble, y es absolutamente necesaria para la sealizacin biolgica (Cruikshank, 1994) a travs de vas que pueden incluir la fosforilacin del p56 .
w

El pretratamiento con IL-13 inhibe la produccin de citocinas proinflamatorias como la IL-1i/ y la IL-1(i, la IL-12 y el IFN-ypor los monocitos activados por LPS. Su regulacin a la baja de la produccin de factor tisular y su regulacin a la alta de la produccin de trombomodulina pone de relieve tambin su naturaleza antiinflamatoria.

Interleucna-14
La IL-14 probablemente fue nombrada prematuramente y no parece ser una molcula distintiva.

Interleucina-15
La IL-15 es una protena de 14 a 15 kDa, 114 aminocidos, identificada por primera vez como un factor de crecimiento celular en los sobrenadantes de las lineas celulares epiteliales de rones de mono (Grabstem. 1994). Aunque su secuencia de aminocidos primaria es nica, su estructura tridimensional contiene dos puentes disulfuro y se parece bastante a la de otros miembros de la familia de citocinas de cuatro u hlices de unin, que incluye a la IL-2. citocina con una actividad funcional similar. El gen que codifica la IL-15 se ha secuenciado en el cromosoma 4. cerca del gen de la IL-2 (Anderson. 1995a). El receptor de la IL-15 (IL-15R) est compuesto de tres subunidades proteicas: una cadena IL-15Ra especfica de ligando, y unas cadenas p y y idnticas a las cadenas [J y y del IL-2R. Este hecho explica las actividades similares de IL-15 y la IL-2. La IL-15Ru comparte homologa con la IL-2Ra, aunque su distribucin tisular es diferente, y al igual que la IL-2R, es incapaz de transducir una seal a menos que est asociada con las cadenas de Iransduccin de seal |5 y y (Anderson, 1995b). Mientras que el IL-15R en las clulas T utiliza al JAK-1 y al JAK-3. en los mastocitos emplea la va JAK-2/STAT-5 (Johnston, 1995). Los macrfagos. los fibroblastos, los queratinoctos. las clulas epiteliales y otros tejidos secretan IL-15. pero a diferencia de la IL-2. no es secretada por los linfocitos. De cualquier modo, la distribucin tisular de la IL-15 es amplia, identificndose tambin transcripcin de ARNm en monocitos y macrfagos, clulas de Langerhans. clulas dendritas y clulas endoteliales. El ARNm de la IL-15 parece almacenarse en una muestra translacionalmente inactiva que est disponible para la traslocacin precoz en la respuesta innata a la infeccin. La produccin de IL-15 por los macrfagos en la fase inicial de la infeccin microbiana puede servir para activar a las clulas NK como parte de la respuesta a la infeccin (Cosman. 1995). Al igual que la IL-2, se ha mostrado que la IL-15 participa en la coestimulacin de las clulas T en proliferacin, en la induccin de la actividad de citocinas en las clulas T. en la proliferacin de las clulas NK. y en la activacin de la proliferacin de las clulas B y liberacin de mmunoglobulinas (Kirman, 1998). Los modelos murinos sugieren un papel esencial para la IL-15 en el desarrollo de las clulas NK. A diferencia de la IL-2. la IL-15 puede aumentar anablicamente la masa muscular esqueltica, y se ha demostrado que

La IL-16 es liberada por las clulas T tras la estimulacin con mitgenos. antgenos, histamina y serotonina. Los cultivos de eosinfilos y mastocitos tambin liberan IL-16 en presencia de GM-CSF. y tambin PMA e ionforos de calcio, respectivamente. La IL-16 tambin h a sido identificada en los sobrenadantes de cultivos de clulas epiteliales respiratorias extradas de asmticos. La IL-16 sirve como quimiolclico para las clulas T CD4+ y otras clulas perifricas inmunes que expresan CD4. incluyendo los monocitos y eosinfilos. y es un factor de crecimiento competente para ellos y estimula la progresin del ciclo celular en clulas CD4+ humanas (Cruikshank. 1994). Adems, la IL-16 promueve el aumento de la adhesin al ECM por los eosinfilos, y regula a la alza la expresin de HLA-DR sobre los monocitos (Wan, 1995). Sobre los cultivos de clulas T, la IL-16 inhibe la expresin del IL-2R mediado por el TCR y la produccin de IL-2, y puede hacer a estas clulas insensibles al AICD. El resultado in vivo puede ser el aumento de la acumulacin de clulas T CD4+ cebadas que responden a citocinas en los lugares de inflamacin, que estn protegidas de la AICD mediada por TCR (Cruikshank, 1994). Se ha informado que los asmticos tienen IL-16 constantemente presente en el epitelio de su va area con clulas T CD4+, sugiriendo un papel para la IL-16 en el reclutamiento de estas clulas en el asma. Los modelos murinos sugieren un papel para la IL-16 en la inflamacin granulomatosa. La IL-16 tambin parece suprimir la transcripcin del VIH en las clulas T infectadas por el VIH a travs de la activacin de un factor represor no identificado.

Interleucina-17
Conocida inicialmente como antigeno 8 de los linfocitos T citotxicos (CTLA-8), la IL-17 es una citocina proinflamatoria de 32 kDa secretada c o m o homodmeros unidos covalentemente por un restringido grupo de clulas T memoria activadas (Yao, 1995; Fossiez, 1996). El gen que codifica esta citocina descrita recientemente ha sido mapeado en el cromosoma 2 y su expresin parece estar estrechamente regulada. La IL-17 se expresa predominantemente por las clulas T CD4+ CD45-RO en respuesta a una variedad de seales de activacin incluyendo la Con A, el PHA, el anti-CD3 mAb, el antiCD28 mAb y el Pl (Fossiez, 1996). Los estudios en ratones sugieren que. en contraste con la expresin restringida de la IL-17. el receptor de la IL-17 (IL-17R) es una protena novel ampliamente distribuida especialmente abundante en el bazo y el rir

CAPTULO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

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Evidencias recientes implican la va de sealizacin JAK/STAT en la transduccin de seales por el IL-17R (Subramaniam. 1999). Algunas evidencias parecen sugerir un papel para la IL-17 como inhibidora del crecimiento de las clulas T activadas en ratones (Yao. 1995a). Esto mismo an no ha sido demostrado en sistemas humanos. La IL-17 tambin parece regular al alza la produccin de IL-6. IL-8. PGE y xido ntrico, y su secrecin por los fibroblastos cutneos, los sinoviocitos. las clulas endoteliales, las clulas del epitelio bronquial y las lineas celulares del carcinoma de rion. La IL-17 induce indirectamente la proliferacin de clulas progenitoras hematopoyticas CD34+ cocultivadas con fibroblastos, y finalmente promueve la diferenciacin de estas clulas a neulrfilos (Yao, 1995b). La IL17 tambin induce la expresin de ICAM-1 sobre los fibroblastos in vitro (Fossiez, 1996).
;

Se ha sugerido un papel in vivo para la IL-17 en la proteccin frente a la infeccin bacteriana, y debido a su capacidad para inducir la produccin de altos niveles de citocinas incluyendo la IL-6. la IL-18 y el MCP-l. puede servir para regular el proceso inflamatorio (Dalrymple, 1996). Evidencias recientes sugieren la posibilidad de que la IL-17 pueda promover indirectamente los tumores de cuello uterino en humanos (Tartour, 1999).

asocia despus con los componentes o transportadores de ECM como la a -macroglobulma. la albmina o la IgG. lo que facilita la captacin y el metabolismo del TGF-p. El TGF-p es bien conocido por su papel en el desarrollo, crecimiento y diferenciacin de clulas epiteliales: en la carcinognesis. y en la inflamacin, la reparacin y la angiognesis. Sus efectos biolgicos son transducidos a travs de cualquiera de los seis receptores descritos incluyendo las tres clases de receptores transmembrana y muchos receptores solubles. De estos, los receptores del TGF-p" tipo I y tipo II son capaces de transducir seales biolgicas, mientras que los receptores tipo III carecen de residuos de sealizacin y sirven sobre todo para almacenar y presentar el TGF-|5 a los receptores de sealizacin. La seal biolgica es transducida al ncleo aadiendo protenas Smad (miembros de la familia relacionada con MAD) como intermediarios (Lopez-Casillas. 1993; Derynck, 1996). El TGF-jJ es producido por cualquier linaje de linfocitos desde linfocitos hasta macrfagos y clulas dendrticas. y acta tanto en la respuesta autocnna como paracrina. Sus actividades biolgicas son muchas y bien equilibradas, provocando efectos perjudiciales tanto el exceso como la insuficiencia (McCartney-Francis, 1998). En ratones knockoute TGF-p, el 30% al 60% de los embriones demostraron fallo en la angiognesis y en la hematopoyesis, y abortos espontneos, mientras que en ratones transgnicos con sobreexpresin de TGF-p. la consecuencia es la hipoplasia pulmonar y la prdida de la diferenciacin epitelial respiratoria originando la muerte perinatal. El TGF-|i funciona tanto como laclor de proliferacin como inhibidor del crecimiento. Inhibe el producto del gen del retmoblastoma (Rb) e inhibe la expresin del protooncogn c-myc, provocando una alteracin del equilibrio de las protenas reguladoras positivas y negativas que controlan el ciclo celular (Alexandrow. 1995) En ratones, la sobre o infraexpresin de TGF-|4 origina hipo o hiperproliferacin de clulas epiteliales, en donde la hiperproliferacin est asociada con carcinoma (Nogaard. 1995). En humanos, la agresividad de las lneas celulares del melanoma y del carcinoma de colon aumenta con el aumento de la prdida de respuesta al TGF-|i. El TGF-|! tambin puede servir como supresor de tumores, ya que los anticuerpos contra el TGF-|i aumentan la carcmogenia de las clulas del carcinoma de colon in vitro. En el compartimento hematopoytico (McCarteny-Francis, 1998), el TGF-p controla la mielopoyesis, la linfopoyesis y la supervivencia de las clulas dendrticas de Langerhans. En la respuesta inmune el TGF-J5 mantiene el proceso inflamatorio a travs del aumento de la adhesin de las clulas inflamatorias a travs de la regulacin a la alta de las integrinas. y quimiotcticamente reclutando y activando linfoctos nativos. Interesantemente, los ratones knockout de TGF-p desarrollan una hiperactividad frente a las clulas B parecida a la autoinmunidad, con infiltracin por un nmero considerable de macrlagos y linfoctos de rganos incluyendo el corazn, el pulmn y el hgado (Kulkarni, 1993). El TGF-p puede promover normalmente la tolerancia a lo propio regulando la maduracin de los limocitos CD4+ y CD8+ de modo que clones aulorreactivos sufren apoptosis. En la periferia, una poblacin de TGF-|i producidos por las clulas Th2 mantienen la tolerancia perifrica promoviendo la anergia clonal. El TGF-p suprime la respuesta inflamatoria y promueve la curacin a travs de la inhibicin de la proliferacin de clulas T y B. la inhibicin de la funcin de las clulas NK, la induccin de los antagonistas de citocinas, la regulacin a la baja de la expresin de integrinas, y la inhibicin de la liberacin de IgG. Sin embargo, la sobreproduccin de TGF-p no solo acaba con la respuesta inflamatoria sino que produce una "excesiva" curacin, provocando una fibrosis exuberante y una excesiva cicatriz (Wahl, 1994). Se ha propuesto un papel para el TGF-p en la aterosclerosis, en donde el TGF-ji insuficiente puede permitir la formacin de la placa arteriosclerlica. En esta via, la formacin de la placa en algunos ratones seleccionados es inhibida por la administracin de tamoxifeno, que aumenta el TGF-p circulante.

lnterleucina-18
Llamada originalmente factor inductor de IFN-y (IFIF), la IL-18 es una proleina de aproximadamente 18 kDa producida por los macrlagos activados, las clulas de Kupffer, los osteoblastos y los queratinocitos (Torigoe, 1997). La formacin de la IL-18 biolgicamente activa requiere el procesamiento del precursor de 24 kDa por la caspasa-1 (ICE) en las clulas de Kuplfer. El receptor de la IL-18 (IL-18R) es idntico a la protena relacionada con el IL-1R (IL-1 Rrp) (Torigoe, 1997), y cuando se une a su ligando el IL-18R induce la unin del ADN NF-vp. Se han identificado IL-18Rs de alta y baja afinidad, pero sus papeles en la transduccin de seal no estn claros. La funcin primaria de la IL-18 parece ser la induccin del IFN-y en las clulas Th1 activadas y en las clulas B anti-CD40 activadas (en presencia de IL-12). La IL-18 tambin induce la sntesis por las clulas T de CM-CSF e IL6. y promueve la cilotoxicidad sobre las clulas NK permitiendo la exocilosis de perforinas y granzima A (Ushio. 1996). Los estudios in vitro sugieren un papel para la IL-18 fuera del sistema inmune (Udagawa, 1997; Stoll. 1997; Conti. 1997). Los papeles fisiolgicos de la IL-18 pueden incluir la defensa contra la infeccin, y un papel en el rechazo de tumores. A travs de la supresin de la produccin de IgE. la IL-18 puede abortar la respuesta alrgica (Yoshimoto, 1997), pero la produccin no regulada de IL-18 est asociada con el dao del parnquima heptico en modelos animales. La IL-18 puede participar en la patognesis de la linlohistiocitosis hemolagoctica (HL) a travs de la induccin de clulas Th1. La medicin de los niveles de IL-18 en la sangre perilrica de los pacientes afectos puede facilitar un medio para la monitorizacin de la actividad de la enfermedad HL latente (Takada, 1999).

Factor transformante del crecimiento [i

El TGF-p es una citocina de 25 kDa definida en un bioensayo por su capacidad para mantener la formacin de colonias por los fibroblastos del rion de ralas normales (NRK) en presencia de tactor de crecimiento epidrmico (Clark, 1998). En mamferos, son producidas tres isoformas de TGF-|i (TGF-(11. TGF-|12 y TGF-P3) (McCartney-Francis, 1998). El TGF-|i bioactivo es un homo- o heterodimero del pptido TGF-p de 12.5 kDa degradado por endopeptidasas desde el pro- TGF-p. Antes de su secrecin, el dimero TGF-p de 25 kDa se une al pptido de unin latente del TGF-p de 75 kDa (TGF-(3-lpb), y juntos se unen al pptido de latencia asociado al TGF-|J de 135 kDa (TGF-(i-lap) form a n d o el complejo TGF-ji latente (TGF-(i-lc). El TGF-p-lc se encuentra en grandes cantidades en los granulos a de las plaquetas. Una vez liberado, el TGF-p-lc se puede unir a los receptores de superficie celulares para el TGF-p o puede adherirse a los componentes ECM y permanecer latente. Alternativamente, puede degradarse a su forma activa una vez secretado a travs de las sern proteasas liberadas ya sea por la misma clula o por clulas vecinas. EL pptido de degradacin bioactivo se

Factor de necrosis tumoral

El TNF es una citocina proinflamatoria de 17 kDa (Beutler, 1995) que puede existir como forma transmembrana de 26 kDa, o como pptido soluble que se homotrimenza para formar la citocina fisiolgicamente activa de

922

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGIA

52 kDa. Su nombre deriva de su capacidad para malar clulas tumorales y para inducir la necrosis hemorrgica en tumores trasplantados a ratones. Es un miembro de la familia de los ligados parecidos al TNF. formados todos por tres cadenas polipeptdicas y capaces lodos de unirse a miembros de una lamilia de receptores de TNF relacionados estructuralmente (Beutler, 1994). La mayora de los efectos del TNF estn mediados a travs de dos receptores de superficie celular de alta afinidad: el TNFR-I (CD120a, 55 kDa) y el TNFR-II (CD120b, 75 kDa) (Hohmann. 1989). Cuando son ligados, estos receptores median seales para la proliferacin y muerte celular programada (apoptosis), con evidencias que muestran que esto ltimo est mediado a travs de la induccin de la prdida de la integridad de la membrana mitocondrial y la liberacin de protenas del especio intermembrana. En relacin con esto, el TNFR-I tiene en su dominio mtracelular un residuo denominado "dominio mortal" que es necesario para la transduccin de la seal apopttica. Principalmente, producen TNF los macrfagos y los monocitos. pero otras clulas incluyendo los linfocitos, los mastocitos, los neutrfilos, los queratinocitos. los astrocitos, las clulas microgliales, las clulas del msculo liso y las clulas tumorales tambin lo producen. El TNF puede actuar localmente en una funcin paracrina, pero tambin acta en lugares distantes a modo de hormona. Los efectos biolgicos del TNF-a son numerosos (Kollias, 1999) e incluyen un efecto citotxico directo, la modulacin del crecimiento y diferenciacin tisular, y un papel en las situaciones de inflamacin e infeccin crnica. Adems, el TNF-a es responsable del sndrome de caquexia tumoral y de la mayora de las infecciones parasitarias. A travs de la estimulacin de los neutrfilos. el TNF-a aumenta la fagocitosis, la degranulacin y la actividad de la cadena respiratoria. Los efectos proinflamatorios adicionales incluyen la induccin del aumento de la formacin del factor activador de plaquetas (PAF) en los neutrfilos, la estimulacin de la secrecin de cido araquidnico, el aumento de la citotoxicidad anticuerpo dependiente mediada por clulas, y el aumento de la adherencia de los neutrfilos al endotelio activado por TNF a travs de la regulacin a la alta de la E-selectina; los efectos muestran el papel proinflamatorio del TNF. Los modelos animales implican al TNF en la AF y en la enfermedad inflamatoria intestinal donde el TNF ejerce un efecto proinflamatorio a travs de la activacin de las clulas endoteliales y de la induccin de las quimiocinas quimotcticas de neutrfilos. Adems, se ha propuesto un papel para el TNF en las enfermedades desmielinizantes inflamatorias del SNC sobre la base de mltiples estudios de esclerosis mltiple (EM) en humanos (Kollias, 1999). En pacientes que sufren de fiebre recurrente transmitida por piojo (infeccin por Borrelia recurrenlis), la administracin de anticuerpos bloqueantes anli-TNF ha demostrado suprimir la reaccin de Jarisch-Hexheimer (hipotensin persistente) que acompaa a la administracin del antibitico (Fekade, 1996).

MOLCULAS DE ADHESIN CELULAR

El pegamento que une los tejidos vivos en complejos organismos multicelulares est compuesto en parte de molculas de adhesin que se describen a continuacin. Estas compleas glicoproteinas permiten la migracin celular durante la embriognesis y cicatrizacin de heridas, y gobiernan el trfico de leucocitos, que es de importancia clave en la linfopoyesis y en la respuesta inmune. Las molculas de adhesin se dividen convencionalmente en cinco grupos basados en su homologa estructural: cadherinas, mucinas, integrinas, selectinas y molculas de la superfamilia de inmunoglobulmas. Las cadherinas son expresadas en su mayora en las clulas epiteliales e interaccionan con las otras de forma calcio-dependiente Las mucinas son protenas m u y glicosiladas que interactan principalmente con las selectinas. Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas tienen dominios semejantes a las mmunoglobulnas e interaccionan con las mtegrmas. las selectinas. y una con la otra. Las integrinas y las selectinas se discuten ahora.

Integrinas
La familia de molculas de adhesin de las integrinas (revisadas en Gonzalez-Amaro. 1999) proporciona una unin fsica crtica entre los elementos externos a la clula (otras clulas y el ECM) y los elementos del interior de la clula (el citoesqueleto, las molculas intracitoslicas y el ncleo). Cada miembro de la familia de las integrinas est compuesto de un heterodimero d e subunidades a y p unidas no covalentemente (Tabla 39-1). Actualmente, estn completamente descritas las 16 subunidades a y las ocho |1 pudiendo originar ms de 22 combinaciones de heterodmeros. Las 14 principales integrinas se dividen en cuatro subfamilias, difiriendo en los patrones de expresin y en la especificidad de ligando. Las integrinas (i, (las integrinas de la activacin final [VLAsJ) se crean por la asociacin de una subunidad de cadena |i, (CD29) con cualquiera de las subunidades de la cadena o (CD49a a CD49f). Son expresadas en todas las clulas que requieren un firme anclaje al ECM, y en los leucocitos, plaquetas y algunas clulas tumorales circulantes. Las integrinas p , que tienden a ser expresadas principalmente por los leucocitos y las clulas mieloides, resultan de la asociacin de la subunidad de la cadena p (CD18) con cualquiera de las mltiples subunidades rx Cuando se combinan con la subunidad a, (CD11a), se forma la integrina p LFA-1 (CD11a'CD18). La LFA-1 juega un papel crucial en la adhesin leucocitana al endotelio vascular durante la migracin transendotelial. La subunidad de
? 2

Tabla 39-1

Principales integrinas: estructura molecular e interaccin

Interfern -y
El IFN--/ (Samuel, 1991) es una proteina homodimera de 40 a 70 kDa, 143 aminocidos, detectada por primera vez como un inhibidor derivado de las clulas T de la replicacin viral en cultivos de fibroblastos. Est codificado por una gen simple que est mapeado en el cromosoma 12. La clulas T y las clulas NK son las nicas fuentes conocidas de IFN. Las clulas T lo producen en respuesta a la estimulacin antignica o mitognica, y las clulas NK lo producen en respuesta a IL-2, anticuerpos anti-CD16, o en presencia de macrfagos activados (Carson, 1995). In vilro, el IFN es un potente estimulador de los macrfagos y aumenta fuertemente su actividad tumoricida. Origina una regulacin a la alta de las molculas MHC en muchos tipos celulares incluyendo las APCs. Adems, regula la produccin de anticuerpos por las clulas B (Snapper, 1987). y estimula a las clulas Thl. En respuesta a la infeccin, el IFN induce a los macrfagos a matar a los microorganismos intracelulares a travs de la produccin de metabolitos oxidativos y proteasas. Clnicamente, el IFN se ha empleado para aumentar la capacidad bactericida de los fagocitos en los que tienen enfermedades granulomatosas crnicas (Bolinger, 1992). Se ha mostrado poco prometedor como agente antitumoral.

L M N = laminina F B N = tibronectma F B G N librinogeno. VN = vitronectina. vWF = factor de von Willebrand. VCAM = molcula de adhesin celular, L F A= antigeno linfocitico funcional: ICAM= molcula de adhesin mtracelular

CAPTULO 39
? M

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

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la cadena p en asociacin con la subunidad (CD11b) forma el Mac-1 (CD11b/CD18), una integrina expresada en las clulas mieloides y en los fagocitos mononucleares. Las subunidades a. de las integrinas son protenas de membrana con 120 a 180 kDa con dominios intracitoplasmticos cortos, un fragmento extracelular largo con siete dominios homlogos, y muchos residuos de unin para iones metales (lugares de adhesin dependientes de iones metales [MIDAS]) que se cree que funcionan convirtiendo la integrina de una conformacin inactiva a una activa. Tanto la subunidad a como la |i se unen a un ligando, pero se cree que generalmente la subunidad a proporciona especificidad de ligando. Los tallos intracitoplasmticos de las subunidades de las integrinas a y p se asocian con los componentes del citoesqueleto para transducir seales mtracitoplsmicas. En el proceso de transduccin de la seal, las integrinas se asocian e interaccionan con las otras protenas asociadas a la membrana, con los componentes del citoesqueleto y con los componentes citoplsmicos no citoesquelticos. La proteina asociada a integrinas (IAP o IAP 50) designada como CD47, miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, es una de las protenas asociadas a la membrana que a travs, sobre todo, de su asociacin con las integrinas (5-, puede funcionar como un transductor de seal. Otras protenas asociadas a la membrana implicadas en la sealizacin de integrinas incluyen la caveolina-1 y el CD9, que estn implicados en la formacin de picnosomas de la membrana celular y en la agregacin plaquetaria. respectivamente. Las molculas citoslicas incluyendo la protena asociada a dominios citoplasmticos de integrinas (ICAP-1) ayudan a orquestar la compleja actividad de la migracin de clula mediada por integrina p,. Quizs las asociaciones intractoplasmticas de las molculas de integrinas mejor estudiadas son aquellas asociadas con las protenas del citoesqueleto rx-actinina, talina filamina, vinculina, tensina y paxilina. Estas protenas del citoesqueleto a travs de su asociacin con las subunidades de las integrinas p,, |1 , y p , unen la integrina al citoesqueleto y dirigen la migracin celular, la fagocitosis, la formacin de fibras de estrs en los lugares de contacto, la transduccin de seal intracelular, y unen las protenas del citoesqueleto separadas.
2 3

integrinas que median la unin a los componentes menos ampliamente distribuidos, la distribucin tisular est ms restringida. La expresin de las molculas de integrina depende de la activacin celular, y puede estar regulada a la alta o a la baja en respuesta a estmulos especficos del ambiente externo, incluyendo la estimulacin local por citocinas o la interaccin inmune. La interaccin de las integrinas leucocitarias con las clulas endoteliales es crtica para la evolucin de las respuestas inflamatoria e inmune. Adems, el trasporte de las clulas linfoides a sus lugares de residencia y la diseminacin intravascular de las metstasis implican similares interacciones endoteliales mediadas a travs de las integrinas de superficie y otras poblaciones de molculas de adhesin, las selectinas y sus ligandos. La extravasacin de leucocitos ocurre durante el transporte celular como el trfico de las clulas T y/6 a las placas de Peyer, y como parte de la respuesta inflamatoria. Ambos procesos implican etapas similares, empleando diferentes molculas de adhesin. En la inflamacin el proceso comienza con la liberacin local de citocinas proinflamatorias como el TNF-ot, la IL-1 y el IFN-y, que activan el endotelio local para aumentar la expresin en su superficie de molculas de adhesin incluyendo miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas, el VCAM-1 y el ICAM-1. Adems, las clulas endoteliales liberan agentes quimiotcticos incluyendo la IL-8, formando una superficie de unin y un gradiente quimiotctico soluble reconocible por la transmigracin de clulas inflamatorias, que las localiza en los focos inflamatorios. Este proceso para los linfocitos y los eosinfilos (Fig. 39-1) implica: (1) unin de los leucocitos circulantes a la superficie endotelial principalmente por las selectinas endoteliles (selectinas E y P) y sus ligandos leucocitarios; y (2) movimiento leucocitario {rolling), en donde a travs de la expresin rpida secuencial, principalmente de la integrina leucocitaria VLA-4 y u p , la fuerza de cizallamiento (shean forc) proporcionada por el torrente sanguneo mueve los leucocitos a lo largo de la superficie endotelial, permitiendo poner estas integrinas en contacto con sus ligandos endoteliales, el VCAM-1 y el MAdCAM-1. respectivamente. En el caso de los neutrfilos, el movimiento o rodamiento est mediado solo por las selectinas. A medida que ruedan, las molculas de adhesin celular leucocitarias desencadenan acontecimientos bioqumicos conduciendo a (3) la activacin leucocitaria y a la conversin de sus integrinas en estados activados. La ahora aumentada avidez y afinidad de, principalmente, LFA-1 e ICAM-1 lleva a aumentar la adhesin celular
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El patrn de distribucin de las integrinas es amplio, especialmente entre aquellas integrinas (principalmente las |5,) implicadas en anclar las clulas a los componentes del ECM general como el colgeno y la laminina. Para estas

5. M i g r a c i n quimiotctica Figura 39-1. El movimiento de los linfocitos del torrente sanguneo hacia los tejidos est regulado por la interaccin de la adhesina de la superficie del leucocito y de la superficie de la clula endotelial a travs de un proceso de varias etapas que incluye el atrapamiento, laminacin, aplanamiento y transmigracin (o diapdesis) cuya direccin la proporciona el gradiente quimiotctico.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA de los niveles de citocinas seleccionadas y administrando las citocinas apropiadas. En la actualidad, mientras no est claro, los ensayos clnicos continuados y las mejoras en los ensayos con citocinas dilucidarn finalmente qu intervenciones y mediciones de laboratorio son realmente tiles en la prctica clnica. BIBLIOGRAFA Alexandrow MG. Moses HL: Transforming g r o w t h lactor-beta and cell cycle regulation. Cancer Res 1995; 55 1452-1457. Anderson DM. Johnson L, Glaccum MB, et al: Chromosomal assignment and genom i c structure o f1 1 1 5 Genomics 1995a; 25:701-706. Anderson DM. K u m a k i S. A h O i e h M. et al: Functional characterization of the h u m a n interteukin-15 receptor alpha chain and close linkage ol I L 1 5 R A and I L 2 R A genes. 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leucocitaria endotelial, y a la larga (4) a detener el movimiento leucocitario, y (5) la transmigracin leucocitaria del endotelio, aunque siguiendo a un gradiente quimiotclico. Es todava tema de debate si los leucocitos pasan directamente a travs de las clulas endoteliales individuales, o simplemente pasan entre las clulas endoteliales adyacentes. Una vez atravesado el endotelio, la migracin celular mediada por integnnas a travs de la matriz extracelular por medio de un gradiente quimiotctico completa el viaje de los leucocitos a los focos de inflamacin. Los estados de deficiencia para las integrinas |l, (deficiencia de adhesin leucocita tipo I) y los defectos congnitos en la expresin de las selectmas y de los ligandos demuestra el papel indispensable que juegan estos receptores en producir la respuesta inflamatoria y en el trfico linfocita. En estos pacientes los neutrfilos son incapaces de salir del torrente sanguneo y de migrar a los lugares de inflamacin o infeccin, creando en efecto un estado de supresin inmune con aumento de la susceptibilidad a las infecciones bacterianas y un neutrofilia perifrica paradjica (Bullard, 1996). Los eventos que acontecen en el choque sptico, en la trombosis, en la lesin de reperfusin y en las metstasis tambin requieren la actividad de las integrinas y las selectinas. Este conocimiento ha llevado al empleo teraputico de anticuerpos monoclonales, ligandos de molculas de adhesin solubles y otras intervenciones, incluyendo los oligonucleticos antisensibilizantes para superar la enfermedad mediada por las molculas de adhesin (Gonzalez-Amaro. 1998: Buckley. 1997).

Selectinas
La familia de las selectinas (Gonzalez-Amaro. 1999) contiene tres protenas homologas. La L-selectina (CD62L) es expresada por la mayora de los leucocitos y se cree que juega un importante papel en el transporte o trfico de los linfocitos nativos y de memoria. La P-selectina (CD62P) es almacenada en los granulos </ y en los cuerpos de Weibel-Palade de las plaquetas y de las clulas endoteliales. respectivamente, y es expresada en la superficie celular Iras la activacin celular. La E-selectina (CD62E) se encuentra en la superficie de las clulas endoteliales activadas. Las selectinas interaccionan con los grupos carbohidrato como el sialil-Lewis" y el sialil-Lewis* y posiblem e n t e con otros ligandos incluyendo las integrinas y los glicolpdos. No se ha determinado la total extensin de ligandos fisiolgicos de las selectinas, pero se espera que la lista incluya molculas expresadas en los leucocitos y el endotelio, ya que las selectinas son importantes para las interacciones leucocito-leucocito y leucocito-endotelio. El papel de las selectinas es doble: mediar la interaccin clula-clula y contribuir a la activacin celular a travs de la sealizacin intracitoplasmtica. Al igual que las integrinas, las selectinas son crticas en el contacto y movimiento (rolling) inicial de los leucocitos sobre el endotelio activado antes de la extravasacin. Tras la unin a la forma soluble de la glicoproteina similar a la mucina GlyCAM-1 (un produelo de alta expresin endotelial), la L-selectina es capaz de mediar la activacin de las integrinas B, y su adhesin a la fibronectina. La P y la E selectina tambin pueden servir como molculas receptoras de transduccin de seal, ya que producen un aumento del Ca2+ mtracelular libre en los leucocitos que se adhieren a las clulas endoteliales (Huang, 1993).

PERSPECTIVAS
Claramente, muchas de las citoemas y molculas de adhesin presentadas aqu juegan un papel en los estados de enfermedad. Los mdicos esperan que un da se estimule la remisin de las lesiones patolgicas mediadas por citocinas a travs de la manipulacin tn vivo de los niveles y proporciones de las citocinas pro y antiinflamatorias. Antes de que esto se pueda considerar seriamente, los investigadores y los laboratorios deben continuar descifrando el lenguaje de las citocinas en las clulas, y desanoliando y retinando los ensayos significativos de stas. De momento es posible monitorizar la enfermedad subclinica (IL-18), identificar poblaciones de nesgo para la sepsis (IL-6). predecir la progresin de la enfermedad (IL-10) y disminuir los efectos adversos de la enfermedad (TNF) a travs de la monitorizacin

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CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

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SECCION V

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C A P T U L O

40

Antigene leucocitario humano: compie mayor de h istocompatibiIidad del hom

Armead H. Johnson, Ph.D. Carolyn Kafovich Hurley, Ph.D. Robert J. Harfzman, Capt, MC, USN, M.D. Judith A. Wade, B.Sc.
GENTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Gentica bsica Composicin del MHC Localizacin de los genes del MHC Herencia Desequilibrio de unin Variacin tnica MOLCULAS DE CLASE I: SUBREGIONES HLA-A. -B. -C Estructura de las molculas de clase I Organizacin de los genes de clase I Regulacin de la expresin de los genes de clase I Funcin de las molculas de clase I Otros genes de clase I MOLCULAS DE CLASE II: SUBREGIONES HLA-DR. -DQ, -DP Estructura de las molculas de clase II Organizacin de los genes de clase II Desequilibrio de unin de los genes en la regin de la clase II Regulacin de la expresin de los genes de clase II Funcin de las molculas de clase II Otros genes de clase II CARACTERSTICAS DE LOS FRAGMENTOS ANTIGNICOS UNIDOS POR LAS MOLCULAS MHC DE CLASE I Y CLASE II NOMENCLATURA HLA Especificidades serolgicas y celulares 930 Designaciones allicas basadas en el ADN TCNICAS PARA LA IDENTIFICACIN DEL POLIMORFISMO DEL HLA Tipificacin basada en el ADN de los alelos de clase I y clase II Deteccin serolgica de las molculas de clase I y clase II 934 Deteccin celular de las molculas de clase II TRASPLANTE DE RGANOS/TEJIDOS Bases genticas del trasplante Concordancia de histocompatibilidad Trasplante renal Trasplante de rganos no renales Trasplante alognico de clulas progenitoras hematopoylicas RESUMEN 936 BIBLIOGRAFA 946 946 941 938 937 MOLCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR 936 928 RECONOCIMIENTO DE LAS MOLCULAS MHC EXTRAAS REPETICIN EN TNDEM Y POLIMORFISMO NUCLETIDO SIMPLE EN EL MHC

936

936

La supervivencia depende de la capacidad del sistema inmune de reconocer y responder a una multitud de sustancias extraas (antgenos). Aunque este mecanismo de defensa es bsico para la supervivencia en un mundo de microorganismos hostiles, este mismo sistema de defensa tiene un impacto negativo cuando se trasplantan tejidos de uno a otro individuo o cuando su mal funcionamiento dispara las reacciones autoagresivas. Los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) codifican protenas esenciales en el reconocimiento inmune: las molculas de clase I y clase II (Fig 40-1). En el hombre, las molculas de clase I incluyen el antigeno leucocitario comn (HLA-) HLA-A. HLA-B y HLA-C. y las molculas de clase II incluyen el HLADR, HLA-DQ y HLA-DP. Estas molculas son los clsicos antigenos del trasplante. Otras molculas codificadas en el MHC son las molculas de clase III (vase Cap. 41). Estas incluyen los componentes del complemento ligados al MHC (C2, C4 y Bl), la 21-hidroxilasa (CYP21), la protena 70 del golpe de calor (Hsp70) y el factor de necrosis tumoral (TNF).

Durante una infeccin, los microorganismos invasores pueden tanto infectar como ser ingeridos por las clulas y entonces ser degradados a fragmentos peptidicos. Dentro de la clula, las molculas del MHC de clase I o de clase II se unen a los fragmentos antignicos derivados de los microorganismos. Una vez que los fragmentos antignicos se han unido a las molculas del M H C y han sido translocados a la superficie celular, los receptores de los linfocitos T interaccionan con el complejo fragmento antigenico-molcula de MHC, disparando tanto la respuesta inmune humoral como la celular (Fig. 40-2). Las molculas de superficie celular especficas de las clulas T, CD4 y CD8. actan para potenciar esta interaccin celular y para transmitir las seales de activacin. Otras molculas de superficie celular actan para aumentar la afinidad de las interacciones celulares (p. ej.. el CD2 y su ligando, el CD58 [LFA-3] o el CD11a/CD18 (LFA-1J y su ligando, el CD54 [ICAM-1]) y para transmitir las seales coestimuladoras (p. ej., el CD28 y sus ligandos, el CD80/CD86 [B7j y el CD40 y su ligando, el CD154) (vase Cap. 39). El polimorfismo de los genes que especifican las molculas

928

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Regin HLA clase II

Figura 40-1. M a p a del compiejo de genes del MHC en el c r o m o s o m a 6. El HLA-DPB2 en la regin H L A clase II est localizado c e r c a del centrmero. El HLA-F es el ms leiomnco. La regin entre el HLA-DRA y el HLA-B no se muestra. (De T h eA n t h o n yN o l a n B o n eM a r r o w Trust: w w w . a n t h o n y n o lanorg.uk/HlG. c o n permiso.)

MHC de clase I y clase II afecta a la especificidad de unin al antigeno de las molculas, originando diferencias en las respuestas inmunes sobre los miembros de las especies. El mismo patrn de interacciones entre el exterior celular y el complejo MHC clase I o clase ll-antgeno y un linfocito T ocurre no solo en el reconocimiento de los patgenos invasores, sino tambin en el reconocimiento de las molculas extraas de clase I y clase II (aloantigenos) y en el reconocimiento de los antigenos propios (autoantgenos) (vase Cap. 41). Y a que las molculas MHC extraas de clase I y clase II son reconocidas c o m o antigenos "de trasplante", es beneficioso garantizar que el donante y el receptor son hislo- (es decir. Tejido) compatibles (es decir. HLA emparejado). Las molculas de clase I y clase II tienen mltiples alelos posibles en la poblacin. Por ello, garantizar la compatibilidad es a menudo una tarea difcil, que requiere la colaboracin del personal mdico, del personal clnico que tipifica el HLA, y de los coordinadores del tejido donante (p. ej., redes de donantes de rganos y registros o bancos de donantes de clulas hematopoyticas). En este captulo se trata la gentica, estructura, luncin, nomenclatura y las tcnicas de deteccin de los productos gnicos del MHC humano, el HLAA, -B y -C (clase I) y el HLA-DR, -DQ y -DP (clase II). Tambin se discute la importancia de la concordancia del HLA en el trasplante. Adems de las listas de referencia del final del capitulo, en la Tabla 40-1 se nombran pginas web tiles que proporcionan tanto material de referencia como actualizaciones de resmenes clnicos.

cromosomas (es decir, un nmero haploide) se transmite por cualquiera de los gametos dados. El doble, o nmero diploide de cromosomas, se restablece cuando se fusionan los gametos masculino y femenino para formar el cigoto. De este modo, para un rasgo determinado por un gen, siempre habr cuatro combinaciones genticas posibles en la descendencia, cada una con una probabilidad de incidencia igual. Estas leyes de la segregacin y de divisin aleatoria se aplican a los genes del sistema MHC. Las definiciones para trminos genticos que sern empleados este captulo se dan a continuacin (Crow. 1976; www.nhgri.nih.gov).

GENTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Gentica bsica

La primera ley de Mendel, la ley de la segregacin, esl basada en el principio de que los rasgos hereditarios estn determinados por factores que estn distribuidos en la progenie. En cualquier individuo, estos factores, o genes como ahora se llaman, estn presentes en los cromosomas (vase Cap. 62). Cada gen tiene mltiples formas (esto es. alelos). Como los humanos son diploides. hay dos genes por cada par de cromosomas homlogos. En la meiosis. los cromosomas se separan al azar durante la formacin de los gametos (ovocito y espermatozoide) de modo que solo ur,o de cada par de

Figura 40-2. Modelo de las interacciones moleculares implicadas en el reconocimiento antignico.

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...

929

Tabla 40-1

Sitios web sobre HLA y trasplante Direccin Informacin Sociedad Amencada para la Histocompatibilidad e inmunogentica. tipificacin estndar del HLA Base de datos de la secuencia HLA, herramientas para la presentacin de alelos y para la manipulacin de secuencias Informacin de nomenclatura de la Organizacin Mundial de la Salud Taller Internacional de Histocompatibilidad Programa Nacional de Donantes de Mdula sea Informacin para el Trasplante de Mdula sea Banco de Donantes de Mdula sea Asociacin Mundial de Donantes de Mdula Registro Internacional de Trasplante de Medula sea Estudio Colaborador de Trasplante United Network lor Organ Sharing Instituto de Investigacin Nacional del Genoma Humano

w w w swmed edu/horne_pages/ashi/ashi.htm w w w wbi.ac.uk/imgi/hla/ w w w anlhonynolan org uk/hig w w w ihwc org o ww ihwg.org w w w marrow.org www.bml.org wwwbmdw.org w w w worldmarrow org www.ibmtr.org www.ctstransplant.org wwwunos.org w w w nhgn.nih.gov

Gen El factor unitario de la herencia. Cromosoma Transportador de los factores unitarios de la herencia. Locus Posicin de un gen en un cromosoma. Alelo Forma alternativa de un gen en un locus nico. Homocigoto Tener idnticos alelos en un locus, uno en cada cromosoma. Heterocigoto Tener diferentes alelos en un locus. uno en cada cromosoma. Codominancia Estado en el que el alelo de cada locus expresa su efecto caracterstico igualmente en el heterocigoto. Genotipo Composicin gentica de un organismo o individuo. Fenotipo Caractersticas observables producidas por los genes. Polimrfico Tener dos o ms genotipos frecuentes distintos mantenidos en la poblacin. Cromosomas homlogos Los dos miembros de un par de cromosomas que tienen su correspondiente locus gnico, uno derivado de cada progenitor. Entrecruzamiento Cambio de segmentos entre cromosomas homlogos. Este proceso tambin puede llamarse recombinacin. Alo- (antgeno. injerto) Se refiere a diferencias antignicas entre individuos de la misma especie. Auto- (antgeno, injerto) Se refiere a tejidos o antigenos del mismo individuo (es decir, propios).

decir, estudios de entrecruzamiento en familias) y por tcnicas de biologa molecular incluyendo la clonacin gnica. la secuenciacin de ADN y elecIroforesis en gel con campo pulstil. La ltima tcnica detecta la presencia de genes en grandes fragmentos simples de ADN El orden de mapeo de los genes en el MHC es HLA-A. -B. -C. -DR. -DO. -DP. siendo el HLA-A distal al centrmero (Fig. 40-1).

Herencia
Los genes del MHC estn muy ligados, esto es, se segregan en bloque a la descendencia. El complejo de genes ligados que reside en uno del par de cromosomas homlogos y que se segrega en bloque a la descendencia se denomina "haplotipo". Cada individuo hereda dos haplotipos M H C (uno de cada progenitor) y por ello tiene dos alelos para cada uno de los genes. Esos alelos se expresan codominantemente. La herencia de los genes del M H C sigue las reglas de la segregacin definidas por Mendel. En una familia, cada nio hereda un haplotipo del MHC de la madre y otro del padre. Por convencin, los haplotipos paternos se designan como a y y los haplotipos maternos como c y d. Por ello, hay cuatro genotipos posibles del MHC en el descendiente: ac. ad. be y bd. Ya que la posibilidad de heredar un haplotipo determinado es aleatoria, la probabilidad de incidencia de cualquiera de los cuatro genotipos es una entre cuatro para cada emparejamiento. En una familia con cinco hijos, al menos dos de los nios tendrn un HLA idntico (asumiendo que no hay entrecruzamiento). En la Figura 40-3 se da un ejemplo de emparejamiento y de los cuatro posibles genotipos. Aunque los genes del M H C estn muy ligados, hay casos de familias en las que se ha producido un entrecruzamiento (Fig. 40-4). Se pens en la frecuencia de entrecruzamiento entre dos genes ligados como medida de la distancia de separacin entre los genes; sin embargo, los datos moleculares han sugerido la existencia de puntos calientes de recombinacin en el ADN implicado que puede aumenlar o disminuir la probabilidad de recombinacin durante la meiosis (Uematsu, 1988)

Composicin del MHC

El complejo de genes de histocompatibilidad mayor en humanos est localizado en el brazo corto del cromosoma 6 (es decir, 6p2l). Abarca 3.600 kb (kilobases) e incluye 224 locus gnicos identificados, de los que 128 est previsto que se expresen. Se estima que aproximadamente el 40% de los genes expresados tienen una funcin en el sistema inmune (Aguado. 1999). L o s genes HLA del MHC estn localizados en seis subregiones: HLA-A. HLA-C. HLA-B. HLA-DR. HLA-DOy HLA-DP (Fig. 40-1). Cada subregn codifica un mnimo de una glucoprotena de superficie celular. Con una nica excepcin, los genes del HLA son altamente polimrficos. esto es, cada uno de los genes del HLA tiene mltiples alelos en la poblacin humana. De hecho, los genes del HLA son los locus ms polimrficos conocidos en el hombre (Parham, 1995; Tabla 40-1, www.anthonynolan.org/uk/hig). Debido a que los genes del HLA especifican molculas que tienen un papel importante en la respuesta inmune, se cree que el polimorfismo es esencial para la supervivencia de las especies y para mantenerse en la poblacin por la seleccin.

Desequilibrio de unin
La observacin de que alelos en diferentes locus genticos ocurren en la poblacin en el mismo haplotipo significativamente ms frecuentemente de lo que cabria esperar sobre la base de la posibilidad aislada se denomina desequilibrio de unin. La frecuencia esperada de que ocurran a la vez dos alelos (f 1. f2) es el producto de la frecuencia gnica de cada alelo en dicha poblacin ([Lju, = f1 x f2]). La frecuencia observada se determina por estudios familiares en la misma poblacin. El desequilibrio de unin es una caraclers-

Localizacin de los genes del MHC

Los genes del MHC fueron asignados al brazo corto del cromosoma 6 (6p) sobre la base de estudios citogenticos de cromosomas aberrantes (esto es, cromosomas que han sufrido una traslocacin). El orden y la posicin de mapeo de los genes del MHC fue determinada por anlisis de unin meitica (es

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

tica del MHC humano y se extiende desde el HLA-A hasta el HLA-DQ. El ejemplo mejor conocido de desequilibrio de unin es el haplotipo A1, Cw7. B8, DR17(3), DR52, DQ2 en caucasianos que es observado aproximadamente cuatro veces ms frecuentemente de lo esperado. El significado del desequilibrio de unin como aplicacin a la competencia inmune y a la enfermedad se discute posteriormente en el Captulo 41 en el apartado Haplotipos extendidos.

Variacin tnica
Los datos acumulados del estudio de los grupos de poblacin mundial (Dausset. 1973; Imanishi, 1992; Cadavid, 1997; Bugawan. 1999) demuestran que las frecuencias de los alelos del HLA difieren significativamente entre los grupos de poblacin tnica. Los haplotipos del MHC y el desequilibrio de unin de los alelos tambin difieren. Estas observaciones deben tenerse en cuenta cuando se desarrollan alotrasplantes de clulas progenitoras hematopoyticas de registros y bancos de donantes no relacionados como en el Programa Nacional de Donantes de Mdula de los Estados Unidos (NMDP) (Perkins. 1994). Tanto la frecuencia de los alelos como de los haplotipos dictan el nmero de voluntarios requeridos para encontrar un donante HLA-idntico no emparentado para cualquier paciente. Algunos pacientes (i.e., aquellos con tipos raros o inusuales) no pueden encontrar donantes idnticos no emparentados de entre ms de 6 millones de voluntarios listados en todos los registros de donantes mundiales (Beatty 1995; Mori, 1997). La mejora en los mtodos para el injerto de clulas progenitoras de donantes parcialmente HLA-idnticos puede permitir el trasplante en pacientes para los que no se pueden encontrar combinaciones cercanas (vase Cap. 33).

cacin de acontecimientos recombinacionales que separaban las dos series allicas. Estas dos series allicas fueron llamadas la primera o LA (ahora HLA-A) y la segunda, o cuatro series (ahora HLA-B). Estos nombres derivaban de la descripcin de las series allicas LA 1, 2, 3 hecha por Payne en 1967 y de las series allicas 4a, 4b de van Rood en 1969. Un tercer locus fue propuesto por primera vez en 1970; sin embargo, no se confirm hasta 1975, cuando se identific una familia con recombinacin entre el HLA-B y el nuevo locus. Este tercer locus fue designado HLA-C tras el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1975. Dausset (1981) recibi el Premio Nobel de Medicina en 1980 por su original trabajo sobre el sistema HLA humano.

Estructura de las molculas de clase I

Las molculas clsicas de clase I, denominadas HLA-A, HLA-B y HLA-C en el hombre, son heterodmeros formados de un polipptido glicosilado transmembrana (cadena pesada, 44 kDa) asociado no covalentemente con la |3microglobulina (12 kDa) (Fig. 40-5) (Bjorkman, 1990). La cadena pesada de la molcula de clase I se ancla a la membrana celular y est orientada con sus aminos terminales en el exterior celular. La p^microglobulina est asociada con la regin extracelular de la cadena pesada y es necesaria para la expresin de la superficie celular.
;

MOLCULAS DE CLASE I: SUBREGIONES HLA-A, -B, -C

Las molculas HLA-A y -B fueron las primeras molculas del MHC descritas en humanos (Dausset, 1981; van Rood, 1993). Y a que estas molculas fueron definidas por respuestas de anticuerpos frente a los glbulos blancos (WBCs), son denominadas "antgenos" leucocitarios humanos. Los anticuerpos leucocitarios fueron observados en humanos m u y pronto, en los aos 20, pero no fue hasta los aos 50 cuando comenz el estudio sistemtico. En 1952, Dausset demostr convincentemente la existencia de los anticuerpos leucocitarios (leucoaglutininas). Y a que estas leucoaglutninas no reaccionan con los leucocitos del anticuerpo productor pero reaccionan con un porcentaje de leucocitos del grupo de O de los eritrocitos de individuos no emparentados, sugiri que estas leucoaglutninas eran aloantjcuerpos. Poco despus, Payne (1964) inform de que el suero de pacientes que tenan reacciones febriles no hemolticas a la transfusin de sangre contenia frecuentemente leucoaglutninas que demostraban la aloespecificidad. En 1958, Dausset describi el primer aloantgeno HLA "MAC* (ahora HLA-A2+HLA-28) y mostr que estaba genticamente determinado. Originalmente, se pens que las especificidades de leucocito eran producto de un locus simple. Se estableci un modelo de dos locus, cada locus con mltiples alelos, a travs de los estudios HLA en familias mediante la identifiFigura 40-5. Modelo esquemtico de la estructura de las molculas de clase I y clase II.

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...

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Tabla 40-2

Ejemplos d e antigenos H L A r e c o n o c i d o s por la O M S (especificidades) definidos por tipificacin serolglca y alelos HLA definidos por secuenciacin d e A D N ' '
A n t g e n o s HLA-DQ Alelos' HLA-A A0101-0I04N A 02011-0230 A 03011-0304 A1101-1105 A2301 A2402101-2420 A2501-2502 A2601-2612 A 2901-2904 A 3001-3007 A 31012-3104 A3201-3203 A3301-3304 A3401-3402 A3601 A4301 AGG01--6603 A68011-'6809 A6901 A7401-7403 A 8001 Alelos* HLA-DQ A1 DOA1 0101-0105 Alelos HLA-DBQI DOB 10501-0504 DOB 1 06011-0615 DQB1 0201-0203 DOB 1 03011-0309 DOB 1'0401-0402

A n t g e n o s HLA-A

A1 A2 A203' A2I0 A3 A9 A10 A11 A19 A23(9)' A24(9) A2403 A25(10) A26(10) A28 A29(19) A30(19) A31(19) A32(19) A33(19) A34(10) A36 A43 A66(I0) AG8(?8) A69(28) A74(19) A80

DOI DQ2 DQ3 DQ4 DQ5(1) DQ6(I) DQ7(3) DQ8(3) DQ9(3)

DOA 10201
DOAI03011-0303 DQA 10401 DQA1 05011 - 0505 DOAI06011-06012

Adoptado de w w w anlhonynolan org uk/HIG con permiso de SGE Marsh Cada columna de la tabla es independiente. Lsatelos HLA-A especilican los antgenos HLA-A. El antigeno A1 se especilica por lsatelos A'0101 o AVI 02 o A 0103. El AOfONesun alelo nulo o no expresado Los alelos HLA-DQ) y HLA-DOBl especifican los antigenos HLA-DQ. El antigeno D05 (I) es especilicado por mltiples combinaciones diferentes del DOAI y el DOB1 incluyendo (1) los alelos DOA1V101 y DAB1V501 y (2) DOAV0101 y DOB10502 En el pasado las designaciones de la divisin seroigica eran dadas a especificidades que parecan identificar el antigeno especificado por un alelo HLA simple (p ej. A2 se divide en A203. A210. B7 se divide en B703: B39 se divide en B3901 y B3902) Ahora se ha reconocido que otros telos pueden tambin codificar anli genos que llevan estas especificidades serctgicas y Comit de Nomenclatura de la OMS ha recomendado que se desechen estas divisiones Los nmeros entre parntesis indican la viea especificidad seroigica El tipo seroiogico puede listarse sin la vieja especificidad Por ejemplo, tanto A23(9) como A23 son designaciones correctas
!

Las cadenas pesadas del HLA estn codificadas en el MHC en el cromosoma 6 (Fig. 40-1) (Shiina, 1999) y son altamente polimrficas. mientras que la IVmicroglobulina est codificada en el cromosoma 15 y no se conoce que sea polimrfica en humanos. El gen tpico de clase I est codificado por ocho Nuevas perspectivas en la estructura de la molcula del HLA llegan cuando exones que corresponden a los segmentos de la molcula recin descrita se define la estructura tridimensional de la molcula de clase I utilizando crista(Fig. 40-7). El primer exn codifica la regin 5 no traducida y el pptido hidrolografa con rayos x (Bjorkman. 1987). La estructura de la porcin extracelular se fbico lder. Los exones 2 a 4 codifican los tres dominios extracelulares: el muestra en la Figura 40-6A La molcula est formada por dos pares de domiexn 5 codifica la regin transmembrana. Los exones sexto y sptimo codifinios estructuralmente similares: el u, tienen la misma conformacin terciaria que can la regin citoplasmlica y el exn octavo codifica la regin 3' no traduciel it, mientras que el u- y la |5,-microglobulina lienen similares conformaciones da incluyendo el lugar de adicin poly(A). Las secuencias intermedias (llamaterciarias. Los dominios a, y [5,-microglobulina estn formados cada uno por dos hojas 3 plegadas antiparalelas. una con cuatro cadenas y otra con tres cadenas, das mtrones) entre los exones son transcritas a cido ribonucleico (ARN) pero son eliminadas durante el corte y empalme del mensajero (ARNm). conectadas por un puente disulfuro. Los dominios (t, y ix interaocionan uno con

La regin extracelular de la cadena pesada de clase I est dividida en tres dominios llamados (/.,, u y a , teniendo cada uno alrededor de 90 residuos de aminocidos. El dominio a, aminoterminal contiene un lugar de glicosilacin en el residuo asparragina en la posicin 86. El segmento transmembrana (TM) de aproximadamente 24 aminocidos es el ms hidrofbico. mientras que el segmento intracelular carboxiterminal de la molcula est formado principalmente por residuos hidrofilicos con un grupo de residuos bsicos adyacentes a la superficie citoplsmica (CY) de la membrana celular. El polimorfismo de las molculas de clase I (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997. 1999) se define por el empleo de (1) anticuerpos especficos de clase I (anticuerpos aloantisuero y monoclonales) que se unen a las molculas del HLA: (2) lnfocitos T citotxcos (LTCs) que reconocen y destruyen en respuesta a la estimulacin in vitro por molculas de clase I extraas o alogenicas; (3) imagen isoelctrica de las molculas de clase I aisladas: (4) reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la tipificacin del ADN de los alelos de clase I; y (5) secuenciacin de los nucletidos de los alelos de clase I. La mayor parte del polimorfismo de la clase I proviene de las diferencias en las secuencias de aminocidos encontradas en los dominios ot, y ce, de la cadena pesada. El dominio (,es altamente conservado entre las molculas HLA de clase I.
3

otro a travs de estas hojas plegadas (i y su estructura simula mucho la desenta para el dominio de la regin constante de la inmunoglobulina. Los dominios a, y a estn unidos para formar hoja plegada |5 de 8 cadenas. Esta hoja se detiene por dos hlices c t formando una ranura en la parte alta de la molcula. Esta ranura es el sito para la unin de los fragmentos peptidicos antignicos por la molcula de clase I (Fig. 40-6S). Los lados y el fondo de la ranura estn formados por cadenas laterales de aminocidos que componen las hlices y las hojas plegadas |i Muchos de los aminocidos que alinean esta ranura son polimrficos. creando diferencias alelo-especficas en la especificidad de unin al antgeno entre los diferentes productos allicos de clase I (Stern, 1994). Otros residuos en las regiones helicoidales de la ranura interaccionan con el receptor de clulas T durante el reconocimiento del complejo clase l-fragmento antignico por el linfocito T (vase Fig. 40-2).

Organizacin de los genes de clase I

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 40-6. A. Modelo tridimensional de la porcin extracelular de l a molcula de clase I. B. Vista superior de la m i s m a molcula mostrando la ranura de unin al pptido (De Bjorkman PJ, Saper M.A, SamraouiB, el al: Structure of the human Class I histocompatibility antigen, H L A A2. Nature 1987; 329:506. con permiso.)

antignicos en los linlocilos T (vase Cap. 36). La presentacin del antgeno por las molculas de clase I permite a las clulas T detectar y crear una Las molculas HLA de clase I son expresadas como glucoprotenas transrespuesta citotxica contra el material extrao (p. ej., un virus o protenas membrana en la superficie de muchos tipos celulares. Sin embrago, el nivel de anormales de clulas malignas). En el citosol. los antigenos mtracelulares expresin de superficie puede variar importantemente (Singer, 1990). El nivel (incluyendo las protenas propias y las protenas virales o anormales) son basal de molculas de clase I es mayor en las clulas linfoides; las molculas degradados en fragmentos peptidicos (Rock, 1999). Los fragmentos peptdide clase I son indetectables en la membrana de otros tipos celulares como las cos son transportados al retculo endoplasmtico donde se unen a la ranura clulas del cerebro, las clulas musculares y los espermatozoides. La secuende la parle alta de las recientemente sintetizadas molculas de clase I y cia de elementos localizados por encima de los genes de clase I se unen a facentonces son transportadas a la superficie celular (Pamer. 1998; T.H.Hansen, tores reguladores que controlan la expresin en la superficie celular de las 1997) (Fig. 40-2). Cuatro genes, localizados en la regin de clase II del MHC molculas de clase I. Durante una respuesta inmune, la expresin en la super(Figs. 40-1 y 40-8), estn implicados en este proceso. Dos de estos genes ficie celular de los genes de clase I puede ser regulada al alza por las citocinas (LMP2 y LMP7) codifican componentes del complejo del proteosoma. una (p. ej., el interfern-Y y el TNF) unindose a los elementos reguladores supeestructura macromolecular que degrada las protenas en el cilosol (Tanaka, riores. Los tumores y ciertos virus (p. ej., virus de la inmunodeficiencia humana 1997). Los otros dos genes {TAP1 y TAP2) codifican componentes de los [VIH]) pueden suprimir la expresin de clase I (Brodsky, 1999). transportadores peptidicos que mueven los pptidos del citosol al retculo endoplasmtico (Momburg, 1998).

Regulacin de la expresin de los genes de clase I

Funcin de las molculas de clase I

Las molculas HLA-A, -B y -C juegan papeles clave en la respuesta inmune. Primero, en la respuesta inmune adaptaliva, las molculas de clase I se unen a pptidos derivados de protenas sintetizadas en el citosol y las presenta en la superficie celular para que sean reconocidas por los receptores

Los LTC CD8+ reconocen el pptido procesado en conjunto con la molcula de clase I (Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para determinar este mecanismo, los LTCs fueron generados por la estimulacin in vitro con clulas autlogas infectadas con virus. El reconocimiento y la lisis de la clula diana fue especfica para cada cepa de virus preparada. El recono-

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ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...

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Figura 40-8. M a p a de la regin de clase II del MHC humano. Los producios gnicos codificados por cada regin se nombran debajo No estn incluidos lodos los genes.

HLA-G. El HLA-G se expresa principalmente en las clulas extravellositarias del citotrofoblasto en la inlertase feto-materna, donde se cree que |uega un papel en la tolerancia matemofetal (Le Bouteiller. 1999). El HLA-G. como ligando para al menos tres N K y otros receptores de inhibicin celular, protege el tejido placentano de la accin citolitica de las clulas NK. Aunque el HLA-G tiene la capacidad de unirse y presentar el antgeno procesado (es decir, pptidos) a las clulas T, la diversidad de pptidos unidos parece ser menor que la diversidad de pptidos unidos por las molculas de clase I clsica. La reguHay dos grupos de receptores de NK: (1) el receptor tipo C lectina CD94/NKG2 lacin de la expresin del HLA-G tambin difiere de la de los genes de clase I cuyos genes residen en el cromosoma 12. y (2) los receptores de clula aseclasicos, ya que el gen no contiene una seal de respuesta al interiern; por sina similares a inmunoglobulinas (KIR) codificados por genes del cromosoma ello, no es interiern mducible. Finalmente, las transcripciones del HLA-G son 19. La funcin de las clulas N K parece ser regulada por un equilibrio entre los unidas alternativamente originando al menos cuatro isoformas de unin a la receptores de seal positivos que inician y los receptores inhibidores que membrana y dos isoformas solubles de HLA-G. Se ha hipotetizado que las forsuprimen la activacin celular. Ambos grupos de receptores reconocen los mas solubles pueden actuar como inmunosupresores especficos durante el ligandos HLA de clase I. Por ejemplo, los receptores KIR2D diferencian entre embarazo (Le Bouteiller, 1999). los ligandos del HLA-C basndose en la presencia de residuos de aminocidos especficos en los codones 77 y 80 (i.e.. asn77lys80 frente a ser77asn80). HLA-E. El HLA-E puede jugar un papel en la proteccin de la clula diana Otro receptor de NK. el KIR3D. reconoce el polimorfismo del HLA-Bw4/Bw6 de la lisis mediada por la clula NK. Las molculas de HLA-E se unen a un (Fig. 40-9). Un lercer receptor NK. el CD94/NKG2. reconoce la molcula de grupo de pptidos hidrolbicos bastante idnticos derivados de las secuencias HLA-E en complejo con el pptido lder HLA de algunos de los productos allider de las cadenas pesadas de la clase I clsica y del HLA-G. El HLA-E prelieos de las molculas del HLA-A, -B. -C y -G (Brooks 1999). Las clulas N K pueden reconocer especficamente y lisar clulas alognicas que no expresan las molculas especficas de clase I expresadas por la clula efeclora (i.e.. "prdida de lo propio") (Valante, 1997). Esto puede ocurrir potencialmente incluso en pares de trasplantes aparentemente HLA idnticos donde un miembro de la pareja es homocigotico y el otro es heterocigtico (p. ej., donante: Bw4, Bw6: receptor: Bw6). Por ello las clulas N KB w 4 especficas del donante pueden lisar las clulas sin B w 4 del receptor en un injerto de progenitor celular hematopoytico. Esta respuesta puede ser unidireccional en algunas situaciones. En el ejemplo, el donante no pierde ninguna molcula HLA presente en el receptor, por ello, las clulas N K del receptor no detectan ninguna prdida de lo propio. Y a que las clulas N K son relativamente radiorresistentes y comprenden una subpoblacin de alrededor del 10% al 15% de los lintocitos de sangre perifrica, la respuesta N K puede ser sustancial: sin embargo, no se conoce hasta el momento el papel absoluto de la actividad N K en la alectacin al trasplante (Ruggeri, 1999).

cimiento tambin estaba afectado por el polimorfismo allico de las molculas de clase I. ya que slo las clulas diana infectadas viralmente que compartan el producto(s) allico de clase I apropiado con el que responda fueron U s a d a s (Zmkemagel. 1997a. 1997b). El ltimo requerimiento se denomina "restriccin MHC". Znkernagel y su colaborador Doherty recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1996 en reconocimiento a la importancia del concepto de la restriccin MHC en la inmunologa. Segundo, la molcula de clase I tiene una funcin protectora en la respuesta inmune innata previniendo la lisis de la clula diana efectuada por las clulas asesinas naturales (NK). A diferencia de los LTC. las clulas N K no requieren la activacin a travs del reconocimiento de pptidos unidos a la molcula de clase I sino que pueden lisar y destruir las clulas diana que han perdido la expresin de la molcula del HLA clase I clsica en la superficie celular. A travs de este mecanismo innato, las clulas N K juegan un importante papel en la supervivencia frente a los virus y a las clulas tumorales quo regulan a la baja la expresin de la molcula de clase I para evitar el reconocimiento por los LTC (Lainer. 1998: Long, 1999).

taliva como en la innata (O Callaghan. 1998) Sus genes son homlogos a los genes de la clase I clsica en estructura y los polipplidos codificados por estos locus tambin se asocian con la |i,-microglobulina. Sin embargo, al igual que un nivel alto de polimorfismo allico es un marcador de los locus del HLAA, HLA-B y HLA-C, un nivel ba|o de polimorfismo del locus del HLA-E. HLA-F y HLA-G es una caracterstica definitoria de estos genes. Adems, en comparacin con las molculas de clase I clsicas, la expresin en la superficie celular de molculas de clase I no clsicas es baja y la distribucin de estas molculas de clase Ib en los tipos celulares especilicos varia.

A2 + B17

A2 - A69

Otros genes de clase I

Al menos se han identificado 20 genes adicionales no clsicos o de clase Ib en la regin de clase I del cromosoma 6p por clonacin de genes (Aguado. 1999) Muchos de estos son seudogenes; sin embargo, muchos codifican y expresan ARNm de tipo clase I y/o molculas. HLA-E. HLA-F y HLA-G. Estas molculas pueden ser mediadores clave tanto en la respues'a inmune adapFigura 40-9. Vista superior de la molcula de clase I con sus residuos aminocidos polimrticos indicados por las especificidades B w 4yB w 6 y las especificidades d e reactividad cruzada A2 * A28 A2 - A69, y A2 + B17. (Modificado de Parham P. y col: HLA-A. B. C: Patterns of polymorphism m peplide-bindmg. proteins. En D u p o n t B [ed]: Immunobiology of HLA. Vol 1 N e w York. Springer-Verag. 1989, pg. 17. con permiso.)

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SecciN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

senta estos pptidos de unin a la superficie celular para el reconocimiento por las clulas NK. proporcionando un chequeo para la integridad de la va de presentacin antgnica (Lee, 1998a, 1998b; O'Callaghan, 1998). Los injertos cutneos en modelos de ratones transgnicos sugieren que el HLA-E puede ser reconocido como un antgeno de trasplante (Pacasova. 1999). HLA-F. El papel del HLA-F es desconocido. Los modelos por ordenador predicen que ciertos residuos de aminocidos del HLA-F pueden contribuir a una unin del pptido putativo en la hendidura, lo que indica un papel en la presentacin antignica del HLA-F (O'Callaghan, 1998). La expresin del HLA-F en la superficie celular no ha sido detectada en reproducciones.

MOLCULAS DE CLASE il: SUBREGIONES HLA-DR, -DQ, -DP

Las molculas de clase II en humanos fueron reconocidas por primera vez por su capacidad para estimular a las clulas T alognicas en los cultivos mixtos de leucocitos (CfvlL). Durante el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1975, los CML fueron empleados para definir las series allicas del HLA-D (Thorsby, 1975). Ya que los cullivos mixtos de leucocitos requieren siete das antes de que se puedan obtener los resultados, se busc una deteccin serolgica rpida del HLA-D. En 1975, se determin que el aloantisuero contena anticuerpos reactivos con las molculas muy asociadas con las especificidades previamente identificadas como HLA-D por tcnicas celulares (Dausset, 1981). Tras el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1977, estas especificidades serolgicas fueron denominadas DR, de especificidades D relacionadas, ya que se observ que el HLA-D y el HLA-DR estaban asociados pero no eran idnticos el uno al otro. Los test serolgicos desarrollados con estudios genticos e inmunoquimicos identificaron molculas adicionales de clase II. el DR52, el DR53, el DR51 y el DQ. Las tcnicas celulares identificaron an otra molcula de clase II a finales de los aos 70 (Shaw, 1981). Esta molcula (ahora llamada HLA-DP) fue descrita inicialmente como un antgeno secundario de la clula B (SB) ya que normalmente era muy baja o indetectable en CML primarios y requera una segunda fase de estimulacin en el cultivo para la deteccin. Posteriormente, se sigui con la caracterizacin de las secuencias codificantes del ADN y las localizaciones de estos genes en el MHC empleando tcnicas de biologa molecular (Beck, 1999).

alta. Al igual que en las de clase I, muchos de las aminocidos que alinean la ranura de unin al pptido antignico son polimrficos, creando diferentes especificidades de unin al pptido para los diferentes productos allicos de clase II. Al igual que las molculas de clase I, las molculas de clase II son altamente polimrficas (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997, 1999). El polimorfismo de clase II est definido por 1) anticuerpos especificos de clase II (anticuerpos aloantisuero y monoclonales), que se unen a las molculas de clase II; 2) clulas T aloproliferativas que reconocen y proliferan in vitro en respuesta a molculas extraas de clase II; 3) electroforesis en gel bidimensional de molculas de clase II aisladas; 4) hibridacin por endonucleasa que difiere el ADN codificante de los genes de clase II empleando sondas especificas de locus (una tcnica que detecta el polimorfismo ligado a los fragmentos de restriccin [RFLPIJ; 5) tipificacin del ADN basada en PCR de los alelos d e clase II: y 6) secuenciacin de nucletidos de los genes de clase II. La mayor parte del polimorfismo de clase II deriva de las diferentes secuencias de aminocidos localizados en los dominios a, y p, de las dos cadenas polipeptdicas.

Organizacin de los genes de clase II

En contraste con las molculas de clase I, tanto la cadena u c o m o la P de las molculas de clase II estn codificadas en una seccin de 1100-kb de la regin MHC (Figs. 40-1 y 40-8) (Beck, 1999). La regin de clase II incluye tres subregiones -DR, DQ y DP- cada una de las cuales codifica al menos un gen expresado A (codificando una cadena ) y uno B (codificando una cadena [}). Las comparaciones de secuencias sugieren que ambos genes de clase I y de clase II surgen de sucesivas seres de duplicaciones gnicas durante la evolucin de este complejo gnico. La duplicacin original en la regin de clase II origina con mayor probabilidad los genes A y B primordiales. Duplicaciones gnicas ms recientes generan las subregiones DR. DQ. y DP que contienen mltiples genes. Un gen A tpico contiene cinco exones codificando: 1) la regin 5' aminoterminal no traducida y la secuencia lder; 2) el dominio a,; 3) el dominio tt 4) el pptido de conexin, la regin transmembrana, el residuo citoplasmtico, y una porcin de la regin 3' no traducida; y 5) el resto de la regin 3' no traducida incluyendo la seal de adicin poly(A). Un gen tpico de cadena | 3 es similar al gen de la cadena a pero tiene un exn extra para el residuo citoplasmtico. Subregin DR La subregin DR codifica una o dos molculas DR. dependiendo del haplotipo (Bodmer. 1997. 1999). La subregin contiene un gen simple expresado DRA que es similar en diferentes haplotipos difiriendo solo en la sustitucin de un aminocido simple conservativo en el dominio citoplasmtico. El gen ms centromrico DRB, DRB1 (Fig. 40-8), codifica una cadena p altamente polimrfica que, cuando se asocia con la cadena a, exhibe especificidades serolgicas desde DR1 a DR18 (Tabla 40-3). Esta molcula es la molcula de clase II predominante en la superficie celular, constituyendo al menos ms de la mitad de la superficie celular total de las molculas de clase II. Hay mltiples cidos nucleicos y, por ello, diferencias en la secuencia de aminocidos entre los alelos DRB1. El segundo gen expresado DRB, presente solo en algunos haplotipos de clase II, est localizado entre el locus DRB1 y el locus DRA (Fig. 40-8). En

Estructura de las molculas de clase II

Las molculas de clase II HLA-DR. -DQ y -DP son heterodmeros formados por dos glicoprotenas transmembrana no asociadas covalentemente, la cadena a (33 a 35 kDa) y la cadena |i (26 a 28 kDa) (Fig. 40-5) (Gorga. 1992). Ambas cadenas polipeptdicas atraviesan la membrana celular y estn orientadas con sus amino-terminales hacia el exterior celular. Las regiones extracelulares de los polipptidos u y | 3 estn divididas cada una en dos dominios, denominados a, y a y P, y P , y cada dominio contiene aproximadamente 90 residuos aminocidos. La cadena a tiene dos grupos carbohidrato, uno rico en maosa y un complejo tipo glicano, en los aminocidos 78 y 118, respectivamente. Las cadenas p tienen un complejo tipo oligosacrido en el aminocido 19. Los dominios amino-terminales (/., y p, de las cadenas a y p contienen los residuos polimrficos, mientras que los dominios de membrana proximales a y p son altamente conservados y son homlogos a los dominios de la regin constante de la inmunoglobulina. Una regin de aproximadamente 12 aminocidos de tamao conecta el segundo dominio extracelular a la regin hidrofbica transmembrana (23 aminocidos) y al pequeo dominio intracitoplasmtico (8 a 15 aminocidos).
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Basndose en la cristalografa, la molcula de clase II es similar en estructura a la molcula de clase I (Brown. 1993) (Fig. 40-6). En la molcula de clase II, los dominios a, y p, de las cadenas a y p forman una cadena |5 plegada de ocho filamentos unida a dos hlices u para formar la ranura de unin al antgeno en la parte alta de la molcula. Los dominios a ? y p forman cada uno dos cadenas p plegadas antiparalelas que soportan la ranura en la parte
?

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ANTGENO IEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD..

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Desequilibrio de unin de los genes de la regin de clase II

Las combinaciones especficas de los alelos DRB1/DRB3, DRB1/DRB4. DRB1/DRB5y DOA1/DQB1 son frecuentes. Las combinaciones encontradas del DQA1/DQB1 pueden controlarse en parte por la capacidad de las cadenas a y |i de aparearse (Kwok. 1993). Adems, ciertos alelos DR y DQ son heredados conjuntamente ms frecuentemente de lo esperado, originando un desequilibrio de unin en la poblacin. La frecuencia de estas combinaciones difiere importantemente entre los diferentes grupos tnicos de la poblacin. Por ejemplo, tanto los haplotipos DRBVttOI. DOBV0501 (DR11 [5]), DQ5[1yel DRB V0901. DOBT0303 (DR9, DQ9 [3)) se encuentran frecuentemente en las poblaciones de descendientes africanos directos; mientras tanto, estas combinaciones DR-DQ se encuentran raramente en poblaciones descendientes de caucsicos. El entrecruzamiento entre locus DP y locus DR'DO es frecuente. Por ello, hay un mnimo desequilibrio de unin entre los alelos DR/DO y los DP. Se han publicado las listas de los haplotipos DRB1/DOA1DOB1 frecuentes (Begovich. 1992: Imanishi, 1992)

Regulacin de la expresin de los genes de clase II

Las molculas de clase II, HLA-DR, -DQ y -DP, se expresan constilutivamente en las clulas presentadoras de antgenos (APCs) del sistema inmune incluyendo los monocitos, los macrfagos, las clulas dendrilicas y los linlocitos B. Las secuencias de ADN encontradas por encima de las secuencias codificantes de los genes de clase II son criticas para la expresin. La unin de las protenas a estas regiones regula la expresin de los genes de clase II. Las alteraciones en la capacidad de las protenas de unin al ADN de interaccionar con las secuencias de ADN 5' reguladoras que eliminan la expresin de los genes de clase II lleva a una inmunodeliciencia denominada "sndrome del linlocito desnudo" (Kovats. 1994: Mach, 1996). Los genes de clase II son inducibles por el interfern-y (IFN-y) en muchos tipos de clulas (Mach, 1996; Glimcher, 1992) y la expresin puede afectarse por otras citocinas (vase Cap. 39) (Guardiola, 1993). La expresin de molculas de clase II en las APCs puede modularse, particularmente en las clulas dendrticas, tras el depsito antignico y la inflamacin. El nivel de expresin del complejo antgeno peptdico-clase II asi como la presencia de una seal coestimuladora en las APC maduras puede tener un importante papel en el trasplante y en las enfermedades autoinmunes (Nepom, 1991: Banchereau. 1998) (vase Cap. 41).

Figura 40-10. Modelo de las asociaciones as y trans de las cadenas DQu. y DQp\

las clulas que expresan los alelos DR. DRBV03. '11, '12. '13. '14. el segundo gen DRB se denomina DRB3 (la nomenclalura HLA se describe a continuacin). El gen DRB3 es polimrfico, aunque hasta el momento el nmero de alelos identificados es aproximadamente 10 veces menor que el nmero de alelos DRB1. El producto del DRB3 se combina con el producto DRA para formar la molcula DR, que transporta la especificidad serolgica del DR52 (Tabla 40-3). En las clulas que expresan los alelos DRB1 4, 7 y '09. el segundo gen DRB se denomina DRB4. El producto DRB4 combinado con el producto DRA forma la molcula que trasporta la especificidad serolgica del Df?53 (Tabla 40-3). Finalmente, en las clulas que expresan los alelos DRBV15 y '16. el segundo gen DRB es denominado DRB5. Este producto DRB5 combinado con el producto DRA transporta la especificidad serolgica del DR51 (Tabla 40-3). Los haplotipos que expresan los alelos DRBV01. '08 o '10 normalmente no transportan un segundo locus del DRB expresado. Hay excepciones a estas asociaciones. Por ejemplo, se ha descrito un haplotipo que transporta DRBT15 sin un locus DRB5 (Wade. 1993). Subregin DO. U n grupo de genes A y B. DOA1 y DQB1. codifican el heterodmero DO que transporta la especificidad serolgica DQ1-9 (Tablas 40-2 y 40-3 y Fig. 40-3) (Bodmer, 1997, 1999). Las molculas DO representan aproximadamente del 15% al 20% del total de molculas de clase II expresadas en la superficie celular. Los locus del DOAJ y del DQB1 son polimrficos y debido a que sus productos proteicos pueden asociarse tanto en trans como en cis. los heterocigotos pues expresar potencialmente cuatro molculas DQ diferentes en sus superficies celulares (Fig. 40-10). Oros genes A y B tipo DQ en la subregin DQ como el DQA2 y el DQB2 son muy similares a los genes DQA1y DQB1; sin embargo, no expresan ninguna protena funcional. Subregin DP. La subregin DP contiene dos grupos de genes A y B (Tabla 40-3 y Fig. 40-8). Un grupo, el DPA1 y el DPB1. codifica el producto proteico DP; el otro grupo est constituido por seudogenes. Tanto el gen OPA i como el DPB1 son altamente polimrficos (Bodmer, 1997,1999). El nivel de expresin del DP en la superficie celular es muy pequeo.

Funcin de las molculas de clase II

Las molculas de clase II actan como receptores antignicos en la respuesta inmune (Fig. 40-2), unindose a fragmentos peptidicos antignicos procesados de antgenos exgenos como las bacterias. Los antgenos exgenos entran en la clulas a travs de la va de endocitosis y son degradados en fragmentos peptidicos en los ltimos endosomas donde se encuentran y se unen a las nuevas molculas de clase II ensambladas (Watts, 1997). La unin de los fragmentos proteicos procesados a las molculas de clase II se facilita por dos protenas codificadas en la regin de clase II del MHC. la DM y la DO (Fig. 40-8). El pptido de unin est afectado por residuos polimrficos localizados en la ranura de la molcula de clase II. El complejo del fragmento antignico unido a la molcula de clase II es transportado entonces a la superficie celular para su presentacin y reconocimiento por las clulas T circulantes. Los receptores antignicos de los linfocitos T CD4+ interaccionan con el complejo clase ll-fragmento antignico disparando la activacin de la clulas (Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para dilucidar este mecanismo, los linlocitos T electores fueron estimulados in vitro con APCs autlogas previamente incubadas con el antgeno. Como se observ para la clase I, el reconocimiento del fragmento antignico por las clulas T electoras est influenciado por el polimorfismo allico del MHC. La clula T efectora es especifica para el pptido antignico promotor en conjuncin con el producto allico particular de clase II que originalmente present el antigeno (restriccin MHC) (Rosenthal. 1973).

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

Cada clula T activada por el reconocimiento del complejo del fragmento antignico unido a la molcula de clase II puede desenpear una o varias funciones (Paul, 1994), La clula T CD4+ puede ayudar a los linfocitos B a diferenciarse a clulas plasmticas productoras de anticuerpo, o puede ayudar a otros linfocitos T a diferenciarse a clulas citotxicas o clulas con funcin supresora. Adems, la clula T puede por s misma funcionar como clula citotxica, matando directamente clulas con la diana apropiada (p.ej.. clulas que expresan complejos de molculas de MHC de clase II con el antgeno especfico), o como clula con funcin supresora, originando un debilitamiento de la respuesta inmune. Las clulas T tambin producen un nmero de molculas biolgicamente importantes (como el IFN-yj que aumentan la respuesta inmune e incrementan la expresin de molculas de MHC en las clulas diana. Adems, las clulas T producen factores de crecimiento como la interleucina-2 (IL2). Estos factores de crecimiento afectan a un amplio rango de clulas de las clulas progenitoras hematopoyticas para madurar a linfocitos.

motivo peptdico se unen a la molcula de MHC en los bolsillos que se encuentran en la ranura de unin al antgeno (Stern. 1994). Los aminocidos polimrficos de las molculas de MHC rodean esta ranura y crean asi diferencias en las especificidades de unin a los pptidos para las diferentes molculas del MHC. Los pptidos unidos a las molculas de clase I tienen una longitud de 9 a 10 aminocidos. Tanto los extremos carboxi- como aminoterminal del pptidos son atrapados en la ranura de unin de clase I formando un complejo pptido-MHC "cerrado". Los pptidos unidos a las molculas de clase II varan en longitud de 12 a 30 aminocidos. A la vez que mantienen requerimiento para los residuos especficos que se encuentran la porcin central del pptido. tanto los extremos carboxi- como amino-terminal del pptido se extienden fuera de la ranura de unin de clase II formando un complejo pptidoMHC "abierto" (Stern, 1994).

Otros genes de clase II

Al menos han sido descritos otros cuatro genes de clase II, DOA. DOB. DMA y DMB. que expresan sus productos proteicos (Fig. 40-8). Las protenas codificadas por los genes DMA y DMB forman el heterodmero DM. Las protenas codificada por los genes DOA y DOB forman el heterodmero DO. Estos productos gnicos no son detectados en la superficie celular pero son expresados posteriormente dentro de la clula, localizados en compartimentos intracelulares especializados donde las nuevas molculas de clase II sintetizadas (DR. DO, DP) se unen con sus pptidos antignicos. La molcula DM regula la unin al pptido del HLA-DR. -DQ. -DP, teniendo una luncin de tipo acompaante o corrector (Morris, 1994) que favorece la presentacin de los pptidos estables unidos. La molcula DO regula negativamente la funcin del DM (van Ham, 1997).

RECONOCIMIENTO DE LAS MOLCULAS MHC EXTRAAS

El alo-reconocimiento implica el reconocimiento por un linfocito T de una molcula de MHC extraa en una clula por un segundo individuo (alognico). Una vez reconocido, la interaccin dispara una serie de acontecimientos originando la activacin de la clulas T y la iniciacin de una respuesta inmune no m u y diferente al reconocimiento de los patgenos (vase Cap. 36). Basndose en los datos de los modelos de trasplante de rganos vascularizados, se han propuesto dos vas de alo-reconocimiento (Sayegh. 1996). L a va directa para el alo-reconocimiento implica la estimulacin de las clulas T receptoras por un complejo MHC-pptido del donante (es decir, reconocimiento directo de las molculas MHC extraas intactas). La segunda ruta de alo-reconocimiento, la va indirecta, implica la estimulacin de las clulas T receptoras por las molculas de MHC propias a travs de la presentacin de los fragmentos peptdicos de las clulas donante. La presentacin indirecta ocurre cuando las clulas presentadoras de antigenos del receptor ingieren material celular del tejido injertado, degradan el material intracelularmente. y presentan el pptido(s) alognico en complejo con las molculas de MHC propias. Los pptidos derivados de las regiones polimrficas de las molculas MHC del donante son los principales candidatos para la estimulacin de la respuesta inmune indirecta (Suciu-Foca. 1998; Gould, 1999; Harris, 1999).

CARACTERSTICAS DE LOS FRAGMENTOS ANTIGNICOS UNIDOS POR LAS MOLCULAS MHC DE CLASE I Y CLASE II
L a funcin de las molculas de clase I y clase II como receptores de unin a antigenos es similar; sin embargo, los pptidos que unen tienen diferentes caracteristicas (Cresswell, 1994; Engelhard. 1994). Los pptidos derivados de las protenas sintetizadas de novo en la clula (antigenos endgenos como los antgenos virales), se asocian con las molculas de clase I en el retculo endoplasmtico. En contraste, los pptidos de los antgenos solubles y particulados captados por la clula por la va de la endocitosis (antigenos exgenos) se unen con las molculas de clase II en el compartimento endosomal. Tanto las molculas de clase I como las de clase II pueden unirse alternativamente a pptidos propios encontrados en estos compartimentos. Los pptidos surgen de la degradacin normal de las protenas celulares. Algunos de estos pptidos propios son fragmentos de las propias molculas de histocompatibilidad. Normalmente, los pptidos propios unidos a las molculas del MHC no activan a los linfocitos T. ya que son molculas a las que el sislema inmune del individuo es tolerante. Esos pptidos propios pueden, sin embargo, disparar la respuesta inmune iniciando un proceso autodestructivo que conduce a la autoinmunidad (Nepom, 1991 ) (vanse Caps. 43-45). La unin del pptido a las molculas del MHC ocurre solo cuando el fragmento peptdico es de un tamao adecuado y contiene una secuencia particular de aminocidos o un motivo que le permite unirse a una o ms molculas del MHC expresadas en dicho individuo. Un ejemplo de un motivo para un pptido que se une a la molcula del HLA codificada por el A'0201 es la leucina (o metionina o isoleucina) en el residuo 2 del pptido. un aminocido hidroflico en el residuo 3, y una valina (o leucina o isoleucina o alanina) en el residuo 9. Los aminocidos que forman el motivo se denominan residuos de "anclaje" del pptido. Las diferentes molculas del HLA. ya sean las molculas codificadas por diferentes alelos en el mismo locus {HLA-A'0203. '0211. o '0301) o las molculas codificadas por diferentes locus (B'4001 o DRBV0406) se unen a pptidos con diferentes motivos. Los aminocidos que forman el

REPETICIN EN TNDEM Y POLIMORFISMO NUCLETIDO SIMPLE EN EL MHC

Ms de 300 repeticiones en tndem cortas (STRs) han sido identificadas en la regin MHC humana (Foissac, 1997). Tambin estn presentes mltiples polimorfismos de nucletidos simples (SNPs). Un estudio de Abbal (1997) examin seis locus STR en el MHC en una poblacin de individuos no relacionados y encontr un fuerte desequilibrio de unin entre los haplotipos HLA especificos y los marcadores STR. Ya que estos marcadores cubren una regin del MHC mayor que los marcadores del HLA clsico empleados ahora, pueden proporcionar una aproximacin ms amplia para identificar a los individuos MHC idnticos. Estos marcadores pueden, por ejemplo, ser utilizados para identificar un haplotipo MHC recombinante en una familia (Carrington, 1996) y aumentar la probabilidad de encontrar genes de histocompatibilidad del MHC apareados. Se han desarrollado mtodos moleculares seguros y reproducibles para identificar tanto las STR como las SNP (Carrington, 1998).

MOLCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR

Los antgenos de histocompatibilidad menor (mHag) son pptidos inmunogenticos que se unen a las molculas de MHC y pueden ser reconocidos por las clulas T. En las clulas progenitoras de injertos MHC idnticos, se puede inducir una enfermedad injerto contra husped (EICH) por las diferencias

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ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

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Tabla 40-4

G e n e s H menores y sus eptopos e n las clulas T

mHag H-Y H-Y H-Y H-Y H-A-2 H-A-1" H-A-1" Secuencia p e p t d i c a SPSVDKAPAEL" FIDSYICQV IVDCLTEMY Desconocido YIGEVSVSV VLHDDLEA VLRDDLLEA

M o l c u l a s de r e s t r i c c i n HLA-B7 HLA-A2.1 HLA-A1 HLA-B60 HLA-A2.1 HLA-A2.1

" Derivado de una proteina evolucionanamenlo conservada codificada en el cromosoma Y Derivado de un miembro de la familia miosina de clase I no formadora de fila mentos Tres ag menores estn en el articulo de levisiOn de Goulmy de 1997. pero esta tabla completa nos la proporcion Els Goulmy No esta publicada y fue usada por la autora en su charla en el ASHI. Comunicacin personal de Goulmy (2000)

entre el mHag del receptor y del donante (Mutis, 1999). Las mHag pueden ser cualquier producto gnico polimrfico codificado fuera del MHC que difiriera entre el donante y el receptor y que estimule la respuesta T celular (Goulmy, 1997; Simpson, 1998). En la Tabla 40-4 se dan ejemplos de mHag. Como otras protenas antignicas, las protenas polimrficas deben ser procesadas en fragmentos antignicos y el fragmento(s) peptidico polimrfico debe unirse con la ranura de las molculas del MHC. Debido al requerimiento para la presentacin antigmca por las molculas del MHC, cualquier pptido polimdico debe transportar un motivo apropiado de unin especfica al MHC. Por ello, no todos los individuos pueden presentar una respuesta a todas las mHag incluso aunque exista una diferencia entre el donante y el receptor. Muchas mHag son presentadas a las clulas T CD8+ por las molculas MHC de clase I. Las respuestas de las clulas T son iniciadas cuando el receptor de clula T reconoce los complejos formados por los pptidos polmrticos de las mHag unidos a las molculas de MHC expresadas en las APC. Las mHag fueron definidas originalmente por el rechazo de injerto cutneo y por ensayos citotxcos con clones de clulas T. Estos pptidos polimrficos tienen una unin restringida a las molculas MHC de clase I, de modo que la definicin bioqumica de los componentes del pptido antignico de histocompatibilidad menor fue determinada por la elucin, purificacin y secuenciacin del pptido del mHag unido a una molcula del MHC especifica (den Haan 1995). Estudios recientes han demostrado el significado potencial de las mHag en el trasplante clnico (Goulmy, 1997.1996; Martin. 1997: Dupont. 1998). Se han demostrado linfocitos T con citotoxicidad especfica para las m H a g en pacientes con EICH (Mutis. 1999). La disparidad del receptor para una mHag (HA-1) se asoci con un aumento del riesgo de EICH tras el trasplante de mdula sea empleando donantes hermanos genotpicamenle HLA idnticos La importancia del apareamiento para otras mHag (HA-2. HA-3. HA-4, HA-5, H- Y) est menos clara. Se han desarrollado tcnicas basadas en el ADN para detectar diferencias en las mHag (Wilke. 1998: Tseng. 1998) y se han empleado en estudios para medir el impacto de estas disparidades en los resultados del trasplante.

cin se hizo ms discriminatoria. La definicin ms corta de la especificidad es llamada la especificidad subtpica o privada. Las especificidades extensas y compartidas se denominan especificidades supertpicas. Por ejemplo, el B44 y el B45 son especificidades subtipicas de la especificidad supertipica B12 Por ello, una clula que es tanto B44+ como B45+ tambin debera ser positiva para B12. La Tabla 40-5 enumera ejemplos de los equivalentes supertipicos para las "divisiones" En los tests serolgicos. algunos aloantisueros se unen a mas de un producto allico del HLA. un fenmeno denominado reactividad cruzada. Esta reactividad cruzada serolgica entre los productos allicos de los locus HLA-A y HLA-B ha sido extensamente estudiada y se ha empleado para agrupar molculas en grupos antignicos de reactividad cruzada (CREG) (Rodey, 1987). Las molculas de clase I en un CREG comparten uno o ms determinantes que no son compartidos por molculas de otro CREG En la Tabla 40-6 se enumeran ejemplos de CREG. Un determinante antignico (eptopo) compartido entre los miembros de un CREG se denomina especificidad pblica. Parte de la reactividad del CREG puede explicarse porque se comparten secuencias de aminocidos entre las molculas HLA en un CREG (Terasaki. 1992) La inclusin de especificidades HLA en un CREG no est estandarizada, ya que diferentes grupos de anticuerpos producen un nico patrn de reaccin y dos investigadores diferentes con distintos grupos de reactantes pueden identificar grupos de CREG ligeramente diferentes. Sin embargo, los grupos CREG se solapan considerablemente (Ellison. 1994). Las especificidades HLA-Bw4 y Bw6 son epitopos amplios, pblicos, que residen en la misma molcula como las especificidades subtipicas del locus HLA-B. pero estn en lugares diferentes. Por ello el Bw4 y el Bw6 son un sistema diallico. y todas las molculas del locus (y algunas del locus A) transportan tanto la especificidad Bw4 como la Bw6. La regin de la molcula del H L A que transporta las especificidades Bw4'Bw6 ha sido identificada en la hlice (/.. entre los residuos aminocidos 77 y 83 (Tabla 40-7 y Fig. 40-9) (Parham. 1991). Las especificidades serolgicas designadas por la OMS. localizadas en las molculas de clase II, HLA-DR y -DQ. han sido asignadas c o m o se describi para las molculas de clase I (Bodmer. 1999, 1997) (Tabla 40-2). Originalmente se definieron por tcnicas celulares seis tipos de HLA-DP. Las molculas HLA-DP de clase II no se delinen adecuadamente por serologia. Hay 26 especificidades del HLA-D que fueron identificadas en cultivos mixtos de leucocitos. Todas las especificidades HLA-D mantienen la designacin

Tabla 40-5

Ejemplos de divisiones* serolgicas

Divisiones A23.A24 A25.A26,A34,A66 A29.A30.A31. A32. A33. A74 A68.A69 B51.B52 B44.B45

Especificidades originales amplias A9 A10 A19 A28 B5 B12 B14 B15 B16 B17 B21 B22 B40 B70 DR2 DR3 DR5 DR6 DQ1 DQ3

B64.B65
B62.B63.B75.B76.B77 B38.B39 B57.B58 B49.B50.B4005 B54.B55.B56 B60.B61 B71.B72 DR15.DR16 DR17.DR18 DR11.DR12 DR13.DR14 DQ5.DQ6 D07.D08.D09

NOMENCLATURA HLA Especificidades serolgicas y celulares

La terminologa HLA est designada por el Comit de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) para la Nomenclatura HLA (Tabla 40-2) (Bodmer 1999. 1997). Histricamente, las especificidades serolgicas y celulares definidas localizadas en las molculas proteicas del HLA fueron asignadas en base a los resultados de los talleres internacionales durante los cuales los reactivos de tipificacin fueron intercambiados entre los laboratorios participantes (sitio web del Taller Internacional de Histocompatibilidad. 13 edicin, Tabla 40-1). Las asignaciones incluyen el nombre de la molcula de HLA y una designacin numrica basada en el orden en que su especificidad serolgica fue definida. Por ejemplo, el HLA-A1 (o solo A1) fue la primera especificidad HLA-A asignada y el HLA-A80 fue la ms reciente. A lo largo del tiempo las especificidades definidas serolgicamente lueron "divididas" a medida que la defini4

En el pasado, las designaciones de divisiones serolgicas eran dadas a especilicidades que parecan idcnlilicar el antgeno especilico por un alelo HLA simple (p ei. A2 se divida en A203. A210 B7 se divide en B703: B39 se divide en B390I y B3902) Ahora se reconoce que otros alelos tambin pueden codilicar antigenos que llevan estas especificidades serolgicas y el Comit de Nomenclatura de la OMS ha recomendado que no se hagan estas divisiones Datos de Bodmer (1997)

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Tabla 40-6 Creg A01C A10C A02C B5C B07C B08C B12C B21C Bw4 Bw6

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

C R E G y antgenos a s o c i a d o s Antgenos asociados

Al, A3. Al 1. A29. A30, A31, A36, A80 A10, A11. A19. A25, A26, A32. A33. A34. A43, A66, A74 A2, A9. A23. A24, A28. A68, A69, A203 A210, A2403, B17, B57. B58 B5. B18, B35, B51, B52, B53, B78, B5102. B5103 B7, B8. B13. B22, B27. B40. B41, B42. B47, B48, B54, B55, B56. B59. B60, B61. B67, B81, B82. B703 B8, B14. BI6, B18, B38, B39, B59. B64. B65. B67. B3901. B3902 B12. B13 B21. B37. B40 B41, B44, B45, B47, B49. B50. B60. B61. B400b B5, B15, B17, B21, B35. B46. B49. B50. B51, B52. B53. B57. B58. B62, B63. B70, B71. B72. B73. B75, B76, B77. B78, B4005, B5102. B5103 A9, A23. A24, A25. A32, B5. B13. B17, B27. B37, B38. B44, B47, B49, B51. B52. B53. B57, B58 B59. B63. B77 A2403. B5102, B5103 B7. B8. B14, B18. B22. B35 B39. B40, B41. B42, B45. B48. B50, B54, B55, B56, B60. B61, B62, B64. B65. B6, B70, B71, B72. B73, B75, B76, B78, B81, B82, B703, B3901. B3902. B4005

tific una nica especificidad serolgica, al antgeno DR determinado por el DRBV10103 se le dio la designacin serolgica DR103. El tercer y cuarto nmero en la designacin allica se refieren al orden en que el alelo fue descrito. Por ejemplo, el A'0201 fue el primer alelo A2 secuenciado y el A"0203 fue el tercero. Algunos alelos pueden diferir en la secuencia de ADN de sus regiones codificantes pero su secuencia de aminocidos predecida no difiere (a menudo llamada sustitucin imperceptible o sinonmica). Estas combinaciones de alelos son identificadas por designaciones de cinco dgitos. Los primeros cuatro nmeros son compartidos, mientras que el quinto dgito se utiliza para distinguir las secuencias de cido nucleico nicas de los alelos (p. ej., B'27051 y B'27052). Adems, dos o ms alelos pueden tener un nombre de siete dgitos en el que se comparten los primeros cuatro dgitos (p. ej., DRB4'0103101 y DRB4'0103102). Los dgitos cinco a siete indican que los dos alelos difieren slo fuera de la regin codificante de la proteina. En el ejemplo nombrado aqu, la diferencia afecta al lugar del empalme del ARN del DRB4'0103102 originando la prdida de la expresin del alelo (Sutton, 1989). Finalmente, los alelos que no son expresados como protenas en la superficie celular pueden tener aadida una Na sus nombres (p. ej A'0215N, DRB4'0103102N) para indicar "nulo". Y a que cada alelo tiene una nica designacin numrica, la designacin N no se escribe siempre (i.e., A'0215 y A'0215N son el mismo alelo). Se describen nuevos alelos en las publicaciones habituales del Comit de Nomenclatura HLA de la OMS (Tabla 40-1, www.anthonynolan.com/HIG/ nomenc.html; Bodmer, 1999), y las secuencias de nucletidos de todos los alelos estn depositadas en un banco de datos computerizado (bases de datos GenBank. EMBL, IMGT/HLA). Actualmente, hay, por ejemplo, ms de 140 alelos HLA-A designados. Continuamente se estn identificando nuevos alelos y puede accederse a ellos a travs del sitio web.

Datos de Ellison (1994).

V, ya que estas especificidades son definidas funcionalmente por la medicin de la estimulacin de la clula que responde. La estimulacin se genera por diferencias en las molculas DR expresadas en las clulas estimuladoras y. en menor medida, por estimulacin adicional por las molculas DQ y DP.

Designaciones allicas basadas en el ADN

Se ha utilizado la secuenciacin de nucletidos para identificar los muchos alelos diferentes que codifican las molculas HLA. Actualmente, la especificidad simple serolgicamente definida puede residir en dos o ms de 25 productos allicos diferentes (Tabla 40-2). Cada alelo HLA es designado por el nombre del locus gnico seguido por un asterisco y un nmero de cuatro a siete dgitos que indica el alelo. Por ejemplo, el A"0221 es un alelo del gen HLA-A. el B'1510 es un alelo del gen HLA-B; el DPBV0101 es un alelo del gen HLA-DPB1 y el DQAV0601 es un alelo del gen HLA-DQA1. Los primeros dos nmeros en la designacin numrica de cada alelo se basan frecuentemente en el tipo serolgico de la molcula resultante y/o de la secuencia nucleotdca similar a otros alelos del grupo. Por ejemplo, la molcula de HLA-A expresada por el alelo A'0201 porta la especificidad serolgica A2 definiendo el antgeno HLA-A2. Sin embargo, la molcula de HLA-B expresada por el alelo B'1510 no tiene la especificidad serolgica asociada al B15 pero porta la especificidad serolgica que define al antgeno B71. Se design B'1510 por su secuencia de aminocidos prevista similar a los antigenos B15. Las clulas que expresan DRB1 '1003 fueron definidas serolgicamente como DR-blank, DR1, o incluso DR13. Las secuenciacin de nucletidos identific un alelo con similar estructura de ADN a los alelos que portan la especificidad serolgica DR1 (p. ej., DRBV01Q1 y '0102) y el nombre de este alelo se bas en su similitud estructural. Cuando posteriormente se den-

TCNICAS PARA LA IDENTIFICACIN DEL POLIMORFISMO DEL HLA

Las pruebas de histocompatibilidad o la tipificacin del HLA o la tipificacin tisular se desarrolla en un nmero limitado de laboratorios ya que utiliza tcnicas y reactantes especializados. Existen disponibles en el mercado equipos para las pruebas basadas en ADN y serolgicas; sin embargo, la interpretacin de los resultados de la prueba requiere una considerable experiencia y conocimiento. Los laboratorios de histocompatibilidad normalmente se encuentran en centros mdicos que tienen programas de trasplantes de rganos y/o de clulas progenituras hematopoyticas. En esta seccin las tcnicas de identificacin del HLA se tratan de forma general. Para tcnicas detalladas, se remite al Laboratory Manual (2000) de la Sociedad Americana de Histocompatibilidad e Inmunogentica (ASHI) (en la Tabla 40-1 se incluye la pgina web de la ASHI). Los laboratorios de identificacin del HLA estn acreditados por la ASHI, por la Fundacin Europea de Inmunogentica (EFI) y por otras organizaciones.

Tipificacin basada en el ADN de los alelos de clase I y clase II

Aunque la tipificacin serolgica y celular de los antgenos HLA ha sido muy til, hay un nmero de inconvenientes en estas tcnicas. Con la llegada de los mtodos rpidos y fiables del aislamiento y caracterizacin de los genes de clase I y II y la determinacin de las secuencias de nucletidos de los alelos de clase I y II, ha surgido la posibilidad de utilizar mtodos basados en el ADN para la tipificacin del HLA. La tipificacin basada en el ADN de los alelos HLA es ahora una tcnica utilizada Irecuentemente en los laboratorios de tipificacin del HLA (Middleton, 1999: Hurley, 1997a). 1. Es especifica. La especificidad de cada reactante tipificante de ADN (p. ej.. sondas y cebadores de oligonucletdos sintticos) se define claramente y est basada en una secuencia de nucletidos especfica conocida. Como los oligonucletdos empleados como reactantes en la tipificacin del ADN son sintticos, los reactantes no estn limitados y no debera existir variacin entre lotes en la especificidad.

/"

Tabla 40-7 Secuencias d e aminocidos q u e definen los eptopos Bw4 y Bw6 y ejemplos de alelos q u e especifican estas secuencias Bw4 Secuencia*
NLARIALR NLRTALR DLRTLLR SLRTLLR SLRIALR

Bw6 Alelo'
B'5301 B'2701 B-2705 B"2704 A'2501

Secuencia' SLRNLRG GLRNLRG

Alelo'
-3501 B'7301

' Codones 77-83. vase Figura 40-9. Solo se da un ejemplo de cada alelo

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ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

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2. Es flexible. Los nuevos reactantes pueden designarse a medida que se descubran los nuevos alelos y se identifiquen las secuencias de nucletidos nicas. Las pruebas pueden llevarse a cabo en muchos niveles de resolucin dependiendo de los requerimientos de tipificacin y del tiempo disponible para hacer las pruebas. 3. Es ms robusta que otras tcnicas. La tipificacin del ADN no requiere linfocitos viables y no est influenciada por la salud del paciente. Adems, las pruebas basadas en el ADN son altamente reproducibles cuando se usan metodologas estandarizadas como el test con una secuencia especfica de una sonda oligonucleotdica (SSOP) usan en conjunto un protocolo de test estndar (Ng, 1996; Hurley. 2000a). 4. Puede utilizarse para grandes escalas de tipificacin. La cantidad de muestras facilitada por las metodologas automticas y computerizadas reduce el coste y los errores. Los mtodos basados en el ADN son particularmente aplicables a la tipificacin HLA de grandes nmeros de voluntarios para los registros de donantes. 5. Puede ser discriminativa detectando toda la diversidad del HLA. Los alelos del HLA pueden especificar protenas HLA que son indistinguibles empleando tipificacin serolgica. Por ejemplo, un individuo que transporte el alelo DRBV0401 tendr el mismo tipo serolgico (DR4) que un individuo que transporte el alelo DRBV0412 (DR4). Por ello, DRBt'0401 y DRBV0402 son divisiones de la amplia especificidad DR4. Estas divisiones son identificadas por la tipificacin del ADN. No estn disponibles reactantes serolgicos suficientemente especficos para definir esta divisin. Hasta ahora, se han definido 30 subdivisiones del DR4. Hay otros muchos ejemplos de divisiones definidas utilizando tipificacin del ADN que no pueden identificarse empleando tipificacin serolgica; algunas se enumeran en la Tabla 40-2. Los problemas de la tipificacin serolgica son particularmente agudos cuando hay que tipificar algunos grupos de poblaciones. Por ejemplo, las poblaciones de origen directamente africano pueden expresar antgenos de clase I y clase II que son difciles de identificar con los reactantes serolgicos disponibles actualmente (Mytilineos. 1998; Yu. 1997; Bozon, 1997). La tipificacin del HLA basada en el ADN ha mejora muchsimo la capacidad de definir los tipos de H L A en estas poblaciones. Preparacin y amplificacin del ADN. Cualquier clula con ncleo puede utilizarse como tuente de ADN. Mientras que los eritrocitos (RBC) no tienen ncleo, otras clulas de la sangre como los linfocitos son bunas fuentes de ADN. Las lineas celulares como los linfocitos B transformados por el virus de Epstein Barr tambin son buenas fuentes de ADN. A medida que las clulas transformadas pueden crecer en un cultivo de laboratorio, proporcionan un suplemento de ADN que se puede reponer y son empleadas para proporcionar un ADN de referencia para el control de calidad de las tcnicas de tipificacin, El ADN normalmente se prepara de una pequea cantidad (0,2 mi a 1 mi) de sangre total. Se puede emplear muchos protocolos diferentes para aislar el ADN de las clulas, y tambin hay equipos disponibles en el mercado para la preparacin del ADN. La sensibilidad de la deteccin de los tipos del HLA aumenta considerablemente con la amplificacin del ADN que codifica los genes HLA utilizando la tcnica de la PCR (Saiki, 1998). Se debe complementar con un par de oligonucletidos sintticos (cebadores) a las secuencias alrededor de un gen especfico HLA para generar millones de copias de dicho gen para su uso en la reaccin de tipificacin del ADN. Algunas reacciones de tipificacin emplean secuencias promotoras que son compartidas por todos los alelos de un locus HLA: otras tcnicas de tipificacin emplean grupos de promotores que son compartidos slo por un grupo de alelos del locus. El fijado de los cebadores a la muestra de ADN durante la reaccin PCR usa las condiciones de la reaccin que garantizan que los promotores se unirn a las secuencias perfectamente apareadas (secuencias diana) y no a secuencias de otros locus o de otros alelos que no estn apareadas. Ajustando la temperatura del componente de fijado de la reaccin PCR, el laboratorio de tipificacin puede controlar la especificidad de la amplificacin. Promotor especfico de secuencia. Un mtodo de identificacin de los alelos HLA utiliza promotores especficos de secuencia (SSP) en la reaccin PCR (Olerup, 1992; Bunce. 1995). Los promotores se aaden para desnatu-

ralizar el ADN que contienen los alelos HLA de los que derivaban las secuencias promotoras. En ia subsiguiente reaccin PCR. solo estos alelos seleccionados son amplitcados. El ADN amplificado por los promotores es identificado por electroforesis en gel o, si el ADN es marcado con un colorante durante la amplificacin, por fluorescencia. Este procedimiento es de utilidad en la tipificacin de un pequeo nmero de muestras en un corto periodo de tiempo. Hay equipos disponibles en el mercado. Hibridacin oligonucleotdica especfica de secuencia. Ha sido posible el empleo de la hibridacin de SSOPs con ADN amplificado para identificar alelos (Gao, 1991; Cao, 1999; Williams, 1997). Suele requerirse el empleo de mltiples sondas de oligonucletidos diferentes para definir un alelo HLA especfico o el empleo de un promotor especifico de secuencia unido con hibridacin con paneles de sondas. Un grupo de oligonucletidos capaz de identificar cada alelo es hibridado a ADN amplificado desnaturalizado por PCR unido a un soporte slido. Las condiciones de hibridacin se ajustan de modo que las sondas se aadan al ADN desnaturalizado que contenga los alelos HLA de los que deriv la secuencia del oligonucletido. Los oligonucletidos se encuentran marcados con una terminacin para detectar la hibridacin. Por ejemplo, el oligonucletido puede asociarse a una enzima como la fosfatasa alcalina. Tras la adicin de un sustrato, la losfatasa alcalina degrada el sustrato para producir un componente coloreado o para producir luz (quimioluminiscencia). Tras la visualizacin. puede leerse el patrn de hibridacin para determinar los alelos presentes. La Figura 40-11 ilustra la aproximacin con el empleo de una sonda de oligonucletido para el alelo DOS?, DQBV0302, para identificar pacientes con diabetes dependiente de insulina que tienen este alelo (Todd, 1987). El mtodo SSOP es muy exacto, especfico y fiable (Ng, 1996; Hurley, 2000a). A menudo es utilizado en situaciones donde se tipifican muchas muestras en grandes grupos. Estn disponibles kits comerciales que utilizan este mtodo. En una tcnica relacionada, llamada el formato reverso, las sondas de oligonucletidos se unen a un soporte slido (Bugawan, 1994). El ADN de las muestras que va a ser analizado es amplificado empleando iniciadores marcados con, por ejemplo, biotina. Entonces el ADN amplificado se hbrida a sondas inmovilizadas, que contienen las secuencias encontradas en los alelos presentes en el ADN. Tras la visualizacin (empleando un sistema de deteccin unido a la avidna), se puede leer el patrn de hibridacin para determinar los alelos presentes. Esta tcnica es til para la tipificacin tanto de un nmero de muestras pequeo como grande. Hay equipos disponibles en el mercado que utilizan este mtodo. Polimorfismo conformacional de secuencia especfica (SSCP) o anlisis heterodoble. Otro mtodo, aunque poco usado, de identificacin de los alelos HLA analiza la movilidad del ADN amplificado, ya sea desnaturalizado (SSCP) o como ADN doble renaturalizado (anlisis heterodoble), tras la electroforesis (Arguello. 1996). La movilidad del ADN es comparada con la movilidad del ADN amplificado de los alelos HLA para definir un alelo HLA. Esta tcnica es til en la tipificacin de un pequeo nmero de muestras y particularmente en las comparaciones entre individuos, por ejemplo, en una familia. Secuenciacn del cido nucleico. Un mtodo final de identificacin de alelos HLA implica la determinacin directa de las secuencias de ADN de los alelos HLA transportados por un individuo (tipificacin basada en la secuencia [SBT]). Los alelos son identificados ya sea tras la amplificacin PCR para separar los alelos basados en SSP o como una mezcla de dos alelos. La secuenciacn es una labor intensa y altamente compleja pero puede usarse frecuentemente para determinar el HLA emparentado en un nivel allico entre los pacientes de trasplantes de clulas progenituras hematopoyticas y sus futuros donantes (Petersdorf, 1995a; Rozemuller. 1996; Scheltinga. 1997). Resolucin de la tipificacin basada en el ADN. El nivel de resolucin (i.e., la capacidad de discriminar entre alelos) obtenido por los mtodos de tipificacin de ADN esl controlado por la eleccin y el nmero de iniciadores y/o sondas empleados en el ensayo y por el mtodo de tipificacin. Esta eleccin puede depender del tiempo disponible para el desarrollo de la tipificacin, del coste de la tipificacin, de la experiencia del personal de laboratorio y del pro-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 40-11. 4, Secuencias de nuclelidos de mltiples aletas D0B1. Las secuencias presentadas cubren los codones para los aminocidos 50 a 60. Una raya indica que el nucle2 3 4 5 7 9 10 tido es idntico a l a secuencia d e la pade superior. En un rectngulo est un oligonucleotide que es especifico para la se U I I H I I I I M B M W H M T I I I U B H H H H M H H H M H H U cuencia DQBI'0302. B. Anlisis de transferencia en m a n c h a (oof blot) con oligonucleotides de 17 pacientes IDDM (DMI19) y un control. BML. El ADN amplificado q u e contiene secuencias DQBf de clase II de los pacientes le unido a la membrana e hibridado para el oligonucleotide especfico marcado para la secuencia DQB1 '0302 (descrita previamente). Las seales de hibridacin positiva indican los pacientes que tienen esta secuencia gnica DQB! (pacientes DM1. 2. 4,7,10-16,19). (De Todd JA. Bell J, McDevitt HO: HLA-DQB gene contributes to susceptibility and resistance to insulindependent diabetes mellilus. Nature 1987; 329-599. con perII 12 1 3 14 1 5 16 17 IS 1') UML

psito de la tipificacin. Normalmente la tipificacin para registros de donantes a gran escala se lleva a cabo con una resolucin baja-intermedia, mientras que la tipificacin de un posible donante de clulas progenituras hematopoyticas para un paciente especfico se realiza a un nivel de resolucin allica. A menudo se utiliza un abordaje con mltiples pasos para identificar los alelos HLA por tipificacin basada en el ADN. Por esta razn, los tipos de HLA definidos por la tipificacin basada en el ADN pueden mostrarse con diferentes niveles de resolucin. El nivel de resolucin bajo (o genrico o seroigico) de tipificacin basada en el ADN produce un resultado similar en apariencia y en detalle a un tipo seroigico. Por ejemplo, un tipo definido por ADN. el DRBI'tl o el DRBV11XX. es el equivalente aproximado del tipo seroigico DR11. El "XX" indica que el alelo no fue definido. En este nivel de resolucin, no es posible determinar cul de los ms de 30 alelos DRBI'11 tiene el individuo que est siendo analizado. Aunque la tipificacin serolgica pues ser tan informativa como la tipificacin de baja resolucin, los resultados son ms fiables con el anlisis basado en el ADN. El nivel intermedio de resolucin de tipificacin basada en el ADN puede reducir las opciones enumerando mltiples posibilidades diferentes para el tipo de un individuo, (p. ej., DRBV1101 o DRBl'1104). Finalmente, el nivel de resolucin alto (o a nivel allico) de la tipificacin basada en el ADN identifica el alelo especifico que transporta un individuo (p. ej.. DRBV1104). Ya que la identificacin de los alelos HLA puede basarse en la secuencia de informacin parcial, es posible que la interpretacin de los resultados pase por alto alelos que eran desconocidos en el momento de la tipificacin (Hurley. 1997b). Por esta razn, los laboratorios tienen cuidado de mantener sus datos de tipificacin brutos (p. ej., qu promotores y qu sondas fueron positivos y negativos y las secuencias de nucieotidos de los reactantes) de modo que los resultados puedan reinterpretarse a mediada que se describan los nuevos alelos.

los ndices de error (Bozon, 1997; Yu, 1997). La reproductibilidad para especificidades determinadas serolgicamente del HLA-C y clase II es m u c h o menor. El HLA-DP normalmente no se define por serologia. El ensayo seroigico de microcitotoxicidad todava se utiliza ampliamente para las especificidades de clase I (HLA-A, -B) pero ha sido sustituido por el anlisis basado en el ADN para las especificidades HLA-C y de clase II (HLA-DR, -DQ, -DPj en muchos laboratorios de tipificacin. El anlisis basado en el ADN con su mayor resolucin se utiliza para determinar el tipo de HLA de individuos n o emparentados y de miembros de una familia especialmente si la segregacin del HLA no puede discriminarse con seguridad por serologia (p ej.. familias donde los padres no estn disponibles o familias donde los padres comparten un antgeno HLA). Por eiemplo. un descendiente hereda un DR4 de cada pariente y por eso el es homocigotico para el antigeno DR4 (DR4. DR4). Sin embargo, la tipificacin del ADN de alta resolucin puede identificar dos alelos distintos del antgeno DR4, el DRBf040t y el Dfl8r0403(heterocigtico para el alelo DRBV04), proporcionando datos informativos para los anlisis de segregacin del haplotipo. Preparacin de los linfocitos. Los linfocitos utilizados rutinariamente en los ensayos de tipificacin serolgica del HLA se obtienen rpidamente de la sangre total perifrica sedimentndola con un gradiente de Ficoll-Hypaque para separar los eritrocitos por densidad de centrifugacin. Los linfocitos de sangre perifrica separados (PBLs) pueden emplearse para la tipificacin del HLA-A. -B. -C. Para analizar las especificidades serologicas del HLA-DR. DQ. es necesario o enriquecer los linfocitos B o utilizar una tcnica de fluorescencia de dos colores especial para diferenciar simultneamente las clulas B y las clulas T no separadas. Ensayo de microcitotoxicidad linfocitica. El fenotipo HLA se determina analizando la preparacin de linlocilos no separados (PBL) o los linfocitos T (para el HLA-A. -B. -C) o los linfocitos B enriquecidos (para el HLA-DR, DQ) frente a un panel de aloantisuero HLA bien caracterizado. El ensayo es un test de dos etapas. Durante la etapa de de sensibilizacin, los linfocitos son incubados con el antisuero. Se aade suero de conejo en exceso preanalizado y estandarizado como fuente de complemento y la mezcla se incuba durante un periodo adicional. Si los linfocitos llevan una molcula de superficie celular reconocida por los anticuerpos fijadores del complemento del aloantisuero, los anticuerpos se unen a las clulas y las clulas son usadas subsiguientemente tras la adicin del complemento. El ensayo termina con la adicin diacetato de fluoresceina y de bromato de elidi para las tcnicas de deteccin

Deteccin serolgica de las molculas de clase I y clase II

El anlisis de la microcitotoxicidad de los linfocitos. que ongnalmente se utilizo en el sistema del ratn por Gorer y Amos y despus fue modificado por Terasaki y McClelland para el empleo en el sistema humano, ha sido usado para la tipificacin del HLA desde los aos 60. El anlisis seroigico del HLAA, -B, puede reproducirse en condiciones controladas y estandarizadas; sin embargo, los anlisis a gran escala (p, ej., para registros), pueden aumentar

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ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

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fluorescentes, o tanto con eosina y formalina como con trypan azul y cido actico etilendiamineter (EDTA) para las tcnicas de visualizacin de colorantes. Las reacciones se leen en porcentaje de lisis y se gradan numricamente. Cubetas de suero para tipificacin del HLA. Los reactantes de tipificacin del HLA derivan del suero de individuos aloinmunizados (mujeres multparas, receptores de trasplantes, pacientes multitransfundidos e inmunizacin planificada en humanos). Las placas con mltiples pocilios de aloantisuero humano (esto es. cubetas de tipificacin del HLA) estn disponibles en el mercado. Debido a la complejidad antignica de los anlgenos HLA. deben utilizarse mltiples antisuero para definir cada especificidad. Muchos de los laboratorios utilizan cubetas de al menos dos vendedores diferentes o pueden utilizar aloantisuero obtenido localmente. Como muchos aloantisueros no son verdaderamente monoespeclicos y muchos presentan alguna reactividad cruzada, la reactividad de cada antisuero debe analizarse cuidadosamente y conocerse para la interpretacin de los resultados. Esto requiere un estrecho control de calidad de cada nuevo lote de cubetas de tipificacin con clulas de referencia bien caracterizadas. Como el titulo y la especificidad del anticuerpo formado por un individuo sensibilizado puede no ser constante con el tiempo, los suplementos de anlisuero son limitados. En un intento de crear un suplemento consistente y no limitado de reactantes, algunas compaas han producido anticuerpos monoclonales. Estos reactantes monoclonales no estn disponibles para todas las especificidades HLA. Reactividad cruzada. El aloantisuero HLA puede reaccionar con ms de un producto allico HLA. Este fenmeno puede proceder de la poliespecificidad del antisuero y/o de la reactividad cruzada y es responsable de los complejos patrones de reactividad de algunos aloantisueros. El suero poliespecfico contiene dos o ms anticuerpos, que pueden ser adsorbidos para retirar uno, con pequeo efecto sobre la reactividad del otro(s). El antisuero con reactividad cruzada contiene, ms frecuentemente, un anticuerpo simple que reacciona con un determinante antignico compartido entre mltiples productos allicos HLA diferentes (p. ej., CREG o determinantes amplios, como se trat previamente) (Rodey, 1994). Las reacciones cruzadas ocurren ms frecuentemente entre los productos allicos codificados por el mismo locus pero pueden ocurrir entre productos allicos codificados por locus diferentes (p. ej., A2 + B17). En la Figura 40-9 y en la Tabla 40-6 se dan ejemplos y la localizacin de los determinantes de la reactividad cruzada.

con los subsiguientes acontecimientos, como la extensin de la EICH. todava son controvertidas.

TRASPLANTE DE RGANOS/TEJIDOS
La supervivencia a largo plazo de rganos slidos y de los injertos de clulas progenitoras hematopoyticas representa uno de los retos ms importantes de la ciencia mdica. El trasplante renal es la terapia de eleccin para la mayora de los pacientes con enlermedad renal en fase terminal. El trasplante de progenitores celulares hematopoytcos, de corazn, de pulmn, de higado y de pncreas est ganando una amplia aceptacin como tcnicas teraputicas con resultados satisfactorios. El principal obstculo al trasplante de rganos slidos y de progenitores de clulas hematopoyticas es el rechazo mediado inmunolgicamente al tejido extrao. Por lo tanto, el xito de un aloinjerto depende de la capacidad para detener la reaccin inmune, lo cual puede realizarse por: 1) concordancia de histocompatibilidad entre el donante y el receptor; 2) terapia inmunosupresora del receptor (Suthanthiran, 1996); y 3) lograr que el receptor no responda al aloantgeno o aloantigenos del donante (esto es, tolerancia) (Remuzzi, 1995).

Bases genticas del trasplante

Las bases genticas del trasplante fueron determinadas por primera vez en 1916 como resultado de experimentos de trasplantes tumorales en ratones y posteriormente se extendi a trasplantes de tejido normal (Snell, 1981). Se demostr que los injertos cutneos en linajes nativos que eran homocigotos en el locus de histocompatibilidad (esto es, injertos singnicos) tenan xito, pero los injertos entre dos linajes nativos diferentes (alotrasplantes) eran rechazados. Adems, los aloinjertos de cualquier linaje nativo emparentado (dos copias de los mismos genes MHC; homocigotos) o de la primera generacin (F1) hibridada (una copia de cada uno de los dos grupos diferentes de genes MHC de dos padres homocigotos) sobrevivan en animales; mientras tanto, los injertos de descendientes F1 hbridos de cualquier progenitor (un haplotipo no emparentado) no sobrevivan. Estas observaciones establecieron las leyes del trasplante. En 1948, Gorer (Snell, 1981) delini el locus d e histocompatibilidad mayor en el ratn, el H-2. Hay otros antigenos de histocompatibilidad o H, que son denominados mHag. Aunque son llamados menores, la discordancia para estos antgenos puede tener efectos importantes (Goulmy. 1997: Dupont, 1998).

Deteccin celular de las molculas de clase II

L a respuesta de una clula en el cultivo tisular a los aloantgenos en la superficie de una segunda clula se denomina cultivo mixto de leucocitos (CML) o reaccin linfocitica mixta (MLR) (Hartzman. 1971). El CML es considerado una medida in vitro de la disparidad de clase II entre individuos que reconocen determinantes encontrados en las molculas de clase II. que son conocidos colectivamente como HLA-D. La respuesta de las clulas T se produce unidireccionalmente impidiendo que se dupliquen las clulas de uno de los dos individuos tratando dichas clulas con radiacin o mitomicina-C antes de su adicin al cultivo. El CLM representa una respuesta sumatoria de una clula respondedora a las diferencias en los mltiples determinantes en las molculas HLA de clase II (DR, DQ y DP) codificadas por los haplotipos de clulas estimuladoras irradiadas. La respuesta a las molculas DR parece predominar.

A medida que existan evidencias convincentes en modelos animales experimentales de que las molculas codificadas por el MHC representan la mayor barrera gentica del xilo del aloinjerto. la tipificacin del HLA fue utilizada en humanos para determinar y para optimizar la compatibilidad entre el injerto del donante y el receptor. Inicialmente, la influencia de los antgenos HLA en la supervivencia del injerto fue investigada injertando piel no vascularizada entre miembros de una familia. Como en los estudios de ratones hijos, los injertos cutneos entre hermanos HLA idnticos sobrevivieron significativamente ms que los injertos entre hermanos padres o donantes no relacionados con un haplotipo emparentado. Estas observaciones se extendieron al trasplante renal durante los ltimos aos de la dcada de los 60 y los primeros de la de los 70. Los datos ms recientes del Estudio Colaborador Internacional de Trasplante (CTS) en Heidelberg y de la United Network for Organ Sharing (UNOS) Registry en los Estados Unidos (analizado en UCLA), confirEl empleo del CLM en los laboratorios clnicos para determinar la histoman que el MHC es la principal barrera gentica en el trasplante de injertos compatibilidad ha declinado debido a las limitaciones inherentes a la tcnica. El CLM puede estar influenciado por la salud del paciente, por el tipo de enfer- renales (Cecka, 1999; Opelz. 1999) (Fig. 40-12; para datos actuales vanse las pginas web sealadas en la Tabla 40-1). Los datos para el trasplante de medad y por la historia de una transfusin previa (Mickelson, 1996). Por estas clulas progenitoras hematopoyticas tambin reafirma el papel del MHC en razones el ensayo CLM se ha reemplazado por mtodos de tipificacin basala evolucin del trasplante determinado por la supervivencia del paciente y por dos en el ADN, ms precisos. Actualmente, en algunos centros de trasplanla EICH (Hansen, 1999) (Fig. 40-13). tes, el cultivo mixto de leucocitos se emplea para identificar receptores de aloinjerto renal con hiporreactividad especifica a las molculas HLA del donante tras el trasplante como una guia para reducir la inmunosupresin Concordancia de histocompatibilidad (Reinsmoen, 1993). Concordancia de HLA. Aunque el nivel de concordancia del HLA es un elemento importante en el resultado del trasplante, la concordancia de la histocompatibilidad significa diferentes cosas en diferentes situaciones y las estrategias para determinar esto varan. Los criterios difieren con variables

Se ha utilizado el anlisis de dilucin limitada para definir la frecuencia de los linfocitos T citotxicos (LTC ) o coadyuvantes (LTC) para predecir la extensin del alorreconocimiento en trasplantes de clulas progenitoras hematopoyticas (Madrigal, 1997). Las correlaciones de estas frecuencias
P p

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INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

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Tabla 40-8 E j e m p l o s d e asociaciones entre los alelos HLA y sus tipos serolgicos Alelos HLA A'0201 A '2603 A-660V B'2702 B'2708' B'1502 B-1503 B' 1536' DRBV0301 DRB1V404 Antigenos HLA

A2 A26 A26 A66 B27 B7 B27 B75(15) B72 (70) No definido DR17(3) DR4 ' El laboratorio puede asignar A66. o ms recuentemente. 26 a las clulas que transportan este alelo. ' Muchos laboratorios tipan serologicamente una clulas con este alelo c o m o B7: sin embargo, la reactividad serolgica sugiere que la tipificacin difiere levemente del B7 "estndar' Las clulas que transportan este alelo no han sido carcter i/adas soioiog camenle
1

dantes para cuatro de seis alelos o anligenos se denominan 4/6 concordancias. Las diferencias aparentes en el nivel de concordancia pueden surgir a causa de la metodologa de tipificacin empleada para asignar los tipos de HLA (p. ej tipificacin serolgica frente a basada en el ADN). Las nomenclaturas serolgicas y ADN, aunque estn relacionadas, pueden diferir. En la Figura 40-12. Supervivencia a cinco aos de aloinjerto renal (primer trasplante) de Tabla 40-8 se dan ejemplos de estas relaciones y se ha publicado una lista tres categoras de histocompalibilidad: hermanos HLA idnticos; un haplolipo d e vida relacionado: donante de cadver, llenos de hermanos donantes HLA idnticompleta (Schreuder. 1999). La definicin de una concordancia tambin puede cos ( a m b o s con cromosomas H L A concordantes) tienen los mejores resultados Se variar dependiendo del tipo de resolucin. Un paciente y un donante pueden indica el numero de trasplantes estudiados (regresin p < 0.0001) (De Opelz G, parecer ser concordantes en el nivel serolgico (p. ej.. receptor: A2. A26: Wujoak T, Dohler B. y col: H L A compatibility and organ transplant survival. Rev donante: A2. A26): sin embargo, la pareja puede ser discordante en el nivel de Inmunogenet 1999; 1:334, con permiso) alelos HLA (p. ej., receptor: A'0201. A'260l: donante: A'0205. A'6601). El nivel de concordancia allico para las molculas de HLA clsicas puede optimizar el resultado de todos los injerios, tanto de rganos vasculares como de clulas progenituras hematopoyticas (Opelz, 1999; Petersdori, 1998). Sin que incluyen el tipo de injerto (p. ej., rgano slido vascularizado frente a proembargo, debido al gran nmero de alelos HLA, el nivel de concordancia algenitor de clula hematopoytica), la enfermedad (p. ej.. leucemia mielode lico es difcil. Por lo tanto, debe considerarse un nivel de concordancia que crnica (rente a anemia aplsica), la edad del paciente y el protocolo clnico garantice un buen resultado para el mximo nmero de pacientes de todas las (p. ej., sangre de mdula frente a sangre de cordn umbilical: deplecin poblaciones tnicas. medular de clulas T frente a no deplecin de clulas T) (vase Cap. 33). La concordancia normalmente incluye la evaluacin de al menos tres locus, Tras el trasplante de clulas progenitoras hematopoylicas, los determiel HLA-A. el HLA-B y el HLA-DR. Los individuos concordantes, en cualquier nantes subtipicos o las diferencias allicas inician una importante respuesta resolucin, para los tres locus se denominan 6/6 concordancias o 0 discorcitotxica de clulas T conduciendo al rechazo del injerto y a la EICH. De dancias. Cero discordancias (un trmino empleado en el trasplante de rganos hecho, los estudios han mostrado que la concordancia de alta resolucin para slidos) tambin puede referirse a pares de donante/receptor, donde el donanlos alelos de clase I y clase II del donanle y el receptor puede mejorar el resulte no tiene diferencias HLA detectables con el receptor, esto es, donde el tado tras el trasplante de mdula no emparentado. Los datos recientes sugiedonante es homocigoto para los alelos en uno o ms de los locus (p. ej., donan- ren que mltiples discordancias son malas para el resultado; sin embargo, el te homocigoto: A'0101: B'0801: DRBT0301: receptor heterocigoto: A'0101: impacto tanto de las discordancias simples como del locus especifico todava A'0301: B'0801: B'0702: DRBV0301. DRBV1501). Los individuos concorno est bien definido (Petersdorf, 1998: Sasazuki. 1998: Hansen. 1999). Solo HLA-ID III RMANO n 4.343 1 -IIAPI. PARIATI-.se n- 18.071 CADVER n 105.360

Figura 40-13, Probabilidad de EICH aguda grados ll a IV en hermanos HLA idnticos (concordancia genotpica HLA) y variabilidad en trasplantes de donantes medulares haploidnticos emparentados con concordancia para el HLA-A. -B o DR/Dw (discordancia HLA: 3 locus, 2 locus, 1 locus o 0 locus). La concordancia para el HLA-A, -B y -DR fue definida por seroiogia. y la concordancia para el H L A D w fue definida p o rC M Lo por tipificacin de los alelos HLA-DRBl con SSOP. Todos los pacientes recibieron mdula no modificada (sin deplecin de clulas T) tras un rgimen de preparacin que incluy la irradiacin corporal total. Se dieron ciclosporina y metotrexato para la profilaxis de la EICH (De Hansen JA. Y a m a m o t o K. Petersdori E. y col: T h e role of H L A matching in hematopoietic cell transplantation. Rev I m m u n o g e n e t 1999; 1:359, copyright 1999 Munksgaard International Publishers Ltd. Copenhagen. Denmark, con permiso.)

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una minora de pacientes que estn esperando el trasplante recibirn injertos de donantes totalmente concordantes (Hurley, 2000b). Para permitir a todos los pacientes beneficiarse de trasplantes que salven la vida, la identificacin de los alelos no emparentados que son bien tolerados permitir la seleccin de donantes no emparentados estableciendo prioridades de acuerdo con el riesgo biolgico de los HLA especficos no concordantes. La concordancia ptima para los injertos de rganos slidos puede diferir de los requerimientos de concordancia para el trasplante de clulas progenituras hematopoylicas. Los datos recientes sugieren que tanto el locus HLA emparentado como el nivel de resolucin del anlisis del HLA contribuyen al resultado del injerto renal (Opelz. 1999). Actualmente la UNOS facilita la comparacin de rones de cadveres basndose en las especificidades subtipicas. Ya que las concordancias subtipicas se identifican infrecuentemente, se ha propuesto que las molculas HLA de clase I sean emparentadas para los amplios determinantes CREG. El CREG puede definir los determinantes mmunodominantes reconocidos en la respuesta inmune humoral. Rodey (1994) mostr que del 80% al 90% de los aloanticuerpos HLA formados por el receptor tras el trasplante de rion estn dirigidos contra los determinantes CREG. Los determinantes CREG son compartidos entre las dilerentes molculas HLA de clase I y. en contraste con las especificidades subtpicas. tienen una distribucin similar entre los grupos de poblacin tnica. En el CREG se incluyen especificidades subtpicas raras. Y a que el nmero de CREGs es menor que el nmero de especificidades subtpicas. la probabilidad de emparentar un nivel CREG es mayor que para un nivel subtpico o allico de HLA clase I. Por lo tanto, la distribucin de rganos basndose en la concordancia CREG debe originar una alta probabilidad de que se distribuyan equitativamente injertos emparentados a receptores de todas las poblaciones tnicas. Un anlisis retrospectivo de los datos de la UNOS corrobora estas predicciones sobre la distribucin (Ellison, 1994), aunque los estudios todava estn en progreso. El impacto de la concordancia CREG en el resultado del injerto es desconocido, pero se est evolucionando. En Europa, una estrategia para eliminar el excesivo tiempo de espera de los receptores con fenotipos HLA raros se implant en 1996 mientras se mantena la distribucin de los injertos bien emparentados (Opelz. 1999). Otras estrategias se centran en la concordancia de los fragmentos biolgicamente relevantes de las molculas del MHC (p. e| concordancia de eptopo) (Suciu-Foca, 1998; Harris, 1999). Hasta hace poco, el reconocimiento directo de los aloantgenos se pens que era la principal via de respuestas de los injertos. Sin embargo, los estudios sugieren que la respuesta indirecta juega un papel significativo en el rechazo del injerto, al menos en los injertos de rganos slidos (Sayegh, 1996). Si se activa la via indirecta, entonces los epitopos peptidicos generados por la ruptura proteolitica de la molcula HLA y no por la molcula HLA en si misma sern el estmulo inmunognico. Por ello pueden disearse nuevas estrategias innovadoras para la definicin de las discordancias deducbles basndose en el reconocimiento de los fragmentos peptidicos. Por ejemplo, una estrategia puede considerar si las molculas HLA del donante no emparentado sern interpretadas como inmunognicas en el receptor (es decir, si las molculas HLA del receptor se unirn y presentarn estos epitopos). Tericamente, uno puede identificar secuencias peptdicas de HLA extrao no presentado por las molculas HLA especficas del receptor y por ello definir las discordancias deducbles para las molculas HLA dadas. La complejidad inherente en la interpretacin de los resultados de la tipificacin del HLA y en la seleccin de un donante hace crtico incluir un experto en los anlisis de hislocompalibilidad. Los expertos en la tipificacin del HLA conocern las ventajas y las limitaciones de cada mtodo de tipificacin asi como la frecuencia de los alelos y los haplotipos en la poblacin, informacin importante tanto en la bsqueda como en la seleccin de un donante adecuado. Deteccin de anticuerpos especficos del HLA en el suero del receptor. Los pacientes pueden sensibilizarse a molculas H L A extraas especficas a travs de una transfusin, el embarazo, o trasplantes anteriores. La evaluacin de la compatibilidad entre el receptor y el posible donante incluye el anlisis para esta sensibilizacin. El suero del receptor es analizado antes del trasplante en un panel (linfocitos o molculas de HLA solubles inmovilizadas) de un perfil HLA conocido para medir la reactividad anticuerpo panel (PRA). En el momento del trasplante, el suero del receptor es analizado con

los linfocitos prospectivos del donante para identificar la reactividad especfica para el donante potencial en la prueba cruzada especfica de donante. Aunque las tcnicas utilizadas para detectar el anticuerpo de unin pueden diferir entre los laboratorios, los propsitos siguen siendo obtener un perfil de factores de riesgo inmunolgico del receptor en la lista de espera, que ser de ayuda al equipo mdico tanto en las decisiones pretrasplante como en las postrasplante. La unin del anticuerpo en el suero actual del receptor a los linfocitos Tdel donante es una contraindicacin para el trasplante renal Anlisis del suero (PRA). La caracterizacin cuidadosa del perfil de anticuerpo de los pacientes en espera de un trasplante es de ayuda en la interpretacin de las concordancias cruzadas especificas de donante pretrasplante. Los objetivos del anlisis PRA son: 1. Identificar el nivel de presensibilizacin del paciente a los antgenos HLA. Un paciente con un exceso de PRA del 60% (i.e., el suero del paciente reacciona con especificidades encontradas en al menos el 60% del panel) tiene una menor probabilidad de concordancia cruzada donante-especfica negativa y, por ello, de recibir un trasplante de un trasplante no emparentado. 2. Identificar la especificidad HLA de los anticuerpos para predecir el antigeno(s) HLA que sern evitados cuando se seleccionen los donantes. 3 Identificar pacientes con anticuerpos irrelevantes (p. ej.. IgM autoanticuerpos) de modo que se puedan seleccionar las tcnicas apropiadas para evitar falsos positivos en la lectura en el momento de la concordancia cruzada donante-especfica. La caracterizacin del anticuerpo HLA especfico presente en el suero del receptor requiere un anlisis en un panel seleccionado de especificidades HLA bien definidas. Se deben incluir en el panel de control los linfocitos o los antgenos solubles de un nmero suficiente de individuos para asegurarse de que se detectarn todos los anticuerpos dirigidos contra el HLA salvo los ms raros. En la medida de lo posible, el panel de control debe permanecer igual de modo que los resultados sean comparables en el tiempo. El receptor de un trasplante renal forma frecuentemente anticuerpos frente a CREGs ms que frente a especificidades subtpicas (Rodey. 1994,1997) de modo que el anlisis de la reactividad del panel debe considerar la identificacin de CREG asi como la de especificidades subtpicas. La identificacin de especificidades de anticuerpo en los pacientes que esperan el trasplante ayuda a la preseleccin de un donante potencial del que el receptor tendr una concordancia cruzada final negativa. Los programas de ordenador ayudan en la seleccin (Claas, 1999: Duquesnoy, 1999). La frecuencia del control y la seleccin de los ensayos empleados para el control son decisiones basadas en el perfil inmunolgico del individuo receptor. El descenso del empleo de las transfusiones sanguneas ha hecho innecesaria la necesidad de un control mensual de las muestras de suero de todos los pacientes (pgina web ASHI: Tabla 40-1). La presencia tanto de anticuerpos especficos HLA de clase I como de clase II es detectada por el anlisis del suero en un panel de linfocitos (p. ej., por citotoxicidad directa dependiente del complemento o por ensayos de citotoxicidad aumentados con antiglobulina) o en un panel de molculas HLA soluble inmovilizadas con placas (es decir, ensayo con enzima unida mmunoabsorbente [ELISA]) o en gotas (es decir citometra de flujo). (Los ensayos se describen con detalle en el manual ASHI [2000].) Una ventaja del ensayo con antigeno soluble de fase slida es que puede ser diseado para detectar solo IgG. anticuerpos especlicos frente al HLA de clase I. Las muestras de suero de los receptores potenciales deben almacenarse a -70 C y protegerse del dixido de carbono y de la evaporacin Las muestras de suero caracterizadas almacenadas sern utilizadas en la prueba cruzada especifica de donante para evaluar la compatibilidad con un donante prospectivo. Prueba cruzada especfica de donante. L a concordancia cruzada de linfocitos analiza la presencia de anticuerpos, si los hay, en el suero de un receptor potencial que reaccionan con los linfocitos del donante especfico. En el test de reactividad cruzada, el linfocito es la clula diana de eleccin, ya que expresa altos niveles de molculas HLA y es fcil de aislar. Este test es probablemente la contribucin ms importante de los laboratorios de tipificacin de tejido HLA al trasplante renal. El propsito de la reactividad cruzada es prevenir el rechazo hiperagudo y detectar anticuerpos que identifiquen fac-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

lores de riesgo inmunolgico en pacientes que esperan un trasplante. La aparicin del rechazo hiperagudo se correlaciona significativamente con la reactividad cruzada de la citotoxicidad directa dependiente del complemento positiva (CDC) entre los linfocitos T del donante y el suero del receptor en el momento del trasplante. La reactividad del suero vlido actual del receptor a los linfocitos T del donante es una contraindicacin para el trasplante de injerto renal. La deteccin de anticuerpos reactivos al donante en muestras anteriores de suero de receptores no es una contraindicacin pero puede representar un nesgo para la prdida del injerto distinto del rechazo hiperagudo inmediato (Cardella, 1982; Geddes. 1999). La reactividad cruzada especifica de donante tambin se utiliza en algunos centros para predecir el fallo del injerto de clulas progenitoras hematopoyticas (Hansen, 1997). Los requerimientos u mtodos para la reactividad cruzada especifica de donante estn determinados en los estndar de la Sociedad Americana de Histocompatiblidad e Inmunogentica (Tabla 40-1) y en el manual de tcnicas ASHI (2000). Las tcnicas aceptadas hasta el momento incluyen el Amos modificado CDC, la extensin del tiempo de incubacin de la CDC. la CDC aumentada con antiglobulina y la citometria de flujo. Tcnicas de deteccin de anticuerpos. Diferentes laboratorios pueden utilizar diferentes combinaciones de ensayos para detectar anticuerpos. El nivel de sensibilizacin detectado variar con el ensayo. El anticuerpo especifico detectado variar con la clula diana. Citotoxicidad directa dependiente del complemento (CDC). La CDC directa incluye todos los ensayos que utilizan la adicin de complemento para detectar la unin directa del anticuerpo con los linfocitos. La fijacin del complemento por los complejos anticuerpo-antigeno sobre la superficie de las clulas originar la muerte celular o la citotoxicidad. Los mtodos de CDC incluyen la tcnica bsica (no hay periodo de lavado antes de aadir el complemento), la tcnica Amos modificada (etapa de lavado aadida antes de la adicin del complemento) y tcnicas de aumento del tiempo de incubacin La etapa de lavado elimina el suero que puede contener sustancias que dificultan la activacin del complemento. Las ventajas de las tcnicas de CDC directa son que son reproducibles y que la correlacin con la incidencia de rechazo hiperagudo es excelente. Tcnicas de reactividad cruzada indirecta. Las tcnicas indirectas incluyen la citotoxicidad aumentada con antiglobulina (AHG) y la citometria de flujo. Ambas utilizan un reactante especifico para la inmunoglobulina humana para aumentar la deteccin de anticuerpos dirigidos contra el HLA. Las tcnicas indirectas detectan la presencia de anticuerpos especficos frente a antigenos de reactividad cruzada (CREG) que frecuentemente no son detectados en los ensayos CDC. Las ventajas del ensayo por citometria de flujo incluyen la discriminacin de las subclases de clulas unidas a las inmunoglobulinas (IgG frente a IgM) y la caracterizacin de la clula diana que se une al aloanlicuerpo (linfocito T frente a linfocito B frente a monocito). Autoanticuerpos. Se sabe que la presencia de autoanticuerpos circulantes en el receptor es nociva. Por ello, debe llevarse a cabo una autorreactividad cruzada, preferiblemente cuando el paciente se incluye en la lista de espera del trasplante. Si estn presentes autoanticuerpos. el suero utilizado para la reaccin cruzada con el donante debe tener la autorreactividad eliminada. Los autoanticuerpos son primariamente IgM y los anticuerpos HLA especficos son primariamente IgG (Barger, 1989) Tanto la inactivacin con calor a 63 1 C o la reduccin con los agentes qumicos ditioeritrtol (DTE) o ditiotreitol (DTT) de cualquiera de los anticuerpos IgM potencales se utiliza para diferenciar entre anticuerpos IgM e IgG en las muestras de suero. Si la muestra de suero inactivada con calor o tratada con DTT es negativa, aun cuando la muestra no tratada sea positiva, la mayora de los centros seguirn adelante con el trasplante. Sin embargo, el DTT o la inactivacin con calor deben emplearse con precaucin, ya que no todos los anticuerpos HLA especficos son IgG y por ello, si no se controla correctamente, ambas tcnicas pueden eliminar la actividad IgG y la IgM. Anticuerpos frente a las clulas B. En algunos centros puede llevarse a cabo una reactividad cruzada utilizando linfocitos B del donante (reactividad cruzada de clula B) en los pacientes sensibilizados. Una prueba de reactividad cruzada positiva frente a clulas B especficas del donante no es una contraindicacin para el trasplante. El significado clnico todava no se

ha resuelto, pero la prueba positiva puede ser un factor de riesgo, particularmente en pacientes que han sido trasplantados previamente. Los anticuerpos detectados en la reactividad cruzada de clula B pueden ser (1) especficos de clase II, HLA-DR. -DQ. (2) anticuerpos de baja especificidad para el HLA-A. -B. -C (las clulas B tienen una alta densidad de molculas de clase l y son ms sensibles a los ensayos dependientes del complemento que las clulas T). y/o (3) anticuerpos no especficos del HLA (p. ej., autoanticuerpos). Para interpretar una reactividad cruzada de clula B positiva, puede ser necesario juntar el suero del receptor con plaquetas antes de desarrollar la reactividad cruzada con el donante. (Las plaquetas expresan molculas de clase I pero no de clase II.) Las dos tcnicas de reactividad cruzada de clula B utilizadas ms frecuentemente son el CDC y los ensayos de citometria de flujo. Seleccin de las muestras de suero del receptor para la reactividad cruzada con el donante. En pacientes con sensibilizacin no detectable (es decir. 0% PRA). puede usarse la muestra de suero disponible ms reciente para la reactividad cruzada especifica de donante. Si el paciente tiene anticuerpos preexistentes o ha tenido un acontecimiento sensibilizante reciente, debe recogerse una muestra de suero en el momento (Le., en las 48 horas antes del trasplante). En receptores sensibilizados, las muestras representativas, incluyendo la ms reactiva o muestra de suero "pico", son analizadas en muchos centros ya que una muestra positiva de donante anterior puede ser considerada un factor de riesgo particularmente en el paciente que rechaz precozmente un injerto anterior en el periodo postrasplante (Mahoney, 1996).

Trasplante renal
La prctica actual es seleccionar donantes para receptores que son ABO compatibles, tienen reactividad cruzada especfica de donante de clulas T negativa con un suero receptor adecuado y la mejor concordancia HLA disponible. El hallazgo original de que los injertos de rion entre hermanos HLA idnticos sobrevivan significativamente ms que los injertos transplantados entre hermanos HLA no emparentados o combinaciones de hermanos-parientes se ha confirmado consistentemente. La Figura 40-12 muestra el anlisis ms reciente de supervivencia a cinco aos de aloinjertos renales del registro internacional CTS entre tres categoras de donantes: (1) hermano HLA idntico, 84% de supervivencia; (2) pariente vivo con un haplotipo, 73% de supervivencia; (3) todos de cadver. 66% de supervivencia. El impacto de la concordancia para el MHC en trasplantes de parientes vivos se observa claramente comparando las categoras 1 y 2. Resultados similares se observan en la base de datos de la UNOS (Cecka, 1999). Aunque los resultados de los anlisis sobre injertos de parientes vivos confirman el papel del MHC como la mayor barrera gentica en el xito del resultado del injerto, la demostracin y la aceptacin de la influencia positiva de la concordancia HLA en el resultado del injerto en los trasplantes de cadver no emparentados ha sido ms controvertida. Sin embargo, los datos de la supervivencia a largo plazo de estudios multicntncos colectivos son consistentes a la hora de mostrar un efecto altamente significativo de la concordancia del HLA en la supervivencia del trasplante renal de cadver (Fig. 40-14) (Opelz. 1999; Cecka. 1999). Ms an, dos estudios de centros independientes, uno de Europa (Oslo) y otro del norte de Amrica (Toronto) han informado de una mejora significativa en la supervivencia del injerto como una funcin de la concordancia del HLA (Fig, 40-15) (Leivestad, 1999: Geddes, 1999). Un centro aislado puede requerir la priorizacin basada en la concordancia HLA para trasplantar a suficientes receptores con injertos bien emparentados para mejorar la significacin estadstica en el resultado de los anlisis. Aunque los nmeros son pequeos, se ha observado una influencia altamente significativa de la concordancia del HLA en el resultado de los injertos de rion de donantes vivos no emparentados (Opelz, 1999). Los injertos con cero discordancias (0 MM) de donantes cadver sobreviven significativamente mejor y aproximadamente tan bien como los injertos de hermanos HLA idnticos (Figs. 40-12 y 40-14): por ello, la UNOS ordena compartir de 0 MM rones La supervivencia del injerto en pacientes tras los primeros trasplantes de rion disminuye proporcionalmente a medida que aumenta el nmero de discordancias de 0 MM a 6 MM (Cecka, 1999; Opelz, 1999). Sin embargo, para asegurar la distribucin equitativa de

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ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

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rganos a lodos los receptores, incluyendo aquellos con haplotipos HLA raros, se han adoptado por los programas de distribucin de rganos nuevos algoritmos para la priorizacin de receptores en lista de espera (Opelz, 1999). Los resultados de los datos ms recientes tanto de supervivencia de injerto como de paciente pueden verse a travs de pgina web de la CTS (Tabla 40-1). La concordancia del injerto inicial no solo aumenta el tiempo de supervivencia del injerto, sino que disminuye la probabilidad de sensibilizacin del receptor y facilita el retrasplante. La acumulacin de pacientes altamente sensibilizados en la lista de espera es un problema significativo en muchos centros, ya que los pacientes esperan durante largos perodos de tiempo y pueden presentar problemas clnicos de difcil tratamiento (Sanfilippo, 1992).

Trasplante de rganos no renales

La supervivencias de los injertos de corazn, hgado, pulmn y pncreas es buena, con entre un 58% y un 67% de supervivencia de los primeros injertos en cinco aos (Fig. 40-16). Los donantes normalmente no tienen concordancia en el tipo de HLA. y no se hace rutinariamente una reactividad cruzada pretrasplante con el donante. Se recomiendan los controles de anticuerpos sricos para identificar el estado de sensibilizacin como un factor de riesgo inmunolgico para el receptor. Si es posible, los receptores de injerto y los donantes cadveres de injertos vascularizados no renales deben ser clasificados para el HLA para permitir anlisis retrospectivos. Los datos recientes de la CTS internacional no muestran el efecto de la concordancia HLA en el resultado del trasplante de hgado: sin embargo, los datos de la CTS muestran un impacto significativo de la concordancia del HLA-A. -B y -DR en el resultado de los primeros trasplantes de corazn (Opelz, 1999). El perodo aceptable para la preservacin de la isquemia fra puede limitar la extensin de la posible concordancia HLA en el trasplante cardaco.

Figura 40-15. Supervivencia a c i n c o aos de injerto cadavrico c o m o una (uncin del nmero de antigenos HLA discordantes. El anlisis Kaplan-Meier de la supervivencia del injerto con respecto a los antigenos discordantes H L A no se m u e s t r ap e r o fue estadsticamente significativo (p = 0,01). (De Geddes CC, Cole E. W a d e J. y col: Factors influencing long-term primary cadaveric kidney transplantation-importance of functional renal m a s s versus avoid-ance of a c u t e rejections- t h eT o r o n t oH o s p i t a experience 1985-1997. En C e c k a M, T e r a s a k i P [eds]:Clinical Trasplants 1998. Copyright U C L A Tissue Typing Laboratory. Los Angeles. CA. 1999. c o n permiso.)

Trasplante alognico de clulas progenituras hematopoyticas

El trasplante de clulas progenituras hematopoyticas alognicas se lleva a cabo en neoplasias malignas y trastornos hematolgicos, en el fallo de la medula sea, en ciertos trastornos metablicos heredados, como las enfermedades de depsitos de lpidos. y en el sndrome de inmunodeficiencia congnita. A partir de una histocompatibilidad inicial, el mejor donante es o uno m i s m o (trasplante autlogo) si la neoplasia maligna no implica a la mdula sea o si la

Figura 40-14. Electo combinado de las discordancias serolgicas para el HLA-A. HLA-B y HLA-DR en la supervivencia de los primeros injertos de rion de cadver. (MM = discordante). La asociacin de la concordancia con el resultado del injerto fue estadsticamente signilicativa (regresin p < 0. 0001). El anlisis fue restringido a los trasplantes para los que se inform la divisin de especificidades HLA-A y H L A B al centro de estudio para el receptor y el donante (De Opelz G. Wujciak T. Dohler B. y col: H L A compatibility and organ transplant survival. R e vI m m u n o g e n e t 1999; 1:334. c o n permiso.)

Figura 40-16. Supervivencia a cinco aos del injerto de los primeros trasplantes para el trasplante de rganos vascularizados en injertos de corazn, rion de cadver, hgado, pncreas, pulmn y cardiopulmonar. (Del Collaborative Transplant Study, proporcionado p o ryc o n permiso del Dr.Gerhardt Opelz y tratado en Opelz, 1999.)

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

enfermedad no es gentica, o un gemelo idntico (trasplante smgnico). Las clulas progenitoras de donantes hermanos HLA idnticos son una fuente frecuente. Estas clulas donantes normalmente sern genticamente idnticas a las del paciente a lo largo de toda la regin MHC. El empleo de un hermano donante tambin aumenta la probabilidad de que los genes no HLA que pueden afectar el xito del trasplante y que no estn bien definidos (i.e., genes de histocompatibihdad menor) sean concordantes (Goulmy. 1997). Los miembros de una familia haploidnticos tambin pueden ser elegidos como donantes (Aversa, 1998), aunque hay un mayor riesgo de EICH severa que en los donantes HLA no emparentados. Basndose en los datos del Registro Internacional de Trasplantes de Mdula sea (IBMTR) (Tabla 40-1; www.ibmtr.org). se llevaron a cabo ms de 16.000 trasplantes alognicos de mdula osea desde 1996 hasta 1997: el 75% utilizaron donantes emparentados. Muchos pacientes (-70%) no tienen hermanos HLA concordantes y se puede considerar el trasplante con clulas de un HLA concordante, de donante no emparentado. Para facilitar la bsqueda de un donante concordante, se han desarrollados registros nacionales de donantes no emparentados alrededor del mundo (Hansen, 1996), El NMDP en los Estados Unidos es uno de estos registros y contiene ms de 3,9 millones de donantes HLA tipados, siendo el mayor registro de donantes no emparentados del mundo (Perkins, 1994; vase Tabla 40-1; www.marrow.org). Aproximadamente, el NMDP ha facilitado 8.100 (en el ao 2000) trasplantes de donantes no emparentados desde que el registro comenz en 1987. Los injertos de clulas progenitoras hematopoyticas estn entre los ms difciles de todas las tcnicas clnicas por varias razones (Madrigal. 1997; Hansen. 1997). Primero, en el momento del trasplante, los receptores estn casi totalmente inmunodeficientes. ya sea debido a la deficiencia heredada (inmunodeficiencia combinada severa [IDCS]) o a causa del acondicionamiento pretrasplante (quimioterapia citotxica y radiacin). El acondicionamiento se requiere para eliminar las clulas malignas y para prevenir al sistema inmune del receptor del rechazo de las clulas progenitoras del donante que son infundidas muchos das despus del acondicionamiento. La cantidad de pretratamiento citotxico es suficiente para eliminar los leucocitos circulantes, casi eliminar las plaquetas, y abrogar la produccin de nuevos eritrocitos. Por ello, el receptor es profundamente susceptible a todo tipo de infecciones y ciertamente morir si no se le rescata con cuidados mdicos extraordinarios y con translusin de clulas progenitoras. El segundo nesgo es el potencial del ataque inmunolgco del receptor por las clulas progenitoras alognicas trasplantadas originando una EICH. La EICH tiene muchas formas y puede ser letal. A pesar de las dificultades, algunos centros de trasplantes han obtenido un xito excepcional. Los recientes informes de instituciones determinadas y la IBMTR sugieren una supervivencia libre de leucemia del 40% al 60% a los cinco aos tras el trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas no emparentadas a pacientes con leucemia mieloide crnica en fase crnica (Tabla 40-1, www.ibmtr.org) (Hansen. 1998). La supervivencia de los pacientes con anemia aplsica severa trasplantados con clulas de donantes no emparentados vara de un 30% a un 50% a los cinco aos dependiendo de la edad del paciente (vase Tabla 40-1, NMDP en www.marrow.org y www.ibmtr.org) y se ha informado en algunos centros de ndices de supervivencia cercanos al 90% (Deeg. 1998). Adems de mdula como fuente de clulas progenitoras hematopoyticas. la obtencin de clulas progenitoras hematopoyticas de sangre perifrica movilizadas con factor de crecimiento (Anderlini. 1997) o de clulas progenitoras de sangre de cordn umbilical (Cairo, 1997) aumenta la disponibilidad de donantes no familiares. Las nuevas aproximaciones a la inmunosupresin. incluyendo protocolos de acondicionamiento menos agresivos (p. ej., "minitrasplantes") (Storb, 1999). pueden aumentar la disponibilidad del trasplante de clulas progenitoras como tcnica teraputica en pacientes actualmente excluidos por su edad o por su disfuncin orgnica. El trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas puede usarse tambin para generar respuestas inmunes dirigidas contra las clulas tumorales. La recada de la enfermedad tras el trasplante es mayor en pacientes que han recibido un injerto HLA concordante, lo que sugiere que algn grado de discordancia puede ser beneficioso en la estimulacin de la respuesta inmune contra las clulas tumorales (Beatty, 1993). A medida que se vayan resolviendo los problemas de esta tcnica tan difcil, el trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas puede convertirse en uno de los mtodos ms

ampliamente utilizados para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades (vase Cap. 33). Tipificacin HLA para el trasplante de clulas progenitoras. Muchos factores, incluyendo la histocompatibilidad. influyen en el resultado del trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas (Madrigal. 1997). El trabajo pretrasplante incluye la tipificacin del HLA-A. -B y -DR de todos los miembros disponibles de los familiares ms cercanos para identificar un donante concordante relacionado y para establecer la herencia de los haplolipos. Tambin puede ser apropiada la tipificacin basada en el ADN de los genes de dase II. que se ha convertido en un estndar, y la tipificacin basada en el ADN de los genes de clase I se ha incorporado en muchos centros. La tipificacin de la familia completa, la tipificacin del nivel allico (i.e.. alta resolucin) de los locus especficos HLA de clase I y II. la tipificacin de otros locus en el MHC (repeticiones en tndem cortas o locus complementario), o el empleo de otras pruebas (p. ej., reactividad cruzada: mediciones de precursores de clulas T citotxicas) para medir la compatibilidad (Hurtey. 1999) tambin puede ser adecuado. El nivel de resolucin de la tipificacin del HLA requerido difiere para el trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas y renal. Parece que para el trasplante de clulas progenitoras se necesita una alta resolucin de tipificacin HLA. mayor de la que es necesana para el trasplante renal, debido a que el trasplante de clulas progenitoras incluye la transferencia de un sistema inmune completo al paciente. Las investigaciones actuales se centran en definir los locus que deben considerarse en la seleccin del donante, el nivel de resolucin que debe emplearse para la concordancia, y el efecto aditivo de las mltiples discordancias. El nivel de concordancia requerido puede variar en cada enfermedad o protocolo. Las evidencias sugieren que la concordancia de un donante y un receptor no emparentados para los alelos HLA-A. -B y -DRB1 est relacionada con una mejora del resultado. El impacto de la concordancia en el otro locus HLA (p. ej.. HLA-C y HLA-DQ) est bajo estudio. Las discordancias aisladas pueden ser toleradas; sin embargo, las discordancias mltiples parecen tener un impacto negativo en el resultado (Sasazuki, 1998; Petersdorf, 1998,1995b: Madrigal, 1997; Hansen. 1997). Adems, el efecto positivo de la concordancia de histocompatibilidad en el resultado debe evaluarse por el impacto positivo del trasplante precoz en el curso de la enfermedad. Los datos de la IBMTR y de la NMDP muestran que la supervivencia tras el trasplante est reducida a medida que avanzan las lases de la enfermedad (dalos en las pginas web sealadas en la Tabla 40-1).

RESUMEN
Las molculas HLA de clase I y clase II codificadas en el complejo mayor de histocompatibilidad tienen un papel significativo en la especificidad y en el carcter de las respuestas inmunes. El extenso polimorfismo de estas molculas proporciona la diversidad necesaria para asegurar la supervivencia en un ambiente de patgenos hostiles y adaptativos. Desgraciadamente, esta capacidad del sistema inmune de distinguir lo propio de lo extrao se extiende al reconocimiento de las molculas de HLA extraas tras el trasplante tsular. La definicin y la caracterizacin de los alelos y las molculas del HLA se han combinado con los protocolos clnicos para maximizar la compatibilidad y minimizar el impacto de la respuesta inmune sobre el tejido extrao. Estos avances han contribuido al desarrollo del trasplante como una modalidad de tratamiento con xito en la sustitucin del tejido enfermo.

BIBLIOGRAFA
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CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD..

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SECCIN V

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CAP

4 1

Complejo mayor de histocompatibilidad y enfermedad

Julio C. Delgado, M.D. Edmond J. Yunis, M.D.
GENES EN LA REGIN NO-HLA O CLASE III Genes BF. C2y C4 Factor de necrosis tumoral de linfotoxina y (y ) y genes 949 MTODOS DE DETECCIN DE LA ASOCIACIN O CORRELACIN DE LA ENFERMEDAD CON LOS MARCADORES GENTICOS Polimorfismo gentico Fuerza de la asociacin 952 952 953 954 955 Anlisis del modelo de herencia basado en parejas de hermanos Anlisis del modelo de herencia basado en estudios de poblacin Mtodo de clculo de probabilidades (Lod RESUMEN BIBLIOGRAFA Score Method) 964 961

959

Genes de la protena 70 del golpe de calor COMPLOTIPOS HAPLOTIPOS EXTENDIDOS TIPIFICACIN DEL COMPLEMENTO PAPEL DE LAS MOLCULAS MHC CLASE I Y CLASE II COMO GENES DE RESPUESTA INMUNE ASOCIACIONES ENFERMEDAD-MHC Enfermedades que incluyen herencia mendeliana de defectos en genes de MHC Enfermedades de etiologa y patognesis desconocidas

Para comprender el papel del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en las respuestas inmunes y en la patognesis de la enfermedad se requiere la definicin de polimorfismo en la Clase I y Clase II, y los genes en la regin central del MHC. algunas veces llamada regin no-HLA o regin Clase III. Debe mencionarse desde el principio que existen regiones del ADN donde aparecen recombmaciones con ms frecuencia de lo esperado (esto es, en el intervalo de HLA-DR a HLA-DP). Pero tiene particular importancia el hecho de que hay zonas del ADN, o ADN fijado, donde raramente se observan recombinaciones. Las dos mayores constelaciones son la regin del complemento en la regin central, y HLA-DR. DO en la regin Clase II Adems, el anlisis de los haplotipos MHC en muchas poblaciones ha permitido reconocer que una proporcin considerable de individuos tienen haplotipos especficos del grupo familiar que tienen un intervalo de HLA-B a HLA-DR. DQ idntico. Eslos haplotipos. llamados haplotipos extendidos se deberan considerar c o m o unidades genticas fijadas que. estudiadas junto con variantes MHC que no forman parte de estos haplotipos. sirven para ayudar a comprender las respuestas inmunes y la asociacin con la enfermedad. Las variantes de los genes clase I y clase II se describen en el Captulo 40. Aqu se tratarn los genes y alelos de la regin no-HLA, haplotipos extendidos, asociaciones con la enfermedad y los mtodos para detectar la asociacin de las enfermedades con los marcadores genticos.

contiene genes que codifican protenas de diversa funcin. Aunque las molculas clase I y clase II se distinguen por parecidos estructurales y funcionales compartidos con los miembros de cada clase, las molculas de clase III pueden definirse slo como no-I y no-ll. porque sus genes y sus productos no tienen rasgos comunes y no son reconocidos por las clulas T. Incluye genes que codifican las protenas del complemento C2 (C2). factor B {BF). C4 (C4A y C4S), el esteroide microsomal enzimtico P-450 21hidroxilasa (CYP21). las citocinas como lactor de necrosis tumoral (TNF). linfotoxina- (LT ). linfotoxina . (LF- ). tres miembros de la mayor familia de la protena 70 del golpe de calor (HSP70-1. -2, -Hom) y varios genes ms (Trowsdale. 1995). Se ha analizado toda la regin clase III mediante electroforesis en gel con campo pulstil o clonando cromosomas artificiales de levaduras y vectores csmidos (Dunham, 1987; Kendall, 1990; Ragoussis, 1991; Sargent, 1989; Spies. 1989). Se piensa que esta es una de las regiones con ms genes del genoma humano, con aproximadamente un gen por 15 kb (Fig. 41-1). Se han secuenciado varios genes entre los genes C4A y HLA-B Algunos de ellos se han llamado G, genes localizados en bandas Giemsa-negativas (G1-G11) o BAT. trascripciones asociadas a HLA-B (BAT 1-9) (Sargenl, 1989; Spies. 1989). Gf codifica el factor 1 inflamatorio de alomjerto, y la transcripcin del intertern- (INF- ) (Utans. 1995) Los genes G6 a G7 codifican protenas putativas que pertenecen a la superfamiha Ly-6. que se sabe son importantes en la maduracin de los leucocitos (Ribas, 1999). El transcriptor-1 especfico de leucocitos representa el homlogo humano del transcriptor del ratn B144 y codifica un transcriptor inducible de IFN- . que existe en los tejidos linfticos, clulas T. macrlagos y lineas celulares histocitarias (Holzinger, 1995). IKBL codilica un miembro putativo de la familia

GENES EN LA REGIN NO-HLA O CLASE III

Existen alrededor de 1.100 kilobases (kb) de ADN entre la regin clase I y Clase II. generalmente llamada regin no-HLA o clase III. Esta regin

CAPTULO 41

COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD

951

de protenas ikB involucradas en la regulacin de la expresin de los genes de citocinas (Albertella. 1994). La secuencia completa de 1C7 ha revelado que este gen codifica un nuevo miembro putativo de la superfamilia Ig (Neville, 1999). RD. SK12W, DOM3Zy RP1 son cuatro nuevos genes encontrados entre Bf y C4. Las protenas RD y Ski2w pueden estar relacionadas a empalmes del ARN, renovacin del ARN y la regulacin de la traduccin. Las funciones de Dom3z y RP1 estn siendo investigadas (Yu. 1998). La regin entre los genes C4A y HLA-DR se ha estudiado con los mismos mtodos. Se han identificado vanos genes, incluyendo NOTCH-4, G18. PBX-2 (G17), RAGE. G16, G15, G14. G13 (Creb-rp). GI2y TNX, en un segmento de 160 kb del ADN centromrico al gen C4A (Aguado, 1996). Alguno de ellos (G13-G15). expresa protenas involucradas en el metabolismo lipidico (Aguado, 1998. 1999). Un par de genes, TNXA y TNXB. organizados en la orientacin transcripcional opuesta a otros genes en esta agrupacin, codifican protenas extracelulares similares a tenascina y restrictina, que estn presentes en el sistema nervioso central y perifrico y en el msculo liso (Yang, 1999).

Genes BF, C2 y C4
Los C2 y C4 de la via clsica y el factor B de la va alternativa del complemento son codificados por una regin 120 kb del ADN genmico de unos 300 kb de HLA-DR y 650 kb de HLA-B (Carrol. 1984). C2 y BF muestran una semejanza considerable en la secuencia de aminocidos y comparten un nmero de caractersticas fsico-qumicas y funcionales, lo que sugiere que ambos genes surgieron por duplicacin en tndem de un gen ancestral similar al factor B. Ambos son sern-proteasas (de la familia SERPIN de protenas del plasma) y median la escisin de C3 durante la activacin de las respectivas rutas. C4, por otra parte, est relacionada estructural y funcionalmente con C3 y C5 y como contiene un tiolster interno muy reactivo, se relaciona con C3 y el inhibidor de la proteasa -macroglobulina. Aunque el gen para C3 est ligado ligeramente al MHC en el ratn, en el hombre est en un cromosoma completamente diferente. Junto a 3' en cada locus C4 hay dos locus para el enzima adrenocorticoideo 21-hidroxilasa (CYP21A y CYPB). (Carroll, 1985: Higashi. 1986: White. 1986). Los dos genes tienen aproximadamente 3.4 kb de longitud y se dividen en 10 exones. En cierto modo son homlogos, pero tres mutaciones causan una terminacin prematura de la transcripcin del gen CYP21A. convinindolo en unseudogen (White. 1988).

Hay un alelo no expresado (C2'QO) que se encuentra en el 2% de la poblacin caucsica europea. C4 se sintetiza como un nico gran polipptido de unos 200 kDa que sufre un proceso postsinttico que incluye la prolelisis de una estructura de tres cadenas unidas por enlace disulfuro. La cadena ms larga, de unos 87 kDa. es la cadena a y transporta el tiolster interno. Durante la activacin de la va clsica del sistema de complemento. Cls activado escinde un pequeo pptido con propiedades de analilotoxina por el extremo a m m o de la cadena (/. C4. Hay dos locus distintos C4A y C4B que codifican dos formas de C4. C4A y C4B se diferencian slo por cuatro residuos aminocidos en la cadena a. entre las posiciones 1101 y 1106. Asombrosamente, C4A acetila preferentemente grupos ammo, mientras que C4B acetila preferentemente grupos hidroxilo. As, C4B es hemolticamente ms activo, pero C4A es ms activo que C4B inhibiendo la formacin y disolviendo inmunocomplejos. Las variantes de C4 generalmente transportan determinantes antignicos Rodgers (un epitopo Val-Asp-Leu-Leu de la cadena C4A), y variantes de C4B transportan determinantes Chido (un epitopo Ala-AspLeu-Arg de la cadena o. de C4B). Hay un polimorfismo gentico amplio, detectable por electroforesis de gel de agarosa en protenas C4A y C4B en todas las poblaciones examinadas (Awdeh, 1980). Se han reconocido al menos 18 alelos C4A. 21 alelos C4B y un gen no expresado (C4'Q0) de cada locus C4 (Mauff.1990). Se han identificado producios genticos aberrantes o hbridos con caractersticas en parte C4Ay en parte C4B Ms sorprendente es la variacin en el nmero de genes C4 en algn haplotipo individual. Aunque es ms habitual tener un C4A expresado y un C4B expresado, la homoduplicacin y la heteroduplicacin son habituales, como son los haplotipos con un solo gen C4 expresado. C4A'3y C4B'1 son los alelos ms comunes en casi todas las poblaciones. C4A'4. C4A'2. C4B'2y C4B'5 muestran una distribucin universal. C4A'6 tambin se observa en muchas poblaciones excepto en algunos grupos mongoloides. C4B'3 se identifica principalmente en grupos caucsicos y africanos.

Factor de necrosis tumoral a (y |5) y genes de linfotoxina a y p

Los genes TNF y LTA o TNFB codifican potentes citocinas inmunomoduladoras que son producidas en respuesta a varios estmulos inflamatorios. El TNF-rx se produce en una variedad de clulas hematopoyticas y no hematopoyticas, y LT-a especficamente por linfocitos (Carroll. 1987). TNFo. y LT-a forman trmeros biolgicamente activos y ambos se unen a los mismos receptores de 55 kDa y 75 kDa (Bazzoni. 1995).TNF-</ y TNFjj son codificados cada uno por genes separados y comparten aproximadamente el 34% de la identidad de aminocidos (Carrol. 1987). Los genes que codifican TNF y LTA estn localizados en una regin 7kb centromrica 250 kb del gen para HLA-B y telomrica 355 del gen para C2. TNF-a y LTa se mantienen como molculas de superficie de las clulas o son liberadas de las clulas. LT-a se retiene en la superficie de la clula por una regin transmembrana. La superficie TNF-a no resulta de la presencia de una regin transmembrana sino ms bien de una membrana glicoproteica de 33 kDa conocida como linfotoxina-p" (LT-(i) (Browning, 1993). L T j s " tiene un 21% y 24% de identidad con TNF y LT-a. respectivamente El gen para LTB contiene cuatro exones, giros de 2 kb y est localizado entre los genes TNF y LST1. Hasta la fecha, se han identificado nueve polimorfismos en los iniciadores TNF-a, localizados en los nucletidos -1031,-863, -857, -575. -376, 308. -244. -238 y +70 relacionados con el lugar del comienzo de la transcripcin (Brinkman. 1994,1995: D'Alfonso, 1994: Hamann. 1995: Higuchi. 1998: Uglialoro, 1998; Wilson. 1992: Zimmerman, 1996). Dos endonucleasas, EcoRI y Ncol, han mostrado modelos polimrficos con el gen LTA (Messer, 1991; Partanen. 1998). La secuencia polimrfica para el enzima EcoRI est localizada en el exn 4. mientras que la secuencia para Ncol se ha localizado en el primer intrn del gen LTA. Se han identificado las secuencias de ADN que constan de longitudes variables de repeticiones TC.'GA o AC'GT o microsatlites dentro de la regin de los genes TNF usando secuenciacin con gel de poliacrilamida. (Nedospasov, 1991) H a y

El factor B es sintetizado por el gen BF. Durante la activacin de la va alterna del sistema de complemento, la proteina se escinde en un fragmento aminoterminal Ba de 30 kDa y un fragmento Bb de 60 kDa. Mediante electroforesis con gel de agarosa. la protena muestra un moderado polimorfismo con dos alelos muy comunes, BF'F (rpido) y BF'S (lento), dos alelos menos comunes, BF'F1 (ms rpido) y BF'S. tambin llamado BF'S07. (ms lento), y un husped de alelos raros. Con electroforesis, BF'F puede subdividirse en dos subtipos, BF'FA y BF'FB. BF'FB tiene dos variantes, FB1 y FB2. Hay variantes de BF'S. llamados SSf, 2y 3. La sustitucin del aminocido responsable de las variantes comunes de BF'FA. BF'FB y BF'S viene determinado por los residuos encontrados en el Iragmento Ba. mientras que los de BF'F1 y BF'S estn localizados en el fragmento Bb. En las poblaciones caucsicas europeas, BF'F tiene una frecuencia de 0,2, BF'S 0,77. SF'Ff 0,01. BF'S 0,01, y un recuento de alelos raros slo un 0,002. BF'S es el ms comn en las poblaciones caucsicas, mongoloides y australoides, mientras que BF'F es la ms comn en las poblaciones negroides. BF'F1 se observa en grupos africanos asi como en algunas poblaciones caucsicas. El gen C2 tiene 18 kb de longitud. Durante la activacin de la va alterna del sistema de complemento, la proteina se escinde en los aminocidos 223 y 224, un enlace arginina-lisina, en dos fragmentos. C2a y C2b. C2a es hemolticamente activa. A nivel proteico, C2 muestra por electroforesis un polimorfismo menor. Los alelos son C (comn), un alelo 6 (bsico) menos comn con tres variantes bsicas raras y cuatro variantes A (acidcas) raras. La localizacin polimrfica para el alelo C2'B es transportada por el fragmento C2A. C2'C supone ms del 95% de los genes C2 en la mayoria de las poblaciones. C2'B supone del 3% al 4% de los genes C2.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

cinco microsatlites: los microsatlites TNFa y TNFb estn localizados en la regin telomrica 3.5 kb al gen TNFB y se han identificado 7 y 13 alelos, respectivamente. El microsatelite TNFc est localizado en el intrn 1 del gen TNFB y tiene dos alelos. TNFdy TNFe, que tienen siete y tres alelos, respectivamente (Jongeenel. 1991).

HAPLOTIPOS EXTENDIDOS
Del estudio de la distribucin de los complotipos segn las especificidades HLA-B y HLA-DR en haplotipos normales caucsicos determinados por estudios de familias, se hizo evidente que existia un notable desequilibrio de ligamiento que afectaba a toda la regin. Se poda fcilmente reconocer el HLAB. complotipo, grupos de alelos DR que mostraban tres puntos de desequilibrio de ligamiento estadsticamente significativos (Fig. 41-2) y que definan los que se denominan haplotipos extendidos (Awdeh. 1983). Estos haplotipos extendidos, que suponen al menos un 30% de los haplotipos normales caucsicos, tienen una estructura voluminosa y una secuencia de ADN relativamente fija y transportan alelos si no idnticos, muy parecidos, incluso cuando se encuentran en individuos sin relacin aparente. Otro rasgo importante de los haplotipos extendidos es su asociacin con ciertos grupos raciales. En su mayora, son muy caractersticos de un subgrupo tnico y tienen frecuencias ms bajas o no existen en absoluto en otros grupos tnicos. Tienen presumiblemente su origen en el grupo donde su frecuencia como haplotipos intactos es la ms alta. Hay ms de una docena de haplotipos extendidos comunes en los caucsicos (Alper. 1992). Se han descrito diferentes haplotipos extendidos para diferentes razas (p. ej. afroamericanos) (Fraser, 1990). Estudios iniciales definieron los haplotipos extendidos como el intervalo entre HLA-B y DR. Entonces se observ que otros alelos del MHC no caracterizados en el intervalo probablemente estaban incluidos. Al contrario, a pesar de que los alelos HLA-A han mostrado una variacin limitada para los haplotipos extendidos, slo la mitad de estos haplotipos muestran asociaciones nicas significativas de alelos HLA-A (Alper. 1982). El gen HLA-Olue el ltimo en ser determinado. Segn la distancia gentica y los datos de identificacin previamente incompletos de los pares HLA-B/Cw. era evidente que los haplotipos conservados tambin incluiran la regin gentica HLA-Cvt. Recientemente, se han asociado diferentes alelos HLA-Cw con diferentes haplotipos extendidos (Tabla 41-2) (Clavijo, 1998). El autor ha desarrollado el concepto de que los haplotipos extendidos poseen una fijacin al ADN al menos en el intervalo HLA-B/DR y. por lo tanto, si transportan un gen de susceptibilidad para una enfermedad, implcitamente todos los eiemplos independientes de ese haplotipo mostrarn asociacin con esa enfermedad. Y al contrario, si el haplotipo extendido no tiene un gen de susceptibilidad para una enfermedad, entonces l y los alelos que lo constituyen protegern frente a la enfermedad. Es esencial conocer la distribucin tnica de un haplotipo extendido para evaluar si el haplotipo extendido en pacientes est aumentado comparado con una poblacin control tnicamente equivalente o es realmente de hecho un marcador para la distribucin tnica de la enfermedad.

Genes de la protena 70 del golpe de calor

Las protenas de estrs o protenas de goipe de calor se expresan en respuesta a una variedad de estmulos de estrs a las clulas. Esta respuesta se ha observado en todas las especies examinadas hasta la fecha. La familia de las protenas de estrs de 70 kDa tiene una alta identidad de secuencia de aminocidos desde los primitivos eucanotas hasta los humanos. Varios estudios han demostrado el locus para la protena 70 del golpe de calor (HSP70) en los cromosomas 6. 14, 21 y al menos en otro cromosoma autosmico (Hunt. 1985: Sargent, 1989). Tres genes que codifican a los miembros de la familia HSP70 estn localizados en la telomrica 92 kb al locus C2 {HSP701, HSP70-2 y HSP70- Hom). Los anlisis secuenciales de genes HSP70-1 y -2 han mostrado que hay genes carentes de intrn que codifican un compuesto proteico idntico de 641 aminocidos. HSP70-Hom tambin es un gen carente de intrn que codifica una proteina de 641 aminocidos y tiene un 90% de identidad de secuencia con HSP70-1 (Milner. 1990). Debido al alto grado de similitud de secuencias entre las regiones codificadoras de los genes HSP70. las sondas de ADN que corresponden a las regiones codificadoras tienden a la hibridacin cruzada. Sin embargo, hay suficiente diferencia de secuencias entre las regiones no traducidas 5' y 3' del HSP70-1. -2 y -Hom para designar cebadores de oligonucletido y sondas que permitan la ampliacin especfica e hibridacin de los tres genes (Milner. 1992). Se han detectado tres sustituciones de nucletidos en las regiones 5' flanqueadoras y no traducidas de HSP70-1: una transversin A-*C en la posicin -110, una transicin T-C en la posicin +120, y una transversin G->C en la posicin +190. Se ha demostrado que variaciones en la posicin -110 y +120 influyen en la movilidad en la electroforesis en gel de polacrilamida. Se han reconocido tres formas allicas: HSP70-1 A (lenta), 8 (rpida) y C (intermedia). Las sondas de oligonucletidos que contienen variaciones de secuencia en la posicin -110 y +120 pueden tambin detectar los tres alelos. despus de una reaccin de ampliacin en cadena de la polimerasa especfica (PCR) del gen HSP70-1. En HPS70-2. una transicin G->A en la posicin 1267 provoca la prdida de un lugar de restriccin Psl-I. La hibridacin de ADN digerido genmico Psl-I con una sonda HSP70 provoca un fragmento polimrfico de ADN. de 8,5 kb o 9 kb de longitud. En el gen HSP70-Hom. hay una transicin T~*C en la posicin 2437 que se encuentra dentro de un lugar de restriccin Nco-I y produce dos fragmentos allicos de 1.5 kb y 0,5 kb, respectivamente.

COMPLOTIPOS
Tabla 41-1 En humanos, los genes C2 y BF estn muy cercanos el uno al otro, separados por menos de 2 kb. pero BF y C4A estn separados por unos 30 kb. C4A y C4B estn separados por unos 10 kb. Los cuatro genes complementarios muestran un notable desequilibrio de ligamiento en haplotipos determinados por estudios de familias. Es decir, aparecen en poblaciones juntas como grupos y en el mismo cromosoma con ms frecuencia de la esperada a la de sus alelos individuales ms o menos de la misma manera que los alelos en los sistemas de grupos sanguneos Rh y MNS. No se han documentado recombinaciones entre los genes complementarios. Por estas razones, se consideran de forma correcta como unidades genticas nicas, o complotipos. arbitrariamente designados por sus alelos BF. C2. C4A y C4B. Asi, BFS. C2'C. C4A'00. C4B 1 es un complotipo que en forma abreviada es SC01. Hay ms de una docena de complotipos en caucsicos que tienen frecuencias de casi un 0,01 o ms (Tabla 41-1). El complotipo SC31 es el ms comn en la mayora de las poblaciones. En las poblaciones negroides, FC31 es comn, como lo es SC42 en los mongoloides asiticos.

Complotipos comunes e n cromosomas normales d e poblaciones caucasoides* Complotipo Frecuencia

SC31 0,43 SC01 FC31 0.096 SC30 0.053 SC42 0,04 SC61 0.034 FC30 0,031 FC01 0.029 SC02 0.029 SC21 0.022 SB42 0.019 SC33 0,014 SC2(1, 2)0.013 SC32 0.011 "Los complotipos so dan c o m o letras abreviad is y nmeros, con cuatro alelos en orden arbitrario: BF. C2. C4A. C4B - El locus C4B esta heleroduplicado

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COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD

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Figura 41-2. La distribucin de haplotipo de los complotipos (haplotipos de los alelos complementarios) SC01 {BF'S. C2'C. C4A'00. C4B'1) y SC21 (BF'S. C2'C. C4A'2. C4B'/)en relacin con los alelos HLA-B en ordenadas y los alelos HLA-DR en abcisas. Las alturas y anchuras que representan cada especificidad H L A son proporcionales a las frecuencias de los alelos para las respectivas poblaciones. L o s racimos representan los desequilibrios de ligamiento y los crculos los haplotipos extendidos (HLA-B16(38). SC21. DR4) en los judos asquenazies y [HLA-B8. SC01. DR3) en los ingleses y. con un alcance m u c h o menor, en los judos. (De Alper CA. A w d e h Z. Yunis EJ: Conserved. extended M H C haplotypes. Exp Clin lmmunogen1992; 9:58; con permiso de S. Karger)

TIPIFICACIN DEL COMPLEMENTO

El sistema complemento est dividido en dos vas: la va clsica que contiene nueve diferentes componentes totalizando al menos 12 protenas, y la va alterna que contiene cuatro. Tres de las 16 protenas estn codificadas dentro del MHC y manifiestan variantes estructurales heredadas que pueden estudiarse por tcnicas que detectan diferencias en la carga superficial neta debidas a diferencias en los aminocidos. Se utilizan dos mtodos para separar las protenas (1) electroforesis en gel de agarosa de alto voltaje para detectar variaciones de movilidad entre protenas a un pH determinado y (2) electroforesis en geles de poliacrilamida de capa fina, que demuestra diferencias en puntos isoelctricos. Las protenas pueden obser-

varse por electroforesis de inmunofijacin usando la insolubilidad de los complejos antgeno-anticuerpo o por la deteccin de actividad hemoltica funcional con geles sobrepuestos donde los hemates de oveja sensibilizados con anticuerpos se combinan con suero deficiente en complemento (Awdeh. 1983) (vase Cap. 38). Las protenas de la va clsica |C2. C4A y C4B) y una de la va alterna (BF) estn codificadas dentro del MHC. son polimrficas. y por lo tanto tiles para la misin de los haplotipos del MHC. Para la tipificacin de C2. las protenas se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida y se visualizan por hemolisis C2-inducida en geles superpuestos. El suero humano normal diluido puede reemplazar el suero deficiente en C2 como un reactivo porque C2 es el factor limitante en la va clsica (Fig. 41-3). La tipificacin de C4 requiere tres tcnicas diferentes: 1. Electroforesis de inmunofijacin tras el tratamiento con neuramimdasa. Los patrones producidos muestran tres bandas para cada variante con alguna coincidencia entre ciertas variantes. Un tratamiento adicional de la muestra con carboxipeptidasa reduce cada variante a una sola banda. 2. Deteccin de C4A frente a C4B mediante un ensayo funcional hemolitico. Este mtodo distingue C4A o patrones sobrepuestos de C4B porque las variantes de C4B tienen de 5 a 10 veces la actividad hemoltica de las variantes de C4A. 3. Reactividad serolgica Rodgers (C4A) o Chido (C4B). El suero se incuba bien con anti-Rodgers humanos o con anti-Chido humanos para probar la inhibicin de la aglutinacin con eritrocitos positivos apropiados.

Tabla 41 -2 Distribucin d e l alelo HLA-Cw e n relacin c o n haplotipos extendidos c o m u n e s * Haplotipo extendido [HIA-R8. SCOI. DR3 HLA-B7. SC31. DR2 [HLA- B44. FC31. DR7] [HLA-B44. SC30. DR4] (HLA-B57, SC6I. DR7 [HLA-B14. SC22. DR1] [HLA-B35. SC31. DR5] HLA-B38, SC21. DR4] HLA-B 15. SC33. DR4) [HLA-B 18. F1C30. DR3I [HLA-B 18. S042. DR2]' [HLA-B42. FC(1.90) 0. DR3f Alelo HLA-Cw 0701 0702 1601 0501 0602 0802 0401 1203 0304 0501 1203 1701

'Dalos Oe cromosomas de poblacin normal caucasoide de Boston. Datos de pacientes con deficiencia de C2 De Clavijo OP. Delgado JC. Awdeh ZL. y col: Tissue Antigens 1998. 52 282 Datos de cromosomas de poblacin normal negra que vive en Boston De ClaV I J O OP, Delgado JC. Yu N. y col Tissue Antigens 1999: 54 303
:

Alternativamente, las variantes de C4 pueden tipificarse por reactividad Chido o Rodgers mediante inmunotransferencia. Hay dos formas de detectar alelos nulos de heterocigotos C4. La electroforesis de muestras de C4 nulos (C4AVO y C4B'QO) demuestra ausencia de bandas en homocigotos pero en heterocigotos requiere la cuantificacin por inspeccin visual, por inmunoelectroforesis cruzada o por barrido densitomtnco de los patrones de inmunofijacin. Un mtodo alternativo consiste en determinar la presencia y las relaciones de las cadenas (/ de C4A y C4B tras la electroforesis de inmunoprecipitados en gel de poliacrilamida en dodecil sulfato sdico.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

Hl

1 ) 2 B3 B4 5

B6 1 ) 7

Al

A7 A2 A3 A4 A3

A6

C4

Figura 41-3. Posiciones electrolorticas de vanantes de C4 relacionadas unas con otras (diagrama) Las variantes del locus C4B (Chido) se muestran a la izquierda, y las del locus C 4 A (Rodgers) se muestran a la derecha Cada gen consta de tres Bandas. Se observar que alguna de las variantes de C4B corresponden exactamente a la posicin de las variantes de C4A (B7 y A2. p o r ejemplo) La distincin entre ellas se hace mediante un gel de agarosa superpuesto sensible a C 4 donde slo las variantes d e C4B tienen una actividad hemoltica activa C4 (Awdeh, 1980). El BQOy AQO (alelos nulos) no muestran bandas. En la posicin ms baja (lado izquierdo) de la figura, se muestran ejemplos del tipo comn C2 (C) y un heteroogoto (BC) mediante electroloresis en gel de poliacrilamida con gel de agarosa superpuesto, conteniendo hemates de oveja sensibilizados con anticuerpos y una dilucin 1/90 de suero h u m a n o normal. En la porcin ms baja (lado derecho) de la figura, se m u e s t r a n ejemplos d e patrones electrolorticos de vanantes BF tras eleclroforesis con gel de agarosa e inmunofi|acin con antisueros anti-lactor B Cada gen consta de una banda m a y o r y otras dos menores. El nodo estaba a la derecha.

La tipificacin del factor B se realiza despus de una electroforesis prolongada en gel de agarosa e inmunofi|acin. Los modelos homocigticos constan de una banda mayor y unas bandas menores rodeando, y los patrones heterocigticos son la suma de dos patrones homocigticos.

PAPEL DE LAS MOLCULAS MHC CLASE I Y CLASE II COMO GENES DE RESPUESTA INMUNE
Los genes que controlan la respuesta inmune a antgenos extraos fueron descritos inicialmente en modelos animales. Se demostr que estaban localizados dentro de la regin de la clase II del MHC. Se ha demostrado que las clulas presentadoras de antigenos (APC) procesan fragmentos de antgeno y presentan a estos pptdos como complejos con las molculas clase I y clase II, inicindose as la respuesta inmune. En los ltimos aos, se han producido avances significativos en la comprensin de la base molecular de la presentacin del antgeno MHC, bsicamente como resultado de la determinacin de la estructura tridimensional de

las molculas de clase I (Bjorkman. 1987). y clase II (Brown. 1993). y la caracterizacin de la unin de los pptdos a las molculas MHC (Jardetzky, 1991; Stem. 1994). La estructura cristalina del pptido ligado a las molculas Clase II ha demostrado que las cadenas laterales del pptido estn localizadas en pequeas cavidades, llamadas bolsillos, en el lugar de unin. Estos bolsillos varan de acuerdo a los aminocidos codificados por cada alelo HLA. Las mutaciones puntuales en los genes clase II son criticas para la unin del pptido y la presentacin y ocurre normalmente dentro o cerca de los bolsillos de unin al pptido. As, la diferenciacin de los alelos HLA es crucial para la interpretacin de HLA y asociaciones con la enfermedad. Los mtodos para la caracterizacin de los alelos clase I y clase II se han descrito en el Captulo 40. Parece que algunos bolsillos juegan un papel en algunas enfermedades. Por ejemplo, ciertos alelos que codifican el bolsillo de unin al pptido. P4 o la cadena DRp\ estn asociados con artritis reumatoide (Hammer. 1995) y lepra tuberculoide (Zerva. 1996), mientras que otras que codifican el bolsillo P9 o la cadena DQ|i estn relacionadas con la tuberculosis clnica (Goldfeld, 1998), pnfigo vulgar (Delgado, 1997) y proteccin frente a diabetes insulino-dependiente (Todd, 1987).

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COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD

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ASOCIACIONES ENFERMEDAD-MHC
Hay un nmero notable de enfermedades que muestran asociacin con HLA. La mayora, aunque no todas, son autoinmunes y no muestran una herencia mendeliana bien definida. El gran nmero de enfermedades asociadas con HLA se debe al hecho de que el MHC contiene muchos genes importantes y porque los genes de la regin, incluso los genes no-HLA, son extraordinariamente polimrficos. En una regin donde la densidad de genes se muestra anormalmente alta, esto provoca un gran nmero de genes de potencial susceptibilidad. Un problema importante con los genes de susceptibilidad de MHC es su penetrancia incompleta, haciendo muy difcil, sino imposible, la segregacin formal habitual y los estudios de ligamiento. Adems parece probable que muchas enfermedades asociadas a MHC sean polignicas. Debido a estos problemas, el autor comenzar su exposicin con las alteraciones determinadas por MHC que muestran herencia mendeliana y un 100% de penetrancia, al menos para el defecto bioqumico primario.

y otras mutaciones que producen fallos en la transcripcin (Braun, 1990; Lokki, 1999). El alelo C4A'O0. particularmente en individuos homocigticos o en aquellos con deficiencia completa de C4, se ha asociado con lupus eritematoso discoide y sistmico (Dunckley, 1987; Nousari, 1999). Esta susceptibilidad probablemente se relaciona tambin con un manejo defectuoso de inmunocomplejos, como en la deficiencia de C2 y otras deficiencias del primer componente del complemento (Fielder, 1983). Los homocigticos C4B'Q0se han asociado con nefropatia de inmunoglobulina A (IgA). Adems, hay una incidencia 3.5 veces mayor de homocigticos C4B'Q0 en nios con meningitis bacteriana (Colten, 1992). El nivel de C4 en suero en pacientes con alelos C4 nulos es extremadamente variable y no puede utilizarse con fiabilidad para detectar heterocigotos para una deficiencia completa, incluso aunque haya una correlacin aproximada entre el nivel de C4 y el nmero de genes C4 expresados.

Hiperplasia suprarrenal congnita por deficiencia de 21-Hidroxilasa

Esta alteracin es clnicamente heterognea, con una forma grave con deplecin salina, una forma ms leve tarda manifestada en gran parte por masculinizacin en las chicas, y una forma leve oculta. El vnculo con el MHC de esta alteracin le descubierto antes de que tuese detectada ninguna asociacin de MHC y antes de que se supiera que los locus CYP21 estaban localizados en el MHC. Posteriormente se encontr que en los caucsicos europeos estudiados en el noreste de Estados Unidos y en Inglaterra, el 20% o ms de los haplotipos en los pacientes con la forma con deplecin de sales tenan el haplotipo extendido raro [HLA-A1. Cw6, B47, FC (91)0. DRB1 '07. DRB4'0101. DQAV0201. DQBV0201] (Fleischnick, 1983). Se ha demostrado que este haplotipo tiene una delecin tanto de C4B como de CYP21B. explicndose asi la gravedad de los sntomas y la deficiencia completa del enzima en homocigotos para este haplotipo. Entre los pacientes con la enfermedad ms leve y oculta, es comn un haplotipo extendido diferente; [HLA-B65. SC2(1.2>, DR1] (Sinnot, 1991). Este haplotipo es comn, particularmente en el sur de Europa, y tiene una frecuencia en caucsicos de Boston por encima de 0,01. En todas las formas de deficiencia de 21-hidroxilasa, la mayora de haplotipos de MHC no estn extendidos y hay una gran variedad de complotipos, lo que sugiere que muchas mutaciones independientes han provocado una delecin o una alteracin del gen CYP21B. De estas observaciones, se pueden extraer algunos principios generales para la posible aplicacin a estas enfermedades de herencia y patognesis desconocidas que presentan asociacin o ligamiento con MHC. Primero, si un gen de susceptibilidad para una enfermedad se produce en un haplotipo extendido, todos los alelos de ese haplotipo mostrarn asociaciones positivas con la enfermedad. Y al contrario, si esto no ocurre en un haplotipo extendido, todos los alelos de ese haplotipo mostrarn una asociacin negativa con la enfermedad. Como los haplotipos extendidos tienen fijacin al ADN en eiemplos independientes de haplotipo extendido asociado a enfermedad, y son comunes, las personas sanas deben transportar genes de susceptibilidad. Todos los marcadores de enfermedad de MHC, y particularmente los haplotipos extendidos, muestran un alto grado de especificidad en la poblacin, Es por tanto particularmente importante en estudios de marcadores de MHC para la enfermedad comparar alelos de enfermedad y haplotipos (los de pacientes) con aquellos controles cuidadosamente emparejados tnicamente. Idealmente, el apareamiento tnico debera incluir regiones especficas de origen o subgrupos tnicos.

Enfermedades que incluyen herencia mendeliana de defectos en genes de MHC

Las variaciones frecuentes de los componentes del complemento humano y la cantidad de genes, junto al amplio polimorfismo de las protenas, hace que los genes de complemento sean excelentes marcadores de asociaciones de enfermedad con el complejo de histocompatibilidad (Yang, 1999).

Deficiencia de C2
La deficiencia del segundo componente del complemento se ha descrito slo en caucsicos y es el estado deficitario de protena del complemento ms comn en esa poblacin. Aproximadamente la mitad de los pacientes son asintomticos. Sin embargo, la deficiencia de C2 se ha asociado con polimiositis, infecciones piognicas recurrentes, prpura Henoch-Schnlein y vasculitis. El cuarenta por ciento de los casos descritos tienen una enfermedad sistmica tipo lupus; sin embargo, slo el 16% de los hermanos homocigticos deficientes en C2 han tenido alteraciones tipo lupus. Esto aconseja con firmeza la investigacin de errores sistemticos. No obstante, existe una clara tendencia aumentada de los sujetos homocigticos deficientes en C2 a tener alteraciones tipo lupus, quiz relacionado con una depuracin o desagregacin defectuosas de los inmunocomplejos. La deficiencia de C2 tipo I resulta de la homocigosidad del alelo nulo. C2"QO, que tiene una frecuencia de gen de un poco menos de 0,01. Hay aproximadamente 1 homocigoto por cada 10.000 individuos. Casi todos los pacientes tienen elementos de un haplotipo extendido [HLA-A25. Cw'1203, B18. S042. DRBV1501. DQBI'0601. DQAV0102] que contiene un gen de deficiencia en C2 (Awdeh, 1980; Clavijo, 1998; Truedsson, 1993). Las asociaciones de complotipo son ms frecuentes, seguidas por las asociaciones del DR, HLA-B, HLA-CW y HLA-A, de acuerdo con el orden de gen conocido. C2"Q0 resulta de la delecin de un gen de 28 pb que genera un marco de lectura y un codn finalizador de 14 pb distal al final del exn 5. La deficiencia de C2 tipo II (no asociada con ningn elemento de los haplotipos tipo I) es muy rara y produce un bloqueo selectivo de la secrecin de C2. El motivo del bloqueo de esta secrecin no se conoce (Colten, 1992; Zhu, 1998).

Deficiencia de C4
Hay una alta incidencia de alelos nulos C4 en la poblacin general. El treinta y cinco por ciento de individuos de todas las razas no expresan un gen C4A o C4B (esto es, portan C4A'Q0 o C4B'Q0), del 8% al 10% portan dos alelos nulos, y menos del 1% no expresan tres alelos. Las deficiencias completas de haplotipos C4 (Irans C4A'Q0. C4B'Q0) son extremadamente raras y pueden detectarse en heterocigotos slo con estudios de familia. En contraste con la deficiencia de C2, la deficiencia de C4 se ha descrito en al menos nueve haplotipos MHC diferentes, incluyendo aquellos con tipos BF diferentes, lo que sugiere que la deficiencia surge de un nmero de mutaciones diferentes. C4A'O0 y C4B'O0 proceden de deleciones de genes, codones finalizadores

Enfermedades de etiologa y patognesis desconocidas

Se han descrito un gran nmero de enfermedades que muestran asociaciones con MHC. Estas alteraciones son m u y diferentes de unas a otras y, aunque la mayora tienen al menos algn aspecto inmunolgico, otras pocas no. Hay muchos problemas que impiden comprender los mecanismos por los que se producen estas enfermedades, y los anlisis de marcadores de MHC en pacientes y sus familias han clarificado el panorama slo secundariamente. El origen ms importante de confusin es un fen-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

meno denominado penetrancia incompleta. Se ha observado ms claramente en gemelos homocigticos que presumiblemente tienen genes idnticos. Si uno de estos gemelos tiene una de estas enfermedades (p. ej., diabetes mellitus tipo I). el otro gemelo no tiene necesariamente la enfermedad. Para la diabetes tipo I. la relacin de concordancia no es superior al 50c (Ftubinstein. 1977). Esto sugiere que la penetrancia de una enfermedad en un husped completamente susceptible es incompleta: aunque hay una importante razn para considerar a los genes en el MHC como determinantes de la susceptibilidad para la diabetes tipo I. slo el 15% de los hermanos con MHC idntico de los pacientes tienen diabetes insulinodependiente. La diferencia entre el 50% y el 15% muestra la influencia de los genes en un segundo locus (o locu) no ligado a MHC, y tambin sugiere un factor o factores ambientales en la susceptibilidad determinante. La penetrancia incompleta hace difcil la asignacin de una forma especifica de herencia y provoca que la probabilidad de encontrar familias con ms de un miembro afectado en una o ms generaciones sea ba]a. Normalmente se utilizan las lamilias para determinar las formas de herencia. Otros factores que complican la situacin son la incapacidad para determinar si se est estudiando un grupo de pacientes homogneos en trminos de determinacin gentica. Casi el 5% al 6% de las familias seleccionadas al azar con un miembro diabtico tipo I tendr un segundo nio afectado. De estas parejas hermanas, aproximadamente el 60% tendr un MHC idntico, el 35% sern haploidnticos, y un pequeo porcentaje no compartir haplotipos MHC. Este patrn sugiere una herencia recesiva de un gen de susceptibilidad ligado a MHC para la enfermedad. Esta conclusin tambin se basa en los resultados de los anlisis de distribucin de homocigotos y heterocigotos para BF'F1 entre 1.100 diabticos tipo I (Raum. 1981). Sin embargo, todavia se ha de explicar la desviacin del 100% de identidad MHC de hermanos afectados. Entre las explicaciones que se barajan estn el entrecruzamiento del locus de susceptibilidad y el MHC, genes impenetrantes en padres susceptibles, y heterogeneidad en la forma de herencia, incluyendo penetrancia variable en homocigotos comparado con heterocigotos. Esto ha conducido a un vasto nmero de modelos de enfermedad sin encontrar una manera de hacer distincin entre ellos. Al menos, sin embargo, los estudios de familia proporcionan datos de haplotipos muy tiles y generalmente permiten la asignacin de homocigosidad para un marcador HLA en los individuos de prueba. Tambin se ha establecido que la asociacin MHC est basada en un ligamiento entre un gen de susceptibilidad y el MHC. Se desconoce todavia el nmero de alelos de susceptibilidad diferentes para una enfermedad en una poblacin especfica. Con respecto a esto, los haplotipos extendidos pueden ser tiles porque, si estn aumentados en los pacientes, probablemente representan un alelo nico de susceptibilidad que pudiera estar en cualquier lugar en la regin de fijacin. Sin embargo, algunos pacientes presentan slo porciones de esos haplotipos y esto proporciona indicios para localizar la participacin de los alelos especficos. Otro indicio puede ser el reparto de alelos especficos por dos o ms haplotipos extendidos diferentes.

una historia familiar de la enfermedad, la prevalencia entre los parientes HLA-B27positivos es aproximadamente del 20%. Se han descrito al menos 1 4 alelos de HLA-B27, HLA-B'2705 es el alelo que se encuentra ms comnmente en los sujetos normales. Se ha propuesto que la presencia de HLA-B40o HLA-B39en el otro haplotipo HLA. incrementa ms la susceptibilidad a EA. lo que corrobora la hiptesis de que los alelos no-B27contribuyen a una susceptibilidad aumentada de EA. Las protenas bactenanas que muestran homologa estructural con HLA-B27 incluyen una secuencia de seis aminocidos entre los residuos 72 y 77 del HLA-B'2705 y los residuos 188 y 193 de una nitrogenasa reductasa de Klebsiella pneumoniae, y entre las posiciones 71 y 75 de los subtipos mayores HLA-B27 y una secuencia de cinco aminocidos de un plsmido de una cadena atrilognica de Shigella flexnerii (Stieglitz, 1989). De todas las enfermedades ligadas al MHC. la diabetes mellitus tipo I es la que ms se ha estudiado (Lernmark. 1999; Nepom, 1991; Thorsby, 1992; Winler, 1993). La contribucin de HLA a la diabetes tipo I no se ha explicada adecuadamente. Existen considerables aumentos en el HLA-DR3y DR4 en pacientes caucsicos. En muchas pero no en todas las poblaciones de pacientes caucsicos con diabetes tipo I hay un exceso de heterocigotos DR3/DR4 por encima del nmero de homocigotos DR3 o DR4 predecibles por el equilibrio Hardy-Weinberg. Las razones de esto no estn claras. Por anlisis del ADN. el aumento en DR4 se encuentra ante todo en el subgrupo de DR4 en desequilibrio de ligamiento con DOBT0302. Aunque actualmente se considera que el ltimo gen es un marcador principal y quizs un determinante primario de la susceptibilidad a la diabetes tipo I, existe slo en el 70% de los pacientes caucsicos, e incluso en aquellos que lo transportan, hay una variabilidad en el nesgo relativo para diabetes: DRBV0401. DOBV0302 y DRBV0402 DOBV0302 estn asociados en gran medida con la enfermedad, mientras que DRBV0404, DOB1'0302\o estn menos. Adems, se ha observado que los pacientes HLA-DR1/DR4 transportan el alelo DOBV0302 en el haplotipo DR4. Por lo tanto, parece probable que haya mltiples contribuciones de la regin clase II a la susceptibilidad a diabetes DQA 1'0301 esta presente en todos los haplotipos Dispositivos, transporten DOB1 '0302 o no. y es posible que pueda contribuir al nesgo. Por otra parte, DQ6 se encuentra negativamente asociado a la diabetes tipo I. Los individuos heterocigoticos para DRBV1501 que tambin transportan un gen de susceptibilidad para la diabetes tipo I en el otro haplotipo no sufren riesgo en absoluto para la enfermedad (proleccin dominanle), como se espera en una alteracin recesiva. Un modelo recientemente propuesto para la diabetes tipo I que asume que DOB1 es un determinante directo de la susceptibilidad, sugiere una jerarqua de afinidades entre las diferentes molculas clase II que compiten por unirse al mismo pptido de diabetes tipo I (no identificado). La susceptibilidad sucede si un producto del gen (por ej., DQBV0302) se une y presenta el pptido. En presencia de un competidor de alta afinidad {DRBI'1501). esto no ocurre. El sinergismo (DR3/DR4) podra explicarse por la unin de un pptido de alta almidad a un dmero clase II frans-asociado. Un nesgo relativo diferente (DR1/DR4 o diferentes haplotipos transportando DOBV0302) puede explicarse por diferentes afinidades de aquellas molculas por el pptido. Otro modelo propone que un cido asprtico en el codn 57 de la cadena DOS protege (rente a la diabetes tipo I. La presencia excesiva en pacientes de un aminocido dilerente. ms frecuentemente valina o serina. en esa posicin en haplotipos transportando HLA-DR3 o DR4 respalda este concepto. Varios estudios han confirmado este hallazgo en caucsicos pero no en diabticos orientales. Otros estudios proyectan la hiptesis de que la presencia de arginina en la posicin 52 del DQA1 es otro factor gentico. Se ha propuesto que la combinacin del cido no asprtico en la posicin 57 de DOB1 y arginina en la posicin 52 de DQA 1 es un importante determinante de susceptibilidad para la diabetes tipo I mediada por genes DOB1. Existe datos significativos respecto a la asociacin entre marcadores MHC y artritis reumatoide (AR) (Auger. 1998: Nepom, 1992: Ollier, 1992). Para la mayora de las poblaciones estudiadas, el marcador asociado primario es HLA-DR4. En los caucsicos, por ejemplo, los alelos DR4 ms comunes asociados con AR son DRBV0401, 0404 y 0408. y en pacientes japoneses, israeles y chinos, es DRBV0405. Otras especificidades HLADR tambin se asocian con AR: DR1 se ha descrito en asociacin con AR en pacientes caucsicos, japoneses, espaoles, griegos e israeles: DR3

Enfermedades especificas sin evidencia de herencia mendeliana y con asociaciones MHC

La Tabla 41-3 enumera algunas enfermedades asociadas a MHC y sus marcadores. Esta lista no es exhaustiva y slo se tratarn algunas de ellas. La aplicacin de los mtodos de anlisis ya citados slo ha permitido entender unas pocas de estas alteraciones. Existe una asociacin marcadamente potente entre HLA-S27 y espondilitis anquilosante (EA) en poblaciones caucasoides. orientales y africanas (Khan, 1992). Entre los pacientes con EA, artropatas reactivas y uveitis aguda anterior, alrededor del 90% de los pacientes caucsicos, comparado con un 5% o 10% de los controles sanos, tienen HLA-B27(Rubin. 1994). La asociacin de B27 con estos sndromes en cuatro grupos raciales (caucsicos, negros, japoneses, indios americanos) sugiere que B27 por s mismo o un gen estrechamente ligado a B27 est involucrado en la patognesis de estas enfermedades. Las diferencias en la prevalencia regional de EA se relaciona tambin con la frecuencia de HLA-B27. Entre los individuos HLAB27 positivos en la poblacin en general, slo el 2% desarrolla EA Si hay

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COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD

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Tabla 41-3 Ejemplos de asociacin entre HLA y enfermedad' Enfermedad Enlermedad de Behcet Enfermedad celiaca Etnia Japoneses Chinos Caucsicos britnicos Antgeno HLA B51 B51 DRB1-0301 DQB1*0201 DQAV0501 DRB 1-0301
DQB1*0201

Riesgo relativo 79 3.4 26.7 51 8 139 6.9 368

Caucsicos italianos

Caucsicos checos

Enfermedad de Graves

Caucsicos germanos Japoneses Caucsicos sardos Chinos de Singapur

Tiroidilis de Hashimoto

Caucsicos hngaros Caucsicos canadienses Caucsicos britnicos Caucsicos europeos

infeccin VIH Progresor rpido"

Progresor lento Enfermedad de Hodgkin Nefropatia membranosa idiopatica

Caucsicos (Europa/Amrica) Caucsicos britnicos

Japoneses

Sndrome nelrtico idiopatico

Caucsicos franceses Caucsicos germanos

Esclerosis mltiple

Caucsicos franceses Caucsicos europeos Japoneses

Narcolepsia

Caucsicos canadienses

Artritis reumatoide

Caucsicos franceses

Indios asiticos Chinos Japoneses

DQ Al'0501 10.9 DRB 1 "0701 4 DQA1-0201 67 DRB t '0301 12.2 11 DOAt-0501 DRB1-0701 3.1 DQA 1-0201 2.9 DR3. B8. Cw7 3.?-5.5 DOAt'0102 9.2 A2 2.9 DPB1-0501 5.3 DRBT1601 2,3 DRB 1 -0301 3,5 DR5? 7,3 DR52 3.4 DR53 4.1 DOA1-0301/0302 DQBV0201 3.6 DQA 1 "0301/0302 DQB 1 '0301 9.7 Cw7 1.5 DQB 1 '0601 2,2 B7 3,4 B35 2.5 Cw7 2,1 DQB 1-0605 9,2 DPB 1'0301 1,95 DRB3-0101 5.5 DRB 1 "0301 9.8 DQB 1-0201 21.6 DQA 1'0501 6.7 DRB1M501 14,2 DQB 1-0602 16,8 DQAV0102 7,1 DR7 6,4 5,3 DQA 1-0201 DR7 2,8 DQA 1-0201 3.3 DRBT1501, DQB 1*0602. DQAT010? 3.0 Uno de DQAr010?/0103 o 0501 mas uno de DQB1 0602/ 13.0 0603/0604/0302/ o 0303 DRB T1501 1 030 DRB5-0101 1 263 DR15 384 DQB 1 '0602 1 468 DQAT0102 537 DRBV1501 93.5 DR15 13.2 DQB 1-0602 85.4 DQA 1-010? 28.6 DRB 1'01 3,5 DRB t-0401 4,1 DRB1'0404 107 DR1 34 DRBI-IOOt 3.8 DR1 6.8 FB-FS 3.1 3.6 DRB 1-0405
ledad mas rapido t 1988: 1:1185). id Conference New York. Oxford University Press,

'Individuos infectados con VIH que transportan el haplotipo [HLA-B8. SC0I. DR3] tienen un d( (Vase Stool CM. Ludan CA. Beatson. D. y col: HLA haplolype Al B8 Dr3 as a risk for HIV re Datos extrados de Tsuii K. Aizawa M. Sasa/uki T (eds) HLA 1991 Proceedings of the 11'" Inter 1992

en kuwaites; Dfl6en indios Yakima americanos; DR9 en chilenos, y DflfOen pacientes espaoles, griegos e israelies. Para explicar este amplio espectro de diferentes asociaciones HLA-DR con AR. se ha propuesto que la secuencia de un pptido DRB1 compartido est involucrada en conceder

susceptibilidad a AR. Los alelos asociados con AR comparten una secuencia de aminocidos m u y bien conservada en su tercera regin hipervariable (aminocidos 70 a 74). Estos residuos podran afectar a la unin de pptdos y a su presentacin a las clulas T. As. s existe un pptido artri-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

tognico. puede unirse preferentemente a molculas con la secuencia DRB1 de la AR. Por el momento, no se ha identificado tal pplido. Una explicacin alternativa puede involucrar un mimetismo molecular entre el DRB1 de la AR compartido y secuencias antignicas de un patgeno que pueda inducir AR. Se ha encontrado una homologa de secuencia entre la secuencia compartida de AR y una HSP de 70 kDa de Escherichia Coli. Varios artculos han demostrado una relacin entre la gravedad de la AR y la frecuencia HLA-DR4 en aumento, en particular con DRBV0401. Se ha detectado que los pacientes HLA-DR4-positivos con AR tienen una evolucin grave de la enfermedad, y los pacientes homocigticos HLA-DR4 tienen ms probabilidad de sufrir una AR mas grave. Tambin es posible que la produccin de factor reumatoide est asociada con DR4 El riesgo asociado con DRBV04 generalmente es mayor que el alribuible a DRBI'01 o DRBV10. La AR se diferencia clnicamente de la artritis reumatoide juvenil (ARJ). En contraste con la asociacin con DR4 en la artritis reumatoide. las asociaciones HLA con ARJ son bastante diferentes. Adems, otras asociaciones HLADR varan con los subgrupos clnicos de ARJ (Stastny. 1993). Por ejemplo, se h a descrito que el haplotipo HLA-DRB1'0801. DQAV0401. DQBV0402 est aumentado en todo el grupo pauciarticular y en pacientes con la forma persistente pauciarticular. El haplotipo HLA-DRBV1301. DRB3'0101. DOA1 '0103. DQB1 '0603 tambin se asoci con pacientes con ARJ pauciarticular persistente (Fernndez-Vina, 1994). Otras especificidades asociadas con la ARJ pauciarticular persistente son DRBV1104 y DPBV0201. La ARJ pauciarticular que pasa a la forma poliarticular se ha asociado con: DRBI'01. DRBV0801. DRBV1401. DQBV0501, DQBV0503. DQAV0101 y DPB1'0201. La ARJ pauciarticular con iritis crnica muestra una fuerte asociacin con DRBV1104. DR8y DR6. Adems de las asociaciones Clase II, se ha observado un aumento significativo en HLA-A2 en pacientes con ARJ pauciarticular. Los pacientes varones con comienzo despus de los ocho aos tienen una frecuencia marcadamente aumentada de HLA-B27. En pacientes con ARJ poliarticular y factor reumatoide negativo, DRBV0801 y DPBI'0301 han mostrado asociacin con la enfermedad. Teniendo en cuenta que la forma poliarticular de ARJ es un caso de AR en la juventud, el DRBV0401 muestra una fuerte asociacin. En caucsicos, los dos haplotipos extendidos suponen ms del 60% de los haplotipos en pacientes con enteropata sensible al gluten (ESG) (Goggins, 1994; Marsh, 1992): [HLA-B8. SC01. DR3] y [HLA-B44. FC-31. DR7). De manera anloga a la diabetes, existe un aumento en HLA-DR5/7. Tanto HLADR3 como DR7 estn en desequilibrio de ligamiento con HLA-DQ2 (DQBV0201. DQAV0501). Esta combinacin de genes DQB y DQA se encuentra en el 98% de los pacientes con enfermedad celaca (EC). El pptido gliadina, que previamente se ha visto que exacerba la lesin EC in vitro e n vivo, parece que se una a DQ2, aportando ms credibilidad a su posible papel en la patognesis de EC (Shidrawi, 1998). Este hallazgo sugiere que HLA-DQ2 podra presentar al pptido gliadma a las clulas T para su reconocimiento inmune. Diferentes estudios han apuntado la posibilidad de la existencia de alelos especficos HLA-DP asociados con ESG: DPBV01 y DPB1'03en el sur de Europa, y DPB1'03y DPBV04 en el Norte de Europa. El aumento en DBP'01 se encuentra asociado con HLA-DR3. lo que indica que el haplotipo extendido [HLA-B8, SC01. DR3] a menudo se extiende a travs de DP en EGS. Los determinantes de susceptibilidad DP y DQ comparten un residuo cargado positivamente alrededor del codn 71 de la cadena-(5. pero su papel especfico an no est claro. Otro marcador MHC recientemente asociado con ESG es el alelo de 8,5 kb del gen HSP70-2. que se conoce por estar ligado de forma inestable con haplotipos transportadores de HLADR3 (Partanen, 1998). ESG y la dermatitis herpetiforme (DH) comparten algunos rasgos clnicos y marcadores MHC. Los pacientes con DH han aumentado la frecuencia de los mismos haplotipos extendidos asociados a ESG. Sin embargo, comparando el halotipo. es evidente que las dos alteraciones son diferentes: los genes de susceptibilidad para ESG estn dentro o cerca de la regin HLA-DR/DQ. mientras que los de DH parecen estar entre el complemento y la regin HLA-DR/DQ. ms cercanos a la regin del complemento (Ahmed. 1993a). El pnligo vulgar (PV) se ha asociado a dos tipos de haplotipos HLADR4. DQ8 entre los pacientes judos [HLA-B38. SC31. DR4. DQ8] y [HLA635, SC31. DR4. DQ8] y un haplotipo HLA-DR6. DQ5 [HLA-B55. SB45.

DR6. DQ5] en pacientes no judos. Estos hallazgos indican que dos mutaciones dieron origen a genes de susceptibilidad MHC para el pnfigo vulgar. Uno, quiz el ms antiguo, surgi en un precursor de [HLA-B38/35. SC2I/31. DR4. DQ8] en una poblacin judia y se difundi a poblaciones no judas. El otro, ms reciente, parece haber surgido sobre [HLA-B55. SB45. DR14(6). DQ5] en el sur de Europa o en Asia y se difundi a otras poblaciones (Ahmed, 1991). La presencia de autoantcuerpos PV (desmogleina 3) ha mostrado una fuerte evidencia de ligamiento con DRB1'1404, DQB1 '0503. DQA V0101 (Delgado. 1997). El cuarenta y ocho por ciento de los parientes de los pacientes con PV que comparten los haplotipos de susceptibilidad tienen bajos niveles de anticuerpo PV. Asi. la enfermedad parece producirse en individuos susceptibles con bajos niveles de anticuerpo cuando un segundo factor, gentico o ambiental, induce niveles altos, suficiente para producir vesculas (Ahmed, 1993b). La evidencia que establece un papel directo de los genes HLA en PV surge de estudios que muestran que un pptido de 15 residuos, idntico a un segmento de la desmogleina 3. se une a un punto de un DRB1'0402 {Bho\. 1995). En el penfigoide cicatricial (PC), HLA-DRBT04 y DQBV0301 se han asociado con la forma ocular de la enfermedad (Ahmed, 1991). La forma oral de PC tambin est asociada con DQBV0301 (Delgado. 1996). Estos resultados indican que DQBV0301 es un marcador comn para ambas formas, oral y ocular, de PC, lo cual puede formar un espectro de una sola enfermedad. Los anlisis de la secuencia de aminocidos presentes en los alelos DQB1 en los pacientes con formas ocular y oral de PC mostraron que comparten residuos comunes en las posiciones 57 y de la 71 a la 77, y es posible que puedan ser tambin marcadores para esta enfermedad (Yunis, 1994). El MHC se ha asociado con una variedad de enfermedades infecciosas En la malaria, ambas molculas HLA clase I y clase II se han asociado con la proleccin de la enfermedad grave en Gambia (Hill, 1991). Un alelo especifico, HLA-DQBV0503. se ha asociado con la tuberculosis clnica progresiva (Goldfeld, 1998) Esta asociacin es particularmente intrigante, ya que el alelo DQBV0503 codifica un cambio en la posicin 57 del aminocido de la cadena [i (|i57), que afecta a la carga existente en el bolsillo de la unin al pptido putativo. P9. de la molcula DQ. Se sabe que este bolsillo contiene residuos hidrofbicos. El alelo DOS V0503 codifica el cido asprtico negativamente cargado en |557 en lugar del aminocido valina ms comn, sin carga e hidrofbico Es posible que la presentacin de pptidos restringida a MHC por los macrfagos infectados de tuberculosis est afectada en el grupo de pacientes que expresan este bolsillo en particular. El bolsillo de unin a P9 cargado negativamente puede unirse a antigenos de tuberculosis con menos efectividad o puede obtener una respuesta inmunognica disminuida. HLA-DRBV0901 esta ms representado en pacientes tuberculina (PPD) positivos en comparacin con pacientes TB anrgicos. DfBJ '0901 es el nico alelo que codifica un cambio en la posicin 9 del aminocido de la cadena (i (|}9). que influye en la carga en el bolsillo de unin al pptido putativo. P9. de la molcula D R El alelo DRBV0901 codifica el aminocido lisina cargado positivamente en (59 en lugar del cido glutmico ms comn y cargado negativamente Es posible que la respuesta restringida a MHC a los pptidos PPD est aumentada en el grupo de pacientes que expresan este bolsillo particular. El bolsillo de unin a P9 cargado positivamente puede unirse a residuos de PPD con ms eficacia o puede obtener una respuesta inmunognica aumentada Los antgenos HLA-B. B-27. B51 y B57 se han asociado a la falta de progresin del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) (Kaslow. 1996) Las molculas HLA-B pueden ser clasificadas por la presencia de un epitopo molecular B w 4oB w 6 o especificidad pblica, que est definida por los residuos 79 a 83 en el extremo carboxi-terminal de la hlice a, (Salter, 1989). El autor ha encontrado recientemente que la profunda supresin de la viremia por el virus de inmunodeficiencia humano tipo 1 (VIH-1). en ausencia de terapia antiviral con frmacos, est significativamente asociada con la homocigosidad para alelos HLA-B que comparten el eptopo HLA-Bw4 (Flores-Villanueva, comunicacin personal). Estos datos sugieren que los pptidos que se unen a los alelos HLA-Bw4 pueden mostrarse tiles en el desarrollo de vacunas basadas en pptidos. Los polimorfismos de genes HLA clase III se han asociado a enfermedades. Se han estudiado varios sistemas de alelos TNFy HSP-70 y micro-

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COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBIUDAD Y ENFERMEDAD

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satlites en relacin con los haplotipos extendidos (Tabla 41-4). El polimorfismo en la regin promotora TNF-ot, localizada en el nucletido -308 afn al lugar de comienzo de la transcripcin, se relacion con una aumentada susceptibilidad a la malaria cerebral (McGuire, 1994), espondilitis anquilosante (McGarry, 1999), mortalidad por choque sptico (Mira, 1999) y leishmaniasis mucoculnea (Cabrera, 1995). Los microsatlites del TNF d3 y b4 y la vanante HSP-70-1 9.0 fueron encontrados en frecuencias ms altas en dos poblaciones distintas con agranulocitosis inducida por clozapma (Corzo, 1995; Turbay, 1997). Otros sistemas de microsatlites se han asociado con artritis reumatoide (Mu. 1999) y lupus eritematoso sistmico (Sturfelt. 1996).

Es posible calcular la frecuencia del gen (g) sin conocer el tipo de herencia usando la frmula: 7 = i -v7

Fuerza de la asociacin
Se han ideado varios mtodos para detectar el grado de asociacin de los marcadores genticos con los hipotticos genes para la susceptibilidad a la enfermedad. Uno es calcular el riesgo de enfermedad entre individuos que transportan un alelo especifico de un sistema polimrfico. En este clculo, el riesgo relativo (RR) o relacin de probabilidad (odds ralio) calcula el riesgo de transportar un marcador en una poblacin de individuos enfermos comparado con una poblacin control. Ms interesante, pero ms dificil de estimar, es el riesgo de tener una enfermedad en un individuo que transporta el marcador (Tabla 41-5, vase tambin Tabla 41-3). Esta fuerza de asociacin es el A de Bergston y Thomson (Svejgaard. 1983), que es lo mismo que la fraccin etiolgica (FE) (Miettinen. 1976). Si. en una poblacin de pacientes, individuos a transportan el carcter especifico pero individuos no y. en la poblacin normal (control), individuos c transportan el carcter, la informacin puede ser escrita convenientemente en la tabla 2x2: Carcter positivo Paciente Control a c Carcter negativo b d

MTODOS DE DETECCIN DE LA ASOCIACIN O CORRELACIN DE LA ENFERMEDAD CON LOS MARCADORES GENTICOS Polimorfismo gentico
El polimorfismo gentico se define como la existencia en la misma poblacin de dos o ms alelos en un gen. cada uno con una frecuencia importante. La frecuencia se ha determinado de forma arbitraria como mayor que el 1%. Hay dos grupos de polimorfismo gentico; equilibrado o estable y transitorio. Un polimorfismo equilibrado se produce cuando dos o ms alelos se mantienen en una poblacin por seleccin. La ventaja heterocigtica es el clsico ejemplo de polimorfismo equilibrado. El polimorfismo transitorio representa una fase de cambios allicos conducida por deriva gentica o por seleccin. El polimorfismo de un gen puede ser estable en una poblacin y transitorio en otra, dependiendo del efecto de la seleccin. Para determinar el polimorfismo gentico es necesario encontrar una muestra representativa de la poblacin, valorar los individuos, contar los genes y estimar el nmero de genes contenidos en la poblacin total. Por ejemplo, asumiendo que se ha estudiado una poblacin de 100 individuos para un rasgo gentico particular o alelo en un determinado gen, se puede definir la frecuencia de fenotipo como el nmero de individuos que transportan el rasgo o la variante gentica. Para calcular la frecuencia (/) de cada alelo, se suman las frecuencias de cada alelo, y luego se divide entre el nmero total de alelos analizados:

La frecuencia del carcter en esta poblacin de pacientes (l\) es

f(x)+t(<i)+f{z)

Tabla 41-4

Constelacin de g e n e s TNF en relacin c o n haplotipos e x t e n d i d o s c o m u n e s Complotipo C4A BF 0 3 3 6 3 2 2 3 I 3 HSP70 2 8.5 9 g 9 9 9 9 9 'i 9 8,h Marcadores en el locus TNF d 862 -308 -856 I 3 3 3 4 3 4 3 4 3 4 2 1 1 1 l 1 1 1 1 l 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1

HLA-DR

C4B 1 1 1 1 1 1. 2 1 3 2 0

C2

HLA-B HLA-Cw

3 2 7 4
7

s s
I

5
i
;

s s
s

i 2 3

I1

s s s s

c c c c c c c c c
0

C
.A A
M

A A A A

3 3 3 3 3 3

hl numero de letras debajo de cada columna se refiere a una variante del alelo particular del complemento, protena 70 del golpe de calor (HSP70). polimorfismo de microsatlite TNF o promotor TNF- estn asociados con las especificidades HLA como se resea Vase texto para explicacin En el caso de TNF-a -308 I y 2 representan las vanantes -307/G y 307/A. respectivamente El alelo TNF-a -856/C se resena como 1 y el alelo -856/T como 2 El alelo 862/C TNF-a se resena como 1 y el -862/A como 2 Dalos extrados y modificados de Clavijo OP Delgado JC. Awdeh ZL y col Tissue Antigens 1998. 54 303.

3 1 3 3

2 11 7. 8 6. 7 2 S 2 10 2 10 1

3 4 4 5 5 5 1 4 1 A 5

8 7 44 44 57 35 14 38 62 18 18

0701 070? 1601 0501 060? 0401 080? 1203 0304 1203 0501

960

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 41-5

Riesgo relativo (RR)* para alelos M H C e n varias e n f e r m e d a d e s HLA-A HLA-B RR 1.6 Alelo
B8

HLA-DR RR 2.5 2.5 2,5 0,2 3,5 8,0 3,0 2,3 2,3 1.9 4.9 3.5 Alelo DR3 DR4 DR2 DR2 DR3 DR3 DR3 RR
\:

BF Alelo RR

Enfermedad Diabetes melhtus tipo 1

Alelo A1

B15 B18
B7

4,5 BF'Fl 0.1 4,2 17,0 2.2 4,4 BF'Fl BF'Fl 16,0 2,0

Esclerosis mltiplo Enteropala gluten Hepatitis crnica activa Glomerulonefritis membranosa idioptica Hemocromatosis idiopatica
.

A3 A1 A1

1.8 i8 1,7

B7 B8 B8 B8

B18 A3 Al 4.8 2.0

B7

B14
B15

DRw6
DR4

3.1 2.9

pacientes con marcador controles sin marcador

x

H n =

pactonte9 sin marcador controles con marcador . ,

De manera similar, en riesgos disminuidos, para los cuales RR es menor de 1, se puede usar el factor de prevencin (FP).

FP

0-RRK
RR

(i-<v)

Las fracciones FE y FP pueden variar entre 0 (no asociacin) y 1.0 (mxima asociacin) Aparte de facilitar estimaciones de tener un marcador si uno ya tiene la enfermedad, estos clculos ignoran el modo de determinacin gentica de la enfermedad en cuestin, Esto es particularmente problemtico para modos recesivos o ms complicados en los cuales ambos hapltipos son importantes para determinar la enfermedad pero se da el mismo peso a los heterocigotos y homocigotos para un marcador dado (esto es, ambos son positivos para el marcador).

Anlisis del modelo de herencia basado en parejas de hermanos

El anlisis de la forma de herencia basado en pareas de hermanos se introdujo para ayudar a superar los problemas de penetrancia incompleta de los genes de la enfermedad y las variaciones en edad al comienzo (Penrose. 1935). El mtodo se basa en la suposicin de que si el HLA y/o los genes estrechamente ligados a HLA no influyen en el desarrollo de la enfermedad, entonces las parejas de hermanos afectados compartirn hapltipos HLA con una frecuencia normal: el 25% compartirn ambos hapltipos. el 50% compartirn uno y el 25% no compartir ninguno. As, se comparan distribuciones observadas y esperadas de hapltipos compartidos. Si los genes de susceptibilidad o sus marcadores estrechamente ligado son raros y totalmente penetrantes, en una enfermedad determinada recesivamente, la distribucin de los hermanos que comparten 2.1 y ningn haplotipo seria 100, 0. 0. respectivamente. Para la determinacin dominante, la relacin sera 33, 66, 0. Lo que se observa en diabetes, por ejemplo (Rubinstem. 1977), es 60, 35, 5. ms cercano a las predicciones recesivas que a las dominantes. Una vez que se ha establecido la forma de herencia, se pueden establecer la frecuencia y la penetrancia del gen de la enfermedad (Thomson, 1977).

proporcin de individuos que son homocigotos para el marcador. La aplicacin de este mtodo al HLA-B27 y a la espondilitis anquilosante condujo, en terrenos estadsticos, a la desestimacin de un mecanismo recesivo. Asi, se concluy que la susceptibilidad a la espondilitis anquilosante es heredada como un rasgo dominante. De forma similar, el mismo mtodo de anlisis se aplic a la distribucin de BF'Fl entre 1.107 pacientes con diabetes mellitus tipo 1 (Raum. 1981). Para la herencia dominante, se pronosticaron 1,89 homocigotos y para la herencia recesiva 6.2. Se encontraron siete homocigotos BF'Fl. un resultado consistente slo con la herencia recesiva. Otros modos de herencia que podrian ser desestimadas por estas observaciones incluyen la dominante simple, episttica (enfermedad resultante de la presencia de genes no allicos) o superdominante (enfermedad con mayor penetrancia cuando dos alelos especficos estn presentes que cuando se producen otras combinaciones, incluyendo homocigosidad para cada alelo especfico). Aunque un modelo mixto con diferente penetrancia para homocigotos y heterocigotos no podra ser excluido completamente, otras consideraciones podran hacer insatisfactorio a tal modelo.

Mtodo de clculo de probabilidades (Lod Score Method)

Este es un mtodo estadstico de concordancia entre un locus marcador tal como en el MHC y un gen de susceptibilidad a una enfermedad (Sutton, 1980): (1) el valor Zes la relacin de la mxima probabilidad de encontrar o no concordancia (P F,/ 0]) en un valor de recombinacin particular 0; y (2) el valor o (q) de frecuencia de recombinacin, que es una medida de la distancia desde un locus determinado a un valor Z mximo. El clculo de probabilidades expresa la probabilidad de que alelos en dos locus se separen juntos, en trminos de la relacin entre la frecuencia de recombinacin observada con la pronosticada si concuerdan independientemente. Varios valores de (q) de 0 a 0.5 se sustituyen en la ecuacin: P(F,/e) = 1/2 [& (i -or' + e-'ii - ) ] Donde n = el nmero de nios en una familia determinada y r= el nmero de recombinantes. La probabilidad de obtener un estudio genealgico para un valor determinado de 0 (frecuencia de recombinacin de 0 a 0,5) se expresa como la relacin de P (FJ 0) en una familia en una fraccin 0 (de 0 a 0,5) de recombinacin dada a P (F./0.5) en la misma familia, asumiendo que ninguna recombinacin pueda ser expresada como el clculo de probabilidades (Z):

Anlisis del modelo de herencia basado en estudios de poblacin

Thomson y Bodmer (1977) han ideado un mtodo de anlisis de los datos de la poblacin para marcadores estrechamente ligados a locus de susceptibilidad para enfermedades con penetrancia incompleta. En esencia, este mtodo predice la proporcin de homocigotos. heterocigotos y no portadores para el marcador ligado esperado en casos de herencia dominante o recesiva. La diferencia principal entre los dos modos de herencia se obtiene por la

z - log

P(F,/0.5)

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COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Y ENFERMEDAD

961

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En general, un valor de Z mayor de 3 (para algunos valores de 0<0,5) significa que las probabilidades a favor del ligamiento son 1.000 a 1 (p = 0,05) en oposicin al no ligamiento o independencia. Es ms fcil calcular la concordancia para rasgos codominantes (es decir. H L A y GLO) que para rasgos recesivos. En estudios de concordancia de H L A y enfermedad, los padres pueden tener genes de susceptibilidad impenetrantes dominantes o recesivos. Hay problemas bsicos para usar el mtodo de clculo de probabilidades para detectar concordancias de genes parcialmente penetrantes, aparte de hermanos susceptibles impenetrantes. Si los genes de susceptibilidad son comunes, como parece ser en el caso de la diabetes tipo 1. por ejemplo, los cruzamientos aparentes de hermanos no idnticos podran sugerir genes de susceptibilidad adicionales en un padre.

962

SECCIN V

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C A P T U L O

42

Trastornos nmunodeficitarios
Charlotte Cunningham-Rundles, M.D., Ph.D.

INDICADORES CLNICOS DE INMUNODEFICIENCIA EVALUACIN DEL SISTEMA INMUNOLGICO INVESTIGACIONES DE PRIMER NIVEL Historia clnica y recuento sanguneo inicial Inmunoglobulinas Rayos X y tomografa computarizada Funciones pulmonares INVESTIGACIONES DE SEGUNDO NIVEL Produccin de anticuerpos Subclases de IgG Inmunidad de clulas T Valoracin funcional de las clulas T Anlisis de leucocitos polimorfonucleares Evaluacin del complemento

963 964 964

INVESTIGACIONES DE TERCER NIVEL Medidas enzimticas Histologa Ensayos con clulas asesinas naturales Anlisis adicionales de leucocitos polimorfonucleares Citocinas y receptores de citocinas

969

967

Marcadores adicionales de superficie celular Deficiencia de IgA y anticuerpos anti IgA Utilizacin de nuevos inmungenos para valorar la produccin de anticuerpos Gentica molecular y diagnstico prenatal RESUMEN BIBLIOGRAFA 972 972

La resistencia a la infeccin es una particularidad necesaria de la salud. Las principales barreras a las infecciones son las barreras fsicas naturales, la piel, la produccin de moco en las superficies mucosas expuestas, y la funcin de las clulas ciliadas del tracto respiratorio, intestinal y genital que tienen tendencia a eliminar los microbios invasivos. Adems de estas barreras, un importante nmero de funciones inmunitarias ejercen una continua vigilancia: estas funciones pueden ser no especificas no requiriendo ninguna sensibilizacin previa, y especificas, que requieren una previa exposicin para sensibilizarse (Tabla 42-1). Las funciones inmunitarias estn compuestas por un conjunto interrelacionado de clulas inmunitarias y funciones inmunitarias, siendo los principales elementos 1) los Imfocitos B produciendo anticuerpos, 2) los linfocitos T proporcionando funciones celulares, 3) el sistema (agocitario conteniendo leucocitos polimorfonucleares (PMN) y monocitos / macrofagos 4) el sistema complemento y 5) las clulas asesinas (clulas NK). La enfermedad por inmunodeficiencia primaria surge debido a anormalidades de uno o ms componentes de este grupo interrelacionado de funciones. Estas enfermedades fueron originariamente consideradas como enfermedades bastante poco frecuentes, caracterizadas como enfermedades graves con un comienzo clnico en los primeros aos de vida. Sin embargo, como en los ltimos aos se ha esclarecido el espectro de estos defectos, est claro que estas enfermedades son mucho ms comunes de lo que originariamente se crea, y la manifestacin clnica puede ser benigna. Lo ms importante es que ahora est claro que estas enfermedades pueden ser diagnosticadas en nios mayores, en adolescentes y en adultos de todas las edades. La incidencia general de estas enfermedades de inmunodeficiencia se estima en aproximadamente 1 de cada 10.000, excluyendo la deficiencia selectiva de inmunoglobulina A (Ig A). Por razones desconocidas, mas de la mitad de los defectos inmunes descritos incluyen defectos en la produccin de anticuerpos (Fig. 42-1). La Unin Internacional de Ciencias Inmunologas ha catalogado los defectos conocidos del sistema inmunitano.

que peridicamente se actualizan {Primary Inmunodeliciency Diseases. Report of an lUIS Scientific Committee, 1999). En la Tabla 42-2 se muestra un enfoque general de los principales sndromes inmunodeficitarios, clasificados por tipo.

INDICADORES CLNICOS DE INMUNODEFICIENCIA

El indicador clnico ms frecuente de un defecto inmune es la aparicin de "demasiadas infecciones". Esta es la principal manifestacin en los bebs y nios con deficiencias inmunitarias y representa un reto significativo para el pediatra, ya que las infecciones son m u y comunes en la infancia normal. Cuando las infecciones frecuentes y prolongadas se acompaan de retraso en el desarrollo o si aparecen infecciones poco habituales, debe realizarse una evaluacin del sistema inmunitano. La confirmacin de una enfermedad inmunodeficitaria en un hermano o pariente de primer grado debera implicar una valoracin clnica cuidadosa y una investigacin de laboratorio, incluso sin antecedentes de infecciones graves o inusuales. Aprovechando las caractersticas comunes de infeccin que aparecen en las enfermedades de inmunodeficiencia primaria, se han creado un grupo de signos de alarma para ayudar a la identificacin de individuos que tienen ms probabilidad de sufrir un defecto inmune (Tabla 42-3). Quiz los indicadores ms importantes para emprender una evaluacin del sistema inmunitario surgen al realizar una historia inicial cuidadosa. Junto con las seales de alarma reseadas en la Tabla 42-3, el mdico deberia preocuparse por elementos en la historia que son inusuales, como antecedentes de enfermedad autoinmune. adenopata significativa, la necesidad en un adulto de realizar una miringotomia. herpes zster grave, o herpes zster que aparece en nios pequeos, etc. Estas manifestaciones adicionales pueden tambin indicar que deberia considerarse un defecto inmune (Tabla 42-4).

964

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 42-1 Mecanismos de defensa del husped No especficos Barreras (piel, secreciones, moco, lgrimas, saliva) Fagocitos (neutrofilos, macrfagos) Clulas asesinas naturales Complemento Citocmas Especficos Anticuerpos Funciones de clulas T

recurrentes del tracto urinario no son caractersticas de deficiencia inmunitaria; el sistema inmune parece jugar un pequeo papel, si es que juega alguno, en la prevencin de pielonefritis y cistitis.

EVALUACIN DEL SISTEMA INMUNOLGICO

Basados en las consideraciones previas, cuando se sospecha un defecto inmunitario hay que hacerse estas preguntas: qu parte del sistema inmunitario debera investigarse, qu pruebas se necesitan y hasta dnde deberan llevarse estas investigaciones. La evaluacin del sistema inmune se lleva a cabo mejor por etapas, realizando primero las pruebas de deleccin bsicas, hasta llegar a las pruebas ms complejas, segn el caso. En la Tabla 42-6 se ofrece una visin general de este abordaje por etapas.

Por supuesto; no es prctico investigar todos los sistemas en todos los pacientes; sin embargo; el cuadro clnico y la edad del paciente indicarn al examinador qu parte del sistema inmunitario es con ms probabilidad el causante. Por regla general, la elaboracin de una historia cuidadosa y el examen fsico completo puede reducir las posibilidades de problemas que implican principalmente a clulas T. clulas B, granulocitos o el sistema complemento. La Tabla 42-5 enumera los sntomas y signos clnicos y sus correlaciones con los elementos de defensa del husped. En muchos casos el tipo concreto de nfeccin(es) que el paciente ha padecido puede proporcionar un indicador til sobre el defecto inmunitario ms probable (Fig. 42-2). Si predominan las infecciones por bacterias encapsuladas, se debera investigar la clula B, el sistema de complemento o los sistemas fagocticos: si hay predominio de infecciones fngicas o vricas, puede estar defectuoso el sistema de las clulas T. Las infecciones recurrentes por Neisseria deberan alertar al mdico sobre la posibilidad de una deficiencia gentica de uno de los componentes del complemento. Las infecciones recurrentes por Candida, incluyendo las aftas orales, no suelen ser un problema alarmante si se han utilizado con frecuencia antibiticos. Sin embargo, la candidiasis oral adquiere una mayor importancia cuando es resistente a una terapia local sencilla y cuando persiste despus de seis meses de edad. Las aftas orales no se consideran igual que la candidiasis mucocutnea, una enfermedad caracterizada por diseminacin de la infeccin desde las membranas mucosas a la piel contigua incluyendo generalmente las uas de los dedos. Estas lesiones cutneas pueden presentarse de forma granulomatosa. La candidiasis mucocutnea siempre es anormal. Tambin es importante observar las circunstancias clnicas y no fijarse exclusivamente en el nmero o la gravedad de los episodios infecciosos. Por ejemplo, cuando un proceso infeccioso afecta a la misma zona anatmica repetidamente, es ms probable que la etiologa sea estructural y no un defecto de una de las defensas del husped. La osteomielitis crnica en una localizacin, o episodios recurrentes de neumona que afectan slo a un lbulo pulmonar, o infecciones recurrentes de una herida quirrgica son ejemplos de estas situaciones. Por razones desconocidas, las infecciones

INVESTIGACIONES DE PRIMER NIVEL Historia clnica y recuento sanguneo inicial

Aparte de realizar una historia inicial y exploracin fsica, incluyendo medicin de la altura y peso, la primera prueba inmune es el hemograma completo (CBC). Un recuento de glbulos blancos (WBC) y diferencial proporcionar informacin sobre la morfologa y nmero de linfocitos pequeos (dimetro<10um). Se espera que haya ms de 1.200 linfocitos por milmetro cbico. Puesto que menos (-10%) de los linfocitos son linfocitos B, una deficiencia absoluta de linfocitos indica sobre todo deficiencia de clulas T. Parte de la primera visita debe tambin incluir la obtencin de todos los expedientes mdicos anteriores, incluyendo informes patolgicos o diapositivas, y resultados de cultivos previos y radiografas.

Inmunoglobulinas
Como las enfermedades por deficiencia de anticuerpos son ms comunes que otros defectos inmunes, se debe empezar investigando las inmunoglobulinas y produccin de anticuerpos (Stiehm, 1996). Los anlisis cuantitativos de inmunoglobulinas se encuentran disponibles en todos los laboratorios comerciales y hospitalarios, y para realizarse necesitan de muy poco suero (vanse Captulos 13 y 35). Como los valores de inmunoglobulinas aumentan con la edad, es necesario para la correcta interpretacin que se compare con controles de edad (vase Tabla 37-7). Durante los primeros meses, la IgG de origen materno es la principal inmunoglobulina presente en el suero del nio. El punto ms bajo se ve aproximadamente a los tres meses. Sin embargo el nio puede sintetizar IgA e IgM: asi. la presencia de estas dos inmunoglobulinas (partcularmenle la IgM, que se sintetiza antes que la IgA) es una evidencia

Figura 42-1. Clasificando los defectos inmunes de u n a amplia poblacin de pacientes remitidos para anlisis inmunolgicos y tratamiento, casi un 50% de todos ellos presentaban defectos en la produccin d e anticuerpos, incluyendo mmunodeficiencia variable comn, deficiencia selectiva de IgA, deficiencia de la subclase IgG, nipogammaglobulinemia transiloria del nio y agammaglobulinemia ligada al c r o m o s o m a X. Dalos t o m a d o s del M o u n t Sinai Medical Center, Immunodeficiency Clinic.

CAPTULO 42

TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS

965

Tabla 42-2

Clasificacin d e las inmunodeficiencias primarias' Enfermedad Comentarios

Deficiencia combinada de clulas B y clulas T Disgenesia relicular Inmunodeficiencia severa combinada (IDSC)

Sndrome hiper IgM

Ataxia-telangiectasia Timoma Sndrome Wiskott-Aldrich Deficiencia primaria de clula T Anomalia de DiGeorge

Hipoplasia hematopoyetica generalizada Incluye: (1) La ligada al cromosoma X debido a un defecto en la cadena del receptor IL-2. (2) herencia autosmica recesiva de naturaleza desconocida: (3) causada por deficiencia de adenosma deammasa (ADA); (4) causada por enzima recombinasa (RAG 1.2) delecluosa, (5) Sndrome de Omenn, en muchos casos debido a la mutacin en el enzima RAG: (6) asociada con defectos seos (hipoplasia cartilago-pelo. enanismo de miembros cortos); (7) sndrome del linfocito desnudo, baja expresin de la histocompalibilidad de los antigenos HLA clase II; (8) causada por un defecto en la cinasa JAK; (9) causada por un defecto en el receptor IL-7. (10) causada por un delecto en el enzima ZAP-70 de las clulas T IgM normal-elevada; defecto en la expresin de gp 39. un ligando de las clulas T para CD40. el receptor de clulas B responsable del cambio del isotipo; neumona por Pneumocystis, a menudo coiangitis asociada con neutropenia cclica, alta incidencia de esclerosis, normalmente no se ve en las enfermedades de las clulas B frecuente Deficiencia comn de IgE lgG2 y/o IgA: alta incidencia de malignidad linforrelicular defecto de la reparacin del cromosoma Detecto en clulas T variable; hipogammagiobulinemia en algunos Trombocitopenia (plaquetas pequeas); no respuesta a anticuerpos de carbohidratos: eczema: herencia ligada al cromosoma x alta incidencia de malignidad linforeticular, clulas CD43+ no detectadas Facies caractersticas: lesiones cardacas (lo ms tipico arco artico interrumpido); hipoparatiroidismo; la deficiencia en clulas T puede ser lo suficientemente grave como para ir asociada con deficiencia de anticuerpos, el defecto inmune por lo general mejora espontneamente: el limo est ausente en su forma completa, casi siempre fracaso del declive normal Se produce inmunoglobulina, pero la respuesta al anticuerpo especfico est marcadamente deteriorada; delecto timico no caracterizado A menudo asociado con aplasia de glbulos rojos primaria Las clulas T presentan pero no expresan CD3, necesario para la funcin del receplor de las clulas T Lesiones de piel granulomatosas; a menudo asociado con hipoadrenalismo. hipoparatiroidismo u otras endoermopatias. con el tiempo, puede aparecer una deficiencia de anticuerpos Ausencia de clulas B Clnicamente se presenta en el primer ao de vida, varones para la forma ligada al cromosoma X y varones y hembras para las otras Aparece a los 2-4 meses de edad: dificultad para diferenciarlo del nadir normal de IgG que se produce durante ese periodo IgM normal-elevada; defecto en la expresin de gp 39. un ligando de las clulas T para CD40, el receptor de clulas B responsable de la mutacin del isotipo; la neumona por PiieumcKystis, no observada normalmente en las enfermedades de clulas B. es frecuente: a menudo asociada con neutropenia cclica lgA<10mg/dl: IgG normal a aumentada; alrededor del 12% con deficiencia de lgG2. deficiencia selectiva de IgA; la deficiencia ms comn (1/500 de los caucsicos): asociado con herencia de antigenos de histocompatibilidad Bastante rara asociada a infecciones por Neisseha Importante defecto de anticuerpos clulas B presentes: puede presentarse deficiencia de clulas T y aumentar con el tiempo Dobido a la supresin de los genes de las cadenas pesadas do IgG. o produccin deficiente de isolipos de IgG seleccionados; asintomlica o asociada con infecciones, si la produccin de anticuerpos esta deteriorada Puede imitar sndromes de deficiencia de anticuerpos: deficiencias de C3 clnicamente similares a panhipogammaglobulinemia; deficiencias de componentes de complemento, particularmente C6-C9, tienen inlecciones recurrentes con especies de Neissena Imita a los sndromes de de crnicas con bronquela enca de anticuerpos; otitis recurrentes e infecciones pulmonares caracterstica

Sndrome de Nezelof Deficiencia de inosina fosforilasa (PNP) Ausencia de expresin de CD3 Candidiasis mucocutnea crnica Deficiencia primaria de clulas B Agammaglobulinemia congenita ligada al sexo (Bruton) Defecto de p-cadena, cadena sustituida lig. etc. Hipogammagiobulinemia transitoria de infancia Sndrome hiper IgM

Deficiencia selectiva de IgA Deficiencia selectiva de IgM Inmunodelicioncia comn variable Deficiencia do subclase de IgG Defectos de complemento Deficiencia de complemento Defectos estructurales Dismotilidad de cilios Defectos de origen desconocido Sndrome hiper IgE Candidiasis mucocutnea crnica

Sindrome de Job-Buckley (hiper-lgE); abscesos en piel y rganos, anormalidades seas. anormalidades dentales Lesiones de piel granulomatosas; a menudo asociado con hipoadrenalismo. hipoparatiroidismo u otras endocrinopalas, con el tiempo, puede aparecer una deficiencia de anticuerpos

Otros defectos Deficiencia molecular de adhesin a la clula Imita algo a los sndromes de deficiencias de anticuerpos: separacin retrasada del cordn (LFA-1/Mac-1) umbilical: respuesta inflamatoria pobre periodontitis. episodios spticos recurrentes
Para mSs delates vGase el articulo IUIS Primary Inmunodeliciency Diseases Report of an IUIS Scientific Committee. Clin Exp Immunol 1999: 17 311-321. con perrraso

convincente de que no existe panhipogammaglobulinemia. La panhipogam- dades significativas hasta la edad de seis meses; si embargo, despus d e la maglobulinemia es la forma habitual de presentacin de la agammaglobulme- edad de un ao. un nivel de IgA de 10 mg/dl o menos indica que la deficienmia ligada al cromosoma X. La IgA habitualmente no se encuentra en canti- ca de Ig A ser un defecto permanente (Plebani. 1986). En el sindrome hiper-

966
Tabla 42-3

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Diez signos de alerta d e inmunodeficiencia*

Tabla 42-5

Dos o ms episodios de neumona Prdida inexplicable de peso en adultos, fallo en el desarrollo en lactantes Abscesos recurrentes en rganos profundos o piel Uno o ms episodios de infecciones senas tales como meningitis. sepsis, celulitis u osteomielitis Historia familiar de deficiencia inmunitaria Infecciones recurrentes de odos, necesidad de sondas en adultos Candidiasis orales o cutneas despus de la edad de un ao Dos o ms meses con antibiticos orales con poco efecto Necesidad de antibiticos intravenosos para curar infecciones Dos o ms infecciones de sinus en un ao
'Dos o mas pueden indicar inmunodeficiencia.

Sntomas clnicos d e deficiencia correlacionados c o n el tipo de defecto

inmunoglobulina M. se han visto niveles normales o elevados de IgM con ausencia de IgA (Ramesh, 1998; Levy 1997). En general, las desviaciones de otros sotipos de inmunoglobulinas no se diagnostican como sndromes especficos. Sin embargo, los aumentos marcados de IgE forman casi siempre parte del sndrome de hiperinmunoglobulina E (Buckley, 1978), son comunes en el sndrome de Wiskott-Aldrich, algunas deficiencias de clulas T aisladas y se pueden encontrar en enfermedades crnicas granulomatosas. El sndrome de Wiskott-Aldrich caractersticamente muestra tambin un marcado aumento de IgA en suero con bajo IgM (Ochs, 1998).

Radiografas y tomografa computarizada

Las radiografas y la tomografa computarizada (TC) y los estudios de resonancia magntica (RM) tambin pueden ser tiles para valorar las deficiencias inmunitarias. La neumona crnica intersticial es frecuente en bebs, nios o adultos con deficiencias en clulas T, y debera confirmarse con radiografas de trax. Con el tiempo, muchos pacientes con deficiencia primaria de clulas B (agammaglobulinemia, inmunodeficiencia variable comn) pueden desarrollar fibrosis pulmonar crnica o bronquiectasias (Swenberg, 1991; Cunningham-Rundles, 1999). La tomografa computarizada de trax en un paciente que presenta infecciones recurrentes del tracto respiratorio es la mejor prueba para investigar una bronquiectasias; si estos cambios se han desarrollado, se necesita seguir investigando. Antes se realizaban proyecciones laterales del cuello para objetivar el tejido linfoide farngeo en nios. Sin embargo, no se recomiendan las radiografas para la evaluacin de tejido linfoide cervical porque la informacin que stas proporcionan se obtiene ms fcilmente por otros mtodos alternativos. Las proyecciones anteriores del trax pueden revelar una ausencia de la sombra timica en nios pequeos, pero como el timo puede disminuir fcilmente debido al estrs, la evaluacin del tamao del timo por este mtodo no es fidedigna. Las anormalidades seas, sin embargo, pueden alertar al radilogo de un problema inmunolgico presente en la infancia. Un subgrupo de pacientes con inmunodeficiencias que implican anormalidades de clulas T o B y T, sufren enanismo de extremidades cortas. Estos pacientes muestran lesiones caractersticas, generalmente en las regiones metafisarias de los huesos largos. Los pacientes con deficiencia de adenosina deaminasa muestran biselado de los extremos costales, cuadratura de los omplatos y articulaciones inusuales de las apfisis transversales costales (Cederbaum, 1976).

Tabla 42-4

Hallazgos clnicos q u e sugieren u n a inmunodeficiencia de defecto o localizacin inciertos

Defectos en el desarrollo Eczema intratable Dermatitis seborreica generalizada (inmunodeficiencia grave combinada) Adenopatia, esplenomegalia Colitis ulcerosa manifestada antes del primer ao de vida Diarrea intratable Enfermedad autoinmune (son habituales PTI o anemia hemolitica) Deficiencia hematolgica inexplicable (de cualquier serie: eritrocitos, neutrlilos, plaquetas)
PTI = prpura trombocitopenica inmune.

Se piensa en una deficiencia de clulas T cuando 1. Vacunas de virus vivos o bacterias atenuadas producen enfermedades sistmicas o resultados inesperados (p ej., viruela generalizada, neumona de clulas gigantes con rubola, infeccin generalizada por Mycobacterium) 2. Un virus habitualmenie benigno ocasiona una infeccin contundente (a menudo neumona) como varicela o citomegalovirus. 3. Candida oral no responde a la quimioterapia, no va asociada a la dermatitis de paal o anlibioterapia excesiva, o persiste despus de seis meses de evolucin. 4. Candida est presente en superficies mucosas y se traslada a reas cutneas contiguas a modo de candidiasis mucocutnea. 5 El paciente sufre enanismo de miembros cortos (El pelo puede ser muy fino y tejidos laxos con hiperexlensibilidad de articulaciones y gran hernia umbilical) 6. Hay signos de enfermedad intrauterina de injerto contra husped (p. ej. descamacin, eritrodermia, alopecia, defectos en el desarrollo). 7. Enfermedad de injerto contra husped se produce tras la infusin de un hemoderivado 8. Se produce tetania neonatal. (Buscar mandbula hipoplsica. surco nasolabial corto, orejas de implantacin baja con el pabelln corto, hipertelonsmo de anomala de DiGeorge.) 9. Lintocitos pequeos (< 10 en dimetro) con recuento permanentemente menor de 1 200/mm . 10. Infecciones debidas a organismos oportunistas o se produce un sarcoma de Kaposi generalizado Buscar factores de riesgo asociados con sida. Se piensa en una deficiencia de clulas B cuando 1. Infecciones recurrentes con pigenos exlracelulares, Streptococcus, Staphylococcus. Haemophilus. 2. Hiperplasia linfoide nodular de intestino es persistente 3 Infeccin intestinal por Giardia j Se piensa en un defecto combinado de clulas T y B cuando 1 Hay signos del sndrome de Wiskot-Aldnch (supuracin de odos, trombocitopenia, diarrea sanguinolenta, eczema en el varn). 2 Hay signos de ataxia-telangiectasia (La ataxia es el principal signo de la enfermedad, especialmente cuando el nio crece Una caracterstica predominante es la telangiectasia de la esclertica y los odos. La expresin facial es triste.) 3 Los sntomas antes mencionados de las enfermedades de clulas T y B se producen juntos. Se piensa en un defecto bioqumico cuando 1. Hay sntomas de defectos combinados T y B con cambios caractersticos en las radiografas en costillas, omoplatos, vrtebras (deficiencia de adenosina deaminasa). 2. Hay aplasia medular primaria de glbulos rojos y otros sintomas del sndrome Blackfan-Diamond (deficiencia de nuclesidofosforilasa). Se piensa en un defecto de leucocitos cuando 1. Hay abscesos estaliloccicos de piel recurrentes y graves; se pueden observar abscesos prolundos de rganos internos, pero menos habitualmente (sndrome hiperlgE o sndrome de Buckley-Job). Ms adelante aparecen abscesos en pulmn en casi todos los pacientes con sndrome hiperlgE 2. Osteomielitis crnica o recurrente, nodulos linfticos que supuran, particularmente cuando son causados por especies de Klebsiella o Serraba (enfermedad crnica granulomatosa). Se piensa en una inmunodeficiencia secundaria cuando 1 Hay una infeccin viral concomitante o anterior (especialmente virus de Epstein-Barr. VIH). La infeccin viral puede producirse en el tero y producir una enfermedad inmunodeficitaria en el feto. 2. El paciente tiene determinadas enfermedades malignas (p. ej.. leucemia linloctica crnica, enfermedad de Hodgking. mieloma mltiple). 3 Se produce acidosis, alopecia y convulsiones con candidiasis mucocutnea crnica (deficiencia de botina) Deficiencias de biolina, zinc y selenio pueden producirse en pacientes con prolongada hiperalimentacin.
3

4. El paciente est recibiendo inmunosupresores. 5. El paciente tiene una historia consecuente con posible exposicin a VIH. 6. El paciente tiene los sintomas clnicos de acrodermatitis enteroptica (deficiencia de zinc puede tambin ocurrir con hiperalimentacin prolongada).
I VIH = Virus de inmunodeficiencia humana

CAPITULO 42

TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS

967

Subclases de IgG
La IgG consta de cuatro subclases, de la IgGl a la lgG4. que se distinguen por diferencias tanto estructurales como biolgicas (vase Tabla 30-4 y Tabla 42-7) (Normansell, 1987; Schur, 1987). Aunque no se ha establecido el papel individual de cada una de las subclases de la IgG para diferenciarse del resto, los anticuerpos a los antigenos de los carbohidratos se concentran en la subclase lgG2, y muchos antgenos de las paredes de las clulas bacterianas tienen naturaleza de carbohidrato (Scott, 1988). Asi. la ausencia de respuesta a lgG2 podra traducirse en un defecto para desarrollar proteccin (rente a infecciones bacterianas. Esta relacin es ms convincente en el paciente ocasional con deficiencia de IgA que tambin tiene deficiencia de la subclase lgG2 y que no responde con anticuerpos ante una vacuna c o m o la del neumococo. En aquellos pacientes con deficiencia de IgA e lgG2, las pruebas de funcin pulmonar pueden ser significativamente anormales comparadas con aquellos slo con deficiencia de IgA (Bjorkander, 1985). Una deficiencia en la subclase IgG tambin se ha sealado como causa de infecciones recurrentes en pacientes con niveles normales o casi normales de IgG (Oxelius. 1979: Shackelford. 1990: Wedgwood, 1986: Gross, 1992; Popa. 1994). A pesar de estos indicadores, la importancia biolgica de la deficiencia de la subclase IgG no est clara. De hecho, algunos individuos que carecen totalmente de genes para lgG2 IgA e IgE. estn sanos (Lefranc. 1982: Migone, 1984). Adems, los anticuerpos anticarbohidrato lgG2 no son la nica fuente de proteccin de anticuerpos para estos antigenos. En realidad, una deficiencia significativa de anticuerpos, limitada a reacciones frente a antigenos de carbohidratos, o ms defectos globales, se pueden encontrar en nios o adultos con niveles normales de inmunoglobulina total en suero (Ambrosmo. 1988). La IgGl es el primer tipo de subclase de respuesta frente a antgenos de carbohidratos, producindose una conversin a respuesta lgG2 a medida

Figura 42-2. El espectro de agentes infecciosos encontrado puede indicar el sist e m am m u n i t a r i o donde se encuentra el potencial detecto.

Pueden aparecer anormalidades seas en pacientes con el sndrome de hiperinmunoglobulina IgE: estas anormalidades incluyen osteoporosis generalizada, fracturas ante un mnimo traumatismo, craniosinostosis y defectos en huesos de la lnea media (Grimbacher, 1999).

Funciones pulmonares
La inmunodeficiencia. especialmente si ha persistido durante algn tiempo, a menudo afecta a las funciones pulmonares, a todos los volmenes pulmonares, debiendo evaluarse los volmenes espiratorios forzados, incluso si la radiografa de trax es normal. Los pacientes con defectos de clulas B y T son propensos a infecciones pulmonares, que terminan en broncoespasmo, enfermedad restrictiva u obstructiva, o combinaciones de estas anormalidades.

Tabla 42-6 Niveles de pruebas inmunolgicas Nivel* Primer nivel Medida

INVESTIGACIONES DE SEGUNDO NIVEL Produccin de anticuerpos

Para reconocer el significado clnico de los niveles algo reducidos de mmunoglobulina en suero, se miden las respuestas especificas de los anticuerpos a antgenos previamente administrados o que ya existen. Si el nio o el adulto recibieron previamente las inmunizaciones habituales, pueden cuantificarse los ttulos de anticuerpos para los antgenos de esas vacunas. Si el nio no ha sido inmunizado o para los adultos donde ha transcurrido ms tiempo desde la vacunacin, se debe producir una respuesta tras la administracin de la vacuna de recuerdo (Moen, 1986)). Las mejores respuestas a vacunas suceden con el ttanos, difteria, haemophilus y neumococos; muchos laboratorios comerciales han desarrollado pruebas de sensibilidad que pueden utilizarse para calcular la produccin de anticuerpos. Lo que no est tan claro es cmo interpretar cada respuesta; en general un aumento de dos a tres veces o ms por encima de los niveles de referencia, y la existencia de niveles protectores de anticuerpos, significa una adecuada respuesta a estas vacunas. Es importante recalcar que no deben administrarse vacunas de virus vivos a los nios, o a cualquier miembro de la lamilia si se cuestiona el estado inmunolgico. Las vacunas del sarampin, paperas, rubola, polio, bacilo de Calmette-Guerin (BCG) y varicela no pueden ser usadas en esta poblacin. Si el paciente no tiene el grupo sanguneo AB, se pueden determinar los niveles de las isohemaglutininas A o B que convengan (Parker, 1997). Sin embargo, debido a la relativa inmadurez, o quiz a la inadecuada exposicin a edades menores de dos o tres aos, las isohemaglutininas pueden ser negativas o de ttulos baios en nios pequeos, incluso en aquellos que tienen la inmunidad normal.

Historia y exploracin fsica CBC y diferencial Nmero de linfocitos (mortologia de linfocitos) Niveles cuantitativos do inmunoglobulina Radiografas Cultivos Funciones pulmonares | Segundo nivel Respuestas a anticuerpos especficos Anlisis de subclase IgG Prueba de complemento Pruebas cutneas de hipersensibihdad retardada Anlisis de marcadores de superficie de linfocitos Estudios de proliferacin de clulas mononucleares (usando clulas mitogmeas. alognicas y estimulacin de antigenos) Reduccin de neutrfilos con tincin (equivalente al citmetro de flujo NBT) Tercer nivel Medidas de enzimas (adenosina deaminasa. PNP") Estudios de citotoxicidad de clulas NK Estudios de fagocitos (movilidad, glucoproteinas de superficie, bioqumica) Anlisis de estructura e inmunohistolgico de rganos linfoides Produccin de citocnas Estudios complejos de complemento; defectos genticos Nuevos antigenos a pruebas de produccin de anticuerpos Biologa molecular, deleccin de portadores. diagnostico prenatal
" El nivel de medida se refiere a la localizacin clnica en la que se realiza y se interpreta la prueba Las pruebas de primer nivel se obtienen fcilmente en hospitales locales o en laboratorios comerciales El mdico de primaria dobe ser capaz de interpretar estos valores. Las pruebas de segundo nivel se realizan si las condiciones clnicas lo justifican y algunas pueden necesilar mdicos con formacin especializada para determinados anlisis Las pruebas de tercer nivel se realizan e interpretan en centros con un inters aelrvo de investigacin en el tema. CBC recuento completo de sangre NBT = nilroazul de tetrazolium; PNP = purina nuclesido fosforilasa; NK = clulas asesinas naluraies

968
,
__

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 42-7

Propiedades d e las inmunoglobulinas h u m a n a s IgM IgG IgA IgD

A. Fisiolgicas Concentracin normal en adultos, mg/ml 1.2-4,0 8.0-16.0 0,4-2.2 0,03 17-450 ng/ml Unidades internacionales/ml 69-322 92-207 54-268 <10O Porcentaje total de inmunoglobulina 13 80 6 1 0.002 Distribucin intravascular, porcentaje 41 48 76 75 51 Ritmo de sntesis, mg/kg/dia 2,2 35 24 0,4 0.003 Ritmo de catabolismo en suero, 10.6 6 24 37 90 porcentaje/dia (o semivida. da) (5-6) (18-23) (5-6,5) (2.8) (2.3) B. Biolgicas i Capacidad de aglulinacin +4 Capacidad de fijacin de complemento por la ruta clsica +4 + Hipersensibilidad homologa anafilctica +4 Anafilaxis heterloga de cobaya + Fijacin a mastocitos y basfilos homlogos +4 Unin citoflica a macrtagos + Transporte placentario al feto + Actividad de fijacin al factor reumatoide + Presente en secreciones externas +4 +2 + Otras propiedades caractersticas: IgM Producida rpidamente en respuesta inmune, primera defensa electiva contra la bacteriemia IgG: Combate microorganismos y toxinas en fluidos extravasculares IgA Deliende las superficies externas del cuerpo IgD- Presente en superficie de linfocitos o clulas inmunocompetent.es, importante para la activacin y/o mmunorregulacin de clulas B
;

.J

que el individuo madura (Scott, 1988). No hay evidencia de que los que se limiten slo a respuestas IgG 1 tengan ninguna desventaja. Es obligatorio determinar la importancia biolgica de una deficiencia en la subclase IgG, probando con una produccin especfica de anticuerpos, generalmente mediante la administracin de vacunas como ttanos, difteria, haemophilus y neumococo. Solamente se debera considerar que tienen un defecto de inmunidad significativo aquellos sujetos con una deficiencia clara de anticuerpos a un nmero de antgenos.

Valoracin funcional de las clulas T

Las pruebas cutneas de hipersensibilidad retardada se utilizan habitualmente como medidas de funcin de las clulas T. porque miden la capacidad de reconocer y de presentar el antigeno, movilizar las clulas T y generar una respuesta especfica inflamatoria. Y a sean los nmeros de clulas T normales, bajos o nulos, se debe comprobar la funcin de las clulas T si existe cualquier sospecha de existencia de un defecto celular de esta naturaleza. Sin embargo, el principal inconveniente cuando se realizan pruebas cutneas en lactantes es que no han tenido suficiente exposicin para responder a los antgenos (Kniker, 1985). Asi, en el momento en que la valoracin de las clulas T es particularmente importante, estas pruebas son inservibles. Entre los tres y los cinco aos de edad, las pruebas cutneas adquieren ms fiabilidad. Otro problema con las pruebas cutneas es que el antgeno debe ser inyectado intradrmicamente con cuidado. Una idea ms definitiva sobre la capacidad funcional de las clulas T se puede obtener mediante valoraciones funcionales. Junto con las pruebas cutneas utilizadas como mtodos de deteccin, para valorar la funcin de las clulas T se emplea habitualmente una respuesta proliferativa in vilro. Se emplean generalmente tres tipos diferentes de estimulo: mitgenos. antgenos y menos habitualmente, aloantgenos. Los mitgenos son inespecificos (generalmente extractos de plantas), y estimulan linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ independientemente de la especificidad de los antgenos. Los aloantgenos (antgenos presentes en las clulas que controlan el rechazo en los trasplantes de rganos o tejidos) tambin estimulan las clulas CD4+ y CD8+ de una forma relativamente inespecfica; en la prclica se pueden usar clulas mononucleares irradiadas de un individuo sin parentesco. Las respuestas proliferativas a estos estimuladores indican la presencia de clulas T, pero una respuesta no garantiza la capacidad de eliminar los agentes infecciosos del husped. Los pacientes con deficiencias significativas de clulas T pueden presentar alguna respuesta mitgena o aloantgena. La prueba mejor relacionada con la capacidad a resistir infecciones es la de las respuestas proliferativas a antgenos especficos (Lae, 1985). En el caso de antigenos especficos se usa habitualmente ttanos, difteria y candida. Se requiere una exposicin suficiente al antgeno para una respuesta positiva; por consiguiente la proliferacin ante estmulos antignicos es poco habitual en nios durante el primer ao de vida. Otra medida de respuestas especficas de clulas T, que puede incluso utilizarse en lactantes, es cultivar clulas mononucleares de sangre perifrica con concentraciones mitognicas del anticuerpo

Inmunidad de clulas T
El desarrollo de anticuerpos monoclonales ha permitido la rpida enumeracin de clulas T y subgrupos de clulas T, usando slo una pequea cantidad de sangre. Estos marcadores de anticuerpos se han clasificado, con la designacin "CD". para "antgenos de diferenciacin"("c/usfer ol differentiation"). lo que quiere decir que un grupo de anticuerpos monoclonales identifica una protena caracterstica determinada de un subgrupo de clulas mononucleares seleccionadas. La designacin CD subdivide a las clulas T (como un grupo, CD3-*-) en dos principales subgrupos, CD4+, algunas veces llamadas clulas "colaboradoras", clulas involucradas en el inicio de las reacciones inmunes, secrecin de citocinas y aumento de respuestas de clulas B, y clulas T CD8+. asociadas con funciones citolilicas (asesinas). Aunque estas actividades funcionales definen alguna de las actividades inmunolgicas de las clulas T CD4+ y CD8+. ambas molculas sirven como molculas sealizadoras, que funcionan en unin con las principales clases I y II de histocompatibilidad de antigenos (MHC), y sirven para ampliar y estabilizar la unin del receptor de la clula T (TCR) con el antgeno. Las enfermedades con inmunodeficiencia que derivan de la generacin defectuosa de clulas T pueden dar lugar a un nmero bajo o nulo de clulas T CD3+, produciendo un bajo nmero de clulas CD4+ y CD8+, o un nmero reducido de clulas CD4+ o CD8+. El sndrome de DiGeorge, por ejemplo, provoca un nmero bajo de clulas CD3+ en general (Hong, 1998); una deficiencia de la clase II MHC provoca un nmero bajo de clulas CD4+ (Klein,1993); y una anormalidad de la clula iniciadora, Zap-70. esencial a la actividad del receptor de las clulas T, provoca un nmero reducido de clulas T CD8+ (Eider. 1998). En general, si se sospecha un defecto inmunitario, se examina este panel de marcadores de clulas T y se determina el nmero absoluto de clulas en cada grupo, comparndolo con los controles normales de edad similar establecidos por el laboratorio.

CAPTULO 42

T R A S T O R N O S INMUNODEFICITARIOS

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monoclonal anti CD3; este estimulador normalmente produce la proliferacin de lodas las clulas T CD3+, mientras que la ausencia de proliferacin demuestra un grave defecto de clulas T (Hong, 1996).

zados de conejo; estas clulas son potentes activadores de la via alterna. Si alguno de los ensayos es anormal, la identificacin del componente individual que es deficiente depende de pruebas inmunoqumicas o funcionales especializadas que sean especficas para cada componente, (vase Cap. 38).

Anlisis de leucocitos polimorfonucleares

La enfermedad granulomatosa crnica (EGC) es la principal enfermedad de leucocitos polimorfonucleares. Sus principales manifestaciones son adenopatia, neumona, abscesos en el hgado o los nodulos linfticos, y osteomielitis; la forma de herencia es ligada al sexo (la ms habitual) o recesiva autosmica (debido a mutaciones que afectan a las posiciones de los cromosomas 16p24,7q11.23 o 1 q25). El principal defecto es el error metablico que provoca el fracaso de la reaccin metablica que sigue a la ingestin fagoctica de las bacterias (Meischl. 1998). En consecuencia, no se reduce el oxigeno molecular a superxido. No se produce el radical hidroxilo y el perxido de hidrgeno y se pierde un importante mecanismo intracelular de eliminacin bacteriana (Babior, 1978). Este defecto se compensa parcialmente por organismos que producen perxido de hidrgeno en el interior de las clulas. En la enfermedad crnica granulomatosa, los organismos productores de catalasa, que destruyen el perxido de hidrgeno citoplsmico. sobreviven a la ingestin intracelular, se multiplican y causan una respuesta de tejido granulomatoso. El Staphylococcus aureus es el microorganismo involucrado ms habitual. Las infecciones crnicas con Serratia, especies de Klebsiella, Pseudomonas (ahora Burkholderia) cepacia, y especies de Aspergitlus son particularmente molestas (Gallin. 1983. 1990). Ante una historia sugestiva, se debera considerar en la primera consulta este diagnstico. La prueba llamada la prueba del nitroazul de tetrazolium (NBT) es el mtodo clsico de laboratorio para detectar la EGC (Park, 1968), pero ha sido sustituida en muchos laboratorios por un equivalente de citometria de flujo (0' Gorman, 1995) que se adapta mejor al estudio de muestras clnicas. Otra prueba de deteccin de la EGC es la medida de luminiscencia y produccin de superxido (Gallin, 1983, 1990) pero estas pruebas no se realizan en la mayora de los laboratorios. La caracterstica biolgica tundamental del leucocito en la EGC es que fagoctar a las bacterias normalmente, pero no las destruir. Este comportamiento constituye la base de un ensayo de muerte de bacterias para EGC El sndrome de hiperinmunoglobulina IgE (Buckley, 1978) es de alguna form a fenotpicamente similar a la EGC, con abscesos recurrentes de piel y pulmonares, pero incluyendo tambin anormalidades seas, facies anormales y candidiasis cutneas: sin embargo, la funcin defectuosa de los PMN no es un rasgo claro de esta enfermedad (Buckley, 1978). El defecto inmunitario en el sndrome de hiperlgE todava no est muy definido y es difcil la clasificacin o asignacin de una causa inmunolgica o molecular. En una situacin de abscesos cutneos recurrentes y profundos, que generalmente requieren incisiones para su control, debera considerarse el sndrome de hiperlgE. El diagnstico se sugiere por la manifestacin de niveles de IgE superiores a 2.000 Ul/ml (pero tan elevados como 20.000 a 60.000 Ul/ml) con las manifestaciones clnicas correspondientes (Grimbacker, 1999). Todava no estn disponibles pruebas diagnsticas o de confirmacin; sta es una enfermedad reconocida por un fenotipo clnico, aunque se ha identificado una posible localizacin cromosmica (Grimbacher, 1999).

INVESTIGACIONES DE TERCER NIVEL Medidas enzimticas

Las deficiencias enzimticas relacionadas con el metabolismo de las purinas, adenosina deaminasa (ADA) y purina nuclesido fosforilasa (PNP) estn asociadas con deficiencias inmunolgicas. El mecanismo bsico es el acumulo de metabolitos txicos que inhiben la replicacin celular, produciendo finalmente la prdida de importantes lineas celulares de linfocitos. La falta de adenosina deaminasa, que cataliza el catabolismo de adenosina a inosina, produce primero la prdida de clulas T (clulas T CD4+ en particular) y con posterioridad clulas B. conduciendo a una forma comn de deficiencia grave combinada de clulas T y B (Hirschhorn, 1995). Aproximadamente el 25% de las inmunodeficiencias severas combinadas (IDSC) son causadas por la deficiencia de ADA. A menudo se observan anormalidades seas caractersticas que afectan a las caderas, pelvis y omoplatos (Cederbaum, 1976). Como para muchos de los defectos inmunitarios primarios que primero fueron identificados en su forma grave, la deficiencia de ADA tambin se ha diagnosticado en adultos con linfopenia de CD4 y defectos significativos de clulas T (Shovlin, 1994). La deficiencia de PNP provoca deficiencia de clulas T con un efecto mnimo o nulo sobre las clulas B. Las enzimas generalmente se miden en usados de hemates (Kizaki, 1977), pero si se han hecho transfusiones sanguneas en los tres meses previos, el ensayo puede no ser exacto, y en su lugar se deben determinar en los fibroblastos de la piel, extrados de una biopsia de piel.

Histologa
El timo normal y tejidos linfticos muestran rasgos estructurales caractersticos que estn alterados o ausentes en las inmunodeficiencias (Borzy, 1979; Hong. 19996: Abbas, 1994). En la prctica clnica actual, a menudo estos tejidos no estn disponibles, pero cuando se obtienen estos materiales de las biopsias, el examen microscpico de estos tejidos debera incluirse en la evaluacin inmunolgica. Las pruebas in vilro de las clulas obtenidas de estos tejidos son bastante reveladoras cuando se estudian mediante reactivos monoclonales dirigidos a tipos especficos de clulas y marcadores activos.

Ensayos con clulas asesinas naturales

Las clulas NK forman un subgrupo de clulas, relacionadas con las clulas T. pero carentes de un receptor para clulas T y con morfologa de grandes linfocitos granulares. Las clulas NK son detectadas por CD16, CD56 y CD57; la actividad ltca se correlaciona mejor con la poblacin CD56+ (Trinchieri, 1989). La actividad funcional de las clulas N K puede medirse por ensayo de citotoxicidad Irente a una linea celular como K562; esto puede ser importante en el diagnstico de IDSC, el sndrome de Chdiak-Higashi y casos raros de deficiencia de clulas NK aisladas. Slo se ha descrito un caso de ausencia completa de clulas NK. Este paciente presentaba importantes complicaciones con varicela, herpes y citomegalovirus, pero era capaz de resistir otras infecciones de manera normal (Biron, 1989).

Evaluacin del complemento

Se han descrito un nmero de defectos congnitos del sistema complemento: defectos individuales que conducen a 1) sndromes clnicos claros como angioedema hereditario o la hemoglobinuria paroxistica nocturna, o a 2) una tendencia a enfermedades bacterianas recurrentes, o a (3) enfermedades autoinmunes (Schneider, 1999). Muchas de las deficiencias genticamente determinadas de la via de activacin clsica (C1, C2, C3, C4) y de los componentes terminales (C5, C6, C7, C8 y C9) pueden detectarse mediante hemates de oveja sensibilizados con anticuerpos en un ensayo completo del complemento hemoltico (CH50). Este ensayo requiere de la integridad funcional de C1 hasta C9. Muchos laboratorios comerciales realizan este ensayo, pero para realizar la prueba con exactitud es necesario el suero recin extrado o que el plasma est congelado. Lo menos habitual son las deficiencias de los factores D, H, e I y properdina componentes de la va alterna, que pueden detectarse por un ensayo hemoltico distinto que utiliza hemates no sensibili-

Anlisis adicionales de leucocitos polimorfonucleares

Aparte de la EGC, otros defectos de los PMN incluyen los defectos de mieloperoxidasa. y enfermedades de adhesin y movilidad celular. La deficiencia de mieloperoxidasa, heredada como un defecto autosmico recesivo, tiene una importancia clnica desconocida, habiendo sido descrita tanto en individuos asintomticos como propensos a la infeccin (Lehrer, 1969; Klebanoff, 1999). Los leucocitos, transportados a travs del sistema circulatorio, son atrados a las reas de inflamacin interaccionando con los receptores de clulas endoteliales conocidos como selectinas, que nteraccionan con ligandos carbohidratos de los leucocitos tales como el sialyl-Lews" (antigeno del grupo sanguneo Lewis). Esto provoca una lenta accin rodante (rolling) a lo largo de la pared del vaso, que "aparca" esencialmente la clula circulante, Des-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOIOGA res de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, e IL-15 (Candotti, 1997). Como el IL-7 es esencial para el desarrollo normal de las clulas T del timo, un defecto en el receptor de IL-7 aislado provoca otra versin de IDSC (Puel, 1998). Hay otras enfermedades congnitas de inmunodeficiencia donde s e ha identificado el defecto de una sola citocina. En varios casos raros, la carencia de secrecin de defectos del receptor IL-2 en un nio constituye la base para el dficit inmunitario (Doi. 1988; Arnaz-Villena, 1992). Se ha descrito la deficiencia de IL-1 (Chu, 1984). Otro defecto de citocinas, ms recientemente descrito, es el de la secrecin de IL-12. que provoca una grave susceptibilidad a micobacterias y salmonela. Otros sujetos, que tienen una mutacin en el receptor de INF-y. tienen la misma presentacin clnica (deJong, 1998); Jouangy, 1999). En este momento se han clonado 18 citocinas que tienen una accin primaria sobre el sistema linltico (llamadas interleucinas). Se estn investigando las actividades biolgicas de cada una (Vanse Caps. 38 y 39).

pues, la activacin del leucocito provoca una expresin aumentada de las |5-2 integrinas (CD11/18), que causa una firme adhesin de la clula a la pared del vaso, siguiendo con la emigracin y la infiltracin del tejido (McEver, 1992). Aparecen anormalidades de adhesin a la clula si hay defectos de la integrina CD18. la cadena p comn de LFA-1, Mac-1 y molculas p150,95 (deficiencia de adhesin al leucocito [LAD-1]) (Anderson. 1987). Esta anormalidad provoca un desprendimiento postergado del cordn umbilical, lceras cutneas crnicas, periodontitis y leucocitosis. Las clulas afectadas son los neutrfilos. monocilos. macrfagos. linfocitos y clulas NK. Hay defectos demostrables de adherencia y funciones adhesin-dependientes como la difusin, fagocitosis y orientacin quimiotctica (Anderson, 1987). Tambin hay una segunda forma de esta enlermedad deficitaria, que afecta principalmente a los neulrfilos y macrfagos, donde un fallo en la expresin de un ligando selectina sialyl- Lewis' y un fallo de conversin de GDP maosa en fucosa. provoca un sndrome clnico similar, pero aporta a los individuos el grupo sanguneo Bombay (LAD-2) (Etzioni, 1993), Los defectos congnitos de la movilidad de los neutrfilos se producen en las enfermedades de defectos de adhesin antes citadas, as como en otras enfermedades de neutrfilos, sndrome de Schwachman. sndrome de Chdiak- Higashi y deficiencias de granulos especficas. Las dos primeras pueden reconocerse por los signos clnicos: hay anemia, trombocitopenia, insuficiencia pancretica en la primera y albinismo parcial oculocutneo en la ltima (Inlrone, 1999). El examen morfolgico de los neutrfilos teidos muestra las anormalidades caractersticas en la deficiencia de granulos especficos (Ganz. 1988). La quimiotaxis de los PMN tcnicamente es una prueba de laboratorio difcil y los resultados irregulares pueden deberse simplemente al laboratorio (Cates. 1981) Una quimiotaxis escasa a menudo es un signo inconstante de enlermedad; asi, no muestra una correlacin consistente con la sintomatologia. La evaluacin total de los trastornos del movimiento exige una relacin ms estrecha con todo el cuadro clnico y extensa experiencia clnica. La movilidad de los leucocitos generalmente se evala por la migracin directa a travs de filtros de membrana o con agarosa (Nelson, 1975: Cates. 1981). Otras pruebas para valorar la movilidad de los PMN incluyen inyecciones de epinefrina y esteroides. que hacen que los PMN se desmarquen y abandonen las reservas de la mdula. Se ha descrito una alteracin de actina, importante en la migracin de los PMN (Southwick. 1988). La ventana cutnea de Rebuck. que muestra la duracin y caractersticas de las clulas de la migracin en la piel, se utiliz en el pasado para describir la respuesta inflamatoria pero no ha tenido mucha aplicacin clnica (Southam. 1966); sin embargo, es un indicador biolgico real de las funciones de los neutrfilos in vitro.

Marcadores adicionales de superficie celular

Para investigar la relacin proporcional de vanas subpoblaciones presentes de linlocitos. monocilos y clulas NK. existen un nmero de anticuerpos monoclonales, que pueden utilizarse en el anlisis de citometria de flujo en muestras de sangre incluso m u y pequeas. Adems de los marcadores d e superficie de clulas caractersticos de las clulas T, clulas T colaboradoras o clulas T supresoras, clulas B o clulas NK. stos y otros tipos de clulas se caracterizan por molculas superficiales funcionales, tambin designadas como "CD" (del ingls: cluster o dilferentiation). En la Tabla 42-8 se explica un nmero de estos anticuerpos y sus blancos especficos. Al igual que otros marcadores de clulas T, la mayora de las clulas T se unen al antigeno, mediante un receptor que consta de cadenas a y p Casi un 5% tiene un receptor compuesto de cadenas y y 6. Estas clulas T se conocen como clulas T <r. / p y y i 6. respectivamente; ambas pueden ser evaluadas por anticuerpos monoclonales apropiados y tcnicas de tincin fluorescente. La seleccin positiva o negativa de las clulas T a /13 viene determinada por la afinidad de la interaccin del receptor de la clula T con sus propios antgenos presentados como fragmentos de pptidos que estn en el retculo endoplsmico de las molculas MHC clase II y /o clase I de las clulas del estroma limico. Las clulas T y 1o" no expresan CD4 o CD8 durante la maduracin intratmica, y la seleccin clonal no aparece esencial para la maduracin. La funcin del grupo minoritario, las clulas y 15. no est clara. En contraste con las clulas T a / |i. las clulas T yl 5 pueden unirse a dianas que no forman complejo con los antigenos del trasplante. Asi, pueden representar un mecanismo ms primitivo de defensa, anlogo a la activacin alternativa del sistema de complemento, capaz de responder a los microbios previo al desarrollo de la inmunidad especifica. Las clulas localizadas en el epitelio intestinal, linlocitos intraepiteliales, son principalmente del tipo y / 6 (Abbas, 1994). No ha aparecido ninguna enfermedad congnita de inmunodeficiencia que produzca una expresin defectuosa de las clulas T de las cadenas ut' |i o y' 6. Sin embargo, se han descrito varios defectos de expresin del receptor de CD3 (Alarcn. 1993) incluyendo una expresin escasa del complejo CD3 en su conjunto y defectos heredados de las cadenas yo del receptor de clulas T. Se han descrito mutaciones congnitas que afectan a la expresin de molculas MHC clase I y clase II. Las molculas clase II se encuentran principalmente en las clulas presentadoras de antgeno. que inician la respuesta inmune. Como se podra predecir, los defectos genticos en las molculas MHC clase II (de mutaciones que implican activacin del gen de transcripcin de las MHC clase II) provocan un profundo estado de inmunodeficiencia, donde hay defectos de clulas T y de clulas B: en este sndrome, las clulas T CD4-t pueden ser normales en nmero o deficientes (Klein, 1993). Los antgenos de clase I se expresan en casi todas las clulas, y la eliminacin de un antigeno extrao puede efectuarse por la unin de clulas T CD8+. Raramente, los delectes inmunes que provocan deficiencia de clase I, una mutacin que incluye alguno de los transportadores peptidicos citoplsmicos de las MHC clase I, TAP-1 o TAP-2. producen un delecto inmune caracterizado por una enfermedad pulmonar grave que se manifiesta en la infancia tarda (Donato, 1995. de la Salle, 1999). El diagnstico de ambos defectos incluye el examen de la expresin de estos antigenos MHC o clulas linfticas d e sangre perifrica.

Citocinas y receptores de citocinas

Las respuestas inmunitarias estn reguladas por los mediadores solubles, llamados citocinas. que producen una mulliplicidad de acontecimientos inmunes mediante interacciones con los receptores de citocinas apropiados Muchas de estas citocinas y receptores se han caracterizado. Los efectos de las citocinas son a menudo mltiples, con diferentes efectos en diferentes clulas (Lederer, 1995). Los receptores de las citocinas pueden contener cadenas compuestas, comunes a receptores para varias citocinas diferentes; esto se repite en el sistema hematopoytico. donde los receptores para interleucina-3 (IL-3), IL-5 y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrfagos (GM-CSF) utiliza una cadena p comn, y el sistema linftico, cuyos receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-5 comparten otra cadena p comn. En el ltimo caso, esta cadena p est codificada en el cromosoma X: la presencia comn de esta cadena en este grupo de receptores de citocina esenciales es la razn de por qu un defecto molecular a este nivel provoca un estado de inmunodeficiencia profunda como la inmunodeficiencia ligada al cromosoma X (Noguchi, 1993; Puck, 1993). Un mecanismo que es comn a un nmero de receptores de citocinas con dos o ms cadenas es la fosforilacin y activacin de varios miembros de la familia de la cinasa Jak: stos incluyen IL-2, IL-3, IL-4. IL-5, IL-6. IL-7. IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13. IL-15, GM-CSF, intertern-a (IFN-u), IFN-ji e IFN-y. Podra esperarse que los defectos en la cinasa Jak especifica simulasen un defecto de la citocina, o de su receptor; un ejemplo de esto es la versin de IDSC provocada por una mutacin de Jak3, la cinasa asociada con la cadena p comn de los recepto-

CAPTULO 42

TRASTORNOS INMUNODEFICITARIOS

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Tabla 42-8

Marcadores d e superficie d e leucocitos Comentario Timocilos corticales Clulas T. clulas NK, receptor LFA-3 Parte del complejo del receptor de clulas T. un marcador pan-T Clulas T reactivas con antigeno HLA clase II (clulas colaboradoras) Marcadores pan-T; presentes en un subgrupo de clulas Clulas T reactivas con antgeno HLA clase I (clulas asesinas) Clulas T; activadas; limocitos, lugar de estimulo a la segunda seal Leucocitos excepto clulas (leucosialino): reducido en el sndrome de Wiskolt-Aldrich Clulas T vrgenes (naive) (que no han reaccionado con antigenos), recientemente emigrado del timo Clulas T de memoria Antigeno comn de leucemia linloblastica aguda (ACLLA) Marcador pan-B Marcador pan-B Receptor CR2, EBV Marcador pan-B Clulas activadas macrfagos, eosinfilos, plaquetas; el FcRIl de baja afinidad Clulas B, carcinomas, monocitos; asociado con cambio de isotipo Linfoma de Burkitt CR3, receptor C3bi Receptor CR4 Monocitos, granulocitos, clulas de Langerhans, macrfagos Clulas NK, granulocitos, macrlagos: el receptor FcRIIIA, FcRIIIb Clulas precursoras hematopoyticas, clulas endoteliales Granulocitos, monocitos, NK, clulas B: el receptor CR1/C3b
FCYRIII

Marcador Series de clulas T CD1a CD2 CD3 CD4 CD5 CD8 CD28 CD43 CD45 CD45RO Series de clulas CD10 CD19 CD20 CD21 CD22 CD23 CD40 CD77 Series mieloides CDl 1b CD11c CD14 CD16 CD34 CD35 Series NK
CD16

CD56 CD57 Molculas de adhesin CD11a CD11b CD11c CD18 CD62E CD62L CD62P Marcadores de activacin CD25 CD30 CD38 CD69 CD70 CD71 CD154

Clulas NK (N-CAM, NKH-1); con CD16 usados para enumerar el nmero de NK en sangre perilrica Clulas NK. subgrupo clulas T (HNK-1) Leucocitos, cadena L-integrina (ligando ICAM-l) Granulocitos. monocitos, clulas NK; cadena M integrma del complejo LFA-1 (MCA-1. fibringcno y receptor C30i) Granulocitos. monocitos, clulas NK; cadena X integrma de LFA-1, gp 150-95 Leucocitos (integrina, cadena |5 de CD11) E- selectina, ELAM-1. clulas activadas endoteliales L-selectina, clulas T y B, monocitos, clulas NK. PMNs. eosinfilos. clulas progenitoras (LECAM-1.LAM-1) P-selectina; plaquetas activadas, clulas endoteliales Clulas y T activadas (receptor IL-2) Clulas y T activadas, clulas Reed-Sternberg Clulas T activadas inmaduras Clulas y T activadas clulas NK. macrfagos Clulas y T activadas, clulas Reed-Sternberg (ligando CD27) Receptor de transierrina El ligando para CD40 en clulas B. asociado con hiper IgM

Deficiencia de IgA y anticuerpos anti IgA

En el caso de ausencia completa de IgA. deberan determinarse los anticuerpos para IgA, ya que la presencia de estos anticuerpos provoca anaflaxia en el transcurso de la administracin intravenosa de productos sanguneos que contengan IgA. Los pacientes con deficiencia en IgA presentan una incidencia aumentada de enfermedad autoinmune y. dependiendo de la historia clnica, puede estar indicada la bsqueda de otros autoanticuerpos (Cunningham- Rundles. 1996). Ya se ha mencionado la asociacin de deficiencia selectiva de IgA con deficiencia de subclase de IgG (Bjorkander. 1985).

nos, toxoide diftrico, o las vacunas de haemophilus o neumoccica. En la ma. yora de los casos, la respuesta indicar la capacidad relativa del sujeto para producir una respuesta a la vacunacin de recuerdo. Sin embargo, otra herramienta valiosa es la vacuna de investigacin, el bacterifago < J > X 174. Como este es un antgeno nuevo de vacuna provoca en principio una respuesta primaria de IgM. y luego, tras la reexposicin, una respuesta secundaria de IgG. Usando <I>X174, los patrones de aclaramiento y las respuestas de isotipo se pueden medir, definiendo varios grados y subgrupos de deficiencias de clulas B (Ochs. 1971). Esto es muy til en pacientes que ya han estado recibiendo inmunoglobulina intravenosa, ya que la infusin pasiva de estos anticuerpos a intervalos provoca que no se puedan interpretar las respuestas a vacunas estndar.

Utilizacin de nuevos inmungenos para valorar la produccin de anticuerpos

Para investigar la produccin de anticuerpos, en muchos casos es suficiente investigar la respuesta a los antigenos de las vacunas, como la /acuna del tta-

Gentica molecular y diagnstico prenatal

Actualmente se han identificado, clonado y secuenciado un nmero de genes involucrados en los sndromes de inmunodeficiencia primaria (Conley,

972

SECCIN V

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1992; Puck. 1993: Derry. 1994; Ramesh. 1998; Vhinen. 1999). En muchos casos, los modelos de ratones knockout se producen para estudiar los efectos de los genes involucrados en la inmunidad. En casos sospechosos de inmunodeficiencia. los genes relevantes pueden ser examinados directamente. Estas tcnicas permiten el diagnstico de pacientes, y la identificacin de portadores. Cada vez est siendo ms posible el diagnstico prenatal de un nmero de defectos inmunes. Si la mutacin especifica se conoce, o si se sabe que el patrn de herencia est ligado al cromosoma X, se pueden realizar anlisis de marcadores polimrficos ligados o deteccin de mutaciones especificas usando muestras de vellosidades corinicas. ADN de amniocitos preparados directamente de clulas fetales, o de lineas de clulas cultivadas y expandidas. Cuando el genotipo no se conoce, puede investigarse directamente en las clulas letales el defecto funcional, aunque estas pruebas se deben realizar ms adelante durante el embarazo y suponen ms nesgo. Por ejemplo, en los sindromes de IDSC. se puede demostrar en la sangre fetal la linfocitopenia. un nmero descendido de clulas T y una escasa transformacin de linfocilos (Durandy, 1985). Se pueden determinar deficiencias de enzimas en cultivos de fibroblastos obtenidos por amniocentesis. Se puede realizar, si la sangre letal puede obtenerse sin contaminacin de sangre materna, ausencia de antigenos HLA o valoracin de (unciones de las clulas T y quimioluminiscencia de granulocilos.

RESUMEN
La valoracin de las defensas del husped es un proceso extraordinariamente complejo que supone la cooperacin del mdico, cientfico investigador y del patlogo. Una aproximacin lgica, basada en la apreciacin de los diversos sistemas involucrados en la defensa del husped y las diversas capacidades de los distintos laboratorios, pueden llevar a un diagnstico en casi todos los casos. El impresionante xito de la terapia moderna, basada en los antibiticos ms recientes, la tecnologa del ADN recombinante y los trasplantes de mdula sea, favorece la definicin precisa y el tratamiento de los estados de inmunodeficiencia inmunolgica.

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CAPJTUIO 42

T R A S T O R N O S INMUNODEFICITARIOS

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CAPTULO

43

Evaluacin clnica y de laboratorio de las enfermedades reumticas sistmicas

Carlos Alberto Von Mhlen, M.D., Ph.D. Robert M. Nakamura, M.D.

INTRODUCCIN Y CLASIFICACIN DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMICAS LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO Y TRASTORNOS RELACIONADOS TIPO LUPUS Factores etiolgicos en el lupus eritematoso sistmico Cules son los criterios diagnsticos para el lupus eritematoso sistmico? Qu son los sndromes y enfermedades "tipo lupus"? Perfil de autoanticuerpos en el lupus eritematoso sistmico Lupus crnico discoide Lupus eritematoso inducido por medicamentos y anticuerpos antihistona SNDROME DE SJOGREN ESCLERODERMIA Anticuerpos frente a antgenos del centrmero Anticuerpos frente a Scl-70 (ADN topoisomerasa I) Anticuerpos frente a ARN polimerasas Autoanticuerpos frente al antgeno nucleolar fibnlarina (U3-snRNP) Anticuerpos dirigidos a la regin organizadora nuclear ARTRITIS REUMATOIDE Factor reumatoide Anticuerpo antiqueratina Factor antiperinuclear

974 974

Anticuerpo frente al antgeno nuclear asociado a artritis reumatoide Anti-RA33 y relacin con la artritis reumatoide POLIMIOSITIS Y DERMATOMIOSITIS SNDROME DE ASTENIA CRNICA CONCEPTO DE SNDROMES DE SUPERPOSICIN Enfermedad mixta del tejido conectivo BIOLOGA MOLECULAR Y FUNCIONES DE CIERTOS AUTOANTGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES 981 PERFILES DE AUTOANTICUERPOS EN VARIAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMICAS 980 981 981

981

978 979

TABLA DE DECISIN PARA EL DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES MTODOS DIAGNSTICOS EN LA DETECCIN DE AUTOANTICUERPOS VARIACIONES EN LAS METODOLOGAS USADAS PARA LA DETECCIN DE AUTOANTICUERPOS FRENTE A ANTGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES Enzimoinmunoanlisis

982

982

983

980

Inmunotransferencia RESUMEN BIBLIOGRAFA 987 987

INTRODUCCIN Y CLASIFICACIN DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMICAS

Las enfermedades reumticas se caracterizan por la presencia de uno o ms anticuerpos que pueden estar dingidos contra componentes de la superficie, citoplasma o ncleo de la clula. El ltimo grupo, anticuerpos contra antigenos nucleares (AAN), es el sello de las enfermedades reumticas sistmicas (Nakamura, 1985.1986,1992; Tan, 1982a, 1989). Se ha progresado mucho en la aclaracin de los mecanismos inmunes involucrados en las enfermedades reumticas durante los ltimos 1 5 aos. Muchas de las enfermedades reumticas tienen un perfil de anticuerpos distintivo con especificidades diagnsticas. Por otra parte, las funciones bioqumicas y biolgicas de muchos de los antgenos estn involucradas en la replicacin del cido desoxiribonucleico (ADN), el corte y empalme de los precursores del cido ribonucleico (ARN). y el procesamiento del ARN (Tan. 1989). La clasificacin de las diversas enfermedades reu-

mticas ha sido difcil debido a la falta de una base etiolgica constante para la mayora de las enfermedades. Un subcomit del Colegio Americano de Reumatologia (Decker. 1986) desarroll una clasificacin y vocabulario extenso L a clasificacin de las enfermedades reumticas sistmicas y las alteraciones relacionadas realizada por el autor se muestra en la tabla 43-1.

LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO Y TRASTORNOS RELACIONADOS TIPO LUPUS

El lupus eritematoso sistmico (LES) es el prototipo de las enfermedades reumticas sistmicas y posee los siguientes rasgos significativos (Nakamura, 1994a): 1. LES es una enfermedad autoinmune que no es rgano-especfica, donde el dao tisular est mediado principalmente por inmunocomplejos ADNanti-ADN.

CAPTULO 4 3

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

975

Tabla 43-1

Enfermedades reumticas sistmicas y trastornos relacionados

Lupus erilematoso sistmico (LES) Lupus erilematoso discoide (LED) Sndromes tipo lupus Lupus eritematoso inducido por medicamentos Sndrome de S|0gren Esclerodermia/sndrome CREST (calcinosis cutis, fenmeno de Raynaud, trastornos de la mohlidad esofgica, esclorodactilia y telangiectasia) Artritis reumatoide (AR) Dermatorniositis y polimiositis Sndromes sobrepuestos a) Enfermedad del tejido conectivo mixto (ETCM) b) AR y LES (rupus) c) LES y esclerodermia (lupodermia) d) Esclerodermia y dermatomiositis (esclerodermatomiositis) e) Otros 10. Sndromes de enfermedad del tejido conectivo que no estn definidos como para tener una categora clnica

comit para los criterios de LES de ARA public criterios revisados que incorporaban nuevos conocimientos inmunolgicos y mejoraban la clasificacin de la enfermedad del LES (Tan. 1982b). Los criterios revisados en 1982 para la clasificacin de LES incluan 11 categoras aadiendo 1) ttulo anormal de anticuerpo antinuclear por inmunofluorescencia o ensayo equivalente y 2) anticuerpo a ADN nativo y/o antgeno Sm. En contraste con los criterios de 1971, los criterios de 1982 retiraban el fenmeno de Raynaud y la alopecia por su falta de sensibilidad y especificidad. Cuando los criterios de ARA de 1982 para la clasificacin de LES fueron comparados con los criterios de 1971, hubo una mejora definitiva en la sensibilidad y en la especificidad. Los criterios de 1982 mostraban un 96,7% de sensibilidad y un 96% de especificidad al ser evaluados con pacientes con LES conocido y controles (Tan. 1982b). Los criterios de la ARA de 1982 consideraban que los pacientes tenan LES si cumplan cuatro de los critenos secuencial o simultneamente en cualquier momento del examen. En 1997, se public una actualizacin de los criterios, donde como cambios se elimino la prueba de las clulas LE y se aadieron los anticuerpos anticardiolipina (Tabla 43-2) (Gladman, 1999).

Qu son los sndromes y enfermedades tipo lupus?

2. Es una enfermedad multisistmica que afecta a la mayora de las personas de todas las edades y ambos sexos, aunque es ms prevalenle en mujeres en edad frtil. 3. La enfermedad manifiesta un sistema inmune hiperactivo con mltiples anormalidades. 4. Los pacientes con LES manifiestan una respuesta de anticuerpos heterogneos y policlonales, con reaccin de formacin autoanticuerpo incluyendo mecanismos similares a los vistos en una respuesta inmune tpica a inmungenos extraos (Fatenejad, 1998). 5. El caso tpico de LES presenta una media de tres anticuerpos circulantes diferentes presentes de forma simultnea. La prevalencia de anticuerpos vara por encima de un amplio rango, y se han identificado ms de 25 tipos diferentes de autoanticuerpos en LES (Nakamura, 1994a). Hay muchas enfermedades y sndromes que pueden compartir ciertos rasgos clnicos con el LES pero no son LES y tienen diferentes etiologas y patognesis. Las enfermedades que se han enumerado en esta categoria incluyen vasculitis, crioglobulinemia, policondritis recidivante, enfermedades linfoproliferativas, fiebre reumtica, glomerulonefritis, sfilis, hepatitis lupoide. lupus inducido por medicamentos y neoplasia oculta (Panush, 1993). Hay una categoria m u y amplia de pacientes que manifiestan menos de cuatro de

Tabla 43-2

Actualizacin d e 1997 de los criterios revisados en 1982 para la clasificacin del lupus eritematoso sistmico'

Factores etiolgicos en ei lupus eritematoso sistmico

Su etiologa sigue sin conocerse bien. Algunos de los factores etiolgicos importantes en LES son 1) endocrino-metablicos, 2) ambientales y 3) genticos (Chan, 1989). El factor de riesgo ms fuerte para el desarrollo de LES es el gnero femenino (Hochberg. 1990). Se ha considerado que el LES puede tener una posible etiologa viral (Pincus. 1982). La presencia de anticuerpos antinucleares se observ en trabajadoras de laboratorio con diversos niveles de exposicin a sangre de pacientes con LES. La presencia de anticuerpos antinativos ADN fue mayor en trabajadoras de laboratorio que en un grupo de mujeres no expuestas que no trabajaban en un laboratorio (p<.00l) (Zarmbinski. 1992). Estos resultados ayudan a mantener la hiptesis de que un agente transmisible que puede existir en la sangre de pacientes con LES, puede ocasionar la formacin de anticuerpos. Se han implicado algunos productos qumicos en el LES (Hochberg, 1990). Se ha estudiado el sndrome del lupus inducido por medicamentos tipo hidralacma. procainamida e isoniacida. como pista en la patognesis del LES. Diversos artculos demuestran el mecanismo de acetilacin como un factor de nesgo en el LES. Existen estudios que han demostrado una mayor relacin de concordancia de LES en gemelos monocigticos y dicigticos (Block, 1975). La concordancia de LES estaba presente en 11 (58%) de 19 gemelos monocigticos. El resultado final de la interaccin de mltiples tactores etiolgicos es la activacin policlonal de clulas B en pacientes LES con produccin de un amplio espectro de anticuerpos (Nakamura. 1994a).

Cules son los criterios diagnsticos para el lupus eritematoso sistmico?

En 1971, el Colegio Americano de Reumatologia (ACR: previamente la Asociacin Americana de Reumatismo (ARA)) public entonos preliminares para la clasificacin de LES (Cohn. 1971). Entonces se consideraba que los pacientes tenan LES si cumplan cuatro de los criterios secuencial o simultneamente durante cualquier momento del examen. En 1982, el sub-

Exantema malar Exantema discoide Fotosensibilidad lceras orales Artritis no erosiva Serositis (pleuritis o pericarditis) Alteracin renal (proteinuna persistente cilindros celulares) Alteracin neurologa Alteracin hematolgica a) Anemia hemolitica con reticulocitosis. o b) Leucopenia < 4.000/mm' en >2 ocasiones, o c) Linfopenia < 1 500 mm en >2 ocasiones, o d) Trombocitopema < 100 OOO/mm'en ausencia de un medicamento culpable 10. Alteracin inmunolgica a) Anti-ADN; anticuerpo contra ADN nativo en titulo anormal, o b) Anti-Sm presencia de anticuerpo contra anticuerpo nuclear Sm. o c) Hallazgos positivos de anticuerpos antifosfolipidos basados en: (t) un nivel anormal en suero de IgG o Igtvl anticuerpos anticardiolipina (2) un resultado positivo para anlicoagulante de lupus usando un mtodo estndar, o (3) un falso positivo en la prueba de la sfilis que se sabe que es positivo durante al menos seis meses y confirmado por inmovilizacin de Treponema palhdum o prueba de absorcin del anticuerpo fluorescente de treponema 11, Anticuerpo antinuclear positivo Un ttulo anormal de anticuerpo antinuclear por inmunofluorescencia o prueba equivalente en cualquier momento en el tiempo y en ausencia de medicamentos que se sabe estn asociados con el sndrome de "lupus inducido por medicamentos" ' La clasificacin propuesta esta basada en 11 criterios Con el propsito de identificar a los pacientes en estudios clnicos, se ova que una persona tiene LES si estn presentes 4 o mas de los 11 criterios, en serie o simultneamente, durante cualquier Intervalo de observacin De Hochberg MC Updatmg the American College of Rheumalology revised criteria for the classification ol syslemic lupus erythematosus (Carla). Arthntis Rheum 1997; 40 1725, con permiso.
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1 2 3 4 5 6 7 8 9

976

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

los criterios de clasificacin de ARA de 1982 para LES (Lzaro. 1989: LomOrta. 1980: Schur. 1993) pero se considera que tienen enfermedades "tipo lupus". Estos pacientes se han clasificado del siguiente modo: 1) enfermedad reumtica indiferenciada; 2) enfermedad no reumtica; 3) sndrome sobrepuesto; y 4) lupus incompleto, latente o incipiente. Schur recomendaba, de forma similar a los primeros criterios de ARA para el diagnstico de la artritis reumatoide (AR), que los pacientes fueran calificados como LES clsico (muchos criterios). LES definido (cuatro o ms criterios), LES probable (tres criterios) o posible (dos criterios). Los pacientes con dos o tres criterios pueden ser considerados como incompletos, incipientes o latentes, adems de lupus posible y probable (Schur. 1993). Si se sigue a estos pacientes, algunos permanecen con sntomas leves, y como tales quedan clasificados como "enfermedad indiferenciada del tejido conectivo": unos pocos desarrollan un LES definitivo, pero muchos pueden evolucionar a otras enfermedades con un pronstico mejor.

Tabla 43-3 Antgenos y autoanticuerpos en lupus eritematoso sistmico Antgenos ADN nativo ADN desnaturalizado Hislonas Sm Estructura molecular ADN doble cadena ADN cadena simple H1. H2A. H?B. H3 H4 Protenas. 29 (B ), 28 (B) 16 (D), y 13(E) kDa en complejo con U1, U2 y U4-U6 snRNAs: componente espliceosoma Frecuencia autoanticuerpo' 40-70% 70% 50-70% 15-30%

RNP nuclear (U1 RNP) SS-A/Ro

Perfil de autoanticuerpos en el lupus eritematoso sistmico

SS-B/La Ku

La caracterstica del LES es la presencia de un amplio espectro de autoanticuerpos, incluyendo anticuerpos contra ADN nativo (ds-ADN), antgeno Sm, U1-nRNP, SS-A/Ro, SS-B/La y otras varias protenas no-histona o complejos protena no-histona-ARN (Nakamura. 1994a). Existe una policlonalidad de anticuerpos en LES y esclerodermia. y se ve raramente en las otras enfermedades reumticas sistmicas. El anti-ADN nativo y anti-Sm generalmente son especficos para LES. El lupus eritematoso sistmico se caracteriza por una respuesta de anticuerpos policlonales y heterogneos, y presenta una media de tres anticuerpos circulantes diferentes presentes simultneamente. La prevalencia de autoanticuerpos varia por encima de un amplio rango. Los anticuerpos contra ADN nativo e histonas se detectan en hasta un 40% y 70% de los pacientes, respectivamente, y anticuerpos contra el antigeno nuclear de proliferacin celular (PCNA) y ciclina o proteina Alu-ARN en el 3% o menos (von Mhlen. 1995) (Tabla 43-3).

hnRNP protena A1 PCNA RNP ribosomal Hsp '!(.: Protena ALu ARN HMG-17 B, glucoproteina I

Proleinas, 70, 33(A) y 22(C) 30-40% kDa, en complejo conU1 snRNA, componente espliceosoma Protenas. 60 y 52 kDa, en 24-60% complejo con Y1-Y5 RNAs Fosfoprotenas. 48 kDa. 9-35% (ormando complejo con Y1 copias ARN Poi III naciente Protenas. 86 y 66 kDa 1-19% protenas unin a ADN Proteina nuclear. 34 kDa 31-37% Proteina. 36 kDa, protena 3% auxiliar de ADN polimerasa Fosfoproteinas. 38. 16 y 10-20% 15 kDa asociado a ribosomas Proteina de golpe de calor. 90 kDa 5-50% Protena 68 kDa. 11 en raro complejo con Alu-ARN Protenas asociadas a ADN 9 a 17 kDa 34-70% Fosfolpidos aninicos. 25% cardiolipina

Anticuerpos contra ADN nativo o ADN bicatenaro

Anticuerpos anti- ADN bicatenaro (ds-ADN) son bastante especficos para LES y se observan con una frecuencia del 75% al 90% en pacientes LES con enfermedad activa (Buskila. 1992). Se han publicado muchos artculos previos de anticuerpos ds-ADN en otras enfermedades que no son LES. Sin embargo, el pensamiento actual es que los anticuerpos reactivos a ADN en las otras enfermedades eran realmente anticuerpos anti ADN monocatenario. Las pruebas del anticuerpo ds-ADN a menudo utilizaban preparaciones de ds-ADN contaminadas con ADN desnaturalizado o monocatenario. Una posible excepcin podra aparecer en el sndrome primario de Sjgren. una enfermedad a veces difcil de diferenciar del LES en gente de ms edad. El anticuerpo contra ADN juega un papel definitivo en la patognesis del LES. En estudios de pacientes LES. al anticuerpo contra ADN le sigue en aparicin el antgeno circulante ADN, una secuencia de acontecimientos que terminan con la formacin de inmunocomplejos. Estos inmunocomplejos ADN-anti-ADN tienen un tropismo especial por las membranas bsales y se depositan enseguida en el glomrulo renal. Esto inicia un dao renal por mecanismos inflamatorios que terminan con la activacin del complemento y la lisis de clulas (Okamura. 1993). Los mtodos previos de deteccin de anticuerpos ADN fueron el mtodo de precipitacin insensible, fijacin de complemento y hemaglutinacin pasiva. Los mtodos habituales son radioinmunoanlisis (RA), inmunofluorescencia indirecta (IFA) sobre Crithidia luciliae y enzimoinmunoanlisis (ELISA) (Buskila, 1992). Estos pueden detectar anti- ADN en el 75% al 90% de pacientes activos LES no tratados.

Las frecuencias estn relacionadas sobre lodo con pacientes con enlotmedafl activa. Modificado de Nakamura RM, Bylund DJ. T a n EM Curent status of available standards lor quality improvement ol assays lor the detection of autoantibodies to nuclear and intracellular antigens J Clin Lab Anal 1994b. 8:360 y K r a p f AR. von Mhlen CA. Krapf FE. y col Atlas of Immunofluorescenl Autoantibodies Munich. Urban & Schwar/enberg. 1996. con permiso

Anticuerpos contra Sm y ribonucleoproteina nuclear

Los anticuerpos de precipitacin al antigeno Sm se han considerado marcadores altamente especficos para LES (Tan, 1989). Los anticuerpos contra S m y contra ribonucleoprotenas nucleares (nRNPs) se encuentran en pacientes con LES. Los antgenos Sm y nRNPs se asociaban notoriamente, porque el nRNPs no se pudo aislar bioqumicamente del antgeno Sm. Lerner

(1979) emple las herramientas de la biologa molecular para demostrar que los antgenos Sm y nRNP eran partculas subcelulares compuestas de pequeos ARN nucleares formando un complejo con protenas. La partcula unida por anti-nRNP est formada por un componente ARN llamado U1 (U por rico en uridina). formando complejo con al menos siete protenas que variaban en peso molecular de 12 a 68 kDa (Tan. 1989), y encontrados con una frecuencia de 20% a 40% (ter Borg, 1990). Los antgenos de Sm constan de varias protenas, llamadas convencionalmente B1 (29 kDa). D (16 kDa) y E (13 kDa) (Tan. 1989). Los anticuerpos anti B1/B purificados reaccionan de forma cruzada con la protena D y viceversa, pero no se observa ninguna reaccin cruzada en pequeas cantidades de sueros LES. As. hay al menos dos epitopos en la protena B1/B reconocidos por sueros anti-Sm. Los antigenos reactivos con anti-Sm y ARN antinuclear estn por consiguiente en unin de protenas interactivas y ARN ocupados del corte y empalme del ARNm precursor (Tan, 1989). No hay rasgos clnicos caractersticos aparentes en pacientes LES con anticuerpos anti-Sm (Barada, 1981). aunque algunos autores afirman que estos anticuerpos se asocian a enfermedad renal u otras alteraciones del sistema nervioso central (SNC) Los pacientes q u e slo tienen anticuerpos a nRNP presetan una baja lasa de anticuerpos al ADN y baja frecuencia de enfermedad renal clnicamente aparente (ler Borg, 1990). Los anticuerpos anti-Sm y anti-nRNP pueden detectarse por inmunodifusin, hemaglutinacin pasiva o contrainmunoelectroforesis. Sin embargo, los mtodos antes mencionados no distinguen exactamente entre anticuerpos y pequeos polipptidos asociados a ARN nuclear Las reactividades con los ARN individuales y polipptidos pueden demostrarse mejor por tcnicas de inmunoprecipitacin del ARN e inmunotransferencia, respectivamente. Se ha comprobado que la inmunotransferencia es ms sensible que

CAPTUIO 43

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

977

los mtodos convencionales para la deteccin de anti-Sm y anti-nRNP (Nakamura, 1994b). Habitualmente. las pruebas de laboratorio ms ampliamente usadas para la deteccin de anticuerpos anti-Sm y anti-nRNP son la inmunodifusin y ELISA. Estas pruebas pueden diferenciar entre anticuerpos Sm y nRNP pero no pueden definir los eptopos de los anticuerpos especficos presentes en los sueros de los pacientes. La especificidad de los anticuerpos y los eptopos se determinan mejor por mtodos de inmunotransferencia Western Northern.

Anticuerpos contra protenas rbosomales P

Cerca del 10% al 20% de los sueros LES muestran anticuerpos dirigidos a tres fosfoproteinas rbosomales de 15, 18 y 38 kDa en ensayos en sangre completa (WB). La asociacin de anti-rRNP con las principales enfermedades del SNC en LES. principalmente los sntomas sicticos, fue descrita en un estudio retrospectivo (Bonfa, 1987). No se mostr ninguna asociacin con el empeoramiento cognitivo o depresin en pacientes con lupus. Se han encontrado diferencias significativas en la prevalencia de anti-rRNP entre razas. Los estudios recientes se concentran en el papel etiopatognico de anti-rRNP en sntomas SNC en pacientes con lupus (Isshi. 1998; Nakamura, 1997),

Anticuerpos contra SS-A/RO y SS-B/La

Los pacientes con LES pueden tener anticuerpos contra SS-A/Ro slo, o pueden tener ambos anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La. El poseer slo antiSS-A/Ro est fuertemente asociado con el antgeno leucocito humano (HLA) DR2 y con ser joven (<22 aos de edad al comienzo). La presencia de ambos. anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La. en el LES est asociado con HLADR3 y se ha visto en pacientes mayores (>50 aos de edad al comienzo de la enfermedad). (Hochberg, 1985). Un estudio con 55 pacientes con LES mostr que los pacientes con anti-SS-A/Ro slo tenan una enfermedad renal mucho ms seria (Hochberg, 1985). Los pacientes LES slo con anti-SS-A/Ro tambin tenan una mayor incidencia de anticuerpos antiADN concomitantes que aquellos pacientes LES con ambos anticuerpos anti-SS-A/Ro y anti-SS-B/La (Chan. 1989). Los auloanticuerpos anti-SSA/Ro se han asociado ntimamente con la aparicin de nefritis, vasculitis, adenopatia, fotosensibilidad y leucopenia en pacientes LES. Los anticuerpos anti-SS-A/Ro, como los anticuerpos anti-SS-B/La, son anticuerpos importantes por su fuerte asociacin con el sndrome de Sjgren. que se produce en ms de dos tercios de los pacientes con este trastorno. El antigenoSS-B/La es una proteina celular unida a una especie de pequeo ARN, formando un pequeo RNP que puede funcionar en el procesamiento de las copias de ARN polimerasa III (Chan, 1989)

Antgeno nuclear de proliferacin celular y anticuerpos Hsp-90

En el 3% de los pacientes con LES activo se detectaron anticuerpos contra PCNA y no hay rasgos clnicos distintivos asociados con la presencia del anticuerpo (Miyachi, 1978). Una posible asociacin con los rasgos SNC, como mielitis transversa, se ha visto en nuestros propios pacientes (C.A. von Mhlen y R.M. Nakamura, resultados no publicados). Se ha determinado que la protena PCNA est relacionada con el ciclo celular, y se ha observado que los anticuerpos PCNA son sondas tiles en el estudio de los agentes que regulan la replicacin del ADN, la proliferacin celular y la transformacin del blasto. Se ha detectado un autoanticuerpo contra la proteina del golpe de calor en mamferos, Hsp-90 (Minota, 1988). La Hsp-90 es una protena del citoplasma y de la membrana plasmtica de 90 kDa. El autoanticuerpo contra Hsp-90 fue observado en el 50% de los pacientes con LES y dos de seis pacientes con polimiositis.

Anticuerpos

antifosfolpido

en

Subgrupos clnicos de lupus eritematoso sistmico asociado a anticuerpos contra SS-A/Ro

Los niveles elevados de anticuerpos SS-A/Ro estn relacionados con vanas alteraciones autoinmunes clnicas, incluyendo: 1) lupus eritematoso cutneo subagudo, 2) sndrome neonatal de lupus eritematoso con bloqueo cardaco congnito y lesiones cutneas; 3) deficiencia homocigtica C2 y C4 con enfermedad tipo LES; 4) vasculitis primaria del sndrome de Sjgren, positividad de factor reumatoide y sntomas sistmicos graves 5) pacientes LES ANA-negativos y 6) LES con neumonitis intersticial (Bylund. 1991). Los anticuerpos de precipitacin contra SS-A'Ro se han visto en el 65% al 95% de los pacientes con subgrupos asociados de anti-SS-A/Ro. y ms del 90% tienen niveles anti-SS-A/Ro cuando se detectan por mtodos ELISA (Bylund, 1991).

el lupus eritematoso sistmico

El sndrome de anticuerpos antifosfolpido o anticoagulante lpico se caracteriza por la presencia de anticuerpos circulantes contra fosfolipidos y rasgos clnicos de trombosis venosa y arterial, trombocitopenia, anemia hemolitica y varios sntomas sistmicos. Se han encontrado anticuerpos antifosfolipidos frecuentemente en pacientes con LES y tambin en otras alteraciones c o m o las enfermedades infecciosas (Alarcn-Segovia. 1992: McNeil. 1991). Los anticuerpos antifosfol pidos se encuentran en hasla el 60% de los pacientes con LES. Recientemente, se evidenci de forma clara que los anticuerpos antilosfolpidos son muy heterogneos, funcional e inmunoquimicamente, y son policlonales (McNeil. 1991). La cardiolipina (fosfolipido animco) se ha utilizado ampliamente en la deteccin de anticuerpos antilosfolipidos. La mayora de los anticuerpos anticardiolipina reaccionan de forma cruzada con fosfolipidos zwitterionic (McNeil. 1991). Los anticuerpos contra fosfolipidos identificados pueden ser IgG o IgM, mientras que los anticuerpos a fosfolipidos de ion dipolar son ms frecuentemente IgM. Los anticuerpos contra fosfolipidos son identificados en pacientes LES de tres maneras (AlarcnSegovia, 1992): 1) prueba falsa-positiva serolgicamente para sfilis por pruebas de Laboratorio de Investigacin de Enfermedades Venreas (VDRL). que es un ensayo de floculacin con partculas de carbn cubiertas con colesterol, lecitina (fosfatidilcolina) y cardiolipina; 2) el ensayo anticoagulante lpico, que es la prolongacin del tiempo de caoln parcial de tromboplastina (KPTT) que no est corregido por el plasma normal; y 3) el inmunoensayo de cardiolipina con el uso de cardiolipina u otros fosfolipidos negativamente cargados como antgenos. Los pacientes con LES reaccionarn generalmente con un grupo fosfato cargado negativamente presente en la cardiolipina, cido fosfatdico. fosfatidilserina o fosfatidilinositol. Harris (1987.1990) coordin unos talleres internacionales para mejorar la precisin y exactitud de los inmunoanlisis de los anticuerpos antifosfolipidos. Se prepararon sueros de referencia y se definieron unidades estndar (GPL y MPL). Una unidad GPL (MPL) es equivalente a 1mg/ml de una muestra estndar IgG (IgM) purificada por afinidad. Sin embargo, Lpez (1992) sugiri que un ensayo IgA especfico para anticuerpos antifosfolpido es importante para valorar el sndrome antifosfolpido en pacientes con LES. Parece que se encuentra una mayor prevalencia del isotipo IgA para anticuerpos

Anticuerpos anti-Ku y anti-Ki

El sistema antigeno Ku consta de un par de protenas llamadas p70/'p80 (Francoeur. 1986; Reeves, 1992). Estas protenas poseen una alta afinidad por el ADN y se sabe que son protenas de unin al ADN. interaccionando covalentemente con los extremos de ADN nativo. Mediante pruebas de inmunoprecipitacin e inmunotransferencia, se encontr el autoanticuerpo Ku en el 1 0 % de los sueros LES y no fue detectado en 100 de los sueros de esclerodermia examinados. En esludios con un enzimoinmunoanlisis, Reeves (1992) mostr que el 39% de LES. el 55% de la enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) y el 40% de los pacientes con esclerodermia presentaban niveles bajos de anticuerpo contra la proteina Ku. El anticuerpo anti-Ki fue descrito por primera vez en Japn (Tojo. 1981) y se observ en casi el 10% de los pacientes LES. Se advirti una relacin entre el antiKi y los rasgos clnicos de artritis, pericarditis e hipertensin pulmonar en pacientes LES. El antgeno Ki le purificado del timo de conejo y tena un peso molecular de 32 kDa. Sakamoto (1989) realiz un ELISA y observ anticuerpos anti-Ki en el 21.4% (30 de 140) de los pacientes LES. mientras que 11 de 140 fueron positivos para anti-Ki por pruebas de doble inmunodifusin.

978

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

antifosfolpido en las personas negras. Los ensayos recientemente desarrollados para autoanticuerpos de la glucoprotena I |i, parecen aportar especificidad a los hallazgos, dado que se describi que la glucoprotena f es el eptopo especfico para anticuerpos antifosfolpidos.

Lupus crnico discoide

Una forma benigna de lupus puede manifestarse como lesiones cutneas discoides" (con forma de moneda o disco) sin sntomas de enfermedad sistmica. Esta alteracin se llama lupus eritematoso crnico discoide (LEC) (Sontheimer.1992; Wallace,1992). Las caractersticas clnicas y de laboratorio de LEC no se han definido claramente desde la adopcin de los criterios del Colegio Americano de Reumatologa revisados en 1982 para la clasificacin de LES. Las lesiones cutneas del lupus discoide crnico son las siguientes: 1) eritema localizado persistente. 2) escamas adheridas, 3) taponamiento folicular, 4) telangiectasia y 5) atrofia (Wallace. 1992). El lupus eritematoso subagudo cutneo (LESC), otro cuadro cutneo similar, consiste en lesiones papuloescamosas o no cicatriciales con una asociacin principal al auloanticuerpo SS-A/Ro. Tambin se han descrito variantes adicionales del lupus crnico discoide, como la paniculitis lpica y el lupus urticarial (Sontheimer, 1992). Wallace (1992) ha definido el lupus crnico discoide como el cumplimiento de la descripcin del lupus crnico discoide o LESC. o una de las variantes de LES donde no se renen los criterios ACR para LES. Desgraciadamente, el lupus crnico discoide es una alteracin cutnea autoinmune que carece de anormalidad serolgica que unifique el diagnstico. Es una forma leve del lupus eritematoso que raramente evoluciona a LES. Por otra parte, hay una superposicin considerable entre el lupus discoide y LES, ya que hasta un 15% de los pacientes con LES tienen lesiones cutneas discoides. Alrededor del 6% al 12% de los pacientes con LES tenan lupus discoide durante un nmero variable de aos antes del comienzo de la enfermedad sistmica (Wallace, 1992). Habitualmente presentan anticuerpos antinucleares, con una estimacin de prevalencia en el lupus discoide del 6% al 50%. La relacin mujeres/hombres (2:1) est mucho menos inclinada hacia las mujeres que la forma sistmica

mune sintomtica (Rubn, 1988). En pacientes asintomticos. el anticuerpo anti-histona es predominantemente IgM y manifiesta una amplia reactividad con todas las histonas individuales. Los pacientes con enfermedad sintomtica desarrollan un nico tipo de anticuerpo anti-histona IgG que. ms que reaccionar con las histonas individuales, presenta una reactividad especfica con el complejo dimero de histonas H2A-H2B (Rubin. 1988) (Tabla 43-4). Asi. la IgG anti-(H2A-H2B) es un marcador til de diagnstico, con alta sensibilidad y especificidad para la enfermedad sintomtica, en contraste con la forma benigna de autoinmunidad inducida por procainamida. con anticuerpos IgM contra la histona individual. En ambos tipos de lupus eritematoso inducido por medicamentos (hidralazina y procainamida). existen anticuerpos IgM en concentraciones ms altas que los anticuerpos IgG. El cincuenta por ciento de todos los pacientes tratados con procainamida desarrollaron ANA despus de un ao de tratamiento (Tan. 1989). Los acetiladores lentos desarrollaron ANA ms rpidamente que los acetladores rpidos (Woosley. 1987). Todos los pacientes con tratamientos prolongados de procainamida desarrollaron una respuesta ANA positiva con independencia del fenotipo acetilador.

SINDROME DE SJOGREN
El sndrome de Sjogren es una enfermedad inflamatoria autoinmune D e gresiva marcada por una progresiva sequedad de ojos, boca y otras mucosas (Schumacher, 1993). La enfermedad puede evolucionar desde las glndulas exocrinas hasta una alteracin sistmica asi como una alteracin linfoprolferativa de clulas B. Se halla mucho ms frecuentemente en mujeres que en hombres, con una prevalencia creciente a lo largo de la vida adulta. A menudo asociadas al sndrome de Sjogren estn otras enfermedades reumticas, como AR. LES. cirrosis biliar primaria o esclerosis sistmica (Tabla 43-5). Las glndulas afectadas salivares o lacrimales son infiltradas con agregados de linfocitos. Las manifestaciones extraglandulares incluyen adenopata. vasculitis cutnea, neumonitis intersticial, etc. Esta enfermedad se ha clasificado dentro del sndrome primario de Sjogren (1). que no est asociado con otras enfermedades del tejido conectivo, y el sndrome de Sjogren secundario (2). donde est presente la AR u otras enfermedades autoinmunes. Se sabe que el sndrome de Sjogren se produce en una forma primaria, con el complejo seco (queratoconjuntivitis seca y xerostomia) como marco caracterstico. Los autoanticuerpos en el sndrome de Sjogren normalmente se confinan a los antgenos SS-A/Ro y SS-B/La (Tan, 1989), pero el autor los ha observado con otras especificidades solas, como complejo anti-Golgi o anti NuMA. El anti SSA/Ro y anti-SS-B/La estn presentes en LES pero en prevalencas mas bajas que en el sndrome de Sjogren. El anti ss-B/La se observa en un 60% de los pacientes del sndrome de Sjogren y en un 35% de los pacientes LES. y anti-SS-A/La en el 40% y 15%. respectivamente (Von Mlhen, 1995). La presencia de anti-SS-A/Ro cuando va asociado con anti-SS-B/La

Lupus eritematoso inducido por medicamentos y anticuerpos antihistona

Una caracterstica del lupus inducido por medicamentos es la presencia de autoanticuerpos de histona. Las histonas son protenas bsicas moleculares que contienen altas relaciones molares de aminocidos cargados positivamente, lisina y arginna. Las histonas se encuentran en las clulas eucariticas estrechamente asociadas al ADN genmico. La subunidad de este complejo histona-ADN se llama nucleosoma, cuyo ncleo ("core") tiene dos molculas de cada (H2A, H2B. H3 y H4). y una molcula de H1. junto con ADN de unos 200 bp de longitud (Rubn. 1985,1987), En los estudios de lupus inducido por drogas, el enzima heptico acetiltransferasa parece jugar un papel importante (Woosley, 1987). La acetiltransferasa es un enzima que puede acetilar medicamentos como la hidralazina y procainamida, jugando un importante papel en la desintoxicacin y excrecin del medicamento. Los pacientes con bajos niveles de acetiltransferasa eran ms propensos a desarrollar ANA y sntomas clnicos que pacientes que eran tratados con hidralazina y tenan fenotipicamente niveles altos de acetltransferasa. Los pacientes con altos niveles de enzima y que eran aceliladores rpidos no eran inmunes al desarrollo de ANA. Estos pacientes, sin embargo, tuvieron una dosis acumulada de hidralazina mayor y ms prolongada antes de desarrollar la enfermedad. Estos hallazgos relativos a los fenotipos de acetltransferasa se han confirmado en pacientes tratados con procainamida (Rubin. 1988). La procainamida es el medicamento implicado ms habitualmente en la autoinmunidad inducida por medicamentos. La hidralazina, quinidina y otros medicamentos tambin se han implicado como causantes de la autoinmunidad inducida por medicamentos. En el lupus inducido por medicamentos, existen anticuerpos frente a ADN de cadena simple e histonas. La procainamida se utiliza para tratar a los pacientes con arritmias, y la mayora de los pacientes desarrollan anticuerpos anti-histona. Sin embargo, slo del 10% al 20% de los pacientes tratados con procainamida desarrollan una enfermedad autoin-

Tabla 43-4

Especificidades de los autoanticuerpos en el lupus inducido por medicamentos: asociaciones o b s e r v a d a s m s habitualmente en la bibliografa Especificidad a anticuerpo asociada (prevalencia)

Medicamento inductor Procainamida

Complejo |H2A-H2B]-ADN (95%), H1 y otras histonas individuales Complejo |H2A-H?B]-ADN (35%). histonas Hidralazina individuales H1. complejo |H2A-H2B)-ADN a-Metildopa Complejo |H2A-H2B)-ADN Isoniazida Complejo [H2A H2BJ-ADN D-Penicilamina Complejo [H2A-H2BJ-ADN (58%) histonas Quinidina individuales Complejo [H2A-H2BJ-ADN Acebutolol Histonas totales Carbamazepma Gotas oftlmicas Timolol Complejo |H2A-H2B)-ADN
De von Muhlen CA, Tan. EM: Autoantibody specilicilies in autoimmune rheumatic diseases Rev Bras Rheumatol 1994 34 173. con permiso

CAPTULO 43 Tabla 43-5

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE L A S ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

979

Asociaciones clnicas frecuentes c o n el s n d r o m e d e Sjogren

Anticuerpos frente a antgenos del centromero

Los autoanticuerpos frente a antgenos del centrmero fueron detectados inicialmente por microscopia de inmunofluorescencia. El antigeno del centrmero fue localizado en la regin condensada de la metafase de los cromosomas. En estudios de inmunotransferencia, los antigenos del centrmero constan de tres protenas: 16 kDa, 80 kDa y 120 kDa. Existen autoanticuerpos de las protenas del centrmero en el 50% al 80% de los pacientes con el subgrupo de esclerodermia llamado CREST. El veinticinco por ciento de los pacientes con fenmeno de Raynaud idioptico con otros signos o sntomas de CREST tienen anticuerpos anlicentrmero (Rothfield. 1992).

Artrilis reumaloide Tiroiditis auloinmune Lupus entemaloso sistmico Hepatitis crnica activa Pohdermatomiositis Crioglobulmemia mixta Enfermedad del tejido conectivo mixta Prpura hipergammaglobulinmica Cirrosis biliar primaria Vasculitis necrotizante sistmica

es indicativa de un sndrome de Sjogren primario, a veces coexistiendo con LES. La presencia de anticuerpos anti-SS-B es menor del 1% en artritis reumatoide (Tan, 1988). Existe tambin una asociacin notable entre antiSS-A'Ro y la presencia de vasculitis sistmica y cutnea (Bylund. 1991). Se ha observado una asociacin de los anticuerpos SS-A/Ro y vasculitis en pacientes con enfermedad de tejido conectivo no clasificada. Paprotnik (1999) encontr ttulos fluctuantes de anticuerpos contra SS-A'Ro tanto en el sndrome de Sjogren primario como en el lupus eritematoso sistmico, pero sin correlaciones principales con la actividad de la enfermedad clnica.

Anticuerpos frente a Scl-70 (ADN topoisomerasa I)

Un antigeno importante es Scl-70. que fue detectado inicialmente como una protena de 70 kDa. Este fue ms tarde reconocido como un producto de degradacin de una proteina de 95 kDa. ADN Topoisomerasa I (Tan, 1989). El antigeno fue localizado en distribucin puntiforme en el nucleoplasma y el nucleolo. En primeros estudios, los autoanticuerpos frente a Scl-70 se detectaron en el 20% de los pacientes con esclerodermia no seleccionados por estudios de inmunodifusin (Tan, 1982a). En estudios posteriores, se detectaron autoanticuerpos Scl-70 en el 75% de los pacientes con la forma difusa severa de esclerodermia por pruebas de inmunodifusin (Jarzabek-Chorzelska, 1986). Este ltimo hallazgo probablemente se realiz por la mejor conservacin del antigeno topoisomerasa I en las pruebas, asi como la demostracin de una mayor prevalencia del autoanticuerpo Scl-70 en pacientes con la forma difusa severa de esclerodermia (Nakamura. 1992).

ESCLERODERMIA
La esclerosis sistmica (esclerodermia) es una enfermedad multisistmica del tejido conectivo de etiologa desconocida donde son rasgos prominentes las lesiones vasculares y la fibrosis del tejido. La etiologa de la esclerosis sistmica sigue sin conocerse bien. Los pacientes con esclerosis sistmica producen espontneamente anticuerpos frente a antgenos nucleares, nucleolares, y mitocondriales (Reimer, 1990; Rothfield. 1992). Un paciente con esclerodermia generalmente tiene una heterogeneidad restringida de tipos de anticuerpos. Un paciente determinado raramente tiene ms de un autoanticuerpo detectado. La Tabla 43-6 enumera los diversos tipos de autoanticuerpos descritos en la esclerodermia. Los pacientes con manifestaciones cutneas difusas y de rpida progresin que afecten a las extremidades distales y a menudo proximales y el tronco tienen un riesgo mayor nesgo de desarrollar manifestaciones viscerales precoces. Incluidos en la clasificacin de esclerodermia, se encuentra un subgrupo amplio de pacientes que tienen una forma del sndrome CREST (calcinosis del culis, fenmeno de faynaud, alteraciones de la motilidad esofgica, esclerodactilia y elangiectasia). El subgrupo de pacientes CREST puede representar del 20% al 30% de todos los pacientes de esclerodermia (Fritzler, 1980). Los pacientes con la variante CREST tienen una afectacin cutnea limitada a las extremidades distales de los dedos y la cara y generalmente un mejor diagnstico y evolucin clnica que los pacientes con afectacin cutnea difusa.

Anticuerpos frente a ARN polimerasas

Tres ARN-polimerasas catalizan la transcripcin de genes en ARN (von Mutilen, 1994). Los autoanticuerpos contra las ARN polimerasas tienden a aparecer al mismo tiempo en el mismo paciente, parecen ser especficos para esclerodermia y aparecen sobre todo en individuos con esclerodermia difusa.

Autoanticuerpos frente al antgeno nucleolar fibrilarina (U3-snRNP)

El nombre fibrilarina procede de la localizacin del antigeno en el componente denso librilar del nucleolo. Los anticuerpos antifibrilarina se ven en hombres jvenes con esclerodermia y minima afectacin de las articulaciones (von Mhlen, 1994).

Tabla 43-6

A u t o a n t g e n o s y autoanticuerpos en esclerodermia
Estructura molecular 100 kDa nativo y producto de d e g r a d a c i n 70 kDa. ADN topoisomerasa I Proteinas. 17, 80 y 140 kDa, localizadas en las placas de cinetocoro internas y externas Complejo ARN Poi l de protenas subunidades. 210-211 kDa Transcribe RNAm Transcribe 5S RNAr. RNAt Protena, 34 kDa, componente de partcula U3 RNP Complejo empalme-soma Complejo de 11 proteinas. 110-120 kDa Protenas de unin a ADN Proteina, 40 kDa, complejos con RNAs 7S y 8S Frecuencia de anticuerpo 70% en esclerodermia; 20-59% en todos los pacientes; 13% en CREST 57%-82% en CREST. 8% en lorma difusa 4%-20% en esclerodermia. 13% en forma difusa 4% 23% en esclerodermia; 45% en forma difusa; 6% en CREST 6%-8%; 5% en forma difusa, 10% en CREST 2%-5% en todos los pacientes; 24% en PM/ superposicin de esclerodermia 2%-5%; 24% en PM7 superposicin de esclerodermia 1%-14% en esclerodermia; 26-55% en PM/ superposicin de esclerodermia 4%-10% en esclerodermia; 1-11% en forma difusa, 8-19% en CREST, hasta el 3% en PM/superposicin de esclerodermia Raro

Autoantgeno Scl-70 Centromero ARN Pol I ARN Pol II ARN Pol III Fibrilarina U1-nRNP V PM-ScL Ku Th/To

NOR-90

Proteina, 90 kDa. localizada en la regin organizadora del nucleolo

980 Anticuerpos dirigidos a la regin organizadora nuclear

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

Los anticuerpos de la regin organizadora nuclear (NOR)-90 reconocen el factor de transcripcin hUBF (human upstream oinding /actor) de la ARN polimerasa I en el centro fibrilar del nuclolo. Los OR son regiones donde los nuclolos se reconstituyen despus de la mitosis, con grupos de genes ARN ribosomales, y zonas donde los antigenos Scl-70. U3-ARN/librilarina, NOR-90 y ARN polimerasa I pueden ser detectados (von Mutilen. 1994).

ponente esencial en los eptopos reconocidos por estos anticuerpos (Schellekens. 1998). Esta prueba de inmunofluorescencia es sensible pero menos especifica que AKA en pacientes con AR. Entre un 49% y un 87% de pruebas APF-positivas se han descrito en pacientes con AR (Aho. 1994; Janssens. 1988) y hasta un 5% en otras enfermedades del tejido conectivo o en controles normales. Tanto el A K A como el factor antiperinuclear se han descrito en AR seronegativa en su primera etapa, permitiendo una clara mejora en el diagnstico de la enfermedad. Se llev a cabo un ELISA utilizando lilagrina publicada de epidermis humana, con una sensibilidad que iguala la de A K A (Palosuo. 1998),

ARTRITIS REUMATOIDE
La AR es una alteracin sistmica autoinmune que se caracteriza por una artritis crnica, simtrica y erosiva de las articulaciones perifricas. Un gran porcentaje de pacientes presenta ttulos elevados de factores reumatoides sricos. Existen manifestaciones asociadas no articulares, como nodulos subcutneos, vasculitis. fibrosis intersticial y otras similares. Los sndromes de Sjgren y Felty se producen habitualmente con AR. Se desconoce la causa primaria de AR. La mayora de los pacientes con AR tienen los alelos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) Clase II DR4. DR1 o ambos (Schumacher, 1993). La AR est asociada con varios anticuerpos, que pueden servir como marcadores de diagnstico y pronstico (Aho, 1994; Viander. 1997). Estos incluyen: 1. Factor reumatoide (RF) 2. Anticuerpo antiqueratna (AKA) 3. Factor antipennuclear (APF) 4. Anticuerpo (rente a antgeno nuclear asociado a AR (RANA) 5. Anti-RA33 Los tres primeros, y posiblemente anti-RA33, pueden preceder al inicio de la AR clnica.

Anticuerpo frente al antgeno nuclear asociado a artritis reumatoide

El anticuerpo frente a RANA se encontr en pacientes con sndrome de Sjgren asociado a AR (Tan. 1989). Se descubri, por estudios microscpicos de inmunofluorescencia. que el RANA estaba localizado en el ncleo de forma finamente moteada. El RANA no fue detectable en cortes tisulares de muchos rganos en ratn, mono y humanos. Se detect tambin en dos lneas de clulas T humanas (Mol 4 y 1301) pero fue detectado en los ncleos de tres lineas de clulas B (WIL2. Raji y Daudi). Las lneas de clulas B albergaban virus de Epstem-Barr (EBV). mientras que las lneas de clulas T no. Existia una clara relacin entre RANA y EBV. Antes de la transformacin de los linlocilos con EBV, las clulas eran negativas para RANA. Sin embargo, despus de la transformacin, los antgenos RANA se encontraban en el ncleo (Tan. 1989). El anticuerpo anti-EA (un antigeno prematuro de EBV) estaba presente tambin con mayor frecuencia en pacientes con AR. En un estudio, se observ un gran nmero de pacientes con AR con ttulos altos (>1:20) de anti-EA (Fenell. 1981). El lazo de unin entre EBV. AR y RANA no ha sido definitivamente establecido. El fenotipo HLA. EBV y, durante la infeccin, las deficiencias de inmunorregulacin y reactivacin de clulas infectadas por EBV latentes pueden jugar un papel en la patognesis de la enfermedad (Nakamura, 1992). En los primeros estudios con anlisis de inmunodifusin, se delectaron anti-RANA en dos tercios de los pacientes con AR (Tan, 1982a, 1989). Sin embargo, en artculos posteriores, se encontr que la incidencia de anti- RANA estaba por encima del 90% en pacientes con AR (Tan, 1988). En sujetos controles normales la frecuencia de anti-RANA variaba del 6 c al 25% (Tan, 1988). Los estudios seroepidemiolgicos para anticuerpos virales de EB en AR han mostrado que haba una frecuencia mayor de pacientes con AR con ttulos altos (>1:320) de anticuerpos frente al antgeno de cpside viral EB. No hubo diferencia en la frecuencia del antigeno nuclear anti-EB o los ttulos entre los pacientes con AR y los normales (Ferrell, 1981).
3

Factor reumatoide
Este anticuerpo est dirigido contra la porcin Fe de la molcula IgG. Los estudios del FR monoclonal y policlonal han mostrado un RF polirreactivo con especificidad de unin por sustancias distintas de IgG. como componentes nucleares (Schumacher. 1993). El FR polirreactivo generalmente es de la clase IgM con baja afinidad. El FR no es especfico para AR, y a menudo se observa en casos de infecciones crnicas y otras condiciones. El FR en las enfermedades reumticas tiene una heterogeneidad inmunoqumica considerable. Junto con el FR IgM comn, se han detectado tanto FR IgA como FR IgG. El FR IgA se ha visto recientemente que est relacionado con enfermedad grave con erosiones. La mayora de los FR en suero de los pacientes con AR reaccionan con la zona Ga no alotpica (o yl-2-4) presente en las molculas de lgG1, lgG2 e lgG4. El FR reactivo con los grupos GM alotpicos presentes en lgG1 e lgG3 tambin pueden existir en el suero de los pacientes con AR. Adems, el grupo de los FR est entre los nicos anticuerpos que claramente muestran que estn involucrados en la patognesis de la enfermedad (Smolen, 1998).

Anti-RA33 y relacin con la artritis reumatoide

Hassfeld (1989) ha descrito un anticuerpo antinuclear (anti-RA33) que puede ser especfico para la AR. A partir de extractos de clulas Hela, se descubri un antigeno de aproximadamente 33 kDa que reaccionaba con el 36% de los 95 sueros de pacientes AR y con slo 1 de 170 pacientes control. El antgeno fue denominado RA33. y el autoanticuerpo no tiene una relacin perceptible con otros anticuerpos antmucleares. El anli-RA33 no estaba relacionado con anti-histona. De 11 pacientes AR con anti-RANA, seis fueron positivos para anti-RA33. De los cinco sueros anti-RANA negativos, dos fueron positivos para anti-RA33. (Hassfeld. 1989). Los anlisis de inmunotransferencia con extractos solubles de clulas Hela mostraban un autoanticuerpo dirigido frente a un antigeno de 33 kDa (anti-RA33) en el 30% de pacientes AR austracos y ninguno en pacientes con espondilitis anquilosante o artritis psorisica (Aho, 1994). Sin embargo, se observ una prevalencia de anti-RA33 en finlandeses con AR del 6% (Aho, 1994).

Anticuerpo antiqueratna
Este anticuerpo reacciona con la capa crnea del esfago de rala (Young. 1979), El AKA es un marcador para AR bastante especfico pero no muy sensible. La aparicin de reacciones positivas en suero AR es del 36% al 59% y de 0% al 3% en individuos sanos normales (Aho, 1994). La mayora de los sueros antiqueratna positivo son tambin reactivos con el factor antperinuclear, sugiriendo que ambos antigenos comparten algunas semejanzas.

POLIMIOSITIS Y DERMATOMIOSITIS Factor antiperinuclear

Este anticuerpo es reactivo con granulos de queratohialma perinucleares de las clulas de la mucosa bucal. El aminocido citrulina parece ser un comLa pohmiositis (PM) es una enfermedad inflamatoria del msculo estriado de etiologa desconocida. Se caracteriza por la presencia de infiltrados infla-

CAPTULO 43

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

981

matnos en el msculo esqueltico, con necrosis de fibras musculares y degeneracin asociadas (Targoff, 1992). Cuando la enfermedad se acompaa de cambios tpicos en la piel, se denomina dermatomiositis. La polimiositis se caracteriza serolgicamente por la presencia de un nmero de anticuerpos de vanas especificaciones dirigidos contra diferentes sintetasas de ARN de transferencia (RNAt) (von Mhlen, 1994) (Tabla 43-7). Estos anticuerpos definen un subgrupo de pacientes con PM. artralgia. enfermedad pulmonar intersticial y un diagnstico ms insuficiente que los pacientes sin los autoanticuerpos. Los anticuerpos frente a Jo-1 (histidil RNAt smtetasa) aparecen en el 23% al 36% de los pacientes PM. teniendo la mayora la enfermedad pulmonar intersticial (Targoff. 1992). Los autoanticuerpos frente a treonil y alanil RNAt-sntetasa aparecen con una prevalencia ms baja en la miositis autoinmune. Se ha descrito en pacientes con un sndrome clnico que muestren rasgos solapados de polimiositis y esclerodermia, un anticuerpo denominado anti- PM-Scl (Tan. 1988). El anticuerpo anti- PM-Scl reacciona con un complejo de 11 polipeptidos que van de 1 1 0 a 120 kDa. El Anti-PM-Scl muestra coloracin del nuclolo y nucleoplasma de las clulas del sustrato por microscopa de inmunofluorescencia indirecta.

mera publicacin presentaban una combinacin de rasgos generalmente asociados a LES, esclerosis sistmica y polimiositis. De modo caracterstico, por hemaglutmacin se detect un ttulo alto de autoanticuerpos frente a una ribonucleoprotena nuclear en todos los pacientes (Sharp. 1972). La falta de anormalidades renales y neurolgicas y la excelente respuesta de estos pacientes a pequeas dosis de corticoides orales justific inicialmente la clasificacin de estos pacientes como un grupo separado de LES y esclerosis sistmica. Sin embargo, el concepto de MCTD como un grupo separado ha cambiado con el tiempo. Muchos piensan que MCTD representa un solapamiento de esclerosis sistmica. LES y polimiositis (Nimelstein, 1980). Un grupo de pacientes diagnosticados inicialmente como MCTD lueron estudiados de nuevo ocho aos ms tarde y mostraron una evolucin general fuera del patrn de superposicin al de una enfermedad nica, siendo el diagnstico ms prevalente el de esclerodermia (Nimelstein, 1980). Parece haber una gran superposicin que se manifiesta cuando los criterios antes mencionados se aplican a u n a determinada poblacin de pacientes, y los estudios no confirman totalmente la existencia de MCTD como una entidad clnica individual

SNDROME DE ASTENIA CRNICA

Aunque no pertenece al clsico concepto de enfermedades del tejido conectivo difuso, el sndrome de astenia crnica (SFC) en una enfermedad con afectacin sistmica que se ha demostrado que est relacionada con la presencia de autoanticuerpos (von Mikecz, 1997). De 60 pacientes SFC, el 68% fueron positivos para ANA. Utilizando clulas Hep-2, los autores pudieron obtener palrones nucleolares (13%), moteados (25%), perifricos (52%) y moteados densos y finos (5%). Los estudios de co-localizacin mostraron unas protenas asociadas a lminas, factor SC-35 de empalme RNP, y vimentina como posibles dianas, en lo que parece ser una seleccin para antgenos celulares insoluoles. La alta frecuencia de autoanticuerpos en el SFC puede ayudar a distinguir esta entidad de otras enfermedades sistmicas reumticas.

BIOLOGA MOLECULAR Y FUNCIONES DE CIERTOS ANTGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES

Muchos de los autoanticuerpos intracelulares, incluyendo los ANA, se han identificado como marcadores de diagnstico para las enfermedades reumticas, como el LES. esclerodermia. sndrome de Sjgren, MCTD. lupus inducido por medicamentos y polimiositis/dermatomiositis (Tan. 1989). Los autoanticuerpos en las enfermedades del hombre se han utilizado como herramientas para estudiar varias funciones biolgicas moleculares y mecanismos. Los ANA se han utilizado para investigar bibliotecas de expresin de DNAc. con posterior identificacin de autoantigenos. Se han estudiado y aclarado las funciones biolgicas de muchos de los autoanticuerpos inducidos por autoantigenos. Las funciones biolgicas que se han demostrado que los anticuerpos inhiben son el empalme del pre-ARNm, replicacin del ADN. reparacin del ADN, transcripcin, transcripcin de ARNr, movimiento del cromosoma basado en el microtbulo durante la mitosis, y aminoacetilacin de ARNt (Tan, 1988, 1989; Casiano. 1996; Tan. 1997).

CONCEPTO DE SNDROMES DE SUPERPOSICIN

El sndrome de superposicin se utiliza para describir a los pacientes que muestran sntomas de ms de una enfermedad. Por ejemplo, se han descrito pacientes que renen los criterios diagnsticos para LES y tambin tienen manifestaciones que sugieren un segundo diagnstico como la AR (Lzaro, 1989). Se duda de si los sndromes de superposicin pueden representar la coexistencia de dos o ms enfermedades diferentes, o si el sndrome constituye una entidad diferente.

PERFILES DE AUTOANTICUERPOS EN VARIAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMICAS

Se ha observado que existen distintos perfiles de ANA en dilerentes enfermedades reumticas sistmicas. Algunas caractersticas de stas incluyen la presencia o ausencia de ciertos anticuerpos y diferencias en los titulos medios de estos anticuerpos (Nakamura. 1986; Tan. 1988). No obstante, se debera tener cuidado del bajo valor predictivo positivo de la prueba de ANA en grupos con una baja prevalencia de enfermedades reumticas sistmicas y en una poblacin de edad (Slater, 1996). Deben researse las siguientes caractersticas:

Enfermedad mixta del tejido conectivo

El concepto de enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) fue propuesto inicialmente por Sharp (1972). Los 20 pacientes descritos en la pri-

Tabla 43-7

A u t o a n t i g e n o s y autoanticuerpos e n pollmiosltis ( P M ) y dermatomiositis ( D M ) Estructura molecular

Proteina histidil ARNt sintetasa. 52 kDa Proteina treonil ARNI sintetasa. 80 kDa Proteina alanil ARNt sintetasa. 110 kDa Complejo proteina nuclear, protenas 53 y 61 kDa Proteina, 54 kDa. en complejo con 7 SL ARN Complejo de 1t proteinas. 110-120 kDa Complejo espliceosoma 56 kDa, componente RNP Glicil-RNAt sintetasa Isoleucil-ARNt sintetasa

Autoanligeno
Jo-1 PL-7 PL-12 Mi-2 Partcula de reconocimiento de serial (SRP) PM-Scl UtnRNP 56 kDa EJ 0J

Frecuencia de anticuerpo
23%-36% 4% en PM

3%
15%-35% en PM. 5%-9% en DM 4%-5% en PM, no se produce en DM 8%-12% en PM. 25% en PM/ superpo: 4%-17%en PM/DM 80% <3% en PM <3% en PM

de Tan ( 1988). Nakamura (1992) y von Mhlen y Tan ( 994)

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

1 Mltiples ANA observados frecuentemente en LES. a menudo con altos niveles de anticuerpos anti-ds-ADN. 2. Distincin de anti- Sm para LES. 3. Restriccin de ANA en lupus inducido por medicamentos a anticuerpos antihistona. 4. Anticuerpos frente a U1-RNP o anticuerpos nucleares frente a RNP presentes en varias enfermedades reumticas con diferentes frecuencias. 5. La restriccin de ANA en MCTD frente a U1-RNP o anticuerpos nucleares RNP. 6. Sueros de sndrome de Sjgren caracterizados primariamente por la presencia de anticuerpos frente a SS-A'Ro y SS-B'La. 7. Pacientes con esclerodermia mostrando un perfil consistente en anticuerpos frente a Scl-70, el antgeno centrmero/cinetocoro y antgenos nucleares. 8. La presencia frecuente de RE AKA. APF. anti-RA33 y RANA en artritis reumatoide. 9. La presencia de autoanticuerpos Jo-1. Mi-2 y PM-Scl en PM/DM.

TABLA DE DECISIN PARA EL DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES

La microscopa de inmunofluorescencia mediante extractos celulares humanos, como clulas Hep-2. permite la deteccin sensible de anticuerpos en suero que reaccionan muy especficamente con varias protenas celulares y cidos nucleicos. Esta tcnica es esencial en laboratorios de inmunologa dedicados al diagnstico rutinario de las enfermedades autoinmunes humanas. De una inmunofluorescencia positiva se puede asociar el patrn especfico con la presencia de un autoanticuerpo distinto en el suero de ese paciente particular. Como los patrones de los distintos autoanticuerpos aparecen en las distintas enfermedades, como se trat previamente, los laboratorios ofrecen al mdico la posibilidad real de reducir la bsqueda del diagnstico. En la Tabla 43-8 se desarrolla una tabla de decisin teniendo en cuenta todo esto, as como la clasificacin del patrn citoplasmtico para utilizarse en el laboratorio de rutina (Tabla 43-9). Las Figuras 43-1,43-2 y 43-3 representan algunos ejemplos de los patrones de inmunofluorescencia.

cuerpos frente a antgenos nucleares. La deteccin de anti-SS-A/Ro requiere de la implantacin y cumplimiento de varias recomendaciones tcnicas y de garanta de calidad. Con el uso de las clulas de sustrato apropiadas que contengan el antgeno SS-A/Ro, muchos de los llamados pacientes lupus eritematoso ANA-negativos mostrarn resultados positivos en la inmunofluorescencia indirecta, Los anlisis de inmunoprecipitina y doble inmunodifusin (ID) se han utilizado para determinar la especificidad de varios ANA. La especificidad del ensayo en doble inmunodifusin depende generalmente de la calidad de los otros sueros control usados en el procedimiento, asi como de la naturaleza de la preparacin del antigeno. Las pruebas de inmunodifusin no son muy sensibles. Las pruebas de inmunodifusin positivas tienen un alto grado de especificidad como marcador diagnstico en ciertas enfermedades reumticas Existen equipos comerciales de inmunodifusin disponibles para la deteccin de anticuerpos frente a RNP. Sm, SS-A/Ro. SSS-B/La y Scl-70, asi como otros marcadores menos comunes (Nakamura, 1994b). En la pasada dcada se han desarrollado un nmero creciente de enzimoinmunoanlisis con el uso de antgenos estndar purificados y recombinantes (Saitta, 1992). Muchos de estos enzimonmunoanlisis han demostrado ser ms sensibles que los mtodos de inmunodifusin anlogos. Asi, debido a la alta sensibilidad de los enzimonmunoanlisis, se necesita determinar el rango de referencia de pacientes normales y los valores discriminantes apropiados. Comparadas con las pruebas de inmunodifusin. las pruebas ELISA mostraron una sensibilidad mucho mayor pero tenan una especificidad menor (Nakamura, 1992). Adems, las pruebas ELISA eran frecuentemente positivas en ttulos bajos para anticuerpos en sueros de pacientes con enfermedades reumticas que no fueran LES. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos frente a Sm en pruebas de inmunodifusin se considera como altamente especifica para LES. Sin embargo, en las pruebas ELISA el anlicuerpo Sm

Tabla 43-8 Tabla d e decisin para la identificacin de algunos autoanticuerpos u s a n d o clulas HEp -2 y su asociacin con la e n f e r m e d a d 1 Patrn nuclear Envoltura (bordo) Punteado, figura mittica negativa -> CBP Continuo, figura mittica negativa -> enfermedades hepticas crnicas Homogneo, figura mittica negativa -> LES, LES inducido por medicamentos Moteado Grande -> hnRNP en LES, Grueso -> Sm, RNP en LES. MCTD Fino - SS-A/Ro. SS-B/La en LES. SS Pleomorfo - PCNA en LES Discreto Figura mittica positiva - * centrmero en SCL Figura mittica negativa -> p95 en PBC 2 Patrn nucleolar Homogneo -> PM-Scl en SCL Con grumos -> librilarma en SCL Moteado Figura mittica punteada -ARN pol I. NOR-90 en SCL Figura mittica homognea - Scl-70 en SCL 3 Patrn citoplasmtico Manchas densas finas -Jo-1. PL-7 PL-12 en PM/DM Homogneo -> rRNP en LES Fibrilar -> actina, miosina en MCTD, CBP, HCA Segmentario -> a-actinma, vinculina en MG. EC, CU Reticular -> mitocondna en CBP Polar -> Golgi en SS, LES, infecciones virales Aparato fusiforme -> NuMA en SS, mediocuerpo, p330' en cncer CBP= Cirrosis biliar primaria: L E S = lupus eritemaloso sistomico: M C T D= enfermedad del tejido conectivo mixto. SS = sndrome de Siogron, SCL =esclerodermia. PM = polimiosilis; DM = dermatomiositis; HCA = hepatitis crnica i autoinmune, EC = enfermedad de Crohn: CU = colitis ulcerosa. PCNA antgeno nuclear de clulas proliferativas; N u M A = aniigeno nuclear milOlico-ascciado Modificado de Krapl AR. von Mutilen CA Krapf FE. y coi: Atlas ol I m m u n o f l u o ^rescent Autoaniibodies. Munich. Urban & Schwarzenberg, 1 9 9 6 con permiso J

MTODOS DIAGNSTICOS EN LA DETECCIN DE AUTOANTICUERPOS

Los mtodos que habitualmente se utilizan en la deteccin de anticuerpos se enumeran en la Tabla 43-10. Una prueba ampliamente utilizada en el cribado de autoanticuerpos intracelulares es la microscopa de inmunofluorescencia (IFM) y las pruebas de inmunoenzimas (Nakamura, 1994b). Las pruebas secundarias definitivas para la identificacin especfica de ANA son la inmunodifusin. inmunoprecipitacin, aglutinacin de partculas, mmunoenzima, inmunotransferencia y mtodos de radioinmunoanlisis (Teodorescu. 1992). La estandarizacin de la inmunofluorescencia indirecta (IF)-ANA ha resultado muy difcil (Nakamura. 1992; Fellkamp. 1996: Smolen. 1997). Muchos factores estn implicados en la realizacin de las pruebas IF-ANA. Incluyen 1) el sustrato y las variaciones de fijacin, 2) ptica microscpica, 3) mtodo y cuantificacin de resultados, 4) establecimiento del rango de referencia, 5) interpretacin de resultados, 6) sueros de referencia, y 7) especificidad y avidez de los ANA. El Comit de Estandarizacin de ANA de la Organizacin Mundial de la Salud recomienda que 1) los laboratorios deberan comunicar los resultados IF-ANA a ambas diluciones, 1:40 y 1:60, y 2) deberan proporcionar informacin del porcentaje de individuos normales que son positivos a esas diluciones dentro de su propia experiencia (Tan. 1997). Bylund y Nakamura (1991) han mostrado la importancia de la deteccin de los autoanticuerpos SS-A/Ro en las pruebas de cribaje de autoanti-

CAPTULO 43 Tabla 43-9

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE L A S ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

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Clasificacin de patrones citoplasmticos en inmunofluorescencia indirecta Antgenos representativos Actina, mosina no muscular Enfermedades y asociaciones clnicas Ambos en hepatitis crnica activa, cirrosis heptica y miastenia gravis: actina en hepatitis autommune. enfermedad de Crohn . hemodilisis a largo plazo. SHN. pero raro en DCTD Antivimentina a menudo causada por reaccin cruzada con anticuerpos anti-hlix en muchas clases de condiciones inlecciosas o inflamatorias, y en hemodilisis a largo plazo; raro en DCTD, ambos vistos en SHN: la queratina es sistema principal en EHA (69%). tambin comn en DCTD y psoriasis Miastenia gravis. enfermedad de Crohn. colitis ulcerosa

Patrones citoplsmicos en IIF (substrato celular) 1. Fibroso Fibras de estrs libras lineales citoesquelticas. algunas veces con depsitos granulares pequeos (HEp-2. fibroblastos) Filamentoso- filamentos y fibrillas separndose del borde nuclear (HEp-2, PIK2 clulas epiteliales)

Vimentina. queratina

Segmental - slo pequeos segmentos de fibras (cuerpos densos peridicos) estn decoradas (HEp-2. fibroblastos) 2. Moteado Moteado tino: pequeas motas esparcidas, la mayora con londo homogneo o moteado denso fino (HEp-2) Moteado denso tino nuboso, casi homogneo en todo el citoplasma (HEp-2) Polo granular, perinuclear, en forma de flecha, granular grueso, correspondiente a los apilados laminares del complejo Golgi (HEp-2) Reticular gruesa reticular grueso difuso y granular (HEp-2) Pequeos moteados esparcidos: irregularmente distribuidas molas citoplasmticas contables (HEp-2) Reticular lino - reticular lino difuso y granular (HEp-2) AWCA-pANCA tincin perinuclear irregular; cANCA: motas densas, finas o gruesas (granulocitos de sangro perifrica, lnea celular de leucemia HL-60)

a-actinma, vinculina. tropormosina

Muchas de las ammoacil-RNAt-sintetasas. PM: "sindrome Jo-1" (miositis y enlermedad pulmonar intersticial) principalmente Jo-1 rRNP. fosfoproteinas ribosomales Aparato de Golgi LES neuropsiquitrico Raro en LES, SS y otras enfermedades reumticas sistmicas; descrito en ataxia cerebelosa idioptica, degeneracin cerebelosa paraneoplsica e infecciones virales, incluyendo E B V y VIH CBP; esclerosis sistmica (43%). raro en otras DCTD. anticuerpos del centrmero estn frecuentemente asociados Ninguno reconocido

Protenas en la membrana mitocondnai interna (M2 principalmente) Lisosomas o peroxisomas

Retculo endoplsmico(); otras protenas desconocidas Dianas pANCA mieloperoxidasa. cANCA dianas PR3 (proleinasa 3)

EHC. detectado en todos los tipos de condiciones inflamatorias (crnicas) Descrito primero en vasculitis sistmica con glomerulonefritis necrolizante y enfermedad pulmonar inflamatoria: granulomatosis de Wegener (cANCA) y otras vasculitis necrotizantes (pANCA); catepsma-G es el antigeno principal en colilis ulcerosa, enfermedad de Crohn y colangitis primaria esclerosante hepatitis autommune; vasculitis en terapia PTU: recientemente descrito en AR (32%). IgM ANCA en tuberculosis y malaria

ANCA = anticuerpos citoplsmicos antineutrotilos, EHA = enfermedad heptica alcohlica; EHC = enlermedad heptica crnica. DCTD enfermedad ditusa del tejido conectivo; EBV = virus EpsteinBarr; VIH = virus de inmunodeficiencia adquirida; IIF = test de mmunolluorescencia indirecta. SHN suero humano normal; CBP = cirrosis biliar primaria: PM = polimiositis. PTU - propiltiouracilo. RNP ribonucleoproleina, SS = sindrome de Sjogren: LES lupus eritemaloso sistemico Modificado de von Mhlen CA, Tan EM Autoantibody specificities in autoimmune rheumatic diseases Rev Bras Rheumatol 1994 34:173. con permiso

era positivo en el 23% de 54 pacientes AR, 25% de 24 pacientes con esclerosis sistmica, 9% de 11 pacientes con polimiositis, y el 2% de 59 pacientes normales (Maddison, 1985). Una sensibilidad creciente y una especificidad decreciente podran provocar falsos positivos en las pruebas. Ademas, se determinaron asociaciones clnicas con distintos anticuerpos principalmente utilizando tcnicas de ID.

anuales desde 1989 hasta 1992 (Charles. 1992; V a n Venrooij, 1991). En 1988 y 1989, se dirigieron talleres de consenso para definir la concordancia entre laboratorios en la deteccin de especificidades de autoanticuerpos en enfermedades reumticas. Veintiocho laboratorios participaron en el estudio y utilizaron diversas metodologas. Los objetivos del estudio del consenso iniciado en 1989 fueron 1) definir el consenso entre laboratorios en cuanto a la deteccin de autoanticuerpos y especificidades. 2) probar si las discrepancias eran debidas a la metodologa utilizada, y 3) hacer recomendaciones para la calidad mejorada de resultados con sensibilidad mejorada y mayor especificidad.

VARIACIONES EN LAS METODOLOGAS USADAS PARA LA DETECCIN DE AUTOANTICUERPOS FRENTE A ANTGENOS NUCLEARES E INTRACELULARES
Los mejores estudios referentes a los diferentes mtodos para la deteccin de autoanticuerpos frente a antigenos intracelulares fueron descritos por un Grupo de Estudio de Consenso Europeo. El Grupo de Estudio de Consenso Europeo para la Deteccin de Autoanticuerpos frente a Antgenos Intracelulares en Enlermedades Reumticas se form en 1988 y ha dirigido cuatro talleres

Enzimoinmunoanlsis
En los estudios de 1988 y 1989. se observaron muchas reacciones falsopositivas. Las reacciones falso-positivas estaban causadas por reactivos bloqueantes de baja calidad en el proceso; tambin, se usaban preparaciones de antigeno impuro. En el estudio de cooperacin de 1990 y 1991. el laboratorio que usaba ELISA funcion muy bien, con pocos falso-positivos o resultados negativos extraos. Los ELISA tambin funcionaron bien al clasificar los sueros con mltiples especificidades. El porcentaje de laborato-

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

CAPTULO 43

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

Figura 43-2. Inmunolluorescencia indirecta de clulas HEp-2 con auloanticuerpos para distinguir amgenos citoplasmticos (x400. m a n c h a FITC). A. Se observa el patrn caracterstico de autoanticuerpos frente al aparato de Golgi. con granulos organizados en grupos en un poio de la clula y respetando los ncleos. B. Los autoanticuerpos frente a miosina no muscular adornan las fibras de estrs del citoesgueleto. Estos autoanticuerpos se encuentran en pacientes con miastenia gravis y enfermedades hepticas crnicas. C, Autoanticuerpos antimitocondriales presentan un patrn granular grueso que incluye todo el citoplasma, observado sobre todo en cirrosis biliar primaria. Distintos puntos en el nucleoplasma obtenidos por el suero utilizado estn determinados probablemente por una segunda poblacin de autoanticuerpos dirigidos contra un antgeno mtranucleoplsmico, un fenmeno no poco habitual en pacientes con enfermedades hepticas. D. El patrn citoplasmtico granular denso, casi homogneo, obtenido con anticuerpos anti-r RNP. Ellos se dirigen a fosfoproteinas nbosomales. y se asocian clnicamente con manileslaciones del sistema nervioso central en pacientes con lupus eritematoso sistmico. Como se puede ver en el dibujo, no es infrecuente que estos anticuerpos tambin tian el nuclolo en un patrn homogneo, aunque dbilmente. (De von Mhlen CA. T a n EM: Autoantibody specilicilies in autoimmure rheumatic diseases. R e v Bras Rheumatol 1994; 34:173; c o n permiso.) Figura 43-1. Inmunolluorescencia indirecta con autoanticuerpos frente a antgenos nucleares y nucleolares en clulas HEp-2 (x40C. m a n c h a FITC) A, Autoanticuerpos frente a protenas laminares A, B y C de la envoltura nuclear dan un patrn homogneo nuclear en clulas HEp-2, asociados con un borde nucleoplsmico continuo. No se observa ningn borde cuando los anticuerpos se dirigen contra histonas o ds-ADN. Los artculos previos sobre un patrn perifrico obtenido por anticuerpos anti-ds-ADN probablemente se deban a arielactos de fijacin. El patrn nucleoplsmico moteado que se ve en fies caracterstico de autoanticuerpos dirigidos contra antgenos nucleares extraibles. como el anli-U1-nRNP mostrado aqui. Los nuclolos y las clulas en metafase son negativos. C, Autoanticuerpos anticenlrmero, observados tpicam e n t e en pacientes con la forma limitada de esclerodermia (sndrome de CREST). pero tambin en cirrosis biliar primaria. Se observan distintas manchas en el ncleo en interfase. una por cada par de cromosomas, que se renen en las placas de metafase durante la divisin de la clula (en el centro dos clulas en telofase). Autoanticuerpos frente a NOR-90 y ARN-polimerasa I obtienen el m i s m o patrn en clulas HEp-2 (D). con motas nucleolares y puntos a lo largo de algunos husos de las clulas en metafase (en las dos clulas dividindose en el centro). Pueden diferenciarse por otros ensayos, c o m o la mmunotransferencia o la mmunopreciptacin. Los autoanticuerpos que se dirigen contra la fibrilarina (U3-nRNP) lien de forma grumosa lodos los nuclolos (). (De von Mhlen CA. Tan EM: Auloantibody specificities in autoimmue rheumatic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994; 34:173: con permiso.)

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

Figura 43-3. Algunos otros patrones distintos en nmunofluorescencia indirecta de clulas HEp-2 (x 400, m a n c h a FITC). A. Clulas al final de la metalase muestran antigenos que se condensan en la mitad del cuerpo, tambin lamada la regin de puente intercelular. Los polos del huso de las clulas en divisin pueden estar adornados, como en 0, con anticuerpos frente al aparato mittico. c o m oN u M A (proteina nuclear asociada a la mitosis). Los autoanticuerpos PCNA ofrecen un mosaico de patrones nucleoplsmicos (C), que oscilan desde homogneos a distintos moteados, segn las fases de la divisin celular (detalles en el texto). D, El patrn obtenido con autoanticuerpos anti-p80-coiln, donde se pueden ver de una a ocho m a n c h a s nucleoplsmicas. (De von Mhlen CA, Tan EM: Autoantibody specilicities in autoimmune rheumalic diseases. Rev Bras Rheumatol 1994; 34:173, con permiso.)

Tabla 43-10

M t o d o s d e deteccin de anticuerpos contra antgenos nucleares e intracelulares Mtodo Extraccin del antigeno
Seccin tisular, lineas celulares Tejido y extractos celulares Tejido y extractos celulares Extractos celulares Antgenos nativos purificados o recombinantes

Sensibilidad y utilidad
Tcnica sensible, utilizada a menudo como deteccin precoz Necesita una reaccin de precipitacin, alta especificada pero baja sensibilidad Elevada sensibilidad y velocidad comparada con las tcnicas de ID Alta sensiblidad, permite la deteccin de anticuerpos Irente a antigenos solubres c insolubles Alta sensibilidad y cuantilicacin. puede determinar la clase de anticuerpo

Inmunofluorescencia con microscopa (IFM) Inmunodilusin doble (ID) Recuento por mmunoelectroloresis Inmunoblot; Western blot (IB. WB) ELISA

From Nakamura RM. Bylund DJ. Ian EM: Curent status ol available standards for quality improvement ot assays tor the detection of autoantibodies to nuclear and intracellular antigens J Clin Lab anal 1994b: 8:360. con autorizacin.

CAPTULO 43

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE L A S ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

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dad para los mejores reactivos comerciales es la revisin peridica del Colegio de Inmunopatlogos Americanos.

Inmunotransferencia
Esta tcnica es muy sensible y es un importante mtodo para la caracterizacin de la naturaleza especfica de muchos de los autoanticuerpos. U n a importante ventaja del mtodo es que un anticuerpo especifico puede ser identificado mediante preparaciones de extractos de antgeno de clulas natural (Fig. 43-4). El Estudio de Consenso Europeo observ lo siguiente con el procedimiento de inmunotransferencia (Nakamura, 1994b): 1. La preparacin del antgeno es m u y importante en el procedimiento de inmunotransferencia 2. La deteccin de anticuerpos frente a nRNP. Sm y Scl-70 fue aceptable. Este mtodo sensible es til en la deteccin de mltiples especificidades de anticuerpo en la misma muestra. 3. El mtodo requiere controles cuidadosos a las bandas de peso molecular. Por ejemplo, las bandas de histona pueden ser confundidas con un antigeno centromrico (CENP-A, 19 kDa) y Scl-70 (topoisomerasa I) puede ser confundido con otras bandas de100 kDa. 4. La degradacin de protenas puede producirse en el extracto de clulas de antigeno usadas para inmunotransferencia, especialmente Scl-70 y antigenos de centrmero. 5. El anti-Sm se distingue por la presencia de anti-D (el antigeno D es una protena de 16 kDa contenida en todas las partculas principales nRNP). 6. Anti-SS-B/La se detecta enseguida por inmunotransferencia. Anti-SS-A'Ro se detecta mal por inmunotransferencia y es insensible, porque SS-A'Ro puede no demostrar la estructura apropiada para el reconocimiento.

SDS-PACI : l- yol
t u r a d o Ir iinli|>i'iiii: I I K L I la clula VIOIT -4 Sislenia lie ili'li'ccii'in: l-pnuciiiu A

Figura 43-4. Ensayo de immunotranslerencia de autoanticuerpos c o m u n e s observ a d o s en enfermedades reumticas. En la b a n d a 1 la zona de nitrocelulosa fue investigada en un suero h u m a n o normal (control negativo), no aprecindose ninguna reactividad, tal y c o m o se esperaba. Las siguientes 3 bandas m u e s t r a n distintas franjas obtenidas por sueros controles positivos m e z c l a d o s conteniendo especificid a d e s conocidas. La b a n d a 2 representa reactividades c o n las nbonucleoproteinas (RNP) SSA (52 y 60 kOa), SSB (48 kDa), Sm (B/B\ 28 kDa, y D. 14 kDa) y U1-nRNP (la protena de 70 kDa y una franja tenue alrededor 0e 1 9 kDa. el antigeno C; la protena A. con 32 kDa y tambin reconocida de m o d o caracterstico p o r anticuerpos U1- n R N P . no se ve en este experimento). La banda 3 m u e s t r a las franjas obtenidas u s a n d o los prototipos de antisueros h u m a n o s frente a Jo-1 (52 kDa), Ku (dos band a s alrededor de las regiones de 70 y 80 kDa) y RNP ribosomal (15, 18 y 37 kDa). La pequea franja por e n c i m a del antgeno de 52 kDa no est identificada. La banda 4 p r e s e n t a las Iranias vistas ms comnmente utilizando sueros de pacientes con esclerodermia, p o r ejemplo, anti-ADN topoisomerasa I (Scl-70. 95 kDa), y anticuerpos anticentrmero (16 kDa. CENP-A, y 80 kDa. CENP-B). A la derecha, se pueden v e r posiciones en kilodaltons del amplio rango de pesos moleculares estndares. (De von M U h l e n CA. T a n EM Autoantibody specificities m a u t o i m m u n er h e u m a t i c diseases. R e v Bras Rheumatol 1994: 34:173, con permiso.)

RESUMEN

Hay muchos tipos de autoanticuerpos trente a antigenos intracelulares y nucleares en las diversas enfermedades reumticas sistmicas. Normalmente, se considera importante no slo detectar la presencia y cantidad del autoanticuerpo intracelular y nuclear en el paciente, sino tambin identilicar la especificidad inmunolgica. Estudios anteriores han mostrado que distintos perfiles diagnsticos de los autoanticuerpos se observan en muchas de las enfermedades reumticas. Algunas de las enfermedades se caracterizan por la presencia o ausencia de un anticuerpo especifico, o por diferencias en el nivel cuantitativo o titulo del anticuerpo. Se ha progresado mucho en mejorar la sensibilidad, especificidad y control de calidad de las diversas pruebas de laboratorio para la deteccin de autoanlicuerpos frente a antgenos intracelulares y nucleares. Los bilogos moleculares han utilizado muchos de los anticuerpos c o m o sondas biolgicas y han aclarado las lunciones biolgicas de varios de los autoantgenos. Se ha progresado mucho en el conocimiento de la patognesis y mecanismos inmunes en las enfermedades reumticas.

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os clnicos que usaban ELISA aument del 25% al 47% durante un periodo de cuatro aos, de 1989 a 1992. Homburger (1998) public una comparacin enlre un ELISA comercial y IF-ANA sobre clulas HEp-2, concluyendo que ambos mtodos eran sustancialmente equivalentes para detectar ANA clnicamente relevantes en pacientes con enfermedades reumticas sistmicas. Llegando a la conclusin opuesta, Emlen (1997) prob seis equipos de ELISA comerciales y sac como consecuencia que existan diferencias significativas en la deteccin de ANA por inmunofluorescencia y ELISA. Un grupo de cientficos internacionales reunidos por la Organizacin Mundial de la Salud llevaron a cabo la realizacin de muchos ELISA comerciales, mostrando que 1) ningn fabricante en particular era claramente superior a otros en lo que se refera a la sensibilidad, especificidad y precisin de sus productos y 2) las reas que necesitaban mejora estaban en los equipos para la deteccin de anticuerpos frente a ds-ADN y antigenos Sm (Tan. 1999). Se debe tener gran cuidado a la hora de seleccionar reactivos ELISA y equipos comerciales. Una buena fuente de datos de control de cali-

988

SECCIN V

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CAPTULO 43

EVALUACIN CLNICA Y DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES REUMTICAS SISTMTICAS

989

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C A P T U L O

44

Vasculitis
Rex M. McCallum, M.D. David J. Bylund, M.D.

CLASIFICACIN PATOGNESIS DE LA VASCULITIS PERSPECTIVAS SOBRE EL USO DE PRUEBAS CLNICAS DE LABORATORIO Pruebas de rutina Pruebas especiales Algunos patrones de prueba en vasculitis ANTICUERPOS ANTINEUTRFILOS CITOPLASMTICOS Mtodos de deteccin Especificidad antignica Asociaciones con enfermedad Interpretacin de la prueba

990 990 991

RESUMEN DE LOS PRINCIPALES SNDROMES VASCULTICOSIDIOPTICOS Poliarteritis nodosa Variantes de PAN Sndrome de Churg-Strauss Sndrome mixto de poliangetis Granulomatosis de Wegener Granulomatosis linfomatoide

993

992

Prpura de Henoch-Schnlein Arteritis de clulas gigantes (temporal) Arteritis de Takayasu Angetis primaria del sistema nervioso central Enfermedad de Kawasaki RESUMEN BIBLIOGRAFA 998 998

Las manileslaciones clnicas y patolgicas de la vasculitis necrotizante sistmica son proteicas. Los clnicos se enfrentan a un paciente que presenta una serie amplia de sntomas y/ o signos confusos y contradictorios. El diagnstico de un sndrome vasculitico necrotizante sistmico requiere una evaluacin minuciosa que relacione la historia de un determinado paciente y la exploracin fsica con los datos de laboratorio. Aunque la vasculitis se puede producir en cualquier zona del cuerpo, se han definido patrones distintos de la enfermedad y su tipificacin apunta hacia alteraciones determinadas. El diagnstico especfico es importante porque el Iratamiento y el pronstico dependen de los lugares y patrones de la afectacin del rgano (Langford. 1995). La vasculitis necrotizante sistmica puede definirse patolgicamente como una inflamacin causante de lesiones vasculares. Estas lesiones pueden incluir la proliferacin de clulas ntimas dentro de la luz de los vasos, estrechando o incluso cerrando ese espacio y causando isquemia y un posible infarto de estructuras anatmicas distales al lugar del dao vascular. Tambin, la pared del vaso puede debilitarse hasta formarse un aneurisma o la ruptura del vaso. La vasculitis idioptica (primaria) se produce cuando el dao inflamatorio vascular es el principal hallazgo clinicopatolgico y no hay enfermedad subyacente. La vasculitis secundaria se produce cuando las lesiones vasculares acompaan a una enfermedad subyacente (Tabla 44-1). El foco de este captulo es la vasculitis idioptica y aquellas pruebas clnicas de laboratorio tiles para su diagnstico y tratamiento. Como los mtodos de diagnstico y tratamiento en los sucesos vasculares secundarios se centran en las enfermedades subyacentes, se tratan en los captulos correspondientes de este libro. Sin embargo, los comentarios relacionados con la valoracin de laboratorio del dao en el rgano distal en la vasculitis idioptica estn relacionados con la vasculitis secundaria.

CLASIFICACIN
No existe un sistema de clasificacin estndar ampliamente aceptado para las afecciones vasculares idiopticas. Histricamente, su clasificacin se ha basado en varias combinaciones de hallazgos clnicos y patolgicos (Jennelte, 1998, 1997). aunque en los ltimos aos las clasificaciones activas han mejorado debido a los resultados en la nomenclatura estndar (Hoffman. 1998; Hunder, 1990; Jennette, 1994). El esquema de clasificacin que aparece en la Tabla 44-2 est modificado a partir del utilizado en los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (Langford, 1995).

PATOGNESIS DE LA VASCULITIS
Ni la etiologa ni la patognesis de las afecciones vasculares se conocen excepto en los ejemplos de dao directo en los vasos sanguneos por infeccin vascular, o vasculitis secundaria. La mayora de las alecciones vasculares idiopticas se atribuyen a daos vasculares mediados por la inmunidad inducidos por alguno de varios mecanismos, incluyendo: 1) depsitos inmunocomplejos; 2) autoanticuerpos directos ligados o a estructuras de las paredes de los vasos (p. ej., endotelio o antgenos de la membrana basal) o a neutrfilos cuando la vasculitis est asociada con el anticuerpo antineutrfilo citoplasmtico (ANCA); y 3) inflamacin mediada por clulas T. Los efectos patognicos de todos estos mecanismos se unen en una va final comn d e dao vascular que activa los mediadores humorales y celulares de la inflamacin. Las molculas de adhesin que estn involucradas en la respuesta inmune normal parecen intervenir en las respuestas inmunes patolgicas

CAPTULO 44

VASCULITIS

991

Tabla 44-1

Afecciones vasculares necrotizantes sistmicas secundarias

Tabla 44-3

Anticuerpos a s o c i a d o s con vasculitis Asociacin con e n f e r m e d a d Granulomatosis de Wegener Poliarteritis microscpica Prueba principal Mtodos IFM. ELISA IFM, ELISA

Vasculitis relacionada con medicamentos Vasculitis relacionada con protenas extraas Vasculitis asociada con infeccin Vasculitis en neoplasias malignas Granulomatosis linlomatoido Vasculitis urticarial hipocomplementmica Prpura hipergammaglobulinmica Vasculitis cnoglobulinmica Vasculitis por radiacin Vasculitis por trasplante (rechazo vascular) Vasculitis asociada a enfermedades del tejido conectivo Artritis reumatoide Lupus eritematoso sistmico Sndrome de Sjogren Esclerodermia Dermatomiositis/ polimiosilis Sarcoidosis Policondritis recidivante Sndrome del anticuerpo anlilosfolipido Enfermedad de Behcet
Adaptado de Langford CA, McCallum RM Idiophatic vasculitis. In Belch JJF Zurier RB (eds): Connective Tissue Diseases London. Chapman & Hall, 1995 pag 179. con permiso

Anticuerpo ANCA (generalmente c-ANCA) ANCA (c-ANCA o p-ANCA) Anticuerpos anli C1q

Vasculitis urticarial unin C1 q hipocomplementmica Anticuerpos antihepatilis B PAN asociado a hepatitis B ELISA Anticuerpos antinucleares Lupus eritematoso sistemico IFM. ELISA (ANA) Crioglobulmas mezcladas Vasculitis cnoglobulinmica Cnoprecipitacin, IEP.IF SSA (Flo). SSB (La) Sindrome de S|gren IFM. ELISA, ID Factor reumatoide Artritis reumatoide LA, ELISA
ANCA = autoanticuerpos antineulrMos citoplasmaticos; c-ANCA = ANCA otoplasmticos ELISA ensayo inmunosorbente ligado a enzimas: GBM membrana basal glomerular. ID = inmunodilusion, IEP = inmunoelectroforesis; IF = inmunofijacin IFM = microscopa de inmunoflorescencia indirecta; LA aglutinacin del ltex. p-ANCA = ANCA perinuclear; PAN = poliarteritis nodosa.

observadas en la vasculitis. Se observan anormalidades cuantitativas y cualitativas en la produccin de citocinas en la vasculitis sistmica. Se han descrito niveles aumentados de interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-6. factor a de necrosis tumoral (TNF-(x) y T N F J 5 (Arimura, 1993: Grau, 1998), asi como una produccin aumentada de TNF-u por las clulas mononucleares circulantes (Deguchi, 1990). Estos mediadores inician la infiltracin de clulas inflamatorias, la activacin del complemento y cascada de la coagulacin, y la regulacin ascendente de otras molculas inflamatorias (Conn, 1993: Niles. 1995: Snellen 1997).

mente, la confirmacin histolgica o angiogrfica de la vasculitis debera obtenerse de una biopsia de tejido o angiografia para el diagnstico definitivo previo a la terapia (Mandell. 1994). Las pruebas clnicas de laboratorio tienen un valor limitado en el establecimiento de un diagnstico especfico de la vasculitis (Mandell. 1994), aunque los clnicos usan estas pruebas como ayuda en la identificacin de los patrones de la implicacin del rgano caracterstico de la vasculitis, evaluando el alcance y la gravedad del dao en el rgano final, diferenciando la vasculitis idioptica de las formas alternativas secundarias y estableciendo los valores bsales para su tratamiento. La asociacin de ANCA con ciertas afecciones vasculares idiopticas se ha convertido en una importante ayuda en el diagnstico y tratamiento. Los ANCA se tratan con detalle a continuacin. Cuando se evala a un paciente cuyo diagnstico diferencial incluye vasculitis, resultan tiles los siguientes principios relativos al uso e interpretacin de las pruebas clnicas de laboratorio.

PERSPECTIVA SOBRE EL USO DE PRUEBAS CLNICAS DE LABORATORIO

Cuando se evalan pacientes con una enfermedad multisstmica complicada, el objetivo del clnico es el diagnstico correcto hasta un nivel que permita un tratamiento adecuado. Como no existe una clnica patognomnica ni rasgos de laboratorio de la vasculitis, el clnico debe utilizar combinaciones de hallazgos clnicos y de laboratorio para reconocer los patrones de la enfermedad. Esto puede permitir un diagnstico especfico o, ms comnmente, la clasificacin de la enfermedad del paciente como una dentro de un grupo de trastornos vasculticos con tratamiento similar, incluso cuando no se identifica ninguna entidad especfica. Decidir si un paciente tiene vasculitis basndose estrictamente en los sntomas clnicos conlleva riesgos debido al amplio nmero de posibilidades de diagnstico diferencial y la falta de hallazgos patognomnicos. Consecuente-

Pruebas de rutina
Los pacientes cuya historia y exploracin fsica sugieren vasculitis idioptica a menudo presentan una serie confusa de dolencias multisistmicas que han venido sucediendo durante algn tiempo. Las pruebas de primer orden que hay que considerar incluiran las siguientes: cultivos para agentes infecciosos, si el paciente tiene fiebre; recuento completo de sangre (CBC) con recuento diferencial; velocidad de sedimentacin globular (VSG); anlisis de orina: panel qumico de la sangre; y pruebas para la funcin de un rgano especfico, como el hgado.

Pruebas especiales
Las pruebas especiales ayudan a diferenciar la vasculitis idioptica de las alternativas en el diagnstico diferencial activo. Las pruebas relevantes d e laboratorio incluiran aquellas que identifican los auloanticuerpos circulantes que se enumeran en la Tabla 44-3 e inmunocomplejos. La biopsia tisular dirigida para la confirmacin histolgica de la vasculitis y/o la angiograla se consideran las pruebas definitivas para la vasculitis idioptica.

Tabla 44-2

Afecciones vasculares necrotizantes sistmicas idiopticas (primarias) Vasculitis de pequeos vasos Granulomatosis de Wegener Prpura do Henoch- Schnlem Angeitis primaria del sistema nervioso central Vascuhlis de vasos medianos Sndrome de Churg- Strauss Poliarteritis nodosa Enlermodad de Kawasaki Vasculitis de vasos grandes Arteritis de clulas gigantes (temporal) Arteritis de Takayasu

Algunos patrones de prueba en vasculitis

Son tiles ciertos patrones de resultados de pruebas clnicas de laboratorio: El hallazgo de leucopenia y/o trombocitopenia en afecciones vasculares idiopticas es raro y sugiere diagnsticos alternativos tales como lupus eritematoso sistmico (LES), neoplasia, alteraciones de la mdula sea, granulomatosis linfomatoide o hiperesplenismo (Mandell. 1994). VSG. aunque es un hallazgo no especfico, est tpicamente elevada en afecciones vasculares idiopticas. Si la VSG no est elevada antes del tra-

992

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

tamienlo, el diagnstico no es arteritis de clulas gigantes (temporal) o granulomatosis de Wegener (WG). Puede verse vasculitis con rasgos histolgicos de poliarteritis nodosa (PAN) asociada con pancitopenia en pacientes con leucemia de clulas peludas (Mandell, 1994). Anemia con hemoglobina por debajo de 9 g/dl se produce por circunstancias distintas que la anemia de la enfermedad crnica, tal como la hemolisis, el sangrado oculto o la enfermedad renal (Mandell, 1994). Cuando se sospecha PAN, deberan realizarse las pruebas para la funcin heptica, virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV) y citomegalovirus (CMV) (Golden, 1994; Mandell, 1994). De forma similar, son apropiadas las pruebas serolgicas para los virus de la hepatitis B y C cuando un paciente tiene crioglobulinas, vasculitis leucocitoclstica o biopsia cutnea y / o enfermedad renal.
1 1

Creatina-cinasa (CK) en sangre elevada puede indicar miositis o isquemia muscular (Mandell, 1994). Las pruebas para los anticuerpos antinucleares (ANA) y el factor reumatoide (FR) son tiles slo cuando se sospecha enfermedad del tejido conectivo o artritis. Pacientes con vasculitis reumatoide tienen un alto ttulo de FR. L a eosinofilia en sangre perifrica se produce en una amplia variedad de alteraciones inflamatorias. Alrededor del 15% al 20% de los pacientes con PAN o WG pueden tener eosinofilia pero no con los altos niveles vistos en el sndrome de Churg- Strauss (CSS). La identificacin de ANCA citoplasmtico (c-ANCA) apoya el diagnstico de WG en pacientes con hallazgos clnicos de WG (Mandell, 1994). Pacientes con WG no tratados no tienen leucopenia En la primera orina de la maana, tanto antes como despus de la centrifugacin, se deberan examinar cuidadosamente las protenas, hematuria, clulas y cilindros que acompaan a la glomerulonefritis que se puede producir en las afecciones vasculares. Si la amiloidosis renal est en el diagnstico diferencial, existe de forma tpica proteinuria sin clulas.

Figura 44-1. Patrn de anticuerpo citoplasmtico antineutrfilo citoplasmtico (c- ANCA). La mayora de los neutrfilos fijados con etanol m u e s t r a n una fluorescencia citoplasmtica finamente granular con acentuacin central No hay tincin nuclear (x 400).

ANTICUERPOS ANTINEUTROFILOS CITOPLASMATICOS

Los ANCA reaccionan con antgenos neutrfilos citoplasmticos (Jennette, 1993). La identificacin de ANCA se ha convertido en un importante accesorio para el diagnstico de la vasculitis sistmica necrotizante (Niles, 1993). En los ltimos aos, ha habido tambin un gran inters en cmo ANCA puede ser importante en la patognesis de WG y otras afecciones vasculares sistmicas (Jennette, 1993,1994).

demuestran tincin citoplasmtica y 3) no especificidad por los neutrfilos (p. ej., los linfocitos en el portaobjetos no deberan teir cuando el verdadero ANCA est presente) y 4) granularidad citoplsmica heterognea (Roberts, 1992; Saviage, 1998). El p-ANCA se caracteriza por la tincin del rea perinuclear (Fig. 44-2). aunque la tincin nuclear mimetizando ANA puede producirse cuando existen ttulos altos de este autoanticuerpo (Niles, 1993). El patrn de tincin perinuclear que define p-ANCA est causado por la redistribucin de los antigenos diana desde el citoplasma neutrfilo hasta la regin nuclear cuando se usa etanol para preparar neutrfilos humanos como sustrato (Jennette, 1993). Cuando se utiliza formalina antes que alcohol para fijar neutrfilos. el antigeno diana se inmoviliza, y el patrn de tincin inmunofluorescente entonces es citoplasmtico (Jennette, 1993). El papel del uso de neutrfilos fijados con formalina para detectar ANCA en la labor diagnstica de rutina sigue siendo una controversia (Chowdhury, 1999).

Especificidad antignica
La especificidad antignica de c- ANCA se ha identificado como una sern proteasa nuclear de 29 kDa, proteinasa 3 (PR-3), situada dentro de granulos primarios de neutrfilos y lisosomas de monocitos (Niles, 1993; Roberts, 1992). El p-ANCA en vasculitis se debe generalmente a anticuerpos frente a mieloperoxidasa MPO-ANCA) (Falk, 1988). De manera interesante, muchos p-ANCA no se dirigen hacia MPO pero bastantes se dirigen a otros

Mtodos de deteccin
Existen varios mtodos de laboratorio incluyendo la microscopa de fluorescencia indirecta (IFM), enzimoinmunoanlisis (ELISA), radioinmunoanlisis. transferencia western. transferencia en marcha, citometria de flujo e inmunoprecipitacin que se han utilizado para detectar ANCA (Roberts. 1992; Wieslander, 1991). IFM y ELISA son los mtodos de prueba usados ms comnmente con este fin. El IFM es el mtodo ms sensible para la deteccin de ANCA. IFM se realiza utilizando neutrfilos humanos normales aislados como sustrato. Estos neutrfilos son citocentrifugados frente a portaobjetos de cristal multiperforado, fijados con un 99% de etanol, y despus incubados con diluciones de sueros de pacientes. Los neutrfilos tambin pueden sujetarse a los portaobjetos por adherencia, frotis o tcnicas de gota (Roberts, 1992, 1990). Los portaobjetos son teidos con un conjugado de inmunoglobulina (Ig) poliespecfica marcada con fluorescena; el conjugado poliespecfico se recomienda porque se producen IgM e IgA c-ANCA (Roberts, 1992). Los portaobjetos se leen en un microscopio de fluorescencia. Usando IFM. hay dos patrones principales de tincin de neutrfilos; c-ANCA y ANCA perinuclear (p-ANCA). El c- ANCA se caracteriza por una tincin finamente granular de citoplasma neutrfilo con una acentuacin central entre los lbulos nucleares; el ncleo por s mismo no lie (Fig 44-1). Los criterios tiles para diferenciar c- ANCA de tinciones citoplasmticas no especficas debidas a otros autoanticuerpos incluyen los siguientes: 1) ausencia de acentuacin central; 2) menos del 95% de los neutrfilos

Figura 44-2. Patrn de anticuerpo antineutrlilo citoplsmico perinuclear (p-ANCA). La mayora de los neutrfilos fijados con etanol muestran fluorescencia perinuclear y nuclear sin tincin citoplasmtica ( x 400).

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VASCULITIS

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enzimas ciloplasmticos neutrfilos incluyendo elaslasa, laclolernna. lactoperoxidasa, lisozma, azurocidma o catepsma G (Hoffman. 1998: Jennette. 1993; Niles. 1993). Los ELISA para detectar autoanticuerpos (rente a PR-3 (PR-3-ANCA) muestran una buena correlacin con la presencia de c-ANCA cuando observadores experimentados realizan IFM (Niles. 1993; Robeds, 1992). Un ELISA para detectar PR-3 ANCA debe ser validado cuidadosamente, lijndose de modo especial en el uso de tcnicas conocidas en la preparacin del antgeno en fase slida y utilizando un control tanto de los pasos previos como de pasos especficos en la absorcin para enlaces no especficos de inmunoglobulina a la fase slida (Niles, 1993; Roberts, 1992: Wang, 1997). En Europa se han hecho esfuerzos para estandarizar ELISA en fase slida (Hagen, 1996,1998). Existen en el mercado disponibles ELISA autorizados tanto para PR-3 como para MPO. La mayora utilizan un recubrimiento de antigeno estndar directo de placas microperforadas de poliestireno para que la pureza del antgeno sea de vital importancia en la definicin de la sensibilidad y especificidad analtica (Niles. 1993; Roberts, 1992). Son importantes los intentos para conservar la conformacin del antigeno natural, ya que los ANCA frente a PR3 estn dirigidos contra los epitopos conformacionales (Hoffman, 1998). La correlacin entre p-ANCA y la deteccin de mieloperoxida en ELISA, sin embargo, no es buena (Roberts, 1992). Varios autoanticuerpos incluyendo ANA, elastasa antineutrfila o ANA granulocito-especificos (GS-ANA) pueden producir un patrn p-ANCA en IFM. As los sueros que producen fluorescencia nuclear en IFM requieren una prueba adicional para confirmar MPO-ANCA. MPO-ELISA se recomienda para confirmar la especificidad anti -MPO porque se sabe que los verdaderos ANA o GS-ANA y MPOANCA se producen simultneamente. IFM usando clulas Hep-2 no hace esta distincin adecuadamente porque ANA y MPO-ANCA pueden producirse juntos, y GS-ANA puede ser negativo en clulas Hep-2 (Robeds. 1992; Specks. 1994). ELISA tiene limitaciones por lo que. por ltimo, cada laboratorio debe verificar cuidadosamente las informaciones de un fabricante para que el clnico pueda recibir informacin sobre las caractersticas de la realizacin Esto adquiere especial importancia en las situaciones clnicas confusas donde puede haber discrepancias entre la presentacin clnica y los resultados de laboratorio y/o resultados discordantes entre IFM y pruebas ELISA.

antigeno diana en la enfermedad inflamatoria intestinal no se han definido plenamente, aunque se han descrito autoanticuerpos contra lactoperoxidasa. proteina bactericida del aumento de la permeabilidad (Hoffman. 1998), lactoferrina (Peen. 1993) o catepsina G (Jennette, 1993).

Otras

enfermedades

Los ANCA tambin se han descrito en otras enfermedades incluyendo lupus eritematoso inducido por medicamentos, LES. sndrome de Felty y artritis reumatoide. sndrome de Sigren, polimiositis y dermatomiositis. artritis reumatoide juvenil, artritis reactiva, policondritis recidivante, sndrome del anticuerpo antifosfolipido. sndromes mielodisplsicos. virus de inmunodeliciencia humana (VIH), cromomicosis, amebiasis invasiva, endocarditis subaguda bacteriana, fibrosis quslica y ciertas neoplasias (Choi, 2000; Hoffman. 1998; Jennette, 1993: Peter. 1993). En las alteraciones del tejido conectivo, los ANA que mimetizan p-ANCA deben ser excluidos Muchos pacientes tratados con hidralazina parecen desarrollar MPO-ANCA (Roberts. 1992). Vasculitis asociada a propiltiouracilo se ha asociado con ANCA positivo (Hoffman, 1998).

Interpretacin de la prueba
La interpretacin de las pruebas de ANCA debera considerar vanos factores (Hagen. 1998; Hoffman. 1998: Vassilopoulos.1999): Las pruebas ANCA no deberan utilizarse como pruebas de deteccin sistemtica en grupos de pacientes no seleccionados donde la prevalencia de vasculitis es baja (Langford. 1998). Las pruebas de ANCA son ms valiosas cuando se ordenan selectivamente en situaciones clnicas donde alguna torma de vasculitis asociada a ANCA sea una posibilidad seria. El patrn de inmunofluorescencia c-ANCA deberia confirmarse usando PR3 ELISA (Savige. 1999). La reactividad anti- PR3 se ve ms a menudo en WG activo o P A N pero puede verse en glomerulonefritis idioptica progresiva o CSS. c-ANCA en WG se considera altamente sensible al sealar la enfermedad sistmica activa (67% a 97%) segn Vassilopoulos y Hoffman (1999). El valor predictivo de un ttulo aumentado de c-ANCA como presagio de una recidiva de WG est controvertido, pues no todas las elevaciones en el titulo de c-ANCA se siguen de un empeoramiento de WG (Specks, 1994). El patrn p-ANCA en IFM no es especfico desde el punto de vista diagnstico. Los sueros p-ANCA positivos deberan probarse con ELISA para MPOANCA (Savige, 1999) MPO-ANCA se ve ms a menudo en PAN, glomerulonefritis idioptica progresiva o CSS; sin embargo, puede verse en WG. Ni un diagnstico de la vasculitis sistmica necrotizante ni una decisin para tratar debera basarse slo en un resultado de la prueba ANCA positivo. Un ANCA negativo no debera usarse para excluir la enfermedad Los autores consideran un c-ANCA positivo como posible WG y una seal para una evaluacin ms exhaustiva. Por ltimo, la interpretacin de una prueba para ANCA depende de la filosofa y experiencia de los clnicos individuales que tratan las vasculitis (Jennette, 1998).

Asociaciones con enfermedad Vasculitis

Tanto PR-3 ANCA (c-ANCA) como MPO-ANCA (p-ANCA) estn asociados con WG, PAN incluyendo poliarteritis microscpica. CSS, glomerulonefritis idioptica necrotizante pauciinmune y progresiva y sndromes de superposicin de poliangitis (Cohn, 1991; Niles, 1993). PR-3-ANCA se identifica en alrededor del 90% de los pacientes con WG activa mientras que MPO-ANCA se identifica en menos del 10% de estos pacientes. El ochenta por ciento de los pacientes con poliarteritis microscpica activa tienen o PR3-ANCA o MPO-ANCA ms o menos con la misma frecuencia. MPO-ANCA se identifica en pacientes con CSS o glomerulonefritis pauciinmune en el 70% al 80% de pacientes con enfermedad activa; raramente, este ltimo grupo de enfermedades puede asociarse con PR-3-ANCA antes que con MPO-ANCA. Se ha descrito la coexistencia de ANCA y anticuerpos antiglomerulares de la membrana basal (anti- GBM) (Niles, 1993; Bonsib. 1993).

Enfermedad inflamatoria de los tractos gastrointestinal y hepatobiliar

Se han publicado vanos artculos sobre la asociacin de ANCA con enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal (Gl) y hepatobiliar (Jennette, 1993). Los p-ANCA se han descrito en aproximadamente el 75%-80% de los pacientes con colitis ulcerosa activa o colangitis esclerosante primaria (Ellerbroek. 1994; Klein, 1991: Lo, 1993), alrededor del 75% de los pacientes con hepatitis crnica activa; alrededor del 30% de los pacientes con cirrosis biliar primaria (Kallenberg. 1992: Mulder. 1993) y el 20% de los pacientes con enfermedad de Crohn (Jennette, 1993: Roberts, 1992). Las especificidades del

RESUMEN DE LOS PRINCIPALES SNDROMES VASCULTICOS IDIOPTICOS Poliarteritis nodosa Epidemiologa

PAN. como todas las afecciones vasculares, es una enfermedad poco comn. Las estimaciones de la prevalencia de PAN han vanado desde 4.6 por 1.000.000 en Inglaterra, hasta 9.0 por 1.000.000 en el Condado de Olmstead. en Minnesota, y hasta 77 por 100.000 en una poblacin de esqu-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA nes significativas por la medicacin en si. La ciclofosfamida puede utilizarse para pacientes con PAN grave (afectacin Gl, cardaca y del sistema nervioso central [SCN]), aquellos en los que fracasan los corticoides solos, y para restringir esteroides en pacientes que presentan efectos adversos significativos a estos (Langford, 1995). El pronostico para pacientes con PAN ha mejorado en gran medida con el uso de glucocorticoides. atendiendo la media de supervivencia de cinco aos del 13% al 50% y al 60%. L a mayora de los fallecimientos se producen durante el primer ao, pero ya sea antes o despus de un ao de enfermedad, la mortalidad se produce sobre todo o por infeccin o por complicacin del tratamiento o por secuelas de la obliteracin del vaso, como el infarto de miocardio o idus (Langlord. 1995).

males de Alaska hiperendmica para hepatitis B (Langford. 1995: Conn, 1993). PAN puede producirse en cualquier gnero y a cualquier edad, pero es ms comn en hombres (relacin varones/hembras = 2:1) entre 40 y 60 aos de edad (Langtord. 1995). No se ha observado predileccin racial (Conn.1993).

Rasgos clnicos
PAN es una vasculilis sistmica necrotizante que afecta predominantemente a arterias de pequeo a mediano calibre. Las manifestaciones clnicas de la PAN clsica son muy variables. Los pacientes a menudo presentan sntomas no especficos como fiebre, prdida de peso y malestar. La hipertensin es habitual y puede ser una importante clave diagnstica. Aunque la PAN puede producirse prcticamente en cualquier rgano, la afectacin sintomtica de la piel, articulaciones, nervios perifricos, tracto Gl y rones normalmente dominan el cuadro clnico (Conn, 1993). Las pruebas que indican una funcin heptica anormal sugieren la posibilidad de una infeccin por hepatitis B concurrente (Langford. 1995). La afectacin pulmonar en la PAN clsica es rara e incluso controvertida. Aunque algunos investigadores piensan que la PAN pulmonar se produce (Lie, 1989), otros creen que estos pacientes tienen CSS o WG, donde la enfermedad pulmonar es habitual (Langford, 1995: Fauci, 1998). La evolucin de la PAN se caracteriza por remisiones, recidivas y, si no se trata, alia mortalidad (Fauc, 1998).

Variantes de PAN
Dos importantes variantes de la PAN son la PAN cutnea y la PAN asociada con hepatitis B. La PAN cutnea es una vasculitis necrotizante de las arterias pequeas musculares en el tejido subcutneo. Por definicin, este es un proceso localizado que no afecta a arterias viscerales y por consiguiente, no es una vasculitis sistmica. El diagnstico se establece por hallazgos histolgicos caracteristicos en biopsia de piel con una evaluacin sistmica negativa. Las lesiones cutneas histolgicamente idnticas pueden verse en la PAN sistmica; por lo tanto la PAN cutnea puede considerarse un diagnstico de exclusin. Como regla, la PAN cutnea sigue un curso benigno, no progresa a enfermedad sistmica y tiene un excelente pronstico a largo plazo (Langford, 1995). La positividad del antigeno de superficie de la hepatitis B se ha encontrado en hasta un 54% de los pacientes con PAN. Hay indicios que indican que la hepatitis C tambin se asocia con PAN, aunque actualmente se conoce poco del espectro clnico de la enfermedad. La identificacin del intervalo entre la infeccin con hepatitis B y el establecimiento de la PAN ha variado desde meses hasta aos, en parte porque los pacientes tienen frecuentemente hepatitis B subclnica, sin diagnosticar, hasta que se diagnostica la hepatitis B asociada a PAN. Sin embargo, no se ha reseado ninguna asociacin entre la actividad inflamatoria en el hgado y la vasculitis. Los pacientes con hepatitis B asociada a PAN tienen una mayor incidencia de pruebas de funcin heptica elevadas y aneurismas que aquellos con PAN no relacionada con hepatitis pero por otra parte son clnicamente similares. Desgraciadamente, la presencia de hepatitis B complica el tratamiento inmunosupresor, porque la replicacin viral puede dar lugar a un riesgo aumentado de la enfermedad heptica progresiva durante el tratamiento e incluso la hepatitis tulminante cuando cesa la inmunosupresin. A pesar de estas cuestiones, la terapia corlicoidea es importante, ya que los pacientes con PAN asociada a hepatitis B no tratada tienen una alta tasa de mortalidad. La terapia antiviral con intertern-a debera utilizarse en todos los pacientes con PAN asociada a hepatitis B (Guillevin, 1997). El intercambio de plasma puede ayudar a eliminar inmunocomplejos y mejorar el tratamiento de algunos pacientes con PAN asociada a hepatitis B (Langford, 1995: Guillevin, 1997).

Hallazgos clnicos de laboratorio

Los resultados de las pruebas clnicas de laboratorio, aunque no especficas diagnsticamente, refleja la naturaleza sistmica inflamatoria de la PAN. Tpicamente, se encuentra una anemia normocrmica, leucocitosis neutroflica. hipoalbuminema. hipergammaglobulinemia y una VSG marcadamente elevada. La medida de la creatinina srica y el nitrgeno de urea en sangre (BUN) junto con un anlisis de onna para controlar la proteinuria. hematuria y sedimento anormal son importantes para evaluar la funcin renal normal. El ANA positivo o FR encontrado en el 1 0 % al 40% de estos pacientes puede estar asociado con niveles disminuidos de componentes de complemento C3 y C4. En todos los pacientes con PAN deberan obtenerse pruebas serolgicas para el antigeno de superficie y anticuerpo de la hepatitis B (Langford. 1995; Conn. 1993). Con poca frecuencia se ve eosinofilia en sangre perifrica y, cuando est presente en altos niveles, esto debera conducir a considerar un CSS (Fauci, 1998).

Diagnstico
La PAN puede ser difcil de diagnosticar, por su presentacin no especfica, el potencial para la afectacin de diversos rganos de forma difusa, y la baja prevalencia. Sin embargo, una vez que se sospecha, el diagnstico de PAN se basa en la angiografa y/o la demostracin histolgica de PAN en la biopsia tisular de la(s) zona(s) sinlomtica(s), como msculo, nervio, rion y testculos. Patolgicamente, la PAN es una arterits necrotizante focal pero panmural de arterias musculares de pequeo y mediano tamao, que preferentemente se produce en los puntos de ramificacin de los vasos. La inflamacin necrotizante de clula mixta con necrosis fbrinoide, circunferencial o segmentaria en la pared del vaso, es la lesin que marca una PAN activa. La dilatacin aneurismtica o microaneurismtica tambin son caractersticas de la fase aguda de la PAN. El proceso inflamatorio se cura con librosis que puede conducir a una endarteritis proliferativa. Un rasgo caracterstico de la PAN es una mezcla de lesiones activas y/o lesiones en curacin adyacentes a segmentos normales de vasos sanguneos (Langford, 1995). La angiografa puede ser especialmente valiosa para identificar anormalidades Gl o cuando una posible biopsia de una zona sea inasequible. En particular, se debera considerar una angiografa antes de intentar una biopsia heptica o renal cerrada con aguja en pacientes con sospecha de PAN, debido a la predileccin por aneurismas en estos lugares que aumenta el riesgo de sangrado grave (Langford. 1995).

Sndrome de Churg-Strauss Epidemiologa

Se piensa que CSS es una condicin clnica rara; no hay datos epidemiolgicos amplios disponibles (Conn, 1993). El CSS comienza tpicamente entre las edades de 15 y 69 aos, siendo los 38 aos la media de edad para el establecimiento de la vasculilis (Langford. 1995).

Rasgos clnicos
El CSS. tambin llamada angetis alrgica y granulomatoss, es una vasculitis necrotizante sistmica caracterizada por una inflamacin granulomalosa vascular y extravascular, afectacin mltiple de rganos, y asociaciones con rinitis alrgica, asma grave e hipereosinofilia (Fauci, 1998; Langford, 1995). Las manifestaciones clnicas de CSS pueden recordar a las de la PAN en muchos aspectos pero difieren en que la enfermedad pulmonar es tpica y

Tratamiento y pronstico
Los pacientes con PAN se tratan con glucocorticoides. El objetivo del tratamiento con glucocorticoides es el control de la enfermedad sin complicacio-

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VASCULITIS

995

la enfermedad renal es poco comn, generalmente menos grave en CSS que en PAN (Fauc, 1998). El curso clnico de CSS a menudo se divide en tres lases distintas, aunque en realidad, estas tres lases no siempre se identifican o pueden superponerse (Langford, 1995): 1) una fase prodrmica caracterizada por enfermedad respiratoria alrgica; 2) una fase eosinoflica caracterizada por hipereosmolilia en sangre perifrica y tejido: y 3) una fase vascultica. La afectacin cardaca, bien carditis eosinoflica transmural o vasculitis coronaria, se produce en el 25% al 62% de los pacientes con CSS y es la principal causa de muerte (Langford. 1995).

entre el establecimiento del asma y el establecimiento de la vasculitis se considera un signo pronstico desfavorable.

Sndrome mixto de poliangetis

El sndrome mixto de poliangetis se produce en un grupo heterogneo de pacientes que. por definicin, tienen una vasculitis sistmica necrotizante pero no manifiestan la enfermedad de forma que se siten claramente dentro de una categora especfica de diagnstico. Los pacientes con el sndrome mixto de poliangetis pueden tener los rasgos combinados d e varias enfermedades vasculticas, signos patolgicos mezclados de modo similar, o sntomas atpicos que no encajan con una enfermedad/sndrome especifico (Langford, 1995). El sndrome mixto de poliangetis tiene la capacidad de afectar a mltiples sistemas de rganos. Aunque el pronstico para el sndrome mixto de poliangetis no est establecido, existe la posibilidad de dao visceral serio y enfermedad potencialmente mortal. Tanto desde el punto de vista diagnstico como teraputico, estos pacientes deberan tratarse como s tuvieran un sndrome vascultico bien definido. Una historia cuidadosa, u n a exploracin fsica y una evaluacin de laboratorio deberan permitir definir el alcance de su afectacin sistmica. El diagnstico del sndrome mixto de poliangetis debera demostrarse mediante biopsia o angiografa. Una vez que se ha descubierto la presencia de una vasculitis sistmica necrotizante. y se han descartardo otros diagnsticos, especficamente la infeccin, el tratamiento debera iniciarse con corticoides y considerar el uso de agentes inmunosupresores adicionales, como la ciclofoslamida (Langford, 1995).

Hallazgos clnicos de laboratorio

Un signo caracterstico del CSS es la notable eosinofilia en sangre perifonea, que puede verse en cualquier fase de la enfermedad. El recuento de eosinfilos en sangre perifrica alcanza los 1.000 eosinfilos por microlitro en el 80% o ms de los pacientes con CSS (Conn, 1993); sin embargo, la eosinofilia no puede encontrarse en todos los pacientes debido a los previos tratamientos con esferoides para el asma o a la amplia y rpida fluctuacin que se puede producir en el recuento de eosinfilos en esta enfermedad. La normalizacin del recuento de eosinfilos en respuesta al tratamiento con esteroides es un rasgo de CSS. distinguindolo del sndrome hipereosinoflico en el cual la eosinofilia puede ser resistente a corticoides El grado de eosinofilia puede relacionarse con la actividad de la enfermedad vascultica en algunos pacientes. Otros hallazgos de laboratorio en CSS son no especficos. La anemia, leucocitosis y aumento de la VSG frecuentemente acompaan a la enfermedad vascultica. Los niveles de IgE en suero pueden estar elevados. El FR en suero puede ser identificado, pero el titulo es generalmente bajo. El complemento en suero est descrito como normal (Conn. 1993). A diferencia de la PAN, no se ha descrito ninguna asociacin entre CSS y hepatitis B (Langford, 1995).

Granuiomatosis de Wegener Epidemiologa

No existe una incidencia anual detallada disponible ni datos de prevalencia para WG, pero se estima que WG es menos comn que PAN. La WG se produce en personas de cualquier edad, raza o sexo, aunque se manifiesta predominantemente en caucasianos y tiene un cierto predominio en los varones (Conn, 1993). La edad media de comienzo son los 41 aos (Langford, 1995).

Diagnstico
Histricamente, el diagnstico de CSS se realiza exclusivamente con la demostracin histolgica de la vasculitis eosinoflica necrotizante. infiltracin eosinoflica del tejido, y granuloma extravascular. En la prctica, sin embargo, pocas muestras de biopsia contienen todos estos hallazgos. Para aumentar la probabilidad de la identificacin y el diagnstico de CSS. se puede dar menos importancia a estos indicadores clnicos e incluir rasgos clnicos. Un estudio ha recomendado los siguientes criterios: 1. Asma 2. Eosinofilia de sangre perifrica por encima de 1 , 5 x1 o clulas u7l 3. Vasculitis sislmica incluyendo dos o ms rganos extrapulmonares (Conn, 1993)
3

Rasgos clnicos
WG es un sndrome clnicopatolgico de naturaleza desconocida caracterizado patolgicamente por una inflamacin granulomatosa necrotizante d e los tractos respiratorios superior e inferior, glomerulonefritis focal segmentaria, y una vasculitis necrotizante que afecta predominantemenle a las arterias medianas y pequeas. La WG se manifiesta en las regiones de oido/narz/garganla con sinusitis, obstruccin nasal o ulceracin, otitis media o prdida de audicin (Fauci. 1998: Lie. 1989). El cuarenta y cinco por ciento de los pacientes con WG tienen afectacin pulmonar al principio, y el 85% manifiestan una enfermedad pulmonar en algn momento durante el curso de su enfermedad. Las manifestaciones habituales del pulmn incluyen infiltrados pulmonares, nodulos pulmonares, hemoptisis o pleuritis (Fauc, 1998). Aunque slo alrededor del 18% de estos pacientes sufren inicialmente fallo renal, el 80% manifiestan glomerulonefritis en algn momento en el curso de WG (Fauc. 1998). Otros signos habituales de la enfermedad sistmica incluyen exantema cutneo, artralgias. liebre, manileslaciones oculares y prdida de peso (Fauc. 1998: Lie. 1989). Aunque se han descrito pacientes con WG limitado al tracto respiratorio sin afectacin renal ("WG limitado"), por encima del 50% de los pacientes con esta enfermedad al inicio desarrollan con el tiempo una enfermedad ms generalizada (Langford, 1995).

El diagnstico delinitivo todava requiere la demostracin de la vasculitis comprobada con biopsia. Una biopsia abierta de pulmn frecuentemente no confirma todos los rasgos histolgicos de CSS pero debe considerarse antes del establecimiento de la terapia, si se teme una posible infeccin. Cuando los sntomas clnicos as lo indican, las muestras de biopsia tiles se obtienen la mayora de msculo, nervio safeno, prstata y rion. El diagnstico diferencial de CSS incluye PAN, WG y el sndrome hipereosinoflico (Langford. 1995).

Tratamiento y pronstico
Los corticoides son la base del tratamiento de CSS. La utilidad de la lerapia mmunosupresora con azalioprina y ciclofosfamida no est bien estudiada (Langford. 1995). El diagnstico precoz de CSS y corticoides ha llevado a estos pacientes a tener una tasa de supervivencia de cinco aos del 62%. La insuficiencia cardiaca congestiva y el infarto de miocardio causan el 48% de todas las muertes en CSS. La hemorragia cerebral, fallo renal, perforacin o hemorragia Gl. estado asmtico e insuficiencia respiratoria tambin causan fallecimiento de los pacientes con CSS. Todos estos rasgos deberan llevar a considerar el uso de una terapia con un agente citotxico (ciclofosfamida) en combinacin con corticoides (Langlord. 1977). La poca duracn del intervalo

Hallazgos clnicos de laboratorio

Los hallazgos clnicos de laboratorio tpicos de WG incluyen leucocitosis moderada sin eosinofilia acusada, anemia normocrmica leve y trombocitosis (Conn. 1993. Langford, 1995). No se ha observado leucopenia en los pacientes no tratados y, asi, esto ayuda a distinguir WG de otros trastornos. La presencia de c-ANCA apoya el diagnstico. Los inmunocomplejos circulantes, determinados por enlaces Clq. se pueden encontrar junto con niveles normales de complemento e hipergammaglobulinemia: a menudo estn elevadas las cantidades de subclase IgA (Conn, 1993; Langford. 1995). Los indicado-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

res de afectacin glomerular incluyen hematuria microscpica o gruesa, proteinuria, cilindros de hemates y/o creatinina srica elevada y BUN. Ms del 50% de estos pacientes son FR positivos, pero los ANA estn generalmente ausentes (Fauci, 1998; Langford, 1995). Las pruebas serolgicas para autoanticuerpos anti-GBM son negativos. Previo al tratamiento, el 80% de estos pacientes presentan una VSG elevada.

pulmones, donde clnicamente imita a la WG. Sin embargo, los hallazgos histolgicos caractersticos incluyen la infiltracin marcada de vasos sanguneos ("angiocnlrica") y la destruccin imitando a la vasculitis, pero la morfologa celular es ms sugerente de linfoma o alteracin linfoproliferativa (Langford, 1995). No hay pruebas clnicas de laboratorio especificas.

Diagnstico
Aunque los hallazgos clnicos y de laboratorio pueden ser sugerentes. el diagnstico de WG debera hacerse solo con una biopsia probada, confirmacin histolgica o cuando se h a comprobado la existencia de c-ANCA en el paciente con sinusitis, infiltrado pulmonar o nodulo y glomerulonelrilis (Langford, 1998). El tejido pulmonar obtenido mediante biopsia abierta de pulmn olrece la mejor oportunidad para hacer un diagnstico certero (Langford, 1995). La biopsia transbronquial no proporciona el tejido adecuado para el diagnstico ms del 90% del tiempo. Aunque el tejido de cabeza y cuello es directamente ms accesible, los rasgos patolgicos caractersticos se encuentran en menos del 23% de estas muestras de biopsas El tejido til desde el punto de vista diagnstico de cabeza y cuello que mejor se obtiene, segn orden decreciente de frecuencia, es el de los senos paranasals, tejido nasal y regin subgltica. Los cambios glomerulares en el tejido de la biopsia renal, aunque sugerentes de WG, son raramente diagnsticos (Langford, 1995). Aunque el espectro morfolgico de WG es amplio, el marco de la lesin patolgica en WG es la vasculitis granulomatosa y necrolizante. Los vasos afectados experimentan necrosis fibrmoide con infiltracin precoz por leucocitos polimorfonucleares seguidos de clulas mononucleares. El tejido pulmonar puede revelar cualquier combinacin de necrosis, vasculitis, e inflamacin granulomatosa. aunque las muestras de biopsia no incluyen lodos estos rasgos caractersticos. El hallazgo ms habitual en la biopsia renal es la glomerulonefritis necrotizante segmentaria presente en diversos grados en el 80% de las muestras. La vasculitis renal no relacionada con el glomrulo es poco comn y est presente slo en el 8% de las biopsas. Muchas alteraciones pueden imitar la WG, incluyendo las enfermedades granulomatosas infecciosas o no infecciosas. CSS. sndrome de Goodpasture, granuloma idioptico de media linea, granulomatosis Imfomatoide y neoplasias de las vas respiratorias altas o pulmones (Fauci, 1998). De estos, la infeccin es una consideracin importante, ya que un diagnstico errneo puede tener fatales consecuencias cuando se trata de forma equivoca con terapia inmunosupresora (Langford, 1995).

Prpura de Henoch-Schnlein Epidemiologa

La prpura de Henoch-Schnlein (HSP) se produce principalmente e n nios de edades comprendidas entre los 4 y los 1 1 aos (Conn. 1993) pero tambin aleda a algunos adultos. La HSP se presenta ms habitualmente e n primavera y generalmente sigue a una infeccin de las vas respiratorias superiores (Conn. 1993). La HSP tiene un predominio en los varones de 3:2 (Langford, 1995).

Rasgos clnicos
La HSP. llamada a veces prpura anafiladoide. es una vasculitis sistmica de pequeos vasos clasificada como un subgrupo de la vasculitis de hipersensibilidad. No se conoce la etiologa de HSP. Los hallazgos clnicos tpicos en HSP incluyen prpura palpable no trombocitopnica, artralgias, lesin renal y anormalidades del tracto Gl (Langford. 1995). El 70% de los pacientes con HSP manifiestan signos y sntomas gastrointestinales incluyendo dolor abdominal espasmdico asociado con nauseas y vmitos, sangre o moco en heces, hemorragia Gl potencialmente mortal, e invaginacin (Langford. 1995). La enfermedad renal asociada se caracteriza por glomerulonefritis focal proliferativa que tiene una expresin clnica variable que va desde la hematuria aislada con cilindros de hemates, hasta insuficiencia renal aguda, y Iracaso renal crnico raro (Fauci. 1998; Langford, 1995; Lie, 1989).

Hallazgos clnicos de laboratorio

Los estudios clnicos de laboratorio en HSP son no especficos y resultan especialmente tiles para excluir otras alteraciones y buscar evidencia de afectacin renal. Se pueden observar leucocitosis y VSG elevada. Las pruebas de CBC con recuento de plaquetas y de coagulacin son importantes en la evaluacin de prpura cutnea; en HSP. las prpuras no son de trombocitopenia. Deberan realizarse coprocultivos intermitentemente para buscar evidencia de prdidas de sangre oculta. Los niveles de complemento en suero generalmente son normales, aunque se ha descrito una asociacin entre HSP y la ausencia congenita del componente del complemento C2 (Conn, 1993). Se deberan realizar anlisis de orina y medidas de creatinina en suero al comienzo de la enfermedad y dos veces a la semana hasta que los signos sislmicos hayan cesado (Langford, 1995).

Tratamiento y pronstico
Un rgimen de ciclofosfamda oral diaria y corticoides es la terapia de eleccin para la WG. Utilizando este rgimen, el Instituto Nacional de la Salud public el logro de una marcada mejora o remisin parcial en el 91% de los pacientes, con remisin completa en el 75%. Se observ una tasa de mortalidad global del 20%, el 13% de la cual podra atribuirse de forma completa o parcial a la WG. A pesar de esta marcada mejora en la supervivencia y la remisin comparada con el 100% de mortalidad en los pacientes no tratados, se observaron recidivas y morbilidad tanto de la enfermedad como del tratamiento. La mitad de las remisiones completas fueron seguidas de una o ms recidivas, que se produjeron entre tres meses y 16 aos despus de alcanzarse la remisin (Langford. 1995) El metotrexato es una alternativa a la ciclofosfamda en pacientes que no sufren de enfermedades en las que peligra la vida (Langford, 1997). Durante el primer ao de WG. el alcance de la enfermedad renal es el factor ms estrechamente relacionado con el pronstico. Despus, la afectacin del pulmn se convierte en el indicador de pronstico ms importante, y la glomerulonefritis no parece afectar significativamente al pronstico.

Diagnstico
La dificultad para diagnosticar HSP es rara, excepto cuando la afectacin de otros lugares principales precede a la aparicin de prpura palpable. A diferencia de otras vasculitis necrolizantes, el diagnstico es clnico, con estudios de laboratorio que se utilizan para excluir otras alteraciones. La biopsia renal, que demuestra glomerulonefritis proliferativa, no es propiamente necesaria para el diagnstico, aunque se utiliza para valorar la gravedad de la enfermedad y estimar el pronslico Las alteraciones que se han de considerar en el diagnstico diferencial de HSP incluyen cualquiera que cause abdomen agudo, nefritis o prpura (Langford, 1995).

Tratamiento y pronstico Granulomatosis linfomatoide

La granulomatosis linfomatoide (GL) est considerada como una alteracin linfoproliferativa poco habitual que puede evolucionar a un linfoma maligno en aproximadamente el 50% de los pacientes. La GL afecta pnncipalmente a los El tratamiento de HSP es de sostn y no existe un tratamiento especifico de beneficio probado para la nefritis de HSP. Aunque los glucocorticoides pueden ser tiles para disminuir el edema, el dolor de articulaciones y el malestar abdominal, la terapia de mantenimiento c o n glucocorticoides no es beneficiosa, ya que no disminuye el nesgo de enfermedad recurrente o mejora el diagnstico renal (Langlord. 1995). Los analgsicos no sali-

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VASCULITIS

997

cilatos pueden suavizar el malestar de las articulaciones y tejidos blandos. La terapia para adultos se parece a la de los nios, aunque la hipertensin en adultos debe ser controlada cuidadosamente (Langford. 1995). El pronstico para esta enfermedad generalmente autolimitada, que dura de 6 a 1 6 semanas, es bueno (Conn, 1993). La tasa de mortalidad est alrededor del 1% al 3% (Langlord. 1995). y el Iracaso renal es la causa principal de muerte (Langford, 1995). Aquellos que tienen una presentacin nefrtica aguda, particularmente con sndrome nefrtico. tienen el peor desenlace, con menos del 50% que recuperen la funcin renal y los anlisis de orina normales en dos aos El porcentaje de glomerulos semilunares puede ser tambin un indicador de pronstico til: sin embargo, es importante tomar conciencia de que el curso de HSP puede ser extremadamente variable. Los pacientes con anormalidades graves clnicas o histolgicas pueden recuperarse totalmente, y aquellos con cambios benignos pueden evolucionar a insuficiencia renal. La enfermedad se repite en el 25% al 40% de los pacientes y consiste en su mayor parte en manifestaciones cutneas. El deterioro o la mejora puede ser ms notable durante los primeros dos o tres aos tras la resolucin del episodio agudo, aunque tambin se han observado cambios significativos con ms posterioridad. Es extremadamente importante una revisin regular con medidas de presin sangunea y anlisis de orina durante al menos los cinco primeros aos siguientes a un episodio de HSP. (Langford, 1995).

cin de la vista que sigue a la ceguera secundaria a la arteritis GC. incluso con una terapia de corticoides rpida a altas dosis.

Arteritis de Takayasu Epidemiologa

Como muchas de las alecciones vasculares idiopticas. la arteritis de Takayasu es poco habitual, y la epidemiologa de esta enlermedad no se conoce exactamente. Esta alteracin es ms prevalente en adolescentes y mujeres jvenes en edades comprendidas entre los 10 y 30 aos; en realidad, entre el 80% y el 90% de los casos se produce en mujeres. Aunque es ms comn en Japn, esta enlermedad no tiene limitaciones probadas raciales o geogrficas (Conn, 1993: Fauci, 1998).

Rasgos

clnicos

Arteritis de clulas gigantes (temporal) Epidemiologa

L a arteritis de clulas gigantes (GC) es una alteracin relativamente comn. Los estudios epidemiolgicos han demostrado una incidencia creciente con la edad. Un estudio que inclua arteritis GC probadas con biopsia demostr una tasa de incidencia anual de 23,3 por 100.000 personas mayores de 50 aos (Conn. 1993). Casi todos los casos de arteritis GC empiezan despus de la edad de 50 aos.

La arteritis de Takayasu es una vasculitis granulomalosa de las arterias elsticas medias y grandes que causa estenosis vascular u oclusin; existe una fuerte predileccin por la arteria artica y sus grandes ramas, incluyendo las arterias pulmonares (Fauci, 1998; Langford. 1995). Esta enlermedad se llama a veces sndrome de la arteria artica o arteritis granulomalosa idioptica. Los pacientes presentan sntomas sistmicos agudos que incluyen fiebre, malestar, sudores nocturnos y prdida de peso. La isquemia en los rganos que reciben el aporte vascular a travs dellos vaso/s afeclado/s causa seales y sntomas rgano-especficos. En la fase crnica obliterante, las pulsaciones de las arterias estn disminuidas o ausentes en las arterias implicadas (Langford, 1995), ms habitualmente en la arteria subclavia (Fauci. 1998). Son habituales los soplos vasculares y la hipertensin (Langford. 1995). Otros hallazgos incluyen la regurgitacin artica, cardiomegalia secundaria a hipertensin artica o pulmonar, e ictus (Fauci, 1998). La arteritis de Takayasu puede progresar lentamente, puede estabilizarse, o puede causar la muerte rpidamente (Fauci, 1998)

Hallazgos clnicos de laboratorio Rasgos clnicos

La arteritis GC es una entermedad sistmica caracterizada por una inflamacin vascular granulomalosa que afecta a las arterias medianas y grandes. Aunque las arterias afectadas pueden estar en mltiples lugares, la arteritis GC clsicamente afecta a la arteria temporal y/o otras ramas de la arteria cartida (Fauc. 1998) Las manifestaciones clnicas incluyen fiebre, cefalea y claudicacin mandibular en pacientes con ms de 50 aos La neuritis ptica isqumica puede provocar una ceguera repentina, particularmente en pacientes no tratados (Fauc, 1988). La arteritis GC est estrechamente asociada con la polimialgia reumtica, que se caracteriza por rigidez y dolor cervical, de hombros, zona inferior de la espalda, caderas y muslos que es peor por la maana y mejora con la actividad del da (Fauci, 1998). Los estudios de laboratorio de la arteritis de Takayasu definen una alteracin inflamatoria sistmica (Langford. 1995). La VSG est elevada en el 75% al 100% de los pacientes, que tiende a volver a la normalidad a lo largo del tiempo. Se cree que la VSG es un ndice fiable de actividad inflamatoria y se ha utilizado como herramienta para monitorizar la eficacia de la terapia. El poder de resolucin de la enlermedad. tanto sintomtica como angiogrficamente. se ha visto que est correlacionado con la disminucin de la VSG. Los estudios hemalolgicos muestran con frecuencia una anemia normocrmica de leve a moderada y/o leve leucocitosis. El FR y ANA son generalmente negativos. Puede haber hipergammaglobulinemia, hiperfibrinogenemia e hipoalbuminemia (Conn, 1993). Los inmunocomplejos circulantes pueden estar presentes en hasta un 50% de estos pacientes pero no parecen relacionarse con la actividad de la enfermedad.

Hallazgos clnicos de laboratorio

Los hallazgos clnicos de laboratorio incluyen una VSG elevada y anemia normocrmica La fosfatasa alcalina en suero est habitualmente elevada. Se ha descrito una hipergammaglobulinemia, asi como niveles elevados de complemento e inmunocomplejos (Fauci, 1998).

Diagnstico
La arteritis de Takayasu se diagnostica por los datos correlacionados de la historia, la exploracin fsica y la angiografia. L a enfermedad debera considerarse como una posibilidad diagnstica en cualquier mujer joven que carezca o tenga una frecuencia de pulso perifrico marcadamente disminuida o que presente variaciones en la presin sangunea yo soplos arteriales (Fauci. 1998). Los hallazgos angiogrficos caractersticos ayudan a confirmar el diagnstico clnico. La biopsia del tejido de diagnstico para la confirmacin raramente se requiere o se hace (Fauci, 1998). La predileccin de este sndrome por mujeres jvenes es un rasgo importante que a veces lo separa de otras consideraciones diagnsticas, particularmente de la arteritis GC (Langford, 1995).

Diagnstico
El diagnstico se basa en la identificacin de las manifestaciones clnicas tpicas y una VSG alta en un paciente anciano que puede o no tener tambin sntomas de polialgia reumtica (Fauci. 1998). El diagnstico se confirma por biopsia de la arteria temporal.

Tratamiento y pronstico
La arteritis GC se trata con glucocorticoides. y la respuesta clnica a esta terapia es generalmente llamativa. El pronstico clnico es bueno, pues la mayora de los pacientes consiguen y mantienen una remisin completa Iras la terapia corticoidea (Fauci, 1998). Desgraciadamente, es rara la recupera-

Tratamiento y pronstico
En pacientes con entermedad activa, la terapia corticoidea es el tratamiento inicial de eleccin. Si la enlermedad activa persiste a pesar de los corticoi-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGIA dificultad para obtener un diagnstico certero de esta enfermedad, la biopsia es igual de importante para descartar otras posibles etiologas. Histolgicamente, existe una inflamacin segmentaria mixta con necrosis que afecta predominantemente a arterias craneales de pequeo y mediano tamao. La inflamacin por granulomatosis puede estar presente. A menudo se detecta trombosis; las arterias extracraneales raramente se afectan (Langford, 1995; Rhodes, 1995). Por eso, deben realizarse en todos los casos diagnsticos dilerenciales cuidadosos para decidir las pruebas apropiadas tanto para apoyar un diagnstico de PACNS como para descartar otros procesos. La combinacin de la resonancia magntica (RM) y LCR normales tiene un fuerte valor predictivo negativo y excluye la consideracin de PACNS en la mayora de las situaciones clnicas (Calabrese, 1997).

des, se pueden administrar ciclofosfamida o metotrexato. Los vasodilatadores, anticoagulantes y antiinflamatorios no esteroideos se utilizan para el alivio sintomtico. Puede ser necesana la intervencin quirrgica para la estenosis vascular sintomtica o la oclusin (Langford. 1995). El curso clnico de la arteritis de Takayasu es variable. Aunque se produce la remisin espontnea, la mayora de los pacientes requieren tratamiento. El pronstico parece estar relacionado con la presencia y gravedad de las complicaciones. Las principales complicaciones incluyen la retinopatia de Takayasu. hipertensin secundaria, insuficiencia de la vlvula artica y aneurisma artico/arterial (Langford, 1995). La supervivencia desciende con el paso del tiempo, a medida que aumenta el nmero y gravedad de estas complicaciones. Las muertes relacionadas con la enfermedad generalmente se producen por complicaciones vasculares, como insuficiencia cardiaca congestiva, ictus, infarto de miocardio y rotura de aneurisma (Langford, 1995).

Tratamiento y pronstico
El tratamiento intensivo est indicado para los pacientes donde se han descartado otras alteraciones, el diagnstico de PACNS se mantiene, y hay evidencia de dificultades neurolgicas progresivas (Calabrese, 1997). Se defiende la terapia combinada de corticoides y ciclofosfamida diarias; sin embargo, el pronstico de PACNS es malo, con un 60% a un 70% de pacientes que fallecen por la enfermedad antes de un ao desde el diagnstico (Langford. 1995).

Angetis primaria del sistema nervioso central Epidemiologa

La angetis primaria del sistema nervioso central (PACNS) es una situacin rara donde la dificultad para hacer un diagnstico definitivo impide los estudios epidemiolgicos. PACNS es ligeramente ms habitual en hombres que en mujeres (4:3) y comienza a una edad media de 43 aos (Langford, 1995),

Enfermedad de Kawasaki Rasgos clnicos

Los pacientes con PACNS presentan cefaleas; dficit focales neurolgicos, y estado mental alterado, paraparesia. cuadriparesia. neuropatas craneales, ataques y ataxia (Calabrese, 1997; Fauci. 1998). Los sntomas iniciales estn ms generalizados y los signos y sntomas focales generalmente se desarrollan ms tarde en el curso de la enfermedad (Langford. 1995). El quince por cenlo de los casos tienen afectacin de la mdula espinal (Calabrese. 1997). El curso puede ser progresivo rpidamente o crecer y decaer durante un largo periodo de tiempo. Los sntomas sistmicos son raros. La enlermedad de Kawasaki o sndrome linfonodular mucocutneo es una forma de vasculitis que afela a arterias de pequeo y mediano calibre. L a enfermedad se produce tpicamente en nios que presentan linfadenitis cervical y alteraciones en piel y mucosas. La enfermedad de Kawasaki generalmente es autolimitada. pero la arteritis provoca aneurismas coronarios en el 25% de los pacientes. La muerte se produce en hasta un 3% de los pacientes, generalmente por vasculitis coronaria. Los autoanticuerpos de clulas anliendoteliales han sido determinados en pacientes con enfermedad de Kawasaki (Fauci, 1995).

Hallazgos clnicos de laboratorio

Los estudios de laboratorio no son tiles para hacer un diagnstico de PACNS, pero juegan un importante papel en la exclusin de otras enfermedades. La VSG est elevada en la mayora, pero no en todos, estos pacientes. Solamente se ha visto anemia en el 17% de ellos, y otros parmetros hematolgicos son generalmente normales. El FR, ANA y ANCA estn ausentes tpicamente. Sin embargo, el liquido cefalorraqudeo (LCR) es generalmente anormal con hallazgos que incluyen presin de apertura aumentada, protenas elevadas y pleocitosis linfoctica. Como el LCR puede ser completamente normal, estas pruebas no siempre excluyen la posibilidad de vasculitis (Langford. 1995).

RESUMEN
El diagnstico de las afecciones vasculares sistmicas necrotizantes requiere un alto grado de sospecha y puede ser difcil debido al amplio nmero de consideraciones de diagnstico diferencial. No existen pruebas clnicas de laboratorio patognomnicas en pacientes con afecciones vasculares sistmicas necrotizantes. pero estas pruebas son tiles para definir el alcance y los patrones de la afectacin del rgano. Los ANCA y sus asociaciones con la vasculitis sistmica necrotizante. particularmente la asociacin de c-ANCA con WG. se han convertido en una prueba serolgica importante utilizada en la evaluacin de estos pacientes. Sin embargo, los mdicos y tcnicos d e laboratorio que usan esta prueba deben entender a fondo las caractersticas operativas, incluyendo limitaciones, de la misma cuando la realizan en su laboratorio, La biopsia de tejido del lugar(es) sintomtico(s) con confirmacin histolgica de vasculitis necrotizante contina siendo el procedimiento de laboratorio ms importante para el diagnstico de las afecciones vasculares necrotizantes sistmicas.

Diagnstico
El diagnstico de PACNS contina siendo de exclusin. Los criterios diagnsticos propuestos han incluido la disfuncin del SNC que no se explica por exploracin clnica, de laboratorio o neurologica: documentacin por angiograma y/o biopsia de una arteritis dentro del SNC; y ausencia de una vasculitis sistmica u otra condicin para la cual los rasgos angiogrficos o patolgicos podran ser secundarios. Debido a la inevitable dificultad en cuanto al ltimo criterio y el pobre poder discriminatorio de la angiografa en cuanto a la enfermedad vascular inflamatoria frente a la no inflamatoria (Calabrese, 1997), las biopsias de SNC estn infrautilizadas. El papel de la biopsia cerebral en el diagnstico de PACNS permanece en controversia, aunque algunos defienden que esta biopsia es esencial para hacer un diagnstico definitivo (Calabrese, 1997). La exclusin de una biopsia cerebral como mtodo generalizado se debe no slo a la naturaleza invasiva sino tambin por la incapacidad de demostrar la vasculitis histolgica debido a la naturaleza heterognea del proceso. El rendimiento de la biopsia puede aumentarse mediante la obtencin de muestras de vasos tanto de parnquima como de la leptomeninge. Por la

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Enfermedades autoinmunes organoespecficas

David J. Bylund, M.D. Robert M. Nakamura, M.D.

MTODOS DE DETECCIN Microscopa de inmunofluorescencia indirecta PIEL Pnfigo Penfigoide Epidermlisis ampollosa adquirida y lupus eritematoso ampolloso Dermatitis herpetiforme Dermatosis IgA lineal Lupus eritematoso Vasculitis HGADO Autoanticuerpos Enfermedades hepticas GLNDULA TIROIDES Enfermedades tiroideas Autoanticuerpos RION Glomerulonefritis Enfermedad por anticuerpos contra la membrana basal glomerular

1000

GLNDULA SUPRARRENAL Enfermedad de Addison

1011

1001

PNCREAS Diabetes mellitus TRACTO GASTROINTESTINAL Anemia perniciosa Enteropatia sensible al gluten SISTEMA NERVIOSO Miastenia gravis Esclerosis mltiple

1011

1013

1013

1006

Neuropatas Autoanticuerpos contra protenas neuronales

1009

Autoanticuerpos contra ganglisidos neuronales OTROS RGANOS Corazn 1014

1010

Msculo RESUMEN BIBLIOGRAFA 1014 1014

Las enfermedades autoinmunes pueden clasificarse como sistmicas o enfermedades especficas de rgano. En este capitulo se tratan la mayora de las enfermedades autoinmunes organoespecficas enumeradas en la Tabla 45-1. La principal caracterstica clnica de estos trastornos autoinmunes es la inflamacin crnica, que generalmente se localiza en un nico rgano especfico en cada enfermedad. Dentro de este grupo de enfermedades autoinmunes, aparece con cierta Irecuencia un agrupamiento familiar. Los autoanticuerpos ms relevantes pueden ser especficos de la especie o no serlo, pero si exhiben especificidad por un antgeno presente en el tejido u rgano daado. En este capitulo tambin se incluyen algunas enfermedades con autoanticuerpos y lesiones inflamatorias restringidas a uno o varios rganos, que combinan las caractersticas clnico-patolgicas de los dos tipos de trastornos, las enfermedades autoinmunes sistmicas y las especficas de rgano. Como ejemplo de stas encontramos enfermedades autoinmunes hepticas como la cirrosis biliar primaria (CBP) o la hepatitis autoinmune (AiH). Si excluimos los autoanticuerpos antireceptores tiroideos, la implicacin de los autoanticuerpos en la patognesis de las enfermedades autoinmunes especficas de rgano an no ha sido demostrada.

detectar la presencia de autoanticuerpos circulantes dirigidos contra rganos o tejidos especficos. Sin embargo, gracias a la mejora de los aspectos tcnicos, los laboratorios clnicos utilizan con mayor frecuencia los ensayos ELISA (anlisis de inmunoabsorcin ligado a enzimas).

Microscopa de inmunofluorescencia indirecta

Este procedimiento es esencialmente el mismo para las distintas pruebas, excepto por los suslratos utilizados como objetivo para los autoanticuerpos. El procedimiento general es el siguiente: 1. Preparar diluciones para el cribado o diluciones seriadas de los sueros de los pacientes, y de los controles apropiados con fosfato salino tamponado (PBS). 2. Incubar en cmara hmeda durante 20 a 30 minutos las diluciones de los sueros de los pacienles y los controles sobre secciones de tejido criopreservadas sobre portas de cristal multiporo. No permitir que se sequen los portas. 3. Sacar los portaobjetos de la cmara hmeda. Lavar brevemente y con cuidado cada portaobjetos, dos o tres veces, usando para ello PBS a temperatura ambiente. Despus lavar los portaobjetos en PBS durante 15 minutos, cambiando la solucin de lavado una vez en este tiempo.

MTODOS DE DETECCIN
La microscopa de inmunofluorescencia indirecta (IFID), descrita brevemente ms adelante, es el mtodo que se utiliza con mayor Irecuencia para

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

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Tabla 45-1 Enfermedades autoinmunes organoespecficas E n f e r m e d a d del r g a n o Glndula tiroides Tiroiditis aulommune Autoanticuerpos Peroxidasa tiroidea Tiroglobulma Receptor de TSH Adrenocortical Protenas endoteliales paratiroideas Clulas del islote Asociados a insulina Anti-decarboxilasa de c i d o glulmico PM -1. Jo-1 Clulas parietales gstricas Factor intrnseco Clulas de conductos salivares Clulas panetalos gstricas Colon; lipopolisacrido; asociado a p-ANCA Reticulina Transglutammasa tisular IgA de endomisio Gliadina Reticulina Msculo liso Microsomas hepticos y renales ANA Mitocondrial ( M 2 ) p-ANCA AChR M t o d o / s de d e t e c c i n ELISA. IFID sobre tiroides de mono no lijada IFID sobre tiroides de mono fijada en metanol; hemaglutinacin pasiva, aglutinacin en ltex Ensayo de unin al radiorreceptor, bioensayo do cAMP IFID en corteza adrenal de mono o humana no fijada IFID sobre glndula paratiroides bovina no lijada IFID sobre pncreas humano no lijado, grupo sanguneo O Radioinmunoprecipitacin ELISA. RA. inmunotransferencia ELISA; inmunodifusin IFID en estmago/rin de ratn Ensayo de unin a vitamina B,. radiactiva IFID en glndula salival humana no fijada IFID en sustrato de mucosa gstrica humana, de mono, de ratn o de rala IFID sobre colon humano o de rata, hemaglutinacin IFID en neutrfilos fijados en elanol IFID sobre rion de ratn ELISA IFID sobre e s f a g o de mono ELISA IFID sobre n n de ratn IFID en estmago/rin de ratn IFID on oslmago/rin de raln; ELISA Clulas Hep -2 IFID en estmago/nn de ratn, ELISA IFID sobre neutrfilos fijados en elanol Inmunoprecipitaan de AChR conjugado con la-bungarotoxina (msculo esqueltico humano); ELISA
,26

Enfermedad de Graves Glndula suprarrenal Enfermedad de Addison Glandula parattroides Paratiroides Pncreas Diabetes mellitus dependiente de insulina Msculo Dermatomiositis/polimiosilis Tracto gastrointestinal Gastritis atrfica Anemia perniciosa

Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn Enfermedad celiaca

Hgado Hepatitis autoinmunc

Cirrosis biliar primaria Colangitis esclerosante primaria Neurolgicas Miastenia gravis Enfermedades desmielinizantes (a saber, esclerosis mltiple)

Mielina; lubulina, proteina bsica de la mielina; FID sobre m d u l a espinal de mamitero; ELISA; glucoproleina asociada a mielina inmunotransferencia Membrana basal glomerular y pulmonar ELISA

Rones Enfermedad por anticuerpos anti-GBM Piel Pnfigo Penfigoide Dermatitis herpetiforme Pnfigo paraneoplsico IgA BMZ Dermatosis lineal por IgA IgA ICS Pnligo por IgA Espacios intercelulares (desmogleinas) BMZ (protenas de hemidesmosomas) Transglutaminasa tisular IgA de endomisio ICS y BMZ

IFD sobre muestra de biopsia de piel. IFID sobre e s f a g o de mono o cobaya IFD sobre biopsia de piel; IFID sobre esfago de mono ELISA IFID sobre e s l a g o de mono IFD sobre biopsia de piel; IFID sobre epitelio de ve|iga de rata IFD sobre biopsia de piel humana. IFID sobre esfago de mono IFD sobre biopsia de piel humana; IFID sobre esfago de mono

AChR = receptor de acetilcolina; BMZ = zona de memprana basal; IFD = microscopa de inmunofluorescencia directa; ELISA ensayo de inmunoabsorcin ligado a onzima; ICS = espacios intercelulares IFID - microscopa de Inmunofluorescencia indirecta; p-ANCA anticuerpos perinucleares anticiloplasma de neutrfilos; RA = radioinmunoensayo. TSH = hormona estimulante de litoides

4. Ir sacando cada portaobjetos por separado del bao de PBS. s e c a r el e x c e s o de lquido de c a d a portaobjetos, y colocarlos de nuevo en la cmara hmeda. Dispensar en c a d a pocilio la dilucin de conjugado m a r cado con fluorescena. I n c u b a r los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 minutos. No permitir q u e se sequen los portaobjetos. 5. Lavar los portaobjetos con PBS y azul de Evans como colorante de contraste durante 10 minutos. 6. Montar los cubreobjetos. 7. Observar los portaobjetos al microscopio de fluorescencia. 8. Almacenar los portaobjetos en la oscuridad a 4C.

PIEL
La deteccin de autoanticuerpos es muy til en el estudio de las enfermedades cutneas ampollosas. En pacientes con enfermedades autoinmunes de la piel, los autoanticuerpos incluyen aquellos dirigidos contra la zona de membrana basal (BMZ), los espacios intercelulares (ICS) o los vasos sanguneos drmicos, c o m o se recoge en la Tabla 45-2. Se encuentran disponibles algunas revisiones tcnicas excelentes que detallan el uso de la inmunofluorescencia para el examen de la piel (Flotte, 1995; Crosby, 1993).

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 45-2 Enfermedades autoinmunes de la piel H a l l a z g o s inmunolgicos esenciales para el diagnstico Espacios intercelulares epidrmicos Pntigo Pnligo paraneoplsico Zona de membrana basal Penligoide Penligoide gostacional Epidermlisis ampollosa adquirida Dermatosis lineal por IgA Dermatosis ampolloso crnica de la inlancia Papilas drmicas zona de membrana basal Dermatitis herpetilorme Hallazgos inmunolgicos tiles para el diagnstico Manifestaciones cutneas en enfermedades reumticas sistmicas Dermatomiositis/polirniosilis Lupus eritematoso Enfermedad mixta del tejido conjuntivo Policondritis recurrente Sindrome de Sjogren Esclerosis sistmica Vasculitis

txica, lupus eritematoso sistmico (LES), miastenia grave (MG), penligoide y liquen plano. Raramente se observan en individuos sanos (<1%) (Becker. 1993; Mutasim. 1993; Nousari, 1997).

Pnfigo

foliceo

Los subgrupos de pnligo foliceo incluyen el PF idioptico, PF endmico (fogo selvagem), PF inducido por frmacos y pnfigo eritematoso (PE). El principal antgeno en el PF es la desmogleina 1 (Lin. 1998: Naparstek, 1993). IFD. Para todas las formas de PF excepto para PE, el patrn de IFD e s similar al de PV. En algunos casos, el mareaje predomina en la epidermis superficial, a nivel de la capa granulosa. En PE, hay un depsito lineal de IgG en ICS epidrmicos combinado con inmunorreactivos granulares a lo largo de BMZ. IFID. La IFID debe detectar autoanticuerpos IgG ICS en prcticamente el 100% de los pacientes de PF con enfermedad activa (Nousari, 1997). Casi el 90% de los pacientes con PF tienen autoanticuerpos detectables cuando se utiliza esfago de mono para los estudios indirectos. El esfago de cobaya es algo ms sensible ya que detecta el 10% restante de los pacientes y los ttulos indirectos tienden a ser mayores que los obtenidos cuando se utiliza esfago de mono (Jiao. 1997).

Pnfigo Pnfigo
El pnfigo se refiere a un grupo de enfermedades que se caracterizan clnicamente por ampollas e histolgicamente por acantlisis. Existen tres subtipos principales de pnfigo: pnfigo vulgar, pnfigo foliceo y pnfigo paraneoplsico (Nousari, 1999). Cada uno de estos subtipos se caracteriza por la existencia de autoanticuerpos contra las molculas de adhesin de los desmosomas. Para maximizar la sensibilidad diagnstica de las evaluaciones iniciales, se utilizan tanto la IFID para detectar autoanticuerpos circulantes como la microscopa de inmunofluorescencia directa, que resulta ms informativa.

paraneoplsico

El pnfigo paraneoplsico (PNP), una enfermedad poco comn caracterizada por la presencia de ampollas dolorosas o erosiones de las membranas mucosas y piel, es una afeccin de pacientes con neoplasias. Estas ampollas o lesiones aparecen en la boca, pero tambin se han descrito en mucosas de otros lugares. Las neoplasias malignas que se han asociado con PNP incluyen linfoma maligno, leucemia linfocitica crnica, limoma, carcinoma broncognico de clulas espinosas y sarcomas. PNP es relacionado con neoplasias benignas rara vez (Mutasim, 1993; Flotte, 1995; Camisa, 1993).

Pnfigo vulgar
El pnfigo vulgar es una enfermedad poco comn que aparece en todos los grupos raciales y tnicos, aunque la incidencia es ligeramente superior en la poblacin juda. La enfermedad afecta a ambos sexos y ocurre ms comnmente en individuos de entre 40 y 60 aos (Becker. 1993). La desmoglema 3 es el principal antgeno en el PV (Lin, 1998; Naparstek. 1993). IFD. La I F D de piel perilesional muestra inmunofluorescencia lineal/granular de inmunoglobulina G (IgG) y C3 en ICS sin depsitos en BMZ (Fig. 45-1). Este patrn se describe a menudo como en forma de "alambrada", que produce el mareaje preferentemente de la mitad inferior de la epidermis. La IgG, especialmente lgG4, est presente en cerca del 100% de los pacientes mientras que C3 est presente entre el 50% y el 100% de los pacientes, generalmente en reas acantolticas (Becker, 1993: Flotte, 1995, Lin, 1998). Se observan I g A o IgM inmunorreactivas en el 30% y el 50% de los pacientes (Izuno. 1986). Se muestra inmunofluorescencia debida a C3 exclusivamente, sin IgG. en el pnfigo inducido por frmacos y en el imptigo (Nousari, 1997). IFID. L a IFID debe detectar autoanticuerpos IgG contra la superficie de clulas epiteliales de la capa espinosa en el 100% de los pacientes con enfermedad activa (Nousari,1997). Se considera al esfago de mono como el mejor sustrato tisular. La presencia de autoanticuerpos de PV es anormal a cualquier titulo. El ttulo se suele correlacionar con la actividad de la enfermedad, y ttulos que van en aumento pueden ser predictivos de una recada (Becker, 1993; Crosby, 1993). Sin embargo, existen excepciones a esta correlacin, por lo que los exmenes seriados de ttulos de IgG para monitorizar estos pacientes se deben correlacionar cuidadosamente con los hallazgos clnicos. Los pacientes que slo muestran lesiones de la mucosa oral pueden no tener autoanticuerpos de PV circulantes detectables. En estos pacientes, el diagnstico se realiza utilizando IFD (Izuno, 1986). Se detectan bajos ttulos de autoanticuerpos con las caractersticas de ICS de forma poco frecuente en diversas condiciones como son las quemaduras de piel, alergia a penicilinas u oros lrmacos, necrlisis epidrmica

Figura 45-1. Inmunofluorescencia directa d e lesin de piel en el pnfigo q u e muestra depsitos lineales/granulares de IgG sobre las superficies celulares de los queratinocitos (espacios intercelulares), sin fluorescencia en la zona de la m e m brana basal (x 400).

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1003

Mutasim (1993) propuso los siguientes criterios para definir PNP: Erosiones mucosas dolorosas y erupciones polimorfas de la piel, con lesiones papulosas que progresan a ampollas y lesiones erosivas que afectan al tronco, las extremidades, las palmas de las manos y las plantas de los pies, asociadas con una neoplasia oculta o clnicamente conocida. Acantlisis suprabasilar, necrosis de queratinocitos y cambios en la mterfase vacuolar de secciones de tejido microscpicas y ligeras. IgG contra ICS combinado con depsito lineal / granular de complemento e IgG a lo largo de BMZ. Autoanticuerpos circulantes contra ICS que se unen a epitelio vesical de roedor y esfago de mono o cobaya. Inmunoprecipitacin de un complejo de cuatro protenas queratinociticas unidas por los autoanticuerpos: esta es una herramienta de investigacin principalmente, pero puede ofrecer informacin clnica til en casos difciles. PNP asociado a neoplasias malignas seala un pronstico extremadamente malo. Aunque se ha descrito la mejora clnica o la remisin de las lesiones mucocutneas tras la reseccin del tumor, el tratamiento de PNP asociado a malignidad es de soporte. PNP asociado a una neoplasia benigna remiti tras la reseccin del tumor (Mutasim, 1993). IFD. La IFD de piel perilesional o de mucosa de pacientes con PNP detecta IgG contra ICS mmunorreactivo con o sin componentes del complemento. Tambin estn presentes depsitos granulares o menos frecuentemente lineales de componentes del complemento (C3, C1q) en BMZ. adems de la inmunofluorescencia de IgG contra ICS (Mutasim, 1993). IFID. La IFID con esfago de mono o epitelio vesical de roedor pone de manifiesto una IgG inmunorreactiva tanto en ICS como a lo largo de BMZ. La unin a epitelio vesical de roedor (rata o ratn) es un hallazgo diferencial importante que diferencia PNP de otros tipos de pnfigo (LIU, 1993: Mutasim, 1993).

mi
Figura 45-2. Inmunofluorescencia directa de lesin de piel en el penligoide q u e mueslra depsito intenso lineal de IgG a lo largo de la zona de m e m b r a n a basal (x 400). Se puede identificar un patrn lineal epidrmico en BMZ en trastornos clnicos dispares, incluyendo el penfigoide de la membrana mucosa benigno, epidermlisis ampollosa adquirida (EBA). penfigoide gestacional (herpes gestationis) y lupus eritematoso ampolloso (BLE). Para ayudar a diferenciar estos trastornos, son tiles las biopsias directas de piel separada en solucin salina (Domloge-Hultsch, 1991). En BP y penfigoide gestacional, se localizan depsitos de IgG lineal en el lado epidrmico o techo de la separacin. Sin embargo, se puede observar inmunofluorescencia lineal de C3 a lo largo del lado epidrmico y drmico de la separacin. En EBA y BLE, se observan inmunorreactantes en el lado drmico de la separacin (Nousari, 1997). La correlacin clnica se convierte entonces en un factor importante en la resolucin de las alternativas diagnsticas. IFID. La BP se caracteriza serolgicamente por la presencia de autoanticuerpos circulantes contra BMZ. tanto cutnea como de la m u c o s a oral. L a IFID detecta autoanticuerpos circulantes IgG contra B M Z en cerca del 5 0 % de los pacientes con penfigoide. pero la sensibilidad aumenta hasta el 7 0 % y 80% si se utiliza como sustrato piel separada en solucin salina (Nousari, 1997; Domloge-Hultsch. 1991: Izuno, 1986). En el BP los autoanticuerpos solo se unen al techo de la piel separada en el 80% de los pacientes. En E B A y BLE. los autoanticuerpos se unen a la base, o suelo drmico, de la separacin en el 50% de los pacientes (Korman. 1993; Crosby. 1993: Domloge-Hultsch. 1991).

Pnfigo IgA (Dermatosis intercelular IgA)

IFD. La dermatosis intercelular por IgA es una enfermedad vesculo-ampollosa inlraepidrmica poco frecuente. Los estudios directos muestran una inmunofluorescencia lineal en ICS que es suprabasilar. y particularmente acentuada en la epidermis superior. IFID. La IFID detecta autoanticuerpos circulantes I g A anti-ICS (Flotte. 1995: Teraki, 1991).

Penfigoide Penfigoide ampolloso

El penfigoide ampolloso es una enfermedad ampollosa subepidrmica de causa desconocida que aparece en pacientes de cualquier edad, pero que principalmente afecta a adultos mayores de 60 aos. Esta enfermedad involucra de forma tpica las superficies flexoras de brazos, piernas, ingles, axilas y abdomen inferior. Las membranas mucosas orales tambin pueden afectarse, pero estas lesiones raramente son el signo de presentacin predominante, un punto que diferencia el penfigoide del PV. Los principales anlgenos en BP son dos protenas hemidesmosmicas de queratinocitos, una protena ntracelular de 230 kDa (antgeno penfigoide ampolloso 1) y una protena transmembrana de 180 kDa (antgeno penfigoide ampolloso 2) (Nousari, 1997; Lin, 1998). IFD. La IFD sobre piel perilesional libre de ampollas del borde de una ampolla fresca es sensible para el diagnstico y demuestra de forma tpica inmunofluorescencia lineal en B M Z en cerca del 100% de los pacientes (Fig. 45-2). Los inmunorreactivos predominantes son C3 e IgG o C3 exclusivamente. Tambin I g A o IgM pueden estar presentes en casi un 25% de los pacientes, generalmente en menor intensidad y en combinacin con IgG (Korman, 1993; Crosby, 1993; Izuno, 1986).

Penfigoide benigno de membranas mucosas

El penfigoide benigno de membranas mucosas (BMMP) o penfigoide cicatrizal afecta de forma constante a las mucosas orales y oculares. Otras mucosas afectadas por estas lesiones pueden ser la nasofaringe, laringe, genitales, recto y esfago (Mutasim, 1993). La curacin de la lesin est seguida de su cicatrizacin, y la ceguera es la complicacin ms temida. IFD. El patrn de IFD es similar al que se observa en BP. La sensibilidad es del 90% pero aumenta si se realizan biopsias adicionales. El penfigoide cicatrizal localizado crnico, tambin conocido como penfigoide cicatrizal de Brunstmg-Perry. es una variante del BMMP que se localiza en las regiones de la cabeza y cuello (Sarret. 1991). En esta variante, la IFD demuestra la presencia de IgG exclusivamente, a lo largo de BMZ, sin I g A o IgM; los autoanticuerpos circulantes contra BMZ son poco frecuentes (Izuno, 1986).

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

IFID. L a IFID detecta autoanticuerpos circulantes IgG en menos del 33% de los pacientes con BMMP cuando se utiliza exclusivamente mucosa oral como sustrato pero slo en el 5% a 15% de los pacientes si se utilizan sustratos estndar (Crosby, 1993; Sarret. 1991; Nousan, 1997). El estudio de piel humana separada en solucin salina puede revelar IgA, IgG o ambos depsitos en cerca del 80% de estos pacientes (Sarret. 1991). No existe correlacin entre la presencia y ttulo de autoanticuerpos y la actividad de la enfermedad.

Penfigoide gestacional
Aunque es poco frecuente, la enfermedad ampollosa subepidrmica penfigoide gestacional (GP) (herpes gestationis) se desarrolla durante el embarazo o poco tiempo despus (Izuno, 1986). Las lesiones son de forma tipica pruriginosas y se localizan predominantemente en el abdomen o extremidades. IFD. Con IFD tan slo se pueden encontrar tpicamente depsitos lineales de C3 en BMZ. Se detectan depsitos de IgG asociados en el 30% al 40% de los casos, pero son raros los de IgA o IgM (Izuno, 1986). IFID. Los depsitos de C3 slo pueden ser visualizados a lo largo de BMZ, pero los ttulos de autoanticuerpos suelen ser demasiado bajos para ser observados utilizando sustratos estndar de IFID. Sin embargo se puede detectar el complemento utilizando inmunofijacin de complemento si se utiliza como sustrato piel humana normal separada en solucin salina (Izuno, 1986; Nousari. 1997).

Figura 45-3. Inmunofluorescencia directa oe lesin de piel en dermatitis herpetiforme mostrando deposicin granular de IgA predominantemente en las cspides de las papilas drmicas (x 400).

patrn caracterstico de inmunofluorescencia en la mucosa muscular subepitelial de esfago de mono (Peters. 1989).

Dermatosis IgA lineal

L a dermatosis IgA lineal es un cuadro subepidrmco ampolloso poco comn considerado como una entidad clnica distinta en vez de ser u n a variante de DH como se pensaba (Izuno. 1986; Crosby. 1993). La mayora de los casos son idiopticos. pero algunos se asocian con frmacos (Nousari, 1999.1995; Kuechle. 1994). La dermatosis crnica ampollosa infantil es similar a la dermatosis IgA lineal, tanto clnicamente como inmunopatolgicamente (Elenitsas, 1995). IFD. En casi el 100% de los casos, la IFD demuestra depsitos lineales intensos de IgA a lo largo de BMZ pero ninguno en las papilas drmicas (Izuno. 1986). Aunque casos ocasionales pueden mostrar de forma concomitante un mareaje dbil de C3 en BMZ, otros inmunorreactivos distintos de IgA no suelen estar presentes. IFID. Se pueden detectar autoanticuerpos circulantes IgA contra BMZ c o n la IFID en cerca del 10% al 30% de los casos (Flotte, 1995; Crosby, 1993).

Epidermlisis ampollosa adquirida y lupus eritematoso ampolloso

EBA y BLE son enfermedades ampollosas subepidrmicas adquiridas caracterizadas por la presencia de autoanticuerpos contra la protena de colgeno lipo VII en BMZ (Gammon, 1993). E B A puede aparecer a cualquier edad, pero se presenta ms comnmente en adultos de entre 40 y 50 aos. Todos estos pacientes estn afectados por una combinacin de vesculas, erosiones, cicatrices, milia y despigmentacin de la piel, localizadas ms a menudo en superficies extensoras de piel susceptibles de traumatismo como las rodillas, codos, o el dorso de manos y pies (Gammon. 1993) BLE ocurre en pacientes con lupus eritematoso. IFD. Utilizando IFD, se observan inmunorreactivos lineares en BMZ en los pacientes con E B A y BLE, que suelen estar formados por IgG y C3. Utilizando biopsias directas de tejido de piel separada por solucin salina, los inmunorreactivos se localizan en el lado drmico, o suelo, de la vescula inducida. IFID. Solo el 40% de los pacientes con EBA tienen autoanticuerpos demostrables cuando se utiliza piel humana sin tratamiento salino como sustrato. Utilizando la tcnica indirecta de piel separada en solucin salina, se pueden identificar autoanticuerpos circulantes en cerca del 50% al 85% de los pacientes (Fine. 1994; Nousari. 1997).

Lupus eritematoso
El lupus eritematoso es una enfermedad caracterizada serolgicamente por la presencia de autoanticuerpos mltiples incluyendo anticuerpos antmucleares, anti-ADN nativo, antihistonas y anti-Sm. IFD. Con la IFD, se observan depsitos caractersticos gruesos, granulares y continuos de inmunoglobulinas y complemento a largo de la B M Z epidrmica en el 50% al 95% de los pacientes con LES (Izuno, 1986). Los depsitos en B M Z del complejo de ataque a la membrana, C5b-9. en piel de la lesin pueden ser marcadores de LES (Helm. 1993). A pesar de que estos pacientes tienen comnmente depsitos de IgG, IgM y componentes del complemento (C3 o C1q) (Fig. 45-4), se pueden identificar inmunoglobulinas de todas las clases (Izuno, 1986). Cuando la piel no lesionada contiene al mismo tiempo inmunoglobulinas IgG, IgA o IgM en el patrn tpico, es ms probable que el diagnstico sea LES (Izuno, 1986). Aunque es caracterstico, este patrn de reaccin se puede observar en otras enfermedades como la enfermedad mixta del tejido conjuntivo, oermatomiositis. reaccin de injerto contra husped, erupcin por frmacos y vasculitis (Izuno. 1986). Por tanto es obligatorio correlacionar los resultados directos tanto c o n la presentacin clnica c o m o con los resultados del estudio de una biopsia de piel por microscopia ptica. Esta informacin es despus interpretada en el c o n t e x t o de los hallazgos directos individuales para clasificar el tipo clnico de LE. N u m e rosas publicaciones citan la IFD con la finalidad del diagnstico de LES a partir de piel obtenida por biopsia, con o sin lesiones, y de lugares expuestos o no expuestos al sol. En pacientes diagnosticados con LES. la piel normal expuesta

Dermatitis herpetiforme
L a dermatitis herpetiforme es una enfermedad ampollosa subepidrmica pruriginosa asociada a enteropatia sensible al gluten. DH tambin est asociada al tipo de histocompatibilidad HLA-B8. DR3 (Crosby. 1993). IFD. La biopsia directa debe ser de la piel perilesional porque una biopsia de la piel lesionada podria resultar negativa. La IFD delecta IgA granular en la cspide de las papilas en aproximadamente el 80% al 100% de los pacientes con DH (Flotte, 1995) (Fig. 45-3). Puede haber depsitos de IgA a lo largo de BMZ de forma concomitante. Se encuentran con frecuencia depsitos de C3 con IgA, pero IgG o IgM se detectan poco frecuentemente (Izuno. 1986). IFID. Los pacientes con DH no tienen autoanticuerpos contra BMZ detectabas. Sin embargo, se detectan autoanticuerpos IgA contra endomisio en el 80% de los pacientes con DH. Estos autoanticuerpos son identificados por su

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ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

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al sol se confirma c o m o positiva en cerca del 70% de los casos, mientras que la piel normal no expuesta al sol es positiva en cerca del 40% de los pacientes (Izuno, 1986). Sin embargo, el potencial para predecir la actividad de la enfermedad o la afectacin renal de esta forma sigue resultando controvertida (Izuno, 1986). Tal vez la aplicacin clnica ms prctica de las pruebas de laboratorio es el diagnstico diferencial de LES del LE discoide (LED). Casi el 95% de los individuos con LED tienen depsitos en BMZ gruesos, granulares y continuos similares a los de LES (Izuno. 1986). Sin embargo, los hallazgos positivos con IFD en LED estn confinados a la piel lesionada, mientras que la IFD con piel con o sin lesin puede dar hallazgos positivos en el LES (Izuno. 1986). El lupus eritematoso cutneo subagudo (LECS) est caracterizado clnicamente por artritis, manifestaciones sistmicas leves y autoanticuerpos antiSS-A/Ro. La IFD de biopsias de piel de estos pacientes detecta depsitos de inmunoglobulina o complemento en tan slo el 50% de las biopsias de piel lesionada y en el 30% de biopsias de piel no implicada (Izuno. 1986). La IFID es positiva en el 50% al 70% de los pacientes con LECS. Otras enfermedades autoinmunes sistmicas importantes no ofrecen hallazgos especficos para el diagnstico ni por IFD ni por IFID. Aunque algunos pacientes tienen depsitos granulares de IgM a lo largo de BMZ, se considera este hallazgo inmunopatolgico un marcador completamente inespec-

fico que puede ser detectado no slo en enfermedades autoinmunes, sino tambin en un gran nmero de dermatitis o en la piel expuesta al sol de individuos clnicamente normales (Izuno. 1986).

Vasculitis
Las vasculitis de la piel tienen varios sinnimos, incluyendo vasculitis leucocitoclstica, vasculitis alrgica y angeitis I vasculitis por hipersensibilidad. Histolgicamente, los pequeos vasos sanguneos de la dermis muestran clulas endoleliales con tumefaccin, exocitosis neutrofilica. detritus nucleares ("leucocitoclasis") y trombos conjuntamente con eritrocitos extravasados. IFD. La siopsia de tales lesiones dentro de las 24 horas de su comienzo, puede exhibir depsitos de IgM. C3. fibringeno y algunas veces IgG (Fig. 45-5). Un resultado negativo no excluye la vasculitis. La biopsia de una piel de ms de 24 horas podra no ser til puesto que el nico hallazgo podra ser el marcaje no especifico del fibringeno. La confirmacin histolgica del diagnstico se hace por tanto esencial. La prpura de Henoch-Schnlem se diagnostica cuando se observa inmunofluorescencia vascular granular I g A con o sin C3 dentro del marco clnico apropiado.

Figura 45-4. Inmunolluorescencia directa de piel en lupus eritematoso que muestra inmunorreactivos I g G (A), C1q (B) e IgM (C) granulares, bastante continuos a lo largo de la zona de la m e m b r a n a basal (x 400).

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

tes con PBC, pero se observan en pacientes con infeccin por virus EpstenBarr, infeccin por citomegalovrus y otros trastornos infecciosos. Los NOMA estn dirigidos contra eptopos de los antgenos M2 y M9 en la PBC. pero no contra los mismos antgenos que los AMA (Bylund. 1992). Aunque la trascendencia de los NOMA no est aclarada, su presencia en personas asociadas con pacientes de PBC ha generado preguntas sobre la posible existencia de agentes contagiosos en los sueros de eslos pacientes (Bylund, 1992).

Autoanticuerpos

antimsculo

liso

Los anticuerpos antimsculo liso (SMA) se encuentran en aproximadamente un 50% de los pacientes con AiH clsica y suelen aparecer junto con ANA (Nakamura. 1991). Cuando se acompaan de un trastorno heptico, los SMA estn dirigidos contra actina F, que forma parte del citoesquelelo Figura 45-5. I n m u n o f l u o r e s c e n c i ad i r e c t a de piel en vasculitis cutnea de pequeos de la clula heptica en asociacin directa con la membrana plasmtica de v a s o sq u em u e s t r ai n m u n o f l u o r e s c e n c i a vascular de los vasos del p l e x o capilar super- las clulas hepticas (Nakamura, 1991). Es tpico que el ttulo de SMA sea ficial. E s t a biopsia es de un p a c i e n t e con prpura de Henoch-Schlnem y d e m u e s t r a superior o igual a 1:80 en el suero de pacientes con AiH. Sin embargo, se el i n m u n o m a r c a j ev a s c u l a r por IgA caracterstico de e s t a enfermedad (x 400). pueden detectar ttulos bajos de SMA en pacientes con otros trastornos y en individuos que aparentemente estn sanos (Nakamura, 1991).

HGADO Autoanticuerpos Autoanticuerpos antinucleares

Los autoanticuerpos antinucleares (ANA) se detectan ms frecuentemente por IFID, aunque la identificacin de autoanticuerpos especficos por ELISA se est haciendo ms popular en los laboratorios clnicos. Los ANA son un grupo m u y heterogneo, y casi todos los subtipos que aparecen en los trastornos reumatolgicos se pueden encontrar en personas con AiH. Los patrones tanto homogneos como moteados en clulas Hep-2 se pueden identificar ms frecuentemente en pacientes con AiH. Tambin se han descrito autoanticuerpos especficos contra el ADN de doble cadena en enfermedades hepticas (Manns, 1992). Se detectan ttulos de ANA superiores a 1:80 en casi el 80% de los pacientes con AiH (Nakamura. 1991). Sin embargo, tambin pueden encontrarse ANA en el 60% de pacientes con PBC, 50% de pacientes con trastomos hepticos relacionados con el alcohol, en el 40% de pacientes con hepatitis viral tipo B y en el 25% de pacientes con AiH que tambin tienen autoanticuerpos antimicrosomales renales y hepticos (LKMA) (Nakamura, 1991). Se pueden identificar autoanticuerpos anticentrmero en el 10% a 15% de los pacientes con PBC.

Se utiliza con frecuencia la IFID sobre sustrato de tejido estomacal de roedor para detectar SMA, de manera que se tie la capa muscularis propria del estmago con un patrn uniforme y constante (Fig. 45-7). Es caracterstica la tincin especfica de la muscularis mucosa y las paredes de los vasos sanguneos. Si se utiliza como sustrato un bloque de tejido de estmago/rin de roedor, se puede producir un mareaje dbil en las zonas mesangiales glomerulares debido a la presencia de actina F en esta regin. Si se utilizan clulas Hep-2 en vez de otros sustratos, la IFID revela un mareaje citoplasmtico de aspecto "cableado" cuando estn presentes los SMA.

Autoanticuerpos

antimitocondriales

Se han identificado nueve antigenos mitocondriales por separado que reaccionan con anticuerpos antimitocondriales (AMA). Los AMA dirigidos contra los antgenos M2 y M9 se consideran los marcadores diagnsticos ms importantes de PBC (Bylund, 1992). Los A M A que se detectan por IFID usando como sustrato bloques de tejido de estmago/rin de roedor muestran un patrn de fluorescencia tpico que refleja un mareaje citoplasmtico homogneo de las zonas correspondientes a los tbulos renales y a las clulas parietales; tambin son positivos los tbulos distales (Fig. 45-6). Este mareaje de los tbulos distales es un punto importante en la diferenciacin de la reactividad de los AMA frente a los LKMA. que no producen mareaje en los lbulos renales distales. El autoantigeno M2 es una mezcla heterognea que contiene diversos componentes del complejo mitocondrial 2-oxo-cido dehidrogenasa. El autoantigeno dominante M2 en pacientes con PBC es la subunidad E2 de piruvato dehidrogenasa (PDH-E2), de 70 kDa (Manns, 1992). El segundo autoantigeno mitocondrial ms comn es la subunidad de 50 kDa E2 de la cadena ramificada oxo-ceto-cido-dehidrogenasa (BCOADH-E2) (Manns, 1992). Se pueden encontrar autoanticuerpos mitocondriales de aparicin natural (NOMA) en personas que han tenido contacto cercano con pacientes de PBC e incluso en el personal tcnico de laboratorio que procesa sueros con PBC (Bylund, 1992). Los NOMA se producen raramente en pacien-

Figura 45-6. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimitocondriales utilizando c o m o sustrato estmago/rin de ratn. Hay una inmunofluorescencia difusa de los tbulos renales, incluyendo los tbulos distales (A, x 200) que tiene una apariencia citoplasmtica homognea a m a y o ra u m e n t o (B, x 400).

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1007

zando transferencia westem. aunque este ensayo no est disponible fuera de los laboratorios de investigacin. Utilizando el procedimiento de transferencia western. los L K M A se han agrupado en tres subtipos basndose en sus antigenos diana (Manns, 1992). Se ha identificado un componente de 50 kDa del citocromo P-450IID6 como el principal antgeno de los LKMA-1 (Manns, 1992). Se encontr LKMA-2, dirigido contra el citocromo P-450 IIC9, en pacientes que estaban en tratamiento con ticrinafeno (Manns, 1992). un frmaco que h a desaparecido del mercado americano. Se ha identificado LKMA-3 en sueros de pacientes con hepatitis viral crnica tipo D (Manns. 1992).

Otros autoanticuerpos

hepticos

Figura 45-7. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimsculo liso utilizando como sustrato estmago/rin de ratn ( x 400).

Los restantes grupos de autoanticuerpos hepticos incluyen los autoanticuerpos anticitoesqueleto. anticitosol, antimembrana heptica, antilminas nucleares, especficos de hgado y autoanticuerpos antirreceptor de asialoglicoprotena. Todos ellos han sido identificados en pacientes con enfermedades hepticas autoinmunes, pero su uso como marcadores diagnsticos no est actualmente extendido (Nakamura, 1991).

Autoanticuerpos antimicrosomales de hgado y rion

Los L K M A producen el mareaje de los microsomas de hepalocitos y de tbulos proximales renales cuando se utiliza un bloque de tejido de estmago/rin de roedor como sustrato para la IFID (Fig. 45-8). Los tbulos renales dislates son caractersticamente negativos en la inmunolluorescencia. La aparicin simultnea de AMA y LKMA es posible pero muy poco probable. Se est empezando a disponer de ELISA para detectar LKMA en los laboratorios clnicos. La presencia de LKMA tambin puede ser confirmada utili-

Enfermedades hepticas
La Tabla 45-3 recoge los perfiles serolgicos tpicos en AiH, PBC y colangitis esclerosante primaria (PSC). Estos son trastornos crnicos tpicamente definidos por concentraciones sricas de transaminasas elevadas al menos durante seis meses. El diagnstico clnico diferencial comn incluye las enfermedades hepticas relacionadas con el alcohol, dao heptico inducido por frmacos, hepatitis virales, o hgado graso de diabetes mellitus u obesidad. Otros diagnsticos diferenciales menos frecuentes son la hemocromalosis idioptica, la enfermedad de Wilson, el dficit de a,-antitripsina y la afectacin heptica en enfermedades sistmicas.

Hepatitis

autoinmune

La AiH aparece de forma clsica en mujeres de aproximadamente 35 aos que presentan una elevada concentracin srica de transaminasas. hipergammaglobulinemia. amenorrea, artralgia y autoanticuerpos circulantes c o m o ANA. SMA y LKMA. Por delinicin, estas pacientes no tienen evidencia serolgica de hepatitis viral, enfermedad de Wilson u otras enfermedades en el diagnstico diferencial. Histolgicamente, la biopsia heptica muestra hepatitis crnica con necrosis en sacabocados. La respuesta del paciente a corticoides es espectacular y el fallo en la respuesta siembra dudas sobre el diagnstico de AiH. La AiH es un grupo heterogneo de enfermedades de etiologa dudosa. No hay caractersticas palognomnicas para la AiH. El Grupo Internacional de Hepatitis Autoinmune (IAHG) h a integrado las caractersticas clinicas y de laboratorio que puede presentar un paciente en un sistema de puntuacin para diagnosticar de forma definitiva o probable la AiH. La Tabla 45-4 recoge los parmetros analticos de laboratorio clnico utilizados como criteno para diagnosticar AiH; en la bibliografa se recogen otros criterios e interpretaciones por puntuaciones (Johnson, 1993: Manns, 1998). De manera relevante, la ausencia de ANA, SMA o LKMA no excluye este diagnstico. Aunque la bibliografa mdica muestra subtipos de AiH basndose en los patrones de autoanticuerpos, la utilidad clnica de estos subtipos no est clara, y la IAHG no recomienda la subdivisin de AiH basada en los perfiles de autoanticuerpos. Desde una perspectiva clnica, la AiH puede ser vista como una enfermedad heptica crnica caracterizada por la presencia de gran variedad de autoanticuerpos. La mayora de los expertos estn de acuerdo en que los tipos 1 y 2 de AiH son las principales formas de esta enfermedad, mientras que los subtipos adicionales aun deben demostrar sus resultados. Figura 45-8. Inmunolluorescencia indirecta de autoanticuerpos antimicrosomales de higado-rin utilizando c o m o sustrato estmago/rin de ratn. Aparece inmunofluorescencia de los tbulos renales proximales. pero no en los tbulos distales. (A. x 200) que tiene una apariencia citoplasmtica finamente granular a m a y o r aumento (B. x 400). Puesto que los distintos subtipos de AiH estn ampliamente citados, la clasificacin de AiH de acuerdo con su perfil serolgico se discute aqu brevemente. Los ANA caracterizan la forma clsica de hepatitis autoinmune. el tipo 1. Los SMA tambin se detectan con frecuencia. Aunque los AMA son marcadores diagnsticos de PBC especficos y sensibles, como se describe ms tarde, tambin pueden ser detectados en cerca de 15% de los pacientes con

1008 Tabla 45-3

SECCIN V E n f e r m e d a d e s hepticas a u t o i n m u n e s
ANA LKMA

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

SLA

SMA

AMA

ANTI-HCV

p-ANCA

AC

Tratamiento Inmunosupresin Inmunosupresin Inmunosupresin Inmunosupresin Soporte, traducir Soporte; traducir Inmunosupresin

Hepatitis autoinmune Tipo 1 Tipo 2a Tipo 2b Tipo 3 Tipo 4 PBC PSC AiC

+ 1

-H

i i i i i ++ i

i i

1 1 1

i +

-H + 1 1 1

i +

1 + 1 1

1
+

AiC = colangiiis autoinmune; ANA anticuerpos antmucleares. p-ANCA = anticuerpos pennucleares anticitoptasma de neulrfitos. L K M A = autoanticuerpos a n t w r u crosomales de hgado y rion; SLA = anticuerpos contra antigenos hepticos solubles; SMA = anticuerpos antimusculo liso. AMA = anticuerpos antimitocondriales. HCV = virus de hepatitis C. PBC = cirrosis biliar primaria: AC = anhidrasa carbnica, PSC = colangitis esclerosante primaria. Modificado de Manns MP Autoinmmune diseases ot the liver Clin Lab Med 1992: 12 25-40 con permiso
... y

las caractersticas clnicas e histolgicas de AiH, incluyendo la mejora clnica como respuesla a la terapia mmunosupresora. Se considera que dichos pacientes tienen un sndrome con caracterislicas que se "superponen" tanto con AiH como con PBC. El ttulo de AMA en este subgrupo de AiH raramente es superior a 1:40 (Bylund. 1992). Adicionalmente. el antgeno especfico

Tabla 45-4 P a r m e t r o s d e laboratorio y puntuacin para el d i a g n s t i c o de hepatitis a u t o i n m u n e (AiH) Parmetros analticos Bioqumica Proporcin de aumento de fosfatasa alcalina respecto a transaminasas > 3.0 < 3.0 Globulinas sricas totales, globulinas o IgG (x nivel superior normal) >2.0 1,5-2.0 1.0-1.5 <1.0
Autoanticuerpos (IFID)

Puntuacin

de estos AMA es similar al que se encuentra en la PBC clsica (Manns. 1992|. L a enfermedad heptica en la que se detectan LKMA, denominada AiH tipo 2, se ha subdividido en dos grupos, los tipos 2a y 2b. Generalmente los pacientes con esta variante de AiH tienen ANA y SMA negativos. Sin embargo, se detectan con frecuencia autoanticuerpos contra mtcrosomas tiroideos, tiroglobulina y clulas parietales. La AiH de tipo 2 se caracteriza por bajos niveles de IgA y porque la hipergammaglobulinemia es menos destacada que la observada en la AiH tipo 1 (Manns. 1992). La de tipo 2a aparece en mujeres jvenes que tienen altos ttulos de KLMA-1. serologa negativa para virus de hepatitis C y enfermedad activa pero que responde a esteroides. La variante de tipo 2b aparece en pacientes mayores y la preponderancia femenina es menor. Estos pacientes tienen ttulos bajos de LKMA-1, manifiestan enfermedad heptica leve y a menudo tienen serologa positiva para el virus hepatitis C. Su enfermedad tiende a responder menos a la inmunosupresin que el tipo 2a. Algunos autores han propuesto un tercer grupo de AiH separado de los otros subgrupos de AiH basndose en la identificacin de autoanticuerpos contra antigenos solubles de hgado (SLA) (Manns, 1992). Aunque la determinacin de estos autoanticuerpos podra convertirse en importante puesto que se ha evidenciado como el nico marcador serolgico en cerca del 25% de los pacientes de AiH, los test fiables para detectar SLA son tcnicamente difciles y an no estn disponibles para su uso habitual en el laboratorio clnico (Manns. 1992). Puede ser que los altos ttulos de SMA dirigidos contra actina F caractericen un cuarto subgrupo de las AiH que se observa frecuentemente en nios (Manns. 1992).

-2 +2

+3 +2 +1 0

Adultos ANA. SMA. LKM1 >1 80 1 80 1.40 <1:40 Nios ANA LKM >1:20 1:10 o 1:20 <11 0 SMA >1:20 1:20 <1:20 AMA Delectado No detectado Adultos y nios (si no se detectan ANA. SMA, LKM1) Otros autoanticuerpos hepticos (SLA. ASGP-R. LC1) Detectados No deteclados Marcadores virales HAV o HBV aguda HCV por ELISA o RIBA ARN HCV por PCR Otras inlecciones virales activas Seronegativo para virus conocidos Factores genticos HLA-B8-DR3 o alotipo DR4

+3 +2 +1 0 +3 +2 0 +3 +2 0 -2 0 +2 0 -3 -2 -3 -3 +3 +1

Cirrosis

biliar primaria

La PBC es un trastorno crnico, progresivo y colestsico que sucede tpicamente en mujeres jvenes o de mediana edad. Los pacientes pueden estar asmtomticos o tener sntomas de colestasis (picores). Estudios de laboratorio han demostrado una elevacin de la fosfatasa alcalina con o sin hiperbilirrubinemia. as como un incremento de IgM y AMA. Pueden producirse fenmenos inmunolgicos extrahepticos como el fenmeno de Raynaud. complejo sicca. artritis reumatoide. tiroiditis. esclerodermia o enfermedad celaca (Manns, 1992: Bylund, 1992). Histolgicamente, el hgado muestra varios estadios de colangitis destructiva no supurativa. Los AMA son los marcadores diagnsticos ms sensibles y especficos para PBC. Como regla general, un ttulo de AMA superior o igual a 1:160 es altamente predictvo de PBC, aunque cerca del 10% de los pacientes de PBC tienen ttulos de AMA de 1:16 o menores (Bylund. 1992). Cerca del 95% d e los pacientes con caractersticas tpicas de PBC han mostrado tener anti-M2 o anti-M9, mientras que el 5% restante de pacientes son A M A negativos. La causa de la PBC es desconocida. Aunque esta enfermedad se asocia clsicamente con AMA sricos, el dao inmune mediado por clulas T a los conductos biliares interlobuhllares intrahepticos predomina en las lesiones tisulares (Manns. 1991.1998: Batts. 1991: Poupon, 1996). El reciente descubrimiento de anticuerpos contra retrovirus en pacientes con PBC se ha atribuido a una respuesta inmune o a la reactividad inmune contra protenas virales que comparten eptopos con retrovirus (Masn. 1998).

Adaptado de Johnson PJ. McFarlane IG. Convenors on behall ol the panel: Meeting report International autoimmune hepatitis group. Hepatology 1993: 18: 998-1008. con permiso

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1009

El diagnstico de PBC AMA negativo deriva de la presentacin clnica, hallazgos en la biopsia heptica y colangiograta, siendo esta ultima realizado para descartar PSC.

Colangitis esclerosante primaria

La PSC ocurre de forma tpica en varones con historia de enfermedad inflamatoria intestinal o diarrea. En el 50% de los pacientes, la enfermedad inflamatoria intestinal ligada a PSC es la colitis ulcerosa. El diagnstico de PSC se basa de forma general en la colangiografa, que revela un patrn arrosariado caracterstico de los conductos biliares debido a constricciones multifocales en estos lugares. La lesin histolgica ms destacada es la colangitis fibrosa de conductos biliares grandes o pequeos, aunque en la prctica se puede observar un amplio espectro de lesiones inflamatorias crnicas en la biopsia heptica. Estudios bioqumicos de rutina demuestran la elevacin de la fosfatasa alcalina y un aumento de transaminasas con o sin hiperbilirrubinemia. Aunque pueden estar presentes los ANA, los AMA no lo estn. Adems, la IFID en neutrfilos fijados en etanol y formalma exhibe una alta prevalencia de anticuerpos citoplasmticos perinucleares atipicos antineutrfilos descritos (Bansi, 1996; Lo, 1994; Gur, 1995: Manns, 1992). Figura 45-9. Inmunolluorescencia indirecta de autoanticuerpos m i c r o s o m a l e s tiroideos utilizando tejido tiroideo de m o n o no lijado c o m o sustrato (x 400).

Colangitis autoinmune
La colangitis autoinmune es una enfermedad heptica crnica colestsica que no parece ser una variante de PSC (Goodman, 1995: Tsui, 1997). La presentacin clnica y la apariencia histolgica del hgado se asemejan a la PBC. pero los hallazgos serolgicos imitan a los de la AiH tipo 1. No se detectan AMA. Adems se ha detectado un autoanticuerpo contra la anhidrasa carbnica en algunos pacientes con AiC (Gordon, 1995). Aunque la conexin entre AiC y PBC no est resuelta, la AiC podra ser lo mismo que una PBC AMA negativa. Generalmente los pacientes responden a la inmunosupresin.

la poblacin lemenina adulta sin enlermedad clnica tiene anti-Tg o anti-TPO detectables. lo que desata la pregunta sobre su significado patognico (Patrick, 1993) El reemplazo de hormona tiroidea queda reservado para pacientes con hipotiroidismo probado. Existen semejanzas entre la enfermedad de Graves y la tiroiditis de Hashimoto (Utiger, 1991). Ambas estn asociadas con HLA-B8: ambas comparten fundamentalmente una patognesis similar, y se cree que la enfermedad de Graves puede progresar hacia una tiroiditis de Hashimoto (Utiger, 1991; Patrick. 1993).

Autoanticuerpos
En las enfermedades tiroideas autoinmunes hay tres autoanticuerpos principales, que incluyen los anti-TPO, anti-Tg y autoanticuerpos contra el receptor de la hormona estimulante de tiroides (anti-TSHR) (Naparstek, 1993). Aunque los anticuerpos anti-TPO y anti-Tg se consideran marcadores de enfermedad tiroidea autoinmune. su papel etiolgico no ha sido esclarecido. Pueden aparecer tambin en otras enfermedades autoinmunes especficas de rgano. Los anticuerpos anti-TSHR. sin embargo, desempean claramente un papel causal en la enfermedad tiroidea autoinmune (Naparstek, 1993).

GLNDULA TIROIDES Enfermedades tiroideas

Las enfermedades tiroideas autoinmunes incluyen la enfermedad de Graves y la tiroiditis de Hashimoto (Burek, 1995).

Enfermedad de Graves
El paciente con enfermedad de Graves presenta sntomas de hipertiroidismo y bocio difuso. La mxima incidencia aparece entre la tercera y cuarta dcadas de la vida, y la razn mujer/hombre es de 4 a 8:1; entre el 60% y el 70% de estos pacientes manifiestan adicionalmente trastornos oculares (Patrick, 1993). Los datos de laboratorio muestran un incremento en los niveles de triyodotironina (T) y tiroxma (T,). y tambin en la captacin de Tj. La terapia est dirigida a reducir la capacidad de la glndula tiroides para responder a la estimulacin por autoanticuerpos. Esto se puede conseguir por una tiroidectoma subtotal, por administracin de yodo radiactivo, o con la utilizacin de frmacos como propiltiouracilo o metimazol (Patrick, 1993).

Autoanticuerpos contra la peroxidasa tiroidea

Los anticuerpos anti-TPO van dirigidos contra un antgeno de 105 kDa contenido en la fraccin microsomal del citoplasma de clulas epiteliales tiroideas (Burek. 1995). Aunque el mtodo de laboratorio que se utiliza ms comunmente para detectar anti-TPO es la tcnica de hemaglutinacin pasiva cuantitativa (Nordyke, 1993). el ELISA tambin puede utilizarse con este fin en los laboratorios clnicos. Histricamente, IFID ha sido un mtodo popular y sensible para la deteccin de anti-TPO ("anticuerpos antimicrosomales"). El test de IFID utiliza como sustrato secciones de tejido crioconservado de mono o humano, no fijado y secado al aire. Los sueros positivos marcan el citoplasma de las clulas epiteliales foliculares tiroideas pero no su ncleo (Fig. 45-9). Se debe diferenciar entre anti-TPO y AMA cuando se observe mareaje citoplasmtico granular grueso: esto puede hacerse analizando los sueros con tejido de estomago/rin de ratn. Se pueden detectar anti-TPO en el suero de pacientes tanto con enfermedad de Graves como con tiroiditis de Hashimoto, y su presencia y titulo se correlacionan luertemente con la enfermedad clnica activa (Burek. 1995). Existe cierta controversia entre los investigadores acerca de si la determinacin de anti-TPO aislada es suficiente para detectar enfermedad tiroidea autoinmune de manera dable (Kaplan. 1999; Nordyke, 1993). El papel patognico de los anti-TPO permanece sin esclarecer (Naparstek. 1993).

Tiroiditis de Hashimoto
La tiroiditis de Hashimoto es la forma ms comn de tiroiditis. y se caracteriza funcionalmente por una lenta progresin hasta hipotiroidismo. En pacientes con hipotiroidismo. los niveles de T T. y captacin de T suelen ser bajos y la cantidad de hormona estimulante del tiroides (TSH) se incrementa anormalmente (Patrick, 1993). La incidencia de tiroiditis de Hashimoto es mxima desde la tercera a la quinta dcadas, con una razn mujeres/hombres de 10:1. Los autoanticuerpos dirigidos contra los antigenos de tiroglobuI m a (anti-Tg) y peroxidasa (microsomal) tiroidea (anti-TPO). son clnicamente los ms importantes para el diagnstico (Patrick. 1993), pero hasta el 20% de
3

1010 Autoanticuerpos contra

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

tiroglobulina

Los anti-Tg estn dirigidos contra la tiroglobulina, que es la forma de almacenaje de las hormonas tiroideas en los folculos de la glndula tiroides (Burek, 1995). Se encuentran disponibles varios mtodos para la medida de anti-Tg, incluyendo la tcnica de hemaglutinacn pasiva cuantitativa, IFID y ELISA. La tcnica de hemaglutinacn pasiva cuantitativa tanto con hemaglutinacn con cloruro de cromo como con glbulos rojos recubiertos es el mtodo ms sensible y ampliamente utilizado para la deteccin de anti-Tg (Burek, 1995). Los anticuerpos anti-Tg detectados por hemaglutinacn son identificados con ttulos superiores a 1:1.000 en cerca del 80% de los pacientes con tiroiditis de Hashimoto (Burek. 1995). Los pacientes con enfermedad de Graves (60%) o carcinoma de tiroides (30%) u otras enfermedades autoinmunes como la anemia perniciosa o el sndrome de Sjgren, y entre el 3% y el 18% de los individuos aparentemente normales, tambin pueden tener anti-Tg, pero sus ttulos de hemaglutinacn son generalmente (>90%) inferiores a 1:1.000 (Burek, 1995). Para localizar anti-Tg, se realiza una IFID utilizando secciones de tejido criopreservadas de glndula tiroides de mono. Se requiere la fijacin para impedir la prdida de tiroglobulina durante las etapas de lavado. Se describen tres patrones de nmunofluorescencia cuando estn presentes los anti-Tg (Burek, 1995): 1) patrn flocular; 2) espacios coloidales en sombra pero fluorescencia perifrica brillante; y 3) mareaje difuso, brillante, uniformemente marcado en un patrn de "vidrio molido" atribuido a la reaccin de anti-Tg con CA2 (Burek, 1995). CA2, denominado segundo antgeno coloidal, se detecta como nico marcador serolgico de las tiroiditis autoinmunes en el 5% y el 8% de los pacientes que son positivos por IFID pero negativos para anti-Tg y antiTPO utilizando otros mtodos (Bigazzi, 1992).

do del mtodo de deteccin (Bigazzi. 1992; Brunt, 1995). Los TSI. que suelen ser de la clase IgG, estimulan la produccin de hormonas tiroideas activando el sistema de adenilato ciclasa tras su unin al TSHR (Patrick, 1993). Los ensayos para anti-TSHR son tiles para confirmar la enfermedad de Graves en pacientes hipertiroideos con resultados equvocos en los estudios habituales de laboratorio (Bigazzi, 1992). Adicionalmente, se puede utilizar un ensayo de anti-TSHR para monitorizar la terapia de sustitucin hormonal del paciente o para diagnosticar la tirotoxicosis neonatal (Bigazzi, 1992). Existen dos clases principales de ensayos para anti-TSHR, denominados bioensayos y ensayos de unin; los aspectos metodolgicos son revisados en otros trabajos (Bigazzi, 1992; Patrick, 1993; Gupta, 1988). Nuevos ensayos con el suero del paciente basados en la estimulacin de adenosin monofosfato cclico (cAMP) en clulas de tiroides de rata, mantenidas en cultivo tisular, pueden confirmarse como una mejora sobre las dificultades tcnicas de los bioensayos (Burek. 1995). Los TSI son analizados en bioensayos que determinan el aumento de actividad mediado por TSHR por la medida del cAMP liberado o bien por la medida de la captacin de yodo por clulas tiroideas mantenidas en cultivo (Brunt, 1995). Los TBII son analizados por la determinacin de la inhibicin de la unin de TSH marcada radiactivamente a su receptor o utilizando bioensayos con cAMP (Brunt, 1995).

RION

GLOMERULONEFRITIS
La glomerulonefritis es la principal causa de enfermedad renal primaria. Se piensa que los mecanismos mediados por inmunidad juegan un papel importante en la patognesis de la glomerulonefritis, aunque la confirmacin experimental de dichos mecanismos autoinmunes an no ha sido llevada a cabo. La IFD tiene un papel importante en el estudio y diagnstico de la glomerulonefritis. Los patrones de reactantes inmunes pueden ser divididos a grandes rasgos en aquellos que causan depsitos granulares o lineales en el glomrulo u otras estructuras del rion examinadas con IFD. Los depsitos granulares se han atribuido a complejos inmunes (IC) que abandonan la circulacin o se forman in situ (McCIuskey, 1995). Los patrones de IFD de depsitos inmunes asociados con las principales enfermedades glomerulares se resumen en la Tabla 45-5. Se encuentran disponibles revisiones minuciosas de estos trastornos en varios textos (McCIuskey, 1995; Heplinstall, 1992). Sin embargo, para esta exposicin, slo se presentan en mayor detalle los autoanticuerpos contra la membrana basal glomerular (anti-GBM).

Autoanticuerpos contra el receptor de la hormona estimulante de tiroides

Los autoanticuerpos anti-TSHR constan de dos grupos de autoanticuerpos que pueden tanto estimular como bloquear los TSHR, causando respectivamente hipertirodsmo o hipotiroidismo. Los autoanticuerpos anti-TSHR que se unen a estos receptores y estimulan la produccin de hormonas se denominan inmunoglobulinas estimulantes del tiroides (TSI), mientras que los autoanticuerpos anti-TSHR que se unen a los receptores y bloquean la unin y (uncin de TSH se denominan inmunoglobulinas inhibidoras de la unin de TSH (TBII) (Brunt, 1995, fvlooij, 1993). Los TSI son probablemente la causa del hipertiroidismo en la enfermedad de Graves (Bigazzi, 1992; Brunt, 1995: Wilkin. 1990). Su prevalencia varia desde un 55% hasta un 95%, dependien-

f Tabla 45-5 Hallazgos por nmunofluorescencia directa en las principales enfermedades glomerulares Patrn de nmunofluorescencia y enfermedad Reactivos inmunes Depsitos granulares, mesangiales y en GBM
Glomerulonefritis aguda postestreptoccica Nefritis lpica proliferativa difusa Glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN. tipo I) Glomerulonefritis idioptica en semilunas por complejos inmunes Enfermedad de depsitos densos (MPGN tipo II) Infecciones crnicas (p.ej. endocarditis bacteriana) C 3 IgG difuso, IgM IgG, IgA, IgM, C 3 C 3 , IgG. IgM IgG. C 3 IgM C 3 (globular) IgM IgG. IgM. C 3

Granulares, predominancia mesangial

Nefritis lpica Mesangial Proliferativa focal Prpura de Henoch-Schnlein Nelropata IgA IgG, C 3 , generalmente IgM e IgA IgG, C 3 , IgA; depsitos focales en el asa capilar Predominantemente IgA; IgG. IgM, C 3 predominantemente IgA: a menudo IgG. IgM. C 3 IgG C 3 . IgA. IgM IgM IgG C 3 , masas mtravasculares IgG, C 3 ; IgA e IgM poco frecuentes Generalmente cadena ligera K, tal vez en TBM. vasos sanguneos, intersticio

Granulares, predominantemente GBM

Nefritis lpica membranosa Crioglobulinemia mixta

Lineal, en GBM
Nefritis por anti-GBM Nefropata por cadenas ligeras

GBM = membrana basal glomerular; TBM = membrana basal tubular. Modificado a partir de McCIuskey RT, Collms AB, Niles JL Kmdney. En Colvin RB, Bhan AK, McCIuskey (eds): Diagnoslic Immunopatthology, 2> ed. New York, Raven Press. 1995, pg 109. con permiso.
...

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

1011

Enfermedad por anticuerpos contra la membrana basal glomerular

La presentacin clnica en pacientes con enfermedad por anticuerpos antiGBM vara en cuanto que cerca de un 50% tienen enfermedad limitada al rion mientras que el otro 50% tiene sntomas tanto renales como pulmonares. Esta ltima presentacin es denominada frecuentemente sndrome de Goodpasture. Raramente los pacientes con enfermedad por anticuerpos antiGBM pueden tener enfermedad limitada a los pulmones (Wilson, 1987). El diagnstico de la enfermedad por anticuerpos anti-GBM requiere la deteccin de autoanticuerpos anti-GBM contra el dominio NC1 del colgeno tipo I V (McCIuskey. 1995), el denominado antgeno de Goodpasture. Los mtodos para la deteccin de anticuerpos anti-GBM incluyen IFID. ELISA y radioinmunoensayo (RA) (McCIuskey, 1995: Wilson, 1987): algunos investigadores han desarrollado adicionalmente un test sensible de transferencia western (McCIuskey, 1995). Debido a que la IFID es difcil de estandarizar y requiere experiencia para realizarse, los mtodos para la deteccin se han centrado, en lugar de esto, en la validacin de RA o ELISA cuantitativos. Actualmente se encuentra disponible un kit ELISA con licencia comercial para la determinacin de anticuerpos anti-GBM. Este ensayo determina los valores del paciente a partir de una curva estndar y permite dar resultados como rangos negativos, dudosos limitantes o positivos. La mayora de los pacientes con enfermedad por anticuerpos anti-GBM activa parecen tener valores superiores a 1 0 0 unidades. Aunque se pueden obtener valores dudosos limitantes tanto en enfermedad por anticuerpos anti-GBM activa como latente, tambin hemos observado estos valores en pacientes con trastornos renales que no son enfermedad por anticuerpos anti-GBM. La coexistencia de anticuerpos contra el citoplasma de neutrdlos (ANCA) ha sido documentada en algunos pacientes con glomerulonefritis rpidamente progresiva (RPGN) (McCIuskey, 1995). La coexistencia de estos dos autoanticuerpos vara desde un 0% hasta 40% de los pacientes con RPGN. lo que se acompaa por alguna evidencia de que la presencia de ANCA en pacientes con enfermedad por anticuerpos anti-GBM proporciona un pronostico renal mejor (McCIuskey, 1995).

Adems de los autoanticuerpos adrenocorticales. se han detectado otros autoanticuerpos en pacientes con enfermedad de Addison, incluyendo autoanticuerpos contra las clulas esteroideas y autoanticuerpos que se unen a los receptores de la hormona adrenocorticotropa (Muir, 1993).

PNCREAS
Diabetes mellitus (vase Cap. 11) Diabetes mellitus es el trmino diagnstico aplicado a un grupo de trastornos metablicos que comparten la hiperglucemia como nexo comn (Eisenbarth, 1995). El que la DM sea un diagnstico serio est documentado por el hecho de que las complicaciones agudas y crnicas multiorgmcas justifican un 15% del total del gasto econmico del sistema sanitario en EE.UU. (Schatz, 1995). Sin embargo, se ha hecho un progreso significativo en el cuidado de los pacientes diabticos gracias al conocimiento de que un control agresivo de la glucosa en sangre disminuye el riesgo de desarrollo y progresin de complicaciones vasculares (Schatz, 1993).

Subtipos

clnicos

Existen dos subgrupos principales de DM: el tipo 1. DM msulino-dependienle (DMID); y el tipo 2, DM no insulino-dependiente (NIDDM) (Eisenbarth, 1995). La DM tipo 2 ocurre con ms frecuencia en individuos obesos mayores de 30 aos. Estos pacientes tienen insulina plasmtica, pero en concentracin insuliciente para prevenir la hiperglucemia (VanArsdel. 1993). Algunos pacientes tipo 2 tienen autoanticuerpos asociados a insulina en su suero (VanArsdel, 1993). Los pacientes tipo 2 carecen de la mayora de las otras caractersticas autoinmunes observadas en pacientes tipo 1, aunque la diferencia entre tipo 1 y tipo 2 no siempre es tan fcil (Eisenbarth, 1995). Los pacientes tipo 2 se tratan por medio del control del peso y con medicaciones que estimulen la produccin de insulina (VanArsdel, 1993). La DM tipo 1 se considera una enfermedad autoinmune crnica que aparece en individuos genticamente susceptibles y est causada por la destruccin de las clulas p productoras de insulina en los islotes de Langerhans pancreticos (Harrison, 1990). Esta destruccin de las clulas |5 da lugar con el tiempo a una deficiencia de insulina e hiperglucemia crnica. En los Estados Unidos, la DMID aparece en 1 de cada 300 personas (esto es, una incidencia media anual de 15 por 100.000 personas) (Eisenbarth, 1995). Existe un slido soporte para concluir que la DMID es una enfermedad crnica autoinmune (Harrison, 1990; Eisenbarth, 1995: Schatz, 1995). La deteccin de autoanticuerpos circulantes precediendo a la manifestacin clnica de DMID refuerza esta conclusin y proporciona una informacin importante respecto a la evolucin natural de la DMID y la capacidad para predecir su aparicin (Schatz. 11995). Los principales tipos de autoanticuerpos circulantes en DMID son los siguientes: autoanticuerpos contra las clulas de los islotes, autoanticuerpos contra el cido glutmico descarboxilasa, autoanticuerpos contra insulina y autoanticuerpos asociados a insulinoma-2 y 2|i.

GLNDULA SUPRARRENAL Enfermedad de Addison

La insuficiencia adrenocortical crnica no tuberculosa, o enfermedad de Addison, tiene una prevalence estimada de entre casos por 100.000 personas (Muir, 1993). Del 65% al 70% de estos pacientes tienen autoanticuerpos circulantes contra los microsomas y la membrana plasmtica de las clulas adrenocorticales. demostrable utilizando IFID sobre secciones congeladas de corteza adrenal humana (Patrick, 1993; Burek. 1995; Muir. 1993). La 21 -hidroxilasa y la 17-t/hidroxilasa son dos autoantigenos que se han identificado c o m o reactivos con autoanticuerpos adrenocorticales (Song, 1994). No se han encontrado autoanticuerpos adrenocorticales en la enfermedad de Addison causada por tuberculosis u otros agentes exgenos (Patrick, 1993). De manera destacable, cerca del 45% de los individuos asintomticos con autoanticuerpos adrenocorticales desarrollan trastornos de la funcin adrenocortical en 2,5 aos tras la identificacin del autoanticuerpo (Muir, 1991). La enfermedad de Addison asociada con autoanticuerpos es la que se diagnostica ms frecuentemente en personas entre 20 y 50 aos y es de dos a tres veces ms frecuente en mujeres cuando se diagnostica despus de los 30 aos (Patrick. 1993; Muir. 1993). Las pruebas de laboratorio muestran acidosis metablica. hiperpotasiemia. hiponatremia y bajos niveles de cloruro y bicarbonato sricos. Los niveles de Cortisol plasmtico estn disminuidos y los niveles de hormona adrenocorticotropa elevados (VanArsdel, 1993). Consecuentemente, la terapia consistir en el reemplazo de glucocorticoides y mineralocorticoides (Patrick, 1993). La enfermedad de Addison asociada con autoanticuerpos puede ocurrir por s misma, pero es ms comn que est acompaada por otras enfermedades autoinmunes c o m o parte de un sndrome autoinmune poliglandular (APS) (Muir. 1993). Estas enfermedades acompaantes pueden incluir tiroiditis autoinmune. anemia perniciosa o diabetes mellitus insulino-dependiente (Patrick, 1993).

Autoanticuerpos contra las clulas de los islotes

La IFID es el mtodo clsico para la deteccin de anticuerpos contra las clulas de los islotes (ICA) (Atkinson, 1993). Se utilizan secciones congeladas de pncreas humano como tejido de sustrato para detectar fluorescencia citoplasmtica, finamente granular y especifica en todas las clulas de los islotes pancreticos (Fig. 45-10). Se recomienda sangre humana del grupo O como sustrato para reducir las interferencias de fondo no especficas debidas a isohemaglutininas ABO. Utilizando IFID, los ICA son detectables en cerca del 80% de los pacientes con DMID delectada de novo, entre el 3% y el 4% de parientes no diabticos de pacientes con DMID. y slo en el 0.5% de sujetos clnicamente normales (Atkinson, 1994). Los ICA consisten en autoanticuerpos que incluyen aquellos especficamente reactivos con autoanticuerpos contra la descarboxilasa de cido glutmico (GADA), asi c o m o aquellos que son ICA reactivos con anticuerpos no GADA (Atkinson, 1993; Kaufman, 1992).

1012

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGIA

identificar individuos con riesgo de DMID est siendo evaluado para determinar la necesidad de estudios metablicos que aseguraren la intolerancia a la glucosa subclinica y demanda de inmunoterapia en la fase preclinica de la DMID (Maclaren, 1992). La determinacin de GADA utilizando ELISA puede mejorar finalmente la viabilidad de la difusin del cribado de este autoanticuerpo. Adems de los autoanticuerpos sobre los que se ha disculido antes, los pacientes con DMID tambin pueden tener autoanticuerpos anti-TPO, contra clulas parietales y anti-adrenocorticales, por lo que debe realizarse un cribado de estos autoanticuerpos en pacientes con DMID al menos una vez (Maclaren. 1992).

TRACTO GASTROINTESTINAL
Figura 45-10. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos contra las clulas de los islotes utilizando c o m o sustrato pncreas h u m a n o de grupo sanguneo O (x 400).

Anemia perniciosa
La anemia perniciosa (PA) se caracteriza por aclorhidria rpida resistente a histamina, hipergastrinemia y dficit de vitamina B (Brown, 1995). El comienzo gradual de los sntomas neurolgicos y el desarrollo de anemia megaloblstica son caractersticas tpicas del curso clnico de P A (Patrick, 1993). Morfolgicamente, la biopsia de mucosa del cuerpo del estmago contiene evidencias de grastritis atrfica crnica.
tt

Los ICA deben ser titulados en las unidades de la Juvenile Diabetes Foundation (JDF) en referencia a un suero estndar de 80 unidades del Immunology of Diabetes Workshop; ttulos superiores a 20 unidades JDF parecen tener significado pronstico (Maclaren, 1992). Se encuentran disponibles ensayos comerciales para ICA con sustrato de primate.

Autoanticuerpos contra insulina

Se han identificado autoanticuerpos contra insulina (IAA) en cerca del 50% de los pacientes con DMID en el momento del diagnstico y antes de empezar con la terapia insulnica (Atkinson, 1994). Los I A A se suelen determinar utilizando ensayo de radioinmunopreciptacn competitiva tcnicamente exigente. Este ensayo no puede distinguir entre IAA de aparicin espontnea de aquellos que aparecen como resultado de la terapia con insulina. Por tanto, se debe realizar el ensayo para IAA antes de que la insulina sea administrada.

La PA est asociada con autoanticuerpos circulantes contra clulas parietales (APC) en el 90% de los pacientes y contra el factor intrnseco (anti-IF) en entre el 60% y 75% de los pacientes, aunque los anti-IF pueden ser ms especficos para PA(Burek. 1995; Brown, 1995). Los APC son detectados por IFID llevada a cabo sobre bloques de tejido de estmago/rin de ratn. Este bloque de tejido combinado permite la identificacin del mareaje especfico de clulas parietales cuando no hay mareaje concomitante de tbulos renales como se vera en presencia de AMA(Fig. 45-11). Los anti-IF son detectados ms frecuentemente por RA. De los dos tipos conocidos de anti-IF, los anti-IF tipo 1, o autoanticuerpos bloqueantes, impiden la unin de IF a la vitamina B. , y los de tipo 2, o autoanticuerpos de unin, reaccionan con la vitamina B, libre o complejada para inhibir la accin de IF (Karen. 1994; Patrick, 1993). Los anti-IF tipo 1 estn considerados ms sensibles y especficos para el diagnstico de P A (Karen, 1994). Sin embargo, la identificacin de APC o de anti-IF no es necesaria para el diagnstico de PA, La PA puede ocurrir en asociacin con otras enfermedades autoinmunes como la liroiditis autoinmune o enfermedad de Addison y puede formar parte tanto de APS 1 como de APS 2 (Patrick, 1993).
; 2

Autoanticuerpos contra la descarboxilasa de cido glutmico

Los GADA se detectan en la mayora de pacientes recin diagnosticados de DMID y en cerca del 80% de parientes de primer grado, prediabtcos, de pacientes con DMID (Hagopian, 1993. Schatz, 1995). Los dos autoantgenos GAD, clasificados por peso molecular, se denominan GAD65 y GAD67 (Atkinson, 1993). Los GADA en pacientes con DMID son dirigidos en primer lugar contra la isoforma GAD65, que se encuentra principalmente en los islotes pancreticos y en el sistema nervioso central (SNC), donde acta como una enzima responsable de la formacin del neurotransmisor inhibidor cido y-aminobutrico (Barmeier, 1992; Luhder, 1994; Maclaren. 1988; Kaufman. 1992). La forma GAD67 predomina en los nervios perifricos (Falorni, 1994; Atkinson. 1993). Los GADA tambin estn asociados al raro sndrome del hombre rgido (Eisenbarth, 1995). De manera a destacar, un alto porcentaje de estos pacientes tiene DMID.

Enteropata sensible al gluten

La enteropata sensible al gluten (GSE), o espre no tropical, es una enfermedad del intestino delgado caracterizada por malabsorcin de la grasa gastrointestinal, que puede estar infradiagnosticada en Estados Unidos

Interpretacin y utilidad clnica de los autoanticuerpos en DMID

Los autoanticuerpos ICA. GADA, IAA e IA-2 se usan frecuentemente como marcadores predctivos para DMID. Los ICA son un marcador especfico asociado con un riesgo elevado de desarrollar DMID, pero los ICA no persisten. Los GADA se detectan generalmente antes del diagnstico de DMID y generalmente disminuyen su titulo tras el comienzo de la clnica de DMID (Schatz, 1994). Los GADA e IA-2, tanto separados como juntos, parecen ofrecer la mejor utilidad predictiva para el cribado (Schatz, 1995). La identificacin de autoanticuerpos contra los islotes puede ser utilizada para confirmar la autoinmunidad en pacientes con DMID aguda, lo que diferencia la DMID de tipo 1 de la de tipo 2. El uso de estos marcadores para Figura 45-11. Inmunofluorescencia indirecta de autoanticuerpos c o n t r a clulas parietales gstricas utilizando estmago/rin de ratn c o m o suslralo (x 400).

CAPTULO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECFICAS

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(u-BTx) en RA competitivo para medir las diferentes formas de anti-AChR (Barna. 1995). La M B T X es una proteina de veneno de serpiente que se une irreversiblemente a AChR, pero se une al receptor de Ach en un sitio diferente del lugar de unin de los anti-AChR (Rose, 1995). Los AChR se obtienen a partir de extractos de msculo esqueltico humano denervado, c o m o puede ser a partir de amputaciones diabticas, o a partir de cultivo tisular. Para la determinacin, se marcan los AChR con u-BTx y despus son incubados con el suero del paciente para permitir que cualquier autoanlicuerpo anti-AChR presente se una a los AChR en los sitios cercanos al lugar de unin de u-BTx. Tras la incubacin, los complejos radiomarcados son precipitados por inmunoglobulina anti-humana polivalente, y se procede a detectar la radiactividad en el precipitado lavado, despus de la correccin de las uniones inespecficas. El grado de radioactividad en el precipitado es directamente proporcional a la cantidad de anti-AChR en el suero del paciente. Se pueden utilizar modificaciones de este ensayo de unin para identificar autoanticuerpos anti-AChR bloqueantes y moduladores. En un ensayo de bloqueo, se permite que el suero del paciente, que contiene anti-AchR. incube con AChR antes de la adicin de a-BTx. La base de esta tcnica es la premisa de que los anti-AChR capaces de bloquear la unin de r/.-BTx tambin bloquean la unin de Ach a AChR (Rose. 1995). La cantidad de radiactividad en el precipitado es, por tanto, inversamente proporcional a la cantidad de anti-AChR en el suero del paciente. Se piensa que los autoanticuerpos anti-AChR moduladores aceleran la degradacin de AChR, pero su determinacin en el laboratorio clnico es tcnicamente difcil y no est ampliamente instaurada.

Figura 45-12. Inmunofiuorescencia indirecta de autoanticuerpos IgA contra endomisk) utilizando estmago de mono como sustrato (x 400)

(Ferguson, 1997). La hipersensibilidad al gluten, o derivados del gluten, es la causa de GSE (Brown, 1995). La biopsia de intestino delgado de un paciente con GSE es anormal de forma variable, pero los cambios caractersticos incluyen la atrofia vellosilaria, elongacin de las criptas, lintocitos intraepiteliales y mitosis en las criptas. Los pacientes con GSE manifiestan varias alteraciones inmunes humorales. Es interesante que los niveles de IgA en suero estn generalmente elevados en pacientes con GSE, excepto en aquellos con un dficit de IgA, lo que ocurre en pacientes con GSE ms frecuentemente que en individuos normales (Brown, 1995). Los pacientes con GSE pueden tener autoanticuerpos IgA circulantes antiendomisio, antireticulina o antigliadina. Los autoanticuerpos IgA antiendomisio se detectan por IFID utilizando esfago de mono como tejido sustrato (Fig. 45-12). La transglutaminasa tisular (ttg) es probablemente el autoantgeno del endomisio (Dietench. 1997). Su identificacin est considerada sensible y especfica para el diagnstico de GSE o bien GSE asociada con DH (GSE-DH) (Talal, 1997). La medicin del ttulo de autoanticuerpo IgA antiendomisio puede ser utilizada para monitorizar la adherencia de un paciente a una dieta libre de gluten (Karen, 1994). Los autoanticuerpos antirreticulina son detectados por IFID sobre un bloque de tejido combinado de estmago/rin de ratn. Estos autoanticuerpos son detectables en adultos (40%), asi como en nios (60%) con GSE y tambin en adultos con GSE-DH (20%). Sin embargo, los autoanticuerpos antirreticulina no son especficos para el diagnstico, pudiendo estar presentes tambin en pacientes con enfermedad de Crohn, miastenia gravis, sndrome de Sjgren. y otras enfermedades del tejido conectivo. Los anticuerpos antigliadina son deteclados por ELISA en casi todos los pacientes con GSE o GSE-DH (Brown, 1995). El antgeno diana, la gliadina, se purifica a partir de gluten y es utilizado en la fase slida del ELISA para detectar estos autoanticuerpos. Como los autoanticuerpos IgA antiendomisio, los autoanticuerpos antigliadina pueden ser utilizados para monitorizar la adherencia de un paciente a una dieta sin gluten.

Esclerosis mltiple
La MS es una enfermedad desmielinizante relativamente corriente que involucra a la sustancia blanca del cerebro y la mdula espinal. La MS ocurre ms frecuentemente en mujeres que en hombres (razn de 2:1) y se manifiesta generalmente durante las primeras etapas de la edad adulta con una amplia variedad de manifestaciones clnicas posibles. Cerca del 50% de estos pacientes experimenta periodos alternantes de enfermedad activa y remisiones, mientras que el resto sigue un curso progresivo crnico (Steinman, 1993; McFarland, 1995). El diagnstico de MS deriva de los hallazgos clnicos y la exclusin de cualquier otro trastorno. Aunque la causa de MS es desconocida, se considera a los mecanismos autoinmunes como importantes en la patognesis de esta enfermedad (McFarland, 1995). Sin embargo, no hay ningn autoanlicuerpo circulante lo suficientemente caracterstico en la MS como para ser aceptado como diagnstico en las determinaciones de rutina del laboratorio clnico. Sin embargo, el examen de laboratorio de liquido cefalorraqudeo (LER) proporciona informacin importante que ayuda al diagnstico de MS en un marco clnico apropiado (Barna, 1987). La sntesis de IgG se incrementa anormalmente en el SNC de pacientes con MS, de tal forma que la determinacin del ndice de IgG y la tasa de sntesis de IgG proporciona resultados tiles, pero no especficos (McFarland, 1995; Zweiman, 1991; Karen. 1994: Valenzuela. 1987). La determinacin de bandas oligoclonales en el LCR es tambin til en un marco clnico apropiado, ya que son identificadas en ms del 90% de los pacientes con MS: sin embargo, su presencia no es especifica, puesto que pueden ser detectadas en pacientes con diversos trastornos como neurosfilis, vasculitis SNC, enfermedad de Lyme. panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sndrome de Guillain-Barr y neoplasias (Karen, 1994). La electroforesis de protenas sricas tambin debe realizarse para asegurar que las bandas oligoclonales del LCR no son debidas a filtracin en el LCR desde el suero. Las bandas oligoclonales en el LCR se determinan generalmente por electroloresis de alta resolucin en gel de agarosa con LCR concentrado
(Karen. 1994).

SISTEMA NERVIOSO Miastenia graves

La MG es un trastorno neuromuscular caracterizado por debilidad muscular asociada al ejercicio, fatiga y presencia de autoanticuerpos contra el receptor de acetilcolina (anti-AChFt). El AChFt, localizado en las membranas postsinpticas de las fibras musculares esquelticas, une acetilcolina (ACh) que proviene de las terminaciones nerviosas, lo cual causa una contraccin muscular cuando se ha liberado una cantidad suficiente de Ach (Naparstek, 1993: Rose. 1995). Los autoanticuerpos anti-AChR interfieren en esta funcin neuromuscular, provocando debilidad muscular y fatiga. Los autoanticuerpos anti-AChR se detectan en casi el 90% de pacientes con MG (Rose. 1995). Se utiliza u-bungarotoxina marcada radiactivamente

Neuropatas
El centro de la atencin ms reciente es un grupo de sndromes neurolgicos que afectan tanto al SNC como al sistema nervioso perifrico y estn asociados con autoanticuerpos (Naparstek. 1993). Estos autoanticuerpos son detectados por ELISA. IFID o inmunohistoqumica. La importancia de la iden-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

tlicacin de dichos autoanticuerpos se incrementa indudablemente si los estudios clnicos correlacionan su presencia con una enfermedad particular o un beneficio teraputico. Sin embargo, hasta la fecha, estos autoanticuerpos no son especficos de una enfermedad y pueden incluso aparecer despus de un trauma al sistema nervioso. Los autoanticuerpos contra componentes primarios neurales incluyen aquellos contra protenas neuronales o contra ganglisidos neuronales (Zeballos, 1992).

RESUMEN
Los autoanticuerpos tienen un papel importante en el estudio de las enfermedades autoinmunes organoespecficas. La deteccin de dichos autoanticuerpos puede ser importante en el diagnstico de algunas enfermedades autoinmunes organoespecficas, como la enfermedad de Graves, pero ms a menudo sirven como soporte ms que como elemento esencial para el diagnstico. De manera similar, aunque algunos de estos autoanticuerpos estn directamente involucrados en la patognesis de una enfermedad, por ejemplo el pnfigo. a menudo su presencia es un marcador de dao inmunolgico subyacente atribuible a otro mecanismo de enfermedad, como es el caso de la DMID. Tcnicas ms recientes de biologa molecular han revelado y continuarn hacindolo, la naturaleza especfica de muchos antgenos diana de estos autoanticuerpos. Se espera que este trabajo llegue a elucidar los mecanismos de enfermedad subyacentes, permitiendo la mejora de las pruebas diagnsticas y. tal vez. de nuevas direcciones en las terapias. Los avances tcnicos en los ELISA han hecho de sta una tecnologa asequible para la mayora de los laboratorios clnicos, de manera que muchos ensayos para la determinacin de autoanticuerpos especficos de rgano se encuentran disponibles donde la IFID no es factible.

Autoanticuerpos contra protenas neuronales

Un subgrupo de pacientes con degeneracin cerebelosa paraneoplsica (PCD) tienen autoanticuerpos anti-Yo que generalmente son detectados al mismo tiempo que es descubierta la neoplasia maligna. Los anti-Yo son detectables como fluorescencia citoplasmtica en las clulas de Purkinje utilizando IFID sobre tejido cerebeloso humano. La identificacin de anticuerpos anti-Yo en un paciente sin malignidad conocida debe iniciar una evaluacin minuciosa en busca de una neoplasia maligna (Zeballos, 1992). Los anticuerpos anti-Ri son autoanticuerpos especficos de neurona, cuya identificacin parece limitada a pacientes con carcinoma de m a m a y opsoclonus paraneoplsico (Zeballos. 1992). Los anti-Ri son caracterizados por fluorescencia en el ncleo neuronal por IFID. Los anticuerpos anti-Hu tambin son visibles como fluorescencia nuclear neuronal con IFID. Estos autoanticuerpos pueden ser identificados en pacientes con carcinoma de pulmn de clulas pequeas y encefalomelitis paraneoplsica (Zeballos, 1992).

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Autoanticuerpos contra ganglisidos neuronales

Los ganglisidos son componentes glicolipdicos que se encuentran en las membranas extemas de las clulas nerviosas perifricas (Naparstek, 1993). L a s neuropatas motoras perifricas pueden producirse en pacientes con gammapatas monoclonales IgM, cuya paraprotena IgM reacciona con los ganglisidos GM. o GD, (Zeballos, 1992). Aunque los anticuerpos anti-GM, o anti-GD pueden ser identificados en una amplia variedad de sndromes neurolgicos, su presencia en altos ttulos es ms caracterstica de enfermedad de neurona motora que otras alternativas (Zeballos, 1992).

OTROS RGANOS Corazn Autoanticuerpos contra miocardio

Los autoanticuerpos contra miocardio se han descrito como parte de varias condiciones que daan el msculo estriado cardaco, incluyendo infarto de miocardio, despus de ciruga cardiaca, y miocardiopata, aunque su identificacin puede ayudar a diferenciar la miocardiopata mediada por inmunidad de otras causas de miocarditis (Naparstek, 1993; Burek, 1995). Se utiliza la IFID sobre secciones congeladas de corazn de mono para detectar autoanticuerpos contra miocardio. El mareaje especfico de miocardio tambin puede determinarse excluyendo la reactividad de msculo esqueltico no cardaco. Desgraciadamente, los AMA o autoanticuerpos heterfilos pueden causar mareaje fluorescente que puede ser confundido con el que es debido a autoanticuerpos contra miocardio.

Msculo Autoanticuerpos contra msculo esqueltico

Los autoanticuerpos contra msculo esqueltico tienen una aplicacin clnica limitada. Se pueden observar ttulos bajos (<1:30) en individuos sanos, mientras que algunos pacientes con trastornos miopticos pueden tener ttulos hasta 1:60. Aunque se han encontrado ttulos altos (>1:60) de autoanticuerpos contra msculo esqueltico en pacientes con MG. los ensayos de anti-AChR tienen mayor utilidad clnica en el diagnstico o monitorizacin de MG. Los autoanticuerpos contra msculo esqueltico se detectan por IFID sobre secciones congeladas de msculo esqueltico de los muslos de mono.

CAPITUIO 45

ENFERMEDADES AUTOINMUNES ORGANOESPECIFICAS

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MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA interacciones celulares Caractersticas estructurales de la IgE Liberacin de mediadores desde las clulas efectoras sensibilizadas a IgE EVALUACIN DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES ALRGICAS

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Protena IgE: mtodos de determinacin, valores normales y utilidad clnica Anticuerpos IgE alrgeno-especficos: mtodos de determinacin, calificacin de resultados y utilidad clnica Pruebas para mediadores de reacciones de hipersensibldad inmediata y para anticuerpos IgE alrgeno-especficos BIBLIOGRAFA 1026

Regulacin de la sntesis de IgE: influencias genticas e

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La prevalencia global de enlermedades alrgicas en los Estados Unidos excede el 20%, y los sntomas y signos de la alergia son con frecuencia difciles de distinguir clnicamente de otras etiologas (Huang. 1993). Por estas razones, los mdicos con frecuencia consideran la alergia (hipersensibilidad inmediata) como una posible etiologa de enfermedad en pacientes que se presentan con diversos signos y sntomas. Cuando se seleccionan apropiadamente, las pruebas de laboratorio son tiles para evaluar pacientes con enfermedades alrgicas, pero el conocimiento de los mecanismos bsicos de la hipersensibilidad inmediata y el conocimiento de las relaciones empricas entre los resultados de las pruebas y su valor diagnstico predictivo son necesarios para optimizar la eficacia de las pruebas de laboratorio. Este captulo aborda estos lemas, empezando con una perspectiva general de los mecanismos bsicos de la hipersensibilidad inmediata y procediendo a una descripcin detallada de las pruebas de laboratorio aplicadas a los modos de cribado y diagnstico para evaluar diferentes tipos de enfermedades alrgicas. Se ha hecho una mencin especfica de las aplicaciones de las pruebas de laboratorio que no son rentables o que pueden conducir a conclusiones clnicas incorrectas.

enfocado considerablemente en dos reas: estudios dirigidos al descubrimiento de genes que influyen en el desarrollo del fenotipo alrgico, y estudios celulares y moleculares dirigidos al descubrimiento de mecanismos genticos y biolgicos que influyen en la sntesis y secrecin de la protena IgE y los anticuerpos IgE. Como el nivel de la protena IgE en sangre se correlaciona fuertemente con la presencia de signos y sntomas de enfermedad alrgica, estas dos reas de investigacin se solapan. Es bien sabido que las influencias genticas afectan a la probabilidad de que un individuo desarrolle una enfermedad alrgica (Meyers. 1998). Los individuos predispuestos genticamente a menudo se conocen como atpicos, un sinnimo para el fenotipo alrgico clnico. Los resultados de los estudios epidemiolgicos genticos sugieren que los niveles en suero de la protena IgE estn influidos por lo menos por dos genes, y esa herencia recesiva o codominante de alelos (an no definida) sobre esos locus influye en el nivel basal de la protena IgE en suero (Meyers, 1991). El fenotipo IgE elevado est caracterizado por niveles de protena IgE en suero varias veces mayor que el fenotipo IgE bajo (Martnez. 1994). Como es lgico, los niveles elevados d e IgE en suero se asocian a un fenotipo alrgico con aumento en la prevalenca de enfermedades alrgicas, particularmente el asma. A nivel estructural, se han propuesto varios genes candidatos que podran actuar para determinar el fenotipo alrgico (Tabla 46-1). Los estudios analticos de enlace han identificado las localizaciones aproximadas de estos genes candidalos a nivel cromosmico. y los estudios posicionales de clonacin corroboran la relacin de los genes putativos con genes conocidos para molculas mmunorreguladoras incluyendo receptores de citocina, antigenos leucocitos humanos y factores de transcripcin nucleares (Caraballo. 1999). Una regin del cromosoma 5q incluye genes de diversas atocinas que se sabe influyen en la produccin de IgE por clulas inmunocompetentes o reactividad bronquial incluyendo interleucma (IL)-3. IL-4. IL-5. IL-9 e IL-13 y el receptor (5-adrenrgico. respectivamente (Caraballo. 1999). El cromosoma 6p contiene el complejo del antgeno leucocitario humano (HLA) (vanse Caps. 40 y 41). Diversos haplotipos HLA estn asociados con el fenotipo alrgico, ms marcadamente con el HLA-DR especfico y haplotpo DQ. Los productos genticos de estos locus juegan un importante papel en la determinacin de respuestas inmunes a protenas alergnicas a travs de un papel en la presentacin del antigeno (vase mas adelante). Otros diversos cromosomas contienen genes que pueden jugar un papel en determinar el fenotipo alrgico: el cromosoma 1 1 q contiene un gen para el receptor de alta afinidad de IgE (F B|. el cromosoma 12q contiene genes para interfern-yy el factor de ere-

MECANISMOS DE HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA Regulacin de la sntesis de IgE: influencias genticas e interacciones celulares
Las investigaciones bsicas a linales de los aos 60 conducen a la descripcin de una clase distinta de inmunoglobulinas en humanos, la inmunoglobulina E (IgE). con potentes propiedades reactivas (sensibilidad cutnea) (Ishizaka, 1966a. 1966b, 1966c). Este resultado marc el comienzo de la era actual de investigacin en cuanto a los mecanismos moleculares de las enfermedades alrgicas. Hasta ahora, se sabe mucho sobre los procesos que acontecen dentro de las membranas celulares de las clulas efectoras sensibilizadas por IgE, que conducen a la liberacin de mediadores vasoactivos. Estos mediadores causan directamente los signos y sntomas de la enfermedad alrgica (vase ms adelante). Las investigaciones en este tema se han

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CAPTULO 46

ENFERMEDADES ALRGICAS

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El modelo descrito anteriormente explica los mecanismos comunes que provocan la sntesis de anticuerpos especficos IgG e IgE. pero ciertos mecanismos son particularmente pertinentes para la respuesta de IgE. Estos mecanismos originan la expansin clonal de linfocitos B-lgE y el cambio de isotipo con la expresin de transcnptores maduros ms que de lneas germinales. Los linfocitos B requieren por lo menos de dos seales activadoras para iniciar la sntesis de anticuerpos especficos (Vercelli. 1989a). Una seal es emitida como resultado de una interaccin afn entre clulas T complementaras y linfocitos B que muestran los antgenos procesados. Estos linfocitos B, sin embargo, requieren de seales adicionales para iniciar la transcripcin del C ' mRNA reordenado. En el caso de las IgE. se emiten seales importantes por IL-4 e IL-13. citocinas producidas por un subpoblacin de linfocitos Th. Sin embargo, estas seales solas no son suficientes para inducir la sntesis de anticuerpos IgE maduros. cimiento basotilo. y el cromosoma 14q contiene genes para el receptor antigeno de clulas T y NF-KB1 (Caraballo. 1999). Se necesitan estudios adicionales para determinar la extensin del polimorfismo de estos locus y los efectos de diferentes alelos de estos locus candidatos sobre el fenotipo alrgico. La habilidad de un individuo de responder a un anlgeno exgeno sintetizando anticuerpos especficos est determinada genticamente por genes de la regin HLA-D (vase Cap. 40). Los productos genticos de estos locus altamente polimrficos molculas de DR, DQ y DP de clulas presentadoras de antigenos son responsables del proceso de unin al antgeno procesado para presentarlo a los linfocitos T inmunocompetentes. e iniciando por tanto una respuesta de anticuerpos (Bach. 1985; Korman, 1985; Trowsdale. 1985). L a sntesis de anticuerpos especficos (incluyendo IgE) para antgenos Tdependientes resulta de una sene de interacciones celulares que incluye la seal relacionada (contacto clula a clula) y no relacionada entre clulas. Varios pasos estn implicados. Inicialmente. el antgeno es metabolizado por una clula presentadora del antgeno, por ejemplo, una clula dendrtica o macrfaga, y el antigeno "procesado" se muestra en la superficie de la clula en una hendidura configurada para el antgeno constituida por molculas superficiales de la regin HLA-D y Iragmentos procesados de un antigeno nativo. La interaccin afn entre el complejo antgeno procesado-HLA-D de una clula presentadora del antgeno y los receptores antgenos especficos en una poblacin complementaria de linfocitos T colaboradores/inductores (clulas Th) origina la activacin de las clulas Th, secrecin de citocinas y expansin clonal de la respuesta de los linfocitos (Unanue. 1987). El mismo antigeno puede estar unido a anticuerpos expresados constitutivamente en las membranas plasmticas de linfocitos B especficos de antgeno; y estas clulas que procesan el antgeno internalizando el complejo antgeno-anticuerpo tambin son capaces de metabolizar y presentar el antgeno procesado. De nuevo, despus de la interaccin afn y la secrecin de citocinas. se produce una expansin clonal de linfocitos B antgeno-especficos seguida de la sntesis y secrecin de anticuerpos especficos (Fig. 46-1). La IL-4. junto con IL-13. IL-3 e IL-5, se produce por un subpoblacin de linfocitos T llamadas clulas T2 (Mosmann. 1986: Parronchi. 1991) Los electos de IL-4 e IL-13 son antagonizados por el interfern-y. que junto con la IL-2 se produce en una segunda subpoblacin de linfocitos T llamadas clulas TI. Los productos de citocina de esas dos subpoblaciones T influyen de forma opuesta en la sntesis de IgE. Otras citocinas tambin influyen en la sntesis de IgE (vase Cap. 39). Las citocinas IL-5 e IL-6 originan la sntesis de anticuerpos IgE por linfocitos B comprometidos, pero ninguna es suficiente para emitir un seal "activadora" para desviar un isotipo relacionado con la produccin de transcriptores C, reordenados (Vercelli. 1989b). Como se anot previamente, en el curso de una respuesta inmune caracterizada por la produccin de anticuerpos IgE. los linfocitos B deben diferenciarse a clulas plasmticas que producen ms IgE que IgM (o IgD). Este proceso, llamado desviacin de isotipo. incluye el reordenamiento de los genes inmunoglobulinas a nivel del ADN. No se conocen todos los mecanismos asociados a la desviacin del isotipo. pero se conocen mejor muchos de los requerimientos para la desviacin del IgE. Un elemento importante es el ajuste del CD40 a los linfocitos B por el ligando CD40 en los linfocitos T. Si no existe ajuste del CD40, los linfocitos B expuestos a IL-4 e IL-13 en presencia de las clulas presentadoras de antgenos y los linfocitos T producirn transcriptores C, de la lnea germinal. Los esludios experimentales sugieren que los efectos del ajuste de CD40 estn mediados intraceluiarmente por la familia Src de tirosina cinasas. que estn implicadas en distintos niveles de la activacin transcripcional (Vercelli. 1998)

Caractersticas estructurales de la IgE

La primera evidencia de que los anticuerpos IgE humanos poseen actividad reagnica y son diferentes de otras inmunoglobulinas fue de los Ishizakas (Ishizakas, 1966a, 1966b, 1966c). Estos investigadores cultivaron antisuero de ratn con una fraccin aislada de inmunoglobulina rica en reagina aislada del suero de un paciente atpico. Despus de la absorcin con inmunoglobulinas purificadas de todos los istopos conocidos (IgG. IgA. IgM e IgD), el antisuero an reaccionaba con la globulina-y. presente en el suero de pacientes alrgicos. Despus de la inmunoprecipitacin con este antisuero, se suprimi la actividad sensibilizadora cutnea del suero de diferentes pacientes atpicos La evidencia definitiva de la singularidad inmunoquimica y la actividad reagnica de IgE fue obtenida algo tarde cuando se descubri que las protenas del mieloma humano reaccionaban con el antisuero antes mencionado (Bennich. 1969). Los experimentos realizados con fragmentos de inmunoglobulina aislados preparados por digestin enzimtica de protenas IgE de mieloma indicaron definitivamente que la actividad sensibilizadora cutnea requera de una regin F, intacta y que los determinantes antignicos nicos para molculas de IgE se encontraban en el fragmento F, (Bennich, 1969). Las propiedades fisicoqumicas y las funciones inmunologicas de diferentes regiones de la molcula IgE. determinadas por experimentos llevados a cabo con protenas IgE de mieloma humano purificadas y fragmentos de inmunoglobulina preparados por digestin enzimtica. estn resumidas en la Tabla 46-2. La estructura de la IgE humana se muestra en un diagrama en la Figura 46-2. Los anticuerpos IgE humanos sensibilizan la piel para liberar histamina, un fenmeno llamado anafilaxis cutnea pasiva. L a actividad sensibilizadora

Figura 46-1. Interacciones reconocidas y no reconocidas de clulas presentadoras de antigenos (APC). Clulas T colaboradoras /inductoras y clulas B originan la activacin y la expansin clonal de las clulas IgE-B (vase t e x t o para explicacin).

1018

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 46-2 P r o p i e d a d e s fisicoqumicas d e la nmunoglobulina E Cadena clase H Frmula molecular Coeficiente(s) de sedimeniacin Peso molecular Carbotndralo (%) Determinantes antignicos Fijacin complementaria (clasica) Vida media en suero (das) Transferencia placentaria Actividad reaginica
E

E -L, 8 190 000 11,7 D,. D..2. D,3 Ninguna 2 Ninguna 4+; Los fragmentos que contienen Fe son inhibidores de la actividad sensibilizadora de la piel de IgE nalrvo. pero los fragmentos con Fab. no
2

eos IgE de superficie celular (homocitotrpica). receptores de alta almidad para IgE (F , Rl) localizados difusamente en las membranas plasmticas d e las clulas efectoras. L a unin de los anticuerpos IgE a F, Rl es reversible pero de m u y alta afinidad (K = 10" M ') (Wank, 1983). Mientras que los anticuerpos IgE en sangre tienen una vida media de slo dos o tres das, la vida media de los anticuerpos IgE en la piel delimitados por F Rl en mastocitos se estima que es superior a los 10 das. Se eslima que el nmero de receptores por clula oscila entre 40.000 y 500.000. Mayores nmeros de receptores se encuentran en cultivos de basfilos en presencia de IgE, posiblemente reflejando la sobrerregulacin de F., Rl expresada por IgE. F, Rl es un receptor multimtnco. compuesto por subunidades a, |i. y y como las siguientes; (/.,. |i, y y . Los anticuerpos IgE estn delimitados por la subunidad-u; las subunidades -|i y -y contienen regiones transmembrana que funcionan en la sealizacin transmembrana (Ravetch, 1991).
( a

cutnea de la IgE es lbil al calor; calentando a 56C durante dos horas se modifican irreversiblemente los dominios C,3 y C,4 de la molcula IgE y se suprime la actividad sensibilizadora de la piel (Ishizaka, 1967). La aglutinacin de clulas electoras tambin se suprime por la reduccin y alquilacin de los puentes disulfuro entre las cadena-,. Los agregados de IgE humano no se fijan al complemento por la va clsica, y no hay paso placentario significativo de IgE humano.

Liberacin de mediadores desde las clulas efectoras sensibilizadas a IgE

Los mastocitos y basfilos son las clulas electoras principales de las reacciones de hipersensibilidad inmediata. Ambos tipos de clulas contienen histamina en granulos citoplasmticos que se tien marcadamente con tintes bsicos metacromticos (Siraganian, 1988). Los mastocitos y basfilos se desarrollan en la mdula sea a partir de clulas madre pluripotenciales. un proceso que se estimula por IL-3 (Schrader, 1986). Los baslilos que circulan en la sangre tienen una vida corta, y estn bien diferenciados, mientras que los mastocitos que se encuentran en tejidos prximos a los vasos sanguneos y en tejidos conectivos adyacentes al epitelio del tracto respiratorio, del tracto intestinal y de la piel son clulas con una vida larga capaces de prolilerar en respuesta a estmulos mitgenos. Los mastocitos son heterogneos pero contienen normalmente 10 veces ms del total de histamina por clula que los baslilos. El mecanismo primario de liberacin de histamina desde los mastocitos y basfilos incluye la seal transmembrana mediada por anticuerpos especfi-

Las molculas de F, Rl son mviles dentro de las membranas plasmticas de las clulas sintetizadas, como indican estudios llevados a cabo con anticuerpos anti-lgE conjugados con fluorescencia. Esta movilidad para distancias cortas se cree que es importante en la liberacin de mediadores desde mastocitos y basfilos. Otros estudios ms amplios con basfilos y mastocitos sensibilizados In vitro con protenas de mieloma IgE o con anticuerpos especficos IgE han mostrado que la formacin de puentes de receptores IgE ocupados por antgenos multivalentes o por anticuerpos anti-lgE intactos o sus fragmentos F(ab')^ desencadena la liberacin de histamina. pero haptenos univalentes o fragmentos Fab de anticuerpos anti-lgE no. La importancia de la formacin de puentes de receptores tambin se ha demostrado por estudios llevados a cabo con anticuerpos obtenidos de F Rl. Los anticuerpos intactos de F Rl causan la liberacin de histamina. pero los fragmentos Fab no. Tomando en conjunto estos resultados se propone que los puentes entre los receptores adyacentes son importantes en la iniciacin de la liberacin de histamina (Siraganian. 1975). De acuerdo con la "hiptesis puente", los anticuerpos IgE juegan un papel pasivo en la produccin de la liberacin de mediadores vasoactivos. La seal inicial para la liberacin de mediadores est proporcionada por los puntes cruzados de F Rl por un alrgeno multivalente, con IgE sirviendo como puente.
u

A pesar de los ensayos en los sistemas modelo, las criticas rutas moleculares que siguen al puente de F.,. Rl y que permiten la liberacin de histamina de las clulas sensibilizadas no estn bien definidas. Con respecto a este tema, es suficiente mencionar que la sealizacin transmembrana mediada por F Rl en los mastocitos y basfilos probablemente implica vanos pasos, incluyendo la movilizacin de Ca-' desde los depsitos intracelulares y desde fuentes extracelulares a travs de la formacin de canales de Ca ; activacin de protenas aglutinadas de guanosin-trifosfato (GTP) unidas a molculas de F , Rl, que permiten la activacin de protenas cmasas y metil-translerasas unidas a F,., Rl; activacin de adenil ciclasa con el aumento de la produccin intracelular del adenosin monofosfato cclico; e hidrlisis de fosfolpidos que contienen inositol por activacin de fosfolipasas A, y C, que generan diacil-glicerol y, seguido de nuevas hidrlisis, cido araquidnico (Bradlord, 1998).
Q : c

Figura 46-2. La estructura de la IgE humana.

Estos pasos son importantes por dos razones: muchas seales son importantes para la liberacin de mediadores desde los mastocitos y basfilos. y el tratamiento farmacolgico de las enfermedades alrgicas a menudo implica el uso de frmacos que interfieren con estos mecanismos de sealizacin. Por ejemplo, la cromolma usada en el tratamiento de asma interfiere con la liberacin de mediadores desde los mastocitos bloqueando la formacin de canales de Ca^, y los corticoides interfieren con la sealizacin mediada por F Rl inhibiendo la hidrlisis de fosfolpidos mediada por la enzima (Mazeruk. 1984). Adems, se sabe que el cido araquidnico liberado por los basfilos y mastocitos tras la activacin de las fosfolipasas celulares es el sustrato para las enzimas de las rutas metablicas 5-lipoxigenasa y ciclo-oxigenasa, que conducen, respectivamente, a la sntesis y secrecin de mediadores de inflamacin leucotrienos y prostaglandinas (Fig. 46-3) (Lewis, 1981). El leucotrieno B.,. y prostaglandina D producen el movimiento de leucocitos, incluyendo eosindlos. y ellos estimulan la agregacin, liberacin enzimtica. y generacin de superxido en los neutrfilos. Los leucotrienos C , D y E, son liberados por muchos tipos de clulas, incluyendo mastocitos pulmonares, perifonales y de la mdula sea, y leucocitos macrfagos. eosinfilos y basfilos. Estos mediadores causan broncoconstriccin. aumentan la permeabilidad vascular en vnulas poscapilares y aumentan la secrecin de moco. Estos
u ? 4 ;

CAPTULO 46

ENFERMEDADES ALRGICAS

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Figura 46-3. Metabolismo del cido araquidnico por las rutas de 5-lipoxigenasa y ciclooxigenasa.

tambin pueden mediar la prdida reversible de capacidad pulmonar observada en el asma humano. Desde el punto de vista molar, los leucotrienos son muchas veces ms potentes que la histamina. siendo estos los principales mediadores de los efectos inflamatorios que caracterizan las reaccionas de hipersensibilidad inmediata (Samuelsson, 1983). Otro mediador lpido de la inflamacin, llamado factor activador plaquetario (PAF). es un sustituto derivado del glicerol generado a partir de fosfolpidos tras la activacin celular. El PAF produce anafilaxia cuando se administra en pequeas dosis a animales, y el anlogo en humanos se cree que es liberado por neulrfilos y macrfagos alveolares. Los efectos biolgicos del PAF que ocurren durante la anafilaxia incluyen la agregacin y degranulacin de plaquetas, contraccin del msculo liso y aumento de la permeabilidad capilar (Barnes, 1988).

preciso de enfermedad alrgica o decidir un solo rgimen teraputico determinado en el campo prctico. En nios y adultos, la hipersensibilidad inmediata puede ser el primer mecanismo de la enfermedad o un factor contribuyente; y mientras que en el campo prctico es posible establecer un diagnstico de presuncin de una enfermedad alrgica, a menudo el diagnstico definitivo y el tratamiento requieren de la identificacin inequvoca del alrgeno(s) en particular. Esto es particularmente importante en casos de enfermedad alrgica grave que se produce en individuos sin un antecedente atpico o un antecedente familiar de enfermedad alrgica. La palabra atopia (o atpico) se utiliza sobre todo en la bibliografa mdica de la alergia para referirse a los individuos con una historia familiar de enfermedad alrgica que tienen sensibilidad demostrable a una variedad de alrgenos. Estos individuos se incluyen aqu por tener un fenotipo alrgico. Los individuos no atpicos pueden tambin sufrir enfermedades alrgicas y pueden desarrollan clnicamente reacciones de hipersensibilidad inmediata significativas a alrgenos que se encuentran repetidamente en su entorno. L a caracterstica que distingue a los individuos atpicos es su tendencia a desarrollar sensibilidad a una variedad de alrgenos encontrados en condiciones ambientales rutinarias (Hoekelman. 1974). La atopia clnica existe asociada a la normalidad. No se puede explicar la utilidad de las pruebas de laboratorio en el diagnstico y tratamiento de las enfermedades alrgicas sin mencionar las pruebas n vivo de la hipersensibilidad inmediata, particularmente la prueba cutnea y las pruebas de provocacin rgano-especificas. Histricamente, se consideraban las pruebas in vivo como un criterio de diagnstico preciso y fiable. La capacidad de reproducir una reaccin alrgica especfica por un mecanismo in vivo todava se considera por muchos alerglogos como la tcnica ms sensible para demostrar la presencia de hipersensibilidad inmediata y para definir su especificidad. Las pruebas cutneas se realizan por la inyeccin inlradrmica y por los mtodos de pinchazo cutneo (Bousquet, 1993). La respuesta a la inyeccin intradrmica de un extracto alrgeno se grada determinando el dimetro del grano y por la reaccin eritematosa inmediatamente despus de la inyeccin. Una reaccin con 1+ se corresponde con un grano de 5 mm a 10 mm. Una respuesta de esta magnitud habitualmente se considera como evidencia de una sensibilidad especfica a un alrgeno. Los individuos altamente sensibles a menudo desarrollan granos de dimetros mayores de 15 m m con seudpodos. Las pruebas cutneas realizadas mediante un pinchazo utilizan un alr-

EVALUACIN DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES ALRGICAS

La enfermedad alrgica es un problema de salud pblica significativo. Como antes se coment, ms del 20% de los adultos sufren alguna de las formas crnicas de la enfermedad alrgica. Como muchos individuos atpicos desarrollan alergias durante la infancia, la prevalencia de enfermedades alrgicas en nios proporciona otra estimacin de la magnitud de la totalidad de este problema mdico. El asma afecta aproximadamente al 5% de los nios en edad escolar, y otras enfermedades alrgicas menos incapacitantes como la rinitis alrgica y el eczema, afectan aproximadamente un 15% y un 5% de los nios, respectivamente. Segn una revisin, las enfermedades alrgicas menores afectan a casi el 40% de todos los nios de Estados Unidos. De forma rutinaria los mdicos apenas utilizan unas pocas pruebas de laboratorio para la evaluacin de enfermedades alrgicas. Las pruebas para proteina IgE y para anticuerpos IgE alrgenos especficos son los pilares. Antes de tratar los detalles de estas pruebas, es importante apuntar que la utilidad de cada prueba viene determinada por el contexto clnico en el que se aplica. En el campo de la alergia clnica, las pruebas para protena IgE y anticuerpos IgE se piden principalmente para el diagnstico y menos frecuentemente para la valoracin pronostica, o como una ayuda en el tratamiento teraputico. L a utilidad de los resultados de la prueba en cada situacin est determinada empricamente por si es difcil o no establecer un diagnstico

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA 12.0(M)

geno exaclo ms concentrado, a concentraciones 1.000 veces superiores a las utilizadas en las pruebas intradrmicas. y su gradacin a menudo se omite. El dimetro medio del grano en milmetros se apunta como un indicador del grado de sensibilidad. Se puede obtener una estimacin ms cuantitativa de la sensibilidad a un determinado alrgeno mediante una tcnica de ajuste final. Esta tcnica es una modilicacin de los mtodos mtradrmicos y de pinchazo cutneo. De forma senada se utilizan diluciones con 10 veces el extracto alrgeno estandarizado empezando con la solucin ms diluida. El objetivo de la sensibilidad se define como la mayor dilucin que produce una reaccin 1+. Las pruebas de provocacin a determinados rganos son tiles en la prctica clnica y con propsitos de investigacin. Las adaptaciones de esta tcnica incluyen la prueba de provocacin bronquial en el diagnstico de asma: la prueba de provocacin rinoconjuntival en el diagnstico de rinitis alrgica: la eliminacin de comida y prueba provocacin en el diagnstico del asma inducido por comida, urticaria y malabsorcin: y la provocacin de una picadura en el diagnstico de sensibilidad anafilctica al veneno de insectos (Naclerio. 1993). La aplicacin de pruebas de provocacin en situaciones clnicas rutinarias est limitada por la necesidad de un alrgeno exlrado bien caracterizado de potencia definida y por el nmero limitado de alrgenos que pueden ser probados en un individuo en una nica ocasin. Como ejemplo, la eliminacin de comida y procedimientos de provocacin que requieren de perodos de abstinencia de varios dias. durante los cuales el consumo inadvertido de un alimento determinado puede invalidar la prueba. Un obstculo importante para el diagnstico exacto en el campo de la alergia clnica es la falta de extractos de alrgeno disponibles de potencia uniform e y composicin definida (Bousquet, 1995). Salvo en ejemplos seguros, como las conocidas hierbas, cspedes, caros y mohos, los constituyentes qumicos que provocan reacciones alrgicas no estn caracterizados para muchos alrgenos reconocidos. A pesar de los esluerzos de los fabricantes por producir materiales estandarizados, a menudo los diferentes lotes del mism o alrgeno varian en potencia por apenas una sene de medidas. Se han utilizado diversas tcnicas para cuantificar la potencia de alrgenos en el uso clnico, incluyendo medidas del contenido de nitrgeno de protenas, pruebas cutneas de ajuste especfico, anlisis inmunoquimicos con antisuero animal especfico, e inhibicin de la aglutinacin de anticuerpos IgE especficos por alrgenos solubles m w'fro (Gleich. 1974). La inhibicin de la aglutinacin de anticuerpos IgE especficos por alrgenos en solucin acuosa es un mtodo excelente para comparar extractos de alrgenos. La potencia de un extracto alrgeno est inversamente relacionada con la dosis de alrgeno soluble requerida para inhibir la aglutinacin de los anticuerpos IgE en un control positivo de suero a una cantidad fija de alrgeno ajustado en fase slida. La semejanza cualitativa y antignica de los diferentes lotes de alrgeno y la cantidad de alrgeno presente se pueden estimar comparando las pendientes y ED, de las curvas dosis-inhibicin. Los diferentes lotes de alrgenos que contienen la misma mezcla cualitativa de constituyentes alergnicos provocan lineas dosis-inhibicin paralelas cuando el porcentaje de inhibicin se traza frente a la dosis de un extracto alrgeno soluble. El mtodo de inhibicin in vilro es til para comparar la potencia y las caractersticas antignicas tanto de alrgenos puros como de mezclas.

pero la habilidad de detectar pequeos cambios de concentracin en el rango de 0,5 a 4 U /mi disminuye comparada con concentraciones ms elevadas (Fig. 464). Se han realizado numerosos estudios clnicos de las concentraciones de IgE en suero en sujetos sanos (no alrgicos). En todos los estudios, hay tendencias estrictas en el desarrollo de niveles de IgE con la edad y con distribuciones de frecuencia de concentraciones de IgE observadas en adultos sanos sin tener en cuenta los mtodos analticos (Homburger. 1986). La distribucin de la frecuencia de las concentraciones de IgE en adultos sanos se angula positivamente con los lmites de percentil 95 y con un nmero exagerado de valores baios de IgE. Al calcular el percentil 95 de los limites normales, la mayora de los investigadores han tratado sus datos con transformacin logartmica, produciendo por lo tanto lmites superiores a lo normal que son al parecer muy elevados cuando se comparan con las medias aritmticas (Barbee. 1981). Como se comentar ms tarde, estos limites superiores de lo normal sirven para reducir la sensibilidad diagnstica de la prueba de IgE en suero como una prueba de despistaje clnico de alergia cuando el lmite superior al normal se usa como valor de corte. La sntesis de IgE en el feto humano se produce incluso a las 11 semanas de gestacin en el tejido fetal pulmonar y heptico, aunque el cordn umbilical contiene IgE virtualmente no detectable. La concentracin media del cordn umbilical es menor de 1 U/ml (Kimpen. 1989). Las concentraciones de IgE en el suero materno y en el cordn umbilical no se correlacionan, indicando que no hay paso placentario apreciable de IgE materna. La existencia de anticuerpos IgE especficos para la leche de vaca en el cordn umbilical, pero no en el suero materno, indica que puede existir una sensibilizacin intrauterina y apoya la conclusin de que la protena IgE detectada en el cordn umbilical tiene un origen fetal. Las concentraciones de IgE en suero de nios aumentan lentamente c o n el desarrollo o alcanzan los niveles adultos aproximadamente a los cinco a los siete aos de edad (Homburger, 1986a). Varios estudios clnicos han mostrado un promedio un tanto ms alto de la concentracin de IgE en suero en nios de edades entre los 10 y los 14 aos que en adultos de 20 aos. El significado clnico de este descubrimiento no est claro. No se han observado diferencias entre los niveles de IgE en nios y nias de edades similares. En individuos mayores de 70 aos de edad, hay una tendencia a un promedio de niveles de IgE ms bajo que en los adultos jvenes menores de 40 aos de edad. La determinacin de la proteina IgE en suero ha sido evaluada a fondo por su utilidad clnica en el diagnstico de vanas enfermedades alrgicas, por su valor predictivo como un indicador de la probabilidad del desarrollo de enfermedad alrgica en bebs y nios asmtomlicos. y como indicador pronstico en adultos con algunos tipos de enfermedad alrgica crnica. La determina-

Protena IgE: mtodos de determinacin, valores normales y utilidad clnica

Existen una variedad de mtodos inmunoquimicos disponibles comercialmente para determinar el IgE en suero, incluyendo desplazamiento competitivo e inmunoanlisis sandwich y nefelometra (Homburger. 1993). Los mtodos n o isotpicos son los ms populares. Cada uno de estos inmunoanlisis es capaz de detectar IgE en suero a concentraciones tan bajas como 0,5 U/ml (1,2 ng/ml). Los mtodos sandwich de inmunoanlisis utilizan una aproximacin analtica comn; un anticuerpo anti-lgE policlonal o monoclonal, unido covalentemente a una fase slida, se incuba con una proporcin de suero o estndar, y la IgE unida se detecta mediante incubacin con el anticuerpo anti-lgE marcado, purificado de afinidad, o monoclonal. La concentracin de IgE en muestras de suero se calcula comparndola con una curva estndar. L a mxima sensibilidad analtica se consigue en el rango de 7,5 a 50 U IgE /mi. Las concentraciones menores pueden determinarse por mtodos sandwich.

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ENFERMEDADES ALRGICAS

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cin de IgE tambin es valiosa en la valoracin de pacientes en los que se sospecha que puedan tener enfermedades de inmunodeficiencia. enfermedades parasitarias o el raro sndrome hiper-lgE. El sndrome hiper-lgE fue descrito primero en 1972 por Buckley y col., que publicaron dos casos de pacientes con niveles altamente elevados de IgE en suero, dermatitis difusa, furunculosis recidivante y neumona con neumatoceles secundarios a Staphylococcus aureus. Las publicaciones posteriores de pacientes con este trastorno definen este sndrome clinico: las elevaciones de los niveles de IgE en suero son extremas (de 2.000 a 50.000 U / mi), y los pacientes tienen eosinofilia en sangre y tejidos y un habn fuertemente positivo inmediato y reacciones enlematosas a alrgenos inhalados, plenes, alimentos, y antgenos bacterianos y de hongos. A pesar de estos descubrimientos, el asma no es comn en pacientes con el sndrome hiper-lgE (Buckley, 1978). La sntesis de IgE, como se refleja en los niveles de suero, se ha estudiado en pacientes con un sinfn de enfermedades nmunodeficientes primarias Se han descrito niveles elevados de IgE asociados con deficiencias incompletas de la inmunidad celular, incluyendo el sndrome de Wiskott-Aldrich, sndrome parcial DiGeorge y alinfoplasia timica (sndrome de Nezelof) (Buckley. 1975). Las inmunodeficiencias en las que hay ausencia completa de sntesis de mmunoglobulinas G, A y M, como la enfermedad inmunodeficienle aguda (SCID), muestran caractersticamente una disminucin de la sntesis de IgE y niveles de IgE marcadamente disminuidos en suero. Los niveles de IgE en suero son variables en pacientes con deficiencia de IgA: los pacientes con ataxia telangiectasia tpicamente tienen niveles disminuidos, pero los pacientes con deficiencia aislada de IgA pueden tener niveles normales o moderadamente aumentados (Buckley, 1975). La enfermedad alrgica no es comn en pacientes con inmunodeficiencias, a excepcin de los individuos con deficiencia de IgA selectiva que tienen niveles de IgE elevados en suero. La sntesis elevada de IgE en pacientes con sndrome hiper-lgE o con deficiencias parciales de inmunidad celular posiblemente manifiestan una secrecin de IgE aumentada producida por los linfocitos B que escapan del control regulador de los linfocitos T. La infiltracin parasitaria del tracto gastrointestinal o rganos parenquimatosos estimula intensamente la sntesis de IgE, y los estudios de laboratorio con animales sugieren que los anticuerpos IgE especficos son importantes en la defensa del husped frente a parsitos como el Nippostrongylus brasillensis y Schistosoma mansoni (Mulligan, 1965). Las concentraciones de IgE en suero superiores a 1.000 U/ml se encuentran de forma habitual en nios en reas de infestacin endmica con parsitos. Se sabe que existen otras enfermedades parasitarias asociadas a niveles de IgE en suero aumentados, incluyendo la larva visceral migratoria (Toxocara cams), capilariasis intestinal (Capillana philippinensis). esquistosomiasis. anquilostomiasis y equinococosis. En pacientes con enfermedad parasitaria intestinal, se han evidenciado niveles de IgE en suero disminuidos considerablemente despus de seguir un tralamienlo exitoso con frmacos antiparasitarios. Al revisar la utilidad de los niveles de IgE en suero como prueba diagnstica para la enfermedad alrgica, es importante tratar su uso en nios y adultos por separado. Los niveles de IgE en suero elevados al nacer o durante la

lactancia sucede a menudo antes del desarrollo de la alergia clnica (Kjellman, 1984). Se observaron niveles de IgE en suero por encima del percentil 95 para la edad en el 75% de los nios con antecedentes de ambos padres de enfermedad alrgica; y entre los nios sanos con niveles de IgE mayores de 1 SD por encima de la media para una edad determinada, la incidencia de desarrollo de enfermedad alrgica durante los siguientes 18 meses aumentaba en 1 0 veces ms en comparacin a un grupo con niveles de IgE ms bajos. Aunque prevn el desarrollo de una futura enfermedad alrgica, estos datos aportan relativamente poca informacin sobre cmo basar decisiones clnicas especificas. El diagnstico de enfermedad alrgica en los laclantes es complicada debido a que la rinorrea es la manifestacin ms comn de alergia en este grupo de edad, pero las infecciones respiratorias son comunes durante la lactancia y puede ser imposible distinguirlas de la rinitis alrgica en la prctica clnica. Sin embargo, como la enfermedad alrgica de inicio precoz parece estar asociada con manifestaciones clnicas ms agudas, es importante establecer el diagnstico de alergia lo antes posible {vase ms adelant). El valor principal de las determinaciones de IgE en nios parece ser la alerta para el mdico de una posible enfermedad alrgica cuando el diagnstico clnico de sospecha es diferente. Los niveles de IgE en suero superiores a 20 U/ml en estos casos apoyan el diagnstico de enfermedad alrgica, pero un nivel normal de IgE no excluye el diagnstico de enfermedad alrgica durante la infancia o en la vejez. Los resultados de otras pruebas diagnsticas, incluyendo pruebas para anticuerpos IgE, pueden tomarse en consideracin en el diagnstico de exclusin de enfermedad alrgica. En esas situaciones clnicas donde los signos de enfermedad alrgica son inequvocos, por eiemplo eczema y rinitis en un nio con antecedente familiar de atopia, el nivel de IgE en suero proporciona una pequea informacin adicional. La situacin es bastante similar en nios mayores. La determinacin de la protena IgE en suero tiene una sensibilidad diagnstica limitada para la enfermedad alrgica cuando el limite superior del rango normal se utiliza como una cota diagnstica. En general, los nios con hipersensibihdad a varios alrgenos diferentes y mltiples enfermedades alrgicas presentan niveles en suero elevados, y aquellos con hipersensibilidad a menos alrgenos y afectacin limitada a un rgano a menudo tienen niveles normales (Berg. 1969). Este detalle se ilustra en los datos de la Tabla 46-3. La sensibilidad diagnstica es mayor en pacientes con sensibilidad clnica a un numero de alrgenos diferentes. En nios atpicos, la presencia de enfermedad cutnea y manifestaciones gastrointestinales aumenta la probabilidad de que los niveles de IgE en suero estn elevados (Havnen, 1973). Tambin h a y evidencias que apuntan que la frecuencia de los niveles elevados de IgE en suero es mayor en nios con hipersensibilidad a los alimentos y a alrgenos del polen que en nios con hipersensibilidad a alrgenos de polvo o moho (Berg. 1969). Los nios con enfermedad alrgica que afecta a varios rganos tambin suelen tener elevaciones en IgE en suero de mayor magnitud que aquellos con enfermedades ms limitadas; las elevaciones extremas ocurren ms a menudo en pacientes con manifestaciones cutneas. La especificidad diagnstica de un nivel elevado de IgE para la enfermedad alrgica es excelente. La asociacin es tan fuerte, que los

Tabla 46-3

Incidencia de c o n c e n t r a c i o n e s e l e v a d a s de IgE en s u e r o en n i o s alrgicos de e d a d e s de d o s a 16 a o s con diferentes c o m b i n a c i o n e s d e e n f e r m e d a d e s alrgicas de n i o s en cada grupo 33 70 75 de nios con IgE en suero e l e v a d o 3 13 41 46 12 13 11 Incidencia de IgE en suero elevado (%) 14 39 58 61 50 84

Diagnostico Slo asma Asma y rinoconjuntivitis Asma y dermatitis atpica ms otras enfermedades de hipersensibilidad Asma y urticaria ms oirs enfermedades de hipersensibilidad Asma y urticaria y dermatitis atpica ms otras enfermedades de hipersensibilidad Asma y alergia gastrointestinal ms otras enfermedades de hipersensibilidad

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INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

nios asinlomlicos con niveles elevados de IgE a veces se califican como prealrgicos, asumiendo que desarrollarn signos de alergia clnica en el futuro. La determinacin de la proteina IgE en suero tiene una utilidad diagnstica moderada en la mayoria de los adultos con sospecha de padecer una enfermedad alrgica. Los resultados de estudios clnicos de alergia respiratoria adulta indican que aproximadamente el 50% de los adultos con asma extrnseca y menos del 5% de adultos con la denominada asma intrnseca (no atpica) tienen elevados niveles de IgE en suero (Wittig. 1980). Los adultos asmticos con hipersensibilidad a un nmero limitado de alrgenos habitualmente tienen niveles normales. Los mayores niveles de IgE en adultos caractersticamente ocurren en aquellos pacientes con hipersensibilidad a diversos alrgenos y combinaciones de asma, dermatitis atpica y rinitis. Al igual que en los nios, la sensibilidad diagnstica limitada de los niveles de IgE en suero limita la utilidad clnica de las determinaciones de IgE en aquellas situaciones donde el diagnstico de enfermedad alrgica es ms incierto (Klink, 1990). Esto no quiere decir, sin embargo, que la IgE en suero no pueda determinarse en estos casos, pues un nivel elevado tiene un alto valor predictivo de enfermedad alrgica. Los niveles de IgE en suero han recibido una atencin particular en nios y adultos con dermatitis atpica. Los mecanismos relacionados con la patognesis de la dermatitis atpica se desconocen por completo, pero el descubrimiento de niveles m u y altos de IgE en la mayora de los pacientes con dermatitis atpica y enfermedad activa ha provocado diversas investigaciones de la relacin entre la actividad de la enfermedad y los niveles de IgE. Aunque no hay un consenso, algunos estudios indican que las fluctuaciones en la gravedad de las manifestaciones cutneas paralelas cambian anlogamente al nivel de IgE en suero (Wuthrich. 1978). Las relaciones causales, si existen, permanecen ocultas. La aspergilosis broncopulmonar alrgica tambin se asocia a una marcada elevacin del nivel de IgE en suero. Esta enfermedad ocurre tpicamente en pacientes con asma extrnseca, generalmente de larga duracin. Los niveles de IgE en suero estn elevados en casi todos los pacientes con aspergilosis alrgica cuando existe una infiltracin pulmonar aguda, pero los niveles de IgE pueden fluctuar considerablemente durante el curso de la enfermedad. Un nivel normal de IgE en un paciente con enfermedad pulmonar activa excluye prcticamente este diagnstico (Imbeau, 1978).

de estas caractersticas, la prueba de liberacin de histamina leucocitaria presenta aplicaciones limitadas en la prctica clnica. Aproximadamente el 15% de los individuos tienen leucocitos que no liberan histamina in vitro. Aunque se han desarrollado sistemas automatizados para la determinacin de histamina, este anlisis es incmodo de realizar y caro. La prueba requiere de clulas sanguneas frescas y slo se pueden analizar un nmero limitado de alrgenos utilizando una muestra nica de sangre. Actualmente, la prueba de histamina liberada se utiliza ms en investigacin que en la prctica clnica. La prueba de anticuerpo IgE. inicialmente conocida como prueba radioalergoabsorcin (RAST), es un inmunoanlisis sandwich anlogo en principio a la prueba de Coombs indirecta. Se mezcla la muestra de suero en la que se quieren determinar los anticuerpos IgE con un alrgeno unido a un material en fase slida. Despus de la incubacin inicial, los componentes que no son anticuerpos se retiran, y el alrgeno inmunoabsorbente se incuba en una segunda fase del anlisis con anticuerpos anti-lgE monoclonales o cromalografia marcada purificada. Los anticuerpos IgE especficos fijados en la primera fase del anlisis se detectan con anticuerpos anti-lgE marcados unidos a la fase slida del complejo alrgeno (Gleich. 1975). Las concentraciones reales de anticuerpos IgE no se determinan con precisin con estas tcnicas. En el suero de algunos individuos alrgicos, las concentraciones de anticuerpos IgE exceden la capacidad aglutinante de los alrgenos inmunoabsorbentes, y los sobrenadantes incubados en la primera fase contienen cantidades residuales de anticuerpos IgE especficos. En un rango un tanto limitado de concentraciones, la aglutinacin de anticuerpos en la segunda fase incrementa en proporcin directa a la concentracin de anticuerpos IgE en suero y se puede obtener alguna cuantificacin. Sin embargo, la aglutinacin final refleja cantidades y afinidades de los anticuerpos presentes (Schellenberg, 1975). Como inicialmente describieron Wide y col. (1967). la prueba del anticuerpo IgE empleaba alrgenos unidos covalentemente a gotas de Sephadex. Una variedad de otros materiales de fase slida se han utilizado con posterioridad, incluyendo partculas de celulosa, gotas de agarosa. discos de filtro de papel y placas de microttulaciones de poliestireno. Muchos de estos materiales de soporte pueden activarse qumicamente a formas intermedias lbiles que reaccionan con alrgenos en solucin acuosa para formar inmunoabsorbentes unidos covalentemente. La aglutinacin de alrgenos en las placas de microttulaciones se realiza por absorcin no covalente. Para la aplicacin clnica, la fase slida alrgeno inmunoabsorbente puede contener todos los constituyentes alergnicos presentes en el extracto alrgeno liquido, en las mismas proporciones que el extracto alrgeno original. Aunque es posible controlar la unin de todas las protenas a inmunoabsorbentes, existen pocos datos disponibles para determinar si todas las protenas alergnicas relevantes se han fijado a algunos sistemas alergnicos clnicamente importantes. Existe un amplio rango de alrgenos disponible para la prueba de anticuerpo IgE. Es posible adquirir los reactantes en kits o se puede enviar el suero a un laboratorio de referencia para su anlisis. Las diversas clases de alrgenos disponibles incluyen epitelio animal; alimentos; plenes de rboles, cspedes y hierbas; mohos; hongos: venenos de insectos; frmacos; y alrgenos ocupacionales. La mayora de las drogas son compuestos de bajo peso molecular que no pueden fijarse fcilmente en una fase slida por los mtodos qumicos habituales. Algunas drogas macromoleculares, como la insulina, pueden unirse para producir reactivos satisfactorios. En el caso de la penicilina, el grupo peniciloil puede conjugarse a la polilsina o a la proteina transportadora, que as puede fijarse a una fase slida apropiada para utilizarse en la prueba de anticuerpo IgE (Wide, 1971). No hay reactantes anlogos disponibles para detectar anticuerpos IgE de los conocidos determinantes antignicos menores de penicilina, responsables de algunas reacciones anafilcticas agudas a esta droga. No hay un acuerdo unnime para notificar resultados de las pruebas de anticuerpos IgE. Varios mtodos comerciales utilizan un sistema de puntuacin que obtiene los resultados de las muestras de pacientes a partir de la comparacin con la curva dosis-respuesta de referencia obtenida de u n a serie de diluciones de un control positivo (Fig.46-5). En un intento de maximizar la sensibilidad analtica de estos mtodos, se consideran positivos aquellos resultados superiores a 0,35 KU/L (unidades Killa por litro) estndar. La concentracin de anticuerpos IgE puede expresarse tanto en K U/L

Anticuerpos IgE alrgeno-especficos: mtodos de determinacin, calificacin de resultados, y utilidad clnica

Las pruebas cutneas y de provocacin a un rgano son procedimientos establecidos para la deteccin de anticuerpos IgE in vivo, como se coment previamente. Tambin existen mtodos in vitro para detectar anticuerpos IgE en suero y en los granulocitos basfilos; los mtodos principales son la prueba del anticuerpo IgE especfico y la prueba de liberacin de histamina leucocitaria, respectivamente. La prueba de liberacin de histamina leucocitaria le descrita por primera vez hace ms de 50 aos. Los leucocitos aislados de sangre perifrica por sedimentacin de dextrano se lavan y se suspenden de nuevo en un tampn que contiene iones Ca y Mg \ Entonces, se aaden concentraciones variables de un extracto alrgeno a un nmero determinado de leucocitos lavados, y la mezcla se incuba a 37C durante una hora. La reaccin se para congelando los tubos a 4C, y las clulas se separan por centrifugacin. La histamina secretada por los basfilos como consecuencia de la interaccin del alrgeno con las clulas unidas a anticuerpos IgE se libera en el lquido sobrenadante y se aisla por extraccin con butanol ya cido. La concentracin de histamina en el extracto se mide de forma fluoromtrica o por inmunoanlisis especfico. El procedimiento fluoromtrico. realizado manualmente, detecta aproximadamente 1 ng de histamina. El mtodo de inmunoanlisis es un poco ms sensible. Los resultados se expresan como un porcentaje del total de histamina celular liberada; la histamina total se determina en los usados cidos de leucocitos no expuestos al extracto de alrgeno (Lichtenstein. 1964),
2, 2

Los resultados de la prueba de liberacin de histamina leucocitaria definen la especificidad de los anticuerpos IgE ligados a clulas e indican la integridad funcional de los mecanismos mediadores de liberacin. A pesar

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ENFERMEDADES ALRGICAS

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2(1.0(10

do. Sin embargo, en la mayora de los esludios clnicos los resultados de las pruebas de anticuerpo IgE se han comparado con los resultados de las pruebas de diagnstico in vivo y los antecedentes de enfermedad alrgica. Est claro segn estos estudios que la sensibilidad diagnstica varia considerablemente dependiendo del tiempo transcurrido desde la exposicin a un alrgeno y la prueba, la clase de alrgeno examinado, la edad del paciente y los rganos diana afectados (Homburger, 1986a). En los objetivos de este capitulo, es til considerar las siguientes aplicaciones clnicas por separado: enfermedad respiratoria alrgica, alergia a alimentos, sensibilidad al veneno de insecto y alergia a lrmacos u ocupacional. Como los anticuerpos IgE asociados a clulas median en la enfermedad respiratona alrgica, es razonable tener en cuenta los resultados de las pruebas de provocacin a un rgano especfico c o m o un criterio para determinar la sensibilidad hacia un alrgeno determinado. Diversos estudios en adultos con a s m a o rinitis alrgica han mostrado una excelente relacin general entre los resullados de pruebas de provocacin y las pruebas de anticuerpo IgE llevadas a c a b o con alrgenos inhalados, incluyendo plenes de rboles, cspedes y hierbas, mohos y caros. Los resultados de las pruebas cutneas y pruebas de anticuerpo IgE tambin concuerdan en la mayora de los casos. La mayora de los resultados discordantes fueron pruebas cutneas dbilmente positivas en pacientes con pruebas de anticuerpo IgE negativo (Wide, 1967). En nios con enlermedad alrgica, los estudios epidemiolgicos recientes han aportado un secuencia de desarrollo de signos y sntomas de enfermedad que se acompaan de una secuencia predecible de sensibilizacin a diferentes clases de alrgenos (Bergmann, 1997). Esta denominada marcha alrgica a menudo empieza con alergia a alimentos en nios menores de tres aos asociada a manifestaciones gastrointestinales y dermatitis atpica seguida de enfermedad respiratoria incluyendo a s m a y rinitis causadas por sensibilidad a alrgenos inhalados. La secuencia de deteccin de anticuerpos IgE que es paralela al desarrollo de manifestaciones clnicas avanza con la edad de la siguiente forma: los anticuerpos IgE de protenas de alimentos especialmente huevo y leche se detectan primero sobre los tres aos de edad, luego anticuerpos de alrgenos inhalados, empezando con alrgenos internos incluyendo epitelio animal y caros de polvo sobre los cinco aos de edad; y al final de la infancia, los alrgenos inhalados externos incluyendo plenes. El desarrollo de sensibilidades en esta secuencia tiene implicaciones obvias para las pruebas clnicas en nios. Entre los nios con enfermedad respiratoria alrgica, los estudios clnicos han mostrado que los resultados de las pruebas de anticuerpo IgE y las pruebas de provocacin concuerdan en muchos casos. De nuevo, la mayora de los resultados discordantes se han observado en nios con pruebas de provocacin positivas hacia extractos alrgenos altamente concentrados. Se observ una concordancia importante en nios con alergia moderada o aguda, y en nios con pruebas de provocacin negativas. Como muestran estos resultados, la sensibilidad diagnstica de estas pruebas de anticuerpo IgE hacia alrgenos inhalados varia directamente con la magnitud de sensibilidad clnica en pacientes con alergias respiratorias (Berg, 1974). Tambin es oportuno preguntarse si concuerdan bien los resultados de anticuerpo IgE con las pruebas cutneas en casos de sospecha de alergia respiratoria. En los estudios previamente mencionados, si los resultados de pruebas cutneas realizados con el mtodo del pinchazo se utilizaron para definir la sensibilidad hacia un alrgeno, se obtuvieron muchos ms resultados discordantes. La prueba de anticuerpo IgE fue negativa en pacientes con pruebas cutneas dbilmente positivas, pero se obtuvieron resultados positivos casi en el 90% de los pacientes con pruebas cutneas fuertemente positivas. En general, las mejores correlaciones se observaron con alrgenos de polen y alrgenos purificados, mientras que se observaron menores grados de correlacin con alrgenos de polvo y moho. Los partidarios de la prueba cutnea defienden que datos como stos indican que la prueba cutnea es un mtodo diagnstico ms sensible, mientras los partidarios de la prueba de anticuerpo IgE sealan que un alto porcentaje de las pruebas cutneas dbilmente positivas no son validadas por pruebas de provocacin positivas. El argumento es un tanto terico; cualquier mtodo diagnstico es fiable en pacientes con sensibilidad marcada a un alrgeno y ninguno es completamente fiable para identificar ligeras discordancias de sensibilidad clnica. En este ltimo caso, los dos mtodos pueden proporcionar informacin diagnstica complementaria.

0.35 0,7

3.5

17,5

50 100

Concentracin (kU-1)
Figura 46-5. Curva dosis-respuesta para la determinacin de anticuerpos IgE por inmunoanlisis de enzima fluorescente comercial. FU = unidades fluorescentes.

como en clases numeradas del O al V o VI. La mayora de los mdicos estn ms familiarizados con los sistemas de puntuacin basados en clases. Sin tener en cuenta el sistema usado para expresar los resultados, debera tenerse en cuenta que la mayora de los resultados son semicuantitativos. Los resultados dudosos o dbilmente positivos pueden deberse a la variabilidad analtica (Jacob, 1982). El suero con niveles de proteina IgE marcadamente elevados tambin pueden producir resultados falsos positivos, debido a una unin incrementada no especfica de IgE. Este fenmeno habitualmente no ocurre a no ser que la concentracin de IgE exceda de 1.000 KU / L, lo que puede ocurrir en pacientes con dermatitis atpica o enfermedades alrgicas mltiples. Los resultados de falsos negativos causados por la inhibicin de la unin de anticuerpos IgE puede ocurrir en algunos sistemas analticos debido a la competicin por lugares de unin a alrgenos por anticuerpos IgG. Estos anticuerpos tienen afinidades similares a los anticuerpos IgE y habitualmente se encuentran en concentracin de microgramo por mililitro en el suero de pacientes tratados con inmunoterapia alrgena (Paull. 1978). Como las determinaciones de anticuerpos IgE no son tiles en pacientes tratados para determinar si existe sensibilidad clnica residual, se entiende que este problema habitualmente ocurre cuando la prueba de anticuerpo IgE se usa mapropiadamenle. La sensibilidad analtica de una prueba de anticuerpo IgE en parte est determinada por el anticuerpo anti-lgE marcado utilizado en la segunda fase del anlisis. Los anticuerpos anti-lgE comerciales con afinidad purificada y marcados funcionan bien como protenas detectoras y permiten la determinacin de cantidades en nanogramos de anticuerpos IgE especficos. Los anticuerpos anti-lgE monoclonales marcados tambin estn disponibles comercialmente. Las recomendaciones para el uso clnico de la prueba de anticuerpo IgE se basan en los resultados de estudios clnicos donde los resultados de la sensibilidad del anticuerpo IgE fueron comparados con oirs pruebas diagnsticas. En algunos casos, la decisin de identificar los alrgenos especficos responsables de los signos clnicos est moderada al saber que la terapia no ser diferente si se identifican los alrgenos agresores. Este ltimo punto es importante en muchos pacientes cuyo tratamiento est basado en el uso de frmacos que inhiben la liberacin de mediadores inflamatorios, producen broncodilatacin o suprimen la inflamacin. Sin embargo, en la mayora de los individuos alrgicos, el conocimiento de los alrgenos agresores es clnicamente til para decidir qu tipo de alrgenos deben usarse en un rgimen de inmunoterapia, como en pacientes con rinitis alrgica o sensibilidad al veneno de insectos, o para conseguir evitar un alrgeno en casos de sensibilidad anafilctica a alimentos o frmacos. Es difcil definir la sensibilidad diagnstica absoluta y especfica de los resultados de anticuerpo IgE porque no hay un mtodo de referencia umversalmente aceptado para definir la sensibilidad hacia un alrgeno determina-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Las pruebas para anticuerpos IgE tienen ciertas ventajas comparadas con las pruebas cutneas. No presenta riesgo para el paciente, y los resultados no estn influidos por tratamientos concomitantes con antihistamnicos o broncodilatadores. Adems, la prueba de anticuerpo IgE puede ser mejor que la prueba cutnea en ciertos grupos de pacientes, como los bebs, pacientes con dermografismo o pacientes con dermatitis generalizada. Tambin hay desventajas. La prueba serolgica es cara si se hace indiscriminadamente, y los resultados no son inmediatos. Recientemente, la prueba de anticuerpo IgE multalrgeno realizada con inmunoabsorbentes que tienen ms de un alrgeno acoplado a su superficie se ha mostrado que es una prueba de deteccin sistemtica sensible y eficaz en coste para la alergia por inhalacin. Se necesitan nuevos esludios para documentar la utilidad de esta prueba como una prueba de deteccin sistemtica en otras situaciones clnicas (Ownby, 1984). Como se coment previamente, la sensibilidad a alimentos sucede precozmente en nios atpicos y se manifiesta con una variedad de signos clnicos en bebs, nios y adultos, incluyendo eczema y dermatitis, rinitis y broncoespasmo, angioedema, urticaria, y rara vez anafilaxia. La determinacin de anticuerpos IgE puede ser til en estos casos, pero existen posibles riesgos al interpretar los resultados de estas pruebas que deberan conocerse. En la determinacin total excepto de la sensibilidad anafilctica a determinados alimentos, el uso de provocacin con un alimento a doble ciego se considera el diagnstico estndar (Bock, 1980). Sin embargo, las pruebas para anticuerpos IgE son tiles para seleccionar alrgenos para pruebas de provocacin a doble ciego y para confirmar el antecedente. Los resultados IgE positivos se supone que son clnicamente significativos si los resultados estn apoyados fuertemente por la historia clnica. Sin embargo, a diferencia de las alergias por inhalacin, la incidencia de resultados falsos positivos (anticuerpos IgE a comida detectables no parece que se asocien a signos clnicos) es considerable, particularmente en nios. Los resultados de las pruebas de anticuerpo IgE pueden utilizarse para predecir los resultados de la prueba de provocacin a alimento (Sampson, 1997). Los resultados negativos rara vez se asocian a provocacin a alimento positiva: mientras que los resultados fuertemente positivos pueden evitar la necesidad de pruebas de provocacin. Se necesitan nuevos estudios clnicos para definir los lmites apropiados para anticuerpos IgE a diferentes alimentos. A menudo se considera la sensibilidad a alimentos en el diagnstico diferencial de enfermedades cutneas, enfermedad gastrointestinal o enfermedad respiratoria en bebs y nios jvenes. Los anticuerpos IgE especficos a alimentos ms comnmente encontrados en bebs y nios pequeos son para protenas alrgenas en la leche de vaca y al huevo. Las principales protenas alrgenas en la leche de vaca son la w.-lactalbmina, p-lactoglobulina, albmina bovina, y casena. La relacin entre los anticuerpos IgE haca estas protenas y las manifestaciones de la alergia a leche de vaca est establecida, pero existen anticuerpos IgE mediles en muchos nios atpicos que toleran la leche de vaca. La prueba de anticuerpos IgE a leche de vaca no puede establecer un diagnstico de intolerancia a la leche debido a mecanismos distintos de la hipersensibilidad (Liebman, 1981). Los resultados de pruebas para anticuerpos IgE son mucho ms especficos y tienen valores predictivos positivos mayores en casos de sensibilidad anafilctica o angioedema causados por alrgenos alimentarios, por ejemplo, alergia al pescado o a frutos secos. En un estudio publicado, los autores encontraron al menos un resultado de anticuerpo IgE positivo en el 100% de nios con sensibilidad anafilctica alimentaria, 96% de nios con asma, y 92% de nios con angioedema. En estos casos, la prueba de anticuerpo IgE es ms til porque la historia clnica a menudo incrimina a alimentos particulares como alrgenos (Hoffman, 1974). La prueba de anticuerpo IgE se utiliza comnmente para investigar la especificidad de la sensibilidad a alrgenos alimentarios en pacientes con dermatitis atpica. Como se cit anteriormente, las pruebas cutneas pueden ser imposibles de realizar en pacientes con enfermedad cutnea difusa o dermografismo. La interpretacin de los resultados de las pruebas en pacientes con dermatitis atpica es complicada por el hecho de que estos individuos a menudo tienen asma y rinitis concomitantes con elevaciones extremas de IgE en suero. En estos casos, no es infrecuente encontrar niveles bajos de anticuerpos IgE a una diversidad de alrgenos. Las especificidades clnicamente importantes se definen por resultados positivos varias clases superiores al

nivel inferior de resultados positivos. A menudo es posible definir la especificidad del alrgeno en estos pacientes mediante un proceso minucioso de eliminacin alimenticia combinada con una prueba de anticuerpo IgE. La prueba de anticuerpo IgE es til en el diagnstico de sospecha de sensibilidad a veneno(s) de himenptero. Los individuos sensibles a los venenos de abejas de miel, abejas, avispones o avispas tpicamente manifiestan signos de anafilaxs despus de un picadura: despus puede producirse urticaria, angioedema, broncoespasmo o colapso cardiovascular. La mortalidad publicada por reacciones sistmicas inducidas por picadura es de 30 a 40 casos anuales, pero esta cantidad probablemente subestima la incidencia real. La evolucin natural de sensibilidad al veneno no tratada no se conoce completamente. En muchos pacientes con sensibilidad anafilctica documentada, es posible obtener una historia clnica de reacciones progresivamente ms graves a sucesivos episodios de picadura. Por otro lado, la sensibilidad al veneno aparentemente mejora en algunos individuos. La decisin de tratar a un paciente con inmunoterapia al veneno se basa en la evaluacin clnica del riesgo de anafilaxia en posibles picaduras futuras. El indicador ms fiable de la sensibilidad al veneno es la respuesla a u n a provocacin con una picadura controlada (Parker, 1982). Sin embargo, generalmente no se realiza esta prueba y raramente se requiere en pacientes previamente no tratados para establecer el diagnstico de sensibilidad al veneno. Las pruebas cutneas al veneno y pruebas de anticuerpo IgE son tiles para confirmar la impresin de que existe sensibilidad clnica y para definir su especificidad. En esta situacin clnica, la mayora de los esludios indican que la prueba cutnea es la modalidad diagnstica ms sensible (Sobotka. 1978). Las pruebas de anticuerpo IgE al veneno son tiles ante todo para confirmar los resultados de pruebas cutneas y para definir la especificidad alrgena de la hipersensibilidad al veneno. Excepto cuando se provoca la picadura, no hay pruebas in vilro o in vivo que realmente anuncien la respuesta clnica a una picadura de insecto en un paciente tratado despus de inmunoterapia al veneno. Aunque los niveles de anticuerpos IgG en suero aumentan marcadamente con la inmunoterapia al veneno, no se ha definido un nivel lmite que pueda utilizarse para identificar a los pacientes que ya no son de riesgo. Las estimaciones semicuantitativas de anticuerpos IgE no son tiles clnicamente, y los niveles de anticuerpos IgE despus de tratamiento muestran que no hay relaciones consistentes con el estatus clnico. Medidas de anticuerpos IgE han sido tambin aplicadas al diagnstico de hipersensibilidad a frmacos. Aunque muchos frmacos y sus metabolitos son capaces de provocar la sntesis de anticuerpos, slo hay datos clnicos y resultados de determinaciones de anticuerpo IgE disponibles para la penicilina y sus metabolitos. La penicilina y su ismero, el cido penicilinico, se combinan con protenas del suero mediante uniones amidas. El conjugado peniciloil-protena es el mayor determinante antignco, y el conjugado cido penicilinico-proteina es el menor determinante antignco (Fig. 46-6). Los niveles mediles de anticuerpos IgM e IgG especficos para el determinante peniciloil se obtienen comnmente en pacientes tratados con penicilina, y aunque persisten ttulos elevados de estos anticuerpos en plasma durante periodos relativamente cortos, a menudo pueden detectarse ttulos inferiores despus del tratamiento (Sheperd, 1991). Los intentos realizados en el diagnstico de hipersensibilidad a la penicilina han contado con pruebas cutneas con penicilina, peniciloil-polilisina y una mezcla menor de antgenos. Los resultados positivos de pruebas cutneas ocurren infrecuentemente, especialmente cuando la prueba se realiza mucho despus del tratamiento con penicilina. Menos del 30% de los pacientes con posibles antecedentes de hipersensibilidad inmediata a la penicilina tienen pruebas cutneas positivas, y las reacciones de hipersensibilidad inmediata a la terapia con penicilina son raras en pacientes con pruebas cutneas negativas. Cuando se utilizan los resultados de las pruebas cutneas como una referencia diagnstica, los estudios clnicos han encontrado anticuerpos IgE mediles al determinante peniciloil casi en el 100% de los pacientes con pruebas cutneas positivas. Los anticuerpos antipeniciloil son indetectables en sujetos control. Segn estos datos, es razonable recomendar las pruebas in vitro para anticuerpos IgE-peniciloil slo en pacientes con antecedentes de reacciones de hipersensibilidad reciente. Los resultados falsos negativos pueden ocurrir inmediatamente despus de reacciones mediadas por IgE y, aunque la mayora de los datos

CAPITULO 46

ENFERMEDADES ALRGICAS

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Figura 46-6. Metabolitos de penicilina, determinantes antignicos mayor y menor. (De Rose NR, De M a c a n o EC, Fahey JL. et al [eds: ManualotClinical Laboratoy Inmunoiogy. 4' ed. Washington DC. A m e rican Society tor Microbiology, 1992, pg. 719. con autorizacin.)

publicados indican que los resultados falsos negativos son raros, la ausencia de anticuerpos especficos de peniciloil-polilisina no excluye completamente la posibilidad de significado clnico de los anticuerpos IgE a otros metabolitos de penicilina (Weiss, 1988). Las enfermedades alrgicas, particularmente el asma, tambin pueden deberse a una gran variedad de alrgenos encontrados en el lugar de trabajo. El asma puede resultar tanto de mecanismos alrgicos como no alrgicos. La lista de agentes etiologicos relacionados con el asma alrgico ocupacional es larga e incluye los siguientes: protenas animales, enzimas, protenas de plantas, legumbres, anhdridos, sales metlicas, tintes, diisocianuros y polvo de la madera. Existen pruebas de anticuerpos IgE disponibles para varios de estos alrgenos. Recientemente, se ha puesto una especial atencin en las gomas de ltex como un alrgeno en el cuidado de la salud laboral y en ciertos pacientes, por ejemplo, pacientes con espina bifida que han sufrido diversos procedimientos quirrgicos. La prueba de anticuerpo IgE a la goma de ltex es til para identificar individuos sensibles (Yunginger, 1994). Para finalizar esta seccin respecto a la prueba de anticuerpo IgE. es apropiado resumir algunos de los puntos principales marcados anteriormente. La determinacin de anticuerpos IgE es til y puede recomendarse en las siguientes situaciones clnicas: 1) la evaluacin de nios con un antecedente lamiliar de enfermedad alrgica importante y signos clnicos de enfermedad precoces: 2) la evaluacin de nios y adultos sospechosos de tener enlermedad respiratoria alrgica para establecer el diagnstico y definir la especificidad de la sensibilidad alrgena a plenes, polvo, antgenos fungios y alimentos: 3) para confirmar la expresin clnica de sensibilidad a alimentos especficos en pacientes con sensibilidad anafilctica o con asma y angioedema: 4) para evaluar la sensibilidad a alrgenos de veneno de insectos, particularmente como una ayuda en la definicin de la especificidad de veneno en aquellos casos donde las pruebas cutneas sean confusas; 5) para confirmar el diagnstico de hipersensibilidad a la penicilina en pacientes con sensibilidad anafilctica; y 6) para confirmar la presencia de anticuerpos IgE a ciertos alrgenos ocupacionales, por ejemplo, goma de ltex. La prueba de anticuerpos IgE no es til como una prueba de deteccin sistemtica para enfermedad alrgica, excepto si se realiza por un mtodo analtico multialrgeno; y los resultados no son tiles para evaluar los efectos de

la mmunoterapia o excluir el diagnstico de sensibilidad anafilctica a venenos de insectos en pacientes tratados. Las pruebas para anticuerpos IgE estn indicadas slo en pacientes a los que se les ha realizado una historia mdica y exploracin (sica completa.

Pruebas para mediadores de reacciones de hipersensibilidad inmediatas y para anticuerpos IgG alrgeno-especficos
Previamente, se han mencionado varios mediadores de reacciones de hipersensibilidad inmediata, incluyendo la histamina y los mediadores lpidos llamados leucotrienos y factores activadores de plaquetas. Cada uno de estos mediadores causan inflamacin en enfermedades alrgicas humanas o en modelos animales de alergia y analilaxia. Estos mediadores inducen muchos de los efectos biolgicos caractersticos de las reacciones alrgicas A pesar de estos descubrimientos, las determinaciones de los mediadores en lquidos corporales tienen una utilidad limitada clnicamente en el diagnstico diferencial de enfermedades alrgicas. Las determinaciones de histamina en plasma u orina pueden ser vlidas en pacientes con analilaxia cuando las pruebas se realizan inmediatamente despus del episodio anafilctico (Friedman, 1989), pero se requiere tener cuidado para obtener una muestra apropiada. La hemolisis puede provocar niveles de histamina falsamente elevados en la sangre y los alimentos ricos en histamina o colonizacin bacteriana pueden conducir a niveles falsamente elevados en orina. Una prueba muy til en este entorno clnico es la determinacin de triptasa en sangre (Schwartz, 1987,1989). La triptasa es una proteasa de suero de 1 3 4k D a formada por cuatro subunidades unidas no covalenlemente y se encuentra en mastocitos y granulocitos basfilos. La liberacin de triptasa desde las clulas sensibilizadas provoca una relacin cruzada de anticuerpos IgE citofilicos. Tras la anafilaxia, los niveles de triptasa en sangre aumentan rpidamente (30 minutos a 1 hora) y permanecen elevados durante 12 horas. Por comparacin, la histamina se aclara rpidamente de la sangre con una vida media de minutos. Los leucotrienos y factores activadores de plaquetas se activan localmenle y se encuentran en concentraciones mnimas en los lquidos corporales (Lewis, 1984).

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Otra clase de mediadores de la inflamacin de inters en la alergia son los pptidos anafilatxicos del complemento. C3a. C4a y C5a. producidos durante activacin de la cascada del complemento (vase Cap. 38). El papel de estos pptidos como mediadores de la inflamacin en la enfermedad alrgica no est bien establecido. Las anafilatoxinas humanas probablemente no se producen por interaccin del alrgeno y anticuerpos IgE. Sin embargo, como el C5a provoca la contraccin del msculo liso y aumenta la permeabilidad vascular, hay razones para una nueva investigacin de las anafilatoxinas complementarias como mediadores inflamatorios en sndromes de anafilaxia. Los anticuerpos del isotipo IgE sensibilizan basfilos humanos y mastocitos durante largos periodos de tiempo, al menos 24 horas, y estos anticuerpos median directamente la liberacin de histamina inducida por antgeno. como se coment anteriormente. En diversas especies de animales, los anticuerpos IgG de una o ms subclases tambin se ligan a clulas efectoras y originan la liberacin de histamina. No est bien establecido el papel anlogo de los anticuerpos IgG humanos. Algunos datos experimentales sugieren que los anticuerpos IgG humanos de la subclase lgG4 se ligan a leucocitos basfilos y pueden mediar en la liberacin de histamina, y a menudo la concentracin de la proteina lgG4 en suero se encuentra por encima de lo normal en adultos con asma (Homburger. 1986b). Sin embargo, los estudios clnicos no han podido demostrar un papel de la determinacin de la proteina lgG4 o anticuerpos lgG4 en el diagnstico o evaluacin pronostica en pacientes con asma.

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ENFERMEDADES ALRGICAS

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C A P T U L O

47

ai Diagnstico y tratamiento del cncer mediante marcadores tumorales serolgicos

James T. Wu, Ph.D.

NEOPLASIA Y REGULACIN DEL CRECIMIENTO TIPIFICACIN DE MARCADORES TUMORALES Respecto a la proliferacin celular Respecto a la diferenciacin celular Respecto a las metstasis Respecto a otros procesos asociados al tumor Respecto a la transformacin maligna Mutaciones heredadas

1028 1030

EFECTO DE LOS ANLISIS DISEADOS Unin competitiva Formato sandwich Anticuerpo monoclonal frente al policlonal Anticuerpo heterfilo MARCADORES TUMORALES PARTICULARES a- fetoprotena Molculas de adhesin Factores angiognicos P -microglobulina
?

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1037

Marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales especficos APLICACIONES CLNICAS Examen colectivo Diagnstico Monitorizacin del tratamiento Deteccin de recidiva Pronstico RECOMENDACIONES EN LA PETICIN DE MARCADORES TUMORALES Nunca se base en los resultados de una sola prueba Cuando se piden pruebas consecutivas, asegrese de pedir todas las pruebas al mismo laboratorio utilizando el mismo equipo de anlisis Asegrese de que el marcador tumoral seleccionado para controlar la recidiva est elevado en el paciente antes de la ciruga Valore la vida media del marcador tumoral cuando se interprete el resultado de la prueba Valore cmo se elimina o metaboliza el marcador tumoral desde la circulacin sangunea Trate de pedir mltiples marcadores para mejorar la sensibilidad y especificidad del diagnstico Pida marcadores no especficos para ahorrar costes y para una mayor sensibilidad Controle la posibilidad de efectos falseados Controle la presencia de marcadores tumorales ectpicos Existe un gran nmero de marcadores tumorales en la circulacin sangunea. Como el nivel sanguneo de marcadores tumorales por lo general refleja el volumen de clulas tumorales y la actividad tumoral. la determinacin de los marcadores tumorales en suero se ha convertido en un medio atractivo para la deteccin y el diagnstico de enfermedades neoplsicas. incluso para el control de su evolucin, especialmente durante el tratamiento La facilidad en la extraccin de sangre y la sensibilidad de estos anlisis de marcadores tumorales no invasivos tambin hace que las pruebas serolgicas sean muy superiores respecto a otras exploraciones clnicas basadas en mtodos fsicos. 1031

CA19-9. CA50yCA19-5 CA125 CA15-3 CA 72-4 Calcitonina Antigeno carcinoembrionario 1033 Oncoprotena c-erbB-2 (HER-2/neu) Cromogranina A CYFRA21-1 Ciclinas Receptores de estrgeno y receptores de progesterona Gonadotropina corinica humana LASA-P Enolasa neuronal especfica p53 Protena pS2 Hormona paratiroidea relacionada con pptidos Antgeno prosttico especfico PSA libre Carcinoma de clulas escamosas Antgeno polipptido tisular BIBLIOGRAFA 1041

NEOPLASIA Y REGULACIN DEL CRECIMIENTO

Para aprender cmo identificar, seleccionar y utilizar marcadores tumorales para el diagnstico de cncer y para el tratamiento de pacientes con cncer, es imprescindible que uno est familiarizado con los fundamentos de los procesos neoplsicos (vase Cap. 64). Es importante tener en mente que h a y dos importantes procesos involucrados en el crecimiento celular, diferenciacin y proliferacin. En clulas normales, ambos procesos se encuentran bien

CAPTULO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO D E L CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIGICOS Tumor -l marcadores inmorales

1029

Figura 47-1. Ilustracin de cmo la prdida de regulacin en c'ulas cancergenas genera diferentes marcadores tumorales y cmo estos procesos tienen que v e rc o n las dos importantes reacciones en el crecimiento celular.

regulados y bajo un estncto control. Cuando alguno de estos procesos pierde su regulacin, aumenta el riesgo para las clulas normales de convertirse en clulas tumorales (Fig, 47-1). De hecho, cada vez que se produce un crecimiento tisular nuevo, es importante diferenciar entre dos posibles causas del nuevo crecimiento: hiperplasia o neoplasia. La mayor diferencia entre estos dos procesos similares tambin se relaciona con el control del crecimiento La hiperplasa tiene un propsito til y est controlado por estmulos, mientras que la neoplasia no est regulada y no sirve a ningn propsito. Por tanto, se puede entender que la proliferacin no regulada es una caracterstica fundamental de todas las clulas neoplsicas, sin reparar en si el tumor es benigno o maligno. El resultado de la proliferacin incontrolada nos llevar a la formacin de una masa anormal de tejido, conocido como tumor. Seguidamente, el tumor continuar creciendo de forma irregular incluso despus de retirar el

Figura 47-3. Ilustracin de cmo los tumores estn compuestos de clulas heterogneas. Cada tipo de clula puede producir un m a r c a d o r tumoral diferente. Los tumores de diferentes tejidos tambin son diferentes en cuanto a su composicin celular pero pueden compartir clulas similares. Las baas de la derecha ensean la importancia del tratamiento de los mltiples marcadores tumorales para conseguir una sensibilidad del 100%. Tambin indica que un patrn especifico de mltiples marcadores puede estar asociado con un tipo especial de tumor.

estimulo que provoca el cambio. Los tumores benignos se quedarn en esta primera fase y presentarn menos riesgo para el husped. Los tumores benignos tambin tienen ms posibilidades de curarse mediante una extirpacin completa. No obstante, la inestabilidad gentica asociada a las clulas tumorales las hace ms susceptibles a mutaciones adicionales, que pueden llevar eventualmente a una enfermedad maligna (Fig. 47-2). Los tumores malignos habitualmente se asocian a diagnsticos errneos y poca supervivencia debido a su capacidad y tendencia para extenderse y metastatizar por va linftica y sangunea. En general, todos los tumores benignos se encuentran bien diferenciados. Las neoplasias malignas, por otro lado, varan desde bien diferenciadas hasta indiferenciadas. Aparentemente, el control de la proliferacin y diferenciacin se pierde en los tumores malignos. Algunos de los tumores malignos parecen tener la escasa diferenciacin fetal y producir sustancias similares a aquellas encontradas en tejidos fetales, las comnmente conocidas c o m o protenas carcinoembriognicas (Figs. 47-1 y 47-2). Las clulas malignas tambin pueden producir enzimas proteolticas que facilitan su escape de su entorno inicial. El cncer en el ser humano habitualmente se desarrolla a partir de clones mulantes de clulas como resultado de transformaciones neoplsicas. L a mayora de los cnceres tienen origen monoclonal, pero se requieren mltiples mutaciones para producir clulas malignas. Las mltiples mutaciones que suceden en los tumores pueden provocar el desarrollo de la heterogeneidad celular del tumor. Es interesante observar que los tumores no eslan compuestos de clulas homogneas; normalmente estn constituidos por subpoblaciones celulares con fenotipos claramente diferentes (Schnipper, 1986). El proceso de evolucin y progresin tumoral puede tambin generar diversidad biolgica dentro y en los diferentes focos melastsicos. Una clula obtenida de un determinado tumor puede ser distinta por varios factores:

Figura 47-2. Ilustracin de cmo clulas normales, despus de mltiples mutaciones, se convierten en clulas malignas. Los marcadores tumorales tienen dilerente capacidad de pronstico para las clulas tumorales y diferentes estados de desarrollo.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

tasa de crecimiento, receptores superficiales celulares, inmunogenicidad. expresin de marcadores tumorales (Fig. 47-3). capacidad de invasin y metstasis, y respuesta a drogas citotxicas (Fidler, 1982).

Respecto a la diferenciacin celular

Las protenas carcinoembnonanas encontradas en ambos tejidos, letal y tumoral, pero no en el tejido adulto normal, normalmente carecen de alguna funcin fisiolgica conocida y presentan niveles de concentraciones en sangre de milmetros por nanogramo (Figs. 47-1 y 47-2) Por tanto, las determinaciones de las protenas carcinoembronarias en sangre se deben realizar mediante inmunoanlisis. La especificidad y sensibilidad asociadas a estas protenas, aunque no son del 100, si son mucho mayores que otras enzimas y metabolitos utilizados como marcadores tumorales en el pasado. La concentracin serolgica de estas protenas carcinoembronarias no slo se correlaciona bien con la actividad tumoral sino que tambin se utiliza para predecir el pronstico. En general, las protenas carcinoembronarias no son convenientes en el examen colectivo: primero, los anticuerpos policlonales contra estas protenas a menudo tienen reacciones cruzadas con otras protenas normales, y segundo estas protenas carcnoembrionarias no aparecen lo suficientemente pronto en la sangre de pacientes con cncer. Sin embargo, se han utilizado como pruebas complementarias de diagnostico de cncer y son extremadamente tiles para controlar el xito del tratamiento y para detectar recidivas.

TIPIFICACIN DE MARCADORES TUMORALES

A pesar de que el cncer se origina por una transformacin maligna de una clula normal, hay pocas diferencias en cuanto a la expresin fenotpica entre una clula cancergena y una clula normal. Las mutaciones inducidas por el cncer no parecen alterar ninguna de las expresiones genticas o lenolpicas excepto en las regulaciones del crecimiento celular. En consecuencia, en los ltimos aos los esfuerzos para identificar un marcador tumoral especifico o un eptopo tumoral especfico no han tenido xito. Por otro lado, cualquier producto celular como enzimas, protenas sricas, metabolitos, receptores, protenas carcinoembronarias, oncoprotenas y protenas codificadas por genes supresores puede utilizarse como marcador tumoral siempre que tenga relacin con algn proceso durante la formacin o el crecimiento tumoral. as c o m o en la transformacin maligna, proliferacin, diferenciacin y metstasis. La evaluacin clnica de algn marcador tumoral determinado depender de la intencin de su utilidad clnica y de la especificidad y sensibilidad del marcador tumoral. El uso de marcadores tumorales como factores pronsticos o factores de riesgo tambin ha ganado ms y ms popularidad en estos ltimos aos. La determinacin de los factores de riesgo es muy valiosa en la valoracin de la agresividad de un tumor y til en la seleccin de las estrategias de tratamiento (Fig. 47-4).

Respecto a las metstasis

Las metstasis tumorales tienen varios pasos importantes (Liotta, 1987). Primero, las clulas tumorales tienen que penetrar en zonas cercanas, despus invadirn el torrente sanguneo o los vasos linfticos. Entonces, las clulas tumorales viajan a zonas distantes, hasta que se alojan en lechos venosos o capilares de rganos distantes. En este nuevo entorno, estas clulas tumorales han de penetrar de nuevo por las paredes vasculares para crecer en este nuevo lugar. Todos los productos celulares liberados y sintetizados durante estos pasos son posibles factores de nesgo. Su aparicin en el tejido tumoral o en la circulacin sangunea indica el riesgo o la aparicin de metstasis o un pobre pronstico. Las determinaciones de muchos de estos marcadores, sin embargo, estn an limitadas a tejidos tumorales o citosoles de tejidos tumorales.

Respecto a la proliferacin celular

Muchas hormonas gonadotropina corinica humana (hCG)). protenas sricas, enzimas (lactato deshidrogenasa [LD], fosfatasa alcalina []) y sus metabolitos (cido vanilmandlico [VMA], acido homovanlico [HVA], cido 5hidroxiindolactico [5-HIAA]) pueden llegar a estar elevadas en los tumores debido a la alia velocidad de proliferacin de las clulas tumorales. Sus concentraciones en suero aumentan incluso a concentraciones mayores cuando un tumor benigno se convierte en maligno y metastatiza. Como las enfermedades benignas y no malignas tambin pueden tener niveles de marcadores altos, no es conveniente el uso de estos marcadores para la deteccin sistemtica ni para el diagnstico de cncer debido al gran nmero de falsos positivos. Estos marcadores se utilizan para monitorizar a los pacientes durante el tratamiento.
Cncer de inania

Respecto a otros procesos asociados al tumor

Aparentemente, las actividades enzimticas de varias glucosiltransferasas rgano-especficas estn alteradas en clulas tumorales. Algunas de las glucosiltransferasas elevadas se han utilizado como marcador tumoral. La secuencia del azcar y la composicin de parte del hidrato de carbono de muchas glucoprotenas sricas, incluidas sustancias del grupo sanguneo y mucinas como CA 19-9. son marcadores tumorales resultantes de la alteracin de la glucosiltransferasa. La AFP (alfa-fetoprotena) aislada en pacientes con hepaloma primario tiene una fucosa adicional comparada con la AFP de enfermedades benignas hepticas, un ejemplo de la fucosiltransferasa alterada en clulas del hepatoma (Wu. 1990).

Respecto a la transformacin maligna

Los oncogenes, que codifican protenas que funcionan en todos los niveles de regulacin del crecimiento, juegan un importante papel en la transformacin celular (Druker. 1989). Estas oncoprotenas son similares a los productos normales de los protooncogenes excepto en que han perdido la tuerza reguladora de su actividad y no necesitan seales de activacin externas para originar una proliferacin celular. La determinacin de la expresin tisular de estas oncoprotenas se ha utilizado para el pronstico. Una de las oncoprotenas ms extensamente estudiadas, llamada, proteina c-erbB-2 (p185), se ha detectado en el suero por inmunoanlisis. Una investigacin posterior descubri que el dominio extracelular del c-eroB-2 podra fraccionarse y liberarse a la circulacin sangunea. El dominio extracelular del p185 parece que se relaciona no slo con la cantidad de p185 expresado en la membrana de la clula tumoral, sino tambin con el cambio de la concentracin de muchos importantes marcadores tumorales sricos (Wu. 1995). Como la transformacin maligna es un acontecimiento especifico en la carcinognesis. cualquier producto celular asociado a este evento tiene la posibilidad de ser un marcador tumoral especfico ms. Es posible que otros receptores transmembrana rea-

Figura 47-4. Ilustracin de cmo la afectacin ganglionar determina el riesgo de las pacientes con cncer de m a m a y del propio tratamiento. Actualmente se utiliza un panel con varios nuevos marcadores pronsticos determinados en el citoplasma del t u m o r junto con la determinacin de ganglios para proporcionar u n a valoracin ms correcta de los riesgos para las pacientes con cncer de mama.

CAPTULO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIGICOS

1031

Tampoco se necesita la caracterizacin e identificacin completa de la molcula que lleva el epitopo. Un hibridoma se puede preparar inyectando a un ratn una fraccin enriquecida de la membrana de la clula tumoral o incluso toda la clula tumoral. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales de inters se seleccionan para el procedimiento posterior de deteccin sistemtica. Una vez concretado el hibridoma, se obtendr un nmero ilimitado y consistente de anticuerpos monoclonales para diferentes utilidades. La especificidad tanto de los anticuerpos como del inmunoanalisis esta bien definida y es reproducible. Muchos de los problemas relacionados con los anlisis que utilizan anticuerpos policlonales. como la reduccin de una gran parte de la variacin del anticuerpo e inconsistencias del anlisis, desaparecern o se reducirn sobremanera. Tambin han fracasado las tentativas para identificar eptopos especficos tumorales usando anticuerpos monoclonales. Como sucede con los marcadores tumorales identificados por anticuerpos policlonales, slo hay eptopos asociados al tumor (Fig. 47-5). No obstante, se ha demostrado que las pruebas para definir los marcadores tumorales para un tumor definido tienen una sensibilidad y especificidad ms alta que otros que utilizan anticuerpos policlonales. Por ejemplo. CA 19-9. CA 125 y CA 15-3 son mucho ms sensibles y especificas que el antgeno carcinoembrionario (CEA) en el carcinoma pancretico, ovarico y de mama, respectivamente. Estos marcadores (Tabla 471) estn recomendados para reemplazar la prueba del CEA policlonal en el diagnstico y tratamiento de pacientes con los carcinomas previamente mencionados. Muchos eptopos asociados al tumor comparten con varios marcadores tumorales derivados de diferentes tumores. Por eiemplo. CA 19-9, CA 15-3. y CA 125 se expresan en casi todos los carcinomas de distintos grados. Adems de la participacin de unos eptopos determinados en ms de un carcinoma, tambin es posible que una sola molcula exprese ms de un epitopo (Yu, 1991); por ejemplo, como sucede cuando CA 15-3 y CA 1 2 5 son expresados por la misma molcula de mucina en el suero.

Figura 47-5. Ilustracin de cmo se detinen e identifican los eptopos situados en la superficie d eu n a gran molcula del m a r c a d o r lumoral mediante anticuerpos monoctonales. Las diferentes molculas pueden compartir los m i s m o s eptopos. pero la composicin global o el modelo de mltiples eptopos en distintas molculas particulares pueden diferir entre ellas.

cionados con la transformacin celular puedan comportarse similarmente y ser tiles como marcadores tumorales o indicadores de pronstico. Se necesitan amplios estudios detallados sobre el c-erbB-2 y otras protenas codificadas por oncogenes para evaluar completamente el potencial de las oncoprotenas en el diagnstico y tratamiento de pacientes con cncer.

Mutaciones heredadas
Aparte de los oncogenes, pero igualmente importantes, est un grupo de genes supresores que han sido descubiertos incluso ms recientemente. Las protenas codificadas por genes supresores son responsables de la supresin del crecimiento celular. Estos genes supresores pueden sufrir supresiones o mutaciones resultando en la produccin de productos del gen inactivos, que fueron encontrados en familias con alto riesgo de cncer. Se han identificado los distintos genes supresores y las protenas que codifican. Por ejemplo, la p53 se ha investigado considerablemente por su papel en distintos cnceres. Los genes supresores y sus productos son potencialmente tiles como marcadores tumorales para el examen colectivo e identificacin de familias o individuos de alto riesgo. El descubrimiento de dos genes susceptibles (o genes supresores tumorales) para el cncer de mama, llamados BRCA1 y BRCA2. ha generado recientemente un tremendo inters (Miki, 1994; Wooster. 1994). Los estudios (Easton. 1993) sugieren que las mutaciones en el BRCA1 son responsables de aproximadamente la mitad de todos los casos de cncer de m a m a hereditario. Adems, los portadores de las mutaciones del BRCA 1 tambin provocan un incremento del riesgo de cncer de ovario, colon y prstata (Futreal, 1994). El BRCA2, segundo gen susceptible para el cncer de mama, se cree que se encuentra en casi el 70% de casos de cncer de m a m a hereditario que no se debe a mutaciones del BRCA1 y est relacionado con un aumento de nesgo en el cncer de m a m a en hombres. El desarrollo de inmunoanalisis para la determinacin de las protenas que codifican BRCA1 y BRCA2 est en proceso y debera servir para la identificacin de individuos de alto riesgo y sus familias.

APLICACIONES CLNICAS
Es esencial que se entienda el significado de las pruebas de sensibilidad y de especificidad de los marcadores tumorales antes de hablar sobre las aplicaciones de los marcadores tumorales (von Kleist, 1988; Sell, 1990). De hecho, la utilidad clnica de un marcador tumoral depende casi totalmente de la especificidad y la sensibilidad del marcador tumoral. Cuando el anlisis de un marcador tumoral se dice que tiene una sensibilidad del 100%. significa que el anlisis puede detectar a todos los pacientes con ese tipo concreto de cncer, mientras que un anlisis con una especificidad del 100% significa que el anlisis identificar solamente a los pacientes con ese tipo especifico de tumor y no aquellos con enfermedad benigna o no maligna. En consecuencia, la sensibilidad es una medida de los verdaderos positivos y se calcula con la siguiente frmula;

% Verdaderos positivos Sensibilidad = (% Verdaderos positivos + % Falsos negativos) Por otro lado, la especificidad es una medida de los falsos positivos y se calcula con la siguiente frmula; % Verdaderos negativos Especificidad = (% Verdaderos negativos + % Falsos positivos)

Marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales especficos

El desarrollo de la tecnologa del hibridoma ha tenido mucho impacto en la identificacin de marcadores tumorales. Antes de conocer una molcula completa de una estructura protenica conocida, actualmente es posible centrarse en una pequea rea de superficie, un epitopo o determinante antignico mediante anticuerpos monoclonales (Fig. 47-5). Ya no se necesita purificar el antigeno para la preparacin de anticuerpos policlonales en animales.

Tabla 47-1

Determinacin de m a r c a d o r e s tumorales mediante anticuerpos m o n o c l o n a l e s E n f e r m e d a d maligna importante Carcinoma ovrico Carcinoma pancreatico Carcinoma de mama Carcinoma gstrico

M a r c a d o r tumoral CA 125 CA 19-9 CA 15-3 CA 72-4

1032

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Teniendo en cuenta esta informacin, se puede comenzar a hablar de las siguientes aplicaciones clnicas de los marcadores lumorales.

Monitorizacin del tratamiento

Una de las dos aplicaciones ms tiles de los marcadores tumorales implica el control del curso de la enfermedad, especialmente durante el tratamiento. En la Figura 47-6 se muestra el cambio en los niveles en suero de diversos marcadores tumorales durante el curso de un cncer ovrico en u n a paciente. El nivel en suero de los marcadores tumorales refleja bien el xito de la ciruga o la eficacia de la quimioterapia. Cuando se detectan niveles elevados de un marcador tumoral despus de la ciruga, esto puede indicar una extirpacin incompleta del tumor recidiva, o la presencia de metstasis. L a determinacin de los marcadores tumorales en suero durante la quimioterapia tambin aporta una indicacin de la elicacia del citostlico utilizado y una gua para la seleccin de los medicamentos ms efectivos para cada caso en particular.

Examen colectivo
El primer intento por parte de Gold (1965) en detectar el carcinoma colorrectal en hombres mediante radioinmunoanlisis (RA) de CEA en suero llev al autor a la comprensin de que ninguno de los marcadores tumorales descubiertos tena la especilicidad y la sensibilidad para el examen colectivo. En la actualidad no se recomienda el examen colectivo, especialmente en una poblacin asintomtica. Adems de la carencia deseada de especificidad y sensibilidad de los marcadores tumorales, la baja prevalencia del cncer y la baja sensibilidad y especificidad de los marcadores tumorales en general tambin se opone al examen colectivo de los cnceres. Se temia que la naturaleza no especfica de la mayoria de los marcadores tumorales examinados pudiera crear demasiados falsos positivos y causar de forma innecesaria una alarma o preocupacin en la poblacin general. Por otro lado, hay excepciones donde el examen colectivo del cncer est comprobado usando marcadores tumorales. El examen colectivo del hepatoma primario en China mediante el tratamiento de la AFP en suero es un buen ejemplo de estas excepciones debido a la alta incidencia de cncer heptico en esta rea del mundo (Wu, 1987). La posibilidad del examen colectivo de cncer de ovario en mujeres con la determinacin en suero del CA 125 sigue en proceso de investigacin. El diagnstico de cncer ovlico depende en principio de la ciruga. Sin embargo, en la mayoria de los casos, en el momento de la deteccin del tumor, ste se encontrar en estadio avanzado, donde la posibilidad de curacin es baja. La recomendacin de la identificacin sistemtica de cncer de prstata mediante la determinacin del antigeno especifico prosttico (PSA) en suero junto con el tacto rectal digital (DRE) se debe a la especificidad del tejido para el PSA (Wu. 1994) y a la alta prevalencia del cncer de prstata en hombres a partir de los 50 aos de edad. Est especialmente recomendado en hombres afroamericanos, debido a que el porcentaje de incidencia para este grupo es casi el doble que para la poblacin general, y el porcentaje de mortalidad es Ires veces superior. El examen colectivo permite el tratamiento confinado al rgano, potencialmente curable del cncer de prstata descubierto en hombres con una esperanza de vida superior a 10 aos. La combinacin de la prueba del PSA y del DRE proporciona el mnimo coste considerado para la deteccin precoz del cncer de prstata (Littrup, 1993).

Deteccin de recidiva
La segunda aplicacin ms til de los marcadores tumorales es controlarlos para la deteccin de recidiva despus de la extirpacin quirrgica del tumor. Se sabe que la aparicin de la mayoria de los marcadores tumorales circulantes tiene un "tiempo de adelanto" de vanos meses (de tres a seis meses) antes de cualquier procedimiento fsico utilizado en la deteccin del cncer. La facilidad de su deteccin en sangre y la sensibilidad de los marcadores tumorales hacen que este proceso de control no invasivo sea aceptado de forma generalizada en la actualidad. La especificidad de los marcadores tumorales no presenta un problema para esta aplicacin.

Pronstico
La estimacin de la agresividad tumoral y el pronstico para la evolucin del paciente con cncer han ganado creciente popularidad en estos ltimos aos. El conocimiento de la agresividad lumoral tambin ayuda al desarrollo de una terapia apropiada para el paciente. Por ejemplo, la deteccin de marcadores tumorales. altamente asociada con malignidad y metstasis, apuntar un tratamiento ms riguroso y sistmico. La mayora de los marcadores tumorales se elevan cada vez ms cuando el tumor metastatiza. Desdichadamente, muy pocos marcadores tumorales tienen un lmite bien definido entre estadios benignos y malignos. Los (actores de riesgo asociados al proceso de metstasis tumoral, como proteasas y molculas de adhesin, son habitualmente mejores marcadores para predecir el pronstico. Sin embargo, la mayoria de estos marcadores an se determinan en tejidos tumorales y citoplasmas. El hallazgo del dominio extracelular de la protena c-eroB-2 en el suero y la correlacin entre el dominio extracelular del suero con los niveles de otros marcadores tumo-

Diagnstico
Los problemas tanto de la especificidad como de la sensibilidad asociados a la mayora de los marcadores tumorales excluyen su determinacin en el diagnstico del cncer. La frecuencia de deteccin de niveles elevados de marcadores tumorales en enfermedades no malignas y la coexistencia observada entre las concentraciones normales y las concentraciones de marcadores tumorales en pacientes con cncer se oponen a su uso en el diagnstico. La mayora de los marcadores tumorales usados en la actualidad no pueden distinguir las enfermedades malignas de las benignas. Los marcadores tumorales, no obstante, siguen utilizndose con xito como prueba complementaria para la deteccin del cncer. Se han propuesto recientemente varios abordajes para mejorar la especificidad diagnstica de muchos marcadores lumorales. El uso de mltiples marcadores es un abordaje que ha tenido gran aceptacin. Los patrones especficos de mltiples marcadores tumorales parecen estar relacionados con determinadas enfermedades malignas. Los principales inconvenientes para el uso de mltiples marcadores tumorales son el coste y los rigores de la propia seleccin de los marcadores tumorales para incluirlos en el panel. Otro abordaje para mejorar tanto la especificidad como la sensibilidad de un marcador tumoral. como en el caso de la prueba de PSA en suero, implica la medida de la velocidad (porcentaje de aumento en la concentracin de PSA en el tiempo) y la densidad (p. ej.. dividiendo la concentracin de PSA en suero entre el volumen de la glndula prosttica, determinado por ecograla transrectal) (Benson, 1992). Un ligero aumento del nivel de PSA en suero asociado con una glndula prosttica pequea puede indicar cncer, mientras que la misma valoracin en un paciente con una glndula grande puede indicar slo una hiperplasia prosttica benigna (HPB).

Da
Figura 47-6. Ilustracin del c a m b i o de los niveles en suero de CA 1 2 5 en el transcurso de la enfermedad en una paciente con cncer ovrico. Tambin se acenta el hecho de que mltiples marcadores pueden aumentar o descender conjuntamente. Los niveles de los marcadores tumorales se normalizan dividindolos p o r sus cotas superiores normales.

CAPTULO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLGICOS

1033

rales en suero es alentadora. Se espera que en un futuro cercano sea posible la determinacin en la circulacin sangunea de estos factores de riesgo para el pronstico.

tardarn 30 das para disminuir a un rango no detectable despus de un xito quirrgico.

Valore cmo se elimina o metaboliza el marcador RECOMENDACIONES EN LA PETICIN DE MARCADORES TUMORALES

Cuando se solicitan marcadores tumorales como prueba diagnstica complementaria y para el tratamiento de los pacientes con cncer, se deben considerar las siguientes recomendaciones para evitar equivocaciones en los resultados de las pruebas.

tumoral desde la circulacin sangunea

A menudo se detectan marcadores tumorales elevados en suero en pacientes con enfermedad renal o heptica, dependiendo de si el marcador tumoral se elimina por filtracin glomerular o se metaboliza por el hgado. Por ejemplo, el CEA en suero a menudo se eleva en pacientes con enfermedades hepticas porque el hgado daado es incapaz de eliminarlo eficazmente de la circulacin sangunea, mientras que una |J-microglobulina (|i2M) elevada a menudo se detecta en pacientes con fracaso renal, donde hasta la pequea molcula (2M tiene dificultad para atravesar la membrana glomerular de una manera normal.
2

Nunca se base en los resultados de una sola prueba

Debido a que la mayora de los marcadores tumorales no son especficos, es difcil diferenciar entre enfermedades malignas y otras enfermedades benignas o no malignas basndose en los resultados una sola prueba. La mayora de las elevaciones encontradas en las enfermedades no malignas son frecuentemente transitorias, mientras que en el cncer los niveles se mantienen elevados o aumentan continuamente. La peticin de pruebas consecutivas puede ayudar a detectar falsos niveles de elevacin debidos a elevaciones transitorias. El mejor ejemplo es la AFP en suero. La AFP elevada en suero puede detectarse en pacientes con hepatoma primario o con enfermedades hepticas. Sin embargo, en una segunda prueba dos semanas ms tarde la AFP en suero permanecer elevada en pacientes con cncer, mientras que en pacientes con enfermedades hepticas la AFP en suero volver a un nivel normal.

Trate de pedir mltiples marcadores para mejorar la sensibilidad y especificidad del diagnstico
Como se ilustra en la Figura 47-3, los tumores estn formados por clulas heterogneas. Algunas pueden incluso ser clulas normales y otras pueden ser clulas tumorales heterogneas como resultado de una secuencia diferente de mltiples mutaciones. Cada tipo de clula puede expresar un nico marcador o un numero de marcadores tumorales caracterstico. El mismo marcador puede tambin ser producido por diferentes tipos de clulas. Puede que algunas clulas nunca produzcan un solo marcador. Como se ilustra en la Figura 47-3, los distintos tumores que derivan del mismo tipo de tumor aparentemente pueden incluso ser heterogneos en su composicin celular. Igualmente, se necesita ms de un marcador tumoral para proporcionar una sensibilidad en la deteccin del 100%. L a heterogeneidad en la composicin celular y el porcentaje de la distribucin celular de cada tumor explican por qu se necesita un nmero de marcadores tumorales para alcanzar el 100% de sensibilidad de deteccin y por qu la sensibilidad de un marcador en particular tambin es diferente entre pacientes con cncer. En la Tabla 47-2 se detallan mltiples marcadores tumorales relacionados con enfermedades malignas particulares: la aparicin de marcadores tumorales caractersticos en varias neoplasias se detalla en la Tabla 47-3. Esto explica por qu ninguno de los marcadores tumorales utilizados actualmente tiene una especificidad y sensibilidad del 100%. y por qu el uso de mltiples marcadores mejorar la sensibilidad de deteccin. Sin embargo, un nico patrn de mltiples marcadores puede identificarse en tumores derivados de los mismos tejidos. Por tanto, al pedir mltiples marcadores tumorales tambin se mejorar la especificidad. Por ejemplo, un patrn especfico puede estar asociado a carcinomas de colon, de mama, de ovario y de pncreas cuando los cuatro marcadores tumorales determinados por anticuerpos monoclonales, como CEA. CA 19-9, CA 15-3 y CA 125, se miden simultneamente. Esta informacin es clnicamente importante, ya que ms del 60% de los cnceres que se tratan son carcinomas derivados del epitelio celular (Wu, 1989). Se desarrollaron mltiples marcadores para una estrategia de deteccin precoz mas especifica para el cncer ovrico. Se vio que el uso de CA 15-3 y TAG72 junto con CA 1 2 5 puede aumentar la especificidad aparente de los anlisis de CA 1 2 5 para distinguir enfermedades malignas de benignas (Bast, 1991). Se debera tener en cuenta que durante la seleccin de los mltiples marcadores tumorales, slo se deberan de seleccionar los marcadores que son complementarios unos con otros. Aquellos numerosos marcadores tumorales que van paralelos a la actividad tumoral no deberan seleccionarse para este propsito.

Cuando se piden pruebas consecutivas, asegrese de pedir todas las pruebas al mismo laboratorio utilizando el mismo equipo de anlisis
Cada equipo comercial distinto puede generar diferentes resultados aunque todos estn diseados para el mismo marcador tumoral. Cuando se piden desde el mismo laboratorio tambin se garantiza una mayor seguridad en la ejecucin. Es importante asegurarse de que algunos cambios observados durante el proceso controlado se deben al cambio del volumen tumoral o a otras actividades tumorales y no a la variabilidad de laboratorio (Fig. 47-6).

Asegrese de que el marcador tumoral seleccionado para controlar la recidiva est elevado en el paciente antes de la ciruga
Como ninguno de los marcadores tumorales tiene una sensibilidad del 100% en la deteccin de un determinado cncer, para estar seguro es importante que el marcador tumoral concreto para detectar la recidiva est elevado antes de la ciruga. De lo contrario, se deberan detectar mltiples marcadores antes de la ciruga para seleccionar el marcador tumoral ms elevado que pueda controlar la actividad de la enfermedad.

Valore la vida media del marcador tumoral cuando se interprete el resultado de la prueba
Estime el tiempo requerido para que el nivel determinado antes de la ciruga disminuya al nivel normal o. en el caso del PSA, a un nivel indetectable basndose en el conocimiento de la vida media de los marcadores tumorales. Es importante que la determinacin de las concentraciones de marcadores tumorales para determinar el xito de la extirpacin quirrgica de ese determinado tumor no se realice antes de las dos semanas del postoperatorio. Sera preferible esperar todo un mes debido al tiempo necesario para que los niveles de marcadores tumorales preexistentes en suero desciendan a niveles ms bajos. Por ejemplo, la vida media del PSA en suero es de aproximadamente tres a cuatro das; por tanto, 50 ng/'ml de PSA en suero

Pida marcadores no especficos para ahorrar costes y para una mayor sensibilidad
Si el nico objetivo es controlar la eficacia del tratamiento, debera considerarse el uso de marcadores tumorales no especficos (Tabla 47-4). Aunque estos marcadores no especficos carecen de especificidad para el diagnstico y, en lo que respecta a algunos tipos especficos de tumores, sus concentraciones son sin duda m u y sensibles a algunos cambios en la actividad tumo-

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Tabla 47-2

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

Marcadores tumorales s e r o l g i c o s relacionados con enfermedades malignas particulares Marcador importante Hormona del crecimiento Cortisol TdT B2M Otros marcadores IGF-I Catecolaminas libres, DEA, 17-cetoesteroides, prolactina B2M en suero. LASA-P LD Antgeno-T, inhibidor de urocinasa, CEA, TPA. citoqueratinas, glucosammoglucosas Protema de Bence Jones, hidroxiprolma. calcio en suero Poliaminas CEA, calcitonina. CA 549, CA M26. CK-BB. termina, B-hCG. LASA-P, prolactina, protena P 21, PS-2 Histamina, ADH, bradicmina Anticuerpos AG-4. CA 125, CEA, TPA CA 19-5, CA 19-9, CA 72-4, CK-BB, NSE Endorfina. lpotropina CA 19-9, CA 50, CEA, ferritina, CK-BB. hCG. LASA-P, pepsingeno II, prolrombina

Enfermedades malignas Tumores pituitarios acromeglicos Tumores pituitarios suprarrenales Leucemia de lintocitos B crnica Linlocitos B malignos Cncer de vejiga Cncer de hueso Tumor cerebral Cncer de mama Carcinoma broncognico Tumores carcinoides Cncer cervical Conocarcinoma Cncer colorrectal Leucemia mieloide crnica Sndrome de Cushing Tumores pancreticos endocrinos Carcinoma gstrico Gastrinoma Glucagonoma Leucemia de clulas peludas Tumores de cabeza y cuello Carcinoma hepatocelular Hipercalcemia maligna Enfermedad de Hodgkin Insulinoma Cncer de duodeno Tumores renales Leucemia Cncer de pulmn Lmfoma Cncer medular de tiroides Antigeno de melanoma Microadenomas (pituitaria) Mieloma mlliple Mesotelioma Microadenomas Neoplasias endocrinas mltiples Tumor testicular no seminomatoso Neuroblastoma Tumores no-islotes Cncer microctico Osteosarcomas Carcinoma ovrico Carcinoma pancretico

Foslatasa alcalina Desmesterol CA 15-3 Prolactina SCC hCG CEA TdT ACTH Polipptido pancretico CA 72-4 Gastnna Glucagn Receptor IL-2 SCC AFP Pplido relacionado con PTH Insulina ADH CEA TdT

CEA, ferritina, rGT, ALP. TPA, y-glutamiltranspeptidasa LASA-P. ferritina Pptido-C, proteina I aglutinante IGF-I

Tumores de islotes pancreticos Cncer tiroideo papilar y folicular Tumores paratiroideos Feocromocitoma Tumores pituitarios Tumores placentarios Leucemia de clulas plasmticas Carcinoma prostlico Carcinoma de clulas renales Sarcoma Seminoma Tumores de bazo Cncer de clulas escamosas Crvix Pulmn Cabeza y cuello Cncer de estmago Teratoblastoma Cncer testicular no seminomatoso Cncer uterino Vipoma (pncreas)

NSE ALP, 2M, ferritina, LDH. protema mielina bsica. NSE adenosine deaminasa, PNP ACTH, CK-BB, calcitonina. CA 72-4. CEA, AFP, lerritina. LASA-P. TPA B2M TdT. Ki-67, LASA-P Calcitonina NSE LASA-P relacionado con melanoma, i-dopa NSE, catecolaminas plasmticas Prolactina Inmunoglobulina densa de cadena ligera y densa Protena de Bence Jones. 2M. IgA cido hialurnico Prolactina Cromogranma A AFP hCG VMA HVA. NSE. cistationina, ferritina, metanefrinas Insulina como factor de crecimiento ACTH, ADH, CEA, CK-BB, NSE, bombesina, calcitonina ALP UGF, inhibina. AFP, isoenzima amilasa, CEA. CK-BB. CA 125 hCG, galactosiltransferasas, LDH. TPA CA 19-5. CA 50. CA 72-4, CEA, CK-BB, ADH. ALP. CA 19-9 ferritina. isoenzima II galactosiltransferasa. Y-glutamiltranspeptidasa, PAP Insulina Tiroglobulina PTH ntegro Cromogranma A, catecolaminas plasmticas Metanetnna FSH, LH, prolactina, TSH othCG libre hCG a-hCG libre TdT PSA PAR ALP, CEA, CK-BB, TPA Renina, eritropoyetina, interleucina-4, prostaglandina A. CA 15-3, hormona paratiroidea, NSE, prolactma B2M NSE Ferritina SCC SCC SCC CA 72-4 AFP hCG AFP SCC VIP

CYFRA 21-1 Ferritina CEA, NSE hCG. ferritina -hCG, LDH

La labia contina en la siguiente pgina

CAPTULO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLGICOS

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Tabla 47-2

M a r c a d o r e s tumorales serolgicos relacionados c o n e n f e r m e d a d e s m a l i g n a s particulares (continuacin) M a r c a d o r importante Inmunoglobulinas IgM Gastrina Otros marcadores 2M

E n f e r m e d a d e s malignas Enfermedad de Waldenstrom Sndrome de Zollinger-Ellison

ACTH = hormona adenocorticolropa: ADH = hormona antidiurtica; AFP -letoproteina; ALP = tosfatasa alcalina; AMF = tactor de motilidad autocrino; 2M = beta microglobulina; HPB = hiperplasia prosttica benigna; CEA = antlgeno carcinoembrionario; CK-BB = isoenzima BB creatina cinasa; DEA = dehidroepiandrosterona. FDP = productos de degradacin de fibrina; FSH = hormona lollculo-estimulanle: Gl = gastrointestinal; GT = gamma-glutamil Iransferasa; hCG = gonadolropina orlonica humana. HVA = cido homovanilico; IGF-I = factor de crecimiento insulinico I: IL-2 = interleucina; LASA-P = cido silico relacionado con lipidos: LD = laclato deshidrogenasa: LH = hormona lutemizante; NSE = enolasa especlica neuronal PAP = fosfatasa cido prosttico: SCC = antigeno de clulas escamosas e carcinoma. TdT = deoxinucleotidol transferasa terminal; TPA = antlgeno de tejido polipptido; TSH = lirotropina; VIP pohpptido intestinal vasoaclivo. VMA = cido vanilmandlico.

Tabla 47-3

E n f e r m e d a d e s m a l i g n a s relacionadas con m a r c a d o r e s t u m o r a l e s s e r o l g i c o s particulares E n f e r m e d a d e s m a l i g n a s asociadas

Marcador tumoral" AFP -hCG. cadena libre 2M CA 15-3 CA 19-9 CA 72-4 CA 125 -hCG Protena de Bence Jones Bombesina CA 549 CA M26 Calcitonina CEA c-erbB-2 oncoprotena Cromogranina A CYFRA 21-1 Desrnesterol DEA ADN Ferritina Galactosillranslerasa Isoenzima II galactosillranslerasa Gastrina Histaminasa hCG cido hialurnico IgA IGF-I Receptor IL-2 Inmunoglobulinas Inhibira Insulina como factor de crecimiento Catacalcina 17-cetoesteroides LASA-P Antgeno relacionado con melanoma Metanefrinas Enolasa neuronal especifica Polipptido pancretico Proteina P 21 Catecolaminas plasmticas PNP POA PSA PAP Protena PS-2 SCC TdT Tiroglobulma TPA TAG 72 Inhibidor de urocinasa VIP 'Vase Tabla 47-2 para abreviaturas.

Enfermedades importantes Carcinoma hepatocelular primario Tumores pituitarios Neoplasias de linfocilos B Cncer de mama Carcinoma pancretico y gstrico Carcinoma gstrico Carcinoma ovrico Coriocarcmoma Mieloma multiple Cncer microctico Cncer de mama Cncer de mama Carcinoma medular Carcinoma colorrectal Cncer de mama Feocromocitoma. neuroblastoma Carcinoma de clulas escamosas del pulmn Tumores cerebrales Cncer adrenal/pituitaria Carcinoma cervical Leucemia mieloide aguda Cncer de ovario Cncer pancretico Gastrinoma Cncer medular/tiroideo Coriocarcinoma Mesotelioma Mieloma mltiple Cncer hipofisario Leucemia Mieloma mltiple Tumores de clula granulosa Tumores de clulas no-islotes Cncer medular de tiroides Cncer adrenal/pituitaria Melanoma Feocromocitoma Carcinoma microctico de pulmn Tumor endocrino Cncer de mama Feocromocitoma Leucemia Cncer pancretico Cncer de prstata Cncer de prstata Cncer de mama

Enfermedades menos importantes Teratoblastomas de ovarios y testculos Mieloma mltiple, linfoma de linlocitos B. leucemia linloctica de linfocilos B crnica y clulas reticulares, sarcoma enfermedad de Waldenstrom Carcinomas varios Carcinomas vanos Carcinomas varios Carcinomas varios Cnceres testiculares (no seminomatosos). tumores troloblslicos

Cncer de tiroides, cncer de hgado, cncer renal Carcinomas varios Carcinomas varios Neoplasias endocrinas mltiples, cncer microctico de pulmn, tumores carcinoides

Linfoma de Hodgkin, neuroblastoma y vanos carcinomas, leraloblastoma

Sndrome de Zollmger-Ellison Carcinoma gstrico, ovrico y de mama, tumores trofoblsticos o de clulas germinales, cncer testicular

Insulinoma

Linfoma mediterrneo, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma maligno

Carcinomas varios, leucemia, linfoma, enfermedad de Hodgkin Neuroblastoma, ganglioneuromas Neuroblastoma, tumores renales

Hipertrolia prosttica benigna (HPB) Algunas leucemias Carcinoma de clulas escamosas del tero, crvix, SCC de pulmn y de cabeza y cuello

Leucemia Cncer tiroideo No especifico Carcinoma gstrico Tumores de vejiga Vi poma

Carcinomas varios Cncer colorrectal, de pulmn, pancretico y de ovario

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/* ' " ' "' " " """"" . '

SECCIN V
. . . . .

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

Tabla 47-4 M a r c a d o r e s t u m o r a l e s n o especficos* Antlgeno Tennessee CEA (policlonal) Antigeno del tepdo polipplido cido silico relacionado con llpidos Vase T a b l a 47-2 para abreviaturas.
B2M

El Colegio Americano de Mdicos tambin ha publicado las directrices clnicas en lo que se refiere a la deteccin precoz del cncer de prstata. Subrayan la importancia de la identificacin sistemtica del PSA y de la realizacin del DRE en la deteccin precoz del cncer de prstata. Aunque el DRE no es tan sensible como el de la identificacin sistemtica del PSA, detecla el cncer que de otro modo podra no detectarse con el PSA (Coley, 1997a b).

EFECTO DE LOS ANLISIS DISEADOS

ral. Muchos de ellos son econmicos y fciles de determinar y son. por tanto, tiles para controlar la terapia y para detectar una recidiva en pacientes con diagnstico conocido. Por eiemplo. el cido silico P asociado a lpidos (LASA-P) puede cuantificarse con un procedimiento de calorimetra simple, rpido y econmico y su concentracin en suero est estrechamente relacionada con las concentraciones en suero de muchos marcadores tumorales de alta especificidad. El impacto del diseo de una prueba, incluida la seleccin de anticuerpos, no slo afecta a la sensibilidad y especificidad de la prueba y al porcentaje de concentracin, sino que tambin afecta al nivel de marcador tumoral donde aparece el electo trampa y si un resultado falso negativo o falso positivo provocar interferencias.

Unin competitiva
El primer RA desarrollado se bas en el formato de unin competitiva. L a combinacin de una prueba de unin competitiva con un antigeno marcado radiactivamente aportaba la sensibilidad necesaria para cuantificar m u c h o s marcadores tumorales circulantes, especialmente las protenas carcmoembrionarias, en los rangos de concentracin de nano y picogramo por mililitro. L a base de este formato de prueba incluye la competicin entre una cantidad fija de antigeno marcado radiactivamente y del antigeno en la muestra con u n a cantidad limitada de anticuerpo. Despus de la separacin del compuesto antgeno-anticuerpo del antigeno libre, la medida de la radiactividad del compuesto permitir la estimacin de la cantidad de antigeno presente en la muestra. En la Figura 47-7 se presentan dos formatos de prueba diferentes, uno para RA y uno para el enzimommunoanlisis absorbente (ELISA). No obstante, algunas sustancias que interfieren en la unin entre antigeno y anticuerpo provocarn un resultado falsamente elevado. Lo que no se tuvo en cuenta es el hecho de que la misma sustancia que interfiere y que est presente en un anlisis empleando el mismo antigeno y anticuerpo en formato sandwich producir un resultado falsamente negativo (Wu. 1983). En la dcada de los 80 se mostr que los dos sistemas importantes comercializados de CEA, uno de Abbott empleando un formato sandwich y uno de Roche usando el formato de unin competitiva, no producan el mismo resultado de CEA de las mismas muestras cuando las muestras contenan sustancias que interferan, c o m o las giucosaminoglucanos.

Controle la posibilidad de efectos falseados

Uno de los inconvenientes del popular inmunoanlisis de tipo sandwich es la capacidad para provocar efectos engaosos (Wu. 1991). El efecto trampa que tiene lugar en un inmunoanlisis tiende a dar un valor falsamente bajo cuando la concentracin del marcador tumoral en la muestra sube por encim a de una muy elevada concentracin. El nivel exacto de marcador tumoral donde puede producirse un efecto trampa depende del diseo de la prueba y de la concentracin de anticuerpos utilizada en el anlisis. El uso de la misma muestra para dos diluciones distintas (sin diluir y dilucin de 1:10) revelar el efecto trampa. La muestra diluida 1:10 normalmente producir un valor 1 0 veces menor que otra muestra no diluida. Si hay un efecto trampa, la muestra diluida 10 veces producir un valor ms alto que la muestra original (despus corregir con el factor de dilucin). El anlisis del marcador tumoral deber repetirse con una muestra diluida 10 veces cuando el resultado de un inmunoanlisis de tipo sandwich sea demasiado bajo para equiparar la gravedad clnica del paciente.

Controle la presencia de marcadores tumorales ectpicos

La expresin de marcadores tumorales tiene una regulacin gentica. Para tumores benignos, los marcadores producidos por el tumor normalmente son especficos para clulas y estn relacionados con los productos celulares normales en una elevada concentracin (Figs. 47-1 y 47-2). Cuando el tumor benigno se convierte en agresivo y ms maligno, las clulas comienzan a perder el control y se convierten en autnomas. Las protenas que normalmente se encuentran en un estado fetal precoz, y no se expresan en el tejido adulto normal, empiezan a aparecer en el tumor como resultado de la prdida de la regulacin de la expresin gentica. Esta es la razn por la que las protenas carcinoembrionarias y los marcadores tumorales ectpicos normalmente se expresan en enfermedades malignas avanzadas. En otras palabras, la aparicin de marcadores tumorales ectpicos se asocia a un mal pronstico o metstasis. Por ejemplo, las concentraciones elevadas de AFP en suero pueden detectarse en pacientes con cnceres del tracto gastrointestinal con metstasis, aunque las pruebas de luncion heptica sean normales. En la Tabla 47-5 se muestran algunos de los marcadores ectpicos conocidos y las enfermedades malignas asociadas. Hay que tener en cuenta las recientes directrices sobre el uso de marcadores lumorales gastrointestinales y de mama publicados por la Sociedad Americana de Oncologa Clnica (Smith, 1999). Ellos recomiendan que se deberia realizar una autoexploracin mamaria mensual, mamografia anual de la m a m a conservada y de la contralateral, y una historia clnica detallada y exploracin fsica cada 3 6 meses durante dos aos, y despus anualmente. N o recomiendan el uso de marcadores tumorales. como son CEA, CA 15-3 y CA 27.29. para el examen colectivo. Ni tampoco recomiendan de forma habitual la gammagrafia sea, la radiografa de trax, el recuento hematolgico sanguneo, la ecografia heptica o las imgenes de tomografa computarizada.

Formato sandwich
El ELISA, usando el formato sandwich, se ha convertido en el mtodo ms popular para la cuantificacin de marcadores tumorales. En este caso, un anticuerpo especfico es adsorbido a la tase slida. Despus se aade una solucin del antigeno y se deja que se una. Despus del tiempo suficiente de incubacin y lavado, se aade un anticuerpo marcado con enzimas en la lase slida y se deja incubar. El anticuerpo marcado que no esta unido se retira y el resto de la fase slida contiene el antigeno "en sandwich" entre el anticuerpo adsorbido a la fase slida y el anticuerpo marcado. Luego se

Tabla 47-5 AFP Calcitonina

M a r c a d o r e s tumorales ectpicos* Carcinoma Gl. renal, de pecho, de vejiga y de ovario Carcinoma de pulmn, de clulas no-islolos. carcinoide. de mama, medular y de ovario. feocromocitoma Para tumores endocrinos (carcinoma medular de tiroides, adenoma de adenohipfisis. carcinoma de clulas de islotes pancreticos) Carcinoma colorrectal y tumores pancreticos endocrinos Carcinoma gstrico y pancretico, hepatoma, adenocarcinoma ovrico tumores de clulas germinales de los testculos Carcinoma tiroideo diferenciado

C'omo(jr;irun;i A

rx-hCG libre hCG

Tiroglobulina

"Vase Tabla 47-2 para abreviaturas

CAPTUIO 47

DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLGICOS

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Aglutinacin competitiva

Formato sandwich

rando por tanto una respuesta analtica falsa. Se conoce que entre el 15% y el 40% de los individuos puede tener uno o mas anticuerpos heterfilos. El mtodo estndar para reducir la interferencia de anticuerpos heterfilos es incluir en el anlisis mucho suero de ratn o inmunoglobulmas de ratn no especificas en el inmunoanlisis.

MARCADORES TUMORALES PARTICULARES cx-fetoprotena

Figura 47-7. Ilustracin de las diferencias importantes entre los dos formatos de prueba importantes de mmunoaniisis. La interferencia en la aglutinacin competitiva p r o d u c e un valor falsamente elevado; en un formato sandwich produce un resultado falsamente bajo. La AFP es una protena fetal importante del suero y tambin una de las ms importantes protenas carcinoembrionarias (Wu, 1987). La AFP se parece a la albmina en muchas propiedades fisicoqumicas. En el feto, la AFP es sintetizada por el saco vitelino y por los hepatocitos fetales y en menor grado por el tracto gastrointestinal fetal y el rion. La AFP elevada puede encontrarse en pacientes con hepatoma primario y en tumores de clulas germinales derivadas del saco vitelino. La AFP es el marcador serolgico ms til para el diagnstico y tratamiento de carcinoma hepatocelular (HCC). Sin embargo, la AFP tambin se eleva de forma transitoria durante el embarazo y en muchas enfermedades hepticas benignas. Debido a la alta prevalencia de cncer de hgado en China y en otras ciudades en el sudeste de Asia, las pruebas de la AFP se han usado con xito en el examen colectivo de hepatoma en esa zona del mundo. Las pruebas tanto de AFP como de hCG son tiles para reducir los errores en el estadiaje clnico en pacientes con algunos tumores testiculares y ayudan en el diagnstico diferencial de varios tumores de clulas germinales. Como se observ un aumento de la fucosilacin de la AFP (de ah la reactividad de lecitina de lenteja de AFP serolgica) en el carcinoma hepatocelular primario, la determinacin de la reactividad en suero de lentil lecitina con AFP ha sido til no slo para diferenciar entre hepatoma pnmario y enfermedades benignas de hgado, sino tambin para proporcionar una seal precoz que indique cundo se puede empezar a desarrollar un hepatoma en pacientes con enfermedades hepticas.

aade el sustrato enzimtico y el desarrollo colorimtrico resultante es proporcional a la cantidad de antigeno en la solucin de la prueba. Aunque se disponen de otros marcadores distintos de enzimas, la enzima sigue siendo el marcador ms popular. La sensibilidad de ELISA puede acercarse a la del RA, especialmente cuando se usa un sistema de amplificacin biotina-avidinalEngvall, 1971). Recientemente, el formato de prueba de la unin competitiva ha desplazado al procedimiento de sandwich. A pesar de las muchas ventajas asociadas al nuevo formato, puede persistir el problema de los efectos trampa al obtenerse un valor falsamente bajo de una muestra que contiene una concentracin altamente elevada de marcadores lumorales. Por ejemplo, se produjeron valores falsamente bajos de CA 19-9 en el equipo Centocor, empleando un formato sandwich, con muestras que contenan niveles altamente elevados de CA 19-9. Sin embargo, cuando se utiliz el equipo de RA Biomira, basado en un principio de aglutinacin competitiva, se pudieron evitar completamente los valores falsamente bajos de CA 19-9. La utilizacin del equipo de RA Biomira tambin reduce el nmero de repeticiones debido a que el nivel de CA 19-9 en la muestra puede aproximarse por la canlidad de radiactividad (Wu. 1991).

Molculas de adhesin
Las molculas de adhesin celulares (CAM) pueden dividirse en cuatro grupos importantes: caderinas. selectinas, una superfamilia de inmunogtobulinas e integrinas (Wu. 1997). Estas molculas de adhesin, especialmente la E-selectina, pueden contnbuir al crecimiento tumoral y a las metstasis. Las molculas de adhesin intercelulares solubles pueden encontrarse en el suero de pacientes con enfermedades malignas (Hebbar. 1998).

Anticuerpo monoclonal frente al polielonal

El desarrollo por Kohler y Milstein (Milstein. 1983) de anticuerpos monoclonales murinos (MAb) con tcnicas de hibridacin de clulas somticas permite un anlisis inmunoqumico mucho ms detallado y molecular de antigenos asociados al tumor que antao era imposible. Al combinar los anticuerpos monoclonales con la fase slida de la prueba en sandwich, se han desarrollado muchos anlisis nuevos que han eliminado numerosos problemas relacionados con los anlisis pohclonales, que conllevan una escasa reproducibilidad, muchas variaciones, pobre especificidad y reactividad cruzada no especifica (Diamond. 1981). Tambin reduce las diferencias entre los diferentes equipos y ampla el rango de concentracin lineal del anlisis. Siempre que se disponga de un anticuerpo monoclonal, se recomienda su uso. Para conseguir una mayor sensibilidad de la prueba, parece que el uso de una combinacin de mltiples MAb mejora la afinidad entre los mltiples MAb absorbidos en fase slida y el antgeno soluble.

Factores angiognicos
La angiognesis es la formacin de vasos sanguneos in situ; incluye la migracin ordenada, la proliferacin y la diferenciacin de clulas vasculares. La neoformacin de vasos sanguneos tambin es importante en la patogenia del crecimiento rpido y metstasis de tumores slidos. Se han identificado muchos factores angiognicos incluyendo factores de crecimiento fibroblstico cido y base, angiogenina y factores de crecimiento -o. y -|i transformados (Folkman, 1992; Wu, 1997). Ambos factores angiognicos y antiangiognicos se han encontrado en el suero de pacientes con enfermedades malignas (Morelli. 1998).

Anticuerpo heterfilo
El uso de MAb en inmunoanlisis y la creciente aplicacin clnica de MAb de ratones para dianas imaginarias y de la mmunoterapia establecen un nuevo problema. Los individuos tratados producen aparentemente anticuerpos heterfilos contra anticuerpos murinos y esto interfiere con muchos de los inmunoanlisis de marcadores tumorales (Nahm, 1990). La interferencia de los anticuerpos heterfilos en suero humano puede aumentar o disminuir los resultados de un inmunoanlisis. Estos anticuerpos reaccionan de un modo similar frente a antgenos en trminos de aglutinacin a anticuerpos asociados a fase slida y marcados con una seal. Estos anticuerpos heterfilos se pueden aglutinar en otro lugar distinto que el sitio analizado para la aglutinacin, cruzando la seal del anticuerpo mediante el anticuerpo captura y gene-

|i -microglobulina
2

La [52M es la cadena ligera constante del antigeno del locus antignico de histocompatibilidad humano (HLA) expresado en la membrana de la mayora de las clulas nucleadas. La |J2M slo tiene un peso molecular de 11,8 kDa. Cuando las clulas nucleadas son metabolizadas. la cadena ligera (o |)2M) se vierte al lquido extracelular. L a |52M es un marcador tumoral no especifico debido a que est elevado no slo en los tumores slidos sino tambin en las enfermedades linfoproliferativas (incluyendo leucemia de linfocitos B crnica, linfoma de no Hodgkin y mieloma mltiple) (Wu. 1986a). La concentracin de (32M se correlaciona con la actividad lintoctica y es un buen marcador para las neoplasias de la linea de linfocitos B. Se ha utilizado como un indicador de la respuesta de los pacientes al tratamiento. Los niveles de |2M en el liqui-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

po cefalorraqudeo (LCR) es til para detectar metstasis en el sistema nervioso central (SNC). Se debera saber que las elevaciones sucesivas de en estas situaciones pueden tambin deberse al deterioro de la funcin renal, como sucede en el rion del mieloma.

CA19-9, CA 50 y CA 19-5
El CA 19-9 es el primer marcador tumoral de un grupo de nuevos eptopos. incluyendo CA 125 CA 15-3 y CEA, definidos por anticuerpos monoclonales. Estos nuevos equipos de monoclonales detectan los recin descubiertos epilopos y estaban destinados a sustituir las determinaciones policlonales de CEA en vanos carcinomas (Wu, 1988a). El anlisis de CA 19-9 mide un carbohidrato angiognico determinante expresado en una mucina de alto peso molecular. El CA 19-9 es un eptopo reconocido por el anticuerpo monoclonal 1116NS-199; se define como una lacto-W-fucopentosa II sialilada. La molcula, que transporta el epitopo CA 19-9, aparece como una mucina en el suero de pacientes con cncer pero como un ganglsido en las clulas tumorales. El CA 19-9 tambin est relacionado con las sustancias del grupo sanguneo de Lewis y slo el antigeno serolgico de pacientes con cncer pertenecientes al grupo sanguneo Le(a b) o Le(ab ) sern positivos para CA 19-9. Adems del CA 19-9, tambin se ha definido otros dos marcadores tumorales por anticuerpos monoclonales que son slo ligeramente diferentes del CA 19-9. Son el CA 19-5 y CA 50. El epitopo relacionado a CA 50 es muy similar al de CA 19-9 pero carece de residuo de lucosa, el mismo eptopo encontrado en individuos con Lewis-negativo Le(ab~). Las concentraciones en suero de CA 19-9 no slo suelen estar altamente elevadas en carcinomas gstricos y pancreticos sino que son tiles para controlar el xito de la terapia y para detectar recidiva en estos pacientes de cncer. Sin embargo, se ha visto que el CA 19-9 y CA 50 se complementan el uno al otro en el carcinoma pancretico y en otros carcinomas: su uso simultneo mejorar la sensibilidad en la deteccin de estas enfermedades malignas. El CA 19-5 es detectado por el anticuerpo monoclonal en ratones CC3C-195 y reacciona tanto con el eptopo Le" como con el sialil-Le . El CC3C-195 se aglutina con alta afinidad con el antigeno del grupo sanguneo Le sialilado, pero exhibe una baja afinidad con la forma no sialilada. Los niveles elevados en suero de CA 19-9, CA 50 y CA 19-5 tambin pueden verse en pacientes con carcinomas de colon, pancretico y hepatocelular. La elevacin encontrada en enfermedades hepticas benignas puede deberse a coleslasis en estos pacientes (Wu, 1992).
a 1

variedad de adenocarcinomas, incluyendo mama, colon, pulmn, ovario y pncreas. El CA 15-3 es un marcador muy sensible y especfico para controlar el curso clnico de pacientes con cncer de m a m a metastlico. Significativamente ms pacientes tienen elevados niveles circulantes de CA 15-3 que de CEA (96.2% frente a 69,8%). En general, el CA 15-3 se correlaciona con la progresin, la regresin, o la estabilidad de la enfermedad en un mayor nmero de pacientes que el CEA Determinado CEA y CA 15-3 no se mejoran los resultados obtenidos slo con CA 15-3. Sin embargo, CA 15-3 tambin puede estar elevado en hepatitis crnica, cirrosis heptica, sarcoidosis, tuberculosis y lupus eritematoso sistmico (Tondini, 1988).

CA 72-4
El anlisis de CA 72-4 detecta un antigeno relacionado con adenocarcinoma humano parecido a la mucina, TAG-72, que tiene un alto peso molecular (>10 MW), como la compleja molcula de mucina. Debido a que TAG-72 puede detectarse en el epitelio fetal y en el suero de pacientes con diversos carcinomas, tambin se considera como una proteina carcinoembnonaria. Sin embargo, slo se puede detectar CA 72-4 moderadamente elevado en la mayora de los carcinomas. Actualmente, el CA 72-4 est considerado como el nico marcador til para el tratamiento de pacientes con carcinoma gstrico, a pesar de su baja sensibilidad. El CA 72-4 puede ser til como uno de los mltiples marcadores para tumores derivados de clulas epiteliales. Los RA de CA 72-4, CA 19-9 y CEA son complementarios unos con otros en la deteccin de diversos carcinomas (Wu, 1992).
I,

Calcitonina
La calcitonina es una de las hormonas peptidicas circulantes que pueden llegar a elevarse en pacientes con una tasa de recambio sea incrementada asociada a metstasis seas. La calcitonina puede encontrase ectpicamente elevada en carcinomas broncognicos. Tambin se eleva en el carcinoma medular de tiroides.

Antigeno carcinoembrionario
El CEA es una glucoproteina con un peso molecular de aproximadamente 200 kDa. El CEA es la primera de las denominadas protenas carcinoembrionarias que fue descubierta por Gold y Freedman (1965). El CEA sigue siendo el marcador tumoral ms extensamente usado en la actualidad para el cncer gastrointestinal, pero la mayora de los anlisis de CEA han reemplazado el anticuerpo policlonal por el anticuerpo monoclonal anti-CEA. Aunque el RA de CEA en suero no cumple con las expectativas iniciales, las intensas investigaciones sobre el CEA en los ltimos 20 aos nos han enseado muchas lecciones valiosas que tienen gran beneficio en el campo de los marcadores tumorales. En un principio se pens que el CEA era un marcador especfico para el cncer colorrectal. pero en nuevos estudios result ser un marcador no especifico. Se aprendi en los estudios de CEA que los marcadores tumorales podian utilizarse para seguir a los pacientes durante la terapia y para detectar las recidivas despus de una ciruga exitosa. Tambin se descubri a travs de los estudios de CEA una asociacin entre una concentracin elevada en suero de marcador tumoral con metstasis y mal pronstico. Como el CEA se metaboliza en el hgado, los daos hepticos pueden alterar la aclaracin del CEA y con ello provocar un aumento de los niveles en la circulacin sangunea. Se han observado concentracin elevadas de CEA en algunos pacientes despus del tratamiento con radio y quimioterapia (Wu. 1986b).

CA125
El C A 125 es otro determinante angiognico definido por anticuerpos monoclonales y tambin est relacionado con glucoproteinas parecidas a mucinas con un alto peso molecular (>200 kDa). El CA 125 se expresa en ms del 80% de los carcinomas epiteliales no mucinos ovricos. El CA 125 se encuentra en la mayora de los carcinomas de ovano serosos, endometriales y de clulas claras (Jacobs. 1989). Sin embargo, los pacientes sometidos a quimioterapia pueden mostrar un (also descenso del antigeno CA 125, y un resultado negativo no siempre descarta la recidiva del tumor. El CA 125, tambin se ha utilizado clnicamente en el seguimiento de tumores uterinos (>60% estn elevados) y en tumores benignos, incluyendo endometnosis. Recientemente, se est probando la determinacin de CA 125 en suero para determinar si puede utilizarse en la identificacin sistemtica del cncer ovrico Se ha indicado el uso de mltiples marcadores para mejorar la especificidad y sensibilidad de las pruebas para cncer ovrico (Wu. 1988b: Jacobs, 1989).

CA15-3
El CA 15-3 es un antigeno circulante relacionado con el cncer de mama identificado por dos anticuerpos monoclonales distintos. El anlisis emplea un anticuerpo monoclonal conjugado en fase slida, MAb 115D8. para capturar el antigeno MAM-6 en el plasma humano y uno denominado MAb DF3 como marcador. MAb 115D8 se prepar contra los glbulos grasos de leche desnalada humana mientras que MAb DF3 se prepar contra la linea celular MCG-7 del carcinoma de mama. El antigeno CA 15-3 est presente en una

Oncoprotena c-erbB-2 (HER-2/neu)

El gen c-eroB-2 (HER-2/neu) es un miembro de la clase de los oncogenes relacionados con la proteina tirosma cinasa. Se ha descrito que el gen c-erbB-2 se encuentra amplificado del 25% al 30% de cncer humano de mama y ovario. Se ha demostrado que la amplificacin del c-eroB-2 es un predictor independente tanto de la recada como de la supervivencia global, y es superior a todos los dems factores pronsticos conocidos excepto cuando los ganglios linfticos son positivos. Recientemente se ha

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DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROLGICOS

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deteclado que el c-eroB-2 es un til marcador para identificar a pacientes con cncer de mama, que se beneficiarn ms de altas dosis de quimioterapia adyuvante (Tandon, 1989: Duffy, 1990). Hay una relacin directa entre la amplificacin del gen c-erbB-2 y la sobreexpresin de la proleina c-erB-2. Como consecuencia, se ha visto que tanto la amplificacin como la sobreexpresin de c-eroB-2 estn relacionadas con un mal pronstico y con una escasa supervivencia y recidiva en diversos carcinomas. La protena codificada por c-erbB-2 es un receptor transmembranoso de 185 kDa (p185); tambin es una glucoprotena que tiene dominios intracelular, transmembrana y extracelular. La proteina c-erbB-2 muestra una semejanza estructural y funcional con el receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR). Recientemente se ha publicado que el ectodominio de la oncoproteina c-erbB-2 se podra separar proteolticamente del receptor intacto y podra eventualmente descubrirse en la circulacin sangunea Parece que el ectodominio secretado en la matriz extracelular del tumor de m a m a corresponde con niveles de expresin de p185 en el tejido del tumor de mama. Tambin parece existir una relacin entre el ectodominio serolgco y pl85. aunque no se ha probado. En la actualidad hay estudios en marcha para determinar si el ectodominio serolgico de la proteina c-erB-2 puede utilizarse como un marcador pronstico (Wu, 1995).

placenta y es una hormona heterodimrica compuesta por subunidades </. y p unidas no covalentemente. Los trofoblastos malignos y no malignos sintetizan y secretan no slo el dmero-(/p biolgicamente activo sino tambin las subunidades u y p no combinadas (o libres). Adems del dmero intacto, se ha detectado una subunidad p libre de hCG en el suero de las mujeres al inicio del embarazo y en pacientes con tumores malignos (vase Cap. 22). Sin embargo, se puede encontrar una elevacin de hCG en tumores trofoblsticos, coriocarcinoma y tumores testiculares. Ms del 60% de los pacientes con tumores no seminomatosos y entre un 10% y un 30% de los seminomas tienen una |i-hCG libre elevada. La determinacin de la subunidad p libre es til para la deteccin de recidiva de metstasis en el coriocarcinoma cuando la hCG intacta sigue normal El anlisis de las subunidades hCG en suero puede ser especialmente til en el tratamiento de pacientes con cancer seminomatoso, ya que en estos pacientes no se encuentra otro marcador tumoral elevado. El cncer testicular seminomatoso contiene hCG intacta y p-hCG o subunidades o libres en la misma proporcin; por tanto, slo se necesita un anlisis para controlar a estos pacientes. Por otro lado, en pacientes con cnceres no seminomatosos slo se encuentran hCG o subunidades p-hCG. La determinacin de las subunidades libres y de hCG intacta aumentar la sensibilidad de la prueba en pacientes con cnceres no seminomatosos. La produccin de p-hCG ectpica libre se produce casi en el 30% de los pacientes con cncer urotelial, pero slo se detectaron la subunidad p-hCG libre y sus respectivos productos de degradacin, (i-core, en estas muestras clnicas. La -hCG es un marcador de malignidad en tumores endocrinos pancreticos (Madersbacher. 1992).

Cromogranina A
La cromogranina A es una importante protena soluble de los granulos cromafines. La cromogranina A puede liberarse de la mdula adrenal junto con catecolaminas tras la estimulacin de nervios esplcnicos; sin embargo, no est limitada a clulas cromafines de la mdula adrenal y neuronas simpticas: tambin existe en diversos tejidos neuroendocrinos. Los niveles elevados de cromogranina A en suero pueden detectarse en feocromocitomas y en el carcinoma microctico de pulmn (OConnor, 1984).

LASA-P
Los cidos silicos (cidos /V-acetilneuraminicos) son los derivados acilados del cido neuramnico y los residuos terminales del extremo no reducido de las cadenas de carbohidratos en glucoproteinas y glucolipidos. La LASA-P. por otro lado, se considera como un marcador tumoral no especifico; se encuentra elevada en una variedad de enfermedades malignas, aunque tambin en enfermedades inflamatorias no malignas. Esta ausencia de especificidad tumoral limita sustancialmente su utilidad como un marcador tumoral para el diagnstico. La LASA-P tiene una sensibilidad muy baja, y slo se puede detectar en suero que contenga marcadores tumorales en elevadas concentraciones, hablamos de rangos de mil nanogramos por milmetro de concentracin El mtodo ms comnmente usado para medir la LASA-P en suero es un procedimiento colonmtrico simple y baralo que utiliza cido tobarbitnco y resorcinol (Katopodis, 1982).

CYFRA 21-1
CYFRA 21-1 es un fragmento de la citoqueratina 19 encontrada en el suero. Es una subunidad del filamento de citoqueratina intermedio expresado en el epitelio simple y su anlogo maligno. La elevacin de CYFRA 21-1 indica un mal pronstico en el carcinoma de clulas escamosas de pulmn (Pujol, 1993).

Ciclinas
La progresin en el ciclo celular de las clulas eucariotas est controlada por la familia de ciclinas y las quinasas afines dependientes de ciclinas. Las distintas protenas ciclinas se pueden encontrar en diferentes estadios del ciclo celular. Tres ciclinas diferentes marcan las diferentes fases del ciclo celular E para G, y S precoz. A para S y G,. y B para G, tarda; la fraccin de clulas positivas para un cclico determinado predecir la fraccin en una fase determinada del ciclo celular. La apariencia peridica de las ciclinas en las distintas lases del ciclo celular sugiere que pueden utilizarse como marcadores de proliferacin tisular. Se ha detectado expresin elevada de varias ciclinas en extractos de cnceres humanos (Sherr. 1996).

Enolasa neuronal especfica

La subunidad y de una isoenzima enolasa en la va glucoltica. que se encuentra predominantemente en clulas neuronales y neuroendocnnas, se llama enolasa neuronal especfica (NSE) y se identifica por inmunoanlisis. Los niveles elevados de NSE se pueden encontrar en tumores que se originan de clulas del sistema neuroendocrine Los niveles de NSE en suero parecen ser marcadores relativamente especficos del cncer microctico de pulmn (SCLC) (85%). Se ha visto que es un marcador til para controlar el tratamiento y predecir recadas en pacientes con SCLC (Burghuber, 1990).

Receptores de estrgeno y receptores de progesterona

La determinacin de receptores de estrgeno (RE) y receptores de progesterona (RP) en el citoplasma del tumor de m a m a se utiliza para identificar a las pacientes que probablemente se beneficien ms de terapia endocrina. Los RE y RP positivos tambin indican buen pronstico, largo intervalo libre de enfermedad y larga supervivencia en general. Aproximadamente del 55% al 60% de las pacientes cuyos tumores primarios tienen RE positivos, y casi el 85% de las pacientes con RE y RP positivos, respondern a la terapia endocrina (Wu. 1997).

p53
La p53 es una fosfoproteina nuclear de 53 kDa y un regulador negativo del crecimiento celular. Funciona como un supresor tumoral induciendo la expresin de productos del gen que son responsables de la inhibicin o detencin del crecimiento y la proliferacin celular. La habilidad de la proteina p53 para regular la transcripcin de estos genes diana se basa en la actividad aglutinante de la secuencia especfica del ADN y en la presencia de un dominio que puede activar la transcripcin cuando se une al dominio unido al ADN de otra protena. Es el dominio unido al ADN el que parece ser sensible a la disrup-

Gonadotropina corinica humana

La gonadotropina corinica humana es un miembro de la familia de las hormonas glucoproteicas, se sintetiza y secreta por los trofoblastos de la

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

cin por mutacin y a ms lesiones relacionadas con cnceres humanos que producen en este dominio. Se ha visto que el gen codificador para p53 est mutado en casi la mitad de prcticamente todos los tipos de cncer surgidos desde un espectro amplio de tejidos. La inhibicin funcional de la activacin de p53 tambin parece jugar un papel en la gnesis tumoral humana. La sobreexpresin de algunos productos de oncogenes en ciertos tumores sirve para aglutinar y enmascarar la activacin del dominio de p53. La p53 puede determinarse tanto en tejido como en fibroblastos, clulas blancas o en suero. Existe disponible en el mercado un inmunoanlisis de enzima sandwich de Oncogene Science para la cuantilicacin de protenas p53 desnaturalizadas mulantes. Debido a la corta vida media (20 minutos), no se detecta la protena p53 en estado puro en la circulacin sangunea (Harris, 1993; Malkin. 1990).

Antgeno prosttico especfico

El PSA se sintetiza en las clulas epiteliales de la glndula prosttica y quiz sea el mejor marcador tumoral descubierto hasta ahora. La especificidad tisular del PSA hace que sea el marcador tumoral ms til disponible para la deteccin sistemtica y el tratamiento del cncer de prstata. La ausencia de especificidad es el nico inconveniente del PSA. Los procesos benignos como la HPB. la prostatitis y el infarto tambin se correlacionan con niveles elevados de PSA en suero. Debido a su especificidad tisular, el anlisis del PSA es particularmente til para controlar el xito despus de una prostatectomia quirrgica. La completa extirpacin de la prstata resultara en un nivel de PSA indetectable; cualquier deteccin de PSA despus de una prostatectomia radical indicara persistencia de tejido prosttico o metstasis. En estos pacientes, el incremento en las concentraciones de PSA despus de una ciruga con xito indica una recidiva de la enfermedad. Sin embargo, si la deteccin de PSA en suero despus de una prostatectomia radical se debe a una reseccin glandular incompleta y no de persistencia de enfermedad, el nivel permanecer inalterable en los posteriores seguimientos. H a y que saber que puede existir un aumento leve pero pasajero de los niveles de PSA durante la radioterapia, que no debe malinterpretarse como progresin de la enfermedad. L a especificidad tisular del PSA tambin permite que esta prueba sea un excelente instrumento para detectar una recidiva despus de una prostatectomia radical. Ha surgido una gran demanda para el desarrollo de una prueba de PSA ultrasensible. Una prueba de PSA muy sensible permitira una deteccin precoz de recidiva y metstasis y proporcionara una mejor oportunidad para un tratamiento con xito. Muchas de las pruebas de PSA actualmente disponibles en el mercado son capaces de detectar PSA en suero por debajo de 0,1 ng/ml. Se recomienda el uso de PSA en suero junto con un DRE o ecografa transrectal de la prstata como instrumento de examen para detectar cncer de prstata clnicamente significativo (Calalona, 1991; Brawer. 1992). El PSA es una serin proteasa capaz de unirse formando complejos con diversos inhibidores de proteasa. En consecuencia, existe PSA en suero principalmente en forma de complejo PSA-ACT (PSA-ct.-anliquimotripsJna) (Christensson. 1993) (Fig. 47-8). Hay convencimientos de que la determinacin directa del complejo PSA-ACT no slo elimina muchos problemas tcnicos relacionados con el anlisis del PSA sino que tambin mejora la dilerenciacin de la HPB (hipertrofia prosttica benigna) del cncer de prstata (Wu, 1994,1998).

Protena pS2
L a pS2 es un pptido rico en cisteina inducido por estrgenos. Es una pequea protena secretada por las clulas de la mama. Su deteccin en los citoplasmas de tumores de m a m a permite que se pueda prever la respuesta a la terapia endocrina. Se ha visto que la expresin de pS2 est asociada a una supervivencia larga en general y libre de enfermedad. La pS2 negativa est asociada con recidiva precoz y mortalidad: RE+ / RP+ / pS2+, del 85% al 97% tiene buen pronstico frente a RE+ / RP + / pS2-, slo del 50% al 54% tiene buen pronstico

Hormona paratiroidea relacionada con pptidos

Las concentraciones en plasma de la hormona paratiroidea relacionada con pptidos (PTH-RP) se encuentran elevadas en la mayora de pacientes con cncer asociado a hipercalcemia. Son secretadas por tumores asociados con hipercalcemia. Las formas circulantes de PTH-RP en estos pacientes incluyen tanto un pptido aminoterminal largo como un pptido carboxitermnal con una secuencia similar homologa a la paratirina (PTH). El mecanismo por el cual PTH-RP induce hipercalcemia incluye aglutinacin y activacin de receptores que tambin aglutinan PTH. La determinacin de las concentraciones de PTH-RP puede ser til en el diagnstico diferencial de hipercalcemia relacionada con malignidad y asociada tambin con hiperparatiroidismo primario, sarcoidosis, toxicidad de vitamina D o diversas neoplasias (incluyendo carcinomas de clulas escamosas, renales de vejiga y de ovario). Se debera conocer que los pacientes con afectacin de la funcin renal, pero sin hipercalcemia o cncer, pueden presentar concentraciones en plasma de PTH-RP aumentadas (Burtis, 1990).

PSA libre
La determinacin del PSA libre (fPSA) y el clculo del %fPSA (%fPSA = [fPSA/PSA] x 100) se ha utilizado para diferenciar entre HPB y cncer de

En la circulacin sangunea, la mayora del PSA presente s e encuentra como complejo PSA-ACT

Inmunoanlisis sandwich para el complejo PSA-ACT

Figura 47-8. La ilustracin muestra que la mayora del PSA existente en la circulacin sangunea se e n c u e n t r a en forma de complejo PSA-ACT. La figura de la d e r e c h a indica cmo se puede desarrollar un anlisis especfico para el complejo PSA-ACT m e d i a n t e dos anticuerpos diferentes, uno para el P S A libre y otro para ACT. en un formato s a n d w i c h

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DIAGNSTICO Y TRATAMIENTO DEL CNCER MEDIANTE MARCADORES TUMORALES SEROIGICOS

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Hollstein M: Clinical implications ol the p 5 3 tumor-suppressor g e n eN Debe advertirse de que cualquier molcula puede utilizarse como marEngl J M e d 1993: 329:1318. cador tumoral siempre que las variaciones en su concentracin reflejen H e b b a r M, Revillion F, L o u c h e z M-M, et al: T h e relationship b e t w e e n concentrations of circulating soluble E s e l e c t ma n d clinical, pathological, a n d biological features cierta actividad celular tumoral. La valoracin de la utilidad clnica de un in patients with breast c a n c e r Clin Cancer R e s 1998; 4:373. marcador tumoral particular se basa en su sensibilidad y especificidad. Ha J a c o b s I, B a s t RC Jr: T h e CA 1 2 5 tumour-associated antigen: A r e v i e w ol t h e liteexistido una clara tendencia para mejorar la especificidad y sensibilidad de rature H u m a n Reprod 1989; 4:1. la prueba al pedir mltiples marcadores tumorales. Sin embargo, todava Katopodis N: Lipid associated sialic acid test for t h e detection ol h u m a nc a n c e r . Cancer R e s 1982: 42:5270 existen discrepancias respecto a cul y cuntos marcadores tumorales se Liotta LA: Biochemical m e c h a n i s m s of t u m o r invasion and m e t a s t a s e s Ctrl Physiol deben incluir en el panel de determinadas enfermedades malignas. El B i o c h e m 1987; 5:190. coste que conlleva la peticin de mltiples marcadores tumorales tambin Littrup PJ. C o o d m a n AC, Metllin CJ: T h e benefit and cost of prostate c a n c e r early puede ser prohibitivo. Existen varios marcadores tumorales nuevos posidetection. CA Cancer J Clin 1993; 43:134. bles. Estos marcadores tumorales estn compuestos de oncoprotenas. Madersbacher S, Klieber R, M a n n K: Free u-sbunit. free |5-subunit of h u m a n chorionic gonadotropin (hCG), and intact h C G in sera ol healthy individuals a n d tesprotenas supresoras, molculas de adhesin, ciclinas y factores angiogticular cancer patients Clin C h e m 1992: 38:370 nicos. stos difieren sobre todo de los marcadores tumorales utilizados Malkin D U FP. Strong LC, et al: Germ line p 5 3 mutations in a familial s y n d r o m e of actualmente en su asociacin con rutas metablicas especficas conocidas breast cancer, s a r c o m a s and other neoplasms. Science 1990; 250:1233. o reacciones fisiolgicas. La mayora de los marcadores tumorales que se Miki Y. Swensen J, Shattuck-Eidens D. et al: Isolation o f BRCA1. trie 17q-linked breast and ovarian cancer susceptibility gene. Science 1994; 266:66. emplean actualmente para el tratamiento de pacientes no estn asociados Milstein C, Cuello AC: Hybrid hybridomas and their u s e in i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y con ninguna reaccin biolgica especfica conocida. Posiblemente, midienNature 1983: 305:537. do estos nuevos marcadores tumorales se proporcionar informacin Morelli D, Lasserini D. Cazzaniga S, el al: Evaluation ol the balance b e t w e e n angiosobre defectos ms especficos, lo que ayudar al diseo de tratamientos genic and antiangiogenic circulating factors in patients wilh b r e a s ta n d gastrointestinal cancers. Clin C a n c e rR e s 1998: 4:1221. ms apropiados. El mejor ejemplo es el clebre uso de Herceptin (un antiN a h m MH, H o f f m a n n JW: Heteroantibody: P h a n t o m ol the i m m u n o a s s a y Clin C h e m cuerpo monoclonal humano contra el ectodominio del receptor c-erB-2) 1990, 36:829. en pacientes con cncer de mama metasttico. Slo las pacientes con O'Connor DT, Bernstein KN: Radioimmunoassay of chromogranin A in p l a s m a as a sobreexpresin de la oncoproteina c-eroB-2 (HEfl2) en su tumor son m e a s u r e of e x o c y t o t i c sympatho-adrenal activity in n o r m a ls u b j e c t sa n d patients with p h e o c h r o m o c y t o m a . N Engl J M e d 1984; 311:764. seleccionadas para el tratamiento Herceptin (Wu, 1999). Pronto estar disPujol J-L, Grenier J, Daures JP. et al: Serum fragment ol cytokeratin subunit 19 ponible un anlisis en suero de la oncoproteina c-erbB-2 (Wu, 1998). measured by C Y F R A 21-1 immunoradiametric assay as a m a r k e r ol lung c a n c e r . Cancer R e s 1993: 53:61. Schnipper LE Clinical implications of t u m o r cell heterogeneity N Engl J M e d1 9 8 6 : 314:1423. BIBLIOGRAFA Sell S: Cancer markers of the 1990s. Comparison of the n e w generation of m a r k e r s defined by m o n a c l o n a l antibodies and o n c o g e n e probes to protolypic markers. 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Un %fPSA alto (>23%) normalmente se asocia a HPB, mientras que el cncer prosttico est asociado a un %fPSA bajo (<6%) (Catalona, 1995).

1042

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA Wu JT. Clayton F. Myers S. Knight JA: A simple radial immunodiffusion method for assay ol (^-microglobulin in serum. Clin Chem 1986a: 32:2070 Wu JT. Knight JA: Alpha-fetoprotein: Its use in clinical medicine ASCP check sample. Clin Chem 1987 27:1. Wu JT. Knight JA: Monoclonal immunoassays for tumor markers ASCP check sample. Clm Chem 1988a. 28:1. Wu JT. Knight JA, Knight DP: Carcinoembryonic antigen (CEA) in Ihe diagnosis and management of colorectal cancer. Check Sample. Clin Chem 1986b. 86.8. Wu JT, Liu GH. Advantages of replacing the total PSA assay with Ihe assay for PSA(/.,-antichymotrypsin complex lor the screening and managemenl ol prostate cancer J Clin Lab Anal 1998a: 12:32. Wu JT. Mau E, Kmghl JA: Interference with carcinoembryonic antigen radioimmunoassays by glycosaminoglycans, and their removal Clin Chem 1983: 29:2049 Wu JT. Miya T. Knight JA: Improved specificity of the CA 125 EIA for ovanan carcinomas by use of the ratio ol CA 125 to CEA. Clm Chem 1988b 34:1853 Wu JT, Nakamura R: Human Circulating Tumor Markers Chicago. American Association ol Clinical Pathologists. 1997 Wu JT, Zhang P, Bentz JS: Quantification of HER2 oncoprotein in breast fine-needle aspirates. Am Clm Lab Sci 2000. 30:49-55 Wu JT, Zhang P, Lyons BW. Wu LL: Isolation ot Ihe intact molecule and ectodomain of cerbB-2 oncoprotein from SK-BR-3 cells and development of immunoassays on microplate. J Clin Lab Anal 1998b; 12:298-303. Yu H, Schlossman DM. Harrison CL et al: Coexpression ol different antigenic markers on moieties that bear CA 125 determinants Cancer Res, 1991b. 51:468.

Tondini C, Hayes DF, Gelman R. Comparison of CA 15-3 and carcinoembryonic antigen in monitoring the clinical course of patients with metastatic breast cancer Cancer Res 1988: 48:4107 von Kleist S: What's new in tumor markers and their measurements'' Path Res Pract 1988:183:95. Weber K, Osborn M. Moll R: Tissue polypeptide antigen (TPA) is related to the nonepidermai keratins 8. 18. and 19 typical of simple and nan-squamous epithelia: Re-evaluation of a human tumor marker. EMBO 1984: 3:2702. Wooster Ft. Neuhausen SL. Mangion Y: Localization of a breast cancer susceptibility gene. BRCA2. to chromosome 13q12-l3. Science 1994; 265 2088 Wu JT: Expression of monoclonal antibody-detined tumor markers in four carcinomas Ann Clin Lab Sci 1989:19:17. Wu JT: Measurement ot AFP and its lectin reactive isoforms in liver diseases and various malignancies. Ann Clin Lab Sci 1990: 20:98 Wu JT: Assay for prostate specific antigen (PSA): Problems and possible solutions J Clin Lab Anal 1994: 8:51 Wu JT. Astill ME. Gagon SD. et al: Measurement of c-ertB-2 protein in sera from patients with carcinomas and in breast tumor tissue cytosols: Correlation with serum tumor markers and membrane-boumd oncoprotein. J Clin Lab Anal 1995; 9:151. Wu J T, Carlisle P: Low frequency and low level ot elevabon of serum CA 72-4 in human carcinomas in comparison with established tomor markers. J Clin Lab Anal 1992. 6:59. Wu JT Christensen SE: Effect ol dillerent test designs ot immunoassays on "hook effect' of CA 19-9 measurement J Clin Lab Anal 1991a. 5.228
1

S E C C I N

VI

Microbiologa mdica
Gail L. Woods, M.D. John Bernard Henry, M.D.

CAPTULO

48

Infecciones vricas
Michael Costello, PhD. Margare Yungbluth, M.D.
Cultivo de virus Deteccin de antigenos y deteccin molecular Serologa vrica Obtencin y transporte de las muestras Equipos y material Sndromes clnicos infecciosos causados por virus INFECCIONES HERPTICAS MUCOCUTNEAS Aislamiento del virus del herpes simple mediante cultivo celular Deteccin directa del virus del herpes simple Diagnstico serolgico INFECCIONES VRICAS DEL TRACTO RESPIRATORIO 1053 Gripe (Influenza) Bronquiolitis por virus respiratorio sincitial Crup Obtencin de muestras Ensayos para la deteccin de antigenos vricos Aislamiento de virus MONONUCLEOSIS INFECCIOSA E INFECCIONES RELACIONADAS 1057 Diagnstico serolgico Mononucleosis infecciosa heterfilo-negativa Sndrome de la fatiga crnica INFECCIONES VRICAS CONGNITAS Y PERINATALES Citomegalovirus Rubola Virus del herpes simple Virus de la inmunodeficiencia humana, parvovirus, enterovirus ENCEFALITIS Y MENINGITIS VRICA Diagnstico de laboratorio EXANTEMAS VIRALES GASTROENTERITIS VRICA Diagnstico de laboratorio HEPATITIS VRICA E INFECCIONES POR RETROVIRUS Virus de la inmunodeficiencia humana INFECCIONES VRICAS EN HUSPEDES INMUNOCOMPROMETIDOS BIBLIOGRAFA 1065 1063 1064

1059

1050

1060

1067 1068

La virologa clnica es una ciencia que ha experimentado una profunda evolucin en los ltimos 40 aos, de tal forma que hoy en da est claramente establecido que los virus son la causa ms frecuente de enfermedades infecciosas en el hombre. El mbito de las enfermedades vricas es muy amplio, con manifestaciones que van desde el trivial resinado comn hasta la reciente patologa consistente en un estado de inmunosupresin de consecuencias fatales, resultante de la destruccin de los linfocitos T-CD4 por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Los mtodos de cultivo inicialmente disponibles para llevar a cabo el aislamiento e identificacin de los virus eran complejos y tediosos y, en consecuencia, poco prcticos para ser utilizados de forma sistemtica en el diagnstico. Sin embargo, debido a la epidemia de infecciones venreas producidas por el virus del herpes simple, al incremento en el nmero de pacientes inmunocomprometidos que padecen infecciones oportunistas y al desarrollo de agentes antivirales eficaces, se ha generado una fuerte demanda de servicios de virologa clnica que sean accesibles fcilmente. En este contexto, hoy en da los hospitales, tanto los municipales como los universitarios, asumen como algo habitual la confirmacin de las infecciones respiratorias, del sistema nervioso central (SNC), gastrointestinales (Gl) y diseminadas, causadas por virus. Un diagnstico especfico de una infeccin vrica es de gran ayuda para el mdico de cara a optimizar las condiciones de hospitalizacin del paciente y a administrar la quimioterapia antivrica ms apropiada en cada caso; de este modo, se evitan o reducen los tratamientos innecesarios y se consigue un ahorro significativo en los procedimientos diagnsticos, implementando al mismo tiempo los mtodos d e aislamiento ms eficaces para limitar la diseminacin nosocomial de los virus. Los beneficios secundarios para la salud pblica de una diagnstico preciso no deben ser pasados por alto; los datos epidemiolgicos sobre la gnpe, el sndrome de inmunodeficiencia adqumda (sida), las infecciones por arbovirus y enterovirus y el herpes venreo representan una informacin tan valiosa como la compilada sobre la tuberculosis, la salmoneltosis. la gonorrea y la sfilis.

Existen varios trabajos de excelente calidad que contienen informacin sobre la taxonoma y patogenicidad de los virus humanos (Fields. 1996; Topley, 1998; Murray. 1999). En este capitulo se revisan los sndromes infecciosos de origen vrico ms comunes y que son responsables de la mayor parte de pruebas diagnsticas que se llevan a cabo en un laboratorio de microbiologa clnica tpico. Se analizarn los aspectos relativos a la organizacin del laboratorio, equipos y suministros, recogida de muestras y seleccin de las pruebas, junto con los mtodos habituales de aislamiento e identificacin que tienen una mayor aplicacin prctica en clinica. Ya que las enfermedades vricas son tan comunes y afectan tanto a los nios y adultos sanos como a inmunocomprometidos, la mayor parte de hospitales municipales registran una mezcolanza de casos clnicos que justifica la existencia de un servicio de virologa. En la Tabla 48-1 se recogen los datos relativos al nmero de pruebas de aislamiento y de deteccin de anlgenos, asi como las frecuencias de recuperacin en el General Hospital Lutheran, un centro mdico suburbano de 600 camas localizado en Chicago, con un gran volumen de atencin pnmaria peditrica y de adultos y servicios de obstetricia, neonatologia y hematologa'oncologia de alto riesgo. Esta mezcla de pacientes conlleva una amplia variedad de infecciones vricas comunes; en otros hospitales con diferentes perfiles de especialidades mdicas se recuperarn bsicamente los mismos tipos de virus, aunque pueda haber variaciones en los porcentajes relativos de aislamiento. El tiempo medio requerido para la deteccin de la mayor parte de virus es corto (a menudo, dos das o menos) y. desde luego, est en la m i s m a escala de tiempo que se necesita para el aislamiento habitual de baclenas mediante cultivo. Ello es consecuencia del uso de pruebas rpidas para la deteccin de antigenos y cidos nucleicos (utilizando las correspondientes sondas especificas) y de cultivos en "shell vial" que necesitan cortos periodos de incubacin. El porcentaje de recuperacin es alto -del 15% al 38%- y, por lo general, vanas veces superior al valor que se obtiene en el caso de los

1046
I .
:

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
: ,

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"

Tabla 48-1 Deteccin de virus: frecuencias de aparicin, tiempos de deteccin medios y frecuencias de positividad viral (Lutheran General Hospital, Park Ridge, II) Virus Virus del herpes simple Cilomegalovirus Adenovirus Virus de la influenza A Enlerovirus Virus de la vancela-zsler Virus de la influenza B Virus de la parainfluenza Virus respiratorio sincitial Sarampin y paperas Total de muestras procesadas Porcentaje de recuperacin de virus 1995 34% 3% 5% 6% 8% 2% 1% 6% 27% <1% 3.323 21% 1998 25% 4% 6% 11% 7 % 1% <1% 4% 41% 0% 3.040 23% Tiempos de deteccin medios (das) 2 3 3 2 4 3 2 2 0,33 5

hemocultivos o los cultivos de heces ordinarios, los cultivos de micobacterias y el examen en busca de parsitos y sus huevos (Costello, 1996). Muchos de los virus ms comunes muestran variaciones estacionales. Las epidemias de gripe y de las infecciones por virus respiratorio sincitial (VRS) se repiten anualmente durante los meses fros, al igual que sucede para las infecciones por los virus tipo 1 y tipo 2 de la parainfluenza. Las infecciones por adenovirus, virus tipo 3 de la parainfluenza, citomegalovirus (CMV) y virus del herpes simple (VHS) tienen lugar a lo largo de todo el ao. Las enfermedades provocadas por enterovirus se concentran al final del verano y principio del otoo (Fig. 48-1). Estos patrones de distribucin temporal de la incidencia de las diferentes infecciones provocan fluctuaciones en las necesidades de personal de laboratorio que son particularmente problemticas en los hospitales peditricos. En la Tabla 48-2 se muestran los tres mtodos principales para el diagnstico de laboratorio, todos los cuales tienen ventajas y limitaciones. Las tcnicas de cultivo y deteccin de antigenos requieren que en la muestra existan virus via-

bles o fragmentos del virus relativamente intactos; las muestras deben obtenerse del lugar en donde est teniendo lugar la replicacin activa del virus, durante la fase aguda de la infeccin. Debido a su mayor sensibilidad, las tcnicas de hibridacin con sondas de cidos nucleicos especficas permiten una m a y o r libertad a la hora de obtener el espcimen; sin embargo, la interpretacin de los resultados puede ser ms difcil, puesto que es posible seguir observando valores positivos con estas tcnicas, incluso durante la fase de recuperacin o convalecencia. Los ensayos con sondas pueden discriminar entre infeccin activa y latente mediante la deteccin de componentes del genoma vrico que estn replicndose activamente; por ejemplo, el ensayo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la transcrptasa reversa (RT) (RT-PCR) para ARN especfico de CMV indica replicacin activa del virus, mientras que la PCR especfica para ADN puede dar tambin un resultado positivo durante la fase de latericia. El diagnstico serolgico tradicional requiere el anlisis de dos muestras de suero, una tomada durante la fase aguda y la otra durante la de convalecencia de la enfermedad, para poner de manifiesto un incremento de cuatro veces o superior en el ttulo de anticuerpos especficos frente al virus entre ambas muestras. Aquellos mtodos que detectan IgM especficas frente al virus permiten diagnosticar la enfermedad aguda a partir de una nica muestra de suero obtenida durante la lase aguda o al comienzo de la fase de convalecencia de la enfermedad. Por ltimo, las pruebas que identifican inmunoglobuiinas especificas del tipo IgG se utilizan habtualmente para poner de manifiesto la existencia de un estado inmune en el individuo frente a un determinado agente viral. En la actualidad, todos los materiales y reactivos necesarios para llevar a cabo el aislamiento de virus, los ensayos de deteccin de antgenos virales y los mtodos serolgicos estn disponibles comercialmente. Los laboratorios de virologa ya no necesitan mantener las lneas de cultivos celulares o preparar sus propios reactivos, al igual que un laboratorio de microbiologa general tampoco utiliza medios de cultivo y colorantes preparados de forma casera. El nmero de virus que puede identificarse y cuantificarse mediante ensayos de amplificacin de cidos nucleicos contina aumentando, aunque slo estn disponibles unos pocos sistemas comerciales de aplicacin general basados en esta tecnologa. En este contexto, los procedimientos particulares son la regla ms que la excepcin y necesitan una buena experiencia tcnica y un severo control de calidad para garantizar la precisin y Habilidad del diagnstico.

Adenovirus Herpes simple Citomegalovirus Varieela-zster Sarampin Paperas Virus respiratorio sincitial

Parainfluenza tipos I y 2 Parainfluenza tipo 3

Influenza A y B

Enterovirus Arbovirus Rotavirus

Figura 48-1. Variacin de la aparicin de infecciones vricas en funcin de la estacin del ao.

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS

1047

Tabla 48-2 M t o d o s d e laboratorio para e l diagnstico d e las infecciones virales Cultivo de tejidos Cullivo en tubo (monocapa estndar de clulas) Mtodos de cultivo potenciados mediante centrifugacin (monocapa de clulas en "shell-vials'/monocapa de clulas mixtas) Deteccin de antigenos/cidos nucleicos del virus en el espcimen del paciente Tincin directa con anticuerpos fluorescentes (DFA) Enzimonmunoensayo (EIA) Ensayos directos con sondas de cidos nucleicos (hibridacin in situ, HIS) y tcnicas de amplificacin (PCR, RT-PCR, SD. bADN. LCR. TMA. HC. etc.) Secuenciacin de genomas (VIH. VHC. ele.) Scrologia Pruebas con anticuerpos policlonales Mtodos especficos para IgM. IgG. e igA HIS = Inundacin in situ. T M A amplificacin mediada po' transcripcin. PCR = reaccin en cadena de la polimerasa; R T P C R = reaccin en cadena de la polimerasa de la transcriptasa reversa SD = desplazamiento de cadena; bDNA = ensayo de ADN ramificado, LCR reaccin en cadena de la ligasa. VIH = virus de la inmunodeficiencia humana; VHC = virus de la hepatitis C A pesar de estas restricciones, los mtodos basados en la biologa molecular son particularmente atractivos para la identificacin de virus que se propagan lentamente, o incluso no lo hacen, en los cultivos celulares, y, en teora, deberan proporcionar una sensibilidad y una precisin cuantitativa superior a la que tienen los sistemas convencionales.

Cultivo de virus
L a propagacin de virus en cultivos de tejidos se consigui por primera vez h a c e ms de 50 aos, y hoy en da aun contina siendo el procedimiento ms verstil y amplio para el diagnstico de las infecciones vricas. Muchos virus (aunque no todos) de importancia clnica son capaces de replicarse en cultivos celulares, existiendo una correlacin entre la recuperacin del virus y la fase aguda de la enfermedad correspondiente. Sin embargo, el cultivo requiere m u c h o esfuerzo y experiencia tcnica, y generalmente implica al menos uno o dos das de espera para obtener resultados positivos. La replicacin en tejidos de ratn recin nacido o en huevos embrionados puede ser preferible, o incluso esencial, para algunos virus incmodos: sin embargo, la mayor parte de laboratorios clnicos confan en los cultivos de lneas celulares in vitro. y, en consecuencia, la inoculacin en animales o huevos se realiza m u y raramente fuera de los laboratorios de investigacin o de las instituciones de salud pblica (Nalonen, 1998). Los cultivos de tejidos celulares se dividen en tres categoras: cultivos primarios, lineas celulares diploides y lneas celulares heteroploides. Los cultivos celulares primarios se preparan a partir del rgano original directamente (como puede ser rion de mono o de conejo). Las clulas son separadas individualm e n t e mediante triturado y tratamiento con tripsina, y la mezcla de clulas resultante se transfiere a tubos de ensayo o "shell-vials", donde las clulas se unen formando u n a monocapa confluente. El cultivo de clulas se recubre con un medio que mantiene su viabilidad, consistente en una solucin salina tamponada

a pH fisiolgico que contiene sales minerales, glucosa, aminocidos, vitaminas y coladores. El medio mnimo esencial de Eagle en solucin salina balanceada de Earl o de Hanks es la combinacin utilizada ms frecuentemente c o m om e d i o nutritivo para los cultivos celulares: usualmente se le aade una baja concentracin de suero letal bovino rico en protenas y pobre en inmunogtobulinas. con objeto de mantener en buenas condiciones fisiolgicas la m o n o c a p a de clulas, pero sin favorecer su proliferacin. Las lineas de clulas diploides son generalmente fibroblastos que derivan de pulmn o de prepucios de recin nacidos, la mayora de los cuales tienen una dotacin diploide d e cromosomas normal. Estas clulas se propagan en un medio de cultivo rico, con suero, y pueden ser subcultivadas de 20 a 50 veces antes de que pierdan su viabilidad; algunos tipos celulares de esta categora son MRC-5, wl-38 y los fibroblastos procedentes de prepucio. Las lneas de clulas heteroploides derivan de tumores malignos y son clulas "inmortalizadas" que pueden ser subcultivadas indefinidamente: tienen un genoma aneuploide y s e dividen rpidamente. Las lneas celulares heteroploides ms populares son HEp-2 (denvada de un carcinoma larngeo). HeLa (de un carcinoma cervical) y A549 (tambin de un carcinoma larngeo). Los cultivos primarios deben examinarse para comprobar que no estn contaminados por virus endgenos. Las lneas diploides y heteroploides deben examinarse peridicamente para comprobar tanto la ausencia de contaminacin por micoplasmas c o m o que sigan siendo susceptibles a la infeccin por virus. Lgicamente, si las clulas son adquiridas comercialmente. todos estos controles, que implican una gran inversin de tiempo, son responsabilidad de la firma suministradora. Las lineas celulares "hbridas" representan un nuevo concepto: en este caso, la monocapa est constituida por una mezcla de dos tipos celulares distintos capaz de permitir el crecimiento de una amplsima gama de virus. Un ejemplo de esta categora es el sistema R-Mix (Diagnostic Hybrids) formado por clulas A549 y clulas de pulmn de visn. en un medio de mantenimiento que contiene tripsina, y que permite la recuperacin de varios patgenos respiratorios, c o m o los virus de la gripe y parainfluenza. VRS y adenovirus. Los virus no infectan con igual afinidad todos los tejidos humanos y tambin difieren en su capacidad para replicarse en las lneas celulares de los cultivos de tejidos, por lo que para incrementar al mximo las probabilidades de recuperacin cada espcimen debe inocularse en diferentes lneas celulares. La Tabla 48-3 muestra una lista de varias lneas de cultivos de tejidos con los virus que son capaces de infectarlas. Todas estn disponibles en el comercio y pueden suministrarse en tubos, shell-vials, o en frascos a granel (Fig. 482). Cada laboratorio debe seleccionar las lneas que necesite para cubrir todas sus necesidades, en tuncin de los tipos de virus que ms frecuentemente se aislan a partir de la poblacin de pacientes que estn bajo su responsabilidad, aunque los requerimientos en el nmero y tipo de cultivos celulares puedan variar para aiustarse a los cambios estacionales en la incidencia de las diferentes infecciones virales. La replicacin de los virus en las monocapas de clulas se pone de manifiesto mediante el examen de la lmina de clulas con un microscopio invertido de contraste de fases, con objeto de observar las alteraciones citopticas causadas por la proliferacin del virus. Las monocapas de clulas en tubo tienen una gran versatilidad: una nica lnea celular puede permitir el crecimiento de varios virus, siempre que cada uno de ellos cause un efecto citoptico (ECP) distintivo, o bien

1048

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Deteccin de antgenos y deteccin molecular

La identificacin rpida (menos de un da de espera) de virus por mtodos directos es especialmente til en los casos para los que hay disponible una terapia antivrica especfica (p. ej.. en las infecciones causadas por VHS. VVZ. CMV. virus de la gripe o VRS) y cuando existe riesgo de infeccin nosocomial (como es el caso del virus de la gripe, VRS, rotavirus y VVZ). Los antgenos virales pueden ser detectados con una sensibilidad y especificidad semejantes, tanto por inmunofluorescencia directa (DFA) como mediante enzimoinmunoensayo (EIA). El test DFA tiene la ventaja de que permite observar la celularidad del espcimen, lo que permite establecer fcilmente si la muestra es adecuada (Rossier, 1989). La realizacin del mtodo DFA requiere una inversin considerable de tiempo y esfuerzo, lo que es un inconveniente importante, ya que implica una carga adicional de trabajo en aquellos laboratorios en los que se procesa un gran nmero de muestras. El EIA puede ejecutarse de forma mucho ms automatizada y la interpretacin de los resultados obtenidos con el mismo es menos subjetiva que la de los datos del test DFA, aunque el EIA no permite determinar la calidad de la muestra. Para el mtodo DFA es recomendable utilizar un microscopio equipado con epifluorescencia, y deben Figura 48-2. Ejemplos de dilerent.es tipos de cultivos de tejidos suministrados p o r fir- realizarse en paralelo, de forma habitual, controles positivos y negativos. La m a s comerciales. En los sistemas tradicionales en tubos, la m o n o c a p a de clulas mayor parte de los procedimientos basados en el EIA estn adaptados para el c r e c e en u n o de los lados de los mismos, y son transportados e incubados en la anlisis de muestras individuales, e incluyen tanto el control positivo c o m o el orientacin c o r r e c t a (horizonlalmente) para que el medio de mantenimiento est negativo incorporados directamente en las placas de un solo uso. Los proces i e m p r e en contacto con la lmina de clulas. En los tubos shell-vial, la m o n o c a p a de dimientos automatizados de EIA para el anlisis masivo combinan en un clulas est adherida sobre un cubreobjetos de vidrio que se encuentra en el fondo del recipiente, junto con un volumen de 2 mi de m e d i o de mantenimiento, y se alma- mismo equipo todos los componentes necesarios para el lavado, lectura espectrofotomtrica y procesado de datos. Los controles se realizan indivicenan, transportan e incuban en posicin vertical. dualmente para cada ensayo, y la interpretacin de los datos de la lectura se lleva a cabo de acuerdo con un valor de corte establecido previamente. algn otro tipo de manifestacin caracterstica (hemaglutinacin, hemoadsorcin, interferencia). Los ECP pueden aparecer entre uno y tres das (en el caso Los mtodos de hibridacin y amplificacin detectan a los virus mediante el del VHS), o pueden tardar de 5 a 20 das en ser detectados (VRS, virus de la reconocimiento de secuencias especficas del genoma de ADN o ARN vrico. varicela-zster [VVZ], CMV); por tanto, la mayor parte de cultivos deben ser La hibridacin ir) situ (HIS) es una tcnica directa utilizada en patologa quirrincubados dos semanas, o incluso ms. En la tcnica que implica la utilizacin gica para identificar, mediante sondas especficas, el virus del papiloma de cultivos celulares en shell-vials, la lmina de clulas descansa sobre un humano (VPH), CMV, VHS y parvovirus B19: la especificidad de la m i s m a es cubreobjetos redondo, que se coloca en el shell-vial con la monocapa orientada excelente, aunque su sensibilidad por debajo de los valores ptimos limita, en hacia arriba. El espcimen es inoculado en el recipiente, que es seguidamente gran medida, su aplicacin en clnica. Los mtodos de amplificacin han increcentrifugado para favorecer la adhesin de los virus a las clulas. Tras un corto mentado la sensibilidad del diagnstico molecular ms all de los valores que, perodo de incubacin, generalmente de uno a tres das, la monocapa de cluen este contexto, tienen los ensayos para la deteccin de antgenos y las tclas es analizada mediante inmunofluorescencia para detectar la presencia de nicas de cultivo, mediante la amplificacin exponencial de la secuencia oligoantgenos virales especficos (Gleaves, 1985). El cultivo en shell-vials es un pronucleotdica del virus elegida como diana (PCR y desplazamiento de cadena cedimiento idneo para identificar un nico tipo de virus (VHS) o un nmero limi[SD]), la amplificacin de la seal quimioluminiscente (captura de hbridos [HC] tado de virus (VRS y virus de la gripe), y para agentes de crecimiento lento (CMV y ADN ramificado [bADN]), o por amplificacin de la sonda o la seal (reaccin y VVZ). El material procedente de las lesiones vesiculares causadas por el VHS en cadena de la ligasa [LCR] e Invader). La amplificacin por las tcnicas de es un candidato excelente para intentar el aislamiento del virus mediante la tcPCR y bADN se ha convertido en el estndar de eleccin para la monitorizanica del cultivo en shell-vials, la sensibilidad roza el 100% y el tiempo de espera cin cuantitativa del VIH y el virus de la hepatitis C (VHC). L a PCR es el para los cultivos negativos se reduce de siete das a tan slo uno. Los shell-vials mtodo preferido por su gran sensibilidad para el diagnstico de la meningitis tienen una eficiencia comparable o incluso superior a la del mtodo en tubo para por enterovirus y la encefalitis por VHS (Tang, 1998: Read, 1999); la deteccin la recuperacin de CMV a partir de orina, aunque se recomienda realizar un culdel virus Epstein-Barr (VEB) en el liquido cefalorraqudeo mediante PCR es un tivo suplementario en tubo a partir de una muestra de sangre perifrica para diagnstico positivo de linfoma del sistema nervioso central (SNC) en pacienaumentar las posibilidades de aislamiento de este tipo de virus. En la Tabla 48tes con sida. La PCR cuantitativa de CMV en fluido bronquioalveolar o en san4 se indican diversas situaciones en las que la utilizacin de los cultivos en shellgre permite predecir una neumona viral en pacientes sometidos a un trasvials est recomendada para la deteccin de virus. plante de mdula sea. La automatizacin de los mtodos de amplificacin, con la incorporacin de estndares internos para detectar inhibicin y de protocolos experimentales configurados para evitar la contaminacin cruzada de amplicones, ha acortado los plazos de obtencin de resultados y reducido los errores de interpretacin debidos a los falsos positivos y negativos. Aunque todava no hay una gran cantidad de reactivos disponibles en el mercado, hay varios sistemas para la identificacin de virus patgenos comunes basados en sondas gnicas que estn actualmente en fase de desarrollo. L a visualizacin directa de los viriones mediante microscopa electrnica (ME), utilizando tincin negativa con cido fosfotngstico o fijacin con osmio seguida de tincin con acetato de uranilo. es un mtodo empleado para detectar aquellos virus que no crecen en las lineas celulares estndar o para una demostracin rpida de la presencia de virus en una muestra. La ME ha sido una tcnica de gran ayuda, particularmente para identificar el agente causal en c a s o s de gastroenteritis vrica: rotavirus. adenovirus intestinales, virus Norwalk, astrovirus y calicivirus se multiplican m u y pobremente, o no lo hacen en absoluto, en los cultivos de clulas en monocapa. pero tienen caractersticas ultraestructurales distintivas que permiten su identificacin al microscopio electrnico.

CAPTULO 48 Tabla 48-5

INFECCIONES VRICAS

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Aplicaciones de la serologia para el diagnstico de las infecciones virales Virus IgG VHA, VHB rubola, sarampin, paperas. WZ IgM VHA, VHB. VEB. sarampin. paperas, rubola, parvovirus Bt9. arbovirus IgG: VIH. VHB, VHB. VHC, VLHT Sndrome de Rev (influenza, WZ) poslmlecciOn PEES (sarampin) IgG: VHB. VHC. VIH. CMV. VLTH

Aplicacin Demoslraci inmunidad preexistente Mtodo diagnstico pretendo por su relacin coste/eficacia

Diagnstico de Control de la infec hemoderivados

VHA = virus de la hepatilis A: VHB = virus de la hepatitis B: VHC = virus de la hepatitis C VEB = virus de Epstein-Barr; VIH = virus de la inmunodeliciencia humana VLTH = virus de la leucemia humana de clulas T, PEES = panencela lilis esclerosante subaguda. Pora ver el signilicado de otras abreviaturas, consltense las Tablas 48-3 y 48 4

Serologia vrica
El diagnstico serolgico de las infecciones virales representa una alternativa atractiva, ya que las muestras de suero pueden obtenerse, transportarse y almacenarse con gran facilidad. La serologia viral tiene dos mbitos de aplicacin principales: diagnosticar una infeccin reciente y poner de manifiesto la existencia de inmunidad previa. El diagnostico de infeccin actual o reciente requiere la deteccin de IgM especificas frente al virus en una muestra de suero obtenida durante la lase aguda de la infeccin o durante la observacin de un incremento de cuatro veces o superior en ttulo de IgG especficas entre dos muestras de suero, una tomada durante la fase aguda y otra en la de convalecencia. Las IgM

especificas estn presentes en sangre generalmente durante la primera semana de la infeccin primaria, para hacerse despus prcticamente mdetectables entre el pnmer y tercer mes siguientes: el enzimonmunoensayo es ms sensible y es capaz de detectar IgM persistentes aproximadamente durante el doble de tiempo del que es posible hacerlo con la inmunofluorescencia. Se puede incrementar la sensiblidad y especificidad de los ensayos para detectar IgM eliminando del suero el factor reumatoide y las IgG, para evitar la competicin de estas ltimas con las IgM con los antigenos virales. Las IgG especificas aparecen entre una y dos semanas despus de la infeccin primaria, y su titulo v a aumentando hasta alcanzar un pico entre las cuatro y las ocho semanas para comenzar a bajar a partir de este momento, aunque pueden ser detectadas oe forma indefinida. La respuesta inmune secundana que aparece c o m o consecuencia de una reinfeccin o reactivacin vrica da lugar a un perfil serolgico diferente: las IgM pueden aparecer transitonamente. con un titulo baio, mientras que el ttulo de IgG aumenta muy rpidamente, alcanzando el peo a unas concentraciones ms altas que las observadas durante la respuesta primana Por supuesto, estos son patrones o perfiles generales: la intensidad, especificidad y tipo de respuesta (clase de mmunoglobulina producida) estn condicionados por el tipo del virus infectivo, el sitio donde se ha producido la infeccin y la situacin inmunolgca del paciente. En las infecciones congmtas, los anticuerpos (IgG) matemos pasan a la circulacin fetal a travs de la placenta, aunque cualquier otra clase de mmunoglobulinas (IgM, IgA o IgE) presentes en la sangre del leto, del cordn umbilical o del recin nacido, son producidas por el feto o por el neonato en respuesta a una infeccin primana perinatal La serologia puede ser utilizada como un respaldo a los mtodos de deteccin directa y de cultivo de virus, especialmente en el caso de que la calidad del espcimen o las condiciones de transporte del mismo no hayan sido las ms adecuadas. Si durante el primer examen del paciente no ha existido nada que hiciese sospechar la existencia de una infeccin vrica, la serologia puede ser el

Tabla 48-6

Obtencin de muestras para el diagnstico de los s n d r o m e s virales c o m u n e s Virus VRS. parainfluenza 1,3, adenovirus. influenza A y B Influenza A y B VRS. parainfluenza 3, influenza A y B, adenovirus VHS. adenovirus. clamidias. enterovirus. WZ. sarampin VHS. WZ. enterovirus VHS E s p c i m e n preferido y condiciones de transporte SNF LBA transportar inmediatamente en hielo SNF o hisopado de garganta en MTV. esputo. LBA. transportar inmediatamente en hielo SNF. LBA. hisopado de garganta en MTV: transportar inmediatamente en hielo Hisopados o exfoliados de la conjuntiva en MTV. transportar inmediatamente en hielo Fluido de vesculas/clulas en MTV, frotis secados al aire, transportar inmediatamente en hielo Fluido de vesculas/clulas en M T V , frotis secados al aire; transportar cuanto antes LCR", hisopado de garganta, heces. transportar inmediatamente Validacin de los e s p e c m e n e s Clulas columnares o macrfagos alveolares Clulas columnares o macrlagos alveolares Clulas columnares o macrfagos alveolares Clulas epiteliales Clulas epiteliales Clulas epiteliales Pruebas ms tiles DFA. EIA cultivo

Sndrome Bronquiolitis/bronquitis

Gripe Neumona Conjuntivitis Exantema vesicular Infeccin genital Meningitis Encefalitis Enteritis

DFA. EIA, cultivo DFA, EIA. cultivo DFA, EIA. cultivo DFA cultivo Cultivo. DFA PCR. cultivo PCR. cultivo. DFA. serologia EIA, ltex. ME

Infeccin viral diseminada

Enterovirus. VHS. paperas WZ. adenovirus. VLCM, sarampin VHS, arbovirus, Biopsia de tejido cerebral fresco. Enterovirus, rabia LCR. suero (arbovirus); transportar inmediatamente Rotavirus, adenovirus Heces frescas (heces, paales El hisopo debe estar (40.41), calicivirus. o hisopados rectales), cubierto ms de un Coronavirus, asirovirus. transportar cuanto antes 75% con las heces virus Norwalk CMV, VHS. WZ, Orina (en hielo), sangre (a temperatura adenovirus ambiente), LBA, biopsia pulmonar (en hielo); transportar inmediatamente

Cultivo, prueba cuantitativa para CMV. PCR cuantitativa (en investigacin)

SNF = secrecin nasofarngea: LBA = lavado bronquioalveolar. DFA = fluorescencia directa con anticuerpos; EIA = enzimonmunoensayo; MTV = medio de transpone para virus; VLCM = virus de la linlocoriomenmgitis LCR = liquido cefalorraqudeo. PCR = reaccin en cadena de la polimeasa; ME = microscopa electrnica Para ver el signilicado de otras abreviaturas, consltense las Tablas 4 8 - 3 y 4 8 - 4 'Los cultivos a partir de muestras de LCR pueden ser positivas en el caso de neonatos, pero raramente lo son en el caso de adultos con encefalitis causada por el VHS.

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

nico procedimiento diagnstico disponible, una vez se haya descartado el empleo de otras alternativas analticas como son el cultivo y la deteccin de antigenos o cidos nucleicos vrales. La serologa tambin puede ayudar a clarificar los resultados obtenidos mediante la tcnica del cultivo; por ejemplo, el aislamiento de enterovirus a partir de heces en un paciente con encefalitis cobra una importancia mayor si el ttulo de anticuerpos frente a estos virus aumenta. L a serologa es la eleccin lgica para el diagnstico de infecciones causadas por virus que requieren el empleo de mtodos complejos para su aislamiento (VEB. VIH, herpesvirus humanos [HVH-6). o inoculacin en animales (arbovirus. algunos virus Coxsackie A), o de aquellos cuya manipulacin implica riesgos biolgicos graves (VIH, arbovirus). Para algunos tipos de infecciones, la serologa es una alternativa ms rpida y barata; tanto el sarampin como las paperas pueden diagnosticarse mediante el aislamiento del virus responsable, aunque las IgM especficas estn presentes en el suero del paciente, a partir del tercer da desde el comienzo de la enfermedad, y su deteccin requiere menos tiempo y expenencia que el diagnstico mediante cultivo. Los virus pueden incluso no ser detectados cuando comienzan a manifestarse los sntomas de la infeccin: por ejemplo, los arbovirus pueden desaparecer, a menudo, del lquido cefalorraqudeo en el m o m e n t o en el que el paciente desarrolla la encefalitis, lo que h a c e que la serologa sea el mtodo diagnstico de eleccin en este caso. Frecuentemente, en las infecciones con un prdromo prolongado puede existir un ttulo detectable de anticuerpos cuando se manifiestan los sntomas (VEB y mononucleosis). Las situaciones clnicas especficas para el diagnstico serolgico estn resumidas en la Tabla 48-5.

pado con epilluorescencia para los ensayos de D F AeI F A y espacio de almacenamiento a -70 C y a -20 C. para reactivos y especmenes Todos los equipos y productos esenciales para la identificacin de los virus ms comunes estn disponibles en el mercado. Los cultivos celulares son alimentados con una solucin salina balanceada (SSB; puede utilizarse tanto la Hanks como la de Earle). a la que se aaden sustancias tampn. suero y una mezcla nutritiva como el medio mnimo esencial (MME) de Eagle. El MME de Eagle es una mezcla definida de aminocidos, carbohidratos, vitaminas, cofactores y el resto de requerimientos nutricionales que necesitan las clulas en la monocapa. El suero bovino fetal (SBF) es el suplemento nutricional y hormonal que con mayor frecuencia se aade al MME; se aade entre un 5% y un 10% de SBF en el medio de crecimiento para el cultivo de tejidos y un 2% en el m e d i o de mantenimiento. Los mayores problemas del SBF son la variabilidad que presenta de lote a lote y su alto coste: como alternativa ms econmica al SBF se puede utilizar suero de ternera enriquecido (OmniSerum), que adems tiene una composicin mucho mas estable y funciona aceptablemente para cultivar las lneas celulares utilizadas para el aislamiento del VHS y otros tipos de virus. En el laboratorio tambin debe existir una reserva de tripsina (solucin al 0.25%). tampn fosfato salino (PBS). soluciones de glutamina y bicarbonato de sodio, medio de transporte para virus, mezclas de antibiticos para descontaminar los especmenes y cido fosfotngstico al 2% para microscopa electrnica.
a

Obtencin y transporte de las muestras

El xito en cualquier diagnstico de infeccin viral depende de que la muestra sea recogida y transportada en condiciones adecuadas. El laboratorio debe establecer unas directrices realistas para una ptima manipulacin del espcimen y una poltica de rechazo de muestras inapropiadas. y hacer circular esta informacin entre el personal mdico y las unidades de enfermera (Tabla 48-6). Las muestras para cultivo y deteccin de antgenos y cidos nucleicos virales deben obtenerse durante la fase aguda de la enfermedad, cuando la liberacin de los virus es mayor; la recuperacin de los virus es espordica y poco fiable durante la fase de convalecencia.

Los laboratorios que toman a su cargo por primera vez los sen/icios de diagnstico de infecciones virales deberan comenzar su actividad con pruebas sencillas, como el cultivo de VHS y la deteccin de antgenos virales. Durante los meses de invierno se pueden ir aadiendo otros protocolos analticos para el virus de la gripe. VRS y rotavirus. La identificacin de CMV es prioritaria en aquellos hospitales en donde existen pacientes inmunodeprimidos. En principio, puede considerarse el aislamiento de enterovirus durante el verano y el otoo. A medida que la experiencia del personal tcnico vaya incrementndose s e pueden ir incorporando las tcnicas necesarias para el cultivo y deteccin de antgenos de VVZ, adenovirus y virus de la parainfluenza.

Sndromes clnicos infecciosos causados por virus

Un enfoque habitual en el diagnstico de laboratorio consiste en separar las enfermedades virales de acuerdo con sndromes clnicos especficos, Un medio de transporte para virus (MTV) contiene una solucin salina tamaconsejando al mdico que asocie un grupo, lgico pero limitado, de virus con ponada. un estabilizador proteico, un indicador de pH y antibiticos para inhibir la patologa que sufre el paciente. El laboratorio debe solicitar informacin el crecimiento indeseado de bacterias y hongos contaminantes. Se han desespecfica sobre el paciente (datos demogrficos), el diagnstico clnico y los arrollado medios de transporte muy verstiles, que sirven tanto para virus como posibles agentes virales asociados a la patologa, con objeto de que el trabajo para clamidias y micoplasmas (M4. Flextrans): la m a y o r parte de formulaciones analtico pueda racionalizarse y enfocarse hacia la utilizacin de la prueba pueden conseguir estabilizar a los virus durante 24 horas como mucho (Johnson. que sea ms rpida y eficiente y rinda los mejores resultados. En este capi1990). T o d a s las muestras, excepto las de sangre, deben transportarse y almatulo se analizarn las siguientes enfermedades virales: cenarse a 4'C hasta el m o m e n t o de proceder a su anlisis. A veces puede ser Infecciones herpticas mucocutaneas. inevitable tener que transportar el espcimen a temperatura ambiente, aunque el Sndromes respiratorios en nios y adultos. clnico debe ser consciente de los efectos negativos que esta circunstancia Mononucleosis infecciosa. puede tener en la recuperacin del virus. Las muestras de sangre para el aislaInfecciones congnitas y neonatales. miento de virus deben mantenerse a temperatura ambiente todo el tiempo. Los Infecciones virales del sistema nervioso central. cultivos deben realizarse el mismo da en el que las muestras lleguen al laboraExantemas e infecciones intestinales en nios. tono, preferiblemente dentro de las 36 horas siguientes al m o m e n t o de la recoHepatitis vrica e infeccin por VIH gida; al menos debe programarse una sesin de inoculacin de cultivos durante Infecciones vricas en el husped inmunocomprometido. los fines de semana. Las muestras pueden congelarse a -70 C slo como ltimo recurso; las muestras de sangre y orina y los especmenes respiratorios para el INFECCIONES HERPTICAS MUCOCUTANEAS aislamiento de CMV y VRS. respectivamente, no deben congelarse.
S

Equipos y material
La mayor parte de los equipos utilizados en virologa son relativamente baratos y, a menudo, estn disponibles en las secciones de microbiologa e inmunologia de los laboratorios. Para la inoculacin de los cultivos, y siempre que los mismos vayan a ser manipulados, debe utilizarse una cabina de flujo laminar de clase II para proteger al personal tcnico de los aerosoles infectivos y reducir la contaminacin accidental de los cultivos. Tambin debe encontrarse disponible una centrifuga adaptada para acomodar los shell-vials. Asimismo son necesarios incubadores para mantener las lineas celulares no inoculadas e incubar los cultivos inoculados; los incubadores deben estar equipados, a ser posible, con un dispositivo que permita instalar un tambor giratono en su interior. Finalmente, es necesario disponer de un microscopio invertido con contraste de fases para identificar los ECP en las monocapas de los cultivos celulares, un microscopio equi-

La familia Herpesviridae contiene dos virus que tradicionalmente producen infecciones en la piel y en las membranas mucosas del cuerpo: el VHS y el VVZ. Ambas infecciones son m u y comunes, y aunque no ponen en peligro la vida, el hecho de que el tratamiento de las mismas con aciclovir sea m u y efectivo ha incrementado la demanda de diagnsticos rpidos, especialmente en el caso del VHS (Corey. 2000). El VVZ se describir ms adelante en el apartado de Exantemas virales. El VHS es ubicuo e infecta a lodos los grupos raciales humanos a nivel mundial. Las dos cepas del VHS. el serotipo 1 y el serotipo 2. comparten m u c h a s caractersticas biolgicas y moleculares e infectan preferentemente a las clulas epiteliales escamosas; sin embargo, cada una de ellas tiene un perfil antignico distinto y una epidemiologa un tanto diferente. El VHS1 es altamente infeccioso y se transmite por la saliva para infectar la boca, la faringe, los labios y la piel de la cara. Las lesiones pueden aparecer, ocasionalmente, en la piel

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Figura 48-3. E s q u e m a del protocolo experimental para el cultivo del VHS m e d i a n t e el mtodo tradicional en tubo (izquierda) y el s i s t e m a shellvial (derecha). expuesta de los combatientes de lucha libre o en las m a n o s del personal mdico tras un contacto directo con saliva infectada. L a mayor parte de las infecciones por VHS1 se producen antes de la pubertad, especialmente en individuos pertenecientes a grupos con un nivel socioeconmico baio. A menudo la infeccin primaria es asintomtica. aunque una minora significativa de infectados tienen fiebre y desarrollan una gingivoeslomatitis dolorosa (Kuzushima. 1991). El VHS1 infecta las clulas del ectodermo y. a medida que el virus se replica en el ncleo, las clulas pierden su integridad citoplasmtica. pierden lquido y se separan unas de otras, formando una vescula. Las bacterias de la microbiota de la piel y las mucosas transforman las vesculas en pstulas, que terminan por ulcerarse cuando las clulas epiteliales daadas se lisan por completo. Por lo general, las lesiones herpticas curan sin dejar cicatriz a medida que se van regenerando las capas de la epidermis. La respuesta inmune trente a la infeccin por VHS1 implica la actuacin de las clulas natural killer (NK), linlocitos T citotxicos. y la produccin de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, ni los mecanismos de la inmunidad humoral y celular son capaces de impedir la migracin del VHS a lo largo de los nervios sensoriales hasta los ganglios trigminos, donde persiste por tiempo indefinido, en un estado durmiente, en el ncleo de las neuronas (Straus. 19891. Espordicamente, el VHS se reactiva y viaja de vuelta a travs de los axones neurosensonales hasta llegar a la boca y la piel, donde vuelve a replicarse otra vez en el epitelio escamoso. La mayor parte de las infecciones recurrentes son asinlomticas o producen vesculas que slo tienen importancia desde el punto de vista esttico. Sin embargo, en los casos en los que existe un problema grave en los mecanismos de la inmunidad celular (enfermos de sida o pacientes trasplantados), las inlecciones recurrentes por reactivacin del virus pueden ser graves e incluso ltales. La encefalitis es otra forma gravsima, aunque poco frecuente, de infeccin por VHS1. Estas dos complicaciones se describirn ms adelante, en otras secciones de este capitulo. La infeccin por VHS2 tiene lugar a nivel del epitelio escamoso de la mucosa del aparato genital, se transmite p o r contacto sexual directo y se ha convertido en un grave problema de salud pblica en los ltimos 30 aos Millones de americanos se encuentran infectados en la actualidad, y se estima que cada ao aparecen 500.000 casos nuevos. La recuperacin del VHS2 a partir de nios es m u y rara y generalmente suscita la sospecha de que pueda ser consecuencia de un abuso sexual; sin embargo, con el comienzo de la adolescencia la seroprevalencia aumenta de forma constante hasta la madurez, siendo proporcional al nmero de contactos o compaeros sexuales (Fleming. 1997). La prevalenoa del VHS2 en Estados Unidos es del 22%: en individuos de 1 3 o ms aos, la seropositividad en relacin con la edad ha aumentado un 30% desde 1980. El

Figura 48-4. Cultivo en m o n o c a p ad e clulas d e rion d e conejo, q u e presentan ECP debidos a l a multiplicacin del VHS. Las clulas de rion de m o n o tienen, habitualmente, u n af o r m a poligonal y se e n c a j a nl a t e r a l m e n t eu n a sc o no t r a sp a r af o r m a r un m o s a i c o celular continuo. Las clulas i n f e c t a d a s por el VHS en este cultivo de tres das exhiben una f o r m ar e d o n d e a d a e hinchada, y varias clulas a d y a c e n t e s se han fusion a d o para f o r m a r sincitios celulares gigantes. L a s zonas v a c i a s en l a preparacin corresponder a aquellas reas de la m o n o c a p a del cultivo en d o n d e las clulas infect a d a s han m u e r t o y se han lisado (aumento: x 200: microscopa de c o n t r a s t e de fases).

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Figura 48-5. M o n o c a p a de fibroblastos MRC-5 en s/iefl-wlque m u e s t r a la presencia de antigenos del VHS en el citoplasma y ncleo de las clulas tras 16 horas de incubacin. El a s p e c t o de la m o n o c a p a de clulas es normal, y los ECP caractersticos an no son detectables (aumento: x 250: tincin D F Ap a r a antgenos del VHS) VHS2 produce un patrn de infeccin primaria y recurrente, con lesiones mucocutneas semejantes a las que se observan con el VHS1. El virus se encuentra latente en los ganglios neurales sacros, y la reactivacin se produce con una frecuencia del doble, al menos, de la observada en el caso del VHS1.

un tambor giratorio (Mavromoustakis. 1988). Aquellos cultivos inoculados a partir de muestras de lesiones genitales, en los que no es posible detectar los ECP caractersticos del VHS tras cinco/siete das de incubacin, pueden considerarse negativos: debido a que tambin pueden recuperarse otros virus (p. ej., VVZ. adenovirus. enterovirus) a partir de ciertas localizaciones anatmicas no relacionadas con el aparato genital, como la boca, la crnea o el cerebro, estos cultivos deben incubarse durante dos semanas, al menos. Las clulas individuales infectadas por el VHS se hinchan y adquieren forma redondeada, y el dao celular se extiende rpidamente por toda la monocapa del cultivo, El VHS2 induce frecuentemente la formacin de sincitios. debido a la coalescencia de las m e m b r a nas plasmticas de las clulas infectadas (Fig. 48-4). Este ECP es caracterstico, aunque no el nico, del VHS: un tcnico con poca expenencia puede interpretar incorrectamente como ECP provocados por VHS las alteraciones o cambios causados por otros virus, por toxinas bacterianas o incluso p o r tricomonas. por lo que se recomienda confirmar los resultados de la observacin con una tincin DFA. Para ello, la monocapa de clulas es retirada, transferida a un portaobjetos de vidrio, lijada con acetona y seguidamente teida con anticuerpos monoclnales o policlonales frente al VHS (Lipson. 1991). Los anticuerpos monoclonales especficos de tipo pueden distinguir entre VHS1 y VHS2 mediante el test DFA, aunque el tiempo y los reactivos adicionales necesarios para ejecutar la prueba hacen que se incremente el coste de la misma, aadiendo, por lo general, muy poca informacin a los datos del examen clnico. El serotipado debe reservarse para aquellos casos en los que existan discrepancias de criterio entre mdicos o manifestaciones clnicas ambiguas. La gran cantidad de peticiones de cultivo para VHS conducen al empleo de la tcnica de cultivo en shell-vials. mediante la que es posible detectar los antgenos virales en la monocapa de clulas por medio del test DFA tras un da de incubacin solamente (Gleaves, 1985) (Fig. 48-5). La deteccin del VHS en los cultivos de los shell-vials empleando enzimoinmunoensayo o hibridacin in situ, es una alternativa igualmente sensible y especifica (Espy. 1988; Patel, 1991; Michalski, 1986). Tambin se han utilizado, aunque con resultados variables, algunas adaptaciones del mtodo de cultivo favorecido por centrifugacin que utilizan placas de microtitulacin en lugar de tubos (Woods, 1988; Ziegler, 1988)

Aislamiento del virus del herpes simple mediante cultivo celular

Los especmenes tomados con una torunda y depositados en medio de transporte (MTV) con antibiticos pueden conservarse entre 12 y 24 horas a temperatura ambiente (22"C), con una reduccin mnima en la viabilidad del virus. Los especmenes deben sembrarse en los cultivos celulares en el m o m e n t o que llegan al laboratorio, aunque pueden almacenarse en refrigeracin durante una noche, si as fuese necesario. El aislamiento del VHS es todava el mejor test de diagnstico y es ms sensible que cualquier otro mtodo basado en la deteccin de antgenos virales o hibridacin con sondas de cidos nucleicos especficas; sin embargo, las tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos son claramente superiores al cultivo. El VHS crece excepcionalmente bien en una amplia variedad de lneas celulares: los fibroblastos humanos (WI-38. MRC-5. prepucio) son una de las alternativas ms populares, aunque otras lneas celulares como HeLa, Vero y HEp-2, as como cultivos celulares de rabdomiosarcoma (RD), pulmn de conejo y pulmn de visn, tambin permiten un buen crecimiento del virus. Los cultivos primarios de rion de mono (PMK) no son adecuados y. en consecuencia, no deben utilizarse. Generalmente se inoculan dos tubos con distintas lneas celulares (uno con RK y otro con MRC-5): el procedimiento se resume en la Figura 48-3.

Deteccin directa del virus del herpes simple

La preparacin de Tzanck consiste en realizar un frotis directo del contenido de una vescula herprtica. que se tie por el mtodo de Giemsa para revelar la presencia de clulas gigantes epiteliales multinucleadas (sincitios) y de inclusiones intranucleares. Estos hallazgos no son especficos de una infeccin por VHS; en este contexto, tambin se han visualizado cambios celulares idnticos, consecuencia de la infeccin por VVZ (en vesculas de la varicela y del herpes zster). La preparacin de Tzanck es positiva en el 67% de las lesiones herpticas, cuando stas se encuentran en fase de vescula; a pesar de la rapidez con la que se ejecuta este procedimiento, la baja sensibilidad del mismo limita su utilidad prctica.

La inmunotincin de los frotis directos con anticuerpos frente al VHS, marcados con fluorescena o peroxidasa, elimina la posibilidad de confusin con el WZ y permite la deteccin de antgenos virales incluso en ausencia de sincitios y en clulas que no muestran, todava, las inclusiones nucleares. Sin embargo, cuando se compara con el mtodo del cultivo, el test DFA tiene, como El VHS se replica a gran velocidad y los ECP aparecen entre el segundo y termnimo, entre un 20% y un 30% de error por falsos negativos (Lafferty, 1987; cer da, despus de la inoculacin, especialmente si los tubos son incubados en Moseley, 1981) (Tabla 48-7). Todos los resultados negativos en el test de deteccin directa deben ser considerados potencialmente como falsos negativos, que T a b l a 48-7 Sensibilidad (%) de las tcnicas de aislamiento deben ser validados mediante cultivos realizados en paralelo. Por otro lado, el mediante cultivo, preparacin de Tzanck (frotis teidos diagnstico por PCR del herpes mucocutneo genital tiene entre un 20% y un por el mtodo de Giemsa), inmunofluorescencia directa 30% ms de sensibilidad comparado con el mtodo del cultivo (Slomka, 1998). ( D F A ) y tincin con inmunoperoxidasa (IP) a partir de La PCR es ocho veces ms sensible que el cultivo para la identificacin de las lesiones del herpes simple infecciones asintmaticas (Cone, 1994). L a amplificacin de seal mediante Estadio Sensibilidad (%) del m t o d o captura de hbridos para detectar el ADN del VHS tambin es superior al cultivo d e la como mtodo diagnstico (Cullen. 1997). En su formato de ensayo mltiple Tzanck DFA IP Cultivo lesin para la evaluacin de la enfermedad genital ulcerosa, la PCR mostr un 100% 67 76-87 76 Vescula 70-95 de sensibilidad para la deteccin del VHS. asi como una mejora sustancial en 58-67 75 Pstula 67-83 55 el diagnstico del chancroide y de la sfilis primaria (Orle, 1996). 32-67 30-38 55 lcera Costra 17 10 Diagnstico serolgico
Los valores mostrados son una combinacin de los indicados por Pindak (1986). Langenberg (1988) y Mavromoustakis (1988) en sus respectivos trabajos

Debido a que existe una homologa antignica considerable entre los serotipos 1 y 2 del VHS, es necesano utilizar antigenos purificados que sean espec-

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INFECCIONES VRICAS
VRS

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ticos de serotipo en los ensayos serolgicos. Utilizando antgenos selectos de la envoltura de ambos serotipos del VHS y los mtodos de ELISA o de transferencia electrolorlica {Western mmunoblotting) se puede evitar la deteccin de anticuerpos con reactividad cruzada (Ahsley, 1988; Lee. 1986). Hasta el momento, slo existe un sistema comercial de ELISA que ha mostrado una sensibilidad, especificidad y capacidad discriminatona aceptables (Ahsley. 1998). Sin embargo, un estudio longitudinal en adultos jvenes seropositivos puso de manifiesto que la prdida de reactividad era un comportamiento habitual, tanto en los ensayos comerciales como en los mtodos de laboratorio (Schmid, 1999). El error debido a los falsos negativos conduce a una subestimacin de los datos sobre seroprevalencia y limita, tambin, la utilidad clnica prctica del serodiagnstico. En cualquier caso, una vez que estn disponibles los mtodos que permitan llevar a cabo una serotipificacin precisa, su aplicacin ms importante ser la determinacin de anticuerpos especficos frente al VHS2 en mujeres embarazadas para establecer el riesgo de transmisin neonatal (Brown. 1991).

Resfriados y faringitis son tratados clinicamente sin necesidad de realizar pruebas de laboratorio; sin embargo, el nmero de peticiones de ensayos para la determinacin de antgenos o de cultivos para el diagnstico de las infecciones virales del tracto respiratorio inferior puede sobrepasar fcilmente el de las pruebas equivalentes para la deteccin del VHS (Tabla 48-1 ). El virus de la gripe y el VRS son los patgenos ms importantes en adultos: en nios pequeos, la mayor incidencia corresponde al VRS, virus de la parainfluenza, virus de la gripe y adenovirus.

Gripe (Influenza)
Los virus de la gripe A y B causan anualmente, durante los meses fros, brotes de enfermedades febriles, agudas, del tracto respiratorio superior e inferior, que estn acompaadas de una serie de manifestaciones sistmicas. Por lo general, la influenza A es ms comn y produce una enfermedad ms grave que el tipo B. Debido a que los antgenos virales experimentan cambios determinados por mutaciones puntuales o por recombinacin de fragmentos de ARN vrico y humano, los anticuerpos producidos durante episodios anteriores de gripe proporcionan una proteccin escasa durante brotes subsiguientes de la infeccin. La gripe es altamente contagiosa, y se extiende de persona a persona a travs de aerosoles o por contacto con las manos contaminadas (Troanor. 2000). El virus de la gripe se multiplica rpidamente en las clulas columnares ciliadas de la fannge y el rbol traqueobronquial. La fiebre suele manifestarse de manera brusca: la necrosis del epitelio respiratorio causada por el virus provoca dolor de garganta y tos, aunque otras manifestaciones asociadas, c o m o mialgias, dolor de cabeza y un estado generalizado de debilidad, son, por lo general, ms importantes y graves que los problemas respiratonos. Si no hay complicaciones, la enfermedad remite en cuatro o cinco das. Cada ao se producen aproximadamente 100.000 hospitalizaciones y 20.000 muertes en

INFECCIONES VRICAS DEL TRACTO RESPIRATORIO

Cada ao se producen en Estados Unidos varios millones de visitas ambulatorias y hospitalizaciones debido a las infecciones del tracto respiratorio, que en su mayora estn causadas por virus. Las infecciones van desde resfriados irrelevantes hasta patologas graves como la laringotraqueobronquitis (crup), la bronquiolitis y la neumona. Los nios y adultos sanos tienen el nesgo potencial de enfermar durante las epidemias anuales de crup, bronquiolitis y gripe y la morbilidad y mortalidad asociadas a estas infecciones pueden ser drsticas. El brote de gripe durante 1998-1999 en Estados Unidos tuvo slo una gravedad moderada, pero el porcentaje de muertes debidas a la neumona asociada a la gripe alcanz el 8,8% (Update. 1999)

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MEDICA

Estados Unidos como consecuencia de la gripe. En un porcentaje pequeo de afectados, la necrosis viral aguda se extiende hasta las clulas que recubren los bronquios, causando una forma grave de neumona potencialmente fatal (Yeldandi. 1994). Sin embargo, la mayor parte de fallecimientos relacionados con la gripe estn provocados por una neumona secundaria de origen bacteriano, que aparece c o m o consecuencia de la colonizacin del epitelio de la mucosa respiratoria daado por el virus, por Staphylococcus aureus, Streplococcus pneumoniae, Haemophilus inlluenzae y otras bacterias presentes en la orlaringe. La infeccin bacteriana es ms frecuente en pacientes con una enfermedad pulmonar crnica o fallo congestivo cardaco preexistente. Muy raramente aparecen otras complicaciones asociadas a la gripe, como miocarditis, meningoencefahtis, sndrome de Reye y sndrome de Guillain-Barr. La gripe se diagnostica mejor durante los dos o tres primeros das de la enfermedad, cuando se produce una mxima liberacin de virus. El cultivo representa el mtodo diagnstico ms sensible, siendo los especmenes ms adecuados para este fin un aspirado de secreciones nasofarngeas (SNF), esputo obtenido mediante expectoracin y material recogido de la garganta con hisopo. El cultivo en shell-vials es una alternativa que ofrece una excelente sensibilidad y permite obtener los resultados tras un periodo de incubacin de uno o dos das (Beekmann, 1996; Leonardi, 1994), lo que puede afectar positivamente al tratamiento del paciente y a la prevencin de los contagios por contacto. El cultivo medanle las tradicionales monocapas celulares puede tardar entre dos y siete das en ofrecer resultados. La deteccin de antgenos del virus mediante DFA es un procedimiento til para realizar un diagnstico rpido; el aspirado de SNF contiene abundantes clulas columnares epiteliales infectadas por el virus, por lo que representa el tipo de espcimen preferido para este fin. La sensibilidad del ensayo varia entre un 77% y un 93% para la deteccin del virus de la influenza A y entre un 70% y un 80% para la influenza B; la especificidad es superior al 95% y est fuertemente condicionada por la experiencia del observador y la calidad de la muestra. El material recogido de la garganta con hisopo contiene pocas clulas columnares y, por tanto, no es adecuado para la tincin DFA. Los enzimoinmunoensayos comerciales tienen una buena sensibilidad para detectar antigenos virales, si se utilizan con aspirados de SNF como muestra; la sensibilidad es menor si el espcimen utilizado es el material recogido con hisopo de la garganta del paciente (Leonardi, 1994). La deleccin de un antgeno especfico de los tipos A y B del virus (neuraminidasa) mediante inmunoensayo ptico tiene una buena sensibilidad diagnstica que oscila entre un 80% cuando se utiliza el aspirado de SNF y un 83% con espulo obtenido por expectoracin (Mulford. 1999).

Tabla 48-8

R e c u p e r a c i n de virus a partir de secreciones nasofarngeas (SNF): relacin con la calidad del e s p c i m e n * Nmero de % de muestras a partir muestras de las que se logr la recuperacin de virus de SNF
243 1 930 6 27

Muestra (N = 2.173)

SNF con <1 clulas columnares por campo (observacin a x 250) SNF con 22 clulas columnares por campo (observacin a x 250)

Datos del Lulhoran General Hospital, desde enero 3e 1985 a mayo de 1990. un 11% de especmenes tenan insuficientes clulas y ueron obtenidos de nuevo

ribavirina por va mtranasal o inmunoglobulmas frente al VRS por va intravenosa (Ottolmi. 1997: Hall. 1998). El VRS es particularmente frgil y lbil, y puede inactivarse si la muestra tarda un cierto tiempo en llegar al laboratorio. Una vez inoculado en los cultivos celulares, se replica lentamente, y los ECP aparecen tardamente; el tiempo necesario para el aislamiento oscila entre 3 y 1 0 das (Arens, 1986; Tristram, 1999). La centrifugacin de la muestra en cultivos celulares en shellvials incrementa la recuperacin del VRS y acorta a dos das el tiempo necesario para el aislamiento (Beekmann, 1996; Pedneaull, 1994: Smilh. 1991). La deleccin de antgenos del VRS en secreciones respiratorias mediante DFA o EIA representa otra posibilidad para el diagnstico igual de sensible, o incluso ms, que el cultivo, y permite obtener resultados en una banda de tiempo relevante desde el punto de vista clnico: por tanto, estos mtodos se han convertido en la alternativa prctica definitiva para el diagnstico del VRS (Rossier. 1989; Smith, 1991) El enzimoinmunoensayo es rpido y fcil de realizar, aunque los reactivos necesarios son caros y los procedimientos existentes no permiten evaluar la adecuacin de la muestra. El test DFA necesita ms tiempo para su ejecucin y experiencia para la interpretacin de los resultados, aunque puede implementarse fcilmente para la deteccin de mltiples virus y permite confirmar, de una forma sencilla, la calidad de la muestra.

Crup
El crup es una enfermedad generalmente causada por el virus de la parainfluenza (VPI) (Hennckson. 1994: Vainionpaa. 1994). La incidencia del VPI1 y VPI2 se incrementa durante el otoo o la primavera, mientras que el VPI3 causa infecciones respiratorias por igual a lo largo de todo el ao. Los diferentes tipos del VPI, particularmente el VPI3. son la segunda causa de infeccin viral del tracto respiratorio inferior en nios de menos de 6 meses. L a necrosis epitelial que produce la multiplicacin del virus en la laringe, la traquea y los bronquios, estrecha la luz de los conductos, dificultando el paso del aire y causando ronquera, tos y un patrn de estridencias respiratorias debidas a la obstruccin que son caractersticas del crup. La inmunidad desarrollada es transitoria y las reinfecciones son frecuentes; sin embargo, en nios mayores y en adultos, los sntomas son menos graves y se circunscriben al tracto respiratorio superior. El cultivo de las SNF es el mtodo con mayor sensibilidad para el diagnstico, aunque la deteccin de antgenos del VPI en muestras de SNF es otro procedimiento que tiene tambin una buena sensibilidad, que oscila entre el 69% y el 85% (Costello. 1993). Aquellas muestras que dan resultados negativos con el test DFA deben ser cultivadas para aumentar las posibilidades de recuperacin.

Bronquiolitis por virus respiratorio sincitial

El VRS es la principal causa de infeccin grave en el tracto respiratorio inferior en nios y jvenes (Anderson, 1990; Hall, 1998). El VRS se transmite fcilm e n t e mediante gotas de aerosoles, y los brotes aparecen de forma recunente cada invierno en Estados Unidos (Fig. 48-6). La inmunidad generada por el husped frente al virus es incompleta y de corta duracin, siendo frecuentes las reinfecciones, cada vez con manifestaciones ms leves, a lo largo de la vida, aunque el VRS puede causar tambin enfermedades pulmonares graves en los ancianos y los individuos inmunocomprometidos (Pohl. 1992; Hamngton. 1990). El VRS infecta, al igual que el virus de la gnpe. las clulas columnares epiteliales, desde la nasofannge hasta los bronquiolos ms distales: la forma ms grave de presentacin de la infeccin es la bronquiolitis, especialmente en nios de menos de un ao. cuyas vas respiratorias, poco desarrolladas, son obstruidas fcilmente por las clulas epiteliales necrosadas y los residuos originados como consecuencia del proceso inflamatorio. La obstruccin de los bronquiolos produce un atrapamiento del aire e hipoxia, que puede ser lo suficientemente grave como para necesitar hospitalizacin. Las infecciones ms graves por VRS se producen en nios prematuros, en nios que tienen una patologa cardiopulmonar subyacente o una inmunodeficiencia y en receptores de trasplantes. Aproximadamente un 1% de los nios con bronquiolitis por VRS hospitalizados mueren por hipoxia, fallo cardaco accesorio o sobreinfeccin bacteriana. Es importante un diagnstico rpido del VRS en los pacientes hospitalizados para instaurar medidas de control con objeto de impedir la infeccin nosocomial (uso de mascarillas y guantes: aislamiento de los pacientes con diagnstico positivo) y para que comience a administrarse inmediatamente

Obtencin de muestras
Todos los mixovirus y adenovirus respiratorios pueden infectar las clulas columnares ciliadas del epitelio respiratorio, desde la nasofaringe a los alvolos. Por tanto, cuando se sospecha la existencia de una enfermedad respiratoria (crup, bronquiolitis. neumona o gripe), la mucosa del tracto respiratorio superior es la localizacin ms accesible para lomar una muestra para el cultivo o un test de deteccin de antgenos. Los especmenes deben obtenerse durante los primeros das de la enfermedad, cuando la rephcacin del virus est en sus cotas ms altas. El material recogido con hisopo de la garganta, depositado en MTV con antibiticos, es un material aceptable para el cultivo del virus de la gripe, aunque el rendimiento es entre un 1 0 % y un 20% menor: las muestras de esputo tomadas por expectoracin tambin son adecuadas

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INFECCIONES VRICAS

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tra de SNF d e b eh o m o g e n e i z a r s e con ser tampn fosfato salino que c o n t e n g a p a r a el cultivo (Kimball. 1 9 8 3 : Yungblulh, 1998). en especial en el c a s o de una s u s t a n c i am u c o l i t i c a (Sputolysin) y s e rc e n t r i f u g a d a a continuacin; el aquellos p a c i e n t e sq u e tienen tos productiva. s o b r e n a d a n t er e s u l t a n t e se utiliza p a r a el cultivo, y el s e d i m e n t o se resusL a sS N F se r e c o g e nm e d i a n t e la insercin de un catter a d o s a d oau n a p e n d e en tampn fosfato s a l m o : a partir de esa resuspensin se h a c e un frojeringuila a travs de los orificios n a s a l e sh a s t aa l c a n z a r la nasofaringe, instio r t a o b j e t o sr e c u b i e r t o s con polk-lisina. Las l a n d os e g u i d a m e n t ee n t r e 1 mi y 2 mi de s u e r o salino y a s p i r a n d oac o n t i n u a -tis en lminas de tefln o en p e x t e n s i o n e ss ed e j a ns e c a ra l aire, s e fijan s e g u i d a m e n t ec o na c e t o n aa l cin las s e c r e c i o n e s de la m u c o s a por m e d i o de la leringa. T o d a s las m u e s t r a s 100%. y se tien con a n t i c u e r p o s especficos f r e n t eaa n t i g e n o s virales, c o n d e b e ns e rt r a n s p o r t a d a s rpidamente en un bao de hielo p a r am i n i m i z a r la j u g a d o sc o n fluoresceina, utilizando azul d eE v a n sc o m oc o l o r a n t ed ec o n prdida d e viabilidad del VRS. La calidad de las m u e s t r a sd e b e venlicarse a n t e s traste. Hay que observar el nmero de clulas c o l u m n a r e s ciliadas asi c o m o el d ei n t e n t a r levar a c a b o el cultivo o la deteccin de antigenos. A q u e la sm u e s grado de tincin inespecifica d e b i d a a la p r e s e n c i a de m o c or e s i d u a l en el t r a s de SNF en las que se d e t e c t a n al m e n o s dos clulas ciliadas c o l u m n a r e s fondo de la preparacin o de neutrlilos. La Figura 48-8 m u e s t r a una tincin del epitelio r e s p i r a t o r i o por c a m p o microscpico (observacin a x 250) rinden D F Ad eu n am u e s t r ad eS N F positiva p a r a influenza A .L a especificidad d e los u n a recuperacin cuatro v e c e sm a y o r de patgenos respiratorios virales. anticuerpos a c o p l a d o s a fluoresceina se e n s a y a frente a una batera de cultiEnsayos para la deteccin de antgenos vricos vos de clulas control positivas; los patrones de tincin d e b e nm o s t r a r una distribucin cel u l a r e i n tensi d ad c o n s t a n t e s de l a f l u o r e s c e n c i a en t o d o s los l o t e s En la F i g u r a 48-7 se describe un p r o c e d i m i e n t ob a s a d o en el cultivo y la tinde clulas anal i z ados. En conj u nto, l o s mtodos de tincin fl u orescente ti e nen cin m e d i a n t eD F Ap a r a la identificacin de virus respiratorios. U n a deteccin u n ag r a n especificidad y sensibilidad ( C h e e s e m a n , 1986; H u g h e s , 1988). r e p r o d u c i b l eyp r e c i s ad e antgenos virales m e d i a n t eD F A requiere c i e r t a En la actualidad estn disponibles en el m e r c a d o varios e n z i m o i n m u n o e n e x p e r i e n c i ap a r a la interpretacin de la observacin al microscopio, p o r lo sayos (EIA) p a r a la deteccin del VRS y el virus de la gripe. La e s p e c i f i c i d a d que. si es posible, d e b e realizarse simultneamente un cultivo de virus y un y sensibilidad de e s t o ss i s t e m a sc o m e r c i a l e s es b a s t a n t e buena, c o m p a r a b l e e n s a y o de deteccin de antgenos. Los hospitales con una unidad peditrica a la tincin D F A (Hughes. 1988: Miler, 1993;Thomas. 1991). Las m u e s t r a s de de g r a n tamao e x a m i n a n de f o r m a peridica las m u e s t r a s respiratorias p a r a e b e ne x a m i n a r s ep a r ad e t e c t a r la p r e s e n c i a de clud e t e c t a r diferentes virus (VRS, influenza A y B. distintos tipos de V P I y ade- SNF utilizadas para EIA d las ciliadas epiteliares columnares: p a r a ello, se realiza un preparacin en novirus) d u r a n t e los m e s e s de invierno, si el p r e s u p u e s t o lo permite. L o s e z c l a n d o una gota de la m u e s t r a con una g o t a de solucin p a c i e n t e s adultos d e b e ns e r analizados e nb u s c a del virus d el a gripe; e lV R Scmara hmeda, m salina, que se o b s e r v a al m i c r o s c o p i o (x 250) p a r a verificar que en el espcid e b et e n e r s e tambin en c u e n t a en el caso de pacientes geritricos. La m u e s -

Figura 48-7. E s q u e m a del p r o t o c o l oe x p e r i m e n t a lp a r a el diagnstico de i n f e c c i o n e sr e s p i r a t o n a s virales m e d i a n t e cultivo (izquierda) y por el mtodo de i n m u n o f l u o r e s c e n c i ad i r e c t a( D F A ) (derecha).

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Figura 48-8. Tincin O e inmunofluorescencia directa de un frotis de un aspirado nasofarngeo que revela la presencia de antigenos fluorescentes en el ncleo y el citoplasma de las clulas columnares ciliadas del epitelio y en los mononucleares ( a u m e n t o x 250; tincin para antgenos especficos del virus de la influenza A). m e n existen suficientes clulas columnares nasofarngeas. Las muestras tomadas de la garganta o de la nasofaringe con un hisopo contienen muy pocas clulas para poder llevar a cabo un preanlisis citologico.

Figura 48-10. Monocapa de un cultivo de clulas HEp-2. donde son apreciadles ios ECP debidos a l a multiplicacin del VRS en las mismas. Es patente la presencia de s ^ n c i t i o s multinucleados tras una incubacin de 9 das (aumento 200: m i c r o s copia de contraste de fases). cacin del sistema basado en el cultivo puede ampliarse para la recuperacin de virus que no estn incluidos en los ensayos de deteccin de antgenos, como el virus del sarampin y los enterovirus (Johnston. 1990; Rabalais, 1992). El matenal recogido con hisopo de la garganta, cuya finalidad nica sea servir de muestra de partida para el cultivo del virus de la gripe, debe depositarse en MTV con antibiticos inmediatamente despus de ser obtenido y transportarse rpidamente hasta el laboratorio, preferiblemente en un bao de hielo: la inoculacin de los cultivos celulares no debe demorarse ms all de 48 horas y debera realizarse, preferiblemente, el mismo da en que el espcimen es obtenido. El recipiente con MTV debe agitarse enrgicamente antes de retirar y desechar el hisopo. El lquido sobrenadante se utiliza para inocular, por duplicado, tubos shell-vial que contengan cultivos tripsmizados de las lneas celulares MDCK (clulas Madin-Darby de nn de perro) o PMK. Tras la centrifugacin para favorecer la adsorcin de los viriones a las clulas, se aade a los tubos un volumen de MME (medio mnimo esencial de Eagle) sin suero bovino fetal (SBF), ya que el SBF puede contener anticuerpos frente al virus de la gripe. Despus de uno o dos das de incubacin a 35 C, las monocapas de clulas son teidas mediante la tcnica DFA, con objeto de detectar los antgenos del virus de la gripe (Reina, 1997). Adicionalmente. se puede inocular un tubo ms con clulas PMK o MDCK. que se incuba en un tambor rotatorio y se examina para detectar la multiplicacin del virus, aadiendo eritrocitos de cobaya recin obtenidos. Al igual que los virus del sarampin y de la parainfluenza. el virus de la gripe no produce ECP de forma constante, aunque es capaz de inducir la integracin de hemaglutininas en la membrana plasmtica de las clulas de los cultivos, lo que provoca que los eritrocitos se adhieran a las clulas de la monocapa, hecho que revela que el virus se est replicando en stas. Si la cantidad de trabajo lo permite, los tubos deben examinarse diariamente para detectar la hemoadsorcin (Minnich. 1987). Una vez se ha apreciado la existencia de hemoadsorcin. la monocapa de clulas debe analizarse con u n a batera de anticuerpos para determinar qu tipo de virus est presente. En la Figura 48-9 se muestra una monocapa de clulas P M K en un tubo shell-vial en la que se ha multiplicado el virus de la influenza A. tras dos das de incubacin, y un cultivo estndar de clulas PMK infectadas por el m i s m o virus, que muestra la hemoadsorcin de los eritrocitos de cobaya, tras tres das de incubacin. La Figura 48-7 muestra un esquema del procedimiento de cultivo en tubos shell-vial aplicado a las SNF, empleando una monocapa hbrida de clulas, formada por clulas A549 y ML (de pulmn de visn), que conjuntamente permiten el crecimiento del VRS, adenovirus, virus de la influenza A y B y los distintos tipos del virus de la parainfluenza En comparacin con las lneas celulares tradicionales, el cultivo de tejidos hbrido tiene, globalmente. unos porcentajes de recuperacin de entre el 96% y el 100%. con tiempos de espera ms cortos, y unos costes totales reducidos (Schindler, 1999). Aquellos laboratorios que se dedican exclusivamente al cultivo del VRS deben considerar la utilizacin de los tubos shell-vial en lugar de los tubos Ira-

Aislamiento de virus
En el caso del aislamiento de virus mediante cultivo, tienen validez los mism o s requerimientos y restricciones respecto a la muestra que se tienen en cuenta en los ensayos de deteccin de antigenos. Los cultivos a partir de SNF procedentes de adultos y nios no inmunodeprimidos pueden modificarse para ajustarse a las epidemias estacionales de infecciones causadas por el virus de la gripe, VRS y VPI (Fig. 48-6). Como mnimo, debe intentarse llevar a cabo el aislamiento del VRS y del virus de la gripe durante el invierno; si las disponibilidades de personal asi lo permiten, tambin deben realizarse cultivos para el aislamiento del VPI y adenovirus a partir de pacientes peditricos. En la Tabla 483 se muestra un listado de las lineas celulares que permiten el crecimiento de virus patgenos del tracto respiratorio mfenor. La tcnica del cultivo mejora globalmente el rendimiento diagnstico, ms all del que se obtiene mediante el mtodo de deteccin de antgenos, aproximadamente entre un 10% y un 20%, para lodos los agentes virales, excepto en el caso del VRS. El mbito de apli-

Figura 48-9. Cultivo de clulas primarias de nn de m o n o infectadas p o r el virus de la gripe A. segn se desprende de la aparicin de fluorescencia, tras una tincin con anticuerpos especficos frente al virus (izquierda). Se observa la hemoadsorcin de eritrocitos de cobaya sobre la m o n o c a p a de clulas inducida por la replicacin del virus (derecha).

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INFECCIONES VRICAS

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dicionales para realizar los cultivos de tejidos, con objeto de reducir el tiempo necesario para el aislamiento. Las clulas HEp-2 o A549 en MME de Eagle enriquecido con suero bovino fetal (entre un 2= y un 5 % ) permiten la replicacin del VRS. Las monocapas de clulas contenidas en los tubos deben examinarse diariamente para detectar la aparicin de ECP. En la Figura 48-10 se observan los tpicos ECP causados por la multiplicacin del VRS en las clulas (formacin de sincitios multinucleados), patrn que depende del contenido en cationes y de la frescura del medio de mantenimiento (Tristram. 1999). Los adenovirus tambin son capaces de replicarse en las lneas celulares A549 y HEp-2. produciendo un redondeamiento de las clulas de la monocapa. que se hinchan, adquiriendo una morfologa que semea un grano de uva, generalmente entre cinco y siete das de incubacin; el empleo de tubos shell-vial acorta el tiempo de deteccin de los adenovirus hasta los tres das Existen una serie de mtodos serolgicos para detectar anticuerpos especficos frente al virus en la sangre del husped infectado, aunque son poco prcticos para llevar a cabo un diagnstico rpido de cara a la gestin clnica habitual. Sin embargo, el diagnstico serologico es de la mayor utilidad en los estudios de salud pblica.

miento para evitar el rechazo tras ser sometidos a trasplante, individuos afectados por la enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X). la reactivacin del VEB no puede ser mantenida bajo control y se desarrollan enfermedades como la leucoplaquia oral vellosa y el linfoma de clulas B. El VEB tambin est ligado al carcinoma nasofarngeo en asiticos y al linfoma de Burkitt en frica; aparentemente, el VEB acta como un iniciador en estas patologas, aunque son otros factores, como la coinfeccin o la desregulacin del sistema inmune, los que conducen, posteriormente, a la malignizacin.

Diagnstico serologico
Los linfocitos T citotxicos y los linfocitos apoptscos circulan p o r la sangre durante la enfermedad (Fisher. 1996): la linfocitosis atipica |>10% de linfocitos totales) tiene, relativamente, una ba|a sensibilidad c o m o criterio diagnstico de la MI causada por el VEB. aunque tiene una especificidad total de al m e n o s el 95%. El VEB puede ser cultivado en lneas celulares linfoblastoides, pero el aislamiento del virus no es un hecho que permita distinguir entre inleccion primana o infeccin por reactivacin. Las pruebas serolgicas constituyen el principal mtodo de laboratorio para el diagnstico de la MI (Schooley. 2000). La proliferacin policlonal de linfocitos B en la infeccin aguda por el VEB tiene c o m o consecuencia la generacin de diversos autoantcuerpos transitnos y generalmente inocuos, tales como IgM anti-i (aglutininas trias), factor reumatoide, y anticuerpo antinuclear. Quizs el tipo ms inusual de inmunoglobulinas producidas durante la MI sean los anticuerpos heterfilos de Paul-Bunnell. Estos anticuerpos, que pertenecen a la clase de las IgM, tienen afinidad por los erilrocitos de bvido. caballo y oveja, pero no estn dirigidos contra antgeno alguno del propio virus. Estos anticuerpos son, aparentemente, producidos de forma aleatoria c o m o consecuencia de la proliferacin policlonal de los linfocitos B. inducida por el VEB. y aparecen durante la primera semana de la enfermedad, disminuyen durante la fase de convalecencia y dejan de ser detectados, usualmente, entre tres y seis meses despus. Durante la enfermedad del suero y ocasionalmente en otras infecciones virales, se generan diferentes anticuerpos heterfilos; sin embargo, los anticuerpos de este tipo, con una fuerte afinidad por antgenos de los eritrocitos vacunos, que no es alterada por adsorcin con antgeno de rion de cobaya (test de la adsorcin diferencial), son especficos de una MI causada por el VEB. En algunas de las pruebas se mezcla directamente sobre un portaobjetos el suero del paciente con una suspensin del antigeno d e nn d e cobaya, y seguidamente se aade el antigeno de eritrocitos vacunos o equinos, que frecuentemente se encuentra adhendo a partculas de ltex; si es positiva, la aglutinacin aparece de forma casi inmediata si en el suero del paciente hay anticuerpos heterfilos. Los test de aglutinacin rpida, y sus modificaciones en fase slida, tienen una especificidad enlre el 80% y el 90%, con un porcentaje de falsos positivos m e n o r del 2% y un valor prediclivo positivo del 95% o supenor, por lo que son herramientas de gran valor en la atencin primaria (Rogers, 1999: Farhat, 1993: Lmderholm. 1994). Su principal limitacin es la sensibilidad, puesto que aun cuando los anticuerpos heterfilos estn presentes en ms del 80% de adolescentes y adultos este porcentaje baja hasta el 40% en el caso de nios pequeos con MI por VEB. A medida que la infeccin por VEB evoluciona desde la fase primaria a la de latencia, van expresndose varios antgenos virales, de tal forma que los anticuerpos especficos que se generan frente a los mismos son unos marcadores valiosos para determinar el estadio en el que se encuentra el proceso infeccioso. Los antgenos que se expresan tempranamente (EA) la ADN polimerasa y la timidma (cinasa) se sintetizan durante la fase aguda de la infeccin, durante la replicacin activa del virus, al igual que el antigeno proteico estructural (ACV) de la nucleocpsida del virus. Las IgM frente al ACV son un marcador sensible y espe-

MONONUCLEOSIS INFECCIOSA E INFECCIONES RELACIONADAS

La mononucleosis infecciosa (MI) es una enfermedad linfoproliferativa sistmica, bastante comn, que est causada por una inleccion primaria con el virus de Epstein-Barr (VEB), El VEB pertenece a la familia Herpesviridae y. al igual que el VHS. tiene una distribucin mundial, pudiendo infectar a la mayor parte de la poblacin. El VEB se disemina mediante la saliva contaminada: la infeccin primaria en la niez temprana es generalmente asinlomtica, pero si se retrasa hasta los aos de la adolescencia o la juventud adulta, entonces provoca, a menudo, la entidad clnica conocida como mononucleosis infecciosa. En EE.UU. se detectan unos 150.000 casos de MI anualmente (Schooley. 2000: Straus. 1993). El VEB infecta primero el epitelio farngeo, por lo que el dolor de garganta y la fiebre son los sntomas que se manifiestan tpicamente al inicio de la enfermedad. El VEB es fuertemente linfotrpico. unindose al receptor para el C3d (CD21) presente en la superficie de los Imfocitos B e iniciando una proliferacin policlonal blstica de clulas B. La respuesta de la inmunidad celular est mediada por las clulas NK y los linfocitos T-CD8 ctotxcos. que se encargan de destruir las clulas B infectadas, aunque estas clulas defensivas tambin contnbuyen a la patologa sistmica de la MI. Los linfocitos B infectados por el VEB se acumulan en los ganglios linfticos del cuerpo, y los linfocitos T cilotxicos infiltran las reas nodales interfoliculares, el bazo y el hgado y circulan como linfocitos atipicos en sangre perifrica (Strickler. 1993). A medida que los mecanismos celulares van controlando la replicacin del VEB, los sntomas de la MI disminuyen y la Imfadenopata, la esplenomegalia y la hepatitis remiten. Como otros herpesvirus, el VEB puede persistir en el husped en un estado latente. Un pequeo porcentaje de linfocitos B contienen en su ncleo ARN codificados por el VEB (EBER). asi como el antigeno nuclear del VEB (ANEB) y otro antgeno, la proteina latente de membrana (PLM), que mantienen el genoma durmiente del VEB en las clulas B transformadas; una excesiva proliferacin de las clulas B es controlada por los linfocitos T-CD8. La reactivacin asinlomtica del VEB es un hecho frecuente, y hasta un 20% de los adultos sanos liberan, espordicamente, un pequeo nmero de viriones completos, c o n capacidad infectiva, en su saliva. En individuos que se encuentran en una situacin de mmunodepresin (enlermos de sida, pacientes sometidos a trata-

Tabla 48-9 Perfiles s e r o l g i c o s e n las infecciones producidas por el virus. d e E p s t e l n - B arr Anticuerpos heterfilos (IgM)
Ausencia de infeccin Infeccin primaria silenciosa Mononucleosis infecciosa Infeccin primaria reciente Infeccin pasada remota Paciente inmunodeprimido con reactivacin reiterada

ACV (IgM) +/++ -/+

ACV (IgG) + + + + +

EA (IgG) + ++ + + ++

ANEB (IgG) + + + + ++

+/++ -/+

*h

+/-

ACV = antgeno de la capsida viral EA= antgeno que se expresa tempranamente, ANEB = antgeno nuclear del VEB.

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

clico de infeccin primaria por el VEB. A medida que la mononucleosis aguda va remitiendo, un pequeo porcentaje de linfocitos B infectados por el virus escapan a la destruccin mediada por las clulas T y albergan en estado de latericia el ADN del VEB en forma de un episoma circular; el ANEB (antgeno nuclear del VEB) es el responsable de la replcacin y supervivencia de dicho episoma. En consecuencia, las IgG trente al ANEB aparecen, tpicamente, despus de que la fase aguda de la enfermedad haya remitido Los patrones serolgicos que se detectan a lo largo de las diferentes fases de la infeccin por VEB se muestran en la Tabla 48-9. Los mtodos con anticuerpos fluorescentes (IFA) utilizan lneas de clulas linloblsticas. en las que la replcacin del VEB ha sido interrumpida en diferentes etapas, con objeto de caracterizar la expresin de antgenos especficos en cada una de ellas. Los tesl IFA tienen una buena sensibilidad y especificidad, aunque estn sujetos a una cierta subjetividad en lo referente a la interpretacin de resultados. Los enzimoinmunoensayos (EIA) que utilizan el antgeno ACV purificado u obtenido mediante tcnicas de ADN recombinante muestran una sensibilidad superior al 95% y una especificidad de casi el 100%. y adems tienen la ventaja de poderse llevar a cabo de forma automatizada, y de que la interpretacin de los resultados no est afectada por criterios subjetivos de ningn tipo (Tranchard, 1999; Chan. 1998). Muchos mdicos confian en la demostracin de linfocitos atpicos en sangre perifrica, en el rastreo rpido de anticuerpos heterfilos y en la deteccin de IgM e IgG frente al ACV para diagnosticar la MI. Los mtodos de referencia de deteccin cuantitativa de anticuerpos heterfilos en tubo, IgG anti-ANEB y anti-EA (antgenos que se expresan tempranamente), son de ejecucin ms compleja y tienen una menor aplicacin prctica.

cedimiento caro, que requiere ms tiempo para su realizacin que el diagnstico serologico. La deteccin de IgM frente al CMV mediante IFA se complica por el hecho de que las clulas infectadas por el CMV, utilizadas c o m o sustrato antignico, expresan tambin un receptor para el fragmento Fe de la molcula de inmunoglobulina; el test de la inmunofluorescencia anticomplementaria (ACIF) es ms complejo desde el punto de vista tcnico, pero reduce la aparicin de resultados falsamente positivos. Los enzimoinmunoensayos (ELISA) especficos para IgM tienen, en conjunto, una precisin comparable a la del ensayo ACIF-IFA para la deteccin de este mismo tipo de anticuerpos (Roseff. 1993: Schaefer. 1988: Smith. 1987; VanEnk, 1991). El VHH6 tambin es un virus linfotrpico que produce la roseola infantil (exantema sbito), una enfermedad exantemtica febril comn en nios pequeos (Pruksananonda, 1992; Braun. 1997). Pasada la infancia, la infeccin primaria puede producir mononucleosis (Akashi. 1993). La enfermedad aguda se puede diagnosticar mediante ensayos IFA y EIA especficos para IgM. y lambin por PCR, aunque en la actualidad estos mtodos an no estn disponibles comercialmente (Steeper, 1990: Sumiyoshi, 1993; Chiu. 1998). L a infeccin por VIH-1 puede producir un sndrome retroviral agudo q u e mimetiza. desde el punto de vista clnico, a la mononucleosis causada p o r el VEB (Kessler. 1987: Steeper. 1988). Hasta un 50% de pacientes desarrollan fiebre, linfadenopatia. linfocitosis atpica y, ocasionalmente, dao hepatocelular leve o meningoencefalitis (Fox. 1987). Los mtodos estndar de enzimoinmunoensayo especficos para el VIH son incapaces, por lo general, de d e t e c t a r anticuerpos especficos durante esta fase temprana de la infeccin, aunque la cuantificacin por RT-PCR de virus en suero da usualmente valores elevados (del orden de 10' copias/ml) (Henrard. 1994). A partir del segundo o tercer mes. las pruebas serolgicas (ELISA, inmunotransferencia electrofortica [Western immunoblottingj e IFA) dan sistemticamente resultados positivos en lo que respecta a la deteccin de anticuerpos anti-VIH especficos, al mismo tiempo que las manifestaciones asociadas a la infeccin aguda van remitiendo (Clark, 1991). La Figura 48-11 muestra el esquema general de trabajo para llevar a c a b o la evaluacin serolgica de un paciente que presente sntomas de una mononucleosis aguda. En cualquier caso, a pesar de la gran variedad de mtodos analticos disponibles para la identificacin de los agentes causales de mononucleosis, la etiologa no llega a ser determinada en el 5% al 10% de los casos.

Mononucleosis infecciosa heterfilo-negativa

Entre los pacientes que presentan las manifestaciones clnicas caractersticas de la MI, un 70% o ms dan positiva la prueba de anticuerpos heterfilos, lo que identifica al VEB como el agente causal de la enfermedad. Del 30% de enfermos restante, aproximadamente la mitad de ellos tienen IgM antiVCA, lo que tambin representa una evidencia de infeccin aguda por el VEB. Aproximadamente en un 15% de pacientes con un sndrome febril de MI linfoproliferativa, el agente etiolgico identificado es Toxoplasma gondii, o bien otros virus como CMV, el virus del herpes humano 6 (VHH6) o VIH; en el 5 % 10% restante de los casos no es posible determinar la etiologa. La toxoplasmosis se describe en el Captulo 55. La infeccin primaria por CMV adquirida durante la infancia es, a menudo, asinlomtica, mientras que en los adolescentes y en los adultos puede manifestarse como una enfermedad sistmica, febril y linfoproliferativa. El aislamiento del CMV de la orina o de la saliva no es de gran ayuda, ya que la reactivacin asintomtica del virus es bastante frecuente. La recuperacin del CMV a partir de sangre perifrica representa una alternativa diagnstica vlida por su sensibiliaad. pero es pro-

Sndrome de la fatiga crnica

En los ltimos 15 aos se ha prestado una considerable atencin, tanto en la prensa mdica especializada como en la no especializada, a una entidad clnica que se caracteriza por el hecho de que los pacientes alectados sufren una fatiga persistente incapacitante, acompaada, a menudo, de fiebre, faringitis, linfoadenopata suave, artralgias y mialgias (Holmes, 1988; Klonoff, 1992). En los pacientes sospechosos de padecer esta enfermedad, debe

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INFECCIONES VRICAS

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investigarse tambin la posibilidad de que existan tumores malignos ocultos, enfermedades endocrinas y dolencias psiquitricas, aunque las caractersticas clnicas de esta enfermedad sugieren, con gran fuerza, un origen infeccioso para la misma, En los estudios iniciales se propuso al VEB, tanto en infecciones primarias persistentes como reactivadas, como responsable del sndrome, ya que muchos pacientes tenan ttulos elevados de anticuerpos frente a los antgenos VCA y EA del virus de Epstein-Barr. Sin embargo, los ensayos serolgicos nunca fueron estandarizados y los resultados descritos no fueron reproducibles (Holmes. 1987). y la deteccin del VEB mediante tcnicas de cultivo a partir de saliva y de hibridacin in silu (HIS) en linlocitos circulantes no mostr diferencias entre pacientes con sndrome de fatiga crnica y poblacin control normal. Distintos estudios han implicado a otros agentes infecciosos como CMV, VHH6, VLHT (virus de la leucemia humana de clulas T), e incluso Toxoplasma gondii. aunque no existe consenso sobre la etiologa de la enfermedad (Gold, 1990). Las pruebas inmunolgicas y serolgicas no son de ayuda para el diagnstico o la prognosis. En resumen, el sndrome de la latiga crnica sigue estando definido por los sntomas clnicos ms que por los resultados de las pruebas de laboratorio (Lloyd. 1998).

por CMV en la madre se manifiesta como una viremia que se extiende hematgenamente al feto por va transplacentaria. y que comporta el nesgo ms elevado de provocar daos graves en los tejidos leales. La reactivacin del CMV en la madre conlleva que el virus pueda atravesar la placenta, aunque las IgG anli-CMV de la madre ejercen un cierto efecto protector; en este caso, estos nios son, por lo general, asintomticos. aunque entre un 5% y un 15% de ellos pueden desarrollar una prdida sensorial auditiva o tener problemas de desarrollo neuronal (Istas. 1995: Lazzarotta, 1998). La deteccin del CMV a partir del liquido amnitico mediante PCR junto con el aislamiento del virus por cultivo son los mtodos ms seguros para el diagnstico prenatal (Hagay. 1996; Lazzarotta, 1998). La recuperacin del CMV mediante cultivo o PCR a partir de la orina, saliva, lquido cefalorraqudeo o sangre del recin nacido tambin es una alternativa diagnstica de gran sensibilidad, aunque los especmenes deben obtenerse dentro de las tres semanas siguientes al nacimiento para evitar confusiones con una posible infeccin posnatal (Warren. 1992: Nelson. 1995). La presencia de IgM frente al CMV en muestras de sangre tomadas del cordn umbilical, intrautennamente o en el momento del parto, posee valor diagnstico, aunque tiene un porcentaje del 30% de falsos negativos (Fowler. 1992). La visualizacin de las tpicas inclusiones nucleares producidas por el CMV en frotis otolgicos preparados a partir de orina tiene carcter especfico, aunque es una aproximacin diagnstica que tiene muy poca sensibilidad; incluso las muestras obtenidas mediante autopsia pueden poseer muy pocas clulas apropiadas para el diagnstico si la necrosis tisular est muy avanzada

INFECCIONES VRICAS CONGNITAS Y PERINATALES

El tero de la mujer embarazada es un entorno estril y aislado que protege al feto de la agresin de los microorganismos extemos. La mayor parte de infecciones durante el embarazo son provocadas por las bacterias que se encuentran en la vagina, y que ascienden a travs de una barrera cervical defectuosa, aunque las infecciones maternas pueden alcanzar al feto por el torrente circulatorio a travs de la placenta, o bien afectar directamente al nio en el m o m e n t o del parto vaginal. Algunos ejemplos de infecciones perinatales son la toxoplasmosis (vase Cap. 55), las causadas por diversos virus, como el de la rubola, CMV, VHS. VIH, parvovirus. enterovirus, y por bacterias como Treponema paldum (vase Cap. 52). Muchas de las infecciones maternales son silenciosas o producen sntomas leves solamente: sin embargo, el sistema inmunolgico inmaduro del leto es incapaz de desarrollar una respuesta celular o humoral eticaz, por lo q u e la necrosis tisular puede ser m u y grave o incluso fatal.

Rubola
El virus de la rubola (sarampin alemn) produce fiebre suave y una erupcin cutnea transitoria en nios y adultos. El virus circula por la sangre, incluso en los casos leves, y la diseminacin transplacentaria de la viremia durante el primer trimestre del embarazo provoca gravsimas maltormaciones cardacas, oculares y cerebrales en el feto (Schluter, 1998). El sndrome congnito de la rubola es raro en la actualidad, debido a las eficaces campaas de vacunacin peditrica y a los programas sistemticos de revisin prenatal (Miller, 1984). Cuando se sospecha un caso de rubola aguda en una mujer emDarazada. el mtodo ms sencillo para el diagnstico es el anlisis del suero de la madre para detectar IgM especificas frente al virus, mediante enzimonmunoensayo o IFA. El aislamiento del virus en cultivos de tejidos es una tcnica compleja que requiere mucho tiempo para su ejecucin, por lo que no se realiza de forma ordinaria en la mayor parte de laboratorios clnicos. La deteccin del ARN del virus de la rubola a partir de liquido amnitico mediante RT-PCR tiene un 100% de sensibilidad y especificidad, pudindose llevar a cabo tambin con muestras de placenta o de tejidos procedentes de autopsias (Revello. 1997). Los recin nacidos infectados congenitamente liberan, a menudo, el virus durante muchos meses e incluso aos.

El diagnstico de las infecciones perinatales se centra en dos aspectos: identificacin de la infeccin aguda en la madre (en particular, la infeccin primaria) y verificacin de que el feto o el recin nacido est implicado. La mejor forma de establecer la infeccin materna es mediante el aislamiento del microorganismo sospechoso, aunque para ciertos agentes infecciosos esto es poco prctico o imposible de llevar a cabo y, en consecuencia, la deteccin de IgM especificas, aunque imperfecto, sigue siendo el mtodo diagnstico ms aceptado. La infeccin en la madre atraviesa la placenta para alectar al feto entre el 30% y el 60% de los casos. La ecografia puede detectar el dao en los rganos del feto (p. ej., microcalcificaciones. microcefalia, hidrocefalia, organomegalia, hidropesa), aunque para probar que existe infeccin fetal es necesario aislar el microorganismo mediante cultivo, demostrar la presencia de antigenos o secuencias de cidos Virus del herpes simple nucleicos del mismo en la sangre o en tejidos del feto, o detectar la existencia de La infeccin genital primaria por el VHS durante el embarazo conlleva un anticuerpos especficos. En la Tabla 48-10 se muestra una seleccin de mtodos riesgo elevado de corioamnionitis herptica ascendente que puede conducir para el diagnstico de las infecciones perinatales y congnitas ms comunes. a un aborto espontneo, alumbramiento prematuro y a la exposicin del nio durante el parto vaginal por contacto mucocutneo (Brown, 1987). La infecAun cuando la monitonzacin de todas las mujeres embarazadas en busca de cin genital primaria por el VHS. ms que las infecciones recurrentes, implica anticuerpos frente al virus de la rubola es, en la actualidad, una prctica habiun grave peligro para el nio por dos razones: la carga viral en la madre y el tual de atencin primana. la realizacin de pruebas para detectar anticuerpos nmero total de lesiones son normalmente mayores durante la infeccin prifrente a Toxoplasma gondii. VHS y CMV no est establecida. En particular, los maria y, por otro lado, aunque el suero de la madre tiene IgM especficas, premtodos serolgicos para IgM pueden exhibir una gran variabilidad intra e intersenta pocas (o incluso carece de ellas) IgG que puedan ejercer un electo prolaboratorio, con errores debidos a falsos negativos y posilivos: los ensayos para tector transplacentario en el lelo (Prober, 1987). IgG por si solos no son capaces de diferenciar entre infeccin materna primaria y recurrente o latente, y no pueden predecir que el feto est implicado. La mayor parte de los nios tienen una presentacin ceflica durante el parto,

Citomegalovirus
El CMV es la causa ms frecuente de infeccin intrautenna y afecta aproxim a d a m e n t e a un 1% de los recin nacidos vivos en EE.UU. Alrededor de un 90% de estos nios son asintomticos en el momento del nacimiento; el aislamiento del virus a partir de la orina o de la saliva o la deteccin de IgM especficas pueden ser los nicos indicadores de infeccin congnita. Sin embargo, el restante 10% de individuos sintomticos presenta ictericia junto con hepatoesplenomegalia y pancitopenias: aproximadamente un 10% muere y el resto queda con secuelas neurolgicas durante mucho tiempo. La infeccin primaria

por lo que el cuero cabelludo y la cara s o n las partes del cuerpo del feto q u e primero entran en contacto con el VHS durante el trnsito por el tracto genital de la madre; otras zonas que tambin quedan expuestas con bastante frecuencia a la infeccin por el virus son el pecho y las nalgas, especialmente durante el parto de nalgas. Las vesculas se desarrollan en todas aquellas localizaciones de l a piel y las mucosas donde ha tenido lugar la inoculacin directa con el virus. Puesto que el sistema inmunitario del recin nacido est todava relativamente inmaduro, el nico recurso que el nio tiene para alterar el curso de la infeccin es la IgG de la madre frente al VHS; cuando esta proteccin pasiva est ausente, tiene lugar de forma incontrolada tanto la replicacin del virus c o m o su disem-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA tis de Tzanck o las tcnicas para la deteccin de antgenos dan resultados positivos a partir de las lesiones vesiculares, aunque no son lo suficientemente sensibles como para reemplazar al diagnstico por cultivo (que ahora est disponible en muchos laboratorios y permite obtener resultados positivos en 24 horas, en especial si se utilizan los cultivos en shell-viat). La tcnica de la PCR puede identificar el ADN del VHS en el suero del neonato o en el liquido cefalorraqudeo con una sensibilidad mayor de la que tiene el cultivo, aunque en ocasiones no es posible utilizar este procedimiento diagnstico en el momento preciso, lo que limita su utilidad (Kimura. 1991: Kimberlin. 1996)

nacin a diferentes rganos (Whitley, 1988). Las lesiones que aparecen en la conjuntiva, en la mucosa oral y en la piel son, generalmente, reas en virus: si se produce la diseminacin, virtuaimente cualquier rgano puede resultar infectado. Hoy en da, en plena era del herpes genital, todava existe cierta controversia sobre cul debe ser la estrategia ms adecuada que debe utilizarse en el parto, aunque algunos esludios al respecto merecen ser destacados. El aislamiento mediante cultivo, realizado de forma sistemtica a partir de todas las madres o nios en el momento en que se inicia el parto y en el de dar a luz. tiene un rendimiento bajsimo (0.2%) y, en consecuencia, no es un mtodo recomendado (Prober, 1988). Los cultivos de control del VHS a partir de mujeres embarazadas con un historial de herpes genital recurrente tampoco pueden predecir qu madres liberarn el virus en el momento del parto (Arvin, 1986). Estudios realizados con mujeres que han experimentado su primer episodio, reconocido clnicamente, de herpes genital durante el embarazo han demostrado que tan slo una mitad, aproximadamente, de estas mujeres haban tenido un verdadero herpes genital, aunque estas madres expenmentaron complicaciones (amnionitis herptica, parto prematuro e infecciones neonatales graves) m u y frecuentemente. En las mujeres con infecciones recurrentes se detectaron infecciones neonatales con mucha menor frecuencia, que quedaron confinadas a las superficies mucocutneas, sin diseminacin visceral (Brown, 1987,1991). Es una prctica aceptada que las mujeres que estn de parto y tienen lesiones genitales que hacen sospechar la existencia de un herpes deben ser sometidas a una cesrea para prevenir una posible exposicin del nio al virus. Aquellas mujeres que tienen un historial previo de herpes genital recurrente pueden dar a luz por va vaginal siempre que no se delecten lesiones activas, aunque en este caso se recomienda que se lleve a cabo un control cuidadoso de los recin nacidos, incluyendo cultivos del VHS a partir de la conjuntiva, mucosa oral y cualquier lesin cutnea sospechosa. La infeccin neonatal por el VHS puede permanecer silenciosa durante varios das antes de que la enfermedad se manilieste clnicamente A pesar de la terapia antivrica, la inleccin generalizada es. con frecuencia, mortal; aquellos nios que tienen la infeccin confinada en el sistema nervioso central pueden sobrevivir, aunque con un grave retraso mental permanente. El diagnstico de laboratorio de la infeccin por el VHS fue descrito previamente en otra seccin de este capitulo. Las pruebas rpidas como los fro-

Virus de la inmunodeficiencia humana, parvovirus, enterovirus

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) puede diseminarse hematgenamente al feto, actuando como reservono del virus los trofoblastos de la placenta y los macrfagos de Hofbauer. Sin embargo, aproximadamente un 75% de las infecciones pernatales se contraen en el momento del parto, al entrar en contacto el feto con la sangre materna infectada El nesgo de infeccin pennatal por VIH oscila entre el 1 3 % y el 45%, dependiendo de la carga viral (VIH-1) en la madre, aunque el porcentaje de transmisin baja hasta un 8% si se administra cidovudina a la madre durante el embarazo y el parto. El parto por cesrea y el tratamiento con cidovudina reducen el riesgo de contagio por debaio del 1% Connor, 1994; Sperling, 1996). El diagnstico de la infeccin por VIH en la madre es sencillo (determinacin mediante enzimoinmunoensayo de anticuerpos frente al VIH y posterior confirmacin de los resultados por medio de inmunotranslerencia electrolortica Western immunoblottingj o IFA), y a todas las madres positivas se les debe administrar tratamiento profilctico. Las inmunoglobulinas maternas pasan a travs de la placenta y permanecen en la sangre del nio hasta 15 meses; por tanto, los mtodos estndar de ELISA no pueden ser utilizados para diagnosticar la infeccin neonatal. Las modificaciones del enzimoinmunoensayo o de la inmunotransferencia electrolortica, encaminadas a la deteccin de IgM o IgA (ninguna de estas molculas de anticuerpos pueden ser transferidas d e forma pasiva al feto y, por tanto, si estn presentes en el suero, slo puede ser debido a que el nio las haya producido), podran permitir el diagnostico de la

Tabla 48-10 Mtodos de laboratorio para el diagnstico de las infecciones virales congnitas y perinatales*
' i ni

ni

A g e n t e pagteno CMV

Serologia materna EIA o ACIF para IgM

Cultivo, deteccin de antgenos. PCR Cultivo de CMV. sangre de la madre Cultivo de CMV orina, saliva, sangre, tejidos (del recin nacido, primeras tres semanas) PCR para CMV liquido amnitico, saliva, orina, LCR (del recin nacido, primeras tres semanas) Deteccin de inclusiones nucleares del CMV tejidos Cultivo de virus de la rubola: orina RT-PCR para virus de la rubola liquido amnitico. glbulos blancos letales, tejidos Cultivo de VHS conjuntiva, mucosa oral, piel, LCR. tejidos (del neonato) PCR para VHS: LCR. sangre (del neonato) Deteccin de inclusiones nucleares del VHS te|idos, piel Cuantificacin de VIH (RT-PCR o bADN). PCR del ADN del VIH (en el recin nacido), deteccin del antigeno p24 (en el recin nacido) RT-PCR para enterovirus LCR y sangre (del neonato) Cultivo de enterovirus: sangre. LCR. tejidos, heces, hisopados de garganta (del neonato) Visualizacin de inclusiones nucleares del virus HIS para PB19 en entroblastos ADN del PB19 (a partir de sangre) PCR para el ADN del PB19: plcenla, tejidos leales, sangre

Serologia del feto o del recin nacido EIA o ACIF para IGM

Rubola

EIA o IFA para IgM

EIA o IFA para IgM

VHS

EIA para IgM frente a VHS1 y VHS2 EIA o WB para el VIH; ensayos cuantitativos (HT-PCR o bADN)

EIA o IFA para IgM

VIH

EIA para IgM e IgA, WB Monitorizar VIH mediante EIA para comprobar serorreversin

Enterovirus

Parvovirus E 19

EIA o IFA para IgM frente al PB19: PCR para el ADN del PB19

EIA para IgM'

"Se recomienda eliminai las IgG y el lactor reumaloide antes de llevar a cabo la determinacin de IgM para ovilar los errores debidos a lalsos negativos 'Mtodos de investigacin y de laboratorios de referencia. EIA = enzimoinmunoensayo. ACIF = inmunolluorescencia anticomplementaria; PCR = reaccin en cadena de la pdimerasa LCR * liquido cefalorraqudeo. R T P C R reaccin en cadena de la polimerasa de la iransciiptasa reversa VIH = virus de la inmunodeficiencia humana. bADN = ensayo de ADN ramificado. W B = Western blotting (inmunotransferencia electrolortica). IFA = ensayo de inmunofluorescencia indirecta; PBI9 = parvovirus B19. HIS = hibridacin in sitir. para ver el signilicado de otras abreviaturas, consltense las Tablas 48-3 y 48-4.
k ,
J

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INFECCIONES VRICAS

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infeccin pernalal con una gran precisin; sin embargo, la sensibilidad de estos mtodos depende de la edad del paciente, y son poco fiables durante los tres primeros meses despus del nacimiento (Quinn. 1991). La deteccin del antgeno p24 del VIH tiene una sensibilidad subptima durante el periodo inmediatamente posterior al nacimienlo (Burgard. 1992; Miles. 1993: Sisn. 1992). El ensayo de la PCR para el ADN del VIH detecta el genoma vrico que ha sido transcrito e integrado en las clulas linfoides circulantes y tiene una sensibilidad de casi un 100% al mes de edad (Rogers. 1989). debido a la tpica estabilidad del ADN, este ensayo es vlido incluso cuando se lleva a cabo a padir de especmenes de sangre seca. L a RT-PCR se utiliza para el control cuantitativo de aquellos nios con diagnstico positivo de infeccin que estn recibiendo una terapia antirretroviral combinada. El parvovirus B19 (PB19) produce un tipo de exantema infantil, benigno y autolimitado, denominado eritema infeccioso (en ocasiones denominado "quinta enfermedad" o exantema escolar). Aproximadamente un 50% de mujeres jvenes son seronegativas para esta enfermedad. La infeccin durante el embarazo conlleva un riesgo de infecciones fetales del 25%; las estimaciones de muerte fetal oscilan entre el 2% y el 38% (Alder. 1993). El PB19 tiene como diana las clulas inmaduras del linaje eritrocitano. y la citotoxicidad virolitica causa anem i a y provoca hidropesa fetal (Anand, 1987; Gratacos. 1995). Los eritroblastos infectados exhiben una inclusiones nucleares caractersticas que recuerdan a vidrio molido. Los parvovirus slo han podido cultivarse en suspensiones de mdula sea humana que contengan clulas precursoras eritrocitarias. L a infeccin aguda se diagnostica mediante la deteccin de IgM especficas en la sangre de la madre o del feto, hibridacin in silu o amplificacin del ADN viral por PCR en muestras de lquido amnitico o de sangre del cordn umbilical (Erdman, 1991; Bruu, 1995: Zerbini, 1996). La infeccin por enterovirus es muy habitual en la poblacin en general, con ms de 10 millones de casos detectados anualmente en EE.UU. La infeccin de la madre en un momento prximo al parto puede provocar la diseminacin del virus a travs de la plcenla y alcanzar el feto, sin que exista al mismo tiempo una transferencia de IgG neutralizantes de la madre. El nio nace, entonces, con el virus diseminado por las visceras, pero sin anticuerpos que puedan modificar el curso de la infeccin. Algunos virus ECHO y Coxsackie A yBs e han asociado con infecciones de la madre en el ltimo trimestre de embarazo y del feto dentro del tero materno o en el momento del parto; se han registrado brotes nosocomiales en los que el virus ha sido transmitido por el personal sanitario. El virus ECHO 11 es particularmente virulento, causando necrosis hepatocelular y meningoencefalitis. Generalmente, la infeccin perinatal debida a otros enterovirus es benigna. Los virus ECHO crecen bien en cultivos de tejidos en tubos estndar y en tubos shell-vial (utilizando las lneas celulares PMK. HDF y RD [cultivos celulares de rabdomiosarcoma]): los tipos de especmenes empleados para el cultivo incluyen sangre del neonato, liquido cefalorraqudeo, hisopados rectales y de garganta o tejidos (en casos de muerte). La tipificacin de los enterovirus puede realizarse en laboratorios de referencia nacionales o locales (Modn, 1986).

nostico en estos casos. El virus que se aisla con m a y o r frecuencia en los casos de encefalitis es el VHS. como consecuencia de una reactivacin del VHS1 latente que se extiende (a travs de los nervios craneales, trigmino y olfativo) hasta el crtex cerebral, produciendo una masa de tejido necrosado que ocupa una cierta extensin. Anualmente se detectan unos 700 casos, con un patrn espordico no ligado a cambios estacionales. La progresin de la enfermedad es muy rpida y la mortalidad elevada, aunque un diagnostico rpido y el tratamiento con aciclovir reduce tanto la mortalidad c o m o el grado de incapacidad permanente (Whitley, 1995; Mitchell. 1997). Los mosquitos son los vectores de cientos de virus neurotrpicos en el mundo, pero slo cuatro arbovirus (de arthropod borne, transmitidos p o r artrpodos) son encontrados de forma regular en EE.UU.: el virus de la encefalitis equina oriental, de la encefalitis equina occidental, de la encefalitis de San Luis y el virus Calilomia-LaCrosse. El nmero total de casos vara desde unos 1 0 0 hasta ms de 2.000 en aos de epidemia. La gravedad y mortalidad son ms elevadas en el caso del virus de la encefalitis equina oriental, que es el m e n o s frecuente dentro del grupo (Calisher. 1994). La informacin actualmente disponible sobre la actividad global de los arbovirus y los riesgos para los viajeros est disponible a travs de los Centros para el Control y Prevencin de Enfermedades en la siguiente direccin: wvvw.cdc.gov/travel. Diversos enterovirus. especialmente los virus Coxsackie y ECHO, producen encefalitis ocasionalmente; la poliomielitis (causada por el poliovirus, que produce una necrosis de la mdula espinal y de las neuronas motoras cerebrales) ha sido eliminada en EE.UU. y en la mayor parte del mundo. El virus de la rabia se desplaza hasta alcanzar el SNC a travs de las fibras nerviosas, produciendo lesiones necrticas en el cerebro (Smith, 1999). Raramente se detectan complicaciones del tipo de la encefalitis en otras enfermedades virales c o m o el sarampin, la parotiditis, la MI por VEB y la varicela (Kennedy. 1991): el VHH6 tambin causa encefalitis focal (McCullers, 1995). La demencia en las fases avanzadas del sida est causada, a menudo, por una replicacn progresiva del VIH en las clulas ghales del SNC (Atwood. 1993). En los pacientes inmunocompromelidos tambin se producen infecciones necrotizantes por VHS, CMV y WZ, asi c o m o destruccin de la oligodendroglia por papovavirus JC. Cerca del 75% de los casos de meningitis vrica en EE.UU. estn causados por enterovirus, que tpicamente siguen un curso benigno. La meningoencefalitis crnica grave puede manifestarse en nios con hipogammaglobuImemia, y cualquier infeccin del SNC por enterovirus. con un componente de encefalitis, es ms virulenta y tiene riesgo de dejar secuelas permanentes. Los enterovirus se transmiten fcilmente de persona a persona por va orofecal, existiendo una variacin estacional, con brotes anuales durante el

Tabla 48-11

Virus a s o c i a d o s c o n e n f e r m e d a d e s d e l sistema nervioso central

Causas frecuentes Causas menos frecuentes

Sndrome

Meningitis asptica

ENCEFALITIS Y MENINGITIS VRICA

Las infecciones virales del sistema nervioso central son relativamente infrecuentes, aunque la morbilidad y mortalidad asociadas a las mismas son considerablemente altas. El diagnstico de laboratorio es importante para que los hospitales puedan organizar eficientemente el tratamiento de los pacientes y para que los organismos pblicos responsables lleven a cabo el control de los insectos que son vectores para los arbovrus. La proliferacin de los virus en las membranas menngeas que rodean el cerebro provoca una inflamacin aguda que cursa con fiebre, dolor de cabeza, rigidez de nuca y pleocitosis en el lquido cefalorraqudeo. En la encefalitis, la replicacn del virus tiene lugar en el parnquima cerebral: la inflamacin y la necrosis de los tejidos puede ser difusa o puede dar lugar a una lesin espacialmente definida y masiva. Muchos virus estn asociados con cada una de las dos patologas (meningitis y encefalitis), aunque el dao puede solaparse implicando a ambas localizaciones anatmicas (meningoencefalitis) (Tabla 48-11). La encefalitis es una enfermedad relativamente poco frecuente en EEUU registrndose unos 2.000 casos anuales, aproximadamente El diagnstico preciso est limitado por el hecho de que algunos virus neurotrpicos son delicados, siendo necesario el empleo de tcnicas moleculares par? realizar el diag-

Enterovirus VIH Parotiditis

Parlisis Encefalitis

Enterovirus Allavirus Flavivirus Bunyavirus VHS Parotiditis Sarampin VIH Enterovirus

VHS CML WZ Hepatitis B Poliovirus Sarampin Poliovirus Rubola Rabia Hepatitis B Adenovirus CML VVZ VRS Vacuna influenza CMV

Sndrome de Guillain-Barr Sndrome de Reye

HIV = virus de la mmunodeficien linfocitica. para ver el significadc 48-3 y 48-4

VEB CMV Inlluenza A y B VVZ

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

9 1

y 2

i)

i)

'
8

9 9

0 0

MESES/AOS

Figura 48-12. Variacin estacional en el aislamiento de enterovirus (Lutheran General Hospital. P a r k Ridge. IL) verano-otoo (Figura 48-12). Las infecciones por los virus de las parotiditis, sarampin y adenovirus raramente se complican con una meningitis aguda. Las infecciones agudas por el VIH producen ocasionalmente una inflamacin menngea aguda (Fox, 1987). Aproximadamente en un 1% de infecciones primarias de herpes genital por VHS2 se manifiesta una meningitis transitoria asociada: el VHS2 es la principal causa de la denominada meningitis linfoctica benigna recurrente de Mollaret. (diferentes combinaciones de clulas PMK, HDF, HEp-2, RD y de mono verde Buffalo) permite el crecimiento de muchos enterovirus y de otros virus (VHS, VVZ, sarampin, parotiditis y adenovirus). Si se intenta llevar a cabo el aislamiento de virus, se debe inocular sin demora alguna un volumen de 0.1 mi a 0,2 mi en los cultivos celulares en tubo estndar o en tubo shell-vial. Los ECP inducidos por los enterovirus comienzan c o m o un cambio picnlico focal, con clulas aisladas que comienzan a redondearse y que rpidamente se extienden por la monocapa del cultivo celular (Fig. 48-13). El ECP es detectable al cabo de unos cuatro das hasta en el 69% de los cultivos positivos. La tipificacin de enterovirus puede realizarse en los laboratorios de salud pblica. En la Figura 48-14 se muestra un esquema de trabajo para el diagnstico de laboratorio de las infecciones vricas del SNC. Esta aproximacin experimental mejora el rendimiento del diagnstico y favorece un uso eficiente de los recursos de los laboratorios, especialmente en lo relativo a la identificacin d e las infecciones del SNC asociadas a los artrpodos. Un brote inesperado de encefalitis por el virus West Nile fue delectado rpidamente gracias a los esfuerzos combinados de los laboratorios hospitalarios y gubernamentales (MMWR, 1999).

Diagnstico de laboratorio
El mtodo ms sencillo y sensible para diagnosticar la encefalitis viral es la amplificacin del cido nucleico del virus a partir de una muestra de LCR. La identificacin de enterovirus por RT-PCR y de VHS, VVZ, VEB. CMV y HHV6 mediante PCR es una alternativa diagnstica ms sensible que la basada en el aislamiento en cultivo de los virus responsables, tanto de LCR como de tejido cerebral; se han desarrollado algunos sistemas comerciales para la identificacin por PCR del VHS (Tang, 1998, 1999a). Se recomienda llevar a cabo un examen del LCR para detectar la presencia de protenas, as como un recuento de clulas, puesto que los herpesvirus raramente son identificados cuando ambos parmetros son normales en el LCR (Tang, 1999b). Ocasionalmente puede realizarse una biopsia de cerebro, si existen sospechas clnicas de un posible tumor o una infeccin no viral. Una biopsia de un tamao de 0,5 cm es ms que suficiente para llevar a cabo el estudio anatomopatolgico. realizar extensiones citolgicas para el examen directo, el anlisis por PCR y el cultivo pormenorizado de los posibles agentes infecciosos. La obtencin del espcimen se describe en el Captulo 57. La recuperacin del VHS mediante cultivo celular se ha descrito con anterioridad en otra seccin de este mismo captulo; lambin debe intentarse el aislamiento de otros virus, y la muestra debe ser inoculada en todas las lneas celulares disponibles en el laboratorio. Las extensiones teidas mediante Giemsa o FDA pueden poner de manifiesto la existencia de inclusiones nucleares herpticas o de antgenos virales especficos. Muchos arbovirus y algunos enterovirus han de ser inoculados en animales de laboratorio para poder replicarse; si es necesario, la muestra de tejido puede congelarse a -70'C y enviarse a un laboratorio de referencia.
3

Los enterovirus son el agente infeccioso ms comn en la meningitis asptica aguda: la RT-PCR se ha convertido en la tcnica idnea para la identificacin de enterovirus en LCR, con unos rendimientos del 128% al 142% cuando se compara con el aislamiento mediante cultivo celular (Rotbar, 1994, 1997; Kessler, 1997). Se necesitan entre 10 pl y 100 ul de LCR para la RT-PCR; los formatos simplificados de las pruebas de microtitulacin han permitido acortar el tiempo de espera a 6 horas. El cultivo del LCR con la inoculacin de varias lneas celulares

Figura 48-13. M o n o c a p a de un cultivo de tejidos de clulas A549 d o n d e aparecen los ECP causados p o r la multiplicacin de un enterovirus ECHO (aumento: x 200; microscopia de contraste de fases).

CAPTULO 48

INFECCIONES VRICAS

1063

Figura 48-14. Esquema del prolocolo para el diagnstico de la meningoencefalitis viral.

EXANTEMAS VIRALES
Varios tipos de virus atacan primariamente la piel: algunos infectan la epidermis escamosa directamente (herpes oral y genital, verrugas causadas por papilomavirus humanos o el molluscum conlagiosum provocado por poxvirus). pero la mayoria de los exantemas son debidos a virus que afectan la piel y las membranas mucosas por diseminacin hematgena (VVZ, sarampin, rubola, enlerovirus. parvovirus. VHH6) (Cherry, 1993). La mayor parte de estas infecciones son relativamente benignas y tpicas de la infancia, que se diagnostican clnicamente, sin necesidad de pruebas de laboratorio; sin embargo, el aislamiento del virus por cultivo, la identificacin de antgenos virales o la confirmacin por mtodos serolgicos pueden ser de utilidad a la hora de elegir la terapia antiviral, delimitar la extensin de la enfermedad en los casos graves o aplicar medidas de control de la infeccin en los pacientes hospitalizados. Los procedimientos diagnsticos de laboratorio se resumen en la Tabla 48-12. El VVZ causa la varicela y el zster. En la varicela, el VVZ se disemina mediante gottas de lquido infectadas en aerosoles que son inhalados, se multiplica en la nasofaringe y seguidamente penetra en el torrente circulatorio, por donde circula hasta alcanzar la piel (Weller, 1992). La replicacin del virus en el epitelio escamoso da lugar a la aparicin de unas vesculas pruriginosas que rpidamente se transforman en lceras que eventualmente se recubren con una costra y curan sin dejar cicatriz. En los nios, los sntomas sstmicos son suaves y las secuelas son raras: en los adultos, mujeres embarazadas, neonatos y pacientes inmunocomprometidos, la enfermedad puede ser ms grave, con neumona y afectacin visceral adems de las tpicas lesiones en la piel (Gershon, 1976), Una vez que la varicela ha remitido, la infeccin por el VVZ se mantiene latente en los ganglios sensitivos neuronales (Mahalingham, 1991; Straus. 1989); con la reactivacin, el VVZ se extiende desde las races de los ganglios trigminos o dorsales hasta alcanzar nuevamente la piel, donde origina unas vesculas cutneas dolorosas. con una distribucin en dermatoma (zster). El zster es ms frecuente en ancianos y en pacientes francamente inmunocomprometidos; cuando aparece en adolescentes y adultos jvenes, puede ser indicativo de una infeccin subyacente por el VIH (Pana, 1994)

El liquido de las vesculas es rico en virus, siendo el espcimen ideal para el aislamiento por cultivo y la tincin DFA. Las clulas HDF permiten el crecimiento del VVZ. El cultivo en tubos tradicionales es un mtodo lento y de p o c a sensibilidad, pero si se utilizan tubos shell-vial para el cultivo, aumenta el rendimiento (hasta un 75%) y la rapidez en la deteccin (Brinker. 1993). L a recogida de muestras a partir de las lesiones de la piel sospechosas de estar producidas por el VZZ se lleva a cabo de la misma forma que en el caso de las vesculas causadas por el VHS. De igual modo, el protocolo para el cultivo del V V Z es similar al que se sigue para el VHS (Fig. 48-3); sin embargo, los cultivos estndar en tubo se incuban durante dos semanas y las monocapas de clulas en los tubos shell-vial se tien a los tres y cinco das con la tcnica DFA, utilizando un conjugado para el WZ. L o s ECP causados por el WZ aparecen c o m o pequeos parches de clulas redondeadas, hinchadas y retrctiles en la monocapa de fibroblastos, y son semejantes a los que aparecen como consecuencia de la proliferacin del CMV. Debido a que la conducta del VVZ en los cultivos de tejidos es algo problemtica, la tincin DFA de las clulas presentes en las vesculas para detectar los antgenos virales es el mtodo diagnstico ms rpido y sensible (Schrim, 1989). De los aproximadamente 70 serotipos de enterovirus. varios son capaces de producir erupciones vesiculares o maculopapulares generalizadas (Coxsackie B1 y A9, y virus ECHO 2, 4. 9,11,19 y 33). habitualmente durante los meses clidos. La enfermedad de mano, pie y boca (causada pnncipalmente por el virus Coxsackie A16) es tpica de nios pequeos, y se manifiesta con la aparicin de vesculas en la lengua y en la piel de la palma de las manos y la planta del pie. Los miembros adultos de la familia del nio infectado tambin pueden desarrollar, ocasionalmente, la enfermedad con los sntomas caractersticos. El diagnstico de laboratorio est limitado a la recuperacin del virus en cultivos celulares: la piel que recubre las vesculas, especialmente las de la palma de la mano y planta del pie. debe levantarse completamente para dejar expuestas las clulas escamosas, que deben recogerse frotando enrgicamente con un hisopo. Las infecciones por enterovirus tambin afectan al tracto gastrointestinal, por lo que el material recogido con hisopo de la garganta y el recto es apropiado para llevar a cabo el cultivo. La identificacin de enterovirus en cultivos celulares ha sido descrito en una seccin anterior de este capitulo. Ni la tincin

Tabla 48-12

Diagnostico d e laboratorio de las e n f e r m e d a d e s e x a n t e m t i c a s vricas c o m u n e s Exantema Virus Varicela-zster Cultivo/Deteccin de antigenos Preparacin de Tzanck Extensin para DFA* Cultivo (mayor sensiblidad en tubos s/tell-vial) Cultivo* Cultivo Cultivo de interferencia' HIS en eritroblastos infectados PCR Co-cullivo en linfoblastos* Cultivo* Frotis para tincin DFA
+

Serologia EIA o IFA (varicela) para IgM

Vancela/zsler

Erupcin cutnea por enterovirus (enfermedad de mano, pie y boca) Sarampin Rubola Eritema infeccioso Exantema sbito VHS

Enterovirus Sarampin Rubola Parvovirus B19 VHH6 VHS1 y VHS2

EIA o IFA para IgM" EIA para IgM" EIA o IFA para lgM
:

EIA para IgM'

'Mtodo recomendado 'Mtodos utilizados en los laboratorios de investigacin y/o referencia VHH = herpesvirus humano; para ver el significado de otras abreviaturas, consltense las Tablas 48-3 hasta la 48-6

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

DFA ni la serologa tienen utilidad para el diagnstico de los exantemas producidos por enterovirus (Cherry, 1963,1993; DeChamps, 1988). El sarampin es una enfermedad viral altamente contagiosa que tiene sntomas sistmicos y respiratorios (liebre, conjuntivitis, coriza, lesiones orales, tos y una erupcin cutnea eritematosa y maculopapular generalizada) (Bellini, 1994). La vacunacin ha reducido en gran medida la incidencia del sarampin en EE.UU., pero la enfermedad contina siendo un grave problema en pases pobres, en donde est asociada con una gran morbilidad y mortalidad, debido a las complicaciones acompaantes (neumona) y a la malnutricin. El virus causante puede aislarse de la nasofaringe al comienzo de la enfermedad, aunque la infeccin aguda se diagnstica ms fcilmente por tcnicas serolgicas, detectando las IgM especficas frente al virus. La inmunidad adquirida tras la infeccin permanece, presumiblemente, de por vida y se comprueba mediante la deteccin de IgG especificas: sin embargo, la inmunidad debida a la vacunacin puede desvanecerse durante los ltimos aos de la adolescencia y la madurez. La infeccin que pueda producirse en estas circunstancias produce una enfermedad atpica, con unas grandes posibilidades de sufrir neumonitis y con una erupcin no caracterstica. El diagnstico serolgico es particularmente til en el caso del sarampin atpico. El parvovirus B 1 9 produce un tipo de exantema infantil denominado eritema infeccioso (en ocasiones denominado "quinta enfermedad" o exantema escolar), una enfermedad febril infantil que presenta una erupcin cutnea maculopapular distintiva que da a la cara una apariencia de "mejillas abofeteadas" (Erdman, 1991: Plummer, 1985). L a infeccin en los adultos puede producir tambin ariralgias (Naides, 1990). Los parvovirus infectan las clulas precursoras inmaduras del linaje eritrocitario, presentes en la mdula sea, y pueden provocar crisis aplsica en pacientes con hemoglobnopata o con infeccin por VIH (Harris, 1992). La infeccin primaria durante el embarazo puede ocasionar una aplasia de glbulos rojos en el feto, con anemia grave e hidropesa fetal. El diagnstico de laboratorio fue objeto de anlisis con anterioridad dentro de este mismo captulo. El virus de la rubola produce el denominado sarampin alemn, una enfermedad febril suave con una erupcin cutnea maculopapular transitoria (Cherry, 1993). La infeccin en los nios no tiene mayores consecuencias, aunque en los adultos puede provocar artralgias. La nica complicacin seria de la rubola es la diseminacin transplacentaria del virus hasta alcanzar al feto, lo que conlleva un riesgo muy elevado de aparicin de malformaciones congnitas. La infeccin aguda se diagnostica mediante la deteccin de IgM especficas frente al virus. La comprobacin de la situacin mmunitaria de una persona se determina fcilm e n t e investigando si posee IgG especficas frente al virus. El VHH6, un virus linfotrpico capaz de infectar a los linfocitos B y T, causa el exantema sbito (rosola infantil), una enfermedad autolimitada, comn de la primera infancia, que se caracteriza por una fiebre elevada y la aparicin de una erupcin cutnea maculopapular fugaz, que desaparece al mismo tiempo que la fiebre remite bruscamente (Asano, 1994; Lpez. 1988: Salahuddin, 1986). La infeccin primaria, por el VHH6 en nios mayores y en adultos est asociada a una enfermedad febril linfoproliferativa, con caractersticas de MI aguda (descrita con anterioridad en este captulo) y que pudiera estar asociada con el sndrome de fatiga crnica, y posiblemente con retinitis y neumonitis en pacientes inmunosuprimidos (Cone, 1993). Tambin se ha descrito el diagnstico de laboratorio de la infeccin causada por el VHH6 en este captulo.

Figura 48-15. Deteccin de virus que producen gastroenteritis mediante enzimoinmunoensayo (EIA) y microscopa electrnica (ME). bien se detectan infecciones sintomticas por rotavirus en ancianos ingresados en residencias (Marre. 1982). La transmisin es por va orofecal. y en las reas de clima templado las epidemias por rotavirus tienen lugar durante los meses frios: sin embargo, en climas clidos los casos aparecen durante todo el ao. La deshidratacin con desequilibrio electroltico es la complicacin ms grave de la infeccin por rotavirus, y es la razn principal para hospitalizar al paciente. Los rotavirus pueden sobrevivir transitoriamente en superficies inertes, razn por la que deben extremarse las medidas de control y aislamiento para prevenir la diseminacin nosocomial. Los serotipos 40 y 41 de adenovirus estn asociados con procesos de gastroenteritis y son responsables de un 1 0 % a un 20% de las infecciones de este tipo en nios (Brandt, 1983). La enteritis por adenovirus es similar a la enfermedad causada por rotavirus, aunque no muestra variaciones estacionales. Los astrovirus han sido identificados como responsables de infecciones nosocomiales y de brotes en asilos (Mitchell, 1993; Sastri, 1998): tambin se han detectado casos de gastroenteritis suave en adultos y de diarrea en pacientes infectados por el VIH (Grohman, 1993). Los calicivirus son responsables de entre el 1% al 6% de casos de gastroenteritis en nios pequeos y, ocasionalmente, en ancianos (Dinulos. 1994). Los coronavirus raramente causan diarrea en nios. El virus N o r w a l k y otros virus morfolgicamente relacionados con l (Hawaii; Snow Mountain) se incluyen dentro del grupo de los calicivirus; todos ellos provocan gastroenteritis aguda, que se caracteriza por que los afectados manifiestan nuseas y vmitos ms intensos que la propia diarrea acompaante. Los nios mayores y los adultos son los ms frecuentemente afectados, aunque todos los grupos humanos pueden ser afectados con independencia de la edad. Los virus N o r w a l k sobreviven en aguas contaminadas, crustceos y alimentos preparados, y son responsables de numerosos brotes en todo el pas (EE.UU.) (Hedberg. 1993).

Diagnstico de laboratorio
T o d o s los virus causantes de gastroenteritis crecen pobremente, o no lo hacen en absoluto, en las lneas celulares estndar. El diagnstico se ha basado tradicionalmente en la morfologa distintiva de cada uno de ellos mediante microscopa electrnica (ME) (Fig. 48-16). Las muestras de heces se centrifugan y se filtran, y una alcuota de la muestra procesada se transfiere a una rejilla para ME y se tie con cido fosfotngstico. Los virus son teidos negativamente mediante este procedimiento, lo que permite visualizar con gran facilidad sus caractersticas morfolgicas (tamao, organizacin de la cpsida, caractersticas distintivas de la superficie). Si se aade un anticuerpo especifico al filtrado de la muestra de heces, se consigue aglutinar las partculas vricas en acmulos, lo que facilita su reconocimiento e identificacin (inmunomicroscopia electrnica). Los rotavirus son virus con una cpsida icosadrica sencilla o doble, sin envuelta, que miden entre 55 nm y 75 nm de dimetro y tienen un aspecto que recuerda a una rueda. Los adenovirus entricos son morfolgicamente idnticos al resto de adenovirus; tienen una cpsida icosadrica y tienen un dimetro entre 70 nm y 90 nm. Los calicivirus tambin carecen de envuelta, tienen entre 30 nm y 35 nm de dimetro y presentan una serie de depresiones en forma de

GASTROENTERITIS VRICA
La gastroenteritis vrica es una importante causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, con una mayor incidencia en los nios pequeos en pases en vas de desarrollo. En EE.UU., la enteritis de origen vrico raramente es mortal, aunque se detectan del orden de 3 millones de casos anualmente, con unas 200.000 hospitalizaciones peditricas, aproximadamente Parashar, 1998). Los virus responsables son m u y diversos, pero todos comparten la caracterstica de ser ubicuos. En bebs y nios pequeos, la diarrea grave est causada por rotavirus, adenovirus entricos, calicivirus, astrovirus y coronavirus (Bates, 1993: Barnes, 1999). El virus Norwalk y otros virus parecidos provocan nuseas, vmitos y diarrea, principalmente en adultos (Hedberg, 1993) (Fig. 4815). El tratamiento de todas la gastroenteritis virales es de mantenimiento. Los rotavirus son responsables de al menos el 50% de los casos de diarrea acuosa en nios pequeos y bebs en EE.UU.; la enfermedad tiene un pico en su incidencia entre los 3 y los 15 meses de edad (Haffejee, 1991). Tam-

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INFECCIONES VRICAS

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copa ordenadas regularmente en su cpsida. Los astrovirus tienen entre 27 nm y 30 nm de dimetro: ciertas estructuras de su cpsida dan lugar a una morfologa que semeja a una estrella de seis puntas. Los virus Norwalk miden entre 24 nm y 40 nm, y son virus sin envuelta, geomtncamente simtricos. Los coronavirus son los nicos virus, dentro de este grupo, que presentan una envuelta lipdica: los viriones son ms grandes (tienen un dimetro entre 75 nm y 100 nm) y presentan unas estructuras en forma de bastn que se proyectan desde la cubierta, dando al conjunto la apariencia de una corona. La morfologa de cada tipo de virus al microscopio electrnico es muy caracterstica, pero la ME no est disponible en muchos laboratorios. Se puede llevar a cabo una deteccin sencilla y precisa de rotavirus en heces mediante nmunoensayos o aglutinacin con ltex. Ambos mtodos tienen una gran especificidad, pero el EIA tiene una sensibilidad ligeramente superior (Dennehy. 1994,1999: Thomas, 1994). El diagnstico rpido es de gran ayuda en el caso de pacientes hospitalizados para aplicar las medidas que eviten o reduzcan la diseminacin nosocomial de los virus. Est disponible comercialmente un EIA para detectar antigenos de adenovirus entricos que tambin es sensible y especfico. Se han desanollado una serie de mtodos (EIA, tcnicas de hibridacin directa o previa amplificacin con sondas de cidos nucleicos, y ensayos genotpicos) para otros virus que producen gastroenteritis que estn disponibles en los laboratorios de investigacin y de sanidad pblica; estos mtodos han sido de particular utilidad en la evaluacin de los brotes relacionados con la ingestin de alimentos contaminados.

HEPATITIS VRICA E INFECCIONES POR RETROVIRUS

Muchos virus afectan directamente al hgado. El virus de la fiebre amarilla y otros arbovirus hepatotxicos provocan una necrosis hepatocelular masiva. L a agregacin de linfocitos atpicos en el hgado asociada a la infeccin p o r VEB. CMV. VHH6 y VIH tambin provoca dao heptico como parte del sndrome de la mononucleosis. En pacientes inmunodeprimidos. adenovirus. VHS, VVZ. C M V y virus ECHO causan, ocasionalmente, una hepatitis m u y agresiva (Hierholzer, 1992). De todos modos, la mayor parte de enfermedades vricas del hgado estn producidas por los virus de la hepatitis A, B, C. D y E. que son todos hepatotrpicos y causan una lesin debida a la destruccin litica de los hepatocitos (Iwarson, 1992). El contagio por los virus de la hepatitis A (VHA) y de la hepatitis E (VHE) tiene lugar de persona a persona, transmitindose por va oro-fecal. El V H A es un picomavirus sin envuelta relacionado con los enterovirus que puede sobrevivir en agua contaminada y alimentos; los mariscos contaminados con aguas residuales sin depurar han sido responsables de varios brotes de gran envergadura. Las personas que viven en condiciones sanitarias deficientes, los nios en los asilos y en instituciones masificadas. y personal sanitario o que est al cuidado de nios representan los grupos que tienen mayor riesgo de resultar infectados por el VHA (Iwarson, 1992). En los nios, la enfermedad aguda es suave y, a menudo, asintomtica: ocasionalmente, los adultos

Figura 48-16. Observacin al microscopio electrnico de preparaciones de m u e s t r a s de heces teidas negativamente con cido losfotngstico. A, Rotavirus: se aprecian distintos monotipos con cpsida sencilla o doble (aumento: x 200.000). 6. Adenovirus: se aprecia el caracterstico patrn triangular en la superficie (aumento: x 100.000). C. Calicivims: se aprecian las depresiones superficiales en forma de c o p a (aumento: x 200.000). En la micrografia se pueden observar tambin dos rotavirus (de m a y o r tamao) por encima de los calicivims. (Fotografas cortesa de Teresa Valdivieso.)

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Tabla 48-13

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Caractersticas clnicas de las infecciones por virus de la hepatitis Hepatitis A Hepatitis B Hcpadnavindae Percutnea. mucosas Al menos 8 12 semanas (14-180 dias) 10% en adultos, 25% en nios. 80% en bes Si. elevado -1,4% Hepatitis C Flaviviridae Percutnea, mucosas Al menos 6 8 semanas (14-182 dias) 85% (un 20% desarrolla una cirrosis) S, bajo t%-2% Hepatitis D Virus satlites Percutnea, mucosas Uno (21-91 das) 5%-10%
?

Hepatitis E Calicivirus Fecal-oral Uno 6 semanas (14-63 dias) Poco (recuente

Clasificacin Via de iransmisin Genotipos Tiempo medio de incubacin (rango) Cronificacin

Picornaviridae (Enterovirus 72) Fecal-oral Uno 4 semanas (10-50 dias) No

Riesgo de carcinoma hepatocelular Porcentaje de mortalidad. hepatitis aguda

No -0.3%

2%-20%, con cointeccin con VHB, 30% con sobreinleccin

No 1 %-2%; hasta un 20% en mujeres embarazadas

pueden desarrollar una enfermedad grave, aunque la hepatitis fulminante con resultado de muerte es rara (un 0,6% o menos de los afectados). La recuperacin es total y no existe estado de infeccin crnica. Existen vacunas para el VHA que son seguras y eficaces (Ashur, 1999). Se han producido brotes de la enfermedad debidos al VHE en pases en vas de desarrollo que tienen unas condiciones de alimentacin y de potabilizacin del agua por debajo de los niveles ptimos, habindose descrito muy pocos casos en EE.UU. (Viswanathan, 1957: Wald, 1995). Los ms frecuentemente afectados son los adolescentes y los adultos jvenes. La mortalidad es muy baja, excepto en el caso de las mujeres embarazadas, en las que el porcentaje de fallecimientos puede alcanzar el 20% (Duff, 1998). El VHE no provoca infeccin crnica. El virus de la hepatitis B (VHB) se transmite normalmente a travs de la sangre, y la infeccin se contrae, clsicamente, mediante transfusiones con sangre infectada o pinchazos con agujas hipodrmicas contaminadas. Sin embargo, la transmisin vertical de la madre al feto durante el embarazo, el contagio por cont a c t o sexual directo y la exposicin a fluidos corporales, como la saliva en el ambiente familiar, tambin son rutas importantes para la diseminacin de la enfermedad. La infeccin aguda es, frecuentemente, sintomtica y puede ser fulminante, causando una necrosis hepatocelular masiva de pronstico fatal en un 1% o 2% de los casos. La infeccin por el VHB puede hacerse crnica, aunque el carcter crnico depende de la edad en la que se contrajo la infeccin. Hasta un 90% de los nios que adquirieron la infeccin en el tero, por transmisin vertical desde la madre, pueden convertirse en portadores crnicos, comparado con el 25% que se detecta entre nios infectados con postenoridad al nacimiento o el 10% entre los adultos. El dao hepatocelular es continuo durante la infeccin crnica: en el 2% de los casos de infeccin crnica puede manifestarse una forma crnico-activa de hepatitis con riesgo eventual de cirrosis (Lee, 1993; Overby, 1992). La cirrosis por VHB es un factor de riesgo para desarrollar un carcinoma heptico (CCH). L a infeccin por VHB puede ser prevenida en gran medida mediante vacunacin. La vacunacin masiva de nios en Taiwan ha reducido de forma significativa la incidencia del CCH peditrico (Chang, 1997).

La coinfeccin o sobreinfeccin del VHB con el virus de la hepatitis D (VHD) provoca una aceleracin en la destruccin de hepatocitos y un incremento en los porcentajes de mortalidad hasta valores de un 30%. El VHD es un virus incompleto que necesita la intervencin de ciertos antgenos del VHB para poder expresarse y replicarse completamente. El VHD puede transmitirse de persona a persona en entornos familiares, en aquellas reas donde el virus tiene carcter endmico (Amrica del Sur. frica. Italia), aunque en EE.UU. las transfusiones sanguneas y la drogadiccin por va intravenosa son las principales causas de transmisin (Hadziyannis. 1997). En EE.UU., el virus de la hepatitis C (VHC) es el responsable de la denominada hepatitis no A, no B, siendo el responsable del 80% al 90% de los casos de hepatitis adquirida tras una transfusin sangunea, antes de que se estableciesen, a partir del ao 1990. los anlisis habituales para el control de la sangre y los hemoderivados (Cuthbert, 1994). El consumo de drogas por va parenteral es, en la actualidad, el principal factor de riesgo; el personal sanitario infectado por haberse pinchado inadvertidamente con agujas contaminadas constituye un porcentaje minoritario de casos. La transmisin del VHC durante el embarazo, o c o m o consecuencia de relaciones sexuales o contacto entre miembros en el entorno familiar, se da con una eficiencia mucho m e n o r de la observada para el VHB (Rooney, 1998). El porcentaje de casos de hepatitis fulminante con resultado de muerte es semejante al que se observa asociado a la infeccin por el VHB. Sin embargo, ms del 75% de infecciones por el VHC se hacen crnicas y hasta un 20% acaban en cirrosis; el riesgo de desarrollar un carcinoma hepatocelular tambin es elevado. El tratamiento con interfern-u y ribavirina ha trado como consecuencia una disminucin progresiva de los casos de infecciones crnicas por VHB y VHC, lo que puede modificar o prevenir, a largo plazo, las secuelas duraderas (Yoshioka, 1992; Christie, 1999). Desafortunadamente, el porcentaje de respuesta es menor en las infecciones por el genotipo 1 del VHC. que representan el 75% de todos los casos en EE.UU. (Gitnick, 1998). Las tcnicas de segunda y tercera generacin de inmunotransferencia con protenas recombinantes y los mtodos de enzimoinmunoensayo (EIA) tienen

Tabla 48-14

M a r c a d o r e s s e r o l g i c o s y antignicos en el diagnstico de la hepatitis

VHA - aguda Antigua/posvacunacin VHB - temprana Perodo ventana En resolucin Crnica Antigua Posvacunacin VHC -aguda Crnica Antigua VHD - cointeccin Sobreinleccin VHE
+ = posUivo - = negalivo Adaptada de Biesemier KW. Parks D. Gertis C y cols : Viral hepatitis serology at the University ol North Carolina Hospitals Update. Bull Lab Med 1994; 134:1; con permiso del editor.

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INFECCIONES VRICAS

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una elevada sensibilidad y especificidad en la deleccin de anticuerpos (rente al VHC. Los pacientes seropositivos deben ser evaluados adiconalmente en busca de una infeccin persistente por el VHC. realizando estudios de la funcin heptica en los mismos y. en algunos casos, una biopsia heptica, cuantificando mediante RT-PCR la carga de ARN del VHC y, si procede, caracterizando el genotipo del virus (Lam, 1999). Los cinco virus de la hepatitis no se replican en las lneas celulares estndar. La fase en la que se encuentra la infeccin queda definida mediante la deteccin de IgM e IgG especficas y de antgenos virales (Biesemier, 1994). Las caractersticas clnicas de los virus do la hepatitis y los marcadores serolgicos de infeccin se resumen en la Tabla 48-14. A partir de individuos que han desarrollado una hepatitis despus de haberles sido realizada una transfusin, se han aislado el virus de la hepatitis G'GVB-C (un flavivirus relacionado con el VHC) y el virus transmitido por transfusin (VTT), un virus con ADN de cadena sencilla. Sin embargo, ambos virus se encuentran frecuentemente en personas asintomticas, por lo que su asociacin con una patologa heptica no est clara (Hadziyannis, 1998; Abe. 1999: Ding, 1999).

El tratamiento antirretroviral de gran eficacia (TARGA) con drogas pertenecientes al menos a dos clases distintas de antirretrovirales (anlogos nudesidos inhibidores de la transcriptasa inversa, inhibidores no anlogos e inhibidores de la proteasa) ha mejorado de forma espectacular las expectativas de supervivencia y la calidad de vida de los afectados (Saag, 1996; Shafer, 1999). La terapia tambin ha reducido enormemente la transmisin perinatal. Desgraciadamente, continan apareciendo variantes del virus resistentes a los antirretrovirales, incluso en aquellos pacientes que estn recibiendo una terapia combinada, lo que refuerza la necesidad de trabajar constantemente en la bsqueda y produccin de nuevos tipos de agentes antirretrovirales. El VLHT (virus de la leucemia humana de clulas T) infecta a los linlocitos T-CD4- y causa una leucemia adulta de clulas T (LAT); la enfermedad se da entre el 2% y el 4% de las personas infectadas por el VLHT-1 en reas endmicas del Japn (Folks, 1998). El VLHT-I tambin causa mielopatia/paraparesis espstica tropical (HAM/TSP). una enfermedad degenerativa crnica caracterizada por un debilitamiento progresivo de las extremidades inferiores, espasticidad y prdida de la funcin sensorial y del control de la vejiga (Manns, 1999). El VLHT-II se ha aislado a partir de pacientes con leucemia de clulas T peludas o tricoleucemia, aunque la relacin del virus con la enfermedad no est claramente establecida. Existen tcnicas de enzimoinmunoensayo para la deteccin de anticuerpos que se utilizan en bancos de sangre.

Virus de la inmunodeficiencia humana

El VIH-1 es un retrovirus incluido dentro de la subfamilia Lentivirinae que en la actualidad parece estar diseminado por todo el mundo. El VIH infecta y destruye a los Imfocitos T-CD4, lo que da lugar a que se produzcan numerosas infecciones oportunistas y tumores secundarios en los individuos afectados (Phillips, 1992; Stein. 1992; Poli, 1993: Schnittman, 1990). El VIH tambin es neurotrpico y puede causar meningitis aguda y una encefalopata destructiva lenta (Atwood, 1993). La mitad de los individuos con inteccin aguda manifiestan unos sntomas parecidos a los de la mononucleosis (vase la seccin titulada Mononucleosis infecciosa heterfilo-negatva, en este mismo capitulo) antes de entrar en una fase asintomtica en la que va teniendo lugar una destruccin progresiva de las clulas T-CD4. El tiempo medio necesario para manifestar todas las caractersticas del sida es de 10 a 11 aos: entre el 5% y el 10% de los afectados desarrollan el sida en dos o tres aos, mientras que entre un 5% y un 1 0 % de infectados mantienen estables los valores de recuento de linlocitos y permanecen asmtomticos indefinidamente (Muoz, 1995). Los nios que han sufrido una infeccin vertical en el momento del nacimiento muestran generalmente una progresin muy rpida de la enfermedad (Downs. 1995). Existen varios sistemas comerciales basados en la tcnica del enzimoinmunoensayo, preparados con antgenos purificados del VIH u obtenidos mediante recombinacin, que son capaces de detectar IgG especificas frente al VIH, entre dos y cuatro semanas despus de que se haya producido la infeccin, con unos niveles de especificidad y sensibilidad excelentes. Los bancos de sangre buscan de forma habitual los anticuerpos frente al VIH-2: esta es una estrategia deseable tambin en las reas de frica, donde la infeccin es endmica. Un EIA que ha dado positivo para anticuerpos frente al VIH debe ser repetido y a continuacin confirmado con un test adicional como la mmunotransferencia [Western immunoblotting, mediante el cual sea posible verificar que los anticuerpos del paciente reaccionan con antgenos especficos del VIH (MMWR, 1991). Los resultados que se muestren en los informes serolgicos de laboratorio en relacin con el VIH deben ser concisos, y debe evitarse el empleo de comentarios ambiguos o confusos (Hewitt. 1992). El VIH puede propagarse en cultivos de tejidos, co-cultivando linlocitos o muestras de tejidos infectados del paciente con linfocitos de un donante sano que hayan sido estimulados con fitohemaglutinma. mterleucina-2 e mterfern. Esta es una tcnica cara y compleja, y potencialmente peligrosa, que no debe realizarse en los laboratorios de diagnstico ordinario. La necesidad de tener que aislar el VIH mediante cultivo ha sido reemplazada por los mtodos de diagnstico molecular.

INFECCIONES VRICAS EN HUSPEDES INMUNOCOMPROMETIDOS

La respuesta inmune a la infeccin por virus implica una complea interaccin tanto de factores humorales como celulares. El control de la infeccin aguda es llevado a cabo por los procesos de la inmunidad celular. Los granulocitos natural M/er(NK) de gran tamao que circulan por la sangre y los tejidos identifican aquellas clulas que expresan antgenos virales (antigenos extraos o no propios) y las destruyen por lisis proteoltica. Al principio de la infeccin aguda, los antigenos virales son procesados por los macrofagos y presentados a los Imfocitos T: las clulas T-CD4 producen citocinas que promueven la expansin clonal de las clulas T-CD8 citotxicas. las cuales eliminan, a continuacin, las clulas hospedadoras que contienen antigenos virales. Cualquier alteracin en la normal interaccin entre las clulas CD4, CD8 y los N K reduce la capacidad del husped para controlar la enfermedad vrica. La inmunidad mediada por clulas tambin juega un papel crtico en la supresin de virus que se encuentran en fase de latencia en el hospedador (tales como VHS. CMV y VEB). En los individuos sanos, la mayor parte de infecciones por reactivacin con estos virus son asintomticas o producen una enfermedad limitada que queda confinada a localizaciones anatmicas concretas (p. ej.. el herpes oral o genital). Si los mecanismos de la inmunidad celular estn alterados, cualquier infeccin recurrente puede dar lugar a un

L a amplificacin por PCR del cido nucleico proviral del VIH se utiliza, en principio, para diagnosticar la infeccin Iransmitida verticalmente durante los primeros meses de vida del recin nacido (vase la seccin titulada Infecciones vricas congnitas y perinatales, en este m i s m o capitulo). Los ensayos para determinar la carga viral cuantifican los transcritos de ARN del VIH en el plasma. Estas determinaciones tienen un valor prognstico y han representado una revolucin en el uso de la terapia antirretroviral. Las reducciones en el nmero Figura 48-17. M o n o c a p a de fibroblastos MRC-5 q u em u e s t r a los ECP causados de copias de ARN virco. hasta un valor de 0,5 unidades logartmicas por mi. p o r la replicacin del CMV tras 11 das de incubacin (microscopa ptica de coninducidas por el tratamiento, se asocian con una progresin clnica ms lenta. traste de fases: aumento: x 100).

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MICROBIOLOGA MDICA

Tabla 48-15 Direcciones d e inters e n Internet Nombre de la pgina

Centers tor Disease Control and Prevention Wold Health Organization Association for Professionals m Infection Control and Epidemiology Medscape American Society tor Microbiology European Society lor Clinical Virology National Centers lor Inlectious Diseases Pan American Society lor Clinical Virology Lab Explorer All the Virology on Ihe WWW Johns Hopkins Infectious Disease

Direccin en la web
http:/Avww cdc gov/ http:/Avww who.mt/ http://www.apic.org/ http://www medscapc.com http//www asmusa org/ http://www.eur nl/FGG/VIRO/ESCV/ http://www cdc. gov/nc idod/ hllp://www virology.org/ http://www.labexplorer.com/ hltp://www. virology.net http/Avww.hopkins-id.edu/

proceso altamente agresivo a nivel local o bien a la diseminacin del agente patgeno, produciendo lesiones multiorgnicas graves. El nmero de pacientes inmunodeprimidos se h a incrementado de forma espectacular en los ltimos 20 aos. Los tratamientos con corticosteroides, quimioterpicos, radiaciones, drogas inmunosupresoras, asi como la eliminacin de los linfocitos T-CD4 por la accin del VIH, causan dao en los mecanismos que regulan la respuesta inmune celular y aumentan la susceptibilidad a la infeccin por u n a gran variedad de virus. Infecciones pnmanas como la mononucleosis por el VEB. la gripe y la varicela son, a menudo, mucho ms graves en estas circunstancias. Tambin puede tener lugar una proliferacin d e los condilomas genitales causados por papilomavirus humanos, con una progresin acelerada hacia la displasia escamosa y el carcinoma, tanto en mujeres como en hombres. A menudo, las enfermedades vricas ms graves son consecuencia de la reactivacin en el hospedador de virus durmientes endgenos (CMV, VHS y VVZ). En este contexto, se han descrito casos de necrosis de las lesiones mucocutneas orales y perianales causadas por el VHS, y zster con afectacin de varios dermatomas. Las infecciones vricas oportunistas ms comunes estn causadas por CMV. en pacientes infectados por el VIH y en trasplantados. Los enfermos de sida con unos valores de recuento de clulas CD4 por debajo de 100 por mnv padecen retinitis por CMV como complicacin ms frecuente. Tambin se dan casos de neumona, as c o m o de infecciones del tracto gastrointestinal y del SNC causadas por CMV. T a m p o c o es infrecuente observar afectacin multiorgnica en autopsia (Drew, 1992). La infeccin por CMV produce las tpicas inclusiones especficas en las clulas infectadas, aunque la observacin de las mismas carece de sensibilidad de cara al diagnstico. La sensibilidad se incrementa ligeramente realizando tinciones con inmunoperoxidasa o hibridacin in silu (HIS). aunque el aislamiento del virus es la tcnica que goza de una mayor precisin diagnstica. El CMV se replica casi exclusivamente en la lnea celular HDF: su crecimiento es lento, siendo necesario incubar durante siete dias. e incluso ms. para que se desarrollen los ECP. Los fibroblastos infectados conservan inicialmente su morfologa fusiforme, mientras que su ncleo se hincha y se h a c e ms refringente.

Eventualmente. toda la clula puede redondearse y distorsionarse, a la vez que el virus se extiende a las clulas adyacentes, formando una zona de clulas daadas que va aumentando de tamao progresivamente (Fig. 48-17). La deteccin del CMV se acorta en uno o dos das si se utilizan los cultivos en tubos shell-vial y se lavorece la adsorcin de los virus a la monocapa de clulas mediante centrifugacin (Gleaves, 1984, 1987). Las monocapas de clulas HDF se inoculan con leucocitos de sangre perifrica (separados mediante centrifugacin en gradientes de densidad), liquido del lavado bronquioalveolar (LBA). orina o tejidos homogeneizados; tras unas 16 a 40 horas de incubacin, la monocapa se tie con un anticuerpo especifico frente al antigeno precoz del CMV. conjugado con fluoresceina. Los fibroblastos infectados muestran una fluorescencia homognea por todo el ncleo (vase Fig. 48-18) L a especificidad del mtodo es del 100% y la sensibilidad excelente cuando los cultivos celulares se inoculan con orina, tejidos homogeneizados o L B A (del 95% al 100%). Sin embargo, la inoculacin de leucocitos de sangre perifrica en cultivos en tubos shell-vial tiene tan slo una sensibilidad del 75% comparada con la que se obtiene cuando la inoculacin se lleva a cabo en monocapas en tubos estndar: por tanto, se recomienda siempre efectuar un cultivo suplementano. En los pacientes inmunocomprometidos. el CMV es la causa ms frecuente de viremia. aunque ocasionalmente estos individuos pueden desabollar infecciones por VVZ, VHS. adenovirus y. a veces, enterovirus. Los cultivos tradicionales en lubo de clulas HDF y A549 incubados durante 1 4 das luncionan adecuadamente para la recuperacin de todos esos agentes y tambin del CMV (Stanberry, 1994). Otra ventaja del aislamiento del CMV en tubos shell-vial es la facilidad con que esta tcnica permite realizar cultivos semicuantilativos (Buller, 1992: Slavin, 1992). El empleo de un inoculo estandarizado de clulas (leucocitos o clulas del LBA) y un recuento de los ncleos fluorescentes que aparecen en el cultivo celular tras la tincin con el anticuerpo especifico frente al antigeno precoz del CMV. conjugado con fluoresceina, proporciona u n o s datos que tienen una cierta utilidad clnica a la hora de eslimar la gravedad de la infeccin, controlar la respuesta al tratamiento y realizar una estimacin pronstica. En cualquier caso (cultivos celulares en tubos estndar o en tubos shell-vial), la recuperacin del CMV se incrementa si los especmenes se inoculan inmediatamente despus de haber sido obtenidos en cultivos celulares frescos (Brumbach, 1997; Roberts, 1997). La infeccin por CMV en receptores de trasplantes de rganos o de mdula sea (alognico) compromete seriamente el resultado de los mismos El virus puede daar directamente los rganos trasplantados, y la toxicidad de las drogas antivricas asi como la deliberada disminucin de la terapia inmunosupresora anti-rechazo tambin pueden representar una seria amenaza para la supervivencia del injerto. Los cultivos de vigilancia ordinarios del C M V :enen una utilidad escasa para predecir el desarrollo de u n a enfermedad por C M Vy tomar decisiones clnicas (Falagas, 1997). L a determinacin cuantitativa del antigeno pp65 del CMV en leucocitos de sangre perifrica y la deleccin del ADN del virus mediante PCR son tcnicas ms sensibles que el cultivo y tambin son capaces de detectar la viremia con mayor antelacin (Mndez, 1998; Boeckh. 1998). Los anlisis secuenciales suministran datos de alerta t e m p r a n a que permiten ajustar con la mayor precisin posible las terapias antivirales e inmunosupresoras. La deteccin del antgeno del CMV se lleva a cabo en los leucocitos de sangre perifrica, mediante el mtodo I F A (Erice, 1995; Storch, 1994; Landry, 1996); la principal limitacin de esta tcnica es la leucopema. La PCR cuantitativa parece ser un procedimiento til para predecir infeccin p o r CMV en personas sometidas a un trasplante de hgado o rion (Drouet. 1994.

Figura 48-18. Cultivo de fibroblastos MRC-5 en tubos shelt-vial donde se aprecia un gran nmero de ncleos fluorescentes tras la tincin con el anticuerpo especfico frente al antigeno precoz del CMV, conjugado con fluoresceina (aumento: x 250).

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CAPTULO

49

Infecciones causadas por clamidias, rickettsias y micoplasmas

Gail L. Woods, M.D. David H. Walker, M.D.
INFECCIONES POR CLAMIDIAS Estructura Multiplicacin Chlamydia trachomatis Chlamydophila (originalmente Chlamydia) psittaci Chlamydophila (originalmente Chlamydia) pneumoniae Diagnstico de laboratorio Tratamiento INFECCIONES POR RICKETTSIAS 1076 1072 Infecciones causadas por organismos del gnero Ehrlichia Infecciones causadas por Coxiella burnetii Infecciones causadas por organismos del gnero Bartonella (Rochalimaea) INFECCIONES POR MICOPLASMAS Mycoplasma pneumoniae Micoplasmas genitales Diagnstico de laboratorio Tratamiento BIBLIOGRAFA 1085 1083

Infecciones causadas por organismos del gnero Rickettsia Tifus "scrub" (tifus de las malezas) causado por Orientia tsutsugamushi

Las infecciones causadas por clamidias. rickettsias y micoplasmas en humanos se consideran independientemente en este volumen porque los microorganismos responsables de las mismas son diferentes de la mayor parte del resto de bacterias en varios aspectos: son de tamao ms pequeo, la estructura de su pared celular es distinta y son parsitos intracelulares obligados, en particular las clamidias y la mayor parte de rickettsias.

INFECCIONES POR CLAMIDIAS

Las clamidias tienen tropismo por las clulas epiteliales columnares. Su pared celular es semejante a la de las bacterias gramnegativas; poseen tanto cido desoxirribonucleico (ADN) como cido ribonucleico (ARN). tienen ribosomas procariotas y son capaces de sintetizar sus propias protenas, cidos nucleicos y lipidos: se dividen por biparticin; y son sensibles a ciertos antibiticos. A diferencia de otras bacterias, las clamidias son "parsitos energticos"; son bacterias intracelulares obligadas que no pueden multiplicarse fuera de las clulas que las albergan y son incapaces de sintetizar compuestos ricos en energa como el adenosn Irilosfato (ATP). Las clamidias estn incluidas en el orden Chlamydiales. Una revisin reciente de la taxonoma ha sugerido la creacin de tres familias, una de las cuales, Chlamydiaceae, incluira las especies patgenas para el hombre (Everett, 1999). Se han propuesto dos gneros en donde estaran englobadas tres especies patgenas humanas: Chlamydia trachomatis. Chlamydophila (originalmente Chlamydia) psittaci y Chlamydophila (originalmente Chlamydia) pneumoniae. En la Tabla 49-1 se indican algunas caractersticas tiles para diferenciar las tres especies mencionadas. Adems, estos gneros incluyen tambin otras seis especies que no han sido asociadas con infecciones en el ser humano.

tes disulfuro. El cuerpo elemental es la forma infecciosa del organismo, y tiene una capacidad de supervivencia limitada fuera de la clula hospedadora. Por otro lado, el cuerpo reticular, con un dimetro entre 0.6 iim y 1 . 0 pm. es la forma mtracelular, metablicamente activa, incapaz de sobrevivir en el medio ambiente exocelular. El ADN circular de ambas formas se encuentra organizado, de forma compacta, en un nucleoide central y su genoma tiene un tamao de enlre 1,0 y 1,2 millones de pares de bases (pb). Entre los componentes de la membrana externa del cuerpo elemental, dos tienen importancia para el diagnstico. El ms importante es la proteina mayontaria de la membrana externa (MOMP), una especie transmembranal que posee epitopos, definidos en base a su reactividad frente a anticuerpos monoclonales, especficos de serovariedad. especie, gnero y familia. La infeccin por clamidias induce en el husped la aparicin de anticuerpos anti-MOMP especficos, aunque el papel protector de estos anticuerpos n o est claramente establecido. La membrana extema de las clamidias tambin posee un antgeno de naturaleza hpopolisacaridica (LPS), que es el antigeno mayoritario detectado mediante pruebas serolgicas, especificas de gnero, como indicador de infeccin por clamidias. Se han utilizado anticuerpos monoclonales y anticuerpos polivalentes monoespecificos frente al LPS o la MOMP, para detectar la presencia de antigenos de clamidia en especmenes clnicos, mediante mmunofluorescenoa directa (DFA) y enzimoinmunoensayo (EIA).

Multiplicacin
Las clamidias se multiplican en el citoplasma de la clula hospedadora infectada. El ciclo biolgico de desarrollo comienza con la adhesin del cuerpo elemental a microvellosidades de una clula columnar susceptible; en cualquier caso, los receptores especficos implicados en esta interaccin n o han sido identificados todava. El cuerpo elemental desciende entonces por la microvellosidad, hasta alcanzar la membrana plasmtica de la clula hospedadora, localizndose en invaginaciones o indentaciones de la misma Seguidamente, la clamidia penetra en la clula en un endosoma, donde las diferentes especies, C. psittaci C. pneumoniae y C. trachomatis, permanecen durante su desarrollo mtracelular. El contenido de los endosomas que contienen los cuerpos elementales de C psittaci no se acidifica, y no se produce la fusin de aquellos con los lisosomas celulares; sin embargo, los endosomas con cuerpos elementales de

Estructura
Las clamidias presentan dos formas morfolgicamente distintas. Por un lado, el denominado cuerpo elemental, una forma esfrica, densa, con un dimetro entre 0.2 pm y 0,4 pm, que contiene ARN ribosomal procaritico y posee una pared celular rgida, debido a la gran cantidad de enlaces que se establecen entre los componentes proteicos de la misma, a travs de puen-

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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

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Tabla 49-1

Caractersticas tiles para diferenciar las e s p e c i e s de Chlamydia y Chlamyodophila p a t g e n a s del h o m b r e Especies

Caracterstica Susceptibilidad a las sulfamidas Tincin de glucgeno de las inclusiones Forma del CE

Chlamydia trachomatis S +

Clamydophila psittaci R

Clamydophila pneumoniae R

estados del sureste, homosexuales e individuos que han visitado paises fuera de EE.UU., donde el LGV tiene carcter endmico. El LGV se transmite por contacto sexual directo, aunque tambin se h a observado transmisin del microorganismo a travs de fmites y por aerosoles formados durante accidentes de laboratorio, asociada a casos de neumonitis. derrames pleurales y lintadenopatia mediastinica o hiliar (Jones. 2000). El reservono del agente infeccioso est constituido por personas infectadas pero asintomticas o por individuos con infeccin uretral, cervical o anorrectal ignorada. El L G V es la nica infeccin causada por C. trachomatis que produce manifestaciones multisistmicas y constitutivas. Durante la lase primaria se forma una vescula indolora o una ppula no indurada, de pequeo tamao, que aparece, frecuentemente, en los genitales externos, entre tres das y tres semanas despus de la exposicin al microorganismo, y que desaparece rpidamente sin dejar cicatriz. La lase secundaria se caracteriza por una linfadenopata supurativa local y otros sntomas como liebre, escalofros, anorexia, dolor de cabeza, mialgias y artralgias. comenzando entre dos y seis semanas despus de la infeccin. El examen histolgico de los ganglios linfticos afectados muestra la existencia de granulomas que rodean abscesos estrellados. Los ganglios linfticos afectados aparecen enmaraados y eventualmente supuran, dando lugar a fistulas que sanan, con cicatrizacin, varios meses despus. La fibrosis y el drenaje linftico anormal resultante son responsables del estrechamiento uretral o rectal y de la induracin y edema linftico de los genitales que aparece durante la tercera fase. El espectro clnico de las enfermedades de transmisin sexual debidas a cepas de C. trachomatis que no causan LGV (cepas no LGV) es semejante al de las infecciones debidas a Neisseria gonorrhoeae (vase Cap. 50). En el hombre. C. trachomatis es responsable del 30% al 50% de casos de uretritis no gonoccica. aunque un tercio de varones que albergan a C. trachomatis en su uretra no manifiestan sntoma alguno (Stamm. 1984). Muy raramente, la uretritis producida por C. trachomatis evoluciona hasta una epiddimitis. Entre los varones homosexuales, las cepas no LGV de C. trachomatis se han asociado a casos de proctitis. El microorganismo se ha aislado tambin de la uretra de un 70% de individuos con sndrome de Reiter no tratado asociado con uretritis (Keat, 1983). La infeccin genital por C. trachomatis tiene una incidencia mayor en la m u j e r que en el hombre y es ms frecuente entre mujeres jvenes, solteras o divorciadas, negras, de nivel socioeconmico bajo y que tengan mltiples compaeros sexuales. La infeccin de la endocrvix por C. trachomatis puede ser asintomlica o bien producir una cervicitis mucopurulenta. que puede extenderse h a s t a la uretra y la vejiga unnaria. dando lugar al "sindrome uretral agudo" o piura sin bacteriemia, o hasta el endometno y las trompas de Falopio. causando entonces endometritis o salpingitis. Las infecciones del tracto reproductivo superior pueden evolucionar hasta una enfermedad inflamatoria plvica o provocar cicatrizacin y disluncin del sistema de transporte de los oviductos, lo que puede traducirse en infertilidad o embarazo ectpico. La diseminacin intrapentoneal de la infeccin puede provocar peritonitis aguda, perihepatitis (sndrome de Fitz-HughCurtis), periapendicitis o inflamacin del bazo. Un pequeo porcentaje de adultos con infeccin genital por clamidias desarrollan una conjuntivitis de inclusin. En los paises desarrollados donde las infecciones de transmisin sexual por C. trachomatis tienen carcter epidmico, el microorganismo puede pasar de la madre al hijo durante el trnsito por el canal del parto. Estudios llevados a cabo en Norte Amrica indican que entre el 60% y el 70% de los nios expuestos a C. trachomatis durante el parto por via vaginal resultan infectados por l a bacteria, mientras que la infeccin en aquellos que nacen mediante cesrea es muy poco frecuente (Jones, 2000). Es posible recuperar a C. trachomatis de la conjuntiva de los nios infectados tras una o dos semanas y a partir de la nasofaringe inmediatamente despus. La frecuencia de aislamiento a partir de la conjuntiva disminuye a partir de la quinta/sexta semana, aunque C. trachomatis puede ser recuperada de la nasofaringe, conjuntiva, recto y vagina (habitualmente sin producir sntomas) durante varios meses. La conjuntivitis de inclusin, la manifestacin ms frecuente de la infeccin por C. trachomatis en nios, aparece en casi el 80% de aquellos en los que el cultivo a partir de la conjuntiva o el examen citolgico revela l a presencia del microorganismo (Jones, 2000). Entre 2 y 25 das despus del nacimiento se produce un H u i d o mucopurulento y la conjuntiva se inflama y se vuelve edematosa. Los sntomas generalmente desaparecen sin tratamiento en u n o s cuantos meses y sin dejar secuelas, aunque puede quedar cierto grado de cicatrizacin en la conjuntiva.

Redondeada Redondeada De pera o redondeada

CE = cuerpo elemental. S susceptible; Fl = resistente: * = positivo. - = negativo.

C. trachomatis pueden fusionarse entre ellos y. probablemente, con los lisosomas. Entre seis y ocho horas despus de que el cuerpo elemental haya penetrado en la clula husped, comienzan a producirse cambios en la estructura de la pared celular asociados a la transicin a cuerpo reticular, se inicia la sntesis de ADN, ARN y protenas y comienza la divisin por biparticin. Las mitocondnas de la clula hospedadora migran y se sitan frente al endosoma, cuyo tamao va creciendo, lo que permite que los cuerpos reticulados en multiplicacin utilicen el ATP generado por la propia clula infectada. Los cuerpos reticulados comienzan a reorganizarse tras 1 8 a 24 horas despus de la infeccin; y, presumiblemente, cuando se agotan los nutrientes, tiene lugar su maduracin y transformacin a cuerpos elementales, que son finalmente liberados al medio extracelular. Las clulas infectadas por C. psittaci sufren daos importantes c o m o consecuencia de la multiplicacin de los microorganismos en su interior, teniendo lugar la liberacin de las clamidias por la lisis de la clula husped 48 horas despus de que se haya producido la infeccin. Por el contrano, C. trachomatis es liberada, entre 72 y 96 horas despus de la infeccin, tras la fusin de la membrana que delimita el cuerpo de inclusin que contiene los cuerpos elementales con la membrana plasmtica, dejando una lesin en la m i s m a y permitiendo la supervivencia de la clula hospedadora.

Chlamydia

trachomatis

Chlamydia trachomatis es la causa ms frecuente de enfermedades transmitidas por contacto sexual en EE.UU. Asimismo, en regiones de Oriente Medio y del norte de Africa y de la India, donde el tracoma es endmico, es una importante causa de ceguera.

Epidemiologa, patologa y manifestaciones clnicas

El ser humano es el nico hospedador conocido para todas las cepas de C. trachomatis conocidas. Las manifestaciones clnicas, asi c o m o la especificidad por el rgano afectado en el cuerpo, vienen determinadas tanto por el mecanismo de transmisin como por las propiedades de la cepa infectante. Desde un punto de vista epidemiolgico, las infecciones por C. trachomatis se dividen en tres categoras: el clsico tracoma, las enfermedades transmilidas por contacto sexual en adultos y las infecciones perinatales. oculares y del tracto respiratorio. El tracoma clsico es una causa importante de ceguera en aquellas reas donde las condiciones sanitarias son inadecuadas y la higiene personal escasa, aunque es la causa de ceguera que, a nivel mundial, puede ser prevenida ms fcilmente. Tpicamente, la infeccin se transmite entre los nios a travs de los dedos, mediante fmites y probablemente por las moscas. En reas donde la enfermedad es endmica, la conjuntivitis aguda provocada por clamidias en adultos o en nios es poco frecuente, aunque muchos nios quedan infectados crnicamente pocos aos despus de su nacimiento. Exposiciones repetidas a C. trachomatis conducen, eventualmente, al desarrollo de queratoconjuntivitis folicular crnica, cicatrizacin de la conjuntiva y pannus (invasin de la crnea por los vasos sanguneos). Entre las enfermedades que se transmiten por contacto sexual directo en adultos, y que estn provocadas por C. trachomatis. se encuentran el linfogranuloma venreo (LGV) y la uretritis/cervicitis, con las complicaciones asociadas a las mismas. El LGV tiene carcter endmico en Asia, frica y Amrica del Sur. En EE.UU. se registran alrededor de 500 casos anualmente: la enfermedad afecta ms al hombre que a la mujer, en una relacin de 3 a 1, y es ms frecuente entre personas pertenecientes a un estrato socioeconmico bajo en los

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Aproximadamente un 20% de nios que son infectados por C. trachomatis durante el nacimiento desarrollan neumonitis intersticial. La enfermedad comienza entre las dos semanas y los tres meses de edad (con un pico entre las tres y las seis semanas) con una congestin nasal, seguida de una caracterstica tos staccato con taquipnea y crepitantes, pero sin fiebre. La mitad de ellos tienen o han tenido conjuntivitis. Los sntomas se manifiestan durante varias semanas, aunque los crepitantes inspiratorios y los cambios en el examen radiolgico del lrax pueden persistir durante meses.

Chlamydophila (originalmente

Chlamydia) psittaci

La neumona asociada con el contacto con pjaros fue descrita en Suiza por primera vez en 1879. La enfermedad fue rara en EE.UU. y Europa hasta finales de 1920. cuando comenzaron a ponerse de moda los pjaros tropicales como mascotas. El agente patgeno responsable fue aislado por Bedson en 1930 a partir de muestras de tejido humano y de ave durante la investigacin de un brote epidmico en el zoolgico de Londres.

prominente es la aparicin de una tos seca y persistente que, ocasionalmente, puede producir un esputo sanguinolento. El pulso cardaco es. a menudo, lento para la temperatura corporal del paciente, y tambin es frecuente padecer una jaqueca intensa y difusa. Son comunes otros sntomas c o m o malestar general, mialgias dolorosas y artralgias. y tambin puede aparecer una erupcin macular (manchas de Horder) que semeja las manchas rojizas de la fiebre tifoidea. Un cierto grado de obnubilacin puede manifestarse al final de la primera semana, y unos pocos afectados tienen molestias gastrointestinales (Gl). Chlamydophila psittaci raramente causa endocarditis destructiva: la mayor parte de personas afectadas tienen un historial de enfermedad reumtica cardiaca o de malformaciones congnitas de las vlvulas cardacas (Jones. 1982).

Chlamydophila (originalmente Chlamydia) pneumoniae

En 1986, una especie particular de clamidia se asoci con una patologa aguda del tracto respiratorio humano. El organismo, inicialmente considerado como una cepa de Chlamydia psittaci, fue denominado TWAR, siglas que correspondan a las letras de identificacin de los dos primeros aislamientos de la bacteria obtenidos: TW-183. aislado en 1965 del ojo de un nio de un grupo control durante un ensayo de vacunacin realizado en Taiwan, y AR-39, recuperado ese mismo ao de la garganta de un estudiante de la Universidad de Washington afectado de faringitis. Muy poco tiempo despus de su deteccin, los datos de los estudios de homologa de ADN y de las observaciones al microscopio electrnico pusieron de manifiesto que se trataba de una especie diferente, inicialmente designada como Chlamydia pneumoniae, y que recientemente ha sido reclasilicada como Chlamydophila pneumoniae (Everett, 1999; Chi. 1987: Campbell, 1987; Cox. 1988). Las cepas de C. pneumoniae y C. psittaci tienen un 10% o menos de homologa en la secuencia de ADN. y ba|0 ciertas condiciones el cuerpo elemental de C pneumoniae tiene forma de pera, mientras que en otras es redondeado, como los cuerpos elementales de Chlamydophila psittaci y Chlamydia trachomatis.

Epidemiologa
La infeccin causada por ChiamydophUa (originalmente Chlamydia) psttacci (llamada psitacosis) aparece distribuida mundialmente. Las aves de la familia de las psitaciformes se consideran el principal reservorio del microorganismo responsable de la enfermedad, aunque la mayor parte de especies de pjaros pueden ser infectadas por la bactena. Los animales infectados pueden, obviamente, enfermar y morir, aunque frecuentemente slo muestran sntomas ligeros como anorexia, diarrea, letargo y plumaje rizado. La enfermedad en humanos tiene carcter espordico y ha sido asociada con el contacto con loros, canarios, palomas, gorriones, patos, gallos, aves de corral (principalmente pavos) y ocasionalmente mamferos. Ms de la mitad de los 40 a 60 casos de psitacosis que se detectan anualmente en EE.UU. se dan entre las personas que poseen pjaros como mascotas. Los empleados de las tiendas de anmales, criadores de palomos, trabajadores en zoolgicos, veterinarios y todos aquellos que por su actividad laboral estn en contacto con las aves tienen un mayor riesgo de padecer la infeccin. Se han detectado brotes epidmicos en plantas procesadoras de pavos, principalmente entre los empleados que matan a las aves y las despluman y aquellos que realizan la evisceracin de los cuerpos (CDC, 1990). En las ltimas dos dcadas, la prevalencia de la psitacosis en EE.UU. se ha reducido enormemente como resultado de la adicin de tetraciclma a los piensos que se les suministran a las aves para su alimentacin, el tratamiento de las aves psitaciformes importadas antes de entrar en el pas y la cra domstica de periquitos. C. psittaci est presente en la sangre, tejidos, excrementos y plumas de los pjaros infectados y puede permanecer acantonada varios meses despus de la infeccin aguda. La infeccin se transmite al ser humano generalmente a travs de la inhalacin de aerosoles infectivos procedentes de heces, heces pulverizadas, y secreciones de aves infectadas por C. psittaci. pero puede producirse tambin por la manipulacin de plumaje o tejidos contaminados, picotazos o por contacto directo entre boca y pico. El contacto con los pjaros no tiene por qu ser directo o prolongado. La diseminacin persona a persona de C. psittaci es poco frecuente.

Epidemiologa
El concepto actual de la epidemiologa de la infeccin por Chlamydophila pneumoniae se basa en los datos de estudios retrospectivos con muestras de suero recogidas a partir de pacientes con enfermedades del tracto respiratorio. Alrededor del 50% de los adultos tienen anticuerpos frente a C. pneumoniae. L a tasa de prevalencia de anticuerpos en nios es baja, aumenta de forma abrupta en los adolescentes, contina aumentado durante la madurez y permanece con valores elevados en la vejez; las tasas son entre un 1 0 % y un 2 5 % ms elevadas en varones. Los datos de los estudios serolgicos retrospectivos y prospectivos indican que la enfermedad causada por C. pneumoniae tiene carcter endmico en EE.UU. y epidmico en Escandinavia y Finlandia, aunque los brotes epidmicos no aparecen con una periodicidad estacional consistente (Grayston, 1990. 1989). C. pneumoniae parece ser un patgeno bumano primario que se transmite de persona a persona, sin que en la transmisin participe un reservorio avcola o animal alguno. El mecanismo y lugar de la transmisin, el periodo de incubacin y la infectividad del microorganismo no han sido determinados todava. Los datos obtenidos a partir de estudios retrospectivos realizados en soldados finlandeses han puesto de manifiesto que los brotes epidmicos causados por C. pneumoniae se prolongan de cinco a ocho meses, lo que sugiere que la infeccin se disemina lentamente, incluso en grupos de poblacin cerrados (Kleemola. 1988).

Patogenia y patologa
Chlamydophila psittaci penetra en el cuerpo a travs del tracto respiratorio y es transportada por los macrfagos hasta el hgado y el bazo, donde tiene lugar la multiplicacin de la bacteria. Seguidamente, los microorganismos pasan a la sangre y llegan al pulmn, que es el blanco primario de la infeccin, y a otros rganos. El examen histolgico del tejido pulmonar revela la presencia de linfocitos en los espacios alveolares e intersticiales. Se pueden apreciar tambin pequeas hemorragias y macrfagos con inclusiones mtracitoplasmticas. El hgado, el bazo y los ganglios linfticos hiliares aumentan de tamao y pueden mostrar focos de necrosis, y en los casos graves pueden verse tambin afectados el miocardio, el pericardio, las meninges, el cerebro y las glndulas suprarrenales

Patogenia
La patogenia de la infeccin por C. pneumoniae es desconocida. Debido a que la enfermedad es. generalmente, suave y autohmitada. no hay disponibles dalos de autopsias.

Manifestaciones

clnicas

Manifestaciones

clnicas

La psitacosis comienza bruscamente tras un periodo de incubacin de una a dos semanas, con fiebre y escalofros, o se manifiesta gradualmente con un aumento paulatino de la fiebre y la sensacin de malestar general. Un sintoma

Se estima que C. pneumoniae es responsable de alrededor de un 1 0 % de los casos de neumona detectados en u n a comunidad (Grayston, 1990). L a neumona es. usualmente, suave, con la aparicin de un nico infiltrado subsegmentano. aunque puede tener un carcter grave, especialmente en personas ancianas y en aquellos que tienen enfermedades crnicas. Frecuentemente comienza con faringitis y ronquera, seguidas de u n a tos persistente. Aunque la neumona es el sndrome ms frecuentemente asociado con la

CAPTULO 49

INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

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Tabla 49-2 Tipos d e e s p e c m e n e s clnicos para la deteccin d e C. trachomatis Entermedad Cervicitis mucopurulenta Sndrome ureiral agudo (mujeres) Endometritis aguda Salpingitis aguda Uretritis no gonoccica (hombres) Conjuntivitis de inclusin Tracoma Linfogranuloma venereo Espcimen Hisopo endocervical orina" Hisopo uretral, orina" Aspirado endometrial Biopsia de trompas de Falopio Hisopo uretral, orina" Hisopos o raspados conjuntivaies Hisopos o raspados conjuniivales Aspirado de nodulo linftico, biopsia de la lesin ulcerosa, suero Suero, aspirado traqueobronquial. hisopo nasofarngeo

Mtodos de deteccin directa no basados en el cultivo

Fluorescencia directa con anticuerpos. La prueba de deteccin mediante fluorescencia directa con anticuerpos (DFA). que fue uno de los primeros mtodos no basados en el cultivo desarrollados para la deteccin de clamidias, permite la visualizacin directa de los cuerpos elementales de C. trachomatis en frotis de los especmenes clnicos. El tiempo total necesario para la ejecucin del procedimiento oscila entre 30 y 60 minutos. Es el nico mtodo que permite determinar directamente la calidad del espcimen Las muestras que contienen clulas columnares o metaplsicas escamosas son adecuadas, mientras que aquellos especmenes en los que existen pocas clulas columnares, o tienen una excesiva cantidad de mucus, o en los que hay una excesiva cantidad de clulas escamosas, no son aceptables. Sin embargo, la interpretacin de los resultados de la observacin de los frotis es subjetiva, y la fatiga del analista puede representar un problema en aquellas situaciones en las que hay que procesar un gran volumen de muestras. En la actualidad hay disponibles anticuerpos monoclonales procedentes de diferentes firmas comerciales. Los anticuerpos dirigidos frente a la MOMP especifica de especie de C. trachomatis parecen ser los que presentan u n a mayor especificidad, y producen una fluorescencia ms intensa que la que se observa con anticuerpos dirigidos frente al LPS de las clamidias (Ces. 1988). por lo que son los que se utilizan ms frecuentemente (Woods, 1994). Ocasionalmente, incluso los anticuerpos especficos de especie pueden teir otras bacterias distintas a C. trachomatis. posiblemente debido a una adsorcin inespecifica de las inmunoglobulinas o a una reactividad cruzada. La tincin de bacterias distintas de C. trachomatis es particularmente frecuente en el caso de especmenes rectales; en consecuencia, el cultivo es el mtodo preferido en este supuesto, aunque existen algunos reactivos para D F A aprobados para la evaluacin de muestras rectales. Tambin se h a desculo la existencia de reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales entre miembros de la familia Chlamydiaceae y Bartonella. La sensibilidad de la tcnica DFA varia entre el 50% hasta casi el 100% en comparacin con el cultivo como mtodo estndar, dependiendo de la prevalenca de la infeccin en la poblacin que esl siendo objeto de evaluacin y del nmero de cuerpos elementales necesarios para obtener un resultado positivo (Bames, 1989). En general, la sensibilidad es ms elevada, con valores de corte ms bajos para los cuerpos elementales y en poblaciones con u n a alta prevalencia de la enfermedad. La especificidad del DFA suele ser superior al 95%. Enzimoinmunoensayos. Los enzimoinmunoensayos (EIA) detectan el LPS de las clamidias utilizando como sonda anticuerpos mono o policlonales etiquetados con una enzima que convierte un sustrato incoloro en un producto coloreado. Tanto los sistemas de fase slida, que utilizan plstico o microesferas recubiertas con el anticuerpo, como los sistemas de membrana estn disponibles comercialmente. El tiempo total de procesamiento oscila entre 15 y 30 minutos para los sistemas de membrana, y entre tres y cuatro horas para los sistemas de fase slida. Las ventajas de los EIA son la objetiva interpretacin de los resultados y la facilidad de uso para procesar un gran nmero de muestras. Al igual que en el caso de la DFA. la sensibilidad de los EIA varia (entre cerca del 70% hasta el 100%) en comparacin con el cultivo como mtodo estndar, y tiende a ser ms elevada en poblaciones con una alta prevalencia de la enfermedad, como es el caso de aquellas personas que acuden a una clnica para enfermedades de transmisin sexual (Bames. 1989: Clarke, 1993: Ehret, 1993; Kluytmans. 1993: Mills. 1992; Warren, 1993). La especificidad del EIA es del 95% o incluso superior. Las causas que explican los falsos positivos son la presencia de una infeccin bacteriana del tracto urinario (Demaio, 1991) o la contaminacin del espcimen con m o c o cervical o secreciones vaginales. Este ltimo problema puede reducirse mejorando la tcnica de recogida de las muestras (eliminando el moco cervical y obteniendo una verdadera muestra endocervical). asi como utilizando anticuerpos bloqueantes (Mills. 1992). Hibridacin de cidos nucleicos. Esl comercialmente disponible una sonda de ADN marcada con ster de acridina, complementaria del ARN ribosomal de C. trachomatis. que permite la deteccin directa de este microorganismo en especmenes urogenitales y conjuntivales. El mtodo requiere el empleo de un bao de agua y de un medidor de luminiscencia. El tiempo total de procesamiento requerido est entre dos y tres horas. La sensibilidad de la prueba comparada con la del cultivo como mtodo de referencia varia enlre las muestras endocervicales y los especmenes recogidos con hisopos ure-

Neumonitis (nios) "La orina es u n espcimen aceptablo para algunos enzimoinmunoensayos y pata las pruebas comerciales de amplilicacin de cidos nucleicos

>

infeccin por C. pneumoniae, los estudios serolgicos realizados durante brotes epidmicos entre soldados han mostrado que tan slo un 10% de las infecciones por C. pneumoniae evolucionan a neumona, lo que sugiere que la infeccin es, frecuentemente, suave o asintomtica y no detectada. Otras manifestaciones de la infeccin por C. pneumoniae son bronquitis, faringitis, fiebre de origen desconocido, otitis, procesos seudognpales, miocarditis, endocarditis y posiblemente ateroesclerosis (Campbell, 1998).

Diagnstico de laboratorio Chlamydia trachomatis

El tipo de espcimen utilizado para el diagnstico de las infecciones causadas por C. trachomatis est determinado por las manifestaciones clnicas de la enfermedad (Tabla 49-2). Los procedimientos especficos empleados para la recoleccin de los diferentes tipos de muestras se describen en el Capitulo 57. La mayor parte de las infecciones afectan al epitelio de las membranas mucosas, por lo que los especmenes deben recogerse directamente de la superficie afectada y contener una muestra adecuada y representativa de clulas epiteliales Los fluidos purulentos no son un tipo adecuado de espcimen, por lo que deben ser eliminados antes de proceder a la recogida de la muestra con un hisopo o un cepillo. De entre los diferentes tipos de hisopos existentes, los que tienen la torunda de dacrn o rayn son los preferidos. Los hisopos con mangos de madera no deben ser utilizados, ya que la madera es txica para la bacteria. Los hisopos de alginato calcico pueden resultar txicos para las clamidias o para las clulas que permiten su crecimiento. Los hisopos con torundas de algodn son aceptables, aunque ocasionalmente pueden resultar txicos para las clamidias.

Cultivo celular
Los cultivos celulares son actualmente el mtodo de referencia para el diagnstico de las infecciones causadas por clamidias y deben utilizarse cuando el diagnstico es objeto de controversia y en los casos en los que existe sospecha de agresin o abuso sexual. Las lneas celulares utilizadas ms frecuentemente son McCoy o mono verde Butfalo. Ambas tienen una sensibilidad parecida, pero las segundas son ms fciles de mantener y ms resistentes a las sustancias citotxicas, habindose observado que en las mismas se forma un nmero ms elevado de inclusiones y de mayor tamao (Krech, 1989). La adicin de cicloheximida (0,5 pl-1,5 pl/ml) al medio de cultivo aumenta la sensibilidad. Las clulas crecen en m o n o c a p a en la superficie de cubreobjetos situados en el interior de sheil vials, o en placas de 24 pocilios, o en la superficie de placas de cultivo de poliestireno de 48 o de 96 pocilios. Para incrementar la recuperacin de C. trachomatis, los especmenes son sonicados o agitados en un mezclador vrt e x antes de ser inoculados, para liberar los cuerpos elementales de las clulas infectadas, y los shell vials inoculados o las placas de cultivo son centrifugados. Tras 48-72 horas de incubacin, las monocapas de clulas son fijadas y seguidamente teidas con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorescena. Si se utiliza un sistema de cultivo de 96 pocilios, se recomienda resembrar los especmenes que son negativos a las 48 horas para incrementar la eficiencia del proceso de deteccin; sin embargo, la deteccin no aumenta significativamente cuando se utiliza u n a estrategia semejante en el caso de emplear contenedores o placas de 24 pocilios (Schacter. 1987; Zimmerman, 1992).

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

trates en el hombre (del 76% al 97%) (Blanding, 1993: Clarke, 1993; Warren, 1993; iwen, 1991; Kluytmans, 1994, 1991). La especificidad de la sonda es del 97% o superior, y puede ser mejorada an ms mediante un ensayo de competicin (Woods. 1996). Amplificacin de cidos nucleicos. Existen diferentes mtodos para la deteccin directa de C. trachomatis en especmenes endocervicales y uretrales tomados con hisopo, y en muestras de orina tanto de hombre como de mujer, basados en la amplificacin de cidos nucleicos, que estn disponibles comercialmente en la actualidad. El tiempo total de procesado oscila entre cuatro y cinco horas. Los datos de estudios comparativos entre el mtodo de amplificacin de cidos nucleicos y el cultivo indican que el primero es altamente especfico y ms sensible que el segundo (Vincelette, 1999: Goessens, 1997; Ferrero, 1998: Wylie. 1998; Mahony, 1998; Toye. 1998; Carroll, 1998; Puolakkainen, 1998). Dado el precio considerable del mtodo basado en la amplificacin de cidos nucleicos, el director de cada laboratorio debe determinar si los beneficios compensan la inversin en su poblacin de pacientes.

Chlamydophila

pneumoniae

Verificacin de las pruebas no basadas en el cultivo

Los expertos del Centro para la Prevencin y Control de las Enfermedades (CDC) recomiendan que los resultados positivos resultantes de las tcnicas de rastreo (DFA, EIA, sondas) deben confirmarse con una prueba complementaria si un resultado falsamente positivo pudiera tener consecuencias mdicas, sociales o psicolgicas adversas (CDC, 1993). En poblaciones donde la prevalencia de la infeccin es baja, la confirmacin puede ser algo habitual, pero debe tener carcter selectivo en poblaciones con elevada prevalencia. La confirmacin mediante cultivo es un procedimiento ptimo, pero requiere un segundo espcimen recogido bien durante la primera visita o en una segunda sesin. Los test EIA con anticuerpos bloqueantes, los ensayos de competicin con sondas o la monitorizacin del medio de transporte con un test DFA pueden ser mtodos de verificacin alternativos.

El diagnstico de la infeccin causada por C. pneumoniae se basa fundamentalmente en los test de tipo serolgico (Grayston, 1990). El test de microinmunofluorescencia frente al antgeno TWAR es especfico para C. pneumoniae. Las IgM aparecen unas tres semanas despus del comienzo de la enfermedad primaria, generalmente comienzan a disminuir entre los dos a seis m e s e s siguientes hasta un nivel en el que no pueden ser detectados, y pueden no reaparecer aunque haya una reinfeccin. Las inmunoglobulinas G se detectan entre seis y ocho semanas despus del inicio de la infeccin primaria, permanecen de por vida, y su ttulo puede incrementarse una o dos semanas despus de que se haya producido una reinfeccin. Los resultados de los test serolgicos indicativos de una infeccin aguda son: un incremento de 4 veces o superior del titulo de IgG entre dos muestras de suero tomadas en la lase aguda y de convalencia de la enfermedad respectivamente, un nico ttulo de 1:512 o superior o un titulo de IgM de 1:16 o superior. C. pneumoniae puede ser aislada en cultivos de tejidos, aunque crece peor que C. trachomatis (Roblin, 1992).

Tratamiento
Las tetraciclinas son el tratamiento de eleccin para las infecciones causadas por clamidias. Para las infecciones genitales por C. trachomatis. otros agentes antimicrobianos eficaces son la eritromicina, la acitromicina, el sulfisoxazol y el ofloxacino. Las infecciones oculares por C. trachomatis requieren un tratamiento sistmico con tetraciclina (en adultos) o con eritromicina o sulfisoxazol (en neonatos); la terapia tpica suprime los sntomas pero no elimina al microorganismo. Los macrlidos son una alternativa aceptable para el tratamiento de las infecciones causadas por C. pneumoniae. Las sulfonamides son ineficaces frente a C. psittaci y C. pneumoniae.

Pruebas

serolgicas

INFECCIONES POR RICKETTSIAS

El concepto de rickettsia se desarroll, histricamente, al mismo tiempo que se defina la naturaleza molecular y fsica de los virus (Weiss, 1988). En contraste con los agentes virales que afectan al hombre, que tambin necesitan clulas eucariticas hospedadoras para su multiplicacin, las rickettsas son bacterias con una pared celular tpicamente gramnegatva y su crecimiento es inhibido por determinados antibiticos. Las rickettsas se diferencian, adems, de otras bacterias que tambin son parsitos intracelulares obligados por su ecologa y modo de transmisin mediante insectos artrpodos que actan como vectores. El esquema taxonmico tradicional de las rickettsas basado en algunas de esas caractersticas fenotpicas. como son su multiplicacin intracelular y su transmisin va insectos artrpodos, necesita una modificacin importante a la luz de los ltimos conocimientos derivados de los estudios de comparacin de secuencias gnicas. Los gneros que contienen especies patgenas para el ser humano son Rickettsia. Ehrlichia. Coxiella y Bartonella (originalmente Rochalimaea) (Weiss, 1984). Basndose en las caractersticas genticas y fenotpicas. el agente etiolgico del tifus scrub o tifus de las malezas, Orientia (originalmente Rickettsia) tsutsugamushi ha sido incluido en un nuevo gnero independiente (Tamura, 1995). A pesar de su tradicional relacin con la "rickettsiologa" y la transmisin por artrpodos, el gnero Bartonella (originalmente Rochalimaea) incluye organismos que pueden crecer en medios carentes de clulas y que no pertenecen al orden Rickettsiales (Brenner, 1993). Adems, los miembros de los gneros Rickettsia. Orientia, Ehrlichia y Bartonella estn ms relacionados entre s que con las especies del gnero Coxiella. Agrupadas por gneros, en este captulo se describen las siguientes enfermedades: Rickettsia, fiebre maculosa de las Montaas Rocosas, fiebre botonosa, fiebre de la picadura de la garrapata africana, ricketlsiosis vesicular, tifus murino; Orientia, lifus scrub o tifus de las malezas; Ehrlichia, "ehrlichiosis" monocitica humana causada por chaffeensis y las infecciones granulocticas originadas por phagocytophila y ewingii; Coxiella, fiebre Q; y Bartonella, enfermedad por araazo de gato, angiomatosis bacilar y peliosis, fiebre de las trincheras y bartonellosis sudamericana. Las enfermedades causadas por cada gnero constituyen entidades clnicas coherentes y agrupadas y, en conjunto, las enfermedades causadas por rickettsas plantean problemas similares en lo que respecta a su diagnstico, con aproximaciones tcnicas semejantes para su solucin.

Las pruebas serolgicas tienen muy poca utilidad para el diagnstico de las infecciones por clamidias por dos razones. En primer lugar, los anticuerpos frente a C. trachomatis persisten durante bastante tiempo despus de que la infeccin remita, por lo que un resultado serolgico positivo no tiene por qu relacionarse necesariamente con un proceso infeccioso activo. Por otro lado, muchas pruebas serolgicas no son especficos para C. trachomatis. ya que estos mtodos detectan anticuerpos frente a determinantes antignicos especficos de gnero. Las excepciones a esta norma estn representadas por el diagnstico del LGV y de la neumonitis causada por C. trachomatis en nios. Debido a que el LGV tiene un largo periodo de latencia y a que el diagnstico sufre, a menudo, retrasos, los anticuerpos estn generalmente presentes cuando se t o m a la muestra de suero correspondiente a la fase aguda de la enfermedad, por lo que, a menudo, no es posible detectar un incremento de cuatro veces en el ttulo de anticuerpos entre las muestras de suero tomadas en la fase aguda y en la de convalecencia. Por tanto, un titulo nico o estable de 1:64 o superior de fijacin del complemento apoya un diagnstico presuntivo de LGV. Para el diagnstico de la neumonitis por C. trachomatis en nios, la deteccin de inmunoglobulinas M (IgM) especificas medante microinmunofluorescencia puede ser el mtodo de eleccin (un ttulo de 1:32 o superior es diagnstico).

Chlamydophila

psittaci

C. psittaci puede crecer en cultivos celulares, aunque su manipulacin slo es recomendable en centros especialmente equipados y con personal experto, porque este organismo es particularmente virulento y se ha asociado frecuentemente a infecciones adquiridas en laboratorio. La infeccin por C psittaci se diagnostica usualmente por mtodos serolgicos. preferentemente comparando las muestras de suero obtenidas en las fases aguda y de convalecencia, respectivamente. Un incremento de cuatro veces (o superior) en el ttulo de anticuerpos, entre ambas muestras en un paciente con sntomas de psitacosis. apoya un diagnstico positivo. Un nico ttulo de 1:32 o superior en un individuo con una patologa cuyos sntomas sean compatibles representa una evidencia presuntiva de psitacosis. Los anticuerpos se detectan normalmente hacia el final de la segunda semana de la enfermedad, aunque un tratamiento anticipado con antibiticos puede retrasar su aparicin durante varias semanas. Incrementos falsamente positivos en el titulo de anticuerpos se detectan raramente en individuos afectados de legionelosis.

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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

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Infecciones causadas por organismos del gnero Rickettsia Estructura y funcin

Las rickettsias de los grupos de la liebre maculosa y del tifus son bacterias genticamente relacionadas que tienen una delgada morfologa bacilar (0.3 a 0,5 x 1 a 2 urn) y una pared celular tpica de gramnegativas que posee lipopolisacrido con determinantes antignicos que diferencian los dos grupos. Todas las especies del gnero Rickettsia viven libres en el citosol de la clula hospedadora y s e multiplican por biparticin Las rickettsias se adhieren a la clula hospedadora a travs de una adhesina de naturaleza proteica, penetran seguidamente mediante fagocitosis inducida y salen por ltimo del fagosoma hasta el citosol (Li, 1992, 1998: Walker, 1984). Todos estos eventos tienen lugar en pocos minutos y estn asociados con una actividad fosfolipsica A , aparentem e n t e de origen rickettsial. Las rickettsias del grupo de la fiebre maculosa se desplazan en el interior de las clulas infectadas y durante el proceso de liberacin estimulan la polimerizacin de la actina F de la clula hospedadora en un polo de la m i s m a (Heinzen, 1993). Aquellas rickettsias que poseen esta capacidad (p. ej.. R. rickettsii) salen ms rpidamente de las clulas hospedadoras y se diseminan con mayor facilidad que aquellas especies que no la tienen (p. ej.. R. prowazekii). que se dividen inlracelularmente para dar lugar a un gran nmero de microorganismos hasta que la clula husped estalla, liberando a las bacterias formadas en su interior. De acuerdo con los datos actuales de secuen?

cias de ADN. las especies del gnero Rickettsia que son patgenas del hombre han evolucionado en tres genogrupos (Tabla 49-3) (Roux. 1995.1997; Stolhard. 1995). El grupo del tifus incluye las especies R. prowazekii y R. typhi. En el grupo de la fiebre maculosa se encuentran las especies R. rickettsii. R. conorii. R. aponica, R. atricae. R. honei. R sibinca y R. slovaca. Una subdivisin recientemente identificada incluye a R. akari. R. australis y R tefe. Rickettsia akan y R. australis fueron consideradas Iradicionalmente c o m o miembros alejados de las otras especies del grupo de la liebre maculosa. con las que comparten los antgenos de naturaleza lipopolisacaridica.

Fiebre maculosa de las Montaas Rocosas

La ms grave de todas las rickettsiosis. la liebre maculosa de las Montaas Rocosas (RMSF). tiene una tasa de mortalidad importante, habitualmenle del 5%, incluso entre nios y adultos jvenes inmunocompelentes y sin patologa previa (Dalton. 1995a: Paddock. 1999). En la naturaleza. Rickettsia rickettsii habita normalmente en las garrapatas: Dermacentor vanabilis. la garrapata americana del perro, en los dos tercios del este de EE.UU. y California: Dermacentor andersoni, la garrapata de la madera de las Montaas Rocosas, en el este de EE.UU.; Rhipicephalus sanguineus. la garrapata del perro marrn, en Mxico: y Amblyomma cajennense. en Amrica del Sur Estas garrapatas conservan a R. nckettsii en su intenor mientras mudan de una fase a otra (larva, ninfa y adulto) y transovricamente de generacin en generacin. Menos de un 1 por 1.000 de garrapatas son portadoras de clulas virulentas de R. rickettsii,

Tabla 49-3

Infecciones causadas por Rickettsia. Ehrlichia, Coxiella y Bartonella Enfermedad Distribucin geogrfica Transmisin
Mordedura de garrapata Mordedura de garrapata Mordedura de qarrapata Mordedura de garrapata Mordedura de garrapaia (presumiblemente) Mordedura de garrapata (presumiblemente)

A g e n t e etiolgico
Fiebres maculosas

R. rickettsii R. conorii R. atricae R. sibirica R. japnica R. honei

Tifus

Fiebre maculosa de las Montanas Rocosas Amrica del Norte. Central y del Sut Fiebre botonosa Sur de Europa. frica. Rusia, Georgia. Oriente Medio, subcontinente indio Fiebre africana de las garrapatas Sur y este de frica Tifus de las garrapatas del norte de Asia Rusia, China. Mongolia, Pakistn Fiebre manchada oriental Japn Fiebre manchada de la isla de Flinders Australia, sudeste asitico Tilus epidmico

R prowazekii

R prowazekii

Enfermedad de Bnll-Zinsser

R rowazekn R typhi

Tifus de las ardillas voladoras Tifus murino

Distribucin mundial (polencialmente) Heces de piojo infectado en dcadas recientes en frica. en erosiones cutneas Amrica del Sur. Cenlroamnca, Mxico. Asia Distribucin mundial; en cualquier lugar Reactivacin de una infeccin latente donde residan personas que hayan padecido en el pasado tifus epidmico Heces de pulgas o piojos de la ardilla Estados Unidos infectados (presumiblemente) Distribucin mundial en zonas tropicales y subtropicales Estados Unidos. Ucrania. Croacia, Corea Este de Australia Estados Unidos Mordedura de acaro Mordedura de garrapa!; Mordedura o heces de | (presumiblemente) Mordedura de acaro

Otras fiebres rickettsiales R akan Rickeltsiosis vesicular R australis Tifus de la garrapata de Queensle R telis Tifus de la pulga del galo

Tilus scrub Orienlia tsutsugamushi Tilus setub (tifus de las malezas)

Sudeste asiatico Japn China Sri Lanka, India, Rusia asitica. Tadyikistn indonesia, oeste del Pacifico, norte de Australia Estados Unidos, Europa. frica, Tailandia Estados Unidos, Europa Estados Unidos Japn. Malasia Distribucin mundial

Ehrlichiosis

E. chatfeensis E phagocytophila E ewmgu

Ehrlichiosis monocitica humana Ehrlichiosis granulocitica humana Ehrlichiosis humana por Ehrliclva cwingii Ricketlsiosis sennetsu Fiebre Q

Mordedura de garrapata Mordedura de qarrapata

M i D e c

i (presumiblemente)

Material seco procedente de animales infectados y. posiblemente, ingestin de alimentos de origen animal o mordedura de garrapata Picadura de mosquito Araazo o mordedura de galo Araazo o mordedura de galo (presumiblemente) Heces mlectadas del piojo Pediculus

Barlonellosis

bacillilormis B henselae B. clarridgeirae B quintana

Enfermedad del araazo de galo, angiomatosis bacilar y peliosis Enfermedad del araazo de gato (semejante) Fiebre de las trincheras

Oeste de America i Distribucin mundi; Distribucin mundial (probablemente) Europa y Amrica del Norte

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

que parecen ser medianamente patognicas para las garrapatas. Nuevas lneas de garrapatas se infectan al alimentarse de roedores enfermos, reponiendo la poblacin de bacterias mantenidas transovricamente en las garrapatas. Las infecciones tienen lugar cuando y donde una persona se encuentra con una garrapata infectada por R. r/crefs//(Helmick, 1984). Aunque en los ltimos aos se han detectado casos de RMSF en prcticamente todos los estados de la unin, con excepcin de Hawaii, Alaska y Vermont. la mayor incidencia se ha registrado en los estados del Atlntico sur. desde Maryland a Georgia, y los estados centrales del sur. Oklahoma, Missouri, Arkansas y Tennessee. La mayor parte de casos aparecen al final de la primavera y en verano, aunque, particularmente en las latitudes ms sureas, pueden darse casos incluso en invierno. L a mayor incidencia se detecta entre nios y otras personas que estn expuestas a las picaduras de las ganapatas durante actividades al aire libre. La relacin entre casos y mortalidades es ms elevada entre afroamericanos, varones y personas mayores de 30 aos. Casos fulminantes de RMSF (muerte al quinto da de la enfermedad) tienen lugar asociados con una hemolisis moderada, por ejemplo, en hombres afroamericanos con una deficiencia en la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (Walker, 1983). Las rickettsas son inyectadas a travs de la dermis del paciente, mediante las secreciones de las glndulas salivares de la garrapata infectada, entre 6 y 1 0 horas despus de que la garrapata se haya alimentado, y se diseminan por todo el cuerpo por medio del torrente circulatorio, El endotelio vascular es el blanco de la invasin intracelular, con un cierto grado de invasin de las clulas musculares de los vasos sanguneos adyacentes. El endotelio infectado es daado por la produccin de molculas reactivas derivadas del oxgeno y, posiblemente, por la actividad de la fosfolipasa A. (Silverman, 1992.1997). El dao en el endotelio se manifiesta en un incremento de la permeabilidad vascular, edema, hipovolem i a e hipotensin. Las consecuencias del dao vascular a nivel del sistema nervioso central (SNC) y los pulmones, y que ponen en peligro la vida del paciente, son la menmgoencefalitis rickettsisica y el edema pulmonar no cardiognico. En los primeros estadios de la enfermedad, las lesiones muestran la presencia de rickettsias en las clulas endoteliales. sin trombos o respuesta celular alguna. En estadios ms avanzados, el infiltrado linfohistoctico perivascular caracterstico se manifiesta como una neumona intersticial, miocarditis intersticial, nodulos guales perivasculares en el cerebro y lesiones vasculares similares en la dermis, tracto gastrointestinal, hgado, msculos esquelticos y rones. Las lesiones extensas pueden estar acompaadas por hemonagias focales, pero rara vez por microinfartos, excepto en la sustancia blanca del cerebro.

kettsia japnica se ha descrito solamente en Japn, mientras que las infecciones en humanos causadas por R. australis y R. honeise han detectado exclusivamente en Australia, Despus de un periodo de incubacin medio de siete das, estas enfermedades comienzan con fiebre, dolor de cabeza y mialgias. Frecuentemente, se puede descubrir una escara tras un e x a m e n cuidadoso de la piel en esa fase de la enfermedad. En la patologa de estas fiebres maculares est perfectamente descrito que esta escara o botn negro conesponde al punto donde se produjo la inoculacin de la rickettsia. c o m o consecuencia de la mordedura de la garrapata (Walker, 1988a). La infeccin del endotelio y el dao causado por R. conorii en la escara produce necrosis drmica y epidrmica y edema perivascular, Entre las defensas del hospedador que llevan a cabo la destruccin de las rickettsias intracelulares se incluyen los linfocitos T y los macrfagos, que se infiltran alrededor de los vasos sanguneos de la dermis infectados (Herrero-Herrero, 1987). La activacin de las clulas endoteliales por la accin de atocinas induce una actividad que destruye intracelularmente las rickettsias, aunque la eliminacin final de los microorganismos est mediada por los linfocitos T citotxicos. La infeccin diseminada del endotelio se traduce en la aparicin de una erupcin maculopapular. meningoencefalitis y lesiones vasculares en pulmones, riones, tracto gastrointestinal y corazn (Walker, 1985). Existe una correlacin entre el aumento moderado de la concentracin de transaminasas hepticas y la aparicin de necrosis hepatocelular multifocal y lesiones semejantes a granulomas (Walker, 1986).

Rickettsiosis

vesicular

Rickettsia akan se mantiene en la naturaleza por transmisin transovrica en el acaro Liponyssoides sanguineus, un ectoparsito del ratn domstico. Mus musculus. Este microorganismo se ha aislado solamente en EE.UU., Croacia, Ucrania y Corea, aunque ello pueda indicar simplemente que los estudios en relacin con la distribucin de esta especie de rickettsia no son m u y amplios. Tras un periodo de incubacin de aproximadamente 10 das, aparece una ppula en el lugar donde se produjo la picadura del acaro que evoluciona hasta convertirse en una escara con un tamao entre 1 cm y 2,5 cm. La enfermedad comienza con escalofros, fiebre, malestar general, fuerte dolor de cabeza y mialgia. La erupcin, que aparece entre dos y seis das ms tarde, es maculopapular inicialmente. ms tarde papular, y en los casos tpicos se vuelve pustular y finalmente vesicular. Algunos pacientes tambin experimentan nuseas, vmitos, faringitis, fotofobia, esplenomegalia y rigidez en la nuca. El examen histopatolgico de la escara revela una necrosis coagulativa de la epidermis, daos en los vasos sanguneos subyancentes y un infiltrado linfoctico perivascular en el que los macrfagos parecen ser las clulas atacadas principalmente (Brettman, 1981; Kass, 1994; Walker, 1999). La linfadenopatia regional y la erupcin cutnea son consecuencia, posiblemente, de la diseminacin del microorganismo por el sistema linftico y circulatorio, respectivamente,

La fase clnica de la enfermedad comienza habitualmente con fiebre, dolor de cabeza y mialgias entre 2 y 1 4 das despus de la mordedura de la garrapata (Kaplowitz, 1981). Durante los tres primeros das de la enfermedad son frecuentes las nuseas, vmitos, dolor y ablandamiento abdominal y diarrea. La erupcin cutnea que, generalmente, comienza entre el tercer y quinto da se inicia tpicamente con la aparicin de mculas alrededor de las muecas y tobillos, y ms tarde en brazos, piernas y tronco. Las lesiones se vuelven maculopapulares, y en la mitad de los casos aparece una petequia central en muchas de las mculas papulares. La afectacin caracterstica de las palmas de las manos y las plantas de los pes se detecta slo en la mitad de los afectados como una manifestacin tarda. El fallo renal es una caracterstica de los casos graves de RMSF. La afectacin del sistema nervioso central es notoria; entre el 8% y el 10% de los afectados sufren ataques y c o m a como preludio a un desenlace fatal. En el 50% de los casos existe trombocitopenia, pero la coagulacin intravascular diseminada (DIC) es m u y poco frecuente (Elghetany, 1999).

Tifus murino
La infeccin endmica producida por R. typhi, transmitida por la picadura de la pulga, el tifus murino, es en la actualidad la enfermedad ms importante dentro del grupo del tifus en EE.UU.. causando una gran morbilidad en todas las regiones templadas del mundo (Azad, 1990). Histricamente, las epidemias de infecciones por R. prowazekii transmitidas por piojos han tenido u n a gran influencia en el desenlace de muchas campaas militares, y han constituido un grave azote entre las poblaciones vctimas de geas, hambrunas y desastres naturales (Patterson, 1993; Zinsser, 1935). Rickettsia prowazekii contina provocando infecciones en reas empobrecidas y deprimidas del mundo y reaparece en situaciones como las que provocan la guerra en Burundi y las condiciones sociales, polticas y econmicas actuales en la extinta Unin Sovitica. El recrudecimiento de las infecciones latentes por R. prowazekii puede tener lugar aos ms tarde de la infeccin primaria en inmigrantes procedentes de reas afectadas por el tifus. En EE.UU. se ha detectado una transmisin endm i c a de R. prowazekii a partir de un reservorio infeccioso natural constituido por las ardillas voladoras y sus ectoparsitos (McDade, 1980).
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Fiebre botonosa y otras fiebres maculosas

Rickettsia conorii ha sido aislada en el sur de Europa; norte, este y sur de frica; Israel; la India, Pakistn, Rusia, Georgia y Ucrania. L a ecologa de R. conoriiy la epidemiologa de la fiebre botonosa estn ntimamente ligadas a las garrapatas, especialmente Rhipicephalus sanguineus. que alberga a la rickettsia transovricamente y transmite la infeccin al hombre cuando se alimenta (Walker, 1991). Se han diagnosticado casos importados en viajeros que regresan a EE.UU. y a pases del norte de Europa desde frica y pases de la cuenca mediterrnea. La tasa de mortalidad entre los pacientes hospitalizados oscila entre el 1 , 4 % y el 5,6%, especialmente en pacientes que tienen alguna otra enfermedad subyacente. Una enfermedad ms suave causada por R. aricae aparece con bastante frecuencia en viajeros que regresan del sur de frica. La especie R. sibirica ha sido aislada en Rusia, China. Mongolia y Pakistn. Ric-

El tifus murino se da particularmente en zonas costeras tropicales y subtropicales donde abundan las ratas (Rattus rattus) y las pulgas. Las pulgas absorben las rickettsias de la sangre de las ratas infectadas, manteniendo la infeccin durante todo su perodo de vida normal. La transmisin transovrica solamente tiene lugar a bajos niveles; por tanto, la transmisin horizontal

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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

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entre ratas es un tactor clave para el mantenimiento de R. typhi en la naturaleza. Otros ciclos mamfero-artrpodo se encargan del mantenimiento de la rickettsia y pueden ser responsables de la transmisin de la infeccin a los seres humanos (p. ej., la pulga del gato. Ctenocephalides tefe, y la zarigeya en Texas y California) (Schriefer, 1994b). Se cree que el ser humano es infectado, habitualmente, por inoculacin intradrmica de heces contaminadas a travs de la piel erosionada por el rascado. Sin embargo, la inhalacin de aerosoles que contengan heces pulverizadas de las pulgas o la propia mordedura de la pulga pueden ser tambin responsables de la transmisin en algunos casos Despus de un perodo de incubacin de entre una y dos semanas, la enfermedad comienza con fiebre acompaada en algunos casos por una fuerte jaqueca, escalofros, mialgias y nusea. En el 80% de los pacientes de piel blanca aparece, entre el quinto y sexto da. un exantema macular o maculopapular, que es particularmente evidente en el torso, porcentaje que baja hasta el 20% en personas con la piel fuertemente pigmentada. Una baja proporcin de pacientes tienen tos y presentan infiltrados pulmonares. Los individuos fuertemente afectados pueden sufrir coma, ataques y otros sntomas neurolgicos. Aproximadamente un 10% de los pacientes hospitalizados deben ser ingresados en la unidad de cuidados intensivos, y entre un 1% y un 2% de los afectados por el tifus murino fallecen (Dumler, 1991). Las lesiones patolgicas del tifus murino incluyen inflamacin endotelial e infiltracin linfohistocistica perivascular que implican a los vasos sanguneos de la dermis, SNC. pulmones, corazn, tracto gastrointestinal y rones (Walker, 1989). Las consecuencias ms serias son la menmgoencefalomielitis y la lesin alveolar difusa.

un eptopo presente en el lipopolisacndo de la pared celular especifico del grupo de la fiebre maculosa se puede detectar la presencia de R. rickettsii. R. conorii. R. akari, R japnica. R. australis. R. atricae. R. honei y R. sibinca en muestras de tejidos fijadas con formol e incluidas en parafina. mientras que otro anticuerpo monoclonal especfico frente al lipopohsacrido de los miembros del grupo del tilus se ha utilizado de lorma similar para la deteccin de R. prowazekii y R. typhi'(Walker. 1997b). En el m o m e n t o actual, no estn disponibles comercialmente los reactivos para el diagnstico inmunohistoquimico de las rickettsiosis, aunque es posible que en el futuro se desarrollen sistemas comerciales para la deteccin de grupos especficos de rickettsias, utilizando los anticuerpos monoclonales generados en los laboratorios de investigacin. Una aproximacin muy particular para el diagnstico es la deteccin inmunocitolgica de R. conorii en clulas endoteliales desprendidas que circulan por el torrente circulatorio del paciente. Estas clulas son capturadas a partir de las muestras de sangre por medio de microesferas magnticas recubiertas por un anticuerpo monoclonal frente a componentes de la superficie de las clulas endoteliales humanas (La Scola. 1996a). En enfermos de fiebre botonosa, este procedimiento tiene una sensibilidad del 58% cuando se utiliza para el examen de muestras nicas de sangre, y puede emplearse en los pacientes antes de la aparicin del exantema, que debe manifestarse para poder seleccionar las zonas donde han de tomarse las muestras de piel por biopsia que permitan llevar a cabo el diagnstico por tcnicas inmunohistolgicas. El "estndar oro" en el diagnstico serolgico de las rickettsiosis es el mtodo de la inmunofluorescencia indirecta (IFA) (Kaplan, 1986). El test indirecto con anticuerpos acoplados a peroxidasa ofrece unos resultados parecidos. En EE.UU.. para las infecciones producidas por rickettsias de los grupos de la fiebre maculosa y del tifus, ttulos de 1:64 o superiores en el test IFA se consideran indicadores de diagnstico positivo cuando se da u n a situacin clnica y epidemiolgica compatible En paises donde existe una alta prevalencia de individuos con anticuerpos frente a estas rickettsias, debido hipotticamente a una estimulacin por especies no patgenas de rickettsias o a infecciones subclinicas o no diagnosticadas, son necesarios ttulos ms elevados para poder establecer el diagnstico. En cualquier caso, un incremento de cuatro veces en el titulo de anticuerpos en un test IFA hasta un valor, al menos, de 1:64 tiene valor diagnstico. La sensibilidad del test IFA en el caso de la RMSF oscila entre el 94% y el 100%, mientras que la especificidad es del 100%. Con unos valores de corte en el titulo de 1:128. para las IgG. y de 1:32, para las IgM, el test indirecto de la mmunoperoxidasa rinde valores semejantes y tiene la ventaja de que slo se necesita un microscopio ptico convencional, en lugar de un microscopio con iluminacin ultravioleta. Otros test serolgicos disponibles comercialmente son la aglutinacin con ltex y el enzimoinmunoensayo en fase slida (Kelly. 1995). Ambos mtodos ofrecen informacin til para el diagnstico, requieren un equipo menos caro para su ejecucin, aunque no se consideran, generalmente, tan fiables como el mtodo IFA. Ciertamente, con estas tcnicas se obtienen resultados m u c h o ms fiables que los que se consiguen con la prueba de Weil-Felix, que mide la aglutinacin de las cepas OX-19 y OX-2 de Proteus vulgaris (Kaplan, 1986). Este test de Weil-Felix, poco sensible e inespecfico, no debera utilizarse excepto en los casos de pases en desarrollo en los que no es posible utilizar otro mtodo diagnstico.

Diagnstico de laboratorio
A diferencia de la mayor parte de enfermedades infecciosas cuyo diagnstico debe hacerse durante la fase aguda de las mismas, que es cuando deben tomarse decisiones teraputicas criticas, las infecciones causadas por rickettsias se diagnostican con mucha precisin, basndose en las sospechas clnicas y epidemiolgicas, y se tratan de forma emprica sobre la base del diagnstico presuntivo (Kaplowitz. 1981). El anlisis serolgico. que muchas veces se pretende llevar a cabo de forma equivocada en los estadios iniciales de la enfermedad, slo confirma en la mayor parte de los casos el diagnstico inicial, poniendo de manifiesto un incremento de cuatro veces o superior en el ttulo de anticuerpos, pero ya en la fase de convalecencia. Incluso cuando se utilizan los mtodos serolgicos ms sensibles, menos del 20% de los pacientes poseen anticuerpos especficos frente a antigenos rickettsiales, detectables en suero, cuando acuden por primera vez a la consulta mdica en busca de atencin. Otras aproximaciones diagnsticas utilizadas en ese momento incluyen la visualizacin de las rickettsias por mtodos inmunohistolgicos en las lesiones cutneas, la identificacin inmunocitolgica de las rickettsias en clulas endoteliales desprendidas y circulantes, la deteccin de ADN rickettsial en muestras de sangre y tejidos mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Furuya, 1995; Schriefer, 1994a; Sexton, 1994; Williams, 1994). y el cultivo de las rickettsias presentes en las muestras de sangre y tejidos, aunque la mayor parte de estas tcnicas no estn disponibles en muchos laboratorios clnicos. Las rickettsias fueron puestas de manifiesto por primera vez por Wolbach en muestras de tejidos de pacientes afectados por la RMSF y por el tifus transmitido por piojos, utilizando el mtodo de tincin de Giemsa. durante e inmediatamente despus de la primera guerra mundial. Este mtodo, que en esencia ya es un arte perdido, requiere mucha atencin y cuidado en los detalles relativos a la fijacin y teido de las rickettsias, y en la actualidad no se realiza de forma exitosa en los labratenos histolgicos actuales. Una modificacin del mtodo de Brown-Hopps tie una pequea proporcin de microorganismos, que aparecen c o m o bacilos delgados entre las clulas endoteliales. Una aproximacin ms sensible y especfica para visualizar las rickettsias es la inmunohistologa. bien por inmunofluorescencia o bien por tincin inmunoenzimtica. utilizando como sondas anticuerpos especficos frente los agentes infecciosos del grupo de la fiebre maculosa o del grupo del tifus (Dumler, 1990; Kaplowitz. 1983: Walker, 1989,1997b. 1999). La tincin mediante inmunofluorescencia de muestras de biopsias de piel de pacientes con RMSF tiene una sensibilidad del 70% y una especificidad del 100%. Los pacientes con fiebre botonosa, tifus murino y rickettsiosis vesicular han sido diagnosticados tambin mediante la deleccin mmunohistolgica de las rickettsias en las lesiones de los exantemas y las escaras Mediante un anticuerpo monoclonal Irente a

Tratamiento
Las rickettsiosis de los grupos de la liebre maculosa y del tifus se tratan de forma eficaz con deoxiciclina. tetraciclina o cloranfenicol (Raoult. 1991). Las fluoroquinolonas son aclivas frente a las rickettsias in vitro: pata el tratamiento de la liebre botonosa se han utilizado, con xito, ciprolloxacino. olloxacino y pefloxacino, aunque estas quinolonas no han sido evaluadas todava para el tratamiento de la RMSF.

Tifus scrub (tifus de las malezas) causado por Orientia tsutsugamushi

La pared celular propia de una bacteria gramnegativa de Orientia (originalmente Rickettsia) tsutsugamushi difiere de la que presentan las otras especies de rikettsias pertenecientes a los grupos de la fiebre maculosa y del tifus: en este contexto, la membrana extema presenta la lmina externa ms gruesa y la interna ms delgada, distintas protenas mayoritanas, y carece de lipopoli

sacrido y peptidoglucano (Jamura. 1995). La rickettsia productora del tifus scrub crece en el citoplasma de la clula husped y sale de la misma mediante un proceso que implica la formacin de una pequea evaginacin de la membrana plasmtica que engloba a la rickettsia en trnsito hacia el medio exocelular. Orientia tsutsugamushi se mantiene transovricamente en acaras del gnero Leptotrombidium (Traub, 1978). Los huevos infectados eclosionan para liberar las larvas, la nica fase que se alimenta en el hospedador animal. Las ratas se infectan despus de que las larvas que albergan las rickettsias (chiggers) se alimenten de sus fluidos corporales, aunque las larvas que estn alimentndose y se infectan con las rickettsias no trasmiten la infeccin a su descendencia. Por tanto, los humanos y las ratas son slo huspedes accidentales, no esenciales y terminales de la rickettsia que causa el tifus scrub. Esta enfermedad se da en el rea comprendida dentro del tringulo delimitado por Japn. Pakistn y el norte de Australia. La infeccin se contrae en zonas con vegetacin densa, donde una gran poblacin de ratas alberga a su vez una gran poblacin de larvas que contienen las rickettsias. La lesin patolgica bsica es el dao vascular con inflamacin linfohistoctica perivascular. que se manifiesta en la zona de la piel donde se produjo la inoculacin de la rickettsia y en el cerebro, pulmones, corazn, tracto gastrointestinal y rones. Despus de un perodo de incubacin entre 6 y 21 das, la enfermedad comienza con fiebre, dolor de cabeza y. en algunos pacientes, mialgia, los y sntomas gastrointestinales (Watt. 1999). En la mitad de los pacientes occidentales aparece una escara, normalmente antes del comienzo de la fiebre, que rara vez aparece en los pacientes indgenas. Igualmente, en la mitad de los occidentales afectados con infeccin primaria aparece un exantema macular o maculopapular, entre dos y nueve das despus del comienzo de la enfermedad. Los pacientes gravemente afectados pueden manifestar hipotensin, meningoencefalitis, fallo renal agudo y procesos hemorrgicos, A menos que se administre un tratamiento antimicrobiano adecuado, un 7% de los casos son fatales. El tifus scrub puede tambin afectar a los excursionistas y otros viajeros expuestos a las larvas en las zonas en las que la infeccin tiene carcter endmico. Para el diagnstico del tifus scrub en zonas endmicas, un ttulo de 1 : 4 0 0 o superior en un ensayo de IFA tiene una especificidad del 96% y una sensibilidad del 48%. Un incremento de cuatro veces en el ttulo de anticuerpos especficos hasta un valor de 1:200 o superior implica una especificidad del 98% y una sensibilidad del 54%. Tambin estn disponibles para el diagnstico el test indirecto de la inmunoperoxidasa, un inmunoensayo en fase slida y un test de aglutinacin de la cepa OX-K de Proteus mirabilis. y parece ser prometedor un ensayo con anticuerpos dirigidos frente a la protena superficial mayoritaria de 56 kDa, obtenida mediante tcnicas de ADN recombinante (Kim, 1993: Weddle, 1995). El tratamiento con un antibitico del grupo de las tetraciclinas, como la deoxiciclina, o con cloranlenicol es eficaz, excepto entre algunos casos registrados en la parte norte de Tailandia (Watt, 1996).

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

lo que sugiere que pueden producirse ciertos cambios en la nomenclatura de estos microorganismos. Un agente causante de ehrtichiosis granulocitotrpica en humanos, identificado mediante PCR y secuenciacin del gen que codifica el ARNr 16S, es una coespecie de E. phagocytophilay E. equi. existiendo para esta ltima un precedente histrico (Chen, 1994), Otro agente que infecta a los granulocilos humanos, denominado Ehrlichia eivingii. presenta una gran semejanza con E. chafeensis (Anderson, 1992).

Ehrlichiosis monocitotrpica humana

Ehrlichia chaffeensis es transmitida por garrapatas, principalmente por la especie Amblyomma americanum. la garrapata Lone Star (estrella solitaria, nombre que se le da al estado de Texas, en EE.UU.), pero tambin por Dermacentor variabilis e Ixodes paciicus (Anderson, 1992a: Ewing, 1995; K r a m e r , 1999). Los casos detectados tienen carcter rural y estacional predominantemente, ya que el 68% de los mismos aparecen entre mayo y julio (Fishbein, 1994). Los ciervos son un reservorio del microorganismo bien conocido, aunque los perros infectados tambin pueden ser reservnos potenciales. Las garrapatas resultan infectadas mientras se alimentan en el estado de larva o de ninfa, portando las ehrlichias mientras experimentan la muda entre las diletenles fases de su ciclo, transmitiendo la infeccin durante una posterior alimentacin con la sangre del animal hospedador. La ehrlichiosis monocitotrpica h u m a n a (HME) ha sido detectada en 47 estados de la Unin: la mayor parte de los casos han aparecido dentro de la zona de dispersin de A. americanum en los estados del tercio sudeste de EE.UU., delimitado por una linea trazada desde Nueva Jersey a Texas. El nmero de casos detectados es particularmente elevado en Oklahoma, Missouri, Arkansas, Texas, Virginia. Tennessee y Georgia, Desde que en 1 9 8 7 se detectara el primer caso de ehrlichiosis en EE.UU., ms de 700 pacientes con infeccin por E. chaffeensis confirmada en el laboratorio han sido documentados en el CDC de Atlanta y ms de 1.500 casos en un laboratorio comercial (Fishbein, 1994). Aproximadamente entre un 2% y un 3% de los casos han resultado fatales, aunque este porcentaje podra haber sido m u c h o ms elevado si no se hubiera aplicado un tratamiento antibitico eficaz en muchos pacientes (Fichtenbaum, 1994; Fishbein, 1994). La gravedad de la enfermedad se refleja en el hecho de que el 62% de los pacientes son ingresados. Aunque los casos graves aparecen, a menudo, entre personas ancianas, los nios tambin son susceptibles a la enfermedad (Schultz, 1997). La duracin media de la enfermedad en una extensa serie de casos estudiados por el CDC. incluyendo aquellos en los que se administr tratamiento, fue de 23 das. Los signos y sntomas corresponden a los de una enfermedad sistmica que no tiene caractersticas clnicas distintivas para el diagnstico: fiebre (97% de los casos), cefalea (81%), mialgia (68%). anorexia (66%), nuseas (48%), vmitos (37%). exantema (6% al inicio de la enfermedad. 25% durante la primera s e m a n a y un 36% en conjunto), tos (26%), faringitis (26%), diarrea (25%). linfadenopatas (25%), dolor abdominal (22%) y obnubilacin (20%). Entre las complicaciones graves se incluyen el sndrome de distrs respiratorio del adulto, la coagulacin intravascular diseminada y la insuficiencia renal. Los datos analticos clnicos muestran leucopenia (60%). trombocitopenia (68%) y valores elevados de transaminasas hepticas (86%). La afectacin del sistema nervioso central viene indicada por ciertos sntomas como ataques y coma, y se confirma por una pleocitosis en el lquido cefalorraqudeo (LCR), por la presencia de E, chaffeensis y por un incremento de la concentracin proteica en el LCR. y por la existencia de lesiones cerebrales que se ponen de manifiesto mediante autopsia (Dunn, 1992; Ratnasamy, 1996; Walker, 1997a). En los pacientes nmunocomprometidos, incluyendo los enfermos de sida, la ehrlichiosis monocitotrpica h u m a n ap u e d e ser una infeccin abrumadora, con un crecimiento masivo de las ehrlichias y un desenlace fatal (Paddock, 1993; Walker, 1997a). Tambin existe documentacin sobre infecciones suaves. Ehrlichia chaffeensis produce u n a infeccin persistente en sus hospedadores naturales y al m e n o s ha sido documentado un c a s o semejante en humanos (Dumler, 1993b). Tras la entrada del microorganismo mediante la picadura de la garrapata. E. chaffeensis se disemina por el organismo a travs de los sistemas linftico y circulatorio. Las mrulas del microorganismo han sido detectadas en el interior de los monocitos y los macrfagos de la mdula sea, sangre perifrica (aunque raramente), sinusoides hepticos, bazo, ganglios linfticos, meninges, rion y epicardio (Dumler. 1993a; Walker. 1997a). El examen de la mdula sea pone frecuentemente de manifiesto la existencia de granulomas, hiperplasia mieloide y megacariocitosis. Otras lesiones detectadas han sido

Infecciones causadas por organismos del gnero Ehrlichia Estructura y funcin

Los especies del gnero Ehrlichia son bacterias gramnegativas de pequeo tamao (0,5 um). de morfologa cocobacilar, parsitos intracelulares obligados que viven en el interior de la vacuola citoplasmtica de los glbulos blancos sanguneos (Weiss, 1984). La microcolonia intravacuolar de bacterias semeja a una mora cuando se observa bajo tincin por el mtodo de Wright-Giemsa, razn por la que a esta formacin se le da el nombre de mrula (del latn, mora). Conocidas y estudiadas desde hace tiempo c o m o agentes causales de enfermedades veterinarias, las especies del gnero Ehrlichia han emergido ltimamente como patgenos humanos. Primariamente, las causas que han llevado a esta nueva situacin han sido su reciente deteccin en humanos, su rpida caracterizacin con las herramientas moleculares analticas actualmente disponibles y el incremento de las poblaciones y la distribucin geogrfica de las especies de garrapatas que tienen como hospedador a los ciervos. La taxonoma de estos organismos est pendiente de revisin debido a los nuevos datos genticos que se han ido acumulando en los ltimos aos. Los patgenos animales c o m o Cowdria ruminantiumy Anaplasma margnale estn incluidos dentro de los gneros a los que pertenecen los agentes causales de ehrtichiosis en humanos encontrados en EE.UU. La denominacin del gnero Anaplasna data de 1910,

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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

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infiltrados linfohistociticos perivasculares en el rion, meninges, cerebro y corazn; neumonitis mononuclear intersticial; focos de muerte celular semejante a la apoptosis en el hgado, ganglios linfticos y bazo; hiperplasia reticuloendotelial difusa; eritrofagocitosis; y colestasis.

Infeccin por Ehrlichia ewingii en el hombre

Inicialmente identificada en 1971 como un patgeno del perro. E eiv/ngHtambin es transmitida por la garrapata A. americanum (Anziani, 1990: Ewing, 1971). Esta especie comparte antgenos comunes con E. chaffeensis. aunque infecta principalmente a los neutrfilos. En el informe sobre el descubrimiento de esta bacteria como patgeno humano, tres de los cuatro pacientes estudiados eran inmunocomprometidos, lo que sugiere que los individuos inmunocompetentes pueden ser relativamente resistentes a la enfermedad (Buller, 1999).

Ehrlichiosis

granulocitotrpica

humana

causada

por Ehrlichia phagocytophila

En EE.UU. se han documentado ms de 600 casos de ehrlichiosis granulocitotrpica humana (HGE). detectados principalmente en ios estados de la parte norte del medio oeste (Wisconsin y Minnesota) y los estados del nordeste (Nueva York, Connecticut, Rhode Island y New Jersey), aunque tambin se han confirmado casos de infecciones autctonas hacia el sur, a lo largo de la costa este, as como en California y en Europa (Aguero-Rosenfeld, 1996; Bakken, 1996; Horowitz. 1998; Petrovec. 1997). L a infeccin es transmitida por las garrapatas Ixodes scapulahs. I. pacificus e /. ricinus. siendo el ratn de patas blancas (Peromyscus leucopus) y otros pequeos mamferos el reservoro de la bacteria en EE.UU., mientras que el ciervo rojo, ovejas, cabras y el ganado en general tienen ese papel en Europa (Hodzic, 1998). La patologa viene pobremente definida por la observacin en sangre perifrica y diversos rganos de neutrfilos con mrulas en su interior, de infiltrados de macrfagos espumosos en rganos del sistema reticuloendotelial. de infiltrados linfohistociticos vasculares perifricos y de apoptosis hepatocelular focalizada (Walker, 1997a). La mortalidad est asociada frecuentemente con infecciones secundarias oportunistas provocadas por hongos y virus (Hardalo, 1995). Las manifestaciones de la ehrlichiosis granulocitotrpica humana van desde formas asintomticas hasta casos graves, y muchos de los pacientes diagnosticados necesitan ser hospitalizados (Bakken, 1996). La infeccin resulta mortal en menos del 1% de los casos, y es muy probable que algunas infecciones tengan un curso subclnico. La enfermedad comienza con escalofros, fiebre, dolor de cabeza y mialgia. En la mayor parte de los casos aparece trombocitopenia, y leucopenia en cerca de la mitad de los afectados. El dato que indica la existencia de dao hepatocelular es la deteccin de niveles elevados de enzimas hepticas, y los pacientes gravemente enfermos pueden sufrir un choque sptico con afectacin multiorgnica.

eliminar cualquier interpretacin que signifique un resultado falsamente positivo debida a la presencia de granulaciones txicas, cuerpos de Dhle. plaquetas superpuestas o partculas contaminantes. La deteccin inmunohistoquimica de E chaffeensis en muestras de tejidos se ha utilizado exclusivamente c o m o tcnica de investigacin (Dumler, 1993a; Yu, 1993). El diagnstico serolgico es el procedimiento ms habitual para la deteccin de la ehrlichiosis humana mediante IFA, empleando E chaffeensis propagada en cultivos celulares y antgenos de E. phagocytophila (Nicholson, 1997: Olano. 1999: Walls. 1999). Este mtodo es muy sensible para detectar seroconversin hasta un ttulo de 1:64 o superior entre dos y cuatro semanas despus del inicio de la enfermedad. El resultado esperado en una muestra de suero correspondiente a la fase aguda de la enfermedad es la ausencia de anticuerpos. Por lano, el tratamiento debe iniciarse empricamente en base a factores clnicos y epidemiolgicos y no quedar pendiente de la confirmacin diagnstica de laboratorio. Existen opiniones variables respecto a cul debe ser el ttulo de anticuerpos presente en una nica muestra de suero que varan entre valores de 1:64 y 1:256 para E chaffeensis. Aproximadamente en un 20% de pacientes afectados por H M E y HGE respectivamente se detecta reactividad cruzada entre E phagocytophila y E chaffeensis. En consecuencia, en aquellas zonas geogrficas donde existe una superposicin de ambos tipos de infecciones (HME y HGE), o bien h a y una posibilidad evidente de quedar expuesto a la infeccin como consecuencia de un viaje, es esencial determinar el titulo de anticuerpos frente a los dos microorganismos. Una diferencia de cuatro veces en el titulo es el criterio utilizado para distinguir entre ambos agentes infecciosos. Aquellos casos en los que slo se detecta una diferencia de dos veces o menor se diagnostican c o m o ehrlichiosis de etiologa indeterminada. Poder diferenciar a E chaffeensis de E ewingii segn criterios serolgicos es ms problemtico, porque esta ltima especie an no ha podido ser cultivada. La inmunotranslerencia (Western blot) es. actualmente, una tcnica de investigacin til para distinguir las infecciones causadas por E chaffeensis. mediante la deteccin de una familia de protenas de 120 kDa y 28 kDa especificas, y las provocadas por E phagocytophila, que muestra un patrn de especies proteicas mayoritarias entre 42 kDa y 49 kDa (Asanovich. 1997: Chen, 1997a, 1997b; Zhi, 1997). Los ensayos serolgicos basados en estos antgenos obtenidos mediante tcnicas de ADN recombinante parecen ser prometedores y podrian ser desarrollados en un futuro prximo (Yu, 1999).

Tratamiento
La doxiciclina es muy eficaz para el tratamiento de las ehrlichiosis humanas (Bakken, 1996; Fishbein, 1994). El cloranfenicol tambin parece acortar la duracin de la ehrlichiosis monocitotrpica humana (Fishbein, 1994), aunque los estudios llevados a cabo m vitro con cultivos celulares revelan que tanto E. chaffeensis como E. phagocytophila son resistentes a este antibitico, as como a ciertos antimicrobianos de prescripcin frecuente c o m o los p-lactmicos. macrlidos, aminoglucsidos y sullamidas (Brouqui, 1992: Klein, 1997). Ehrlichia phagocytophila es sensible a la rifampicina y a la rifabutina cuando se encuentra creciendo en cultivos celulares.

Diagnstico de laboratorio
El aislamiento de las ehrlichias a partir de sangre humana en cultivos celulares sin antibiticos, una herramienta utilizada en la investigacin, se ha logrado ms a menudo con E. phagocytophila (en clulas HL-60) que con chaffeensis (en clulas DH-82), slo una vez con E canis (en una persona asintomtica). y an no ha sido logrado (o al menos descrito en la bibliografa) con E ewingii(Childs, 1999: Dawson, 1991; Goodman, 1996; Prez, 1996). La amplificacin del ADN de las ehrlichias por PCR, empleando cebadores especficos de especie, es un mtodo eficaz para el diagnstico de todas las ehrlichiosis humanas, aunque no est disponible para su empleo de forma general (Anderson, 1992b; Buller, 1999; Chen, 1994; Comer, 1999; Everett, 1994). La sensibilidad del mtodo de PCR oscila entre el 79% y el 100% para el diagnstico de la ehrlichiosis monocitotrpica, y entre un 48% y un 86% en el caso de la ehrlichiosis granulocitotrpica causada por E phagocytophila (Anderson, 1992b; Everett, 1994). En fases ms avanzadas de la enfermedad, debido al menor nmero de microorganismos en sangre o al tratamiento con tetraciclina, disminuye la sensibilidad del mtodo de deteccin de ehrlichias basado en la PCR. Aunque sea un mtodo laborioso, la visualizacin de mrulas en los neutrfilos de sangre perifrica es una buena alternativa para el diagnstico de la ehrlichiosis humana, ya que puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio. Esta tcnica tiene una mayor sensibilidad (entre el 30% y el 80%) para el diagnstico de las infecciones causadas por E phagocytophila que para el de aquellas en el que la responsable es E chaffeensis (menos del 10%). Es importante

Infecciones causadas por Coxiella burnetii Estructura y funcin

Coxiella burnetii se encuentra bastante alejada desde el punto de vista gentico del resto de rickettsias patgenas, y es el nico microorganismo integrado en el grupo -/de las Proteobacterias. Estas bacterias gramnegativas tienen un aspecto variable que va desde una morfologa bacilar hasta una coccea, y mediante microscopa electrnica se han identificado dos lormas distintas: una representada por clulas largas (entre 0,5 pm y 1 , 2 pm) y otra por clulas densas de pequeo tamao (0.5 pm), que podrian indicar la existencia de un ciclo de desarrollo. Se ha puesto un gran nfasis en los fenmenos asociados con el cultivo de C. burnetii en el laboratorio, como es la prdida de la capacidad para sintetizar completamente el lipopolsacrido de la pared celular, tras un periodo prolongado de pases sucesivos en cultivos celulares o huevos embrionados. El cambio consistente en la sntesis de una molcula truncada de lipopolisacrido en lugar de la molcula completa del mismo, y que es anlogo a la interconversin entre los fenotipos liso y rugoso que se da en la familia Enterobacteriaceae, se ha denominado como variacin de fase, de fase I a fase II. La fase I se encuen-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Ira en la naturaleza y en los anmales y personas infectadas, mientras que la lase II aparece tan slo en condiciones de laboratorio. Coxiella burnetii penetra en las clulas blanco, los macrfagos, por un proceso de fagocitosis pasiva y est fuertemente adaptada a las condiciones existentes en el interior del fagolisosoma (p, ej la bacteria sintetiza superxido dismutasa y fosfatasa acida), donde tiene lugar la mulliplicacin de la bacteria por fisin binaria.

Fiebre Q
El nombre de fiebre O deriva del desconocimiento de su etiologa cuando el sndrome clnico-epidemiolgico fue descrito inicialmente c o m o liebre interrogante. La ecologa de C. burnetii incluye infecciones silenciosas en animales: muchas especies de garrapatas, ungulados (especialmente ovejas, vacas y cabras), otros mamferos (incluyendo gatos y conejos salvajes), peces, pjaros y marsupiales (Mame. 1988.1997). Los seres humanos se infectan principalmente p o r la inhalacin de aerosoles que tienen su ongen en restos de los partos del ganado domstjco. aunque tambin por la ingestin de leche contaminada no pasteurizada (Fishbein, 1992). Muchas de las infecciones humanas tienen carcter de enfermedad ocupacional: se da entre empleados de mataderos, granjeros y veterinarios. Por el contrario, los casos urbanos no relacionados con una profesin de riesgo son, sin lugar a dudas, m u y poco frecuentes en algunos de los grupos de poblacin donde han sido evaluados, como sucede por ejemplo entre los pacientes inmunocomprometidos en Francia (Brouqui, 1993). La mayor parte de las infecciones humanas son asintomticas (Mame. 1990). La enfermedad aguda se manifiesta, a menudo, como una afeccin febril mdiferenciada y autolimitada, o c o m o una neumona, hepatitis o meningoencefalitis (Drancourt. 1991; Duponl, 1992). Los pacientes individuales con mialgias. anorexia y dolor de cabeza raramente son investigados con objeto de diagnosticarles una fiebre Q, aun cuando estos sntomas son la presentacin clinica ms clsica de esta inleccin, que representa, a su vez. un porcentaje significativo entre los pacientes que manifiestan dichos sntomas en algunos grupos de poblacin. Las manifestaciones de la forma neumnica de la fiebre Q son variables: la tos puede ser no productiva o estar ausente, y la neumona puede ser grave y progresar rpidamente o ser detectada radiolgicamente, visualizando la presencia de mltiples infiltrados radiolgicos redondeados o segmentarios, con ausencia de sntomas pulmonares. La forma heptica de la fiebre Q puede tener una presentacin clinica semejante a la de la hepatitis viral aguda o la manifestacin patolgica de una hepatitis granulomatosa determinada mediante biopsia. La fiebre Q crnica est considerada c o m o un sinnimo de endocarditis producida por C. burnetii. pero tambin aparece menos frecuentemente como consecuencia de la infeccin de un aneurisma o de prtesis vasculares, o de osteomielitis(Brouqui, 1993; Marrie. 1990). La forma de endocarditis crnica de la fiebre Q implica, generalmente, a una vlvula artica o mitral previamente daada, produciendo una enfermedad no febril que puede manifestarse con fallo cardiaco, bepatoesplenomegalia. ruidos cardiacos cambiantes y prdida de peso. Las manifestaciones de la enfermedad asociadas a inmunocomplejos circulantes incluyen un exantema purprico asociado a vasculitis o glomerulonefritis. La patologa de la fiebre Q aguda incluye neumona bronquiolo-alveolar intersticial mixta con clulas inflamatorias mononucleares e inflamacin granulomatosa del hgado y la mdula sea (Walker, 1988b). Los granulomas asociados a la fiebre Q presentan, a menudo, una vacuola central transparente rodeada por un anillo de fibrina y por macrfagos epitelioides. De todos modos, estos granulomas no son lesiones con valor patognomnico ni tampoco el nico tipo de granulomas que se detectan en el higado y la mdula sea de los pacienles afectados por fiebre Q. Las vlvulas cardacas alectadas en la endocarditis asociada a la fiebre Q muestran una inflamacin subaguda y crnica, con una gran cantidad de macrfagos espumosos que tienen el citoplasma repleto de clulas de C. burnetii.

fase I pueden detectarse unas dos semanas despus del inicio de la enfermedad. En general, la fiebre Q aguda se asocia con ttulos elevados de anticuerpos frente a los antigenos de la fase II y bajos frente a los de la fase I. Mediante el test de IFA, un ttulo de IgG y de IgM frente a antigenos de la fase II de 1:200 o superior y de 1 : 5 0 o superior, respectivamente, tiene una sensibilidad del 5 8 %y una especificidad del 92% para el diagnstico de la fiebre Q aguda. En la forma crnica de la enfermedad, se detecta un ttulo ms elevado de anticuerpos frente a la fase I (de 1:800 o supenor mediante el test de IFA) mientras que el titulo de anticuerpos frente a la fase II es. generalmente, igual o inferior al de la fase I. Frecuentemente es posible detectar una respuesta de I g A frente a antgenos de la fase I en pacientes aquejados de fiebre Q crnica. Un ttulo de 1:128 o superior de anticuerpos frente a antigenos de fase detectados mediante fijacin de complemento se considera tambin que tiene valor diagnstico de fiebre Q crnica, si bien algunos pacientes presentan ttulos inferiores. Debido a la reactividad cruzada existente entre Bartonella henselae y B. quintana con C. burnetii. n o debe llevarse a cabo el diagnostico serolgico de la endocarditis causada p o r Bartonella hasta que no se haya determinado el titulo de anticuerpos frente a C. burnetii (LaScola. 1996b), que, en el caso de la endocarditis asociada a la fiebre Q, es sustancialmente ms elevado que el detectado frente a Bartonella. Otros mtodos empleados para el diagnstico de la endocarditis asociada a la fiebre Q crnica son la tincin inmunohistolgica, la microscopa electrnica, y la deteccin de C burnetii mediante PCR, aunque todos ellos implican la utilizacin de tcnicas que son ms propias de la investigacin bsica. Coxiella burnetii puede ser recuperada a partir de la sangre o de las vlvulas cardiacas mediante cultivo in vttro utilizando un sistema de cultivo de clulas HEL en shell vial, facilitado por centrifugacin. Este procedimiento puede detectar e identificar la presencia de coxiellas en unos siete das, pero debe emplearse solamente en instalaciones con medidas de bioseguridad de nivel 3.

Tratamiento
La doxiclma es eficaz para acortar la duracin de la fiebre O aguda cuando se administra durante los tres primeros das despus del comienzo de la enfermedad (Levy, 1991). Las fluoroquinolonas representan una medicacin alternativa para aquellos pacientes que no pueden ser tratados con tetraciclinas. El tratamiento de la endocarditis asociada a la forma crnica de la enfermedad implica la administracin durante liempo prolongado de doxicclina y una quinolona simultneamente, aunque a menudo esta pauta no es capaz de eliminar la infeccin (Marrie. 1997). El xito del tratamiento viene indicado por una lenta cada en el ttulo de IgG frente a antgenos de la fase I hasta un valor por debajo de 1:200, momento en el que puede considerarse la posibilidad de suspender el tratamiento. La sustitucin de las vlvulas cardacas afectadas s e lleva a cabo, frecuentemente, por razones de tipo hemodinamico.

Infecciones causadas por organismos del gnero Bartonella (Rochalimaea) Estructura y funcin
Los organismos originalmente clasificados dentro del gnero Rochalimaea han sido reclasificados como un gnero nuevo, Bartonella. mientras que la familia Bartonellaceae h a sido suprimida del orden Rickettsiales (Birtles. 1996; Brenner. 1993). Las especies patgenas del hombre. S. quintana (el agente etiolgico de la fiebre de las trincheras, una de las pnncipales enfermedades transmitidas por piojos durante la primera guerra mundial), B. henselae (el agente causal de la enfermedad por araazo de gato), B. elizabethae (asociada con endocarditis infectiva) y B. bacilliormis (una bacteria transmitida por los mosquitos que provoca una forma febnl de anemia hemoltica aguda y una lesin cutnea crnica denominada verruga peruana en Amrica del Sur), han podido ser cultivadas en medios artificiales enriquecidos con sangre en presencia de un 5% de CO-, Estos bacilos gramnegativos. parsitos intracelulares facultativos, no producen cidos de los carbohidratos y. generalmente, se localizan en el interior de los entrocilos del animal mamfero que constituye su hospedador natural. Entre las numerosas nuevas especies descritas del gnero Bartonella, B. clarridgeiae podra s e r un segundo agente etiolgico de la enfermedad por araazo de gato (Kordick, 1997),

Diagnstico de laboratorio
El diagnstico de laboratorio de la fiebre Q se lleva a cabo, en la mayor parte de los casos, mediante la deteccin de anticuerpos frente a C. burnetii (Fournier, 1996. 1998). Los mtodos serolgicos utilizan antigenos caractersticos de ambas fases (fase I y fase II) y. a menudo, evalan la produccin de anticuerpos especficos de clase. Los mtodos del enzimommunoensayo y el IFA son altamente especficos y mas sensibles que los basados en la fijacin del complemento. En la fiebre Q aguda, los anticuerpos frente a los antigenos de la fase II aparecen m u y pronto tras la infeccin, mientras que los anticuerpos frente a la

Enfermedad por araazo de gato, angiomatosis bacilar y peliosis bacilar

Bartonella henselae es transmitida al ser humano por los araazos o mordeduras de mascotas infectadas que estn bacterimicas durante muchos meses

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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

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aunque aparentemente parezcan sanas (Bergmans, 1997; Chomel, 1995; Heller, 1997; Tapper, 1993). La bacteria se transmite entre gatos a travs de sus pulgas (Chomel. 1996; Higgins. 1996). La naturaleza de la enfermedad est determinada, en gran medida, p o r el propio hospedador. En individuos inmunocompetentes, alrededor del 80% son jvenes menores de 21 aos que presentan una ppula o pstula cutnea en el punto donde se produjo la inoculacin del microorganismo, con una linfadenopatia regional limitada. Menos del 2% de los pacientes sufren complicaciones en el hgado, bazo, pulmones, huesos, sistema nervioso central, retina, conjuntiva o piel como consecuencia de la diseminacin del microorganismo por la sangre (Listn. 1996). Desde un punto de vista histopatlogico, las lesiones de la enfermedad por araazo de gato consisten en granulomas que rodean a microabcesos estrellados. En pacientes profundamente inmunodeprimidos, la infeccin por B. henselae cursa con fiebre y bacteriemia o con lesiones cutneas o viscerales angioproliferativas. Estas ltimas se caracterizan por ser proliferaciones vasculares lobulares de clulas endoteliales rechonchas con racimos de pequeos capilares que rodean a los capilares ectticos separados por un estroma edematoso, mucilaginoso o fibrtico que contiene cmulos de neutrfilos y de restos de los mismos, as como microcolonias granulares de bartonellas. Cuando se forman en la piel, estas lesiones reciben el nombre de angiomatosis bacilar, mientras que cuando aparecen en el hgado y el bazo se denominan peliosis heptica o esplnica. La infeccin tambin puede diseminarse a otras localizaciones. Las lesiones angioproliferantes provocadas por B. henselae y B. quintana en pacientes inmunodeprimidos son indistinguibles entre si y bastante parecidas a las de la verruga peruana causada por 8. bacilliformis (Koehler, 1997). Bartonella henselae, B. quintana y 8. elizabethae han sido descritas como agentes responsables de endocarditis infecciosa en humanos, al igual que B. vinsoniien perros (Drancourt, 1995).

ptimo se obtiene en medios de cultivo enriquecidos con sangre de conejo, en agar chocolate o en agar con extracto de levadura y carbn activo. Las colonias tardan entre 9 y 15 das, y en ocasiones incluso ms tiempo, en aparecer y ser detectadas. Las especies del gnero Bartonella son bacterias gramnegativas de morfologa bacilar, con una longitud entre 1 u . my3u . my un dimetro entre 0,2 u . m y 0,5 u.m. Bartonella henselae da negativas las pruebas de la oxidasa, catalasa y ureasa y no utiliza los carbohidratos. La identificacin definitiva requiere un anlisis de la composicin de cidos grasos, secuenciacin de ADN o hibridacin con sondas especficas, tcnicas que se utilizan por lo general en los laboratorios de referencia (Scott, 1996). La PCR representa un mtodo atractivo para el diagnstico molecular. Bartonella bacillilormis puede ser cultivada y aislada a partir de muestras de sangre o de las lesiones cutneas en agar infusin de cerebro y corazn, conteniendo un 0,4% de agar y un 5% de sangre humana, de caballo o de cone|0. Originalmente, el diagnstico de la enfermedad por araazo de gato se basaba en una combinacin de datos clnicos, epidemiolgicos y patolgicos. Los estudios morfolgicos, incluyendo la tincin de Warthin Starry, han sido utilizados como datos adicionales para el diagnstico de la angiomatosis bacilar y la enfermedad por araazo de gato. La fiebre de Oroya puede diagnosticarse mediante la visualizacin de las bartonellas en el interior de los eritrocitos, que aparecen como formas cocceas o bacilares, ocasionalmente con morfologas curvadas o en anillo, en muestras de sangre perifrica cuidadosamente teidas mediante el mtodo de Giemsa. para evitar la aparicin de artefactos que pudiesen conducir a una interpretacin errnea de lo observado. El diagnstico de las infecciones causadas por 8. henselae y 8. quintana se lleva a cabo habitualmente mediante la demostracin de la existencia de anticuerpos especficos mediante inmunofluorescencia indirecta o enzimoinmunoensayo (Dalton, 1995b). El diagnstico serolgico de la endocarditis por bartonellas debe contemplar tambin la determinacin del ttulo de anticuerpos frente a C. burnetii, que puede incrementar el ttulo de anticuerpos que reaccionan cruzadamente con Bartonella (Maurin, 1997). El ttulo frente a la fase I de C. burnetii es m u c h o ms elevado que el de anticuerpos anti-8artone//a en la endocarditis asociada a la forma crnica de la fiebre Q.

Fiebre de las trincheras y angiomatosis bacilar

Bartonella quintana produce una bacteriemia prolongada en pacientes convalecientes, que constituyen, aparentemente, su reservono. Durante la primera guerra mundial, se estableci que la infeccin se transmita de persona a persona mediante la picadura del piojo {Pediculus humanus corporis) en las trincheras de la primera linea del frente (Bruce. 1921), no habindose identificado otras fuentes o mecanismos para la transmisin de la infeccin. A partir de las heces del piojo cargadas con B. quintana, el microorganismo penetra por las erosiones de la piel que el propio individuo se produce al rascarse tras la picadura, y aproximadamente ocho das ms tarde comienzan a aparecer los sntomas de la enfermedad, que se manifiesta con un nivel de gravedad variable. Los sntomas incluyen fiebre, que generalmente desaparece en menos de una semana, jaqueca, mialgias, dolor pretibial y la aparicin de una erupcin macular evanescente. Las recadas se producen a menudo con intervalos de cuatro a cinco das. La bacteriemia en el ser humano afectado persiste durante semanas, m e s e s o incluso ms tiempo, siendo la fuente a partir de la cual los piojos se infectan, incluso aun cuando la persona se sienta relativamente saludable. En la actualidad se detectan casos de la enfermedad entre los grupos de alcohlicos y vagabundos en ciudades amencanas y europeas (Spach, 1995).

Tratamiento
Por lo general, la enfermedad por araazo de gato es autolimitada, aunque parece responder favorablemente al tratamiento con acitromicina. Los frmacos de eleccin para el tratamiento de la angiomatosis bacilar, peliosis por Bartonella, bacteriemia o endocarditis son eritromicina, acitromicina o doxiciclina (Guerra, 1993). Eventualmente pueden producirse recadas que necesitan un nuevo tratamiento o incluso una terapia de mantenimiento a largo plazo. Para el tratamiento de la fiebre de Oroya es preferible el cloranlenicol, debido a la efectividad de este antibitico frente a la sobreinfeccin por salmonellas. cuya aparicin est claramente reconocida. El tratamiento puede producir una reaccin semejante a la de Jarisch-Herxheimer. que cursa con fiebre y otros sntomas sistmicos. La verruga peruana se trata con rifampina por va oral. En el tratamiento de la fiebre de las trincheras se han utilizado con xito tetraciclina y cloranfenicol.

Fiebre de Oroya y verruga peruana

La bartonellosis sudamericana, que se manifiesta como una enfermedad aguda, denominada liebre de Oroya, o en forma de una lesin cutnea crnica llamada verruga peruana, se transmite por la picadura del mosquito Lutzomyia. Los portadores humanos asintomticos a largo plazo son el reservorio de la bacteria responsable, B. bacillilormis. Tras un perodo de incubacin de unas tres semanas aproximadamente, la liebre de Oroya comienza de una forma insidiosa con anorexia, dolor de cabeza, malestar y febrcula, o bien de manera brusca con escalofros, fiebre elevada y delirios. Las bartonellas invaden los glbulos rojos sanguneos, provocando cambios en los mismos que se traducen en eritrofagocitosis y anemia. La verruga peruana, caracterizada por la aparicin de nodulos duros, con una coloracin que va de rojo a prpura, que surgen en grupos durante un perodo de entre uno y dos meses y persisten durante meses e incluso aos, es un cuadro que se manifiesta tras la liebre de Oroya, o puede aparecer sin que existan sntomas previos de ningn tipo (Arias-Stella. 1986).

INFECCIONES POR MICOPLASMAS

La capacidad de los micoplasmas para causar enfermedades en el hombre fue puesta de manifiesto en 1962. cuando un organismo de este tipo (seguidamente denominado Mycoplasma pneumoniae) fue identificado c o m o el agente etiolgico de la enfermedad denominada neumona atpica primaria (Chanock, 1962). Los micoplasmas son los microorganismos ms pequeos conocidos con capacidad para vivir como formas libres. Son bacterias pleomrficas, con forma esfrica, de pera o filamentosa, con un dimetro entre 0,2 u , m y 0,8 p.m. La mayor parte de especies son anaerobias facultativas y se dividen por escisin binaria. Los micoplasmas constituyen un grupo nico entre las bacterias porque carecen de pared celular. Son incapaces de sintetizar los constituyentes de la pared celular y necesitan que en el medio exista colesterol (y otros esteroles relacionados) para poder llevar a cabo la sntesis de membranas. L o s micoplasmas tambin carecen de las rutas enzimticas necesarias para realizar la sntesis de purinas y pirimidinas, por lo que necesitan medios de cultivo complejos (como el caldo infusin de corazn de vacuno, enriquecido con suero de caballo, extracto de levadura y cidos nucleicos) para poder crecer in vitro. En este captulo se tratarn las especies potencialmente patgenas, Mycoplasma pneumoniae y los micoplasmas genitales {Mycoplasma hominis y Ure-

Diagnstico de laboratorio
El hemocultivo por el procedimiento de lisis-centrifugacin y el sistema Bactec para hemocultivo han sido utilizados para la recuperacin de 8. henselae y B. quintana a partir de los pacientes (Brenner. 1997). El crecimiento

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

aplasma urealyticum). Las otras especies de micoplasmas forman parle de la microbiota normal de los tractos respiratorio y genitourinario en el ser humano.

Mycoplasma Epidemiologa

pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae tiene una distribucin mundial. Las epidemias provocadas por esta bacteria se dan en grupos de poblacin cerrados, como nios en escuelas, familias, reclutas militares, tpicamente a intervalos de tiempo enlre cuatro y ocho aos, especialmente al final del verano y comienzo del otoo. En los aos de los perodos interepidmicos, los casos aparecen a lo largo de todo el ao y por lo general la infeccin se extiende lentamente, siendo necesario para el contagio que exista un contacto directo con una persona enferma. S i n embargo, durante las epidemias la infeccin puede diseminarse rpidamente, y la deteccin de brotes puntuales que no parecen estar asociados a una exposicin cercana y prolongada al microorganismo sugiere que M. pneumoniae puede transmitirse a travs de partculas de pequeo tamao presentes en aerosoles. La tasa de infeccin con M. pneumoniae es elevada en nios en edad escolar y adultos jvenes, y la enfermedad aparece con mayor frecuencia en personas con edades comprendidas entre los 5 y los 20 aos, especialmente en aquellas que se encuentran en la franja entre los 15 y los 19 aos. La infeccin por M. pneumoniae es frecuente en nios con menos de 5 aos, aunque por lo general es asintomtica o produce tan slo una enfermedad suave con conza y silbidos respiratorios pero sin fiebre o neumona (Femald. 1975).

Los antgenos intracelulares de M. pneumoniae que quedan expuestos c o m o consecuencia de la fagocitosis y subsiguiente degradacin de las bacterias fagocitadas estimulan la respuesta mediada por linfocitos T. que a su vez determina, aparentemente, la gravedad de la enfermedad Existe poca informacin sobre la patologa de la enfermedad causada por M. pneumoniae, ya que la mayor parte de infecciones son autolimtadas. y m u y raramente se obtienen muestras de tejidos por biopsia para su examen. En los casos ltales se pueden observar zonas de consolidacin parcheadas en los pulmones. El examen histolgico de los focos de tejido afectado revela la existencia de bronquitis, bronquiolilis y neumonitis intersticial y alveolar con acmulos peribronquioiares de linfocitos y clulas plasmticas, acompaados por macrfagos y neutrfilos en el caso de que exista necrosis celular.

Manifestaciones

clnicas

Patogenia y patologa
Mycoplasma pneumoniae es un parsito superficial que coloniza el epitelio de la mucosa del tracto respiratorio. Su capacidad para adherirse a las clulas de la mucosa respiratoria, escapar a la fagocitosis y modular la respuesta del sistema inmune es fundamental para que se desencadene la enfermedad. Su movilidad por deslizamiento puede permitirle penetrar a travs de las secreciones respiratorias, y su forma filamentosa y flexible, que posee un orgnulo de adherencia terminal, facilita su localizacin en huecos y plegamientos de la membrana plasmlica de las clulas hospedadoras y entre las microvellosidades y los cilios de las mismas, donde queda protegido de la accin de las clulas fagocticas. La adhesin de M. pneumoniae a las clulas hospedadoras est mediada por la protena P1, que mteracciona con glucoproteinas que contienen cido neuramnico. presentes en la superficie de la membrana celular (Chandler. 1982; Geary, 1987). El perxido de hidrgeno y el ion superxido producido por M. pneumoniae puede causar dao en las clulas de la mucosa, provocando la detencin del movimiento de los cilios y el desprendimiento de las clulas superficiales (Almagor, 1984) Algunos factores relacionados con el hospedador tambin parecen estar implicados en la patogenia de la enfermedad producida por M. pneumoniae. L a aparentemente elevada prevalencia de la infeccin por esta bacteria en nios y jvenes, el carcter suave de la enfermedad en individuos pertenecientes a estos grupos y la aparicin de una forma ms grave de la afeccin en personas con edades ms avanzadas sugiere que la enfermedad grave podra ser consecuencia de la respuesta inmune del hospedador a la reinfeccin por el microorganismo; sin embargo, se desconoce la naturaleza del mecanismo especfico responsable del dao celular en este caso Adems, se sospecha que los sntomas exlrapulmonares (que se comentarn ms adelante) estn mediados por una respuesta inmune, ya que M. pneumoniae se aisla con muy baja frecuencia a partir de muestras no respiratorias. La interaccin de M. pneumoniae con el determinante antignico I de los glbulos rojos humanos, que contiene los restos de 2.3-sialil-poli-/V-acetilgalactosamina necesarios para el reconocimiento, puede causar una alteracin en dicho antigeno I, transformndolo en antgeno extrao que estimule la produccin de aglutininas fras. Otros anticuerpos autoinmunes que se forman durante la infeccin por M. pneumoniae (anticuerpos frente a pulmn, cerebro, msculo liso y Imfocitos) pueden tener un origen semejante. La primera linea de defensa durante la infeccin primaria por M. pneumoniae es la activacin del complemento por la va alternativa y la fagocitosis de las bacterias a nivel de la superficie de las mucosas. Determinados componentes galactosilados y glucosilados presentes en la superficie de la membrana celular del microorganismo parecen tener la capacidad de inducir la produccin de anticuerpos, de los que los ms impodantes son las IgA. que se encuentran predominantemente en las secreciones propias de la mucosa.

La manifestacin ms comn de la enfermedad causada por M. pneumoniae es la Iraqueobronquitis. La neumona, que aparece aproximadamente en un tercio de personas infectadas, comienza de forma gradual entre dos y tres semanas despus de la exposicin al microorganismo, con fiebre, malestar, dolor de cabeza, faringitis y una tos seca persistente no productiva (Baum. 2000). Es frecuente una sinusitis clnicamente inaparente, y tambin puede aparecer miringitis. Las radiografas de trax muestran una bronconeumona unilateral en el lbulo inferior del pulmn y, ocasionalmente, infiltrados dilusos bilaterales. El recuento de leucocitos en sangre perifrica es normal inicialmente. para aumentar a medida que la enfermedad avanza. En aproximadamente un 1 5 % de los afectados, aparece una erupcin cutnea maculopapular y. con menor frecuencia, vesicular, unos pocos das despus del comienzo de la enfermedad. Sin tratamiento antimicrobiano la fiebre desaparece entre los 2 y 14 dias. pero el malestar general, la tos y las anomalas radioscopias persisten entre dos y seis semanas. En un bajo porcentaje de nios y adultos, la neumona es lo suficientemente grave como para requerir hospitalizacin: en estos pacientes pueden aparecer abscesos pulmonares, derrames pleurales, infecciones bactenanas secundarias, bronquiectasias o recadas clnicas. Las manifestaciones extrapulmonares son poco frecuentes e incluyen anemia hemoltica clnicamente aparente, asociada tpicamente con ttulos muy elevados de aglutminas fras: eritema multiforme, eritema nodoso y urticaria; encefalitis, meningoencefalitis, mono o polineuritis y meningitis: miocarditis y pericarditis, y artralgias y. raramente, artritis (Baum. 2000; Cassel. 1981: Ponka. 1979)

Micoplasmas genitales Epidemiologa

En los nios, la colonizacin con micoplasmas genitales liene lugar en el momento del nacimiento cuando el feto pasa por el canal del parto infectado y. por lo general, persiste un poco menos de dos aos. Ureaplasma urealyticum y Mycoplasma hominis pueden ser aislados del tracto genital de hasta un 30% de las nias (con menor frecuencia a partir del tracto genital de nios), y tambin pueden aislarse a partir de nariz y garganta de un 15% de nios y nias (Klein. 1969). En un estudio se encontr que el 20% de las nias prepberes estaban colonizadas con ureaplasmas y un 6% con M. hominis. aunque en nios prepberes los micoplasmas genitales fueran aislados m u y raramente (Hammerschlag. 1978). La colonizacin con micoplasmas genitales despus de la pubertad es consecuencia del contacto sexual. Alrededor del 60% de mujeres aparentemente sanas, sexualmente activas, son portadoras de U. urealyticum en su vagina, mientras que un 20% lo son de M. hominis.

Manifestaciones

clnicas

Ureaplasma urealyticum es responsable de algunos casos de uretritis n o gonoccica; ha sido asociado con fiebres posparto, corioamnionitis y nacimientos con peso bajo, aunque no se ha probado que exista una relacin causal en este ltimo caso: y tambin es raramente responsable de casos de uretrocistits crnica en individuos inmunodepnmidos (Taylor-Robinson. 1980. 1985: Casell. 1986). Mycoplasma hominis es uno de los agentes causales de fiebre posparto y postaborto; y tambin es la causa, aunque con m u y poca frecuencia, de casos de bacteriemia. artritis, peritonitis, meningitis, osteomielitis e infecciones de las heridas, principalmente en personas inmunocomprometidas, aunque tambin en otras que no manifiestan, aparentemente, deficiencia inmunolgica subyacente alguna (Taylor-Robinson, 1980: DeGirolami. 1982: McMahon. 1990).

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INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS, RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

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Diagnstico de laboratorio Mycoplasma pneumoniae

Las muestras recomendadas para llevar a cabo el diagnstico de la infeccin causada por M. pneumoniae son exudados de garganta tomados con hisopo y suero, aunque tambin son aceptables el H u i d o del lavado broncoalveolar, esputo y biopsias de tejido pulmonar. Un test serolgico no especfico que puede proporcionar informacin til es la deteccin de aglutinmas fras, que son anticuerpos del tipo IgM (rente al antgeno I de los eritrocitos humanos. Estas aglutinmas aparecen al final de la primera o comienzos de la segunda semana de la enfermedad, al menos en la mitad de las personas infectadas, aunque su presencia no es diagnstico de infeccin por M. pneumoniae. El diagnstico definitivo se basa en la deleccin del microorganismo, o de IgM especficas en suero, o en la observacin de un incremento de cuatro veces en el ttulo de IgG entre muestras de suero tomadas en la fase aguda y de convalecencia de la enfermedad. Para aislar M. pneumoniae. se inocula un sistema bifsico de cultivo que se incuba a 35C-37"C hasta un mximo de tres semanas en el interior de un contenedor sellado, en una estufa normal. Los cultivos se examinan al microscopio (x40) una o dos veces por semana para detectar en los mismos la presencia de las tpicas colonias que recuerdan a un "huevo frito" (presentan una zona central densa, rodeada de un rea menos compacta), embebidas en la matriz del agar del medio de cultivo. Tales colonias, tpicas de M. pneumoniae. deben ser analizadas para comprobar su carcter hemolitico {M. pneumoniae es |J-hemoltico) segn el siguiente procedimiento: se prepara un agar al 1% en solucin salina al 0.85% que se mantiene fundido a la temperatura de 50 C. mezclndose a continuacin con sangre de oveja o de cobaya para obtener una concentracin final de eritrocitos del 5%; seguidamente se deposita un volumen de la mezcla final resultante sobre la superficie del medio de cultivo donde aparecieron las colonias, para obtener, tras la solidificacin del agar, una delgada capa que cubra las mismas; el cultivo es reincubado durante 24 horas, examinndose seguidamente para detectar los halos de hemolisis completa alrededor de las colonias. Debido a que el aislamiento de M. pneumoniae puede requerir vanas semanas, los test rpidos resultan ms tiles para el diagnstico. Por ejemplo, la deteccin de IgM especficas en una nica muestra de suero es indicativa de infeccin aguda. Si lo que se determina son IgG, entonces deben analizarse muestras de suero tomadas durante la lase aguda y de convalecencia de la enfermedad, para observar un incremento de cuatro veces o superior en el titulo de anticuerpos especficos.

se tien con una o dos gotas de una solucin de CaCI.-urea depositadas directamente sobre la superficie del medio. Las colonias de U. urealyticum tienen un dimetro de 15 pm-16 pm y se tien de un color marrn oscuro en unos 5 minutos al entrar en contacto con la solucin anterior. En caldo U. U. urealyticum provoca un cambio en el pH del medio, haciendo que el color del m i s m o vare de amarillo a rojo. En ese m o m e n t o debe sembrarse por estria con el asa de platino una muestra del cultivo en medio lquido en una placa con medio slido, para llevar a cabo el aislamiento del microorganismo.

Tratamiento
La terapia antimicrobiana no est recomendada en el caso de faringitis o traqueobronquitis causada por iVf. pneumoniae. Una tetraciclma o un macrlido son antibiticos adecuados para el tratamiento de la neumona inducida por M. pneumoniae. aunque la terapia no alecta, aparentemente, a la transmisin del microorganismo. Las tetraciclinas son eficaces frente a M. hominis y la mayor parte de cepas de U. urealyticum. Alrededor de un 10% de ureaplasmas son, sin embargo, resistentes a la tetraciclina: las infecciones causadas por cepas resistentes responden bien, por lo general, a la entromicma (Taylor-Robinson. 1986) o alguno de los nuevos antimicrobianos de los grupos de los macrlidos o las quinolonas. BIBLIOGRAFA

Micoplasmas

genitales

Ureaplasma urealyticum y Mycoplasma hominis pueden recuperarse a partir del material obtenido a partir de la vagina, uretra o endocrvix con un hisopo, o bien de muestras de orina, sangre, material de abscesos, secreciones prostticas, semen o biopsias de tejidos. Se pueden utilizar varios sistemas de cultivo para llevar a cabo el aislamiento de los micoplasmas genitales (Clyde. 1984; Yajko. 1984; Wood. 1985: Phillips. 1986). Tradicionalmente. se han utilizado procedimientos separados para cada especie (caldo U y agar U para U. urealyticum y caldo H y agar H para M. hominis). debido a que el pH ptimo de crecimiento de los dos microorganismos es diferente (pH entre 5,5 y 6.5 para U. urealyticum y entre 6 y 8 para M. hominis). Sin embargo, en la actualidad existen sistemas nicos de cultivo que permiten detectar con gran eficacia ambas bacterias (Yajko, 1984; Wood. 1985: Phillips, 1986). Los cultivos en medio lquido se incuban en aerobiosis en tubos sellados. Los cultivos en medios slidos se incuban en anaerobiosis o en una atmsfera que contenga entre el 5% y el 7% de C0 . y son examinados diariamente con el microscopio. M. hominis tambin crece en agar sangre de ove|a. donde forma colonias visibles, no hemolticas. y en la mayor parte de medios lquidos para hemocultivo. aunque en stos no produce evidencia visible y detectable de su crecimiento.
;

Las colonias de M. hominis. con un dimetro entre 200 pm y 300 pm y la tpica forma de "huevo frito", aparecen tras cinco das, o incluso menos, de incubacin. En un medio liquido que contenga rojo de fenol como indicador de pH y un 0.1% de arginina, M. hominis transforma la arginina en amoniaco, provocando un cambio de color en el medio, que pasa de rojo a amarillo. Las placas de agar U son examinadas diariamente durante cuatro das, y en el cuarto da

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

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CAPTULO 49

INFECCIONES CAUSADAS POR CLAMIDIAS. RICKETTSIAS Y MICOPLASMAS

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C A P T U L O

50

Bacteriologa mdica
Barbara S. Reiner, Ph.D. Gail L. Woods, M.D.

PROCESADO DE LA MUESTRAS Tincin de Gram Tcnicas de cultivo BACTERIAS DE IMPORTANCIA MDICA Cocos grampositivos

1088

Bacilos grampositivos Bacterias gramnegativas Bacterias anaerobias

1091

BIBLIOGRAFA

1118

Es posible r e c u p e r a ru n aa m p l i a variedad de especies b a c t e r i a n a s a partir de los diferentes tipos de especmenes clnicos. P a r ap o d e r valorar correctam e n t e la i m p o r t a n c i ad e s d e el p u n t o de vista clnico de e s t o s organismos, es esencial t e n e ru np e r f e c t oc o n o c i m i e n t od el a microbiota b a c t e r i a n aq u e existe n o r m a l m e n t e en las diferentes localizaciones anatmicas de d o n d ep u e d e n p r o c e d e r las m u e s t r a s clnicas q u e van a ser analizadas. En la T a b l a 50-1 se m u e s t r au n listado d et o d o s aquellos m i c r o o r g a n i s m o sq u ep u e d e n encontrarse en diversos lugares y superficies del c u e r p oh u m a n o sano. En algunos casos, el nmero de o r g a n i s m o s existentes p u e d e ser e x t r e m a d a m e n t e elevado: p o r ejemplo. 10 organismos/cnv en la piel. 10 organismos/ml en las s e c r e c i o n e s orales y 10'' organismos'g en el c o n t e n i d o intestinal (colon). En c o n s e c u e n c i a ,e sm u yi m p o r t a n t eq u el am u e s t r a obtenida t e n g au n a contaminacin mnima con m i c r o o r g a n i s m o s perteneciente a la microbiota normal. E s t e objetivo es difcil de lograr, p e r op u e d e conseguirse si se utilizan los procedimientos tcnicos apropiados. D i c h o s procedimientos, junto con las tcnic a sd ep r o c e s a m i e n t o utilizadas p a r ai n c r e m e n t a rl a eficiencia e nl ar e c u p e racin de m i c r o o r g a n i s m o s patgenos, se p r e s e n t a n en el Captulo 57. E s t e captulo c o m i e n z a con una b r e v e descripcin de los mtodos de laboratorio utilizados p a r a el p r o c e s a m i e n t o de la muestra, orientado h a c i a el cultivo b a c teriano, s e g u i d a de un anlisis m u c h om a s detallado sobre las especies bacterianas consideradas generalmente c o m o patgenas del hombre.
6 v

PROCESADO DE LA MUESTRAS Tincin de Gram

Es difcil e n c o n t r a ra r g u m e n t o s en c o n t r a del h e c h o de que el e x a m e n d i r e c t o de un espcimen clnico bajo tincin de G r a mr e p r e s e n t a uno de los mtodos con m a y o r valor y utilidad entre los e m p l e a d o s en el laboratorio de Tcnicas de cultivo microbiologa. Los resultados de la tincin de G r a m proporcionan rpidamente una informacin valiosa que p u e d e ser utilizada no slo por el clnico p a r a La seleccin de los m e d i o s de cultivo se realiza t e n i e n d o en c u e n t a que h a y elegir la terapia antimicrobiana apropiada, sino tambin por el tcnico de laboque proporcionar las condiciones ptimas de crecimiento a los patgenos que ratorio, p a r a valorar la calidad de la m u e s t r a y la profundidad c o n la q u ed e b ep u e d e ne n c o n t r a r s e comnmente en una d e t e r m i n a d a localizacin o en un abordarse la caracterizacin de algunos de los microorganismos aislados en espcimen concreto. H a y que p r e s t a r una atencin e s p e c i a l a los requericultivo. En general, se c o n c e d e una m a y o r atencin a aquellos o r g a n i s m o s m i e n t o s nutricionales d e las bacterias a s o c i a d a sc o nu nd e t e r m i n a d op r o c e s o que esln p r e s e n t e s en nmero elevado en especmenes que c o n t i e n e n infeccioso, asi c o m o a la n e c e s i d a d de t e n e r que aislar ciertas b a c t e r i a s patabundantes clulas blancas sanguneas (CBS) q u e a los que se encuentran g e n a s que se e n c u e n t r a nf o r m a n d o una poblacin m i x t a con o t r o sm i c r o o r en bajo nmero en muestras en las que las CBS estn ausentes. g a n i s m o s de la m i c r o b i o t a autctona o comensal. Por tanto, p u e d e ser n e c e sario incluir m e d i o s selectivos y diferenciales junto c o n los m e d i o s de P a r ap r e p a r a r una extensin (frotis) s o b r el a que realizar l a tincin, d e b e enriquecimiento estndar. repartirse una alcuota de la parte ms p u r u l e n t aos a n g u i n o l e n t a de la m u e s t r a s o b r e la s u p e r f i c i e de un p o r t a o b j e t o s limpio, de tal f o r m a que la extensin preE la g a r sangre e su nb u e nm e d i od e cultivo general e ne lq u ep u e d e n cres e n t e reas de diferente e s p e s o r . En el c a s o de fluidos o r g a n i c e s originariamen- cer una gran diversidad de bacterias y permite, adems, p o n e r de m a n i f i e s t o

te estriles, se p u e d e utilizar u n ac i t o c e n t r i f u g ap a r ac o n c e n t r a r los m i c r o o r g a n i s m o sp r e s e n t e s en el espcimen de 10 a 1 0 0v e c e s (Peterson, 1988), U n av e z r e a l i z a d a la extensin se d e j a que s e q u e al aire, se fija m e d i a n t et r a t a m i e n t o con etanol. o por m e d i o de c a l e n t a m i e n t o suave, y se tie s e g u i d a m e n t e con los r e a c t i v o s de la tincin de G r a m (cristal vicela, solucin de y o d o lugol], a l c o h o ly safranma). D e p e n d i e n d o de la e s t r u c t u r a de la p a r e dc e l u l a r caracterstica de c a d a categora, las b a c t e r i a sg r a m p o s i t i v a s resistirn la accin d e c o l o r a n t e del m e t a n o l y conservarn el c o l o r prpura del cristal violeta, m i e n t r a s que las g r a m n e g a t i v a s quedarn d e c o l o r a d a s y se teirn de rojo con la safranina. Una vez realizada la tincin, las e x t e n s i o n e s se observan con un objetivo d e bajo a u m e n t op a r ad e t e c t a r estructuras grandes, c o m o larvas d en e m a t o dos, espirales de C u r s c h m a n n . granulos y partculas, m i c r o c o l o n i a s bacterianas y clulas o f o r m a s fngcas. A continuacin, se e m p l e a el objetivo de inmersin en aceite p a r ad e t e r m i n a r el tipo de bacterias presentes. D e b i d oa que es necesario que e x i s t a una concentracin de 10* de m i c r o o r g a n i s m o s p o r mi en la muestra, para q u ep u e d a observarse al m e n o s1b a c t e r i ap o r c a d ac a m p o microscpico c u a n d o se utiliza el objetivo de inmersin (x 1.000), el frotis d e b ee x a m i n a r s em e t i c u l o s aye x h a u s t i v a m e n t ep a r ap o d e rd e t e c t a r aquellos m i c r o o r g a n i s m o s que estn en bajo nmero en el espcimen. D e b ed e t e r m i n a r s e el tamao, la f o r m a y el tipo de tincin de G r a m de las b a c t e r i a so b s e r v a d a s y dar u n a desenpcin lo ms d e t a la d ap o s i b l ed e la o b s e r v a cin realizada; por e j e m p l o , indicar en el i n f o r m e que se h ad e t e c l a d o la p r e s e n c i ad ec o c o sg r a m p o s i t i v o se n parejas, q u es ep a r e c e n a Streptococcus pneumoniae (Lmina 50-1), r e s u l t a de m u c h a ms a y u d a que i n d i c a rs i m p l e m e n t eq u es eh a no b s e r v a d oc o c o sg r a m p o s i t i v o sf o r m a n d oc a d e n a s .D e b e i n d i c a r s eyc u a n t i f i c a r s e tambin l ap r e s e n c i a de l e u c o c i t o s o hemates, asi c o m oc u a l q u i e rp o s i b l eb a c t e r i ai n t r a c e l u l a rq u ep u d i e r ao b s e r v a r s e .

CAPTULO 50 Tabla 50-1

BACTERIOLOGA MDICA

1089
Frecuencia relativa de aislamiento ++ ++++ + ++++ ++++ ++++ + + +++ ++
++++ +

M i c r o o r g a n i s m o s q u e l o r m a n parte de la microbiota n o r m a l de las p e r s o n a s sanas Microorganismos detectados Staphylococcus aureus Staphylococcus apidermidis Eslreplococos del grupo vindans Especies del gnero Corynebacterium Propionibacterium acnes Malassezia lurlur Especies del gnero Candida Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pneumoniae Estreptococos del grupo viridans Especies del gnero Enterococcus Especies del gnero Lactobacillus Especies del gnero Actinomyces Especies del genero Peptostreptococcus Especies del gnero Neisseria Haemophilus influenzae Especies del gnero Haemophilus Especies del gnero Bacteroides Especies del gnero Porphyromonas Especies del gnero Prevotella Especies del gnero Fusobacterium' Especies del gnero Veilionella Especies del gnero Treponema Especies del gnero Candida Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pneumoniae Estreptococos del grupo viridans Especies del gnero Neisseria Especies del gnero Haemophilus Staphylococcus epidermidis Especies del genera Pseudomonas Enterobacteriaceae Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Especies del gnero Haemophilus Bacterias supervivientes del tracto respiratorio superior y de los alimentos Especies del gnero Especies del gnero Especies del gnero Enterobacteriaceae Bacteroidaceae Especies del gnero Enterococcus Lactobacillus Clostridium

Localizacin a n a t m i c a Piel

Boca y orolaringe

++ +

+
++

+
+ ii

++
++ ++++ ++++ +++ ++

Nariz

++
++++ +

++
+ + ++++ +

Oido externo

+
+

Conjuntiva

++++

Esfago y estmago Intestino delgado

++
+++

++
++
+++

Mycobacterium

Intestino grueso'

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Estreptococos del grupo B Estreptococos del grupo viridans Especies del gnero Enterococcus Especies del gnero Lactobacillus Especies del gnero Clostridium Especies del gnero Actinomyces Especies del gnero Peptostreptococcus Especies del gnero Pseudomonas Otros no lermentadores Enterobacteriaceae Bacteroidaceae Especies del gnero Treponema Especies del gnero Mycobacterium Especies del gnero Candida Especies del genero Mycoplasma Ureaplasma urealyticum Staphylococcus epidermidis Estreptococos del grupo B Estreptococos del grupo viridans Especies del gnero Enterococcus Especies del gnero Lactobacillus Especies del gnero Clostridium Especies del gnero Actinomyces

++ +
+

+
++
++ +++ ++++
+

++++ +

+
++++ ++++ + + + +/+/+ + +
+

Vagina

++++ ++

(La tabla continua en la pag. siguiente)

1090
c

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Tabla 50 -1 M i c r o o r g a n i s m o s q u e f o r m a n parte de la microbiota normal de las p e r s o n a s s a n a s (Continuacin) Localizacin a n a t m i c a Microorganismos detectados Frecuencia relativa de aislamiento
Vagina (cont.)
Especies del gnero Bifidobacterium

Propionibacterium

acnes

Especies del gnero Peptostreptococcus Especies del gnero Neisseria Especies del gnero Acinetobactcr Enterobactenaceae

+ + + + + + + ++

*/-

Gardnerella

vaginalis

Bacteroidaceae Especies del gnero Candida Genitales externos y extremo distal de la uretra Microbiota cutnea (vase ms arriba) Especies del gnero Mycoplasma

Ureaplasma

urealyticum

Especies del gnero Enterococcus Especies del gnero Peptoslreplococcus Enterobacteriaceae Baderoidaceae Especies del gnero Mycobacterium'

+/+ + +/+ ++

"Menos prevalento en individuos desdentados. 'El 95% o mas de los microorganismos son anaerobios obligados. Los protozoos pueden estar prsenles en personas que viven en paises subdesarroliados 'Muy frecuente on ol esmegma de varones no circuncidados +-C+ = casi siempre presente: +++ usualmente presente + = presente con Irecuencia: + = prsenle ocasionalmente: +/- = presente con muy poca frecuencia. Adaptada de Tramonl EC General or nonspecilic host delense mechanisms En Mandell GL. Douglas RG Jr Bennett JE (eds) Principles and Praclice ol Inlectious Diseases 3' ed Nueva York. Churchill Livingstone. 1990. pag 33. con permiso.

la actividad hemoltica de los microorganismos sobre los hemates presentes en el mismo. Es posible crear medios selectivos para bacterias grampositivas como el agar CNA, aadiendo sustancias como colistina y cido nalidixico. o el agar PEA. que contiene alcohol feniletlico. en donde el crecimiento de los bacilos gramnegativos queda inhibido. El calentamiento de la sangre durante la preparacin del medio para obtener agar chocolate y la incorporacin de suplementos vitamnicos conducen a la creacin de un medio enriquecido que contiene hemina (factor X) y NAD (nicotinamida-adenina-dinucletido; factor

V) disponibles, sustancias cuya presencia es necesaria para poder llevar a cabo el aislamiento de especies del gnero Haemophilus y otras bacterias delicadas. Los bacilos gramnegativos pueden separarse de los grampositivos utilizando sustancias como la bilis y diversos colorantes que estn presentes en ciertos medios como el agar MacConkey. en el que es posible, adems, distinguir bacterias lermentadoras y no termentadoras de la lactosa en funcin del color de las colonias que forman las mismas en dicho medio. En consecuencia, el agar MacConkey tiene carcter selectivo y diferencial. En la

Tabla 50-2 Espcimen

Medios de cultivo r e c o m e n d a d o s para el aislamiento de m i c r o o r g a n i s m o s a partir de diferentes tipos de e s p e c m e n e s M e d i o s para bacterias aerobias y a n a e r o b i a s facultativas
THIO AS MAC ASC Otros

Medios para bacterias anaerobias*

BBA LKV

Fluidos Cefalorraqudeo Abdominal Pleural Sinovial Heridas Hisopo Aspirado Biopsia de tejido Vas respiratorias Garganta Esputo Lavados bronquiales Vias genitourinarias Crvix. vagina Otero, fondo de saco Prstata Uretra Orina Miccin (toma limpia) Aspirado suprapUbico Heces

X X

X X

X
X

X
X

X X

X" X X X X
X

ASS

X X MTM

X MTM

<

EH GN Campy

'Solo para muestras obtenidas a partir de una fuente apropiada y enviadas al laboratorio en un recipiente para anaerobios El caldo tioglicolalo (THIO) est recomendado slo para el fluido cerebroespinal procedente de una desviacin ventncular y el liquido de dilisis pentoneal ambulatoria continuada. ++Se puede utilizar agar AS, pero es preferible emplear el agar ASS. THIO = caldo lioglucolato: AS = agar sangre MAC = agai MacConkey ASC - agar sangre chocolate; HE = agar entrico Hektoen; GN = calcio de enriquecimiento: BBA = agar Brucella con sangre LKV = agar sangre lacado con vancomicina y canamicma; ASS = agar selectivo para estreptococos: MTM = medio de ThayerMar tin modificado; Campy = medio selectivo para Campylobacter. Adaptada de Washington JA II (ed ) Laboralory Proceduies m Clinical Microbiology. 2" ed. Nueva York. Springer-Verlag, 1985. pp 95-123. con permiso.

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA

1091

Tabla 50-3 Duracin d e la incubacin d e los cultivos bacterianos Tipo de espcimen Sangre Fluidos Abscesos, heridas Tejidos Vias respiratorias Garganta Esputo Lavado bronquial Vas genitourinarias Crvix, vagina tero, tondo de saco Prstata Uretra Orina Material fecal Anaerobios Brucella Actmomyces Tipo de incubacin antes de considerar el cultivo negativo (das) 5-7 2-4 2 2-4' 2 1 2' 2 2-4' 2 2 : 1-3' 4-7 21-30 14-21

incubacin en su interior que mantienen la temperatura adecuada. Cada uno de los diferentes sistemas de incubacin para anaerobios tiene sus ventajas e inconvenientes pero, en general, todos tienen una eficacia semejante para el aislamiento de bacterias anaerobias de inters clnico Los cultivos bacterianos deben examinarse sistemticamente tras un perodo de incubacin entre 18 y 24 horas. La excepcin a esta norma son los cultivos en anaerobiosis que se examinan a las 48 horas para permitir que las bacterias anaerbicas que son de crecimiento ms lento produzcan colonias que puedan ser detectadas a simple vista. En la Tabla 50-3 se muestran los tiempos de incubacin recomendados para los diferentes tipos de cultivos. En general, los medios slidos se incuban durante 48 horas, mientras que para los medios lquidos la incubacin puede prolongarse entre 24 y 48 horas ms. Hay que elaborar un informe preliminar tras examinar por primera vez el cultivo, que se va actualizando a medida que se va disponiendo de nueva informacin adicional. Algunos resultados (p. ej., observacin positiva de microorganismos bajo tincin de Gram en muestras de sangre o lquido cefalorraqudeo [LCR]. aislamiento de un microorganismo cuya deteccin implica que hay que tomar medidas efectivas para controlar la infeccin) son remitidos al centro sanitario inmediatamente despus de ser obtenidos. Los informes finales se redactan una vez que se han completado todas las determinaciones analticas a partir del microorganismo aislado en cultivo.

'Las placas con medios solidos se eliminan despus de 48 horas; los tubos con medios lquidos se conservan durante 4 das "Los cultivos iniciales y tos subcultivos en caldo enriquecido se examinan Iras 1 8 a 24 horas de incubacin para detectar colonias lactosa negativas, si estas no estn presentes, los cultivos se consideran negativos para especies de Samonella y de Shigella Las placas para el aislamiento de Campylobacter deben incubarse durante 72 horas.

BACTERIAS DE IMPORTANCIA MEDICA Cocos grampositivos Staphylococcus

Tabla 50-2 se muestra una gua para seleccionar los medios de cultivo que deben utilizarse para el aislamiento de bacterias a partir de diferentes tipos de muestras clnicas. Los cultivos bacterianos se incuban generalmente a 35 C y se inspeccionan inicialmente tras ser incubados entre 18 y 24 horas. La presencia de una concentracin del 5 % al 10% de C0 estimula el crecimiento, y puede ser incluso esencial para que se produzca el mismo, en el caso de bacterias como Neisseria gonorrhoeae. Haemophilus influenzae y S. pneumoniae, por lo que esta premisa en las condiciones de incubacin debe cumplirse siempre que sea factible. Las excepciones a esta recomendacin estn representadas por aquellos cultivos crecidos en medios diferenciales y selectivos (p. ej.. el agar XLD [xilosa-lisina-desoxicolato] o agar entrico Hektoen [EH]). en los que el hecho que permite distinguir entre distintos tipos de colonias es un cambio en el pH, que puede verse afectado por la presencia de C0 .
? 2

Caractersticas. Los estafilococos son bacterias de morfologa esfrica, catalasa positivas, que en los frotis teidos aparecen en grupos que semejan racimos de uvas (Lmina 50-2) Crecen bien en cualquier medio de cultivo que contenga peptona en condiciones tanto aerbicas como anaerbicas. pueden producir hemolisis en agar con sangre de diferentes especies animales y formar pigmentos de color amarillo o anaranjado cuando crecen en medios slidos. El crecimiento de los estafilococos se observa fcilmente en placas de agar sangre o en diferentes tipos de medios nutritivos lquidos. Un medio selectivo para el aislamiento de Staphylococcus aureus contiene entre un 7.5% y un 10% de NaCI y manitol. Las pruebas que permiten distinguir los estafilococos de los micrococos (que generalmente son considerados como no patgenos) se recogen en la Tabla 50-4 (Kloos. 1999). S. aureus se distingue de otras especies del gnero p o r su capacidad para producir coagulasa, enzima que es capaz de coagular el plasm a sanguneo. Se han identificado dos formas antignicamente distintas de la coagulasa producida por la bactena: una de las formas que se encuentra ligada a la pared celular, recibe el nombre de factor de agregacin y se d e t e c t a mediante la prueba de la coagulasa en portaobjetos, mientras que la otra es la forma libre o no ligada y se detecla mediante la prueba de la coagulasa en tubo. Manifestaciones clnicas y patogenia. S. aureus puede encontrarse formando parte de la flora autctona de la piel, ojos, vas respiratorias superiores, tracto gastrointestinal, uretra y. con menor frecuencia, vagina En consecuencia, la infeccin puede tener un origen endgeno o exgeno. Los factores que juegan un papel importante en el desarrollo de infecciones por S. aureus son las hendas y discontinuidades en la superficie de la piel y mucosas, la presencia de

Para la recuperacin de bacterias anaerobias, los medios de cultivo deben colocarse, una vez inoculados, en un ambiente anaerbico lo ms rpidamente posible. Hay disponibles varios tipos de sistemas para el cultivo de anaerobios. Uno de ellos es la jarra de anaerobios, en la que se aade un pequeo volumen de agua en el interior de un sobre que contiene unos compuestos qumicos que generan C0 y H al entrar en contacto con el agua. El O. que queda en el interior de la jarra en el momento de ser cerrada es convertido en agua al combinarse con el H, por la accin cataltica del metal paladio que se encuentra recubriendo unas lentejas de aluminio, que se hallan en el interior de un receptculo adosado a la cara interna de la tapa de la jarra. Una modificacin de este sistema consiste en una bolsa de plstico transparente, diseada para albergar una sola placa de agar nutritivo, que contiene su propio generador de K, y catalizador de paladio individuales.
2 ?

Otra posibilidad para el cultivo en condiciones anaerbicas est representada por la cmara de anaerobios, que consiste en una cabina grande de plstico transparente, cerrada hermticamente, y en cuyo interior se introduce una mezcla gaseosa carente de oxgeno, compuesta por nitrgeno, hidrgeno y dixido de carbono. Todo el material que ha de ser manipulado (muestras, placas, tubos) se introduce o se extrae de la cmara a travs de un cierre de intercambio gaseoso. L a atmslera anaerbica se mantiene en el interior de la cmara gracias al hidrgeno de la mezcla gaseosa y a la accin cataltica de las partculas de paladio. Todas las manipulaciones en el interior de la cmara se realizan a travs de unos guantes de neopreno que estn sellados a la pared frontal de la cmara o. en el caso de los sistemas "sin guantes'. a travs de orificios en donde estn acopladas unas mangas de material plstico que se cien ajustadamente a los antebrazos. Las cmaras poseen estulas de

Tabla 50-4 P r u e b a s para diferenciar los estafilococos d e los micrococos Prueba Crecimiento en anaerobiosis en medio con glucosa Susceptibilidad a la lisostafina Produccin de cidos en aerobiosis a partir de glicerol Oxidasa modificada para la deteccin de citocromo c Susceptibilidad a la bacitracina Estafilococos Micrococos

+ S +

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

7. Otras, p. ej.. abscesos viscerales imraabdominales: bazo, hgado, pncreas Figura 50-1. Secuencia patognica de la infeccin p o r Staphylococcus aureus. (De Cohen JO [ed.]: The Staphylococci. Copyright 1972. reproducida por J o h n Wiley & Sons. Inc.) cuerpos extraos e implantes, una enfermedad vinca previa, haber sido sometido con anterioridad a una terapia antimicrobiana y padecer enfermedades subyacentes con defectos en la inmunidad celular o humoral. Las infecciones causadas por S. aureus pueden afectar a una gran variedad de rganos y sistemas (Fig. 50-1). Entre las ms comunes estn aquellas que afectan a la piel y sus discontinuidades, tales como el imptigo. la foliculitis, la mastitis y las infecciones de heridas quirrgicas S. aureus es una de las causas principales de bacteriemia en pacientes hospitalizados y puede provocar endocarditis, particularmente en personas que padecen valvulopatas del lado izquierdo y en consumidores de drogas por va intravenosa. Esta bacteria tambin es la principal responsable de abscesos epidurales y de flebitis supurativa intracraneal, y puede recuperarse a partir de abscesos cerebrales que aparecen tras un traumatismo. La meningitis causada por S. aureus es poco frecuente y generalmente aparece como consecuencia de un traumatismo ceflico o un procedimiento neuroquirrgico. S. aureus es responsable de muchos casos de osteomielitis, es la causa ms comn de artritis sptica en nios prepberes y ocasionalmente provoca artritis sptica en adultos. En las zonas tropicales puede causar abscesos profundos espontneos en los msculos que afectan, predominantemente, a personas desnutridas que padecen una infeccin parasitaria concomitante (Chiedozi, 1979). Asimismo, S. aureus es una causa frecuente de neumona comunitaria, generalmente asociada a la aspiracin de bacterias endgenas de la nasofaringe. Entre los factores que predisponen se encuentran la infeccin por el virus del sarampin o de la influenza A, la fibrosis quistica y un estado de mmunodeficiencia. Sin embargo, la neumona por S. aureus en la poblacin general es poco frecuente. Por ltimo, entre las intecciones en el tracto urinario causadas por esta bacteria se encuentran la pielonefritis y los abscesos parenquimatosos y perirrenales. Diversos factores juegan un papel relevante en la virulencia de S. aureus. Si est presente, la cpsula tiene propiedades antilagocitanas. Los peptidoglucanos de la pared celular tienen actividad endotxica y estimulan la liberacin de atocinas por los macrfagos, la activacin del complemento y la agregacin de las plaquetas. La protena A. una sustancia inmunolgicamenle activa que se encuentra formando parte de la estructura de la pared celular, tiene propiedades antilagocitarias que dependen de su capacidad para interaccionar con el fragmento Fe de la molcula de las mmunoglobulmas (lg) G. Otras protenas de superficie denominadas componentes de la superficie microbiana son capaces de reconocer ciertas molculas adhesivas de la matriz extracelular (MSCRAMM) y pueden jugar un papel importante en la capacidad de los estafilococos para colonizar los tejidos del hospedador. S. aureus produce numerosas toxinas. La exotoxma TSST-1 es responsable del sndrome del shock txico y las enterotoxinas (de la A a la E) causan intoxicaciones alimentaras. Las toxinas exfoliantes, las toxinas epidermoliticas A y B, causan el enrojecimiento y desprendimiento de la piel que se observan en el denominado sndrome de la piel escaldada. Tambin producen varias enzimas hidroliticas (proteasa. lipasa y hialuronidasa) que destruyen los tejidos del hospedador, lo que probablemente facilita la diseminacin de la bacteria y el avance de la infeccin.

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA

1093

L a s enfermedades directamente relacionadas con la actividad de toxinas producidas p o r S. aureus son el sndrome de la piel escaldada, las intoxicaciones alimentarias y el sndrome del shock txico. El sndrome de la piel escaldada se da en bebs y en nios muy pequeos infectados por una cepa de S, aureus productora de toxinas exfoliativas. La enfermedad comienza de forma brusca con eritema cutneo, que en dos o tres das es seguido por la acumulacin de lquido por debajo de la piel que provoca su separacin, por lo que cualquier friccin leve puede hacer que se desprendan grandes colgajos o capas de la piel, dejando reas en carne viva que eventualmente pueden cicatrizar completamente. La intoxicacin alimentana estafilococo que cursa con nauseas, vmitos, retortijones abdominales y diarrea aparece entre una y seis horas despus de haber ingerido alimentos contaminados con la enterotoxina estafiloccica preformada. El sndrome del shock txico es una enfermedad multisislmica que afecta a aquellos individuos que no tienen anticuerpos contra la TSST-1 y han sido colonizados por cepas de S. aureus productoras de la toxina TSST-1 o. mas raramente, de enterotoxinas B o C. La enfermedad es ms frecuente en mujeres de entre 1 5 y 25 aos que utilizan tampones durante la menstruacin, aunque tambin puede darse en otras personas, sin que exista asociacin alguna con la regla, como es el caso de mujeres durante el perodo posparto, individuos que tienen una herida quirrgica o algn otro tipo de infeccin focal, o personas que han sufrido una intervencin quirrgica en la nariz o senos nasales. El sndrome del shock txico comienza de forma sbita con fiebre, mialgias, vmitos y diarrea: a estos sntomas les sigue hipotensin, shock hipovolmico y una erupcin cutnea eritematosa que afecta, sobre todo, a las palmas de las manos y a las plantas de los pies y que termina por producir una descamacin de la piel al cabo de una a dos semanas. El diagnstico es clnico, no siendo necesario llevar a cabo el aislamiento de S. aureus para confirmarlo. Por lo general la persona afectada se recupera totalmente, aunque puede experimentar episodios repetidos.

tambin el polisacrido capsular, lo que aumenta la capacidad para detectar las cepas de S aureus resistentes a meticilma (oxaclina). S. saprophyticus y S. sciuri son las otras dos especies del genero que pueden dar positiva la prueba de aglutinacin en ltex. Se han identificado muchas especies coagulasa negativas de estafilococos; sin embargo, con la excepcin de S. saprophyticus. que es una especie resistente a la novobiocina. la identificacin de estos aislamientos hasta el nivel de especie no es de utilidad prctica ni est clnicamente recomendada. Si es necesario, puede intentarse llevar a cabo dicha identificacin utilizando mtodos comerciales que tienen una fiabilidad que oscila entre el 70% y ms del 90%. Alternativamente, los aislados pueden enviarse a un laboratorio de referencia con capacidad para realizar ensayos bioqumicos estndar. Con una finalidad epidemiolgica, para localizar el origen de una infeccin o intoxicacin alimentaria, los estafilococos pueden identificarse a nivel de cepa en base a diferentes parmetros, como la susceptibilidad a diferentes baclerifagos. los perfiles plasmdicos y de cidos grasos celulares, los patrones electroforticos de enzimas multilocus o el tipado cromosmico molecular (electroforesis en campo pulsado y en campo pulsado reverso). Por lo general, estas pruebas slo pueden llevarse a cabo en los laboratorios de referencia. Sensibilidad a los antimicrobianos. Casi todos los estafilococos son resistentes a la penicilina. Dado que esta resistencia es debida a una |i-laclamasa inducibie. cuya sntesis esta codificada por un plsmido. la sensibilidad a la penicilina debe confirmarse tras un periodo de induccin en un medio que contenga un agente |i-lactmico.

La resistencia a las penicilinas resistentes a penicilmasas (meticilina, oxaclina. nafeilina) se detecta en un 70% a 80% de estafilococos coagulasa negativos y hasta en un 40% de cepas de S. aureus. La resistencia a este grupo de agentes antimicrobianos depende del gen mecA. que codifica la sntesis de una protena que liga penicilina anormal, la PBP2a. Tpicamente, la resistencia es heteLas infecciones causadas por las especies coagulasa negativas de Staphyrognea, lo que significa que slo unas pocas clulas (1 de cada W a 10") lococcus tienen lugar como consecuencia de la implantacin de vlvulas carexpresan la resistencia. Debido a este hecho, n a y que seguir un protocolo espediacas, prtesis articulares y desviaciones ventriculares. S. epidermidis es la cfico para garantizar la deteccin: para el mtodo de difusin en placa debe utiespecie que est implicada con mayor frecuencia en este tipo de infecciones. lizarse un disco impregnado con 1 itg de oxaclina; para el mtodo de microdiluS. saprophyticus es un importante agente causal de bacteriuria, particularcn debe utilizarse caldo de Mueller-Hinton con cationes y un 2% de NaCI; tanto mente en mujeres jvenes sexualmente activas. las placas de agar c o m o las de microtitulacin deben incubarse durante 24 horas a 35 C. Para determinar la resistencia a la oxaclina. se inoculan en vanos punDiagnstico de laboratorio. La observacin microscpica de cocos tpitos con un hisopo de algodn placas de agar Mueller-Hinton que contengan un camente redondeados, grampositivos y que se agrupan formando racimos en 4% de NaCI y 6 itg/ml de oxaclina, que se incuban seguidamente durante los frotis realizados a partir de muestras tomadas de lesiones cerradas o no 24 horas. Se han desarrollado algunos procedimientos para detectar rpidamendrenadas, o del lquido de un hemocultivo positivo, es indicativa de la existe la resistencia a la oxaclina Entre stos se encuentran la ampliacin de citencia de una infeccin estafiloccica. dos nucleicos y la hibridacin con sondas especificas para el gen mecA. un enS. aureus produce coagulasa. una enzima que liga el fibringeno del plasma sayo de aglutinacin en ltex para la PBP2a y un ensayo de fluorescencia para sanguneo, provoca que las bacterias aglutinen o que el plasma coagule; prctilas bacterias crecidas en presencia de oxaclina. Aunque los estafilococos resisc a m e n t e ninguna otra especie del gnero Staphylococcus presenta esta enzima. tentes a la oxaclina pueden parecer susceptibles a las cefalosporinas, tambin Alrededor del 95% de aislamientos de S. aureus se identifican mediante la prueo m o resistentes a estos antibiticos, asi c o m o al imipenem. ba de la coagulasa en portaobjetos, que detecta la enzima ligada a la pared celu- deben considerarse c lar bacteriana (factor de coagulacin), y prcticamente todas las cepas se caracLa resistencia a la vancomicina ha sido detectada slo muy raramente en los terizan mediante la prueba en tubo, que detecta la coagulasa extracelular. estafilococos. Las pocas cepas resistentes aisladas tenan concentraciones
=

La prueba en portaobjetos se lleva a cabo mezclando una emulsin densa de microorganismos con plasma sanguneo en la supedicie de un portaobjetos de vidrio. La prueba es positiva si se observa aglutinacin en un plazo no superior a 30 segundos. S. lugdenensis y S. schleileri son las otras dos especies que pueden dar positiva la prueba de la coagulasa con esta tcnica. Para realizar la prueba en tubo, se transfieren varias colonias a un tubo con plasma que se ncuba a 35 C durante 4 horas, observndose seguidamente la formacin del cogulo. Si ste no se ha formado al cabo del tiempo indicado, el tubo se reincuba a temperatura ambiente y se vuelve a examinar tras un perodo total de 20 horas. La prueba debe examinarse despus de cuatro horas, ya que la mayor parte de aislados de S. aureus coagulan el plasma en este intervalo de tiempo y porque algunas cepas producen una actividad fibrinohtica que puede disolver el cogulo, pudiendo dar una reaccin falsamente negativa si la prueba se lee a las 20 horas solamente. S. intermedius y S. hytcus tambin dan positiva la prueba de la coagulasa con el mtodo en tubo, aunque estas especies son patgenos animales y muy raramente se encuentran presentes en especmenes humanos. Hay disponibles algunos ensayos comerciales de aglutinacin en ltex que petmiten llevar a cabo una identificacin rpida de S aureus. Estos ensayos detectan la existencia de proteina A y del lactor de coagulacin, y algunos

mnimas inhibitorias (CMI) en el rango intermedio (de 8 ng'ml a 1 6 iig/ml). Los

Tabla 50-5 Clasificacin d e e s t r e p t o c o c o s y enterococos Hemolisis U A B C Grupo de Lancefield Especies

oy

S. pyogenes S. agalactiae S dysagalactiae subesp equisimilus Enterococcus spp D Vanantes de colonias pequeas Grupo anginosus de los grupos A. C. F. G o inclasificables D Enterococcus spp D S bovis Variantes de colonias pequeas Grupo anginosus de los grupos A. C. F. G o inclasificables Ninguno S pneumoniae Ninguno Estreptococos v

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SECCIN V!

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organismos con unos valores de CMI elevados para la vancomcina deben enviarse a un laboratorio de referencia para su confirmacin, y los casos confirmados deben notificarse al Cenrer lor Disease Control and Prevention (CDC).

Streptococcus y Enterococcus
Caractersticas. Los estreptococos son cocos catalasa negativos, grampositivos. esfricos, ovoideos o lanceolados, dispuestos a menudo formando parejas o cadenas. Son anaerobios facultativos. Algunas cepas necesitan CO;, para su aislamiento inicial, pero pueden perder este requerimiento al ser subcultivadas posteriormente. Los estreptococos pueden ser clasificados en categoras m u y amplias en funcin del tipo de hemolisis que producen en agar sangre (Tabla 50-5). Aquellas cepas que lisan totalmente los hemates alrededor de las colonias que forman en el medio se denominan |5-hemolticos, y pueden ser clasificadas subsiguientemente en algunos de los grupos de Lancefield, atendiendo a los componentes (carbohidratos y protenas) antignicamente reactivos presentes en su superficie celular. Los miembros ms importantes de este grupo son Streptococcus pyogenes (grupo A) y Streptococcus agalactiae (grupo B). Aquellas especies que causan una hemolisis parcial (produciendo un halo verdoso alrededor de la colonia) reciben la denominacin de -herrtolticas. Un miembro importante de este grupo es S. pneumoniae. Los estreptococos que no lisan los hemates son los y-hemolticos. Dentro de este grupo la especie ms destacable es S. bovis. Algunas cepas de S. agalactiae tambin pueden ser y-hemolticas. La mayor parte de las especies a- y y-hemolticas son denominadas globalmente estreptococos del grupo "vindans", que incluye S. mutans. S. sanguis, S. mitis. S. salivariusy S. anginosus. El grupo de estreptococos previamente denominados como variantes nutricionales (dependientes de piridoxal, vitamina B o tiol) ha sido incluido ahora en el gnero Abiotrophia.
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sufrir una infeccin por un estreptococo del grupo A que posea una proteina M frente a la cual no haya generado anticuerpos especficos el hospedador afectado. Otro componente importante de la pared celular es el cido lipoteicoico, que acta como mediador en la adhesin de las bacterias a las clulas del epitelio respiratorio. S. pyogenes sintetiza tambin alrededor de unos 20 productos extracelulares, que incluyen enzimas (estreptolisinas, hialuronidasa, estreptocinasa, desoxirribonucleasas [ADNsasj y nicotinamina-adenodinucleotidasa NADasaj) y toxinas eritrogenticas. La estreptolisina O es una enzima oxgeno-lbil con carcter antignico que produce hemolisis en agar sangre en la zona subyacente a la superficie del medio de cultivo; la estreptolisina S es una enzima estable frente al oxigeno, no inmunogenia, y que produce hemolisis en la superficie del agar sangre. Ninguna de las dos estreptolisinas parece tener un papel en la patogenia de las infecciones en el hombre. La estreptocinasa desarrolla una actividad fibrinolitica transformando el plasmingeno en plasmina, mientras que la hialuronidasa puede favorecer la diseminacin del microorganismo a travs del tejido conectivo. El papel de la ADNsa y la NADasa en la patogenia es desconocido. Las toxinas pirgenas (eritrognicas), de las que se conocen tres serotipos (A,B, y C), son producidas por cepas de S. pyogenes que contienen un bacterifago lisogenizado. Su carcter pirgeno es debido a su accin directa a nivel del hipotlamo. La patogenia de la fiebre reumtica aguda no est bien comprendida todava. Ciertos tipos antgnicos de la proteina M pueden tener carcter reumatgeno. La presencia de complejos de inmunoglobulinas y el componente C3 del complemento a lo largo del sarcolema de las miofibrillas cardacas en individuos aquejados de miocarditis reumtica sugiere que la enfermedad es consecuencia de la formacin de anticuerpos frente al antgeno M de la pared celular de los estreptococos, que tienen reactividad cruzada con componentes de los tejidos del corazn. En este contexto, se ha identificado un antigeno de S. pyogenes que comparte eptopos comunes con la proteina M, aunque es antignicamente distinto de sta, y que exhibe reactividad cruzada con molculas de los tejidos cardacos (Barnett, 1990). El dao renal en la glomerulonefritis aguda est causado por el depsito de inmunocomplejos (formados por antgenos estreptoccicos y anticuerpos del hospedador frente a los mismos) circulantes en los glomrulos renales y por la subsiguiente activacin del complemento. Tambin pueden estar implicados procesos de inmunidad celular frente a una membrana basal del glomrulo alterada, as como la activacin del complemento por la via alternativa. Las infecciones ms frecuentes causadas por los estreptococos del grupo B son la sepsis neonatal, la neumona y la meningitis. La colonizacin del tracto genital materno se asocia con la colonizacin del recin nacido y el riesgo d e enfermedad neonatal, con infecciones que aparecen tempranamente (en los das inmediatamente siguientes al parto) y un poco ms tardamente (despus de la primera semana de edad). Con objeto de reducir la incidencia de las infecciones neonatales, el CDC de Atlanta ha publicado una guia especfica que permite la identificacin precoz y el tratamiento preventivo de mujeres colonizadas por estreptococos del grupo B, asi c o m o la identificacin y tratamiento de neonatos con riesgo de desarrollar enfermedad (Schuchat, 1996). Las infecciones por estreptococos del grupo B en adultos incluyen la endometritis de posparto, infecciones de las vas urinarias, bacteriemia, infecciones de la piel y tejidos blandos, neumona, endocarditis, meningitis, artritis y osteomielitis. Los estreptococos de los grupos C y G son semejantes a S. pyogenes en el sentido de que pueden causar un amplio abanico de infecciones, incluyendo bacteriemia, endocarditis, meningitis, artritis e infecciones de la piel y las vas respiratorias. La faringitis causada por estos estreptococos es similar a la que provocan las bacterias del grupo A, excepto por que no acarrea secuelas no supurativas del tipo de las fiebres reumticas. S. pneumoniae causa neumona, meningitis (especialmente en nios pequeos y ancianos), bacteriemia espontnea (en personas que carecen del bazo), otitis, sinusitis y peritonitis espontnea. Esta bacteria forma parte de la microbiota normal que se encuentra en las vas respiratorias superiores del 25% al 50% de nios en edad preescolar, y en cerca del 20% de adultos, individuos a los que se denomina portadores (Hendley, 1975). La diseminacin del microorganismo se ve favorecida por las infecciones del tracto respiratorio superior y por la masificacin en los entornos humanos. La neumona puede desarrollarse cuando las defensas inmunitarias del husped estn debilitadas. L a mayor parte de los casos tienen un origen endgeno y son consecuencia de la aspiracin de secreciones orales que contienen microbiota normal, incluyendo a S. pneumoniae. La

Los enterococos, previamente designados como estreptococos del grupo D debido a que los cidos teicoicos de su pared celular reaccionaban con antisueros frente a las cepas tpicas del grupo D, son lo suficientemente diferentes de los otros miembros del gnero Streptococcus como para ser incluidos dentro de un gnero independiente. Estos microorganismos son cocos grampositivos, anaerobios facultativos, que se presentan aislados, en parejas, o formando cortas cadenas. La mayor parte de enterococos son a- y y-hemoliticos. aunque algunas cepas pueden exhibir |5-hemlisis en agar sangre. Otros gneros de cocos grampositivos. catalasa negativos, que pueden aislarse a partir de especmenes clnicos son Leuconostoc. Pediococcus. Stomatococcus, Aerococcus y Lactococcus spp. Se considera que la virulencia potencial de estos microorganismos es baja y, por lo general, slo son patgenos en hospedadores inmunocomprometidos. Manifestaciones clnicas y patogenia. Una de las manifestaciones clnicas ms comnmente asociada a los estreptococos del grupo A es la faringitis. La faringitis puede venir acompaada por la escarlatina, que se manifiesta en forma de un exantema puntiforme sobre un eritema difuso que por lo general aparece nicialmente en el cuello o parte superior del pecho, posteriormente adquiere carcter generalizado y finalmente acaba con descamacin de la piel. Entre las infecciones de la piel causadas por los estreptococos del grupo A se incluyen celulitis, erisipela y pioderma. La fiebre reumtica aguda, que se caracteriza por manifestaciones como carditis, poliartritis, eritema marginado, corea y nodulos subcutneos, puede aparecer entre una y cinco semanas despus de haber sufrido u n a faringitis causada por un estreptococo del grupo A. La glomerulonefritis aguda puede desarrollarse entre 10 das y tres semanas despus de padecer faringitis o pioderma provocada por estreptococos del grupo A. A finales de los ochenta comenzaron a detectarse, cada vez con mayor frecuencia, una serie de sndromes clnicos graves causados por estreptococos del grupo A, entre los que cabe destacar la fascitis necrotizante, la miositis, la escarlatina maligna, la bacteriemia y el sndrome del shock txico. Estos sndromes han sido asociados con porcentajes de morbilidad y mortalidad del 30% o incluso superiores. Las causas de este incremento no estn claramente determinadas, aunque pudieran estar relacionadas con cambios en la prevalencia de microorganismos con potencial de virulencia incrementado (Kaplan. 1996). Asociados a las clulas de S. pyogenes existen una gran cantidad de componentes estructurales y enzimticos que actan como factores de virulencia. Uno de los ms importantes es la protena M de la pared celular, que tiene actividad antifagocitaria. Los anticuerpos generados frente a este antgeno confieren inmunidad especfica de tipo permanente: sin embargo, debido a que existen ms de 60 tipos antignicamente diferentes de la proteina M, es posible

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Figura 50-2. E s q u e m a para la identificacin presuntiva de las especies |i-hemoliticas del gnero Streptococcus (+ = resultado positivo: - = resultado negativo; S = susceptibilidad; R = resistencia). (Reproducida de Woods GL, Gutirrez Y: Diagnostic pathology ol infectious diseases. Filadelfia. L e a & Febiger. 1993. con permiso dei editor.) transmisin de persona a persona durante las epidemias tiene lugar por inhalacin de gotitas de humedad en aerosoles. El pnncipal (actor de virulencia en S. pneumoniae es el carcter fuertemente antifagocitario del polisacando capsular, por lo que aquellas cepas que poseen una gruesa cpsula mucosa, como es el caso de las clulas del tipo 3, son particularmente virulentas. En la actualidad hay disponibles vacunas diseadas para ofrecer proteccin frente a la infeccin por neumococos pertenecientes a los grupos predominantes atendiendo al antgeno capsular de los mismos. Asimismo, se dispone de una vacuna para ser administrada en bebs y nios que ofrece proteccin frente a la enfermedad invasiva por neumococo. La endocarditis bacteriana es la infeccin ms comn causada por los estreptococos del grupo viridans; otras patologas incluyen abscesos en el cerebro o en el hgado, bactenemia y caries dental. La bacteriemia por S. bows ha sido asociada con procesos tumorales en el tracto gastrointestinal. Los enterococos no son muy patgenos; sin embargo, estos microorganismos son una causa muy frecuente de infecciones de las vas urinarias en personas hospitalizadas. Tambin pueden provocar endocarditis, bacteriemia e infecciones de las heridas. Diagnstico de laboratorio. Los estreptococos crecen bien en agar sangre o agar chocolate, aunque el agar sangre es preferible, ya que permite determinar las caracteristicas hemolticas del microorganismo. Cuando se siembra a partir de muestras anorrectales de mujeres embarazadas tomadas con hisopo, con objeto de aislar especficamente estreptococos del grupo B, las muestras deben ser inoculadas inicialmente en un medio liquido selectivo, c o m o el caldo LIM (caldo de enriquecimiento para S. agalactiae basado en el medio de ToddHewitt modificado), para llevar a cabo un enriquecimiento de estos microorganismos (Schuchat, 1996). Las pruebas que deben utilizarse en el laboratono de microbiologa clnica para identificar presuntivamente las especies (3-hemolticas

Figura 50-3. Esquema para la identificacin presuntiva de las especies u-nemoliticas y -/-hemoliticas de los gneros Streptococcus y Enterococcus (+ = resultado positivo; - = resultado negativo). (Reproducida de Woods GL. Gutirrez Y Diagnostic pathology of infectious diseases. Filadelfia. Lea & Febiger. 1993. con permiso del editor.)

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

En el caso de las colonias (/.-hemoliticas que no corresponden a S. pneumoniae. asi como de las y-hemoliticas. debe realizarse la prueba de la hidrlisis del L-pirroltdonil-Li-naftilamida (prueba de la PYRasa); los enterococos son PYRasa positivos mientras que los estreptococos del grupo vindans dan Los estreptococos del grupo A pueden detectarse directamente en las muesnegativa esta prueba. Adems, todos los enterococos pueden crecer en pretras tomadas directamente de la garganta con un hisopo utilizando mtodos sencia de una concentracin del 6,5% de NaCI, mientras que los estreptococomerciales diseados para proporcionar resultados rpidamente. Estos mtodos cos viridans son incapaces de hacerlo en esas condiciones. Los enterococos son muy especficos, pero dada su baja sensibilidad, que, segn diversos estuhidrolizan la esculina en presencia de bilis (lo que provoca un ennegrecidios, vara entre el 31% y el 95% (Carroll, 1996: Wegner. 1992), un resultado miento del medio asociado al crecimiento bacteriano), aunque hasta un 1 0 % negativo obtenido con los mismos debe ser reconfirmado mediante cultivo. Las de cepas de estreptococos vindans tambin son esculina positivos Para llepruebas serolgicas encaminadas a detectar anticuerpos frente a la estreptoJisina O y la AONsa B en muestras de suero obtenidas durante las fases aguda y de var a cabo la identificacin de los enterococos a nivel de especie son necesarias pruebas bioqumicas adicionales (Facklam, 1989a). La mayor parte de convalecencia se emplean fundamentalmente para diagnosticar fiebres reumtilos aislamientos clnicos corresponden a E. laecalis. cas o glomerulonefritis aguda tras una infeccin por estreptococos del grupo A. Una cepa que sea |5-hemcJitica e hidrolice el hipuralo o d una reaccin positiva en la prueba del AMP cclico (cAMP) puede identificarse presuntivamente c o m o un estreptococo del grupo B. Un aislamiento con estas caractersticas, obtenido a partir de una muestra procedente de una localizacin anatmica habitualmente estril, debe identificarse mediante serotipado (utilizando aglutinacin en ltex o coaglutinacin) o con una sonda quimioluminiscente de ADN. Las sondas de ADN tambin pueden ser empleadas para identificar estreptococos del grupo B crecidos en medio LIM u otros caldos de cultivo selectivos. Los aislamientos de estreptococos |t-hemolticos de los grupos C, D, F y G pueden ser identificados mediante serotipado con ensayos de aglutinacin en ltex. Hay disponibles pruebas de aglutinacin en ltex para la deteccin directa de estreptococos del grupo B (asi como de S. pneumoniae. algunos serotipos de Neissena meningitidis. Escherichia cot y Haemophilus influenzae serotjpo b) en muestras de LCR. suero y orina. Sin embargo, la Food and Drug Administration (FDA) ha publicado un informe alertando sobre la posibilidad de obtener resultados tanto lalsos positivos como falsos negativos cuando se utilizan este tipo de pruebas para detectar la presencia de estreptococos del grupo B en muestras de onna (FDA. 1997). Adems, los datos de algunos estudios indican que la sensibilidad de estos ensayos en el caso de estreptococos del grupo B, S. pneumoniae. N. meningitidis. E. coliy H. influenzae es menor o igual que la que posee la tincin de Gram, excepto en los casos de meningitis en los que ya ha comenzado a aplicarse el tratamiento con antibiticos. Asimismo, otros estudios han mostrado que los resultados de estas pruebas tienen poca influencia en el proceso global de atencin y cuidado del paciente (Bhisitkul. 1997; Granoff. 1986; Maxson. 1994; Perkins. 1995). Por estas razones, y porque las pruebas para la deteccin rpida de antgenos bacterianos son mucho ms caras y requieren ms tiempo y esfuerzo que la tincin de Gram, muchos laboratorios han prescindido de su uso o lo han limitado de forma estricta. Las pruebas utilizadas para la identificacin presuntiva de los estreptococos - y y-hemolticos y los enterococos se muestran en la Figura 50-3. Las coloLos estreptococos -hemolticos resistentes a la optoquina. y que dan negativa la prueba de la PYRasa. y los estreptococos PYRasa negativos, incapaces de crecer en presencia de un 6.5% de NaCI, se clasifican c o m o estreptococos no hemolticos (viridans). Dentro del grupo viridans. la identificacin de las especies individuales se lleva a cabo mediante pruebas bioqumicas convencionales (Coykendall, 1989). Tambin hay disponibles sistemas comerciales para la identificacin de estos microorganismos. Es importante llevar a cabo la diferenciacin entre los enterococos que han adquirido resistencia a la vancomicina y las especies de los gneros Leuconostoc y Pediococcus intrnsecamente resistentes a este antibitico. Las caractersticas que son de utilidad para cumplir este objetivo se muestran en la Tabla 50-6 (revisado por Facklam, 1989b). Las especies del gnero Abiotrophia no crecen en ausencia de piridoxal. A menudo se identifican inicialmente por el tenmeno del satelitismo, ya que forman colonias alrededor de otra de S. aureus. Las caractersticas diferenciales de las especies A. defectiva y A. adiacens han sido descritas por otros autores (Ruoff. 1990). Sensibilidad a los antimicrobianos. Los antibiogramas de los estreptococos de los grupos A, B. C y G son predecibles. ya que todos estos microorganismos son sensibles a la penicilina: por tanto, los ensayos habituales para determinar la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos son m n e c e s a n o s salvo que no pueda utilizarse la penicilina en el caso de personas alrgicas a este antibitico. Debido a que las cepas de S. pneumoniae con un grado medio (CMI entre 0.1 y 1.0 mgl) o elevado (CMI >2 mg/l) de resistencia a la penicilina estn diseminadas por todo el mundo, los aislamientos de esta especie deben analizarse para determinar su susceptibilidad al antibitico utilizando el mtodo d e difusin en medio slido con discos que contengan 1 pg de oxacilina. Aquellos aislamientos que no muestren susceptibilidad por este mtodo deben ser reevaluados utilizando la tcnica de la macrodilucin o de la microdilucin en caldo, utilizando medio de Mueller-Hinlon enriquecido con sangre de caballo lisada. o
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del gnero Streptococcus se muestran en la Figura 50-2. Ms del 99c de aislamientos de estreptococos del grupo A son susceptibles a la bacitracina. aunque un porcentaje muy pequeo de cepas del grupo B y entre un 10% y un 20% de aislamientos de los grupos C y G tambin son sensibles a esta sustancia. Por tanto, los resultados de la prueba de la susceptibilidad a la bacitracina slo permiten llevar a cabo una identificacin presuntiva. Un aislamiento puede ser identificado tentativamente como un estreptococo del grupo A en base a la prueba de la hidrlisis de la t-pirrolidonil-[i-naftilamda (lest PYR: PYRasa) (Wellstood, 1987). Todas las cepas del grupo A y ms del 99% de aislamientos de Enterocoecus dan positiva esta prueba. La identificacin de un estreptococo del grupo A se confirma mediante serotipado con un ensayo de aglutinacin en ltex, o por hibridacin con sondas de cidos nucleicos especificas.

nias a-hemolilicas, que son mucosas y planas con una depresin central, sugieren la presencia de S. pneumoniae, por lo que debe ensayarse la susceptibilidad de los microorganismos presentes en las mismas al clorhidrato de etilhidroxicuprena, compuesto al que comunmente se denomina optoquina (disco P); S. pneumoniae es sensible a la optoquina, mientras que otros estreptococos (/-hemolticos son resistentes Los presuntos aislamientos de S. pneumoniae realizados a parlir de localizaciones estriles del cuerpo pueden ser identificados ms rpidamente por medio de ensayos de aglutinacin en ltex que detectan el polisacando capsular, o mediante sondas quimioluminiscentes de ADN

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medante la prueba E para determinar su CMI para la penicilina. Asimismo, pueden aparecer resistencias trente a las cefatosporinas de tercera generacin; en consecuencia, tambin debe determinarse la susceptibilidad de los aislamientos frente a estos agentes antimicrobianos. Los ensayos de susceptibilidad deben realizarse con las cepas de estreptococos no hemoliticos (viridans) aisladas de localizaciones estriles del cuerpo, debido a que en estos casos puede existir resistencia a la penicilina. Las especies del gnero Enterococcus tambin deben ser analizadas para identificar, en principio, resistencia elevada a penicilina o ampicilina. estreptomicina y gentamicina. y resistencia a la vancomicina (Tenover. 1993).

Bacilos grampositivos Corynebacterium y Arcanobacterium

Caractersticas. Las corinebacterias o bacilos "difteroides". como son a veces denominados, aparecen en las extensiones teidas por el mtodo de Gram como bacilos grampositivos. ligeramente curvados, con los lados no paralelos y. en ocasiones, con los extremos engrosados, lo que confiere una apariencia de maza (Lmina 50-3). Estas bacterias son catalasa positivas. Existen 46 especies dentro del gnero Corynebacterium. La mayor parte de las mismas raramente son patgenas para el hombre; las excepciones ms notables son Corynebacterium diphteriae y las especies o variedades estrechamente relacionadas con ella, como son C. ulcerans y C. pseudotuberculosis. Las especies de inters clnico dentro del gnero Arcanobacterium son A haemolyticum. A. pyogenes y A. bemardiae. Al microscopio bajo tincin de Gram, estos microorganismos tambin aparecen como bacilos grampositivos con forma irregular. Las arcanobactenas se diferencian de las corinebacterias por que dan negativa la prueba de la catalasa. Manifestaciones clnicas y patogenia. En el lugar de la infeccin inicial a nivel de las amgdalas y la orofaringe. C. diphteriae se multiplica sobre las clulas epiteliales y produce una exotoxina que provoca necrosis celular local e inllamacin subsiguiente. Las lesiones exudativas coalescen. formando unas seudomembranas adherentes de color gris-negruzco. La toxina, que es producida solamente por las cepas de C. diphteriae infectadas por un fago lisognico que contiene el gen que codifica para la toxina, es absorbida y pasa al torrente circulatorio, mediante el que se disemina sistmicamente, produciendo cambios degenerativos en el corazn, sistema nervioso y rones. La molcula de la toxina est formada por dos subunidades: el fragmento A, que contiene el sitio enzimticamente activo, y el fragmento B. en donde se encuentra el dominio que determina la unin a las clulas del husped. La toxina diftrica se une a las clulas a travs de la subunidad B. sufre un proceso de escisin y el fragmento A penetra en el intenor de la clula mediante un mecanismo totalmente desconocido. Una vez en el citoplasma, la subunidad A bloquea la sntesis proteica, catalizando la inactivacin de la actividad translocadora del ARN de transferencia, impidiendo la interaccin de este ltimo con el ARN mensajero y deteniendo la incorporacin de nuevos residuos de aminocidos a la cadena polipeptidica en crecimiento. La toxina puede alectar a cualquier clula del organismo, pero las que resultan daadas ms gravemente son las del corazn, nn y tejido nervioso. El propio microorganismo y la toxina que sintetiza producen un exudado seroso y un infiltrado celular en la m u c o s a de la faringe, lo que conduce a la formacin de unas seudomembranas de color grisceo. Aunque se considera que produccin de toxina y patogenicidad son trminos sinnimos, las seudomembranas tambin pueden formarse en personas infectadas por cepas no toxigenicas. La extensin de las seudomembranas por arriba hacia la nasofaringe y por debajo hacia la laringe puede ser tan masiva como para producir una obstruc-

cin respiratoria. Aunque pueden producirse infecciones de otras partes del organismo por C. diphteriae. las ms frecuentemente observadas en EE.UU.son las de la piel. La va de transmisin de C. diphteriae es por inhalacin de gotitas de humedad expulsadas de las vas respiralonas supenores o por contacto con un loco de infeccin cutnea. Debido a que el resto de corinebacterias forman parte de la microbiota normal presente en la piel y las mucosas, es difcil establecer su papel etiolgico. El significado clnico de la deteccin de una de estas bacterias aumenta si el organismo observado en frotis teidos por el mtodo de Gram aparece acompaado por leucocitos, si el aislamiento ha tenido lugar a partir de una localizacin estenl o si ha sido recuperado a partir de muestras mltiples. Corynebactenum jeikeium se ha asociado de forma clara con infecciones que aparecen tras el implante de prtesis (p. ej., vlvulas cardacas. LCR y articulaciones), se ha identificado como responsable de cuadros de endocarditis bacteriana subaguda y ha estado implicado en una gran variedad de infecciones oportunistas. Corynebacterium ureolyticum se ha relacionado con infecciones de las vas urinarias, asi c o m o con bacteriemia. endocarditis e infecciones de las hendas. Arcanobacterium haemolyticum ha sido asociado con procesos de laringitis y con infecciones de las heridas y tejidos blandos, mientras que otras especies como A. pyogenes y A. bemardiae son responsables de la formacin de abscesos. Diagnstico de laboratorio. Debido a que la difteria es, en la actualidad, una enfermedad relativamente rara en EE.UU., el diagnstico clnico puede ser pasado por alto y el laboratono de anlisis puede errar a la hora de reconocer los cultivos. Siempre debe proporcionarse al laboratorio un diagnstico tentativo, de tal forma que los especmenes sospechosos puedan ser manipulados correctamente. Las connebactenas crecen en agar sangre sin mayor problema; sin embargo, el agar sangre cistina-telurito (CT) es el medio de cultivo pretendo para el aislamiento e identificacin del microorganismo. En el medio CT, las colonias que forma C. diphteriae tras 48 horas de incubacin son de color gris o negro. Las colonias pueden ser tanto grandes como pequeas y planas convexas. Los medios de Lffler (con suero coagulado) o de Pai (con huevo coagulado!, que son ms deficientes desde el punto de vista nutnctnal. son apropiados para cultivar microorganismos que exhiban morfologas caractersticas al microscopio: apariencia pleomrfca, agrupacin en empalizada (los bacilos se disponen adosados lateralmente unos con otros) y presencia de granulos metacromticos. La clasificacin de las corinebacterias, o bacilos difteroides. de la piel y la boca es difcil y confusa. Las caractersticas diferenciales de algunas especies se muestran en la Tabla 50-7. Existen sistemas comerciales disponibles para la identificacin de este grupo de microorganismos. Los aislamientos sospechosos de ser C. diphtenae deben ser analizados para establecer su capacidad de producir la exotoxina. La sntesis de la misma puede ser detectada in vitro mediante la prueba de inmunodifusin de Elek, que consiste en sembrar sobre una tira de papel de filtro impregnada en antitoxina y embebida en la masa del agar del medio de cultivo una nica estra en perpendicular del microorganismo que va a ser estudiado, observando al cabo del tiempo de incubacin la aparicin de lineas de precipitado que se forman con un ngulo de 45 grados en relacin con la lira de papel y la estra del crecimiento microbiano. Se han descrito muchas modificaciones de este mtodo, todas las cuales han conducido a la obtencin de resultados errneos, como puede ser la no aparicin de lineas de precipitado con cepas genuinamente toxignicas o la lormacin de bandas de precipitacin mespecficas con microorganismos no productores de exotoxina. Varios lactores, como son la concentracin del suero antitoxina, la cantidad de inoculo, el tipo de suero de enriquecimiento utilizado en el medio y el tiempo de incubacin, pueden afectar el resultado d e esla

Tabla 50-7 Prueba

Caractersticas diferenciales d e a l g u n a s e s p e c i e s del g n e r o C o r y n e b a c t e r i u m y bacterias relacionadas C. diphteriae +

V

C. ulcerans + + + +

C. pseudotuberculosis + +
+

C. jeikeium +

Arcanobacterium haemolyticum +

A rcanobacterium pyogenes
+ -

Catalasa Hemolisis Gelatinasa Ureasa Reduccin de los nitratos Fermentacin de la sacarosa + = positivo: - = negativo: v = variable.

v v

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

prueba. Se han descrito mtodos alternativos basados en la PCR que pueden ser de utilidad para detectar el gen que codifica la sntesis de la exotoxina. Las especies de Arcanobacterium son catalasa negativas y (i-hemolticas en agar sangre. Las colonias que se forman despus de una incubacin de 48 horas son de pequeo tamao. Las mismas pruebas bioqumicas que se utilizan para la identificacin de las corinebacterias pueden utilizarse tambin en el caso de las arcanobacterias. La especie A. haemolyticum produce fosfolipasa D, enzima que es responsable de una reaccin inversa del cAMP cuando esta bacteria se incuba simultneamente con otra especie bacteriana, Staphylococcus aureus, en agar sangre. A. haemolyticum inhibe la hemolisis alrededor de la estra de crecimiento de S. aureus, produciendo una zona con lorma triangular en la que no se detecta hemolisis. Sensibilidad a los antimicrobianos. Aunque el suero antitoxina sigue siendo el nico mtodo especfico para el tratamiento de la difteria, tambin se administran antibiticos a los pacientes que manifiestan la enfermedad y los portadores asintomticos de cepas toxignicas. C. diphteriae es sensible a la penicilina, la eritromicina y la clindamicina. Debido a su elevada eficacia y a que es bien tolerada, la eritromicina es el antibitico que se utiliza con mayor frecuencia en este contexto; sin embargo, la penicilina-benzatina tambin puede ser de utilidad en aquellos casos en los que se espera que el paciente coopere en la pauta de administracin del antibitico. La sensibilidad a los anlimcrobianos de otras especies de corinebacterias o bacilos difteroides es bastante menos predecible. Por ejemplo. C. jeikeium es, usualmente. resistente a las penicilinas y cefalosporinas, sensible pero con mucha variabilidad a la mayora de los restantes antibiticos y sensible casi de manera uniforme a la vancomicina. El tratamiento de las infecciones causadas por estos microorganismos se ve complicado, a menudo, por unas defensas del husped disminuidas y por la presencia de prtesis implantadas. Las arcanobacterias son sensibles a (5-lactmicos, rifampicina. tetraciclina y macrlidos. Prevencin. La prevencin de la difteria se basa casi exclusivamente en programas de inmunizacin activa y pasiva, con administracin suplementaria de antibiticos para eliminar el estado de portador de cepas toxignicas durante las epidemias.

quesos tiernos o frescos y de carnes elaboradas, en un 30% de diversos vegetales (repollos, rbanos) y hasta en un 50% de carne cruda y aves d e corral (Broome. 1993). Entre un 2% y un 20% de animales y personas pueden ser portadores transitorios. Es m u y posible que alteraciones en el sistema inmunolgico del husped determinen el establecimiento de la enfermedad, ya que la m a y o r parte de individuos aquejados de listeriosis son inmunodeprmidos. Los macrfagos y los linfocitos T representan los principales mecanismos de defensa del hospedado! frente a la infeccin por L monocytogenes. La virulencia de este microorganismo est relacionada con la produccin de listeriolisina O, una protena de 52 kDa que liene actividad hemoltica y citotxica, que es excretada en condiciones de pH cido y baja concentracin de hierro, como las que existen en el interior del fagolisosoma. Se cree que la protena se une de forma irreversible al colesterol de la membrana del lisosoma. provocando su rotura y permitiendo la multiplicacin bacteriana incontrolada en el citoplasma de la clula fagoctica. Las manifestaciones clnicas de la listeriosis son diferentes segn se trate de mujeres embarazadas, neonatos y personas inmunodeprimidas, que constituyen los principales grupos de riesgo. Durante el embarazo, generalmente en el primer trimestre del mismo, la listeriosis cursa con unos sntomas semejantes a los de la gripe. La bacteriemia concomitante en la mujer afectada es responsable de la inleccin del feto. La infeccin puede progresar hasta una amnionitis que provoca un parto prematuro o un aborto sptico en el plazo de tres a siete das. La infeccin en la madre es autolimitada porque la fuente de la misma desaparece con la expulsin del feto infectado y del resto del contenido uterino. La listeriosis neonatal puede tener un comienzo temprano o tardo. En el primer caso, la enfermedad, que se puede manifestar en el mismo momento del nacimiento o unos pocos das despus, es consecuencia de la infeccin en el interior del tero. El recin nacido presenta una temperatura inestable, alteraciones hemodinmcas y problemas respiratorios; tambin son caractersticos de la enfermedad los granulomas, que aparecen ampliamente diseminados, afectando sobre todo a la placenta, el tramo posterior de la faringe y la piel, aunque eventualmenle pueden no estar presentes. La enfermedad de inicio tardo, que afecta a los nios nacidos a trmino de madres con embarazos normales, debe tener su origen en una infeccin contrada posparto, aunque en la mayor parte de los casos la fuente de la m i s m a es desconocida. En este caso, los sntomas clnicos tpicos de una meningitis aparecen tras el nacimiento en un rango de tiempo muy amplio que va desde das hasta varias semanas despus. La listeriosis en los adultos aparece generalmente en individuos inmunodeprimidos, aunque en la tercera parte de casos no se ha identificado o asociado un factor de riesgo con la infeccin. La mitad aproximadamente de estas infecciones cursan como una meningitis; otras formas de listeriosis que afectan al SNC son la cerebritis y los abscesos en el troncoencfalo y el cordn espinal. La bacteriemia primaria o las infecciones focales en localizaciones diferentes al SNC son m u y poco frecuentes. Diagnstico de laboratorio. Las colonias son pequeas, de color gris azulado, y rodeadas de una zona o halo estrecho de hemolisis |5 en agar sangre. La prueba que permite diferenciar a L monocytogenes de los estreptococos del grupo B. que pueden formar colonias con una apariencia semejante, es la catalasa, que es positiva en la primera y negativa en los segundos. L monocytogenes es mvil a temperatura ambiente y forma cidos a partir de glucosa, trehalosa y salicina. Otras caractersticas de esta bacteria se indican en la Tabla 50-8. Sensibilidad a los antimicrobianos. L. monocytogenes es sensible, usualmente, a la penicilina, ampicilina, eritromicina, cloranfenicol, tetraciclina y gentamicina. Recientemente, se han identificado plsmidos que confieren resistencia a cloranfenicol, macrlidos y tetraciclinas en varias cepas de origen clnico. Para el tratamiento de las infecciones causadas por esta bacteria se ha utilizado con xito la ampicilina sola o en combinacin con un aminoglucsido. En los pacientes que tienen alergia a la penicilina puede utilizarse como alternativa teraputica el Irmetoprim-sulfametoxazol.

Listeria
Caractersticas. Las especies del gnero Listeria son bacilos grampositivos, no ramificados y no esponjados. El crecimiento ptimo de L. monocytogenes, la nica especie del gnero patgena del hombre, tiene lugar entre 30"C y 37C; sin embargo, esta bacteria puede crecer a 4C. Las colonias que aparecen a las 24 horas son pequeas y muestran una estrecha zona de hemolisis [i alrededor en agar sangre. A temperatura ambiente este microorganismo exhibe una movilidad a saltos caracterstica que raramente se observa a 35C. Esta motilidad dependiente de la temperatura tambin se aprecia en los medios semislidos, en los que el crecimiento bacteriano se distribuye en un rea cuyo permetro semeja a un paraguas en la parte superior del tubo. Manifestaciones clnicas y patogenia. Listeria monocytogenes se encuenlra en el suelo, polvo, agua, pasto, aguas residuales y leche entera sin pasteurizar. L a transmisin del microorganismo a travs de alimentos como las ensaladas de col, cebolla y zanahoria, leche pasteurizada y quesos frescos ha sido la causa de las diversas grandes epidemias que han tenido lugar en Norte Amrica y Europa (Fleming, 1985; Linnan, 1988). De acuerdo con los datos emanados del control microbiolgico de los alimentos, L. monocytogenes ha sido detectada en el 2% al 3% de productos lcteos, en un 20% de

Tabla 50-8 y

Caractersticas diferenciis d e Listeria monocytogenes Erysipelothrix rhusiopatiae L. monocyogenes + + + + + + + E. rhusiopathiae

Prueba B-hemlisis Crecimiento a 4C Catalasa Movilidad Hidrlisis de la esculina Utilizacin del gluconate Voges-Proskauer Produccin de H-.S en agar TSI

Erysipelothrix
Caractersticas. Erysipelothrix rhusiopathiae es un bacilo grampositivo, catalasa positivo, inmvil, anaerobio facultativo, que no forma esporas y que tiene una distribucin mundial. Las bacterias presentes en las colonias lisas son bacilos de pequeo tamao, rectos o ligeramente curvados, mientras que en las colonias rugosas los microorganismos son bacilos largos y filamentosos.

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BACTERIOLOGA MDICA

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Manifestaciones clnicas y patogenia. rhusiopathiae se transmite de los animales al ser humano mediante heridas en la piel causadas por objetos contaminados o al entrar en contacto con sangre, carne, visceras o heces de animales infectados. . rhusiopathiae se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza en los animales tanto salvajes como domsticos, pjaros, peces, materia orgnica en descomposicin, y causa infeccin en cerdos, ovejas, conejos, ganado, pjaros y aves de corral. Entre las personas con nesgo de contraer infecciones por esta bacteria se encuentran los carniceros, empleados de mataderos, pescadores y manipuladores de pescado, personal de granjas avcolas y veterinarios. La forma ms comn de la enfermedad erisipeloide es una infeccin cutnea local que cursa con dolor, hinchazn y una erupcin en la piel, consistente en una zona de color violceo ligeramente elevada y de progresin lenta, que aparece alrededor del punto en donde tuvo lugar la inoculacin del microorganismo. L a hinchazn y el eritema migran perifricamente y la lesin involuciona sin producir descamacin de la piel. La enfermedad sislmica es rara, aunque existen informes sobre casos de septicemia y endocarditis causadas por E. rhusiopathiae. Tambin son muy poco frecuentes los casos de artritis y abscesos cerebrales. Diagnstico de laboratorio. La biopsia o los aspirados de tejidos de las lesiones erisipeloides son los mejores tipos de especmenes para el cultivo. Los microorganismos estn localizados profundamente en la capa subcutnea del borde externo de la lesin; por tanto, el material recogido de la superficie de la piel con un hisopo no es de utilidad para intentar el aislamiento. E. rhusiopathiae crece en agar sangre o agar chocolate, pero puede necesitar hasta siete dias de incubacin para desarrollarse. Los medios convencionales para hemocultivo son adecuados para el aislamiento de la bacteria a partir de sangre. E. rhusiopathiae es oxidasa y catalasa negativo y produce, tpicamente. H,S en agar TSI (agar triple azcar-hierro). Es inmvil, no reduce los nitratos a nitritos y fermenta la glucosa y la lactosa. Un rasgo m u y caracterstico de esta bacteria es el aspecto de su movilidad en un medio con gelatina, inoculado en picadura e incubado a 22 O que semeja a un desatascador de tuberas. rhusiopathiae se distingue fcilmente de las especies del gnero Listea (vase Tabla 50-8). Sensibilidad a los antimicrobianos. rhusiopathiae es sensible a las penicilinas, cefalosporinas, imipenem. eritromicina, clindamicina, cloranfenicol. tetraciclinas y fluoroquinolonas. pero resistente a las sulfonamidas, aminoglucsidos y vancomicina.

este microorganismo pueden tratarse con ampicilina, porque no se ha encontrado que tenga capacidad de producir [Mactamasa.

Bacillus
Caractersticas. Las especies del gnero Bacillus son bactenas aerobias estrictas o anaerobias facultativas, de morfologa bacilar, formadoras de esporas, catalasa positivas y grampositjvas. Con la nica excepcin de Bacillus anthraos. todas las especies son mviles por medio de flagelos laterales o pentncos. Algunas cepas se tien como gramnegativas y, debido al carcter variable de la prueba de la oxidasa, pueden contundirse con bacilos gramnegativos. La caracterstica diagnstica ms fiable es la capacidad que tienen las especies del gnero para formar endosporas, proceso que tiene lugar de manera ptima en condiciones aerbicas entre 25' C y 30 C en una gran variedad de medios de cultivo. En las extensiones teidas por el mtodo de Gram, las esporas aparecen c o m o zonas o huecos no teidos en el interior de las clulas. Las endosporas pueden teirse por vanos procedimientos especficos. Manifestaciones clnicas y patogenia. Entre las numerosas especies del gnero Bacillus. B. anthracls es la nica que es fuertemente patgena de forma consistente. Deben extremarse las precauciones a la hora de manipular muestras y materiales en los que se sospeche la existencia de este microorganismo. Las manipulaciones deben ser realizadas en cabinas de bioseguridad por personal inmunizado y protegido con guantes, ropas apropiadas y mscaras; las superficies de trabajo deben desinfectarse con hipoclorito o con fenol (ambos al 5%); al finalizar, todos los materiales y equipos utilizados deben ser descontaminados. Existen tres formas clnicas d e la enfermedad que produce B anthraos. el ntrax: cutneo, pulmonar e intestinal. En su forma cutnea, el ntrax se caractenza por la aparicin de una lesin macular rojiza de pequeo tamao que evoluciona hasta formar una vescula que termina por necrosarse. formando u n a escara negra. Junto con estos sntomas, tambin puede haber linfadenopatia regional y septicemia. Sin tratamiento, la mortalidad en esta forma de la enfermedad est alrededor del 20%. La inhalacin de las esporas de B. anihracis puede producir bronconeumonia aguda, mediastinitis y septicemia (enfermedad de los esquiladores). La mortalidad en los casos diagnosticados de esta variedad del ntrax est prxima al 100%. La forma intestinal aparece c o m o consecuencia de la ingestin de alimentos contaminados y cursa con nuseas, vmitos y diarrea. En algunos casos aparecen hemorragias intestinales, seguidas de postracin, shock y muerte. En las tres formas del ntrax puede haber septicemia, que puede conducir a una meningitis purulenta de pronstico fatal Un factor de virulencia determinante de la capacidad patognica del microorganismo es la presencia de una cpsula formada por un polipptido neo en cido glutmico que inhibe la fagocitosis: los anticuerpos especlicos frente al antgeno capsular no tienen efecto protector contra la enfermedad. La bacteria produce, adems, una compleja toxina formada por tres componentes (factor edematoso, antgeno protector y factor letal) que es la responsable de los sntomas del ntrax. Los seres humanos se infectan al entrar en contacto con animales infectados o sus cadveres o al ingerir o inhalar subproductos derivados de los mismos. El ganado vacuno, ovejas, caballos y cabras son los animales que se infectan ms frecuentemente y constituyen una fuente inmediata de formas vegetativas de la bacteria que esporulan y perpetan la contaminacin en el ambiente. Otras especies del gnero pueden causar tambin enfermedad, aunque habitualmente sean formas saprofitas. En este contexto, Bacillus cereus se ha asociado con infecciones del odo, neumona, infecciones de heridas oculares postraumticas, septicemia y endocarditis. Los pacientes con neumona y septicemia estn afectados, frecuentemente, por algn proceso de inmunosupresin. Esta especie puede ocasionar bacteriemia asociada con el uso de drogas por va intravenosa o de dispositivos mtravasculares contaminados. Existen dos formas de gastroenteritis relacionadas con las especies del gnero Bacillus. La intoxicacin alimentaria causada por Bacillus puede producirse entre una y seis horas despus de la ingestin de alimentos contaminados con B. cereus que contienen preformada una toxina termoestable que el microorganismo ha sintetizado in situ. Los sntomas principales de esta intoxicacin alimentaria son nuseas, vmitos, retortijones y, ocasionalmente, diarrea. Clsicamente, esta forma de gastroenteritis es el resultado de la elaboracin, en gran cantidad, de alimentos que no necesitan ser recalentados antes de servirse. L a cepa de fi. cereus tipo 1 crece particularmente bien en

Gardnerella
Caractersticas. Gardnerella vaginalls es una bacteria Gram variable y pleomrfica. ya que puede aparecer en forma de bacilos delgados o cocobacilos. Es inmvil y catalasa negativa. El crecimiento se observa mejor tras 48 horas de incubacin en una atmsfera enriquecida con un 5% de CO . Las colonias son pequeas y producen hemolisis (} en agar con sangre de conejo o sangre humana. Manifestaciones clnicas y patogenia. Este microorganismo se ha asociado con la vaginosis bacteriana, aunque probablemente no sea el nico agente etiolgico de esta enfermedad. Ha sido aislado a partir de la sangre de pacientes con fiebre posparto y tambin puede causar infecciones en los recin nacidos. G. vaginalls forma parte de la microbiota del recto y el ano en adultos sanos de ambos sexos, as como en nios, y de la microbiota endgena de la vagina en mujeres en edad frtil. Diagnstico de laboratorio. El diagnstico de la vaginosis bacteriana no requiere cultivo, sino que se lleva a cabo mediante examen directo de las secreciones vaginales para detectar la presencia de las clulas clave, que son clulas epiteliales con el borde recubierto de bacterias, la existencia de bacilos pequeos y cocobacilos gramnegativos, la ausencia de lactobacilos (bacilos grampositivos delgados), un valor de pH superior a 4,5 y un olor a aminas (a pescado) que aparece cuando se aade una solucin a la secrecin de KOH al 10%. Cuando se observa en cultivo. G. vaginalls puede ser identificado presuntivamente en base a la hemolisis que produce en agar de dos capas con sangre humana y T w e e n tras 48 horas de incubacin. Sensibilidad a los antimicrobianos. No existe una recomendacin expresa sobre la realizacin de pruebas de susceptibilidad de G. vaginalls a los antimicrobianos. por lo que no existe un protocolo especfico para llevar a cabo este anlisis. El metronidazol es la sustancia de eleccin para el tratamiento de la vaginosis bacteriana. Las infecciones sistmicas causadas por

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

arroz rlo y es ms resistente al calor que otros tipos, por lo que esta forma de gastroenteritis se manifiesta con mucha frecuencia asociada al consumo de arroz frito en los restaurantes chinos. La segunda forma de gastroenteritis causada por fl. cereus es consecuencia de la contaminacin de platos de carne y vegetales y cursa con retortijones y diarrea que aparecen entre 8 y 16 horas despus de la ingestin del alimento contaminado. En este caso los sntomas estn causados por una enterotoxina termolbil. Diagnstico de laboratorio. En los casos en los que se sospeche la existencia de la forma cutnea del ntrax, debe recogerse el lquido de las vesculas, asi como material del borde de la escara, con un hisopo para realizar extensiones para la observacin al microscopio y para el cultivo. Si hay sospecha de ntrax pulmonar, hay que obtener muestras de esputo para los frotis y el cultivo. En el caso de la forma intestinal hay que llevar a cabo un coprocullivo. En el caso de que pueda tratarse de una meningitis deben realizarse observaciones microscpicas y cultivos a partir del LCR. En la fase septicmica deben realizarse hemocultivos. L a deteccin de bacilos grampositivos grandes y con los bordes rectos (aspecto denominado boxear) en los frotis realizados a partir de cualquiera de los especmenes indicados en el prrafo anterior tiene valor diagnstico. La microscopa de fluorescencia, disponible en algunos laboratorios de anlisis y en el CDC. permite llevar a cabo un diagnstico presuntivo rpido. Las especies de Bacillus crecen bien en agar con sangre de oveja. Las colonias de 8. anthracis son habitualmente planas, con bordes irregulares (forma que se denomina "cabeza de Medusa"), blancuzcas con la superficie spera (aspecto de cristal esmerilado) y, usualmente. no hemolticas. Cuando se tocan con el asa de inoculacin, las colonias son pegajosas y se levantan como la clara de huevo batida. B. cereus y otras especies del gnero tambin forman colonias con forma de cabeza de Medusa. El bacilo del ntrax es inmvil, tanto por la prueba de la gota pendiente como en medio semislido, mientras que las restantes especies son mviles. La determinacin de la movilidad por la tcnica de la gota pendiente es una prueba til para diferenciar B anthracis de 8. cereus, pero debe hacerse con cultivos jvenes de ambos microorganismos. El resto de pruebas bioqumicas y caractersticas adicionales que pueden utilizarse para identificar los aislamientos a nivel de especie han sido recopiladas por Logan y Turnbull (Logan, 1999). Las pruebas de virulencia se llevan a cabo inyectando subcutnea o mtraperitonealmente en ratones una suspensin ligeramente turbia de las bacterias, que se prepara resuspendiendo en solucin salina las colonias crecidas en medio slido. No debe utilizarse un cultivo en medio lquido para los ensayos de virulencia debido a los productos toxignicos que otras especies de Bacillus pueden formar en caldo nutritivo. La muerte del ratn tiene lugar entre 24 y 72 horas despus de la inyeccin, y es posible detectar los microorganismos en frotis realizados a partir de muestras de sangre del corazn, hgado y bazo. No es posible llevar a cabo de modo fiable el diagnstico de la gastroenteritis causada por 8. cereus mediante coprocultvo. porque este microorganismo puede formar parte de la microbiota autctona del intestino. Por tanto, el diagnstico depende del cultivo cuantitativo realizado a partir del alimento sospechoso de estar contaminado. La presencia de un nmero igual o superior a 10 unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo en el alimento sospechoso constituye una evidencia presuntiva de contaminacin alimentaria por 8. cereus (Logan, 1999).
5

La enfermedad diarreica aguda producida por 8. cereus se puede prevenir mediante la coccin correcta y la refrigeracin de los alimentos preparados en grandes cantidades, para prevenir la proliferacin de las formas vegetativas de las bacterias y la formacin de la enterotoxina.

Nocardia
Caractersticas. En los frotis de muestras clnicas teidos por el mtodo de Gram. las especies de Nocardia aparecen como bacilos grampositivos largos y delgados, formando rosarios de clulas o ramificados (Lmina 50-4). La caracterstica ms destacable de las nocardias es que son parcialmente cido-alcohol resistentes: las clulas se tien positivamente con una modificacin de la tincin de cido-alcohol resistencia (Zielh-Neelsen o Kmyoun), lo que diferencia a estas bacterias de las del gnero Actinomyces. que pueden tener una apariencia semejante cuando se observan bajo tincin de Gram. La cido-alcohol resistencia parcial puede ser difcil de demostrar y puede visualizarse mejor si se hace crecer al microorganismo en el medio de Middlebrook 7H10 o en leche tornasolada. La mayor parte de las infecciones estn causadas por Nocardia asteroides, seguida por N. brasiliensis y con mucha menor frecuencia por N. olitidis caviarum. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las nocardias se encuentran en el suelo y en la materia orgnica, tienen distribucin mundial y causan enfermedades en animales y peces. L a infeccin en humanos es ligeramente superior en el hombre que en la mujer. La infeccin se contrae usualmente por inhalacin del microorganismo, aunque tambin puede tener lugar por contaminacin de las heridas con tierra, o cuando las bacterias penetran en el organismo a travs del tubo digestivo cuando un material contaminado entra en contacto con una zona ulcerada de la mucosa digestiva. En los pulmones, las nocardias son fagociladas por los macrlagos alveolares, multiplicndose en el interior de los mismos, lo que desencadena una respuesta inflamatoria mixta (neutrfilos, linfocitos y macrfagos) que eventualmente da como resultado la formacin de abscesos y. ocasionalmente, de granulomas. Los estudios realizados in vitro sobre los mecanismos de defensa del hospedador frente a las nocardias sugieren la implicacin de los neutrfilos, los macrlagos activados y las clulas T citotxicas. Aunque los neutrfilos son incapaces de destruir las especies virulentas de Nocardia. inhiben su crecimiento, deteniendo el avance de la infeccin hasta que los macrfagos estn totalmente activados Si la infeccin no queda limitada al pulmn, los microorganismos pueden extenderse por crecimiento hasta otros tejidos adyacentes, produciendo empiema, afectacin de la pared costal y senos drenantes, o diseminarse hemalgenamente formando abscesos, especialmente en el cerebro, tejidos subcutneos y rones. El principal factor relacionado con el hospedador, y que implica un riesgo elevado de contraer nocardiosis. es una disfuncin en la inmunidad celular, aunque muchas personas infectadas por Nocardia spp. no tienen problema reconocido alguno en su inmunidad celular y humoral (Wilson. 1989) La enfermedad pulmonar es la manifestacin ms frecuente de la nocardiosis y se caracteriza por una serie de sntomas como fiebre, anorexia, prdida de peso, tos, disnea y dolor pleural. La infeccin en la piel y el tejido subcutneo puede dar lugar a pioderma, celulilis, formacin de abscesos (uno o mltiples), una afeccin linfocutnea semejante a la esporotricosis y aparicin de nodulos. En Amrica Central y del Sur. la infeccin primaria de la piel con N. brasiliensis puede producir un actmomicetoma (una masa granulomatosa indurada y localizada con conductos fistulosos por los que m a n a pus y los denominados granulos de 'azufre"), generalmente en las extremidades inferiores. La enfermedad diseminada casi siempre est causada por N. asteroides. en la mayor parte de los casos tiene su origen en el pulmn, y se manifiesta tpicamente en forma de abscesos mltiples que afectan al sistema nervioso central. La piel es la segunda localizacin ms comn del cuerpo para la diseminacin de las bacterias, seguida por el nn, el hgado y los ganglios linfticos Diagnstico de laboratorio. Las especies del gnero Nocardia crecen aerbicamente en la mayor parte de medios no selectivos c o m o agar con sangre de oveja y agar chocolate, agar Sabouraud-dextrosa sin cloranfenicol o medio Middlebrook. Estas bacterias tambin pueden ser cultivadas en el medio BCYE (medio tamponado que contiene sangre, carbn vegetal, y extracto d e levadura), utilizado para el aislamiento de Legionella spp. Es importante indicar que las especies de Nocardia no siempre sobreviven a los procesos de descontaminacin de las muestras que se aplican en los protocolos para el

Sensibilidad a los antimicrobianos. Aunque el agente causal es sensible a varios agentes antimicrobianos. la terapia con antibiticos del ntrax se centra en el uso de la penicilina sola o en combinacin con estreptomicina. Ambos antibiticos son m u y activos frente a 8. anthracis. aunque algunas cepas producen una |5-lactamasa. La susceptibilidad de otras especies de Bacillus a las penicilinas y cefalospornas es extremadamente variable. Sin embargo, la mayor parte de especies son inhibidas por tetraciclinas, aminoglucsidos y cloranlenicol a bajas concentraciones. Prevencin. La prevencin del ntrax en el hombre depende del control de los animales infectados. La rpida deteccin de los animales enfermos, su aislamiento y tratamiento, y la incineracin de los cadveres son procedimientos indicados cuando se detectan brotes epidmicos espordicos. En las reas enzoticas se utiliza la vacunacin con preparados de esporas no encapsuladas. Aquellas personas que por su profesin puedan tener riesgo de quedar expuestas tambin deben inmunizarse.

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BACTERIOLOGA MDICA

noi

aislamiento de micobacterias. La incubacin en una atmsfera que contenga un 1 0 % de CO favorece el crecimiento de estos microorganismos. Las especies de Nocardia pueden crecer en 48 horas, aunque normalmente las colonias tardan en aparecer entre 5 y 20 das, y pueden presentar aspecto cerleo, una superficie m u y irregular o un aspecto rugoso aterciopelado, generalmente pigmentadas con tonalidades que van del amarillo al anaranjado. La observacin de formas filamentosas que se tien exclusivamente con un mtodo modificado de tincin de cido-alcohol resistencia distingue a las especies de Nocardia de las micobacterias. Las nocardias se diferencian de la mayor parte de los actinomicetos aerbicos comprobando la resistencia a la lsozima (las especies de Nocardia son resistentes, mientras que las de los gneros Streptomyces. Rhodococcus. Gordona y Aclinomadura son sensibles a la enzima). Las especies de Nocardia se distinguen atendiendo a su capacidad para hidrolizar casena, hipoxantina, tirosina y xantina. Sensibilidad a los antimicrobianos. Las sulfonamidas son usualmente los agentes antimcrobianos de eleccin: sin embargo, la terapia antimicrobiana ptima depende de la especie de Nocardia presente, del patrn de resistencia o sensibilidad de la cepa en particular y del tipo de infeccin. Otros agentes antimcrobianos de utilidad potencial son el trimetoprim-sulfametoxazol. la amicacina y el imipenem.

gnero Actinomadura son una causa frecuente de micetomas actinomicticos. la mayor parte de los cuales aparecen en pases tropicales y subtropicales, donde caminar descalzo incrementa las posibilidades de exposicin a los microorganismos a travs de pequeas heridas punzantes en la planta de los pies. Tradicionalmente se ha considerado que las especies del genero Streptomyces tienen una escasa relevancia clnica: sin embargo, una de las especies, S. somaliensis, ha sido identificada como un agente causal de micetomas actinomicticos. Las restantes especies del gnero tienen importancia mdica slo muy ocasionalmente. Diagnstico de laboratorio. Los actinomicetos aerbicos son de crecimiento lento y pueden necesitar entre dos y tres semanas de incubacin para formar colonias. Estos microorganismos crecen en la mayor parte de medios no selectivos utilizados para aislar bacterias, micobacterias y hongos. Las especies de Rhodococcus crecen como cocobacilos dispuestos en zigzag. En los medios lquidos se observan formas filamentosas con ramificaciones rudimentarias. Las colonias pueden ser rugosas, lisas o mucosas y presentan pigmentos de color marrn claro, coral, anaranjado y rosa intenso, que aparecen tras varios das de incubacin. Las colonias de R. equi son de color rosa o amarillo plidos, o coral, y pueden tener una textura viscosa. Las especies del gnero Gordona forman colonias lisas y mucosas que se adhieren al medio o secas y elevadas. Los pigmentos que producen tienen colores que van del beige al salmn Las especies del gnero Tsukamurella son levemente acidoalcohol resistentes cuando se tien mediante una modificacin del mtodo de Kinyoun. Aparecen como bacilos largos que se fragmentan en tres trozos y no forman hitas areas. Las colonias son circulares, con los bordes enteros o rizados. Pueden tener una textura seca o mucosa con pigmentos de color blanco a anaranjado. Las colonias rugosas aparecen tras siete das de incubacin. Las especies del gnero Actinomadura forman colonias con apariencia cerebriforme, cerleas, duras, membranosas, con pigmentos de color blanco, amarillo, rosa o rojo. Las colonias del gnero Streptomyces son secas, con una textura que tiene una apariencia de tiza o terrea, con aspecto amontonado o plegado, con pigmentos de color blanco-grisceo a amarillo y con un olor que recuerda al de los stanos con humedad. Producen u n a amplia variedad de pigmentos que dan color tanto a las hilas como al sustrato donde crecen stas. Algunas especies no forman hitas areas.

Otros

actinomicetos aerobios

Otros gneros del grupo de los actinomicetos que incluyen especies de inters clnico para el hombre son Rhodococcus. Gordona. Tsukamurella. Actinomadura y Streptomyces. Otro miembro de este grupo, Trophyrema whippelii. es un microorganismo no cultivable que es el agente causal de la enfermedad de Whpple. Manifestaciones clnicas y patogenia. Los miembros de este grupo de microorganismos son ubicuos y se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, habiendo sido aislados del suelo, aguas dulces y marinas y materia orgnica. Rhodococcus equies la nica especie del gnero Rhodococcus patgena para el hombre. Es un patgeno oportunista que afecta a individuos con un grado de inmunodepresin profundo, en los que causa una neumona granulomatosa de progresin lenta. El microorganismo puede aislarse a partir de la sangre de los pacientes infectados. La infeccin se adquiere probablemente por va respiratoria, posiblemente como consecuencia de la exposicin a animales mlectados. La capacidad del microorganismo para sobrevivir en el interior de los macrfagos y, en ltimo trmino, causar su destruccin parece ser la responsable de su poder patgeno. Las infecciones causadas por las especies de los gneros Gordona y Tsukamurella son muy poco frecuentes. Las especies de Tsukamurella son patgenas solamente cuando concurren ciertas condiciones clnicas (p. ej.. inmunosupresin, presencia de cuerpos extraos o infecciones crnicas activas, como tuberculosis). Las especies del

Bacterias gramnegativas Enterobacteriaceae

Caractersticas. Las enterobactenas son bacilos gramnegativos. aerobios o anaerobios facultativos, no formadores de esporas, inmviles o mviles por flagelos pertricos, oxidasa negativos, que producen cidos por va fermentativa a partir de la glucosa y reducen los nitratos a nitritos. Los gneros incluidos en este grupo son los siguientes: Budvicia. Buttiauxella. Cedecea. Qtrobacter. Edwar-

Tabla 50-9

Medios selectivo y diferenciales para enterobacterias A g e n t e bacteriosttico para g r a m p o s i t i v o s Eosina Y Azul de metileno Cristal vilela Sales biliares Sales biliares Carbohidrato fermentable Lactosa' Lactosa Xilosa Lactosa Sacarosa Salicina Lactosa Sacarosa Lactosa Glucosa Sacarosa Color de las colonias Indicador Fermentador Eosina Y Azul de metileno Rojo neutro Rojo lenol Rojas o negras con brillo Rojas Amarillas No termentador incoloras incoloras Rojas S, D S, D S. D Categora"

Medio Eosma-azul de metileno (EMB) MacConkey Xilosa-lisinadesoxicolato (XLD) Hektoen entrico (HE)

Sales biliares

Azul de bromotimol Rojo neutro Sulfito de bismuto Azul Ge timol Azul de bromotimol

Amarilloanaranjadas Rojas # Amarillas

Verdes, azul verdosas Incoloras n Incoloras

S, D

Salmonella-shigella (SS) Sulfilo de bismuto (BS) Tiosullato-citrato-saies biliares-sacarosa (TCBS)''

Sales biliares Verde brillante Sales biliares, pH 8 6

S S S. D

' D = diferencial, S = selectivo Frmula de Levine. # Las sanemelas que producen H,S forman colonias negras Utilizado para el aislamiento de especies del gnero Vibrio
:
v

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

siella. Enterobacter. Escherichia. Ewingella. Hafnia. Klebsiella, Kluyvera. Leclercla, Leminorella. Moellerella. Morganella. Obesumbactenum, Pragia, Panloea. Pholorhabdus, Proleus. Providencia. Rahnella. Salmonella. Serralia. Shigella. Tatumella. Trabulsiella. Xenorhabdus. Yersinia y Yokenella. Solamente unos pocos de estos gneros sern objeto de anlisis en este captulo. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las bacterias de la familia Enterobactenaceae se encuentran presentes en las plantas, el suelo, las aguas y el intestino del hombre y de los animales. Se han asociado con una gran diversidad de infecciones clnicas que incluyen abscesos, neumona, meningitis, septicemia e infecciones de las vas urinarias. Los microorganismos que estn implicados con mayor frecuencia en las infecciones en el hombre son Escherichia coii y varias especies incluidas en los gneros Klebsiella, Proteus, Enterobacter. Salmonella, Shigella, Serralia. Citrobacter y Providencia. Las especies E. coli. Proteus mirabilis y Klebsiella pneumoniae son las que se encuentran con una mayor frecuencia en las vas urinarias. K. pneumoniae es el responsable que con mayor frecuencia se encuentra asociado a las neumonas causadas por bacilos gramnegativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Las especies causantes de bacteriemias son E. coli. K pneumoniae y P. mirabilis. Los miembros pertenecientes a los gneros que exhiben una acusada resistencia a los antibiticos, como Citrobacter, Enterobacter y Serratia, son los responsables ms probables de las infecciones nosocomiales atribuidas a esta familia. Las enterobacterias asociadas con procesos diarreicos son diversas especies incluidas en los gneros Shigella. Salmonella. Yersinia y las cepas enterohemorrgicas, enteropatgenas. enterotoxignicas. enteromvasivas y enteroadherentes de la especie E coli. Las especies del gnero Shigella se aislan m u y raramente de una localizacin que no sea el tracto gastrointestinal, mientras que las del gnero Salmonella se aislan con mayor frecuencia de otras fuentes como sangre y orina. Las endoloxinas, que estn presentes como componentes estructurales de la membrana externa de la pared celular de las enterobacterias. asi como en otros bacilos gramnegativos. son responsables en gran medida de la morbilidad y mortalidad asociadas a las infecciones causadas por estas bacterias. Las endotoxinas estn formadas por una parte lipidica y otra polisacardica. con un componente minoritario de naturaleza proteica. Estos componentes de la clula bacteriana pueden producir fiebre, escalofros, hipotensin, granulocitosis. trombocitopenia. coagulacin intravascular diseminada y activacin del complemento por las dos vas, clsica y alternativa. El shock endotxico es el resultado de una septicemia por bacterias gramnegativas, donde la endotoxina reacciona con los macrfagos, leucocitos, plaquetas, complemento y otras protenas del suero para incrementar los niveles sricos de ciertas protenas proteoliticas y de sustancias vasoactivas. con la consiguiente estasis sangunea, incremento de la vasoconstriccin perifrica y disminucin del gasto cardiaco. Debe quedar claro que los efectos letales de las endotoxinas dependen de la activacin y respuesta de los macrfagos. y que la produccin de caqueetma por los macrfagos activados desempea un papel fundamental en la manifestacin del shock profundo y en las mltiples lesiones orgnicas (Tracny, 1988).

Otros factores patognicos de las enterobacterias incluyen el antigeno K1. que est presente en un elevado porcentaje de cepas de E. coli que causan meningitis neonatal; la cpsula de K. pneumoniae. que. al igual que la de los neumococos, inhibe la fagocitosis; el antigeno Vi de Salmonella typhi, que puede interferir con los procesos que causan la muerte intracelular de este organismo: y diversos tipos de antgenos superficiales como las umbras, que participan en la adherencia de los microorganismos a las superficies mucosas. Los factores determinados por plsmidos parecen desempear un papel importante en las propiedades invasivas de Salmonella. Shigella y las cepas enteroinvasivas de coli. Adems, las enlerotoxmas termolbiles (TL) y termoestables (TE) de E. coli estn codificadas por plsmidos. Las toxinas TL estimulan a la enzima adenilato ciclasa en las clulas de la mucosa del intestino delgado, que, a su vez. activa el cAMP, lo que provoca una salida de lquidos y electrlitos desde las clulas a la luz intestinal, produciendo diarrea acuosa. Por el contrario, las toxinas TE parecen activar la guanilato ciclasa. Diagnstico de laboratorio. El aislamiento de bacilos gramnegativos a partir de muestras contaminadas se facilita en gran medida con el empleo de medios selectivos y diferenciales (Tabla 50-9). El agar EMB (con eosina y azul de metileno) y el agar MacConkey pueden ser utilizados de forma indistinta como medios mnimamente selectivos y diferenciales para la seleccin y diferenciacin inicial de los bacilos gramnegativos termentadores y no termentadores de la lactosa. Los medios XLD y HE son medios diferenciales con un carcter selectivo ms acusado, y son especialmente tiles para recuperar especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras con un elevado grado de contaminacin bacteriana, como son las heces. El agar bismuto-sulfito (BS) es un medio fuertemente selectivo de gran utilidad para la deteccin de salmonelas durante los brotes endmicos o epidmicos de las infecciones causadas por estas bacterias. Las especies del gnero Salmonella producen H;S y se reconocen fcilmente por que las colonias que forman en los medios XLD, HE y BS presentan el centro de color negro. Los medios de enriquecimiento como el caldo selenito F o el caldo GN (para gramnegativos) son recomendables cuando se pretende detectar las especies de los gneros Salmonella o Shigella que estn en bajo nmero en muestras de heces. El agar CIN (cefsulodina-irgasn-novobiocina) incubado a temperatura ambiente es selectivo y diferencial para la recuperacin de Y enterocohtica. Las colonias de esta bacteria en agar CIN tienen una apariencia que se denomina "en ojo de toro", con el centro rojo y los bordes transparentes. El agar MacConkey con sorbitol como azcar fermentable permite diferenciar la cepa 0157:H7 de E coli asociada a sndrome hemoltico urmico, porque a diferencia de oirs cepas de E. coli. sta es incapaz de fermentar el sorbitol. Algunas enterobactenas pueden ser identificadas presuntivamente m e d i a n t e la determinacin de unas pocas pruebas bioqumicas y caractersticas de las colonias que forman. Por ejemplo, las especies de Proteus exhiben una movilidad en enjambre cuando crecen en agar sangre, las de Klebsiella forman colonias mucoides voluminosas, las de Serralia pueden sintetizar un pigmento rojo, las de Salmonella pueden producir H,,S y E. coli es indol positiva. La identifica-

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BACTERIOLOGA MDICA

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Tabla 50-10 Caraceristicas diferenciales d e las e s p e c i e s d e enterobacterias aisladas m s f r e c u e n t e m e n t e e n e l laboratorio d e microbiologa clnica (Continuacin)

cin deliniliva requiere pruebas bioqumicas adicionales. Se han descrito innumerables esquemas de identificacin basados en la realizacin de pruebas bioqumicas convencionales para la identificacin de los miembros de la familia Enterobacteriaceae. En la Tabla 50-10 se indican las caracleristicas diferenciales de las enterobacterias mas comnmente aisladas en los laboratorios de microbiologa clnica. Hay disponibles diferentes sistemas comerciales para la identificacin de la inmensa mayora de enterobacterias que ofrecen una gran sencillez de uso y precisin. En algunos casos, la identificacin puede llevarse a cabo en unas pocas horas y con una elevada fiabilidad mediante estos mtodos. Los sistemas semiautomatizados pueden combinar la realizacin de las pruebas de identificacin con las de sensibilidad a los antimicrobianos en un nico dispositivo. En general, todos estos sistemas tienen un grado de precisin muy elevado y permiten obtener resultados comparables. La clasificacin de las enterobacterias ha experimentado una profunda revisin en los ltimos aos como resultado de los estudios realizados con tcnicas de hibridacin de cidos nucleicos. Debido a que la agrupacin fenotipica basada en pruebas bioqumicas no est siempre de acuerdo con el parentesco gentico, se ha eliminado la categora de tribu (p. ej., Klebsielleae, Proteae) para agrupar a las especies dentro de la familia. Histncamente, el gnero Salmonella se ha divido en la siguientes especies: S. typhi. S. paratyphi A y B, S. choleraesuis. S. typhimurium y S. enleritidis. Debido a que todas estas especies estn muy relacionadas genticamente, actualmente slo se reconocen dos especies, S. entrica y S. bongori. cada una de las cuales incluye mltiples serotipos. Casi todos los serotipos conocidos estn incluidos en la especie S. entrica (Brenner, 2000). El serotipado se basa en la reactividad inmunolgica de los antgenos somticos "O" termoestables, que son fundamentalmente de naturaleza lipopolisacaridica. y los antgenos flagelares "H", que son termolbiles y de composicin proteica. El serotipo typhi de Salmonella tambin sintetiza un antgeno capsular denominado Vi. que es de naturaleza polisacardica y termolbil. En la prctica, la mayor parte de laboratorios clnicos identifican los aislamientos c o m o "especie de Salmonella" basndose en las pruebas bioqumicas, utilizando seguidamente los sueros especficos de grupo para asignar el microorganismo aislado a un serogrupo especfico. La identificacin a nivel de serotipo slo se lleva a cabo en los laboratorios de referencia. Los aislamientos que se componan como Shigella desde el punto de vista bioqumico tambin se clasifican atendiendo a la reactividad inmunolgica de sus antigenos "O" al igual que las cepas de E coli identificadas como causas potenciales de diarrea, sndrome hemolitico urmico o prpura trombocitopenica. Hay disponibles sistemas comerciales que permiten la identificacin de co//0157:H7 y la deteccin de algunos tipos de toxinas en los cultivos o en muestras de heces; sin embargo, la realizacin de estas pruebas es llevada a cabo, generalmente, por los laboratorios de referencia. Sensibilidad a los antimicrobianos. La sensibilidad de las enterobacterias a diversos agentes antimicrobianos es m u y variable debido tanto a factores intrnsecos como a mecanismos de resistencia adquiridos. La resistencia intrnseca es el resultado de rasgos genticos que han aparecido evo-

lutivamente antes de que los antibiticos comenzaran a utilizarse teraputicamente. Un ejemplo de esto es la resistencia a la penicilina observada en especies de los gneros Citrobacter. Klebsiella. Enterobacter y Serratia. Algunas de ellas son intrnsecamente resistentes tambin a las cefalosponnas de primera generacin. La resistencia adquirida es el resultado de la exposicin a los agentes antimicrobianos. Ejemplos de la misma son las cefalosporinasas de tipo I producidas por Citrobacter treundh y Enterobacter cloacae. que confieren resistencia a ceftacidima, y las |5-lactamasas de amplio espectro sintetizadas por K. pneumoniae o col!, que son responsables de la resistencia a las cefalosporinas de tercera generacin. Debido a que el patrn de resistencia de las enterobacterias es impredecble, las pruebas de sensibilidad deben realizarse, como regla general, si se considera administrar una terapia antimicrobiana. En caso contrario, c o m o pueden ser las infecciones intestinales sin complicaciones causadas por salmonelas, en las que un tratamiento con antibiticos contribuye realmente a prolongar el estado de portador en el individuo afectado, no es necesario llevar a cabo las pruebas de sensibilidad.

Vibrio
Caractersticas. Las especies del gnero Vibrio son bacilos gramnegativos cortos, rectos o curvados, anaerobios facultativos, oxidasa positivos, generalmente mviles por flagelos polares, capaces de fermentar los carbohidratos y de reducir los nitratos a nitritos. Algunas de las especies tienen importancia clnica (Tabla 50-11). Manifestaciones clnicas y patogenia. Entre las especies del gnero. Vibrio vulniticus causa la patologa ms grave. Las infecciones de las heridas y la septicemia debidas a esta bacteria son. a menudo, mortales. La enfermedad est asociada con el consumo de ostras crudas o con heridas producidas al manipular ostras. En los casos graves casi siempre existe una afeccin heptica subyacente. Una funcin heptica disminuida provoca un aumento en la concentracin de hierro utilizable por el microorganismo, lo que facilita su crecimiento, Las cepas 01 de Vibrio cholerae productoras de toxina colrica son responsables de las epidemias de clera, enfermedad que se caracteriza por una masiva prdida de lquidos a nivel del intestino y que provoca deshidratacin en el paciente. La toxina colrica ejerce su accin unindose a la enzima adenilato ciclasa de las clulas del epitelio de la m u c o s a del intestino delgado causando su activacin, lo que trae c o m o consecuencia una hipersecrecin de agua y electrlitos (Kaper, 1995). Las cepas no-01 de V. cholerae causan una gastroenteritis autolimitada y no provocan epidemias de la enfermedad. Prcticamente ninguna de las cepas no-01 de V. cholerae produce toxina colrica, aunque s que sintetizan dos tipos de hemolismas y una enterotoxina termoestable. Las especies V mimicus y V. parahaemolyticus causan gastroenteritis primariamente. La patogenicidad en el caso de V. parahaemolyticus parece estar relacionada ms con el carcter invasivo de esta especie que con la produccin de enterotoxinas. Ms del 95% de cepas de V. parahaemolyticus ais-

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BACTERIOLOGA MDICA

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ladas de pacientes con gastroenteritis producen una hemohsina exocelular que es letal para el ratn cuando se le inyecta en dosis elevadas, lo que se conoce con el nombre de fenmeno de Kanagawa. Esta bacteria halfila est ampliamente distribuida en las aguas marinas, contaminando a pescados y mariscos. Los brotes de diarrea aguda tras la ingestin de pescado crudo han sido particularmente frecuentes en Japn, pero tambin se han producido en EE.UU. y otros pases. Diagnstico de laboratorio. Aunque antiguamente la preocupacin slo afectaba a los viajeros de EE.UU. que iban a reas endmicas, recientemente se han detectado casos de enfermedad causada por V. cholerae en este pais asociados a la ingestin de mariscos contaminados procedentes de la costa del golfo de Mxico. Adems, se han descrito casos de gastroenteritis por V. parahaemolyticus y otras especies halfilas del gnero Vibrio presentes en mariscos contaminados en muchas regiones del pas, especialmente en zonas costeras. Por consiguiente, es importante que los laboratorios clnicos tengan la capacidad para realizar coprocultivos para el aislamiento de especies de Vibrio cuando est indicado, en funcin del historial (viajes realizados, alimentos consumidos) de la persona sobre la que existe la sospecha de que est sufriendo infecciones de este tipo. Con la excepcin de V. cholerae y V mimicus, el crecimiento de los vibrios requiere que los medios de cultivo contengan NaCI. La mayor parte de medios de cultivo slidos y lquidos utilizados habitualmente para el cultivo de bacterias contienen sodio suficiente, por lo que no es necesario utilizar medios especales en esos casos. Los medios selectivos que contienen sacarosa, como el agar con tiosulfato, citralo y sales biliares (agar TCBS). son de gran utilidad para el cultivo de Vibrio spp. a partir de muestras de heces. Algunas especies (V. cholerae y V. alginolyticus) son capaces de fermentar la sacarosa y forman colonias de color amarillo en ese medio. Puede utilizarse un medio de enriquecimiento como el agua de peptona alcalina antes de realizar la inoculacin en medio slido selectivo, con objeto de aumentar las posibilidades de recuperacin de las especies de Vibrio a partir de muestras de heces. Los miembros del gnero pueden diferenciarse entre ellos y de otros bacilos intestinales gramnegativos segn las caractersticas bioqumicas que se muestran en la Tabla 50-11. En el caso de los vibrios halfilos puede ser necesario utilizar medios que contengan entre un 1% y un 3% de NaCI para llevar a cabo las pruebas pertinentes. Si se inoculan placas con agar TSI (agar triple azcar-hierro) y agar LIA (agar lisina-hierro) con finalidad analtica, las reacciones observadas deben ser pendiente cida/fondo cido sin gas (A/A) o con formacin de H S, y pendiente alcalina/fondo alcalino (K/K), respectivamente. No todos los sistemas comerciales existentes para la identificacin de bacterias gramnegativas son seguros para llevar a cabo la identificacin de las especies del gnero Vibrio, y slo deben utilizarse cuando se ha comprobado previamente su Habilidad
?

para producir una enterotoxina. Tambin se ha descnto una hemolisina y un factor citoptico. Las especies de Aeromonas tambin causan infecciones de heridas traumticas, diarrea o septicemia en pacientes inmunocomprometidos (Janda, 1991.1994). Diagnstico de laboratorio. El aislamiento de bacilos gramnegativos. termentadores y oxidasa positivos, sugiere fuertemente la posibilidad de que se trate de una especie de Aeromonas. Estos microorganismos crecen fcilmente en los medios de cultivo convencionales, lormando colonias que recuerdan a las que producen las especies del gnero Pseudomonas. con un color verdoso semejante al del vidrio triturado y un olor afrulado. La m a y o r parte de especies son [i-hemoliticas cuando crecen en agar sangre. El aislamiento de aeromonas a partir de muestras de heces se facilita si se utiliza agar sangre con ampicilina o medio CIN (agar cefsulodina-irgasn-novobiocina). Sensibilidad a los antimicrobanos. Las Aeromonas son sensibles a las quinolonas. las cefalosporinas de tercera generacin, los aminoglucsidos, el cloranfenicol y las tetraciclinas, aunque producen u n a |Wactamasa que es responsable de la resistencia a las penicilinas y las cefalosponnas de primera generacin. Se ha comprobado que las Aeromonas albergan plsmidos R tanto de enterobacterias como de Pseudomonas spp. Los sistemas comerciales rpidos para las pruebas de sensibilidad pueden no ser liables para este grupo de bacterias, por lo que se recomienda el mtodo de difusin en disco.

Plesiomonas
Caractersticas. Plesiomonas shigelloses, la nica especie comprendida dentro del gnero Plesiomonas. es un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, oxidasa y catalasa positivo, que fermenta la glucosa. Las ltimas evidencias obtenidas mediante tcnicas de gentica molecular indican que el gnero Plesiomonas est estrechamente relacionado con el gnero Proteus de la familia Enterobacteriaceae. Manifestaciones clnicas y patogenia. P shigelloses se encuentra en ambientes acuticos, con una distribucin geogrfica limitada por la temperatura mnima de crecimiento de la bacteria, que es 8 C. El microorganismo puede aislarse a partir de aguas dulces y de estuario en pases tropicales, y provoca gastroenteritis, a menudo tras la ingestin de mansco crudo. Las heces diarreicas contienen, frecuentemente, leucocitos polimorionucleares y hemates, aunque los individuos infectados tambin pueden padecer una enfermedad similar al clera. La gastroententis puede aparecer en casos espordicos o en forma de epidemias. Las formas extraintestinales de la infeccin por P shigelloides incluyen meningitis, septicemia, celulitis, artritis y endoftalmitis. Se sabe relativamente poco sobre los factores de virulencia asociados a esta especie bacteriana. P shigelloides parece tener carcter invasivo, y algunas investigaciones sugieren la existencia de una actividad enterotoxigmca (Brenden, 1988). Diagnstico de laboratorio. P. shigelloides puede aislarse en diversos medios de cultivo no selectivos y selectivos para enterobacterias, incluyendo el agar HE. La produccin de cidos a partir de la lactosa tiene carcter variable, aunque por lo general esta bacteria aparece como no termentadora de la lactosa cuando crece en medios selectivos para bactenas entricas. Entre otras caracteristicas bioqumicas se pueden citar las siguientes; es i n d c J positiva, reduce los nitratos a nitritos, produce catalasa, da positiva la prueba del rojo de metilo y fermenta la glucosa, la maltosa y la trehalosa (Brenden, 1988). Sensibilidad a los antimicrobianos. P. shigelloides es sensible a una gran variedad de antibiticos, incluidos aminoglucsidos, trimetoprim-sulfametoxazol. cloranfenicol. tetraciclinas y quinolonas. La sensibilidad a las penicilinas es variable debido a la produccin de una |i-lactamasa similar a la de Aeromonas spp

Sensibilidad a los antimicrobianos. Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos pueden realizarse mediante el mtodo de difusin en disco, utilizando agar Mueller-Hinton. El National Committee tor Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ha establecido los patrones de referencia para interpretar los resultados de las pruebas de sensibilidad de V. cholerae frente a la ampicilina. la tetraciclina, el trimetoprim-sulfametoxazol. el cloranlenicol y las sullonamidas (NCCLS. 2000a). No existen patrones de referencia para las otras especies del gnero.

Aeromonas
Caractersticas. Las especies de este gnero son bacterias gramnegativas de morfologa bacilar, oxidasa y catalasa positivas, y anaerobias facultativas. Generalmente son mviles por medio de flagelos polares, aunque algunas especies son inmviles. Producen cidos a partir de los carbohidratos, tanto por via oxidativa c o m o fermentativa, y reducen los nitratos a nitritos. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies de Aeromonas se encuentran presentes en hbitats acuticos principalmente. Se han aislado a partir del agua potable, agua de ros, suelo y varios tipos de alimentos, y slo raramente de ambientes marinos. Estos microorganismos se han asociado con infecciones intestinales y extraintestinales. Aunque no existe una evidencia definitiva que demuestre el papel de las Aeromonas en las infecciones gastrointestinales, la presencia de especies de Aeromonas en muestras de heces se asocia ms con un proceso diarreico que con un estado de portador asintomtico. La diarrea se asocia con la capacidad que tienen algunas cepas

Campylobacter
Caractersticas. Los miembros del gnero Campylobacter son bacterias gramnegativas de pequeo tamao (0.5 pm -8 pm de largo por 0.2 iim-0,5 pm de ancho), curvadas (en forma de c o m a o de letra S). mviles y no formadoras de esporas, con un crecimiento ptimo en una atmsfera que contenga entre un 5% y un 10% de oxigeno solamente, razn por la que estas bactenas se consideran microaerfilas. Campylobacter je/uni es la causa ms comn de enteritis bacteriana en los EE.UU. Otras especies del gnero asociadas con esta patologa son C. coli. C. tari y C upsaliensis. C. letus subespecie fetus causa tromboflebitis sptica, artritis, peritonitis, abscesos y pericarditis (Penner, 1988), especialmente en personas con enfermedades crnicas subyacentes.

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Manifestaciones clnicas y patogenia. C. jejuni se encuentra distribuido por todo el mundo, formando parte de la microbiota del tubo digestivo de animales salvajes y domsticos (ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos y aves de corral, como pavos y pollos). Es la causa ms comn de enteritis bacteriana en EE.UU.. con una incidencia estimada de 1.000 casos por cada 100.000 individuos. L a incidencia de la infeccin es similar en el Remo Unido y en otros pases desarrollados, mientras que en los pases subdesarrollados es incluso ms elevada. Las infecciones tienen lugar, generalmente, durante el verano y el otoo y normalmente son consecuencia de la ingestin de alimentos mal cocinados, en especial carne de pollo y otras aves de corral. Tambin se han asociado algunos brotes de enteritis por C. jejuni al consumo de leche y a fallos en los sistemas municipales de potabilizacin de aguas. La infeccin puede ser desde asintomtica hasta muy grave. Las heces diarreicas pueden indistintamente contener o no sangre y leucocitos. Los sntomas pueden durar hasta una semana y generalmente son autolimitados. Tambin pueden producirse infecciones extramtestmales como bacteriemia. artritis reactiva, infecciones de las vas urinarias y meningitis. C. ejuni tambin est reconocido como la causa antecedente del sndrome de Guillain-Barr. La capacidad patognica de esta bacteria no est totalmente esclarecida: parece que primero coloniza la mucosa intestinal y luego es capaz de atravesar la superficie epitelial para alcanzar los tejidos subyacentes. El habitat principal de C. telus subesp. lelus es el intestino de ovejas y ganado vacuno, aunque tambin puede encontrarse en el tracto genital de estos animales, en sus placentas, en el contenido gstrico de los fetos abortados y, con menor frecuencia, en otros animales y en aves. Los mecanismos de transmisin al hombre no estn plenamente caracterizados. El contacto directo con animales infectados es una posible causa de contagio, aunque menos de un tercio de individuos infectados tienen un historial de riesgo a la exposicin por razones profesionales o ambientales. Los alimentos y las aguas contaminadas pueden ser un vehculo para la infeccin en humanos, aunque tambin sta puede producirse a partir de una fuente endgena. Diagnstico de laboratorio. Una nica muestra de heces es apropiada, generalmente, para detectar patgenos intestinales, incluyendo las especies de Campylobacter. El examen de la muestra en busca de leucocitos fecales no est recomendado porque slo aparecen en menos de un 25% de los casos. Est disponible un enzimoinmunoensayo (EIA) para la deteccin de antgenos de C. jejuni y C. coli directamente en las muestras de heces. Pueden utilizarse diferente medios para el aislamiento selectivo de las especies de Campylobacter. como agar carbn vegetal-cefoperazona-desoxicolato, medio selectivo con carbn vegetal, medio semislido sin sangre (para movilidad), medio de Skirrow y agar Campylobacter con un 5% de sangre de oveja y cinco antimicrobianos (cefalotina, tnmetoprim. vancomicina. polimixina B y anfot e r i c m a B). La mayor parte de especies necesitan una atmsfera de incubacin microaerfila (5% de 0 , 10% de CO, y 85% de N,). que puede conseguirse mediante sistemas generadores de gases disponibles comercialmente, La cantidad de oxgeno existente en una jarra con vela es demasiado baja para permitir el crecimiento de Campylobacter spp.. por lo que no debe utilizarse. La incubacin de los medios a 42' C incrementa la selectividad para C. jejuni.
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agentes. No existen hasta el momento mtodos estandarizados para llevar a cabo las pruebas de sensibilidad en este grupo de microorganismos.

Helicobacter
Caractersticas. Las especies del gnero Helicobacter son bacilos gramnegativos curvados o en espiral, no esporulados. que miden entre 0,3 um-1.0 iim de ancho y 1 . 5 Lim-10 iim de largo. Son mviles por medio de mltiples flagelos localizados en ambos polos de la bacteria o de un nico flagelo monopolar, microaeroflicas y tienen metabolismo respiratorio. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies de Helicobaterse encuentran en el Irado gastrointestinal de los mamferos y las aves. La transmisin entre hospedadores es por va oral u oro-fecal. Helicobacterpylori est considerado como una de las especies "gstricas" del gnero. Esta bacteria vive dentro de la capa mucosa del estmago adyacente al epitelio o inmediatamente por debajo de la misma. Tambin se encuentra transitoriamente en el duodeno, en la saliva y en las heces. La infeccin por H. pylon puede provocar los sntomas de una gastritis aguda. La mayor parte de pacientes infectados desarrollan una gastritis crnica activa que puede conducir a una dispepsia no ulcerosa o a una lcera duodenal. Esta especie se ha asociado con el 90% de los casos de lcera duodenal y con la prctica totalidad de los de lcera gstrica. La infeccin por H. pylori tambin se ha relacionado con el carcinoma y el lintoma gstricos (Murray, 1993: Parsonnet, 1991,1994). La prevalencia de la gastritis asociada a la infeccin por H. pylon aumenta con la edad, lo que sugiere que el microorganismo se adquiere a medida que la gente envejece, Las especies "intestinales" del gnero, tales como Helicobacter (antiguamente Campylobacter) cmaedi y H. lenelliae. han sido implicadas en casos de gastroenteritis. Estos microorganismos invaden raramente el torrente circulatorio, pudiendo ser aislados entonces mediante hemocultivo. Diagnstico de laboratorio. Los mtodos no basados en el cultivo bacteriano se han utilizado clsicamente para el diagnstico de las infecciones causadas por H. pylori. Uno de estos mtodos se basa en la deteccin de urea en el aliento. Esta tcnica no invasiva detecta la actividad utesica de H. pylori midiendo el CO etiquetado con C o C que se desprende en el aire expelido por el paciente al que se le ha administrado previamente urea marcada radiactivamente. Los mtodos serolgicos tambin s e utilizan ampliamente en los pacientes sintomticos para detectar anticuerpos frente a H. pylon. En algunos casos pueden obtenerse por biopsia muestras de tejido afectado que se examinan histolgicamente mediante tincin con hematoxilina y eosina o por la tcnica de Gemsa. para detectar la presencia de bacterias con la morfologa tpica de H. pylon. Debido a que el microorganismo hidrolza la urea m u y rpidamente, una alcuota de la biopsia de tejido gstrico debe incubarse directamente en caldo urea o en placas con agar urea, para detectar la hidrlisis de la urea entre 1 y 24 horas despus. Desde hace poco tiempo, se encuentra disponible en el mercado un enzimoinmunoensayo para la deteccin de antgenos de H. pylon en heces, que augura ser una alternativa muy prometedora para el diagnslico no invasivo de las infecciones causadas por esta bacteria.
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Si se sospecha la presencia de Campylobacter spp. en un hemocultivo basndose en el historial clnico o en la apariencia del microorganismo observado bajo tincin de Gram. el caldo debe ser subcultivado en un agar sangre no selectivo, que se incubar a 37 C en una atmsfera microaerofilica. En general, las colonias de Campylobacter spp. son de color gris, planas, irregulares y extensas, que pueden convertirse en redondas, convexas y relucientes a medida que la humedad del medio va disminuyendo. La observacin de la morfologa tpica bajo tincin de Gram y una prueba positiva de la oxidasa a partir de una colonia crecida en un medio selectivo a 42'C son evidencias suficientes para identificar a un aislamiento como una especie de Campylobacter. C. jejuni es capaz de hidrolizar el hipurato y es sensible al cido nalidxico y resistente a la cefalotina. C. coli no hidrolza el hipurato. Las cepas de C. fetus subesp. ietus son resistentes al cido nalidxico, son incapaces de hidrolizar el hipurato y no crecen generalmente a 42C. Sensibilidad a los antimicrobianos. C jejuni tiene una sensibilidad variable a los agentes antimicrobianos. La mayor parte de especies no son sensibles a las penicilinas y las cefalosporinas. En el caso de infeccin intestinal, la eritromicina es el antibitico de eleccin, con las quinolonas c o m o opcin alternativa, aunque se han detectado resistencias frente a ambos

Para el cultivo, las muestras de tejidos deben mantenerse a 4 C y ser procesadas antes de que transcurran dos horas tras su recoleccin. Como medios de transporte pueden utilizarse diferentes alternativas, como el caldo Brucella con un 20% de glicerol, el medio Albem con cistena y un 20% de glicerol. solucin salina isotmca con un 4% de glucosa y el medio de transporte de Stuart. Las muestras procesadas deben inocularse en alguno de los medios apropiados, entre los que se encuentran el caldo infusin de cerebro y corazn, agar Brucella. agar Columbia y medio de Skirrow enriquecido con sangre o suero de caballo, o con sangre de oveja. Se recomienda que los medios contengan vancomicina, anfolencina y cefsulodina c o m o agentes selectivos, Una vez inoculados, los medios deben incubarse en una atmsfera microaerofilica (5%-10% de CO. 80%-90% de N y 5%-10% de 0 ). con humedad elevada, a 35 C. durante 5-7 das. La presencia de H (5%-8%) en la atmsfera de incubacin favorece el crecimiento de H. pylon.
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Por lo general, en los medios antenormente mencionados. H. pylori a lugar a colonias pequeas, de color gris y translcidas, formadas por bacilos espirales gramnegatvos. cuando se observan en extensiones teidas por el mtodo de Gram, y que dan positivas las pruebas de la oxdasa, la catalasa y la ureasa. Generalmente no se lleva a cabo el aislamiento de las especies intestinales de Helicobacter a partir de heces. Las diferentes especies del gnero pueden

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BACTERIOLOGA MDICA

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crecer y delectarse en los sistemas automatizados para hemocultivo que se emplean en muchos laboratorios, aunque en este caso puede ser necesano prolongar el perodo de incubacin ms all de los cinco das estndar. Sensibilidad a los antimicrobianos. Para el tratamiento de las infecciones causadas por H. pylori se utilizan regmenes de administracin combinada de antibiticos, que incluyen, usualmente. dos antibiticos (metronidazol. clantromicina, tetraciclina o amoxicilina) y un medicamento anticido. Se ha descrito la existencia de cepas que son resistentes al metronidazol y a la claritromicina. Para realizar las pruebas de sensibilidad, el NCCLS recomienda el mtodo de dilucin en agar, empleando agar Mueller-Hinton enriquecido con un 5% de sangre de oveja (NCCLS, 2000b).

que producen las bacterias de este grupo. Las reacciones se detectan usualmente al cabo de 48 horas, aunque en algunos casos puede ser necesario prolongar la incubacin hasta siete das. Sensibilidad a los antimicrobianos. Como regla general, las pruebas de sensibilidad deben realizarse con todos los aislamientos de P. aeruginosa con significado clnico. Esto es especialmente importante en el caso de cepas hospitalarias, que pueden ser resistentes frente a uno o incluso todos los agentes antimicrobianos que se utilizan para tratar las infecciones Entre stos se incluyen los aminoglucsidos, las carboxi- y ureidopenicilinas, la celtacidima o cefepima y las quinolonas.

Burkholderia y Stenotrophomonas Pseudomonas

Caractersticas. El gnero Pseudomonas ha experimentado una profunda revisin y en la actualidad muchas de las especies que haban sido inicialmenle clasificadas dentro de este gnero han sido reclasificadas dentro de los gneros Burkholderia. Slenolrophomonas, Comamonas, Shewanella. Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas. Acidovorax y Brevundimonas. Entre las especies que permanecen dentro del gnero Pseudomonas. P. aerugmosa es la que tiene mayor importancia como patgeno del hombre. Las pseudomonas son bacilos gramnegativos. aerobios estrictos, catalasa y oxidasa positivos. Su metabolismo es estrictamente respiratorio (oxidativo), nunca fermentativo, utilizando el oxgeno como el aceplor final de electrones. Algunas especies son mviles por medio de flagelos polares. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies del gnero Pseudomonas se encuentran distribuidas en ambientes hmedos. Algunos de los habitat ms inusuales en donde se pueden encontrar estas bacterias incluyen los productos cosmticos, el agua de las piscinas y jacuzzis. y la parte interior de la suela de las zapatillas. En este ltimo caso, esta es la fuente a partir de la que pueden infectarse con P. aeruginosa pequeas heridas punzantes en la planta de los pies. La especie del gnero responsable de la mayor morbilidad y mortalidad hoy en da es P. aeruginosa. Aunque otras especies del gnero se aislan a menudo a partir de especmenes clnicos, slo estn implicadas ocasionalmente en infecciones en el hombre. P. aeruginosa es ubicua en el ambiente hospitalario, encontrndose presente en casi cualquier lugar en el que haya humedad, incluyendo equipos mdicos, soluciones desinfectantes y jabones. Se encuentra muy raramente lormando parte de la microbiota normal en las personas sanas, pero en los individuos hospitalizados la lasa de colonizacin se incrementa de forma proporcional a la duracin del perodo de hospitalizacin. P. aeruginosa puede producir infecciones graves en pacientes con quemaduras, que tienen heridas traumticas o quirrgicas, que han sufrido manipulaciones en sus vas urinarias, que tienen enfermedades en los sistemas hematopoytico. reticuloendotelial y linftico, y en todos aquellos que tienen problemas en sus defensas inmunolgicas de tipo humoral o celular. Las infecciones pulmonares causadas por estos microorganismos aparecen primariamente en pacientes con fibrosis quistica La tasa de mortalidad ms elevada se da en individuos con leucopenia grave (<1.000 leucocitos neutrfilos polimorfonucleares [PMN] por mnr). P. aeruginosa sintetiza un polisacrido mucoso, una endotoxina y varias proteasas que inactivan los componentes del complemento, lo que conlleva una cierta inhibicin de la opsonizacin y de la respuesta inflamatoria, contribuyendo a la invasividad del microorganismo. La exotoxina A causa dao celular, favorece la invasin de los tejidos y es txica para los macrfagos. Diagnstico de laboratorio. A menudo es posible sospechar la presencia de P. aeruginosa en los cultivos por el olor a uvas y a humedad (o a tortilla de maz) de los mismos, el aspecto rugoso o de polvo de cristal de sus colonias y la presencia de pigmentos o de un brillo metlico en las mismas. Su identificacin se puede llevar a cabo fcilmente determinando la prueba de la oxidasa (P. aeruginosa es oxidasa positiva), una reaccin pendiente alcalina/fondo neutro en agar TSI, la capacidad para crecer a 42"C y la formacin de brillo metlico y/o de pigmento en la pendiente de los tubos con agar TSI o agar P para Pseudomonas. Otras caractersticas que pueden determinarse adicionalmente se indican en la Tabla 50-12. Las pruebas de utilizacin de los carbohidratos deben realizarse en el medio basal para la delerminacin del metabolismo xido-fermentativo (O-F), que contiene una cantidad mnima de peptona (fuente de nitrgeno) y una concentracin relativamente elevada de carbohidrato, y que permite la deteccin de las cantidades muy pequeas de cidos Caractersticas. Las pseudomonas fueron inicialmente divididas en cinco grupos en funcin de los datos de homologa de sus cidos ribonucleicos (ARN). Estudios taxonmicos recientes han dado como resultado una reclasificacin de los microorganismos incluidos en cuatro de esos cinco grupos en varios gneros nuevos: Burkholderia, Slenolrophomonas. Ralstonia, Brevundimonas. Comamonas y Acidovorax. Todas estas bacterias son grampositivas, tienen morfologa bacilar, no form a n esporas, son aerobias estrictas y, con la excepcin de Burkholderia mallei. son mviles mediante flagelos polares. Son catalasa positivas y la mayor parte de especies son tambin oxidasa positivas. En agar MacConkey estas bacterias no fermentan la lactosa. Importancia clnica y patogenia. Estos microorganismos se encuentran en las aguas, el suelo y las plantas. Debido a su predileccin por los ambientes en donde existe humedad, algunos de ellos pueden encontrarse en entornos hospitalarios y tienen la capacidad potencial para producir infecciones nosocomiales. Dos especies patgenas de importancia dentro del gnero Burkholderia son Burkholderia pseudomallei y Burkholderia cepacia. B. pseudomallei infecta por inhalacin o a travs de heridas o abrasiones en la piel, causando la enfermedad denominada melioidosis. La infeccin puede ser asintomtica. hacerse crnica o provocar una sepsis fulminante. L a melioidosis tiene u n a mayor prevalencia en el sudeste asitico y en Australia, aunque tambin s e dan casos en otros ambientes tropicales y subtropicales. Burkholderia cepacia. un patgeno nosocomial que se encuentra en equipos contaminados, medicinas y desinfectantes, puede causar bacteriemia. infecciones de las vas urinarias, artritis sptica e infecciones respiratorias. Tambin es un patgeno importante en los pacientes con fibrosis quistica o con enfermedad granulomatosa crnica. Los enfermos de fibrosis quistica con infeccin crnica por este microorganismo tienen una tasa de supervivencia ms baja. Stenotrophomonas maltophilia es un patgeno nosocomial importante. Los factores de riesgo que incrementan las posibilidades de colonizacin o de infeccin por este microorganismo son la respiracin asistida, la terapia con antibiticos de amplio espectro, la cateterizacin y el estado de neutropenia. Las especies de los gneros Ralstonia. Brevundimonas. Comamonas y Acidovorax se aislan con muy poca frecuencia a partir de las muestras clnicas. Diagnstico de laboratorio. Las especies de estos gneros crecen bien en los medios de cultivo estndar, como agar sangre y agar chocolate. El aislamiento de B. cepacia a partir de especmenes contaminados, c o m o el esputo, puede facilitarse utilizando medios selectivos, como agar PC (Pseudomonas cepacia). agar base para metabolismo xido-fermentativo, con polimixina B. bacitracina y lactosa (agar OFBL). y agar selectivo para B. cepacia (agar BCSA) Son necesarias una amplia variedad de pruebas bioqumicas para poder distinguir cada una de estas especies. Una prueba bioqumica importante para diferenciar a S. maltophilia es la prueba de la oxidasa, que es negativa para esta especie. Sensibilidad a los antimicrobianos. L a sensibilidad de estos microorganismos a los agentes antimicrobianos varia considerablemente. B. cepacia es muy resistente a un gran nmero de antimicrobianos, aunque normalmente es sensible a la piperacilina, azlocilina. cefoperaxona. ceftacidima, cloranfenicol y trimetoprim-sulfametoxazol. Las cepas aisladas a partir de pacientes con fibrosis quistica que han recibido sesiones de tratamiento con antibiticos repetidas son probablemente resistentes a los antibiticos empleados. S. maltophilia es intrnsecamente resistente a muchos antibiticos El trimetoprim-sulfametoxazol es el antibitico de eleccin, aunque las infecciones graves pueden necesitar un tratamiento combinado con diferentes agentes

Tabla 50-12

Caractersticas diferenciales de las p s e u d o m o n a d c e a s aisladas de muestras clnicas

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BACTERIOLOGA MDICA

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antimicrobianos. No existen mtodos estndar para la realizacin be las pruebas de sensibilidad para este microorganismo, por lo que es difcil obtener resultados precisos y reprodceles.

Acinetobacer
Caractersticas. Los microorganismos de este gnero son gramnegativos, tienen morfologa bacilar, a veces casi coccea, y son inmviles, oxidasa negativos y aerobios estrictos. En los frotis teidos por el mtodo de Gram aparecen a menudo dispuestos en parejas y pueden ser difciles de decolorar. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies del gnero Acinetobacter se encuentran habitualmente en el suelo y en las aguas, y con mucha menor frecuencia en la piel y mucosas de las personas sanas. Es escasa la informacin sobre los factores de virulencia asociados a este grupo de microorganismos, aunque parecen producir endotoxina en pequeas cantidades. Aunque son usualmente no patgenas, estas bacterias han sido asociadas, cada vez con una mayor frecuencia, con septicemia, neumona, bacteriuria e infeccin de las heridas en el entorno hospitalario. Diagnstico de laboratorio. Las especies de Acinetobacter pueden distinguirse fcilmente de otras bacterias del grupo de las pseudomonas en base a su inmovilidad, su incapacidad para reducir los nitratos y dar negativa la reaccin de la oxidasa. Puede ser difcil llevar a cabo la diferenciacin de las especies que oxidan la glucosa: estos aislamientos se agrupan dentro del denominado complejo A calcoacelicus-baumannii(Gerner-Smidt, 1991) La mayor parte de aislamientos glucosa-negativos y no hemolticos corresponden a la especie A. Iwotfi. mientras que los hemolticos se identifican c o m o A haemolyticus. Sensibilidad a los antimicrobianos. Las especies de este gnero son resistentes a la mayor parte de los antibiticos |i-lactmicos y ammoglucsidos existentes. L a resistencia a los aminoglucsidos est determinada por acetil-. adenil- y fosfotransferasas codificadas por plsmidos Las especies de Acinetobacter son sensibles a doxiciclma. trimetoprim-sulfametoxazol. quinolonas, ureidopenicilinas, imipenem, ampicilina-sulbactam y ceftacidima. Las pruebas de sensibilidad deben llevarse a cabo con todos los aislamientos que tengan inters clnico.

mente asociada con las lesiones actinomicticas. Sin embargo, en los ltimos aos esta bacteria ha sido identificada, cada vez con mayor frecuencia, como agente causal de endocarditis bacteriana subaguda. periodontitis y abscesos cerebrales, habindose caracterizado dos factores de virulencia en la misma: una leucotoxina y una colagenasa. Diagnstico de laboratorio. A. actinomycetemcomitans crece bien en agar sangre y agar chocolate. Despus de 24 a 72 horas de incubacin, las colonias tienen entre 1 m my3m m de dimetro con el centro arrugado. El microorganismo es catalasa, oxidasa y ureasa positivo. Deben realizarse pruebas bioqumicas adicionales para diferenciarlo de otros bacilos gramnegativos delicados, de crecimiento lento (vase Tabla 50-13). Sensibilidad a los antimicrobianos. Este microorganismo es resistente a la penicilina, pero habitualmente es sensible a otros muchos antibiticos como cefalosporinas, combinaciones de un [5-lactmico con un inhibidor de |ilactamasas, fluoroquinolonas y tetracichnas.

Eikenella
Caractersticas. Clasificados antiguamente como Bacteroides corrodens. los "bacilos corrosivos" anaerobios facultativos se han integrado en la especie Eikenella corrodens. que comprende microorganismos gramnegativos de morfologa bacilar, oxidasa positivos, catalasa negativos, no fermentadores, c u y a s colonias pueden corroer el agar o hacer agujeros en el mismo. Su crecimiento se ve favorecido por la presencia de CO (5%-10%) en la atmsfera de incubacin y generalmente requiere la presencia de factor X en el medio de cultivo. Manifestaciones clnicas y patogenia. Poco se sabe acerca de los factores que contnbuyen a la virulencia del microorganismo, que tiene un bajo nivel de patogenicidad en los animales. E. corrodens se encuentra principalmente en la cavidad oral y se aisla con frecuencia de las vas respiratorias superiores. Tambin se ha recuperado a partir de abscesos y otros tipos de infecciones en casi cualquier localizacin del cuerpo, puede invadir el torrente circulatorio y causar endocarditis. Los procesos infecciosos en los que est involucrado e s t e microorganismo son generalmente mixtos (en combinacin con otras bacterias). Diagnstico de laboratorio. E. corrodens crece en agar sangre o chocolate, pero no en MacConkey. La caracterstica ms llamativa de los cultivos de esta bacteria son las excavaciones que aparecen en el agar c o m o consecuencia del crecimiento de la misma, aunque la capacidad de lormar agujeros no es expresada por todas las cepas. Las colonias tardan en aparecer (entre dos y cuatro das) y por lo general son de pequeo tamao (entre 0,5 m m y 1,0 m m de dimetro). Usualmente deben distinguirse de las que lorman otros bacilos g r a m n e gativos delicados y de crecimiento lento (vase Tabla 50-13). Sensibilidad a los antimicrobianos. E corrodens es sensible a las penicilinas, quinolonas y tetraciclinas. tiene una sensibilidad variable frente los aminoglucsidos y es resistente a la clindamicina y el metronidazol.

Actinobacillus
Caractersticas. Actinobacillus actinomycetemcomitans es una bacteria gramnegativa, no formadora de esporas y con morfologa cocobacilar (bacilos cortos). Crece tanto en condiciones aerobias como anaerobias. La presencia de C0 (entre un 5% y un 10%) en la atmsfera de incubacin favorece su crecimiento. Las colonias aparecen lentamente en agar sangre y son de pequeo tamao.
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Manifestaciones clnicas y patogenia. Estas bacterias se encuentran en la mucosa de las vas respiratorias y del tracto genitourinario de los animales y el hombre. Generalmente slo causan infecciones en individuos inmunodeprimidos o cuando penetran accidentalmente en un tejido sano a travs de una herida traumtica. A. actinomycetemcomitans tiene un bajo poder patgeno. Su nombre deriva del hecho de que se encuentra frecuente-

Legionella
Caractersticas. Las especies del gnero Legionella son bacterias gramnegahvas de morfologa bacilar, delgadas, no formadoras de esporas, que se

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA Sensibilidad a los antimicrobianos. Los resultados de las pruebas de sensibilidad no se correlacionan necesariamente con la respuesta clnica al tratamiento; por tanto, no es necesario llevar a cabo dichas pruebas. La terapia se realiza, generalmente, mediante la administracin de eritromicina y rifampicina. Otros agentes que tambin han sido utilizados son el trimetoprimsulfametoxazol, las quinolonas, la claritromicina y la azitromicna.

tien dbilmente. Estas bacterias fueron identificadas por primera vez como agentes causales de infecciones en el hombre durante una epidemia de neumona que afect a los miembros de la Legin Americana de Pennsylvania, reunidos en 1976 en Filadelfia para celebrar el bicentenario de la asociacin. En la actualidad, el gnero incluye ms de 20 especies y un cierto nmero de especies a las que todava no se ha asignado nombre. La mayora de casos clnicos se deben a la especie Legionella pneumophila, serogrupo 1. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies de Legionella se encuentran en los entornos en los que existen niveles altos de humedad. La capacidad de estos microorganismos para multiplicarse en el interior de protozoos es, m u y probablemente, un factor muy importante para garantizar la supervivencia de los mismas en el medio ambiente. La transmisin al ser humano tiene lugar a travs de la exposicin a aguas contaminadas de orgenes diferentes (p. ej.. las que fluyen de grifos, duchas y fuentes pblicas). No se cree que exista transmisin de persona a persona o que la infeccin se pueda adquirir durante las manipulaciones de laboratorio. Las infecciones pueden ser subclnicas, no neumnicas, neumnicas o extrapulmonares. Usualmente, la infeccin se manifiesta en forma de una neumona aguda fibrinopurulenta, con distribucin lobular. Histolgicamente, se aprecia un infiltrado alveolar de neutrfilos y macrfagos acompaado por fibrina y extravasacin de hemates. Las legionelas pueden encontrarse en el interior de los macrfagos alveolares. L. pneumophila ha sido aislada tambin mediante hemocultivo. Diagnstico de laboratorio. Las legionelas pueden aislarse en agar BCYE enriquecido con factores de crecimiento, entre los que se encuentran la L-cistena, una sal frrica y el <y.-cetoglutarato. Este medio puede hacerse selectivo para el aislamiento de los microorganismos a partir de muestras procedentes de localizaciones no estriles del cuerpo, aadiendo una mezcla de cefamandol, polimixina B y anisomicina, o de polimixina B, anisomicina y vancomicina (Edelstein, 1987). El agar chocolate tambin permite el crecimiento de las legionelas. El tratamiento del esputo con una solucin dbilmente acida (0.2 M HCI/KCI; pH 2,2) durante 4 minutos, o mediante calentamiento a 60'C durante 2 minutos, contribuye a reducir el nmero de otras bacterias presentes en la muestra, aunque tambin puede provocar un descenso en el nmero de legionelas. Los medios inoculados deben incubarse durante cinco das en una atmsfera hmeda que contenga entre un 2% y un 5% de CCy Las colonias son habilualmente iridiscentes y tienen una consistencia pegajosa. Aquellos aislamientos que tengan la morfologa tpica al ser observados bajo tincin de Gram deben ser subcultivados en agar sangre, donde no debe observarse crecimiento alguno. Estas bacterias dan positivas las pruebas de la catalasa y de la oxidasa, aunque en este ltimo caso la reaccin es dbil, son gelatinasa positivas y, a menudo, mviles. La identificacin de estos microorganismos puede llevarse a cabo con gran precisin mediante pruebas serolgicas. utilizando anticuerpos especficos de tipo. Las legionelas pueden detectarse o identificarse mediante inmunofluorescencia directa (DFA) en las muestras o a parlir de las colonias aparecidas en los medios de cultivo. La sensibilidad del examen mediante D F A oscila entre el 25% y el 75%, pero es considerablemente superior cuando se lleva a cabo sobre muestras de tejido pulmonar obtenidas mediante biopsia. Se ha detectado reactividad cruzada entre L. pneumophila y otras especies de Legionella, as como con algunas cepas de Bordetella pertussis. Pseudomonas lluorescens y Bacteroides tragilis. No se conocen los valores de sensibilidad de la tcnica DFA para la deteccin de otras especies del gnero en muestras de esputo (Edelstein, 1987). Tambin existe una prueba para la deteccin de antgenos de L pneumophila del serogrupo 1 en orina que tiene una sensibilidad del 80% al 90%, aunque hay que indicar que la antigenuria puede persistir durante muchos meses tras la infeccin (Edelstein, 1987). Tambin puede llevarse a cabo el diagnstico de la legionelosis serolgicamente, detectando un incremento de cuatro veces o superior en el ttulo de anticuerpos al menos hasta un valor de 1:128. Un nico ttulo de anticuerpos de 1:256 es una prueba presuntiva de una infeccin antigua. No se conoce la sensibilidad del diagnstico serolgico de la enfermedad causada por especies diferentes a L. pneumophila del serogrupo 1; en cualquier caso, la especificidad de las pruebas en estos supuestos es menor que la detectada en el caso de la infeccin causada por L. pneumophila del serogrupo 1 (Edelstein, 1987).

Neisseria y Moraxella
Caractersticas. Estos gneros incluyen bacterias gramnegativas, aerobias, catalasa y oxidasa positivas e inmviles, que presentan lorma coccea, apareciendo a menudo los cocos asociados en parejas con los lados adyacentes aplanados, lo que da una apariencia de un rion o de granos de cal (Lmina 50-5). Estos microorganismos son algo delicados, y en algunos casos necesitan que los medios de cultivo sean enriquecidos con sangre, suero, colesterol o cido oleico para contrarrestar el efecto de algunas sustancias inhibidoras del crecimiento bacteriano que pueden estar presentes en los medios, c o m o son los cidos grasos. Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis deben incubarse rpidamente en una atmsfera que contenga CO, para que puedan ser aisladas: sin embargo, este requerimiento depende de la cepa de que se trate, vara con la fase de la curva de crecimiento en la que se encuentre el microorganismo y desaparece a menudo con el posterior subcultivo. N. meningitidis y la mayora d e cepas de N. gonorrhoeae no son inhibidas por diferentes agentes antimicrobianos, tales como vancomicina o lincomicina, colistina y nistatina, caracterstica particularmente til para el aislamiento selectivo de estas especies a partir d e muestras donde existan otras bacterias. Algunos aislamientos de N. gonorrhoeae (en especial las cepas AUH, que necesitan arginina, uracilo e hipoxantina) son sensibles a la vancomicina. La posicin taxonmica de Moraxella catarrhalis es objeto de estudio en la actualidad, habindose formulado la propuesta de que sea trasladada a su propio gnero. Branhamella. En la actualidad ambos nombres estn en uso. Manifestaciones clnicas y patogenia. Aunque se ha descrito que otras especies del gnero Neisseria, distintas de N. meningitidis y N. gonorrhoeae, pueden causar infecciones oportunistas en huspedes inmunocomprometidos, por lo general estas especies no son patgenas. N. meningitidis puede colonizar las mucosas de las vas respiratorias superiores, un hecho que es seguido al cabo de unos 7 a 10 das por la formacin de anticuerpos bactericidas y hemaglutinantes. que no eliminan el estado de portador pero confieren inmunidad especfica de grupo. En unos p o c o s casos, la enfermedad aparece rpidamente tras la colonizacin en lorma de meningococemia y meningitis. El microorganismo tambin tiene tendencia a invadir las membranas serosas y los tejidos de las articulaciones, lo que conduce al desarrollo de pleuritis, pericarditis y artritis. Entre un 5% y un 1 5 % de individuos sanos son portadores de Ai. meningitidis en su nasofaringe, porcentaje que puede ser ms alto en grupos cerrados, c o m o los soldados en los cuarteles. No ha podido establecerse una correlacin directa entre porcentaje de portadores e incidencia de la enfermedad, con la nica posible excepcin de grupos familiares grandes o de hogares en los que ha habido un caso infantil durante epidemias de la enfermedad. Tambin se han aislado meningococos a partir de muestras genitales, y aunque su significado clnico es desconocido en estos casos, pueden ser fcilmente identificados de forma incorrecta c o m o gonococos salvo que se hagan las pruebas adecuadas para poder diferenciar las dos especies. El factor de virulencia ms importante de N. meningitidis es un complejo endotoxina-polisacrido que en animales de experimentacin activa la cascada de la coagulacin, provocando el depsito de fibrina en los capilares (coagulacin intravascular diseminada), hemorragias en las glndulas suprarrenales y en otros rganos y alterando la resistencia vascular perifrica, lo que conduce al shock y a la muerte. Las manifestaciones clnicas y la patogenia de las infecciones gonoccicas difieren un poco de las observadas en el caso de la infeccin por N. meningitidis. Los tipos patognicos (1 y 2) de N. gonorrhoeae se adhieren a distintos tipos de clulas humanas por medio de "pili", apndices muy delgados distintos de los flagelos que no son producidos por las clulas de los tipos no patgenos (3 y 4). Estos "pili" que son antignicamente heterogneos, uno de los principales factores de virulencia en N. gonorrhoeae, pueden inhibir la fagocitosis e inducir la formacin de anticuerpos especficos de cepa. Otros posibles factores de virulencia en N. gonorrhoeae estn menos claramente definidos. T a n t o N. gonorrhoeae c o m o N. meningitidis producen una proteasa para IgA que puede jugar un papel

' La mayor parte de cepas sensibles a la vancomicina no crecen en agar Thayer-Martin Puede aparecer una reaccin dbilmente positiva en las pruebas rpidas para determinar la utilizacin de carbohidratos Biovar perllava. -. biovar flava. -. ' Algunas cepas son positivas y otras negativas = >90% de cepas positivas: - = >90% de cepas negativas: D = variable
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1112

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

importante en la patogenia, ya que las IgA son la clase de anticuerpo que predomina en las secreciones de las membranas mucosas. Moraxella catarrhalis puede encontrarse en la orofaringe de nios y adultos sanos. Es una bacteria encapsulada que tambin posee ''pili" que se prolongan ms all de la membrana externa de la pared celular y que desempean el papel de adhesinas. Las infecciones que causa con mayor frecuencia son bronquitis, otitis, sinusitis y neumona (especialmente en el caso de personas con una enfermedad pulmonar crnica subyacente) (Catlin, 1990). M. catarrhalis tambin causa, aunque con mucha menor frecuencia, bacteriemia, endocarditis, meningitis, infecciones urogenitales y oflalmia neonatorum. Diagnstico de laboratorio. Los aspectos ms importantes en el diagnstico de laboratorio de las infecciones causadas por N. meningitidis y N. gonorrhoeae son la eleccin del espcimen clnico adecuado y su recogida y transporte hasta el laboratorio en condiciones apropiadas (vase Cap. 57). Las cepas patgenas del gnero Neisseria son sensibles a la desecacin y las temperaturas extremas, por lo que las muestras deben cultivarse rpidamente para incrementar las posibilidades de recuperacin. Son bacterias mesfilas y crecen mal. si es que lo hacen, a temperatura ambiente. Muchas de ellas necesitan ser incubadas con prontitud en una atmsfera con C0 (2%-8%) para su aislamiento inicial. Los medios basados en el agar chocolate son adecuados para su cultivo y deben contener una mezcla de diferentes antibiticos (p. ej., vancomicina o lincomicina. y colistina. nistatina o anisomicina y trimetoprim) si el aislamiento ha de llevarse a cabo a partir de muestras contaminadas con microbiota autctona. Los gonococos sensibles a vancomicina deben ser cultivados en un medio que contenga lincomicma; sin embargo, teniendo en cuenta el efecto sinrgico entre la lincomicina y el trimetoprim, este ltimo debe suprimirse en los medios que contengan la primera. Lo ideal es llevar a cabo la inoculacin directa en la misma cabecera de la cama del enfermo e incubar las placas inmediatamente a 35C en una atmsfera con CO,. Si alguno de estos cultivos tiene que ser enviado a un laboratorio de referencia para su anlisis, ha de incubarse primero durante la noche para asegurar el crecimiento de los microorganismos.
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tarse de N. meningitidis, debe confirmarse la identificacin mediante un ensayo de aglutinacin en portaobjetos, utilizando una mezcla de anticuerpos polivalentes frente a los diferentes serogrupos o anticuerpos individuales para cada uno de ellos. Adems de las pruebas convencionales de degradacin de carbohidratos, debe determinarse tambin la reduccin de los nitratos a nitritos y la produccin de ADNsa. Esta ltima es particularmente til para la identificacin de M. catarrhalis. que es ADNsa positivo, mientras que las especies de Neisseria dan negativa esta prueba. Los inconvenientes de los mtodos convencionales son la necesidad de tener que emplear inculos densos de cullivos puros, los largos tiempos de espera y la incapacidad de algunas especies delicadas de N. gonorrhoeae para crecer en el medio base utilizado. Algunos sistemas comerciales pueden detectar la formacin de cido a partir de los carbohidratos en un tiempo m u y corto (entre una y cuatro horas) (Knapp, 1988). El inoculo debe prepararse a partir de un cultivo puro del aislamiento, por lo que la identificacin puede realizarse generalmente a las 24 horas de haber llevado a cabo el aislamiento. Las reacciones acidas en el caso de algunas cepas de N. gonorrhoeae y, en menor proporcin, de N. meningitidis pueden ser difciles de interpretar o aberrantes en el caso d e algunos de los sistemas existentes, por lo que las cepas de N. gonorrhoeae que son dbilmente productoras de cidos a partir de la glucosa pueden aparecer como glucosa negativas. Algunas cepas de N. cinrea, especie que no produce cido a partir de la glucosa, pueden aparecer como glucosa positivas en algunos de mtodos comerciales. Las pruebas sobre sustratos para enzimas permiten una identificacin rpida (entre una y cuatro horas) solamente para aquellos aislamientos de diplococos gramnegativos, oxidasa positivos, obtenidos en un medio de cultivo selectivo (Kellogg, 1995; Knapp. 1988). Estas pruebas son de utilidad para distinguir las cepas maltosa negativas de N. meningitidis de N. gonorrhoeae, aunque los cambios de color pueden ser sutiles y si, en consecuencia, son interpretados de forma errnea pueden provocar que los aislamientos de N. meningitidis y otras especies de Neisseria sean clasificados incorrectamente como N. gonorrhoeae. Adems, las cepas de Neisseria cinrea y de Kingella denitrificans que crecen en los medios selectivos para el gonococo pueden ser identificadas equivocadamente como N. gonorrhoeae si no se realizan pruebas adicionales de confirmacin de identidad. Los sistemas comerciales que combinan las pruebas con sustratos enzimticos con los mtodos convencionales modificados proporcionan una alternativa rpida y precisa para la identilicacin de las especies de los gneros Neisseria y Haemophilus (Janda, 1987). Los mtodos inmunolgicos para N. gonorrhoeae (coaglutinacin y tincin con anticuerpos fluorescentes) se ulilizan para la identificacin de las colonias aparecidas en los medios de aislamiento primarios. La inmunofluorescencia c o n anticuerpos monoclonales tiene una gran sensibilidad y especificidad en el caso de N. gonorrhoeae, pero puede dar lugar a falsos positivos con otras especies de Neisseria y con Kingella denitrificans. habindose detectado tambin unin inespecfica a travs del fragmento Fe de la molcula de las IgG con otras bacterias (Beebe, 1993; Dillon, 1988; Kellogg, 1995). Por tanto, se sugiere que estos reactivos sean utilizados solamente para identificar microorganismos gramnegativos, oxidasa positivos, aislados en medios selectivos para gonococos. Puede emplearse tambin una sonda quimioluminiscente de cidos nucleicos especfica para N. gonorrhoeae, para la confirmacin de un aislamiento obtenido por cultivo o para la deteccin directa de la bacteria en las muestras de exudados de la uretra o de la endocrvix, recogidos con un hisopo (Hale, 1993; Limberger. 1992). Asimismo, hay disponibles ensayos, basados en la amplificacin de cidos nucleicos para ser utilizados con las muestras de exudados uretrales y endocervicales, que parecen tener una sensibilidad mayor que las tcnicas de hibridacin con sondas de cidos nucleicos o de cultivo microbiolgico (Carrol, 1998; Kehl, 1998). Los ensayos de aglutinacin en ltex estn disponibles para la deteccin directa de antgenos de N. meningitidis en LCR, suero y orina. Como ya s e coment previamente (vase el apartado de Streptococcus dentro de este captulo), la sensibilidad de estas tcnicas parece ser menor o c o m o mucho igual que la de la tincin de Gram; adems, los resultados de estas pruebas parecen tener un efecto mnimo en lo que respecta a la atencin que recibe el paciente (Bhisitkul. 1997: Granoff, 1986: Maxson, 1994; Perkins. 1995). Por tanto, muchos laboratorios han dejado de ofertar estas tcnicas. Sensibilidad a los antimcrobianos. Algunos aislamientos raros de N. meningitidis son resistentes a la penicilina; por tanto, deben realizarse

Un aislamiento obtenido a partir de un espcimen urogenital, que forme colonias con aspecto tpico en un medio selectivo, puede ser identificado presuntivamente como N. gonorrhoeae en base a los resultados de la observacin microscpica bajo tincin de Gram y de las pruebas de la oxidasa y la catalasa. La observacin al microscopio de los frotis preparados a partir de las colonias sospechosas, teidos por el mtodo de Gram, debe revelar la presencia de diplococos gramnegativos con la morfologa caracterstica, aunque los microorganismos tambin pueden aparecer formando tetradas, especialmente en los cultivos jvenes. Todas las especies del gnero Neisseria son oxidasa positivas y todas, con la excepcin de f V . elongata. son catalasa positivas. Debido a que es posible recuperar otras especies del gnero, al margen de N. gonorrhoeae, a partir de tracto genitourinario, es de la mayor importancia realizar pruebas confirmatorias de la identificacin, preferiblemente mediante ms de un procedimiento, en especial en el caso de muestras extragenitales o cuando exista la sospecha de un caso de abuso sexual. La confirmacin de N. gonorrhoeae y la identificacin de otras especies del gnero Neisseria y de M. catarrhalis se basa en sus caractersticas bioqumicas y de crecimiento (Tabla 50-14) (Knapp, 1988). El mtodo de identificacin estndar es la deteccin de la formacin de cidos a partir de azcares en un medio base (agar cistena-tripticasa de soja; medio CTA) y otras pruebas bioqumicas convencionales. Sin embargo, dados los inconvenientes de los mtodos tradicionales, hoy en da se utilizan en muchos laboratorios sistemas de identilicacin ms rpidos. Tambin hay disponibles procedimientos para la deteccin directa de N. gonorrhoeae y N. meningitidis en las muestras clnicas. En principio, el tipado de los aislamientos de ambas especies se lleva a cabo en estudios con un propsito epidemiolgico. En el mtodo estndar de identificacin, se analiza la produccin de cido a partir de glucosa, maltosa, lactosa y sacarosa en medio CTA, comparando los resultados frente a los de un tubo control con medio de cultivo sin carbohidrato. Una vez inoculados, los tubos se incuban a 35C-37"C en ambiente aerbico y se examinan a intervalos de 24 horas hasta que los resultados sean interpretables, o al cabo de 72 horas. Los resultados esperables para las especies de Neisseria y para M. catarrhalis se muestran en la Tabla 50-14. Sin embargo, de manera ocasional, un aislamiento de N. meningitidis puede producir reacciones anmalas; glucosa y maltosa negativas y ausencia de actividad sacaroltica. Si de todos modos en estos casos existe la fuerte sospecha de que pueda tra-

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA

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Tabla 50-15 Especies H. H H H H. H.

Caractersticas diferenciales de las especies del g n e r o Haemophilus de importancia clnica Requiere factor X
+ i +

Requiere factor V
+ + + +

Hemolisis

Catalasa
i + D

Crecimiento favorecido por el CO,

influenzae haemolylicus ducreyi parainfluenzae par aphrophilus aphrophilus

D + +

Para ver el significado de los smbolos utilizados, consltese la Tabla 50-10 Adaptada de Campos J Haemophilus En Murray PR. Baron E Pfaller M. y col (eds 1 Manual of Clinical Microbiology. 7' ed Washington, DC. American Society for Microbiology. 1999. p 608. reproducida con permiso del editor.

n e c e s a r i a la p r e s e n c i a de l o sf a c t o r e s X y/o V en el m e d i o de cultivo. El p r i m e r o de ellos es a p o r t a d o al m e d i o por los hemates u s a d o s por e f e c t o del c a l e n t a m i e n t o (p. ej., en el a g a r chocolate), a u n q u e tambin p u e d e ser p r o p o r c i o n a d o por glbulos r o j o si n t a c t o sh u m a n o s , de c a b a lo o de conejo. El f a c t o r V es a p o r t a d og e n e r a l m e n t e por el e x t r a c t o de l e v a d u r a que se aade al m e d i oop o ru n a suspensin de estafilococos, que se s i e m b r a en u n a nica estria s o b r e la s u p e r ficie del m e d i oya l r e d e d o rd el ac u a lc r e c e nl a sc o l o n i a sd el a sc e p a sd e p e n d i e n t e s de f a c t o r V (fenmeno d e n o m i n a d o satelitismo). L a s caraderisticas difer e n c i a l e sd e las e s p e c i e sd ee s t eg r u p os em u e s t r a ne nl aT a b l a 50-15. L o s requerimientos de factor X y V se e s t a b l e c e nd e t e r m i n a n d o la c a p a c i dad de la c e p a en cuestin p a r ac r e c e r o no en m e d i o s de c u l t i v o s que c o n t e n g a nd i c h o s (adores. U n a alternativa p a r ae s t a b l e c e rl ad e p e n d e n c i a del factor X es la p r u e b a de la porfirina p r o p u e s t ap o r Kilian (1974) y q u ed e t e r m i n a la capacidad de las e s p e c i e sd e p e n d i e n t e sp a r a utilizar el cido >-aminolevulnico en la sntesis de p o r f o b i l m o g e n o y porfirinas. La formacin d e portobilmgeno se p u e d ed e t e c t a r aadiendo r e a c t i v o de K o v a c al m e d i oy Haemophilus observando el desarrollo de una coloracin r o j a en la fase a c u o s a Alternativamente, se p u e d ed e m o s t r a r la formacin de porfirinas en la m e z c l a en r e a c Caractersticas. Las e s p e c i e s de e s t e gnero son b a c i l o syc o c o b a c i l o s cin por la fluorescencia rojiza que a p a r e c ec u a n d o se i l u m i n a con u n a lmg r a m n e g a t i v o s de pequeo tamao, pleomrticos, anaerobios facultativos, s p e c i e s de Haemophilus o x i d a s a positivos y c o nr e q u e r i m i e n t o s de h e m i n a u otras porfirinas (factor X) para de Wood. Las propiedades hemoliticas de las e p u e d e nd e t e r m i n a r s e en a g a rs a n g r e de c o n e j o o de caballo. y/o nicotinamina-adenina-dinucletidos o trinucletidos (factor V). Am e n u d od e b e diferenciarse a H. aphrophilus de otras e s p e c i e sc o m o Manifestaciones clnicas y patogenia. L am a y o rp a r t e de e s p e c i e s de Actinobacillus actinomycetemcomitans. Cardiobacterium hominis y Eikenella Haemophilus son h a b i t a n t e sh a b i t u a l e s de l a s vas r e s p i r a t o r i a s superiores. corrodens ( T a b l a 50-15), t o d a s las cuales se han a s o c i a d o con endocarditis A l g u n a s de ellas p u e d e ne n c o n t r a r s e tambin e n los t r a c t o s gastrointestinal y genitourinano. La diseminacin de persona a persona se p r o d u c e por inhalacin bacteriana subaguda. de gotcuias de h u m e d a d liberadas con la respiracin. Las i n f e c c i o n e sc a u s a d a s El cultivo de H. ducreyi a partir de lesiones chancroides ha sido problemtico. por Haemophilus spp. van d e s d e conjuntivitis y otitis m e d i ah a s t am e n i n g i t i sy Un Irotis del m a t e r i a lo b t e n i d o de la lesin teido por el mtodo d eG r a mp u e d e endocarditis. Las e s p e c i e sc o n s i d e r a d a sc o m o patgenos h u m a n o s habituales ser de a y u d a si la observacin r e v e l a la p r e s e n c i a de b a c i l o sg r a m n e g a t i v o s por son H. influenzae, H. parainfluenzae, H. ducreyi y H. aphrophilus. p a r e j a soe n filas ( " b a n d a d a sd e peces"). L am u e s t r ap u e d ei n o c u l a r s ee nm e d i o basal G Ce n r i q u e c i d oc o nh e m o g l o b i n a (1%), s u e r ob o v i n o fetal ( 5 % 1 0 % ) , IsoEl principal factor de virulencia de H. influenzae es el polisacrido capsular, del V i t a l e X (1%; B B LM i c r o b i o l o g yS y s t e m s )yv a n c o m i c i n a (3 tig/ml) o en a g a rM u e cual exislen seis tipos antignicamente distintos (serotipos del a al f). Las c e p a s ller-Hnton con s a n g r e de caballo (5%), solucin de e n r i q u e c i m i e n t o con c o f a c que c a r e c e n de cpsula se d e n o m i n a nc o m o no tipables. H. influenzae no prolores, v i t a m i n a s y aminocidos (1%) y v a n c o m i c i n a (3 L i g V m l ) . d u c e endotoxna. y e s t ae s p e c i e es rpidamente f a g o c i t a d ayd e s t r u i d a por los macrfagos. a m e n o s que e x i s t a n deficiencias en el f u n c i o n a m i e n t o de los antiSensibilidad a los antimicrobianos. E n l a a c t u a l i d a d , el NCCLS c u e r p o sd el o sf a g o c i t o s o del s i s t e m ac o m p l e m e n t o .T a m p o c os es a b em u c h o (NCCLS. 2000a) r e c o m i e n d a levar a c a b op r u e b a s de susceptibilidad frente s o b r e el p a p e l de l o sa n t i c u e r p o s en la i n m u n i d a d frente a l a si n f e c c i o n e s cau- a ampicilina, cloranfenicol. cefalosporinas de t e r c e r a generacin y m e r o p e -

p r u e b a sp a r ad e t e c t a r actividad |i-lactamsica en estos casos (Saez-Nieto, 1 9 9 2 ; Woods, 1994). Otros a g e n t e s antimicrobianos eficaces s o n las cefalosporinas de a m p l i oe s p e c t r o y el cloranfenicol. Para el t r a t a m i e n t o profilctico del posible c o n t a g i od e n t r o de los g r u p o s familiares, p u e d e n utilizarse la nfampicina, la m i n o c i c l i n a y las fluoroquinolonas. Debido a que la resistencia de N. gonorrhoeae a la penicilina y la tetraciclna est m u ye x t e n d i d a (Fox. 1997). las r e c o m e n d a c i o n e s actuales para el trat a m i e n t oc o n t e m p l a n la administracin de cefalosporinas de a m p l i oe s p e c t r o o de l a sn u e v a s fluoroquinolonas. A u n q u e no p a r e c e existir resistencia frente a las cefalosporinas, si se h a n descrito c a s o s de resistencia a l a s fluoroquinolonas. En consecuencia, d e b e n realizarse pruebas de sensibilidad si los sntomas persisten tras el tratamiento. L a produccin de | M a c t a m a s ap u e d e d e t e c t a r s e con nitrocefina. una cefalosporina cromognica. P a r ad e t e r m i n a r la susceptibilidad de N. gonorrhoeae a las cefalosporinas, las quinolonas y otros a g e n t e s antimicrobianos, p u e d ee m p l e a r s e el mtodo de difusin en disco, c o na g a r GC enriquecido con un 1o de suplemento de crecimiento Casi todas las c e p a s de M catarrhalis p r o d u c e n |5-lactamasa, c u y a presencia p u e d ep o n e r s ed e manifiesto c o n nitrocefina. L o s aislamientos son, p o rl o general, sensibles a cefalosporinas, trimetoprim-sulfametoxazol y a c o m b i n a c i o n e s que incluyan un antibitico |J-lactmco y un inhibidor de |i-lactamasas. Prevencin. Las v a c u n a s de polisacridos c o n t r a los serogrupos A, C. Y y W135 de N. meningitidis han sido autorizadas en los EE.UU.. y su administracin est r e c o m e n d a d a en c a s o de militares, de p e r s o n a s que viven en reas epidmicas de los pases en vas de desarrollo y de individuos c u y o bazo no es luncional o que c a r e c e n de dicho rgano. La profilaxis con antibiticos d e b e limitarse a los c a s o s de contados familiares y a aquellos q u eh a y a n p o d i d oe s t a re nc o n t a c t oc o n las s e c r e c i o n e s orales d e los enfermos. L a n f a m p i c i n a es el antibitico de eleccin habitual en estos casos. L a utilizacin de antibiticos a n t e s de e s t a re x p u e s t o al contado con el m i c r o o r g a n i s m o no est r e c o m e n d a d a por los riesgos potenciales de sensibilizacin y aparicin de c e p a s resistentes. La nica excepcin a esta regla es la aplicacin de solucin de n i t r a t o de p l a t a o de p o m a d a de e n t r o m i c i n a en los ojos de los recin n a c i d o sp a r a prevenir la oftalma g o n o c o c i c a o por clamidias.

s a d a sp o re s t a bacteria. L o sa n t i c u e r p o sv a na p a r e c i e n d oc o nl a edad, p r e s u m i b l e m e n t ec o m oc o n s e c u e n c i a de una infeccin natural con H. inluenzae o c o n o t r a sb a c t e r i a s que c o m p a r t a n homologa antignica con aqulla, por lo que la m a y o r parte de individuos m a y o r e s de 1 5 aos p o s e e n anticuerpos. S ed e s c o n o c e cules de e s t o sa n t i c u e r p o s son p r o t e c t o r e s y a qu nivel actan. D e s d e la introduccin de la v a c u n af r e n t e a H. intluenzae serotipo b a m e d i a d o s de la dcada de los 80, ha habido un b r u s c od e s c e n s o en la incid e n c i ad el a s infecciones invasivas c a u s a d a sp o r este m i c r o o r g a n i s m o , tales c o m o la m e n i n g i t i s y la epglotitis (CDC, 1994). Las cepas no tipables de H. influenzae estn ms frecuentemente asociadas c o n la otitis a g u d am e d i aoc o n las e x a c e r b a c i o n e sa g u d a s de la bronquitis crnica. H. parainfluenzae es u s u a l m e n t e una especie c o m e n s a l de las vas respiratorias superiores, aunque p u e d ep r o v o c a re n f e r m e d a d e sg r a v e s c o m o endocarditis. H. aphrophilus. otra e s p e c i ec o m e n s a l del tracto respiratorio superior, tambin p u e d ep r o d u c i r endocarditis, asi c o m oa b s c e s o sc e r e brales, neumona, meningitis y bacteriuria. H. ducreyi es el a g e n t er e s p o n s a b l e de la e n f e r m e d a d la m a d ac h a n c r o i d e (o c h a n c r ob l a n d o )
Diagnstico de laboratorio. P a r a el a i s l a m i e n t od e Haemophilus s p p .e s

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

nem en el caso de H. influenzae aislado a parlir de muestras de sangre o de LCR. Se ha observado resistencia a ampicilina y cloranfenicol, as como frente a trimetoprim-sulfametoxazol. tetraciclina y rifampicina, aunque con una menor frecuencia en estos casos. La resistencia a las penicilinas est generalmente determinada por la capacidad para producir |5-lactamasas: sin embargo, algunos aislamientos raros son resistentes debido a alteraciones en la permeabilidad de la membrana extema o en la afinidad de las protenas que ligan penicilina (PBP). Las pruebas de sensibilidad para H. influenzae han de realizarse con un medio de cultivo especial (Haemophilus Test Medium).

Bordetella
Caractersticas. Las especies del gnero Bordetella son bacterias muy pequeas de morfologa cocobacilar, aerobias estrictas, no fermentadoras, que necesitan cido nicotinico, cisteina y generalmente metionina, pero no hemina (factor X) o coenzima I (factor V), para su crecimiento. Durante el mism o se produce un exceso de cidos grasos que resultan inhibidores para un mayor crecimiento microbiano, razn por la que es preciso aadir sangre, carbn vegetal, almidn o resinas de intercambio inico al medio para que adsorban selectivamente y eliminen dichos cidos grasos. Tras subcultivos repetidos en medios artificiales tiene lugar un fenmeno de variacin de fase de cepas lisas virulentas a rugosas avirulentas. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies de Bordetella se encuentran en las vas respiratorias de los animales de sangre caliente. S. bronchiseptica afecta primariamente a los perros (tos de la caseta del perro), y a algunos otros animales, y puede causar, aunque raramente, una enfermedad parecida a la tos ferina en huspedes humanos inmunocomprometidos. 8. parapertussis, especie que infecta tanto al hombre como a los corderos, es un patgeno humano poco comn. La infeccin por este microorganismo puede ser asintomtica o provocar una enfermedad semejante a la tos ferina o. con mayor frecuencia, bronquitis. 8. pertussis, el agente causal de la tos ferina, slo provoca enfermedad en el hombre. 8. pertussis. B. parapertussis y 8. bronchiseptica producen varios factores de virulencia. Entre ellos se encuentran una adenilato cclasa que ejerce el papel de toxina (TAC), ya que inhibe diversas funciones celulares al provocar un aumento de los niveles intracelulares de adenosina 3', 5'-fosfato en las clulas afectadas. La citotoxina traqueal (CTT) causa la detencin del movimiento de los cilios y la m u e r t e celular. En la adhesin de las bacterias a los tejidos estn implicadas una hemaglulinina filamentosa (HAF). la pertactina y las fimbrias. 8. pertussis produce, con carcter exclusivo, toxina diftrica (TD). que acta inhibiendo los factores responsables de la transduccin de seal a nivel intracelular, catalizando la transferencia de ADP a las protenas G celulares. Se cree que durante la infeccin por 8. pertussis el microorganismo se fija inicialmente al epitelio ciliado de las vas respiratorias y a las clulas efectoras del sistema inmune, por medio de diferentes molculas y estructuras que actan como adhesinas (fimbrias, HAF, TD y pertactina). La TD y la TAC trabajan juntas para inhibir la respuesta del sistema inmune del hospedador, mientras que la CTT daa el epitelio respiratorio. Como resultado se produce una respuesta inflamatoria y necrosis celular, leucocitosis y linfocitosis, acumulacin de secreciones, tos y, finalmente, bronconeumonia, episodios de hipoxia y encefalopata. 8. pertussis posee un antgeno protector que al combinarse con el anticuerpo especfico frente al mismo anula el carcter infectivo de la bacteria. Parece, sin embargo, que para lograr la erradicacin del microorganismo son necesarias tanto la inmunidad humoral como la celular. Diagnstico de laboratorio. La tasa de aislamiento de B. pertussis a partir de los pacientes disminuye con la duracin de la enlermedad. El espcimen ms adecuado es el material recogido de la nasofannge con un hisopo: en cualquier caso, los aspirados nasofarngeos obtenidos mediante un catter blando de goma tambin han permitido lograr, en las manos de algunos analistas, buenos porcentajes de aislamiento. Tambin pueden utilizarse para el cultivo muestras obtenidas por mtodos ms agresivos, como es el caso del lquido de lavado broncoalveolar. En general, el material recogido con hisopo o los aspirados deben inocularse en un medio apropiado, como el agar Regan-Lowe, directam e n t e en la cabecera de la cama del enfermo. En el caso de que sea necesario su envo al laboratorio de referencia, los medios inoculados deben incubarse durante al m e n o s 24 horas antes de ser transportados, con objeto de permitir un cierto nivel de crecimiento inicial del microorganismo.

El examen directo de los frotis teidos con anticuerpos mono o policlonales frente a 8. pertussis. conjugados con fluoresceina. puede permitir un diagnstic o rpido. Debido a que la inmunofluorescencia (DFA) tiene un bajo grado de sensibilidad, debe realizarse en paralelo el aislamiento y la identificacin del microorganismo mediante cultivo. Tambin pueden aparecer resultados falsamente positivos con la tcnica DFA, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Los cultivos deben incubarse en una atmsfera con un nivel elevado de humedad, pero sin CO , a 35'C. 8. pertussis es una bacteria de crecimiento lento y las colonias que forma pueden tardar entre tres y cuatro das en ser apreciables a simple vista. La incubacin debe prolongarse hasta los 7-12 das antes de que los cultivos se descarten como negativos.
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Las colonias de 8. pertussis son pequeas, redondas y brillantes y pueden tener el aspecto de gotas de mercurio. Los microorganismos presentes en u n a colonia con la morfologa tpica y que tengan el aspecto caracterstico bajo tincin de Gram deben subcullivarse en agar sangre, para verificar su incapacidad de crecer en dicho medio. La identificacin presuntiva de 8. pertussis se lleva a cabo determinando el carcter catalasa y oxidasa positivo y ureasa negativo del aislamiento en cuestin. 8. parapertussis crece ms rpidamente que 8. pertussis. y adems es capaz de hacerlo en agar sangre e incluso en agar MacConkey. Esta especie da negativa la prueba de la oxidasa negativa y positivas la catalasa y ureasa. 8. bronchiseptica crece bien tanto en agar sangre c o m o en MacConkey, es bioqumicamente la ms activa de las tres especies, da positiva las tres pruebas (catalasa, ureasa y oxidasa) y es capaz de reducir los nitratos. Sensibilidad a los antimicrobianos. Los agentes antimicrobianos no desempean, probablemente, ningn papel en el tratamiento de la tos ferina, pero negativizan los cultivos nasofarngeos en uno o dos das, lo que ayuda a impedir la aparicin de complicaciones en los enfermos, as como la diseminacin de la infeccin a individuos no inmunizados. En cualquier caso, no est indicada la realizacin de las pruebas de sensibilidad en el caso de 8. pertussis. La eritromicina es el antibitico de eleccin tanto para el tratamiento como para la profilaxis; alternativamente, tambin se puede utilizar trimetoprim-sulfametoxazol.

Brucella
Caractersticas. Las brcelas son cocobacilos pequeos (0.5 um-0.7 pm de ancho por 0.6 pm-1,5 pm de largo), gramnegativos, que en las extensiones teidas aparecen individualmente, en parejas o formando cadenas cortas. Estas bacterias son inmviles, aerobias estrictas, catalasa positivas y, casi siempre oxidasa positivas. Su crecimiento se ve favorecido por la presencia de CO (5%-10%) en la atmsfera de incubacin, y necesitan medios de cultivo complejos que contengan sangre o suero. Entre las especies conocidas, son patgenas para el hombre 8. melitensis. B. abortus. B. suis y B. canis. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies de Brucella son parsitos intracelulares capaces de infectar a una gran variedad de especies animales (incluyendo al hombre); han sido encontradas tambin en algunos insectos y garrapatas. Son patgenos importantes para el hombre y los animales. Los huspedes preferidos son las cabras y las ovejas para 8. melitensis. el ganado ovino para 8. abortus los cerdos para 8. suis y los perros para 8. canis, aunque cada una de estas bacterias puede infectar ocasionalmente a otras especies animales. El hombre se infecta por inhalacin, al entrar en contacto directo con material infectado, incluyendo cadveres d e animales, membranas fetales, exudados vaginales, fetos, piel o membranas mucosas, o por ingestin de leche no pasteurizada procedente de animales infectados o de productos lcteos derivados de aqulla. En los EE.UU. se declaran unos 1 0 0 casos de brucelosis al ao. Un factor de riesgo muy comn es el consumo de queso importado hecho a base de leche de cabra sin pasteurizar. A menudo se produce una linfadenopatia local con diseminacin y localizacin secundaria del microorganismo en sistema reticuloendotelial, con formacin de granulomas en el higado, bazo, huesos, sistema genitourinario, pulmones y tejidos blandos. Es posible observar a las bacterias en el interior de las clulas fagociticas. Con frecuencia, los signos y sntomas son variables e inespeclicos, con escalofros, fiebre, sudoracin y anorexia. Una caracterstica de la fiebre es que aparece durante el da (fiebre ondulante). Diagnstico de laboratorio. Las brcelas se recuperan con m a y o r frecuencia a partir de sangre y mdula sea y con m e n o r de muestras procedentes del bazo y de abscesos hepticos. Estas bacterias crecen en medios estndar de laboratorio, incluyendo el agar Brucella, sangre, chocolate y tripticasa de soja. Algunas cepas pueden crecer en agar MacConkey. En general, estas bac-

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terias crecen en los medios utilizados para los hemocultivos. Muchos autores recomiendan incubar los hemocultivos durante 21 das, llevando a cabo subcultrvos a ciegas tanto al principio como al final del periodo de incubacin. Sin embargo, ya no es preciso seguir estas recomendaciones con los nuevos sistemas automatizados para hemocultivo. algunos de los cuales han permitido la recuperacin de Brucella spp. en cinco das o incluso menos, sin necesidad de realizar subcultivos a ciegas (Bannatyne, 1997: Yagupsky, 1997). Los medios slidos deben incubarse en una atmsfera que contenga entre un 5% y un 10% de CO . Las brcelas crecen lentamente, e incluso tras 48 horas de incubacin las colonias son difciles de ver. Los microorganismos pueden ser identificados presuntivamente como especies del gnero Brucella en base a su aspecto caracterstico bajo tincin de Gram y a unos resultados positivos para las pruebas de la catalasa. oxidasa y ureasa. La actividad uresica se manifiesta rpidamente (alrededor de 15 minutos) en el caso de B. suis y ms lentamente (entre 2 y 24 horas) en el de B melitens'is y B. abortus. Debido a que la brucelosis puede adquirirse en el laboratono. el personal del m i s m o debe ser advertido si se sospecha la presencia de Brucella spp. en el espcimen, debiendo realizarse todas las manipulaciones en una cabina de biosegundad.
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para bacterias gramnegativas. como son el agar EMB o MacConkey El hallazgo de un bacilo gramnegativo que slo crece en agar sangre, que es oxidasa e indol positivo, y que da negativa la prueba del ONPG. constituye una slida evidencia presuntiva del aislamiento de P. multocida. la especie que se aisla con mayor frecuencia. Sensibilidad a los antimicrobianos. Raramente se observa resistencia a los agentes antimicrobianos en los aislamientos de origen humano. Las pasteurelas son generalmente susceptibles a la penicilina y la tetraciclina. La penicilina es el antibitico de eleccin.

Francisella
Caractersticas. Francisella tularensis es una bacteria gramnegativa muy pequea, aerobia estricta, que exhibe diferentes morfologas (desde cocos hasta bacilos pleomrficos) y que necesita cstina o cisteina para poder crecer. Cuando se tie con colorantes derivados de la anilina muestra una tincin bipolar dbil. Manifestaciones clnicas y patogenia. F. tularensis se encuentra en animales tanto salvajes como domsticos, pjaros, artrpodos, agua, barro y heces. El reservono principal de esta bacteria es el conejo de cola de algodn. La transmisin al ser humano tiene lugar por la picadura de garrapatas, por inoculacin directa a travs de la piel o de la conjuntiva por contacto con un animal infectado, por inhalacin o por ingestin de carne contaminada poco cocida o de agua contaminada. La enfermedad se manifiesta de varas formas, como son la ulceroglandular, glandular, oculoglandular. orofarngea. intestinal, neumnica y tifoidea. Cada ao se detectan entre 100 y 200 casos aproximadamente de tularemia en los EE.UU. La tularemia se manifiesta de varias formas tras un perodo de incubacin que oscila entre 1 y 10 das. Algunos sntomas como cefalea, fiebre, escalofros, vmitos y mialgias se presentan caractersticamente al principio. En la forma ulceroglandular aparecen linfadenitis y linfadenopatias en la zona de drenaje de la lesin primaria. La lesin es papular inicialmente y ms tarde ulcerativa. La forma oculoglandular de la enfermedad se caracteriza por la inflamacin de la conjuntiva y, generalmente, por la aparicin de una ppula en el prpado inferior, con linfadenitis de los ganglios preauriculares, parotideos, submaxilares y cervicales anteriores. La forma intestinal de la tularemia se caracteriza por la presencia de lesiones ulcerosas en la boca, garganta y tracto gastrointestinal superior. La virulencia parece estar relacionada con la morfologa lisa de las colonias. El subcultivo repetido conlleva una transicin de la morfologa colonial lisa a otra rugosa, concomitantemente con una prdida de la virulencia. Las cepas fuertemente virulentas para el hombre presentan actividad citrulin-ureidasa y fermentan el glicerol, estando asociadas con la enfermedad en conejos transmitida por las garrapatas. No se ha detectado la produccin de toxinas en esta bacteria. Puede sospecharse la existencia de tularemia en cualquiera que haya estado en un rea donde la enfermedad tiene carcter endmico, haya entrado en contacto con animales silvestres o ganado, tenga un historial de picaduras por garrapatas, haya estado implicado en labores agrarias, haya bebido agua contaminada o haya estado expuesto a cultivos bacterianos o a animales de laboratorio infectados. Los tramperos, cazadores, trabajadores de la industria peletera y alimentaria, los agricultores y el personal de laboratorio estn en situacin de alto riesgo para contraer la enfermedad. Debido a sus manifestaciones tan diversas, la tularemia puede confundirse fcilmente con muchas otras enfermedades como la brucelosis, el ntrax, la esporotricosis. las fiebres tifoideas, la tuberculosis, la histoplasmosis y la sfilis. Diagnstico de laboratorio. El tipo de muestra adecuado para el e x a m e n incluye los lquidos o legrados recogidos a partir de la lesin primara, los aspirados de ganglios linfticos regionales aumentados de tamao, el esputo, los lavados farngeos y los aspirados gstricos. El aislamiento de la bacteria es difcil porque tiene requerimientos nutricionales especiales y crece lentamente, lo que permite que otros microorganismos de crecimiento ms rpido que puedan estar presentes en el espcimen enmascaren o dificulten su desarrollo. Los cultivos pueden realizarse en agar con glucosa y cisteina. enriquecido con un 5% de sangre de conejo desfibnnada, en agar chocolate con IsoVitaleX o en agar BCYE. Algunas cepas pueden crecer incluso en agar sangre estndar o en agar tripticasa de soja. Si la muestra clnica est contaminada por otros microorganismos (incluidos los hongos), debe aadirse al medio antibiticos, c o m o penicilina, polimixina B y cicloheximida, para inhibir el crecimiento de stos. Se debe

La identificacin a nivel de especie implica la realizacin de pruebas adicionales, como son los requerimientos adicionales de CO la produccin de H S, la hidrlisis de la urea, la sensibilidad a algunos colranles y la sensibilidad a determinados lagos. La mayor parte de laboratorios hospitalarios solicitan a los departamentos estatales de salud o a los laboratorios de referencia la realizacin de estas pruebas complementarias.
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Tambin es posible llevar a cabo el diagnstico de la brucelosis mediante tcnicas serolgicas. Un ttulo mnimo de 1:160 en la prueba estndar de aglutinacin en tubo hace sospechar un diagnstico positivo. Sin embargo, la evidencia de una brucelosis reciente slo puede ser aceptada cuando se detecta un incremento de cuatro veces o superior en el ttulo de anticuerpos especficos durante el primer o segundo mes de la enfermedad. En los pacientes con titulo elevados (1:640) de anticuerpos puede manifestarse un fenmeno de zona que inhiba la reaccin de aglutinacin, por lo que todas las muestras de suero de los pacientes en los que se sospeche la existencia de la enfermedad deben diluirse hasta un valor de 1:1.280 al menos. A veces se detecta una reactividad cruzada con Francisella lularensls y con Vibrio cholerae. incluyendo a las personas que han recibido la vacuna contra el clera. Sensibilidad a los anlimicrobianos. El tratamiento consiste en la administracin de combinaciones de antibiticos como tetraciclma. aminoglucsidos, nfampicina y trimetoprim-sulfametoxazol durante perodos prolongados. Aunque en ocasiones el tratamiento antimicrobiano falla, ello no es debido a fenmenos de resistencia, por lo que no es necesario llevar a cabo pruebas de sensibilidad para los aislamientos recuperados de los enfermos.

Pasteurella
Caractersticas. Las especies del gnero Pasteurella son bacterias gramnegativas con morfologas muy variadas que van desde cocobacilos pequeos hasta bacilos largos y filamentosos, anaerobias facultativas, catalasa y oxidasa positivas e inmviles. De las ocho especies conocidas con capacidad para infectar al hombre (P multocida. P. bettyae. P. cams. P. dagmatis. P. stomatis. P. pneumotropica. P. haemolytica y P. aerogenes). P. multocida es el patgeno humano ms importante. Las especies de Pasteurella son lenolpicamente muy semejantes a las del gnero Actinobacillus. habiendo demostrado los estudios de hibridacin ADN-ADN y la comparacin de los rARN de 16S que las especies P. pneumotropica. P. haemolytica y P. aerogenes estn ms relacionadas con el gnero Actinobacillus que con el genero Pasteurella. Manifestaciones clnicas y patogenia. Las especies de Pasteurella. especialmente P. multocida. se encuentran formando parte de la microbiota comensal de las vas respiratorias superiores de mamferos y aves de corral, aislndose frecuentemente de las heridas causadas por mordeduras o araazos de animales. L a s mordeduras de gatos resultan infectadas con mayor frecuencia que las de perros. Las infecciones localizadas pueden hacerse sistmicas. habindose registrado casos de septicemia, osteomielitis y meningitis. Estas bactenas se han asociado con infecciones de las vas respiratorias, incluyendo sinusitis, abscesos periamigdalares. neumona, empiema. bronquitis y bronquiectasias. generalmente en pacientes con afecciones pulmonares crnicas. Diagnstico de laboratorio. Las pasteurelas crecen bien en agar sangre y slo muy raramente son capaces de crecer en medios de cu.tivos selectivos

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MICROBIOLOGA MDICA

tener un cuidado especial con la manipulacin del material infectado para evitar la formacin de aerosoles o el contacto directo con la piel Los clnicos deben informar siempre al personal del laboratorio si sospechan de la existencia de F. tularensis en las muestras con objeto de que se adopten las medidas de seguridad apropiadas para evitar una exposicin accidental al microorganismo. Los cultivos se incuban a 35"C en una atmsfera que puede contener o no CO,. Las colonias aparecen generalmente entre 2 y 4 das, y tienen un color que va de azul-grisceo a blanco, son redondas, lisas y ligeramente mucosas. En un medio que contenga sangre, puede apreciarse una zona estrecha de (/-hemolisis alrededor de las colonias. Debido a que el trabajo con este microorganismo en el laboratorio es peligroso, cualquier aislamiento sospechoso debe enviarse a un laboratorio de referencia, como el CDC de Allanta, para su confirmacin mediante una prueba de aglutinacin en portaobjetos o de mmunofluorescencia directa. El diagnstico de la tularemia tambin puede establecerse por tcnicas serolgicas. Un ttulo de 1:40 en una reaccin de aglutinacin en ausencia de una infeccin previa tiene valor diagnstico, y puede aumentar durante las tres primeras semanas hasta alcanzar un valor de 1:640 o incluso superior. Las aglutininas frente a Brucella spp. tambin aumentan de forma inespecfica. pero su titulo nunca alcanza valores tan altos. Sensibilidad a los antimicrobianos. Para F. tularensis la estreptomicina es bactericida, mientras que las tetraciclinas y el cloranfenicol son bactenostticos. Puesto que no son infrecuentes las recidivas despus de un tratamiento con estos dos ltimos, el antibitico de eleccin es la estreptomicina.

endocarditis. El examen histopatolgico es mespecifico y revela la existencia de una reaccin inflamatoria crnica. Diagnstico de laboratorio. Esla bactena crece en agar con infusin de corazn enriquecido con suero de caballo inactivado por calor y extracto de levadura. Una vez inoculados, los medios deben incubarse a 35'C en u n a atmsfera hmeda que contenga un 10% de CCy Las colonias que aparecen en medio liquido tienen aspecto de bolas esponjosas, mientras que las que se forman en agar son pequeas y ligeramente translcidas u opacas. Los variantes en lase L pueden aparecer eventualmente en los medios solidos. Debido a que es una bactena relativamente con poca actividad fisiolgica, la identificacin de S. monilitormis es complea. Las pruebas bioqumicas deben realizarse utilizando como medio base caldo o agar con infusin de corazn enriquecido con suero de caballo y extracto de levadura. Sensibilidad a los antimicrobianos. S monililormis es sensible a la penicilina. Tambin pueden utilizarse los aminoglucsidos o la tetraciclina para tratar las lormas L. Prevencin y control. Puesto que entre un 10% y un 65% de las ratas estn infectadas por el microorganismo, el control de estos animales y las precauciones para evitar sus mordeduras representan las nicas estrategias eficaces para el control y prevencin de la enlermedad.

Bacterias anaerobias
Es importante recalcar que las bacterias anaerobias representan el componente principal de la microbiota autctona de la piel y de las membranas mucosas (vase Tabla 50-1). Por tanto, el aislamiento e identificacin de estos microorganismos dependen en gran medida de la correcta seleccin y recogida de las muestras, asi como del transporte de stas hasta el laboratorio en condiciones adecuadas. Las infecciones por anaerobios son con frecuencia polimicrobianas, ya que en las mismas pueden estar implicadas, simultneamente, vanas especies de bacterias anaerobias, o bien de anaerobias con anaerobias facultativas. En consecuencia, la primera tarea a la hora de examinar un cultivo incubado en condiciones de anaerobiosis es poder diferenciar los microorganismos anaerobios estrictos de los facultativos, ya que todos ellos habrn crecido en esas condiciones. El analista experto puede reconocer las especies anaerbicas que se aislan con mayor frecuencia, en base a las caractersticas morfolgicas de las colonias y de los microorganismos observados bajo tincin, y llevar a cabo una identificacin presuntiva mediante unas pocas pruebas adicionales. La identilicacin definitiva se basa en la realizacin de pruebas bioqumicas adicionales, en la determinacin de caractersticas genticas y fisiolgicas y en ensayos de patogenicidad y neutralizacin de toxinas. El grado de identificacin de los microorganismos anaerobios varia de acuerdo con el equipo disponible y la experiencia, el inters del personal de laboratorio y del equipo mdico y la utilidad clnica de la informacin disponible del laboratorio. Definiciones y caractersticas. Una bacteria anaerobia necesita u n a atmslera con una baja tensin de oxigeno para poder crecer, y es incapaz de desarrollarse en la superficie de un medio slido en una atmsfera ambiental normal enriquecida con un 10% de CO.. Un anaerobio facultativo es capaz de crecer en ambas situaciones. El trmino microaertilo. que no tiene una definicin estncta. se aplica a ciertas bactenas. normalmente las especies de los gneros Campylobactery Streptococcus, que slo se desarrollan en una atmsfera con un bajo contenido en oxgeno y una concentracin de dixido de carbono aumentada.

Calymmatobacterium
Caractersticas. C. granulomatis es un bacilo pleomrtico gramnegativo. inmvil y capsulado que puede cultivarse en el saco vitelino de los huevos o en medios de cultivo artificiales que contengan yema de huevo fresca. Esta bacteria posee determinantes de virulencia semejantes a los que exhiben las especies de Klebsiella, lo que ha inducido a algunos expertos a clasificarla dentro de la familia Enterobacteriaceae. Manifestaciones clnicas y patogenia. Esta bacteria no provoca enfermedades en los animales. En el hombre causa el granuloma inguinal, que se caracteriza por la aparicin de lesiones ulcerogranulomatosas en la piel y las mucosas del rea genital e inguinal. Diagnstico de laboratorio. Un fragmento de tejido extrado del borde de una lesin ulcerosa se apneta y restnega sobre un portaobjetos de vidrio para obtener un frotis que se tje por el mtodo de Giemsa o de Wnght. La deteccin de bacilos pequeos, pleomrficos, rectos o curvados, con los extremos redondeados, y granulos polares caractersticos en el interior de las clulas mononucleares es la manera ms efectiva para llevar a cabo el diagnstico. Sensibilidad a los antmcrobianos. Los antibiticos eficaces frente a C. granulomatis son las tetraciclinas. la eritromicina, la ampicilina y el cloranfenicol. La bacteria puede desarrollar resistencia a la estreptomicina.

Streptobacillus

Caractersticas. Streptobacillus moniliformis es una bactena gramnegativa de morfologa bacilar, anaerobia facultativa, inmvil y no capsulada, que aparece frecuentemente formando cadenas o largos filamentos, y que a menudo presenta una serie de engrasamientos ovales o alargados que confieren al conjunto un aspecto de rosario. La morfologa varia con el tiempo, ya que en los cultivos jvenes los microorganismos presentan un aspecto filamentoso bastante uniforme, mientras que a medida que el cultivo envejece aumenta la tendencia a la Patogenia y factores de virulencia. Excepto en el caso de los closlrifragmentacin para dar lugar a lormas cocobacilares irregulares. Esta bacteria dios, se sabe poco sobre los factores que determinan la virulencia y la patoforma colonias L en agar. que tienen un aspecto que recuerda a un "huevo frito" genicidad de la mayora de los microorganismos anaerobios En el caso de y pueden estabilizarse si se aade penicilina al medio de cultivo. los miembros de la familia Bacteroidaceae se han identificado diferentes actividades biolgicas (endotoxina, proteasas. hepannasa) que podrian jugar un Manifestaciones clnicas y patogenia. S monililormis forma parte de papel en este contexto. El polisacrido capsular de Bacteroides Iragilis favola microbiota autctona del tracto respiratorio superior de los roedores silvesrece la formacin de abscesos. Por otro lado, las especies del gnero Ctostres y de laboratorio. La enfermedad que produce en el hombre (fiebre de la tridium producen exotoxinas m u y potentes que incluyen factores letales y mordedura de la rala o enfermedad de Haverhill) es consecuencia de la mornecrotizantes. hemolisinas. lecitinasas, gelatinasas y hialuronidasas. dedura de roedores, de la ingestin de alimentos contaminados o de lesiones traumticas. En un perodo de tiempo de unas tres semanas pueden apareMientras que las infecciones e intoxicaciones por clostridios pueden lener un cer una serie de manifestaciones clnicas como linfoangitis local y linfadeniongen tanto exgeno como endgeno, las causadas por otros microorganismos tis, seguidas por fiebre, escalofros, malestar general y. ms tarde, por un anaerobios se originan endgenamente, a partir de la propia microbiota anaeexantema morbidforme generalizado, maculopapular o petequial Algunos robia normal presente en una membrana mucosa contigua, cuya integridad ha pacientes desarrollan poliartritis migratoria Tambin se han descrito casos de sido daada por una intervencin quirrgica, traumatismos, utilizacin de m s -

CAPTULO 50

BACTERIOLOGA MDICA

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Irumental medico o por un lumor. Para que se inicie el proceso infeccioso causado por anaerobios es esencial que el potencial de oxidorreduccin disminuya en el te|ido afectado, lo que puede ser consecuencia de la interrupcin del aporte sanguneo o de la multiplicacin de otras bactenas en la zona. Sin lugar a dudas, las infecciones e intoxicaciones por clostridios son de la mayor importancia, aunque recientemente se ha reconocido el papel que juegan otros microorganismos anaerobios como agentes causales de celulitis y mionecrosis. La mayora de aislamientos de Clostridium pertringens efectuados en el entorno hospitalario son consecuencia de simples contaminaciones de heridas. En estos casos, las bacterias se multiplican en los restos celulares, en un hematoma o en tejido necrtico sin que se observe sintomatologa clnica alguna. La celulitis anaerobia es una patologa que produce necrosis en los tejidos blandos. Su inicio es gradual, pero puede extenderse rpidamente. Aunque se forma gas. la infeccin no afecta al tejido muscular. Adems de clostndios, o en su lugar, en la celulitis anaerobia pueden estar implicados tambin cocos anaerobios y bacilos gramnegativos anaerobios. En contraste con la celulitis anaerobia, la gangrena gaseosa o mionecrosis clostridial es un proceso invasivo agudo y de rpida progresin que provoca grandes alteraciones en el msculo. Es de la mayor trascendencia el distinguir entre celulitis anaerobia y gangrena gaseosa para evitar la realizacin de intervenciones teraputicas quirrgicas agresivas y mutilantes, innecesarias en el primer caso. Los clostridios histotxicos asociados con la gangrena gaseosa incluyen C. perlnngens. C. novyi. C. septicum, C. histolyticum. C. sporogenes y C. bifermentans. Mientras que C. pertringens es la especie que est implicada con mayor frecuencia como agente causal de gangrena gaseosa, la prevalencia de las otras variedades en el proceso vara ampliamente. El ttanos y el botulismo son intoxicaciones ms que infecciones, debido a que las manifestaciones clnicas de ambas enfermedades estn relacionadas con la elaboracin de potentes neurotoxinas por parte de los microorganismos implicados en las mismas. El botulismo est relacionado muy a menudo con la ingestin de alimentos elaborados en casa que han sido preparados o envasados inadecuadamente; de todos modos, tambin se han detectado brotes espordicos de la enfermedad asociados con la ingestin de alimentos preparados comercialmente o con la infeccin de heridas por el microorganismo (C botulinum). El perodo de incubacin del botulismo es corto; los sntomas y signos clnicos aparecen entre 18 y 36 horas despus de la ingestin del alimento contaminado. De los siete tipos de toxina botulnica conocidos, el tipo A es el ms comn, seguido por los tipos B, E y F en los casos de intoxicacin alimentaria en EE.UU. La toxina es absorbida a nivel del tubo digestivo, y ms raramente a partir de la herida infectada, fijndose en ltimo trmino a las terminales nerviosas motoras, impidiendo la liberacin de acetilcolina y la transmisin del impulso nervioso. El ttanos se presenta tpicamente en personas no inmunizadas dentro de las dos primeras semanas siguientes al momento de haber sufrido heridas, pinchazos o abrasiones de origen traumtico, aunque tambin se han descrito casos tras intervenciones quirrgicas y dentales, despus de un parto o un aborto, o en situaciones de estasis y lceras de decbito. La toxina, denominada tetanoespasmina, es transportada hasta los ganglisidos en el SNC por medio de los torrentes linftico y circulatorio, y por migracin a travs de los espacios penneurales de los nervios perifricos. Clostridium difficile es la causa principal de diarrea de origen nosocomial y el responsable primario de la colitis seudomembranosa. Tambin provoca, aunque m u c h o ms raramente, abscesos, infecciones de las hendas, osteomielitis, pleuritis, peritonitis, septicemia e intecciones de las vias urinarias. El porcentaje de portadores de C. difficile (y de las toxinas que produce) es elevado (50% o ms) en neonatos, aunque los casos de enfermedad son raros (Bartlett, 1997). La colonizacin, con o sin produccin de toxina, puede mantenerse durante varios meses, pero cuando la microbiota intestinal adulta se ha establecido entre los 6 y 12 meses de edad, los porcentajes de colonizacin caen drsticamente y slo un 3% de los adultos sanos se encuentran colonizados por el microorganismo. Las personas hospitalizadas que estn recibiendo tratamiento con antibiticos y resultan infectadas por C. difficile adquieren casi siempre el microorganismo tras una exposicin directa o indirecta con algn reservorio humano o inanimado del mismo. Aunque las penicilinas y las cefalosporinas son los antibiticos que aparecen asociados ms frecuentemente con esta situacin, cualquier antibitico puede, en potencia, desencadenar la

patologa asociada con C. difficile. Raramente la enfermedad aparece sin que haya existido un tratamiento previo con antibiticos, aunque se han descrito casos asociados con tratamientos con agentes antineoplscos que poseen tambin actividad antimicrobiana. La colitis seudomembranosa es una enfermedad mediada por la accin de toxinas y en la que no parece existir invasin de la mucosa intestinal por el microorganismo. C. difficile produce dos toxinas diferentes. La toxina A, una toxina dbilmente citoptica, es responsable de la actividad enterotxica de la bacteria. La toxina B. una potente cilotoxina. parece jugar un papel poco relevante en la enfermedad humana, aunque a partir de pacientes sintomticos se han aislado cepas de C. difficile incapaces de sintetizar toxina A, pero que producen toxina B (Johnson, 1998). Como ya se ha mencionado previamente, otras bacterias anaerobias, particularmente los cocos anaerobios y los bacilos gramnegativos. se han asociado con la celulitis anaerobia adems o en lugar de las especies histotoxicas de Clostridium. Estas bacterias forman parte de la microbiota autctona de las membranas mucosas de la cavidad oral y de los tractos gastrointestinal y genitourinario. Como tales se encuentran en neumonas por aspiracin, abscesos pulmonares, empiemas, abscesos e infecciones intraabdominales, abscesos plvicos y cerebrales y bacteriemias. Las infecciones intraabdominales por anaerobios suelen aparecer como consecuencia de intervenciones quirrgicas en abdomen y colon y se asocian con el grupo de Bacteroides fragilis. Las bacteriemias por anaerobios, clnicamente significativas, tambin son causadas frecuentemente por esta bacteria. Diagnstico de laboratorio. La identificacin de las bacterias anaerobias hasta el nivel de especie puede ser una tarea bastante compleja; sin embargo, el grado hasta el que debe caracterizarse un aislamiento de un microorganismo anaerobio varia ampliamente y puede limitarse a obtener tan slo aquella informacin bsica que sea de utilidad clnica. Por ejemplo, la microbiota mixta presente en una lesin como una lcera de decbito, una fstula perirrectal o un absceso intrabdominal puede caracterizarse simplemente como microbiota fecal mixta, sin necesidad de tener que identificar a c a d a uno de sus integrantes individuales. La identificacin de un aislamiento hasta el nivel de especie puede circunscribirse exclusivamente a aquellos microorganismos que se obtienen en cultivo puro a partir de muestras y fluidos orgnicos procedentes de localizaciones del cuerpo habitualmente estriles, y puede llevarse a cabo con bastante facilidad mediante diversos sistemas comerciales de pruebas bioqumicas o utilizando la cromatografa de gasliquido. Hay que entender que el valor clnico de cualquier informe sobre la deteccin de bacterias anaerobias est directamente relacionado con la rapidez con la que dicho informe es remitido desde el laboratorio. Aquellos protocolos de identificacin que necesitan una o dos semanas para completarse tienen, por lo general, un inters acadmico o bsico solamente. Debido a la rapidez con la que progresan y a su considerable morbilidad y mortalidad, el diagnstico inicial y tratamiento de las enfermedades causadas por las especies de Clostridium deben basarse en las manifestaciones y sntomas clnicos. En algunos pacientes de ttanos no es posible d e t e c t a r la existencia de una herida primaria. Cuando existe una herida, raramente se observan microorganismos con la morfologa tpica de C. tetanien frotis teidos, aun cuando la bacteria pueda recuperarse por cultivo. Adems, debido a que este microorganismo est ampliamente distribuido en la naturaleza, su aislamiento a partir de una herida no implica necesariamente un diagnstico positivo de ttanos. La confirmacin del botulismo en el laboratorio requiere la deteccin de la toxina en el suero, las heridas, el contenido gstrico, las heces o el alimento sospechoso de haber causado la enfermedad. Los mtodos para llevar a cabo la extraccin de la toxina, as como las pruebas de neutralizacin en ratones, son tcnicamente complejos: por tanto, es aconsejable que los especmenes apropiados sean enviados al CDCde Atlanta para su examen y anlisis. En este caso debe hacerse una consulta telefnica previa para asegurarse de que las muestras han sido obtenidas y transportadas correctamente y que las autoridades sanitarias pertinentes han sido alertadas. En los casos en los que existe sospecha de una celulitis anaerobia o una gangrena gaseosa, el laboratorio puede ser una ayuda valiosa para el diagnstico mediante el examen microscpico de las muestras de exudados o tejidos. El hallazgo de bacilos grampositivos grandes, en nmero elevado, con la tpica morfologa "boxear" (Lmina 50-6), permite una confirmacin presuntiva del diagnostico. Los frotis teidos pueden proporcionar tambin el diagnstico d eu n a miositis estreptoccica anaerobia. Tambin deben realizarse cultivos a partir de

1118

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

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El diagnstico de laboratorio de la diarrea causada por C. difficile puede llevarse a cabo fcilmente, d e t e c t a n d o la presencia de toxina directamente en la muestra de heces m e d i a n t e enzimoinmunoensayo o bien p o ru n a prueba en cultivo de clulas. Alternativamente, puede comprobarse la capacidad del microorganismo aislado a partir de las h e c e s para producir toxina.

CAPTULO

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Pruebas de sensibilidad in vitro BiSr m a los antimicrobianos

Michael B. Smith, M.D. Gail L. Woods, M.D. DEFINICIONES INDICACIONES PARA LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD SELECCIN DE LOS ANTIMICROBIANOS MTODOS Mtodo de dilucin Mtodo de difusin en disco E-test Consideraciones tcnicas Sistemas de anlisis PRUEBAS BACTERICIDAS Concentracin mnima bactericida o letal Estudios de la tasa de muertes Estudios bactericidas del suero
1125 1119

ANLISIS DE ANTIMICROBIANOS Indicaciones Recogida de muestras Mtodos Interpretacin BIBLIOGRAFA

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La seleccin de un antimicrobiano depende de numerosos factores, entre los que se incluyen el lugar de la infeccin: diversos factores del husped, como el estado de los mecanismos de defensa inmunolgica, el estado de la funcin renal y/o heptica y la historia de reacciones alrgicas: las caractersticas de absorcin del antimicrobiano y su va de excrecin: las propiedades farmacocinticas y la posologia del antimicrobiano: la experiencia personal con respecto al antimicrobiano; la sensibilidad local y los patrones de resistencia; los costes de adquisicin y la administracin del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo (rente al antimicrobiano. A pesar de que la seleccin del tratamiento inicial para una infeccin se efecta a menudo de una manera emprica, la disponibilidad de pruebas de sensibilidad contribuye de modo adecuado al ajuste de la dosis inicial administrada o bien a la modificacin del tratamiento existente por las siguientes razones: 1) el microorganismo infectante es resistente al antimicrobiano que se est administrando. 2) la dosis del antimicrobiano administrada inicialmente puede ser modificada y 3) el antimicrobiano puede ser reemplazado por otro igualmente eficaz pero de ms bajo coste.

DEFINICIONES
Existen diversas categoras de pruebas utilizadas para determinar la actividad antimicrobiana. La primera categora est representada por la prueba de dilucin y la prueba de difusin con disco, que valoran la actividad inhibidora de un antimicrobiano frente a un microorganismo determinado. En la segunda categora se encuentran las pruebas que determinan la actividad letal de un antimicrobiano (bactericida o fungicida) frente a un determinado microorganismo. Una tercera categora de pruebas se refiere a la determinacin de la actividad (5-lactamasa en un determinado microorganismo, como elemento

pronstico de su sensibilidad frente a algunos antibiticos |5-lactmicos. En la cuarta categora se encuentran las pruebas para determinar directa o indirectamente la cantidad de antimicrobiano en un lquido biolgico, habitualmente el suero. En esta categora se incluyen las pruebas bactericidas sricas y los estudios especficos de antimicrobanos. Las bacterias suelen describirse como sensibles, de sensibilidad intermedia o resistentes a los antimicrobianos. Las definiciones de estas categoras interpretativas han sido proporcionadas por los procedimientos recomendados para las pruebas de difusin con disco y de dilucin, publicadas por el National Committee for Clinical Laboratory Standards {NCCLS M2-A6.1997; NCCLS M7-A4.1997). La sensibilidad implica que la infeccin producida por un microorganismo puede tratarse adecuadamente con la dosis del anlimicrobiano recomendado para este tipo de infeccin y de microorganismo infectante, excepto en aquellos casos en los que est contraindicado por otras razones. Una sensibilidad intermedia supone que la infeccin debida a u n microorganismo puede ser tratada mediante concentraciones alcanzables de determinados antimicrobianos cuando se administran stos en dosis ms altas o cuando las infecciones se encuentran en regiones del organismo donde se concentran los antimicrobianos (p. ej.. la orina). La categora intermedia proporciona una "zona tampn" para impedir que se produzcan discrepancias importantes en la interpretacin debidas a pequeos factores tcnicos no controlados. La resistencia supone que la infeccin producida por un microorganismo no responder o responder de forma inadecuada al antimicrobano. Hay que tener en cuenta que la actividad antimicrobiana m vivo depende de muchos factores, entre los que se incluyen la dosis, la va de administracin, los sistemas defensivos del husped, el volumen de distribucin del antimicrobiano. las caractersticas de absorcin y de excrecin del antimicrobiano, la existencia de una insuficiencia renal o heptica establecida o en desarrollo y las reacciones adversas al anlimicrobiano. Por consiguien-

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te, las categoras de interpretacin slo proporcionan estimaciones de la actividad antimicrobiana in vivo.

A pesar de que se han descrito procedimientos para la valoracin de la anfotericina B. la flucitosma y los azoles. no se han establecido los puntos de corte. Tampoco se ha establecido la utilidad clinica del estudio de la sensibilidad de levaduras y hongos filamentosos.

INDICACIONES PARA LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

Las indicaciones para la realizacin de las pruebas de sensibilidad varan en funcin del microorganismo. Por ejemplo, el estudio de sensibilidad est indicado en las bacterias aerobias y anaerobias facultativas de crecimiento rpido, clnicamente significativas y con una sensibilidad imprevisible a los antimicrobianos de eleccin. En general, la prueba de sensibilidad no es necesaria cuando se sabe que el microorganismo es sensible al antmicrobiano de primera eleccin. En EE.UU., esto sucede con los aislamientos de Streplococcus pyogenes. que hasta la fecha son universalmente sensibles a la penicilina. Sin embargo, si el paciente es alrgico al antimicrobiano de eleccin, es razonable que se estudie su sensibilidad a antimicrobianos alternativos, como la eritromicina en el caso del S. pyogenes. El estudio de aislamientos que de modo caracterstico son considerados "contaminantes" o "flora normal" es caro, conlleva mucho tiempo y puede dar lugar a una administracin innecesaria de antimicrobanos (Bates, 1991); por ello no se recomienda. De forma ocasional, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos, estos "contaminantes" son verdaderos patgenos, siendo importante que el clnico comunique estas circunstancias especiales al personal del laboratorio para que se estudien apropiadamente. Otras situaciones en las que los estudios de sensibilidad son tiles son los estudios epidemiolgicos y las evaluaciones de nuevos antimicrobanos. Debido a los patrones variables de sensibilidad de las bacterias anaerobias, el Working Group on Anaerobio Anlimicrobial Susceptibility Teslmg ol Ihe NCCLS ha recomendado que se estudie la sensibilidad de las bacterias anaerobias aisladas de los siguientes tipos de infecciones: abscesos cerebrales, endocarditis, osteomielitis, infecciones articulares, infecciones de prtesis implantadas e injertos vasculares y en las bacteriemias refractarias o recurrentes (NCCLS M11-A4, 1997). Tambin deben estudiarse especies resistentes o especialmente virulentas, como Bacleroidesde\ grupo Iragilis, PrevotelialPorphyromonas sp.. algunas especies de fusobacterias y clostridios. Bilophilia wadsworthia y Bacteroides del grupo gracilis (NCCLS M11-A4. 1997). Por otra parte, el estudio de sensibilidad de las bacterias anaerobias debe realizarse peridicamente para monitorizar los patrones de sensibilidad en diversos centros y hospitales de EE.UU. y dems pases, tambin para determinar la sensibilidad a nuevos antimicrobianos. Las indicaciones para el estudio de sensibilidad de Mycobacterium tuberculosis han cambiado debido al resurgimiento de la tuberculosis en EE.UU. y a la aparicin de cepas multirresistentes. Actualmente se recomienda que los aislamientos iniciales de lodos los pacientes sean valorados y que el estudio se repita si la muestra de esputo contina presentando un cultivo positivo tras tres meses de terapia (Tenover, 1993a). No existen pautas slidas respecto al estudio de sensibilidad de micobacterias atpicas. Durante los ltimos aos se ha incrementado la prevalencia de las infecciones fngicas sistmicas. sobre todo en inmunodeprimidos, y se han desarrollado nuevos antifngicos. Por otra parte, se ha descrito la resistencia de ciertos hongos a la terapia tradicional (como Candida lusilanae, resistente a la anfotencma B): debido a un aumento en la utilizacin de los azoles. especialmente el fluconazol. han aparecido levaduras resistentes a estos antimicrobianos (sobre todo especies de Candida). Como resultado se ha incrementado el inters en el estudio de sensibilidad de los antifngicos. Se cre el NCCLS Subcommitlee on Antiungal Susceplibility Testing para evaluar la necesidad de una seleccin de paulas en la terapia antifngica que ayude al laboratorio. Reuniendo datos se estableci una necesidad, ante la cual el subcomit desarroll un mtodo de referencia de macrodilucin en caldo y una adaptacin de microdilucin para el estudio de levaduras (especies de Candida y Cryplococcus neoiormans) que producen infecciones sistmicas (NCCLS M27-A, 1997). De modo similar, para evaluar la sensibilidad a los antifngicos se ha desarrollado un procedimiento de macrodilucin en caldo y una adaptacin de microdilucin utilizando conidias o esporangiosporas de hongos filamentosos, como especies de Aspergillus. especies de Fusarium. especies de Rhizopus. Pseudoalleschea boydi y la forma micelar de Sporothrix schenckii (NCCLS M38-P. 1998).

SELECCIN DE LOS ANTIMICROBIANOS

La seleccin de anlimicrobianos para estudios de sensibilidad (Tabla 511) se ha complicado debido a la ampliacin de su espectro de actividad y del nmero de compuestos dentro de las clases de antimicrobanos del mismo espectro. |unto a las nuevas clases de antimicrobanos (NCCLS M100-S9. 1999). El estudio de todos los compuestos disponibles no es necesario ni prctico. El proceso de seleccin comienza en el Pharmacy and Therapeulics Commitlee. que selecciona los antimicrobanos para la guia de frmacos de uso hospitalario. El objetivo ser coordinar los antimicrobianos de la gua que deben estudiarse o informarse. Esta coordinacin tiene hoy en da una gran importancia por diversas razones. En primer lugar, la mayora de los laboratorios utilizan paneles de microdilucin preparados comercialmente para el estudio de la sensibilidad antibacteriana. Los fabricantes ofrecen una diversidad de paneles que se disean para corresponderse tanto como sea posible con los antibacterianos de las guas hospitalarias A pesar de la variedad de paneles disponibles, existe con frecuencia disparidad entre los antimicrobianos de los paneles y los de la gua hospitalaria, por lo que el laboratorio debe enfrentarse la tarea de estudiar ms de un panel para un microorganismo determinado o pagar un precio suplementario para disponer de un panel, de acuerdo con las especificaciones del hospital. Sin embargo, en muchos casos se estudian ms antimicrobianos de los disponibles en la gua del hospital, por lo que el laboratorio debe suprimir los resultados de los antimicrobanos que no se encuentran en sta. En segundo lugar, generalmente no es necesario informar los resultados de los estudios de sensibilidad de muchos compuestos que presentan el mismo espectro (p. ej., cefotaxima, ceftizoxima y ceftriaxona), incluso aunque exista ms de uno en la guia. En tercer lugar, existe con frecuencia un retraso entre la aprobacin del agente para su utilizacin clnica y su incorporacin en el producto comercializado de la prueba de sensibilidad, debido a que los fabricantes de sistemas de pruebas de sensibilidad antimicrobiana preparados comercialmente deben presentar los datos a la Food and Drug Adminislration (FDA). validando la exactitud de sus equipos frente a cualquier antmicrobiano aprobado recientemente. En consecuencia, puede ser aprobado un nuevo antimicrobiano para la guia del hospital antes de que el laboratorio tenga capacidad para estudiar su actividad in vilro. En las normas del NCCLS para el estudio de la sensibilidad por dilucin y difusin en disco se enumeran antimicrobianos que deben considerarse para la valoracin frente a enterobacterias, Pseudomonas. estafilococos, enterococos, estreptococos no enterococos y Haemophilus (NCCLS M2A6, 1997; NCCLS M7-A4, 1997): sin embargo, el nmero de compuestos enumerados en la agrupacin primaria (grupo A) y en la agrupacin secundaria (grupos B y C), que deben considerarse para las pruebas, sobrepasa a menudo el nmero de los que deben estudiarse en un laboratorio determinado. Los documentos del NCCLS enumeran la piperacilina. la mezlocilina y la ticarcilna en las agrupaciones primarias que deben estudiarse frente a Pseudomonas. Puesto que se recomienda que las penicilinas activas frente a Pseudomonas no deben utilizarse individualmente (Grible. 1983) y dado que ningn estudio clnico de pacientes con enfermedades graves (p. ej neutropenia febril) ha demostrado diferencias significativas en los resultados entre regmenes teraputicos combinados de diversas penicilinas ms un aminoglucsido, las diferencias en los grados de actividad in vilro de las penicilinas activas frente a Pseudomonas no son clnicamente importantes y la seleccin de una penicilina activa frente a Pseudomonas para la guia (y, por tanto, para el estudio de la sensibilidad in vilro) puede basarse en la lista de las indicaciones aprobadas para la utilizacin de un compuesto del mismo espectro y sus costes de adquisicin y administracin, relativos a cualquier otro miembro de la misma clase de espectro. El cido clavulnico incrementa el espectro de la ticarcilna frente a enterobacterias y estafilococos productores de (Mactamasa mediada

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por plsmidos. pero poco aade a la actividad antipseudomonas de la ticarcilna; no obstante, existen pocas diferencias entre las actividades antipseudomonas de la piperacilina y de la ticarcilna (con o sin cido clavulnico) con respecto a la concentracin mnima inhibitoria (CMI) recomendada por el NCCLS para definir la sensibilidad de Pseudomonas, es decir, menor o igual a 64 ug/ml (NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M7-A4,1997). Una posible consideracin es que a pesar de que los costes de adquisicin por gramo de ticarcilina-clavulnico pueden ser ms elevados que los de una penicilina antipseudomonas. los costes de la administracin de ticarcilina-

clavulnico ms un aminoglucsido pueden ser menores que los de una penicilina antipseudomonas ms un aminoglucsido ms oxacilina. Asi pues, los costes de la administracin pueden pesar significativamente ms que los costes de adquisicin de un agente antibacteriano determinado. La farmacocintica de cualquier antimicrobiano afecta de manera evidente los costes de la administracin, ya que un antmicrobiano con una vida media prolongada puede administrarse en un rgimen de dosificacin menos frecuente que otro antimicrobiano del mismo espectro antibactenano de actividad pero con una vida meda mas corta.

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Aunque en general existe consenso para estudiar la sensibilidad de estafilococos y estreptococos a penicilina, de enterococos y enterobacterias a ampicilina y de los estafilococos a oxacilina. hay menos acuerdo en lo que se refiere a las cefalosporinas que deben estudiarse frente a las bacterias grampostivas y gramnegafivas. L a cefalotina puede utilizarse como representante de las cefalosporinas de primera generacin, incluyendo la cefazolina; sin embargo, se recomienda que la cefazolina no se utilice como representante de clase para la cefalotina y otras cefalosporinas de primera generacin, debido a la inaceptable tasa de falsas sensibilidades para otras cefalosporinas, en especial por lo que se refiere a Eschetichia coli (NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M7-A4,1997). Por tanto, la cefazolina slo debe estudiarse si es la clase representativa de la guia. Existe bastante controversia respecto a la necesidad de estudiar las cefalosporinas de segunda generacin y, en caso de hacerlo, cules deben ensayarse frente a las enterobacterias. El cefotetn. la cefoxitina y el cefamandol. el cefonicid o la cefuroxima se enumeran como antimicrobianos primarios que hay que considerar para las pruebas en las instituciones en las que existe resistencia endmica o epidmica frente a antimicrobianos primarios (es decir, cefazolina o cefalotina) estudiados en la misma clase. Una vez ms, la seleccin depende de la existencia en la gua y de las indicaciones que han sido especificadas por el Pharmacy and Therapeutics Commillee en cuanto a su utilizacin. Por ejemplo, el cefotetn o la cefoxitina pueden estar disponibles en el hospital para el tratamiento de infecciones por bacterias anaerobias y, en este caso, puede ser til estudiarlas frente a cualquier enterobacteria que pueda estar presente en una infeccin mixta aeroba-anaeroba. Por otra parte, es posible que en el hospital se disponga de una o ms cefalosporinas de segunda generacin nicamente como profilaxis perioperatoria; en este caso, tal vez sea innecesario estudiarlas de forma sistemtica. La seleccin de cefalosporinas de tercera generacin para estudiar su sensibilidad no slo se basa en las cefalosporinas que se encuentren en la gua, sino tambin en la equivalencia de actividad in vitro. Por ejemplo, entre cefoperazona, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona y ceftazidima existen slo pequeas variaciones de actividad con respecto a las enterobacterias. Por consiguiente, incluso en el caso de que en la gua existan ms de uno de estos compuestos, es posible estudiar slo uno como representante de los dems frente a las enterobacterias. La nica excepcin posible a esta norma se refiere a las |5-lactamasas de espectro ampliado (ESBL) de Klebsiella pneumoniae y otras enterobacterias. Estas |$-lactamasas mediadas por plsmidos onginan resistencia a las cefalosporinas, aunque no a cefamicinas ni a imipenem (CTX-1 o TEM-3), o bien presentan actividad preferencial frente a la ceftazidima (CAZ-1 o TEM-5 y CAZ o TEM-6) (Jarlier, 1988; Sirot. 1988; Sougakoff, 1988). La resistencia cruzada entre cefalosporinas de tercera generacin se observa tambin en mulantes gramnegativos desreprimidos de (J-lactamasa de clase I, dado que el inoculo se ha ajustado aproximadamente a 5 x 10" unidades formadoras de colonias (UFC)/ml y la prueba se incuba durante un mnimo de 6 horas (Washington, 1988). En muchos casos, en la guia del hospital se encontrar bien cefoperazona o bien ceftazidima para el tratamiento de Pseudomonas. Por tanto, la principal cuestin reside en s ambos antimicrobianos deben ser estudiados en el laboratorio frente a las enterobacterias. con el fin de fomentar la limitacin del uso de cualquiera de ambos en el tratamiento de las infecciones por Pseudomonas y reducir el riesgo de la aparicin de resistencia. La aparicin de |i-lactamasas mediadas por plsmidos con actividad preferencial frente a ceftazidima, as como las |i-lactamasas mediadas por plsmidos preexistentes con actividad frente a cefoperazona entre las enterobacterias, conducir a una poltica de limitacin de las pruebas de sensibilidad de cefoperazona o ceftazidima frente a Pseudomonas. Los laboratorios deberan considerar el estudio de sensibilidad de todos los aislamientos de enterococos (rente a vancomicina, dada la aparicin de cepas resistentes (Livornese. 1992; HICPAC, 1995). No obstante, no todos los sistemas automticos detectan con fiabilidad la resistencia de los enterococos frente a vancomicina: si se emplea uno de estos sistemas menos fiables, se recomienda la inclusin de un mtodo alternativo (difusin en disco, estudio en agar o E-test) para asegurar unos resultados exactos (Sahm, 1991; Tenover, 1993b; Woods, 1993; Kohner, 1997; Endtz, 1998). Se deben

realizar estudios de resistencia elevada a gentamicina y a estreptomicina en todos los aislamientos de enterococos procedentes de zonas estriles del organismo, y debe informarse al clnico (quizs a travs de un comentario adjunto a los resultados de las pruebas de sensibilidad) de que est indicada la terapia de combinacin entre penicilina o ampicilina ms un aminoglucsido en las infecciones graves por enterococos. como la endocarditis. Como sucede con la vancomicina, no todos los sistemas automticos detectan con habilidad la resistencia elevada a los aminoglucsidos. pudiendo ser necesario investigar un mtodo alternativo que se conozca que proporciona resultados exactos (Wiley, 1992). El NCCLS aconseja estudiar la produccin de [i-lactamasa en los enterococos aislados de sangre y liquido cefalorraqudeo (LCR). Los antimicrobianos a considerar en el estudio de los aislamientos urinarios de enterococos son ciprofloxacna (o bien levofloxacina o norfloxacina), nitrofurantona y tetracichna. Los resultados de las pruebas de sensibilidad de los enterococos frente a cefalosporinas. aminoglucsidos (excepto los estudios de resistencia elevada), clindamicma y Irimetoprim-sulfametoxazol pueden despistar y no deben informarse. El estudiar o no e informar de la actividad del aztreonam. la ciprofloxacna y el imipenem de forma peridica habitualmente reflejar su presencia en la gua del hospital y, en caso de encontrarse, cualquier restriccin en su uso (p. ej., slo mediante consulta de enfermedad infecciosa). En cuanto a Haemophilus influenzae, el grupo primario de antimicrobianos que hay que considerar en las pruebas de sensibilidad de los aislamientos de sangre y LCR est formado por ampicilina. una cefalosporina de tercera generacin (cefotaxima. ceftazidima. ceftizoxima o ceftriaxona) y cloranfenicol. Si la muestra procede de una infeccin localizada, que no supone un riesgo para la vida, los antimicrobanos a considerar incluyen ampicilina, trimetoprim-sulfametoxazol. amoxicilina-clavulnico (o ampicilina-sulbactam), cefaclor y tetraciclina. Los resultados de las pruebas de sensibilidad frente a ampicilina predicen la actividad de la amoxicihna. La resistencia a ampicilina puede delectarse en la mayora de casos por el estudio de la produccin de |5-lactamasa; sin embargo, existen cepas |5-lactamasa negativas con resistencia cromosmica a ampicilina (BLNAR) (Mendelman, 1984). Por tanto, si la prueba de la |3-lactamasa es negativa, la sensibilidad a ampicilina puede confirmarse mediante la prueba de dilucin o difusin en disco si la incidencia de BLNAR es alta en la regin del servicio de anlisis. Debe estudiarse la resistencia a penicilina de todos los aislamientos de Streptococcus pneumoniae procedentes de zonas estriles del organismo. Si se realiza mediante la prueba del disco de oxacilina, los aislamientos con un dimetro de halo menor o igual a 19 mm deben evaluarse adicionalmente por un mtodo de dilucin para distinguir las cepas resistentes de las de sensibilidad intermedia. La consideracin de otros antimicrobianos en el estudio de aislamientos procedentes de zonas estriles del organismo vara en funcin del mtodo de prueba utilizado. En pacientes con infecciones que suponen un riesgo para la vida, como meningitis o bacteremias, el NCCLS recomienda el estudio de penicilina, cefotaxima, ceftriaxona. meropenem y vancomicina. Se han proporcionado normas interpretativas sobre mtodos de dilucin para estos antimicrobianos: sin embargo, sobre mtodos de difusin en disco slo existen normas interpretativas para penicilina y vancomicina; por tanto, los mtodos de difusin en disco slo pueden utilizarse para estos dos ltimos antimicrobanos (NCCLS M100-S9,1999). Los antimicrobanos que hay que considerar en el estudio de aislamientos procedentes de infecciones que no representan una amenaza para la vida incluyen penicilina (mediante la prueba del disco de oxacilina), eritromicina y trimetoprim-sullametoxazol. Con respecto a los estreptococos del grupo viridans. se debe analizar la sensibilidad frente a penicilina de cualquier aislamiento implicado en endocarditis bacteriana o, con menor frecuencia, en meningitis (Goldfarb. 1984; Oumn. 1988). Est justificado el estudio de sensibilidad de los estreptococos del grupo viridans frente a las cefalosponnas consideradas para la terapia, ya que pueden presentar resistencia relativa a las cefalosporinas de tercera generacin (Wilcox. 1993). La vancomicina es la alternativa recomendada a los frmacos p-lactmicos, aunque no es necesario su estudio sistemtico, dado que no se ha informado de resistencia a vancomicina en este grupo de microorganismos. Sin embargo, la valoracin de la sensibilidad a vancomicina es til para propsitos de identificacin, pues la resistencia indicara que el

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microorganismo no es un estreptococo del grupo viridans, sino ms probablemente un miembro de los gneros intrnsicamente resistentes a vancomicina. como Leuconosloc o Pediococcus. Las pruebas habituales de sensibilidad de los aislamientos de Neissena gonorrhoeae no son necesarias. El estudio de la produccin de |l-lactamasa en todos los aislamientos le importante en el pasado, pero no es m u y recomendado, dado que ni la penicilina ni la ampicilina estn incluidas en los regmenes teraputicos recomendados para las infecciones gonoccicas por el Centers for Disease Control and Prevention (CDC. 1993). Sin embargo, la determinacin de la resistencia a penicilina puede ser til para propsitos epidemiolgicos. La prueba de la |i-lactamasa detecta la mayora de aislamientos resistentes a penicilina, aunque no determina algunas cepas con resistencia cromosmica; por ello, la sensibilidad a penicilina de los aislamientos IWactamasa negativos se debe confirmar mediante una prueba adicional, como el mtodo de difusin en disco. Se ha incrementado la resistencia de las bacterias anaerobias a los antimicrobanos. Ejemplos de esto incluyen, entre otros, el aumento de resistencia de Bacteroides spp. frente a clndamicina y a (Mactmicos. Las bacterias anaerobias todava muestran un alto porcentaje de sensibilidad a metronidazol, cloranfenicol, imipenem. ampicilina-sulbactam y ticarcilinaclavulnico; no obstante, la decisin de estudiar una bacteria anaerobia frente a un determinado antimicrobiano debe hacerse en funcin de la especie bacteriana y de la situacin clnica (NCCLS M11-A4.1997). No existe un acuerdo sobre la eficacia clnica de cieas cefalosporinas nuevas ni sobre la posibilidad de evaluar in vitro la respuesta clnica (NCCLS M11-A4,1997). La prueba de la |J-lactamasa (cefalosporina cromognica) se ha empleado para predecir la resistencia a penicilina y ampicilina. sin embargo, la resistencia frente a |i-lactmicos de algunas especies no est mediada por [ilactamasas. lo cual limita su utilidad para anaerobios. Los estudios con el propsito de establecer los patrones de sensibilidad local deben limitarse a los antimicrobianos de la gua. Los antituberculosos primarios que se deben estudiar en los aislamientos de Mycobacterium tuberculosis son isoniacida. rifampicina. etambutol y pirazmamida. Si se sospecha la resistencia a uno o ms de estos frmacos, deben realizarse pruebas adicionales de sensibilidad frente a antimicrobianos, incluyendo estreptomicina, etionamida, canamicina. capreomicina, rifabutina, ofloxacina y cicloserina (Tenover, 1993a). Se recomienda el estudio de resistencia a macrlidos de los aislamientos clnicamente signilicativos de Mycobacterium avium-intracellulare (MAI), sobre todo si el paciente ha recibido previamente terapia con macrlidos para una infeccin por MAI o no se conoce su terapia previa (Wallace, 1997). En cuanto a las levaduras, las normas del NCCLS incluyen informacin sobre el estudio de ciertos antifngicos. aunque slo se dispone de puntos de corte interpretativos en las pruebas de sensibilidad de especies de Candida frente a fluconazol y flucitosma (NCCLS M27-A, 1997).

placas de microdilucin preparadas comercialmente slo contienen una nica concentracin de antimicrobiano, que se utiliza para distinguir entre las categoras sensible y resistente. La mayora de las cepas de referencia utilizadas para el control de calidad de las pruebas de sensibilidad son m u y sensibles a los antimicrobianos adecuados, por lo que la limitacin de las concentraciones de los antimicrobianos plantea problemas extraordinarios en el control de calidad. En otras palabras, los intervalos aceptables de CMI para una cepa determinada de referencia frente a un antimicrobiano determinado pueden estar varias log de diluciones por debajo de la concentracin ms baja presente para ese antimicrobiano del sistema de la prueba de sensibilidad. Este problema aumenta la responsabilidad del fabricante en el control de calidad del sistema de la prueba de sensibilidad.

Mtodo de difusin en disco

En la prueba de difusin en disco, cuya utilizacin esl en gran parte limitada a bacterias aerobias y anaerobias facultativas de crecimiento rpido, se aplica un disco de papel que contiene una cantidad especificada (no concentracin) del antimicrobiano en una superficie de agar que ha sido recientemente inoculada con un microorganismo El antimicrobiano difunde en el medio a partir del disco, originando un halo de inhibicin hasta el punto en el cual una concentracin crtica del antimicrobiano inhibe el crecimiento del microorganismo en un tiempo determinado (habitualmente de 18 a 24 horas). Se mide el dimetro del halo de inhibicin y se relaciona de manera inversa con la CMI (es decir, cuanto ms grande es el dimetro del halo de inhibicin, ms baja es la CMI y viceversa). En condiciones ideales, la relacin entre las dos pruebas puede ser expresada mediante una lnea de regresin: los equivalentes de sensibilidad y resistencia del dimetro del halo para un antimicrobiano determinado pueden extrapolarse a partir de sus intercesiones en la lnea de regresin con las correspondientes CMI utilizadas para definir la sensibilidad y la resistencia.

E-test
El E-test es un mtodo de dilucin basado en la difusin de un gradiente continuo de concentracin de un antimicrobiano a partir de una tira de plstico en un medio de agar. La tira de plstico, que tiene una concentracin predefinida de frmaco seco y estabilizado en una cara y una escala de CMI interpretativa en la otra, se coloca en la superficie del medio de agar inoculado con el microorganismo a estudiar. La placa se incuba segn la atmsfera y el tiempo requeridos por el microorganismo en cuestin. Tras la incubacin, se forma una elipse de inhibicin del crecimiento alrededor de la tira: la CMI se lee en el punto de la escala donde la elipse cruza la tira Dado el coste de estas tiras, puede no ser prctica la seleccin del E-test como mtodo pnmano para el estudio de sensibilidad. Sin embargo, el E-lest es una alternativa valiosa para el estudio de sensibilidad de bacterias de difcil crecimiento, como S. pneumoniae o Haemophilus influenzae, tambin de algunos antimicrobianos clave frente a anaerobios (Jorgensen. 1994; Sanchez. 1992).

MTODOS
Las pruebas de sensibilidad antimicrobiana pueden clasificarse de acuerdo al resultado final que hay que determinar. El resultado final de la mayora de pruebas realizadas en el laboratorio clnico es la inhibicin. Existen indicaciones limitadas para la determinacin de actividad bactericida in vitro. La actividad inhibitoria normalmente se determina mediante una tcnica de dilucin o de difusin en disco.

Consideraciones tcnicas
Se lleven a cabo pruebas de dilucin o de difusin, la estandarizacin de la tcnica y el medio utilizado en sta son de mxima importancia para obtener resultados exactos y reproducibles. En EE.UU., las organizaciones profesionales, la industria y el gobierno han trabajado de forma consensuada dentro del NCCLS con el fin de elaborar una serie de documentos que describen procedimientos estandarizados para estudiar la sensibilidad de bacterias aerobias y anaerobias facultativas (NCCLS M2-A6. 1997; NCCLS M7-A4,1997), bacterias anaerobias (NCCLS M11-A4,1997). micobacterias ( NCCLS M24-T, 1995) y hongos (NCCLS M27-A, 1997), Estas tcnicas deben estar disponibles en los laboratorios clnicos de referencia y proporcionar los detalles tcnicos concernientes a la realizacin de las pruebas de sensibilidad. El Subcommittee on Antimicrobial Susceptibility Testing revisa y modifica las tablas de los documentos cada ao y los textos de los documentos cada tres aos. Por tanto, los laboratorios deben asegurarse de que estn empleando las tablas y los textos ms actuales y de que las revisiones se incorporen a la prctica de laboratorio.

Mtodo de dilucin
En la prueba de dilucin, el microorganismo es inoculado en una serie de tubos o pocilios que contienen una serie de concentraciones que suelen comenzar con una potencia de 2 (p. ej., 128 ug/ml) y disminuye en una base log., (p. ej., 64. 32. 16. 8, 4) hasta la concentracin ms baja estudiada. La concentracin ms baja que inhibe el crecimiento visible se denomina concentracin mnima inhibitoria o CMI. Por conveniencia y economa, se ha hecho cada vez ms frecuente limitar los intervalos de las concentraciones de cada antimicrobiano estudiado a aquellas concentraciones que comprenden las equivalentes a las categoras sensible y resistente En algunos casos, las

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Una variable importante de los estudios de sensibilidad es la composicin del medio. En la actualidad, el NCCLS recomienda el medio Mueller-Hinton para el estudio de bacterias aerobias y anaerobias facultativas, ya que presenta una buena reproducibilidad entre distintos lotes: tiene una concentracin baja de inhibidores de sulfonamida, trimetoprim y tetraciclina y permite el crecimiento de la mayora de patgenos bacterianos que no son de difcil crecimiento. Algunas bacterias, sobre todo estreptococos, no crecen bien en medios de Mueller-Hinton no suplementados, un problema que se supera mediante la suplementacin con sangre desfibrinada de cordero, caballo u otro animal a una concentracin final del 5% (v/V). Varios componentes o suplementos del medio Mueller-Hinton pueden afectar a los resultados de la prueba de sensibilidad. En los mtodos de dilucin y de difusin en disco, las variaciones en la concentracin de cationes divalentes, sobre todo calcio y magnesio, afectan a los resultados del estudio de Pseudomonas aerugmosa frente a aminoglucsidos y colistna, as como de otras bacterias frente a tetraciclina. Una concentracin catinica elevada causa falsas resistencias, mientras que un contenido catinico bajo presenta el efecto contrario (Barry. 1987, 1992: NCCLS M2-A6, 1997; NCCLS M7-A4,1997). El pH del medio debe estar entre 7,2 y 7,4. Un pH por debajo de este intervalo origina la prdida de potencia de frmacos como los aminoglucsidos y los macrlidos, mientras que otros (p, ej., las penicilinas) aparentan tener una mayor actividad. Si el pH es demasiado alto se produce el efecto contrario. En los mtodos de dilucin en caldo, se recomienda el suplemento del caldo Mueller-Hinton con NaCI al 2% para mejorar la deteccin de estafilococos resistentes a oxacilina (NCCLS M7-A3. 1993b). La deteccin de resistencia heterognea en la que menos del 0,01% de las bacterias expresan el rasgo de resistencia se incrementa con la adicin de sal al medio. Un mtodo alternativo para la deteccin de resistencia a oxacilina de los estafilococos consiste en la utilizacin de agar Mueller-Hinton suplementado con NaCI al 4% y la incorporacin de 6 ug de oxacilina por mililitro (Chambers. 1988). Otras cuestiones referentes a los medios estn relacionadas con las pruebas de sensibilidad de H. influenzae. para el cual se recomienda el medio para pruebas con Haemophilus (HTM) (NCCLS M2-A6,1997; NCCLS M7-A4, 1997), y las pruebas de N. gonorrhoeae. para el que se recomienda una base de agar GC. El medio Mueller-Hinton. tan desprovisto de timidina como sea posible, es importante para la determinacin exacta de la sensibilidad bacteriana a trimetoprim/sulfametoxazol. Algunas especies pueden utilizar la timina o timidina del medio para evitar el mecanismo de accin del trimetoprim y las sulfonamidas, dando lugar a falsas resistencias. Se puede incorporar al medio timidina tosforilasa o sangre lisada de caballo para mejorar la fiabilidad del estudio de trimetoprim y sulfametoxazol. Con un medio libre de timidina se obtienen resultados exactos de las pruebas de sensibilidad con microorganismos distintos de los enterococos. Para anaerobios, la dilucin en agar empleando agar Brucelia suplementado con sangre lacada y vitamina K (mtodo Wadsworth) es el mtodo de referencia (NCCLS. M11-A4,1997). Se h a seleccionado la sangre Brucelia en lugar del agar Wilkins-Chalgren empleado en el pasado, debido a su capacidad superior para permitir el crecimiento de anaerobios de dilcil crecimiento. Para el estudio de sensibilidad de anaerobios, no se recomiendan ni el mtodo de difusin disco-placa ni los mtodos de elucin disco-caldo, ya que presentan una pobre correlacin con el mtodo de dilucin en agar de referencia. El mtodo de microdilucin utilizando caldo de Schaedler, Brucelia, West-Wilkins, inlusn cerebro-corazn o un caldo con la misma formulacin que el agar Wilkins-Chalgren, pero sin agar. es ms prctico para su empleo en el laboratorio clnico que el mtodo de referencia (NCCLS, M11-A4.1997). Tambin puede utilizarse el E-test. Existen otros factores relacionados con el medio que influyen sobre la difusin en disco. Por ejemplo, el grosor del agar debe ser de 4 mm. Si el agar es demasiado ancho puede originar falsas resistencias, mientras que si no lo es bstanle pueden aparecer falsos resultados sensibles. Las concentraciones de ciertos cationes divalentes pueden afectar los resultados de las pruebas de sensibilidad, como el magnesio y el calcio en el estudio de Pseudomonas aeruginosa frente a tetraciclina y aminoglucsidos. Cuando el agar MuellerHinton se suplementa con sangre, los dimetros de halo para oxacilina y meticilina pueden ser de 2 mm a 3 mm inferiores a los obtenidos sin el suple-

mento. La sangre de cordero puede causar dimetros de halo imprecisos alrededor de los discos de trimetoprim y sulfonamida o una pelcula de crecimiento dentro del halo de inhibicin.

Inoculo
Las variaciones del tamao del inoculo son responsables de las mayores variaciones diarias en los resultados de las pruebas de sensibilidad. La utilizacin del inoculo adecuado es especialmente importante en la deleccin exacta de resistencia a penicilina y oxacilina en los estafilococos, asi c o m oa penicilinas de amplo espectro y cefalosporinas en mulantes gramnegativos con (Vlactamasa de clase I desreprimida (p. ej., Enlerobacter, Cilrobacter. Pseudomonas). El NCCLS recomienda una suspensin 0,5 de McFarland (18 2x10* UFC/ml) para la dilusin disco-placa y la dilucin de una suspensin 0,5 de McFarland hasta una concentracin linal de 5 x 10 UFC/ml para la dilucin en caldo (NCCLS M2-A6.1997: NCCLS M7-A4,1997). En los laboratorios que utilizan sistemas de microdilucin se observa a menudo una elevada tasa (del 20% al 40%) de sensibilidad de Enterobacter cloacae a ampicilina. Esta observacin siempre se debe al empleo de una cantidad demasiado pequea de inoculo. En consecuencia, es necesario que los usuarios de sistemas de microdilucin incluyan entre sus mtodos de control de calidad la cuantificacin de su inoculo de una manera regular. La sensibilidad de Enterobacter cloacae a la ampicilina no debe ser en general superior al 5%. Un segundo factor relacionado con el inoculo es el mtodo de preparacin. Para muchas bacterias no es importante, pero para estafilococos (con el fin de garantizar la deteccin de resistencia a oxacilina) y para bacterias de difcil crecimiento, como S. pneumoniae, H. influenzae y N. gonorrhoeae, el inoculo debe prepararse a partir del crecimiento durante una noche (18 a 20 horas) en un medio de agar (Chambers. 1988; NCCLS M2-A6,1997; NCCLS M7-A4,1997).
S

Incubacin
Las condiciones de incubacin tambin afectan a los resultados de la prueba de sensibilidad. Las recomendaciones generales son la incubacin durante una noche (16 a 20 horas) en atmsfera aerobia a 35C: no obstante, existen excepciones. Los aislamientos de S. pneumoniae. H. influenzae y N. gonorrhoeae requieren incubacin en atmsfera con un 5%-7% de C0 , adems S. pneumoniae y N. gonorrhoeae deben incubarse hasta 2024 horas ms. Los estafilococos y enterococos tambin deben incubarse durante 24 horas para garantizar la deteccin de resistencia a oxacilina y vancomicina, respectivamente. Los anaerobios y levaduras requieren 48 horas de incubacin, aunque se recomiendan 72 horas para los aislamientos de Cryptococcus neoformans. Para ms detalles sobre mtodos de sensibilidad se recomienda consultar los documentos adecuados del NCCLS.
2

Sistemas de anlisis
De acuerdo con los resultados de los recientes programas de competencia del College of American Pathologists, la mayora de los laboratorios de este pas utilizan en la actualidad sistemas de microdilucin. Una razn para pasar de la tecnologa de difusin a la de dilucin es la mayor eficacia de la inoculacin replicada en sistemas combinados de identificacin y pruebas de sensibilidad y a la gestin de datos mediante paquetes de software caractersticos de estos sistemas. Otras razones son a menudo inconsistentes y se basan en la falsa idea de que las CMI son ms exactas y constituyen los datos que los mdicos desean conocer. Dado que los resultados de las pruebas de dilucin y difusin se correlacionan notablemente desde un punto de vista estadstico y puesto que la mayora de los mdicos que no son especialistas en enfermedades infecciosas tienen dificultades para interpretar las CMI, se requiere que los laboratorios informen de categoras interpretativas junto a las CMI; la eleccin entre las pruebas de difusin y las de dilucin se realiza por motivos puramente econmicos en casi todos los casos. Hoy en da, se dispone de numerosos sistemas comercializados entre los que se puede escoger. Antes de llevar a cabo la eleccin, el director del laboratorio debe considerar si las ventajas de la inoculacin replicada y los sistemas de gestin de datos superan los costes aadidos de estos equipos, cuando se comparan con la simplicidad, la conveniencia y la economa

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PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBANOS

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proporcionada por la prueba de difusin en disco. Existe entre el personal de laboratono una desafortunada tendencia a considerar la prueba de dilusin en disco anticuada y demasiado poco sofisticada para la prctica actual. Esta prueba todava desempea su papel de forma exacta y adecuada, ademas de ser econmica Los resultados obtenidos son comprensibles para el mdico y suficientes en casi todas las situaciones donde se aplica un tratamiento antimicrobiano. La difusin en disco tambin proporciona flexibilidad, ya que se pueden estudiar prcticamente todos los antimicrobianos simplemente seleccionando el disco adecuado. La seleccin de un sistema mecanizado o semiautomatizado debe basarse en numerosas consideraciones. Entre stas se encuentran el nmero de muestras, la experiencia tcnica, la necesidad de gestin de los datos, la utilizacin de un sistema comn de identificacin bacteriana y de pruebas de sensibilidad, la compatibilidad con los sistemas de informacin del laboratorio, los costes de adquisicin o de arrendamiento del equipo, el coste de los suministros y reactivos fungiles, el coste de los contratos de servicios y la disponibilidad de espacio. En el sistema VITEK (bioMrieux, Hazelwood. MO). los antimicrobanos se encuentran en pocilios dentro de una placa de plstico. Este sistema consta de un mdulo llenador/sellador, un lector/incubador, un mdulo informtico, una terminal de datos y una impresora. Las placas se incuban en el mdulo lector/incubador y los pocilios se monitorizan por densidad ptica. Los resultados se obtienen en cuatro horas: sin embargo, el tiempo medio de incubacin para las pruebas de sensibilidad es aproximadamente de siete horas. Este tiempo de incubacin es suficiente para proporcionar una deteccin exacta de mutantes desreprimidos para |i-lactamasas de clase I, estafilococos productores de penicilinasa y estafilococos resistentes a oxacilina. Existen ciertos sistemas de microdilucin en los que los antimicrobanos se proporcionan en estado congelado o liofilizado La seleccin entre estos sistemas no slo se basa en la disponibilidad de espacio de congelacin para el almacenamiento de las placas, sino tambin en la disponibilidad del tiempo que requiere cada sistema. La seleccin tambin puede basarse en la disponibilidad y la sofisticacin de los sistemas de gestin de datos. En algunos casos, los resultados finales se leen de modo visual y se introducen manualmente con propsitos de informe y almacenamiento (p. ej., Pasco. Becton-Dickmson Diagnostic Systems. Sparks. MD). En otros casos, los resultados son ledos por el sistema fotomtricamente (p. ej McroScan WalkAway, Dade Behring. Inc; Aris. Trek Diagnostic Systems. Westlake. OH). Tanto el sistema McroScan como el Ans poseen capacidad para estudiar la sensibilidad aproximadamente a las 5 horas de incubacin o bien tras 18 horas de incubacin De los sistemas disponibles actualmente, VITEK, McroScan WalkAway y Aris ofrecen capacidades "walkaway". Debido a la escasez actual de londos para el equipamiento, cada vez ms laboratorios utilizan sistemas de alquiler de equipos financiados a travs del consumo de reactivos. Con el obieto de mantener el equipo y el software, suele ser necesario disponer de un contrato de servicio, cuyo coste bsico es aproximadamente el 10% del valor de adquisicin del equipo. Los fabricantes de sistemas fomentan la rapidez de las pruebas de sensibilidad, proporcionando las CMI en tres o cinco horas Sin embargo, estos sistemas no detectan con fiabilidad los estafilococos resistentes a penicilina o a meticilina. tampoco los bacilos gramnegativos desreprimidos para li-lactamasas de clase I, y parecen necesitar un mnimo de 6 horas para la deteccin de su resistencia a la mayora de los antibiticos |i-laclmicos (Lampe. 1979; Washington, 1988) Incluso en el caso de que las pruebas sean exactas, supone alguna ventaja el hecho de que sean ms rpidas? En un estudio no aleatorizado. Matsen (1985) ha descrito los resultados tanto de un sistema rpido de 3 a 5 horas como de una prueba de difusin en disco, preguntando posteriormente a los clnicos hasta qu punto el hecho de recibir antes el resultado influa en su eleccin del tratamiento antimicrobiano, En el 31,7% de los casos los mdicos indicaron que, basndose en el resultado rpido, iniciaban el tratamiento con un antibitico distinto del que habran utilizado en otras circunstancias; en otro 17% los mdicos sealaron que "probablemente" habria influido. La mayora de pacientes que participaron en el estudio tenan bactenuna. En un estudio prospectivo aleatorizado de 794 pacientes de ciruga general, Vmcent (1985) proporcion resultados rpidos para la milad de los pacientes y resultados convencionales para la otra mitad. Observ que el tratamiento antimicrobiano se modific en el 14.5% de ios casos en el grupo de pacien-

tes para quienes se obtuvieron resultados rpidos y en el 8,8% de los casos en el grupo de pacientes para quienes se obtuvieron resultados convencionales (p <0,001); no obstante, no hubo diferencias estadsticamente significativas entre ambos grupos con respecto a la duracin de la estancia de los pacientes en el hospital. Doem y cois. (1994) evaluaron el impacto clnico de pruebas rpidas de identificacin bacteriana y de sensibilidad frente a antimicrobanos en pacientes hospitalizados en un centro mdico de cuidados terciarios. Los tiempos medios de informacin de los resultados de identificacin y sensibilidad fueron, respectivamente, de 9.6 y 11.3 horas en el grupo de pruebas rpidas y de 19.6 y 25,9 horas en el grupo convencional (p <0,0005) No hubo diferencias significativas entre los dos grupos con respecto a los descriptores demogrficos, con excepcin del tiempo de informacin de los resultados Los tiempos medios de hospitalizacin fueron los mismos para ambos grupos, aunque la tasa de mortalidad fue inferior en el grupo de pruebas rpidas (8.8% frente a 15.3%). Por otra parte, en los pacientes del grupo de pruebas rpidas hubo significativamente menos estudios de laboratorio, menos estudios de imagen, menos das de intubacin y menos das de permanencia en una unidad de cuidados intensivos: el tiempo transcurrido previo a la modificacin del tratamiento antimicrobiano fue ms corto y el coste global de hospitalizacin de los pacientes fue significativamente ms bajo. En un estudio similar. Barenfanger (1999) no encontr diferencias de mortalidad entre grupos donde estuvieron disponibles resultados rpidos de las oruebas de sensibilidad, cuando se compararon con pacientes a quienes se informaron los resultados de modo ordinario (diferencia media de 5,2 horas). No obstante, ellos observaron una disminucin significativa en el tiempo de permanencia hospitalaria (diferencia media de 2,0 das, p - 0.0006) y en el coste total de la estancia en el hospital (diferencia media de 2.395 dlares. p = 0,04) en los pacientes donde estuvieron disponibles resultados rpidos de las prueas de sensibilidad.

PRUEBAS BACTERICIDAS
Existen tres categorias principales de pruebas bactericidas: 1) determinacin de la concentracin mnima requerida para que un antimicrobiano destruya un microorganismo, conocida como concentracin mnima bactericida o letal (CMB o CML): 2) determinacin de la tasa de muertes (tasa de muertestiempo o curva de letalidad) y 3) determinacin de la dilucin ms alta del suero del paciente requerida para destruir un microorganismo, conocida como titulo bactericida o letal del suero (TBS o TLS). La utilizacin de cualquiera de estas categorias de pruebas depende de cuestiones relacionadas con las indicaciones, mtodos e interpretacin.

Concentracin mnima bactericida o letal

Con respecto a la CMB o CML, existe un acuerdo general en que esta determinacin debe formar parte de la investigacin inicial de un nuevo antimcrobiano. No obstante, la unanimidad es menor en lo que se refiere a la posibilidad de que la prueba est indicada para aislamientos de estreptococos en pacientes con endocarditis, de estafilococos en pacientes con endocarditis u osteomielitis y de enterobacterias o Pseudomonas en pacientes con meningitis. La controversia se suscita en parte por las variables biolgicas y tcnicas que afectan a los resultados de las determinaciones de la CMB (NCCLS M26-A. 1999). Para determinar la CMB o CML se inocula el antimicrobiano en caldo, diluido de forma seriada (en una base logj con u n a suspensin estandarizada del microorganismo en estudio, segn lo descrito para la determinacin de la CMI. Tras su incubacin a 35 C durante 24 horas, los tubos con caldo que no muestran crecimiento visible son subcultivados en un medio de agar libre de antibiticos. La CMB o CML se define como la menor concentracin del antimicrobiano que es bactericida o letal para al menos el 99.9% del inoculo original. Entre las variables biolgicas de la prueba se encuentran: 1) el fenmeno de persistencia, en el que un pequeo nmero de bacterias "persistentes" (habitualmenle <0,1%) del inoculo bacteriano sobreviven a la exposicin del antibitico, pero siguen siendo sensibles si se vuelven a estudiar frente al antibitico, habtualmente un antimicrobiano activo frente a la pared celular: 2) el efecto paradjico, en

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

el cual la proporcin de supervivientes se incrementa con la concentracin de antibitico, de nuevo con mayor frecuencia en los antibiticos activos frente a la pared celular y 3) tolerancia, un lenmeno mucho menos comprendido. Se piensa que tanto la "persistencia" como el efecto paradjico estn relacionados con el enlentecimiento de la tasa de crecimiento de las bacterias por el antibitico, lo que da lugar a una disminucin del efecto de destruccin (NCCLS M26-A, 1999). Definidos estrictamente, los microorganismos tolerantes son aquellos en los que la viabilidad se pierde lentamente y aquellos en los que la respuesta bacteriosttica-bacteriolitica frente a los antibiticos se modifica en la direccin de la bacteriostasia (Handwerger, 1985). Sin embargo, la tolerancia se ha definido tambin como una proporcin CMB/CMI mayor o igual a 32, a pesar de los numerosos problemas tcnicos que influyen en los resultados de la CMB y de las variaciones metodolgicas en la determinacin de las CMB (Sherris, 1986). Como ha sealado Sherris (1986). la CMB se define como la concentracin menor de antibitico que produce una supervivencia <0,1% en la zona de menor exactitud de la curva de letalidad (es decir, de 18 a 24 horas). El nmero de supervivientes tras una noche de incubacin con un antibitico activo frente a la pared celular es invariablemente mayor si el inoculo se encuentra en la fase estacionaria en lugar de en la fase logartmica (Handwerger, 1985; Sherris, 1986). El problema tcnico ms frecuente que origina una mayor proporcin de bacterias en la fase estacionaria es la utilizacin de cultivos que han estado creciendo ms de ocho horas (NCCLS M26-A. 1999). Otros problemas tcnicos adicionales incluyen la supervivencia de las bacterias en el condensado por encima del menisco del caldo que contiene el antibitico, el volumen del subcullivo, el efecto remanente de antibitico en los subcultivos y la reproducibilidad de la prueba. Asumiendo que sea posible conseguir el control de estos problemas tcnicos, la determinacin de un resultado definitivo (CMB) puede basarse en los criterios de rechazo publicados por Pearson (1980). La tolerancia se define por una tasa de muertes retrasada, por lo que el mtodo ms fiable para su deteccin consiste en un estudio simplificado de las muertes de los microorganismos en funcin del tiempo, comparando la cantidad de bacterias que permanecen viables tras cinco o seis horas de incubacin en presencia de una concentracin de antibitico de cuatro a ocho veces su CMI, con la cantidad presente en las lecturas a las dos horas o en el tiempo cero (Handwerger, 1985; Sherris. 1986). Considerando todos los problemas biolgicos y tcnicos asociados con las pruebas bactericidas y la definicin de tolerancia, no es sorprendente que la interprelacin de los esludios clnicos publicados sobre infecciones causadas por microorganismos supuestamente "tolerantes" est llena de dificultades, en especial respecto a los estafilococos, para los que las variables tcnicas tienen consecuencias importantes (Handwerger, 1985). Por estos motivos, nuestra norma consiste en no determinar la CMB de los antibiticos activos frente a la pared celular para estafilococos. Existen datos procedentes de estudios de endocarditis producidas por estreptococos del grupo viridans en animales de experimentacin que sugieren que la penicilina puede ser menos eficaz frente a la infeccin por cepas tolerantes que frente a la debida a cepas no tolerantes (Handwerger, 1985; Wilson, 1985): sin embargo, apenas existe informacin sobre el significado clnico de estas cepas (Wilson, 1985). Handwerger y Tomasz (1985) postularon que las bacterias no tolerantes podran manifestar una respuesta fenotpicamente tolerante en una lesin endocrdica a causa de su elevada densidad, su disminuida actividad metablica y su lenta velocidad de crecimiento en las vegetaciones. Dado que algunas cepas de estreptococos del grupo viridans son resistentes a penicilina (CMI >4 pg/ml). sin duda es necesario determinar la CMI de los aislamientos de estreptococos del grupo viridans de pacientes con endocarditis u otras infecciones que suponen un riesgo para la vida. Puesto que los pacientes con endocarditis causada por estreptococos del grupo viridans tolerantes pueden presentar un riesgo mayor de recidivas y requerir de 4 a 6 semanas de tratamiento con penicilina y un aminoglucsido (Wilson, 1985), tal vez sea aconsejable determinar la CMB de dichas cepas.

gonismo entre dos o ms antibiticos. Adems, la actividad bactericida, ms que la bacleriosltica, parece ser un requisito para el tratamiento de la meningitis bacteriana (Sande. 1981). En la meningitis por bacilos gramnegativos (de etiologa distinta a H. influenzae). las CMB de las cefalosporinas pueden tener poca correlacin con el resultado, en contraste con los resultados de los estudios de 6 horas de la tasa de muerte-tiempo (Eng, 1987). Por tanto, cuando se necesita un tratamiento bactericida para la curacin, los estudios de muerte-tiempo de los antimicrobianos, ya sea en administracin nica o en combinacin, podran tener mayor valor predictivo de los resultados que las CMB (Bayer. 1985: Drake, 1985; Eng, 1987). Los resultados de los estudios de combinacin mediante el mtodo muerte-tiempo tambin se correlacionan mejor con los resultados de los estudios de combinacin en modelos de infeccin con animales de experimentacin que los resultados de estos estudios obtenidos mediante el mtodo del tablero (Bayer, 1985), quizs, una vez ms, debido a que los resultados definitivos del mtodo del tablero se determinan a las 18-24 horas, que representa la fase menos exacta de la curva de letalidad (Sherris, 1986). En los estudios de la tasa de muertes se realizan cultivos cuantitativos en diversos intervalos (p. ej., 0, 4. 8, 12 y 24 horas) tras la inoculacin del medio que contiene el antibitico. La actividad bactericida se delme como el 99,9% de muertes del inoculo final, determinado mediante la observacin de una disminucin >3-log de UFC/ml en la curva de muerte-tiempo trazada (NCCLS M26-A, 1999). Cuando se estudia una combinacin de antimicrobianos, la sinergia suele definirse como una reduccin >2-log,<, de UFC/ml entre la combinacin y su constituyente ms activo cuando se utiliza individualmente, suponiendo que al menos uno de los constituyentes no afecte a la curva de crecimiento del microorganismo estudiado. En el caso de enterococos, este requisito no supone dificultades, porque las concentraciones de penicilinas o aminoglucsidos alcanzables desde un punto de vista clnico no son bactericidas; sin embargo, puede suponer un problema en el estudio de otros microorganismos que pueden ser sensibles a cada uno de los antimicrobianos empleados en combinacin. En este ltimo caso, la sinergia slo es definible cuando existe una reduccin >2-log, de UFC/ml entre la combinacin de ambos, presentes en concentraciones que representan una cuarta parte de sus respectivas CMB. en comparacin con el constituyente individual ms activo en una concentracin de la mitad de su CMB (Hallander. 1982). Como ocurre con las determinaciones de CMB. el efecto remanente de los antimicrobianos en los subcultivos cuantitativos es problemtico y requiere inactivar cualquier antimicrobiano presente o diluir las muestras para el subcultivo lo suficiente para eliminar, si es posible, los efectos remanentes del frmaco. Siempre que se produzca un efecto remanente, especialmente en concentraciones de la prueba mayores o iguales a 16 veces la CMI, puede corroborarse marcando una alcuota de 10 pl a 100 pl de una dilucin de un subcultivo a travs de una superficie de agar, permitiendo un tiempo de absorcin de 20 minutos, marcando posteriormente toda la superficie de agar con el microorganismo de estudio y observando la inhibicin del crecimiento en el sitio de la marca inicial tras su incubacin durante 24 horas (NCCLS M26-A, 1999). Otro problema en la interpretacin de los estudios cinticos de letalidad es la aparicin de recrecimiento entre las 6 u 8 horas y las 24 horas de incubacin de la prueba. En estos casos, conviene determinar si se ha producido inactivacin antimicrobiana o si la prolongada incubacin ha seleccionado una subpoblacin resistente. Mediante la determinacin de la CMI a las 0 y a las 24 horas Irente a una cepa de relerencia de la American Type Culture Collection (ATCC), se puede deducir la inactivacin del antibitico si la CMI es marcadamente superior a las 0 que a las 24 horas (NCCLS M26-A. 1999).
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Estudios bactericidas del suero

El principal objetivo de la prueba bactericida del suero consiste en determinar la actividad de uno o ms antimicrobianos presentes en el suero frente a un microorganismo que ha sido aislado del paciente. Empleando distintas modificaciones, se puede determinar la actividad bactericida relativa a la C M B (ttulo bactericida del suero), la tasa de muertes en un determinado tiempo (tasa bactericida del suero) o la magnitud de la actividad bactericida y su duracin (NCCLS M21-A, 1999). En la prctica, los ttulos bactericidas del

Estudios de la tasa de muertes

La determinacin de la tasa de muertes de un antibitico es el mejor mtodo para detectar no slo la tolerancia, sino tambin la sinergia o anta-

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PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBANOS

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suero cuando la concenlracin de antibitico es mxima (pico) y cuando es mnima (valle) son los que se determinan ms fcilmente. Esto se lleva a cabo obteniendo una muestra de suero del paciente durante los niveles previstos de pico y/o valle de los antimicrobanos que est recibiendo el enfermo. Con posterioridad, la muestra de suero se diluye en caldo, en una mezcla de sueros humanos o en una mezcla de caldo y sueros humanos suplementados con cationes (cuando se estudian aminoglucsidos o fluoroqumolonas frente a Pseudomonas aerugmosa). Se aade luego una suspensin estandarizada del microorganismo al suero diluido senadamente y se incuban los tubos durante una noche a 35 C. El titulo inhibitorio del suero es la dilucin ms alta del suero que inhibe de manera visible el crecimiento del microorganismo. Se pueden realizar subcullivos de los tubos que contienen diluciones de suero sin crecimiento visible, con el fin de determinar la dilucin ms alta de suero que ha sido bactericida para el microorganismo estudiado. A pesar de que existe una fuerte controversia acerca del valor clnico de la prueba bactericida del suero, es evidente que todas las cuestiones tcnicas implicadas en las pruebas bactericidas tambin afectan a esta prueba. Adems, la prueba bactericida srica implica dos variables adicionales: 1) el tiempo de recogida de la sangre y 2) el tipo de diluyente (es decir, caldo, suero o una combinacin de ambos). Es difcil establecer una correlacin entre los ttulos bactericidas especficos y los resultados del tratamiento antimicrobiano, dadas las variaciones en el mtodo y las variables tcnicas que afectan a dichas pruebas.

Recogida de muestras
Debido a la corta vida media de la mayora de los antimicrobanos, la recogida de la muestra es esencial para una monitorzacion teraputica adecuada. El suero es la muestra ms apropiada para el anlisis; sin embargo, el plasma es tambin satisfactorio en la mayora de casos. Si se utiliza plasma para la determinacin de aminoglucsidos. debe anticoagularse con cido elilendiaminotetraactco (EDTA). ya que la heparina inactiva los aminoglucsidos. Los anlisis de antimicrobanos en orina rara vez estn indicados, excepto con finalidades de investigacin. Aunque para el anlisis se prefiere la venopuncin, se puede obtener sangre a partir de un catter mtravascular. despus de haber dejado fluir sta y desechar la muestra sangunea inicial. En general, para determinar la concenlracin sangunea mxima, las muestras deben recogerse a los 30 minutos de haber completado la perfusin intravenosa, a los 60 minutos Iras una dosis intramuscular y a los 60-120 minutos tras una dosis oral. Los niveles mximos varan de acuerdo con el antimicrobiano administrado, la va de administracin, la velocidad de administracin, las caractersticas de absorcin y el estado clnico del paciente. Los niveles mimmos de antimicrobiano son indicadores ms sensibles de la disminucin de su aclaramiento y de su acumulacin hasta niveles potencialmente txicos. Por consiguiente, a menudo se recomienda que los aminoglucsidos se monitoricen tanto en niveles previos al pico como en niveles previos al valle, en el primer caso para establecer que se est consiguiendo un nivel teraputico y en el segundo para comprobar que no se produce acumulacin a causa de una disminucin del aclaramiento. Slo se garantiza una recogida exacta de la muestra cuando la misma persona que administra el antibitico es la que extrae la muestra. De otra forma puede existir una considerable disparidad entre los tiempos registrados y reales de la administracin del antimicrobiano. Asi pues, s la sangre se recoge mediante un equipo de flebotoma que confia en el tiempo registrado de administracin del antimicrobiano, los niveles determinados y posteriormente informados pueden interpretarse de forma incorrecta. Bajo estas condiciones de escaso control de la recogida de muestras, es posible recibir informes en los que el supuesto nivel minimo sea ms elevado que el nivel mximo. En el peor de los casos, un supuesto pico puede parecer insuficiente para propsitos teraputicos, incrementndose de forma inadecuada la dosis de un antimicrobiano con estrecho margen teraputico, dando lugar a toxicidad provocada por niveles excesivos del antimicrobiano. Las muestras deben estudiarse inmediatamente o almacenarse a -20 C durante un periodo mximo de 2 das. Algunas amino o ureidopenicilinas inactivan los aminoglucsidos durante un almacenamiento prolongado, por lo que debe aadirse |}-lactamasa al suero si se mantienen almacenadas durante largo tiempo. La interaccin entre penicilinas y aminoglucsidos disminuye en el almacenamiento a -70X.

ANLISIS DE ANTIMICROBIANOS
El nivel de antimicrobiano en el suero u otros lquidos biolgicos se puede determinar directamente mediante bioanlisis, inmunoanlisis o anlisis cromatogrfico. Al contrario del titulo bactericida srico, los anlisis proporcionan una determinacin de la concentracin de cada antimicrobiano que el paciente est recibiendo.

Indicaciones
L a determinacin de la concentracin de antimicrobiano est indicada cuando el agente a administrar posee un estrecho margen teraputico (Tabla 51-2) y cuando determinados factores subyacentes del husped alteran la farmacocintica del antimicrobiano. Los antimicrobianos con un estrecho margen teraputico incluyen aminoglucsidos, vancomicina. cloranlenicol y flucitosina. Con estos antimicrobanos existe un estrecho cociente txico/teraputico. Debido a sus amplios mrgenes teraputicos, no se requiere el anlisis de penicilinas y cefalosporinas, excepto: 1) cuando su va de administracin o la enfermedad subyacente pueden producir niveles sricos que difieran notablemente del intervalo habitual o 2) cuando la infeccin se encuentre en un espacio o lquido donde la penetracin del antmicrobiano sea variable o dudosa. Los anlisis de antimicrobanos estn indicados en pacientes con tratamiento antimicrobiano prolongado (ms de 5 das), en enfermos que no responden al tratamiento y en pacientes que desarrollan signos o sntomas de toxicidad, como por ejemplo ototoxicidad o nefrotoxicidad durante la administracin de aminoglucsidos. La determinacin de antimicrobanos est indicada especialmente en pacientes con deterioro o cambios rpidos de la funcin renal y en pacientes sometidos a dilisis. Otras indicaciones adicionales de los anlisis de antimicrobanos comprenden pacientes ancianos: pacientes con fibrosis qustica, quemaduras, neumona por gramnegativos. obesidad y con expansin del volumen del liquido extracelular; asi como pacientes que no cumplen las dosis prescritas por va oral. Es importante comprender que los anlisis de antimicrobianos con mrgenes teraputicos estrechos no slo son necesarios para confirmar que estos antimicrobianos no se encuentran en concentraciones potencialmente txicas, sino tambin para comprobar que se hallan dentro del intervalo teraputico. Por ejemplo, se ha observado que existe un efecto dosis-respuesta graduado entre un cociente creciente concentracin mxima del pico/CMI de aminoglucsidos y la respuesta clnica (Moore, 1987).

Mtodos
Histricamente, los anlisis microbiolgicos constituan los mtodos ms utilizados y representaban la mejor opcin para la determinacin sistemtica de las concentraciones de antimicrobianos en los lquidos biolgicos. Con la introduccin de la gentamicina alrededor de la dcada de los setenta, se desarrollaron una serie de procedimientos de anlisis que no dependan de una dosis-respuesta microbiolgca in vilro. Estos mtodos proporcionan una exactitud y especificidad mayores que las que haban sido posibles con las pruebas microbiolgicas. Los anlisis microbiolgicos se basan en una comparacin de la respuesta de un microorganismo sensible a una concentracin desconocida de antibitico, con la respuesta de este microorganismo bajo condiciones idnticas de anlisis con concentraciones conocidas del antimicrobiano. La prueba suele basarse en tcnicas de difusin en agar, en las que el agar se siembra con una suspensin estandarizada del microorganismo a estudiar; en esta suspensin, los lquidos contienen concentraciones desconocidas de antibiticos y los patrones contienen concentraciones conocidas de antibiticos, repartidas en pocilios o en discos de papel en blanco. Despus, las placas se incuban durante una noche y se realiza una curva de

CAPTULO 51

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD IN VITRO A LOS ANTIMICROBIANOS

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dosis-respuesta, determinando el dimetro del halo de inhibicin correspondiente a cada concentracin conocida del antibitico utilizado en los patrones. Debe entenderse que el ensayo microbiolgico mide los efectos de todos y cada uno de los antimicrobianos que pueden encontrarse presentes en el lquido biolgico en estudio. Por tanto, si el paciente est recibiendo otros antimicrobianos adems del que es ob|eto de la prueba, el dimetro del halo de inhibicin reflejar los efectos combinados de todos los antimicrobianos presentes. En algunos casos, es posible determinar la concentracin de un antimicrobiano en presencia de otro mediante la seleccin adecuada de un microorganismo de prueba sensible al antimicrobiano a determinar y resistente al que potencialmente interfiere con el antimicrobiano. En otros casos, es posible suplementar el medio de la prueba con sustancias que pueden neutralizar los efectos del antimicrobiano que interfiere. Por ejemplo, en el estudio de antibiticos |i-lactmicos. se pueden aadir cationes o polianetolsullonato sdico al medio de ensayo con el fin de neutralizar la actividad de los aminoglucsidos. En otras ocasiones simplemente no es posible determinar la concentracin de un antimicrobiano en presencia de otro. Pese a estas limitaciones, las pruebas microbiolgicas siguen siendo el "mtodo de referencia" frente al cual se evalan los anlisis no microbiolgicos; el motivo estriba en que la prueba microbiolgica determina la actividad antimicrobiana total de un antimicrobiano, mientras que el anlisis no microbiolgico determina slo un componente de un antimicrobiano estructuralmente complejo. Anhalt (1985) y Edberg (1986) proporcionaron descripciones detalladas de las pruebas microbiolgicas. La cromatografa liquida, proceso para separar una mezcla compleja de sustancias y basado en la distribucin diferencial de stas entre una fase lquida mvil y una fase slida estacionaria, ha demostrado ser una tcnica sensible y especfica para medir casi todos los antimicrobianos de muestras clnicas. La tcnica conlleva la extraccin del antimicrobiano a partir de la muestra o una precipitacin de protenas seguida de cromatografa del lquido extrado o libre de protenas en una columna de fase inversa (Anhalt, 1985). Anhalt (1985) public detalles respecto a los anlisis mediante cromatografa lquida. Los factores que afectan a la utilizacin actual de la cromatografa lquida son la disponibilidad de equipamiento para el anlisis de frmacos distintos de los antibiticos, la falta de disponibilidad de equipos de reactivos para determinados antimicrobianos, el pequeo volumen de pruebas para algunos antimicrobianos y la necesidad de cuantificar los metabolitos e ismeros de los antimicrobianos. Los anlisis mediante cromatografa lquida tienen la ventaia sobre otros mtodos de poder mezclar un patrn con la muestra antes de la prueba, proporcionando un patrn interno. Las ventajas de la cromatografa liquida incluyen su versatilidad, el coste relativamente bajo del reactivo, el coste moderado del equipo y la no necesidad de derivacin, la capacidad para manejar peticiones "estadsticas" y un consumo de tiempo mnimo. Las desventajas de la cromatografa liquida son el tamao de la muestra relativamente voluminoso (500 pl), la necesidad de muestras pretratamiento, la necesidad de una diversidad de detectores, la extraccin constante de muestras y el tiempo de entrenamiento requerido para el procesamiento exacto de las muestras. Los mtodos de cromatografa lquida para el estudio de antimicrobianos se han sustituido en los laboratorios clnicos por los de inmunoanlisis. El radiommunoanlisis (RA) fue uno de los primeros inmunoanlisis disponibles para el estudio de aminoglucsidos. Los RA requeran slo un pequeo volumen de muestra y podan manejar peticiones "estadsticas", eran especialmente capaces de realizar mltiples anlisis por lote, proporcionaron automatizacin y eran sensibles y especficos. Las desventajas del RA consistan en la fecha de caducidad limitada de los reactivos radiactivos, los problemas de tratar con malerial radiactivo, el coste elevado de equipo y reactivos y la falta de versatilidad para el estudio de otros agentes antimicrobianos. En consecuencia, los RA han sido sustituidos casi por completo por inmunoanlisis no isotpicos, entre los que se incluyen la polarizacin, los sustratos marcados, la multiplicacin enzimtica y el fluoroanlisis de polarizacin (Edberg, 1986). La ventaja de estos inmunoanlisis homogneos es el pequeo volumen de muestra requerido (aproximadamente 50 pl), no necesitar preparacin de las muestras, el coste moderado del equipo, un tiempo de adiestramiento mnimo, la capacidad de los sistemas para manejar peticiones estadsticas y la disponibilidad de automatizacin. Sus desventajas incluyen el hecho de que a menudo slo existe una fuente de reactivo y que stos sue-

len ser caros. No obstante, dada su comodidad y el poco tiempo que consumen, estos sistemas de inmunoanlisis son bastante utilizados. Edberg (1986) public una descripcin detallada de los inmunoanlisis. Se han realizado una serie de estudios sobre aspectos tcnicos y de exactitud de las pruebas microbiolgicas, los radioinmunoanlisis, los inmunoanlisis no isotpicos y la cromatografa lquida de alta resolucin. En general, los coeficientes de variacin son comparables (del 7% al 9%). Las sensibilidades suelen ser tambin comparables (de 0.1 ugvml a 1 po/ml). La correlacin de resultados entre los mtodos es alta Los resultados de los inmunoanlisis no isotpicos y de la cromatografa lquida de alta resolucin pueden estar disponibles en 1 hora, mientras que en 3 a 4 horas se dispone de los resultados de los RIA. Aunque la mayora de las pruebas microbiolgicas requieren una noche de incubacin, se dispone de una serie de anlisis microbiolgicos rpidos (de 4 a 6 horas) para aminoglucsidos y vancomicina.

Interpretacin
La interpretacin de los resultados de anlisis de antimicrobianos requiere conocimientos acerca de las dosis de antimicrobiano administrado, el intervalo de tiempo entre la administracin de las dosis y la recogida de la muestra de sangre, la sensibilidad del microorganismo infectante, la tolerabihdad de los niveles sricos alcanzables de antibitico, el volumen de distnbucion y la via de eliminacin del antibitico, las caractersticas de absorcin de ste y la experiencia clnica en el tratamiento de infecciones similares. Considerados estos requisitos, en la Tabla 51-2 se han enumerado los factores que afectan la monitorizacin de los antimicrobianos con estrechos mrgenes teraputicos (Anhalt, 1989).

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C A P T U L O

52

Infecciones por espiroquetas

Michael Smith, M.D. Randall T. Hayden, M.D. David H. Persing, M.D., Ph.D. Gail L. Woods, M.D.
TREPONEMA Treponema Pinta Diagnstico de laboratorio de las treponematosis Tratamiento de las treponematosis GINGIVITIS ULCERATIVA Y PERIODONTITIS CRNICA LEPTOSPIROSIS 1135 1135 pallidum 1131 FIEBRE POR MORDEDURA DE RATA ANAEROBIOSPIRILLUMSUCCINICIPRODUCENS ESPIROQUETOSIS INTESTINAL DIAGNSTICO Y CONTROL DE LAS INFECCIONES POR BORRELIAS Enfermedad de Lyme Fiebre recurrente BIBLIOGRAFA 1141 1137 1136 1136 1136

Las espiroquetas son bacterias finas con forma espiral que presentan una o ms vueltas de hlice completas en el soma bacteriano. Son gramnegativas. pero slo pueden visualizarse en preparaciones en fresco, mediante microscopa ptica de campo oscuro o contraste de fases, o por medio de tinciones por impregnacin argntica en secciones de muestras de tejidos. Unos orgnulos semejantes a los flagelos, denominados fibrillas periplsmicas o filamentos axiales, que surgen cerca de los polos de la bacteria, son responsables del movimiento caracterstico de estos microorganismos, semejante al desplazamiento de un sacacorchos. Si bien existe un gran nmero de especies comensales, no patgenas, las especies de los gneros Treponema y Borrelia, as como Leptospira interrogans, y Spirillum minor causan enfermedades en el ser humano. Por otro lado, se han asociado algunas especies de los gneros Serpulina y Brachyspira con sndromes gastrointestinales, aunque no est universalmente aceptado que exista una relacin inequvoca entre estas bacterias y la enfermedad.

ja es aproximadamente de un 30% a un 50% (Larsen, 1995: Tramont, 1995). Aunque con una frecuencia mucho menor, la infeccin puede transmitirse sin que exista contacto sexual con una lesin infecciosa, mediante una transfusin de sangre fresca (o de hemoderivados de la misma) procedente de una persona infectada (los microorganismos pueden sobrevivir de 24 a 48 horas, e incluso ms, en las condiciones de almacenamiento que existen en los bancos de sangre), por una puncin accidental con una aguja infectada o durante la manipulacin de los especmenes de laboratorio. La incidencia de la sfilis venrea en EE.UU. descendi drsticamente con el advenimiento de la penicilina tras la segunda guerra mundial, y permaneci estable hasta 1980. momento en el que la prevalencia de la enfermedad aument, debido probablemente a la asociacin entre el incremento en el uso de drogas y la promiscuidad sexual en determinados grupos de la poblacin. Esta asociacin ha tenido el desafortunado efecto adicional de provocar un incremento en la prevalencia de la sfilis congnita en los recin nacidos (CDC. 1989). Patogenia y patologa. T. pallidum subesp. pallidum es capaz de penetrar por las membranas mucosas intactas o acceder a los tejidos a travs de abrasiones o excoriaciones de la piel, tras lo cual se multiplica en el m i s m o punto en donde tuvo lugar la inoculacin, teniendo lugar, a continuacin, la diseminacin del microorganismo por los sistemas circulatorio y linftico de la persona infectada. En los animales de laboratorio se ha logrado producir la infeccin con una dosis infectante tan baja como cuatro espiroquetas (Cumberland, 1949). Las lesiones clnicas aparecen cuando se alcanza localmente una masa crtica de microorganismos (aproximadamente 10' espiroquetas): por tanto, el perodo de incubacin est directamente relacionado con el tamao del inoculo inicial y varia entre tres das y tres meses (Magnuson, 1956), La respuesta inmune del hospedador frente a T. pallidum subesp. pallidum est influida por la propia estructura de la bacteria. La membrana externa d e la envoltura celular bacteriana es una bicapa lipdica en la que existen pocos antigenos proteicos expuestos. Los antgenos ms importantes en el contexto de la respuesta inmune del hospedador parecen ser los proteolipidos que se encuentran por debajo de la superficie celular del microorganismo (Chamberlain, 1989; Cox, 1992). Adems, la bacteria parece ser capaz de recubrirse con protenas del husped. El resultado final es retrasar la respuesta inmune de tipo humoral, reduciendo la eficacia de la misma, debido a que las espiroquetas se localizan fuera de los vasos sanguneos cuando se estn produciendo los anticuerpos. Es ms. se ha demostrado en modelos animales que hay una escasa estimulacin de la respuesta inmune celular en el caso de la sfilis, a pesar de la ineficaz respuesta de tipo humoral (Fitzgerald, 1992).

TREPONEMA
El gnero Treponema incluye dos especies que causan enfermedad en el hombre. La especie Treponema pallidum est subdivdida en tres subespecies. cada una de las cuales es el agente etiolgico de una entidad clnica diferente: las subespecies pallidum, pertenuey endemicum causan, respectivamente, sifilis venrea, frambesia y sfilis endmica (bejel). La enfermedad denominada pinta est provocada por la otra especie patgena. T. carateum.

Treponema Sfilis

pallidum

Descripcin. T. pallidum subesp. pallidum, el agente etiolgico de la sfilis venrea, es una espiroqueta muy delgada (0.2 um) y larga (de 6 itm a 20 um) que presenta entre 10 y 13 vueltas de hlice completas. Esta espiroqueta tiene la movilidad de sacacorchos caracterstica, con una flexin ondulante de la parle central del cuerpo de la bacteria, y es rpidamente inactivada por el calor, el fro, la desecacin, los desinfectantes y los cambios en la presin osmtica del medio exocelular. Epidemiologa. El hombre es el nico hospedador natural de T. pallidum subesp. pallidum. La transmisin se produce al entrar en contacto directo con lesiones infecciosas, principalmente a travs de una relacin sexual. La probabilidad de que una persona infectada le transmita la enfermedad a su pare-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA contrario, debido a que los antibiticos se administran en dosis insuficientes para atravesar la barrera hematoenceflica y alcanzar concentraciones bactericidas, la neurosifilis todava aparece con cierta frecuencia (Mohr, 1976; Green. 1980) De esta forma de sfilis se han definido dos variantes, meningovascular o parenquimatosa, aunque es comn que exista una solapacin entre ambas. La sfilis meningovascular aparece entre los 5 y 1 0 aos siguientes a la infeccin inicial y se manifiesta clinicamente en forma de ataques, derrames cerebrales y afasia. La causa principal son los microinfartos mltiples debidos a la endoartertis caracterstica a nivel del SNC. La neurosifilis parenquimatosa, que aparece entre los 15 y 30 aos despus de la primera infeccin, es un proceso degenerativo con prdida de neuronas y segmentos mielmizados (desmielmizacin segmentaria) que provoca manifestaciones neurlogos y psiquitricas complejas, incluyendo paresia generalizada y tabes dorsal. Algunos pacientes no muestran signos o sntomas clnicos, pero un anlisis de su lquido celalorraquideo (LCR) revela anomalas tales como pleocitosis. incremento en la concentracin de protena y presencia de anticuerpos frente a T. pallidum. siendo posible que la prueba VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) d positiva, lo que indica la existencia de infeccin a nivel del SNC. Esta forma se ha denominado "neurosfilis asintomtica" (Tramont. 1995). Tambin existen dos formas clnicas de la sfilis congnita: una forma temprana o infantil y otra tarda, que se maniliesta tras un perodo de latencia que oscila entre 5 y 30 aos. Aunque la idea tradicional de que la infeccin del feto slo tiene lugar durante el segundo trimestre de gestacin ha dejado de ser aceptada, la sfilis congnita causa con mayor frecuencia abortos en las etapas iniciales del embarazo que en las fases tardas del mismo (Blanc. 1981: Harter, 1976). La inflamacin del cordn umbilical (lunisilis necrotizante) es caracterstica de la sfilis congnita. En la forma infantil, son caractersticas una erupcin difusa con desprendimiento de la piel y osteocondntis y periostitis: sin embargo, los recin nacidos afectados tambin pueden ser asintomtcos (Ikeda, 1990; Dorfman, 1990). Asimismo, se h a observado fibrosis difusa en el hgado (hepar lobalum) y el pulmn (neumona alba) Tras un periodo de latencia. la lorma tarda se presenta en la niez o en la edad adulta con una amplia variedad de signos o sntomas, aunque es clsica la trada formada por la queratitis intersticial, los dientes de Hutchinson (dientes en tonel) y la parlisis del octavo par de nervios craneales (sordera). Tambin se observa con frecuencia periostitis, arqueamiento de las tibias (tibia en sable) y deformidad de la nariz, que adquiere un aspecto de silla de montar

Esta respuesta inmune retardada y atenuada permite a 7! pallidum subesp. pallidum diseminarse y producir una infeccin crnica. El curso de la sfilis puede dividirse en tres fases predecibles. La fase primaria, con el desarrollo del chancro, se manifiesta por trmino medio a las tres semanas, aunque no todos los pacientes desarrollan una lesin primaria (el chancro). En algunos casos, debido a su carcter indoloro, la lesin desaparece sin el que paciente llegue a darse cuenta. La cicatrizacin completa del chancro entre dos y ocho semanas despus da paso a la fase secundaria, que se manifiesta por trmino medio unas seis semanas (con un rango de entre 2 y 12 semanas) despus de la inoculacin. Esta fase se caracteriza por una extensa diseminacin de la bacteria por el torrente circulatorio, con afectacin mucocutnea y a nivel de rganos y la aparicin de sntomas constitucionales. La lase secundaria se resuelve y la infeccin entra, seguidamente, en un perodo de latericia durante el cual el paciente no muestra sntoma alguno de la infeccin. Los cuatro primeros aos de esta fase se denominan perodo de latencia temprano, y es durante este tiempo cuando tienen lugar las recadas, principalmente dentro del pnmer ao Esta fase es seguida por el perodo de latencia tardo, durante el cual no se producen recadas. En algn momento entre los 1 0 y 25 aos despus de la fase primaria, un tercio de los pacientes no tratados desarrolla la lase terciaria de la enfermedad, en la que tienen lugar graves manifestaciones clnicas a nivel de los sistemas cardiovascular y nervioso central (SNC). Sea cual sea el rgano afectado o la fase en la que se encuentra la enfermedad, la caracterstica histolgica distintiva de la sfilis es la endoarterilis oblilerativa, una proliferacin endotelial y fibroblstica concntrica con un infiltrado asociado de clulas mononucleares rico en clulas plasmticas. L a endoartertis es consecuencia de la unin de las espiroquetas a las clulas endoteliales a travs de molculas de fibronectina que se han pegado a la superficie de las bacterias (Thomas. 1986). Los treponemas pueden visualizarse en las muestras de tejidos mediante tcnicas de tincin por impregnacin argntica. A medida que la enfermedad progresa disminuye la intensidad de los infiltrados de clulas plasmticas y la concentracin de treponemas.

Manifestaciones clnicas. La sfilis es una infeccin crnica con mltiples manifestaciones relacionadas, pnmariamente, con la fase en la que se encuentra la enfermedad. El chancro primario aparece caractersticamente ulcerado, con los bordes elevados y duros, la base lisa, destacando la ausencia de exudado y dolor en el mismo. Aunque habitualmente es nico, pueden aparecer mltiples chancros hasta en un tercio de los individuos infectados. Los pacientes con infeccin previa pueden presentar lesiones atipicas, c o m o una ppula pequea, La sfilis y la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) e incluso pueden no desarrollar lesin alguna. En algunos pacientes puede apreaparecen frecuentemente en el mismo paciente, puesto que ambas enfermeciarse la existencia de linfadenopata regional, con ganglios linfticos moderadadades comparten factores de riesgo comunes. Los estudios efectuados sobre mente aumentados de tamao, de consistencia gomosa y no supurativos. esta asociacin no han revelado diferencias en la fase de presentacin clnica entre los pacientes con sfilis y sida concomitantes y aquellos que no estn La diseminacin tiene lugar en la fase secundana, y los pacientes presentan afectados por el VIH (Hutchinson. 1991; Gourevitch, 1993) Existe controverlos signos y sntomas de una enfermedad sistmica. Ms del 90% de los missia sobre el hecho de si el sida concomitante puede afectar el curso clnico de m o s desarrollan una erupcin que aparece inicialmente en el tronco y las extremidades (aunque cualquier parte del cuerpo puede verse alectada) en forma de las fases primaria y secundaria de la sfilis. Algunos expertos indican que existe una tendencia a que aparezca una erupcin ms grave y atipica, a que los mculas de pequeo tamao que evolucionan hasta convertirse en ppulas, y sntomas constitucionales sean ms intensos y, en general, a que la enfermeen algunos pacientes en pstulas, durante un periodo de varias semanas. El dad siga un curso ms maligno en los pacientes con sida (Tramont. 1995) Sin aspecto de la erupcin en la palma de la mano y la planta del pie es caracteembargo, otros autores han encontrado pocas diferencias en estas dos fases rstico, y el agrandamiento y la coalescencia de las ppulas da lugar a las plade la enfermedad entre los pacientes afectados y no afectados por el VIH (Hutcas blanquecinas del condiloma lata. Aproximadamente el mismo nmero chinson, 1991: Musher, 1990). Sobre lo que no existe duda alguna, en cual(90%) de pacientes manifiesta una linfadenopatia generalizada, y un 75% puequier caso, es sobre el hecho de que los pacientes con sida enfermos tambin de padecer fiebre, malestar, anorexia, artralgia, faringitis y prdida de peso. En de sfilis tienen una mayor predisposicin a desarrollar neurosililis, y a desun tercio de los casos pueden observarse placas mucosas. Alrededor de un arrollarla de manera ms rpida que los sifilticos que no estn afectados por 40% de pacientes manifiestan sntomas de afectacin del SNC. aunque tan el sida (Tramont. 1995; Musher, 1990: Johns. 1987) En este caso, se ha puesslo entre un 1% y un 2% desarrollan una meningitis aguda asptica (Lukehart. to de manifiesto que existe una relacin con el tratamiento con penicilina a 1988). El resto tiene dolor de cabeza y meningismo. uveitis. prdida neurounas concentraciones insuficientes para atravesar la barrera hematica y accesensonal de la audicin y afectacin de los nervios craneales. der al lugar de la infeccin, el SNC (Berry, 1987). Adems, en los pacientes con La destruccin de los tejidos en la sfilis terciaria se hace evidente entre los 10 sida hay una elevada incidencia de afectacin ocular, siendo la uveitis anterior y los 25 aos despus de la infeccin primaria. La sfilis cardiovascular aparece la manifestacin ms comn de la infeccin (Tramont, 1995). c o m o consecuencia del debilitamiento de la tnica media, que produce un aneurisma en la aorta ascendente con insuficiencia de las vlvulas articas y estrePian chamiento de la luz de las arterias coronaras. Los gomas sifilticas (es decir, reas de necrosis granulomatosa). cuyo tamao puede variar desde dimensiones El pian (tambin denominado frambesia, parangi, paru. buba o bouba) es una microscpicas hasta tumores de gran tamao, afectan frecuentemente a la piel enfermedad crnica causada por T. pallidum subesp. pertenue. Esta enfermeal sistema esqueltico y a los tejidos mucocutneos. aunque pueden aparecer dad, que ha afligido desde antiguo a las personas que viven en zonas tropicaen cualquier rgano. T a n t o la sfilis cardiovascular como las gomas son mucho les, tiene una prevalencia significativa en reas rurales de paises tropicales con menos frecuentes tras el advenimiento del tratamiento con antibiticos. Por el lluvias intensas. Tras un descenso alrededor de 1 9 5 0 debido a las grandes

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INFECCIONES POR ESPIROQUETAS

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campaas emprendidas para el control de las treponematosis. la incidencia de la frambesia ha vuelto a aumentar en algunas zonas (Engelkens, 1991). La frambesia se contrae durante la niez, antes de los 15 aos, por contacto directo, a travs de desgarros en la piel que permiten la entrada de los treponemas. Las lesiones iniciales aparecen, generalmente, unas tres semanas despus de la inoculacin, por trmino medio. Pueden aparecer ppulas en nmero variable (entre una y varias), con mayor frecuencia en las extremidades inferiores, que seguidamente se ulceran o evolucionan hasta convertirse en lesiones papilomatosas. En estas lesiones existen numerosos treponemas, Es normal que estas lesiones se resuelvan espontneamente; sin embargo, tambin son frecuentes las recadas que esln precedidas por malestar, fiebre y una linfadenopata generalizada seguida de lesiones diseminadas en la piel. Muchos pacientes entran en un periodo de latencia durante el que no hay signos o sntomas clnicos evidentes. En la mayor parte de ellos, la enfermedad no da manifestaciones de ningn tipo; sin embargo, un 10- de los afectados desarrolla frambesia tarda, en la que son patentes las lesiones destructivas e irreversibles en los huesos, cartlagos, tejidos blandos y piel (Engelkens. 1991). Tambin se han descrito lesiones cardiovasculares y en el SNC semejantes a las que se observan en los casos de sfilis (Romn, 1986).

Diagnstico de laboratorio de las treponematosis

Debido a que los agentes etiolgicos de las treponematosis humanas no pueden aislarse por las tcnicas habituales de cultivo microbiolgico. su deteccin se lleva a cabo mediante visualizacin directa de los microorganismos en los especmenes procedentes de las lesiones o de forma indirecta por mtodos inmunolgicos. Cada fase de las treponematosis requiere una modalidad particular de prueba. En las fases tempranas, cuando las lesiones estn presentes, se utiliza la microscopa directamente. En las fases tardas, se emplean las tcnicas serolgicas. Para el escrutinio preliminar se utilizan pruebas no especficas basadas en la deteccin de anticuerpos no treponmicos, mientras que la confirmacin del diagnstico se lleva a cabo con mtodos que detedan anticuerpos treponmicos especficos. Es importante tener presente que ninguna de estas pruebas de laboratorio comnmente utilizadas es capaz de distinguir entre especies que estn intimamente relacionadas y las subespecies de los Ireponemas patgenos, por lo que la diferenciacin debe establecerse basndose en las evidencias clnicas y epidemiolgicas. Microscopa de campo oscuro. Cuando es posible obtener una muestra directamente de las lesiones, como sucede en las fases pnmaria y secundaria de la sfilis, asi como en la fase temprana de la sfilis congmta (chancros, placas mucosas, condiloma lata), la lesin debe limpiarse primero con agua estril (sin jabn o antispticos) y a continuacin debe realizarse sobre la m i s m a una suave abrasin. Seguidamente se aplica presin en la base de la lesin para oblener un exudado seroso que se acumula en sta. Una gota de ese exudado se coloca en un portaobjetos y se deposita encima un cubreobjetos. La muestra debe examinarse inmediatamente, puesto que la visualizacin de la movilidad caracterstica de los treponemas es un requisito necesano para la identificacin definitiva. Debido a su extrema delgadez, los treponemas no pueden observarse mediante la microscopa ptica convencional. Es necesario utilizar la microscopa de campo oscuro, que emplea un condensador que hace que los rayos de luz incidan sobre los Ireponemas en ngulo oblicuo, provocando que la luz salga reflejada de stos, con lo que las bacterias aparecen c o m o objetos brillantes sobre un fondo oscuro. El examen en campo oscuro puede arrojar resultados positivos incluso muchas semanas antes de que una prueba de lipo serolgico sea positiva, y tiene una sensibilidad del 80% para el diagnstico de la sfilis (Larsen. 1995). Debido a que puede haber una posible confusin con los treponemas comensales que existen en la boca, la observacin en c a m p o oscuro no est recomendada en el caso de muestras que se obtengan a partir de lesiones orales. Ademas, existen tres especies de Treponema. son habitantes normales de la regin genital (T. phagedensis. T. refrngeos y T. mmutum). que potencialmente pueden confundirse con I pallidum en un examen con microscopa de campo oscuro. Una limpieza cuidadosa de la zona es importante para reducir las posibilidades de que se produzca esta confusin Microscopa de fluorescencia. Los anticuerpos especficos frente a T. pallidum marcados con FITC (isotiocianato de fluorescena) pueden utilizarse para la deteccin directa de treponemas en las muestras obtenidas de las lesiones, y evitan la necesidad de tener que observar la movilidad de las bacterias. La prueba puede realizarse sobre extensiones secas y lijadas de fluidos lisulares realizadas en un portaobjetos (fluorescencia directa con anticuerpos [DFA-TP]) o sobre secciones de muestras de tejidos incluidas en parafina (fluorescencia directa con anticuerpos sobre tejidos [DFAT-TPJ). Existen anticuerpos monoclonales disponibles comerciaimente, que pueden utilizarse en estas pruebas en lugar de los anticuerpos policlonales procedentes de conejos y seres humanos sifilticos adsorbidos sobre la cepa Reiler de T. pallidum. que han sido empleados hasta ahora y son menos especficos. Cuando se utilizan para examinar exudados y fluidos procedentes de lesiones frescas, ambas tcnicas (DFA-TP y DFAT-TP) tienen una sensibilidad de casi el 100%, comparadas con la tincin de impregnacin argntica de Stiener para la sfilis congmta (Larsen, 1995). Debido a que estas pruebas son especificas para los treponemas patgenos, deben utilizarse para el examen de muestras obtenidas a partir de lesiones en la boca. Mtodos serolgicos no treponmicos. Los ensayos no treponmicos detedan la presencia de anticuerpos que se generan frente a material de naturaleza lipoproteica liberado por las clulas daadas y la cardiolipina de los treponemas (es decir, anticuerpos producidos c o m o consecuencia de la respuesta del sistema inmune del husped frente a lpidos tanto de l m i s m o como de las espiroquetas), y en consecuencia no son especficos de Treponema. De f o r m a

Sfilis endmica
La sfilis endmica (bejel) es una enfermedad crnica no venrea, consecuencia de la infeccin por T. pallidum subesp. endemicum. La enfermedad es antigua y, aunque ya no est tan extendida como lo estuvo en un momento, todava se dan casos en zonas con clima clido y seco de Oriente Medio y frica. La prevalencia de la enfermedad ha experimentado un aumento en la regin africana del Sahel (Engelkens, 1991). La enfermedad se transmite por contado directo con lesiones activas, dedos contaminados y utensilios de comida y bebida. Las condiciones de hacinamiento e higiene escasa son tpicas entre las personas afectadas. La infeccin primara tiene lugar en nios con edades comprendidas entre los 2 y los 15 aos, aunque la enfermedad tambin puede darse en los individuos adultos de la misma familia, y tambin los adultos que no han sufrido la enfermedad durante la niez pueden ser infectados por sus nios. El tamao del inoculo (dosis infectante) es pequeo y las lesiones primarias de la sfilis endmica temprana, que aparecen principalmente en la m u c o s a orofarngea, son, a menudo, inaparentes. Frecuentemente, las manifestaciones clnicas iniciales de la enfermedad aparecen en una segunda fase y consisten en la aparicin de placas mucosas, condiloma lata, estomatitis angular, linfadenopata generalizada y osteoperiostitis dolorosa. Estos sntomas son seguidos por un periodo de latencia de duracin variable. La fase tarda se caraderiza por la destruccin de tejidos en la piel, huesos y cartlagos, de manera preferente en la nariz y el paladar, con afectacin de la laringe en algunas ocasiones.

Pinta
La pinta (carate, mal de pinto, azul) es causada por T. carateum. La enfermedad es endmica en zonas rurales de reas tropicales de Amrica Central y del Sur y ha reaparecido, recientemente, en Mxico y Colombia, dos pases en los que haba sido erradicada desde 1950 (Engelkens, 1991). Los individuos afectados primariamente son los nios con edades por debajo de los cinco aos. Se cree que la inoculacin tiene lugar por contacto no venreo con la piel o mucosas. Es difcil caracterizar la patogenia de la enfermedad, ya que, a diferencia de otras treponematosis que afectan al hombre, no hay modelos animales disponibles y el treponema responsable no puede ser cultivado de forma continua. Como sucede en el caso de otras infecciones por treponemas, tambin existen en la pinta fases temprana y tarda, aunque en esta enfermedad es frecuente que exista un solapamiento entre ellas. Unos dos meses despus de la inoculacin, aparece una ppula primaria o placa en el lugar por donde penetr el microorganismo, que puede ir acompaada o no por una Imladenopatia localizada Esta lesin pnmaria se resuelve y, unos meses o aos ms tarde, aparecen las lesiones secundarias diseminadas, o "pintides", que persisten durante largos periodos o bien se resuelven para volver a reaparecer. En la pinta tarda, las lesiones, que pueden permanecer de por vida, muestran hipopigmentacin, atrofia de la piel, e hiperqueratosis. La piel parece ser el nico rgano afectado por esta enfermedad.

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

colectiva, estas pruebas se conocen con el nombre de pruebas reagnicas. aunque el trmino reagina, aplicado al diagnstico serolgico de la sfilis, parece p o c o afortunado, ya que se puede confundir con los anticuerpos de la clase E (IgE), que tambin reciben el nombre de reaginas. Entre estas pruebas se encuentran el mtodo VDRL (prueba de la reagina en portaobjetos), RPR (prueba rpida de la reagina en plasma con tarjeta circular), USR (prueba de la reagina en suero sin calentar) y TRUST (prueba de la reagina en suero sin calentar con roio de toluidina). Todos estos mtodos utilizan un antigeno fosfolipdico (cardiolipina) reforzado con lecitina y colesterol en partculas coloidales. En todos los casos, la aglutinacin de esas partculas se considera resultado positivo. Puesto que la aglutinacin es el criterio utilizado para determinar la positividad de las pruebas, es prelerible utilizar en todas ellas suero en lugar de plasma; en el caso del mtodo VDRL. el suero debe ser tratado con calor para eliminar reacciones inespecfcas. Para las pruebas RPR y USR. no es necesario someter a la muestra a calentamiento si se aade a la m i s m a cloruro de colina. En el caso de las pruebas VDRL y USR. la reaccin de aglutinacin debe visualizarse microscpic a m e n t e (xlOO aumentos), mientras que la presencia de carbn y de cobrante en los mtodos RPR y TRUST, respectivamente, hacen que la reaccin sea macroscpicamente visible. Los anticuerpos detectados mediante todas estas pruebas aparecen generalmente enlre la primera y cuarta semanas despus de la formacin del chancro primario. Por tanto, el momento en el que la muestra es tomada en la lase primaria puede afectar a la sensibilidad del mtodo. El titulo aumenta, se mantiene elevado durante el primer ao. y luego comienza a disminuir. Las pruebas se negativizan espontneamente en el 25% de los pacientes. Pueden darse resultados tanto falsos negativos como falsos positivos. Los falsos negativos son consecuencia de un ttulo elevado de anticuerpos en el suero (debido al fenmeno de zona) y se dan especialmente en el caso de la sfilis secundaria. Este problema puede solucionarse llevando a cabo una dilucin de la muestra antes de realizar el ensayo. Los resultados falsos positivos pueden darse ocasionalmente en pacientes alectados por ciertas enfermedades agudas como la hepatitis, ciertas infecciones vricas y en mujeres embarazadas o con carcter crnico en el caso de individuos aquejados por enfermedades del tejido conectivo (Larsen 1995). Las pruebas positivas se titulan repitindolas con diluciones dobles senadas de la muestra. Los ttulos se utilizan para determinar la eficacia del tratamiento. Un descenso de cuatro veces en el titulo de anticuerpos al cabo de 12 m e s e s en el caso de la sfilis temprana, as como una disminucin de cuatro veces a los seis meses y de ocho a los 12 en la sfilis tarda, es evidencia de que el tratamiento es adecuado (Romanowski, 1991). Aquellos pacientes tratados durante la fase temprana de la enfermedad tienen ms posibilidades de revertir a negativo que los que son tratados en la sfilis tarda (Brown, 1985; Rumara. 1980). El rastreo de ciertos grupos de poblacin para la deteccin de sfilis implica el empleo de muestras o procedimientos particulares. Por ejemplo, en el caso de la sfilis congenita, el suero de la madre es un espcimen mejor que la sangre del cordn umbilical o del propio neonato, muestras que han sido utilizadas en el pasado (USPHS, 1968). Otro ejemplo lo encontramos en el diagnstico de la neurosfilis. que requiere resultados positivos tanto con las pruebas que detectan anticuerpos treponmicos especficos como con el mtodo VDRL. a partir del liquido cefalorraqudeo. El test VDRL es muy especfico, aunque poco sensible, para el diagnstico de la neurosfilis. Puede dar resultados negativos en un 22% a un 69% de pacientes con neurosfilis activa, y su sensibilidad en el caso de neurosfilis inactiva puede ser tan baja como un 1 0 % (Schmidt, 1980; MacLean, 1996). A pesar de esto, ninguno de los restantes mtodos de tipo no treponmicos tienen utilidad para llevar a cabo la deteccin de esta complicacin tarda de la sfilis y, por otro lado, las pruebas treponmicas adolecen de prdida de sensibilidad, y dan falsos positivos debido al paso de anticuerpos a travs de la barrera hemtica en el cerebro. Se han descrito resultados aberrantes obtenidos con varias tcnicas de tipo no treponmico en el caso de pacientes sifilticos coinfectados con el VIH. incluyendo retrasos en la seroconversion: sin embargo, no es frecuente que en pacientes de sida se observe seronegatividad frente a la sfilis, en el caso de coinfeccin (Flores, 1995). La lasa de resultados falsamente positivos aumenta ligeramente en el caso de pacientes con sida (un 4% frente al 1% en individuos sin sida); sin embargo, al menos un estudio ha asociado el incremento en la tasa de resultados positivos con la adiccin a las drogas por va intravenosa, ms que con la propia infeccin por el VIH (Larsen. 1995; Flores. 1995:

Hernndez-Aguado, 1998). Los falsos negativos tambin aparecen en los pacientes con sida que tienen sfilis concomitante, debido a la respuesta exacerbada de anticuerpos no treponmicos que se produce en algunos sujetos, con el consiguiente efecto de zona (Gourevitch, 1993). Adems, el ttulo d e anticuerpos no treponmicos no disminuye en algunos pacientes de sida con sfilis a pesar del tratamiento, aunque algunos autores piensan que esto est ms relacionado con la fase de la enfermedad en la que se inici el tratamiento que con la infeccin por el VIH, puesto que un comportamiento parecido se ha observado tambin en enfermos sin sida (Larsen. 1995). Mtodos serolgicos treponmicos. Estos mtodos detectan la presencia de anticuerpos frente a antgenos treponmicos y se utilizan para ratificar los resultados positivos obtenidos mediante las pruebas de tipo no treponmico, o para confirmar la infeccin en el supuesto de un resultado negativo con estas ltimas en las fases tarda o de latencia de la enfermedad, lo que puede suceder en un 30% de pacientes con sfilis terciaria (Larsen, 1995). El test de absorcin con anticuerpos treponmicos fluorescentes (FTA-ABS). una de las dos tcnicas estndar treponmicas especificas, es una prueba d e inmunofluorescencia indirecta. Se lleva a cabo con suero del paciente calentado y absorbido sobre antigenos de la cepa Reiter no patgena para eliminar los anticuerpos que produzcan reactividad cruzada, que se deposita sobre un portaobjetos sobre el que previamente se han fijado clulas de la cepa Nichols de T. pallidum subesp. pallidum, aadindose linalmente anticuerpos trente a inmunoglobulinas humanas marcados con isotiocianato de fluoresceina (FITC). L a observacin de treponemas visibles bajo microscopa de fluorescencia indica la existencia de anticuerpos frente a los treponemas patgenos en el suero del paciente. El segundo mtodo, que es preferido en m u c h o s laboratorios debido a su relativa sencillez de ejecucin, es el de la microhemoaglulinacin con Treponema pallidum (MHA-TP). En este caso, el suero absorbido se mezcla con eritrocitos de oveja sensibilizados con 7! pallidum (cepa Nichols), mediante sonicacin en una placa de microtitulacin. Si el suero contiene anticuerpos se observar la aglutinacin de los glbulos rojos. En general, ambos procedimientos (FTA-ABS y MHA-TP) son equivalentes excepto en la lase pnmana de la sfilis, en la que la prueba FTA-ABS muestra una mayor sensibilidad (Augenbraun. 1998: Han, 1980). En la Tabla 52-1 se muestran los valores de sensibilidad y especificidad de las diferentes tcnicas de tipo no treponmico y treponmico (Larsen, 1995). Los anticuerpos treponmicos especficos aparecen durante la sfilis primaria y pueden seguir detectndose durante toda la vida del individuo con independencia del tratamiento, aunque hay excepciones. Los pacientes con sida muestran una mayor tendencia a convertirse en seronegativos tras la terapia antimicrobiana (Haas, 1990). La prueba FTA-ABS es la primera en dar resultados positivos, seguida por la MHA-TP y. linalmente. por los mtodos no treponmicos, un poco despus. Los mtodos treponmicos no se utilizan para el escrutinio en el entorno clnico, puesto que aproximadamente un 1% de la poblacin puede dar resultados lalsamente positivos con los mismos. Los falsos positivos con la tcnica FTA-ABS se detectan entre los ancianos, las personas con enfermedades del tejido conectivo y en individuos intectados con bacterias relacionadas con los treponemas, como las especies del gnero Borrelia (Larsen, 1995). La frecuencia de falsos positivos con el mtodo MHATabla 52-1 Sensibilidad d e los m t o d o s serolgicos para el diagnstico de la sfilis en las diferentes fases de la e n f e r m e d a d ' Fase de la sfilis Prueba VDRI RPR FTA-ABS MHA-TP Primaria 78(74-87) 86(77-100) 84(70-100) 76(69-90) Secundaria 100 100 100 100 Latente 95 (88-100) 98(95-100) 100 97(97-100) Tarda 71(37-94) 73 96 94

* Valores de sensibilidad expiesados como porcentajes. Los nmeros entro parntesis representan los rangos de los valores de sensibilidad en los esludios llevados a cabo en el Center loi Diseasc Control and Prevention VORI = Vcncreal Disease Research Laboralory. RPR = prueba rpida de la reagina; FTA-ABS = test de absorcin con anticuerpos treponmicos lluorescenles; MHA-TP ensayo de microhemoaglutinacion para anticuerpos frente a Treponema pallidum. Datos lomados de Larson SA, y cois Laboralory diagnosis and inrerprealion ol tests lor syphilis Clin Microbio! Rev 1995; 8:1

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INFECCIONES POR ESPIROQUETAS

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TP es menor que la que se encuentra cuando se emplea la inmunofluorescencia indirecta (FTA-ABS) (Larsen, 1995). Los ensayos de inmunoadsorcin acoplados a enzimas (ELISA), que utilizan antigenos treponmicos especficos, han comenzado a estar disponibles para su empleo en los labratenos clnicos. Ofrecen las ventajas de tener un formato que facilita la manipulacin de un gran numero de muestras y una interpretacin objetiva de los resultados. La sensibilidad y la especificidad de los mtodos comerciales actualmente disponibles son comparables a las tcnicas FTA-ABS y MHATP (Norgard, 1993: Lefevre. 1990). Estos mtodos han sido utilizados para el escrutinio en situaciones especificas, como las de los donantes de sangre, y, junto con los mtodos de tipo no treponmico, en los laboratorios que procesan un gran volumen de muestras en reas donde existe poblacin con una alta prevalencia (Aberle-Grasse. 1999: Reisner, 1997). Los enzimommunoensayos (EIA) que utilizan antigenos no treponmicos y los procedimientos especficos para la deteccin de IgM tambin estn disponibles para el rastreo y el diagnstico de la sfilis congnita, respectivamente (Hcoper. 1994: Stoll. 1993). Los mtodos moleculares, como la transferencia o Western btot (WB) y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). estn disponibles en algunos laboratorios de referencia. El WB est recomendado para el diagnstico de la sfilis congnita (Larsen, 1995). El uso de la PCR ha sido apoyado en el caso del diagnstico de la neuroslilis, en especial en los pacientes con sida, aunque los esludios realizados no han demostrado que existan ventajas sustanciales sobre los mtodos utilizados habitualmenle (Marra, 1995).

gnero pueden cultivarse utilizando un medio especifico para el aislamiento de las mismas que contenga antibiticos y condiciones de incubacin d e anaerobiosis estricta (Smibert. 1993) Las PROS no han podido cultivarse m vilro. L a deteccin se lleva a cabo con anticuerpos monoclonales contra T. pallidum. frente a los cuales estas bacterias exhiben reactividad cruzada.

LEPTOSPIROSIS
Descripcin. El gnero Leptospira incluye 11 genoespecies. siete de las cuales son patgenas, y ms de 250 serovares (Gravekamp, 1993; de Caballero. 1994). Anteriormente, el gnero estaba formado por tres especies: L, interrogans (patgena), con 23 serogrupos y ms de 200 serotipos, L. bitlexa y L. parva (ambas no patgenas). Las leptospiras son espiroquetas con las vueltas de hlice muy apretadas y con los extremos curvados, que tienen un grosor de 0.1 jim y entre 6 um y 20 um de longitud y que exhiben movilidad giratoria. Pueden sobrevivir en aguas dulces con pH alcalino, pero mueren en aguas saladas o con pH cido y como consecuencia de la desecacin. Epidemiologa. La leptospirosis es una zoonosis con dislnbucin mundial. Algunos serotipos se encuentran preferentemente en determinadas zonas geogrficas. Muchos roedores, asi c o m o otros animales tanto salvajes c o m o domsticos, son portadores de estos microorganismos: en cualquier caso, las ratas son el reservorio ms frecuente, representando una importante fuente de infeccin para el hombre. La forma ms frecuente de infeccin es por contacto con a g u a contaminada con orina, lo que permite la entrada del microorganismo a travs de heridas en la piel o directamente por las membranas mucosas. Algunas personas tienen un mayor nesgo de infeccin debido a su profesin (mineros, granjeros y agricultores, veterinarios, trabajadores de piscifactoras, empleados de plantas de depuracin de aguas residuales) o a la prctica de ciertas actividades de recreo (por acampar en zonas prximas a cursos de agua infectados o p o r baarse en los mismos). En EE.UU. se declaran entre 40 y 120 casos al ao, aunque muy probablemente el nmero sea superior (Farr. 1995). Patologa y patogenia. Tras penetrar en el torrente circulatorio, las bacterias se diseminan por localizaciones muy diversas del cuerpo, incluyendo el SNC y los ojos. Como consecuencia de las lesiones en el endotelio de los tejidos infectados se produce isquemia local y hemorragias. Tambin pueden observarse daos hepatocelulares y en los tbulos renales. El hgado puede tener un color amarillo-verdoso caracterstico, aunque los cambios histolgicos detectados son inespecificos. incluyendo degeneracin (redondeamiento o "balonizacin"). cuerpos de inclusin acidlilos. regeneracin y colestasis. pudiendo encontrarse las leptospiras en aproximadamente un 25% de los casos (Dooley, 1976). El rion muestra nefritis crnica intersticial, necrosis de los tbulos proximales y cilindros granulares o hialinos, con leptospiras mtratubulares en un 65% de los casos (Arean, 1962). Tambin se han observado casos de miocarditis, meningitis/encefalitis y miositis (Arean, 1962). Los mecanismos responsables de los daos endoteliales. hepticos y renales son desconocidos, aunque podran tener una base inmunolgica. Clnica. Tpicamente, la infeccin por leptospiras se manifiesta c o m o una enfermedad suave parecida a la gripe (forma anictrica); una minora de afectados sufre una forma ms grave de la enfermedad con ictericia, que tiene u n a tasa de mortalidad del 5% al 10% (forma ictrica o enfermedad de Weil). La leptospirosis es una enfermedad bifsica, que comienza tras un periodo de incubacin variable (entre 2 y 20 das), con la aparicin brusca de escalofros, fiebre, dolor de cabeza, mialgias, dolor en la espalda y el abdomen, anorexia. nauseas y vmitos. Durante esta fase, denominada fase bacterimica, tiene lugar una extensa diseminacin de la bacteria por el cuerpo. La fase bacterimica dura entre cuatro y siete das y es seguida por un corto periodo (varios das) durante el que los sntomas remiten, tras el que viene la fase de respuesta inmunolgica caracterizada por la aparicin de anticuerpos frente al microorganismo, meningitis, uvetis, sarpullido y dao heptico y renal. La erupcin pretibial se ha asociado con la infeccin por el serovar autumnalis (fiebre de Fort Bragg). En muchos casos, la fase inmunolgica es suave y dura entre uno y tres das solamente. Alrededor de la mitad de los pacientes muestran sntomas clnicos de meningitis y pleocitosis en el lquido cefalonaqudeo durante la segunda semana de la enfermedad. En el pequeo porcentaje de pacientes con enfermedad de Weil, las dos fases se fusionan, teniendo los afectados fiebre elevada persistente, ictericia y hemorragias, a lo que sigue fallo renal oligrico, shock y miocarditis. (Arean. 1962; Edwards. 1960).

Tratamiento de las treponematosis

Las subespecies de T. pallidum y 7! carateum son uniformemente susceptibles a la penicilina y otros antibiticos [i-lactmicos. El tratamiento de la sfilis primaria, secundaria y de la sfilis latente temprana consiste en una nica inyeccin intramuscular de penicilina G-benzatina. La frambesia, la pinta y la sfilis endmica se tratan con el mismo antibitico, aunque con una dosis ms baja (Engelkens, 1991). Los contactos en el mbito familiar con pacientes afectados por estas tres ltimas enfermedades se tratan de igual forma. En el caso de personas alrgicas a la penicilina, se puede utilizar doxiciclina o tetracilina. Los macrlidos ya no estn recomendados para el tratamiento, puesto que se ha observado que su eficacia es inferior al 90% (Schroeler, 1972). Para la sfilis latente tarda o sfilis de duracin desconocida se administran dosis mltiples de penicilina G-benzatina. En el caso de la frambesia, la pinta o la sfilis endmica, la fase en la que se encuentra la enfermedad no afecta al tratamiento (Engelkens. 1991). Para el tratamiento de la neuroslihs y la sfilis congnita se administran por via intravenosa dosis elevadas de penicilina G en solucin acuosa. El CDC de Atlanta no recomienda cambio alguno en las pautas de tratamiento establecidas en los pacientes con sida y sfilis concomitantes: sin embargo, otros autores sugieren que estos pacientes deberan ser tratados con dosis elevadas de penicilina, incluso para el tratamiento de la sfilis en fase primaria, dada la propensin que tienen los mismos para desarrollar neurosfilis (Tramonl. 1995; Musher, 1991).

GINGIVITIS ULCERATIVA Y PERIODONTITIS CRNICA

Descripcin. Un cierto nmero de espiroquetas no caracterizadas (espiroquetas relacionadas con patologa oral [PROS]) y algunas especies del gnero Treponema (entre ellas, como ms comunes. T denticola y T. socranskr) han sido aisladas cada vez con mayor frecuencia y en nmero elevado de las encas de los pacientes con gingivitis ulcerativa y periodontitis crnica, en comparacin con lo que se observa en el caso de individuos con las encas sanas (Riviere, 1991,1995,1996). Patogenia. No ha podido establecerse una relacin causa-efecto definitiva entre las espiroquetas y estas enfermedades; sin embargo, su presencia en nmero significativo solamente en el tejido enfermo sugiere que estas bacterias pueden jugar un papel como agentes responsables de la gingivitis/periodontitis Adems, las PROS han mostrado reactividad cruzada con anticuerpos monoclonales frente a T. pallidum y. al igual que esta especie, tienen la capacidad de invadir las encias y el tejido de la pared peritoneal en ratones in vitro (Riviere, 1991,1996). Otras espiroquetas orales no poseen estas caractersticas Diagnstico. Del mismo modo que las especies comensales del gnero Treponema que se encuentran en la zona genital, las especies orales de este

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Diagnstico de laboratorio. Las leptospiras pueden aislarse a partir de LCR. sangre y tejidos al principio de la fase bacterimica (primeros 10 das), y de la orina durante la fase inmunolgica (segunda semana y hasta los 30 dias). Para el cultivo es necesario un medio semislido (medio de Fletcher o medio de Ellmghausen, McCullough, Johnson, Harris [EMJH]). que se incuba en la oscuridad a 25C-30"C entre cuatro y seis semanas. La orina debe ser alcalinizada si no va a ser procesada inmediatamente. Las leptospiras crecen entre 1 cm y 3 cm por debajo de la superficie del medio, y pueden producir una zona de crecimiento en forma de disco lineal. Las muestras recogidas con periodicidad semanal de esa localizacin de los medios de cultivo deben examinarse mediante microscopa de campo oscuro para detectar las leptospiras con su movimiento giratorio y los extremos curvados. Los anticuerpos aglutinantes aparecen durante la primera semana de la enfermedad, alcanzan un mximo entre la tercera y cuarta semana y pueden persistir durante aos. Los anticuerpos pueden detectarse por medio de aglutinacin en tubo, microaglutinacin en portaobjetos, hemoaglutinacin o enzimoinmunoensayo (EIA), con antigenos bacterianos. La tcnica de la microaglutinacin utiliza bacterias vivas como suspensin antignica, emplendose fundamentalmente en la investigacin bsica. La PCR se ha usado para detectar el ADN de las leptospiras en pacientes infectados (Vinetz, 1996). Recientemente se ha utilizado con xito un test de EIA modificado (en forma de bastoncillo que se sumerge en la muestra de suero) que detecta anticuerpos especficos frente a Leptospira en situaciones en las que existe una infraestructura de laboratorio minima (Yersin, 1999: Gussenhoven, 1997). Tratamiento. La torma grave de la enfermedad necesita tratamiento por va intravenosa con penicilina G o ampicilina en solucin acuosa, mientras que la forma menos grave puede tratarse por va oral con ampicilina. amoxicilma o doxicilina. La profilaxis con doxicilina suministra proteccin a las personas que se encuentran en ambientes en los que hay riesgo elevado de exposicin a las bacterias (Farr, 1995). L a vacunacin de los animales domsticos y mascotas ha reducido el riesgo de infeccin a partir de estos animales en los individuos pertenecientes a los grupos de riesgo, como veterinarios y granjeros. De todas lormas, el riesgo no se elimina totalmente, ya que se han detectado casos de infeccin en animales inmunizados a partir de los que se ha transmitido la inteccin a humanos (Feign. 1973).

nefritis (Washburn. 1995). La mortalidad antes del advenimiento de los antibiticos oscilaba entre el 6% y el 10% (Washburn, 1995). Diagnstico de laboratorio. S minus slo puede cultivarse en animales (ratones o cobayas) mediante inoculacin intraperitoneal de los mismos. La presencia de los microorganismos puede ponerse de manifiesto mediante tincin de extensiones de los exudados procedentes de las lesiones o los ganglios linfticos, por el mtodo de Wright-Giemsa o mediante observacin en fresco bajo microscopa de campo oscuro. No existen mtodos serolgicos para el diagnstico, aunque hasta un 50% de los pacientes pueden dar un falso positivo con los mtodos no treponmicos para el diagnstico de la sfilis (Taber. 1979). Tratamiento. L a penicilina G en solucin acuosa, administrada por va intravenosa, es el antibitico de eleccin. La tetraciclina es la alternativa en el caso de pacientes con alergia a la penicilina.

ANAEROBIOSPIRILLUMSUCCINICIPRODUCENS
Descripcin. Anaerobiospihllum succiniciproducens es una bacteria gramnegativa, espiriforme, que tiene un grosor de entre 0,6 pm y 0,8 pm y entre 4 pm y 8 um de longitud. Exhibe una movilidad semejante a la de un sacacorchos al penetrar en el tapn y posee flagelos multitricos en ambos polos del soma bacteriano. Epidemiologa. Esta bacteria anaerobia puede lormar parte de la microbiota comensal normal de gatos y perros sanos, habindose sugerido (aunque no se ha podido demostrar de forma definitiva) una asociacin entre la enfermedad en humanos y el contacto con estas mascotas (Goddard, 1998; Malnick, 1990). A. succiniciproducens se h a asociado con una enfermedad diarreica en pacientes normales y con septicemia en individuos con u n a enfermedad de base que predisponga. Se piensa que el microorganismo penetra en el torrente circulatorio a partir del tracto gastrointestinal de estas personas (Tee. 1998; McNeil. 1987). La incidencia de la infeccin es ba|a. aunque se ha ido incrementando en los ltimos aos, debido probablemente a la mejora de las tcnicas de deteccin mediante cultivo (Goddard, 1998). Clnica. Los pacientes con gastroenteritis sufren dolor abdominal, vmitos, y diarrea durante un tiempo que oscila entre tres y siete das; aquellos que no tienen enlermedad subyacente alguna se recuperan sin mayor problema (Malnick. 1990). Los casos de septicemia se dan entre individuos con patologas subyacentes, tales como alcoholismo, ateroesclerosis. tumores, diabetes mellitus y gingivitis (Goddard, 1998). Hasta un tercio de los afectados por la septicemia fallecen. Diagnstico de laboratorio. A. succiniciproducens crece bien en los sistemas automatizados para hemocultivo (Tee, 1998). Tras el subcultivo en agar chocolate o agar sangre aparecen las colonias al cabo de 2-3 das, que tienen un aspecto hmedo y miden entre 1 m my2m m de dimetro. Algunas caractersticas bioqumicas de utilidad para la identificacin son la ausencia de catalasa, indol y oxidasa, la produccin de cido succinico y cido actico a partir de la glucosa (puesta de manifiesto mediante cromatografa de gas-liquido) y la ausencia de crecimiento a 25'C o 42"C. Existe un medio selectivo para esta bacteria desarrollado por Malnick y sus colaboradores (Malnick, 1990). Tratamiento. Debido a la naturaleza poco comn de esta infeccin, an no se ha establecido una terapia ptima para el tratamiento de la septicemia. In vilro. la mayor parte de los aislamientos estudiados son sensibles a la carbenicilina, cefoxitina. cloranfenicol y metronidazol y resistentes a la vancomicina y clindamicina; sin embargo, los ensayos han tenido carcter limitado y no han sido estandarizados (Sales, 1982; McNeil, 1987).

FIEBRE POR MORDEDURA DE RATA

Descripcin. Spihllum minus es una bacteria gramnegativa, con las vueltas de espira m u y juntas, que tienen un grosor de 0,5 um y entre 2 pm y 5 pm de longitud, y que posee penachos de flagelos bipolares. Epidemiologa. L a infeccin por S. minus en el hombre causa una fiebre recurrente denominada sodoku. muchos de cuyos casos se han descnlo en Japn, aunque tambin se han detectado en otras partes del mundo, con una distribucin muy amplia. Esta bacteria forma parte de la microbiota del tracto respiratorio de las ratas y se transmite por una mordedura. La ingestin no parece ser una causa de infeccin en el ser humano La enfermedad es muy rara en EE.UU. Las personas que trabajan en los laboratonos de investigacin son uno de los grupos de riesgo para contraer la infeccin (Anderson. 1983). Patogenia y patologa. La patogenia de S. minus es poco conocida L a diseminacin de las bacterias tiene lugar muy poco tiempo despus de la inoculacin. Las pocas autopsias realizadas de los casos mortales han descrito necrosis epitelial y un infiltrado mononuclear en la dermis en el lugar de la mordedura original, un infiltrado mononuclear perivascular en la dermis en la zona de la erupcin cutnea, hiperplasia de los ganglios linfticos y necrosis en el hgado, bazo, rion, miocardio y meninges (Washburn. 1995). Clnica. La herida de la mordedura cicatriza micialmente. pero entre una y cuatro semanas ms tarde aparece una lesin indurada, que puede ulcerarse eventualmente, en el mismo lugar. El paciente sufre perodos febriles recurrentes separados por fases no febriles que duran entre tres y siete das. La fiebre puede estar acompaada de mialgia. dolor de cabeza y vmitos. La mitad de los pacientes tienen una erupcin macular que puede formar grandes placas (Taber, 1979). Los sntomas desaparecen, generalmente, en un tiempo que oscila entre tres y ocho semanas, aunque pueden producirse recadas y complicaciones como endocarditis, meningitis, micocarditis y

ESPIROQUETOSIS INTESTINAL
Descripcin. Se han encontrado dos especies de espiroquetas en el colon de los seres humanos: Serpulma pilosicoliy Brachyspira aalborgi. Estos microorganismos son gramnegativos, con unas dimensiones que oscilan entre 0,2 pm y 0.4 pm (dimetro) y 4 pm y 8 pm (longitud). Cerca de cada polo de las bacterias, en posicin subterminal. hay entre 4 y 6 flagelos. Epidemiologa y clnica. S. pilosicoli provoca la espiroquetosis intestinal porcina, una enlermedad de tipo diarreico que aleda a los cerdos jvenes, y tambin se han recuperado cepas relacionadas con esta especie a partir de

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INFECCIONES POR ESPIROQUETAS

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perros y otros animales (Trott, 1996). No se sabe si los animales actan como reservnos en el caso de la infeccin en humanos. 8. aalborgi est peor caracterizada. El gnero contiene esta nica especie, que fue denominada tras su aislamiento del colon de un paciente humano (Hovmd-Hougen. 1982). La asociacin de las espiroquetas intestinales con la infeccin no est totalmente establecida, ya que las bacterias han sido identificadas en individuos tanto sintomticos como asintomticos. Parece que existe una mayor prevalencia en varones homosexuales que en otros grupos de poblacin (Teglbjaerg, 1990). Los sntomas atribuidos a la espiroquetosis intestinal son diarrea, dolor abdominal y sangrado y descargas rectales (Teglb|aerg, 1990). Adems. S. pilosicolise ha aislado de la sangre de pacientes crticos, aunque el significado de este hallazgo no est claro (Trott, 1997). Patologa y patogenia. Las espiroquetas se pueden observar fcilmente en los especmenes obtenidos mediante biopsia, ya que torman una franja de color azul oscuro en la superficie de las clulas epiteliales del colon, sin afectar a las clulas en copa o globosas. Los mtodos de impregnacin argntica tambin permiten una perfecta vsualizacin de los microorganismos. Las clulas epiteliales aparecen normales y no se detecta un incremento de la inflamacin en la lmina propia. La microscopa electrnica revela que las bacterias se adhieren a la superficie del extremo superior de las clulas epiteliales del colon, quedando orientadas perpendicularmente hacia el lumen intestinal (Teglbjaerg, 1990). Se ha demostrado la invasin de los macrfagos epiteliales y de la mucosa en individuos tanto sintomticos como asintomticos (Teglbjaerg, 1990). No se ha establecido la patogenia. Diagnstico de laboratorio. Las espiroquetas pueden detectarse en las heces mediante microscopa de campo oscuro y cultivarse a partir de las muestras de heces o de tejidos (obtenidas por biopsia) en agar tripticasa de soja con un 5%-10% de sangre de caballo o de ternero. La adicin de espectinomicina y polimixina B confieren carcter selectivo al medio (Teglbjaerg, 1990). En los medios incubados anaerbicamente las colonias son puntiformes y dbilmente [{-hemoliticas, y aparecen en un perodo de tiempo que va desde los tres das hasta las cuatro semanas, dependiendo de la cepa. Tratamiento. Aunque se han publicado los datos relativos a la sensibilidad a los antimicrobianos para la especie tipo de S. pilosicoli, no se han descrito ensayos estandarizados para un nmero elevado de aislamientos (Trott, 1996). Los pacientes con sntomas de padecer espiroquetosis intestinal responden al tratamiento con metronidazol (Teglbjaerg, 1990).

dad clnica diferente, localizando su origen en u n a garrapata intimamente emparentada, /. dammini, que ahora se denomina /. scapularis (Steere, 1978). En 1982, Burgdorfer y sus colaboradores aislaron la espiroqueta que lleva su nombre (Borrelia burgdorferi) a partir de Ixodes dammini. recogida en Shelter Island (estado de Nueva York), asocindola con la enfermedad de L y m e en base a las evidencias de tipo inmunolgico (Burgdorfer. 1986: Steere. 1983). En el periodo siguiente, este microorganismo fue aislado a partir de sangre (Steere, 1983: Benach, 1983: Berger, 1994; Nadelman, 1990), piel (Berger, 1992), liquido sinovial (Schmidli. 1998), iris (Preac-Mursic, 1993), miocardio (Stanek, 1990) y LCR (Steere. 1983; Schmidli. 1998 de pacientes detectndose respuesta inmune mediada por anticuerpos tanto del tipo igM como IgG. Hoy da. la enfermedad de Lyme esla reconocida como la infeccin transmitida por vector ms frecuente en EE.UU.. siendo detectados ms de 16.000 casos de la misma en el ao 1996 (CDC, 1997).

Epidemiologa y patogenia
El agente causal de la enfermedad de Lyme, Borrelia burgdorferi. h a sido caracterizado minuciosamente y subdividido desde el punto de vista filogentico en diferentes genoespecies. Actualmente, tres de estas especies estn asociadas a la enfermedad de Lyme: 8. burgdorferi en sentido estncto (de distnbucin mundial). 8. gariniiy B. atzelii (ambas asociadas con la infeccin en el continente euroasitico). Cada una de estas especies se ha relacionado, asimismo, con determinadas manifestaciones clnicas de la enfermedad de L y m e (vase al final de esta seccin bajo el epgrafe Manifestaciones clnicas), aunque no est claro si estas diferencias se deben a las propias espiroquetas o a otros factores (Berglund. 1995; Postic. 1996; van Dam. 1993) L a presencia de 8. burgdorfenen Amrica del Norte est documentada, al menos en los ltimos 100 aos, mediante la tcnica de la PCR aplicada al estudio de especmenes de museo de garrapatas del gnero Ixodes y de ratones de pala blanca (Persing. 1990: Marshall. 1994), Algunos estudios que han puesto de manifiesto la heterogeneidad gentica de los aislamientos de 8. burgdorfenen EE.UU. (Mathiesen. 1997), apuntan tambin hacia la presencia de este microorganismo en la zona desde muy antiguo. Se han aislado espiroquetas identificadas c o m o 8. burgdorferi a partir de roedores y garrapatas en muchas reas no endmicas de EE.UU. Estos aislamientos muestran, a menudo, un nivel sustancial de heterogeneidad gentica, y algunos de ellos parecen ser genoespecies nicas de 8. burgdorferi sensu lato. El ciclo enzotico vital de Borrelia va en paralelo con el ciclo vital del insecto vector, que son los miembros del compleio Ixodes ricinus. Las garrapatas adquieren las espiroquetas tpicamente durante la fase larvaria de desarrollo, mientras se alimentan de un animal infectado que acta como reservorio de la bacteria. Las espiroquetas se encuentran en el intestino medio de la garrapata y son transmitidas a travs de la saliva de sta mientras se alimenta en las sucesivas fases de desarrollo, estando implicada la lase de ninfa en la mayor parte de casos de transmisin a humanos a partir de las garrapatas. En el este, medio oeste y sur de EE.UU.. 8. burgdorferi es transmitida al hombre principalmente por la mordedura de la garrapata del ciervo, que es responsable de la mayor parte de los casos que se detectan entre mayo y agosto. Ixodes paciticus es el insecto vector a lo largo de la costa oeste de EE.UU. (Dennis, 1998). Otras garrapatas pertenecientes al complejo /. ricinus son las que transmiten la bacteria en Europa, mientras que en China /. persulcatus es la garrapata que est implicada en el proceso (Anderson, 1993). Adems de la transmisin por la mordedura de la garrapata, las espiroquetas adquiridas durante el embarazo pueden atravesar la placenta causando, aparentemente, infeccin congnita (MacDonald, 1989). En la naturaleza, la infeccin por 8. burgdorferi se mantiene por transmisin honzontal desde las ninfas infectadas de la garrapata hasta el vertebrado hospedador. Aunque el reservorio animal primario de 8 burgdorfen en Norteamrica es el ratn de patas blancas, Peromyscus leucopus, m u c h o s otros mamferos y pjaros pueden albergar, y en consecuencia transmitir estas espiroquetas mediante una garrapata vector (Anderson, 1993: Gern, 1998) Diferentes animales, incluyendo varias especies de pjaros, mamferos y reptiles, pueden actuar c o m o huspedes para las especies de Ixodes. Muchas de estas especies anmales no son competentes para servir como reservorio de las espiroquetas del gnero Borrelia: sin embargo, un aumento en la poblacin de aqullas puede ocasionar, subsiguientemente, un aumento en la prevalencia de las garrapatas, lo que indirectamente puede ocasionar un incremento en la incidencia en la transmisin de la enfermedad. Se cree que este ltimo escenario explicara, al

DIAGNSTICO Y CONTROL DE LAS INFECCIONES POR BORRELIAS

Las especies del gnero Borrelia son bacterias helicoidales, microaerfilas, con unas dimensiones que oscilan entre 0,2 um y 0,5 um (dimetro) y 5 um y 25 um (longitud), y que presentan entre 4 y 30 vueltas de hlice. Poseen una envoltura externa o membrana que rodea el cilindro protoplsmico en espiral, formado por la capa de peptidoglucano y la membrana plasmtica que engloba al contenido citoplasmtico de la clula. Entre 7 y 22 filamentos axiales (flagelos periplsmicos) son responsables de la movilidad de estas bacterias. Estos microorganismos se multiplican por escisin binaria y necesitan cidos grasos de cadena larga para poder crecer. En esta seccin se describe a Borrelia burgdorferi, el agente etiolgico de la enfermedad de Lyme, asi como otras especies de Borrelia relacionadas con la fiebre recurrente.

Enfermedad de Lyme
La enfermedad de Lyme es una enfermedad inflamatoria multisistmica que se transmite por las garrapatas y que puede aparecer a cualquier edad en ambos sexos (Steere, 1997,1989). Su manifestacin clnica ms distintiva es una lesin expansiva de la piel, el eritema migrans (EM), que puede ser seguido, semanas o meses ms tarde, por la aparicin de problemas neurolgicos, cardacos o en las articulaciones. Las lesiones del tipo EM lueron ya descritas en Europa en 1910 por Arvid Afzelius (Afzelius, 1910). que asoci su aparicin con la mordedura de la garrapata Ixodes reduvius. La mordedura de esta garrapata (o la de la especie relacionada, /. ricinus) fue asociada ms tarde con la meningopolineuritis transmitida por garrapatas (sndrome de Garin-Bujadoux y Bannwarth). Sin embargo, no fue hasta mediados de la dcada de los 70 cuando Steere y sus colaboradores identificaron la enfermedad como una enti-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

menos en parle, el aumento de casos registrados de la enfermedad de L y m e en el nordeste de EE.UU., donde el ciervo de cola blanca parece ser el husped primario de /. scapularis. Durante los ltimos aos se han hecho avances significativos en el conocimiento del ciclo de transmisin de la espiroqueta, que ha sido reconocida como un importante problema de salud pblica. Aunque muchos aspectos de la enlermedad son todava confusos, se han puesto de manifiesto aspectos clave sobre su patogenicidad. Tal como se ha descrito en recientes revisiones (Sigal, 1997a, 1997; Hu, 1997b; Garca-Moneo, 1997), la patogenia de la enfermedad de L y m e podra estar relacionada tanto con los efectos directos causados por el microorganismo como con efectos indirectos derivados de la respuesta del sistema inmunitario del hospedador. Las bacterias son inoculadas en la dermis por la mordedura de la garrapata y se diseminan hematgenamente a continuacin, unindose a diferentes tipos de clulas a travs de distintas clases de receptores de la superficie celular. Aunque todava quedan muchos aspectos por elucidar, parece que durante la fase inicial de la infeccin existe tanto una respuesta ineficaz de los fagocitos como una respuesta inmunoblstica en la que estn implicados componentes humorales y celulares (Hu, 1997). La liberacin de citocinas durante esta respuesta puede ser responsable, al menos en parte, de algunas de las manifestaciones clnicas de la forma aguda de la enlermedad de Lyme. Tambin es posible que se activen respuestas autoinmunes que podran dar lugar a la forma crnica de la enfermedad, que es menos frecuente y no responde al tratamiento con antibiticos.

miento con antibiticos (Steere, 1987,1995). Las manifestaciones neurolgicas crnicas como la encefalopata, la polineuropata o la leucoencefalitis pueden aparecer al cabo de meses o incluso aos despus de la infeccin inicial (Logigian, 1990). La acrodermatitis crnica atrfica (AC), una lesin cutnea atrfica que contiene espiroquetas de B. burgdorteri (Steere. 1989), ha sido detectada en pacientes al cabo de 10 aos despus del inicio de la enfermedad. Al igual que el linfocitoma por borrelia anteriormente comentado, la AC parece afectar exclusivamente a pacientes europeos (Asbrink, 1986). Varios autores han indicado la existencia de diferencias geogrficas en lo que respecta al espectro clnico tpico de la borreliosis de L y m e (Nadelman, 1998). En concreto, los sntomas sistmicos agudos, as como la evidencia tarda de artritis, se observan con mayor frecuencia en los casos de Norteamrica. Los sntomas neurolgicos y las lesiones cutneas tardas descritas en el prrafo precedente se detectan ms frecuentemente en pacientes europeos. Estas diferencias en las manifestaciones clnicas se han correlacionado con las diferentes especies de Borrelia que tienen prevalencia en los continentes de Amrica del Norte y Eurasia (van Dam. 1993; Balmelli, 1995). Sin embargo, la localizacin anatmica de la mordedura de la garrapata puede tener tambin consecuencias en la afectacin de rganos especficos; as, por ejemplo, la mordedura en zonas alrededor de la cabeza y del cuello se asocia frecuentemente con enfermedad a nivel del SNC (Berglund, 1995). Una complicacin adicional del cuadro clnico est representada por los recientes informes sobre coinfeccin en los pacientes con borreliosis de L y m e por los agentes etiolgicos de la ehriichosis granuloclica humana y la babesiosis (Telford, 1996: Tang, 1997: Krause, 1996: Nadelman, 1997). Estas enfermedades comparten el mismo vector, y la coinfeccin de los pacientes en zonas donde las tres son endmicas puede dar lugar tanto a manifestaciones clnicas atpicas como a una enfermedad potencialmente ms grave. El conocimiento de una posible reinfeccin es necesario a la hora de establecer el protocolo de laboratorio ms apropiado, as como para el establecimiento de un tratamiento antimicrobiano eficaz en tales casos.

Manifestaciones

clnicas

Mtodos serolgicos. Los avances en el diagnstico de laboratorio de la enfermedad de L y m e han retrasado la percepcin del pblico sobre la gravedad y prevalencia de esta enfermedad. Utilizados inicialmente para confirmar tan slo una opinin clnica, el aumento en la utilizacin, cada vez ms generalizada, de los mtodos disponibles comercalmente para las pruebas serolgicas de la enfermedad de Lyme ha conducido, cuando menos, a una situacin de confusin en el diagnstico (Luger, 1990). La mayor parte de la incertidumbre diagSin tratamiento, las lesiones en la piel desaparecen en tres o cuatro semanas nstica que rodea a la enfermedad de Lyme es debida a que los sntomas son inespecficos y, al margen de la lesin caracterstica de la piel, el eritema (con un rango de tiempo que puede ir desde un da hasta 14 meses), aunque migrans (que aparece en muchos, pero no en todos, de los pacientes con la pueden aparecer subsiguientemente daos en uno o en varios sistemas princienfermedad de Lyme), hay muy pocas otras caractersticas con valor patognopales de rganos. En el 10% al 20% de pacientes no tratados en EE.UU., puemnico. En la dcada de 1980, las tcnicas serolgicas para B. burgdorteri se de producirse una afectacin neurolgica aguda (Nadelman, 1998), que normalm e n t e se manifiesta dentro de las primeras cuatro a seis semanas del comienzo utilizaron primariamente en pacientes procedentes de reas fuertemente endmicas del noreste de EE.UU. Sin embargo, la proliferacin de tcnicas serolde la enfermedad. La parlisis de Bell (sptimo nervio) es la manifestacin neugicas disponibles en el mercado, junto con un aumento en la sensibilidad y rolgica ms comn; otras manifestaciones que tambin pueden producirse son conocimiento del pblico sobre la enfermedad, ha conducido a un notable increlas neuropatas perifricas, la meningitis linfoctica o la meningoencefalitis (Bermento en la frecuencia de utilizacin de estos ensayos. En muchos casos, las ger, 1997; Halpenn. 1998). La encefalomielilis se observa mucho menos fretcnicas de diagnstico serolgico se aplican como consecuencia de que detercuentemente, pero puede tener graves secuelas (Halpenn. 1998). La mayor parminados pacientes con ciertos sntomas, como cansancio inespecfco y moleste de personas con manifestaciones de tipo neurolgico muestran pleocitosis tias de tipo neurolgico y/o reumatolgico, exigen un diagnstico concreto de linfoctica (alrededor de 100 clulas por mm) y una elevada concentracin de sus dolencias. Dado que esos sntomas pueden ser debidos a causas m u y protenas en el LCR (Tumani, 1995; Pohl, 1987). Hasta en un 8% de los casos diversas, la prevalencia global de la enlermedad de L y m e en este grupo de perpuede haber afectacin cardiaca aguda (Steere, 1989), que se manifiesta en sonas es, a menudo, m e n o r que la tasa de falsos positivos que producen estos forma de diversos grados de bloqueo atriovenlricular, miocarditis o pericarditis. ensayos, lo que conduce a un nmero absoluto ms elevado de resultados falTambin se ha observado una manifestacin cutnea adicional de la enfermesos positivos en relacin con los verdaderos positivos lAmerican Collage ol dad, el linfociloma por borrelia, pero slo en pacientes en Europa. Physicians, 1997; Tugwell, 1997). Por otro lado, muchos de los mtodos dispoLa fase crnica de la enfermedad de Lyme comienza a partir del momento nibles en la actualidad no son capaces de detectar la respuesta humoral m u y en que aparece la respuesta inmunolgica en el husped y comienza a distemprana frente a B. burgdorteri (Agero-Rosenfeld. 1993: Dressler, 1993); por minuir el nmero de espiroquetas. Los pacientes pueden entrar en una fase lo tanto, el diagnstico de un paciente sin eritema migrans sospechoso de padede latencia; algunos de ellos pueden tener, ms tarde, manifestaciones dercer enfermedad de L y m e en una fase muy temprana puede llegar a ser difcil. matolgicas, reumticas, cardiacas o neurolgicas, mientras que otros pueden permanecer asintomticos. Alrededor de la mitad de personas que no Como sucede con muchos mtodos serolgicos para el diagnstico de reciben tratamiento en EE.UU. pueden experimentar episodios de artritis infecciones bacterianas, los resultados falsos positivos para anticuerpos frendurante dos o ms aos, y en el 10% de los casos la artritis se vuelve crnite a 8. burgdorteri pueden deberse a anticuerpos frente a otras bacterias, tales ca (Steere, 1987); en muchos casos, la artritis parece responder al tratacomo las espiroquetas que se encuentran formando parte de la microbiota or3

El primer y ms fcilmente reconocible sntoma de la enfermedad de Lyme es el eritema migrans (EM), que se manifiesta en un porcentaje elevado (entre el 63% y el 90%) de los individuos afectados, entre dos das y cuatro semanas despus de la mordedura de la garrapata (Nadelman, 1995; Gerber, 1996). En el lugar de la mordedura aparece una mcula o ppula rojiza, indolora, que se extiende en crculo, dando lugar a una tpica lesin plana con un dimetro que puede oscilar entre 3 y 70 cm (el tamao medio es de 15 cm). con el borde de color rojo brillante y la parte central ms clara. El aspecto de la lesin puede, sin embargo, variar; un eritema confluente o con aspecto de una diana suele ser bastante frecuente, y tambin pueden aparecer vesculas en el centro, as como necrosis. La diseminacin hematgena del microorganismo tiene lugar muy pronto, produciendo fiebre, cansancio, dolor de cabeza, rigidez en el cuello, malestar, dolor musculoesqueltico migratorio, lesiones del tipo EM secundarias y linfadenopata generalizada, entre otros sntomas (Nadelman, 1996; Steere, 1997,1987; Berger, 1997).

Diagnstico de laboratorio

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INFECCIONES POR ESPIROQUETAS

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mal de la boca, as como Treponema pallidum y Leptospira. que exhiben reactividad cruzada. Adems, los pacientes con trastornos del tejido conectivo, como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistmico y espondiloartrtis pueden dar tambin un resultado serolgico falsamente positivo (Saulsbury, 1990; Magnarelli, 1990; Lovece, 1991; Fawcett, 1992). Los falsos negalivos pueden presentarse al principio de la infeccin, antes de que se produzcan anticuerpos en cantidades detectables (que pueden tardar hasta dos meses en aparecer), o en pacientes con inmunosupresin. A pesar de estas limitaciones, es un error asumir que las pruebas de tipo serolgico existentes para el diagnstico de la enfermedad de L y m e sean completamente irrelevantes. Si los pacientes que estn siendo analizados son seleccionados cuidadosamente en funcin de los sntomas que presentan (siempre que sean compatibles con la enfermedad de Lyme), y se tienen en cuenta aspectos y consideraciones de ndole epidemiolgica para realizar el diagnstico, el valor predictvo positivo de los mtodos serolgicos puede ser bastante aceptable, especialmente si los resultados positivos de la serologa se confirman mediante la tcnica del Western blol (WB; inmunotransferencia) (Tugwell. 1997). Muchos de los problemas actuales en relacin con las pruebas serolgicas para la enfermedad de Lyme se deben, probablemente, a las diferencias entre laboratorios en lo que respecta a su capacidad para ejecutar estos ensayos con precisin (Bakken. 1997.1992). Ello puede estar relacionado con diversos factores, incluyendo los tipos de preparaciones antignicas empleadas como sustrato y las diferencias en los mtodos utilizados para la preparacin de antgenos y otros procedimientos experimentales, as c o m o en los criterios de interpretacin Actualmente, varias instituciones (Centers lor Disease Control and Prevention, Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors. United States Food and Drug Administration [FDAj) recomiendan que se analicen las muestras de suero de pacientes con sntomas de la enfermedad de L y m e medante un procedimiento en dos pasos (CDC, 1995). Este procedimiento debera comprender en primer lugar un test de escrutinio sensible para la deteccin de anticuerpos totales o especficos de clase frente a B. burgdorferi, lo que puede llevarse a cabo tanto por mmunofluorescencia (IFA) como por enzimoinmunoensayo (EIA). Aquellas muestras dudosas o positivas en el rastreo inicial deben analizarse complementariamente mediante inmunotransferencia (WB). utilizando una cepa de B. burgdorferi con bajo nmero de pases en laboratorio (p. ej.. la B31) que exprese cantidades adecuadas de protenas con valor diagnstico (enumeradas en los prrafos siguientes). L a inmunotransferencia debe llevarse a cabo tanto para IgG como para IgM a partir de muestras de suero de los casos sospechosos que se presenten dentro de las primeras cuatro semanas desde el inicio de la enfermedad. En el caso de pacientes que se encuentren ms all de ese tiempo, slo debe realizarse la nmunotransferencia para IgG. puesto que el patrn de bandas reactivas frente a IgM que se detecta despus de las primeras cuatro semanas del comienzo de la enfermedad es menos fiable. En el caso de pacientes con sntomas de la enfermedad de Lyme en fase temprana y que han dado resultados negativos en el anlisis inicial, se recomienda realizar las pruebas serolgicas a partir de una muestra de suero tomada durante la fase de convalecencia, entre dos y cuatro semanas despus de obtenerse la primera muestra. Los critenos utilizados para interpretar los patrones de inmunorreactividad frente a IgM obtenidos mediante nmunotransferencia (WB) son los propuestos por Engstrom y sus colaboradores. En este contexto, un resultado positivo de existencia de enfermedad de L y m e implica que al m e n o s dos de las siguientes bandas polipeptdicas, reactivas frente a las IgM del husped, han de ser delectadas: antgenos de 24 (OspC). 39 y 41 (flagelma) kilodaltons (kDa) (Engstrom, 1995). En el caso de los patrones de inmunorreactividad frente a IgG, los criterios empleados para la interpretacin han sido propuestos por Dressler y sus colaboradores. En este caso, un transiendo es positivo cuando en el mismo se detectan cinco de las siguientes bandas correspondientes a antigenos de 18.21 (OspC), 28.30.39,41 (flagelma), 45.58.66 y 93 kDa (Dressler, 1993). La existencia de sntomas clnicos que sugieren una posible enfermedad de L y m e en pacientes en los que no existe una respuesta humoral detectable frente a B. burgdorferi (la denominada enfermedad de L y m e seronegativa) representa una situacin problemtica. En algunos pacientes seronegativos con sntomas crnicos es posible demostrar la presencia de una respuesta blastognica especifica por clulas T frente a B. burgdorferi. y este trastorno ha sido atribuido a la erradicacin incompleta de las espiroquetas por el tratamiento antibitico (Dattwyler, 1989). Sin embargo, en un estudio prospectivo

con pacientes afectados por la borreliosis de Lyme, con historiales de un pronto tratamiento bien caracterizado, no se apreciaron diferencias en el estado serolgico a largo plazo entre los pacientes en los que se supona que haban sido tratados adecuadamente de sus sntomas tempranos y los que no (Plorer, 1993). Otros autores han observado que la seroconversion no se ve afectada por la eleccin del antibitico utilizado. La ausencia de seropositividad en estos casos puede reflejar diferencias en la respuesta inmunolgica de ios pacientes individuales, puestas de relieve por la composicin antigenica empleada en los ensayos serolgicos comnmente utilizados (Agero-Ftosenfeid. 1993; Ledue. 1996). La liberacin y deteccin de anticuerpos especficos frente a B. burgdorferi a partir de inmunocomplejos obtenidos del suero de pacientes con enfermedad de L y m e seronegativos demuestra que el secuestro de los anticuerpos especficos en algunos pacientes infectados puede contribuir a la ausencia de anticuerpos detectables frente a la bacteria (Schutzer, 1990). Finalmente, la ausencia de una respuesta humoral especfica frente a S. burgdorferi en algunos pacientes con aparente enfermedad de L y m e puede deberse a un diagnstico equivocado de otras enfermedades (algunas de las cuales tambin pueden ser transmitidas por las garrapatas) que tengan una forma de presentacin similar (Persing. 1995.1992: Bakken. 1994). El diagnstico serolgico de la enfermedad de Lyme se ha complicado en los ltimos aos debido a la introduccin de la vacuna para la misma. Las vacunas aprobadas en la actualidad, y las que se encuentran en lases avanzadas de desarrollo, se basan en la proteina A (OspA) de la membrana externa de B. burgdorferi obtenida mediante tcnicas de ADN recombinante Tras la vacunacin, el aumento en el titulo de anticuerpos frente a la OspA es responsable de la seropositvidad que se detecta mediante los mtodos convencionales basados en la tcnica de ELISA (Zhang, 1997), Aunque la interpretacin de los resultados de la inmunotransferencia (WB) puede servir de ayuda para distinguir entre infeccin verdadera y una respuesta inmunolgica inducida por la vacunacin (Gauthier. 1999). la variabilidad de estos ensayos, asi como su coste, son argumentos en contra de su utilizacin como mtodos de escrutinio o rastreo primarios (Zhang, 1997: Golightly, 1997). Esto significa que los inmunoensayos de primera instancia recomendados habitualmente para el rastreo de la enfermedad de Lyme deben de ser cambiados. Por ejemplo, pueden reemplazarse con pruebas basadas en cepas de Borrelia que carecen de la protena OspA (Zhang, 1997) Alternativamente, se podran desarrollar enzimonmunoensayos con protenas recombinantes con el fin de poder detectar las variaciones de las respuestas inmunolgicas entre los individuos vacunados y los que han sufrido una infeccin natural. Cultivo de B. burgdorferi. La mejoras introducidas en los medios artificiales para el cultivo de B. burgdorferi ofrecen actualmente la posibilidad de detectar directamente a este microorganismo. Ahora puede recomendarse el cultivo en el medio Barber-Stoenner-Kelly (BSK) (Barbour. 1984) c o m o mtodo habitual para el aislamiento a partir de muestras de piel de pacientes con lesiones cutneas compatibles con el eritema migrans, ya que rinde una tasa de aislamiento superior al 80% (Berger. 1992). Las lesiones cutneas no tienen, a menudo, el aspecto caracterstico denominado "ojo de toro", ya que pueden ser alipicas o encontrarse en las etapas iniciales de su evolucin. Diversos estudios han mostrado que una mayora significativa de pacientes en areas endmicas que presentan un eritema migrans definido dan positivo en los cultivos si la muestra es obtenida antes de que haya comenzado a administrarse el tratamiento con antibiticos (Berger, 1992). En la Clnica Mayo. B. burgdorlenna sido recuperada en muchas ocasiones mediante cultivo a partir de las lesiones del eritema migrans. asi como de un paciente estadounidense con acrodermatitis crnica atrofica (AC), que m u y proablemente se encontraba infectado haca ms de diez aos. Estas observaciones han sido confirmadas por otros autores (Asbrink. 1985). El hemocultivo o el cultivo a partir de LCR y lquido sinovial dan resultados positivos con m e n o r frecuencia, aunque pueden ser ocasionalmente alternativas tiles (Schmidi. 1988; Karlsson. 1990: Wormser. 1998; Benach. 1983). Reaccin en cadena de la polimerasa. Las nuevas tecnologas diagnosticas, c o m o la PCR, tienen tambin utilidad para detectar directamente el ADN especfico de B. burgdorferi en las muestras clnicas. Algunos estudios han puesto de maniliesto que la PCR es la tcnica ms sensible y especifica para la deteccin de B. burgdorferi en muestras de lquido sinovial d e pacientes c o n artritis de L y m e (Nocton. 1994). En un estudio retrospectivo ciego con cerca de 150 pacientes aquejados de artritis, la PCR tuvo una sensibilidad del 9 6 %yu n a especificidad del 100% en la deteccin de B. burgdorferi en pacientes no trata-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

dos (Nocton, 1994). La m a y o r parte de enfermos que recibieron tratamiento antibitico con las pautas recomendadas dieron resultados negativos con la tcnica de la PCR y sus sntomas desaparecieron, lo que sugiere que dicha tcnica puede tener utilidad para monitorzar la eficacia de la terapia y predecir el resultado de la misma. El estudio de las muestras de LCR obtenidas de pacientes con sntomas neurolgicos ha revelado que el comportamiento de la PCR en el diagnstico de la enfermedad de L y m e puede variar; la sensibilidad ha oscilado entre valores que van casi desde el 0 % hasta el 100%, dependiendo de la metodologa y del paciente seleccionado (Schmidt. 1997). Sin embargo, puesto que el cultivo a partir del LCR casi siempre es negativo, un resultado positivo por PCR se considera, generalmente, un indicador bastante preciso de la existencia de una infeccin activa (Luft, 1992). Adems, teniendo en cuenta que puede haber una relacin inversa entre un resultado positivo mediante PCR y la produccin intratecal de anticuerpos (Keller, 1992), una prueba de PCR negativa junto con la ausencia de esos anticuerpos puede ser de utilidad a la hora de excluir la posibilidad de enfermedad de L y m e a nivel del SNC en la mayora de los casos. Otros estudios han demostrado que la PCR ofrece una sensibilidad superior a la que posee la tcnica de aislamiento por cultivo a partir de muestras de piel obtenidas por biopsia (Schwartz, 1992; Brettschneider, 1998). Adems, esta tcnica ha sido empleada para poner de manifiesto la presencia de material genmico de 8. burgdorferi en la orina de algunos pacientes que presentaban lesiones en la piel (Schmidt, 1996,1995). La deteccin del ADN de Borrelia en muestras de sangre y plasma de pacientes con EM ha tenido menos xito (Wallach, 1993; Guy. 1991; Goodman, 1995). Las pruebas moleculares pueden ser especialmente tiles para el diagnstico de pacientes seronegativos y para supervisar la eficacia del tratamiento con antibiticos (Schmidt, 1997). Se ha llevado a cabo la deteccin cuantitativa en tiempo real de 8. burgdorferi en modelos animales, habindose establecido una correlacin aparente entre la carga bacteriana y la sintomatologa clnica (Pahl, 1999). La PCR tambin ha sido utilizada para detectar y tipificar las borrelias presentes en las garrapatas aisladas a partir de la piel humana (Liebisch, 1998). En consecuencia, el uso de las tcnicas moleculares promete no slo aumentar nuestro conocimiento sobre la biologa y epidemiologa de la borreliosis de Lyme, sino que parece ser simplemente una cuestin de tiempo que estas tcnicas ocupen un lugar en el diagnstico ordinario, en especial a partir de muestras de lquido sinovial de pacientes con artritis.

tejidos en una o dos semanas de tratamiento (Malawista, 1994). Ensayos ms recientes con seres humanos han corroborado estos resultados, evidenciando una respuesta clnica efectiva en la gran mayora de pacientes afectados tanto de la enfermedad de Lyme en fase temprana como de neuroborreliosis. Aun cuando la mayor parte de pacientes con artritis de L y m e muestran mejora con el tratamiento antimicrobiano (Steere, 1995,1994), en algunos de ellos los sntomas persisten. El aparente fracaso del tratamiento en estos casos se piensa que es debido a varios factores. Por ejemplo, las espiroquetas pueden resistir la terapia debido a una pobre distribucin del antimicrobiano en el lquido sinovial. Otros pueden deberse a mecanismos de autoinmunidad, sobre los que muchos autores opinan que pueden tener un papel en el origen de la artritis de Lyme, particularmente de aquellos casos crnicos resistentes al tratamiento (Hu, 1997). Otra rea de investigacin se centra en la frecuencia de cotransmisin de otras infecciones de tipo zoontico junto con 8. burgdorferi en zonas endmicas. Como se indic anteriormente, el piroplasma Babesia microti y el agente de la ehrlichiosis granuloctica humana son transmitidos al ser humano por la m i s m a garrapata (/. dammini) que acta como vector en el caso la enlermedad de L y m e causada por 8. burgdorferi. Aproximadamente entre un 10% y un 1 5 % de pacientes con enfermedad de L y m e de algunas del noreste de EE.UU. muestran evidencias serolgicas de haber estado expuestos a 8. microti. Los estudios preliminares de seroprevalencia en pacientes de la parte superior del medio oeste sugieren una exposicin frecuente, tanto a las especies de Babesia c o m od e Ehriichia. entre aquellos que han mostrado seropositividad frente a 8. burgdorferi (Telford, 1996; Pancholi. 1995; Krause. 1996: Schwartz, 1997). Los estudios en pacientes que manifiestan una fatiga persistente tras ser sometidos a un tratamiento adecuado para la enfermedad de L y m e muestran que algunos de ellos estn de hecho coinfectados con 8. microti (Krause, 1996). El tratamiento de la enfermedad de L y m e no tiene efecto sobre la infeccin subyacente por 8. mlcrotr. por tanto, sntomas c o m o fatiga, mialgias, artralgias y similares que continan manifestndose bastante tiempo despus de un tratamiento contra la enfermedad de L y m e pueden ser debidos a otras causas, que deberan s e r tenidas en cuenta en la evaluacin clnica de los pacientes con tales sntomas. La infeccin por 8. microti se diagnostica preferentemente por mtodos serolgicos y por PCR, puesto que los frotis realizados a partir de sangre suelen dar resultado negativo en los pacientes que tienen el bazo normal. El riesgo de exposicin a estas zoonosis puede reducirse evitando el contacto con garrapatas, lo que se consigue utilizando camisas de m a n g a larga y pantalones largos, aplicando repelentes para insectos y controlando a las garrapatas a continuacin de una posible mordedura o exposicin. Las garrapatas adheridas deben ser inmediatamente retiradas y la zona de la mordedura ha de desinfectarse a fondo (Fish, 1995). Los estudios iniciales no han apoyado el empleo profilctico de antibiticos para la prevencin de la enfermedad de Lyme tras la mordedura de una garrapata (Shapiro, 1992; Warshafsky, 1996). La posibilidad de contraer la enfermedad de Lyme depende de la tasa de infeccin en las garrapatas (Shapiro, 1992) y del tiempo durante el cual el insecto est adherido a la piel (Piesman. 1987). Adems, parece que el riesgo de reacciones adversas frente a los antimicrobianos puede pesar ms que los beneficios potenciales, debido a que es muy bajo el nmero de casos de enfermedad de Lyme que pueden prevenirse de esta forma. Es concebible que el examen de las garrapatas pueda ser de utilidad algn da para predecir el riesgo de infeccin por 8. burgdorferi y otros agentes causantes de zoonosis. lo que permitira, en consecuencia, un tratamiento profilctico ms selectivo. Recientemente se ha me|orado el potencial de prevencin de la enlermedad de Lyme con el lanzamiento de la primera vacuna aprobada por la FDA para su empleo en seres humanos (CDC. 1999). Es una vacuna subunitaria, constituida por la protena OspAde 8. burgdorferi, obtenida por tcnicas de recombinacin. La investigacin sobre vacunas para el hombre se ha centrado en esta y otras protenas de la superficie extema, tales como OspB y OspC. El calendario para la vacuna actual contempla la administracin de tres dosis, que tiene una eficacia de entre el 60% y el 90% (Steere, 1998: Sigal. 1998). La duracin de la proteccin que confiere la vacuna an no ha sido establecida, y t a m p o c o se conoce mucho sobre su seguridad o eficacia en nios menores de 1 5 aos. La vacuna es. generalmente, bien tolerada; aunque se han observado reacciones locales y sistmicas suaves, no existe evidencia de que pueda provocar efectos a largo plazo, tales como afectacin neurolgica o musculoesqueltica.

Tratamiento y prevencin
La valoracin de los regmenes teraputicos utilizados para el tratamiento de la enfermedad de Lyme ha dependido, en general, de los signos y sntomas clnicos, as como de la informacin emanada de las tcnicas de diagnstico serolgico, tanto para la definicin de un caso como para evaluar la respuesta a la terapia. La sensibilidad de los mtodos serolgicos ha mejorado con el tiempo, aunque stos continan teniendo una baja especificidad. Confiar en los mismos para el diagnstico puede implicar la instauracin de un tratamiento innecesario. Adems, las tcnicas serolgicas no proporcionan un indicador fiable de la respuesta a la terapia, ya que una reduccin significativa en el titulo de anticuerpos puede preceder por muchos meses a la eliminacin de los microorganismos. Como se ha indicado en los prrafos anteriores, los mtodos de deteccin directa como la PCR pueden resultar tiles para determinar el resultado dei tratamiento en enfermos con artritis y, posiblemente, en pacientes neurolgicos con la enfermedad de Lyme. En general, el empleo de estos mtodos puede reforzar los estudios sobre la terapia de la enfermedad, al permitir la identificacin de la bacteria en aquellos sujetos que tienen infeccin activa, y proporcionar una indicacin del final de la terapia por su capacidad para valorar la erradicacin de los microorganismos. Las terapias recomendadas para el tratamiento de la enfermedad de L y m e incluyen la administracin de doxiciclina o amoxicilina por va oral, en los casos tempranos y sin complicaciones, y ceftriasona intravenosa para las infecciones ms consolidadas con afectacin sistmica. Otras terapias que tambin han sido utilizadas son la eritromicina por va oral (en el caso de mujeres embarazadas): formulaciones de acitromicina y cefalosponna oral para la enfermedad temprana; y penicilina intravenosa, particularmente para la neuroborreliosis. La evaluacin inicial de la eficiencia del tratamiento con ceftriasona, utilizando modelos animales de la enfermedad de Lyme, ha puesto de manifiesto la desaparicin de 8. burgdorferi. tanto por cultivo como por PCR, de casi todos los

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INFECCIONES POR ESPIROQUETAS

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Esta vacuna est actualmente recomendada para aquellas personas que estn expuestas con frecuencia o durante mucho tiempo a las garrapatas en zonas donde la enfermedad de Lyme tiene carcter endmico (Hayes. 1998). Como se mencion antes, el empleo extendido de la vacuna puede tener un efecto drstico sobre la utilidad de los mtodos disponibles en la actualidad para el diagnstico serolgico de la enfermedad de Lyme.

(Southern, 1969). Las tcnicas serolgicas estn poco disponibles y tienen un valor diagnstico limitado debido a la variacin antignica que experimentan estos microorganismos, as como a la reactividad cruzada con muchas otras especies bacterianas, incluyendo 8. burgdorferi(Dworkin, 1998). Los antibiticos de eleccin para el tratamiento de la fiebre recurrente son la tetraciclma o la eritromicma. El tratamiento se complica a menudo por la aparicin de una reaccin de Jarisch-Herxheimer, caracterizada por una sene de sntomas como fiebre, escalofros, leucopenia e hipotensin. No existe vacuna contra la fiebre recurrente. La prevencin se lleva a cabo evitando el contacto con los artrpodos vectores y que los roedores aniden en los albergues humanos, sobre todo en las reas donde la fiebre recurrente transmitida por garrapatas es endmica. Se deben utilizar insecticidas en las casas y aplicar repelentes para insectos a la ropa de vestir. La mejor lorma de prevenir la enfermedad transmitida por piojos es mantener una higiene personal adecuada y, cuando sea necesario, aplicar tcnicas para despiojar.

Fiebre recurrente
La fiebre recurrente es una enfermedad con distnbucin mundial en zonas de climas clidos y templados, con la excepcin de unas pocas zonas en el sudoeste asitico, como Nueva Zelanda y Australia (Burgdorfer, 1986). La enfermedad, causada por Borrelia recurrenlis, se transmite por el piojo del hombre. Pediculus humanus. La enfermedad afecta predominantemente a las personas que viven en condiciones higinicas deficientes que provocan un aumento en el nmero de piojos y favorecen la diseminacin de los mismos. La enfermedad ya no existe en EE.UU., pero sigue siendo endmica en los altiplanos del centro y este de frica y en el sur de la Cordillera de los Andes. La fiebre recurrente transmitida por garrapatas, una enfermedad con distribucin mundial pero que se detecta muy espordicamente, se transmite a los seres humanos que penetran en el habitat de las garrapatas del gnero Ornithodoros. representado por ambientes clidos y hmedos como cuevas, madera en descomposicin, madrigueras de roedores y refugios de animales que se encuentren en altitudes comprendidas entre 500 y 2.000 metros, aproximadamente. En EE.UU., las especies 8. hermsii. B. luricataey B. parkeri son los patgenos ms comunes. Las garrapatas se infectan al alimentarse de los roedores con borreliosis o de otros animales de pequeo tamao que actan como reservorio natural de las espiroquetas. Los seres humanos contraen la infeccin a travs de la mordedura de la garrapata o por contaminacin de abrasiones de la piel con la hemolinfa de los piojos aplastados (Dworkin, 1998). Tras entrar en la corriente sangunea, los microorganismos se multiplican, causando los sntomas y signos clnicos de la fiebre recurrente Las bacterias quedan acantonadas en rganos internos durante los periodos no febriles, en los que las espiroquetas circulantes son destruidas por los fagocitos en presencia de anticuerpos especficos. Las recadas se producen cuando las bacterias acantonadas en los rganos y que han experimentado cambios en su composicin antignica superficial son liberadas de nuevo al tonente circulatorio (Barbour, 1990). Las manifestaciones clnicas de la fiebre recurrente transmitida por los pilos o por las garrapatas son semejantes, aunque en el primer caso la enfermedad es generalmente ms grave (Dworkin, 1998; Bryceson, 1970; Horton, 1985; Rahlenbeck, 1995; Southern, 1969). La enfermedad primaria comienza, caractersticamente, tras un perodo de incubacin de 4 a 18 das con fiebre, rigidez, dolor de cabeza, mialgias. artralgias, letargo, fotofobia, tos y dolor abdominal. Puede desarrollarse una hepatoesplenomegalia con ictericia, especialmente en el caso de la enfermedad transmitida por piojos, pudiendo existir afectacin neurolgica hasta en un 30% de los afectados en este supuesto, valor que desciende hasta el 10% en los casos causados por la mordedura de garrapatas. Tambin se ha apreciado afectacin respiratoria o cardaca, linfadenopata. daos oculares y otitis media. Durante la infeccin temprana puede producirse shock por hipotensin que puede ser mortal. Al final de la fase febril primaria de la enfermedad aparece con mucha frecuencia una erupcin papular, macular o petequial en el tronco que dura uno o dos das. La fase primaria termina de forma brusca al cabo de unos tres a seis das. Por lo general las muertes se deben a arritmias cardacas, hemorragias cerebrales y fracaso heptico. Normalmente, el individuo sobrevive y los sntomas reaparecen sbitamente entre 7 y 10 das despus. En el caso de la enfermedad transmitida por las garrapatas son caractersticas las recadas mltiples, cuya duracin y sintomatologa van disminuyendo a medida que se suceden las mismas. En la enfermedad transmitida por piojos slo se dan una o dos recidivas. El diagnstico de la fiebre recurrente se lleva a cabo demoslrando la presencia de las espiroquetas en sangre perifrica mediante microscopa de campo oscuro. Alternativamente, se pueden realizar extensiones gruesas o finas que se tien por los mtodos de Giemsa o de Wright y se observan con microscopia de campo claro, o mediante microscopa de fluorescencia despus de teir con naranja de acridna Estos mtodos tienen una sensibilidad del 70%

BIBLIOGRAFA
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C A P T U L O

53

Micobacterias
Gail L. Woods, M.D.
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium africanum PRUEBAS CUTNEAS MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS Mycobacterium avium-Mycobacterium 1146 DIAGNSTICO DE LABORATORIO Muestras Tinciones microbiolgicas Mtodos de cultivo Test para la identificacin de micobacterias Test de sensibilidad TRATAMIENTO PREVENCIN Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium complex BIBLIOGRAFA 1155 1154 1155 1149 1149 1144 Mycobacterium genavense Mycobacterium ulceraos MYCOBACTERIUM LEPRAE 1148

intracellulare complex Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium kansasii Mycobacterium fortuitum-Mycobacterium chelonae-abscessus complex Mycobacterium xenopi Mycobacterium szulgai Mycobacterium malmoense Mycobacterium simiae Mycobacterium marinum Mycobacterium haemophilum

Las micobacterias son bacilos aerobios, inmviles, cido alcohol resistentes, rectos o ligeramente curvos. Los organismos contienen en sus paredes cidos miclicos de alto peso molecular (con 60 a 80 carbonos) que durante la pirlisis liberan cadenas rectas de cidos saturados C- a C^ de cadena larga. La proporcin de guanina-citosina en su ADN es de 62 mol a 70 mol%. Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium bovis y Mycobacterium africanum son los patgenos humanos que componen el trmino Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Estos organismos, 'bacilos de la tuberculosis", son los agentes etiolgicos de la tuberculosis humana. Otras micobacterias diferentes de la MTBC son las denominadas "atipicas". porque difieren de los bacilos de la tuberculosis. Los trminos "micobacterias no tuberculosas" y otras micobacterias diferentes del bacilo de la tuberculosis" son preferidos porque estos organismos no son atipicos. sino que simplemente tienen caractersticas diferentes de Mycobacterium tuberculosis.
:

micobacterias no tuberculosas basada en su patogenicidad en humanos ipotencialmente patgenos y raramente patgenos) (Woods, 1993). Mycobacterium leprae, que es nica entre las micobacterias por su cualidad de no haber sido an cultivada in vitro, se comenta separadamente.

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX Mycobacterum tuberculosis

En 1957, Runyon propuso que las micobacterias no tuberculosas fueran divididas en cuatro grupos segn la pigmentacin de las colonias y la velocidad de crecimiento en un medio slido (Tabla 53-1) (Runyon, 1959). Este sistema de clasificacin tiene, no obstante, limitaciones Por ejemplo, Mycobacterium kansasii es un fotocromgeno. pero en alguna ocasin es no lotocromgeno o escotocromgeno. Mientras que miembros de Mycobacterium avium intraceIlutare complex (MAC) son no fotocromgenos en el esquema de Runyon, pero algunos aisladamente producen colonias dbilmente pigmentadas, pudiendo causar errnea clasificacin como escotocromgena. Mycobacterium szulgai es escotocromgena a 37 C y fotocromgena a 25 C. Ms an, cuando se usa un medio liquido para cultivo de micobacterias como est recomendado (vase ms adelante), la tasa de crecimiento como factor de la clasificacin usado por Runyon no es vlida. Aqu se usa una clasificacin de utHidad clnica de las

Hoy da la tuberculosis es un problema global. Se estima que en todo el mundo existen entre 8 y 10 millones de nuevos casos de tuberculosis al ao y de 2 a 3 millones de muertes son a causa de esta enfermedad cada ao. En gran parte del mundo, la tuberculosis es el origen infeccioso ms frecuente de muerte, siendo directamente responsable de aproximadamente el 7% de todas las muertes y del 26% de todas las muertes prevenibles en todo el mundo (Murray. 1990; Snider. 1994). En EE.UU.. la tuberculosis estaba a la cabeza de la causa de muerte al comienzo del siglo XX. La mortalidad decreci micialmente por el esfuerzo de la sanidad pblica de alojar a los pacientes con tuberculosis en sanatorios para mejorar las nutricin y ventilacin, y posteriormente gracias a los frmacos antituberculosos. Entre 1953 (cuando la tuberculosis empez a registrarse en una base nacional) y 1984 la incidencia fue cayendo regularmente en torno a un 5%-6% cada ao (Rieder. 1989). La proporcin de descenso se fren drsticamente entre 1984 y 1985, y despus esta tendencia se invirti. Desde 1985 a 1992 el nmero de casos de tuberculosis referidos a los centros para la prevencin y control de enfermedades (CDC) increment en aproximadamente un 20%. es decir, se refirieron cerca de 51.000 casos ms de

CAPTULO 53

MlCOBACTERIAS

1145

Tabla 53-1

Clasificacin d e R u n y o n d e las micobacterias no t u b e r c u l o s a s

D e s c r i p c i n de colonias No pigmentadas a menos que sean expuestas a la luz (ptimamente durante su crecimiento temprano y con buena ventilacin de la superficie) Pigmentadas cuando crecen en la oscuridad y a la luz No pigmentadas cuando crecen en la oscuridad y a la luz Crecimiento en medio slido en siete das o menos j

Clasificacin Folocromgena

Escotocromgena No folocromgena De rpido crecimiento

sin de lisosomas con fagosomas que contienen bacilos dentro del macrfago, favoreciendo posiblemente la supervivencia del organismo dentro de la clula. La respuesta usual del husped a la infeccin por M. tuberculosis es la activacin de la inmunidad celular. Durante la infeccin primaria (inicial) los bacilos inhalados viajan a los espacios alveolares, donde son ingeridos por los macrfagos locales. Dichos macrfagos son incapaces de matar a las micobacterias, que se multiplican dentro de la clula durante los siguientes das tras la infeccin. Los macrfagos infectados con las micobacterias emigran a los ganglios linfticos regionales y presentan los antigenos sensibilizantes a las clulas inmunocompetent.es. o bien pasan a la linfa o al torrente sanguneo regresando a los pulmones (principalmente a las zonas apicales) y rganos a distancia, como son los ganglios linfticos, los rones, la epfisis de los huesos largos, los cuerpos vertebrales y las meninges, donde los bacilos continan multiplicndose hasta que se adquiere la respuesta inmune celular. Las clulas T inmunocompetentes migran desde los ganglios linfticos locales al punto de infeccin en el pulmn. Alli liberan atocinas quimiotctcas. inhibidores de la migracin y atocinas mitogenticas que estimulan el reclutamiento de monocitos y linfocitos sanguneos, la divisin ce macrfagos y de los linfocitos y la activacin de los macrfagos. Los macrfagos archivados tienen una marcada actividad microbicida, produciendo atocinas como la mterleucina-1 (IL-1), el interfern-y (IFN-y) y el factor de necrosis tumoral (TNF) que estimulan o regulan otros componentes del sistema inmune, propiedades que ayudan en el control de la infeccin. Las citocinas y enzimas lticas liberadas por los macrfagos tambin contribuyen a la destruccin tisular local concomitante. Con el paso del tiempo, la poblacin de clulas T activada va declinando y es reemplazada por clulas T de memoria que protegen contra las reinfeccin por M. tuberculosis y dan cierta proteccin cruzada contra infeccin por otras micobacterias. A pesar de frenar nuevas multiplicaciones de micobacterias en el foco primario y en los metastsicos gracias a la actividad de los macrfagos y de los linfocitos T de memoria, un foco de infeccin permanece en el pulmn indefinidamente (ms frecuente en los vrtices donde la presin de oxgeno es alta) y menos frecuente en los focos a distancia. Por tanto, la capacidad de reactivacin de la enfermedad de ese foco latente existe durante perodos de mmunosupresin. El foco primario de infeccin pulmonar, llamado lesin de Gohn. suele ser subpleural en la pade inferior de los lbulos superiores o en la parte superior de los lbulos inferiores, correspondiendo a reas de pulmn que reciben la mayor parte del flujo del aire inspirado. Las lesiones (tubrculos) son bien delimitadas, siendo reas de consolidacin blanco-grisceo, de 1 cm a 2 cm de dimetro con centro necrtico. Una apariencia similar a los tubrculos lueron tpicamente encontrados en los nodulos linfticos regionales, los cuales, junto con la lesin pulmonar primaria, se denominan complejo de Gohn. Microscpicamente los tubrculos estn formados por granulomas caseosos y no caseosos bien de limitados: los organismos pueden ser vistos en cortes teidos con tincin cido resistente. Con el tiempo esas lesiones son reemplazadas por fibrosis hialina y ocasionalmente se calcifican. Las lesiones de la tuberculosis miliar son pequeas reas de consolidacin (de 1 m m a varios milimetros de dimetro) de color blanco amarillentas sin caseum que recuerdan a los tubrculos. La capacidad de formar un granuloma est en funcin de la inmunocompetencia de los huspedes. Las personas infectadas con VIH, por ejemplo, pueden tener gran necrosis sin formar granulomas con algunos neutrofilos. microabscesos y numerosos bacilos cido resistentes (BAAR). En EE.UU., la tuberculosis activa afecta al pulmn en el 85% de los casos. Las manifestaciones clnicas pueden variar. La presentacin clnica puede ser insidiosa, con unos sntomas constitucionales progresivos de meses de evolucin, cuadro catarral con tos productiva frecuentemente atribuible a un m a l resfriado o bronquitis persistente, neumona o cuadro seudogripal. liebre alta, dolores y tos. Tambin puede aparecer esputo hemoptoico y dolor pleurtico. Tambin puede localizarse extrapulmonarmente, pero lo ms comn es que afecte a mltiples rganos con o sin infeccin pulmonar concomitante. La tuberculosis multiorgnica, antiguamente una enfermedad de nios y jvenes, predomina actualmente entre los ms ancianos e individuos inmunocomprometidos, especialmente aquellos infectados con VIH y M. tuberculosis (Chaisson, 1987; Kim. 1990).

los esperables (CDC. 1993). En las reas metropolitanas, el mayor incremento se dio en la ciudad de Nueva York. Los factores contribuyentes a este excesivo nmero de casos incluyen la extensin epidmica del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un deterioro en una infraestructura de los cuidados de salud y un incremento en el nmero de casos de personas sin hogar, trabajadores emigrantes, inmigrantes y pacientes que requeran cuidados crnicos, como en los centros disciplinarios y sanatorios (Ellner. 1993). Desde 1992, la incidencia de la tuberculosis declin cada ao (CDC. 1998). Adems del resurgimiento de la tuberculosis en los EE.UU., otro acontecimiento reciente es la aparicin de la tuberculosis multirresistente (MDR-TB), definida como la enfermedad causada por Mycobacterium tuberculosis que es resistente a 2 o ms antimicobacterianos de primera linea utilizados en los EE.UU. para tratar tuberculosis (vase ms adelante, en Tratamiento). Desde 1988, el CDC investigo 7 epidemias de MDR-TB que afectaron a cerca 200 personas (predominantemente personas infectadas por el VIH) en hospitales y centros penitenciarios en Nueva Y o r k y Florida (Jacob. 1994). Slo cuatro de estas epidemias fueron notificadas desde 1976 a 1987 y las personas afectadas eran personas sin infeccin por VIH. La mortalidad en las recientes epidemias tue alta (del 72% al 89%), con rpida evolucin desde el diagnstico hasta la muerte (con una media de 1 a 4 meses). Tambin se produjo la transmisin de MDR-TB a trabajadores de salud o guardias de las crceles y al menos 9 desarrollaron enfermedad activa y 5 murieron. M. fuberculosis se transmite principalmente por va respiratoria al inhalar residuos secos en pequeas gotitas infectadas (de 1 pm a 10 um de dimetro), pero tambin por inoculacin directa a travs de la piel lesionada, lo que es ms posible que se produzca cuando los patlogos u otros trabajadores del laboratorio manejen muestras infectadas. El foco de infeccin ms importante son las personas con tuberculosis pulmonar cavilada sin diagnosticar (con esputo positivo). Las dosis mnimas infectivas en humanos permanecen desconocidas, pero existen datos que sugieren que la infeccin puede producirse tras inhalar tan slo unos pocos organismos viables (Haas. 1994). El riesgo de padecer enfermedad pulmonar activa es bajo tras una exposicin aislada, pero el riesgo aumenta bajo situaciones de estrs o en ambiente de conlinamiento, donde puede darse una repetida exposicin al organismo. La mayora de las personas que se inlectan con M. tuberculosis no llega a desarrollar la enfermedad activa. El riesgo de desarrollarla en personas inmunocompetentes es del 5% al 10%. Para personas infectadas por VIH, este riesgo asciende a 7%-10% al ao. Las estructuras especificas, antgenos y mecanismos responsables de la virulencia de M. tuberculosis son an desconocidos, pero el factor cordal y las sulfatidas han sido asociadas con la capacidad de las cepas virulentas de producir la enfermedad. In vitro. el factor cordal es el responsable del aspecto morfolgico con el que M. tuberculosis aparece en la clula, como un manojo de cuerdas serpenteantes puestas en paralelo. Este patrn de crecimiento se correlaciona con la presencia de trihalosa 6,6 -dimicolato en el bacilo. Cuando este glucolipido se inyecta en ratones, inhibe la migracin de neutrofilos y favorece la formacin de granulomas y estimula la proteccin contra infecciones virales. Su papel especfico en la patogenia de la tuberculosis humana permanece, no obstante, desconocido. Las sulfatidas son unos glucolpidos situados perifricamente que inhiben la fu-

1146 Mycobacterium bovis

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Mycobacterium intracellular

avium-Mycobacterium complex

ractersticas d ec r e c i m i e n t oyd ec o m p o r t a m i e n t o bioqumico q u ef r e c u e n t e m e n t eh a c e n difcil su diferenciacin en el laboratorio de microbiologa, p o r lo que e l aislamiento d ea m b a s especies s e informa c o m oM A C .E lM A Cc o n tiene 28 serotipos. identificados p o r seroaglutinacin segn los antgenos localizados en la superficie celular o bien p o r cromatografa. A n t e sd e la epidemia del sndrome de m m u n o d e f i c i e n c i a adquirida h u m a na (sida), el M A C era la s e g u n d am i c o b a c t e n a ms f r e c u e n t e m e n t ea i s l a d a en EE.UU. tras M. tuberculosis. Entonces, el p o r c e n t a j ed eM A Ca i s l a d o increment, igualando e incluso s o b r e p a s a n d o el nmero de M. tuberculosis aislados en m u c h a sp a r t e s del pais. Los bacilos M A C estn presentes en cualquier sitio del a m b i e n t e . Se han aislado en el agua, el suelo, el alimento, el polvo domstico y en mltiples animales, p e r o la fuente a m b i e n t a l especifica r e s p o n s a b l e de la infeccin al s e r h u m a n op e r m a n e c e an d e s c o n o c i d a (Inderlied. 1993). La p u e r t a de e n t r a d a ms probable es el tracto de gastrointestinal, pero la transmisin p o r va respiratoria tambin es posible. D e s d e las zonas de colonizacin, los o r g a n i s m o s p a s a n a la s a n g r e e infectan m u c h o s rganos, e s p e c i a l m e n t e aquellos del sist e m a mielomonoctico. Mycobacterium africanum Durante m u c h o s aos la enfermedad p u l m o n a r causada p o rM A C se dab a con m a y o r frecuenci a en a n c i a n o s de raza bl a nca que padecan e n f e r Mycobacterium africanum. el bacilo del tubrculo "africano", fue el que prim e d a d e s pulmonares crnicas o en gastrectomizados. pero en los p a s a d o s m e r o se aisl en personas del oeste de frica (Castets, 1968). A u n q u e ha sido 10-15 aos h a legado a s e r comn en personas sin t a c t o r e s predisponenaislado principalmente en individuos de frica, la prevalencia de la infeccin tes, e s p e c i a l m e n t em u j e r e sa n c i a n a s (Prince, 1989; Dhillon. 2000). La enferc o n M. africanum a lo largo del p l a n e t a es difcil de determinar, p o r q u ep u e d e m e d a d diseminada p o rM A Cs ed ad eu nm o d o casi exclusivo e nm m u n o s u n os e rc o r r e c t a m e n t e identificado e nm u c h o s laboratorios. L o sm e c a n i s m o s pri m i d os. especi a l m ente en personas c o n si d a avanzado. En EE.UU.. el de transmisin y las manifestaciones clnicas de la enfermedad producida por M A C fue la c a u s a ms comn de infeccin bacteriana sistmica en p a c i e n M. africanum son las m i s m a s que las producidas por M. tuberculosis. t e s con sida a finales de los aos 80 y en los inicios de los 90 (Horsburg, 1991). L a incidencia d e tales casos, sin embargo, descendi d e s d e la existenci a de l a terapi a antirretroviral (CDC.1999). El pri n ci p al f a c t o r de r i e s g o MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS para l ae n f e r m e d a d diseminada M A Ce n pacientes c o n sida e se lg r a d od e inmunosupresin, i n di c ado por el r e c u e n t o d e l i n foci t os CD4+; tanto es as, En general p o c o se s a b e acerca de los antgenos responsables de la viruque l a enfermedad e s infrecuente e n individuos c o n linfocitos CD4* p o r encilencia d e las m i c o b a c t e r i a sn o tuberculosas: sin embargo, tales antgenos m a de 50. son. presumiblemente, los responsables de la persistencia de los organisEn EE.UU.. los serotipos 4 y 8 de M. avium son los ms f r e c u e n t e m e n t e m o sd e n t r o del s i s t e m a mielomonoctico del husped. L a respuesta i n m u n e aislados en la s a n g r e de p e r s o n a s con sida. L o s serotipos d e M. intracellulaa la infeccin c o n estas micobacterias es tambin t o r p e m e n t e entendida. Los re son un pequeo porcentaje de los M A C aislados en p e r s o n a sc o ns i d ays e patgenos potenciales se revisan en las siguientes secciones. Las m i c o b a c aislan p r e f e r e n t e m e n t e en los e s p u t o syc o nm e n o sf r e c u e n c i a en la sangre, terias r a r a m e n t e patognicas y las infecciones con las que han sido a s o c i a d a s oq u e sugiere q u er a r a m e n t ep r o d u c e ne n f e r m e d a dd i s e m i n a d ae ne s t o s se r e c o g e n en la T a b l a 53-2 (Weinberger, 1992; Weitzman, 1981; Neely, 1989; l individuos (Yacrus, 1990; Guthertz, 1989). DeChairo. 1973; Edwards, 1978; Cianciulli. 1974; Blacklock, 1983: T s u k a mura, 1975,1983: Casimir. 1982; Wallace. 1988: Smilh, 2000; Davison, 1988; L a s manifestaciones d el ae n f e r m e d a d producida p o rM A Cd e p e n d e n del Butler. 1 9 9 4 : Chiodini. 1989). sitio y la extensin d e la infeccin. L a infeccin p u l m o n a rp u e d es e r asinlo-

Mycobacterium bovis p u e d e ser transmilido a los h u m a n o sd e s d e el ganado vacuno, b e b i e n d ol e c h e cruda c o n t a m i n a d aop o r exposicin respiratoria al ganado infectado o a sus cadveres. Tambin p u e d e ser transmitido de pers o n a a persona por via respiratoria, d eh u m a n o sag a n a d op o r exposicin a la orina d ep e r s o n a s con infeccin del tracto urinario y de ganado a g a n a d o p r o b a b l e m e n t ep o rs e c r e c i o n e s bronquiales. M. bovis tambin p u e d e transmitirse a ganado d e s d e los animales salvajes, por ejemplo, el tejn en Suiza y Gran Bretaa (Grange. 1987). Entre 1900 y 1930. M. bovis le el responsable del 6 % al 30% de los cas o s de tuberculosis en EE.UU. y en el Reino Unido (Grange, 1987: Karlson, 1970), L a tasa d e tuberculosis h u m a n a causada p o r M. bovis descendi debido a la pasteurizacin de la leche y a los programas de inspeccin de ganado. D e s d e 1950, M. bovis ha producido m e n o s del 1 % de los casos de tuberculosis h u m a n a en Norteamrica. La mayora de las infecciones son extrapulmonares. afectando a los ganglios linfticos cervicales y mesenlricos, el intestino, los huesos y los riones. Infrecuentemente, la infeccin fue c o n s e c u e n c i a de la instilacin intravesical del bacilo de Calmette-Gunn (BCG) para tratamiento del carcinoma superficial de vejiga (Kristjansson. 1993)

Mycobacterium avium y Mycobacterium intracellular t i e n e n s i m i l a r e s c a -

Tabla 53-2

Micobacterias raramente p a t o g n i c a s e infecciones a s o c i a d a s

Infecciones asociadas Comentarios

Mycobacterium spp. M. gordonae

M M M M M M M M M M

thermoresistible terrae-triviale complex asiaticiim nonchromogenicum tlavescens shimoidei smegmalis neoaurum chelatum paratuberculosis

Meningitis en pacientes con shunt, e n f e r m e d a d h e p a t o r e n a l , peritonitis, endocarditis sobre vlvula protsica, infeccin cutnea, enfermedad diseminada, enfermedad pulmonar (?) Infeccin pulmonar, infeccin cutnea Artritis sptica, osteomielitis, enfermedad diseminada ( ) Enfermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Enfermedad pulmonar Bacteriemia en inmunosuprimidos con catter intravascular Enfermedad diseminada en pacientes con sida Enfermedad de Crohn (?)
9

Aislada en el suelo y en el agua ( b a c i l o del grifo") y contaminante habitual del laboratorio

Aislada de suelo M. terrae = bacilo del rbano

Enfermedad similar a la del MAC diseminado

Sia sndrome de inmunodeficiencia adquirida; MAC: Mycobacterium avium complex.

CAPTULO 53

MICOBACTERIAS

1147

mtica o imitar a la tuberculosis. La enfermedad diseminada en personas sin sida se manifiesta con liebre, prdida de peso, dolor de huesos, adenopatas. hepatoesplenomegalia y lesiones cutneas. En aquellos con sida es ms comn la fiebre persistente, perdida de peso y diarreas. Tambin se puede dar anorexia, debilidad, adenopatas o esplenomegalia (Inderlied, 1993). Los hallazgos del laboratorio son anemia y elevacin de la loslatasa alcalina. Las adenopatias cervicales causadas por MAC suelen afectar a los nios, aunque tambin pueden darse en adultos. Otras manifestaciones de la infeccin por MAC son sinovitis, enfermedad del tracto genitourinario, lesiones cutneas, infeccin de los tejidos profundos de la mano, osteomielitis, meningitis, ulceracin del colon y peritonitis (Inderlied, 1993; Wolinsky. 1979; Woods, 1987). Los hallazgos histolgico de las lesiones por MAC son variados. Granulomas caseosos con bacilos cido resistentes indistinguibles de la tuberculosis, fibrosis pulmonar con neumona organizada, vasculitis granulomatosa necrotizante similar a la granulomatosis de Wegener y especialmente en personas con sida, pueden verse agregados de macrfagos espumosos que contienen bacilos cido resistentes en su interior.

Mycobacterium chelonae-abscesus

fortuitum-Mycobacterium complex

Los miembros del grupo Mycobacterium fortuitum han sido aislados en el suelo, agua y polvo, y los de Mycobacterium chelonae-abscesus en el suelo, agua y aguas residuales. L a mayora de las personas infectadas con estos organismos han sufrido un dao penetrante (traumatismo o ciruga) con posible contaminacin por tierra o agua. El comienzo de la infeccin con M. chelonae se ha asociado con la administracin de la vacuna de la difteria-pertusis-ttanos-polio, inyecciones de histamina. administracin de lidocaina con un inyector a presin, en hemodializadores contaminados y en el reemplazo de vlvulas porcinas contaminadas (Wallace, 1983). La lesin cutnea principal causada por M. tortuitum o por M. chelonaeabscesus se manifiesta por celulitis local, abscesos o nodulos mnimamente dolorosos. Tpicamente las lesiones se desarrollan entre tres semanas y doce meses (con mayor frecuencia entre 4 y 6 semanas) tras el dao penetrante en personas con el sistema inmune intacto. La osteomielitis es una complicacin ocasional, especialmente tras heridas punzantes en los pies. Las infecciones posquirrgicas se han caracterizado por heridas que no cicatrizaban o por dehiscencia de heridas cicatrizadas con drenaje seroso y con minimos sntomas sistmicos. Generalmente se desarrolla entre tres semanas y tres meses tras la intervencin, especialmente tras esternotomia media, ciruga de aumento mamario o tras la insercin de catteres percutneos. La enfermedad diseminada que suele producirse en inmunodeprimidos (especialmente secundaria a terapia con corticoides) se manifiesta con abscesos cutneos recurrentes y de los tejidos blandos. La principal fuente de infeccin sigue sin ser evidente. Es infrecuente una enfermedad pulmonar crnica similar a la producida por M. kansasii o por el MAC. a excepcin de la cavilacin. L a endocarditis sobre una vlvula protsica suele producirse tras cuatro a d o c e semanas despus de la ciruga. Raramente el M. fortuitum o el M. chelonaeabscesus produce queratitis y ulceracin de la crnea postraumtica o adenopatas cervicales. Las lesiones producidas por M. fortuitum o por M. chelonae-abscesus, se caracterizan histolgicamente por necrosis con una mnima caseificacin y un infiltrado mixto inflamatorio compuesto por neutrofilos y granulomas de cuerpo extrao o de clulas de Langhans. Pueden verse de modo ocasional macrfagos cargados de lipidos. Se pueden encontrar grupos de bacilos cido resistentes dentro de agregados de neutrofilos en menos de un tercio de los casos. En el tejido pulmonar son frecuentes los macrfagos espumosos, con un patrn similar a la neumona lipoidea

Mycobacterium

scrofulaceum

Mycobacterium scrofulaceum fue el primer causante conocido de adenopatas cervicales en nios (Prissick, 1956). Desde el punto de vista antignico es similar al MAC. y debido a su ocasional identificacin como MAC mediante test bioqumicos, y viceversa. M. scrofulaceum se clasifica junto con el MAC como Mycobacterium avium-intracellulare-scrofulaceum complex. M. scrofulaceum se ha aislado en la leche cruda y en otros productos de consumo habitual, como ostras y agua. Se ha hallado tambin en el suelo. Habitualmente produce adenopatias cervicales en nios de 1 a 5 aos, penetrando presumiblemente en el cuerpo a travs de pequeas heridas cutneas o a travs de la mucosa de la cavidad oral. La enfermedad suele ser unilateral, afectando a ganglios linfticos altos del cuello o del ngulo de la mandbula. Los nios infectados generalmente estn con buen estado general, sin fiebre, y tienen mnimos dolores o molestias. Con la progresin, estos nodulos se reblandecen y se abren, pudiendo posteriormente cicatrizarse, librosarse y calcificarse. Las manifestaciones extraganglionares de la infeccin por M. scrofulaceum incluyen afectacin pulmonar, enfermedad diseminada y. ms raramente, conjuntivitis, osteomielitis, meningitis y hepatitis granulomatosa. Las lesiones por M. scrofulaceum son histolgicamente indistinguibles de las producidas por M. tuberculosis.

Mycobacterium Mycobacterium kansasii

xenopi

Mycobacterium kansasii. inicialmenle descrito como el "bacilo amarillo", representaba el 3% de las micobacterias aisladas en EE.UU. en 1979 y 1980; las mayores cifras fueron descritas en Calilornia, Texas, Louisiana, Illinois y Florida (Buhler, 1953; Goods. 1982). El reservorio natural de M. kansasii es desconocido, pero se ha aislado partir de muestras de agua. La enfermedad pulmonar es ms frecuente en varones entre 50 y 60 aos que habitan en zonas urbanas y entre ciertos grupos laborales (mineros, soldadores, marineros y pintores) y entre individuos con neumoconiosis y enfermedad pulmonar obstructiva crnica. La enfermedad diseminada suele afectar a personas con la alteracin de la inmunidad celular. Las manifestaciones ms frecuentes de la enfermedad producida por M. kansasii son lesiones crnicas pulmonares cavitadas que suelen afectar a los lbulos superiores. Las manifestaciones extrapulmonares incluyen adenopatas cervicales en nios, enfermedades cutneas, afectacin msculo esqueltica (sndrome del tnel del carpo, sinovitis, artritis, lendinitis, fascitis u osteomielitis), enfermedad diseminada, enfermedad aislada del tracto genitourinario y peritonitis. Los hallazgos histolgicos de las lesiones producidas por M. kansasii son variables e incluyen granulomas caseosos y no caseosos y lesiones cutneas, necrosis o locos de inflamacin aguda y crnica sin formacin de granulomas. Los bacilos cido resistentes son frecuentes en los pulmones y en los ganglios linfticos, pero menos en el resto de tejidos.

Mycobacterium xenopi se aisl por primera vez en un sapo en 1957 y fue reconocido como patgeno humano en 1965 (Costrinia, 1981). Se ha cultivado a partir de aguas residuales clidas y trias, calderas de hospitales y tanques de almacenamiento y otras fuentes ambientales. En Gran Bretaa. M. xenopi se encuentra ms frecuentemente en zonas costeras que en las del interior y los pjaros son un posible reservorio natural. La mayora de las infecciones pulmonares causadas M. xenopi se han descrito en Europa y Gran Bretaa. Por el contrario, esta micobacteria es poco frecuente en EE.UU. La enfermedad se da slo en adultos y ms frecuentemente en varones que en mujeres La mayora de las personas padecen enfermedad pulmonar preexistente u otro factor predisponente, como neoplasias extrapulmonares malignas, alcoholismo, diabetes mellitus o terapias inmunosupresoras. La enfermedad pulmonar puede ser crnica, subaguda o aguda. Los sntomas son indistinguibles de los asociados a la patologa causada por M. kansasii. La infeccin local extrapulmonar (osteomielitis, artritis, adenopatas) y la enfermedad diseminada son infrecuentes, aunque se han descrito en pacientes con sida (Tecson-Tumang. 1984).

Mycobacterium

szulgai

Mycobacterium szulgai es un patgeno humano infrecuente localizado en cualquier parte del mundo, pero su reservorio natural es an desconocido. La manifestacin ms frecuente de la infeccin es la enfermedad pulmonar er-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

ruca, siendo esto ms frecuente en varones de mediana edad. La afectacin extrapulmonar es infrecuente, habindose descrito una bursitis de olecranon asociada a traumatismos de repeticin o tras inyecciones de corticodes, afectacin cutnea extensa en personas en tratamientos con corticoides. osteomielitis, tenosinovitis con sndrome de tnel del carpo, adenopatias cervicales y enfermedad diseminada (Woods, 1987).

Mycobacterium

genavense

Mycobacterium

malmoense

Mycobacterium malmoense se describi como una nueva especie en 1977, aunque su reservorio natural es an desconocido (Schroder. 1977). La mayora de las infecciones humanas se han descrito en Inglaterra. Gales y Suiza, mientras que en EE.UU. es infrecuente. La enfermedad pulmonar crnica es la manifestacin ms comn de la infeccin por M. malmoense. afectando tpicamente a hombres de mediana edad con neumoconiosis. Tambin se han descrito adenopatias cervicales en nios y enfermedad diseminada en pacientes con sida (Henriques, 1993).

Mycobacterium genavense es una nueva especie propuesta de micobactena que se ha obtenido en cultivos de sangre por primera vez y tambin en bazo o mdula sea de pacientes con sida (Coyle. 1992; Wald, 1992). Casi todos los pacientes tuvieron fiebre y malestar general, y algunos incluso sntomas abdominales. Algunos de los pacientes fueron coinfectados con otro patgeno, como el MAC. por lo que ha sido difcil determinar el papel de M. genavense en la patologa. Desde el punto de vista histolgico, las lesiones estn formadas por agregados de macrfagos espumosos llenos de bacilos cido resistentes (al igual que el MAC diseminado) (Maschek. 1994).

Mycobacterium

ulcerans

Mycobacterium

simiae

Mycobacterium simiae se aisl por primera vez en los monos de la India en 1965 (Karassova, 1965). Se encuentra en los monos y se ha aislado tambin en las aguas residuales de hospitales. Es un patgeno humano anecdtico, aunque se ha asociado con patologa pulmonar crnica y enfermedad diseminada.

Mycobacterium ulcerans es endmico de las reas de Zaire. Uganda. Nigeria, Ghana. Camern, Malasia, Nueva Guinea, Guyana. Mxico y Australia, quedando localizado entre los 25 grados de latitud norte y los 38 grados de latitud sur. Los nios de entre cinco y ocho aos son los ms frecuentemente afectados, aunque en un estudio de Australia la media de edad de personas afectadas fue de aproximadamente treinta aos y un tercio de personas fueron mayores de 40 aos (Wolinsky, 1979). En las zonas endmicas, la enfermedad es ligeramente ms comn en varones. El reservorio de M. ulcerans y la va habitual de transmisin a los humanos permanece an desconocida. Otros nombres con los que se conoce a la enfermedad son la ulcera de Bairnsdale. por el rea de Australia, donde le reconocida por primera vez. y lcera o enfermedad de Buruh. debido al rea de Uganda que refiere la m a y o r parte de los casos. La enfermedad debuta c o m o uno o. ms raramente, mltiples fornculos indoloros o nodulos subcutneos en un rea expuesta, c o m o las piernas, donde posiblemente existi un traumatismo previo. Tras vanas semanas, los nodulos se ulceran y pueden surgir nodulos y lceras satlites. Tpicamente, los ganglios linfticos suelen respetarse y los individuos afectados permanecen afebnles y sin sntomas sistmicos. salvo que se sobremfecten las lesiones por bacterias.

Mycobacterium

marinum

Mycobacterium marinum se reconoci como patgeno humano en 1951 (Norden, 1951). La infeccin humana suele adquirirse a travs de la piel daada en contacto con aguas no cloradas contaminadas, tanto dulces como saladas, aunque tambin puede transmitirse a travs de va traumtica sin contacto con agua o bien por contacto con agua sin traumatismo precedente. Aparece una lesin nica papulonodular a las 2-3 semanas tras la inoculacin, siendo ms frecuente en codo, rodilla, pie o dedos del pie o de la mano, y suele evolucionar a lesin verrugosa o ulcerada. Ocasionalmente se forma un absceso en el punto de inoculacin y mltiples nodulos secundarios pueden aparecer y progresar centralmente a travs de los linfticos, simulando una esporotricosis (vase Cap. 54). Las lesiones cutneas en inmunodeprimidos pueden ser diseminadas. Las manifestaciones extracutneas son infrecuentes: destacan: smovitis. osteomielitis y lesiones oculares y larngeas (Woods. 1987). La histologa de las lesiones cutneas varia segn el estadio de la infeccin. En fases tempranas existe un agregado de neutrfilos rodeado por histiocitos. Ms tarde se ven linfocitos. histocilos y clulas de Langhs con focos de necrosis fibnnoide. En las lesiones de ms de seis meses de evolucin se pueden encontrar linfocitos en la dermis. Las tinciones para bacilos cido resistentes suelen ser negativas, pero se pueden hallar los organismos en el interior de los histiocitos.

MYCOBACTERIUM LEPRAE
Mycobacterium leprae es el causante de la lepra (tambin lamada enfermedad de Hansen). Aunque no pertenece a las MTBC. y por tanto puede considerarse una "micobacteria no tuberculosa", se estudia aparte, ya que es la nica micobacteria que no se ha podido cultivar por el momento. Los animales tiles como modelos de infeccin son el ratn de pie almohadillado y el armadillo de nueve bandas. M. leprae se ha localizado en casi la totalidad del mundo en algn m o m e n t o de la historia. Se estima que entre 10 y 15 millones de personas en todo el mundo padece lepra, y aproximadamente el 62% est en Asia y el 3 4 % en frica (Binford. 1982). Cerca de 6.000 personas en EE.UU. padecen lepra, la mayora inmigrantes, y en algunos de los casos afecta a individuos de los estados de las costas del golfo de California y Hawai (Neill. 1985). L a lepra afecta predominantemente a humanos, pero tambin es una infeccin natural de los armadillos salvajes en Lousiana y Texas, y se han descrito casos espordicos en unos monos (Hastmgs. 1988). El mecanismo de transmisin es desconocido, pero se acepta la teora de la transmisin de persona a persona a travs de la aerosolizacin del organismo a partir de la nariz de la persona con lepra activa (vase ms adelante) que contacta con la mucosa nasal de otro individuo. La transmisin tambin puede producirse a travs de piel sana o por heridas penetrantes, c o m o las producidas por espinas o picaduras de artrpodos. La leche de mujeres lactantes con la enfermedad lepromatosa contiene bacilos que pueden transmitirse a los nios, y tambin es posible una transmisin transplacentaria. Tambin se han descrito casos de lepra en humanos que han tenido contacto con armadillos (Lumpkin, 1983). Adems, el hallazgo de una enfermedad similar a la lepra en armadillos y el hecho de la aparicin de casos espordicos de lepra en personas sin contacto con afectados sugiere la existencia de fuentes de M. leprae attenles a la humana (Blake. 1987).

Mycobacterium

haemophilum

Mycobacterium haemophilum se describi por primera vez en 1978, pero probablemente fue el bacilo cido resistente incultivable que se reconoci en lceras cutneas en 1972 y 1974 (Sompolinsky. 1978' Lomvardas. 1972: Feldman, 1974). Esta es la nica de las micobacterias que requiere hemoglobina o hemina para su crecimiento. Las infecciones humanas por M. haemophilum son raras y suelen verse en personas con una inmunosupresin subyacente, como inmunosupresin tras trasplantes o sida, pero se han descrito algunos casos de adenopatias en nios sanos (CDC. 1991). L a enfermedad se manifiesta ms frecuentemente como mltiples nodulos cutneos, lceras o edemas acompaados de dolor que suelen afectar a las extremidades, pudiendo llegar a formar abscesos y fistulas abiertas que drenan un material purulento. Desde el punto de vista microscpico, se ven focos de necrosis sin caseificacin rodeados por un infiltrado inflamatorio polimorfo con aparicin ocasional de clulas de Langhans en la dermis profunda. Se pueden ver los bacilos cido resistentes de un modo aislado o bien formando pequeos grupos dentro de las clulas.

CAPITULO 53

MICOBACTERIAS

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La mayora de las personas resisten de un modo efectivo la infeccin por M. leprae. La resistencia depende de una correcta inmunidad celular contra los antigenos de M. leprae. como sucede en la lepra tuberculoide. En personas en las que falla esa respuesta celular inmune especfica a dichos antgenos, los bacilos se multiplican dentro de los macrfagos. pudiendo producir una rpida lepra lepromatosa diseminada. Los defectos de la inmunidad celular que pueden afectar a los linfocitos T o su interaccin con los macrtagos son la causa que facilita la enfermedad. Las lesiones de lepra se desarrollan tras un perodo de incubacin de 2 a 5 aos, variando la presentacin segn la respuesta inmune del husped. La lepra siempre afecta a los nervios perifricos, casi siempre a la piel y frecuentemente a las mucosas. Los tres signos cardinales de la enfermedad son lesiones cutneas, reas cutneas de anestesia y una afectacin de los nervios perifricos. El sistema desarrollado por Ridey y Jopling (presentado ms adelante) se usa frecuentemente para clasificar el espectro clnico e histolgico de las formas de lepra (Ridley, 1964). La lepra indeterminada, en las etapas tempranas, se caracteriza por una o ms mculas hipopigmentadas en la piel con ligera prdida de sensibilidad. En cerca del 75% de los casos la patologa se cura espontneamente, mientras que en el resto progresa frecuentemente tras un periodo largo. Los tipos extremos de lepra lepromatosa, la forma diseminada anrgica de la enfermedad y la tuberculoide o forma localizada, son formas clnicamente estables La lepra lepromatosa se caracteriza por distintas lesiones cutneas que van desde una afectacin cutnea generalizada hasta unos nodulos difusos y de distribucin simtrica (llamados lepromas) repletos de organismos. Las lesiones afectan generalmente a las partes ms fras de la superficie corporal, como el tercio anterior del ojo. la mucosa nasal y los troncos de los nervios perifricos superficiales. En la enlermedad avanzada las lesiones se acompaan de prdidas sensitivas debido a la afectacin de las fibras nerviosas drmicas. Desde el punto de vista microscpico, las lesiones muestran histiocitos espumosos que contienen muchos bacilos cido resistentes, ausencia o escaso nmero de linfocitos, mnima inflamacin inlraneural y mltiples bacilos cido resistentes en los nervios, perineuro, pared vascular y msculos. En la lepra tuberculoide se desarrollan una o varias mculas o placas anestsicas bien definidas, a veces acompaadas por un engrasamiento del nervio perifrico cerca de la lesin cutnea. Desde el punto de vista histolgico, las lesiones muestran granulomas no caseosos en los nervios y en la dermis que afectan a las capas bsales de la epidermis, mientras que. si los hubiese, los bacilos cido resistentes estaran en bajo nmero. La lepra bimorfa es una condicin clnica inestable que comparte caractersticas de ambas formas extremas. Puede desarrollar caractersticas ms cercanas a la tuberculoide, que denominaramos progresin, o bien acercarse a la lepromatosa, denominndose entonces regresin.

las minoras tnicas o raciales, residencias de cuidados crnicos y personas que tienen condiciones mdicas asociadas a riesgo de tuberculosis (p. ej., silicosis, gastrectomizados. puentes yeyuno-ileales. personas por debajo del 10% de su peso ideal, insuficiencia renal crnica, diabetes mellitus. tratamiento con altas dosis de corticoides u otros frmacos inmunosupresores y neoplasias). Una reaccin de 15 m m o mayor se considera positivo en el resto de las personas. Pueden existir falsos positivos en la reaccin de PPD por infeccin con micobacterias no tuberculosas. Los falsos negativos se pueden deber a una mala tcnica o a una mala conservacin del derivado. Si se administra apropiadamente, los falsos negativos son raros en personas relativamente sanas, pero pueden producirse en aproximadamente el 20% de los individuos con tuberculosis conocida cuando se les realiz por primera vez. La mayoria de estos falsos negativos son debidos a una enfermedad y se convierten en positivos tras dos o tres semanas de tratamiento. Los factores causantes de un estado generalizado de anergia, como malnutnon proteica, infeccin viral concomitante, sarcoidosis, neoplasias (como el linfoma). terapia con corticoides o nmunosupresin e infeccin por VIH pueden ser responsables de un falso test negativo. El test de Mantoux suele permanecer positivo tanto tiempo como persista el acantonamiento del bacilo en un loco quiescente. No obstante, la reaccin puede ir disminuyendo con el paso de los aos, lo que ocurre con mayor frecuencia en aquellos que sobrepasan los 55 aos. En estos individuos la reaccin puede ser estimulada (o llegar a positivizarse) si se repite el test a la semana de realizarlo, reaccin que se denomina efecto booster. Los compuestos preparados para test cutneos para micobacterias n o tuberculosas incluyen el PPD-A (Mycobacterium avium). PPD-B (Mycobacterium intracellulare). PPD-F (Mycobacterium fortuitum). PPD-G {Mycobacterium scrofulaceum) y PPD-Y {Mycobacterium kansasii). En EE.UU. estos compuestos se podian conseguir en el CDC, pero se interrumpi su administracin, ya que esos antgenos no estaban estandarizados y las reacciones cutneas eran de dificil interpretacin.

DIAGNSTICO DE LABORATORIO Muestras

Las muestras recomendadas para el diagnstico de infeccin por micobacterias se recogen en la Tabla 53-3. Las muestras tomadas de sitios contaminados como esputo, otras secreciones respiratorias, secreciones gstricas, orina y las heces se deben descontaminar antes de su inoculacin en el medio para prevenir un sobrecrecimiento de la llora normal que enmascare la presencia de las micobacterias. La concentracin de las muestras tras su descontaminacin aumenta la sensibilidad de las extensiones y cultivos. Las muestras tomadas de zonas de cuerpo normalmente estriles n o precisan descontaminacin previa al cultivo, como la sangre, el lquido cefalorraqudeo, el lquido pleural o peritoneal y los tejidos. El procesamiento e inoculacin de las muestras para su cultivo deberan realizarse en una cabina biolgica de segundad. El procesamiento con A/-acetil-L-cistena (NALC)-hidrxido sdico (Fig. 53-1) es el mtodo ms comnmente utilizado en el laboratorio clnico para licuar, descontaminar y concentrar muestras para la deteccin de micobacterias. Las muestras contaminadas deberan ser refrigeradas si no se pudiesen procesar inmediatamente. Antes de proceder al paso comentado en la Figura 53-1. se necesita un manejo adicional para algunas muestras. Las muestras de lavado gstrico se deberan procesar inmediatamente, pero si no se puede evitar una demora, se debera aadir hidrxido sdico al 10% hasta que el pH de la muestra (medido con papel de pH) sea neutro. Si se recogen ms de 10 mi de secreciones gstricas, habra que centrifugar la muestra de 3.000 g a 3.600 g durante 20 a 30 minutos, desechndose el sobrenadante y progresando el sedimento como se indica en la Figura 53-1. Para las heces. 1 2 g de muestra slida o bien 5 mi de muestra liquida se colocan en un tubo de 50 mi y se aade agua estril destilada hasta alcanzar un volumen de 1 0 mi. La suspensin se agita en un mezclador, se filtra a travs de una gasa y se procesa como se indica. Las muestras de orina se dividen en dos a cuatro

PRUEBAS CUTNEAS
Las pruebas cutneas de la tuberculosis son de utilidad para identificar a personas infectadas con el MTBC. pero no diferencian enfermedad activa de infeccin. Las personas infectadas con MTBC desarrollan una reaccin de hipersensbilidad a las protenas de los bacilos, en lo que toma su base el test cutneo con un derivado proteico purificado (PPD). El mtodo preferido de test cutneo es el test de Mantoux. que se lleva a cabo mediante la inyeccin intracutnea de 0,1 mi de PPD-S de fuerza intermedia (5 unidades de tuberculina). La reaccin se interpreta a las 48-72 horas midiendo el dimetro de induracin en milmetros (Huebner. 1993). Una induracin de 5 mm o mayor se considera como positivo en personas con VIH, en aquellos con reciente contacto ntimo con personas con tuberculosis contagiosa y en aquellos con hallazgos radiolgicos de lesiones residuales tuberculosas. Un resultado de 10 mm o mayor, es positivo en aquellos que no cumplen esos criterios pero que tienen otros factores de riesgo para tuberculosis. Se incluyen en este grupo los extranjeros de pases con alta prevalencia de tuberculosis (como frica, Asia o Amrica latina), los adictos a drogas por va parenteral, poblaciones mdicamente desatendidas o en declive, como

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Tabla 53-3 Enfermedades causadas por micobacterias y muestras para el diagnstico Enfermedad
Pulmonar

Especie de Mycobacterium' tuberculosis, kansasu. MAC, malmoense. simiae xenopi. szuigai,

Muestras
Esputo (a primera hora de la maana, tos profunda. durante tres das seguidos). BAL, contenido gastrico, tejido pulmonar, lquido pleural Sangre, mdula osea, tejidos afectados Aspirado o biopsia de las adenopatias Aspirado o biopsias de la lesin (se deberan desechar los tapones) extensin de las secreciones nasales y corles cutneos, biopsia de la lesin Lquido y vaina sinovial, hueso LCR. le|ido cerebral, biopsia de nervios perifricos Orina (a primera hora de la maana durante tres das consecutivos), tejidos afectados (rion, endometrio. trompa de Falopio, prstata, vesculas seminales, epididimo) Tejido, heces Biopsia penloneal. lquido ascitico Hgado Pericardio, liquido pencrdico

Diseminada Adenopatias Piel, tejidos blandos

tuberculosis. MAC tuberculosis. MAC, scrolulaceum ulceraos, lortuitum-chelonae. marinum, leprae

haemophilum.

Msculo esqueltico Sistema nervioso Genitourinario

tuberculosis, tuberculosis, tuberculosis

lortuitum-chelonae, leprae

marinum

Gastrointestinal Peritonitis Hepatitis Pericarditis

tuberculosis. tuberculosis tuberculosis. tuberculosis

MAC MAC

Las especies enumeradas son patgenos potenciales MAC Mycobacterium avium complex: BAL lavado broncoalveolar: LCR: liquido cefalorraqudeo Modilicada de Woods GL: Mycobacteria En Woods GL. Gutierrez Y (eds.): Diagnostic Pathology of Infections Diseases. Filadellia. Lea 8 Febiger. 1993. p 378. con autorizacin.

tubos de 50 mi y se centrifugan a 3.000 g-3.500 g durante 30 minutos. Se decanta el sobrenadante dejando unos 2 mi de sedimento en cada tubo. Los tubos se mezclan con un mezclador y los sedimentos se combinan, y si fuese necesario se aade agua destilada hasta un volumen de 10 mi y entonces se descontamina como se muestra en la Figura 53-1.

Tinciones microbiolgicas
En extensiones teidas con la tincin de Gram la mayora de las micobacterias aparecen como unos bacilos grampositivos escasamente teidos, pero a veces los bacilos no captan el violeta y aparecen como "gram neutro" o como "gram fantasma" (Lmina 53-1). Imgenes similares de fantasmas pueden encontrarse en los macrfagos obtenidos con las tinciones de Wnght o Papanicolau. En general, para mejorar la eficiencia, todas las muestras (menos la sangre) recogidas de personas con sospecha de infeccin por micobacterias se deberan examinar microscpicamente. Sin embargo, muchos laboratorios no preparan extensiones de muestras en las que los bacilos cido resistentes raramente sean vistos, tales como lquido cefalorraqudeo, orina y mdula sea. Para preparar la extensin se extienden dos o tres gotas del sedimento concentrado de un modo uniforme en un portaobjetos y se fija a 80 C durante 15 minutos o bien de una a dos horas a 65 C-70 C en un calefactor elctrico. Hay dos tipos de tincin que detectan los bacilos cido resistentes: carbol-fucsina (la clsica tincin de Ziehl-Neelsen. que requiere calefacc en. y la tincin de Kinyoun) y las tinciones fluorocromas preferidas (auramina-rodamina y auramina-O), que son ms sensibles. Las extensiones teidas con la tincin de carbol-fucsina se examinan con un aumento de 800x a LOOOx (con aceite de inversin). Las extensiones teidas con tincin fluorocroma se examinan con aumentos ms bajos (250x y 400x) que permiten visualizar ms campos en menos tiempo. Las clulas de M. lortuitumchelonae complex se tien escasamente con la tincin lluorocroma y pueden pasar desapercibidas, por lo que cuando se sospechasen (p. ej.. en infecciones de heridas quirrgicas) las extensiones que resulten negativas sera conveniente teirlas con carbol-fucsina. Los resultados se comunican tras ver 100 campos y debera ser incluido un informe indicando si la extensin se prepar directamente de la muestra o tras descontaminacin y concentracin. Las directrices para informar los resultados de las tinciones de muestras para bacilos cido resistentes se muestran en la Tabla 53-4 (Kent. 1985). En las extensiones teidas con carbol-fucsina, los bacilos cido resistentes aparecen como unas varas ligeramente curvas de color prpura-rojo (de 1 um a 10 jtm de largo y de 0,2 um-0,6 um de ancho) que frecuentemente son de forma arrosariadas y con bandas (Lmina 53-2), pero tambin pueden tener forma de coco o filamentosas. En general, el aspecto del bacilo cido resistente no facilita la identificacin de las especies, pero sin embargo las clulas de cieas especies tienen caractersticas tiles para el diagnstico. Por ejemplo, las clulas de M. kansasu Irecuenlemente aparecen c o m o un bacilo rayado (Lmina 53-3) ms largo que M. tuberculosis y similar a un cayado. Las clu-

Poner 10 mi (mximo) de esputo, orina u otros Huidos en un luho do centrifugado estril de plstico de 50 mi

I
Aadir el mismo volumen de NALt-2".. NaOll (preparado cada da) y tapar hermticamente

l
Me/clar en el mezclador durante 15 a 30 segundos

Dejar reposar la me/ela a temperatura ambiente durante 15 mininos (45 minutos para muestra! fecales)

l
Aadir 3(1 mi de lampn fosfato (pll ft.X): tapar los tubos y mc/clar i Centrifugar a 3.000-3.600 x % durante 15 minutos (o 2.500 x g . I . I I . I I I I , - 20 mininos)

.
Decantar el sobrenadante; resuspender el sedimento en 1.5 ml-2 mi de agua estril o lampn i Preparar extensin para leir 1 Inocular en medio de cultivo

Figura 53-1. Protocolo para la descontaminacin mediante el uso de hidrxido sdico rV-acelil-L-cisleina al 2%. y concentracin de muestras para la determinacin de micobacterias por extensin y cultivo.

CAPTULO 53

MICOBACTERIAS

1151

dos son ms sensibles que los slidos y aportan una ms rpida deleccin del crecimiento micobacteriano (Stager. 1991. Anargyros, 1990; Abe. 1992). Los sistemas lquidos actualmente disponibles sobre el s i s t e m a radiomtrico N." de B A A R c o n N." de B A A R c o n son B A C T E C 460TB (BD Biosciences). SEPTI-CHECK A F B( B D Biosciencarbol-fucsina (1.000x) f l u o r o c r o m o (450x) Informe ces), t u b o s indicadores d e crecimiento d e micobacterias B B L (MGIT: B D BioNo se ven BAAR 0 0 sciences), el s i s t e m a de cultivo ESP II (sistemas de diagnstico T r e k ) y el 1-2 en 70 campos Dudoso, repetir 1 2 en 300 campos BacT/Alert MB (Organon Teknika). El C D C tambin r e c o m i e n d aq u e los sis(un barrido y medio) (3 barridos) l e m a sd e cultivos u s a d o s detecten e lc r e c i m i e n t od em i c o b a c t e r i a sd e n t r od e 2-18 en 50 11 1-9 en 100 campos campos (un barrido) una m e d i a de 1 4 das. 1 9 en 10 campos 4-36 en 10 campos 2+ La composicin de los m e d i o s slidos habitualmente utilizados se describe 3+ 1 -9 por campo 4-36 por campo en l a T a b l a 53-5. Estos m e d i o s estn disponibles en t u b o s de tapn de r o s c a 4+ >36 por campo >9 por campo y botellas de prescripcin de 29,57 cm, el m e d i o de b a s e de a g a r tambin BAAR bacilos acido resistentes; Bamdo revision de loda la extension est disponible en las p l a c a s de Petri. Las botellas de prescripcin s e prefieModilicada de Kent PT. Kubica GP Public Health Mycobacteriology A Guide ren a los t u b o s con tapn de r o s c a por r a z o n e s de seguridad y p o r q u ep r o v e for the Level III Laboratory Atlanta, Department ol Health and Human Servi ces. 1985 con auto'i-racin e n una m a y o r superficie p a r ae lc r e c i m i e n t od e las m i c o b a c t e r i a s .L a sm u e s tras cutneas deberan inocularse en un m e d i o de h u e v o o de agar, y p a r a a s e g u r a r la obtencin de M. haemophilum (vase arriba) tambin debera depositarse e nu nm e d i od ea g a r chocolate, agar-sangre d eo v e j ad eC o l o m las de M A Cs u e l e n ser pleomrficas, o c a s i o n a l m e n t ec o c o b a c i l a r e s y se lien bia al 5 % ,a g a r Mueller-Hinton c o ns u p l e m e n t o de Fildes o L o w e n s t e m J e n con el cido perydico de S c h i f f (PAS). Las clulas de M. marnum son tpisen con citralo a m o n i o frrico al 2%. T o d o s los cultivos deberan ser i n c u b a c a m e n t e ms largas y ms a n c h a s que las de M. tuberculosis y suelen m o s dos a 37'C en una atmsfera con el 5 % 1 0 % de CO y los m e d i o s de t u b o t r a r rayas. Las clulas de M. leprae se tien ms dbilmente que la mayora deberan i n c u b a r s e en una posicin i n c l i n a d a con los t a p o n e s flojos d u r a n t e de l a s otras micobacterias. al m e n o s una s e m a n ap a r aa s e g u r a r una c o r r e c t a distribucin del i n o c u l o La especificidad de las tinciones para bacilos cido resistentes es del sobre la superficie. P a r am u e s t r a s cutneas, se d e b eh a c e r un s e g u n d o gru9 9 %om a y o r , y la sensibilidad es a p r o x i m a d a m e n t e del 2 5 % 7 5 % (Murray, po de cultivos i n o c u l a n d o e incubndolos a 30C. ya que ciertas m i c o b a c t e 1980: Rickman. 1980; Strumpf. 1979). Los falsos positivos (tincin positiva rias c r e c e nm e j o rat e m p e r a t u r a s ms bajas (M. marinum. M. haemophilum. c o n cultivo negativo) p u e d e n deberse a m i c r o o r g a n i s m o s no viables, c o m o M. chelonae. M. ulcerans). T o d o s los cultivos deben s e re x a m i n a d o ss e m a p u e d ep a s a r en pacientes que estn t o m a n d o el tratamiento antituberculon a l m e n t e al m e n o s durante seis s e m a n a s . so, a una prolongada descontaminacin que destruya t a n t o a las bacterias L am a y o r ventaja d e los cultivos c o n v e n c i o n a l e se sq u ep e r m i t e nl a visuac o n t a m i n a n t e sc o m o a las micobacterias o bien a una contaminacin duranlizacin de la morfologa y la pigmentacin de l a s col o ni a s, lo que es til para te el p r o c e s o de teido. Los factores que influyen en la sensibilidad de los el diagnstico, e s p e c i a l m e n t ep a r a diferenciar las colonias de M. tuberculoresultados son: 1) poblacin de pacientes (las personas con lesiones cavii c o b a c t e r i a s no tuberculosas. El a s p e c t o y las caracterstitadas tienen ms probabilidad de que tengan un esputo positivo que las que sis de aquellas m c a sd e crecimiento d e las colonias d e las m i c o b a c t e r i a sh a b i t u a l m e n t e hallano las tienen). 2) tipo de m u e s t r a s (las respiratorias es ms probable que d a s se recogen en la T a b l a 53-6. L a s desventajas de los m e d i o s slidos s o n sean positivas que otras muestras), 3) el nmero de m u e s t r a s examinadas, el prol o ngado t i e m p o de c r e c i m i e n t o de l a s m i c o b a c t e r i a s (las col o ni a s no 4) el nmero de bacilos cido resistentes presentes en las m u e s t r a s (son son visibles g e n e r a l m e n t e en un m e d i o slido antes de 3-4 s e m a n a s ) y su necesarios de 5.000 a 10.000 microorganismos/ml de m u e s t r ap a r a un reb a j a sensibilidad. La inoculacin en discos de a g a r Middlebrook, examinnsultado positivo), 5) las especies presentes (las m u e s t r a s con M. tuberculodose con el microscopio, permite una ms rpida deteccin de colonias, p e r o sis o M. kansasii pueden ser ms positivas que las que contienen otras s up r o c e s oe sm u y laborioso, n o estando disponible e nm u c h o s laboratorios micobacterias), 6) la experiencia del observador. 7) la tincin usada. Las tinclnicos (Welch, 1993). ciones fluorocromas son ms sensibles y fciles de l e e r que las tinciones El s i s t e m a radiomtrico s e m i a u t o m a t i z a d oB A C T E CT B 4 6 0 utiliza u n con carbol-fucsina y se r e c o m i e n d a np o r los expertos del C D C (Tenover, e d i o lquido (uno p a r a sangre [13 A.) y otro p a r a el r e s t o de m u e s t r a s [12 B]) 1993). Para p o d e r detectar el resurgimiento de la tuberculosis en EE.UU. el m que c o n t i e n e un sustrato de cido palmitico m a r c a d o con C, C a d am u e s t r a CDC tambin sugiere que. para las m u e s t r a s respiratorias, los resultados de e z c l a de antibiticos, e x c e p t oa l a s tinciones s e a n informados dentro de las 24 primeras h o r a s de la recep- es inoculada en un vial y se le aade una m la de sangre. Se incuban a m e d i oa m b i e n t e a 37 C durante 5 6s e m a n a s . cin de la muestra, lo que significa tener que p r o c e s a r las m u e s t r a s todos Para asegurarse el aislamiento de M. genavense. los cultivos de s a n g r e los das de la semana. (especialmente los q u e provienen d e pacientes c o n sida) d e b e ni n c u b a r s ed e 8a1 0 semanas. La multiplicacin de los bacilos en un m e d i o lquido y el uso Mtodos de cultivo de sustrato m a r c a d o libera CO al e s p a c i o que q u e d ae n c i m a del medio. L a s botel l a s s o n m a n u a l m e n t e cargadas en el B A C T E C TB460, q u em i d e la P a r a un ptimo aislamiento de las m i c o b a c t e r i a s a partir de las m u e s t r a s cantidad de '"CO, y c a l c u l a el ndice de c r e c i m i e n t o (Gl). Un Gl m a y o r de 1 0 clnicas, los e x p e r t o s del CDC r e c o m i e n d a n la inoculacin de las m i s m a sa sugiere que h a y micobacterias, y c u a n d o el Gl a l c a n z ae n t r e 50 y 1 0 0 se un m e d i o lquido y otro slido (Tenover. 1993). En general, los m e d i o s lquiTabla 53-4 Directrices para informar las e x t e n s i o n e s para bacilos cido resistentes
1 : l4 s

Tabla 53-5 Medio

M e d i o s habitualmente utilizados para el aislamiento de micobacterias Componentes Huevos coagulados, sales, glicerol. harina de patata Sales, vitaminas, cofactores, cido oleico, albmina, catalasa, glicerol, dextrosa Sales, vitaminas, cofactores, cido oleico, albmina, catalasa, glicerol, hidroxilato de casena al 0,1% Sales, vitaminas, cofactores. cido oleico, albmina, catalasa. glicerol, dextrosa e hidroxilato de casena Agente(s) inhibidores 0.025 g/dl verde malaquita 0.0025 g/dl verde malaquita 0.0025 g/dl verde malaquita 0.0025 g/dl verde malaquita 50 pg/ml carbenicilma 10 (ig/ml anfoteriema B 200 unidades/ml polimixma B 20 pg/ml trimetroprim-laclato

Lowenstein-Jensen Middlebrook 7H10 Midrllobrook 7H11 Selectivo 7H11 (medio de Mitchison)

1152

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Tabla 53-6

Morfologa de las colonias y caractersticas del crecimiento de las diferentes micobacterias halladas en el laboratorio clnico Colonias Morfologa Rugosa Rugosa, fina o Iransparente Lisa pequea, fina, Iransparente o larga, opaca, abovedada rugosa Pigmentacin N (amarillento) N (incoloro) N Tasa de crecimento (semanas)' 4-6 4-6 4-6 Comntanos

Especie d e Mycobacterium M. tuberculosis M. bovis M. avium complex

M. M. M. M M. M. M. M. M M M

scrotulaceum kansasu lortuitum-chelonae xenop szulgai malmoense simiae marmum haemophilum gordonae Ihermoresislible

Lisa, globulosa Rugosa, cristales de p-caroteno Lisa o rugosa Lisa, extensiones filamentosas ("nido de pjaros) Lisa o rugosa Lisa Lisa Arrugada, brillante, lisa, hemiesfnca (raro) rugosa, seca Rugosa. lisa Lisa Lisa o rugosa

S P II s S a 37C. P a 2SC Incoloros P" P N S P

4-6 4-6
1

El crecimiento requiere 8 semanas algunas colonias se vuelven levemente pigmentadas con la incubacin prolongada El pigmento varia de amarillo claro a naranja oscuro Raras veces son N o S Crece a 42T

4-6 4-6 2-3 4-6 2-3 4-6 4-6

<1

Crecimiento ptimo a 31-33C Crecimiento ptimo a 20-32C Crecimiento ptimo a 37-45C, El pigmento es amarillo-naranja, llegando hasta marrn

M M M M

terrae-triviale nonchromogenicum flavescens smegmatis

Lisa (M. terrae) o rugosa (M. triviale) Rugosidad intermedia Lisa Rugosa. lisa

N N S N (amarillento)

4-6 4-6 2-3

<1

Promedio en un medio slido " La produccin de pigmento suele requerir una exposicin prolongada a la luz N: no lotocromgena, S escolocromgena; P: fotocromOgena (vase Tabla 53-1); : ciertas especies tienen ocasionalmente la morfologa indicada.

hace una extensin del medio para teir bacilos cido resistentes. Los viales que contienen bacilos cido resistentes se subcultivan a su vez en un medio slido y se hacen test directos para su identificacin (se comenta en la siguiente seccin). Para cultivos positivos para micobacterias en sangre de pacientes con sida, se debera hacer un subcultivo en agar Middlebrook 7H11 que contenga micobactm J, para obtener M. genavense si los subcultivos iniciales del medio liquido son negativos, o bien, si el medio liquido es positivo, se deberan mandar al laboratorio de referencia para hacer los test oportunos. El SEPTI-CHEK AFB es un medio de cultivo bifsico para micobacterias que consiste en un medio lquido y un medio agar en un canal cerrado, similar al cultivo bifsico de sangre descrito en el Capitulo 57. El medio se inocula con la mueslra, el canal se sujeta a la parte superior de la botella y el sistema se invierte para permitir que el liquido H u y a por el medio del agar. El sistema se incuba de 6 a 8 semanas de 35 C a 37 C con un 5% a 7% de CO . y a intervalos regulares el lquido se subcultiva en el medio slido por el canal al invertir el sistema. La sensibilidad de este sistema es similar al de BACTEC TB460 (Abe. 1992; D'Amato, 1991: Isenberg. 1991). El tiempo de deteccin de crecimiento es, sin embargo, ms largo que en el BACTEC TB460, aunque ms rpido que en un medio slido convencional. El BBL-MGIT consiste en 4 mi de caldo 7H9 modificado y un indicador fluorescente metido en silicona en la ase de un tubo de vidrio de 16 x 100 mm. Los tubos se inoculan con la muestra, se aade una mezcla de antibiticos, para frenar el crecimiento de las acterias contaminantes, y un enriquecedor del crecimiento de micobacterias, y los tubos se tapan y se incuban a 37C durante ms de ocho semanas. Para detectar el crecimiento de las micobacterias, los tubos se colocan encima de un transiluminador de rayos ultravioletas de 365 nm o enfrente de una lmpara de Wood. La aparicin de una fuerte fluorescencia en el sensor (un brillo de color naranja en la base del tubo) indica crecimiento De modo alternativo, los tubos se pueden incuban en el instrumento totalmente automatizado BACTEC 960. que monitoriza de un modo continuo la florescencia y las seales de aquellos que son positivos. El MGIT es lan sensible como el BACTEC 460 para la deteccin de mico-

bacterias, pero el tiempo medio de crecimiento es algunos das mayor con el MGIT (Hanna. 1999; Pfyffer, 1997; Cornfield, 1997). Adems del BACTEC MGIT 960, hay otros tres sistemas totalmente automatizados de monitorizacin continua disponibles para el cultivo y deteccin de micobacterias: el sistema BACTEC 900MB (BD Biosciences) (Zanetti, 1 9 9 7 : Pfyffer, 1997), el sistema BacT/MB (Organon Teknika) (Brunello. 1999: Rohner. 1997) y el sistema de cultivo ESP II (sistemas de diagnstico Trek) (Tholken.1997. Woods.1997). Con cada sistema, las botellas se cultivan en el respectivo instrumento, donde se monitorizan los cambios de produccin y consumo de diferentes gases, lo que indica el crecimiento de micobacterias u otros microorganismos. En general, estos sistemas son comparables al BACTEC 460TB y tienen las ventajas de ser totalmente automatizados y m e n o s laboriosos.

Test para ia identificacin de micobacterias

La identificacin de micobacterias se h a basado tradicionalmente en la tasa de crecimiento en medios slidos, la morfologa de la colonia, la pigmentacin de la colonia con y sin luz y los resultados de los test bioqumicos. Los protocolos de identificacin de micobacterias mediante estos factores en el laboratorio de microbiologa se ilustran en las Figuras 53-2 a 53-3. Los lest bioqumicos especficos se describen con detalle en otros apartados (Kent. 1985). Aunque la mayora de las especies se pueden identificar de este modo, los resultados no suelen estar disponibles hasta vanas semanas o meses tras el crecimiento de colonias en un medio slido. Se recomiendan mtodos ms rpidos de identificacin que permitan la identificacin de MTBC antes de 21 das tras la recogida de las muestras (Tenover, 1993). Actualmente el mtodo de diagnstico de tuberculosis pulmonar ms rpido es el uso de amplificacin de cidos nucleicos para la deteccin directa de M tuberculosis en muestras clnicas (Dalovisi, 1996: Ichiyama. 1996. Wobeser. 1996). En la actualidad, dos de estos test (test directo de Mycobacterium tuberculosis amplificado [GEN-PROBE Inc.) y test de Mycobacterium tuberculosis AMPLICOR [sistemas diagnsticos Roche Inc.]) estn disponibles en

CAPITULO 53

MICOBACTERIAS

1153

Figura 53-2. rbol de decisin para la identificacin de micobacterias no fotocromgenas. Obsrvese que aunque Mycobactenum simiae suele ser fotocromgeno. este hecho es inestable y puede resultar aparente nicamente tras la exposicin a la luz durante un periodo largo. Algunas de las c e p a s de Mycobacterium bovis dan un positivo en la reaccin con niacina. (De Woods GL. Gutirrez Y: Diagnostic Pathology o! Infections Diseases. Filadelfia, Lea & Febiger. 1993, con autorizacin.)

todo el mundo y hay otro ms que est en estudio (BDProbeTec ET System, B D Biosciences). El test amplicor est aceptado por la Food and Drug Administration para el anlisis de muestras respiratorias BAAR positivas. El test Gen-Probe es aceptado para su uso con muestras respiratorias positivas y negativas para bacilos cido resistentes. Datos recientes sugieren que los test podan ser de utilidad en muestras negativas para bacilos cido resistentes en pacientes con alto riesgo de tuberculosis (p. ej., personas inlectadas con VIH y para personas encarceladas en centros penitenciarios), lo que permitira un diagnstico precoz y un rpido inicio del tratamiento (Gamboa, 1998; Bergmann, 1999). Los test aparecen para poder comparar las muestras de otros focos diferentes del respiratorio y. ms an. pueden ser tiles para el diagnstico de tuberculosis extrapulmonar (Pfyffer. 1996; Gamboa. 1997).

El test BACTEC TB NAP (para-nitro-<x-acetil-amno-|l-hidroxipropiofenonai diferencia a los MTBC de las micobacterias no tuberculosas en tan slo cuatro o cinco das tras haber detectado bacilos cido resistentes en un vial BACTEC 1 2 B (Gross, 1985). Una cantidad de caldo del vial 1 2 B que sea positivo se inyecta en dos botellas del medio 12B. una con NAP y otra sin NAP. Un incremento en el Gl en la botella sin NAP y sin producirse un incremento en la que lo contiene indica que se ha aislado un MTBC y que esas especies son susceptibles al NAP y, por tanto, inhibidos por el. Sin embargo, este test no diferencia las especies de MTBC. La prueba del ADN quimioluminiscente permite idenlificar algunas especies de micobacterias en tan slo una o dos horas tras el crecimiento (tanto en medio liquido como en slido) (Evans. 1992: Lebrun. 1992; Goto. 1992; Reisner, 1994). Las pruebas comerciales especificas para MTBC, MAC, M. avium.

M. s c r o / u l a c e i i n i

M. x e n o p i

vi. marnum
Figura 53-3. rbol de decisin para la identificacin de micobacterias fotocromgenas. (De Robert GD: Mycobacteria and Nocardia. En Washington JA II [ed.]: Laboratory Procedures in Clinical Microbiology, 2.'' edicin. Nueva York. SpringerVerlag, 1985. con autorizacin. )

Figura 53-4. rbol de decisin para la identificacin de las micobacterias escotocromgenas habituales. Obsrvese que Mycobactenum szulgai es fotocromgeno a 25' C y escotocromgeno a 35 C y que Mycobacterium xenopi c r e c e bien a 42C. (De Robert GD: Mycobacteria and Nocardia. En Washington JA II [ed.]: Laboratory Procedures in Clinical Microbiology. 2.- edicin. Nueva York. Springer-Verlag. 1985. con autorizacin.)
:

1154

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Test de sensibilidad
Actualmente se ha desarrollado una normativa estandarizada de sensibilidades de micobacterias nicamente para M. tuberculosis aislado. El estudio puede realizarse con colonias aisladas o en los viales positivos BACTEC 1 2 B (test indirecto) o de muestras de esputo con baciloscopia positiva (test directo). Tradicionalmente el mtodo de proporcin, un test modificado de dilucin de agar. se ha utilizado para evaluar la sensibilidad de M. tuberculosis al tratamiento. Con este mtodo los grmenes aislados que muestren alguna resistencia mayor del 1% se consideran resistentes a esa concentracin de frmaco. Los resultados estn disponibles en un minimo de 21 das. El sistema BACTEC TB460 tambin puede ser utilizado para estudiar la sensibilidad de las MTBC. estando disponibles los resultados en 5-7 das. Una descripcin ms detallada de estos procedimientos se puede encontrar en otros textos (Hawkins, 1991). Acerca de la posibilidad de la multirresistencia de M. tuberculosis, expertos del CDC recomiendan que se informe del resultado de la sensibilidad en menos de 28 das tras la recepcin de las muestras, un plazo que en la actualidad slo puede ser logrado por el BACTEC TB (Tenover, 1993). Tambin se puede estudiar la sensibilidad de las micobacterias no tuberculosas que tengan importancia clnica (Wallace. 1997): sin embargo, para algunas especies puede existir cierta correlacin entre los test de sensibilidad y la respuesta clnica al tratamiento. Adems, no hay mtodos de referencia estandarizados para estudio de sensibilidad de algunos de esos organismos. Los mtodos usados son el mtodo de proporcin, ensayos radiomtncos y microdilucin del caldo de cultivo. Para M. lortuitum-chelonae complex aislado se recomienda hacer la microdilucin y test con amicacina. celoxitma. ciprotloxacino, clarilromicina, doxiciclina, imipenem (slo para M. lortuitum). sulfametoxazol y tobramicna (slo para M. chelonae) (Woods, 1999). La dilucin del caldo (tanto macrodilucin como microdilucin) debera ser usada nicamente para estudiar la sensibilidad de M. aviuma los macrlidos (clarilromicina yo acitromicina) (Inderlied. 1997: Wallace. 1997).

M. chelonae
subespecie abscessus

V/. chelonae subespecie borstelense

Figura 53-5. rbol de decisin para la identificacin de micobacterias con un rapi do crecimiento con importancia clnica. Los asteriscos indican que se necesitan tesi bioqumicos adicionales para su diferenciacin. (De Robert GD: Mycobacteria and Nocardia En Washington JA II [ed.]: Labotatory Procedures in Clinical Microbiology. 2. ed. Nueva York. Springer-Verlag. 1985. con autorizacin.)
1

M. intracellulare. M. gordonaey M. kansasii estn actualmente disponibles. Estos estudios requieren un equipamiento mnimo (p. ej.. luminmetro, estufa, etc.). Las desventajas de las pruebas incluyen errores en la identificacin de un pequeo porcentaje de los MAC aislados (3%-5%) y resultados talsos positivos con la prueba de MTBC (Butler, 1994; Lebrun, 1992; Bull, 1992). La cromatograla con gas lquido, la cromatografa con lquidos de alto rendimiento y la cromatografa de capa fina permiten identificar colonias de micobacterias en un medio slido en 2-4 horas. Estas tcnicas, dado que son complejas y requieren un equipamiento caro, suelen realizarse preferentemente en laboratorios de referencia o de investigacin. Rara vez puede resultar imposible identificar una micobacteria por los mtodos previos. Un ejemplo es M. genavense. cuya identificacin requiere la determinacin de las regiones hipervariables de los genes ARN ribosomales 16S. Estas pruebas altamente sofisticadas slo se llevan a cabo en laboratorios de referencia o de investigacin.

TRATAMIENTO
Los aislamientos iniciales de Mycobacterium tuberculosis en todos los pacientes con tuberculosis deberan obligar a estudiar la sensibilidad a los tuberculostticos de primera lnea como isoniacida. rifampicina, piracinamida y elambutol. La sensibilidad deberia repetirse si el paciente continuase con esputo positivo tras tres meses de tratamiento (Tenover, 1993). Si el bacilo aislado es resistente slo a rifampicina o a dos o ms agentes de primera lnea, tambin se debera evaluar la sensibilidad a los frmacos de segunda lnea (estreptomicina, etionamda, kanamicna. capreomicina. ofloxacino y n fabutina). El rgimen quimioteraputico actualmente recomendado para el tratamiento de tuberculosis (Tabla 53-7) se debe iniciar antes de los resultados de sensibilidad, pero se debe alterar en funcin de los resultados si se demostrasen resistencias. La medicacin se deberia administrar mediante observacin directa. Los regmenes habitualmente empleados para el tratamiento de

CAPTULO 53

MICOBACTERIAS

1155

la infeccin por micobacterias se recogen en la Tabla 53-7 (Inderlied. 1993; Wolinsky. 1979; Wallace, 1983, 1994, 1997; Horowictz, 1994). Para muchas micobacterias no tuberculosas la duracin ptima del tratamiento se desconoce, pero los intervalos indicados en la Tabla 53-7 han sido exitosos en algunos casos.

la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) recomienda el uso de la vacuna BCG en los nios infectados por VIH al nacimiento o al poco tiempo del nacimiento. Est contraindicado su uso en nios con infeccin VIH asintomtica o en poblaciones donde el riesgo de tuberculosis es bap y en personas conocidas o con sospecha de estar infectadas por VIH (WHO. 1987).

Mycobacterium avium complex PREVENCIN Mycobacterium tuberculosis

La enfermedad diseminada por MAC en pacientes con sida se asocia con gran morbilidad y una disminucin de la supervivencia (Horsburgh. 1991: Nightingale, 1992). Ms an, lo ms deseable seria la prevencin de la entermedad. Dado que el MAC es ubicuo en el ambiente, la medida ms razonable para la prevencin es la inmunoregulacin o la quimioprofilaxis. Actualmente, el Servicio de Salud Pblica de EE.UU. y la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas recomiendan claritromicina o acitromicina de profilaxis en pacientes con sida con CD4- por debajo de 50 pl (CDC. 1997). La rifabutina es la alternativa para la profilaxis de la enfermedad por M. avium complex si ninguna de las previas fuese tolerable.

Se describen cuatro estrategias generales para el control de la tuberculosis (CDC. 1988). La ms importante es la identiticacin precoz y el adecuado tratamiento de personas con la infeccin tuberculosa. Esta medida hace que las personas infectadas dejen de ser contagiosas en pocas semanas y eventualmenle logra su curacin. La segunda estrategia consiste en identificar y tratar a los individuos con tuberculosis no contagiosa: enfermedad extrapulmonar. enfermedad pulmonar primaria en nios, enfermedad pulmonar sin confirmacin bacteriolgica e infeccin por M. tuberculosis sin enfermedad (p. ej asintomticos con test cutneo positivo y radiografa de trax normal). La tercera estrategia consiste en la creacin de un ambiente de segundad en las situaciones en las que existe un alto riesgo de transmisin: salas de autopsias, habitaciones para recogida de esputo inducido, reas de espera de pacientes respiratorios, centros penitenciarios, algunos refugiados sin hogar y los laboratorios de microbiologa. Para llevar a cabo esto, se deben documentar muchos asuntos (Segal-Maurer, 1994). Las habitaciones de los pacientes infecciosos, o en las que las muestras infecciosas sean manejadas, deben estar a presin negativa y el aire que pueda contaminarse con microgotas infecciosas debe ser eliminado al exterior. Un sistema de ventilacin de un solo paso (mejor mediante la colocacin de unas salidas supletorias de aire en el techo y la entrada de aire cerca del suelo) es lo recomendable, con un mnimo de 6 recambios de aire por hora (12 recambios por hora en cuartos de autopsias). Deben seguirse estas precauciones universales cuando se manejan todas las muestras, y tanto las muestras como los cultivos se deben manipular en una cabina certificada de seguridad clase II. Adems debe emplearse un respirador de partculas que filtre partculas entre 1 pm-5 pm de dimetro y se debe entrenar al personal dentro de un programa respiratorio. Las mascarillas quirrgicas estndar no son adecuadas. La cuarta estrategia consiste en la vacuna del BCG, una vacuna atenuada derivada de una cepa de M. bovis de las francesas Calmette y Gurin. Su eficacia en la prevencin de la tuberculosis es controvertida, pero un reciente metaanlisis de la bibliografa sugiere que reduce el riesgo de tuberculosis en un 50% (Colditz. 1994). En EE.UU. la vacuna BCG se recomienda slo en nios con test cutneo negativo y que pertenezcan a alguno de los siguientes grupos (CDC. 1988): 1) aquellos en contacto ntimo y prolongado con personas tratadas sin xito o reticentes al tratamiento, con tuberculosis pulmonar contagiosa y que no se puede separar de la fuente de exposicin y para los que el tratamiento preventivo a largo plazo no es posible, 2) aquellos expuestos continuamente a personas con tuberculosis por cepas resistentes a isoniacida y rifampicina. 3) aquellos grupos con una tasa de infeccin superior al 1% por ao. y para los que los programas habituales de vigilancia y tratamiento han sido intentados pero no han sido viables. La vacuna BCG no se recomienda en los trabajadores de salud de EE.UU. La recomendacin actual para la proteccin de los profesionales de la salud es una adecuada vigilancia que incluye perodos sistemticos con test cutneos (al menos anualmente, o ms frecuentemente para los grupos de alto riesgo) y profilaxis con isoniacida para conversiones recientes del test de la tuberculina y para personas con test cutneo positivo y que estn en contacto intimo con tuberculosos o que tengan patologa mdica como diabetes, insuficiencia renal o inmunosupresin patolgica o teraputica (CDC. 1988). La vacuna BCG no debe emplearse en inmunosuprimidos y debe darse con cuidado en aquellos con riesgo de infeccin por VIH. Se ha descrito enfermedad diseminada por M. bovis en pacientes con sida y adenopatas por M. bovis en nios infectados por VIH (CDC. 1985: Blanche, 1986). Sin embargo, la enfermedad diseminada por M. bovis no se ha descrito en pacientes con VIH asintomtico. En poblaciones donde el riesgo de tuberculosis es alto.

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SECCIN VI

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CAPITULO 53

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C A P T U L O

54

Enfermedades mich'cas
Washington C. Winn, JR., M.D. M.B.A. Fred W. Westenfeld, MT(ASCP)SM

NOMENCLATURA, TAXONOMA Y TCNICAS DE IDENTIFICACIN Colonia de hongos Estructura de levaduras e hitas Pigmento de hifas Estructuras reproductoras asexuales Estructuras reproductoras sexuales Tasa de crecimiento Inhibicin por cicloheximida Temperatura ptima para el crecimiento Pruebas bioqumicas Dimorfismo Pruebas inmunologas TCNICAS DE DIAGNSTICO Recogida de muestras Examen directo de muestras Aislamiento de hongos en cultivo Seguridad en el laboratorio Tcnicas para el estudio morfolgico de aislamientos fngicos Test de sensibilidad de aislamientos fngicos LEVADURAS E INFECCIONES POR LEVADURAS Gnero Candida Gnero Cryptococcus Gnero Malassezia Otras levaduras y patgenos semejantes a levaduras y saprofitos HONGOS DIMRFICOS Histoplasma capsulatum Blastomyces dermatitidis Coccidioides immitis Sporothrix schenckii Otros hongos dimrficos

DERMATOFITOS 1159 Enfermedad clnica Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones Especies de Microsporum Especies de Trichophyton Epidermophyton floccosum MOHOS DEMATIACENOS Enfermedad clnica CIGOMICETOS Factores de nesgo y enfermedad clnica Patologa de la infeccin por cigomicetos Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones Especies de Rhizopus Otros cigomicetos 1166 MOHOS HIALINOS SEPTADOS (HIPOMICETOS) Factores de riesgo Enfermedad clnica Patologa de la infeccin por hipomicetos Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones Aspergillus fumigatus Aspergillus ftavus Aspergillus niger Otras especies de Aspergillus Especies de Fusarium Pseudallescheria boydii/Scedosporium apiospermum Especies de Penicillium Otros mohos hialinos INFECCIONEES CAUSADAS POR ALGAS ACLORFILAS 1176 PNEUMOCYSTIS CARINII Factores de riesgo Enfermedad clnica Patogenia de las infecciones por Pneumocystis Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones BIBLIOGRAFA

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La micologia mdica se encuentra entre las diversas reas de la microbiologia y enfermedades infecciosas que abarcan levaduras unicelulares y mohos filamentosos, agentes que causan infecciones superficiales de la piel y enfermedades sistmicas de localizacin profunda, patgenos histricos establecidos y hongos saprofitos que han alcanzado el estatus de patgeno por las enfermedades y tratamientos modernos. Para los patlogos que se han formado en patologa quirrgica, la micologia mdica debera ser una adaptacin natural. La identificacin de hongos se logra en su mayoria por la

destreza humana en su observacin mejor que con mquinas. El estudio macroscpico de la muestra quirrgica se detiene en la morfologa de las colonias de los hongos aislados en medio agar; mientras que en anatoma patolgica, el anlisis definitivo del problema debe esperar hasta que se observe al microscopio. La caracterizacin de la estructura molecular de las clulas para el uso de anticuerpos monoclonales no se h a desarrollado mucho en micologa, pero se ha hecho una aproximacin y el diagnstico molecular ser indudablemente de una gran importancia en el futuro.

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS

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El objetivo de este captulo es presentar los lundamentos de la micologia mdica, poniendo ntasis en los usos prcticos y los patgenos fngicos que encontramos regularmente en el laboratorio. Llamamos la atencin al lector de la existencia de algunos grmenes potencialmente patgenos aislados con menor frecuencia. Hay varios textos de referencia excelentes que sirven de recurso para informarnos de hongos saprofitos no usuales que, cada vez ms, estn implicados en pacientes inmunodeprimidos como agentes causales (Kwon-Chung, 1992: Larone, 1995; Murray, 1999; Rippon, 1988; Sutton. 1998). Con el uso creciente de los protocolos inmunosupresores para trasplantes y quimioterapia de las enfermedades neoplsicas, todo hongo aislado debe considerarse como patgeno potencial. Hay que recordar que la infeccin invasiva puede producirse en personas que no estn inmunodepnmidas, o incluso en aquellos que no tienen la enfermedad manifiesta. Los anatomopatlogos, miclogos mdicos y los clnicos deben trabajar en equipo para proporcionar al paciente los mejores cuidados (Walker. 1982). Se produce una gran satisfaccin en el equipo mdico cuando se resuelve un problema clnico con un gran esfuerzo conjunto, pero el que ms se beneficia de que exista una buena comunicacin entre expertos es el paciente. El objetivo de este captulo est en el laboratorio de micologia. Chandler y Watts (1987) han hecho un atlas de histopatologia de la infeccin fngica que es excelente y comprensible. Las especies Prototheca son algas aclorfilas ms que hongos. Se explican en este captulo porque las caractersticas de las algas y las enfermedades que producen recuerdan ms a los hongos que a cualquier otro agente infeccioso. El Pneumocystis cannii tiene caractersticas de protozoos y hongos. Aunque siempre se le ha englobado dentro de las enfermedades parasitarias, los estudios moleculares sugieren una relacin ms cercana a los hongos, por eso se le ha incluido en este captulo.

riticas que se reproducen de un modo tanto sexual como asexual. Se clasifican en funcin de la naturaleza de las estructuras reproductoras. Los estados sexuales de muchos hongos son desconocidos: estos organismos, conocidos como hongos imperfectos, se clasifican por sus estructuras reproductivas asexuales. Estos estados asexuales son, por supuesto, slo imperfectos para los taxonomistas, la mayora de los miclogos y. sin dudarlo, los hongos mismos son perfectamente felices con su estado incompleto. U n a vez que la fase sexual, llamada teleomorfa, de los hongos se conoce, se reclasifica al organismo, aunque en la actualidad el nombre que antes se daba a la lase asexual imperfecta, llamada anamorfa. an se conserva Por eiemplo. poca gente conoce Histoplasma capsulalum. Blaslomyces dermatitidisy Criptococcus neoformans por sus respectivos nombres teleomrficos, A/ellomyees capsulatus. Ajellomyces dermatitidis y Filobasidiella neoformans respectivamente. Por el contrario, la fase sexual Pseudatlescheria boydii y su fase asexual Scedosporium apiospermum s que se reconocen en la prctica comn. La mayor parle de la taxonoma de los hongos se debe a los detalles estructurales, porque la clasificacin y la identificacin en el laboratono dependen mucho de la morfologa. En la Tabla 54-1 hay un resumen donde se explican los trminos ms importantes. En este capitulo nosotros rechazamos los complicados esquemas taxonmicos en favor de un concepto ms simple de los patgenos que se encuentran habitualmente en el laboratorio. Para determinaciones prcticas, unas pocas caractersticas generales sirven como base para identificar los hongos en el laboratorio (Tabla 54-2). Como los miclogos estn aprendiendo, da a da. ms de hongos, la reclasificacin de los organismos se produce de modo regular. McGinms (1999) ha resumido algunos de los cambios en la taxonoma y nomenclatura de los hongos importantes en el mbito mdico. La influencia de las tcnicas moleculares sin duda ir creciendo de modo importante en la taxonoma de los hongos, como tambin lo har el diagnstico en un futuro cercano.

NOMENCLATURA, TAXONOMA Y TCNICAS DE IDENTIFICACIN

El primer obstculo para los miclogos principiantes es la nomenclatura y la taxonoma manual. Los miembros del remo de los hongos son clulas euca-

Colonia de hongos
La caracterstica ms simple es la naturaleza de la colonia de hongos. Las levaduras son organismos unicelulares que por lo general se reprodu-

Tabla 54-1 Trmino Micelio areo Anamorla Ascoma Ascospora Ascos

G l o s a r i o d e t r m i n o s habituales e n micologia mdica Definicin Hila producida sobre la superficie del medio agar La forma asexual de un hongo La estructura que contiene un asco Hay muchos tipos de ascomas Espora sexual que contiene dentro un asco Estructura con forma de saco que contiene esporas sexuales Tambin puede estar desnudo o contenido dentro de otra estructura Eslruclura superviviente Ascoma completamente encerrado, compuesto de capas de hitas Las ascosporas se libran por ruptura Extensin de esporangioforas en la base del esporangio La clula que produce conidias La estructura de la hifa especializada que lleva las conidias: es diferente de las clulas conidiognicas Estructura reproductiva asexual formada de cualquier modo que no implica divisin Suave, referente a la morfologa de las colonias La unidad vegetativa de moho; posee paredes paralelas Nacido dentro de una hifa La ms larga de los dos lipos de conidias producida por el mismo modo La ms pequea de los dos tipos de conidias producida por el mismo modo Hongo filamentoso que se reproduce sexual o asexualmente Masa de hifas que adorna a un moho Ascoma cerrado con un poro en la parte superior, a travs del cual las ascosporas son liberadas Serie de clulas levadunformes conectadas (blastoconidias) que recuerda a una hifa pero contiene reas de estrechamiento entre clulas adyacentes Pared transversal en la hila Estructura de la hifa especializada que transporta el esporangio Espora asexual producida dentro de un esporangio Estructura con forma de saco en la que se desarrollan las esporangiosporas asexuales La forma sexual de un hongo Nacido en el final de una hifa Hifa que se ha producido en la superficie de un medio agar Clula alargada o hinchada, habitualmente en el final de una conidiofora o esporangiofora, pero puede hallarse dentro de una hifa Hongo de clula nica que se reproduce por gemacin o por fisin

Clamidiospora Cleistoiecio Columela Clula conidiognica Conidiofora Conidias Glabrosa Hifa Intercalara Macroconidias Microconidias Moho Micelio Perilecio Pseudohifas Septo Esporangioforas Esporangiosporas Esporangios Telemorfa Terminal Micelio vegetativo Vescula Levadura

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Tabla 54-2

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Caractersticas d e utilidad para la identificacin d e h o n g o s Ejemplos Colonias de organismos unicelulares (levaduras) Colonias de organismos filamentosos (mohos) Gemacin Gemacin con pseudohifas Levadura redonda con capsula Levadura en gemacin con collaretes Hitas verdaderas: septadas Hilas verdaderas no septadas o de septo escaso Pseudohifas No dematiaceno o hialino (ligero o moho pigmentado) Dematiaceno (oscuro) Conidias Esporas Ascos poras Cleistoteco Peritecio Lento (ms de 10 das) Medio (de 5 a 10 das) Rpido (menos de 4 das) Muchos de los hongos saprofitos De 25"C a 30'C De 35C a 37C De 40C a 42X De 5CTC a 58C Asimilacin Fermentacin Degradacin enzimlica (p. ej. ureasa) Aumento de crecimiento Feno-oxidasa (melanina) Sustiluida por mmunolusin o prueba de ADN en la mayora de laboratorios Cryptococcus. Histoplasma. Coccidioides. Blaslomyces Histoplasma. Coccidioides. Blaslomyces

Caracterstica Tipo de crecimiento microscpico Morfologa de la levadura

Morfologa de estructuras filamentosas

Pigmento de la hifa Morfologa de las estructuras reproductivas asexuales Morfologa de las estructuras reproductivas sexuales (demostrable slo excepcionalmente) Tasa de crecimiento

Inhibicin por cicloheximida Temperatura de crecimiento ptimo (ocasionalmente de inters)

Pruebas qumicas

Conversin de fase moho a levadura Deteccin inmunologa de antigenos o anticuerpos Caracterstica molecular del ADN

cen de manera asexual por gemacin para producir una clula hija. Como resultado, la masa de colonias de una levadura es una coleccin de organismos individuales distintos que, sin ser sorprendente, se parece a una colonia de bacterias en la superficie agar. Las colonias de levaduras por lo general son enteras (bordes regulares) y lisas. Cuando estn amontonadas y apagadas, como es el caso de la Candida aibicans, las colonias pueden parecer de estafilococos. Las levaduras producen catalasa, por eso el microbilogo imprudente que no haga una tincin de Gram o una preparacin en fresco podra confundir una colonia de levaduras con una de bacterias y hacer un informe totalmente equivocado. Las levaduras encapsuladas. como el Criptococcus, pueden parecerse a bacterias encapsuladas. tal como Klebsiella pneumoniae. aunque equivocarse al identificadas en este caso es menos probable. Las pseudohifas de las levaduras por lo general son visibles al microscopio como extensiones filamentosas en los bordes de la colonia, y se conocen coloquialmente como "pies", como si la colonia fuera un ciempis (Fig. 54-1). Al contrario que las levaduras, los mohos son hongos filamentosos y multicelulares. La naturaleza filamentosa del moho da a las colonias una apariencia lanuda, de pelusa o aterciopelada, alguna vez puntual con un aspecto granular o de polvo, que se produce por la formacin de estructuras reproductoras asexuales (Lmina 54-1). En otras ocasiones la colonia puede tener una apariencia glabrosa (lisa). La lnea de diferenciacin entre mohos y levaduras no est totalmente definida. Algunas levaduras tambin desarrollan un componente filamentoso que en algunos casos podra verse macroscpicamente. Y a se han mencionado antes las extensiones filamentosas de las colonias de C. aibicans. Otras levaduras desarrollan extensiones filamentosas desde la superficie de la colonia, siendo semejante al crecimiento de pelo de la cabeza de un cientfico loco. Las especies Trichosporon son levaduras que desarrollan extensiones filamentosas, mientras que la Exophiala eanselmei es una levadura dematiacena que desarrolla un micelio segn madura. Lo ltimo en camufla-

je se ejemplariza por el hongo dimrfico. que exhibe una forma de moho bajo algunas condiciones y una forma diferente de moho en otras circunstancias. Los hongos dimrficos ms importantes son patgenos sislmicos que se comportan como mohos en el ambiente y en el medio agar a 25"C-30C. Por el contrario, en el tejido humano es una levadura o. en el caso del Coccidioides immilis, una esfrula. Cuando se cultiva a 37 C, la forma del tejido se reproduce. Aunque estos patgenos clsicos es lo que por lo general entendemos por hongos dimrficos, otros agentes menos comunes tambin muestran dimorfismo. Por ejemplo, el Penicillium mametfei, un miembro distinguido de ese gnero tan extendido, crece como un moho en un medio de

Figura 54-1. Extensiones filamentosas desde la periferia de las colonias de Candida albicans que se c o n o c e n coloquialmente c o m o pies

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ENFERMEDADES MICTICAS

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Figura 54-2. Hilas con ramificaciones septadas de Aspergillus lumigatus. L a s Figura 54-4. Cadenas de u n a levadura alargada d e Candida albicans q u e produr a m a s de las hilas tienen ngulos agudos. Esputo expectorado (tincin de Gram). cen pseudohifas. L a unin d e las levaduras individuales es an evidente en e s t a preparacin. Advirtase q u e las paredes celulares d e estas pseudohifas n o son paralelas. (Tincin de Gram.)

laboratorio a 25"C-30"C, pero en los tejidos humanos lo encontramos como forma de levadura. Los cuerpos esclerticos que encontramos en los tejidos de los pacientes con cromoblastomicosis son una forma vegetativa detenida entre una forma moho/levadura de los hongos dematiacenos. que aparecen como mohos cuando crecen en un medio slido a temperatura ambiente. El Cokeromyces recurvatus es un patgeno humano raro que tiene mortologia de levadura en infecciones humanas in vitro a 37 C, pero crece como moho a 25C-30C (McGough, 1990). La Malassezia frfures un ejemplo de dimorfismo reversible, que produce tanto clulas levaduras como hilas en las lesiones cutneas de la pitinasis versicolor. En el laboratorio es raro encontrar la forma de hifa. salvo que haya unas condiciones de cultivo especiales (Marcon,1992).

Estructura de levaduras e hitas

L a mortologia (o ausencia) de formas filamentosas es una caracterstica importante para la identificacin de las levaduras y mohos. La estructura filamentosa de los mohos se relaciona con una hifa. Un conjunto de hilas se conoce como micelio. El micelio que crece en la superficie del agar o en el agar se conoce como micelio vegetativo, mientras que las extensiones filamentosas por encima de la colonia se llaman micelios areos. Las hifas verdaderas pueden tener paredes perpendiculares que contienen poros para la comunicacin a travs de las hifas o paredes perpendiculares completas que dividen a la hifa en mltiples clulas. Las hifas que tienen paredes perpendi-

culares estn septadas (Fig. 54-2), mientras que aquellas sin paredes perpendiculares estn sin septar (Fig. 54-3). Una vez ms. la situacin es una sombra gris ms que blanca y negra. Algunos hongos que tienen hifas septadas tambin tienen hifas especiales septadas o sin septar (conidioforas) que tienen estructuras reproductivas asexuales. A la inversa, algunos hongos llamados hongos no septados tienen en ocasiones paredes cruzadas, y quiz debera llamrseles de septo escaso. Es importante, por tanto, evaluar el micelio integramente. La anchura de la hifa y el ngulo de las ramas son pistas importantes para identificar la cepa. Entre dos de los mohos patgenos no invasivos clsicos, los cigomicetos, como el Rhizopus spp., tienen hifas anchas con forma de cinta y sus ramas en ngulos rectos (vase Fig. 54-3), mientras que el Aspergillus spp. y la mayora de los otros mohos hialinos tienen hifas ms estrechas y ramas en ngulos agudos (dicotmicamente) (vase Fig. 54-2). Adems, el incremento en el uso de terapias inmunosupresivas y la aparicin de enfermedades inmunosupresivas, como el VIH, han aumentado la frecuencia con que los hongos saprofticos comunes producen enfermedades invasivas (Ftinaldi. 1991). Determinar a un hongo como Aspergillus en funcin de la morfologa de la hifa en una extensin o en una muestra de tejido es en realidad slo una afirmacin de las rarezas a pnori para este grupo de patgenos. Es mejor describir simplemente las caractersticas de la hifa. Cuando las levaduras se reproducen asexualmente por gemacin, la clula hija por lo general aparece al final de una clula levadura y con el tiempo se extiende hasta formar una nueva clula levaduriforme Si una serie de las clulas hijas no se separa enteramente de la clula original, se produce una pseudohila. Las pseudohifas se distinguen de las hifas verdaderas por la presencia de una estenosis en la unin de las clulas adyacentes, por la localizacin uniforme del septo en un punto de la rama del micelio y porque la talla de la clula hija llega a la de la madre o menos (Fig. 54-4). Por el contrario, las paredes de las hilas verdaderas son paralelas sin estenosis (vase Fig. 54-2). C. albicans y algunas cadenas de Candida tropicalis pueden producir tanto hifas verdaderas como pseudohifas, dependiendo de las condiciones de crecimiento, y diferenciar la Candida del Aspergillus en una muestra de tejido en ocasiones puede ser problemtico. Por el contrario, el Cryptococcus spp. produce slo levaduras gemadas y en raras ocasiones pseudohifas primitivas o rudimentarias, pero no forma verdaderas hifas.

Pigmento de hifas
Las hifas del hongo dematiaceno contienen un pigmento de melanina que da coloracin marrn a las hifas en las preparaciones microscpicas y hace que las colonias de los hongos parezcan verde oscuro, marrn o negro (Lmina 54-2). Los tintes que se utilizan para teir las extensiones.

Figura 54-3. Hifas anchas, no septadas, de un ogomiceto en tejido cerebral En la hila hay una rama en ngulo recto. (Hematoxilina-eosina.)

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

las preparaciones frescas o las secciones histolgicas pueden oscurecer el color parcialmente, lo cual puede demostrarse en preparaciones sin teir. L a apariencia macroscpica de los hongos dematiacenos vara desde el verde oscuro hasta el negro, pasando por gris. Estos hongos que carecen de pigmento hifal oscuro se llaman comnmente hialinos (claros o incoloros). Algunas autoridades prefieren no utilizar este trmino, porque una pigmentacin clara puede producir colonias de colores. Adems, las estructuras reproductivas asexuales de algunos mohos hialinos pueden tener pigmentos verdes, marrones o negros que dan color a la superficie de la colonia una vez que se han formado las estructuras reproductoras, La apariencia real de estos mohos, por lo general, puede comprenderse al observar la parte de atrs de la colonia, que mantiene una coloracin clara. Por el contrario, tanto la parte de delante (anverso) como la parte de atrs (reverso) de las colonias de dematiacenos suelen mostrar el pigmento oscuro. Aunque el C. neolormans no se considera un hongo dematiaceno. el que esta levadura produzca melanina nos da una pista para identificarlo. Las clulas de la levadura del C. neolormans no estn pigmentadas, pero podemos encontrar melanina en la levadura y en las hifas pigmentadas de los hongos dematiacenos por el mtodo de tincin Fontana-Masson para pigmentar melanina (Ro, 1987). En ocasiones, el pigmento marrn no lo encontramos en los hongos que consideramos dematiacenos. Es importante aclarar que, sin embargo, en ocasiones los hongos no dematiacenos pueden teirse con el tinte Fontana-Masson, por eso es muy importante considerar otras caractersticas diagnsticas, incluyendo la morfologa de las hifas (Kimura. 1998).

Figura 54-6. Levaduras en gemacin y sin gemar de Candida albicans (tincin de Gram).

Estructuras reproductoras asexuales

El primer punto para identificar los mohos es la caracterizacin de las estructuras reproductoras asexuales. En las levaduras, estas estructuras sirven como pistas auxiliares en la identificacin. Las dos principales estructuras asexuales son las esporas y las conidias. Las esporas de modo natural pueden ser sexuales o asexuales, mientras que las conidias son siempre asexuales. Estrictamente hablando, las esporas asexuales siempre se producen por divisin dentro de una estructura que abarca que se llama esporangio y las esporas se llaman esporangiosporas (Fig. 54-5). Las conidias, que son mucho ms diversas, se forman por la diferenciacin de la punta o el lado de una hifa frtil, como la conidiolora. o por la diferenciacin de la hifa misma. Desgraciadamente, el uso adecuado de los trminos conidia y espora en la bibliografa, es muy pobre, y la coherencia es peor. Los trminos espora y esporulacin se usan como trminos para reproduccin asexual, y el trmino espora se usa algunas veces cuando hubiera sido ms preciso usar conidia. Kwon-Chung y Bennet (1992) han sealado que el modo en que se produce la esporulacin puede ser tan importante como la

morfologa de la conidia, y ponen como ejemplo la diferencia entre hongos dematiacenos, como Drechslera spp. y Helmlnihosporlum spp., que no son patgenos humanos, y Bipolaris spp., que en ocasiones es un patgeno humano. El principal mecanismo de reproduccin asexual de las levaduras es la gemacin. El proceso comienza como una suavizacin de la pared celular de la clula madre, seguida por una expansin de la pared celular (reventn). Un tabique cierra el lmite entre la clula hija y la madre (Fig. 54-6). Si n o hay separacin, el resultado, como se dijo anteriormente, es una pseudohifa. Esta gemacin clsica da como resultado una blastoconidia segn Rippon, o u n a blastoespora segn Kwon-Chung y Bennet. Menos corriente es la divisin transversa que se produce en P. marneffei. Los trozos de micelio vegetativo que se diferencian en conidias se llaman clulas conidognicas. Las hifas especializadas que sostienen las conidias se llaman conidioforas. que pueden ser tanto una clula conidiogmca que crece del micelio vegetativo como una hifa de soporte. En el caso del Aspergillus spp. la conidiofora. que est sin septar. alarga la cola hasta formar una vescula hinchada (Fig. 54-7). De esa vescula, las clulas conidognicas. que se llaman fildes. crecen para sujetar las cadenas de conidias. Algunas especies de Aspergillus producen una fila de fildes, que se produce en una hilera de clulas estriles, con las conidias que crecen de las fildes distales. Los cigomicetos producen estructuras de soporte llamadas esporangioforas, en las cuales los esporangios y las esporangiosporas se

Figura 54-5. Las esporangioforas de Rhizopus s p p soportan esporangios, que contienen esporangiosporas. Los rizoides surgen de las hilas cercanas al origen de las esporangioforas (lactofenol algodn azul). (Fotografa cortesa del Centers lor Disease Control and Prevention.)

Figura 54-7. Cabezas de Aspergillus lumigatus. Las conidioforas estn a u m e n t a das en el extremo formando una vescula. Las fildes surgen de la m i t a d superior de la vescula, y las cadenas de conidias se colocan paralelas al eje longitudinal de la conidiofora. (Lactofenol anilina azul.)

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ENFERMEDADES MICTICAS

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Figura 54-8. L a s porciones d e los micelios de Coccidioides immitis se n a n dteFigura 54-10. Microconidias alargadas d e Trichophyton tonsurans alineadas a lo rendado en artroconidias. Por olro lado, las artroconidias con lorma de barril estn largo de la superficie de la hitas (lactofenol anilina azul), separadas por unas clulas vacias de pared fina (lactofenol anilina azul).

desarrollan en las colas (vase Fig. 54-5). Una extensin del pex de la esporangiospora en el esporangio se denomina columela. La conidiognesis llica es un proceso en el que la conidia no se desarrolla hasta que se forma un tabique entre sta y la clula madre. La conidia se origina de toda la clula madre. Los patgenos humanos ms importantes que tienen una conidiognesis tlica son los dermatofitos y los hongos dimrlicos C. immitis. Segn progresa la conidiognesis. la artroconidia producida por Coccidioides se rompe fcilmente, liberando un gran nmero de conidias en forma de barril que se diseminan fcilmente y que termina con un alto grado de infectividad que demuestra este importante patgeno humano (Fig. 54-8). La conidia tlica de los dermatofitos se divide en dos tipos segn el tamao: macroconidias grandes, que tienen septaciones (Fig. 54-9), y microconidias unicelulares, que son estructuras ms simples (Fig. 54-10). El olro tipo de conidiognesis es la blstica, en la que el protoplasma de la clula conidiognica se rompe dentro de la conidia. La forma ms simple de la conidiognesis blstica es el mtodo de gemacin, por el cual se desarrollan muchas levaduras, incluida la Candida. Como con las conidias tlicas, dividimos las blastoconidias en dos tipos, dependiendo de si toda la pared se incluye en el proceso. Habra que hacer una divisin adicional entre las especies en las que la pared celular externa no participe en la conidiognesis (enteroblstica). Las filides son clulas conidiognicas

que tienen un collarete en los pices, que se produce cuando la cola libera la primera conidia. El collarete puede ser una estructura con lorma de termo visible, como en la Phialophora spp., o una estructura invisible, como en el Aspergillus spp. Por el contrario, los anlidos son clulas conidiognicas que se rompen para liberar un anillo de material celular en la base de la conidia cuando se separa de la anlida. La formacin de conidias secuenciales en la base empuja a la clula mas vieja a la cola de la cadena, y as deja una sene de anillos o anelaciones en el pex de la anlida. registrando sucesos anteriores, como anillos en un rbol. Es difcil ver algunos de estos pequeos detalles con la luz del microscopio. La diferenciacin de varias estructuras de conidias es la clave para la adecuada identificacin de las muestras aisladas. En algunos casos, las caractersticas morfolgicas se comprenden fcilmente. Como en la patologia quirrgica, reconocer el patrn es una herramienta importante para identificar la mayora de los patgenos saprofitos. Es importante apreciar las caractersticas de la morfologa de la totalidad de la preparacin sin localizar en estructuras aisladas o aberrantes, lo mismo que es importante para el patlogo dedicarse al tejido patrn sin distraerse por clulas atpicas ocasionales. Las estructuras conidiales en desarrollo del Aspergillus o Paecilomyces. pot ejemplo, pueden parecerse a las estructuras del Penicillium. y el observador puede confundirse al pensar que hay dos mohos presentes. Tambin hay que recordar la posibilidad de un cultivo mixto. Un miclogo con grandes conocimientos debe usar un objetivo de bajo aumento para la observacin inicial. En todas las disciplinas morfolgicas, sin embargo, el hallazgo de detalles celulares con el bajo aumento obliga a un anlisis ms detallado con mayor aumento. El excelente arte del diagnstico micolgico descansa en la apreciacin y diferenciacin de los detalles celulares y. en algunos casos, la tarea requiere una experiencia considerable. Algunas veces el aislado debe ser incitado a producir las estructuras necesarias para el diagnstico por la seleccin del medio adecuado (Tabla 54-3). En general, el medio enriquecido favorece la preparacin del micelio vegetativo, mientras que las estructuras reproductoras asexuales se fomentan en el medio basal. El subcultivo en agar agua o agar patata es una tcnica usual para fomentar el desarrollo de las estructuras de las conidias. El agar zumo V-8 se ha usado para el estudio de estructuras de conidias en hongos dematiacenos y para el tomento de la formacin de ascosporas en Saccharomyces. El color de las colonias de Aspergillus se estudia mejor en agar Czapek-Dox. mientras que el Trichophyton rubrum lo fomentamos para producir un pigmento rojo en agar patata o agar cornea con glucosa al 1%. Quiz lo ltimo en un medio especial es agar de estircol de pjaro filtrado, desarrollado por Staib y Blisse (1982) para estudio del C. neolormans. La experiencia tambin es importante para determinar si un subcultivo se ha incubado el tiempo suficiente para que se formen las estructuras diagnsticas. Las estructuras semejantes raices (rizoides) que se desarrollan

Figura 54-9. Mltiples m a c r o conidias cortas, con f o r m a de porra de Epidermophyton lloccosum. Alguna de las comdioforas estn ramificadas, y las microconidias estn ausentes. (Lactofenol algodn azul.) (Fotografas cortesa del Centers for Disease Control and Prevenlion.)

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MICROBIOLOGA MDICA

Tabla 54-3 Medios suplementarios para la identificacin de hongos Medio Agar crnea con Tween 80 Medio de ascosporas. agar V-8 Agar dextrosa patata con glucosa al 1% Agar patata Agar C/apek-Dox Agares de Trichophyton Agar de semilla de pjaro (negro) Infusin de corazncerebro con sangre Agar urea Christensen Cullivo con diferentes agares Funcin Visualizar la morfologia de la levadura Desarrollo de las ascosporas Desarrollo del pigmento do Trichophyton rubrum Desarrollo del pigmento de Trichophyton rubrum: morfologa del moho Identificacin de especies de Aspergillus Diferenciacin de las especies de Trichophyton Demostrar la melanina en Cryptococcus neolormans Puede aumentar el aislamiento de hongos dimrficos Diferenciacin de Trichophyton rubrum del Trichophyton mentagrophytes Estudio de la estructura microscpica y su origen

para que aparezcan las colonias. El significado de las colonias de hongos de crecimiento rpido, que aparecen despus de una incubacin prolongada en el medio micolgico. debe cuestionarse como posibles contaminantes. Sin embargo, hay excepciones para esta generalizacin. C. immilis, que es un patgeno clsico, crece relativamente rpido y podra incluso recuperarse en las placas de agar en el laboralorio bacteriolgico si la incubacin es grande. Aspergillus spp.. Scedosporium apiospermum, los cigomicetos y muchas levaduras crecen rpido. Entre los dermatofilos, el porcentaje de crecimiento es una caracterstica importante y podra ayudarnos a identificarlos.

Inhibicin por cicloheximida

La falta de inhibicin por la cicloheximida tambin es una pista til para ver la presencia de patgenos, especialmente entre los hongos dimrficos y dermatofitos. El agar micosel y micobitico. que se utilizan normalmente como medio para aislar, contienen 0,04%-0,05% de cicloheximida. Un hongo que tiene un crecimiento lento en un medio que contiene cicloheximida debera alertar al miclogo de la posibilidad de que est presente un hongo dimrico, o que, con una clnica compatible, se haya aislado un dermatofito. Una vez ms, hay excepciones importantes para esta regla. Los cigomicetos y C. neolormans se inhiben completamente por la cicloheximida. Las especies de Aspergillus y algunas especies de Candida se inhiben parcial o totalmente.

a partir de la hifa de algunos cigomicetos son caractersticas diferenciadoras importantes, pero no pueden detectarse si se hace una observacin precoz. Debe admitirse que algunas de las tcnicas para una diferenciacin completa son difciles, o estn incluso por debajo de lo que la mayora de los laboratorios alcanza. Por ejemplo, el patgeno dematiaceno Exophiala (Wangiella) dermatitidis produce conidias blsticas con filides y anlidas. Sin embargo, no se reconoci la presencia de anlidas cuando lo miraron con un microscopio de luz ptica, y este organismo ha sido alguna vez clasificado como Phialophora dermatitidis. El reconocer que las anlidas eran formadas por la muestra aislada condujo a asignar un nuevo gnero, Wangiella dermatitidis, que contena filides y anlidas. Hay un desacuerdo entre si estas especies deberan estar en el gnero Exophiala o Wangiella (McGinnis, 1999). A pesar de lodos los esfuerzos, algunas cepas no producen estructuras reproductivas asexuales. En las colonias queda pelusa, y consiste slo en hifas areas y vegetativas morfolgicamente. Estas hifas se describen como hifas estriles o micelios estriles.

Temperatura ptima para el crecimiento

El crecimiento a temperatura elevada es en ocasiones una herramienta diferencial para identificar los hongos (Kwon-Chung, 1992). La mayoria de los hongos y levaduras crecen a 25C-30C. El patgeno ms importante en el gnero Cryptococcus es el C. neolormans, que es, y no por coincidencia, el nico que crece bien a 37 C. Como crece rpido, con frecuencia tiene que ser el primer patgeno en aislarse en las placas agar incubadas a 35"C-37"C en el laboratorio bacteriolgico. El Trichophyton verrucosum produce distintas cadenas de clamidosporas cuando se incuba a 37 C. El crecimiento del Cladosporium trichoides (bantianum) a 42C-43C es un modo fiable para diferenciar estas especies de otros miembros del gnero. Asimismo, m u c h a s Exiophiala dermatitidis aisladas crecen a 40' C, mientras que el E. jeanselmei, con una morfologa similar, no crece a temperaturas por encima de 37C. Determinar el rango de temperatura al que crecen es una medida til para diferenciar entre algunos miembros de los cigomicetos (Kwon-Chung, 1992).

Estructuras reproductoras sexuales

Las estructuras reproductoras sexuales en ocasiones son de valor en el laboratorio de micologa para identificar patgenos comunes y saprofitos. Se pueden producir una gran variedad de estructuras sexuales, pero la mayora de ellas no suelen encontrarse. Las dos estructuras ms frecuentemente documentadas son ascis desnudos de Saccharomyces cerevisiae y el cleistotecio de Pseudallescheria boydii (la fase sexual de Scedosporium apiospermum). Aspergillus nidulans, o el grupo de Aspergillus glaucus. Los ascis desnudos del Saccharomyces recuerdan a clulas ovaladas de la levadura en las que hay de una a cuatro ascosporas individuales haploides (Lmina 54-3). La formacin de ascosporas en Saccharomyces spp. puede fomentarse al incubarlo en cierto medio agar, como agar zumo V-8, pero este esfuerzo por lo general no es necesario, porque con los sistemas comerciales de identificacin de levaduras pueden identificarse bioqumicamente. Las ascosporas pueden visualizarse en preparaciones frescas, pero se detectan de un modo ms fiable con un tinte resistente al cido. Un cleistotecio es un cuerpo sexual en forma de fruta en el que estn las ascosporas totalmente encerradas y slo pueden liberarse por la ruptura de la pared del cleistotecio (Fig. 54-11). La pared se compone de una o varias capas de hifas especializadas. Un peritecio es similar a un cleistotecio. pero tiene una abertura en el pex de la estructura en forma de pera.

Pruebas bioqumicas
Las pruebas bioqumicas son las ideales para identificar las levaduras, y en ocasiones son tiles para identificar los mohos. La caracterizacin bioqumica puede acompaarse por un estudio de fermentacin o asimilacin de

Tasa de crecimiento
La tasa de crecimiento de los hongos aislados proporciona una pista til para posibilidades diagnsticas. En general, los hongos patgenos dimrficos y los dematiacenos crecen despacio, necesitando une. semana o ms Figura 54-11. Se pueden ver ascosporas dentro de un cleistotecio del grupo de Aspergillus glaucus (lactofenol anilina azul).

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ENFERMEDADES MICTICAS Tabla 54-4

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patrones, de los cuales la asimilacin de patrones se usa exclusivamente en la mayora de los laboratorios. La fermentacin de los carbohidratos es el uso anaerbico de los carbohidratos con la produccin de gas. Esta tcnica es vlida para identificar las especies de Candida, pero no para las especies de Cryplococcus. La asimilacin, que por lo general es un mtodo que se aplica mucho, comprueba la capacidad de una muestra aislada para utilizar, como nica fuente de carbn necesario para crecer, un carbohidrato o un nitrato, como la nica fuente de nitrgeno. El mtodo auxanogrfico Wickerham utiliza un medio basal en el que un nitrato o un carbohidrato determinado sirven de nutrientes. El crecimiento de las levaduras es el punto final de un test positivo. Este mtodo de referencia tan enrevesado no se explicar, porque en la mayoria de los laboratorios se ha sustituido por uno de los cinco sistemas de identificacin comerciales: API 20C (BioMrieux. Hazelwood, MO), Sistemas V i t e k (BioMrieux. Hazelwood. MO), MicroScan (Baxter Sistemas de Salud. Sacramento. CA). el Sistema UniYeastTek (Laboratorios Remel, Lenexa, KS) y el RapID Yeast Plus System (Sistemas de Diagnsticos Novedosos, Norcross, GA). Los cinco sistemas funcionan bien, segn la bibliografa y los test de inspeccin profesional del College ol American Pathologists (Buesching. 1979: Fenn, 1994: Riddle, 1994: ElZaatari. 1990). El API 20C se ha visto que se puede comparar con los sistemas bioqumicos convencionales (Buesching. 1979). y ahora est considerado el de referencia entre los sistemas comerciales. Una evaluacin de unos datos recientes para el sistema Vitek mostr una actuacin idntica para el API 20C (ElZaatari, 1990). El sistema Vitek tiene un pequeo margen, segn han juzgado unas empresas profesionales, y ser particularmente atractivo para laboratorios que usan esta metodologa en su seccin bacteriolgica. El sistema RapID lo identifica en aproximadamente 4 horas (Kitch, 1996; Smith. 1999). Independientemente del sistema elegdo. es importante estudiar la mortologia de las levaduras. Adems de la fermentacin y de los estudios de asimilacin, hay un test secundario por el cual se estimula el crecimiento de unos componentes qumicos para asi diferenciar ciertos Trichophyton spp. Incluir mositol y tiamina en varias combinaciones de medio agar (agar Trichophyton) permite hacer una valoracin de las propiedades de estimulacin del crecimiento. El punto final del test, crecimiento relativo en comparacin con un medio basal. es subjetivo y se deben incluir tanto los controles positivos como los negativos. Tradicionalmente. la identificacin de la fenol oxidasa era un test diagnstico importante. La fenol oxidasa en el C. neoformans oxida los componentes difenlicos para producir un pigmento marrn. El sustrato original que se usaba para identificar esta caracterstica era cido cafeico en clulas de semillas negras (test Staib), aunque despus se aadieron otros componentes, como la L-dopa y L - dopamina. El test de la oxidacin del fenol no es suficiente l solo para identificar el C. neoformans, y con la introduccin de sistemas de identificacin comerciales, que son eficientes, se ha disminuido su uso en los laboratorios clnicos. Por el contrario, el test de produccin de ureasa en los criptococos es de gran utilidad en el laboratorio clnico para diferenciar los Criptococcus de Candida spp.. particularmente en muestras respiratorias. El C. neoformans es un patgeno pulmonar sistmico. mientras que Candida spp. son habitantes frecuentes de las vas areas altas, pero no es causa comn de neumonas primarias. La ureasa puede ser producida por otras especies no patgenas de criptococos, por especies de Rhodotorula y por algunos aislamientos de Trichosporon beigeliiy Candida krusei. La produccin de ureasa puede comprobarse por la inyeccin de levaduras aisladas en una preparacin con agar urea de Christensen o en caldo de urea. La alcalinizacin del medio despus de la produccin de NH, por parte de los organismos que producen la rotura de la urea se detecta al meter en el sistema un indicador de pH. Zimmer y Roberts describieron un mtodo rpido que proporciona resultados fiables y tiles en 15 minutos para ir eliminando levaduras de un estudio ms a fondo (Zimmer, 1979) (Tabla 54-4). Hay que tener mucho cuidado para no incluir las bacterias que rompen la urea en lo inyectado, como las de la especie Klebsiella. que encontramos ocasionalmente en muestras respiratorias. Las colonias que tienen pseudohifas vistas macroscpicamente (pies) o que crecen en un agar que tiene cicloheximina no necesitan analizarse, porque el criptococo no produce pseudohifas in vitroy no crece con la cicloheximida. Hay un lest de asimilacin especial para el KN0 que es el que se utiliza en primer lugar para diferenciar entre las especies de los gneros dematiacenos. Exophiala (Sutton. 1998).
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Prueba rpida de la ureasa para el screening de las levaduras aisladas de m u e s t r a s respiratorias

1 Colocar un tapn estril en un caldo de ureasa. Apretar el tapn contra el lado del contenedor del caldo de ureasa antes de removerlo para eliminar el exceso de caldo El tapn debe saturarse, no motarse. 2 Tocar ligeramente todas colonias aisladas que se van a estudiar con el tapn saturado i 3 Colocar el tapn saturado en un tubo estril etiquetado j 4 Colocar el tubo con el tapn en un bao de agua a 56C durante 15 minutos j 5 Retirarlo del bao de agua y examinar la existencia de pigmento rosa, que indicarla que es positivo Se deben realizar controles positivos (especies de Cryplococcus) y negativos (Candida albicans) al mismo tiempo.

Los test bioqumicos tienen un papel auxiliar en la identificacin de los mohos dermatofticos. La produccin de ureasa dentro de los cuatro primeros das ayuda a diferenciar el Trichophyton mentagrophytes (positivo para la ureasa) del 7! rubrum (ureasa negativo). El aislamiento debera ser subcultivado en una preparacin agar ureico de Christensen e incubarse a 25 C-30 C durante al menos tres das. Una reaccin positiva es una gran produccin de ureasa, que se evidencia por una alcalinizacin del medio. Si los test bioqumicos son el corazn de los sistemas de identificacin de las levaduras, la confirmacin de la identificacin a travs del anlisis de la mortologia de la levadura en un medio agar es el alma. Utilizar la observacin morfolgica como comprobante puede evitar grandes errores que se cometeran si se confiara enteramente en los sistemas automatizados.

Dimorfismo
La demostracin del dimorfismo es el acercamiento tradicional para identificar definitivamente un grupo de patgenos sistmaos. En la mayora de los laboratorios el aislamiento inicial es la fase moho, porque las placas, por lo general, se incuban a 25C-30C. La conversin a fase tejido se acompaa por una incubacin a 37'C de un subcultivo. L a transicin de la morfologa moho a la de levadura puede producirse equivocadamente, y las formas de hifa generalmente se mezclan con las clulas de levaduras. Algunos aislamientos puede que nunca logren convertirse. Un medio rico, como agar infusin cerebro-corazn con suplemento sanguneo, tendra que ser incluido, sobre todo cuando se trabaja con H. capsulatum. El agar infusin cerebrocorazn o agar algodn estn recomendados para la conversin del B dermatitidis. Los medios para la conversin del C. immilis se han descrito, pero por lo general no se utilizan. De modo similar, la inoculacin en animales es infrecuente que se utilice en laboratorios clnicos. L a introduccin del test inmunolgico para exoantigenos lngicos en cultivo, o caracterizacin molecular de cidos nucleicos, ha simplificado considerablemente la tarea d e la identificacin definitiva y ha eliminado la necesidad de mostrar ambas fases en los hongos dimrficos. El test de exoantigenos para C. immitis. H. capsulatum y B. dermatitidis est disponible comercialmente. Los test de hibridacin de cidos nucleicos para estos tres patgenos dimrficos y para C. neoformans estn comercializados por Gen-Probe, Inc (San Diego, CA). Estos test han sustituido la fase de conversin en muchos laboratorios. El sistema GenProbe se utiliza para detectar la Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae, o para la identificacin de ciertos patgenos bacterianos, incluida la micobactena. En los laboratorios que utilizan la tecnologa Gen-Probe, el acercamiento molecular podra proporcionar una alternativa atractiva a la inmunodilusin para identificar los aislamientos. Si la fase de levadura del patgeno se ha demostrado anteriormente o recientemente en extensiones directas, o en el laboratorio de patologa quirrgica, la conversin de la fase moho correspondiente en el laboratorio de micologia es superflua.

Pruebas inmunolgicas
Las pruebas inmunolgicas son vlidas para detectar antgenos y anticuerpos o para seleccionar patgenos fngicos. Las pruebas serolgicas clsicas han sido unos test de fijacin del complemento contra los principales patgenos dimrficos. H. capsulatum. B. der-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

matitidis y C. immitis. Posteriormente se desarrollan test de inmunodifusin contra varios antigenos del H. capsulatum. El acercamiento serolgico funciona mejor para el diagnstico y pronstico de la coccidioidomicosis. Las extensas reacciones cruzadas entre H. capsulatum y B. dermatitidts comprometen la efectividad de los test. La deteccin de anticuerpos para Aspergillus spp. en el suero ayuda en el diagnstico de aspergillosis broncopulmonar alrgica, pero es de poca utilidad en el diagnstico de enfermedad invasiva (Kurup, 1991). Los anticuerpos que ms comnmente precipitan se han detectado con la tcnica de inmunodifusin. pero tambin se utilizan mtodos ms modernos, como el ensayo inmunosorbenle de la unin de enzimas (ELISA). Algunas autoridades han cuestionado la confianza de los reactivos disponibles comercialmente (Kwon-Chung, 1992). La deteccin de antgenos fungicos es el desarrollo ms reciente. La aplicacin ms importante con diferencia ha sido detectar el antigeno del criptococo en el suero y en el lquido cefalorraqudeo (LCR). Tenemos que considerar este test como una herramienta de diagnstico principal junto con el cultivo, y ha sustituido al test de tinta china, que es menos sensible para el examen directo del LCR. Los inmunoensayos para los antgenos de Aspergillus han sido descritos pero no desarrollados comercialmente (Kurup, 1991). Un radioinmunoensayo para los antigenos H. capsulatum en orina es posible hacerte a travs de un laboratorio de referencia (Laboratorio de Referencia Histoplasma. Indianapolis, IN), y est bien considerado, particularmente en pacientes con enfermedades sistmicas (Williams. 1994). Se detect al antgeno en el 92o de 108 pacientes con infeccin diseminada, pero slo en el 39% de 70 pacientes con enfermedad autosuficiente. Los test cutneos se han usado para estudios epidemiolgicos de algunas infecciones, pero tienen una utilidad limitada para fines diagnsticos. En algunos casos, como histoplasmosis, los test cutneos podran complicar el diagnstico del laboratorio al provocar una respuesta de los anticuerpos (Campbell, 1964). Por desgracia, ninguno de los test que existen para el diagnstico de la infeccin por Candida tienen suficiente sensibilidad y especificidad para ser diagnsticamente tiles (de Repentigny. 1992).

Un resumen practico de hongos mdicamente importantes es el que se representa en la Figura 54-12. Este esquema se presenta c o m o un esqueleto organizador en el cual un miclogo principiante puede acercarse al diagnstico etiolgico de las infecciones por hongos.

TCNICAS DE DIAGNSTICO Recogida de muestras

La muestra correcta para llevar al laboratorio de micologa depende de la presentacin clnica y del rgano del sistema afectado. En la Tabla 54-5 encontramos un resumen de las principales categoras de enfermedades producidas por hongos y la muestra que se recomienda La nomenclatura de las infecciones por hongos importantes se ha resumido en un cuadro (Odds. 1992). Las levaduras, en particular Candida spp., pueden recuperarse en alguna ocasin de muestras recogidas con una torunda, sobre lodo de las lesiones purulentas. Las torundas deben usarse para recoger lesiones orales o vaginales sugestivas de candidiasis. y tienen que ser adecuadas para recoger muestras en pacientes con otitis exlerna crnica, donde solemos encontrar un gran nmero de conidias Aspergillus. Las torundas son. sin embargo, las peores herramientas para recoger muestras en la mayora de las zonas de enfermedades infecciosas. Para el diagnstico de inlecciones fngicas en las que el tejido responsable es con frecuencia granulomatoso. son intiles, e incluso pueden crear confusin y el mdico interpretar un resultado negativo como la ausencia de infeccin. Una poltica firme de rechazar muestras de torundas debe acompaarse de esfuerzos educacionales persistentes. Las mejores muestras para el diagnstico micolgico son raspados, curetajes, aspiraciones y biopsia de las lesiones. Los pelos infectados con algunos hongos dermatofitos comunes (p. ej.. Microsporum canis) son fluorescentes bajo una luz ultravioleta de longitud de onda larga (lmpara de Wood).

Figura 54-12. Esquema de organizacin para los patgenos fungios humanos importantes.

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ENFERMEDADES MICTICAS

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Tabla 54-5

S n d r o m e s clnicos m a y o r e s y p a t g e n o s habitualmente asociados" G r u p o d e pacientes Todos los pacientes P a t g e n o probable Dermatofilos Candida Malassezia 1 Trichosporon\ \Scopulanopsis) 1 Fusarium] Coccidioides immilis Blastomyces dermattidis Sporolhrix schenckii Pseudallescheria boydii Nocardia Streptomyces Actinomadura Histopiasma capsulatum Blastomyces dermatitdis C neoformans Aspergillus Cigomicetos Pseudallescheria boydii Pneumocystis carinii Candida Aspergillus Cigomicetos Candida Candida (mohos y hongos dimrficos) Cryptococcus neoformans Candida Cigomicetos Aspergillus Nocardia asteroides Ciadosponutn [Xylohypha] banltanum Otros hongos Coccidioides immitis Blastomyces dermatitdis Cryptococcus neoformans Moho Aspergillus Fusarium Aspergillus (lumigatus y niger) Aspergillus (lumigatus y niger) Fusarium Mohos demaliacenos Curvularia Bipolaris Aspergillus Cigomicetos Fusarium Pseudallescheria/Scedosporium Candida Candida Malassezia (recin nacidos) Histoplasma capsulatum Blastomyces dermatitdis Coccidioides immitis Candida Cigomicetos Aspergillus Fusarium Pseudallescheria/Scedosporium Cryptococcus neoformans Potencialmente algunos hongos Muestras Raspado cutneo Pelo Urta Recortes

Presentacin clnica o sistema Piel, pelo o uas

Piel, dermis y tejido subcutneo

Todos los pacientes

Biopsia

Pacientes con micetoma

Biopsia

Neumona primaria

Todos los pacientes

Esputo Lavado bronquioalveolar Biopsia transbronquial Biopsia pulmonar abierta

Inmunodeficientes

Infeccin gastrointestinal

Inmunodeficientes

Infeccin del tracto urinario Endocarditis Meningitis Encefalitis y absceso cerebral

Todos los pacientes Todos los pacientes Todos los pacientes Inmunodeprimidos

Raspado Curetaje Biopsias Orma Sangre Lquido cefalorraqudeo Biopsia

Osteomielitis

Todos los pacientes

Biopsia

Queratitis Otitis externa Sinusitis

Todos los pacientes Todos los pacientes Todos los pacientes

Raspado Raspado Tapn Biopsia Curetaje

Quemaduras

Biopsia

Vaginitis Infeccin de catteres intravenosos Inteccin diseminada Todos los pacientes

Tapn secreciones aspiradas Punta del catter Sangre Sangre Biopsia Sangre Biopsia

Pacientes inmunodepnmidos

" Pueden darse otias combinaciones y posibilidades j | menos comn

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MICROBIOLOGA MDICA
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y pueden ser seleccionados especficamente para ser analizados. Las lesiones cutneas de los dermatofitos ("lombriz en anillo") se caracterizan por un borde activo que avanza, con una cicatriz central, por eso los raspados tienen que recogerse del borde de la lesin. Las muestras deben enviarse al laboratorio en un contenedor seco y limpio. Los pelos, uas y raspados de piel tienen que guardarse en un sitio seco para evitar el crecimienlo bacteriano. Algunos mdicos, como dermatlogos y oftalmlogos, prefieren inocular las muestras directamente en la superficie agar en el quirfano. Es importante desarrollar un mtodo para monitorizar el medio en lugares fuera del laboratorio, porque las placas Petri con alguna muestra de agar seca aparecern en el laboratorio sin un sistema fiable.

Tabla 54-7

Preparacin de tir

1. Centrilugar la muestra de liquido durante un mnimo de diez minutos. 2. Colocar una gota de tinta china en un porta de cristal limpio. 3. Mezclarlo con una gota del sedimento del centrifugado. 4 Buscar levaduras encapsuladas mediante el uso de un objetivo de 40x. 5. Las colonias que crecen en agar pueden tambin mezclarse directamente con tinta china en un porta para confirmar la presencia de capsulas.

Examen directo de muestras

Los raspados, curetajes y los pelos pueden examinarse directamente por un microscopio de luz. Las aspiraciones de pus o fluidos tambin pueden examinarse directamente; si el material es demasiado grueso para una observacin sencilla, puede ser extendido en portas de cristal. Las extensiones impresas y las preparaciones tienen que hacerse de muestras de tejidos. Es til preparar extensiones adicionales sin teir, porque los anlisis despus pueden mostrar agentes infecciosos que inicialmente no se sospechaban. Preparacin en fresco. El mtodo ms sencillo para el examen directo es la observacin de una suspensin de la muestra en una solucin salina estril bajo un cubreportas. Para muestras que contienen tejido de desbridacin y clulas, como secreciones vaginales, uas y raspados de piel, debe usarse una solucin de hidrxido de potasio (KOH) (Tabla 54-6). Tincin de Gram. Este tinte microbiolgico usado comnmente es til particularmente para detectar levaduras. La mayora de las levaduras, en especial las de Candida spp.. len parcial o complelamente grampositivos; puede apreciarse la presencia de bacterias contaminantes y puede valorarse la naturaleza de cualquier clula inflamatoria. Las hitas de los mohos aparecen grampositivas o gramnegativas por este tinte, pero la tincin es menos fiable que la de las clulas levaduriformes. Tinte de Giemsa o Wright. Si se sospecha histoplasmosis, estos tintes hematolgicos son tiles para apreciar las clulas de las levaduras dentro de los macrfagos. Preparacin con tinta china. Las cpsulas polisacridas del C. neolormans pueden demostrarse por una tincin negativa de partculas de tinta china (Tabla 54-7). Algunos miclogos prefieren nigrosina porque las partculas son ms homogneas y es menos frecuente que artefacten. Cuando se examina con el microscopio de luz, la cpsula se queda en el exterior como un espacio en blanco alrededor de la clula fngica, con partculas de tinta que salen despedidas del borde con un movimiento explorador (Fig. 54-13). Es importante diferenciar las seudocpsulas producidas por focos imperfectos alrededor del borde de los leucocitos o artefactos. Si se encuentran las clulas en gemacin, nos aseguramos la especificidad del diagnstico. Otros hongos potencialmente encapsulados. como las especies de Rhodotoruia y otras especies de criptococos. son patgenos tan infrecuentes que se puede eliminar la posibilidad de considerarlos. En muestras clnicas, las cpsulas son por lo general grandes, pero despus de aislarlas en un medio agar, pueden hacerse ms pequeas y pueden ser ms difciles de demostrar. Por desgracia, algunas cadenas tienen una encapsulacin pobre. La sensibilidad del test de tinta china es aproximadamente del 50% en pacientes que no estn infec-

tados por VIH (Diamond, 1974), mientras que la deteccin directa del antgeno en el LCR o suero tiene una sensibilidad del 90%-100%. La deteccin de polisacridos criptococos por aglutinacin de ltex o por tcnicas inmunoensayos de enzimas ha sustituido a la observacin de cpsulas de uso habitual. La tcnica de tinta china puede reservarse para usarla por la tarde y por la noche, cuando el test de antigenos no est inmediatamente disponible, y para examinar las cpsulas de colonias aisladas que sugieren C. neoormans. Parece que el test de tinta china tiene mayor sensibilidad en pacientes infectados por VIH, quiz porque hay un gran nmero de clulas levaduras presentes (Chuck, 1989; Kovacs, 1985: Zuger. 1986). Tintes histioqumcos. El mtodo cido peridico de Schiff tie la pared de las clulas fngicas y se utiliza en algunos laboratorios de micologa. L a tcnica de la plata metenamlna se usa por lo general en laboratorios de histologa para detectar hongos. Cuando este mtodo se combina con eosinahematoxilina, puede estudiarse la morfologa detallada tanto de los tejidos como de los hongos (Swisher, 1982). Estas dos tcnicas ten tambin las bacterias, especialmente si el tiempo de tincin en el mtodo de impregnacin con plata es prolongado. Estas herramientas se han reemplazado por el simple y ms rpido tinte de calcoflor blanco. Calcoflor blanco. Este componente es un blanqueador que se utiliza en las industrias de papel y textiles se une a las paredes de las clulas fngicas y emite una fluorescencia blanca (Fig. 54-14) o verde manzana (dependiendo de las combinaciones de filtros que se usen) cuando se expone a una luz ultravioleta de longitud de onda corta (Tabla 54-8) (Hageage. 1984). Es necesario un microscopio de fluorescencia, pero esta herramienta tan importante para el diagnstico tambin sirve para otras tareas, como para tincin con auramina-0 de micobacterias y para inmunofluorescencia. Recuperar los hongos de la sangre puede acompaarse por una inoculacin de medio de caldo, utilizando un sistema bifsico caldo-agar o por la tcnica de la lisis por centrifugacin (Isolator, Wampole, Cranbury, NJ). El sistema Isolator consiste en un tubo que contiene una solucin que produce la lisis de eritrocitos y leucocitos. Despus de sacar la sangre por vaco del tubo, los contenidos Uticos, incluido cualquier microbio, se centrifugan y se depositan

Tabla 54-6

Preparacin KOH

1. Colocar una gota de KOH (hidrxido potsico con o sin calcoflor) en un porta de cristal limpio. 2. Meter la muestra en la gota de KOH preparada en el porta. 3. Cubrirlo y calentar la mezcla de muestra/KOH pasando el porta a travs de una llama de un mechero de Bunsen varias veces. No debe hervir. 4. Examinarlo con 10x y 40x. Las muestras excesivamente tenaces pueden requerir un calentamiento adicional 5. Tambin puede utilizarse el KOH como medio simple, sin calentar.

Figura 54-13. La cpsula de polisacridos alrededor de la levadura en gemacin de Cryptococcus neoormans se tie negativamente con partculas de tinta. Advirt a n s e la redondez y uniformidad de las clulas levaduriformes (preparaciones c o n tinta china).

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ENFERMEDADES MICTICAS

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Figura 54-14. El calcoflor blanco emite una fluorescencia blanca en las paredes del hongo c u a n d o se visualiza con microscopio de fluorescencia. L a s hilas septadas y las ramificaciones de Aspergillus lumigalus se muestran de un m o d o ptimo

ficacin simplificada del agar dextrosa patata que utiliza una preparacin de copos de patata que se encuentra en las tiendas de comestibles Es mucho ms fcil de preparar que el mtodo tradicional basado en patata y funciona igual. Estos medios estn disponibles comercialmente y nos dan un balance razonable de, por una parte, la inhibicin de bacterias contaminantes y, por la otra, de un estimulo de la morfologa y color tpico de las colonias. El agar copos de patata tiene ventajas para los hongos mohos, porque las estructuras reproductoras asexuales tiles para el diagnstico se desarrollan mejor en este agar que en el medio dextrosa Sabouraud. Si la muestra es de una zona no estril, o es probable que se contamine, es importante inyectar en una placa selectiva y en una no selectiva a la vez. Las placas selectivas que con ms frecuencia se utilizan usan cicloheximida para inhibir los hongos saprofitos y agentes antibacterianos (por lo general cloranfenicol y gentamicina) para inhibir las bacterias. Para muestras de tejidos, especialmente cuando los hongos dimrficos pudieran ser los agentes etiolgicos. debera aadirse antibitico a un agar enriquecido, como un agar infusin cerebro-corazn con sangre. El medio agar puede echarse en tubos de tapa ancha o en placas Petn. L o s IUOOS proporcionan un margen oe segunaaa para prevenir la mreccion oei personal y la contaminacin de otros cultivos, pero los aislamientos son mucho ms difciles de manipular, y es prcticamente imposible crear colonias aisladas en situaciones donde est presente una mezcla de hongos y mohos en la muestra. Adems, el factor extremadamente importante c o m o es el rea de superficie se disminuye con los tubos. Los tubos deberan destaparse y dejarlos airear antes de incubarlos. Las placas Petri proporcionan una sensibilidad mayor y una superficie mejor, pero deben cerrarse y manejarse con cuidado. El agar que se echa en las placas debera doblar la profundidad normal (de 7 mm a 8 m m est bien) para que ste se deseque durante periodos de incubacin largos. Las tapaderas deberan tener algo que permitiera pasar el aire. Inoculacin e incubacin. En algunas situaciones, slo las colas que crecen de la hifa son vales y el resfo de la hifa vegetativa est enferma. Las muestras ordinarias en un homogenizador. al igual que se hace para el cultivo de bacterias, es muy desorganizado, y los aislamientos viables pueden perderse. Es mejor inyectar raspados o curetajes por encima y dentro del agar en varios puntos de la superficie agar. Los tejidos deben cortarse, despus los fragmentos son inoculados de un modo similar. Hemos tenido la experiencia de no observar crecimiento en las placas cuando se agitaba el cepillo de las broncoscopias en el caldo, dejando caer un trozo en el medio agar. mientras que vimos el crecimiento de A. tumigatus en el cepillo original que se haba dejado en el resto del Huido que se transportaba. Ahora inyectamos estas muestras colocando la aguja o el cepillo directamente encima de la superficie del agar principal aislado. Las placas o tubos deberan incubarse en el aire a 25C-30 C. La incubacin o inoculacin de muestras en una sala no es adecuada por la variabilidad de la temperatura en el ambiente. Es necesario un controlador de la temperatura de la incubacin. No es necesario incubar placas paralelas o tubos a 37"C para recuperar la fase de levadura de los hongos dimrficos. porque los resultados nos proporcionan poco rendimiento. La mayora de los hongos crecen en un periodo de incubacin de dos semanas: entre los hongos que aislamos con ms frecuencia, slo los hongos dimrficos, como Histoplasma capsulalum y Blaslomyces dermatitidis. son con frecuencia detectados despus de un periodo de incubacin de 1 4 das (Morris, 1996; Hove, 1997). Las recomendaciones de estos autores son muy parecidas, podemos resumirlas en:

en la superficie de las placas agar. Un porcentaje alto de las funguemias causadas por levaduras pueden detectarse con uno de los sistemas de cultivo, como BACTEC (Becton, Dickinson. Sparks. MD) o BacT-Alert (Organon Teknika, Durham. NC). Las levaduras son organismos aerbicos, por lo que deben emplearse botes para cultivo de aerobios. Se ha sugerido que los hemocultivos deben incluir de modo habitual dos frascos para aerobios por la importancia de la Pseudomonas aeruginosa y la Candida spp.. ambos son microbios aerobios, y que el frasco de los anaerobios sea inoculado slo en determinadas situaciones, tales como enfermedades abdominales, donde la probabilidad de que existan patgenos bacterianos anaerbicos es mayor (Morris. 1993). (Vase Cap. 57 para una explicacin ms detallada.) El mtodo mas sensible para detectar la funguemia es el sistema Isolator (Jones, 1990). que es tambin el ms susceptible para contaminarse, bien por el manejo del sistema durante el proceso, o bien por esporas que son transportadas por el aire y se colocan encima de las placas agar. Algunos informes ms recientes documentan una representacin equivalente para recuperar las levaduras entre sistemas de hemocultivos continuamente monitorizados, que primero fueron destinados para recuperar las bacterias, y el sistema Isolator de 10 mi (Wilson, 1993). En nios, un sistema de monitonzacin continua se compar favorablemente con el tubo Isolator 1 . 5 mi (peditrico) para recuperar las levaduras de la sangre (Petti. 1996). Con esto es posible detectar las causas ms comunes de infecciones sistmicas por hongos, sin utilizar ms sangre o recursos de laboratorio que se requieren para detectar bacteriemia. Los mohos dimrticos y hongos filamentosos, sin embargo, se recuperan mejor con el sistema Isolator.

Aislamiento de hongos en cultivo

Seleccin del medio. Todas las muestras deberan ser inyectadas en un medio elegido. El mtodo tradicional es el agar dextrosa Sabouraud, que tiene un pH entre 5,5 y 5,6 y fue elegido para aislar los hongos dermatlicos. La modificacin de Emmons del medio agar dextrosa Sabouraud contiene menos glucosa y un pH entre 6.8 y 7,0, y generalmente proporciona un agar ms til. Algunas autoridades prefieren el agar que inhibe los mohos o el agar dextrosa patata. Rinaldi (1982) ha descrito una modi-

Tipo de muestra Tabla 54-8 Tincin c o n calcoflor blanco

Tiempo de incubacin

1. Colocar la muestra en un porta de cristal limpio. 2. Mezclarlo con calcoflor blanco. 3. Examinar la preparacin mediante el uso de un microscopio de fluorescencia 4 El calcollor blanco se debe sustituir por lactofenol anilina algodn azul cuando se estudia la morlologia microscpica de los cultivos.

Dirigida a confirmar la infeccin por levadura 7 das (p. ej, boca, garganta, vagina) Orma 7-14 das Tejidos y fluidos corporales estriles diferentes de sangre 21 das Respiratorias, mdula Osea y muestras de sangre 28 das Muestras donde se sospecha que hay un moho dimrfico 28 dias Resto de muestras 14 dias

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Las placas deben examinarse al menos dos veces durante la primera semana, cuando puede aparecer el crecimiento rpido, y al menos semanalmente despus. Afortunadamente, es fcil conservar aislamientos fngicos para futuros estudios o como control de calidad. Los mohos sobreviven un mximo de 12 aos despus de almacenarlos en agua destilada a temperatura ambiente (Qiangqiang, 1998). El aislamiento de levaduras puede mantenerse por congelacin, como para las bacterias. Un mtodo simple es cortar un pequeo bloque de agar que contenga colonias de levaduras y despus colocar el bloque en un contenedor estril y congelarlo a -20 C o menos. Los cultivos no necesitan ninguna condicin especial para congelarse.

probamos la informacin recibida de la mquina entre la morfologa de las colonias y la morfologa microscpica, al igual que las condiciones clnicas que conocemos, estamos haciendo un buen trabajo. Morfologa de las levaduras. El test del tubo germinal es un paso inicial importante para identificar el aislamiento de levaduras. Los tubos germinales son alargados, con extensiones en forma de dedo de una clula de levadura; son el comienzo de una hifa verdadera (Fig. 54-15). Pueden diferenciarse de las pseudohifas por carecer de una constriccin en la unin del tubo germinal y la clula levadura y por las paredes celulares paralelas en el tubo germinal. Los tubos germinales verdaderos son formados por C. albicans y Candida stellatoidea bajo las condiciones recomendadas, permitiendo una identificacin temprana de las levaduras patgenas ms comunes e importantes. Candida tropicalis puede producir hifas verdaderas y tubos germinales bajo condiciones especiales, pero generalmente no dentro del periodo de incubacin abreviado que se dice en el test del tubo germinal estndar. Es necesario limitar la incubacin del test del tubo germinal de dos a cuatro horas, porque si la incubacin se prolonga, otras especies pueden empezar a formar estructuras que se parezcan al tubo germinal (Dolan, 1971). En realidad, estos son los comienzos de una seudohifa. y una observacin cercana revelar la constriccin entre el llamado tubo germinal y la clula levadura La identificacin puede confirmarse por la documentacin de clamidosporas. Las clamidosporas son estructuras que tienen una pared gruesa, que. ms que desempear un papel reproductivo, sirve como reserva alimentaria (Fig. 54-16). Pueden estar terminales, como en C. albicans. dentro de la hila (intercaladas), como en los dermatofitos. Hablando de manera estricta, no son esporas, pero la larga tradicin probablemente asegure que el nombre permanezca. Los tubos germinales verdaderos y las clamidosporas se producen por C. albicans y C. stellatoidea. una especie poco frecuente que muchos miclogos creen que es una variante sucrosa negativa de C. albicans. El test del tubo germinal tradicional incluye la inoculacin de un tubo de suero (Tabla 54-9). Se ha descrito un test para la formacin del tubo germinal en la superficie de una infusin agar de crema de arroz con T w e e n 80 y oxgall (Beheshti. 1975). Despus de observar el aislamiento de los tubos germinales a 37C. se contina la incubacin para posterior estudio de la morfologa de las hifas y la formacin de clamidosporas a 25 C-30 C. De este modo, toda la informacin necesaria se puede recoger de una vez. El agar cornea puede sustituirse, pero, a pesar del medio usado, las condiciones de incubacin tienen que ser controladas cuidadosamente, y el test monitorizado con controles para obtener buenos resultados. La tpica tcnica de Dalmau para demostrar las clamidosporas en el agar cornea se detalla en la Tabla 54-10 (McGinnis, 1980). Morfologa de los mohos. El mtodo ms simple para analizar los mohos es la tcnica de la cinta de celofn. Es importante que la cinta sea

Seguridad en el laboratorio
La inoculacin de muestras y todas las manipulaciones de colonias de mohos deben realizarse en una cabina de seguridad de flujo laminar. Tanto el tcnico como las placas de cultivo deben protegerse de la alta diseminacin de conidias fngicas mviles. Un experimento simple en el que tapemos un poco una placa que contenga una sola colonia de A. lumigatus en el laboratorio convencer al observador escptico del problema cuando aparezcan mltiples colonias de Aspergillus alrededor de la superficie de la placa. Para disminuir la dispersin de las conidias, se ha sugerido que los subcultivos de colonias que estn muy cargadas de conidias, como el Aspergillus. se realicen inundando la placa con agua estril, y despus de esto, las conidias que hemos sacado se aspiran y se colocan en la superficie de las placas agar recientes (McGinnis, 1980). No es obligatorio hacer esta maniobra, pero se debe tener gran cuidado para minimizar la manipulacin de cultivos y la exposicin de las placas al aire libre, incluso en la cabina de seguridad. Debera realizarse una atencin y limpieza escrupulosas de las superficies, tanto de la cabina de seguridad como de la incubacin. Separar las cabinas de seguridad para inoculacin de muestras y estudio de mohos aislados puede reducir la contaminacin de las muestras. El mayor riesgo para el personal del laboratorio viene del manejo de los cultivos de mohos de los patgenos dimrficos. particularmente C. immitis. Kwon-Chung y Bennet (1992) recomiendan inyectar en tubos sin rosca si se sospecha este patgeno, pero en la mayor parle del pas el diagnstico no se hace antes de aislar al patgeno. Podemos inundar la placa con un 4% de solucin de formaldehdo (10% formalma) y dejar a temperatura ambiente varias horas o toda la noche antes del examen microscpico. Como esto es obviamente irreversible, es mejor dejar otras colonias creciendo en placas y tubos de reserva. Es importante saber que la fase tejido de patgenos dimrficos no es infecciosa por va area, por eso el riesgo biolgico es poco o nulo al manejar muestras de tejidos de pacientes con histoplasmosis o blaslomicosis. Una excepcin para esta regla seria C. immitis. que crece en su tase moho dentro de una cavidad pulmonar conectada con el rbol bronquial. Adems, hay lesiones locales de Histoplasma o Blastomyces que han aparecido en zonas de inoculaciones accidentales.

Tcnicas para el estudio morfolgico de aislamientos fngicos

Algunos de los estudios morfolgicos necesarios para identificar los aislamientos fngicos pueden lograrse con colonias de las placas de aislamientos originales, pero con frecuencia es necesario transferir porciones de colonias a medios nuevos o diferentes (subcultivos) para identificar las estructuras diagnsticas (vase Tabla 54-3). El agar cornea junto con Tween 80 para analizar los aislamientos de levaduras y el agar copos de patata para mohos son unas opciones excelentes. Estos medios pueden prepararse en el laboratorio o comprarse en los comercios (Laboratorios Remel. Lenexa. KS; BBL. Cockeysville. MD). La frecuencia de los subcultivos se reduce si utilizamos como medio principal los copos de patata. Las pruebas bioqumicas son importantes para la informacin bioqumica, especialmente si se ha utilizado un sistema de identificacin comercial. Un trabajador del laboratorio que coloca el aislamiento en un aparato y. sin revisarlo, se cree el resultado est realizando una mala tarea. Cuando comFigura 54-15. Los tubos germinales se han extendido d e s d e las clulas levaduriformes de Candida albicans. No hay estrechez en la unin de las clulas levadunformes con el tubo germinal. L a s paredes del t u b o germinal son paralelas. El suero h u m a n o fue incubado durante dos horas a 37 0

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ENFERMEDADES MICTICAS

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Tabla 54-10 Test d e la morfologa d e las levaduras Morfologa de las levaduras en agar 1. Extender un inoculo de levadura en una seccin de agai crnea/Tween 80 2. Cubrir el rea inoculada. 3. Incubarlo de 25C a 30C. 4. Observar la morfologa microscpica a las 24-72 horas.

medir el inoculo de conidias de Aspergillus o de las cadenas de Candida blastoconidia en una seudohila? Los estudios de correlacin entre los resultados in vitro e in vivo son difciles. El desarrollo de muchos antifngicos nuevos (Fromtlin. 1988) y el posterior desarrollo de resistencia entre las levaduras patgenas han aadido nuevos impulsos para el desarrollo y estandarizacin de los test para que se guen los laboratorios de la quimioterapia antilngica (Terrell, 1992; Rex. 1993). El Figura 54-16. Las clamidosporas producidas por Candida albicans son estructuras Comit Nacional de Estndares para Laboratorios Clnicos (1992) ha prode pared gruesa que habitualmenle aparecen en los extremos de las hitas. L a s cla- puesto un mtodo de referencia para los test de sensibilidad antimicrobiana midosporas son considerablemente ms alargadas que el dimetro de la hila (lacde las levaduras patgenas usando caldo diluido o una variedad de microditofenol algodn azul). lucin. Existen mtodos ms modernos para determinar concentraciones inhibitorias mnimas de antibiticos para patgenos bacterianos, como el Etest (AB Biodisk, Piscataway. NJ). que estn siendo estudiados pero que requieren ms evaluaciones antes de que sean adoptados como un medio estndar clara. Las preparaciones deben cerrarse con esmalte de uas para retardar (Colombo, 1995; Sewell, 1994). Ahora es posible para los laboratorios que tieque se sequen, y es esencial examinar pronto la muestra. Si no se obsernen que hacer un nmero elevado de test para aislar levaduras realizar pruevan las estructuras diagnsticas, se puede alargar la incubacin y repetir el bas de sensibilidad. Si slo tenemos que analizar aislamientos de manera proceso. El mtodo tradicional para observar la morfologa de los mohos es ocasional, lo mejor es enviarlo a un laboratorio de referencia. separar el micelio con agujas y examinar la hita que hemos separado en El test de sensibilidad de mohos est peor estandarizado. Estos test se salino, calcollor blanco o lactofenol, con o sin anilina azul. Se prefiere la realizan mejor en laboratorios de referencia. anilina azul mejor que el algodn azul, porque es menos txico. En ocasiones es necesario realizar un cultivo para evitar que las estructuras de las conidias se rompan fcilmente en su forma original. El acercamiento clsico incluye cortar cuadrados en un medio agar apropiado, LEVADURAS E INFECCIONES POR LEVADURAS que se colocan en un plano inclinado que se sujeta con las varillas de cristal en una placa Petri, donde aadimos agua estril para mantener la humedad Otra alternativa puede ser utilizar una placa agar que se comerGnero Candida cialice y que se haya diseado para cultivos inclinados (Laboratorios Las especies de Candida son las levaduras patgenas ms importantes. Renet, Lenexa. KS). Como la terapia inmunosupresiva ha llegado a ser muy comn y los antibitiSi sospechamos que un aislamiento de mohos puede tener hongos dimrficos de amplio espectro, como las celalospormas de tercera generacin, se cos (p. ej.. crecimiento en un medio que contenga cicloheximida), no debera usan con mucha frecuencia, las levaduras ocupan un gran lugar entre los realizarse el cultivo de este modo, y el test de la tira de celofn debe analizarpatgenos nosocomiales. En 1994, slo los estafilococos, E coli. Klebsiella se slo despus de puesta la preparacin en una cabina de seguridad de flujo spp. y los enterococos superaban a Candida como causa de infeccin sanlaminar. El lactofenol azul anilina es fungicida, por lo que proteger la muestra gunea en la universidad de Hermont. con esmalte de uas antes de observarlo nos da mayor proteccin. Tambin se puede cubrir el cultivo con formalina al 10% (4% solucin formaldehdo) e incubar a temperatura ambiente toda la noche antes de manipular el moho. Factores de riesgo Las infecciones por Candida tienen una extensin y una gravedad limitadas si el husped es normal. La terapia antibitica de amplio espectro trastorna el balance de la llora colonizante en las membranas mucosas de la cavidad oral y del tracto gastrointestinal al eliminar la flora bacteriana predominante. En algunos lugares, como el aparato genital femenino, la causa de una interrupcin en el balance normal en la flora puede no ser obvia. En zonas cutneas, tales como las ingles y los pliegues inframamarios. una humedad excesiva predispone a una infeccin por Candida. La gravedad y la invasin de la enfermedad aumenta cuando el husped tiene menos defensas (Fraser, 1992). La diabetes, las enfermedades o terapias inmunosupresivas y la neutropenia son factores de riesgo comunes. Las infecciones sanguneas, incluida la endocarditis fngica, se fomentan por inyeccin de drogas ilegales por via parenteral (Bisbe. 1992: Weems. 1992) y por usar vas intramusculares, como generalmente requieren los pacientes hospitalizados (Curry. 1971).

Test de sensibilidad de aislamientos fngicos

Durante muchos aos haba muy pocos agentes antifngicos quimioterpicos que fueran tiles: la anfotericina B era el nico agente efectivo contra la mayora de los patgenos sistmicos. Este potente agente antifngico era con frecuencia txico, pero por fortuna era rara la resistencia. El desarrollo de los test de sensibilidad para los antibiticos m vilro fue interrumpido por dificultades para estandarizar las condiciones de inoculacin y crecimiento. Cmo

Tabla 54-9

Test d e l t u b o g e r m i n a l - s u e r o

1. Colocar de un modo asptico varias colonias de levaduras a un tubo de test de 1? x 75 mm que contenga aproximadamente 0,5 mi de suero (humano feto de ternero, de oveja o conejo) 2 Incubar el tubo a 37 C. 3. Despus de 2 a 4 horas, colocar una gota de la mezcla en un porta de cristal limpio. 4 Buscar tubos germinales mediante el uso de un objetivo de 40x.
Q

Manifestaciones

clnicas

El patgeno ms comn con diferencia en el gnero Candida es C. albicans. La frecuencia con que se aislan otras especies vara en funcin de la

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SECCIN VI

MICROBIOIOGA MDICA

institucin. Candida (Torulopsis) glabrata. parapsilosis tropicalis son los siguientes patgenos ms frecuentes (Pfaller, 1998) Iropicalis se encuentra en pacientes inmunodepnmidos que tienen enfermedad diseminada. C. parapsilosis puede producir tambin enfermedad diseminada, particularmente cuando el paciente h a abusado de las drogas o ha tenido catteres intravenosos (Weems. 1992). C. glabrata (formalmente Torulopsis glabrata) tambin causa funguemias (Harn. 1993; Marks. 1970). Se ha asociado con infecciones del tracto urinario y vaginal (Kauffman, 1974; Sobel, 1986). C. kruse/'es una causante menos comn de infeccin diseminada que se parece a la producida por C. Iropicalis (Goldman, 1993). Continan asocindose muchas especies con las infecciones humanas, como C. zeylanoides (Levenson. 1991). demostrando una vez ms que la capacidad de los hongos para producir infecciones humanas es inexhaustible si las condiciones clnicas son adecuadas. La resistencia a los antibiticos imidazlicos (p. ej., cetoconazol. fluconazol o ilraconazol) desafortunadamente est aumentando en los aislamientos de especies de Candida. glabrata y C. krusei en particular son intrnsecamente ms resistentes a estos antifngicos que C. albicans (Pfaller. 1988). Candida lusitaniae. un patgeno aislado con poca frecuencia, es propensa a desarrollar resistencia a la anfotericina in vivo (Blinkhorn. 1989; Hadfield, 1987). La frecuencia con que se aislan varias especies varia de una institucin a otra. La enfermedad cutnea como ms frecuentemente se ve es como lesiones erilematosas de la piel, algunas veces acompaadas de un exudado blanco cremoso o escamas. La humedad es una precursora de la infeccin, por ejemplo, eritema del paal en nios o infeccin de los pliegues cutneos (intertrigo) en adultos. Las zonas comunes son las ingles (en forma de picor), entre los dedos de las manos y pies, debajo del pecho en las mujeres y en las axilas. Los trabajadores que tienen que meter las manos en el agua durante periodos de tiempo largos tienen un gran riesgo de infeccin de la piel de las manos, uas (onicomicosis) o paroniquia. Tambin podemos encontrar las lesiones en la piel de los muslos y nalgas, aunque son zonas donde no es corriente la infeccin. Una enfermedad cutnea crnica es una manifestacin poco comn de infeccin por Candida en pacientes con una inmunidad celular defectuosa (Kirkpatrick. 1971). La candidiasis oral por lo general se manifiesta como unas placas blancas por encima de la mucosa oral entematosa. Los sntomas son mnimos, pero puede haber una disfagia importante si la infeccin es grave. Es comn que aparezcan fisuras en las comisuras de la boca (queilitis angular) y esto suele ser la primera manifestacin. La candidiasis oral es una infeccin inicial comn en pacientes infectados por VIH (Gottlieb. 1981; Klein. 1984). La candidiasis oral y la infeccin por Pneumocystis y eran las dos pistas iniciales para identificar la presencia del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida). La candidiasis gastrointestinal se produce ms comnmente como esofagilis (Haulk, 1991) y menos comnmente como gastritis (Katzenstein. 1979). Las erosiones del esfago distal y del estmago provocan un dolor retroestemal. que empeora al tragar. A veces, por endoscopia, vemos unas placas blancas cubriendo la lesin. El diagnstico diferencial incluye la infeccin por el virus del herpes simple, y los des procesos pueden coexistir. Las especies de Candida son flora frecuente del tracto gastrointestinal bajo (Cohn, 1969), haciendo complicada la valoracin del significado de las levaduras en las muestras de heces. Una infeccin invasiva verdadera del tracto intestinal bajo es mucho menos comn que la enfermedad del tracto alto, aunque el crecimiento de Candida spp. en las heces debe acompaarse de tratamiento antibitico. Se h a descrito enteritis por Candida, carece de documentacin histolgica (Kane. 1976; Kozinn, 1962). La vulvovaginitis afecta a las mujeres pospuberales. La diabetes, el tratamiento antimicrobiano, los embarazos y la actividad sexual son condiciones predisponentes. Una quemazn vaginal, picor, dispareunia y una secrecin de color crudo se asocian con una infeccin que puede ser aguda o crnica y difcil de erradicar (Sobel, 1986). La infeccin del tracto urinario es difcil de diagnosticar, porque es frecuente que encontremos especies de Candida en la orina por una contaminacin vaginal o colonizacin de la vejiga en pacientes con catteres intravasculares. especialmente cuando se han administrado antibiticos por va sistmica (Goldberg, 1979). La infeccin grave del tracto urinario alto, incluida la necro-

sis de la papila renal, es una complicacin seria de las infecciones del tracto bajo, y se produce generalmente en pacientes que tienen una uropata obstructiva. Los cultivos no son tiles para valorar el significado de las especies de Candida en el tracto urinario (Goldberg, 1979). L a candidiasis diseminada es una enfermedad nosocomial seria, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos que estn neutropnicos (Fishman, 1972: Klein. 1979). Del 10% al 15% de las infecciones del torrente sanguneo las causan las levaduras. Las lesiones focales en cualquier rgano pueden ser el resultado de una diseminacin hematgena. Es raro que se produzca endocarditis (Johnston, 1991) en pacientes que abusan de drogas (Bisbe, 1992: Weems, 1992). Desafortunadamente, muchos hemocultivos con frecuencia son negativos en las candidiasis diseminadas (Jones, 1990). Es importante retirar los catteres infectados (Edwards. 1992). Muchos especialistas de enfermedades infecciosas recomiendan una terapia emprica para la infeccin hongos si el tratamiento que hemos utilizado para los patgenos bacterianos no ha funcionado, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos con neutropenia (Pizzo. 1989: Walsh. 1999). La mayora de las infecciones pulmonares se presentan como parte de una infeccin diseminada. La neumona primaria por Candida puede producirse, pero no es lo habitual (Harn, 1993; Ramrez, 1967). El valor predictivo para la neumona por levaduras identificadas o especies de Candida aisladas de muestras respiratorias es m u y bajo, porque pueden estar contaminadas con secreciones del tracto respiratorio alto. Un acercamiento razonable de costebeneficio para las levaduras del tracto respiratorio es informar de su presencia como formas levaduriformes despus de eliminar la posibilidad de que sea un criptococo con un rpido test de ureasa (Murray, 1977). Las infecciones del sistema nervioso por Candida son poco corrientes (Bayer. 1976; Parker, 1981), Pueden producirse como una parte de una infeccin diseminada o pueden resultar de una inoculacin directa.

Patologenia de la infeccin por Candida

La reaccin histolgica a la infeccin por Candida es por lo general purulenta, asemejndose a las lesiones de las infecciones bacterianas. Encontramos generalmente abscesos. En ocasiones, la reaccin a la infeccin por Candida es granulomatosa. En tejidos, podemos encontrar levaduras gemando, pseudohilas e hitas verdaderas. El aforismo que tanto se repite de que las pseudohifas en una superficie mucosa indican un infeccin invasiva deriva de los estudios clnicos de enfermedad gastrointestinal (Kozinn, 1992). pero esta teora ya se ha rechazado en el momento actual (Odds, 1994). Cuando predominan las pseudohifas o las hilas verdaderas, hay que diferenciar las levaduras de los mohos patgenos invasivos, como el Aspergillus. La invasin vascular no es comn en infecciones por levaduras, como sucede con el Aspergillus o los cigomicetos. Con frecuencia se muestran levaduras en las partes teidas con hematoxilina-eosina, pero tambin hay que utilizar la tincin de Gram de tejidos, el tinte de metenamina plata y la tcnica del cido peridico de Schiff.

Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones

Las muestras para cultivo deben tomarse de los rganos afectados y de lesiones donde puedan visualizarse. Como se ha explicado antes, el sistem a Isolator es el mtodo ms sensible para detectar bacteriemia (Jones. 1990). pero los sistemas modernos de monitorizacin continua de hemocultivos, que en principio se usaban principalmente para detectar la bacteriemia, detectan la mayora de los aislamientos de levaduras clnicamente significativos (Wilson, 1993; Petti, 1996). Las muestras de tejidos, raspados o exudados de boca o vagina tienen que inocularse en un medio de aislamiento primario con y sin cicloheximida. Si en presencia de la ocloheximida hay buen crecimiento, es una pista preliminar de la presencia de Candida albicans, aunque C. guilliermondii. C. kefyr (formalmente pseudotropicalis) y algunas cepas de C. iropicalis pueden encontrarse tambin en este medio. La presencia de extensiones filamentosas de los bordes de la colonia (pies) es una indicacin macroscpica de que se estn produciendo pseudohifas (Fig. 54-1). C. glabrata (formalmente Torulopsis glabrata) y Cryptococcus spp. in vitro no forman pseudohifas, y otras especies de Can-

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ENFERMEDADES MICTICAS

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dida. como C. lusilamae y C. guilliermondii, puede que no formen muchas pseudohifas. La extensin de la evaluacin micolgica depende del marco clnico y del tipo de muestra. Los tractos urinario y respiratorio son dos sistemas orgnicos impodantes donde aislar Candida frecuentemente, pero es difcil de interpretar, como ya se ha explicado. La identificacin completa de aislamientos de estos sitios slo debera terminarse despus de consultarse con el mdico responsable. Aunque la prctica clnica normalmente no se altera por identificar especies de Candida aisladas, pensamos que los aislamientos de sangre u otros tepdos y fluidos estriles deberan examinarse enteros cuando las levaduras son el patgeno predominante o el nico. Del mismo modo, identificamos los aislamientos cuando se ha pedido analizar los hongos en un marco donde se espera encontrar Candida, como vaginitis o muguet oral. La importancia puede ser til para el epidemilogo del hospital para el estudio de las infecciones nosocomiales. Un grupo de investigadores ha sugerido que el porcentaje de recurrencia y cronicidad de la vulvovaginitis son mayores cuando el patgeno es C. Iropicalis que cuando es C. albicans (Horowitz, 1985), pero se necesitan ms estudios. Cuando aislamos una levadura en el laboratorio bacteriolgico, o est presente en una infeccin polimicrobiana, informamos de su presencia, y antes de hacer ms estudios pediremos una consulta. Es muy poco frecuente que tengamos estas peticiones. Tenemos que expedir un informe preliminar de C. albicans si el test del tubo germinal es positivo (Fig. 54-15). Si hacemos el estudio de la morfologa de las levaduras utilizando un agar crnea para confirmar la presencia de clamidosporas. la identificacin por lo general puede terminarse en una sola placa de agar en 24-48 horas; en ocasiones, a las 72 horas para que el cultivo se complete (Fig. 54-16). Si no se demuestra el tubo germinal ni las clamidosporas. la identificacin primaria o presuntiva de las especies de Candida puede hacerse si las pseudohifas estn presentes o no hay artroconidias. Una pequea fraccin de Candida aisladas no producen pseudohifas. tubos germinales o clamidiosporas. Una identificacin completa necesita un test de asimilacin, pero las observaciones morfolgicas auxiliares son necesarias (Tabla 54-11). Algunos laboratorios usan los lest de fermentacin para ayudar a identificar las especies de Candida, pero no se piden. En el momento actual no se recomiendan los test nmunolgicos para diagnosticar candidiasis (de Repentigny. 1992). Continua la investigacin de los mtodos para detectar antgenos. que podran proporcionar un test til y rpido para la infeccin invasiva.

ciones que definen el VIH que ha llegado a ser el factor de nesgo ms importante Es animoso que la incidencia de esta infeccin oportunista parece disminuir entre pacientes con sida en algunas ciudades (Hajjeh. 1999).

Enfermedad

clnica

Neumona. La puerta de entrada de todas las infecciones criptoccicas es el pulmn, aunque la enfermedad pulmonar sintomtica puede no estar presente en el momento que se reconozca la enfermedad extrapulmonar (White. 1994). La neumona criptoccica nuestra una amplia variedad de presentaciones. Los pacientes inmunocompetentes pueden no mostrar sntomas, a pesar de la presencia de los criptococos en el Irado respiratono bajo (Randhawa, 1977). La neumona puede ser lenta y prolongada, tardando mucho en resolverse. La infeccin puede ser difusa o localizada, incluida la presencia de lesiones nodulares que no suelen calcificar. La infeccin es ms grave en pacientes inmunocomprometdos. y con frecuencia se acompaa por otros agentes infecciosos, en particular Pneumocystis cannii y citomegalovirus. La enfermedad extrapulmonar puede aparecer semanas despus de haber encontrado una infeccin pulmonar (Kerkering, 19811 Infeccin cutnea. Las lesiones cutneas por lo general son el resultado de la diseminacin hematgena desde el tracto respiratorio (Pema, 1994). Se presentan como ppulas simples o mltiples, que aumentan y se ulceran, produciendo un pequeo exudado que contiene las levaduras. Infeccin articular y sea. Una vez ms el foco primario de infeccin es el tracto respiratorio, desde donde se disemina el cnptococo: lo ms comn es a la columna vertebral (Behrman. 1990). Se producen lesiones osteolticas. Los abscesos llamados fros en el tejido suave adyacente producen un exudado fino que contiene gran nmero de criptococos. Con menos frecuencia incluye los espacios articulares. Infeccin del sistema nervioso central. Los focos ms frecuentes y peligrosos de infeccin criptoccica diseminada son las meninges y el parnquima cerebral (Chuck, 1989; Kovacs. 1985; Lewis. 1972; Zuger. 1986). El comienzo de la enfermedad suele ser agudo, pero la presentacin puede ser insidiosa y la progresin lenta. Las cefaleas y cambios en el estado mental y de personalidad con frecuencia dominan el cuadro clnico. L a meningitis basilar, afectacin de los nervios craneales, y la invasin de la parte de debajo del crtex. producen una hidrocefalia y disminuyen la agudeza visual. Si hay fiebre, es febrcula, y los signos tpicos de irritacin menngea, como rigidez de nuca y los signos de Kernig y Brudzmski, estn ausentes.

Gnero

cryptococcus

El patgeno principal dentro de este gnero es el Cryptococcus neoormans. Existen dos variedades: C. neotormans variante neotormans y C. neotormans variante gattii. La ltima variante se encuentra predominantemente en los trpicos y subtrpicos, y es raro aislarla en los laboratorios clnicos en EE.UU. (Levitz, 1992). Ambas variantes tienen dos serotipos. pero la determinacin serolgica slo es de inters epidemiolgico. El estado sexual del C. neotormans es un basidiomiceto, Filobasidiella neotormans. pero el teleomorto no se aisla en laboratorios clnicos. Otros criptococos y Rhodotorula spp. en ocasiones se aislan en zonas no estriles, pero es raro que estn implicados en enfermedades humanas, si se encontrasen alguna vez (Horowitz, 1993; Kiehn, 1992; Sinnott, 1989). La fuente ambiental primaria del C. neotormans son los excrementos de palomas o. menos comnmente, de otras aves. El suelo contaminado tambin puede esconder los hongos.

Patologa de la infeccin por Cryptococcus

La respuesta histolgica depende del grado de encapsulacin de la cadena infectada. Lo ms comn es que no haya respuesta inflamatoria o que sea pequea, correspondiendo al exudado fino visto clnicamente. Meior dicho, las clulas del tejido normal estn separadas por un gran nmero de criptococos encapsulados. Cuando examinamos el LCR, las nicas clulas presentes pueden ser las levaduras, que podan malinterpretarse como clulas huspedes mononucleares si por la clnica no sospechamos la infeccin. En las tinciones de tinta china positivas encontramos cpsulas grandes. En los tejidos seccionados es raro que encontremos pseudohifas cortas y rudimentarias de C. neotormans (Freed, 1971). Las cadenas del C. neotormans pobremente encapsuladas producen una respuesta granulomatosa inflamatoria, y las levaduras las encontramos predominantemente en el citoplasma de los macrfagos (Farmer. 1973) Pueden confundirse con las clulas del Blastomyces dermatitidis o incluso con esprulas inmaduras del C. immitis. Se han descrito confusiones entre levaduras pequeas criptoccicas con el H. capsulatum, pero la diferenciacin por lo general no es difcil (Gutirrez, 1975). La dilerenciacin en los Irozos de tejido puede terminarse al teir los mucopolisacridos de criptococo con tintes de mucina, o al demostrar el pigmento de melanina con el tinte de Fontana-Masson. El tinte de melanina es ventajoso cuando la cadena infectada tiene poco material capsular (Ro, 1987) Las combinaciones del tinte Fontana-Masson y varios tintes para mucopolisacndos, como mucicarmma o azul alcin se han utilizado para

Factores de riesgo
El tratamiento inmunosupresor o la enfermedad es un factor de riesgo para la criptococosis (Williams, 1976). Antes de que apareciera la infeccin por VIH. del 30% al 50% de los pacientes con infeccin por Cryptococcus eran inmunolgicamente normales, medidos con parmetros adecuados. Entre los factores de riesgo para los pacientes que no estn infectados por VIH se incluyen neoplasia, diabetes, terapia inmunosupresiva o enfermedades inmunolgicas (Hajjeh, 1999). La criptococosis es una de las infec-

Tabla 54-11

Detalles auxiliares tiles para la Identificacin de levaduras Crecimiento con cicloheximida + -(+) Tubos . ... _. germinales Pseudohifas P.gmento ro,o + + + + + + + (-) _ _ _ _
+ H +

Organismo Candida albicans Candida tropicalis

Ureasa

Artroconidias _

.. Crecimiento Clarmdosporas
c o n | i p d o s

Ascosporas _

Comentarios

Candida parapsilosis Candida krusei Candida kelyr (pseudotropicalis) Candida guilliermondii Candida (Torulopsis) glabrala Candida lusitaniae Cryptococcus neoformans Especies de Rhodotorula Malassezia frfur Malassezia pachydermatis Especies de Trichosporon Geolrichum candidum Saccharomyces cerevisiae

+ + _ _ _

+ + _ _

+ (->

+ + -

Pseudohifas bien desarrolladas, rara produccin de tubos germinales Pseudohifas en cepillo Colonia plana y seca Pseudohifas en "tronco en arroyo"; verde brillante en agar EMB Las pseudohitas pueden estar ausentes o en poco nmero; colonia vitrea Levaduras pequeas (de 2uma5 pm) Las pseudohilas pueden estar en el escaso nmero Capsula polisacrida presente, clulas levaduriformes redondas La cpsula polisacrida puede estar presente Levaduras pequeas con lorma de termo Levaduras pequeas con forma de termo No blastoconidias, artroconidias germinales a partir del ngulo de la clula Las pseudohilas pueden ser raras

-(+)

(): Reaccin menos frecuente. EMB eosina azul de metiieno.

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ENFERMEDADES MICTICAS

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avanzar, pero no suelen ser necesarios (Lazcano. 1993). Blastomyces dermatitidis se tie muy poco con los linles de mucina en raras ocasiones. El Rhinosporidium seeberies positivo para la mucina. no se ve en climas templados y se diferencia fcilmente de los criptococos en cuanto a la morfologa. Las clulas que vemos en la cromoblastomicosis contienen melanina. pero se diferencian en la morfologa y no reaccionan con tintes de mucina. El tamao variable (3 pm-10 pm) y la naturaleza redonda de la levadura in vivo y son pistas para identificarlas correctamente, a pesar del grado de encapsulacin y respuesta histolgica. Un complejo primario de granulomas en la periferia del pulmn y en nodulos linfticos regionales, que recuerda a los que nos encontramos en tuberculosis e histoplasmosis. probablemente se produce con ms frecuencia de la que lo reconocemos (Salyer. 1974).

te indio, se ha encontrado en muchos animales, especialmente en las orejas de los perros, y en ocasiones de los humanos. El nombre formal del M. turtur es Pityrosporum ovale o P. omiculare. dependiendo de la morfologa de la levadura.

Factores de riesgo
M. frfur se encuentra en la piel de ms del 90% de los individuos (Roberls. 1969b. 1969c), y la enfermedad cutnea se produce en huspedes normales. Puede haber un aumento de sensibilidad a la enfermedad en pacientes que suden mucho (Roberls, 1969a) o en pacientes que tienen un nivel de corticoesteroides elevado debido al tratamiento (Boardman, 1962) o una produccin endgena, como en la enfermedad de Cushing (Caizares. 1959). La infeccin sistmica se produce principalmente en neonatos y se asocia con una hiperalimentacin intravenosa con soluciones lipidicas (Powell. 1986). Aunque M. frfur no suele estar presente en la piel de los neonatos sanos, se ha encontrado la levadura en la piel del 37% de los nios que estuvieron en la unidad de cuidados intensivos (Powell, 1987). Los factores de nesgo para la infeccin por M. pachydermatis en humanos son similares (Mickelsen, 1988).

Identificacin en el laboratorio y otras investigaciones

Los posibles criptococos siempre deben identificarse como especies para determinar si el C. neotormans est o no presente. Las pistas para ver la presencia de este hongo son un buen crecimiento en placas de agar de sangre incubados en el laboratorio bacteriolgico a 35'C-37 C. las colonias tienen apariencia mucoide (Lmina 54-4), apariencia redonda de las clulas de levadura en las preparaciones en fresco o preparaciones teidas y ausencia de crecimiento en un medio que contiene cicloheximida (Tabla 54-11). Podemos obtener una supuesta identificacin de un modo rpido examinando una preparacin de tinta china para las cpsulas (Fig. 54-13) (Tabla 54-7) o realizando un test rpido de ureasa (Tabla 54-4). o ambos. Las cpsulas pueden diseminarse incluso en cadenas fuertemente encapsuladas una vez que se han aislado en medio agar. Hemos encontrado varios aislamientos de C. neotormans del tracto respiratorio que eran no mucoides y que se parecan a Candida spp. en la morfologa de las colonias. El subcultivo de los aislamientos puede restaurar la cpsula mucoide. La identificacin definitiva se lleva a cabo por un test bioqumico. La determinacin de la actividad de la fenol oxidasa puede incluirse, pero no es necesario si se utiliza uno de los sistemas de identificacin de levaduras que se comercializan. El antgeno polisacrido del C. neotormans puede encontrarse en el LCR y el suero: lo ms comn es por una aglutinacin de ltex. La sensibilidad del test supera el 90%. pero los equipos comerciales varan considerablemente en sensibilidad y especificidad. El factor reumatoide puede dar falsos positivos (Dolan. 1972). y deben incluirse controles para la antiglobulina en los test (Bennett. 1971). Las infecciones grupo DF-2 (Capnocytophaga canimorsus). los bacilos gramnegativos no fermentativos (Westerink, 1987) y T. beigehi pueden causar falsos positivos, pero stas son infecciones poco comunes. Otras causas ocasionales de falsos positivos son poco comprensibles. La frecuencia de resultados errneos puede disminuir tratando las muestras de suero con pronasa (Hamilton, 1991; Stockman, 1982). Los falsos positivos parece que son menos comunes en pacientes infectados por VIH. quiz porque hay presente un gran nmero de organismos (Berln, 1989). La titulacin de los resultados positivos se ha hecho de modo adicional para valorar el pronstico y como una base para seguir los efectos del tratamiento. Un gran nmero de antigenos y la persistencia del antigeno siguiendo tratamiento son pequeos signos de pronstico en pacientes que no estn infectados por VIH (Diamond, 1974). Por el contrario, no se ha demostrado que estos parmetros sean tiles de manera uniforme en pacientes con VIH, que en la actualidad son el grupo de mayor nesgo (Chuck. 1989; Kovacs, 1985; Zuger. 1986). La medida del antgeno en el suero parece ser el test ms sensible en pacientes inlectados por VIH, ms que el anlisis de LCR. Tanto el suero como el L C R deben analizarse para una buena sensibilidad. En algunos informes, aislar el C. neotormans de un sitio de fuera del SNC se ha asociado con un pronstico pobre en pacientes infectados con VIH. Un test negativo para la tinta china en el LCR es un signo de buen pronstico en pacientes no VIH, pero no tiene la misma implicacin en pacientes con sida.

Enfermedad

clnica

Pitiriasis (tina) versicolor. Esta infeccin comn de la epidermis termina en una hiperpigmentacin o hipopigmentacin de la piel, sobre todo en el tronco y parte alta de los brazos (Powell. 1986). Las mculas marrones es la presentacin ms comn, pero las lesiones despigmentadas son ms obvias en personas de piel oscura, y pueden utilizarse sustancias para acentuarlas en individuos de piel clara. Los efectos de la enfermedad son puramente cosmticos, pero pueden ser considerablemente problemticos. Las lesiones hipopigmentadas deben diferenciarse del vitligo. El tratamiento consiste en una aplicacin tpica de cremas fungicidas o enjuagues. Infeccin sistmica. La infeccin sistmica se produce en casi todos los nios que han recibido infusiones intravasculares de lpidos. Aunque las soluciones lipidicas por s solas no apoyan el crecimiento de las levaduras, las soluciones lipidicas diluidas apoyan el crecimiento de M. frfur abasteciendo la cadena larga de cidos grasos que tambin se encuentran en la piel, y deben abastecerse en laboratorio para aislarlas (Powell, 1986). Los nios infectados por lo general estn asintomlicos. pero la fiebre, la leucocitosis y la trombocitopenia pueden estar presentes. La neumona es la manilestacin sistmica ms importante de la enfermedad, probablemente a causa de una embolia de catteres intravenosos infectados. El tratamiento es quitar el catter infectado.

Patologa de la infeccin por Malassezia frfur

El diagnstico de pitiriasis versicolor por lo general se hace clnicamente o demostrando levaduras o formas cortas de hifas (parecidas a los espagueti) en preparaciones de KOH de raspados de piel. Aadir calcoflor blanco u otros tintes fngicos aumenta la deteccin porque las clulas fngicas son pequeas y es difcil verlas cuando no estn teidas (Fig. 54-17). Cuando se hace la biopsia puede verse hiperqueratosis. acantosis y unos infiltrados drmicos mononucleares. Se sabe poco de la patologa de la infeccin sistmica de M. luriur, porque es raro hacer biopsias y la infeccin letal no es comn. En casos extremos, las lesiones se han descrito en muchos rganos, incluidos pulmn, hgado y rion (Shek, 1989). Tambin se observaron vasculitis. endocarditis, infartos spticos e inflamacin granulomatosa.

Identificacin del laboratorio y otras investigaciones

En enfermedades cutneas es raro que se pida un cultivo para M. luriur, y la observacin directa de las levaduras en preparados de KOH por lo general se hace en el despacho del mdico. Esta levadura debera verse en cultivos de sangre y en la punta de catteres intravenosos en neonatos. Antes de inocularla, se aade una gota estril de aceite de oliva a la superficie de un medio agar vlido, como el agar Sabouraud dextrosa o el agar

Gnero Malassezia
Las dos especies ms importantes dentro del gnero Malassezia son M. furtury M. pachydermatis (Marcon, 1992). M. frfures con diferencia el patgeno humano ms comn. M. pachydermatis, micialmente aislado de un rinoceron-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

sangre de oveja. En nuestro laboratorio utilizamos aceite de cacahuete, que tambin funciona bien. Dentro de los dos o tres primeros das, las colonias aparecen en marrn claro y por lo general tienen una apariencia muy seca en el aceite subyacente (Lmina 54-5). Una pista inicial es la taita de crecimiento por la presencia de un aceite. Debera haber suficiente lipido en la sangre o en la punta de catter, sin embargo, para mantener el crecimiento inicial en las placas que no contienen aceite. M. pachydermatis no es dependiente de la cadena larga de cidos grasos para crecer. La identificacin del aislamiento puede confirmarse por un examen microscpico de las clulas de levadura, que miden de 3 pm a 7 pm. El proceso de gemacin en la Malassezia es inusual, porque se produce como un proceso enteroblstico con la formacin de flides. La gemacin tiene una amplia base y los collaretes de las filides podran observarse con el microscopio de luz como un anillo oscuro distinto que separa la clula madre de la hija (Fig. 54-18).

Otras levaduras y patgenos semejantes a levaduras y saprofitos

7! beigelii produce una infeccin del pelo conocida como piedra blanca y puede producir infeccin sistmica (Hoy. 1986: Ogata, 1990). El Blastoschizomyces capitatus (formalmente Trichosporon capitalum) ha causado casos raros de infeccin diseminada semejante a la candidiasis (Liu, 1990). Un hongo morfolgicamente similar, Geotrichum candidum, es tambin una causa rara de enfermedad pulmonar o diseminada (Fishbach, 1973; Jagirdar. 1981). Geotrichum y Trichosporon producen colonias lisas y parecidas a las levaduras que despus desarrollan micelios areos, como un pelo que nace de una cabeza calva (Lmina 54-6). Ambas especies producen artroconidias que rompen las clulas disyuntoras vistas en el C. immitis (Fig. 54-19). Saccharomyces cerevisiae (Clemons. 1994; Sobel. 1993), especies de Rhodotorula (Pen. 1980) y las especies de Hansenuta son levaduras saprofticas que en raras ocasiones pueden producir infeccin. Encontrar levaduras en los tejidos o aislarlas en mltiples muestras, incluso de zonas estriles, es necesario para informar del papel de las levaduras en un proceso infeccioso. Saccharomyces cerevisiae es la levadura de los panaderos y a lo mejor es ms conocida por los estudiantes de micologa por sus efectos saludables en malta y lpulos.

Figura 54-18. Clulas levadurilormes en gemacin de Malassezia luriur que dan la clsica forma de termo.

Sporothrix schenckii. El Sporothrix se distribuye a travs de lodo el mundo. Los oros organismos se encuentran predominantemente en Amrica del Norte, donde tienen distintas distribuciones geogrficas (Fig. 54-20). La enfermedad epidrmica es ms comn con Histoplasma y Coccidioides y menos comn con Sporothrix y Blastomyces. La fase de tejido de Coccidioides es la esfrula. El otro gnero produce una fase levadura in vivo y puede tambin crecer como una levadura si se incuba a 37'C m vitro.

Histoplasma

capsulatum

Factores de riesgo
El principal tactor de riesgo para adquirir la infeccin es vivir en una de las regiones endmicas de EE.UU.. en una zona que se localice en el curso de los ros Ohio y Missssppi. as como en los valles de las montaas Appalachian. En algunas zonas, ms del 90% de la poblacin tiene un resultado positivo en los test de piel de histoplasmina. El crecimiento de H. capsulatum se estimula por el pjaro guano, aunque los hongos no crecen en los mismos pjaros. Una tpica historia de una histoplamosis aguda est representada por el paciente que ha limpiado recientemente un gallinero. Las enfermedades epidmicas se han producido despus de hurgar en los nidos de los pjaros durante proyectos de construccin (Tosh. 1966). De

HONGOS DIMRFICOS
Los hongos dimrficos son los organismos patgenos ms importantes encontrados en un laboratorio de micologa clnica. En EE.UU.. los patgenos ms importantes son H. capsulatum. Blastomyces dermatitidis. C. immitis y

Figura 54-17. Raspado cutneo de una lesin de tina versicolor. Son caractersticas las formas levadurilormes e hifas cortas de la Malassezia uriur. Estas formas Figura 54-19. Las artroconidias y la especie Trichosporon no estn separadas p o r s e han descrito c o m o "espagueti y albndigas" (mtodo PAS). clulas disyuntoras (lactofenol algodn azul).

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ENFERMEDADES MICTICAS

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suelve completamente. Si ha habido una inflamacin granulomatosa local, la calcificacin del foco puede deiar una lesin nodular perfectamente definida que puede verse en la radiografa de trax. Las lesiones cutneas del eritema nodoso y del eritema multiforme pueden acompaarse de una infeccin pulmonar aguda (Medeiros. 1966). Pericarditis y mediastinitis. La inflamacin granulomatosa del pericardio y la mediastinitis se han atribuido al H. capsulatum. con ms frecuencia en terreno serolgico (Loyd, 1988; Schowengerdt. 1969). La inflamacin crnica puede terminar en fibrosis y pericarditis constrictiva. Es raro ver levaduras en las lesiones y es raro encontrarlas en el cultivo. H i s t o p l a s m o s i s crnica pulmonar. Esta enfermedad debilitante se produce principalmente en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crnica. La mayora de ellos suelen ser hombres de mediana edad (Goodwin, 1995). Puede calcificarse y producirse una cavitacin. El diagnstico diferencial incluye tuberculosis pulmonar crnica y neoplasia pulmonar. H i s t o p l a s m o s i s d i s e m i n a d a . La diseminacin de las levaduras a travs del sistema reticuloendotelial puede ser como una parte de u n a histoplasmosis pulmonar aguda, terminando en granulomas cicatrizados que con frecuencia se calcifican, especialmente en el bazo (Johnson. 1988; Kauffman, 1978; Nightingale, 1990; Reddy, 1970). La enfermedad diseminada clnicamente se produce en dos clases de pacientes. El primer grupo son individuos en edades extremas que no tienen una condicin inmunosupresiva reconocida, pero pueden tener el sistema inmune que no est completamente desarrollado, o que ha disminuido por la edad de un modo que no se entiende. El segundo grupo son pacientes con una enfermedad o tratamiento inmunosupresivo que est reconocido. Antes de 1980, las enfermedades eran predominantes en neoplasias hematolgicas; en la actualidad, la infeccin por VIH es el factor de nesgo ms importante (Johnson, 1988; Wheat, 1990). El avance de la enfermedad puede ser rpido o insidioso. L a infeccin del sistema reticuloendotelial puede terminar en linfadenopatia, hepatoesplenomegalia o trombocitopenia. La destruccin de la corteza suprarrenal por el proceso granolumatoso puede ser suficientemente extensa como para causar una insuficiencia hormonal. La infeccin del SNC puede manifestarse como meningitis crnica, granulomas intracerebrales o ambos. La infeccin endovascular incluye la endocarditis con unas vegetaciones grandes y voluminosas. Puede afectarse cualquier parte del tracto gastrointestinal, y macroscpicamente las lesiones ulceradas pueden sugerir una neoplasia. La afectacin de la piel es menos comn que con otros hongos dimrficos (Studdard, 1976). En pacientes infectados con VIH. los sntomas de la histoplasmosis diseminada pueden parecerse a esos producidos por el virus, incluyendo fiebre, linfadenopatia, anemia, leucopenia. trombocitopenia, prdida de peso y fatiga. Las lesiones cutneas solitarias son raras; pueden seguir a la introduccin directa de hongos.

Coccidioidomicosis
Figura 54-20. Distribucin geogrfica de las infecciones fngicas dimrficas en Estados Unidos. Se ilustran las reas de mayor endemicidad (sombra oscura) y las de m e n o r endemicidad (sombra clara). Pueden producirse casos espordicos en otras reas fuera de las endmicas. La histoplasmosis y la blastomicosis se extienden en el sur de Canad, mientras que la coccidiomicosis se da en Centroamrica y Sudamnca.

modo irnico, el comienzo de una histoplasmosis se produjo en el 40% de los estudiantes y facultativos que participaron en un da de limpieza en el colegio (Brodsky. 1973). La histoplasmosis pulmonar crnica es una enfermedad particular con enfermedad pulmonar obstructiva crnica (EPOC). La infeccin diseminada normalmente se asocia con deficiencias inmunolgicas, especialmente del sistema inmune celular. La infeccin por VIH se ha convertido en el factor de riesgo ms importante para la diseminacin de la enfermedad (Johnson, 1988).

Patologa de histoplasmosis
Como un patgeno facultativo intracelular, H. capsulatum se asocia particularmente con macrfagos. Las lesiones patolgicas consisten en recogidas de macrfagos infectados, granulomas no caseosos o granulomas caseosos. Las lesiones histopatolgicas son muy parecidas a esas que se producen por Mycobacterium tuberculosis, y debera pensarse en estos dos patgenos a la vez. Las levaduras intracelulares por lo general se muestran bien por una tincin de hematoxilna-eosina (Fig. 54-21). Las tcnicas de cido peridico de Schilf y de plata metenamina son ms frecuentes, y el tinte de plata es necesario para demostrar las clulas de levaduras en granulomas cicatrizados. Estas levaduras, que presumiblemente no son viables ms tiempo, pueden alargarse y retorcerse. El diagnstico diferencial de las formas de levaduras es con formas pequeas de B. dermatitidis. En el marco clnico adecuado, debemos considerar P. marnettei y las especies de Leishmania o Candida spp., en especial C. glabrata L a talla mayor de las clulas de levadura de Candida (distinta de C. glabrata) o la presentacin clnica por lo general sugiere el diagnstico adecuado.

Enfermedad

clnica

Infeccin pulmonar aguda. L a mayora de los individuos inmunocompetentes desarrollan una infeccin asintomtica o subclnica acompaada de una respuesta inmunolgica (Goodwin. 1973,1978). Los pacientes sintomticos desarrollan un sndrome parecido a la gripe que puede acompaarse de dolor pleurtico o retroesternal. Los pacientes ms gravemente afectados pueden estar enfermos durante varias semanas, pero por lo general se re-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

nologas o moleculares. El agar de sangre cistena glucosa o el agar infusin de cerebro-corazn con sangre de oveja se incuban a 37 C. Si se ha demostrado la fase levadura en muestras de tejidos, la conversin del m o h o in vitro es acadmica. El diagnstico serolgico de la histoplasmosis tiene un papel secundario en el diagnstico y no debe sustituir los intentos para cultivar los hongos (Walter, 1969). La fijacin del complemento y las tcnicas de inmunodilusin es lo que se utiliza ms frecuentemente. La sensibilidad del serodiagnslico no es mayor del 50% al 85% en enfermedad pulmonar crnica, y desafortunadamente es mucho menor cuando la enfermedad diseminada se produce en pacientes inmunocomprometidos. Una seroconversin retardada y unas reacciones cruzadas numerosas adems comprometen este acercamiento diagnstico (Terry. 1978). Cuando se trabaja en un rea endmica, la observacin de uno de nosotros (WW) de que aumentaba la fijacin del complemento al B. dermatltidis era indicacin de que el paciente probablemente tuviera toxoplasmosis. Figura 54-21. Clulas levaduriformes de Histoplasma capsulalum dentro de los macrfagos. Los ncleos son nicos. Las clulas estn separadas de las dems por un espacio que es un artefacto de la fijacin con formalina. Los hongos se consideraron originalmente como unos protozoos tisulares, y el espacio claro se consider como una cpsula (tincin de nematoxilma-eosina). El test cutneo de histoplasmina ha sido muy lil para estudios epidemiolgicos, pero no debera usarse nunca para diagnstico. La alta frecuencia de test positivos en zonas endmicas no slo entorpece la interpretacin, sino que el test cutneo puede producir seroconversin, confundiendo adems el tema (Campbell. 1964). Se ha desarrollado un radiommunoensayo urinario para el anligeno del Histoplasma y est disponible desde un laboratorio de referencia sencillo (Laboratorio de Referencia del Histoplasma. Indianpolis. IN). Como ya se coment anteriormente, este test parece ser de gran uso en el diagnstico en pacientes con enfermedad diseminada (Williams. 1994).

Las levaduras de H. capsulatum en granulomas caseosos son lo suficientemente distintas para proporcionar un diagnstico posible, pero tienen que diferenciarse de las presentaciones granulomatosas inusuales del Pneumocystis carinii.

Blastomyces

dermatltidis

Factores de riesgo Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones

Cualquier consideracin de este patgeno fngico principal debe llevarse hasta el final. La forma de levadura en el tejido puede demostrarse histolgicamente o en preparaciones de secreciones respiratorias, fluidos, sangre perifrica, mdula sea o tejidos impresos. Tienen que usarse preparaciones frescas y calcoflor blanco, pero la morfologa del tejido y las clulas levaduriformes se ven mejor con la tincin de Giemsa, porque se pueden valorar los detalles de la morfologa nuclear. La medida de las clulas es de 3 pm a 5 pm. tienen un ncleo sencillo y un brote con un cuello estrecho. Si se sospecha una infeccin diseminada, en particular en pacientes infectados VIH, deben realizarse hemocullivos para Histoplasma. La tcnica Isolator parece ser la ms sensible para recuperar la fase levadura de la sangre (Paya, 1987). Si se sospecha H. capsulatum, debera inyectarse un agar enriquecido tal como un agar de infusin cerebro-corazn con suplemento de sangre de oveja. Las placas tienen que incubarse a 30"C; la incubacin del primer aislamiento en placas a 37'C no es necesaria. Las colonias de H. capsulatum que se aislan a 25C-30C son vellosas y varan de color blanco a marrn (Lmina 54-7). Algunas cadenas crecen ms despacio y necesitan varias semanas para desarrollar las colonias. Las formas de diagnstico asexual incluyen microconidias y macroconidias. Las microconidias. que se producen primero, son muy parecidas a las estructuras producidas por B. dermatltidis. Las macroconidias ms caractersticas han incrementado la aspereza de los salientes de la periferia de la conidia, una configuracin parecida a un tubrculo (Fig. 54-22). Las macroconidias de una saprofita. Sepedonium. deben diferenciarse del Histoplasma. La apariencia macroscpica de las colonias, el porcentaje de crecimiento, el crecimiento del H. capsulatum en un medio que contenga cicloheximida, la presencia de formas de levadura en los tejidos y la historia clnica generalmente son suficientes para diferenciar hongos. La configuracin final de la identificacin se realiza cuando se produce la conversin de la fase moho a la fase levadura a 37 C. para el test del exoantigeno. o por la hibridacin de cidos nucleicos La conversin a fase levadura algunas veces es excesivamente difcil y se ha cambiado en muchos laboratorios per tcnicas inmuLa mayora de los casos de blastomicosis son espordicos, y no suele encontrarse una fuente ambiental Se producen pequeas epidemias y se ha llevado a cabo el aislamiento de hongos del suelo en las zonas de brote (Klein. 1986). N o hay factores de riesgo especficos reconocidos para l a blastomicosis. aunque se ha descrito una infeccin grave y diseminada en pacientes infectados por VIH (Harding, 1991). La blastomicosis pulmonar primaria se ha descrito en un trabajador de laboratorio que ha estado expuesto en la fase moho (Baum, 1970).

Enfermedad

clnica

La puerta de entrada es a travs del tracto respiratorio, donde la infeccin puede ser asintomtica. transitoria (Sarosi. 1974; Witorsch, 1968) o avanzar

Figura 54-22. L a s macroconidias luberculadas d e Histoplasma capsulatum son caractersticas. Tambin suelen estar presentes las microconidias en las c o m d i o l o ras cortas (lactofenol algodn azul).

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ENFERMEDADES MICTICAS

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insidiosamente. La blastomicosis pulmonar crnica con febrcula, prdida de peso infiltrados pulmonares localizados puede sugerir enfermedad neoplasia, para la que tienen que llevarse a cabo estudios diagnsticos, incluido lavado alveolar. PAAF del pulmn o una biopsia pulmonar. La diseminacin de las levaduras desde el pulmn casi siempre termina en una infeccin cutnea u sea El SNC y el sistema genitourinario es menos frecuente que se incluyan. Las lesiones cutneas son con frecuencia hipertrficas, fngicas o ulcerativas, y pueden ser localmente destructivas. Las lesiones pueden confundirse con clulas escamosas del carcinoma de piel. Tambin hay un compromiso secundario de la piel por encima de las lesiones seas.

Patologa de la blastomicosis
La respuesta histolgica caracterstica de B. ermatittdis es una mezcla de inflamacin aguda, incluidos microabscesos. inflamacin granulomatosa. En lesiones cutneas, es caracterstico una hiperplasia seudoepitehomatosa de la epidermis por encima de la inflamacin. Las clulas de las levaduras las encontramos ms frecuentemente en los microabcesos o dentro de las clulas gigantes mullinucleadas. Podemos encontrarlas frecuentemente con el tinte hematoxilina-eosina, pero el cido peridico de Schiff o la metenamina plata deben emplearse si no encontramos los hongos en las secciones realizadas. Las clulas levaduriformes de pared gruesa miden de 8 pm a 1 5p m y mantienen la base ancha durante el proceso de gemacin. Una separacin, debida a un artefacto, del citoplasma de la pared celular en preparaciones fijadas con lormalma puede dar la apariencia errnea de una pared doble. Pueden verse ncleos mltiples en algunas clulas de levaduras con la tincin hematoxilina-eosina. Se deben distinguir las clulas de levaduras no geminadas de las de C. neolormans y de las esfrulas en desarrollo de C. immitis. Las tinciones de mucina pueden teir la pared celular de Blastomyces ligeramente de manera ocasional, pero la diferenciacin con respecto a C. neoformans debera ser posible empleando criterios morfolgicos.

Figura 54-23. Las clulas levadurilormes en gemacin de Blastomyces dermatitidis tienen una pared gruesa y una b a s ea n c h a entre las clulas m a d r e y la hija. Cuando se utilizan tinciones nucleares c o m o la hematoxilina-eosma. se p u e d e n demostrar mltiples ncleos en los clulas levadurilormes (lactofenol algodn azul).

ejemplo clsico de coccidioidomicosis epidmica se produjo en un grupo de estudiantes de arqueologa en una cueva en el norte de California. Al menos 61 estudiantes lueron infectados por artroconidias en el suelo de la zona de la excavacin, y el 77% de los individuos estaban sintomticos (Werner, 1972). En EE.UU., los hongos se concentran en el suroeste. Se ha llamado fiebre del valle o liebre del valle de San Joaqun. La incidencia de la coccidioidomicosis ha aumentado considerablemente en California durante el comienzo de los 90 (Pappagians. 1994). Una de las posibles explicaciones de este aumento es la sequa prolongada seguida de periodos de lluvia, la construccin de nuevos edificios y el aumento del nmero de individuos susceptibles a esta infeccin (Pappagians. 1994) Sin embargo, los pacientes con coccidioidomicosis pueden encontrase por todo el pas, por la frecuencia de viaje y la alta mfectividad de la artrocomdia para los individuos que entran en reas endmicas (Pappagians, 1993). Se han descrito casos en los que la infeccin se ha originado por material importado del suroeste de EE.UU. En una ocasin recuperamos el C. immitis de un perro que haba nacido en Arizona y despus se haba llevado a Vermont La inleccin de laboratorio es un riesgo serio, y este patgeno debera tratarse con gran respeto. Se han descrito ejemplos ocasionales en los que el desarrollo de la lase moho in vitro ha producido despus infeccin.

Identificacin de laboratorio y otras investigaciones

La demostracin directa de las clulas de levadura puede llevarse a cabo en secciones de tejido o preparaciones en fresco o fluidos aspirados y muestras de tejidos (Fig. 54-23). La tincin con calcoflor blanco aumenta la deteccin de levaduras. El crecimiento es algo ms rpido que el del Hlstoptasma, de aspecto desde blanco velloso a colonias de color que con frecuencia no pueden distinguirse de H. capsulatum. y por lo general aparecen dentro de la primera o segunda semana. Las microconidias se parecen a las del H. capsulatum (Fig. 54-24), pero no se forman macroconidias. Un hongo saproftico, Chrysosporium, se parece al Blastomyces, pero no desarrolla una fase levadura y no crece en un medio que contenga cicloheximida. La conversin a la fase de levadura puede producirse en un medio ordinario incubado a 37 C, pero para este propsito se han utilizado especficamente agar de sangre glucosa cisleina o agar de semilla de algodn. Una vez ms. demostrar la forma levadura en los tejidos sirve como un sustituto razonable para la demostracin del dimorfismo en el laboratorio. El test del exoantgeno y la hibridacin de cidos nucleicos, son los mtodos preferidos para confirmar los aislamientos en muchos laboratorios.
n

El test de fijacin del complemento es el test serolgico ms comnmente utilizado para el diagnstico de blastomicosis. Como se ha mencionado con la histoplasmosis, este test tiene limitaciones considerables y slo debera usarse adjunto al cultivo de hongos.

Coccidioides

immitis

Factores de riesgo
Residir en una zona endmica es el principal factor de riesgo para desarrollar la infeccin, porque la artroconidia de la fase moho se disemina fcilmente por el aire (Ampel. 1989: Pappagianis. 1993: Stevens. 1995). Un

Figura 54-24. Conidias caractersticas en una conidiofora de Blastomyces dermatitidis (lactofenol algodn azul).

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Hay sugerencias de que los factores genticos influyen en la frecuencia de la diseminacin y de la gravedad de la infeccin, pero la naturaleza de la asociacin no se conoce completamente. La infeccin diseminada es ms comn en individuos filipinos y de raza negra que en los de raza blanca. Los asiticos, americanos nativos y mexicanos pueden tener tambin mayor riesgo. Las mujeres adultas desarrollan un eritema nodoso ms comnmente que los hombres, en respuesta a una infeccin primaria de Cocadioides, pero la infeccin diseminada se produce con ms frecuencia en hombres adultos que en mujeres. La infeccin inmunosupresiva o la enfermedad es un factor de riesgo importante para la infeccin diseminada. Los pacientes infectados con VIH tienen un riesgo particular para infeccin diseminada (Bronnimann, 1987: Fish, 1990; Galgani, 1990).

Enfermedad clnica
La coccidioidomicosis primaria es con frecuencia asintomlica, como se indica por la alta prevalencia de resultados positivos de los test cutneos para los antgenos fngicos en zonas endmicas. La enfermedad sintomtica, por lo general, se manifiesta como fiebre con tos o dolor torcico, o ambos, y podra imitar clnicamente a una neumona bacteriana (Lpez, 1993). El eritema nodoso y el eritema multiforme, que pueden acompaar a la infeccin primaria, son signos de buen pronstico. Los nodulos pulmonares solitarios pueden persistir como consecuencia de la infeccin pulmonar primaria. La infeccin diseminada afecta ms frecuentemente a la piel, al sistema esqueltico y a las meninges. Las lesiones cutneas incluyen ppulas, lceras, senos drenantes y abscesos subcutneos. La artritis, por lo general, resulta del compromiso de huesos adyacentes. La meningitis puede ser aguda, pera es ms comn que sea lenta y crnica.

Figura 54-26. Las colonias blancas y vellosas lijadas con tormalina del Coccidioides immitis pueden tener reas de coloracin gris (agar Sabouraud con cicloheximida incubada a 30C).

Patologa de la coccidioidomicosis
La respuesta del tejido a C. mmitis es granulomatosa, con o sin caseificacin. Las esfrulas desarrolladas es tpico encontrarlas en macrfagos y clulas gigantes multinucleadas. Las endoesporas dentro de las esfrulas miden de 2 pm a 5 um. Las esfrulas miden de 10 pm a 80 um, y las esfrulas desarrolladas tienen un gran rango de tallas. El diagnstico diferencial de las esfrulas desarrolladas primariamente incluye formas no gemadas de B. dermatitidis o C. neolormans. Las esfrulas deben diferenciarse de las formas fngcas en adiaspromicosis y rinosporidiosis; ambas son infecciones muy poco comunes en EE.UU.

o. ms comnmente, en lavados broncoalveolares (Fig. 54-25), pero la sensibilidad de los mtodos citolgicos es slo aproximadamente del 50% (DiTomasso, 1994). Se utilizan las preparaciones frescas y el tinte calcoflor blanco. La digestin con 10%-30% de KOH puede ser necesaria para eliminar elementos que sobran de tejido. Si est presente la enfermedad cavitaria, las hifas pueden estar presentes en las muestras clnicas. Al contrario que otros patgenos dimrficos, existe la posibilidad de comunicacin de la artroconidia directamente de la muestra. C. immitis crece relativamente rpido (en menos de una semana) y puede incluso aparecer en las placas agar sangre en el laboratorio bacteriolgico. La infeccin de los trabajadores del laboratorio es la preocupacin principal, por eso los cultivos inoculados deben manejarse con gran cuidado en una cabina de seguridad de flujo laminar. Las sugerencias del manejo de estas muestras se explic antes. Todo el trabajo debe llevarse a cabo en una cabina de seguridad biolgica de flujo laminar. Si se han inoculado placas de Petri, deben taparse con cuidado para evitar que la tapadera se salga accidentalmente. Las colonias de C. immitis son extremadamente variables en la apariencia, variando desde aterciopeladas o algodonosas a granulosas o polvo (Fig. 54-26). La morfologa de la colonia puede cambiar segn la colonia y el desarrollo de la artroconidia. La mayora de los aislamientos son blancos, pero puede observarse una gran variedad de colores, y puede producirse un pigmento difuso por algunas cadenas. Los cultivos con frecuencia se convierten en ms grises con el tiempo. En particular, debe considerarse la posibilidad de que este riesgo biolgico pudiera haber sido aislado, cuando en un medio que contenga clicloheximida encontremos un hongo de rpido crecimiento. Si se sospecha C. immitis, algunos miclogos prefieren esterilizar el cultivo antes de examinar las colonias, llevando el contenedor con formalina al 10%, seguido por una incubacin durante toda la noche. Las artroconidias en forma de barril con clulas de unin vacas son distintivas (Fig. 54-8). pero deben diferenciarse de otros organismos que producen artroconidias, como Trichosporon (vase Fig. 54-19), Geotrichum y algunos miembros de la familia Gymnoascaceae, por el test del exoanlgeno o por la hibridacin de cidos nucleicos, Al contrario que la histoplasmosis y la blastomicosis. el anlisis serolgico con el test de fijacin del complemento es til para valorar la extensin y el pronstico de la coccidioidomicosis (Pappagianis, 1990). Se han utilizado varias tcnicas serolgicas, de las cuales se ha estudiado de un modo ms extenso la lijacin del complemento. Los anticuerpos se detectan aproximadamente en 2 a 6 semanas despus de la infeccin. La cuantificacin de ttulo es indicador de la enfermedad diseminada y un ttulo creciente es poco esperanzados al contrario que la situacin normal, en la que la aparicin de anticuerpos refleja el control de la infeccin. El test de piel no confunde el diagnstico por producir una seroconversin, como en la histoplasmosis, pero

Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones

Como con otros hongos dimrficos, la posibilidad de esta infeccin debe seguirse hasta el final. Las esfrulas pueden demostrarse en los esputos

Figura 54-25. Dos esfrulas de Coccidioides immilis en la m u e s t r a de e s p u t o Preparacin sin teir (fotografa cortesa de Centers for Disease Control and Prevention)

CAPTULO 54

ENFERMEDADES MICTICAS

81

la alta prevalencia de una positividad del test cutneo disminuye la utilidad del test. Los pacientes con enfermedad diseminada pueden mostrar anergia al antigeno del test cutneo.

Sporothrix

schenckii

Factores de riesgo
S. schenckii se encuentra normalmente en la vegetacin alrededor de todo el mundo, aunque no parece que sea un patgeno de plantas. Las epidemias se han causado por una exposicin a productos de plantas, como el musgo sphagnum utilizado en jardinera (D'Alessio, 1965; Grotte, 1981). Los patgenos lngicos de plantas y ambientales en ocasiones cruzan los caminos. Asi como H. capsulatum estuvo implicado en el da de la limpieza de tierra, el S. schenckii caus infecciones en el da de la celebracin de Arbor (Cote. 1988). Hubo una epidemia inusual entre miembros de un colegio de fraternidad en Florida, que estaban haciendo un muro con ladrillos empaquetados en paja contaminada mientras beban gran cantidad de cerveza (Sanders, 1971). El nico factor predisponente que se ha identificado con frecuencia es el consumo de alcohol. Tambin se ha informado de la transmisin del S. schenckii de gatos infectados a humanos (Reed, 1993). Se ha observado infeccin diseminada en pacientes inmunodeprimidos (Lynch. 1970). La puerta de entrada por lo general es una entrada traumtica por la que los hongos pasan a travs de la piel, como ocurri con los estudiantes, que tenian las manos daadas por coger ladrillos contaminados. El estereotipo de paciente con riesgo de esporotncosis es un jardinero de rosas alcohlico.

conidias de pared ancha, oscuras, que son las responsables del color oscuro que vemos macroscpicamente, que estn sujetas directamente a las hifas (Sutton, 1998). Las microconidias de pared fina nacen de las conidioforas que crecen de los ngulos rectos de las hifas; pueden organizarse alrededor de una vescula expandida en la punta de la conidiofora formando una estructura que ha sido denominada racimo (Fig. 54-27). Las especies de Acremonium producen estructuras similares, que raramente se han descrito como una causa de enfermedad humana, y tambin son producidas por un saprofito que rara vez es aislado. Ophiosloma stenoceras. Estos mohos se diferencian del Sporothrix por la ausencia de crecimiento en un medio agar con cicloheximida y por la ausencia de fase levadura. La conversion de la fase moho a levadura se finaliza por la incubacin del aislamiento a 37 en un medio rico, como el agar de infusin cerebro-corazn o el agar sangre glucosa cistena. Los test cutneos y ensayos serolgicos para el diagnstico de la esporotricosis han sido descritos pero an no estn disponibles.

Otros hongos dimrficos

El H. capsulatum variante duboissi causa enfermedades cutneas y sistmicas en frica. Las levaduras son ms grandes que las del H. capsulatum variante capsulatum. y las paredes son ms gruesas, recordando a las clulas del B. dermatitidis. pero sin los bordes de base ancha. El Paracoccidioide brasiliensis produce infecciones cutneas, diseminadas y pulmonares en Amrica Central y del Sur (Londero. 1972: Restrepo, 1970). Hay pocos casos importados de paracoccdioidomicosis, que se producen ocasionalmente en EE.UU. (Murray, 1974). Las clulas levaduriformes caractersticas del Paracoccidioides tienen mltiples brotes perifricos, dando una apariencia que se ha comparado con una rueda marina. La infeccin por P. mametlei se caracteriza por clulas intracelulares parecidas a las levaduras que recuerdan al H capsulatum en macrfagos. Esta infeccin es endmica en el sureste asitico, pero se han descrito casos importados en pacientes inmunocomprometidos que regresaron a EE.UU.

Enfermedad clnica
La lorma clnica que sin duda predomina de esporotricosis es la cutnea o linfocutnea. Una ppula en la puerta de entrada puede ulcerarse. La rapidez del patgeno a travs de los linfticos regionales puede terminar en una serie de lesiones que avanzan en el miembro afectado. La esporotricosis sistmica. que no es comn, podra ser por la inhalacin de esporas en el tracto respiratorio bajo (Pluss, 1986). El sistema esqueltico, que incluye huesos (Lynch. 1970) y articulaciones (Crout. 1977), es el ms afectado.

DERMATOFITOS
Los hongos dermatofitos son causas comunes e importantes de morbilidad humana, pero no producen infecciones que pongan en peligro la vida (Hay. 1992; Midgley, 1994; Odom. 1994: Weitzman, 1995). Se reconocen tres gneros: Microsporum. Trichophyton y Epidermophyton. Las especies de Acremonium, especies de Fusarium. Scytalidium spp. y las especies de Scopulanopsis en ocasiones han estado implicadas en enfermedades de las uas (onicomicosis). Los hechos ocasionales de un papel etiolgico para otros hon-

Patogenia de la esporotricosis
Las respuestas histolgicas al Sporothrix y Blastomyces son similares (Lurie. 1963). La inflamacin granulomatosa puede acompaarse de pequeas colecciones de neutrfilos polimorfonucleares. En la piel, es comn la hiperplasia seudoepiteliomatosa. Las clulas levaduras del S. schenckii son pleomrficas. redondas o alargadas, y se han comparado con cigarros, pero rara vez se ven en el tejido. Una reaccin del tejido al hongo puede terminar en radiar material eosinfilo de un grosor mayor de 10 pm alrededor de la clula levadura; este fenmeno se conoce como Esplendor Hoepph. Desafortunadamente, esta reaccin tan distintiva del tejido no puede verse y no es especfica para la esporotricosis. El diagnstico diferencial de las lesiones culneas es, en primer lugar, una infeccin micobacteriana, especialmente Mycobacterium marinum (granuloma de las piscinas), en EE.UU., y una leishmaniosis cutnea en los trpicos.

Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones

L a muestra preferida es una aspiracin, un curetaje o una biopsia de la lesin cutnea. S. schenckii crece bien en un medio de aislamiento primario incubado a 25C-30 C. Es resistente a la cicloheximida. Las colonias, que pueden ser lisas o hmedas (glabrosas), al principio son por lo general de color banco (Lmina 54-8), y pueden volverse ms oscuras con el tiempo. El S. schenckii. produce dos tipos de conidias: conidias hialinas de pared lina, que se organizan como una roseta alrededor del pex de la conidiofora. y las

Figura 54-27. Las conidias de Sporothnx schenckii nacen en grupos en los extrem o s de las conidioforas laterales (lactofenol anilina azul).

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

gos saprofticos son difciles de evaluar por la existencia comn de estos mohos como colonizantes o contaminantes de la flora. Como un grupo, los hongos dermatofitos se distribuyen alrededor del mundo, pero las especies individuales pueden tener una distribucin geogrfica ms restringida (Aly, 1994). Los dermatofitos pueden encontrarse asociados con humanos (antropoflicos), con animales (zooflicos) o con tierra (geofilicos). Los factores de riesgo incluyen el contacto con la fuente de infeccin, que nos puede dar una pista para el diagnstico. Por ejemplo, la infeccin de la cara en granjeros que se apoyan en las vacas mientras las ordean es caractersticamente causada por el T. verrucosum. un dermatofito zooflico que se encuentra en el ganado. La importancia de la variacin geogrfica en los patgenos dermatofticos se ilustra en un estudio de una epidemia de infeccin cutneo fngica entre tropas americanas durante la guerra de Vietnam (Alien. 1973). La mayora de las infecciones fueron causadas por una variante con gran esporulacin del T. mentagrophytes, que no se haba reconocido en EE.UU. Las tropas americanas tuvieron mucho mayor nesgo de infeccin que los vietnamitas. Epidemiolgicamente, las foliculitis y lesiones anulares se asociaban con el tiempo de servicio en Vietnam y el tiempo pasado en una patrulla. La infeccin se produca de modo predominante en la estacin de lluvias, y la nica fuente que no fuera humana de los hongos eran las ratas. Las asociaciones medioambientales de los hongos dermatofticos aislados con mayor frecuencia se resumen en la Tabla 54-12.

las lesiones. La terminologa clnica utiliza el nombre latino linea seguido de la parte del cuerpo afectada, como linea capitis (cabello), linea barbae (barba), linea corporis (tronco y miembros), linea pedis (pie de atleta) o linea cruris (Inguinal). En ocasiones excepcionales, el Epidermophyton floccosum infecta slo la piel. Microsporum spp. y Trichophyton spp. afectan al cabello, as como a la piel fina. El Trichophyton spp. produce infeccin de las uas (onicomicosis), as como del cabello y la piel. I tonsurans es la causa ms comn de infeccin del pelo en EE. UU. M. canis es una causa comn de infeccin del cuero cabelludo, sobre todo en nios. Cuando hay una infeccin profunda del folculo del pelo, se produce un proceso inflamatorio llamado querin. El T. mentagrophytes y el T. verrucosum se asocian particularmente con querin. T. mentagrophytes, T. rubrum y M. canis se encuentran normalmente en la linea corporis y linea pedis. Las lesiones producidas por T. rubrum por lo general son crnicas e intratables. El E. floccosum es una causa comn de linea cruns y tinea peds. Las enfermedades dermatofiticas se limitan a la epidermis. Slo raras veces hay una invasin ms profunda por los mohos. La diseminacin de la infeccin es poco corriente y, por lo general, se produce cuando la inmunosupresin es grave (Porro, 1997).

Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones

El tratamiento de las infecciones dermatofiticas no se dirige por la identificacin especfica del aislamiento, por eso la demostracin de hfas en los raspados de piel es importante para el inicio del tratamiento (Fig. 54-28), La talla y morfologa de las hitas sugiere la inclusin de los dermatofitos en la infeccin. La confirmacin de la identificacin especfica generalmente no es necesaria, pero es til para confirmar que las hitas, en realidad, pertenecen a los hongos dermatofticos, para valorar la fuente probable de infeccin y

Enfermedad clnica
Los dermatofitos producen infeccin de la epidermis, del pelo y de las uas (Hay. 1992). La infeccin de la dermis y tejido subcutneo se produce rara vez. La infeccin del pelo y la piel por lo general se refieren como una imagen en lombriz anular, un nombre derivado del avance serpginoso de

Tabla 54-12

Caractersticas de los m o h o s dermatofticos Ecologa Antropollico Zooflico Tasa de crecimiento Lento Moderado (6-10 das) Estructuras d i a g n s t i c a s Raramente observadas Rugosa o espinosa, de pared gruesa, macroconidias de contorno espinoso: 2-14 septos; microconidias con forma de porra Suave o finamente rugosa, macroconidias de pared gruesa. 4-6 septos, microconidias con forma de porra Microconidias tpicamente redondas y agrupadas en ramas de conidioforas (racimos de uvas): puede tener forma de lgrima: macroconidias de pared fina y lorma de cigarrillo Microconidias con lorma de lgrima ("pjaros en una verja"). Puede formarse en macroconidias; macroconidias ms largas y estrechas que las del Trichophyton mentagrophytes Microconidias pequeas y delicadas; ocasionales macroconidias finas (en cola de rata) Microconidias con forma de lgrima o de porra con un tamao muy variable, raras macroconidias Macroconidias caracteristicas. no microconidias Test auxiliares Lmpara de Wood del pelo Lmpara de Wood del pelo: pigmento brillante amarillo limn Z o n a s ms frecuentes Cuero cabelludo Cuero cabelludo, piel

Dermatofito Microsporum audouinii Microsporum canis

Microsporum gypseum

Geofilico

Moderado

Colonia en estallido de estrella; color desde marrn a canela

Cuero cabelludo, piel

Trichophyton mentagrophytes

Zooflico, antropofilico

Moderado

Penetracin del pelo positivo; ureasa positiva; a veces puede producir pigmento rojo

Piel, cuero cabelludo, barba

Trichophyton rubrum

Antropofilico

Lento (hasta 1 4 das)

Trichophyton verrucosum

Zooflico

Lento

Trichophyton tonsurans

Antropofilico

Lento

Pigmento rojo intenso que puede ser incrementado en medios especiales, como el agar patata; ureasa negativa; penetracin del pelo negativa Cadenas de conidias a 37C; mejor crecimiento en agar T3 o en agar T3 yT4 Mejor crecimiento en agar T3 y T4

Piel, uas

Barba, cuero cabelludo, piel

Cuero cabelludo, piel

Epidermophyton floccosum

Antropofilico

Moderado

Ninguno

Pie

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ENFERMEDADES MICTICAS

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macroconidias, que diagnsticamente no son tiles. M. audouinii, un agente antropolilico clsico de forma anular, produce pocas, o ninguna, estructuras diagnsticas. Afortunadamente, en la actualidad no se aisla con frecuencia, quiz porque hay mayor higiene. Las caractersticas de las estructuras diagnsticas producidas por los patgenos ms comunes se resumen en la Tabla 54-12. M. canis. las especies que con mas frecuencia se aislan, produce un pigmento amarillo limn caracterstico (Lamina 54-9) que se intensifica por el crecimiento en agar copos de patata. Las macroconidias de estas especies se muestran en la Figura 54-29. Las macroconidias del M. gypseum. las especies geoflicas mas comnmente aisladas, se muestran en la Figura 54-30.

Especies de Trichophyton
El gnero Trichophyton incluye los hongos dermatofticos importantes: 7! tonsurans (Fig. 54-10 y Lmina 54-10). T. rubrum (Lmina 54-11), T. verrucosum y I mentagrophytes (Lmina 54-12 y Fig. 54-31). Las colonias pueden tener apariencia de pelusa, granular o, menos comnmente glabrosa. Las macroconidias, que son extremadamente tiles para la identificacin, pueden ser producidas por este gnero, en especial en cadenas que producen colonias en polvo, pero desafortunadamente suelen estar ausentes. Las microconidias se forman con ms frecuencia. Las microconidias tiene pared fina, lisa, y tienen un nmero variable de septos. La apariencia clsica de las estructuras diagnsticas en las especies que se aislan ms comnmente se resumen en la Tabla 54-12. En el mundo real, la interpretacin de la morfologa microscpica en algunos aislamientos puede ser muy difcil, porque con frecuencia se forma un solapamiento. Afortunadamente, los test adicionales son tiles para hacer diferenciaciones especificas dentro del gnero (Tabla 54-12). En particular, los agares Trichophyton son tiles para la caracterizacin de los requerimientos nutricionales entre los miembros del gnero (Fig. 54-32). Se han descrito siete medios, de los cuales hemos encontrado los cuatro primeros medios a base de cido casamino como los ms tiles. En combinacin, estos medios permiten la valoracin de la dependencia en inositol, liamina o ambos componentes juntos. La diferenciacin de T. mentagrophytes y 7! rubrum se facilita por varios test no morfolgicos (Tabla 54-12). Un pigmento difusible puede ser producido por ambas especies, pero el pigmento rojo intenso del T. rubrum se fomenta por el cultivo en agar copos de patata o agar crnea con dextrosa al 1%. La produccin de ureasa dentro de los tres o cinco das por T. mentagrophytes. pero no por T. rubrum, ayuda a diterenciar estas dos especies. Por ultimo el test de penetracin del pelo puede utilizarse como un test diferencial. T. mentagrophytes produce defectos en forma de cua en los pelos in vitro (Fig. 54-33), mientras tanto T. rubrum crece fuera del pelo sin pene-

Figura 54-28. Las hifas de un dermatolilo se demuestran en un raspado de u n a lesin d e lia. L a presencia d e estas hifas finamente segmentadas establece el diagnostico de dermatomicosis. aunque no define la especie etiolgica (preparacin con KOH). (Fotografa cortesa de Centers for Disease Control and Prevention.)

para valorar el incremento de parecido para infecciones crnicas y recadas cuando aislamos T. rubrum. Los raspados de piel, uas y pelos pueden examinarse en preparaciones de KOH, que puede incorporar calcoflor blanco para facilitar la deteccin de hifas. Los fragmentos de tejidos, fibras y los cristales de colesterol pueden ser confundidos con hifas por un observador inexperto. Los pelos infectados deben seleccionarse para analizarlos. Cuando el hongo que infecta es H. audouinii. M. canls o M. ferrugineum. el pelo floresce con una luz ultravioleta de longitud de onda larga (lmpara de Wood). M. canis es el nico miembro de este trio de patgenos que se aisla normalmente en EE.UU. El examen microscpico de la relacin de los hongos con el pelo infectado puede usarse para estrechar el diagnstico diferencial del agente etiolgico: esporas en el exterior del pelo (entothrix), esporas dentro del pelo (ecdolhrix), hifas sin esporas dentro del pelo, o que no haya invasin del pelo. El anlisis de los pelos infectados requiere una experiencia considerable y una prctica regular. Los pelos infectados, raspados de uas o raspados de los bordes de las lesiones cutneas deben llevarse al laboratorio en un recipiente limpio y seco o ser colocados en la superficie de un medio de aislamiento primario suministrado por el laboratorio. Se ha sugerido picar los recortes de uas en un homogeneizador como un aumento de las levaduras de los dermatolilos. El agar de dexlrosa Sabouraud (ue elegido para recuperar los hongos dermatofticos, y tambin es efectivo para aislar Candida spp., especialmente C. albicans, la cual puede producir infecciones similares de la piel y uas. La cicloheximida no inhibe los dermatofitos, pero si inhibe muchos hongos saprofticos. El medio del test dermatofito, que produce un pigmento rojo en la alcalinizacin, es utilizado normalmente por los dermatlogos para demostrar la presencia de un dermatofito, que por lo general no se estudia ms. Desafortunadamente, el medio del test de dermatofitos no es especfico para dermatofitos. Otros organismos, incluido H. capsulatum, pueden alcalinizar este medio, y no es el medio de aislamiento preferido por los laboratorios clnicos. Todos los hongos dermatofticos tienen septos, hifas hialinas. Producen macro y microconidas de vanas combinaciones. Tambin pueden producirse artroconidias y clamidiosporas. pero la morfologa de las macroconidias y especialmente, la de las microconidias es ms importante para la identificacin. Se ha identificado el estado sexual de muchos dermatofitos, pero no se han encontrado en el laboratorio clnico.

Especies de

Microsporum

Las especies de Microsporum producen macroconidias caractersticas. Figura 54-29. Macroconidias de pared gruesa, rugosas y afiladas d e Microsporum que son las estructuras diagnsticas clave. En algunos casos se producen canis e hifas finas segmentadas (lactofenol anilina azul).

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Figura 54-30. Macroconidias lisas de pared gruesa del Microsporum gypseum (laclolenol algodn azul).

Figura 54-32. Agares de Trichophyton. El crecimiento del Trichophyton verrucosum se a u m e n t a b a en agar T (contiene t i a m m a e inositol) en comparacin con los agaresT. yT,
s

trar en l. El uso de ambos acercamientos, morfolgico y no morfolgico, proporciona la identificacin ms exacta de los aislamientos suficientes para proporcionar experiencia continua con las caractersticas diagnsticas de estos mohos.

Epidermophyton

floccosum

colonias, que en principio son marrones amarillentas, grises o marrn caqui, a medida que maduran se vuelven aterciopeladas y se pliegan. E. lloccosum no produce microconidias. pero unas macroconidias distintivas proporcionan las pistas para la identificacin (Fig. 54-11). Estas estructuras tienen paredes externas lisas, ms de cuatro paredes cruzadas y forma de palo.

El nico patgeno dentro del gnero Epidermophyton es un hongo antropofilico. que es una causa importante de Tinea cruris y linea pedis. Las

MOHOS DEMATIACENOS
Los mohos dematiacenos son un grupo fascinante y complejo de hongos que producen enfermedad debilitante de la piel y del tejido subcutneo y pueden invadir profundamente. Las infecciones se encuentran ms comnmente en los trpicos y subtrpicos, aunque la infeccin diseminada puede raramente encontrarse en EE.UU.. especialmente entre pacientes gravemente inmunocomprometidos. La clasificacin de estos mohos ha registrado cambios segn se ha ido refinando el entendimiento de la conidiognesis (Larone, 1989). Se muestra un resumen breve de las formas clnicas de enfermedad producidas por especies patognicas, pero la descripcin detallada de la micologa est ms all del propsito de este captulo. La mor-

Medio

Constituyentes Medio basal Inositol Inositol + liamina

Interpretacin del Crecimiento estimulado Agar con el que se comparan otras formulaciones Estimulado con mositol solo Estimulado solo cuando estn presentes los dos compuestos Estimulado con tiamina sola

T1 T2 T3

T4

Tiamina

Figura 54-31. Gaipos d e microconidias y macroconidias d e pared fina de 7richophyton mentagrophytes (laclofenol algodn azul) (Fotografas cortesa de Centers lor Disease Control and Prevention.)

Figura 54-33. Penetracin del pelo por Trichophyton mentagrophytes El pelo e s penetrado por las hilas por los lados (Fotografia cortesia de Centers for Disease Control and Prevention)

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ENFERMEDADES MICTICAS

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en la que las hilas pueden estar dentro de los senos o. menos comnmente, extenderse a travs de las paredes oseas para invadir el tejido adyacente. Entre las especies que producen esta infeccin, se encuentran S/polaris spp., Curvularia spp. y Alternara spp. Los hongos dematiacenos son causas raras de queratomicosis. La caracterstica diagnstica de la feohilomicosis. es una pigmentacin marrn de la melanina de las hifas. El color generalmente puede percibirse en trozos sin teir. Las cadenas poco pigmentadas pueden reconocerse al aplicar un tinte para la melanina. como la tcnica Fontana-Masson.

CIGOMICETOS
Los cigomicetos son causas importantes de infecciones fungicas en huspedes comprometidos (Williams, 1976). El patgeno ms comn es el Rhizopus. Otros mohos que han estado implicados en la enfermedad humana son Absidia. Rhizomucor, Mucor y Cunnmghamella (Bergman. 1969). La enfermedad invasiva causada por estos hongos se ha llamado histricamente mucormicosis. En vista de que las especies Mucor son causas poco comunes de infecciones, un trmino clnico mejor, es cigomicosis.

Figura 54-34. Cadenas de conidias producidas por especies de Cladosporium, un g e r m e n aislado en el medio ambiente de los laboratorios clnicos. Las hilas son septadas Tanlo las hitas c o m o las conidias estn pigmentadas d e color oscuro (lactolenol anilina azul).

Factores de riesgo y enfermedad clnica

fologia de las especies de Cladosporium. mohos saprofticos comunes que frecuentemente encontramos en laboratorios clnicos, se muestra en la Lmina 54-2 y en la Figura 54-34. El crecimiento lento y el crecimiento en presencia de cicloheximida. el aislamiento del tejido y los hallazgos histolgicos compatibles y/o historias clnicas son pistas que pueden encontrarse en las especies patgenas. Es importante comentar con los mdicos las caractersticas clnicas del caso antes de catalogar estos mohos como insignificantes. Hay dos presentaciones clnicas comunes de la cigomcosis. y los factores de riesgo son algo diferentes entre ambas (Straatsma. 1962). Una infeccin invasiva que empieza en los senos paranasales se conoce como cigomcosis rinocerebral o craneofacial. La infeccin comienza como una sinusitis indiferenciada. pero las hifas rpidamente atraviesan las paredes finas del seno y se extienden por la rbita, avanzando hasta la piel de la cara e introducindose en la cavidad craneal. El factor de riesgo para este tipo de infeccin es predominantemente la diabetes mellitus, y la mayora de los pacientes presentan cetoacidosis en el momento en que la infeccin se desarrolla (McNulty, 1982). La enfermedad rinocerebral puede avanzar rpidamente y. por lo general, suele terminar en la muerte. Puede producirse una trombosis de la arteria cartida o del seno cavernoso. La segunda presentacin principal de la cigomcosis es la enfermedad pulmonar, que puede seguirse de una diseminacin hematgena. La infeccin comienza con una neumona no diferenciada que puede complicarse con hemoptisis y cavitacin. La diseminacin de la infeccin es comn y el

Enfermedad clnica
El Micetoma es una infeccin crnica indolente de la piel y del tejido blando que se desarrolla en el lugar de la inoculacin de una variedad de hongos o bacterias. La infeccin puede extenderse profundamente, incluso llegar al hueso, y por lo general se desarrollan senos drenantes. La infeccin la encontramos ms frecuentemente en los trpicos y subtrpicos, pero pueden encontrarse en el sur de EE.UU. Madurella mycetomatis es el patgeno demataceno ms comn. Hay lesiones parecidas que pueden producirse por otros hongos (p. ej., Acremonium. Pseudallescheria boydti. Fusanum). por actinomicetos aerbicos (Nocardia. Slreptomyces. Actinomadura) y ocasionalmente por bacterias (botriomicosis). La cromoblastomicosis es una infeccin crnica, de avance lento, de la piel y del tejido subcutneo que se produce principalmente en pacientes que viven en los trpicos. Se producen algunos casos aislados ocasionalmente en el sur de EE. UU. Las lesiones pueden ser nicas o mltiples, y pueden parecerse a las lesiones cutneas de blaslomicoss. La caracterstica que la distingue es la presencia de clulas redondas, no htales y marrones (cuerpos muriformes) en los tejidos (Fig. 54-35). Estas estructuras, que se dividen por seplacin, son diagnsticas, aunque no proporcionan una pista para identificar el moho. Los agentes etiolgicos de la cromoblastomicosis son Phialophora verrucosa. Fonsecaea pedrosoi, Fonsecaea compacta. Rhinocladiella aquaspersa. Cladosporium carnonii. E. jeanselmei y E spinilera. Feohilomicosis es un trmino utilizado para describir la infeccin del tejido cutneo y subcutneo, y de los rganos sistmicos, particularmente el sistema nervioso central. Estas infecciones oscilan entre lesiones subcutneas indolentes, probablemente como resultado de la inoculacin directa de hongos de la zona, y una infeccin devastadora y destructiva que casi siempre es mortal. Los aislamientos ms frecuentes han sido E. jeanselmei. E. dermalitidis. Cladosporium bantianum (trichoides). especies de Fonsecaea y especies de Bipolaris. Una entidad clnica distintiva es la sinusitis crnica.

Figura 54-35. Cuerpos muriformes de un hongo demataceno en una lesin de cromoblastomicosis. L a s clulas oscuramente pigmentadas estn s u t n e n d o seplacin. En la lesin estn presentes macrfagos y clulas gigantes m u l t m u c l e a d a s (tincin hematoxilina-eosma).

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

desenlace casi siempre latal. Los factores de riesgo para la infeccin pulmonar son neutropena e inmunosupresin. particularmente por malignidad hematolgica (Meyer. 1972). Otros factores de riesgo que se han observado son una sobrecarga de hierro, abuso de drogas intravenosas y uremia (Kwon-Chung, 1992). La diabetes con cetoacidosis est presente en algunos pacientes. Una presentacin menos comn de la cigomicosis es la infeccin de la piel y de los tejidos blandos (Meyer, 1973a). Las hifas pueden alcanzar la piel por va hematgena, por una extensin directa de un foco profundo o por introduccin del exterior. Un comienzo drstico de enfermedad del tejido blando se produjo en pacientes que estaban contaminados con esporas Rhizopus (Gartenberg, 1978). Antes de que se hiciera el potencial de infeccin, los fabricantes no siguieron los pasos para la esterilidad de los vendajes. Las heridas por arma blanca y otro tipo de heridas traumticas tambin son zonas de entrada de estos hongos comunes en el ambiente (Cocanour. 1992). La enfermedad pulmonar limitada con cavitacin es una presentacin poco usual de la cigomicosis en individuos inmunolgicamente competentes (Record, 1976). Figura 54-36. Una c o l o m a gris vellosa de Rhizopus llena el espacio de la placa de Petri (lid lifters) (fotografia cortesia de Centers for Disease Control and Prevention).

Patologa de la infeccin por cigomicetos

La histopatologia est dominada por la necrosis del tejido, sin reparar en la zona de infeccin (Straatsma. 1962). La propensin de estos mohos para invadir a travs de las paredes de las arterias y venas, produciendo trombosis agudas, conducen a necrosis coagulativa extensa. Las hifas aparecen como cintas de hifas anchas que por lo general estn torcidas y plegadas (Fig. 54-3). Los septos estn esparcidos y por lo general no se observan en el tejido, pero un londo compuesto de las paredes exteriores de las hifas plegadas puede confundirse con septos. Los segmentos hinchados de las hifas y las hifas cortadas en perpendicular pueden ser malinterpretadas por clulas levaduriformes. Las ramificaciones tienen tendencia a producirse en ngulos rectos. Las hitas de estos mohos con frecuencia se tien mejor con hematoxilina-eosina que con la tcnica de cido peridico de Schiff o incluso el mtodo de plata metenamina.

ovales o romboidales y pueden tener un pigmento marrn (Fig. 54-5). Una caracterstica diagnostica importante es la presencia de estructuras hialinas parecidas de raiz marrn (rizoides), que se desarrollan en el punto donde crecen las esporangiosporas (Fig. 54-5). Se ha inlormado de que el 60% de los casos de cigomicosis y el 90% de los casos de enfermedad rinocerebral son causadas por el Rhizopus arrhizus (citado en KnownChung, 1992)

Otros cigomicetos
A diferencia de Rhizopus. los rizoides de las especies de Absidia surgen de los estolones de las conidioforas. Las esporangiosporas de Absidia tienen forma de pera ms que redondas, y se ve un collarete alrededor de la columela cuando los esporangios se desintegran. Las especies Mucor no producen rizoides. Las conidioforas generalmente estn ms ramificadas que otros cigomicetos, y no hay crecimiento por encima de 37 C. El Rhizomucor. que es morfolgicamente intermedio entre Rhizopus y Mucor. tiene rizoides rudimentarios y conidioforas ramificadas, y crece a temperaturas de hasta 58 C. Uno de los patgenos principales en el gnero Mucor (Mucor pusillus) se ha translerido al gnero Rhizomucor. Cunninghamella produce vesculas hinchadas en la punta de las conidioforas. Desde las vesculas, mltiples esporangiolas unicelulares crecen en tallos pequeos.

Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones

Los cigomicetos con frecuencia estn considerados como contaminantes comunes (Kwon-Chung. 1992). Las implicaciones clnicas potenciales de los aislamientos deberan investigarse cuidadosamente antes de que sean tachadas de saprofitos. La demostracin de hifas en el tejido nos proporciona una evidencia importante de que un moho aislado estuvo presente in vivo y no es un contaminante medioambiental. Las hifas anchas y con septos esparcidos pueden demostrarse en trozos de tejidos o en extensiones impresas de tejido usando el tinte de calcoflor blanco. El tejido debe ser corlado, mejor que sea homogeneizado. despus de lo que se inyecta en la superficie de un aislamiento agar primario. Los cigomicetos se inhiben por la cicloheximida. Los aislamientos crecen rpido y producen abundantes hifas areas que rpidamente alcanzan la tapg de las placas Petri "lid lifters". Los cigomicetos producen cigosporas sexuales in vilro. pero las estructuras reproductivas asexuales son ms tiles para la identificacin. La identificacin de especies es difcil, y para la mayora de los propsitos clnicos no es necesaria.

MOHOS HIALINOS SEPTADOS (HIPOMICETOS)

Este gran grupo de hongos saprofitos se encuentra con frecuencia en el laboratorio clnico y contiene algunos de los mohos patgenos ms importantes. En esta seccin consideramos Aspergillus, Fusanum. Penicillium. Paecilomyces y Pseudalieschezria. Pseudallescheria boydii. el patgeno ms comn en este gnero, tiene una fase asexual llamada Scedosporium apiospermum, y el moho puede encontrarse de cualquier forma. Este moho se considera generalmente como un organismo hialino (Sutton, 1998). aunque algunas autoridades lo han colocado en el grupo de dematiacenos (Larone, 1992). Cualquiera de los miembros de este grupo puede ser patognico bajo las condiciones clnicas adecuadas. Debera intentarse una correlacin clnica cuidadosa antes de descartar aislamientos de tejidos y fluidos como contaminantes. Por otro lado, es un error aceptar sin criticar el aislamiento de un patgeno no comn como evidencia de que no se ha determinado la etiologa de la infeccin. Son de utilidad mltiples aislamientos de mohos, y una documentacin de patogenicidad requiere una correlacin patolgica.

Especies de Rhizopus
Los Rhizopus crecen rpidamente, llenando las placas de Petri dentro de las 48-72 horas con hifas blancas y como de lana, pasando de gris a negro segn se desarrollan las esporas (Fig. 54-36). Los esporangios diagnsticos se encuentran mejor en los bordes o en el centro del cultivo, donde pueden verse como puntos negros. Las hifas son anchas (de 6 pm a 15 pm de dimetro), raramente septadas e hialinas. Las esporangiosporas no tienen ramificaciones y sostienen esporangiosporas redondas (de 60 pm a 350 LIm) con una columela elipsoidal. Las esporangiosporas (5 ppm) son

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ENFERMEDADES MICOTICAS

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Factores de riesgo
Los hipomicetos son hongos ubicuos a los que todos nosotros estamos expuestos de manera regular. Residen en todo tipo de vegetacin. Aspergillus fumigatus est presente en hojas de vegetales y se ha descrito la enfermedad alrgica en pacientes que estuvieron expuestos a excrementos de abonos (Kramer. 1989). A. fumigatus y A. Nigerse aislaron en una planta en la habitacin de un paciente con aspergillosis (cita de Know-Chung, 1992). y los comienzos han coincidido con la construccin del hospital (Amow. 1978; Sherertz, 1987). Ser prudente, por tanto, evitar la exposicin de los pacientes ms gravemente inmunocomprometidos. En un estudio epidemiolgico, no hubo ningn caso de aspergillosis invasiva en 39 pacientes que residan en habitaciones con un filtro de aire HEPA. mientras que hubo 1 4 infecciones invasivas en 74 pacientes similares que estaban en habitaciones convencionales (Sherertz. 1987). Los factores de riesgo ms importantes para la infeccin invasiva por hipomicetos son enfermedad inmunosupresiva o quimioterapia (Scherr, 1992: Walker, 1978: Williams. 1976). La neutropenia tambin es un factor predisponente importante (Young. 1989). Es importante reconocer, sin embargo, que puede haber una enfermedad invasiva grave en pacientes que no estn inmunodeprimidos por la quimioterapia o por enfermedad maligna (Rosenberg, 1982; Smith. 1982). Es rara, sin embargo, la enfermedad invasiva en individuos totalmente normales. Las infecciones locales superficiales, que pueden extenderse a estructuras ms profundas o diseminarse a otros rganos, pueden terminar en quirfano (Stern, 1986) o habr que usar medicaciones, especialmente corticoesteroides, por una infeccin local o una aplicacin tpica. Las infecciones de las heridas han sido un problema en pacientes con quemaduras extensas y en individuos expuestos a materiales contaminados con conidias, una situacin tpica de los cigomicetos (McCarty. 1986). Las bolas de hongos en los pulmones se producen en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crnica, bronquiectasias y con cavidades antiguas causadas por tuberculosis. En los senos paranasales tambin existen bolas de hongos causadas tanto por especies hialinas como por dematiacenos.

(Conlan. 1987). La invasin a travs de las paredes de los senos paranasales es la complicacin ms seria de la enfermedad de va area alta, y es de gran importancia en los pacientes infectados por VIH (Meyer. 1994). La colonizacin endobronquial tambin se produce en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crnica y en pacientes con fibrosis quistica que puedan tener bronquiectasias (Gilligan, 1991; Nelson, 1979). A. fumigatus es el moho ms comn aislado en pacientes con fibrosis quistica. pero hemos encontrado otros mohos, como las especies de Penicillium. las especies de Paecilomyces y S. apiospermum. El curso clnico de la mayora de los pacientes con fibrosis quistica no parece modificarse por la presencia de Aspergillus en los pulmones, pero se h a descrito una aspergillosis alrgica broncopulmonar en parte de estos individuos, que desarrollan hipersensibilidad a los antigenos fngicos (Nelson, 1979). A. fumigatus y A. niger son mohos comunes encontrados en las bolas fungicas pulmonares. A fumigatus. A. flavus y Fusarium spp.. al igual que los hongos dematiacenos. se encuentran normalmente en los senos paranasales. La aspergillosis broncopulmonar alrgica es una complicacin en pacientes que tienen una ditesis alrgica (Ahmad, 1984; Golbert, 1970). Las hifas colonizan el tracto respiratorio bajo, pero no invaden el tejido. La deteccin de anticuerpos precipitantes en el suero es til, pero algunos investigadores no consideran que los reactantes disponibles comercialmenle sean validos (Kwon-Chung. 1992). Las manifestaciones clnicas incluyen asma, infiltrados pulmonares y, al final, fibrosis pulmonar en algunos pacientes. Las especies de Aspergillus son los agentes incitanles ms comunes. Un proceso similar puede incluir los senos paranasales (Katzenstem, 1983).

Infeccin pulmonar y enfermedad invasiva

La neumona puede ser difcil diferenciarla de un proceso bacteriano, pero la tos y la produccin de esputo son con frecuencia menos marcados que en la mayora de las neumonas bacterianas (Mehta, 1984). L a progresin hasta la cavitacin y la falta de respuesta a los antibiticos son pistas que deberan considerarse en la infeccin fngica. Un aislamiento repetitivo del mismo moho de muestras clnicas aumenta la probabilidad de que el hongo sea un colonizador o patgeno invasivo ms que un contaminante de laboratorio. La demostracin de hifas en muestras clnicas indica que el moho est presente in vivo. La caracterizacin definitiva del proceso infeccioso puede precisar una correlacin clnica cuidadosa y con frecuencia un estudio morfolgico de las muestras de tejido. La diseminacin desde el pulmn u otras zonas puede incluir cualquier rgano (Meyer, 1973b). La propensin de las hifas para invadir las estructuras vasculares y causar trombosis conduce a infartos y abscesos en mltiples rganos. A. fumigatus y A. flavus son las especies que con ms frecuencia se aislan, pero otras especies de Aspergillus. como A. terreus. tambin producen neumona e infeccin diseminada (Tritz. 1993). A. niger rata vez lo encontramos en enfermedad invasiva, pero virtualmenfe cualquier hongo puede producir infeccin diseminada si las condiciones clnicas y medioambientales son adecuadas.

Enfermedad clnica Infecciones tica y ocular

La queratomicosis por lo general es consecuencia de un traumatismo del ojo, especialmente en pacientes que han sido tratados con esteroides tpicos. El dolor y la visin borrosa siguen al traumatismo, y si no se trata adecuadamente, la infeccin puede extenderse a la cmara anterior. Si el proceso no se comprueba, puede ser necesaria una enucleacin. A. fumigatus (Gingrich, 1962) y Fusarium sotan son agentes etiolgicos comunes (Liesegang, 1980). La otomicosis es una infeccin del odo extemo, causada generalmente por A. niger o A. fumigatus. Dolor, prdida de audicin y disfuncin se acompaan de un crecimiento de una pelusa verde o negra en el canal de la oreja. La extensin ms all del odo externo es rara (Phillips. 1990), pero puede producirse en pacientes inmunodeprimidos.

Infeccin

cutnea

Patologa de la infeccin por hipomicetos

La respuesta histolgica a estos agentes puede ser granulomatosa. pero normalmente est ms dominada por los neutrfilos polimorfonucleares, a menos que el paciente est gravemente neutropnico. La invasin vascular, la trombosis y el infarto con frecuencia son caractersticas importantes. Las hifas son delgadas (de 2 jim a 5 un), septadas y ramificadas en ngulos agudos (dicotomos) (Fig. 54-2). El tinte hematoxilina-eosina con frecuencia colorea bien las hifas. pero, para avanzar, puede verse la morfologa con las tcnicas del cido peridico de Schiff o la tcnica de plata metenamma. Es importante darse cuenta de que es imposible identificar el m o h o por la morfologa de las hifas. Ramificacin dicotmica, hifas delgadas y septadas no siempre es igual a Aspergillus.' Cuando el proceso patolgico es una bola de hongos, las hilas que presumiblemente estn muertas pueden teirse pobremente con todos los tintes. Cuando la cavidad est en contacto con el aire, como en el pulmn o en los senos, pueden desarrollarse unas cabezas afrutadas, un suceso que

Las especies de Aspergillus pueden infectar la piel despus de la diseminacin desde otra zona, por lo general pulmonar, tanto en pacientes infectados por VIH como en pacientes no infectados. Es menos comn que haya una infeccin cutnea primaria en cualquier grupo. Entre los factores de riesgo reconocidos est la inmunosupresin. pero tambin son importantes los factores de riesgo que disminuyen los mecanismos de defensa de la piel. Los ejemplos incluyen quemaduras y heridas quirrgicas, especialmente si estn presentes vendajes oclusivos (van Burik, 1998).

Bolas de hongos
Las dos zonas ms comunes para esta infeccin son los senos paranasales y las cavidades pulmonares (Dar. 1984: Meyer. 1994). En los senos, los signos y sntomas son los de la sinusitis crnica. Las bolas de hongos pulmonares con frecuencia son asintomticas, pero pueden producir hemoptisis

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

permite la asignacin de un gnero especifico, tal como Aspergillus (Fig. 54-37). Las conidioforas, que no estn septadas y que pueden ser ms anchas que las hitas vegetales, no deben contundirse con los cigomicetos. Las clulas Hlle de pared gruesa y los cleistotecios se han descrito In vivo. Los cristales de oxalate demostrables con filtros polarizantes, pueden encontrarse en las bolas de hongos producidas por A. niger (Louthrenoo, 1990: Staib, 1979). Cuando el paciente es inmunocompetente y la respuesta histolgica es granulomatosa, las hifas pueden fragmentarse y reducirse a citoplasma de macrfagos y clulas gigantes mullinucleadas (Ahmad. 1981). La respuesta granulomatosa al Aspergillus en el pulmn puede confundirse con una granulomatosis broncocntnca (Bosken, 1988; Nagata, 1990), por lo general en pacientes que tienen enfermedad alrgica. En las aspergillosis alrgicas son comunes la mucosidad impactada con eosinfilos y los cristales Charcot-Leyden (Bosken. 1988). La infeccin alrgica por Aspergillus en los senos paranasals se parece a la enfermedad broncopulmonar (Katzenstein, 1983).

Nmero de filides Morfologa de las colonias, incluido el tamao Presencia y forma de las clulas Hlle Presencia de cleistotecios El color y morfologa de las especies de Aspergillus se estudian correctamente en el agar Czapek-Dox. El reverso de las colonias de hipomicetos es de color claro, pero puede tener pigmentacin amarilla, marrn o roja. Las hifas vegetales son delgadas, septadas y ramificadas. Las colonias de muchos de estos mohos rebosan de conidias. Para evitar la contaminacin del trabajador y de otros cultivos, debe manipularse con cuidado en una cabina de seguridad de flujo laminar, y despus las superficies de las cabinas tienen que limpiarse con una solucin fungicida. Mantener los mohos aislados en bolsas de plstico mientras contina la incubacin tambin reduce la probabilidad de contaminar otros cultivos. Como ya se dijo antes, delectar los anticuerpos de las especies de Aspergillus puede ser diagnsticamente til, especialmente para aspergillosis alrgica broncopulmonar (Kurup, 1991).

Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones

Estos mohos son hongos saprofitos, algunos de los cuales se aislan comnmente en los laboratorios clnicos. Sin embargo, nunca deberan ser descartados de contaminantes sin determinar la situacin clnica. El aislamiento de una zona estril o varios aislamientos obliga a llamar al mdico. Las hifas tienen que ser demostradas directamente en las muestras clnicas, en las preparaciones fijadas o preparaciones en fresco. Una vez ms, el calcoflor blanco es til para demostrar los mohos. La presencia de hifas en una muestra siempre es ms significativa que aislar los mohos solos. Sin embargo, en las secreciones respiratorias, incluso aunque encontremos hifas, no se define la naturaleza de la interaccin entre hongos y huspedes. Una correlacin clnica detallada y, algunas veces una biopsia son necesarias para la determinacin final. Es importante obtener tejidos, raspados, fluidos o curetajes para analizar, con la excepcin de la otomicosis por Aspergillus. El tejido tiene que ser preparado e inoculado directamente en la superficie de un medio de aislamiento. Estos mohos crecen rpidamente, pero la mayora se inhiben parcial o totalm e n t e por la cicloheximida. La identificacin especfica de las especies la hacemos por el estudio de: Clulas pie Color de la colonia Morfologa de la cabeza colonial

Aspergillus

fumigatus

A. fumigatus es uno de los ms comunes, si no el ms comn, aislado en los laboratorios de micologa. Las colonias crecen m u y rpidamente, produciendo una apariencia de pelusa. El desarrollo de cabezas afrutadas concede una apariencia azul-verdosa a la colonia (Lmina 54-1). Examinar la colonia con un microscopio de diseccin nos muestra las conidioforas con sus vesculas expandidas como globos pequeos protegiendo por arriba el micelio vegetativo. La conodiolora es lisa, relativamente corta (de 300 um a 500 um). y se extiende en una vescula en forma de frasco. Las filides se desarrollan en una hilera nica (uniseriada), y lo ms comn es que se desarrollen slo en los dos tercios superiores de las vesculas paralelas al eje de la conidiofora (Fig. 54-7). Las conidias son rugosas (equinuladas) y de forma redonda u oval.

Aspergillus

flavus

El segundo patgeno ms importante en el gnero Aspergillus es A. flavus. Las colonias crecen rpidamente y, una vez que las cabezas afruladas se desarrollan, tienen una apariencia aterciopelada de amarillo a verde (Lmina 54-13). Las conidioforas son largas (de 400 pm a 700 pm), terminando en una vescula que puede ser elptica o redonda. La conidiofora es rugosa o achaparrada. Una hilera sencilla o doble (biseriada) de las filides se produce sobre toda la vescula o los tres cuartos superiores (Fig. 54-38). Las conidias de redondas a ovales parecen amarillas verdosas en masse y miden de 3 um a 4,5 pm. Las estructuras de descanso (esclerotia) se encuentran en las hifas vegetales de algunos aislamientos.

Aspergillus

niger

Este saprofito comn se aisla con frecuencia del canal auditivo externo. Tiene una apariencia colonial espectacular, con cabezas afrutadas negras contra un fondo de micelios vegetales blancos como la nieve (producen una apariencia de sal y pimienta) (Lmina 54-14 y Fig. 54-39). Las conidioforas son lisas y largas (de 1,5 pm a 3,0 pm). sosteniendo una vescula redonda con filides biseriadas, que se irradian fuera desde la vescula entera. Las conidias marrones y rugosas son redondas y miden 4 pm. Puede estar presente esclerotia.

Figura 54-37. Se demuestra la cabeza de Aspergillus niger dentro de un micetom a pulmonar (bola de hongos). Se observan bien las tilides y las conidias. Aunque las hifas de Aspergillus no son diagnsticas, la demostracin de dicha cabeza demuestra la presencia de este gnero (hematoxilina-eosina).

Otras especies de Aspergillus

El grupo A. glaucus consiste en mohos de color verde con manchas amarillas que crecen rpidamente. Las conidioforas son lisas y las filides unise-

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ENFERMEDADES MICOTICAS

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Figura 54-38. La cabeza de Aspergillus tlavus es unsenada y biseriada. Las IiliFigura 54-40. Conidias de la especie Fusarium con lorma de piragua L a s conidias des s e extienden alrededor d em u c h a s de las vesculas. Puede verse la apariencia generalmente son septadas. (Lactofenol algodn azul.) r u g o s a de las conidioforas. (Lactofenol anilina azul.)

nadas. Normalmente estn presentes cleistotecios (Fig. 54-11). Aspergillus terreus produce una colonia marrn canela, conidioforas cortas (<250 um) y filides biseriadas. A nidulans produce colonias entre verde y verde oliva oscuro, conidioforas onduladas cortas (<150 um) y filides biseriadas. L a formacin de cleistotecios de la etapa sexual se realza por el cultivo en agar Czapek-Dox. Los cleistotecios, que miden de 100 um a 300 um, son redondos y marrn rojizo Estn rodeados por una capa marrn-amarillenta de hifas que contienen clulas Hlle redondas. Ocasionalmente se encuentran otras especies.

una macroconidia con forma de canoa o semicrculo que puede tener uno o ms septos.

Pseudallescheria

boydii/Scedosporium

apiospermum

Especies de Fusarium
Este gnero est altamente implicado en la queratomicosis, en quemaduras y en la enfermedad diseminada en pacientes inmunocomprometidos (Anaissie, 1992; Nelson, 1995; Wheeler, 1981). Las colonias se desarrollan rpidamente, produciendo un micelio areo como pelusa, que con frecuencia es de color rosa, lavanda o salmn. Unos pigmentos difusos pueden verse en los alrededores del agar. Las filides simples o ramificadas se desarrollan directamente de la hila sin una conidiofora que las separe. Pueden producirse macroconidias cortas ovaladas, pero la estructura distintiva es

P boydii es la fase sexual de esle patgeno, mientras que S. apiospermum es la fase imperfecta, asexual. El moho crece rpidamente en un medio de aislamiento, produciendo una colonia vellosa que evoluciona de color marrn grisceo a gris oscuro ("ratn") despus de incubarlo durante varios das. El cultivo se oscurece ms an con una incubacin continuada (Lmina 54-15). Este moho puede crecer en un medio que contenga ms de 8 mg/ml de cicloheximida. La fase asexual se caracteriza por agrupaciones simples o pequeas de anelocondias en una conidiofora recta o ramificada que puede crecer terminal o lateralmente de la hifa vegetativa Las conidias son de marrn claro y tienen una morfologa oval parecida al esperma (Fig. 54-41). En la fase sexual, los cleistotecios marrones contienen ascosporas (Fig. 54-42). Los cleistotecios, que se encuentran ms preparados en los bordes de la colonia, se desarrollan mejor en un medio nutricional deliciente. como el agar cornea. Estrictamente hablando, la cepa debe referirse como P. boydn si se demuestran cleistotecios. y como

Figura 54-41. Las microconidias de Scedosponum apiospermum c o nf o r m a d e Figura 54-39. L a s cabezas de Aspergillus niger se demuestran con un microsco- renacuajo o d e espermatozoide dan al organismo su nombre. (Lactofenol algodn po de diseccin (Preparacin sin teir.) azul.)

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MICROBIOLOGA MDICA

Figura 54-42. U na s c o de la lorma sexual Pseudallescheria boydiivene un exterior rugoso causado p o r hitas especializadas.

Figura 54-44. La septacin de las clulas algiformes de Prototheca wickerhamn produce m u c h o s cuerpos mtracelulares y estructuras conocidas c o m o mrulas (hematoxilina-eosina).

S. apiospermum si las conidias asexuales son las nicas estructuras diagnsticas observadas.

Otros mohos hialinos

Hay una gran lista de mohos hialinos que son saprofitos del ambiente, o de virulencia baia. y por lo general no se asocian con enfermedad clnica cuando se aislan en el laboratorio de micologia. Como ya se ha dicho antes, cualquiera de estos mohos puede ser patognico ba)0 condiciones adecuadas. En la mayoria de los casos, las defensas del husped estn deprimidas de algn modo, o el hongo se introduce en el cuerpo por un traumatismo o manipulaciones mdicas. Como ejemplo. Paecilomyces lilacinus es un moho hialino que se parece morfolgicamente a las especies Penicillium (Westenleld, 1996). Este moho fue considerado hasta hace poco como un contaminante de laboratorio. Un gran nmero de documentos cuentan la capacidad de los llamados contaminantes para producir infecciones del tejido profundo y de los rganos sistmicos. La demostracin de hifas en el tejido es extremadamente importante para averiguar la patogenicidad del aislamiento.

Especies de

Penicillium

Este hongo saprofito se aisla comnmente en el laboratorio de micologia. por lo general sin ninguna enfermedad clnica asociada. Las especies comnmente aisladas crecen bien en un medio de aislamiento fungico, pero se inhiben por la cicloheximida. La colonia es aterciopelada, y se desarrolla una apariencia verde, en ocasiones con un borde blanco (Lmina 54-16). La estructura diagnstica es el penicilo, que recuerda la mano de un esqueleto con cadenas de conidias creciendo desde la punta de los dedos (Fig. 54-43). Las especies de Penicillium tienen que dilerenciarse de las Paecilomyces spp. que son morfolgicamente similares. P. mameflei es un miembro poco normal del gnero que es dimrfico y regularmente produce enfermedad humana sistmica (KwonChung. 1992). Esta especie es endmica en el sureste asitico, y la mayoria de los casos en EE.UU. se han producido en pacientes inmunodeprimidos que han viajado a Asia (Phiehl, 1988) La infeccin por P. mame/Ye/puede parecerse clnicamente a la tuberculosis, moluscos contagiosos, histoplasmosis o cnptococoss (Cooper. 1997). A 25 C-30 C. las colonias de mohos son grises con un pigmento rojo soluble; segn maduran las conidioforas, el color de las colonias se vuelve verde. Las clulas de levadura se producen a 37"C o en los tejidos, pero la divisin es por septacin o fisin ms que por gemacin.

INFECCIONES CAUSADAS POR ALGAS ACLORFILAS

Prototheca wickerhamii y P. zopfii son dos especies de algas que no producen clorofila. Producen en ocasiones infecciones humanas, y se consideran en este capitulo porque se parecen a las infecciones de enfermedades fngicas (Sudman, 1974; Tindall, 1971). Los Prototheca se encuentran en aguas frescas y marinas, y probablemente entran en el cuerpo a travs de heridas superficiales. Algunos pacientes son inmunocompetenles, pero algunas enfermedades subyacentes, como diabetes mellitus, o terapias inmunosupresivas con frecuencia predisponen a los pacientes a la infeccin por este patgeno. Otros pacientes han recibido inyecciones de corticoesteroides en la zona de infeccin o han tenido infeccin musculoesqueltica. sobre todo con afectacin de los tendones. Las infecciones normalmente afectan a la piel y al tejido subcutneo, y despus afectan a los tendones y las articulaciones (Holcomb, 1981; Nosanchuk. 1973). Son crnicas e intratables, y puede ser difcil eliminarlas sin daar las estructuras que estn debajo, particularmente en la mano (Lee. 1975). La diseminacin de la infeccin es rara (Cox, 1974). Las algas crecen en medios fngicos de aislamientos preparados que no contienen cicloheximida. y las colonias se parecen a las de las especies Candida (Lmina 54-17). Las clulas de las algas tienen una apariencia caracterstica, en la que mltiples clulas hijas (esporangiosporas) s e desarrollan dentro de la clula madre (esporangio), recordando a una esfrula (Chandler, 1978; ElAni. 1967). Tambin podemos encontrar estas estructuras en secciones histolgicas, donde deben ser diferenciadas de hongos dimrficos (Fig. 54-44). Pueden verse en las preparaciones de hematoxilina-eosina y se tien bien con el cido peridico de Schiff o mtodos de plata matenamma. Las especies de Prototheca se incluyen en la base de datos

Figura 54-43. El penicilo de las especies de Pnicillium est compuesto de cadenas de conidias nacidas de filides que han sido comparadas con los huesos del esqueleto de la m a n o El gnero Paecilomyces. que posee ms filides. puede ser confundido con el Penicillium (lactofenol algodn azul).

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ENFERMEDADES MICTICAS

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de los sistemas de identificacin de levaduras comerciales, tales como API 20C (BioMerieux. Hazelwood. MO) y sistemas Vitek (BioMneux, Hazelwood, MO).

se produce por los hongos, ms que por una reaccin del tejido especifico para el pulmn.

Diagnstico de laboratorio y otras investigaciones PNEUMOCYSTIS CARINII

Hace pocos aos, este importante patgeno hubiera sido incluido en el captulo de parasitologa. El organismo tiene caractersticas peptnicas. tanto de protozoos como de hongos, pero los estudios moleculares han establecido su relacin con los hongos ascomicetos (Edman, 1988). Pneumocystis carinii ha sido cultivado en cultivos celulares, pero no se ha acompaado de un mantenimiento senado de los subcultivos (Latorre. 1977; Pifer. 1977). Por tanto, el diagnstico es morfolgico y. ms recientemente, inmunolgco. El ciclo vital del Pneumocystis carinii afecta al desarrollo de los esporozoitos dentro de quistes, despus de lo cual los esporozoitos se liberan. El lavado broncoalveolar nos proporciona la fuente ms fiable para material diagnstico (Kelley. 1978), y la biopsia pulmonar rara vez tiene que realizarse. En pacientes con VIH se produce un nmero de microorganismos suficientes para que con un esputo inducido con salino pueda proporcionarnos el diagnstico. La experiencia con los esputos ha variado, sin embargo, en diferentes centros y el rendimiento es muy bajo en pacientes que tienen otras infecciones aparte del VIH (Lau. 1976). La tincin con Giemsa nos muestra bien los esporozoitos. pero las estructuras pequeas son ms difciles de detectar que los quistes. El tinte comercial Diff-Quik (Corporacin de Salud Baxter. McGaw Park, IL) es el que se utiliza normalmente. El tinte de plata metenamina, modificado para Pneumocystis, se utiliza normalmente en laboratorios de patologa quirrgica (Fig. 54-45). El azul de toluidma 0 ha sido empleado en muchos laboratorios de microbiologa (Gosey, 1985). El calcofiUor blanco tambin tie los quistes y se ha utilizado con xito en algunos laboratorios (Baselski. 1990). Los quistes, que miden 5 um son redondos, pero las formas plegadas son comunes. Los quistes plegados con forma de casco y los engrasamientos de las paredes del quiste que recuerdan a las comillas en preparaciones teidas con plata, son caractersticos, pero no diagnsticos. Los quistes deben diferenciarse de otros hongos, en particular de H. capsuiatum. El uso de tintes para quistes y trolozoitos, separados o combinados, nos da una gran sensibilidad (Bartlett, 1991; Blumenfeld. 1988). La llegada de anticuerpos monoclonales combinados con fluorescena para P. carinii nos ha proporcionado un mtodo especfico para identificarlo. La tcnica de la inmunolluorescencia. segn algunos artculos, ha sido ms sensible en tintes histoqumicos (Baughman. 1989; Kovacs, 1988). pero la destreza y el cuidado de los observadores sin duda tienen un papel importante al comparar la sensibilidad de las tcnicas (Bartlett, 1991; Cregan. 1990). El Pneumocystis encontrado en las ratas no se tie con el monoclonal para quistes humanos (Bauer, 1993). pero la especificidad de estas especies es un problema slo en la competencia de los test de las muestras. Debe decirse que los quistes del P. carinii en ocasiones pueden encontrarse en las preparaciones teidas con Gram (Fig. 54-46). aunque esta tcnica no es un mtodo sensible para detectarlos. La deteccin

Factores de riesgo
Pneumocystis cariniies un patgeno de humanos (Bartlett, 1991: Masur. 1989; Walzer. 1974: Watts, 1991). Organismos morfolgicamente similares causan infecciones en especies de roedores. Primero se reconoci en los comienzos de la enfermedad pulmonar entre nios malnutridos en el este de Europa durante y despus de la Segunda Guerra Mundial. No se conoce ninguna fuente en el medio ambiente conocida para los hongos. Podemos comprobar que la mayora de los individuos se infectaron asintomticamente en la infancia por anlisis serolgicos (Maddison. 1982: Peglow, 1990). Tambin se han encontrado infecciones asintomticas o ligeramente sintomticas en adultos (Sheldon. 1959). Hay una evidencia sugerente de que los hongos pueden colonizar el tracto respiratorio bajo, produciendo una infeccin activa cuando interviene un tratamiento o enfermedad inmunosupresiva. La neumocistosis es una enfermedad de individuos comprometidos inmunolgicamente (Walzer, 1974). El tratamiento con corticoesteroides y malignidad hemalolgica fueron los principales factores de riesgo antes de que apareciera el VIH, que se ha convertido en el principal factor de riesgo (Phar, 1990). El sida se descubri por la apariencia de esta enfermedad en hombres jvenes que previamente estaban sanos en Los ngeles y Nueva York (Gottlieb. 1981: Masur, 1981). y la infeccin por Pneumocystis carinii ha sido una de las infecciones que se encuentran en los comienzos del sndrome. La incidencia ha descendido en estos aos, quiz por la introduccin de un tratamiento retroviral efectivo y el uso extensivo de antibiticos profilcticos que son activos contra los hongos (Kovacs, 1992; Sehonanda. 1996).

Enfermedad clnica
La neumona es la manifestacin ms comn de la enfermedad y el pulmn era el nico rgano afectado antes de la aparicin del VIH. El comienzo puede ser agudo o insidioso y predomina la disnea. Con frecuencia los infiltrados son mucho ms extensos de lo que se pensara por el grado de los sntomas (Dee, 1979) Es normal que haya infeccin concurrente con otros agentes, sobre todo con citomegalovirus y C. neoformans. La infeccin con frecuencia es mortal en pacientes no tratados, inmunodeprimidos que mueren de un fallo respiratorio progresivo. La diseminacin de los hongos ms all del pulmn es comn en pacientes infectados por VIH. pero no es comn en pacientes con otros factores de nesgo (Telzak, 1990).

Patogenia de infecciones por Pneumocystis

La presentacin patolgica inicial en nios malnutridos fue una neumona intersticial grave con un infiltrado molecular que tenia un gran componente de clulas plasmticas (neumona de clulas del plasma). El patrn histolgico clsico es un exudado alveolar espumoso que puede calcificarse (Weber. 1997). Un dao alveolar difuso con membranas hialinas es una presentacin menos especfica pero comn (Askin. 1981). Se han descrito, aunque son menos comunes, enfermedad granulomatosa, enfermedad cavitaria y necrosis coagulativa que se parece a los infartos. Las lesiones extrapulmonares son mnimamente inflamatorias, y consisten en cmulos focales de exudado espumoso en el que se encuentran clulas fngicas. Los estudios ultraestructurales de los organismos cultivados (Murphy, 1977) y la histologa extrapulmonar apoyan la evidencia ultraeslructural de que el exudado espumoso

Figura 54-45. Los quistes de Pneumocystis carinii pulmonar son redondos o colapsados y lienen un engrasamiento focal en la pared del quiste que le da u n a apariencia de parntesis (tincin con plata metenamina).

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

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CAPITUIO 54

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CAPiTuio 54

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Parasitologa mdica
Thomas R. Fritsche, M.D., Ph.D. James W. Smith, M.D.

MTODOS DE LABORATORIO Examen de sangre Examen de muestras fecales Examen de muestras urogenitales y otras muestras (expustos, aspirados y biopsias) Tcnicas de cultivo parasitario Mtodos de inmunodiagnstico Mtodos de diagnstico molecular Control de calidad, de mejora y seguridad PROTOZOOS SANGUNEOS Y TISULARES Malaria Babesiosis Hemoflagelados Toxoplasma gondii Amebas oportunistas de vida libre PROTOZOOS INTESTINALES Y UROGENITALES Amebas y Blastocystis hominis Flagelados Ciliados Coccidios Microsporidios

1198

HELMINTOS INTESTINALES Nematodos Cestodos Tremtodos HELMINTOS TISULARES Nematodos Cestodos Tremtodos ARTRPODOS DE IMPORTANCIA MDICA

1221

1228

1231

1204

Caractersticas biolgicas Mecanismos de lesin Aproximacin de laboratorio a la identificacin de artrpodos Insectos Arcnidos Clases de menor importancia mdica

1211

INFECCIONES PARASITARIAS Y HUSPEDES INMUNOSUPRIMIDOS BIBLIOGRAFA

1237 1237

El estudio de la parasitologa ha ganado renovada importancia en un mundo cada vez ms pequeo debido al rpido desplazamiento de la gente, especialmente viajeros y emigrantes de reas endmicas para enfermedades parasitarias, y por la aparicin de patgenos que surgen y resurgen en individuos inmunodeprimidos por diferentes razones. Las enfermedades parasitarias de los humanos y animales domsticos tienen un gran peso en las reas de recursos de salud limitados, y afectan de un modo adverso al desarrollo social y econmico de muchos pases en todo el mundo. Mientras que los organismos clasificados como parsitos constituyen un gran grupo, los que afectan a los humanos son ms limitados en nmero y estn compuestos mayoritariamente por protozoos, helmintos y artrpodos (Tabla 55-1). Mdicos de EE.UU. y otros lugares se estn encontrando con un creciente nmero de problemas en el diagnstico de las enfermedades parasitarias. Tambin los laboratorios han cambiado con el desarrollo de nuevas tecnologas para diagnosticar, rpidamente y con precisin, parsitos como Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayelanensis, Toxoptasma gondii y

microsporidios tanto en inmunocompetentes como en immunosuprimidos. El resurgimiento mundial de la malaria y otras enfermedades parasitarias ha requerido tambin un mayor esfuerzo de los laboratorios para detectar protozoos y helmintos sanguneos, intestinales y tistulares. Una vez diagnosticados, pueden surgir problemas adicionales en su tratamiento debido a la falta de terapias efectivas o al incremento de las resistencias a las terapias tradicionales. Muchos parsitos precisan de un vector artrpodo para su transmisin, y el uso irregular de los esfuerzos erradicadores de los vectores ha producido, en muchas ocasiones, una aparicin de resistencias a los insecticidas. La malaria est resurgiendo en muchas reas debido a un descuido en las medidas de control, as como por la aparicin de parsitos resistentes a los frmacos y mosquitos resistentes a los insecticidas. La esquistosomiasis se ha extendido a nuevas zonas debido a un aumento de la irrigacin a causa del crecimiento de la poblacin, que necesita una expansin de la agricultura. Debido a la naturaleza crnica de muchas enfermedades parasitarias, asi como a los largos perodos de incubacin (tiempo entre la infeccin y la aparicin de estadios diagnsticos), los mdicos pueden no considerarlas en el

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA

1197

Tabla 55-1

R e s u m e n d e los parsitos m s f r e c u e n t e m e n t e hallados e n h u m a n o s y s u principal zona d e infeccin S u b r e i n o de los protozoos Filo Sarcomarligophorea Sublilo Sarcodina (amebas)
. histolytica (I)' hartmanni (I)

S u b r e i n o d e los m e t a z o o s Filo Platelmintos (gusano plano) Clase ceslodos (lenias) Diphyllobothrium spp. (I)' Dipylidium caninum (I)* Echinococcus granulosus (H)" multilocularis (H)' Hymenolepis nana (I)' H. diminuta (I)' Taen/a saginata (1)" 7 solium (I. T)" Clase Tremtodos (lombrices) Clonorchis sinensis (H) Fasciola heptica (H)* Fasciolopsis buski(i) Heterophyes heterophyes (I) Metagonimus yokagawai(I) Nanophyetus salmincola (1)" Opistorchis viverinni (H) Paragonimus spp (L)* Schistosoma haematobium (B) S japonicum (B) S. mekongi (B) S. manson/(B) Filo Nematodos (gusanos redondos) Clase Adenophoros (aplasmidios) Trichinella spiralis (T. 1)" Trichuris trichiura (I) Capillaria philippinensis (I) Clase Secernentia (plasmidios) Enterobius vermicularis (I) Ascaris lumbhcoides (I)' Ancylostoma duodenale (I) Necator amencanus (I)* Strongyloses stercoral (I) Trichostrongylus spp. (I)' Amsaki spp. (1)" Wucfiereria bancrotli (T, B) Brugia malayi (T. B) Loa toa (T, B) Onchocerca volvulus (T) Mansonella perstans (TB) M. ozzardi (T. B) M streptocerca (T) Dracunculus medinensis (T) Angiostrongylus cantonensis (T) A costaricencis (T)
-

d/spar(l) coft'(l) lodamoeba butschlii (I) Endo/imex nana (I) Nacglcria fowleri(T. C)* Acanthamoeba spp (T. C, E)" Balamulhia mandrillaris (T, C)* Blastocystis hominis (I) Subfilo Mastigophora (flagelados) Giardia lamblia (I)* Dienlamoeba fragihs (I)' Chilomasyix mesniii (I) Relor amonas intestinalis (I) Enteromonas hominis (I) Trychomonas hominis (I) Ttychomonas vaginalis (V)" Leishmania tropica (T) L. major (T) L aethiopica (T) .. mexicana (T)" /.. braziliensis (T) L. donovan/(T) Trypanosoma gambiense (B, 7" rhodesiense (B. C)
7" CY/;>7(B. T)'

C)

Filo Ciliophora (ciliados) Balanlidium coli (I)* Filo apicomplexa (apicomplejos) Clase Sporozoea Subclase Piroplasmea Babesia spp. (B) Subclase coccidios Plasmodium falciparum (B) P malariae (B) P ova/e (B) P wvax (B) Cryptosporidium parvum (I)" Cyclospora cayetanensis ( I ) Isospora belli (I)* Toxoplasma gondii (T)' Filo Microspora (microsporidios) Encephalilozoon spp. (E, H, T)* intestinalis (I. T)' Enterocytozoon bieneusi (I)'
-

* Parsitos patgenos naturales de Estados Unidos B sangre. C liquido cefalorraqudeo: E 0|0: H: hgado: I: intestino L pulmn T : tejidos; V: vagina Adaptada de Murray PR Barron EJ Pfaller M. y cois. Manual of Clinical Microbiology, 6a ed Washington DC A S M Press. 1 9 9 5

diagnstico diferencial a menos que el paciente aporte informacin voluntariamente o se le interrogue especficamente sobre la historia de viajes u otras exposiciones. La malaria es una de las patologas parasitarias que cursa con un cuadro febril agudo, que puede tener consecuencias letales a menos que se la considere en el diagnstico diferencial y se recoja una historia de viajes a una zona endmica. Se han hecho varias estimaciones de la prevalenca y mortalidad de las infecciones parasitarias en todo el mundo (Tabla 55-2). Se desconoce la incidencia actual de las infecciones por parsitos en los EE.UU. porque la mayora no se declaran a las oicmas de salud pblica. Giardia lamblia.

otros protozoos intestinales y los gusanos redondos intestinales son los ms frecuentemente declarados (7,2%. 10% y 3.5%, respectivamente) por los laboratorios, pero probablemente son ms comunes otros parsitos, entre los que se incluyen Cryptosporidium. Cyclospora y los microsporidios, aunque estn infradiagnosticados (Kappus, 1994). Este captulo hace una revisin del abordaje general de los laboratorios para la deteccin y el reconocimiento de los protozoos y helmintos en las muestras humanas. Se necesita una descripcin de las distintas especies de parsitos para tener una informacin clnica y biolgica esencial para el diagnstico y tratamiento. Para una mayor descripcin de los parsitos.

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
N

Tabla 55-2 Prevalencia mundial e s t i m a d a para las infecciones parasitarias Poblacin estimada N. anual afectada de muertes Enfermedad Protozoos Amebiasis Tripanosomiasis africana Tripanosomiasis americana Giardiasis Leishmaniasis Malaria Helmintos Ascariasis Ceslodos ClonorquiasisOpistorquiasis Dracunculosis Fasciolopsiasis Filaras linfticas Uncinanas Oncocercosis Paragonimiasis Esquistosomiasis milln Estrongiloidiasis Tricoeslrongiliasis Tncunasis Aprox. 10% de la poblacin 100.000 nuevos casos al ao 24 millones 200 millones 1.2 millones 400-490 millones 1.3 billones 65 millones 13.5 millones < 100.000 10 millones 128 millones 1,3 billones 17.7 millones 2.1 millones 150 millones 35 millones 5,5 millones 900 millones 40.000-110.000 5.000 60.000

2.2-2.5 millones
1 550

cuencia de muestras necesarias para el diagnstico. Tambin son tiles en muchas ocasiones los mtodos de diagnstico inmunolgico y molecular, y a veces pueden ser los nicos mtodos de diagnstico disponibles. Se puede encontrar una descripcin completa de los procedimientos de laboratorio general para la deleccin e identificacin de los parsitos en distintas fuentes a las que nos remitimos (Ash. 1987; Balows, 1 9 8 8 : Beaver. 1984; Garcia. 1997.1999: Isenberg. 1992; Murray. 1999: Price. 1994). La familarizacin con la calibracin y el uso de un micrmetro ocular es necesaria para llevar a cabo cualquier examen parasitolgico en cualquier laboratorio. La medicin del tamao de los trolozotos de los protozoos y los quistes, as como de los huevos de los helmintos y las larvas, es algo m u y necesario para una rpida identificacin. Diferenciar entre amebas patgenas y no patgenas (concretamente entre Entamoeba histolytica y E. hartmanni) slo puede realizarse con seguridad a travs de la cuidadosa medicin del tamao. Igualmente, los huevos de Diphyllobothrium spp., Paragonimus westermani y Fasciola>Fasciolopsis pueden distinguirse segn su tamao (Smith, 1979).

Examen de sangre
Los parsitos que se pueden detectar en muestras de sangre son los agentes de la malaria (Plasmodium spp.). babesiosis (Babesia spp.), tripanosomiasis (Trypanosoma spp.) y leishmaniasis (Leishmania donovam) y filanasis (Wuchereria bancrofti, Brugia malayi. Loa loa y Mansonella spp.). Las tcnicas ms importantes que debe realizar el laboratorio para el diagnstico de los parsitos sanguneos son la preparacin, la tincin y el examen de las extensiones gruesa y fina de sangre. Otras tcnicas menos frecuentes son aquellas de concentracin reservadas para la deteccin de microfilarias (National Committee tor Clinical Laboratory Standards [NCCLSj, 2000).

500 000-1

Adaplada de Marken EK. John DT Krotoski WA Marken and Voge's Medical Pa rasilology 8 ed Filadelha. WEt Saunders Company. 1 9 9 9

Frotis sanguneos gruesos y finos

nos remitimos a un gran nmero de textos disponibles (Beaver. 1984; Cook. 1996: Garcia. 1997. 1999; Goldsmith. 1989: Kettle, 1995; Lae. 1993; Markell. 1999: Strickland, 2000; Warren. 1990: entre otros) Una importante fuente de informacin la tenemos tambin en los atlas de parasitologa para todo laboratorio que trabaja con parsitos, y que debe estar disponible para consulta (Ash, 1987. 1997; Brooke, 1984; Isenberg, 1992: Murray, 1999; Peters, 1989: Spencer, 1982; Sun, 1988). En otros textos se documentan aspectos especficamente patolgicos de la inleccin parasitaria (Binford, 1976; Connor, 1997; Gutirrez, 2000; Orihel, 1995; Marcial Rojas, 1971; Sun, 1982; Von Lichtenberg, 1991; Woods, 1993). Las infecciones parasitarias en los mmunodeprimidos tambin han sido objeto de revisin (Walzer. 1989) Es necesario el examen de frotis sanguneos teidos para la identificacin de la mayora de los parsitos sanguneos. Los frotis finos se preparan igual que los usados en el diagnstico diferencial hematolgico: la sangre se extiende sobre un portaobjetos en una fina capa evitando la superposicin de los elementos celulares. Es importante la integridad de las membranas celulares para determinar la naturaleza mtracelular o exlracelular de la inleccin. En el frotis grueso, la sangre se concentra en un rea pequea en la que muchas clulas yacen en el fondo. Durante la tincin, los eritrocitos pierden la hemoglobina, de modo que slo son visibles los ncleos leucootarios. las plaquetas y los parsitos (si estuviesen). Se prefiere el uso del frotis grueso para el diagnstico, ya que posee entre diecisis y treinta veces ms sangre por campo que el frotis fino, incrementndose asi la posibilidad de detectar parsitos reduciendo el tiempo necesario de examen. La cantidad de sangre estudiada en un frolis grueso en cinco minutos, usando un objetivo de aceite de inversin (100 x), requerira al menos treinta minutos si se examinase la misma cantidad en un frotis fino. Mientras que la probabilidad de deteccin de una infeccin aumenta con el frotis grueso, la identificacin de la especie se realiza mediante examen del frotis fino, ya que as la morfologa es ms definida, especialmente para la malaria Para el examen ordinario, se deberan preparar ambos tipos de frotis. Preparacin de las extensiones, La sangre para examen puede obtenerse por puncin en el dedo, en el lbulo de la oreja o por puncin venosa. La sangre de la puncin del dedo debe dejarse salir libremente para evitar su dilucin con los lquidos titulares y no debe ser contaminada con alcohol desinfectante, sino que primero se debe dejar que sta se seque. Si se obtiene por puncin venosa, se usar la primera gota de sangre (sin anticoagulante) para preparar el frotis a la cabecera del paciente. El uso de anticoagulantes est contraindicado en la sospecha de malaria porque pueden distorsionar la morfologa de los parsitos e interferir en su tincin. En la prctica, no obstante, la sangre suele remitirse al laboratorio con anticoagulante, ya que puede ser el nico modo de asegurar que s e puedan preparar las extensiones. El anticoagulante ms utilizado, en tales

MTODOS DE LABORATORIO
Se han descrito numerosos mtodos para la deteccin e identificacin de parsitos en las muestras clnicas, algunas de las cuales son tiles para detectar distintas especies, mientras que otras detectan una nica especie en particular. Es preferible para el laboratorio ofrecer un nmero limitado, pero competente, de procedimientos a llevar a cabo, en vez de proporcionar una gran variedad de pruebas poco empleadas que puedan resultar problemticas. Los anlisis de sangre y heces comprenden la mayora de los requerimientos clnicos para un estudio parasitolgico. Otras muestras son de uso menos frecuente, como las urogenitales, el esputo, los aspirados y las biopsias. Como cada vez hay nueva informacin disponible de algunos de los llamados parsitos emergentes, los laboratorios pueden necesitar desarrollar y usar mtodos adicionales altamente especficos o encontrar laboratorios de referencia competentes donde llevar a cabo las pruebas. Las muestras recogidas para la valoracin del laboratorio dependen de la especie y del estudio del parsito sospechado. El conocimiento del ciclo de vida del parsito da informacin de la determinacin del tipo, nmero y fre-

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PARASITOLOGA MDICA

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casos, es el cido etilendiaminoletraactico (EDTA). pero debe ser llevado al laboratorio en menos de una hora para evitar el deterioro de la morfologa de los organismos. Los anticoagulantes no interfieren en la tincin de las microfilarias. Tanto el frotis fino como el grueso se deben preparar en un porta limpio y sin grasa. Los frotis gruesos se preparan poniendo unas cuantas gotas de sangre en una zona de 1,5 cm de dimetro y dejndolos secar a temperatura ambiente, casi siempre por la noche. Un frotis grueso debe ser lo suficientemente fino para que se pueda leer un peridico a su travs; si fuese demasiado grueso, el frotis puede escurrirse por el portaobjetos. El exceso de calor podra fijar los eritrocitos y evitar su deshemoglobinizacin. Tinciones. La sangre empieza a perder su afinidad por las tinciones en unos tres dias y los Irolis gruesos ms antiguos no pierden bien la hemoglobina. Los mejores resultados de la tincin se logran con el uso de la tincin de Giemsa. ya que la cromatina de las clulas y la del parsito se tie con viveza, mientras que la hemoglobina de los eritrocitos queda de color rojo plido. Es la nica tincin que permite ver el punteado entrocitario que se produce en la infeccin por algunos parsitos de la malaria. La tincin de Wright puede usarse para frotis finos, pero tie los parsitos peor que el Giemsa y tie los eritrocitos, dejando un fondo poco ntido. Debido a que la tincin de Wright lleva alcohol como fijador, los frotis gruesos se deben lisar con agua antes de ser teidos. El proceso de tincin con Giemsa requiere mayor atencin a la hora de preparar los activos y de realizar el protocolo de tincin, mientras que en el caso de la tincin de Wright suele estar todo automatizado. Generalmente, el colorante de Giemsa fresco se debe hacer cada da, usando una solucin diluyeme con agua tamponada con fosfato. Para lograr una adecuada tincin, incluyendo la aparicin del punteado de Shflner, el agua tamponada se debe mantener con un pH entre 6,8 y 7.2. Se debe revisar cada lote de Giemsa para determinar el tiempo de tincin ptimo y su dilucin, ya que hay algunas variaciones de lote a lote (NCCLS. 2000). Examen de las extensiones. Tanto los frotis gruesos como los linos se examinan en su totalidad bajo un objetivo de bajo aumento (10x) para detectar microfilarias, que no suelen estar en gran nmero. Particularmente se deben examinar los bordes del frotis fino, ya que las microfilarias se desplazan all frecuentemente durante la preparacin del frotis. El examen con aumento de 50x en aceite de inversin puede usarse para la bsqueda de protozoos en frotis sanguneos, aunque es an necesario el examen en objetivo de aceite de inversin 100x para detectar los parsitos ms pequeos, como Plasmodium spp.. Babesia spp.. y Leishmania spp. Nuevamente, el examen de los bordes es importante, puesto que los eritrocitos son desplazados a una capa de clulas, permitiendo la evaluacin de su morfologa y la existencia de protozoos mtracelulares. Un experimentado microscopisla antes de dar un resultado negativo debe examinar como poco cien campos con aceite de inversin en frotis gruesos (dedicando cerca de cinco minutos) y doscientos campos en un frotis fino (dedicando al menos quince minutos) usando un objetivo de cen aumentos (Ash, 1987).

gulada se lisa con formalma al 2% y se centrifuga para concentrar las microfilarias en el sedimento, que puede ser posteriormente examinado como una preparacin en fresco, o bien se tie con Giemsa o hemaloxilina. En el proceso de filtracin de membrana la sangre es lisada y pasada a travs de un filtro de membrana de 5 pm, que posteriormente es teida con hematoxilina para detectar alguna microfilaria (Ash, 1987; NCCLS, 2000). El uso de naranja de acridina-fluorocromo en un formato de microhematcrito (OBC. mtodo de deteccin de parsitos sanguneos. Becton Dickinson, Franklin Lakes. NJ) permite la deleccin de parsitos sanguneos y parece ser ms sensible que los tradicionales frotis grueso y fino. Los laboratorios que detectan malaria infrecuentemente pueden tener dificultades para la interpretacin de los resultados con este mtodo, pero sin embargo se les anima a conservar la experiencia en la realizacin de las tcnicas con los tradicionales frotis sanguneos (NCCLS. 2000).

Examen de muestras fecales

La identificacin de parsitos intestinales se realiza a travs del examen directo de la deposicin usando heces acuosas, tcnicas de concentracin, tinciones permanentes y, menos frecuentemente, cultivos. Se han hecho populares los nuevos mtodos de inmunoensayo mediante anticuerpos especficos para detectar antgenos de Giardia lamblia. Cryptosporidium parvum y Entamoeba histolytica. Los estadios de helmintos ms frecuentemente vistos son los huevos y larvas, aunque ocasionalmente pueden verse gusanos enteros o porciones. La infeccin por protozoos intestinales se diagnostica por la deteccin de trofozotos. quistes u ooquistes. Los mtodos habituales para la identificacin de huevos y parsitos (examen O/P) deberan incluir procedimientos que permitiesen detectar tanto protozoos como helmintos, dejando el uso de tcnicas especiales slo para solicitudes especificas. Como existen pocos laboratorios dedicados al examen parasitolgico, deben estar capacitados para realizar un examen directo de heces frescas acuosas, tcnicas de concentracin y tcnicas de tincin. Muchas infecciones por protozoos pueden no detectarse a menos que se realicen exmenes con tincin permanentes (Garca, 1979,1997; NCCLS. 1997; Price, 1994: Smith, 1996).

Recogida, manejo y conservacin de muestras

Una correcta deteccin e identificacin de los parsitos de las muestras fecales requiere una adecuada recogida y manejo de las mismas. Las muestras antiguas, mal conservadas o contaminadas son de escaso valor. Las muestras no se pueden recoger en la semana que sigue a la ingestin de sustancias que dejen residuos cristalinos, como componentes antidiarreicos no absorbibles, anticidos, bismuto, bario o agentes antimalricos. Los laxantes oleosos, como el aceite mineral, tambin pueden interferir en el examen. El uso de antibiticos o los medios de contraste pueden disminuir el nmero de organismos en el tracto digestivo, especialmente protozoos, durante varias semanas (Ash. 1987). Las muestras se deben remitir al laboratorio mientras estn frescas o con los conservantes apropiados. Todas las muestras frescas se deben examinar en la primera hora tras ser remitidas, y las muestras lquidas deben examinarse en menos de treinta minutos o ser puestas en conservantes para mantener el mximo rendimiento. Estas estrategias aseguran que los frgiles protozoos y trofozotos no sean destruidos inadvertidamente. La muestra que no se procese inmediatamente se debe dejar en una habitacin a temperatura ambiente o refrigerada y nunca colocada en una incubadora, ya que peligrara la integridad de los parsitos. Las muestras deben ser pasadas directamente a un cartn seco y limpio o que el paciente defeque sobre un papel encerado y se transfiera u n a parte a un recipiente. Las muestras liquidas pueden tambin ser recogidas en u n a cua limpia. Los contenedores deben tener una tapa hermtica y se deben colocaren una bolsa de plstico antes de llevar al laboratorio. La mezcla inadvertida de orina o de agua del inodoro con la muestra puede destruir los protozoos y trofozoitos, por lo que se debe evitar. Tambin la contaminacin con

Tcnicas de concentracin
Se han descrito una variedad de tcnicas especiales para la concenlracin de parsitos sanguneos, especialmente para leishmanias. tripanosomas y microfilarias. Los detalles se pueden encontrar en otros textos (Ash, 1987; Beaver. 1984; Garcia, 1997.1999: Isenberg. 1992; NCCLS, 2000). La preparacin de extensiones tamponadas, que puede realizarse con los recursos existentes en la mayoria de los laboratorios, es til para deteccin de Leishmania donovani, tripanosomas y microfilarias. Tras la centrifugacin de una muestra de sangre con anticoagulante, la capa de clulas que queda entre el plasma y los eritrocitos es recogida y usada para preparar frotis sanguneos para teir o para hacer una preparacin en fresco para detectar organismos mviles (Ash. 1987; Strickland. 2000). Para la deteccin de microfilarias, es til la concentracin de Knott o la filtracin de membrana, especialmente cuando la densidad de microfilarias en sangre perifrica es baja. En la tcnica de Knott, la sangre anticoa-

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Tabla 55 -3 Fijadores de muestras fecales y tcnicas de examen Tcnica de examen Fijadores Ninguno (heces Irescas) Formatina al 10% Fluido de Schaudinn Alcohol polivinilo (PVA)' P V A modificado' Mertiolato-yodo-formalina (MIF) Acetato sdico-lormalina (SAF)
d j r e c

Concentraron Si Si No No" No' Si Si

Si Si No No No S S

Si No Si S Si No' S

la muestra, aunque algunos huevos (especialmente esquistosomas) pueden pasar al torrente fecal en el colon descendente y el recto y distribuirse irregularmente, como puede ocurrirle a los huevos de Taenia spp. Los trofozolos de los protozoos pueden ser ms numerosos en la parte final de la deposicin y deberan ser buscados especficamente en la mucosidad (Smith, 1996).

Examen

microscpico

" Aunque las tcnicas de concentracin con PVA se ha descrito, no son totalmente usadas debido al problema de reconocimiento de algunos organismos. ' El sulfato de cobre o el sulfato de cinc sustituyen al cloruro de mercurio. Las extensiones preservadas con MIF se deben teir con policromo IV.
:

Las muestras se deben examinar microscpicamente por examen directo de material fresco o conservado, por examen de los concentrados o con tincin permanente. Cada procedimiento tiene sus ventajas e inconvenientes. La humidificacin de las heces frescas con suero salino permite la deteccin y observacin de trofozotos mviles de protozoos y larvas de helmintos, El estudio de heces conservadas puede permitir la deteccin de parsitos que no se concentren bien. Los procesos de concentracin son de mayor rentabilidad para la deteccin de quistes de protozoos y huevos de helmintos, as como de larvas, pero no es satisfactorio para la deteccin de trofozotos de protozoos. Las tinciones son tiles para la deleccin y el examen morfolgico de los trofozotos de los protozoos y los quistes. Las circunstancias para llevar a cabo cada procedimiento dependen del tipo de muestra (formada, blanda, descompuesta, acuosa). Generalmente, las muestras frescas blandas, descompuestas o acuosas deben tener los tres procedimientos de manejo (Smith, 1996). Las muestras acuosas se deben concentrar por centrifugacin simple mejor que por flotacin o concentracin con formalina-etil actico. El estudio directo se puede omitir si la muestra llega con conservantes (NCCLS, 1997). Como mnimo, las muestras tomadas se deben estudiar por un proceso de concentracin, aunque se ha demostrado un gran rendimiento cuando se emplea una tincin (Garca, 1979,1997). Estudio directo en fresco. El estudio directo es uno de los ms fciles de realizar entre los estudios parasitolgicos, aunque la correcta interpretacin requiere un examen cuidadoso y gran experiencia en el uso del microscopio. Es ms til cuando las muestras frescas se examinan para trofozotos mviles o larvas de helmintos (especialmente residuos lquidos o aspirados duodenales). Una pequea cantidad de muestras se mezcla con una gota de suero salino al 0,85% y se cubre con un cubreobjetos. La preparacin ha de ser lo suficientemente densa para permitir leer un peridico a su travs. El examen de la totalidad del portaobjetos se ha de hacer sistemticamente con el objetivo de bajo aumento (10x), con el diafragma del microscopio cerrado para aumentar el contraste. Los objetos sospechosos y aqullos retrctiles, como los quistes de los protozoos, se deben examinar con el objetivo de gran aumento (40x). La deteccin del movimiento de amebas de movimiento lento requiere un examen durante al menos 15 segundos. En ausencia de imgenes sospechosas, por lo menos se ha de examinar un tercio de la preparacin con el objetivo de 40x. El uso del objetivo de aceite de inversin no se suele utilizar a menos que el cubreobjetos se haya sellado con esmalte de uas o vaspar (una mezcla al 50:50 de jalea de petrleo y parafina). Se debe hacer una segunda preparacin igual salvo que se aada una gota de yodo Lugol al 1:5, o una preparacin equivalente, en vez del salino, El uso de yodo Lugol o yodo Gram produce la agrupacin del material, por lo que se desaconsejan. El yodo es til para incrementar la visibilidad de las estructuras nucleares en los quistes de protozoos y para la deteccin de inclusiones de glucgeno. Entre sus limitaciones se incluye una prdida de la motilidad de los trofozotos y de la refractilidad de los quistes, as como la dificultad para reconocer los cuerpos cromatoides. Tcnicas de concentracin. Las tcnicas de concentracin, que se pueden realizar con material fresco conservado (Tabla 55-3), son ms sensibles que el estudio directo para detectar quistes de protozoos y huevos de helmintos y sus larvas, debido a que disminuye el material de desecho en las preparaciones y, en la mayora de las ocasiones, se concentran los organismos. Aunque se han descrito gran variedad de mtodos y modificaciones, algunos son tiles slo para parsitos especficos (Ash,

agua o tierra puede introducir accidentalmente organismos de vida libre que se pueden confundir con los parsitos. Hay equipos que contienen viales de conservacin apropiados para el examen de extensiones teidas que estn disponibles en el mercado a bajo precio. Se debe poner inmediatamente una parte de la muestra fresca en estos viales y mezclarlos completamente. Estos equipos son especialmente tiles para aquellos pacientes a los que es imposible extraer una muestra fresca en el plazo requerido o para los que han de recoger varias muestras en das consecutivos. Con la tcnica de los dos viales, una parte se fija en tres porciones de formalina tamponadas al 5%-10% y otra parte en otras tres porciones de alcohol polivinilo fijador (PVA). Otros sistemas de conservacin disponibles son: mertiolato-yodo-formalina (MIF) y acetato sdico-formalina (SAF) (Tabla 55-3). El SAF tiene la ventaja de que puede usarse para tinciones permanentes, para el estudio en fresco y para procedimientos de concentracin y adems no contiene mercurio, que s est presente en los fijadores de Schaudinn y PVA. Adems de ser venenoso, el mercurio puede presentar problemas de eliminacin en muchos estados. Sin embargo, la calidad de las tinciones permanentes con el SAF no es tan buena como con los fijadores de Schaudinn y del PVA. El PVA con base de sulfato de cinc y otros nuevos productos comerciales van ganando popularidad y su uso est indicado cuando los componentes con mercurio no se puedan utilizar (Garca. 1993, 1997: NCCLS, 1997). El examen de tres muestras recogidas en das alternos es el mnimo necesario para realizar una adecuada evaluacin E/P (NCCLS, 1997: Smith. 1996). Este procedimiento asegura un intervalo ptimo de recogida de aquellos parsitos que poseen una eliminacin cclica, especialmente Giardia lamblia y Strongyloides stercoralis. El uso de purgantes puede dar una sensibilidad adicional para deteccin de parsitos como E. histolytica. El laboratorio debe ser avisado antes del comienzo de la purga para tener personal disponible para el proceso. Las muestras han de recogerse en contenedores diferentes y ser remitidas al laboratorio en pocos minutos. Se recomiendan purgantes como el sulfato sdico o el fosfato sdico tamponado.

Examen

macroscpico

Se debe examinar de un modo general la consistencia de las heces (formadas, blandas, acuosas, descompuestas) y si hay presencia de moco, sangre, larvas o gusanos adultos y progltides. Los protozoos y trofozotos se encuentran fcilmente en muestras acuosas o descompuestas, mientras que los quistes predominan en las muestras blandas o formadas. Los helmintos o sus huevos se pueden encontrar en cualquier tipo de heces. La mayora de los parsitos se distribuyen de modo uniforme en

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1987: Barnes, 1984; Garca, 1997, 1999; Melvin. 1982: NCCLS, 1997) Para el uso sistemtico, se debe seleccionar un mtodo que permita la deteccin de quistes de protozoos y huevos de helmintos. Los mtodos de concentracin se basan en los principios de sedimentacin y flotacin. En la sedimentacin, los parsitos ms pesados emigran al fondo debido a la gravedad o por centrifugacin. En la flotacin, los quistes y huevos ms ligeros suben a la superficie de una solucin de alta densidad. Los dos procesos de concentracin ms usados en los EE.UU. son las tcnicas de flotacin centrfuga con sulfato de cinc (tcnica de Faust) y la sedimentacin con ter-formalina (tcnica de Ritchie o modificaciones). En la prctica, el etil actico ha sustituido al ter en el ltimo mtodo debido al peligro de su uso y a unos resultados superpombles (Truant. 1981). La concentracin con formalina-etil actico es una tcnica de sedimentacin bsica que es eficiente en la recuperacin de la mayora de los quistes de protozoos, larvas y huevos de helmintos, incluyendo los huevos con oprculo, y tiene una moderada efectividad para los huevos de esquistosomas. Con esta tcnica se consigue menos distorsin de los quistes que con la flotacin con sulfato de cinc. Sin embargo, los huevos de Hymenolepis nana se pueden perder y la concentracin de G. lamblia y de los quistes de lodamoeba btschlii puede ser defectuosa. Para una correcta concentracin de ooquistes de coccidios y esporas de microsporidios se debe prestar atencin a la velocidad y tiempo recomendado de centrifugacin (Isenberg, 1992; NCCLS. 1997). A pesar de estos problemas, la tcnica es comnmente empleada por su simplicidad y su disponibilidad en la mayora de los laboratorios. Con la tcnica de flotacin de sulfato de cinc, la muestra fresca se procesa usando sulfato de cinc con una densidad especfica de 1,18, y la muestra lormalinizada se procesa con una solucin de una densidad de 1.20. Los elementos parasitarios se recuperan de la capa superficial de la solucin Iras la centrifugacin. Esto produce una preparacin ms limpia que la de formalina-etil actico, pero es intil para la deteccin de larvas de nematodos, huevos inlrtiles de Ascaris y huevos de la mayora de los tremtodos y de las tenias. Tambin puede haber problemas con las muestras que contienen gran cantidad de grasas. El uso de material formalinizado en vez de fresco ayuda a limpiar los muestras y previene la apertura de los que oprculos y la distorsin de los parsitos (Bartlett, 1978). Tinciones permanentes. El uso de preparaciones teidas permite guardar permanentemente las muestras y su revisin por distintos mdicos cuando aparezcan dificultades de identificacin. De todos los mtodos descritos para el estudio de las muestras fecales, nicamente la tincin permanente es la diseada para el uso del objetivo de aceite de inversin (100x). La tincin es ms til para la deteccin de trofozotos y quistes de protozoos, que pueden reconocerse cuando la preparacin en fresco y los concentrados sean negativos. Aunque no suele ser lil para la deteccin de huevos o larvas de helmintos, las tinciones son ms sensibles para detectar inleccin por protozoos y se recomienda su uso para todas las muestras remitidas para estudio de O/P (NCCLS, 1997). Se han descrito una gran variedad de tcnicas de tincin y sus modificaciones con todas sus ventajas y desventajas. La tincin de tncromo de Wheatley y la tincin de hierro-hematoxilina son mtodos que permiten detectar amebas y flagelados. Desafortunadamente, la deteccin de la mayora de las infecciones humanas por coccidios y microsporidios requieren tinciones especiales. Pueden aparecer muchos problemas tcnicos a la hora de realizar la tincin. La mayora dependen del tiempo transcurrido tras la toma de la muestra, de la extensin y de la fijacin, asi como de la calidad de los reactivos. Se deben realizar controles positivos de extensiones conocidas con cada batera de extensin. Esto es especialmente cierto para la realizacin de tinciones ms especificas para coccidios y microsporidios. Otros tintes menos comnmente usados, como la tincin policroma IV, usados con muestras preservadas con MIF y la tincin de negro clorazol E para muestras en fresco no se revisan aqu y los detalles se pueden encontrar en otros textos (Garca, 1997). Tincin de tricomo de Wheatley. En los EE.UU. la modificacin de Wheatley del mtodo de tricromo sigue teniendo gran aceptacin por su sim-

plicidad, fiabilidad y su bajo coste. Los detalles de su realizacin se pueden encontrar en muchos textos (Isenberg, 1992; Melvin, 1982: NCCLS, 1997; Price, 1994). Con tricromo se pueden teir muestras que se han lijado con el fijador de Schaudinn o P V A o muestras conservadas con SAF o MIF, pero los resultados son menos satisfactorios. Tincin de hierro-hematoxilina. Esta tcnica es mas difcil de llevar a cabo que el tricromo. pero tiene mejores resultados debido a que incrementa la definicin del ncleo y las caractersticas del citoplasma (Price, 1994). Una tincin modificada del hierro-hematoxilina que puede ser til es la que incorpora carbol-fucsina, permitiendo la tincin de organismos cido resistentes, como Cryptosporidium. Cyclospora e Isospora (NCCLS. 1997; Palmer. 1991). Las muestras fijadas con SAF. Schaudinn y P V A pueden teirse con hierro-hematoxilina (tincin preferida para el SAF). Tinciones cido-resistentes modificadas. Los ooquistes de Cryptosporidium. Cyclospora e Isospora son difciles de reconocer en extensiones teidas con tricromo o hierro-hematoxilina. pero se pueden detectar con la tcnica de tincin acido-resistente. como la modificada Kinyoun. la modificada de cido-resistente dimetil-sulfxido (DMSO) o la auramina-0 (Bronsdon, 1984; Current, 1991: Ma, 1983: NCCLS, 1997). Las tinciones cido-resistentes son sensibles y eficientes para la deteccin de estos protozoos, pero pierden especificidad. Se debe prestar especial atencin a los criterios morfolgicos cuando se usan estas tinciones y es obligatorio el uso de controles positivos Para aquellos laboratorios en los que Cryptosporidium se aisla, rara vez se recomienda el uso de reactivos de alta especificidad y sensibilidad. Las muestras biliares, los esputos, las heces en fresco o fijadas con formalina o SAF se deben teir con tinciones cido-resistentes. Tinciones para microsporidios. Los microsporidios (especficamente Enterocytozoon bieneusi y Encephalitozoon intestmalis. junto con un gran nmero de otras especies) se han implicado como agentes comunes de procesos diarreicos, especialmente en inmunosuprimidos, aunque su deteccin ha sido problemtica. Aunque la biopsia y la microscopa electrnica han sido una clave de sus diagnsticos, se han descrito procedimientos de tincin para ser llevados a cabo en el laboratorio. Una tincin del tricromo modificada con una concentracin aumentada (diez veces) y 2F cromotropo con un incremento en el tiempo de tincin ha ganado aceptacin como estudio para la identificacin de esporas de microsporidios (Weber, 1994). Las tcnicas de tincin fluorescente mediante el uso de agentes blanqueantes pticos como el Uvitek-2B y el calcoflor blanco tambin son tiles para el screening rpido y sensible de heces y otras muestras (DeGirolami. 1995: Didier. 1995: Luna. 1995; van Gool. 1993). El pequeo tamao (1,5 pm-3 pm) de estos organismos hace su deteccin difcil, y estos estudios no deberan realizarse sin una adecuada comparacin con el control.

Tcnicas adicionales para el examen de parsitos entricos

Tcnica de papel de celofn para oxiuros. La hembra del oxiuro, Enterobius vermicularis. emigra desde el colon a la piel penanal, donde deposita sus tpicos huevos fecundados. Los huevos, y a veces los gusanos adultos, se pueden detectar por el examen de un trozo de adhesivo de celofn o con los equipos comerciales de recoleccin de pegado en la piel perianal. Los huevos o los adultos no suelen encontrarse en las heces, por lo que se considera una muestra inapropiada para la deteccin de este parsito. Las muestras se deben tomar por la noche, cuando los gusanos son activos, o a primera hora de la maana, antes de la ducha o de la deposicin. Se deben examinar vanas muestras de diferentes das antes de descartar infeccin. Estudio de los huevos. L a estimacin de la carga de gusanos es a veces necesaria para evaluar la eficacia teraputica o la tasa de reinfeccin por nematodos intestinales (Ascaris. Trichuris y uncinarias) y. ocasionalmente, esquistosomas. Los procedimientos incluyen el mtodo de extensin

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directa de Beaver. recuento de huevos con la dilucin de Stoll, frolis grueso de Kato y diversas modificaciones (Ash. 1984; Beaver. 1984: Garca, 1997). Hay grandes variaciones en los resultados con estos estudios, y la significacin clnica del nivel de recuento de huevos varia segn la especie infectante, la edad de la persona y el estado nutricional (Beaver, 1984). Los mtodos de incubacin de huevos se usan para detectar la presencia de esquistosomiasis en infecciones leves y para determinar su viabilidad. Los huevos fecundados de esquistosomas contienen un miracidio que se incuba en varias horas tras ser colocados en agua sin cloro. En la prctica, la orina o las heces se mezclan con diez partes de agua y se colocan en un matraz de Erlenmeyer. La parte superior del vaso se tapa con papel de plata y se coloca bajo una lmpara de mesa. Los miracidia incubados son muy fototrpicos y se acumulan cerca de la luz. Los huevos, si los hay. pueden ser examinados por su viabilidad, mediante el estudio de los movimientos ciliares dentro de las clulas llama (excretoras). Cultivo de nematodos y tcnicas de deteccin. Se usan muchas tcnicas de cultivo (coprocullivos) para la deteccin e identificacin de los distintos nematodos infectantes, entre los que se cuentan el cultivo con filtro de papel Harada-Mori, el cultivo en filtro de papel inclinado y el cultivo en carbn vegetal (Ash, 1984; Beaver 1984: Garcia, 1997). La diferenciacin entre lombrices y tricostrongiles segn la morfologa de los huevos es difcil, mientras que la larva en fase infectiva es mas fcilmente identificable. Tales tcnicas de cultivo pueden tambin ser tiles para la deteccin de larvas de Strongyloides. que pueden estar en escaso nmero, y para diferenciarlas de las lombrices uncinarias. Con todos los mtodos de cultivo, las heces son incubadas en un ambiente hmedo que permite lograr la incubacin de los huevos. En las tcnicas de arada-Mori y del filtro de papel inclinado, las larvas emigran desde las heces a la fase acuosa, donde se pueden detectar con ms facilidad. En el cultivo del carbn vegetal las larvas migran primero a una gasa hmeda que se coloca en agua, permitiendo su colonizacin. La tcnica de Baermann es una tcnica sensible y fiable para la deleccin de Strongyloides y otras larvas de nematodos a partir de muestras fecales. En esta tcnica, las heces se colocan en varias capas de gasas en la parte superior de una pantalla de alambre que se suspende en un embudo. El extremo del embudo est cerrado con una abrazadera y se aade agua hasta el nivel de la gasa. Las larvas emigran activamente a travs de

las gasas y se depositan en la base del embudo, donde se pueden recoger para su examen. La recuperacin de larvas puede ser superior a la tcnica de cultivo, ya que examina una gran cantidad de heces. En las infecciones latentes por Strongyloides. en las que hay pocas larvas, pueden requerirse varios exmenes a lo largo de una semana para demostrar la infeccin (Ash. 1987).

Objetos semejantes a parsitos entricos

Hay una gran variedad de objetos que pueden parecerse a diferentes parsitos y que se pueden ver en las heces y en otras muestras enviadas para examen. Es necesaria una cuidadosa diferenciacin de estos objetos para evitar un innecesario o inadecuado tratamiento. Los leucocitos, los macrfagos y las clulas epiteliales, escamosas y columnares s e pueden asemejar a las amebas; la levadura y los granulos de fcula pueden parecerse a quistes de protozoos; las conidias fngicas y plenes pueden confundirse con huevos helmintos: las fibras o la piel de las plantas pueden simular larvas de nematodos, y los trozos de vegetales parecerse a gusanos adultos o progltides. (Tabla 55-4). Los ejemplos de artefactos y seudoparsitos se pueden revisar en otros textos (Ash, 1997; Garcia. 1997; Isenberg, 1992; NCCLS, 1997).

Examen de muestras urogenitales y otras muestras (esputos, aspirados y biopsias)

Los productos vaginales y uretrales, secreciones prostticas u orina se pueden remitir a laboratorio para la deteccin de Trichomonas vaginalis. El mtodo ms rpido y efectivo es la preparacin de varias extensiones con una gota de muestra (se debe centrifugar la orina) diluida con una gota de suero salino y cubriendo con un cubreobjetos. Se examina con un objetivo de bajo aumento (10x) en condiciones de poca luz para ver los trofozotos mviles, que poseen un movimiento espasmdico. Los exmenes con gran aumento pueden revelar el movimiento de los flagelos y las caractersticas ondulantes de las membranas. El uso de cultivo, anticuerpos fluorescentes, o tcnicas de cido desoxirribonucleico (ADN) aumenta la sensibilidad si es necesario (Briselden, 1994). Se precisan cultivos de los organismos para demostrar las resistencias a los frmacos imidazlicos (Meri, 2000). En el esputo se pueden hallar un gran nmero de protozoos y helmintos, y la tcnica a usar depende del organismo sospechado. Generalmente la tcnica requerida para detectar un parsito en su sitio habitual se aplica al esputo. Cuando se sospechan amebas, se deben hacer tinciones permanentes. Son apropiadas las tinciones cido-resistentes o anticuerpos especficos para Cryptosporidium. mientras que las tinciones tricromo o lluorocromo se deben emplear para detectar esporas de microsporidios. Las tcnicas de identificacin para Pneumocystis carinii se describen en otro apartado. Para el examen de aspirados se necesita el empleo de las tinciones adecuadas para el germen implicado. Adems de los mtodos utilizados para espulo, la tincin de Giemsa es habitualmente apropiada para el examen de protozoos, especialmente los hemoflagelados. Los biopsias se deben remitir para estudio histolgico tras haberse hecho extensiones y tras ser preparadas para la tincin con Giemsa u otros tintes permanentes. El cultivo para leishmanias y tripanosomas tambin puede hacerse en tejidos y puede ser importante para demostrar estas infecciones. Las biopsias cutneas mandadas para Onchocerca o Mansonella deben separarse en salino y ser examinadas a los 30 y 60 minutos para microfilarias. La biopsia muscular para las larvas de Trichmella spiralis se debe examinar mediante la colocacin de las muestras frescas en dos portas de cristal o para estudio histolgico habitual. Las biopsias de recto o vejiga se pueden examinar para buscar huevos de esquistosomas.

Tabla 55-4

O b j e t o s e n c o n t r a d o s e n las m u e s t r a s fecales q u e p u e d e simular parsitos entricos Semejanza Quisles de Entamoeba histolytica Trofozoilos de Entamoeba histolytica Trofozoilos de amebas Trofozolos de amebas Quistes de protozoos (especialmente Endolimax nana) Huevos de helmintos Huevos de helmintos Quistes de protozoos, huevos de helmintos Larvas nematodos Huevos de helmintos (Ascaris o huevos de tenia) Huevos de helmintos Quistes de protozoos

Tipo de artefacto Neutrfilos Macrfagos Clulas del epitelio columnar Clulas del epitelio escamoso Levaduras Conidias do hongos Esporas de champin Clulas de plantas Hebras de plantas Polen Ditomos Granulos do fcula, gotas de grasa, burbujas de aire, moco Huevos de caros ingeridos Huevos ingeridos de nematodos de las plantas Larvas ingeridas de nematodos de las plantas

Huevos de helmintos Huevos de helmintos Larvas de nematodos

Tcnicas de cultivo parasitario

Se han descrito mtodos de cultivo para una gran variedad de protozoos, pero pocos laboratorios qumicos se toman el esfuerzo debido a su

Adaptada de Isenberg HE (ed): Clinical Microbiology Procedures Handbcok. vols t y 2. Washington. DC. American Society for Microbkxgy, 1992

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Tabla 55-5

P r u e b a s de anticuerpos, antigenos y A D N para el diagnstico de e n f e r m e d a d e s parasitarias* Mtodos serolgicos Mtodo de deteccin de antigenos o A D N EIA

Enfermedad parasitaria Protozoos Amebiasis Babesiasis Enfermedad de Chagas Criptosporidosis Giardiasis Leishmaniasis Malaria Toxoplasmosis Trichomoniasis Helmintos Triquinisosis Toxocariasis Estrongiloidiasis Filariasis Cisticercosis Equinococosis Esquistosomiasis Paragonimiasis

DD, EIA, IHA IFA CF, EIA, IFA, IHA

mosis o la toxocariasis no se pueden diagnosticar fcilmente por criterios morfolgicos, y los estudios invasivos no se recomiendan en primera medida. Las diarias, los esquistosomas y Strongyloses pueden permanecer subclinicas debido a infecciones leves o al estadio de la latencia clnica. En esas circunstancias, la evaluacin serologica puede resultar til, especialmente en individuos que han viajado a zonas endmicas sin residir en ellas. Ya que los test serolgicos se piden rara vez, las muestras se remiten a laboratorios de referencia (centros para el control y prevencin de enfermedades [CDC]). Algunos de los tesl ms comnmente usados pueden estar disponibles en centros locales, entre los que se incluyen toxoplasmosis, amebiasis y triquinosis. Los criterios de interpretacin vienen establecidos por los fabricantes, y los reactivos pueden variar en los diterentes centros. Las peticiones individuales de estos test deben cuestionarse acerca de las caractersticas de realizacin, incluyendo sensibilidad y especificidad, y deben estar sobre aviso de que pueden producirse reacciones cruzadas. Adems, las serologas de las enfermedades parasitarias no diferencian entre infeccin activa e infeccin pasada, punto impodante cuando se estudia a alguien que ha residido en reas endmicas. Hay mtodos de deteccin antgena disponibles para muchas enfermedades parasitarias que incluyen amebiasis, criptosporidiosis, giardiasis, malaria, y tricomoniasis (Tabla 55-5) y pueden ser tiles en aquellos casos en que los test tradicionales son negativos y persiste una alta sospecha clnica Estos estudios tienen la ventaja de detectar la infeccin actual y pueden ser realizados por personas sin demasiada experiencia (Wilson, 1995).

EIA. DFA. IFA EIA. DFA, IFA CF IFA IFA EIA. IFA, IHA IC DFA. IP EIA, DFA. prueba de ADN

EIA. BF, IHA EIA EIA IHA EIA, IHA EIA, IHA. IB IHA. IEP. DD (arcS), IB EIA. IB EIA. IB

" Equipos disponibles en comercios o en laboratorios de referencia o de salud

publica. BF lloculacion do benlonila. CF fijacin de complemento. DA aglutinacin directa; DD difusin doble: DFA: anticuerpos de fluorescencia directa; EIA: enziomoinmunoensayo; IB mmunoblotl, IC inmunocaplura: IHA hemaglutinacion indirecta; IFA: anticuerpos de fluorescencia indirecta, IP inmunoperoxidasa: IEP: inmunoeleclroloresis Adaptada de Wilson M, y Schantz P. Pieniazek, N Diagnosis ol parasitic infections: Inmunologic and molecular methods En Murray PR. Barron EJ. Pfaller y cois (eds ) Manual of Clinical Microbiology, 6 ' ed Washington, DC. ASM Press. MA. 1995. p 1.159.

Mtodos de diagnstico molecular

El uso de mtodos diagnsticos mediante la amplificacin de ADN y cidos nucleicos se ha descrito para la mayora de las enfermedades parasitarias ms frecuentes y tiene una gran sensibilidad y especificidad (Persing, 1993; Weiss, 1995; Wilson, 1995). Sin embargo, la mayoria de estas tcnicas han permanecido para un uso de investigacin y no estn disponibles para uso habitual (Bendall. 1993). Como dato, el equipo y otros materiales necesarios, incluido el personal entrenado en biologa molecular, han permanecido fuera del alcance de la mayora de los laboratorios de diagnstico debido a limitaciones fiscales. Aunque hay gran variedad de equipos disponibles para el diagnstico de bacterias y virus, slo un equipo ha recibido la aprobacin para un parsito como es Trychomonas vaginalis (Briselden. 1994). Los mtodos moleculares pueden tener una gran importancia en la identificacin de los vectores de los parsitos y contribuir a la prevencin mediante programas de control contra dichos vectores (Weiss. 1995).

escaso empleo y a la pobre familiaridad con dichos mtodos. Cuando se hace una peticin de cultivo suele ser para Trichomonas vaginalis. Leishmania spp., Trypanosoma cruzy, Enlamoeba histolytica. Acanlhamoeba spp o Naeglena lowlen. Adems, ocasionalmente se pide a los laboratorios cultivos para Toxoplasma gondii. Una revisin de los mtodos se puede encontrar en otros textos (Ash. 1987; Fritsche, 1989a: Garcia. 1997: Isenberg. 1992; Murray. 1999: NCCLS. 1997).

Mtodos de inmunodiagnstico Control de calidad, de mejora y seguridad

Los mtodos de inmunodiagnstico para la deteccin de anticuerpos o antigenos en las enfermedades parasitarias son muchos, pero tienen gran variabilidad de sensibilidad y especificidad, as como de disponibilidad. El tema est ms all del propsito de este captulo, pero se puede encontrar una revisin asequible (Wilson, 1995). Los test disponibles para uso sanitario, hospitalario o comercial se resumen en la Tabla 55-5. Histricamente, los procedimientos serolgicos para enfermedades parasitarias eran desestimados por su baja sensibilidad y especificidad, debido principalmente a la compleja naturaleza antignica de los parsitos y la posibilidad de reacciones cruzadas entre las especies descritas. La introduccin de nuevos test, combinados con el uso de componentes altamente antignicos. est dando mejores resultados con grandes valores predictivos. La mayora de los nuevos test utilizan el enzimoinmunoensayo (EIA) o el inmunoblot (Western blot), aunque an son populares la inmunofluorescencia indirecta (IFA), la hemaglutinacin indirecta (IHA). la fijacin de complemento (CF) y la lloculacion de bentonita (BF). El uso de test serolgicos en el diagnstico de enfermedades parasitarias es un suplemento a los mtodos habituales de diagnstico que intentan detectar el parsito de un modo directo en las heces, la sangre, los tejidos o los Huidos corporales. Ciertas infecciones como la toxoplasEl programa de segundad para la seccin de parasitologa del laboratorio es semejante al de otras secciones del laboratorio, cubriendo todos los aspectos esenciales del trabajo, incluidos, entre otros, un manual del proceso completo que debe ser revisado anualmente, guias de mantenimiento de todas las muestras y de recogida de datos, as como de los resultados, programa completo de control de calidad con la apropiada supervisin tcnica y revisin, y la participacin en programas de competencia. Los laboratorios tambin necesitan centrarse en la satisfaccin del cliente, mediante la participacin en el equipo de trabajo con cuestionarios de opinin, en la identificacin de problemas y en la generacin de soluciones para la mejora de calidad. Para el rendimiento de la seccin de parasitologa, se deben monitorizar peridicamente muestras desconocidas, tanto internas como extemas, y se debe actualizar la competencia, especialmente en aquellos laboratorios con escaso volumen de muestras. Debe existir un material de referencia disponible para el uso del laboratorio que incluya muestras positivas, atlas impresos y atlas de preparaciones. Se deben considerar potencialmente infecciosas las muestras sin preservar. Toda la sangre y fluidos corporales se deben manejar de acuerdo

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con las normas universales de precaucin realizadas por la administracin de salud y seguridad laboral (Federal Register, 1991). Adems de los virus de transmisin sangunea, los parsitos de la malaria y los hemoflagelados tambin pueden ser infecciosos. Una gran cantidad de parsitos pueden seguir siendo infectivos en muestras de heces frescas, como los quistes de protozoos entricos, los huevos de Taenia sotium. Enterobius vermiculars H. nana, y las larvas de Strongyloides stercoralis. Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides y las uncinadas pueden persistir infectivas en muestras antiguas, y los huevos de Ascaris pueden sobrevivir en formalina al 5%. Las muestras fecales tambin pueden contener patgenos como Salmoneiia, Shigella o virus, Es esencial una observacin cuidadosa del manejo de las muestras. Tambin es necesaria una especial atencin al lavado de las manos. En uso de etil actico en vez de ter en las tcnicas de concentracin es recomendable para evitar la posibilidad de explosin (Truant, 1981).

zontes y merozotos (Fig. 55-1). En el torrente sanguneo algunos merozotos se diferencian en gametocitos (gametogonias), que. cuando son digeridos por un mosquito hembra de Anopheles, maduran a microgametos masculinos y macrogametos femeninos. La lusin de un microgameto y un macrogameto da lugar a un oocineto mvil que emigra a travs de la pared de estmago y forma un ooquiste. Dentro del ooquiste se forman numerosos esporozotos mviles. La ruptura del ooquiste maduro en la cavidad corporal libera esporozotos que emigran a travs de los tejidos de las glndulas salivares, desde donde pasan a huspedes vertebrados cuando el mosquito se alimenta. El tiempo requerido para el desarrollo en el mosquito es de 8-21 das. Los esporozotos en los vertebrados alcanzan las clulas hepticas en pocos minutos e inician una fase de proliferacin conocida como esquzogonia exoeritrocitaria. La liberacin de merozotos tras la ruptura de los esquizontes hepticos o la ruptura de esquizogonias eritrocitaras produce la infeccin del torrente circulatorio, causando la clnica de la malaria. P. vivax y P. ovlese diferencian de P. lalciparum y de P. malariae en que las recadas por especies antiguas pueden producirse semanas o meses despus tras el primer brote. Esto es consecuencia de la renovacin de las esquizogonias exoeritrocilarias, y a veces eritrocitaras. a partir de esporozotos hepticos latentes que se conocen como hipnozoitos (Krotoski, 1982). Las recurrencias debidas a P. lalciparum o P. malariae, llamadas recrudescencias, se deben a un incremento en el nmero de formas sanguneas hasta niveles clnicamente detectable, no a formas hepticas persistentes. Los hepatocitos se infectan slo por esporozotos a travs del mosquito, de este modo la infeccin por P. vivax o P. ovale adquiridas por transfusin no recidivan. Los merozotos liberados de los hepatocitos afectados infectan a los eritrocitos. La consiguiente amplificacin del parsito en el torrente sanguneo durante un tiempo y su aparicin sincrnica desata las crisis de malaria. Los parsitos de P. vivax y P. ovale infectan a los eritrocitos jvenes, mientras que P. malariae infecta a los viejos y P. falciparum a los eritrocitos de cualquier edad. Los estadios morfolgicos observados en los eritrocitos incluyen trofozoitos (formas en crecimiento), esquizontes (formas en divisin) y gametocitos (formas sexuales) (Lminas 55-1 a 55-4). Los trofozotos ms jvenes tienen un contorno globuloso o con una vacuola central, una masa de cromatina roja y un citoplasma azul. En frotis teidos, los trofozotos se asemejan a anillos de sello y se describen como anillos o con forma anular. Los trofozotos en crecimiento tras la fase de anillo mantienen una nica masa de cromatina, pero tienen un citoplasma abundante que puede ser compacto o ameboide (irregular). Los trofozotos maduros an poseen una nica m a s a de cromatina y un grandsimo citoplasma que rellena parcialmente el eritrocito. El pigmento hemozona (hematina), un derivado de la hemoglobina, e s caracterstico de todos los eritrocitos que contienen formas maduras de la malaria, pero no se detecta en las formas anulares. Los esquizontes inmaduros tienen dos o ms masas de cromatina y un citoplasma sin dividir, mientras que los maduros poseen tanto el citoplasma como la cromatina divididos, de tal modo que los merozotos son evidentes. Los esquizontes maduros rompen el eritrocito, liberando merozotos e iniciando un nuevo ciclo de infeccin. El ciclo eritrocitario se realiza en 48 horas aproximadamente (periodicidad terciana) para P. falciparum. P. ovale y P. vivax, y en 72 horas (periodicidad cuartana) para P. malariae. En algunos momentos de la infeccin una subpoblacin de merozotos se transforma en gametocitos. Los de P. vivax, P. malariae y P. ovale son redondeados, mientras que los de P. falciparum son alargados (forma de salchichas). Caractersticamente, los macrogametocitos (femeninos) poseen una masa compacta de cromatina, mientras que los microgametocitos (masculinos) la tienen ms dispersa. Los gametocitos en desarrollo son ms compactos que los trofozotos en crecimiento. Epidemiologa. L a transmisin endmica de la malaria requiere un reservorio, un mosquito vector y un husped susceptible. El control de la malaria se dirige a la eliminacin del mosquito, al tratamiento de los casos activos y a la profilaxis de personas susceptibles. Sin embargo, la aparicin de resistencias a los insecticidas por parte de los mosquitos y de la resistencia al tratamiento y profilaxis por parte de P. falciparum. y recientemente por P. vivax (Murphy, 1993), y la falta de recursos hacen difcil el control en muchas zonas.

PROTOZOOS SANGUNEOS Y TISULARES Malaria

La malaria (del italiano malaria, que significa mal aire) es una infeccin aguda y a veces crnica del torrente sanguneo que se caracteriza por fiebre, anemia y esplenomegalia, y es provocada por parsitos apicomplejos del gnero Piasmodium. Los hallazgos clnicos defimloros de un ataque de malaria consisten en escalofros, fiebre (mayor de 40 C), diaforesis generalizada, seguidos por el cese de la fiebre. Las crisis se producen cada 610 horas y se desatan por la ruptura sincrnica de eritrocitos, de los que se libera una nueva forma infecciosa conocida como merozoito. La enfermedad se produce generalmente entre los 45" norte y 40 sur de latitud (WHO, 1987) y se transmite nicamente por mosquitos Anopheles hembra. Las cuatro especies de Piasmodium que producen la malaria humana son P. vivax. P. lalciparum. P. malariae y P. ovale. La infeccin por P. falciparum se da principalmente en zonas tropicales de todo el mundo, mientras que las infecciones por P. vivax se producen tanto en zonas tropicales como templadas. P. malariae tambin se da en todo el mundo, pero mucho menos extendido que P. lalciparum o P. vivax. P. ovale es el menos frecuente de la malaria, siendo la mayora de los casos en el oeste de frica, India y Sudamrica.
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Dado que la infeccin de la malaria es potencialmente tratable, se debe considerar en el diagnstico diferencial de la fiebre de origen desconocido y en historia de viajes a zonas endmicas. En una era de creciente empleo de los viajes por todo el mundo, el riesgo de contraer malaria no es insignificante, y la rpida extensin de las resistencias a los frmacos se debe considerar a la hora de valorar una profilaxis o un tratamiento. La evaluacin del laboratorio ante la sospecha de la malaria sigue basndose en el examen de los frotis grueso y fino de la sangre, para objetivar los parsitos intraeritrocitarios. Aunque su aproximacin diagnstica es sencilla, la realizacin de estas tcnicas puede ser problemtica. La identificacin de este organismo requiere un entrenamiento continuo para mantener la experiencia, por lo que los laboratorios que no suelen ver muchos casos pueden optar por mandar las muestras a laboratorios de referencia. Otros mtodos ms avanzados de laboratorio, incluidas la tincin naranjaacridna (vase Mtodos de laboratorio) o la deteccin del ADN especfico (Lanar, 1989; Persing. 1993; Weiss, 1995), dan una mayor sensibilidad y especificidad pero no suelen estar disponibles en laboratorios pequeos. El reciente desarrollo de los ensayos inmunolgicos para la deteccin de lactato deshidrogenasa especfica de Piasmodium parece dar una alta sensibilidad y especificidad en el diagnstico de la malaria. Uno de estos test, realizado con una tira de reactivo, es especialmente prometedor en aquellas situaciones donde la facilidad de la realizacin de los estudios es crtica y hay escasez de medios (Piper, 1999; Palmer. 1998). Ciclo vital. Los parsitos de la malaria tienen una fase sexual (esporogonia) en el mosquito Anopheles. que produce esporozotos infecciosos, y un estado asexual (esquzogonia) en los humanos que deriva en esqui-

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Figura 55-1. Ciclo de vida del parsito de la malaria (Cortesa del CDC. Parasitology Training Branch. Atlanta. GA.)

Los negros con anemia falcilorme son menos susceptibles a la malaria por P. falciparvm. y las personas que carecen del grupo sanguneo Duffy estn protegidas contra la infeccin por P. vivax (Miller. 1976). El dficit de glucosae-fosfato deshidrogenasa (G6PD) se ha asociado a una proteccin contra la malaria, pero la evidencia est menos demostrada que con las otras anomalas hereditarias. La malaria secundaria a transfusin puede producirse cuando el donante padece una malaria subclnica. y puede resultar mortal para el receptor. Del mismo modo, puede darse una malaria congnita en nios nacidos de madres de zonas endmicas. Los nios la adquieren durante el nacimiento a causa de la rotura de los vasos placenlarios en una transfusin malerno-fetal. Ni en

la malaria congnita ni en la secundaria a transfusin se esperaba que existieran recadas, ya que no se forman esquizogonias exoeritrocitarias El nmero de casos de malaria en EE.UU. aument de 151 en 1970 a 1.838 en 1980, pero descendi a 1.411 en 1993 (CDC. 1988,1993). Las especies causantes de la infeccin en 1987 fueron P. vivax (44%), P. falctparum (43%), P. malariae (4%). P. ovale (3%) y un 6% indeterminado. El intervalo entre la llegada a EE.UU. y el desarrollo de la enfermedad fue menos de un mes para el 25% de los casos de P vivax y del 80% de los casos por P. lalciparum. Slo un 3% de los pacientes desarrollaban la enfermedad tras un ao. Los ciudadanos de EE.UU. adquirieron la infeccin en frica (63%), Asia (18%). hemisferio occidental (14%) Oceana (4%).

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Enfermedad clnica. La mayora de los pacientes con infeccin por P. lalciparum desarroll los sntomas en menos de un mes tras la exposicin, mientras que esto poda ser mayor de seis meses con otras especies de Plasmodium. Los sntomas comunes de malaria incluyen escalofros y fiebre, que suele asociarse a esplenomegalia. En los estadios precoces, los episodios febriles son irregulares, pero luego se van haciendo ms sincrnicos, tomando la periodicidad terciana (P. vivax. P. falciparum y P. ovale) o cuartana (P. malaria). Los pacientes pueden tener anemia y otras manifestaciones como diarrea, dolor abdominal, cefalea y mialgias. La malaria por P. falciparum puede producir mucha parasitemia (50%). llegando a producir hemolisis grave, hemoglobinuria y gran anemia. Los eritrocitos infectados por trofozotos en crecimiento y esquizontes de P. falciparum tienden a ser secuestrados en capilares, pudiendo llegar a ocluirlos, causando clnica asociada y anoxia tisular. La afectacin cerebral se conoce como malaria cerebral, produciendo desorientacin, delirio, coma y. frecuentemente, la muerte. En las infecciones graves por P. falciparum las transfusiones pueden salvar la vida (Nielson. 1979; Organizacin Mundial de la Salud [OMS], 1987). La evolucin de la malaria sin tratamiento depende de la especie causal. La mayoria de los casos fatales se deben a P. falciparum. En los restantes casos, las crisis febriles pueden ir siendo progresivamente menos graves y desaparecer gradualmente. Los pacientes con infeccin por P. vivax o P. ovale pueden sufrir recada tras meses o incluso tras aos. Los pacientes con infeccin por P falciparum y P. malariae pueden tener perodos asintomticos y sufrir recada debido a la presencia de parasitemia de bajo grado. Las recadas y reagudizaciones se pueden asociar con cambios en la inmunidad del husped o con cambios antgnicos en los parsitos. Las extensiones perifricas pueden mostrar leucocitos con pigmento malrico. Un aumento del nmero de reticulocitos se debe al rpido recambio eritrocitario. Se puede detectar la presencia de grandes plaquetas alargadas en la sangre perifrica debido a un rpido recambio, secundario a un secuestro esplnico, La infeccin por malaria puede interferir con otros test serolgicos, produciendo falsos positivos, especialmente con los de la sfilis. El tratamiento y profilaxis de la malaria puede ser difcil debido a aparicin de resistencias a la cloroquina por P lalciparum. as como otros antipaldicos, y a la menos extendida resistencia a la cloroquina por P. vivax. Tambin, personas que han adquirido P. vivax o P. ovale, o que han pasado mucho tiempo en zonas muy endmicas para estos parsitos, requieren tratamiento con primaquna para erradicar los hipnozotos y prevenir as las recadas. El uso de primaquna puede ser peligroso en los dficit de G6PD y se debe realizar un screening previo antes de empezar el tratamiento. Diagnstico. Se debe incluir a la malaria en el diagnstico diferencial de fiebre en pacientes que han viajado o residen en zonas endmicas, drogadictos o gente que ha recibido transfusiones. El diagnstico suele hacerse por la deteccin de parsitos en frotis de sangre finos y gruesos. Las muestras de sangre se deben tomar preferiblemente justo antes del pico febril o tras el pico febril. A veces es necesaria la toma de muestras separadas varias horas para detectar la infeccin e incluso la especie, ya que el nmero y fase de los parsitos varan segn el ciclo. Un cuidadoso examen de los frotis gruesos revelara la presencia de parsitos en casi todos los pacientes con clnica de malaria. La identificacin de parsitos de la malaria en los frotis finos requiere un abordaje sistemtico. Hay tres factores principales a tener en cuenta: la aparicin de eritrocitos infectados, la aparicin de parsitos y los estadios hallados. En la Tabla 55-6 se resumen las caractersticas diagnsticas de las especies que se ilustran en las Lminas 55-1 a 55-4. Los eritrocitos infectados por P vivax o P ovale suelen estar aumentados de tamao en comparacin con los que les rodean, mientras que los parsitos P. malariae y P. falciparum suelen encontrarse en eritrocitos de un tamao normal. Ms del 20% de los eritrocitos con P. ovale pueden ser ovales o con fimbrias (proyecciones irregulares en los mrgenes de la clula), mientras que menos del 6% de los eritrocitos infectados por P vivax son ovales. Pueden verse numerosos granulos rosas uniformes dentro del eritrocito (granulos

de Schffner) en las clulas infectados con P vivax y P. ovale, aunque pueden no ser evidentes en las clulas infectadas con formas tempranas o en extensiones que no se han teido al pH apropiado (vase previamente en Mtodos de laboratorio). La presencia de granulos de Schffner es til, ya que no se ven en P malariae y P falciparum. Mientras los trofozotos crecen en las clulas infectadas, la cantidad de hemoglobina en el eritrocito disminuye y se acumula pigmento de hemozona. La cantidad y aspecto del pigmento varan segn la especie. Las formas anulares de todos los parsitos pueden ser similares si solo se encuentran formas anulares, impidiendo diferenciar las especies. Los anillos jvenes de P. falciparum son ms pequeos que los de las otras especies (un sexto del dimetro de la clula roja, en comparacin con un tercio del dimetro de la clula roja de las otras especies). Los anillos de P. falciparum que han crecido son similares en tamao a los de oirs especies. Los trofozotos que yacen en la superficie del eritrocito o que protruyen se denominan formas apliqu o accol. y se ven ms frecuentemente en infecciones por P. falciparum. La presencia de clulas doblemente infectadas y doble punteado de cromatina en los trofozotos en anillo es ms frecuente en P falciparum. pero puede producirse en las dems especies. Los trofozotos en crecimiento de P vivax tienen una forma irregular y se denominan ameboideas. Los de P. malariae y P. ovale permanecen compactos. Los trofozotos y esquizontes maduros de P. falciparum suelen ser secuestrados en el lecho capilar por adherencia a las clulas endoteliales. por lo que no se ven en sangre perifrica excepto en infecciones graves. Cuando se detectan esquizontes en la sangre perifrica, la determinacin del nmero de merozotos puede ser til para dilerenciar las especies. Los gametocitos de P. falciparum son fcilmente identificables por su forma caracterstica en salchicha. Los gametocitos de P. vivax, P. malariae y P. ovale son similares y difciles diferenciar, aunque las caractersticas de la clula roja infectada pueden ayudar. La variedad de los estadios en la sangre penfrica puede ser til. En la deteccin de infecciones por P. falciparum predominan las formas en anillo, y el hallazgo de numerosas formas en anillo sin otras formas maduras es u n a evidencia de infeccin por P falciparum. En las infecciones por P. vivax. P. malariae y P ovale se encuentran diferentes estadios de parsitos con algn predominio, dependiendo de la fase del ciclo. Para la deteccin de la malaria se prefieren frotis gruesos, ya que se examina mayor cantidad de sangre (vase previamente en Mtodos laboratorio). Las formas en anillo suelen tener la apariencia de signos de puntuacin ms que de anillos completos, y debe buscarse la presencia de cromatina roja y citoplasma azul para identificarlos como parsitos. Los granulos de Schffner pueden ser tiles para la identificacin y se deben reconocer alrededor de los trofozotos en crecimiento como un halo rosa. El carcter ameboide de los trofozotos de P vivax no es tan evidente en los frotis gruesos, pero es til el nmero de merozotos en los esquizontes maduros. Los macro y microgametocitos pueden no ser diferenciabas. La forma distintiva en salchicha de los gametocitos de P falciparum es an evidente, sin embargo puede ser ms estirado que en los frotis finos. Los gametocitos de otras especies se pueden detectar y diferenciar fcilmente de los ncleos celulares por la presencia de pigmento de hemozoina de refraccin. Pueden producrise infeccin m i x t a (en aproximadamente el 5 % de las veces), pero se debe ser prudente a la hora de hacer el diagnstico, a menos que exista evidencia de dos poblaciones claramente separadas de parsitos. La mezcla ms comn es la infeccin por P falciparum y P. vivax. El hallazgo de gametocitos de P falciparum en una persona claramente infectada con P. vivax es diagnstico. Hay mltiples artefactos que pueden simular parsitos en el frotis. Los ms frecuentes en los frotis finos son las plaquetas superpuestas a los glbulos rojos. Estas plaquetas se pueden identificar fcilmente porque no tienen una autntica forman anillo y no muestran diferencia de la cromatina y de citoplasma y, adems, no contienen pigmento. Se pueden confundir grupos de bacterias o plaquetas con esquizontes. A veces, masas de plaquetas pueden asemejarse a gametocitos de P. lalciparum, pero no muestran el colorante diferencial o el pigmento. Tambin se pueden confundir con parsitos los grumos de colorante, las bacterias contaminantes o las esporas.

Tabla 55-6 Comparacin de las especies de Plasmodium que afectan a los humanos Apariencia del eritrocito Especies Plasmodium vivax Tamao Granulos del eritrocito En todos los estadios excepto en las formas precoces de anillo (Rara vez se ven los puntos de Ziemann) Citoplasma Irregular, ameboide en los trofozotos. Tiene apariencia "extendida" Redondo, trofozotos compactos con citoplasma denso. Trofozotos con forma de banda ocasionalmente Apariencia del parsito Pigmento Marrn dorado, poco llamativo Nmero de merozoitos 12-24, la media es 16 Estadios hallados en sangre perifrica Todos los estadios La mayora de los estadios pueden verse en el mismo frots

Plasmodium malariae

Aumentado. La talla mxima alcanzada por los trofozotos y esquizontes puede ser 1-2 veces el dimetro normal Normal

n >
c
r-

Marrn oscuro, basto, llamativo

6-12, promedio Todos los estadios. La gran de 8: a veces variedad de los estadios se ven esquizontes no suele verse. Relativamente pocos anillos en "roseta o gametocitos presentes 6-14, promedio de 8 Todos los estadios

o
en
C7!

Plasmodium ovale

Plasmodium falciparum

Aumentado. Tamao mximo + V*-V veces el dimetro En todos los estadios excepto del eritrocito. en las formas de anillo Aproximadamente el 20% o ms tempranas de los eritrocitos infectados son ovalados y/o fimbriados el borde tiene proyecciones irregulares Normal. Los eritrocitos infectados son normales (Ocasionalmente se ven puntos de Maurer)

>

Redondo, trofozotos compactos Marrn oscuro. A veces levemente ameboide. llamativo Los trofozotos en crecimiento tienen grandes masas de cromatina

9
O

Los anillos jvenes son pequeos, delicados y frecuentemente con doble punteado de cromatina Los gametocitos estn alargados

Negro. 6-32. Basto y llamativo promedio 20-24 en los gametocitos

Anillos y/o gametocitos. Otros estadios se desarrollan en los vasos sanguneos u rganos internos, pero no en la sangre perifrica, excepto en infecciones graves

>

De Smith JW Melvm DM. Onhel TC. y cols.: Diagnostic Parasitology-Blood and Tissue Parasites Chicago. American Society of Clinical Pathologists. 1976. con autorizaciOn

K5
O

-4

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MICROBIOLOGA MDICA

Los test serologicos para malaria son especficamente tiles para estudios epidemiolgicos y para la deteccin de donantes de sangre infectados. No obstante, estos test no estn capacitados para diferenciar entre infeccin actual o pasada. Hay test sensibles y especficos disponibles en el CDC de IFA que utilizan antgenos para las cuatro especies humanas (Wilson. 1995).

Babesiosis
Como el parsito de la malaria, los agenles de la babesiosis o piroplasmosis son protozoos apicomplejos extendidos por todo el mundo que infectan eritrocitos, produciendo enfermedades febriles de gravedad variable. A diferencia de la malaria, se transmite por garrapatas y hay una gran variedad de animales que actan como reservorio. La infeccin en EE.UU. se produce principalmente en estados del noreste y del medio oeste, donde el parsito de los roedores Babesia microli es el responsable de la infeccin (Herwaldt. 1995). /. capulahs es la garrapata vector. Estudios recientes han implicado a otra especie de Babesia, aun sin nombre (por el momento conocida como WA1), como causante de la enfermedad en el oeste de EE.UU. Se cree que este parsito, asociado con la enfermedad en Washington y California, se transmite por la garrapata de patas negras. Ixodes paciticus (Persing, 1995: Quick. 1993). En Europa, es el parsito canino Babesia divergens. transmitida por Ixodes ricinus. el que infecta a los humanos. El espectro clnico vara desde enfermedad latente y subclnica a hemolisis fulminante. Se han descrito fatalidades, especialmente en espleneclomizados o inmunosuprimidos. Las personas mmunocompetentes pueden tener sintomas similares a la malaria, como fiebre, escalofros, malestar general y anemia, aunque sin la caracterstica periodicidad. La investigacin de un brote por Babesia microli en la isla de Nantucket, en Nueva Inglaterra, mostr que algunos pacientes sinlomlicos portaron el parsito durante meses,

y otros mostraron evidencia serolgica de infeccin s m historia de enfermedad clnica (Ruebush, 1980). Otra evidencia es que la infeccin crnica subclnica puede ser infrecuente (Persing, 1995). El parsito se multiplica en los eritrocitos como esquizogonias, pero no produce gametocitos. Aunque los trofozoitos de muchas especies tienen forma de pera, en algn momento de su desarrollo los de S. microli suelen parecerse a delicadas formas anulares que pueden confundirse con las de la malaria, especialmente P. falciparum (Lmina 55-5A) (Healy, 1980). Los trofozoitos de Babesia se pueden diferenciar de los de la malaria por la presencia de mltiples anillos en una clula que pueden formar una tetrada (cruz de Malta) y por la ausencia de trofozoitos grandes en crecimiento y de los gametocitos. Tambin, las clulas de los infectados por Babesia carecen de pigmento de hemozoina, que est presente en las clulas infectadas por Plasmodium. La historia de residencia o viaje en zonas endmicas, o picadura reciente por garrapatas, puede sugerir infeccin por Babesia. Hay disponibles test serolgicos (IFA) para Babesia microtiy WA1 en el CDC con referencia a los departamentos de salud estatal. Los test serolgicos de malaria son negativos en la babesiosis. aunque pacientes con malaria pueden tener actividad cruzada con las serologas de Babesia (Wilson. 1995).

Hemoflagelados
Los hemoflagelados de humanos y animales son miembros del orden de los Kinetoplastida y se caracterizan por la presencia de un gran mitocondrin conocido como cinetoplasto, que contiene suficiente ADN para ser visto por microscopio de luz cuando se tien con Giemsa. Los dos gneros importantes en la patologa humana son Trypanosoma y Leishmania. Ambos se transmiten por artrpodos y tienen huspedes animales como reservnos.

Figura 55-2. Morfologa de los hemoflagelados.

CAPTULO 55

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Los cnetoplstdos tienen diferente morfologa dependiendo de su presencia en huspedes vertebrados, incluidos los humanos, o en sus vectores (Fig. 55-2). El estadio amastigote es esfrico, de 2 urn a 5 pm de dimetro, y posee un ncleo y cinetoplasto. Por definicin le falta un flagelo externo, aunque a nivel ultraestructural es aparente un axonema (parte inlracelular del flagelo) Los amastigotes se pueden encontrar en huspedes humanos o animales infectados con T. cruzo Leishmania spp.. donde se multiplican nicamente dentro de las clulas. El promastigote es un organismo alargado y delgado con un ncleo central, un cinetoplasto anterior y un axonema. y un flagelo libre que va desde el extremo anterior. Esta fase se da en el insecto vector de Leishmania y es la que se detecta en los cultivos. El epimastigote es similar al promastigote. pero el cinetoplasto est ms cerca del ncleo y posee una pequea membrana ondulada que acaba en un flagelo libre. Todas las especies de Trypanosoma que infectan a humanos toman la forma de epimastigote en el vector o en el cultivo. En el tripomasligote, el cinetoplasto est en el extremo posterior y el flagelo forma una membrana ondulada que se extiende a lo largo de la clula, acabando como un flagelo libre en el extremo anterior. La forma de tripomastigote se da preferentemente en el torrente sanguneo en el husped de mamferos infectados con Trypanosoma spp. Las fases infecciosas encontradas en los vectores formados a partir de epimascigotos se conocen como tnpomastigotes metacclicos

vida domstica, donde infectan a casas de pobre construccin, especialmente en zonas rurales. A la hora de alimentarse, las chinches defecan. Las heces contienen tripomastigotes infectivos que tras el rascado entran en el cuerpo por el punto de la picadura a travs de la mucosa intacta de la boca o la conjuntiva. La forma infectiva entra activamente cerca de las clulas tisulares, donde se transforman en amastigotes en divisin. Cuando las clulas infectadas se llenan de amastigotes, se transforman en tripomastigotes, seguido de la rotura celular. Los tnpomastigotes se liberan en la sangre perifrica alcanzando los tejidos distantes, donde comienza el ciclo reproductivo de novo. La enfermedad de Chagas puede causar infeccin aguda o crnica. La aguda es ms frecuente en nios menores de cinco aos y se caracteriza por malestar, escalofros, fiebre, hepatoesplenomegalia y miocarditis. El edema palpebral (signo de Romana) puede presentarse si la inoculacin se produce en la cara. El edema tisular en otras partes, tras la picadura de las chinches infectadas, se llama chagoma. En personas ancianas, el curso agudo es leve o frecuentemente asintomtico. En ambos casos, el paciente estar afectado de por vida Las manifestaciones crnicas de la infeccin, incluido el megaesfago, el megacolon y las alteraciones de la conduccin miocrdica. son debidas a la destruccin de las clulas efectoras del sistema parasimptico por autoanticuerpos. La infeccin s e puede transmitir por transfusiones, y las infecciones latentes pueden exacerbarse por nmunosupresin. El diagnstico en el estadio agudo se hace demostrando el parsito en frotis gruesos o finos de sangre, extensiones o en aspirados de los chagomas o de las adenopatias. Estas muestras tambin se pueden cultivar con el uso del medio Novy-MacNeal-Nicolle (Ash, 1987; Garcia, 1997; Vsvesvara, 1992c). En las reas endmicas se puede usar el xenodiagnstico (examen de contenido gstrico de chinches a las que se les ha permitido picar a un paciente). En los estudios en los estadios crnicos, el diagnostico serolgico es el mtodo de eleccin. El EIA. IFA y el test de CF estn disponibles, aunque no permiten diferenciar entre enfermedad aguda o crnica y pueden tener reaccin cruzada con pacientes con leishmaniasis.

Trypanosoma
Las infecciones por Trypanosoma incluyen las causadas por T. brucei (tripanosomiasis africana o del Viejo Mundo) y T. cruzi (tripanosomiasis americana o del nuevo mundo o enfermedad de Chagas). Ambas son de gran importancia en zonas endmicas, pero rara vez pueden verse en EE.UU. Una tercera especie. T. rangeti, se ha descrito en humanos en Amrica, pero no produce de enfermedad clnica. El tripomastigote del torrente sanguneo del grupo T. brucei (Lmina 55-5B) es mayor de 30 um de longitud, con unas curvas graciosas y un pequeo cinetoplasto. Los del T. cruzi son ms pequeos (20 um), tomando formas de S y C en los frotis teidos, y poseen un cinetoplasto ms largo. En frica ecuatorial, los parsitos del grupo T. brucei infectan tanto a humanos como a animales y se transmiten por la picadura de la mosca tsetse, del gnero Glossina. La proliferacin de los organismos en el punto de puncin produce un chancro transitorio. En el este de frica, la tripanosomiasis es causada por I brucei rhodesiense, que tiene un gran nmero de huspedes animales como reservnos. La enfermedad se caracteriza por un cuadro febril agudo rpidamente progresivo y adenopatias. La muerte del paciente se da tras la afectacin del sistema nervioso central. La infeccin en frica occidental es debida a T. brucei gambiense, que es el causante de la clsica enfermedad del sueo africana. L a enfermedad posee un curso crnico que empieza con fiebre intermitente, sudoracin nocturna y malestar. Pueden ser llamativas las adenopatias, especialmente las cervicales (signo de Winterbottom). Con el tiempo, acaba afectando al sistema nervioso central: somnolencia, confusion, fatiga y estupor progresivo, coma e incluso muerte. Los humanos son el principal reservono ante esta enfermedad (OMS. 1986). El diagnstico se debe sospechar con la historia geogrfica y los hallazgos clnicos. Se observa un aumento en la IgM total en sangre y el lquido cefalorraqudeo (LCR). Existe pleocitosis con 50-500 clulas mononucleadas/microlitro en el liquido cefalorraqudeo. El diagnstico se confirma por la demostracin de los parsitos en frotis sanguneos, tanto gruesos como finos, extensiones, aspiraciones de adenopatias o de la mdula sea, o en el centrifugado de lquido cefalorraqudeo teido con Giemsa (Cattand, 1988; Van Meirvenne, 1985). Los cultivos o la inoculacin en animales tambin pueden ser tiles si estuviesen disponibles. La tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas est causada por T. cruzi. En su forma selvtica, se da en EE.UU., Centroamrica y. sobre todo, en Sudamrica. La infeccin humana es comn en zonas de Mxico, Centroamrica y Sudamrica, donde se transmite por chinches de la familia de los Reduviidae. Los gneros y especies implicadas en la transmisin varian de un pas a otro y segn los diferentes nichos ecolgicos. Algunas de las chinches son responsables de mantener el ciclos selvtico en los reservnos animales, mientras que otras estn acostumbradas a la

Leishmania
La leishmaniasis es una enfermedad del sistema reticuloendotelial producida por protozoos cinetoplstidos del gnero Leishmania. Todas las especies que infectan a humanos tienen reservnos anmales y se transmiten por moscas que pertenecen a gnero Phlebolomus en el Viejo Mundo y Lulzomyia en el Nuevo Mundo. Los parsitos toman la forma de amastigotes en los mamferos y la forma de promastigotes en los insectos vectores. Las especies de Leishmania no se pueden diferenciar por examen de otros amastigotes o promastigotes. La leishmaniasis puede lomar diferentes formas clnicas: la forma cutnea, mucocutnea y visceral son las ms conocidas. La forma y gravedad varan segn la especie infectante, el estado inmune del husped y la exposicin previa (Peters. 1987: Strickland, 1999). Leishmaniasis cutnea. La leishmaniasis cutnea del Viejo Mundo (llaga oriental) se produce en el sur de Europa, norte y este de frica, Oriente Medio. Irn, Afganistn y el sur de Rusia. Las infecciones estn producidas por L tropica. L. major y L. aethiopica. aunque L. donovam y L. infantum tambin pueden producir lesiones cutneas. L. tropica causa la lcera urbana o seca, que es ms duradera que la rural o la lcera hmeda de L. major. Estas lceras suelen producirse en una zona expuesta del cuerpo y s e cura espontneamente. La infeccin deja inmunidad duradera. L. tropica puede llegar a ser viscerotrpica. tal como se demostr recientemente en personal militar que particip en la operacin Tormenta del Desierto (Magill, 1993). L. aethiopica produce una infeccin cutnea ms agresiva, que en algunos casos puede producir lesiones mucosas a distancia o leishmaniasis cutnea difusa, cuyo extremo se caracteriza por mltiples mdulos cutneos que se asemejan a la lepra lepramatosa. La leishmaniasis cutnea del Nuevo Mundo es causada por muchas especies, incluidos L. mexicana. L. braziliensis. L. amazonensis. L vene-

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zuelensis. L. garnhami, L. pifanoi. L. peruviana. L. panamensis y L. guyanensis. Las lesiones causadas por L. mexicana pueden afectar al lbulo de las orejas (lcera del chiclero), siendo autolimitada, y se desconoce su afectacin a distancia de las mucosas. Sin embargo, L. mexicana y L. amazonensis pueden causar lesiones cutneas difusas similares a las de L aethiopica. Existe un foco de leishmaniasis cutnea en el sur de Texas, donde las infecciones estn causadas por una o ms especies (Gustafson, 1985). L. peruviana, hallada en las pendientes occidentales de los Andes peruanos, causa una infeccin llamada uta. una lesin cutnea benigna que se da preferentemente en nios. L. peruviana se adquiere en las casas, donde los principales reservorios son los perros domsticos. Esta situacin epidemiolgica contrasta con otras leishmaniasis cutneas que suelen adquirirse en los bosques y tienen animales salvajes como reservnos. Leishmaniasis mucocutnea. La Leishmaniasis mucoculnea (espundia) es provocada por L. braziliensis y rara vez por otras especies causantes de lesiones cutneas ms agresivas, y a veces se disemina a membranas mucosas, especialmente la nasal, la oral y la farngea. En estas zonas puede producir lesiones desfigurantes por erosin de las partes blandas y de los cartlagos. L. braziliensis se distribuye en Mxico, Amrica central y Sudamnca. Leishmaniasis visceral. La leishmaniasis visceral del Viejo Mundo se produce espordicamente a lo largo de toda la geografa y es causada bien por L. onovanio por L. infantum. L. donovanies predominante en frica. Asia y la India y L. infantum predomina en las regiones mediterrneas y en el Oriente Medio, aunque existen superposiciones. La leishmaniasis visceral del Nuevo Mundo est producida por L. chagasiyse produce espordicamente en Amrica central y Sudamrica. Algunas especies que producen enfermedad cutnea tambin pueden ser responsables, en ocasiones, de enfermedad visceral, como se demostr recientemente en algunos grupos que participaron en la operacin Tormenta del Desierto (Magill. 1993). En algunas reas los humanos pueden servir de reservorios. aunque suelen ser diversos animales, incluidos perros y gatos, los que toman este papel. La infeccin suele ser benigna y a veces subclnica, aunque algunos individuos, especialmente chicos |venes e individuos mal nutridos, tienen marcada afectacin visceral, especialmente hgado, bazo, mdula sea y ganglios linfticos. En algunos casos la muerte se produce tras meses o aos, a menos que se les trate adecuadamente. La infeccin se llama Kala-azar en la India, por el oscurecimiento que toma la piel La leishmaniasis visceral es tambin una infeccin oportunista en individuos inmunosuprimidos (VIH), como mala respuesta a tratamiento (Medrano, 1992). Diagnstico de leishmaniasis. El diagnstico se realiza habitualmente por la visualizacin de los amastigotes en las extensiones o en las biopsias, o por el crecimiento de los promastigotes en cultivos. En la leishmaniasis tegumentaria, el borde de la lesin (que es ms activo) debe ser biopsiado y se debe emplear en fresco para hacer muestras. Tambin se debe preparar una extension haciendo una incisin de 2 mm a 3 mm en el borde de la ulcera y cogiendo pequea cantidad de tejido de la superficie tras cortar la superficie con la hoja del bistur. Tanto la extensin como la muestra de la biopsia se deben tratar con Giemsa. Las muestras que se deben tomar cuando se sospecha leishmaniasis visceral incluyen preparaciones teidas, aspirados de adenopatas o de mdula sea y biopsias de bazo o hgado. El cultivo es deseable, ya que es ms sensible y permite determinar las especies y subespecies. prctica que puede ayudar al tratamiento clnico del paciente. Las biopsias y aspirados recogidos aspticamente se cultivan en el medio de Novy-MacNeal-Nicolle o en el medio de Drosophila de Schneider suplementado con suero fetal de carnero (Visvesvara, 1992c). Los cultivos suelen empezar a mostrar promastigotes de 2 a 5 das, pero se debe esperar al menos cuatro semanas. Los amastigotes hallados en las biopsias, extensiones y secciones tislares se reconocen por su tamao (de 2 pm a 4 pm), por su citoplasma, por el ncleo y un cmetoplasto (Lmina 55-5C). En las secciones tisulares pueden parecer mas pequeos debido a su reduccin de tamao durante la fijacin. Los amastigotes deben diferenciarse de otros organismos mtracelula-

res. incluidos clulas levaduriformes de Histoplasma capsulatum y los trofozoitos de Toxoplasma gondii. Leishmama spp. tiene un cmetoplasto y no posee pared celular. En contraste, Histoplasma pierde el cinetoplasto. y la pared celular se tie con cido peridico de Shifl (PAS) y con plata metenamina. De acuerdo con un estudio (Weigle, 1987), la sensibilidad de las secciones histolgicas teidas con hematoxilina-eosina es del 14%. las impresiones del 19%. de los cultivos del 58%. y de todos los mtodos combinados del 67%.

Toxoplasma

gondii

Toxoplasma gondii es un parsito protozoo del filo Apcomplexa con una distribucin mundial en el ser humano y en los animales tanto domsticos como salvajes, especialmente carnvoros. L a infeccin en inmunocompetentes suele ser asintomtica o leve, pero en los mmunocomprometidos puede traer serias complicaciones. La infeccin in tero puede producir una infeccin congnita grave con secuelas o causar la muerte letal (Remington, 1990). El estadio sexual del ciclo vital de este parsito coccidio se completa en el epitelio intestinal de los gatos y otros felinos, que le sirven exclusivamente como huspedes definitivos. Durante este ciclo, pueden formar esquizogonias asexuales y gametocitos sexuales, dirigidos al desarrollo de los ooquistes inmaduros que pasan a las heces. Los ooquistes maduran a una fase infectiva (que contiene dos esporoquistes y cuatro esporozotos cada uno) en el plazo de 2 a 21 das. La ingestin de estos ooquistes puede conducir a la infeccin de una gran variedad de vertebrados susceptibles en los que los trofozoitos en crecimiento (taquizoitos) pueden infectar activamente cualquier clula nucleada. La proliferacin de los taquizoitos produce la muerte celular. Una vez que se desarrolla la inmunidad, los organismos forman quistes tisulares que pueden contener cientos o miles de bradizotos de crecimiento lento. La presencia de quistes tisulares es caracterstica de las infecciones crnicas. Todos los estadios del ciclo vital se producen en los felinos, pero slo los estadios de trofozoitos y quistes se producen en humanos y otros huspedes intermediarios. Los humanos adquieren la infeccin por Toxoplasma gondii por la ingesta de carne mal cocinada, especialmente cordero o cerdo, que contiene quistes tisulares, o por la ingesta de ooquistes inactivos de material contaminado por heces de gato. Los brotes pueden producirse por la inhalacin de polvo contaminado en el interior de establos (Teutch, 1979) y por beber agua contaminada o leche sin pasteurizar (Benenson. 1982: Sacks. 1982). Tambin puede producirse por la transmisin por transfusin o por trasplantes La mayora de las infecciones agudas son asintomticas o similares a otras enfermedades en las que destacan la fiebre y las adenopatas. La infeccin congnita puede producirse cuando la madre tiene infeccin aguda durante la gestacin. El riesgo de inleccin en neonatos no se relaciona con la presencia o ausencia de sntomas en la madre, sino que la gravedad de la infeccin depende del estadio de la gestacin. Si se contrae en la primera mitad del embarazo, puede aparecer muerte intrauterina, microcefalia o hidrocefalia con calcificaciones intracraneales. Si se da la infeccin en la segunda mitad del embarazo, suelen ser asintomticos al nacimiento, aunque puede aparecer fiebre, hepatoesplenomegaha e ictericia. La coriorretmitis, el retraso psicomotor y las convulsiones pueden aparecer meses o aos despus. En inmunosuprimidos, especialmente aquellos con sida, las infecciones por Toxoplasma gondiiduelen presentarse con afectacin de lquido cefalorraqudeo (Luft. 1988). Otras posibles manifestaciones clnicas y patolgicas son neumonitis. miocarditis, retinitis, pancreatitis y orquitis (Luft, 1989; Schnapp, 1992). La toxoplasmosis puede ser difcil de diagnosticar clnicamente y a veces se descubre en las autopsias (Gutirrez, 2000). Estas infecciones suelen ser resultado de la reactivacin de infecciones latentes, adquiridas meses o aos antes, pero ocasionalmente pueden ser infeccin primaria. El diagnstico de toxoplasmosis se puede establecer por el examen de tejidos, sangre o fluidos corporales. El hallazgo de taquizoitos o quistes tisulares es definitivo, pero puede existir dificultad para demostrarlo en las tin-

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PARASITOLOGA MDICA

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clones con hematoxilina-eosina; las tinciones fluorescente o con inmunoperoxidasa suelen ser tiles. El Giemsa es bueno para la tincin de extensiones de fluidos corporales y tejidos. Los organismos se pueden demostrar inoculando material adecuado en cultivo de tejido o en un ratn. La recuperacin en cultivos virales tambin se ha descrito, pero requiere una incubacin prolongada (Shepp, 1985). El aislamiento de los organismos a partir de la sangre o fluidos corporales es evidencia de infeccin aguda, mientras que su obtencin en tejidos puede significar infeccin crnica. En las extensiones, los taquizotos son ovalados o en forma de media luna, midiendo aproximadamente 3x7 um; los quistes miden ms de 30 urn de dimetro y suelen ser esfricos, excepto en las fibras musculares, donde estn alargados (Lminas 55-50. E y F). El uso de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es de alta sensibilidad y especificidad para su deteccin en la encefalitis por Toxoplasma, enfermedad diseminada e infeccin intrauterina (Cazenave. 1991; Grover, 1990. Parmley. 1992; Weiss. 1995). Estos procedimientos no estn completamente disponibles, sin embargo requieren un control de calidad cuidadoso para evitar resultados falsos positivos. La serologia permanece en primera linea para el diagnstico por Toxoplasma (Wilson. 1995). El test de Sabin-Feldman y el test de IFA son los estndares con los que se comparan los otros mtodos, aunque el primero es llevado a cabo slo en algunos centros. Muchos de los test EIA estn disponibles a la venta y generalmente dan un resultado similar al del IFA Los anticuerpos aparecen en una o dos semanas y los titulos pico entre la sexta y octava semanas. Los test para los anticuerpos IgM especficos son especialmente tiles para diagnstico de infeccin aguda e infeccin congenita, pero el conocimiento de las limitaciones (especialmente de los falsos positivos) es de gran importancia. La persistencia de anticuerpos IgM en ocasiones durante un ao o ms, es tambin problemtico y se debe interpretar en conjunto con los resultados de la IgG. Debido a que muchas personas han tenido infecciones asintomticas, los titulos bajos de IgG tienen poco significado. Los ttulos en pacientes con infeccin crnica ocular tambin pueden ser bajos. Los inmunosuprimidos, como los pacientes con sida que tienen infecciones activas por Toxoplasma, casi siempre tienen anticuerpos IgG existentes, aunque los ttulos pueden ser bajos y la actividad de IgM rara vez es detectada. La interpretacin de los titulos de IgG e IgM vara segn el mtodo usado y quien lo haya llevado a cabo. El laboratorio que lo hace debe dar los criterios necesarios para su interpretacin.

brado con un tapiz de E. col! viva o muerta con calor (Visvesvara. 1999). Las amebas digieren las bacterias, dejando huellas en el tapiz de bacterias, que pueden ser vistas con bajo aumento utilizando poca luz (Lmina 55-60). La meningoencefalitis amebiana granulomatosa (GAE) puede ser causada por varias especies de Acanthamoeba. incluidas A. castellao!. A. culbertsoni. A. polyphaga y A. astrnyxis entre otras Suele ser una infeccin oportunista subaguda o crnica de pacientes con enfermedades crnicas debilitantes e inmunosuprimidos. causando la muerte en semanas o meses tras el inicio de los sntomas. Se cree que la infeccin se extiende por va hematgena a partir de un foco primario de la piel, la faringe o de tracto respiratorio. Pueden producirse infecciones sistmicas en personas con sida y presentarse como lesiones cutneas o ulcerativas, abscesos subcutneos o nodulos eritematosos (Lmina 55-6C) (Tan, 1993). No es necesaria la exposicin al agua, ya que los quistes de Acanthamoeba son llevados fcilmente por el aire y pueden hallarse en la nariz y la garganta (Lawande, 1979; Wang. 1967). La reaccin tisular consiste en granulomas con trofozotos en los tejidos viables y quistes en las reas de necrosis. El diagnstico se suele hacer en autopsias, pero se pueden ver organismos en las biopsias cerebrales mediante tcnicas de cultivo descritas para Naegleria. Los trofozotos de Acanthamoeba son algo ms grandes que los de Naegleria, midiendo entre 15 pm y 45 pm, y poseen unas proyecciones filamentosas similares a agujas, conocidas como acanlopodios. Los quistes miden de 10 pm a 25 pm y tienen doble pared: una externa rugosa (ectoquistes) y otra interna poligonal estrellada o redondeada (endoquistes) (Lmina 55-60). La identificacin de las especies es problemtica y refleja la incertidumbre a la hora de reconocer las dieciocho o mas especies descritas. El uso de tcnicas de inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa puede resultar til para diferenciar especies y estn disponibles por el CDC (Visvesvara, 1999). La GAE puede ser causada por amebas leptomyxldes, especialmente Balamuthia mandrillaris (Visvesvara. 1993). Morfolgicamente. Balamuthia no se puede diferenciar de Acanthamoeba por la histologa habitual, aunque se pueden detectar diferencias a nivel ultraeslructural. Estos organismos son antignicamente diferentes y se pueden identificar mediante el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales en ensayos con inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa (Visvesvara, 1999). Balamuthia no crece en las placas de agar usadas para Naegleria y Acanthamoeba, pero se puede hallar en cultivos de tejido usando lineas celulares de mamferos. La queratitis por Acanthamoeba es una dolorosa infeccin de la crnea cada vez ms frecuente y que es ms habitual que se produzca en personas que usan lentes de contacto blandas o que sufren un traumatismo en la crnea (Anuran. 1987: Kilvington, 1994). La desinfeccin incompleta o infrecuente y el uso de suero salino casero son factores de riesgo conocidos para sufrir la infeccin (Stehr-Green, 1990). La enfermedad se caracteriza por el desarrollo de un infiltrado en anillo en el estroma corneal que progresa a ulceracin y riesgo de perforacin con prdida del ojo. La infeccin se puede confundir con una queratitis fngica. bacteriana o herptica que caractersticamente es refractaria a los antimicrobianos ms habituales. Se ha empleado la queratoplastia en el tratamiento de esta enfermedad, aunque se han descrito avances recientes en la terapia mdica (Varga, 1993). El diagnstico se establece por la demostracin de trofozotos amebianos o quistes en los raspados o biopsias corneales (Lmina 55-6E). Se pueden usar un gran nmero de tinciones, incluidos el Giemsa, el PAS y el tricromo. El uso de fluorocromo-calcoflor blanco es especialmente til en la deteccin de quistes de amebas (Lamina 55-6F) (Marines. 1987). Los cultivos (descritos previamente) aumentan la sensibilidad.

Amebas oportunistas de vida libre

Las amebas de gneros Naegleria. Acanthamoeba y Balamuthia habitan en la tierra, el agua y otros substratos ambientales, donde se alimenta de otros organismos microscpicos, especialmenle bacterias y levaduras. Los tres gneros se han asociado con infecciones oportunistas del sistema nervioso central, y la infeccin por Acanthamoeba causa queratitis (Kilvmgton. 1994: Marciano-Cabral. 1988; Martnez. 1985: Ubelaker. 1991; Visvesvara. 1999). La memngoencefalitis causada por el ameboflagelado Naegleria lowleri suele afectar tpicamente a nios y jvenes adultos que han estado nadando o buceando en lagos o piscinas de aguas dulces calientes. Los ameboflagelados entran en el cerebro a travs de la lmina cribiforme y del bulbo olfatorio, alcanzando los lbulos frontales, donde produce una meningoencefalitis aguda hemorrgica que suele ser latal en el plazo de una semana Iras el comienzo de los sntomas. Tiene un malsimo pronstico a pesar del tratamiento vigoroso. El diagnstico suele establecerse por autopsias al encontrar trofozotos (los quistes no se suelen ver) en los cortes histolgicos (Lmina 55-6/1). El diagnstico en vida se hace ocasionalmente al ver trofozotos tpicos en el lquido cefalorraqudeo, bien sea en examen directo o en preparaciones teidas o en cultivo. Los trofozotos miden de 10 pm a 35 pm, y tienen cariosomas largos, redondeados y centrales: si se ponen en agua destilada templada, se convierten en formas flageladas en una o dos horas. Los quistes son esfricos y miden de 7pm a 15 pm de dimetro. El cultivo se suele hacer en placas de agar no nutriente (1,5% agar, 0,5% cloruro sdico. pH 6.6-7,0) sem-

PROTOZOOS INTESTINALES Y UROGENITALES

Los grupos de protozoos que habitan el tracto intestinal en humanos incluyen las amebas, flagelados, ciliados, coccidios y microsporidios, sin ser todos ellos patgenos. En una revisin de muestras fecales enviadas a los laboratorios del departamento estatal de salud, Giardia lamblia estaba presente en

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II

SECCIN VI
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MICROBIOLOGA MDICA
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RetOrttmOfUU inlestinalis

I nlcToiiHuus h o m i n i s
I ni a m o e b a ha r i m a n i l i I nclionumas homniis Indohmax nana

I rofozotoi

( hilomaslix nKsnili (nanita lamblia

D i e n l i i m o c b a tVagilis lodaniocha hischlii r-nlamocba coli l.iiiamocba histoMica

lialaniitlium coli

Itosponi
J 40 L
20

IK-II

Ooqu

XI)

20

40

(.0

Figura 55-3. Rangos de los tamaos de los protozoos intestinales. (Los trofozoitos de B. cot pueden medir hasta 200 pm.)

un 7,2%, histolytica en un 0,9%, Dientamoeba tragilis en un 0.5% y Cryptosporidium spp. en un 0.2% de las muestras. Los protozoos no patgenos se encuentran en aproximadamente el 10,7% de las muestras (Kappus, 1994). La mayora de las infecciones intestinales son adquiridas por va fecal-oral, tanto directamente, desde manipuladores de alimentos, como indirectamente, a travs del agua contaminada. Para la mayora de los laboratorios, la identificacin de los protozoos intestinales es uno de los aspectos ms difciles de la parasitologa. Los protozoos son pequeos y las especies patgenas se deben diferenciar de las no patgenas y de las clulas inflamatorias, de las clulas de endoteliales, de las levaduras, de los plenes y de otros objetos. Hay un nmero de caractersticas que ayudan para la identificacin de los protozoos intestinales. El tamao es til (Fig. 55-3) y un adecuado micrmelro ocular debe estar disponible. La diferenciacin de amebas de los flagelados en muestras hmedas o material fresco es relativamente fcil por los seudpodos tpicos de las amebas, mientras que los flagelados se mueven ms rpidamente, de un modo que se asemeia a una hoja cayendo. El nmero y el tamao de los ncleos y el patrn de la cromatina. visto en preparaciones con tincin permanente, son tambin tiles. Las caractersticas del citoplasma incluyen fibrillas y otras estructuras tpicas de los flagelados, material ingerido en los trofozoitos amebianos y la masa de glucgeno y cuerpos de cromatina en quistes de amebas. Los flagelados suelen estar agrandados y con forma de huso, con uno o varios ncleos en un extremo. Cuando se examina por cualquier mtodo, las caractersticas nucleares y citoplasmticas se deben determinar a partir de un nmero de organismos para completar la identificacin. Cuando se informa de la presencia de dos o ms especies en una muestra, el observador debe ser capaz de definir las diferentes poblaciones para evitar confundir algn organismo con apariencia atpica. Los trofozoitos predominan en las heces lquidas, pero degeneran en menos de una hora a menos que se pongan conservantes. Los quistes predominan en las heces formadas y son ms resistentes a la degeneracin. Ambas formas se pueden ver en el examen directo a partir de heces frescas. La formalina no conserva bien los trofozoitos, y se pueden perder a menos que se preparen extensiones con tinciones permanentes. Para la

identificacin definitiva se debe hacer un examen de muestras con tincin permanente.

Amebas

Blastocystis hominis

Los tres gneros de amebas que pueden habitar el tracto intestinal humano son: Entamoeba. Endolimax y lodamoeba. Los quistes se digieren y se exquistan en el intestino delgado. El resultado es la proliferacin de trofozoitos por fisin binana en la luz del colon. Tanto los quistes como los trofozoitos pueden salir con las heces, pero slo los quistes maduros son infectivos. Entamoeba histolytica es la nica especie de ameba capaz de invadir tejidos y producir enfermedad. El gnero Entamoeba, caracterizado por la presencia de cromatina de la membrana nuclear, incluye E. histolytica, el agente de la amebiasis; E. dispar, una especie no patgena idntica a E. histolytica; E. hartmanni y coli. que se encuentran habitualmente como especies comensales: y polecki que se encuentra a veces en personas que tienen contacto con cerdos (Fig. 55-4) (Gay, 1985: Levin, 1970). gingivaiis. que no tiene un estadio quistico conocido, puede habitar en la boca de individuos con pobre higiene bucal (Dao, 1983). polecki y gmgivalis se ven rara vez y no se describen ms adelante. Endohmax nana e /. btschlii son especies no patgenas. Dientamoeba fragilis se reconoce actualmente como flagelada, aunque pierde su flagelo externo y se explica en el texto dentro de los flagelados, pero puede ser encontrada con las amebas en las tablas y figuras debido a sus similitudes morfolgicas. Entamoeba histolytica. Esta ameba puede producir diversas enfermedades, siendo las ms comunes la disentera amebiana, la colitis amebiana y a abscesos hepticos (Beaver, 1984; Ravdin, 1988: Strickland, 1999). Los mecanismos de defensa del husped, el contacto previo con el parsito, la alimentacin y la cepa de Entamoeba histolytica son los responsables de la gravedad de la infeccin. Los anlisis de los patrones de isoenzimas han mostrado que slo ciertas cepas son invasivas y que la mayora de las infecciones no se detectan (Bruckner. 1992; Murray 1999). Las diferencias genticas y bioqumicas entre las cepas invasivas y no invasivas se han identifica-

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PARASITOLOGA MEDICA

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do, y se ha propuesto que se denomine a la cepa no patgena Entamoeba dispar (Diamond, 1993). La disenteria amebiana, que es rara en EE.UU.. es una enfermedad aguda que se caracteriza por diarrea sanguinolenta con calambres abdominales. Se produce una invasin de la mucosa intestinal, causando ulceracin que puede conducir a perforacin y peritonitis. La forma ms comn de la enfermedad vista en este pas es la colitis amebiana, que puede simular una colitis ulcerosa y otra forma de enfermedad inflamatoria intestinal. Los sntomas suelen ser menos graves que en la disentera amebiana, pero pueden incluir diarrea no sanguinolenta, estreimiento, dolor abdominal y prdida de peso. Se pueden formar pequeas ulceraciones de la mucosa y extenderse dentro de la submucosa formando lceras. Se puede afectar todo el colon o una parte, ms frecuentemente el ciego, el recto-sigma o el colon ascendente. Los abscesos hepticos por amebas son la forma extraintestinal ms frecuente de amebiasis, dndose aproximadamente en el 5% de los pacientes que presentan amebiasis intestinal. Se caracteriza por fiebre y dolor en el hipocondrio derecho. Estos abscesos hepticos se suelen diagnosticar por escner, ecografa y test serolgicos. Las amebas estn presentes en las heces en menos de la mitad de los pacientes en el momento de la deteccin del absceso heptico. La hepatitis amebiana. caracterizada por un aumento doloroso del hgado en personas con amebiasis intestinal, tambin puede producirse. Su patognesis es an poco conocida. Rara vez pueden aparecer abscesos amebianos en otros rganos como pulmn, cerebro o piel, bien por diseminacin hematgena desde el intestino o bien por continuidad desde abscesos hepticos. Se pueden formar masas de tejido granulomatoso (amebomas) como respuesta a la presencia de amebas, pudiendo causar en el intestino una lesin en servilletero que podra simular un carcinoma. Epidemiologa. La mayora de las infecciones por E. histolytica se adquieren por ingesta de agua o alimentos contaminados, aunque un brote se produjo por una irrigacin colnica contaminada (Istre, 1982). Se pueden ver seudoepidemias a causa de la confusin en el laboratorio de las

clulas inflamatorias, otras amebas o restos fecales como si fuesen E. histolytica (CDC. 1985; Krogstad, 1978). Aunque histolytica es un parsito endmico de Estados Unidos, muchas personas lo adquieren durante viales o viviendo en pases extranjeros. Diagnstico. El examen de una serie de muestras fecales puede ser suficiente para el diagnstico de amebiasis intestinal en la mayora de los casos. Si se han administrado antibiticos o medios de contraste, la infeccin puede ser enmascarada durante una temporada. El material aspirado de un absceso heptico puede mostrar trofozotos al microscopio. La ltima porcin del aspirado es la que ms trofozotos suele contener y puede usarse para el examen microscpico directo o para tincin permanenle. Si hubiese tejido disponible, la seccin puede mostrar organismos que se tien mucho con PAS (Lmina 55-7C) Los cultivos (Diamond, 1988; Visvesvara. 1992a) no tienen un empleo muy extendido para diagnstico, pero son tiles para la investigacin y esenciales para determinar la patogenicidad basndose en las soenzimas Los test de deteccin de antigenos por EIA son especficos, sensibles y capaces de diferenciar a Entamoeba histolytica de Entamoeba dispar y estn disponibles en el mercado (Wilson, 1995; Murray, 1999; Rosenblatt, 1995). En uso de las tcnicas de PCR y de ADN tambin es til para diferenciar Entamoeba histolytica de Entamoeba dispar (Bendall, 1993; Samuelson, 1989; Weiss, 1995), pero no estn comercializadas. Los test serolgicos (Tabla 55-5) son los ms tiles para el diagnstico de infeccin extraintestinal, ya que aproximadamente el 95% de los pacientes con abscesos hepticos son seropositives. Esto disminuye al 70% para la infeccin intestinal y al 10% para los portadores asintomtcos. Los titulos detectables pueden durar meses o aos tras el tratamiento correcto (Wilson, 1995). Los trofozotos de Entamoeba histolytica miden de 10 pm a 60 pm de dimetro; la forma comensal suele medir de 15 pm a 20 pm y las formas invasivas unas 20 pm (Tabla 55-7; Figs. 55-3 a 55-5; Lmina 55-7), En el examen directo, los trofozotos muestran una movilidad progresiva gracias a la rpida formacin de un pseudpodo hialino que tiene una clara dife-

* inrrt-cuentc. prohuhli'im'ntt- di-

u n g e n aniiKil.

Figura 55-4. A m e b a s halladas en las muestras fecales humanas. {Dientamoeba Iragilis es un flagelado.)

to

Tabla 55-7 Morfologa de los trofozotos de las amebas intestinales Tamao (dimetro o longitud) Ncleo Motilidad Nmero
:

Citoplasma Cromatina cariosmica Pequeo, discreto Habitualmente central pero a veces excntrico Apariencia Finamente granular Inclusiones A veces eritrocitos en las formas invasivas Las no invasivas contienen bacterias Bacterias

Especies Entamoeba histolytica/ E. dispar

Cromatina perifrica Granulos finos Habitualmente distribucin y tamao regular

10-60 um; talla habitual, Progresiva, con 15-20 (im en la forma pseudpodos hialinos comensal', en torno a como dedos 20 pm para las formas invasivas' 5-12 pm; habitualmente Habitualmente no progresiva. de 8-10 (im pero a veces puede s e r progresiva 15-50 um; Como una babosa, no progresiva, lo habitual 20-25 um pseudpodos abruptos

1 No visible sin teir

Entamoeba hartmanni Entamoeba coli

Endoiimax nana lodamoeba btschiii

6-12 pm; lo habitual 8-10 (tm 8-20 pm; habitualmente 12-15 pm

C o m o una babosa habitualmente no progresivo, pseudpodos abruptos C o m o una babosa, habitualmente no progresiva

1 No visible sin teir 1 Frecuentemente visibles en preparacin sin teir 1 A veces visible en preparaciones sin teir 1 No suele ser visibie sin teir

Similar a la Entamoeba Pequeo, discreto. histolytica Irecuentemente excntrico Granulos bastos de tamao Grande, discreto, y distribucin irregular habitualmente excntrico

Finamente granular

Basto, frecuentemente Bacterias, vacuolado levaduras y otros materiales Granular, vacuolado Bacterias

Ninguno

Grande irregular

Ninguno

Grande, habitualmente central. B a s t a m e n t e granular, Rodeado por granulos refrctiles vacuolado y acromticos. Estos granulos no suelen verse en las preparaciones teidas Grandes acmulos de 4-8 granulos Finamente granular, vacuolado

Bacterias, levaduras u otro material

Dientamoeba fragilis*

5-15 pm. habitualmente 9-12 pm

Los pseudpodos son angulares, aserrados o lobulados y alineados, casi transparentes

2 (En el 20% slo hay un ncleo.) Son invisibles en preparaciones sin teir

Ninguno

Bacterias

'Habitualmente hallado en casos asniomticos o crnicos, puede contener bacterias. 'Usuaimente hallado en casos agudos; con frecuencia contienen glbulos rojos. 'Visible en material sin (jar Los ncleos se pueden ver a veces en material lijado 'Flagelado (vase texto) Adaptada de B r o o k eM MM e l v m DM: Morphology o f Diagnostic Stages Of Intestinal Parasites o f Man. U S D H E W PHS. Publicacin n.- 1.966. 1969

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I nuiiiwbjvu.il

bniumijcbu Insilili Ltv'j

Figura 55-5. Ncleos de amebas. Este dibujo m u e s t r a algunas de las distintas apariencias de los ncleos de las amebas en las preparaciones teidas. (Dientamoeba Iragilises un flagelado: vase texto.)

renciacin entre el endoplasma y el ectoplasma: el ncleo no es visible. En la enfermedad invasiva algunos trofozotos contienen eritrocitos sin digerir (Lmina 55-7C), una caracterstica de la infeccin por E. histolytica. En las preparaciones teidas, la cromatina nuclear perifrica suele distribuirse a lo largo de la membrana nuclear como finos granulos. El cariosoma es pequeo y a veces centralmente emplazado, con finas fibrillas que no suelen ser visibles y que lo sujetan a la membrana nuclear. Pueden existir variaciones en la estructura nuclear, pudiendo estar algunos cariosomas localizados excntricamente y la cromatina perifrica distribuida irregularmente. La nica caracterstica que es patognomnica de E. histolytica es la fagocitosis de eritrocitos, que rarsima vez se produce en otras especies, El citoplasma es finamente granular y en los organismos invasivos no hay inclusiones, o bien nicamente inclusiones de eritrocitos. En los organismos no invasivos pueden verse bacterias ingeridas. En los organismos en degeneracin, el citoplasma puede ser vacuolado y el ncleo puede tener cromatina anormalmente agrupada. Los quistes de E. histolytica son esfricos y miden de 10 pm a 20 pm (habitualmente de 12 pm a 15 Jim) de dimetro (Tabla 55-8; vanse Figs. 55-3 a 55-5: Lmina 55-7). La fase de prequiste tiene un ncleo nico y carece de pared refrctil. Cuando madura, desarrolla otros ncleos, siendo cada uno aproximadamente 1/6 del dimetro del quiste. Los ncleos son similares a los de los trofozotos, pero su tamao menor les hace menos Utiles como caracterstica dlerenciadora. El citoplasma puede contener vacuolas de glucgeno y cuerpos cromaloides de extremos romos o agudos. El numero y el tamao de los ncleos, as como el aspecto de los cuerpos cromatoides, son criterios importantes para la identificacin de los quistes. En los laboratorios que no usan alguno de los mtodos inmunolgicos o moleculares para diferenciar E. histolytica de E. dispar y que cuentan nicamente con anlisis morfolgicos, se deben usar formatos de informes que tengan en consideracin las tecnologas de diferenciacin. Asi, un informe de E. histolytica/E. dispar sera lo ms apropiado en ltima instancia. Amebas no patgenas. El microbilogo debe estar capacitado para diferenciar las amebas no patgenas o comensales de la histolytica/ E. dispar y de D. Iragilis (un flagelado), que son potencialmente patgenos. Las caractersticas de identificacin, que se ven mejor en cortes teidos permanentemente, se resumen en las Tablas 55-7 y 55-8 y en las Figuras 55-3 a 55-5. La identificacin de trofozotos se basa en el tamao y las caractersticas del ncleo y del citoplasma: la identificacin de quistes se basa en el tamao, numero y caractersticas del ncleo y en la presencia de los cuerpos de cromatina. as como en sus caractersticas, sin olvidar las masas de glucgeno. hartmanni tiene caractersticas morfolgicas similares a las de histolytica, excepto en que los trofozotos tienen un dimetro mximo de 12 pm,

y los quistes de 10 pm. teniendo los quistes a veces un ncleo nico. Histricamente. E. hartmanni tue llamada la raza pequea de histolytica. Su diferenciacin requiere cuidadosas mediciones con un micrmetro ocular bien calibrado. Entamoeba coli. una habitante habitual del lumen, puede ser difcil de diferenciar de E. histolytica. El citoplasma se tie algo ms oscuro que el de E. histolytica y es ms vacuolado. conteniendo numerosas bacterias ingeridas, levaduras y otros materiales. Aunque las caractersticas nucleares difieren de las de Entamoeba histolytica (Fig. 55-5). puede existir una superposicin significativa, especialmente en muestras que no se han conservado debidamente. Los quistes maduros de coli contienen ocho ncleos, aunque pueden llegar a tener 16 o ms. Los quistes inmaduros, que son poco comunes, tienen cuatro ncleos (un cuarto del dimetro del quiste) mayores que los de E. histolytica (un sexto de dimetro del quiste) y pueden contener glucgeno. La distribucin de la cromatina perifrica y los cariosomas no tiene gran importancia en la identificacin de los quistes de Entamoeba. Los cuerpos cromatoides, cuando se presentan, son irregulares, con extremo desflecado, mientras que los extremos romos se ven en histolytica. Entamoeba nana es la ameba ms pequea que inlecta a los humanos. Los trofozotos con frecuencia tienen un ncleo atpico que contiene una masa de cromatina triangular, una banda de cromatina que atraviesa el ncleo o dos masas discretas de cromatina en los lados opuestos de la membrana nuclear (Fig. 55-5). Un halo claro o espacio cariolinfoide rodea el cariosoma y se extiende a la membrana nuclear. La forma nuclear atipica puede ser til en la diferenciacin de nana de /. btschlii que es de una apariencia similar pero ms larga. Los quistes de Endolimax suelen contener cuatro ncleos, aunque se pueden ver con menos ncleos. El glucgeno, cuando est presente, se dispone difusamente por el citoplasma en vez de en masas. Los quistes se diferencian fcilmente de las otras amebas, pero se pueden confundir con Blastocystis hominis. El ncleo del Blastocystis hominis pierde el halo que se vea en los quistes de nana. El ncleo de los trofozotos de /. btschlii y sus quistes tienen un cariosoma grande y central frecuentemente rodeado por granulos acromticos que pueden no ser diferentes, pero aparecen slo como un halo o espacio cariolinfoide. En algunos ncleos, el halo es claro sin granulos acromticos, haciendo al organismo indistinguible de nana. Los quistes de /. blschliicontienen un ncleo nico en el que el cariosoma suele ser excntrico, con unos granulos acromticos en media luna (vanse Figs. 55-3 a 55-5). Los quistes se caracterizan por una vacuola prominente de glucgeno que se tie de marrn rojizo en las muestras frescas teidas con yodo, de ah el nombre del organismo. El glucgeno se disuelve con los fijadores acuosos y puede no ser visible en el material almacenado.

Tabla 55-8 Morfologa de los quistes de a m e b a s intestinales Especies Entamoeba histolytica/ E. dispar Tamao 10-20 urn; habitualmente 12-15 pm Contorno Habitualmente esfrico Ncleo Nmero 4 en los quistes maduros. 1 2 en los quistes inmaduros Cromatina perifrica Cromatina perifrica. Granulos uniformes. finos y homogneos Cromaiina cariosmica Pequea, discreta y habitualmente central Citoplasma Cuerpos cromatoldes Presente. Barras alargadas con extremos desflecados Glucgeno Habitualmente difuso. Frecuentes masas concentradas en los quistes jvenes Se tien de marrn rojizo con el yodo Similar a Enthamoeba histolylica

Entamoeba hartmanni Entamoeba colt

5-10 urn riabitualmente 6-8 pm

Habitualmente esfrico

4 en ios quistes maduros Similar a Entamoeba 1 2 en los quistes inmaduros histolytica

Similar a Entamoeba histolytica

Presente. Barras alargadas con extremos desflecados

10-35 urn; Habitualmente esfrico. 8 en los quistes maduros habitualmente 15-25 u r n Ocasionalmente ovaiado. Ocasionalmente quistes m u y triangular u otro contorno nucleados con 16 o ms L o s quistes inmaduros tienen 2 o ms

Endolimax nana

5-10 pm; habitualmente 6-8 u r n

Esfrico, ovalado o elptico

4 en los quistes maduros. A veces se ven quistes inmaduros con menos de 4 ncleos

lodamoeba biitschlii

5-20 pm; Ovalado, elptico, triangular 1 en los quistes maduros habitualmente 10-12 urn u otro contorno

Cromatina perifrica. Grande, discreto. Presente. Habitualmente Habitualmente difuso, Bastos granulos habitualmente excntrico. con extremos castigados pero a veces masas irregulares en tamao y pero a veces central bien definidas en los distribucin, pero quistes inmaduros. frecuentemente son ms Se lie de marrn uniformes que los que se rojizo con el yodo encuentran en los trofozoitos Ninguno Grande, habitualmente Ocasionalmente, granulos Habitualmente dituso. central pequeos o masas ovaladas Frecuentes masas pero no estn presentes en concentradas en los los cuerpos vistos en quistes |venes. Entamoeba Se tie de marrn rojizo con el yodo Ninguno Grande, habitualmente Granulos a veces presentes. Masas compactas excntrico. Granulos pero los cuerpos vistos en bien definidas. 'elrctiles. acromticos Enlamoeba no estn Se tien de marrn en uno de los lados del presentes oscuro con el yodo cariosoma

Adaptada de Brooke MM Melvm DM: Morphology of Diagnostic Stages of Intestinal Parasites of Man. USDHEW PHS. PuDlicacion n " 1 966 1969.

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA

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Figura 55-6. A. Ciliados, coccidios y Blaslocyslis spp. hallados en muestras tecales humanas. B, Flagelados hallados en muestras tecales h u m a nas. (Adaptada de Brooke MM. Melvin DM: Morphology ol Diagnostic Stages of Intestinal Parasites o fM a n (Publicacin n. [CDC] 848116.) Washington, DL, Departamento de Salud y Recursos H u m a n o s de los Estados Unidos, 1984.
?

Blastocystis hominis. Blastocystis hominis es un protozoo similar a la ameba que habita en el intestino y se encuentra frecuentemente en muestras fecales de individuos asintomticos. Algunos estudios han relacionado la enfermedad intestinal sintomtica con infeccin grave, aunque esto es controvertido (Markell, 1986; Miller 1988: Sheehan, 1986; Stenzel, 1996: Zierdt, 1991). Los quistes pueden tomar una de las siguientes tres formas: vacuolada, que es la ms comn, ameboide o granular. La vacuolada tambin se conoce como forma vacuolada central, que suele ser esfrica y de tamao variable (de 5 pm a 20 pm), con un rea central clara y de dos a cuatro ncleos perifricos (Fig, 55-6A; Lmina 55-8G). Las formas ameboides de contornos atpicos pueden predominan en infecciones graves. La presencia de Blastocystis se debe informar, especialmente cuando son numerosos (cinco o ms por campo de 400x) (Sheehan. 1986; Stenzel. 1996).

Flagelados
Dientamoeba fragilis. Dientamoeba tragilis es un patgeno ameboide que infecta el colon y se asocia a diarrea, especialmente en nios jvenes

(Preiss. 1991: Spencer, 1979; Tumer, 1985: Yang, 1977). Aunque es parecido a las amebas. Dientamoeba se ha reclasificado como un flagelado basndose en los detalles ultraestructurales y la similitud antignica. N o se le conoce un estadio de quiste. Debido a la similitud de Dientamoeba a las amebas en el microscopio de luz ptica, estas especies se han incluido tradicionalmente en las tablas y figuras de las amebas (vanse Tabla 55-7; Figs. 55-3 a 55-5: Lmina 55-7H). Los sntomas incluyen diarrea y distensin abdominal Recientes investigaciones sugieren que la dientamebiasis es una causa de diarrea ms frecuente de lo que se pensaba; el 4,3% de los pacientes en un estudio podaban este organismo (Spencer, 1979: Murray, 1999). Aproximadamente el 25% de las personas infectadas presentaban sntomas. En contraste con la amebiasis, esta infeccin no suele asociarse con otros protozoos fecales, pero muestra una asociacin entre diez y veinte veces mayor de lo esperado con enterobiasis (infeccin por oxiuros, analizado ms adelante). Esta asociacin sugiere que la infeccin por D. tragilis puede estar difundida por la ingesta de huevos de lombrices infectadas con D. tragilis (Burrows. 1956). La infeccin por D. tragilis pasar desapercibida a menos que se examinen preparaciones con tincin permanente. Pueden necesi-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

tarse muchas muestras, ya que la eliminacin varia da a da. Cuando se preparan extensiones, la ltima parte de las muestras fecales debe ser la examinada, ya que es donde mayor nmero de parsitos se pueden encontrar. De 2/3 a 4/5 de los organismos contienen dos ncleos que constan de un grupo de cuatro a ocho granulos cariosmicos que pueden formar un cariosoma grande e irregular (Fig. 55-5), Se puede confundir con trofozotos de Enlamoeba nana o de /. btschlii. El citoplasma es finamente granular y suele contener bacterias ingeridas. Los trofozotos son delicados y pueden pasarse por alto fcilmente, de modo que la preparacin teida se debe examinar cuidadosamente. Se ha descrito un mtodo de inmunofluorescencia que puede ayudar a su deteccin pero que no est comercializado (Chan, 1993). Giardia lamblia. G. lamblia es un protozoo patgeno intestinal que produce endemias y epidemias por todo el mundo, y en EE.UU. es especialmente problemtica para los viajeros, campistas y homosexuales (Wolfe, 1992), Frecuentemente produce enfermedad en personas que beben agua contaminada, y se ha descrito un gran nmero de epidemias a partir del agua en lugares como Aspen, Colorado. Leningrado. Rusia, Roma y Nueva Y o r k (Craun, 1986). Los protozoos patgenos no mueren por las concentraciones habituales de cloro de las aguas municipales, y as, salvo que se filtre, puede actuar de fuente de infeccin, como ya sucedi en las epidemias de Roma y Nueva York. Los trofozotos de G. lamblia se multiplican en el intestino delgado y atacan la mucosa mediante una ventosa ventral cncava. Puede ser asntomtica o producir patologa que va desde diarrea leve con vagas molestias abdominales hasta un sndrome de malabsorcin con diarrea y esteatorrea, parecido a espre. La patogenia no est totalmente comprendida, aunque puede darse una interrupcin de la integridad del borde en cepillo de la mucosa, produciendo dficit de disacaridasas debido al efecto directo o indirecto del parsito (Wolfe, 1992). La giardiasis se debe considerar en todo paciente con diarrea de ms de diez das de duracin. El diagnstico se hace demostrando los trofozotos o quistes de Giardia en las muestras fecales. Los trofozotos suelen estar en las heces darreicas, mientras que los quistes estn en las heces formadas. La eliminacin de los organismos vara de da en da, por lo que puede ser necesario el examen de diferentes muestras en diferentes das. El examen directo suele ser especialmente til para el hallazgo de los trofozotos con su motilidad en "cada de hoja". Los quistes se pueden ver tanto en examen directo como en concentraciones, y tanto quistes como trofozotos se pueden ver en tinciones permanentes. En algunos casos no se pueden hallar en muestras fecales y son necesarios pequeos aspirados intestinales o muestras del test de la cuerda. El laboratorio debe ser avisado de antemano para que el personal est disponible para la realizacin de un examen directo nada ms recibir la muestra. Muchos mtodos de deteccin de antgenos por inmunofluorescencia o por EIA estn comercializados (Wilson, 1995; Wolfe, 1992; Garca, 1997). Parecen tener buena sensibilidad y especificidad y pueden detectar algunas infecciones no detectadas por el examen de las heces. Tambin pueden ser especialmente tiles en investigacin epidemiolgica, pero no reemplazan la necesidad de los tradicionales estudios morfolgicos para detectar otros parsitos. Los trofozotos de Giardia mirados desde el exterior tienen una torma de pera con extremo posterior en forma de huso y poseen dos ncleos que les da el aspecto de una cara sonriendo con ojos prominentes (Tabla 55-9: vanse Fig. 55-68 y Lmina 55-8C a E). Cuando se ven desde un lado, el extremo anterior es ms grueso y ahusado posteriormente: la mitad anterior consta de una ventosa en la cara ventral. Los cuatro flagelos laterales, los dos ventrales y los dos caudales no suelen ser evidentes en las muestras frescas o en las preparaciones teidas. Los quistes son ovales y suelen ser tener cuatro ncleos. Bajo el ncleo, los cuerpos medios oscuros con fibrillas se cruzan longitudinalmente, dando unas caractersticas internas distintivas. El citoplasma suele estar apartado de la pared de los quistes. Chilomatix mesnili. C. mesnili (Tabla 55-9; Fig. 55-68; Lmina 55-8F) es un flagelado habitual del lumen no patgeno, que se debe distinguir de los tro-

fozotos de las amebas y de Giardia en las preparaciones. La localizacin del nico ncleo en uno de los extremos y la forma de huso del otro extremo es til. Si se examinan varios organismos, serian visibles el citoplasma y el surco espiral en algunos de ellos. Los tres flagelos externos no suelen ser visibles en preparaciones teidas o fijadas con formalina. Los quistes con forma d e limn contienen varias fibras citosomales curvas con un aspecto parecido a un imperdible. Pentatrichomonas hominis. P. hominis. conocida antiguamente como Trichomonas hominis (Tabla 55-9; Fig. 55-68) es un raro flagelado intestinal no patgeno que se puede confundir con Entamoeba hartmanni o los pequeos trofozotos de Entamoeba histolytica. No se ten especialmente bien y frecuentemente se distorsionan en las preparaciones. Hay que examinar muchos de ellos en las preparaciones teidas para lograr ver el ncleo nico similar al de Entamoeba. la membrana ondulada y los flagelos. Un objeto prominente similar a una vara, el axostilo, atraviesa el organismo y protruye en el extremo posterior. No se han descrito estadios quisticos. Trichomonas vaginalis. Trichomonas vaginalis es una causa frecuente de vaginitis, caracterizada por inflamacin, prurito, flujo vaginal y. a veces, disuria. Se suele transmitir por relacin sexual, frecuentemente por varones que tienen una infeccin asntomtica. A veces los hombres pueden padecer una prostatitis o una uretritis. Trichomonas vaginalis se suele diagnosticar en el mismo despacho del mdico mediante un examen directo del flujo vaginal o del prosttico, o bien del sedimento de orina. Morfolgicamente, Trichomonas vaginalis se asemeja al P. hominis. pero es ms grande (cerca de 23 pm) y la membrana ondulante se extiende slo hasta la mitad del cuerpo. Debido a la diferencia en el habitat, no suele ser necesario diferenciar estas Trichomonas morfolgicamente. El examen directo puede ser insensible y el uso de cultivo o las tcnicas de inmunoensayo se recomiendan cuando el diagnstico no es fcil (Garca, 1997; Visvesvara, 1992b; Wilson, 1995). Los cultivos tienen una sensibilidad de aproximadamente el 90% (Beal, 1992; Krieger, 1988; Schmid. 1989), as como las tcnicas inmunofluorescentes y el EIA que usan anticuerpos monoclonales (Kreiger, 1988; Lisi, 1988; Wilson, 1995). La tincin de Papanicolaou puede revelar T. vaginalis en ocasiones, pero tiene baja sensibilidad y especificidad. Otros flagelados. Enteromonas hominis y Retortamonas intestinalis son flagelados intestinales pequeos, no patgenos, que se ven rara vez y que cuando estn presentes pueden darse en gran nmero. Las caractersticas morfolgicas se revisan en la Tabla 55-9 (vase tambin la Fig. 55-68). Trichomonas tenax son unas tricomonas que veces se aislan en la cavidad oral, pero no causan enfermedad.

Ciliados
Balantidium coli. B. coli (Fig. 55-6A; Lmina 55-8H) puede causar un sndrome similar a la disentera con lceras en el colon similares a las de las amebas, pero no produce abscesos hepticos u otras lesiones sistmicas. La inleccin humana, rara en EE.UU., se puede adquirir de los cerdos, que son los habitualmente infectados. 8. coli es el protozoo ms grande que infecta a los humanos. Los trofozotos van desde 40 pm hasta cerca de 200 pm en su mayor tamao (la mayora son de 50 pm a 100 pm) y estn cubiertos uniformemente con cilios que son ligeramente ms largos en el extremo anterior, adyacente al citostoma. Hay un gran ncleo que se ve tcilmente en las preparaciones, y un microncleo ms pequeo que rara vez es visible. En el citoplasma hay numerosas vacuolas alimenticias y vacuolas contrctiles. Los quistes son redondos, midiendo de 50 pm a 70 pm de longitud. En los quistes ms jvenes se pueden ver cilios y las caractersticas nucleares son similares a las de los trofozotos. Las muestras fecales contaminadas con agua estancada pueden contener ciliados de vida libre que pueden diferenciarse de 8. coli por el patrn ciliar.

Tabla 55-9 Morfologa de los flagelados intestinales Especies Trofozotos Pentatrichomonas lodo hominis' Chilomastix mesnih Giarda lamblia Enteromonas hominis Relorlamonas intestinalis Especies Quistes Chilomastix mesnih Giardia lamblia habitualmente 6-7 (jrn 6-10 jim; habilualmente 8-9 um Tamao 8-13 ym; habilualmente il-i2u.m Enteromonas Retortamonas hominis intestinalis 4-10 um; habitualmente 6-8 ym 4-9 um. habitualmente 4-7 um Alargado u oval Forma de pera o similar a un limn Tamao
8-20 L U T I ;

Forma Forma de pera

Motilidad Rpida, en sacudidas

U.- de ncleos

N de flagelos' 3-5 anterior.

Otras caractersticas Membrana ondulada que se extiende a lo largo de el cuerpo Citostoma prominente que se extiende un tercio o la mitad Surco espiral a lo largo de la superficie ventral Ventosa que ocupa la mitad o tres cuartos de la superficie ventral Un lado del cuerpo es plano. Flagelo posterior que se extiende libremente hacia el posterior o el lateral Citostoma prominente que se extiende aproximadamente hasta la mitad del cuerpo Otras caractersticas Citostoma con fibrillas de soporte. Habitualmente visible en preparaciones teidas Fibrillas o flagelos longitudinales en el quiste Citoplasma frecuentemente apartado a una porcin de la pared del celular Se asemea al quiste de E. nana. Los flagelos o fibrillas no suelen verse Se parece al quiste de Chilomastix. Sombra exterior al citoplasma con fibrillas de soporte que se extienden sobre el ncleo

habilualmente 11-12 um 6-24 urn habitualmente 10-15 um Forma de pera 10-20 (im; habilualmente 12-15 u . m 4-10 um; Forma de pera u oval En sacudidas habilualmente 8-9 um 4-9 um, Forma Forma de limn con unos botones hialinos anteriores o "pezn' Oval o elptico Oval En sacudidas Cada de hoia F o r m a de pera Rotatoria, rgida

No visible en preparaciones sin teir 1 No visible en preparaciones sin teir 2 No visible en preparaciones sin teir 1 No visible en preparaciones sin teir 1 No visible en preparaciones sin teir N. de ncleos
?

1 posterior 3 anterior, 1 en el citostoma 4 lateral 2 ventral. 3 caudal. 3 anterior. 1 posterior 1 anterior, 1 posterior

1 No visible en preparaciones sin teir Habitualmente 4 No diferenciabies en preparaciones sin teir Habitualmente localizados en un extremo 1 -4 habitualmente 2 en el extremo opuesto del quiste, no visible en preparaciones sin teir

No visible en preparaciones sin teir

'No es practico para la identificacin de especies en el examen ordinario 'Pentatrichomonas hormnis no tiene forma guistica. Adaplada de Brooke MM Melvm MD Morpnology of Diagnostic Stages of Intestir

is of Mai USDHEWPHS Publicacin n.1.966 1969

No -

~o

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Coccidios

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Los coccidios comprenden un gran grupo de parsitos apcomplejos que tienen una lase sexual en el intestino de los vertebrados e invertebrados. Algunas especies pueden tambin desarrollarse asexualmente en zonas extraintestinales en los tejidos del husped. Los gneros infectantes del intestino humano, como Isospora. Sarcocystis. Cryptosporidium y Cyclospora suelen producir una diarrea autolimitada en personas inmunocompetentes. Se puede desarrollar una diarrea grave en inmunosuprimidos tras la infeccin de Isospora. Cryptosporidium y Cyclospora. Isospora belli. Isospora belli sufre un desarrollo sexual y asexual en el citoplasma de las clulas epiteliales del intestino delegado (Lmina 55-9/4). El desarrollo sexual produce ooquistes. que pasan a las heces y maduran a fase infectiva en el medio ambiente. La infeccin humana causa diarrea y malabsorcin. que suele ser autolimitada. En pacientes con sida u otra inmunosupresin, la enfermedad puede durar meses o aos y podra causar la muerte (DeHovitz, 1986; Mannheimer. 1994). El diagnstico se hace hallando ooquistes no esporulados de 12 x 30 pm en las heces, habitualmente en examen directo o en preparaciones concentradas (Lmina 55-9S). Si la muestra sin fijar se deja a temperatura ambiente durante 24 a 48 horas, se produce la esporulacin. Los ooquistes infectivos contienen dos esporoqustes, cada uno de los cuales tiene cuatro esporozoitos (Fig. 55-6/4) Los ooquistes. como los de Cryptosporidium, se tien con tincin cido resistente. Sarcocystis spp. Las especies de Sarcocystis son coccidios de doble husped en los que la lase sexual se da en el intestino de carnvoros y la asexual o extraintestinal se da en los msculos y tejidos de huspedes intermediarios. Los humanos pueden servir como huspedes intermedios o como huspedes definitivos, dependiendo de la especie de Sarcocystis. La infeccin intestinal con S. hominis y S. suihominis se adquiere por ingesta de carne poco hecha (vaca o cerdo) respectivamente, que contiene los quistes tisulares (sarcoquisles), La infeccin suele ser asmtomtica, pero algunos pacientes desarrollan diarrea pasajera, dolor abdominal o anorexia. La infeccin intestinal es autolimitada, ya que la multiplicacin asexual se produce en el husped intermediario y no se repite en el husped definitivo. La produccin de ooquistes se limita por el nmero de organismos ingeridos como sarcoquistes. El diagnstico se hace al detectar los esporoquistes esporulados de 25 x 33 pm en las heces (Fig. 55-6A). Cada esporoquiste maduro contiene cuatro esporozoitos. La pared de los ooquistes es fina y no suele verse o se rompe liberando dos esporoquistes. Estas formas, que se ven mejor en examen directo o en tinciones cido resistentes, parecen ms grandes que los ooquistes de Cryptosporidium, y la tincin de tricromo es de poco valor en la deteccin de estos parsitos. Los hombres tambin puede servir de husped intermediario en muchas especies innominadas de Sarcocystis (conocidos colectivamente como S. lindemannt), en cuyo caso los quistes se encuentran en los msculos esquelticos y cardacos (Beaver. 1979: Strickland, 1999). Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium parvum utiliza un nico husped en su ciclo vital, pero puede infectar a humanos y a una gran variedad de animales, incluidos los de ganado vacuno y ovino. Los parsitos se desarrollan en el borde en cepillo de las clulas endotelales del intestino y a veces se extienden a otras zonas como la vescula biliar, el pncreas o el tracto respiratorio (vanse Fig. 55-6A y Lmina 55-9Cy 0). Cryptosporidium es una causa frecuente de diarrea aguda autolimitada en personas sanas, especialmente en nios. La epidemiologa es similar a la de Giardia. Uno de los mayores brotes conocidos transmitido por agua se produjo en Milwaukee y Wisconsin en el ao 1993. En este brote, ms de 400.000 personas cayeron enfermas por beber agua contaminada con vertidos de granjas tras unas fuertes lluvias (McKenze, 1994). Como los quistes de Giardia y los ooquistes de Cryptosporidium son resistentes a la cloracn habitual del agua potable, y a menos que el agua comunitaria se filtre, pueden darse epidemias. En pacientes con sida, Cryptosporidium puede producir diarrea secretora crnica que puede durar meses o aos y puede acarrear la muerte. El perodo de

incuacin es aproximadamente de ocho das, y en personas previamente sanas puede durar de 9 a 23 das. Los pacientes pueden tener malestar, liebre, anorexia, calambres abdominales y diarrea (Current, 1991; Mannheimer, 1994). El diagnstico se suele hacer examinando las heces. Existen varios mtodos de concentracin que son buenos, incluidas la sedimentacin con formalina-etil actico y la flotacin en azcar de Sheather (Garca, 1983). La disponibilidad del mtodo de formalina-etil actico hace a esta tcnica muy atractiva, aunque se deben incrementar al mximo el tiempo y la velocidad de centrifugacin para maximizar el rendimiento (NCCLS, 1997; Isenberg. 1992), Se prepara una extensin con el sedimento y se tie con tinte cido resistente o reactivos inmunolluorescentes. Se han evaluado muchos mtodos de tincin cido resistente, incluida la auramina-O, pero el que tiene un uso ms extendido es el mtodo de Kinyoun modificado. Los ooquistes esfricos miden de 4 pm a 6 pm de dimetro y cuando se tien de este modo se tornan a un fucsia profundo, aunque hay algunas irregularidades en la intensidad de la tincin y puede variar el porcentaje de los quistes que se tien. Se debe usar un control positivo en cada preparacin. Son especialmente buenos los reactivos de inmunofluorescencia y de EIA, con alta sensibilidad y especificidad (Arrowood. 1989; Murray. 1999; Rosenblatt, 1993; Rusnack, 1989), para los laboratorios donde es poco habitual el hallazgo de Cryptosporidium y donde hay dificultad para la interpretacin de las tinciones cido resistentes. La necesidad de examinar heces para Cryptosporidium depende de la poblacin a cubrir, de los objetivos, de los intereses y de la habilidad del personal del laboratorio. Algunos laboratorios realizan exmenes para Cryptosporidium slo si se pide especficamente y otros examinan todas las muestras de los inmunosuprimidos. Cyclospora cayetanensis. Cyclospora cayetanensis es un parsito coccidio de reciente descripcin responsable de enfermedad diarreica en inmunocompetentes e inmunosuprimidos (Ortega, 1994: Murray. 1999). Se ha deteclado en pacientes de diferentes pases, incluido Estados Unidos, y fue inicialmente descrito como un alga verde-azulada, similar a un cuerpo parecido a una cianobacteria, o como un coccidio (Ortega. 1993). La infeccin produce un cuadro seudogripal, con nuseas, vmitos, prdida de peso y diarrea acuosa explosiva que dura de una a tres semanas. Los ooquistes no esporulados son esferas no retrctiles de 8 pm a 10 pm que contienen un acumulo de glbulos refrctiles englobados dentro de una membrana cuando son vistos al microscopio de luz ptica. Se requieren de una a dos semanas para su esporulacin, despus los ooquistes maduros contienen dos esporoquistes, cada uno con dos esporozoitos. En las tinciones de tricromo los ooquistes aparecen como objetos claros, redondos y algo arrugados. Los ooquistes autofluorecen desde un verde brillante a un azul intenso bajo la epifluorescencia ultravioleta y las tcnicas de tincin con colorante cido resistente modificado o auramina-O. Se deben diferenciar de los ooquistes de Cryptosporidium, que se tien de igual forma pero son ms pequeos (de 4 pm a 6 pm) (Lmina 55-9E).

Microsporidios
Los microsporidios son unos parsitos protozoos lormadores de esporas, intracelulares estrictos, del filo Microspore que infectan a variedad de animales, incluidos los humanos (Franzen. 1999: Shadduck. 1989). Hay importantes patgenos en los huspedes inmunosuprimidos, especialmente en aquellos con sida, siendo responsable en ellos de un gran porcentaje de diarreas inexplicables por otra causa (ms del 30% en algunos estudios) (Curry, 1993). Enterocytozoon bieneusiy Encephalitozoon intestinalis, las dos especies ms frecuentemente implicadas en la infeccin intestinal humana, pueden producir diarrea y prdida de peso en los pacientes con sida, similares a las causadas por Cryptosporidium. E. intestinalis tambin puede producir enfermedad diseminada (Cali, 1993; Willson, 1995). Los organismos se multiplican mtracelularmente (merogonia) y forman esporas resistentes (esporogonia) que rompen ocasionalmente la clula

CAPTULO 55

PARASITOLOGA MDICA

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Figura 55-7. Tamaos relalivos de los huevos de helmintos. (Del CDC. R a m a de Entrenamiento Parasitolgico, Atlanta. GA.)

husped e infectan las clulas adyacentes o se eliminan al exterior. La esporas contienen un tbulo enrollado que se refuerza por el apropiado estimulo ambiental y penetra la membrana de las clulas receptoras. El esporoplasma del parsito se inyecta a travs del tbulo al citoplasma de la clula husped, donde se multiplica. Los reservnos no se han identificado. A veces ha habido pacientes que han sido infectados por otros gneros de microsporidios, incluidos Encephalitozoon (hepatitis, infeccin ocular, enfermedad del sistema nervioso central). Nosema (infeccin diseminada) y Pleistophora (miosis) (Curry. 1993: Shadduck. 1989). entre otras (Franzen. 1999). Hasta hace poco, el diagnstico requera el examen de los tejidos al microscopio de luz ptica (Lmina 55-9Fy G) y al microscopio electrnico. El desarrollo de una tincin de tricromo modificada para el examen de muestras fecales para esporas ha resultado un importante avance en el diagnstico (Weber. 1992). Con este mtodo, las pequeas esporas elpticas (de 1,5 pm a 3 pm) se tien de rojo sobre un fondo dbilmente verde, y algunas poseen una caracterstica banda cruzada (Lmina 55-9H). Tambin se han descrito modificaciones de este mtodo. Las tinciones fluorocromas, as como la Uvitex 2B y la calcotlor blanco, parecen ser ms sensibles en la deteccin de esporas y pueden ser tiles en el screening inicial de la muestra (DeGirolami, 1995: Luna, 1995: van Gool, 1993). El pequeo tamao de las esporas hacen de su deteccin todo un reto.

hasta cerca de 10 m de longitud, y para los huevos de 25 pm a 150 pm (Fig. 55-7). Es importante una comprensin de los ciclos vitales de los helmintos y de su distribucin geogrfica para el conocimiento de las fases parasitarias que pueden encontrarse ante una sospecha, qu rganos o tejidos pueden afectarse y cundo se puede esperar que aparezcan los diferentes estadios tras la exposicin. Aunque el diagnstico suele depender del hallazgo e identificacin de un estadio del desarrollo (huevo, larva o adulto), algunas infecciones se puede diagnosticar principalmente por la clnica o los datos serolgicos, o ambos. Ciertas especies tienen ciclos de desarrollo donde los estadios infecciosos se pueden transmitir directamente de persona a persona (Enterobius y H. nana). En otros (Trichuris. Ascaris y Trichostrogylus) se requiere un periodo extra de maduracin en el extenor del husped antes de que el huevo o la larva sean infecciosos. La ingesta de los estadios infecciosos puede ser accidental por el parsito vector iDipylidium. Hymenolepis). plantas (Fasciolopsis. Fasciola) o tejidos animales (Trichinella, Taenia. Diphyllobolhrium. Clonorchis. Opisthorchis. Paragonimus. Heterophyes. Melagonimus y Nanophyelus). En algunos casos las larvas pueden penetrar directamente la piel (uncinarias. Strongyloides y esquistosomas). La deteccin e identificacin de los huevos y larvas en heces, orina o esputo requieren una sistemtica aproximacin y el entrenamiento adecuado del personal. El tamao de los huevos y de las larvas es una caracterstica especialmente importante, y con frecuencia se requiere el uso de un micrmetro ocular calibrado. Se debe prestar atencin a las caractersticas externas d e los huevos, incluida la forma, el grosor de la pared, la presencia o ausencia de cubierta mamelonada. oprculos, hombros operculares. botn, tapn polar o espinas. Tambin se debe observar el desarrollo de los huevos (embrionados o sin embrionar) la presencia o ausencia de ganchos, que caracterizan a los cestodos. El examinador tambin necesita conocer la gran variedad de artefactos que se detectan en las heces y que pueden simular huevos o larvas (Tabla 55-4).

HELMINTOS INTESTINALES
Los helmintos intestinales aqu tratados incluyen nematodos (gusanos redondos), cestodos (tenias) y tremtodos (lombrices), que residen como adultos en el tracto de gastrointestinal o en otras localizaciones (hgado, pulmn o sangre) y que producen huevos que salen dei cuerpo humano por va intestinal. Los tamaos para los helmintos adultos van desde 1 m m

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Nematodos

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un grueso caparazn con estras radiales y tapones mucosos que son poco llamativos. Ascaris lumbricoides. Este es el nematodo ms largo que afecta al tubo digestivo humano y probablemente el gusano intestinal redondo ms frecuente, puesto que infecta a aproximadamente 1 , 3 billones de personas en todo el mundo (Markell, 1999). Afecta principalmente a regiones con pobre higiene y, como el Trichuris, es ms comn en nios, siendo, a su vez, los ms predispuestos a las infecciones graves. Ascaris adulto vive principalmente en el duodeno y en el yeyuno proximal. Las hembras miden ms de 35 cm de largo por 6 m m de dimetro. El m a c h o es algo ms pequeo y tiene un extremo curvado ventralmente, a diferencia de la hembra (Lmina 55-10F). Tanto los inmaduros como los adultos se pueden identificar por la presencia de tres labios prominentes en su porcin anterior. Las hembras producen unos 2.000 huevos al da, que estn sin embrionar y requieren de 4 a 6 semanas en un ambiente ptimo para que sean infectivas. Posteriormente, al ingerirlos alcanzan el intestino y las larvas penetran en la mucosa llegando al torrente circulatorio. De ah son transportados a los pulmones, donde maduran rpidamente en el lecho capilar alveolar y luego pasan al alvolo. Los mecanismos de aclaramiento mucociliar los arrastran hasta la epiglotis y nuevamente son ingeridos y se hacen adultos en el intestino. Desde que son huevos hasta que alcanzan el estadio adulto pasan aproximadamente dos meses. La clnica de la ascariasis va desde la infeccin asintomtica a la enfermedad grave. El paso de las larvas por los pulmones puede causar u n a neumonitis por Ascaris o un sndrome de Lffler, caracterizado por infiltrados pulmonares difusos bilaterales y bronquitis con eosinoflia asociada. Este sndrome es infrecuente y habitualmente se produce en individuos previamente expuestos a los antgenos de los Ascaris.

Enterobius vermicularis. La infeccin por Enterobius u oxiuros es la infeccin helmntica ms frecuente en nios de todos los estratos sociales en EE.UU. Aunque es principalmente tpica de los nios, la rpida maduracin de los huevos permite que sea fcilmente transmitida de nio a nio y a adultos tanto en familias como en instituciones. Los gusanos machos o hembras viven principalmente en el ciego y en las reas adyacentes. Las hembras miden ms de 13 mm y tienen un extremo posterior puntiagudo que da pie a su nombre, oxiuro. Ambos sexos tienen prominentes alas laterales que se ven en una seccin axial y un bulbo esofgico prominente (Lmina 55-1OA a C). Aunque los machos rara vez son vistos, las hembras se pueden encontrar en la superficie de las heces o en la piel perianal, especialmente por la noche, donde deposita sus huevos; stos son incoloros y ovoidales con un lado aplanado y miden entre 20 pm y 40 pm de ancho y de 50 pm a 60 pm de largo (Lmina 55-106). Se hacen infectivos en horas y Iras ser ingeridos completan el desarrollo hasta adultos grvidos en un mes (perodo de latencia). Aunque la infeccin puede ser asintomtica. los nios frecuentemente tienen prurito anal, irritabilidad e insomnio. La infeccin por Enterobius debe ser descartada en todo estudio de enuresis. Los gusanos adultos pueden migrar a zonas inusuales, como la vagina, la trompa de Falopio o la cavidad peritoneal. Su muerte en estas localizaciones puede producir una reaccin inflamatoria granulomatosa (Symmers. 1950). La deteccin de los huevos y. a veces, de los gusanos adultos en la piel perianal se hace mediante la tcnica de papel de celofn durante el sueo o a primera hora de la maana (Ash, 1987; Garca, 1997). En el examen habitual de las heces slo se detecta del 5% al 10% de los casos. Se requiere un examen de muestras tomadas en diferentes das para poder detectar los huevos (Sadun, 1956).

La presencia de escaso nmero de gusanos en el intestino no suele advertirse, mientras que la infeccin grave produce diferentes grados de diarrea y dolor abdominal. Tambin puede producirse una obstruccin Trichuris thchiura. La infeccin por Trichuris es tpica de las zonas trointestinal con una masa de gusanos, especialmente en nios. Incluso con picales y subtropicales. Los gusanos adultos se hallan en el intestino y espepoco nmero de gusanos, hay que estar alerta, ya que tienen facilidad para cialmente en el ciego, pero las infecciones graves se pueden ver en el colon invadir sitios ectpicos, como la va biliar y el hgado, el apndice y el y en el recto. Los machos y hembras miden ms de 50 mm de longitud y perestmago. La fiebre y el tratamiento pueden favorecer su migracin. En las manecen en la mucosa por el extremo anterior, que es fino, mientras que el zonas endmicas con frecuencia se usan antihelmnticos antes del uso de otro extremo, ms grueso, cuelga libremente en la luz. La hembra es alargaanestesia en la ciruga. da, mientras que la cola de los machos es enrollada (Lmina 55-10D). TriEl diagnstico se realiza al visualizar los huevos en las heces o por la churis tiene un ciclo vital en el que los huevos salen con las heces sin deteccin de un gusano adulto en el vmito o en las heces. Un recuento embrionar y tarda varias semanas, en las adecuadas condiciones de la tiemenor de 20 huevos por extensin (2 mg de heces) indica infeccin leve, y rra, en madurar a un estadio infectivo. Cuando se digieren huevos embriosi es mayor de 100 huevos, por extensin, indica infeccin grave. nados, se liberan larvas y maduran en el colon, donde se fijan y viven ms Los huevos frtiles de Ascaris pueden ser redondos o ligeramente ovales, de diez aos. con una cubierta irregular externa, mamelonada, amarilla-marrn y con un Las infecciones leves suelen ser asintomticas, pero cuando hay muchos caparazn grueso. Los huevos que pierden su cubierta se llaman decorticaparsitos (ms de 300 gusanos) pueden aparecer diarrea o sntomas de dos y pueden asemejarse a los de las uncinarias. Se eliminan sin embrionar disentera junto con deshidratacn y anemia (Beaver, 1984; Strickland, 1999). y miden aproximadamente de 55 pm a 75 pm de largo por 35 pm a 50 pm de Una posible complicacin en nios con infecciones graves es el prolapso recancho (Lmina 55-10G y H). Las hembras pueden producir huevos sin fertilital (Cooper, 1988). zar, que son ms largos y ms alargados (ms de 90 pm de longitud) y tienen El diagnstico se hace al hallar los huevos en las muestras fecales o una cubierta ms fina y con mamelones irregulares. Estos huevos estn llecon tcnicas de conservacin. Los huevos son como barriles, con unos nos de gotas de grasa irregulares. tapones refrctiles en ambos extremos, y suelen medir de 50 pm a 55 p m Trichostrongylus spp. La enfermedad humana causada por Trichosde largo por 22 pm a 24 pm de ancho (Lmina 55-10E). A veces, los trongylus spp. representa una infeccin zoontica, ya que infecta principalhumanos se pueden infectar por el gusano del perro, T. vulpis, que posee mente a herbvoros como la oveja, la vaca o las cabras. Hay distintas espeunos huevos ms grandes y anchos que los de Trichuris trichiura. A veces cies que pueden infectar a humanos como, T. colubriformis. T. orientalis. T. pueden ser necesarias tcnicas de cuantificacin de los huevos para valoaxei y T. brevis, que se encuentran en muchas partes del mundo. Los gusarar la intensidad de la infeccin, la eficacia del tratamiento y la tasa de nos adultos habitan en el intestino y producen huevos que maduran en el reinfeccin. exterior. Las larvas salen y se colocan entre la tierra y la vegetacin, donde pueden ser ingeridos por sus huspedes definitivos. A diferencia de las unciCapillaria philippinensis. Este parsito, que normalmente se narias. no invaden la piel directamente ni poseen una fase migratoria por los encuentra en pjaros que se alimentan de peces, afecta a humanos que pulmones. Las infecciones suelen ser leves y asintomticas, pero las graves comen pescado crudo y que contiene larvas. Aunque se describi en pueden dar diarrea y dolor abdominal, habitualmente con eosinoflia. Los huepersonas de Filipinas, y luego en Tailandia, a veces se ven casos en vos son semejantes a los de las uncinarias pero ms largos y estrechos, de otras partes de Asia. Oriente Medio y Sudamrica (Cross, 1992). Puede 78 pm a 98 pm por 40 pm a 50 pm y ligeramente ahusados en un extremo. producir diarrea crnica y los infectados pueden eliminar huevos, larvas y gusanos adultos en las heces. Los huevos son similares a los de TriUncinarias. Las uncinarias, que estn entre los helmintos que con ms churis, aunque miden de 36 pm a 45 pm de largo y 21 pm de ancho, con frecuencia afectan a los humanos, se dan en regiones tropicales y subtropi-

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secundaria. Por cada adulto de A. duodenale se pueden perder entre 0.15 I y 0.25 mi de sangre al da. comparado con los 0,03 mi de cada N. americanus. El crecimiento del nio puede verse afectado con la infeccin crnica. La prdida de sangre y el nmero de uncinarias se correlacionan con el numero de huevos por gramo de heces, lo que puede a ayudar a determinar cundo empezar el tratamiento en pacientes en reas endmicas (Layrisse, 1964a, 1964b). El diagnstico se realiza por el hallazgo de huevos de cubierta fina en las heces. stos son parcialmente embrionados cuando se eliminan y miden de 58 um a 76 pm de longitud por 36 pm a 40 pm de ancho (Lmina 55-11/4). Los huevos embrionados o de larvas rabdiformes libres pueden encontrarse en muestras sin conservar que no se examinan en su momento. Las uncinarias rabdiformes pueden distinguirse de las de Strongyloides slercolans. ya que las primeras tienen una cmara bucal ms grande y un primordio genital que no llama la atencin (Fig. 55-8). La maduracin de las larvas tiene como consecuencia la aparicin de filaras infectivas, que tienen un extremo puntiagudo y un esfago que mide aproximadamente un cuarto de su longitud. Los huevos de uncinarias se deben diferenciar de los de Trichostrongylus spp. (que son ms largos y ms picudos) y de los de los nematodos de las plantas, especialmente Heterodera spp. (que son ms largos, con el extremo romo, que pueden ser asimtricos) (Lmina 55-116). Aunque los adultos se pueden diferenciar segn las partes de la boca y la bolsa copulatoria de los machos, los huevos de las uncinarias humanas son indistinguibles. En el examen directo, un recuento de menos de cinco huevos por portaobjetos denota infeccin leve, que raramente puede producir anemia, mientras que ms de 25 indica infeccin grave y que fcilmente puede asociarse a sntomas. Figura 55-8. Larvas de uncinarias y de Strongyloides slercolans A. Larva rabdiloiStrongyloides stercolaris. La infeccin por Strongyloides se da en de de S. slercolans en heces humanas. Obsrvese el corto tamao de la cavidad muchas zonas de los trpicos y subtrpicos, pero la infeccin tambin se bucal y el gran primordio genital (GP). 6, Larva rabditoide de uncinarias vista en las produce en zonas templadas y que histricamente fueron reas endmicas heces dejadas 24 horas a temperatura ambiente. La cavidad bucal es ms larga y del sureste de los Estados Unidos. Las hembras adultas miden de 2 mm a el primordio es ms corto 3 mm y viven unidas a la mucosa del duodeno, donde se reproducen por padenognesis (Lmina 55-11C), Los machos no se dan en los vertebrados. Los huevos se abren en el intestino, liberando la lase inicial o larvas rabditoides que salen en las heces (los huevos casi nunca se hallan). En este ciclo directo las larvas rabditoides se transforman en diarias infectivas de tercer estadio en el suelo. Estas larvas infectivas penetran con facilidad la piel de los individuos y migran a los pulmones por va circulatoria, y de ah al rbol bronquial, siendo nuevamente deglutidas. Es entonces cuando se completa el desarrollo a estadio adulto. Bajo unas condiciones de suelo adecuadas con gran humedad, se puede dar un ciclo indirecto transitorio cales y en algunas zonas templadas. Necaloramericanus se halla en EE.UU. en el que las nuevas larvas evolucionan a una generacin de vida libre y en otras partes del mundo, superponindose su distribucin con la de consistente en machos y hembras reproductivas. Los huevos asi formados Ancylostoma duodenale. que no se da en EE.UU. desarrollan larvas filariformes que infectan de nuevo a los humanos. Una Las hembras adultas miden ms de 12 mm y los machos un poco metercera variante del ciclo de vida de Strongyloides consiste en autoinfecnos. Los machos se diferencian por la bolsa copulatoria con forma de abacin. en la que la maduracin del estadio filariforme se completa en el tracnico en su extremo posterior. En el extremo anterior tienen una cpsula to intestinal, con la consiguiente reinvasin de la mucosa intestinal o de la bucal que contiene dientes o lminas cortantes. Ambos sexos se fijan a la piel perianal. mucosa intestinal, donde pueden vivir ms de dieciocho aos (Beaver, 1988). Los huevos se eliminan por las heces y se desarrollan rpidamente segn las condiciones. Las larvas rabdiformes se liberan y se hacen infectivas en su estadio de filaras en unos siete dias. Cuando contactan con el husped apropiado, las larvas penetran la piel y posteriormente acceden a la circulacin llegando a los pulmones, desde donde suben por el rbol bronquial hasta ser nuevamente deglutidas. Cuando maduran en el intestino, comienzan a poner huevos. Aunque poseen ciclos de vida similares, Ancylostoma puede madurar directamente en el intestino si se ingiere la larva infectiva. Las uncinarias pueden causar patologa cutnea en el sitio de entrada de la larva. Esto se caracteriza por inflamacin, eritema y ampollas con gran picor. Su paso por el pulmn puede causar sndrome de Lffler, como se describi para Ascaris. Dependiendo de la carga de gusanos, la infeccin intestinal puede dar gastroenteritis con dolor abdominal, diarrea y nauseas. Sin embargo, las uncinarias son ms conocidas por su capacidad para causar prdida crnica de sangre con anemia ferropnica La clnica es variable y depende de la cepa adquirida (Genta, 1989). L a migracin de las larvas de tilarias puede causar irritacin, eritema y prurito en el punto de entrada, mientras que una emigracin tarda por los pulmones puede producir sndrome de Lffler (Purtilo. 1974). La clnica intestinal se asocia a la intensidad de la infeccin, pudindose producir sntomas de ulcera pptica, dolor abdominal y diarrea. Se han descrito una infeccin crnica con un sndrome de malabsorcion. La capacidad del parsito para autoinfectar puede perpetuar la infeccin durante dcadas, como se observ en tropas aliadas que estuvieron prisioneras en la guerra del sudeste de Asia durante la Segunda Guerra Mundial (Gil, 1979). Por otra parte, en pacientes sanos, la autoinfeccin puede causar larva currens (lesiones urticariformes lineales). En pacientes inmunosuprimidos, alcohlicos o desnutridos la autoinfeccin puede acabar en una hiperinfeccin con riesgo vital por una reproduccin rpida del parsito (Genta. 1992; Maaen, 1987). A veces, una forma de presentacin de la hiperinfeccin es una neumonitis grave, seguida de diarrea, enteritis y septicemia. En los pacientes de las reas endmicas se

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debe descartar Strongyloides antes de terapias inmunosupresoras (Stickland. 1999). El diagnstico se hace por el hallazgo e identificacin de las tpicas larvas rabdiformes en las heces, aunque el examen O/P no siempre logra revelarlas (Lmina 55-110) (Genta. 1989; Pelletier, 1988). Las larvas rabdiformes de Strongyloides se deben diferenciar de las de las uncinarias. y se caracterizan por una cavidad bucal corta y un primordio genital prominente (Fig. 55-8). Las larvas filariformes de Strongyloides tienen una cola con una muesca y un esfago que mide aproximadamente la mitad de su cuerpo. Ambos estadios larvales pueden verse con lacilidad en muestras frescas con bajo aumento. Si se detectan larvas filariformes infectivas en una muestra reciente, es diagnstico de superinfeccin (Eveland. 1975). El examen del aspirado duodenal o de las muestras del test de la cuerda puede ser til en las sospechas con un examen de ordinario negativo. El mtodo de concentracin del embudo de Baermann o una de las tcnicas de coprocultivos (vase previamente en Mtodos de laboratorio) pueden demostrar tambin la infeccin (Ash, 1987; Garca, 1999; Genta, 1989). Las larvas pueden hallarse en el espulo o en otras muestras pulmonares, especialmente en los sndromes de hiperinfeccin. Los test serolgicos son tiles cuando se sospecha la infeccin, pero no se logra demostrar por otros mtodos. El EIA y otros test poseen buena sensibilidad y especificidad aunque pueden existir reacciones cruzadas con las filaras y otras infecciones por nematodos. Estos test no suelen distinguir entre infeccin pasada y actual, pero son tiles para ver la respuesta al tratamiento (Wilson, 1995). Anisakiasis. Vase ms adelante en Helmintos tisulares.

Las larvas de cestodos se hacen infectivas tanto en los cuerpos de los huspedes vertebrados como de los invertebrados, segn las especies, y completan su ciclo vital cuando son digeridos por un husped definitivo. Las larvas de muchas especies pueden infectar a humanos, produciendo cisticercosis. hidatidosis. esparganosis y cenurosis. Estos cuadros se explican ms adelante bajo el epgrafe de Helmintos tisulares Taenia saginata. Los humanos son los nicos huspedes definitivos de Taenia saginata, el gusano plano de la vaca. Aunque su distribucin es mundial, son especialmente comunes en Oriente Medio, frica. Europa. Asia y Amrica latina. En EE.UU. es espordico. Los cisticercos larvales (Cysticercus bovis) se desarrollan en los tejidos del ganado que pasta en tierras contaminadas con desechos humanos. Cuando los humanos comen carne de vaca cruda o poco hecha, los cisticercos se transforman en un adulto frtil dentro del intestino en un plazo de dos a tres meses. Los sntomas son infrecuentes, pero pueden incluir malestar abdominal y diarrea. A diferencia de 7! solium. los huevos de I saginata no son infectivos para los hombres y su ingesta no provoca cisticercosis. El diagnstico se realiza al encontrar los huevos en las heces con tcnicas directas o de concentracin, o en los pliegues perianales mediante la tcnica de papel celofn. Los huevos son esfricos y miden de 31 pm a 43 pm de dimetro (Lmina 55-12A). La cubierta es gruesa y radialmente estriada, con embriones con seis garfios. Los gusanos de la especie Taenia son indistinguibles y deben informarse nicamente como huevos de Taenia. La identificacin de las especies se debe hacer recuperando las progltides o, a veces, los esclex. Las progltides tienen una caracterstica protuberancia lateral conocida como poro genital. La inyeccin de tinta china por dicho poro usando una aguja fina puede lograr definir el tero. El tero grvido de 7aen/'a saginata tiene de 1 5 a 20 corchetes laterales, mientras que el de T. solium tiene de 7 a 1 3 (Fig. 55-9: Lmina 55-126). Las progltides tambin pueden ser aclaradas por la noche en glicerol o teidas con carmn o hematoxilina mediante las tcnicas descritas (Ash. 1987). Si se aisla, el esclex de T. saginata se puede identificar por la presencia de cuatro ventosas y la ausencia de garfios en la corona o rstelo. Taenia solium. Taenia solium. el gusano plano del cerdo, es ms frecuente en Europa, especialmente en Europa del este, Amrica latina, China, Pakistn y la India. Ocasionalmente puede verse en los Estados Unidos, principalmente en inmigrantes. La infeccin con el gusano adulto se adquiere por la ingesta de cerdo poco hecho o crudo que contiene cisticercos (C. cellulosae). Cuando hay sntomas, stos son idnticos a los de la infeccin por T. saginata. Un dato importante es que la ingesta de huevos de T. solium, bien a partir de un gusano adulto o bien por comida contaminada, puede acabar en cisticercosis (Schantz, 1992). Se pueden encontrar ms detalles en Helmintos tisulares. Los procedimientos para el diagnstico de infeccin intestinal por T. solium son los mismos que los usados para T. saginata, aunque son aparentes ciertas diferencias morfolgicas. En el esclex de T. solium existen

Cestodos
Los cestodos o gusanos planos son platelmintos similares a cintas que viven en el tracto intestinal de los vertebrados como adultos, y en los tejidos o cavidades corporales de diferentes huspedes intermediarios, como larvas. Se unen a la mucosa intestinal por un esclex. o un rgano de sujecin, en el extremo anterior, que puede tener ventosa, surcos (botrios) o un rstelo con garfios segn las especies. El cuerpo del gusano, o estrbilo, se compone de una regin cervical de crecimiento activo y una serie de progltides que se desarrollan secuencialmente a lo largo de los estadios inmaduro, maduro y, finalmente, grvido en el extremo posterior. Cada progltide posee tanto gnadas femeninas como masculinas, y est capacitada para producir huevos frtiles. Los huevos de la mayora de los cestodos son infecciosos (excepto los de Diphyllobothrium) y pueden diferenciarse fcilmente de los de otros helmintos por la existencia de un embrin con seis ganchos. Segn las especies, los huevos se eliminan con las heces o se liberan como progltides. No es infrecuente para algunas especies con gran longitud de estrbilos que stas se eliminen intactas o que las progltides migren activamente por el ano. Las especies largas de Taenia y Diphyllobothrium pueden llegar a medir ms de 762 cm y vivir unos 20 aos.

Figura 55-9. Progltides grvidas de distintos g u s a n o s planos humanos. 1, Taenia saginata. 2, Taenia solium. 3. Dipylidium caninum. 4, Diphyllobothrium latum. 5. Hymenolepis spp.

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cuatro ventosas y, a diferencia de T. saginata. el rstelo tiene dos filas de garfios. Las progltides grvidas tienen de 7 a 13 corchetes uterinos laterales (Fig. 55-9). Hymenolepis nana. H. nana, conocida como el gusano plano enano, tiene una distribucin mundial y es la especie de cestodos ms frecuentemente hallada en EE.UU. Es un parsito comn en ratones y el ms pequeo que infecta a los humanos, midiendo hasta 4 c m de largo. El esclex tiene un rstelo armado, y las progltides tienen dos polos genitales localizados en el mismo lado del estrbilo (Fig. 55-9; Lmina 55-12F). El ciclo vital puede ser tanto directo, a travs de la ingesta de los huevos, como indirecto, a travs de la ingesta de huspedes intermediarios (habitualmente por el escarabajo del grano), que contienen larvas cisticercoides. En primera instancia, los huevos se pueden pasar directamente de persona a persona, habitualmente entre nios, o ser ingeridos en la alimentacin, especialmente productos de grano contaminados con excrementos de roedores. Los huevos se anclan en el intestino y el embrin penetra la mucosa, en donde pasa la larva cisticercoide. Posteriormente emergen y se vuelven a anclar en la pared intestinal, donde completan su desarrollo a adultos en dos a tres semanas. La ingesta de escarabajos con lanzas es mucho menos (recuente. La autoinfeccin interna puede producirse en algunos individuos en los que los huevos se anclan rpidamente tras ser puestos por el adulto e invaden rpidamente la pared intestinal sin abandonar el cuerpo. Tal mecanismo es el responsable de los casos espordicos de infecciones masivas. La infeccin sintomtica, caracterizada por dolor abdominal, diarrea, anorexia e irritabilidad, se da en pacientes con gran nmero de gusanos. El diagnstico se hace por el aislamiento en las heces de los huevos ovales de pared fina e incoloros, que miden de 30 um a 47 pm de dimetro (Lmina 55-12D). Contienen un embrin con seis garfios (oncosfera) centralmente localizados separados de la pared por un espacio claro. El embrin posee dos engrasamientos polares de los que surgen finos filamentos que se extienden en el espacio claro hasta alcanzar la pared. A veces se pueden detectar estrbilos intactos si se examinan las heces detenidamente. Hymenolepis diminuta. El gusano plano de la vaca. H. diminuta, tiene una distribucin cosmopolita y. a veces, infecta a los humanos. La infeccin, sin embargo, es infrecuente, ya que necesita un husped artrpodo intermediario en el que las larvas cisticercoideas se desarrollen. La infeccin humana suele producirse por ingesta accidental de escarabajos infectados, que contaminan los productos de grano o cereales. Los gusanos adultos se desarrollan en el intestino, donde pueden crecer hasta 60 cm. Al igual que los de H. nana, las progltides tienen poros genitales en un nico lado, pero se diferencian de estas especies en que el esclex carece de rstelo armado. Las infecciones suelen ser asintomticas debido al pequeo nmero de gusanos que suelen infectar a una persona, aunque se han descrito sntomas intestinales. El diagnstico se obtiene por el hallazgo en las heces de huevos de pared gruesa, ligeramente ovoides, de color amarillo-marrn, que miden de 70 pm a 85 pm por 60 pm a 80 pm (Lmina 55-12E). Los huevos son los que ms fcilmente se confunden con los de H. nana pero se diferencian porque no poseen filamentos polares. Diphyllobothrium spp. Los humanos se pueden infectar por una de las variadas especies de gusanos planos del pescado llamado Diphyllobothrium. que suelen infectar a mamferos que se alimentan de peces y. posiblemente, a pjaros (Connor, 1997; Curts, 1991). Estos parsitos se dan en las zonas templadas, especialmente en el norte de Europa, Escandinavia, la antigua URSS y Japn, La infeccin tambin se produce en Canad y en los estados centrales del norte de la costa pacifica y en Alaska. Aunque Diphyllobothrium latum es la especie conocida que con ms frecuencia infecta a humanos, su diferenciacin no se puede basar en la morfologa de los huevos. El parsito habita en el intestino, donde puede llegar a medir 10 m y persistir durante aos. Los huevos se eliminan por las heces sin embrionar y deben alcanzar un arroyo o un lago para desarrollarse. En las siguientes semanas surge una forma de larva ciliada, el coracidio de los seis garfios, y

es ingerido por un tipo de zooplancton. El coracidio se desarrollar en una larva procercoide. que es infectiva para el segundo husped intermediario, un pez. En ste, el procercoide migra a los tejidos y se transforma en larva de pleurocercoide. Los pleurocercoides pueden escalar la cadena alimenticia y afectar a peces ms grandes. Los humanos lo adquieren a travs de la ingesta de pescado poco hecho o crudo que ha pasado al menos parte de su vida en agua dulce. Los gusanos adultos maduran y se inician en la produccin de huevos en un mes. La infeccin puede ser asintomtica. con la eliminacin de trozos de estrbilos como manifestacin inicial. En otros, puede presentarse un grado variable de molestias abdominales y diarrea. Raras veces puede producirse una obstruccin intestinal. En las reas endmicas del norte de Europa, un pequeo porcentaje de pacientes desarrolla un dficit de vitamina B,, con anemia megaloblstica. El diagnstico se hace al hallar los tpicos huevos marrones, ovalados y operculados en las heces mediante las tcnicas habituales. stos miden de 58 pm a 76 pm por 40 pm a 51 pm y, adems del oprculo, poseen una proyeccin abotonada pequea y redondeada en el extremo (Lmina 55-12F). L a presencia del oprculo es la nica entre los cestodos que infecta a humanos y se debe tener cuidado para no confundir los huevos con los de los tremtodos, especialmente con el Paragommus o Nanophyetus. La identificacin del gnero es posible cuando una porcin de estrbilo o un gusano intacto es eliminado. El esclex es alargado y posee un par de surcos longitudinales conocidos como botrios, que suplen a las habituales ventosas. Las progltides grvidas son ms anchas que largas y tienen sus poros genitales colocados en mitad de la cara ventral, adyacentes al tero con forma de roseta que se halla en el centro (Fig. 55-9; Lmina 55-12G). Dipylidium caninum. D. caninum es un gusano liso frecuente de perros y gatos en la mayor parte del mundo y no es raro que afecte a humanos, especialmente a nios. En su habitual ciclo de vida, los huevos se ingieren por las larvas de pulga, que infestan las reas frecuentadas por perros o gatos. Las larvas cisticercoideas persisten hasta que la pulga pasa al estado adulto. La ingestin accidental de pulgas adultas que contienen el cisticercoide produce la infeccin. Los nios tienen el mayor riesgo de infeccin, ya que estn en gran contacto con animales. Los gusanos maduran en el intestino y crecen hasta 70 cm de largo. La infeccin tiene pocos sntomas, generalmente causados por las progltides que se mueven activamente. L a deteccin se basa en el hallazgo de los huevos tpicos, paquetes de huevos o progltides en las heces. Los huevos son esfricos y contienen un embrin con seis garfios. Miden de 24 pm a 40 pm de dimetro y aparecen aislados o formando paquetes (Lmina 55-12H). El esclex es alargado, con cuatro ventosas y un rstelo retrctil y pequeo. Las progltides tienen forma de barril y dos poros genitales, uno en cada lado, lo que le da el nombre comn de gusano plano de doble poro (Fig. 55-9).

Tremtodos
Los tremtodos, o lombrices, son helmintos dorso-ventralmente aplanados (platelmintos) que incluyen tanto formas hermafroditas (lombrices intestinales, hepticas y pulmonares) como otras con diferenciacin de sexos (lombrices sanguneas o esquislosomas). Todas las especies de los humanos se caracterizan por una ventosa oral, por la que se abre al tracto digestivo, y otra ventosa para su fijacin. Los adultos miden desde 1 m m (Metagonimus) a 70 m m (Fasciola gigantica). Los huevos llegan al exterior eliminados por las heces, el esputo o la orina, segn las especies. Los hermafroditas producen huevos operculados que no estn embrionados (Clonorchis y Opisthorchis son excepciones). Los huevos de esquistosomas no son operculados y cada uno contiene una larva madura cuando se elimina. La larva trematodo. o miracidia. es ciliada y capaz de penetrar los tejidos de un molusco. Cada especie de trematodo usa algn tipo de caracol como primer husped intermediario. Un proceso de multiplicacin asexual compleja dentro de caracoles produce un gran nmero de larvas que nadan libremente y se llaman cercaras.

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MEDICA

Las cercaras de esquistosomas son capaces de penetrar la piel humana directamente, produciendo esquistosomiasis. Las lombrices hermafroditas enquistan en la vegetacin acutica o invaden los tejidos de un segundo husped, como un pez o un cangrejo, segn las especies. La ingesta de estas larvas enquistadas, llamadas metacercarias, produce infeccin humana. La infeccin se produce en muchas zonas tropicales y subtropicales. Su presencia depende de la ausencia de tratamiento de las aguas residuales, de la disponibilidad de los huspedes intermediarios apropiados y, en el caso de las especies hermafroditas. de las costumbres dietticas asociadas a la ingesta de metacercarias. Alguna de estas enfermedades, especialmente la esquistosomiasis, se estn extendiendo debido al incremento del uso de irrigaciones en las reas endmicas. La clnica vara segn el nmero de gusanos parasitarios, los rganos afectados y la respuesta del husped. Muchas infecciones son asintomticas. El diagnstico se hace identificando los huevos tpicos en heces, esputo, orina y, a veces, tejidos. Los mtodos directos y los de concentracin con lormalma-etil actico son ms tiles para el aislamiento de estos huevos, mientras que los mtodos de flotacin con sulfato de cinc son menos satisfactorios. Fasciolopsis buski. Es el trematodo intestinal ms largo que infecta a humanos, variando de 20 mm a 75 mm de largo y de 8 mm a 20 mm de ancho. Se da en China, sudeste de Asia y la India, hallndose con frecuencia en cerdos como reservorio natural. Se adquiere por la ingesta de metacercarias de las plantas acuticas, como el castao de aguas. Los gusanos se unen a la pared del duodeno y del yeyuno, donde maduran a adultos en tres meses. Los sntomas incluyen diarrea, dolor epigstrico y nuseas, si hubiese suficientes gusanos como para producir ulceracin de la mucosa. Puede existir eosinolilia incluso en los asintomticos. El diagnstico se hace al ver los huevos largos (de 130 pm a 140 um por 80 pm a 85 pm), marrones, ovales y de pared delgada (Lmina 55-13/4). El oprculo puede pasar desapercibido y los huevos ser eliminados sin embrionar. La diferencia con los huevos de Fasciola no suele ser posible, aunque las infecciones pueden diferenciarse basndose en la historia geogrfica y en la clnica. Los huevos de tremtodos equinostomas. cuando afectan a humanos, son similares pero ms pequeos (Beaver. 1984). Heterophyes y Metagonimus. Estos dos gneros incluyen un nmero de especies de minsculos gusanos intestinales (de 1 m ma3m m de longitud) que infecta a humanos. Heterophyes heterophyes y Metagonimus yokogawai son parsitos comunes en Asia, pero, (unto con otras especies, se encuentran tambin en otras partes del mundo. La infeccin se adquiere por la ingesta de metacercarias en pescado de agua dulce poco hecho. Aunque son de poca importancia mdica, pueden producir diarrea y dolor abdominal. La infeccin es autolimitada, ya que los gusanos tienen una vida de tan slo unos pocos meses. El diagnstico se realiza por el hallazgo de huevos embrionados y operculados que miden de 20 pm a 30 pm de largo por 15 pm a 27 pm de ancho (Lmina 55-138). La diferenciacin de estos huevos de los de Clonorchis y Opisthorchis es difcil, aunque el oprculo es ms profundo en Opisthorchis. No obstante, tal distincin puede ser importante por razones mdicas. Nanophyetus salmincola. Nanophyetus salmincola es un pequeo gusano intestinal (de 0,8 mm a 1.1 mm) descrito en el este de Siberia y en el noroeste de la costa pacfica de EE.UU. (Eastburn, 1987: Fristche. 1989b). Estos gusanos se adquieren por la ingesta de salmn crudo o poco cocinado o bien ahumado, o por truchas con metacercarias infecciosas. Los sintomas estn en funcin del nmero de gusanos y puede incluir dolor abdominal, diarrea y, a veces, eosinofilia. Los huevos, de 60 pm a 80 pm por 34 um a 50 pm son ovoidales. operculados y de un color marrn amarillento (Eastburn, 1987). Hay un engrosamiento en el extremo de la pared que lo diferencia de botn visto en los huevos de Diphyllobothrium. Fasciola heptica. Las vacas, las ovejas y las cabras de muchas partes del mundo estn infectadas con la lombriz heptica Fasciola heptica y, menos Irecuentemente, con especies de Fasciola giganiica. Los parsitos adultos habitan en el rbol biliar y de|an huevos que se eliminan por las

heces. Las cercaras eliminadas a partir de los caracoles huspedes se enquistan en la vegetacin acutica, donde las metacercarias quedan a merced de los huspedes herbvoros. Los humanos lo adquieren al comer berros. Una vez ingeridas, las larvas pasan la pared intestinal y migran por el peritoneo hasta el higado. Atraviesan la cpsula heptica y el parnquima, llegando a alojarse en el interior de los conductos biliares, donde la puesta de huevos comienza en aproximadamente dos meses. La migracin a travs de higado provoca una reaccin inflamatoria dolorosa en el parnquima y. posteriormente, en los conductos biliares, pudiendo acabar en fibrosis. Las manifestaciones clnicas incluyen clico, ictericia obstructiva, dolor abdominal, colelitiasis y eosinolilia. El diagnstico se realiza al hallar los huevos en las heces. Los huevos operculados. sin embrionar. son de un color marrn amarillento, de 130 pm a 150 um por 63 pm a 90 pm, pudiendo ser difciles de distinguir de los de Fasciolopsis (Lmina 55-13A). Falsas infecciones, como la producida por la ingesta de higado de vaca u oveja infectados, se diagnostican mediante una buena anamnesis y realizando un seguimiento del examen de las heces para buscar la eliminacin de los huevos. Clonorchis sinensis y opisthorchis viverrini. Clonorchis sinensis. la lombriz heptica oriental, y una especie cercana. Opisthorchis viverrini. habitan el sistema biliar de los humanos y de otros piscvoros, incluidos gatos y perros. C. sinensis se da principalmente en China, Taiwan, Corea, Japn y Vietnam, mientras que Opisthorchis viverrini se halla en el sureste de Asia, especialmente en el norte de Tailandia. Tambin se conoce la infeccin humana por O. lelineus en Europa y por Amphimerus pseudolelineus en Ecuador (la misma que O. guayaquilensis). Todos estos parsitos se adquieren al ingerir las metacercarias en pescado crudo o poco cocinado. Las lanzas emigran a la via biliar, donde viven ms de 20 aos y crecen hasta 25 m m (Lmina 55-13C). Producen huevos que se eliminan en la bilis y posteriormente en las heces. Con frecuencia las infecciones son asintomticas, aunque gran nmero de lombrices e infecciones de repeticin pueden producir inflamacin biliar y posterior hiperplasia fibrosa y cirrosis heptica. Se ha descrito el desarrollo de un colangiocarcinoma en las infecciones mantenidas. El diagnstico se realiza al aislar los huevos operculados en las heces. Estos huevos son pequeos, marrones y embrionados (Lmina 55-13D) Los huevos de Clonorchis no pueden ser diferenciados fcilmente de los de Opisthorchis. Ambos miden de 25 pm a 35 um por 1 2 pm a 20 pm y tienen un oprculo prominente y un pequeo botn en el extremo. stos son difciles de diferenciar de los del grupo de Heterophyes'Metagommus. aunque estos ltimos carecen de oprculo y del botn del extremo. Cuando no se logra una identificacin, en el laboratorio deber reflejarse (p. ej.. catalogndolos como huevos de Clonorchis/Opisthorchis/Heterophyes/ Metagonimus). Paragonimus spp. Muchas especies de Paragonimus pueden parasitr los pulmones de gatos, perros y otros carnvoros, incluidos los hombres. P westermani es problemtica en muchas reas de Asia, mientras que en Amrica del Sur y Amrica Central se han implicado diferentes especies, incluidas P. mexicanus. P. caliensis y P. ecuadoriensis. P. kellicotti se ha implicado en ocasiones en casos en Norteamrica, y se han descrito otras especies en frica (Mariano, 1986; Pachucki, 1984; Strickland, 1999). Los gusanos adultos miden hasta 12 mm por 6 mm y Irecuentemente se hallan por parejas en el parnquima pulmonar, donde residen en una cpsula librtica causada por el husped (Lmina 55-13E). La cpsula comunica con los bronquios, pudiendo eliminar los huevos en el espulo o en las heces. Aunque es un caracol el que sirve de primer husped intermediario, los cangrejos de agua dulce sirven como segundos intermediarios para las metacercarias. La ingesta de crustceos crudos o marinados puede causar la infeccin. Las larvas se liberan en el estmago y migran a travs de la pared intestinal al peritoneo, alcanzando, a veces, los pulmones a travs del diafragma. La maduracin tarda aproximadamente de cinco a seis semanas y los gusanos pueden vivir durante aos. Los sntomas, cuando existen, se pueden deber a la migracin de las larvas a travs de los tejidos o ser causados por los adultos asentados en el pulmn. No es infrecuente que los gusanos se desarrollen en zonas ect-

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PARASITOLOGA MDICA

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picas como el peritoneo, tejido subcutneo o el cerebro. La afectacin de los pulmones suele asociarse con fiebre, escalofros y eosinoflia. Una vez estabilizado, los sntomas incluyen tos crnica con abundante expectoracin y episodios de hemoptisis. La radiografa puede mostrar infiltrados nodulares, calificaciones o infiltrados parcheados. Los huevos que permanecen en los pulmones o en sitios ectpicos pueden producir reaccin granulomatosa extensa. El diagnstico se hace al encontrar los tpicos huevos en las heces, en el esputo o en los tejidos. Los huevos de las diferentes especies de Paragonimus no se pueden distinguir fcilmente y se deben deducir segn el rea de origen. Los huevos, operculados y sin embrionar, miden de 80 pm a 120 pm por 45 pm a 70 pm y poseen una capa externa moderadamente gruesa de color marrn amarillenta (Lmina 55-13F). El oprculo es aplanado y suele sobresalir del resto de la pared por unos prominentes hombros. El extremo operculado est algo endosado pero carece de botn. Los huevos de Paragonimus se pueden diferenciar de los de Diphyllobothrium y Fasciola/Fasciolopsis por el tamao. Schistosoma spp. La esquistosomiass, o bilharziasis, est entre las ms importantes enfermedades parasitarias del mundo, afectando entre 200 y 300 millones de individuos. Los machos adultos y hembras habitan en las venas mesentricas o de la vejiga. Las especies ms importantes para los humanos son S. imansoni, S. japonicum, S. mekongi. S. intercalatum y S. haematobium. Las otras especies infectantes de humanos son menos frecuentes. Los esquistosomas adultos y hembras son ms finos y miden cerca de 26 mm por 0,5 mm. Los machos, que son algo ms cortos, se abrazan a la hembra con unos mrgenes laterales del cuerpo (el canal ginecforo) para fecundarla. Cuando se examinan in situ, los esquistosomas son encontrados frecuentemente copulando. En este sitio de asiento producen poca o ninguna respuesta inflamatoria. Los huevos se depositan en las vnulas, donde pueden causar una gran respuesta inflamatoria que resulta en una expulsin de los huevos a la luz intestinal o a la luz de la vejiga. La patogenia est en funcin del sitio, el nmero de huevos y la respuesta de los husped a los antgenos de los huevos. Los huevos estn totalmente embrionados cuando se eliminan y listos para eclosionar cuando se depositan en agua dulce. El miracidio penetra en un caracol apropiado, donde sufre una transformacin y una extensa divisin asexual. Tras cuatro semanas, un gran nmero de cercaras de cola bfida emergen del molusco. stas nadan durante horas y penetran fcilmente en la piel del husped susceptible, incluidos los humanos. Tras la penetracin, las cercaras, llamadas ahora esquistosomulas, pasan a la circulacin atravesando los pulmones antes de llegar a los vasos mesentricos-porta. La clnica se produce en primer lugar por la penetracin de la cercara (dermatitis cercarial). por el inicio de la puesta de huevos (esquistosomiasis aguda o fiebre de Katayama) y como una complicacin tarda de la proliferacin tisular y reparacin (esquistosomiasis crnica). Tras la penetracin de la cercara, puede aparecer un exantema papular con prurito en cuestin de horas. Este es un fenmeno de sensibilizacin producido por una exposicin previa a los antgenos de cercara. La forma ms grave de dermatitis se da en individuos que tienen una exposicin repetida a esquistosomas de cercaras. La dermatitis por cercaras o picor del nadador se produce en todo el mundo y es una entidad bien conocida en EE.UU. (Hoeffler, 1974). El comienzo de la puesta de huevos por adultos entre las cinco y siete semanas puede producir una esquistosomiasis aguda o fiebre de Katayama, un sndrome similar a la enfermedad del suero que se da en las infecciones primarias graves, especialmente en las del S. japonicum. La respuesta al antgeno es a travs de la produccin de inmunocomplejos (Boros, 1989). La infeccin crnica produce puesta continua de huevos, pudiendo permanecer algunos en el cuerpo. Alrededor de esos huevos se producen granulomas en el intestino y en la vejiga y se van sustituyendo por colgeno pudiendo causar fibrosis y cicatrizacin. Los huevos atrapados en el hgado pueden causar fibrosis con obstruccin del flujo portal. A veces, los huevos se depositan en lugares ectpicos, como la mdula espinal, los pulmones o el cerebro.

El diagnstico se hace viendo los huevos en las heces u orina por e x a m e n directo o mtodos de concentracin con formalina-etil actico. La concentracin con sulfato de cinc no es satisfactoria para deteccin de los huevos pesados de esquistosomas. Los huevos tambin pueden detectarse en las biopsas de recto, vejiga y, a veces, del hgado (Lmina 55-14). El uso de mtodos de eclosin de huevos puede emplearse a veces para determinar su viabilidad o, menos frecuentemente, para detectar la enfermedad leve. La mezcla de heces con agua destilada se coloca en un frasco cubierto por papel de aluminio para protegerlo de la luz, exponiendo a una luz brillante slo el cuello o un lateral. Los miracidios, si estuviesen presentes, nadaran hacia la luz y se podran detectar con una lupa. Los test serolgicos pueden ser tiles para el screening en personas que han viajado a zonas endmicas y que. aun teniendo orina o heces negativas, tienen el riesgo de infeccin, o para monitorzar la respuesta al tratamiento. Aunque no est totalmente disponible, hay laboratorios de referencia y el CDC puede realizarlo. Generalmente, los test serolgicos varan segn el antgeno empleado y la metodologa usada. El CDC usa el test del screening de Falcon. una tcnica inmunoabsorbente con enzima fijadora (FAST-ELISA). Aquellos que son positivos en el screening se evaluarn posteriormente por inmunoblot para aumentar la especiticidad (Wilson, 1995). Schistosoma mansoni. S. mansoni se da en frica, especialmente en reas tropicales y en el delta del Nilo, Sudfrica y Madagascar, Brasil, Venezuela, Surinam y algunas islas del Caribe, incluido Puerto Rico. Los adultos de S. mansoni viven principalmente en la vena porta y en la mesentrica inferior. La puesta de huevos en el intestino produce dolor abdominal y disentera, con abundante aparicin de sangre y moco en las heces. En este momento se pueden detectar huevos en las heces. La infeccin crnica puede acabar produciendo fibrosis heptica e hipertensin portal, segn el nmero de gusanos. Los huevos son ms difciles de encontrar en esta fase. Los huevos, que miden de 1 1 6 pm a 180 pm por 45 pm a 58 pm, son ovalados, con una espina lateral larga que sale del huevo cerca del extremo (Lmina 55-14A y S). Si la espina no se viese, el huevo podra estar rotado en el cubreobjetos. En el caso de que la larva sea viable, puede ser evidente el movimiento del miracidio dentro de los huevos en las muestras sin fijar. Se pueden necesitar tcnicas de concentracin para detectar huevos, ya que los individuos con exposicin limitada o con infeccin crnica pueden eliminar pocos. Schistosoma japonicum. Schistosoma japonicum. que se da en China, sureste de Asia y Filipinas, produce una patologa que es similar a la de S. mansoni. pero frecuentemente ms grave porque se producen ms huevos (aproximadamente diez veces ms). Esta enfermedad ha sido erradicada en Japn, aunque an existen reservnos animales. Los gusanos adultos viven en el territorio de la vena mesentrica superior y los huevos alcanzan fcilmente el hgado, causando fibrosis e hipertensin portal, siendo la complicacin ms frecuente de la infeccin crnica. El menor tamao de los huevos predispone a su diseminacin, especialmente al cerebro y la mdula espinal. Los huevos suelen ser ovalados, de entre 75 pm y 90 pm por 60 pm a 68 pm, con una espina lateral que pasa desapercibida, por lo que es difcil de demostrar (Lmina 55-14C y D). Schistosoma mekongi. Esta especie se da en reservnos humanos y en animales de pases a lo largo del ro fvlekong, especialmente Camboya y Laos (Bruce, 1980). Es similar al S. japonicum, pero se diferencia por varias caractersticas biolgicas y por los huevos ms pequeos (de 60 pm a 70 pm por 52 pm a 62 pm), que de otro modo seran indistinguibles de los de S. japonicum. Schistosoma haematobium. La esquistosomiasis urinaria se da en muchas partes de frica. Oriente Medio y Madagascar. Los parsitos emigran por va hemorroidal al plexo venoso de la vejiga, la prstata, el tero y la vagina. Uno de los sntomas ms comunes y tempranos es la hematuria, especialmente al final de la miccin. La enfermedad crnica puede causar dolor plvico y clico vesical con tenesmo vesical. El acumulo de huevos en los tejidos puede producir hipertrofia del urotelio, metaplasia escamosa y fibrosis, que puede progresar a obstruccin y, finalmente, fracaso renal. La

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MICROBIOLOGA MDICA

esqustosomass urinaria se ha asociado tambin a carcinoma escamoso de vejiga (Badawi. 1992). Los huevos se aislan de la orina mediante el examen del sedimento. stos son alargados, de 1 1 2 pm a 1 8 0 iim por 40 pm a 70 pm con una caracterstica espina terminal (Lmina 55-14). A veces se detectan en las heces o en la biopsia del recto. Schistosoma intercalatum. Esta especie se da en muchas partes de lrica central y en frica occidental y produce esquistosomiasis intestinal. Los huevos tienen una espina terminal similar a la del S. haematobium, pero se dan principalmente en las heces y son ms largos (de 140 pm a 240 pm por 50 pm a 85 pm).

do evolucionar a linfedema y fibrosis obstructiva (Lmina 55-15A). La afectacin grave de los miembros inferiores y de los genitales produce elefantiasis. En la mayora de las reas, las microfilarias circulan por la sangre perifrica con una periodicidad nocturna que corresponde con las actividades alimenticias de los vectores habituales (mosquitos Culex. Aedes y Anopheles). La infeccin del pacfico Sur suele ser sin periodicidad. Los microfilarias estn envainadas, aunque esto puede no ser evidente con la tincin de Giemsa. La cola es punteada y no hay ncleos en la punta. El espacio ceflico no es tan largo como ancho y los ncleos de la columna nuclear son diferenciales (Fig. 55-10; Lmina 55-15S). Pueden ser necesarias tcnicas de concentracin para su aislamiento, ya que las microfilarias suelen estar en pequeo nmero. Brugia malayi. Esta especie produce una enfermedad similar a la de W. bancrofti. aunque suele ser ms moderada y con mayor frecuencia afecta a los linfticos de los miembros superiores. Se da principalmente en la India, sudeste de Asia, Corea, Filipinas y Japn. La infeccin humana por especies zoonticas se encuentran peridicamente en EE.UU. La microfilaria circula por la sangre de un modo peridico. Sus vainas se tien bien con Giemsa. La punta tiene un ensanchamiento con dos ncleos solitarios al final de la columna nucleada (llamados ncleos subterminal y terminal). El espacio ceflico puede ser ms largo que ancho (Fig. 55-10; Lmina 55-15C). B. timones otra especie que se da en el este del archipilago indonesio, especialmente en las islas de Timor y Flores. Sus microfilarias son muy similares a las de la B. malayi, aunque algo ms largas.

HELMINTOS TISULARES Nematodos Filaras

Los nematodos filariales son parsitos comunes de los vertebrados transmitidos por artrpodos. Los adultos son largos y finos, midiendo cerca de 100 mm. y es sabido que afectan distintos tejidos, como el subcutneo, linfticos, vasos sanguneos, espacio pleural y peritoneal, corazn y cerebro. Todos producen larvas denominadas microfilarias, que pueden detectarse en la sangre o en la piel, segn las especies. Las microfilarias de algunas especies circulan por la sangre con una periodicidad bien definida (tanto diurna como nocturna), mientras que otras no. Las microfilarias siguen su desarrollo slo en el apropiado artrpodo vector, usualmente un mosquito o una mosca, donde maduran a la fase infectiva. Cada larva es entonces depositada en los tejidos de un husped definitivo cuando el vector se alimenta de sangre. El diagnstico se hace por el hallazgo de microfilarias en la sangre o en la piel, ya que los estadios adultos son habitualmente secuestrados en los tejidos. El uso del Irotis sanguneo grueso teido con Giemsa o hematoxilina es la tcnica habitual, aunque suelen requerirse otros procedimientos ms sensibles, como un filtro de membrana, la concentracin de Knott o anlisis por saponificacin (Garca, 1997). Las microfilarias pueden verse movindose en el examen directo de la sangre o de los fluidos tisulares. La identificacin de las especies es importante debido a su diferente patogenicidad. La caracterstica principal usada para la identificacin de microfilarias incluye la presencia o ausencia de vaina, as como sus caractersticas de tincin, la morfologa de la cola y la distribucin de los ncleos celulares en su interior, y el tamao del espacio ceflico, asi como la apariencia de su columna nuclear. Ya que las microfilarias de Wuchereha y Brugia suelen poseer una periodicidad nocturna, la sangre de los pacientes en los que se sospecha debe recogerse entre las 10 de la tarde y las 2 de la madrugada. Loa loa posee un periodo diurno, por lo que la sangre debe recogerse en torno al medioda. M. ozzardiy M. Persians carecen de periodicidad. Las microfilarias de M. streptocerca y Onchocerca volvulus estn presentes en la piel y se detectan por examen de biopsias. Los test serolgicos para el diagnstico de filaras linfticas pueden ser tiles en pacientes seleccionados, especialmente en los no nativos de reas endmicas. Tales mtodos son limitados en su capacidad para diferenciar entre exposicin pasada o actual y adems pueden existir reacciones cruzadas con otras especies de nematodos. Los test de deteccin de antigenos tambin pueden ser tiles para la filariasis linftica, pero no suelen estar disponibles (Wilson, 1995). Wuchereria bancrofti. Esta especie, responsable de la filariasis bancroftiana, es la filara que ms frecuentemente infecta a los humanos. Las zonas endmicas son frica central. frica del Norte, la India, sureste de Asia y ciertas islas del Pacifico Sur, as como partes de Centroamrica y Sudamrica y las Indias occidentales. Los gusanos adultos residen en el sistema linftico, donde producen adenopatias y linfangitis crnica, pudien-

Figura 55-10. Exiremos anterior y posterior de las microfilarias ms frecuentemente encontradas en humanos. , Wuchereria bancrofti. 2. Brugia malayi. 3. Onchocerca volvulus. 4. Loa loa. 5. Mansonetla perstans. 6. Mansonella ozzardi.

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PARASITOLOGA MDICA

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Loa loa. Conocido como el gusano del ojo. Loa loa vive en el tejido subcutneo. Los nematodos estn migrando continuamente produciendo una reaccin inflamatoria local transitoria (de 2 a 3 dias) conocida como Calabar. La aparicin ocasional en la conjuntiva permite su extirpacin. La loasis se da principalmente en frica occidental y central, donde las moscas ciervo del gnero Chrysops sirven como vector. El parsito provoca una gran eosinofilia y se le ha visto a veces en EE.UU. en gente que viaj a frica. La microfilaria, que circula por la sangre con una periodicidad diurna, est envainada, pero esta vaina no es visible con Giemsa. Los ncleos de la cola llegan hasta la punta redondeada. La columna nuclear es distintiva y el espacio ceflico es ms corlo (Fig. 55-10: Lmina 55-150). Onchocerca volvulus. La infeccin por Onchocerca es una de las primeras causas de ceguera en las zonas endmicas, como frica central. Amrica central (Mxico y Guatemala) y el norte de Sudamnca. Los vectores son las moscas negras del gnero SimuHum. Los gusanos adultos viven en nodulos subcutneos fibrosos y en el tejido ms profundo, pudiendo crecer hasta 40 m m de dimetro (Lmina 55-15f). Los nodulos suelen darse en la mitad superior del cuerpo de las personas infectadas en Centroamrica y en la mitad inferior del cuerpo en las personas afectadas de frica. Los gusanos adultos producen microfilarias que emigran por la piel. Las complicaciones son secundarias a dicha migracin, causando mltiples formas de dermatitis. Los movimientos de las microfilarias por la superficie del ojo pueden causar queratitis, opacidad corneal y daos en las cmaras del iris causando asi ceguera por infecciones repetidas. El diagnstico se hace al hallar las tpicas microtilarias en los raspados cutneos o biopsias cutneas, preferiblemente de la regin escapular o de la cresta iliaca. Como alternativa se puede examinar el exudado de la piel cicatricial o el aspirado de los nodulos (Beaver. 1984). Las microfilarias en las preparaciones teidas pierden tanto la vaina como los ncleos de la cola (Fig. 55-10). Mansonella spp. Hay muchas especies de Mansonella que infecta a los humanos, pero se las considera como mnimamente patgenas. Sin embargo, las microfilarias se deben diferenciar de las autnticas filarias patgenas. M. ozzardi se halla en el centro de Amrica y Sudamrica y en algunas zonas del Caribe. Los parsitos adultos residen en los tejidos subcutneos. M. perstans se da en reas de frica tropical y. a veces, en Sudamrica. Se cree que los adultos residen principalmente en las cavidades corporales y mesentncas. Los microfilarias carecen de vaina y circulan por la sangre sin evidencia de periodicidad. La microfilaria de M. ozzardi tiene una cola fina, afilada, sin ncleos, mientras que la cola de M. Persians es ancha y abrupta, con ncleos que llegan hasta la punta (Fig. 55-10; Lmina 55-15F). M. streptocerca, que se halla en frica tropical, se puede confundir con O. volvulus, ya que tanto los adultos como las microfilarias se localizan en la piel y en los tejidos subcutneos. Tambin pueden causar dermatitis. Las microfilarias que se encuentran en las muestras cutneas carecen de vaina y poseen un pliegue en la cola con ncleos hasta la punta. Todas las especies de Mansonella se transmiten por mosquitos del gnero Cuhcotdes. Filarias zoonticas. Ciertos nematodos filanales de los gneros Dirolilaria y Brugia, que habitualmente parasitan a mamferos salvajes y domsticos, pueden afectar a humanos. Dirofilaria immitis est muy extendida y la infeccin humana est bien documentada. La larva transmitida por mosquito migra hasta el lado derecho del corazn. Cuando el gusano muere, se transporta hasta una arteriola pulmonar, causando un nodulo granulomatoso que puede verse como una lesin con forma de moneda en la radiografa de trax. El diagnstico suele hacerse por histologa de dicho nodulo. Otras especies de Dirofilaria como D. tenuis. D. repens y D. ursi suelen producir nodulos subcutneos. Estos nodulos se han descrito en mltiples sitios del cuerpo, como la cara, la conjuntiva y la mama y se suelen quitar con ciruga. El examen histolgico muestra una gran reaccin inflamatoria mixta rodeando a un gusano muerto. Los criterios para identificar las filaras zoonticas en la histologa se pueden encontrar en otros textos (Connor, 1997; Ohnel, 1995: Gutirrez, 2000).

Otros
Dracunculus medinensis. Los gusanos adultos viven en el tejido subcutneo y se hacen clnicamente evidentes cuando la hembra migra a la superficie cutnea y produce ampollas, habitualmente en los miembros inferiores. Cuando las extremidades se meten en el agua, las ampollas se rompen y liberan mltiples larvas mviles. El zooplanclon ingiere las larvas, que despus maduran a estadios infectivos y se transmiten nuevamente a humanos al tragar accidentalmente el zooplancton del agua. Es endmico de reas de frica, Oriente Medio y Asia y puede causar cicatrices cutneas desfigurantes con riesgo de sobreinfeccin bacteriana grave posterior. Se han hecho grandes esfuerzos de control en los ltimos aos para erradicar este parsito (CDC, 1992). El diagnstico se hace al ver a la hembra en la superficie cutnea y las larvas en el Huido de las ampollas. El gusano puede ser cuidadosamente extrado en varios das, pero procurando no daarlo. L a muerte de un gusano in situ produce gran reaccin inflamatoria y posterior sobreinfeccin bacteriana. Angiostrongylus cantonensis y Angiostrongylus costaricencis. La menmgoencefalitis eosinoflica humana producida por A. cantonensis se produce tanto en epidemias como espordicamente en reas del sur del Pacfico, sudeste de Asia y Taiwan. Los parsitos maduros se suelen encontrar en las arterias pulmonares de las ratas. Las larvas migran hasta la traquea, donde se eliminan con las heces. Se transforman en infectivas dentro de babosas o caracoles terrestres y. cuando son comidas por un husped roedor, emigran por el cerebro antes de madurar en las arterias pulmonares. Los humanos lo adquieren al comer caracoles o cangrejos o camarones crudos, que pueden actuar de huspedes transportadores, as como vegetales contaminados con moluscos infectados. En los humanos, las larvas de A. cantonensis migran al sistema nervioso central, causando una meningitis con gran eosinofilia en el lquido cefalorraqudeo (Alicata. 1991). El diagnstico se hace tanto por la clnica como por la anamnesis, aunque la larva se ha aislado ocasionalmente en el liquido cefalorraqudeo (Kubersky, 1979). A. costaricencis se da en Amrica central y Sudamrica (LonaCortez. 1980). El parsito, responsable de la forma intestinal de la angiostrongiliasis. suele residir en las arterias mesentricas del leon y del ciego de los roedores. La infeccin humana se da en esas mismas localizaciones, causando inflamacin granulomalosa y abdomen agudo. El diagnstico se hace por el examen histolgico de la pieza quirrgica y el hallazgo de huevos en los tejidos (Strickland. 1999). Trichinella spiralis. La infeccin por Trichinella humana se da en todo el mundo, aunque su incidencia en EE.UU. est actualmente descendiendo, con menos de cien casos al ao. Los humanos adquieren la infeccin por la ingesta de carne de cerdo cruda o, a veces, con la carne de oso, que posee larvas infectivas. Los gusanos ingeridos maduran en el intestino y producen nuevas larvas en dos a tres semanas. Durante esta fase aparecen sntomas gastrointestinales que duran varios dias. Posteriormente las larvas pasan a los linfticos y vnulas, alcanzando as la circulacin sistmica. Invade principalmente los msculos esquelticos, donde sufre el desarrollo y se encapsula. Durante la fase de migracin y encapsulacin puede aparecer fiebre, dolor muscular, dificultad respiratoria, edema periorbital y eosinofilia. dependiendo de la cantidad inoculada. Tras enquistarse, los sntomas son mnimos. Asi, pueden persistir viables durante aos, aunque a veces se calcifican. El diagnstico se hace con la anamnesis y la clnica, y se confirma mediante la biopsia del msculo esqueltico, especialmente del gastrocnemio o del deltoides (Lmina 55-11E y 11F). Los test indirectos incluyen la medicin de la creatina fosfocinasa, que suele estar elevada, y la deteccin de anticuerpos por floculacin con bentonita o con EIA. De stos, el ms especfico es la creatina fosfocinasa y el EIA es el ms sensible (Wilson, 1995). Larva migratoria. La larva migratoria se produce por la migracin de larvas de ciertas uncinarias, ascridos y especies de Strongyloides a travs de los tejidos. El sndrome varia segn la especie causante, el nmero de gusanos y los tejidos afectados.

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

L a larva migratoria cutnea (CLM), o picor del suelo, se produce por la migracin cutnea de uncinarias de perros o gatos del gnero Ancylostoma, que penetra la piel pero no puede tener el habitual patrn de maduracin. Aparecen en la piel tractos serpiginosos, eritematosos y pruriginosos en zonas expuestas al contacto con el suelo. Especial problemtica surge en los climas hmedos y clidos, donde los huevos y larvas de estas uncinarias viven ms tiempo. Algunas especies de Strongyloides que parasitan animales salvajes pueden causar una dermatitis similar. La larva visceral migrans (VLM) suele estar causada por el scaris canino Toxocara canis y, en menor grado, por Toxocara cali, del gato domstico. Los nios suelen infectarse por la ingesta accidental o intencional de tierra contaminada con heces de perros o gatos. Tras la eclosin de la larva, sta es incapaz de completar su ciclo vital y comienza una migracin prolongada a travs de diferentes rganos y tejidos. Los nios pueden debutar con retraso del crecimiento y aparicin de fiebre, hepatomegalia, neumonilis, eosinofilia e hipergammaglobulinemia. Una reaccin inflamatoria en la retina puede simular un retinoblastoma, un tumor maligno con el que se debe hacer el diagnstico diferencial. El diagnstico de VLM se suele realizar mediante los hallazgos clnicos, ya que el parsito raramente se consigue aislar. Los test serolgicos pueden ser tiles para confirmar la sospecha y actualmente se recomienda el EIA, que usa los antgenos de la fase larval (Wilson, 1995). Un sndrome similar al VLM puede ser causado por especies de Gnathostoma. que inlectan el estmago de mamferos. La infeccin humana es ms frecuente en el sudeste de Asia, pero tambin se han descrito casos en Mxico y Ecuador. Este parsito utiliza un cefalpodo como prim e r husped intermediario y peces y anfibios como huspedes secundarios. Tambin pueden servir como huspedes diferentes clases de reptiles, pjaros y mamferos. Las larvas pueden migrar a travs del tejido subcutneo, produciendo inflamacin transitoria y, ocasionalmente, invasin del sistema nervioso central. La existencia de lesiones migratorias y una historia de ingesta de pescado crudo pueden ayudar para el diagnstico clnico. Capillaria heptica. Aunque suele parasilar roedores, a veces causa enfermedad en humanos, especialmente en nios, en los que puede simular una VLM, hepatitis, absceso amebiano heptico u otras enfermedades patolgicas. En el husped roedor, los huevos se digieren y producen una larva migratoria que llega al higado, donde madura y pone huevos en el parnquima. Cuando el hgado es ingerido por un depredador, los huevos se eliminan en las heces y contaminan el suelo. Los nios estn en riesgo para adquirirlos si ingieren la suciedad. En las reas endmicas el diagnstico se hace por el examen de biopsia heptica o por autopsias. Los huevos son fcilmente reconocibles en la biopsia al tener paredes estriadas gruesas. Anisakis. Pseudoterranova y Eustrongyloides spp. La ingesta de pescado crudo, aunque se considere una exquisitez en algunas partes del mundo, tiene como resultado un incremento en el nmero de casos de inlecciones por nematodos del pescado. Anisakiasis y Pseudoterranova son parsitos comunes gastrointestinales de mamferos marinos, y las fases infectivas se encuentran en diferentes peces de agua salada, salmn y calamares como huspedes intermediarios. Los pequeos crustceos similares al camarn sirven como primer husped. Cuando se digieren, esta larva penetra la pared gstrica o del intestino, produciendo dolor abdominal agudo. La infeccin por Anisakis se puede diagnosticar por presuncin basndose en una anamnesis y hallazgos clnicos, y se puede confirmar mediante el aislamiento de un gusano en la endoscopia o por la presencia de un granuloma eosinlilo que contenga un nematodo en una de las piezas quirrgicas. Las especies de Anisakis tienden a ser ms productoras de enfermedad invasiva, mientras que Pseudoterranova spp. tienden a ser tosidas o vomitadas intactas (Lmina 55-11 7 y 11H) (Sakanari. 1989). La larva de Anisakis es difcil de identificar (Binford, 1976). Se han descrito escaso nmero de infecciones por Eustrongyloides spp. en personas que ha comido sushi casero. Estos parsitos suelen infectar pjaros que se alimentan de pescado, pero en humanos la larva rojo brillante invade la cavidad abdominal, precisando tratamiento quirrgico (Wittner. 1989).

Cestodos
Son muchas las especies de cestodos que afectan a humanos en sus estadios de larva y pueden causar seria enfermedad. Las ms habituales son fcilmente distinguibles de las otras y tienen patrones de transmisin nicos Cuando se ven en secciones tisulares, las larvas y adultos contienen cuerpos laminados basofilos conocidos como corpsculos calcreos, importantes para su identificacin. Cisticercosis. La infeccin humana con la (ase larval del gusano plano del cerdo, Taenia solium. se da en todo el mundo tras la ingesta accidental de huevos de un adulto. Es especialmente prevalente en Mxico y el resto de Amrica latina, Europa, la India y Asia. La mayora de los casos en EE.UU. se originan en zonas endmicas, aunque en los ltimos aos el nmero de casos de origen local ha aumentado (Richards, 1985). Los huevos se pueden ingerir accidentalmente con comida contaminada o con agua; posteriormente eclosionan en el tracto gastrointestinal penetrando los embriones en la mucosa intestinal, que diseminan posteriormente por el torrente sanguneo a sitios a distancia, especialmente el msculo esqueltico y tambin al corazn, cerebro u ojos, donde la clnica inflamatoria puede ser muy evidente. Una complicacin frecuente en reas endmicas son las crisis y frecuentemente es el sntoma de presentacin (Lmina 55-16/1). El diagnstico suele hacerse con los hallazgos clnicos en las zonas endmicas, pero puede ser ms difcil en reas no endmicas. El uso de la tomografa computanzada (TC) es m u y til, pero no suele estar disponible en la mayora de las reas endmicas. La radiografa es til para ver la existencia de quistes calcificados, pero no para el diagnstico de infeccin reciente. El aislamiento de cisticercos intactos mediante ciruga confirma el diagnstico. El cisticerco, o gusano vesiculado, es un saco lleno de lquido translcido, oval que contiene un nico esclex que mide 5 m m o ms de dimetro (Lmina 55-16S). Entre los test serolgicos, el inmunoensayo con glucoproteinas disponible por el CDC tiene alta sensibilidad y especificidad, superando al EIA (Daz. 1992). Desafortunadamente, estos test no diferencian entre infeccin activa e inactiva, por lo que no son tiles para monitorizar la respuesta al tratamiento. La existencia de cisticercosis en personas de un rea no endmica y sin clara historia de viaje obliga a la investigacin de la exposicin de los manipuladores de alimentos relacionados con el paciente, o de la posibilidad de infeccin con una especie diferente de Taenia (Schanz, 1992). Hidatidosis. La infeccin humana con estadios larvales de gusanos planos del gnero Echinococcus puede tomar una de estas tres formas: hidatidosis unilocular causada por E. granulosus. hidatidosis multilocular o alveolai causada por E. multilocularis e hidatidosis poliqustica causada por E. vogeli (Thompsom. 1995). Los huspedes definitivos de estos minsculos gusanos son los perros. Lo que pierden de tamao, lo ganan en nmero de individuos, con varios cientos o miles de gusanos que ponen gran nmero de huevos en un solo husped. Los huevos se eliminan por las heces y se digieren por huspedes intermediarios, como la oveja, la vaca, el cerdo, los roedores y otros herbvoros. Los humanos, especialmente los nios, se infectan tras la ingesta accidental de huevos. Los huevos se rompen en el intestino y el embrin penetra la pared intestinal y pasa a la sangre. Aunque la mayora de las hidtides se desarrollan en el higado, algunas se diseminan a otros sitios. El desarrollo de los quistes es lento y puede durar aos para lograr un tamao de 10 c mo1 5c m de dimetro. En el husped secundario, los quistes contienen numerosos protoesclex, que proliferan a partir de la membrana germinal. E. granulosus es el ms importante causante de patologa humana, especialmente en reas de cuidadores de ovejas o vacas, incluidos los EE.UU. donde los perros son los huspedes definitivos. La hidatidosis unilocular se desarrolla como un quiste nico en el higado y, posteriormente, en el pulmn u otro sitio. Los quistes estn llenos de un liquido claro que contiene capsulas germinales y numerosos protoesclex pudiendo llegar a ser miles (Lmina 55-16C y D). La clnica es la derivada del lento crecimiento de la masa, aunque la infeccin en el sistema nervioso central s eh a c e aparente antes que en otras zonas. El diagnstico se basa en la presentacin clnica y la his-

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tora junto con el uso de radiografa o TC y la ecografa. Los test serolgicos son muy tiles para confirmar el diagnstico y constan de un test de screening como EIA o el IHA seguido, si fuese positivo, de un test de confirmacin como el inmunoblott o el gel de difusin (Wilson. 1995). La sensibilidad va desde el 60% al 90% segn cada caso. Los falsos positivos se pueden dar en la cisticercosis, aunque la presentacin clnica debera evitar la confusin. La aspiracin de contenido de los quistes es potencialmente peligrosa, ya que el vertido de su contenido puede producir diseminacin o riesgo de shock anafilctico, pero si se realiza, revelara una mezcla de protoesclex, cpsula germinal, garfios y corpsculos calcreos. E. multiloculans causa hidatidosis multilocular o alveolar en las regiones del norte de Europa y Rusia, y en Alaska. Canad y el norte de EE.UU. Los huspedes miermediarios incluyen una variedad de pequeos roedores; los zorros, los lobos y los perros son los huspedes definitivos. La infeccin humana se da en el hgado, donde las hidtides se desarrollan como un quiste invasivo que se introduce en el tejido con un patrn alveolar. Aunque la membrana germinal prolifere en el hgado, los protoesclex carecen de desarrollo, La imagen puede asemejarse a la de un hepatocarcinoma. Los test serolgicos que usan los antgenos de E. granulosus son tiles para el diagnstico. El uso diferencial de antigenos de ambos parsitos parece tener un gran potencial para la diferenciacin entre estas dos enfermedades (Wilson, 1995). vogeli produce un quiste hidatidico poliquslico que es invasivo, pero se diferencia de multilocularis en que vogeli produce tanto membrana germinal como protoesclex. La enfermedad est limitada a Latinoamrica, donde los roedores completan el ciclo vital (D'Alessandro. 1979). La hidatidosis poliquslica en Sudamrica puede tambin ser causada por E. oligarlhus, un parsito de felinos y roedores. Esta especie es morfolgicamente similar a vogeli y en el pasado se confundieron casos (D'Alessandro. 1995). Esparganosis. La esparganosis est causada por la larva del gnero Spiromelra. emparentada con Diphyllobothrium spp. Habitualmente parsita perros y gatos y estn en Asia (Spirometra mansoni) y Norteamrica Spirometra mansonoides). Los ciclos vitales son similares a los de Diphyllobothrium. los cefalpodos sirven como primer husped intermediario para la larva procercoide y el pescado como segundo huspedes para la larva pleurocercoide. Los humanos se infectan con estos estadios larvales a travs de la ingesta de cefalpodos en el agua o con el pescado crudo o poco cocinado. El uso de ranas o serpientes como cataplasmas tambin puede transferir larvas. La esparganosis se suele presentar como un edema local o migratorio a nivel subcutneo junto con eritema y dolor; a veces se da una infeccin cerebral. La exploracin quirrgica puede revelar un delicado gusano, delgado y de color marfil y de escasos centmetros de largo. Los cortes axiales demuestran un grueso tegumento con profundos pliegues y un parnquima con marcadas fibras musculares. No se han visto cavidades corporales en los nematodos y los corpsculos calcreos son numerosos (Lmina 55-16F) (Orihel, 1995; Gutirrez, 2000). Coenurosis. La tenia intestinal de perros y gatos (principalmente T. muticeps y T. serialis) produce una larva en los huspedes intermediarios conocida como coenuro. Este estadio consta de un largo saco transparente (de unos 1 0 cm) que contiene muchos esclex que surgen de una membrana germinal que se invagina en quistes llenos de lquido (Lmina 55-16E). Las ovejas son los huspedes intermediarios de T. multiceps. y los roedores, liebres y conejos lo son para T. serialis. aunque los humanos juegan este papel por la ingesta accidental de huevos producidos por gatos y perros domsticos. Como un cisticerco. el coenuro puede desarrollarse en cualquier rgano causando una enfermedad similar. El diagnstico se suele hacer por el examen de quistes extirpados o en secciones tisulares. La presencia de mltiples esclex invaginados en una sola vescula lo diferencian del resto de los cestodos larvales.

por las heces, la orina o el esputo. Dada su localizacin extraintestinal, estas lombrices y sus huevos se pueden encontrar en los tejidos, c o m o hallazgo o asociados a clnica. Los adultos de F. heptica. C sinensis y O. vivernm se pueden hallar en el hgado y en las vas biliares y. a veces, en sitios ectpicos. La presencia de los tpicos huevos, tanto libres en los tejidos como dentro del tero de los helmintos, frecuentemente facilita la identificacin definitiva. El adulto de Paragonimus spp. es el que reside principalmente en el pulmn, pero puede hallarse en sitios ectpicos como el cerebro y el tejido subcutneo, produciendo abscesos frecuentemente asociados con una gran produccin de huevos. Los esquistosomas adultos viven en los vasos sanguneos, principalmente en el territorio de la vena mesentrica interior (S. mansoni). vena mesentrica superior (S. japonicum y S. mekongi) y en el plexo vesical (S. haematobium). Aunque los adultos no suelen encontrarse en las biopsias tisulares. los huevos pueden encontrarse en gran nmero de tejidos del intestino, del hgado y de la vejiga (Lmina 55-14 B, Dy F). Los huevos pueden diseminarse por la sangre a otros locos, incluidos el cerebro, la mdula espinal, los pulmones, el corazn, los rones y el bazo. Los huevos de S. japonicum tienen tendencia especial a diseminarse debido a su pequeo tamao y al gran nmero de huevos producido. La identificacin de los huevos depende del reconocimiento de su tamao tpico y de su morfologa en los tejidos adecuados.

ARTRPODOS DE IMPORTANCIA MDICA

Los artrpodos comprenden un gran y diverso grupo de organismos, algunos de los cuales tienen una gran importancia clnica o econmica. Esto es debido a que son una importante causa de morbimortalidad en los humanos y para sus animales domsticos, con serias prdidas econmicas para la agricultura. Aunque quiz los artrpodos son ms conocidos entre los clnicos por su capacidad para transmitir agentes infecciosos, como son virus, bacterias (Rickettsia, espiroquetas y otros), protozoos y algunos helmintos, stos tambin pueden causar patologa directamente por invasin tisular. envenenamiento, formacin de vesculas, prdida de sangre y reacciones alrgicas. El miedo exagerado a artrpodos (entomofobia) y los delirios de infestacin (delirio de parasitosis) son neurosis no infrecuentes que pueden afectar a algunos individuos. Las especies que directa o indirectamente causan enfermedad humana son representativas de todas las clases de artrpodos (Tabla 55-10). En esta seccin, se presenta una aproximacin que se puede usar en el laboratorio clnico cuando se evalan muestras con artrpodos, seguida por una breve descripcin de cada grupo de artrpodo con relevancia mdica. Existe una variedad de textos generales y especializados disponibles para una completa cobertura del campo de la entomologa (Beaver. 1984; Garca. 1997: Goddard. 1996: Harwood. 1979; Kettle. 1993; Lane, 1993; Centro Nacional de Declaracin de Enfermedades, 1969; Strickland, 1999).

Caractersticas biolgicas
Los artrpodos se caracterizan por una simetra bilateral y un cuerpo segmentado, varios pares de apndices articulados y un caparazn rgido que se va modificando durante el crecimiento. El desarrollo va desde huevos hasta adultos a travs de una metamorfosis gradual (huevo, ninfa y adulto) o completa (huevo, larva, pupa y adulto). Las chinches, los revviros, los piojos y las cucarachas son ejemplos de insectos que sufren una metamorfosis gradual. La mosca, el mosquito, las pulgas, las hormigas, las abejas y las avispas, asi como los escarabajos, sufren una metamorfosis completa. Las formas larvales similares a los gusanos se hacen pupa y luego adultos. Los arcnidos sufren cambios de desarrollo muy similares al proceso gradual de metamorfosis. Las larvas de estos artrpodos, que con frecuencia, sufren una metamorfosis completa, suelen ser los ms difciles para identificar y se deben enviar a un especialista.

Tremtodos
Todos los tremtodos que habitan en el hgado, el pulmn y la sangre y que maduran en humanos producen huevos que generalmente salen del cuerpo

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Tabla 55-10 Clasificacin de los artrpodos de importancia mdica

Clase Insecia (insectos) Orden Anopleura (piojos) Orden Siphonaplera (pulga) Orden Diclyoplera (cucarachas) Orden Hemiptera (chinches, revviros) Orden Hymenoplera (hormigas, avispas, abejas) Orden Coleptera (escarabajo) Orden Lepidoptera (orugas, mariposas, polillas) Orden Dptera (moscas, caros. mosquitos) Clase Aracnida (arcnidos) Subclase Scorpiones (escorpiones) Subclase Araneao (araas) Subclase Acari (garrapatas, caros, ninguas) Clase Diplopoda (milpis) Clase Chilopoda (ciempis) Clase Crustcea (crustceos) Orden Copepoda ( c e f a l p o d o s ) Orden Decapoda (cangrejos) Clase Pentastomida (gusanos de la lengua)

biana, giardiasis y gusanos. Los mecanismos que intervienen en la transmisin biolgica varan desde la simple amplificacin en el artrpodo vector hasta cambios ms complejos del ciclo vital del parsito. Tanto garrapatas como caros intervienen en la transmisin de ciertas bacterias (Rickellsia. Ehrlichia. espiroquetas y otras), protozoos (Babesial y virus. Entre los insectos, los piojos transmiten bacterias {Rickettsia, Bartonella y Borrelia): los revviros transmiten Trypanosoma: las pulgas transmiten agentes de peste, tifus y gusanos planos caninos; y los dpteros transmiten arbovirus. malaria. Trypanosoma, Leishmania. filaras y bacterias. Reacciones de hipersensibilidad. La mayora de las reacciones graves de las picaduras suelen ser producidas por hipersensibilidad alrgica. Las picaduras de heminpteros son las responsables de la mayora de las muertes por artrpodo y suelen ser por hipersensibilidad tras una exposicin repetida al veneno (Reisman. 1994). La alergia tambin puede exacerbarse tras la exposicin a la saliva, excrementos o partes del cuerpo de los caros. garrapatas, piojos, chinches, orugas, polillas y mariposas. Se puede producir asma y fiebre elevada como respuesta a estos alrgenos en el ambiente (Frazier, 1980). Manifestaciones psicolgicas. La entomofobia se define como un irrazonable o excesivo miedo a la vista o al contacto con artrpodos Aunque esto puede causar alteraciones en las actividades habituales de una persona, rara vez es incapacitante. El delirio de parasitosis es un trastorno emocional ms serio por el que una persona est convencida de que estaba infectada con parsitos o artrpodos a pesar de la evidencia objetiva de lo contrario. Si esto progresase, podra resultar en una prdida de empleo, divorcio, abuso de pesticidas y mudanzas repetidas. Las visitas a los servicios de salud suelen ser numerosas, aunque insatislactoas. El problema puede empezar tanto en el hogar como en el trabajo y se puede transferir del uno al otro. El delirio puede ser tan convincente que puede ser credo por otros miembros de la familia o amigos o tomarse como propio. El paciente puede remitir muchas muestras, como piel, pelo, mocos o pelusa al laboratorio. Es obligacin del laboratorio examinar dicho material para descartar una autntica infestacin. El misterio de la irritacin y el picor puede deberse a picaduras de caros, piojos, pulgas o chinches no reconocidas o bien a insectos y caros trados por un roedor o pjaros en el rea habitada por el paciente. Antes de descartar tales causas, se deben buscar y excluir su presencia (Lynch. 1993).

Mecanismos de lesin
Invasin tisular directa. La invasin de la superficie de tisular (conocida como inlestacin) se produce con gran variedad de artrpodos, de los que los caros, la pulga y algunas larvas de dpteros son los ms comunes. La invasin de tejidos profundos y las cavidades (referidos como infeccin) se da principalmente con los gusanos y. rara vez. con las larvas de pentastmidos. La invasin por larvas de dpteros, llamada miasis. puede darse en tejidos vivos o desvitahzados segn las especies. Envenenamiento. Muchos artrpodos pueden inyectar saliva o veneno con sus mordiscos o picaduras. Para la mayora de las personas produce slo una reaccin local tisular. pero puede producir serias reacciones, como anafilaxia debido a una previa sensibilizacin a la toxina en cuestin. Las picaduras de heminpteros (hormigas, abejas y avispas) y las de escorpiones son las ms agresivas (Reisman, 1994). Las mordeduras de ciertos artrpodos, especialmente los ciempis, los mosquitos, las moscas, las chinches, los revviros, las chinches asesinas, los piojos, las pulgas, las garrapatas y los caros, tambin pueden ser txicas, causando reacciones locales o sistmicas. Casi todas las araas son venenosas, pero slo un pequeo grupo (araas viudas, araas violn y algunas tarntulas) pueden causar peligro para la salud humana. Causas de envenenamiento menos (recuentes pero tambin descritas son motivadas por la exposicin a los pelos urticantes de ciertas orugas o larvas de escarabajos. Vesiculacin. Algunos de los milpis ms largos son capaces de rociar o lanzar una sustancia qumica vesicante (productoras de ampollas) desde unas glndulas localizadas en cada segmento del cuerpo. Esto es especialmente irritante si alcanza la conjuntiva. Los escarabajos vejiga son llamados as por su capacidad de descargar fluidos vesicantes (cantaridina. el ingrediente aclivo de la mosca afrodisaca espaola) cuando se les manipula. Prdida de sangre. Los artrpodos responsables de causar prdidas de sangre a los hombres o animales domsticos incluyen chinches, revviros. pioios. pulgas, moscas, mosquitos, garrapatas y caros. Aunque no suele suponer un nesgo para la vida, tiene el riesgo de transmisin de agentes infecciosos. Transmisin de agentes infecciosos. Muchos artrpodos juegan un papel m u y importante en la transmisin mecnica o biolgica de agentes infecciosos. La mosca domstica puede ser responsable de la transmisin del agente de disenteria bacilar, clera, tifus, diarrea viral, disentera ame-

Aproximacin de laboratorio a la identificacin de artrpodos

Las muestras de artrpodos son frecuentemente dirigidas al laboratorio clnico tanto por mdicos como por pacientes con la esperanza de que sean identificados, pero pocos trabajadores de los laboratorios reciben algo ms que un entrenamiento superficial en entomologa. Sin embargo, los especialistas pueden tener acceso a textos y claves que permiten una identificacin de los grupos encontrados con ms frecuencia, especialmente los ectoparsilos (pulgas, caros. piojos y garrapatas). De mayor importancia es la capacidad del personal del laboratorio para reconocer las raras situaciones en las que se debe buscar la opinin de un experto. Esto es de especial relevancia en las ocasiones en las que se estn lomando importantes decisiones teraputicas y de pronstico. Los laboratorios de salud pblica local o estatal suelen tener expertos disponibles o conocen a personas entrenadas en entomologa mdica en institutos educacionales, o museos u oirs agencias, incluido el CDC. Las muestras recibidas en el laboratorio suelen ser organismos intactos, raspados cutneos, tejidos, esputos, orina o heces. Tambin se pueden remitir objetos personales como plantillas, agua, ropa, ropa de c a m a y alfombras, entre otras. No es raro que se remitan artrpodos hallados en el inodoro tras la miccin o la deposicin. En la mayora de los casos, la presencia de estos organismos es coincidencia y no implica infeccin. L a correcta muerte y conservacin de los artrpodos es importante para preservar sus caractersticas, que luego sern necesarias para su identificacin. Los artrpodos pequeos, sin alas, especialmente los ectoparsitos (piojos, pulga, garrapatas y caros). larvas (gusanos, orugas, larvas), araas

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PARASITOLOGA MEDICA

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y escorpiones se deben colocar directamente en alcohol etlico al 70%-80%. Las grandes formas larvales se matan mejor en agua caliente (sin hervir), para que sus cuerpos se extiendan sin contraerse antes de meterlos en alcohol. Los tejidos afectados u otros escombros se deben manipular con delicadeza o lavar antes de conservarlos. Las formas ms pequeas (acaras, pequeas garrapatas, pulgas, moscas de arena) se deben preparar como muestras permanentes. Los insectos alados, especialmente los mosquitos adultos y moscas, se deben matar exponindolos a humos de etil actico o cloroformo y preservarlos en seco para mantener la informacin taxonmica recogida en las escalas corporales y de las alas. Tales artrpodos suelen pinchar y secar, seguido por un almacenamiento en cajas hermticas protegidas con naftalina o diclorobenceno. Ms detalles de la recoleccin, preservacin y preparacin de las muestras artrpodos se pueden encontrar en otros textos (Beaver. 1984; Garca. 1993; Lae, 1993; Steyskal, 1987).

nos de D. caninum y, menos frecuentemente, de H. diminuta y H. nana. Y a que las larvas de estas especies frecuentemente se dan en los lechos de los animales, alfombras y muebles, su erradicacin puede requerir la fumigacin y su limpieza. La pulga de la rata oriental. Xenopsyila cheopis. es una especie muy importante, ya que transmite el bacilo de la peste y el agente del tifus murino. Aunque parsita en muchas especies de ratas, estas pulgas atacan con facilidad a humanos. La pulga ningua o de las arenas (Junga penelrans) se halla en Amrica central y Sudamrica y regiones de frica tropical. La pulga hembra se une a la piel especialmente entre los dedos del pie y bajo las uas, donde crecen hasta el tamao de un pequeo guisante. Tras la puesta de huevos, la pulga muere, produciendo una respuesta inflamatoria con el riesgo de una sobreinfeccin bacteriana. La tungiasis se diagnostica al identificar la porcin oscura del abdomen de la pulga saliendo de la piel en una lesin alargada (Beaver, 1984; Goddard, 1996: Lae, 1993). Cucarachas. Las cucarachas se han adaptado rpidamente a la vida d e los humanos compartiendo nuestra comida, cobijo y nuestro calor. Aunque son unos compaeros algo pesados, stos son potencialmente transportadores de patgenos lecales debido a su capacidad de moverse rpidamente desde los desages a las cocinas o despensas. Adems de transmitir bacterias, pueden extender poliovirus. virus de la hepatitis, protozoos intestinales, incluida Entamoeba histolytica. y muchas especies de nematodos entricos. Tambin se pueden dar alergias y asma en algunos individuos tras la exposicin a excrementos, caparazones o partes del cuerpo de las cucarachas (Goddard, 1996). Chinches y revviros. Las chinches (familia Cimidiae) y los revviros (familia Reduviidae) son insectos chupadores de sangre con probscides largas y estrechas que las doblan bajo el cuerpo cuando no las usan. Las chinches (Cimex lectulanus y Cimex hemipterus) son marrones rojizas, aplanadas dorso-ventralmente, sin alas, de unos 5 m m de longitud (Lmina 55-17). Tienen una distribucin cosmopolita y atacan a la mayora de los mamferos, alimentndose principalmente por las noches. Durante las horas del da se esconden ba|o los colchones, el papel de las paredes las tablas del suelo. Aunque no se les conocen como transmisores de enfermedades, sus mordiscos pueden ser dolorosos, con ampollas, segn la sensibilidad del individuo a su saliva. Los revviros (Tnatoma. Rhodnius. Panstrongyius) tienen una cabeza con forma de cono con un cuello estrecho y un abdomen que se ensancha en su mitad. Estos son negros o marrones y algunos tienen marcas naranjas o negras en el abdomen. Suelen medir de 1 cm a 3 cm y, a diferencia de las chinches, tienen unas alas bien formadas para volar. Al igual que las chinches, se alimentan en vertebrados y causan similares reacciones cutneas. En Mxico y Amrica central y Sudamrica transmiten el agente de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruz. en las heces, que posteriormente se introducen en la piel mediante el rascado (Goddard, 1996; Lae, 1993). Abejas, avispas y hormigas. Los heminpteros son insectos sociales que hbilmente defienden sus nidos cuando se les molesta. En las hembras no reproductoras, el rgano ponedor de huevos se modifica como un aguijn capaz de inyectar veneno para capturar presas o para defenderse. El veneno de la abejas, avispas y avispones causa slo una inflamacin dolorosa temporal en la mayora de las personas, pero pueden causar a veces reacciones sistmicas, como anafilaxia en personas sensibilizadas (Reisman. 1994). Cerca de cien personas mueren cada ao en EE.UU. por este motivo. La abeja de la miel africana se encuentra ahora en Norteamrica tras su introduccin en Brasil en 1956. Estas abejas, que son fcilmente ms provocadas por otras abejas, muestran un masivo comportamiento a la hora de picar. Muchas especies de hormigas son problemticas para los humanos por su capacidad de morder, y algunos grupos, como las hormigas segadoras y las hormigas del fuego, son capaces de producir picaduras dolorosas. Escarabajo. Aunque quiza son con frecuencia conocidos como provocadores de plagas en los campos de agricultura, algunos tienen unas mordeduras dolorosas y otros, especialmente los escarabajos vejiga, pueden exudar un lquido vesicante (cantaridina) que produce dermatitis o ampollas.

Insectos
Los insectos comprenden ms del 90% de todas especies de artrpodos descritos, aunque slo algunas especies son responsables de patologa humana. Los miembros de esta clase se diferencian de los dems artrpodos por poseer el cuerpo dividido en tres partes (cabeza, trax y abdomen), un par de antenas, tres pares de patas y uno, dos o ningn par de alas. Es la nica clase de artrpodos en los que se ha desarrollado el vuelo. Piojos. Los piojos estn aplanados dorso-ventralmente, sin alas, con unas caractersticas pinzas en el final de cada pata que les permite fijarse a los pelos o a la ropa (Lmina 55-17/1 y S). Todas las especies se alimentan de sangre intermitentemente y pueden causar una dermatitis poco explicada. Los huevos, conocidos como liendres, se depositan en los pelos o en la ropa, segn la especie. Aunque se les nombra segn su principal localizacin, no siempre estn confinados a esa localizacin. El piojo de la cabeza, Pediculus capitis. y el de cuerpo, Pediculus humanus. son indistinguibles por personal no especialista. Son ms largos que anchos y miden hasta 3 mm. La dilerencias biolgicas son aparentes. P. humanus es el nico que transmite el agente del tifus, la fiebre de las trincheras y la fiebre recurrente (Kim. 1986). La infestacin por ambos tipos se da en gente acinada y con poca higiene. Los nios en edad escolar tienen mayor riesgo para adquirir el piojo de la cabeza, al compartir gorros, ropa y peines (Orkin, 1985). Las liendres de piojo de la cabeza se colocan principalmente en el eje del pelo, y las del corporal se colocan en la ropa. Los productos de cuidado del pelo, las micosis del pelo, as como otros objetos, pueden simular liendres y su diferenciacin es importante. Las liendres miden 1 mm y, cuando an no han eclosionado, poseen un oprculo intacto (Lmina 55-17C). La transmisin se da principalmente al compartir ropa infestada, as como ropas de cama, ya que el piojo corporal tiende a poner los huevos en racimos especialmente a lo largo de las costuras o dobleces de la ropa. El piojo del pubis. Phlhirus pubis, es diferente de los otros. Es ms redondeado (mide hasta 2 m m de dimetro), y el abdomen es ms parecido al de un cangrejo. Su primer par de patas es mayor y ms largo que las dems patas (Lmina 55-17S). Estos piojos y sus liendres se hallan principalmente en el vello pbico. pero pueden extenderse al trax, las axilas y a la cara. La transmisin suele producirse durante el acto sexual. Pulgas. Las pulgas son pequeos ectoparsitos (de 1 mm a 2 mm). sin alas y lateralmente aplanados que se alimentan de sangre (Lmina 5517D). Sus largas y musculosas patas estn adaptadas para saltar de grandes distancias. Todas las pulgas que alectan a humanos son parsitos de otros mamferos o aves de corral. La infestacin se produce por la exposicin a animales domsticos y mascotas. Las especies ms nocivas son la pulga del perro (Ctenocephalides canis). la del gato (C. Felis), y la humana (Pulex irrilans). Algunas personas crean alta sensibilizacin a las mordeduras de las pulgas, mientras que a otras casi no les afecta. Las pulgas de gatos y perros tambin son huspedes intermediarios de gusanos pla-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Las larvas de ciertos escarabajos poseen pelos urticantes que producen dermatitis o, si se ingieren, irritacin del tracto gastrointestinal. Las larvas y los adultos de los escarabajos del grano pueden actuar como huspedes intermediarios para los gusanos planos H. diminuta y H. nana de los roedores y humanos. Polillas y mariposas. Algunas larvas (orugas) de lepidpteros poseen pelos urticantes o espinas que inyectan veneno al manipularlas. Aunque la mayora de los efectos de estas toxinas pueden quedar en la piel, se han descrito efectos sistemticos, incluidos shock y parlisis (Goddard, 1996). Los adultos de la polilla gitana y de montecillo de hierba poseen pelos urticantes que pueden causar dermatitis, conjuntivitis o irritacin de la va area, especialmente en trabajadores forestales (Shama. 1982). Moscas y mosquitos. Los dpteros se caracterizan por poseer un par de alas membranosas. Entre todos los artrpodos, son los responsables de la mayor parte de las enfermedades humanas producidas al alimentarse de sangre, transmisin de agentes infecciosos y la invasin directa de tejidos por sus larvas (miasis). Las picaduras suelen causar irritacin local debido a la sensibilidad a la saliva y, en algunos individuos, reacciones sistmicas. Adems de su accin de sangre, los repetidos ataques pueden producir daos fsicos y psicolgicos. Ciertas especies chupadoras de sangre son tambin responsables de la transmisin de patgenos: malaria, filariasis y arbovirus por mosquitos; las oncocercosis por la mosca negra; loiasis por la mosca ciervo; leishmaniasis y bartonellosis por la mosca de la arena; tripanosomiasis africana por la mosca tse-ts. Otros agentes virales, bacterianos o parasitarios se transmiten con facilidad de modo mecnico por las moscas no picadoras, como la mosca domstica o la mosca de la carne que pueden contaminar fcilmente el alimento. La miasis puede producirse de un modo accidental, facultativo u obligatorio. La mosca domstica no tiene la necesidad de desarrollarse en los tejidos de mamferos, aunque puede hallarse a veces en tejidos muertos. Este tipo de miasis accidental no es infrecuente, pero no suele tener relevancia clnica. La miasis facultativa es causada ms frecuentemente por la mosca de la carne, que suele alimentarse de tejidos muertos pero puede ir a los tejidos viables adyacentes. La miasis obligatoria se produce por especies que se desarrollan slo en tejidos vivos. Estas especies tienen un origen zoontico. La mosca humana. Dermatobia hominis. se desarrolla en lesiones subcutneas como fornculos, con el extremo posterior apareciendo por la superficie cutnea (Lmina 55-17F). Estas especies se encuentran ms frecuentemente en personas que ha estado algn tiempo en Amrica Central o Sudamrica, o con menos frecuencia en frica. Es raro que los huevos sean transportados al husped por otros insectos, habitualmente mosquitos. La mosca Cordyiobia anthropophaga. hallada en frica subsahariana, tambin causa una miasis foruncular. Sus huevos se suelen poner en el suelo o en las ropas tendidas y la larva penetra rpidamente al contacto con la piel. La miasis obligatoria grave es la causada por Chrysomya bezziana y por Cochlimyia hominivorax. Estas especies ponen sus huevos en el ganado vacuno, habitualmente en las heridas o cerca de la nariz. Las larvas se mueven y se alimentan activamente a travs de los tejidos vivos. Las infecciones humanas pueden ser especialmente destructivas y afectar al 0|0, a la nariz o a la boca. Otras especies tambin pueden ser causantes de miasis obligatorias en los humanos (Lane. 1993).

grejo, y una cola segmentada con un aguijn globuloso en el extremo (Lmina 55-18A). Tienen una naturaleza depredadora, paralizando a sus vctimas con su veneno del aguijn, aunque tambin puede usarlo para fines defensivos. La toxicidad humana vara segn las especies. Pueden no producir ms dao que la picadura de una abeja, pero algunos son mortales, causando cerca de mil muertes al ao. Las especies venenosas se dan en el hemisferio oeste, Europa, frica y Oriente Medio (Beaver, 1984; Goddard, 1996). Araas. Las araas carecen de cola con aguijn, pero a cambio poseen quelceros parecidos a colmillos en su zona bucal, a travs de los cuales pueden inyectar veneno. Aunque la mayora son venenosas, tan slo unas pocas tienen quelceros capaces de penetrar la piel humana. La mayora de las picaduras producen slo irritacin y dolor temporal. Las araas viudas (gnero Lactrodectus) son uno de los grupos responsables de sntomas sistmicos gracias a la accin de una potente neurotoxina capaz de producir somnolencia, dolor muscular, parlisis, convulsiones y, a veces, la muerte. La tasa de mortalidad publicada vara del 1% al 6%. Se han descrito cinco especies en EE.UU., siendo la viuda negra (Lactrodectus mactans) la ms extendida. Las hembras de la viuda negra poseen un color negro brillante con una caracterstica marca rojo-naranja en la parte inferior del abdomen y tienen una envergadura de 3 cm o 4 cm. Viven en localidades protegidas, como cobertizos, bosques y stanos (Strickland, 1999). Las araas violin (gnero Loxosceles) son causantes del aracnidismo necrtico. En EE.UU., el recluso marrn (Loxosceles reclusa) es el que ms frecuentemente afecta, aunque hay otras especies. Esta especie mide de 1 cm a 2 cm, con un color entre canela y marrn oscuro, con una marca oscura en forma de violin orientada hacia la parte delantera en el dorso del cefalotrax. Cuando se halla en los hogares est recluida en su guarida, prefiriendo zonas tranquilas como armarios, stanos o porches. Su picadura es indolora y con frecuencia no se descubre hasta horas despus, cuando se forma eritema, edema y dolor. El veneno es dermonecrotizante y hemoltico, causando necrosis cutnea durante varios das. La lesin puede tener dificultad para cicatrizar y puede sobreinfectarse. Son raras las reacciones sostenidas, como la hemolisis y el fallo renal agudo. Otros gneros tambin se han implicado en aracnidismo necrotizante (Fisher, 1994). Garrapatas. A diferencia de las araas y escorpiones, las garrapatas tienen un cefalotrax fusionado con el abdomen y un caracterstico hipostoma para alimentarse. Se desarrolla en cuatro fases: huevo, larva, ninfa y adulto. Tras anclarse, necesita alimentarse de sangre para su desarrollo. Los humanos la adquieren en las reas de arbustos o de hierba en las cercanas de los huspedes animales. Son ectoparsitos que necesitan alimentarse de sangre y son importantes vectores de patgenos virales, bacterianos y protozoos, tanto para hombres como para animales domsticos. Su alimentacin tambin causa dao local y prdida de sangre, especialmente al ganado y a la fauna, o la parlisis de la garrapata que es un sndrome causado por una neurotoxina secretada por las glndulas salivares que causa parlisis flcida ascendente y toxemia. La clnica puede asemejarse al sndrome de Guillain-Barr, a la poliomielitis o al botulismo. L a resolucin de los sntomas se da en tan slo unas horas o das tras quitar la garrapata. Las especies que afectan a humanos son los miembros de la familia Ixodidae (garrapatas duras) y Argasidae (garrapatas blandas). Las duras tienen el aparato bucal dirigido hacia delante y un caparazn escleroso en el dorso llamado scutum. Este caparazn cubre la totalidad del dorso del macho, pero slo la porcin anterior de la hembra, permitiendo que se hinche cuando engorda (Lmina 55-186 y C). Las garrapatas Argasidae tienen un cuerpo blando que carece de caparazn y el aparato bucal est dirigido ventralmente, siendo invisible cuando se la observa desde arriba (Lmina 55-180). Las garrapatas sin engordar miden de 2 mm a 5 mm pero crecen varias veces tras engordar. Las garrapatas duras engordadas pueden asemejarse a las blandas, por lo que se debe tener cuidado a la hora de su identificacin (Sonenshine, 1991,1993). La mayora de garrapatas observadas libres o unidas a la piel son duras. Las blandas suelen alimentarse brevemente por la noche. Las especies de

Arcnidos
Los arcnidos de importancia mdica son los escorpiones, las araas, las garrapatas y los caros. Los escorpiones y las araas poseen dos segmentos corporales, el cefalotrax y el abdomen, mientras que las garrapatas y los caros slo tienen uno. Poseen cuatro pares de patas, tanto de ninfas como de adultos. La larva de garrapata y de caros tiene tres pares de patas. Todos carecen de antenas, mandbulas y alas. Los escorpiones y las araas son ms conocidos por su capacidad de inyectar veneno, mientras que las garrapatas y los caros son conocidos por actuar como vectores de patgenos virales, bacterianos y protozoos. Escorpiones. A diferencia de otros arcnidos, los escorpiones slo tienen un par de pinzas delanteras, que les da un aspecto similar a un can-

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PARASITOLOGA MEDICA

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garrapatas duras importantes en Amrica del Norte son Dermacentor variabais (garrapata canina americana). D. andersoni (garrapata de la madera de las Montaas Rocosas). Amblyomma americanum. Rhipicephalus sanguineus (garrapata canina marrn). Ixodes escapularis (garrapata de palas negras) e /. pacificus (garrapata de patas negras del oeste). A Dermacentor y Amblyomma se les llama tambin garrapatas adornadas por las marcas blancas en sus caparazones. Las otras carecen de adorno. Las garrapatas Dermacentor transmiten la liebre manchada de las Montaas Rocosas y posiblemente la tularemia y liebre Q. Ixodes son vectores de la enfermedad de Lyme. babesiosis y ehrlichiosis, y en otras partes del mundo transmiten ciertos arbovirus. Amblyomma es capaz de transmitir la fiebre manchada de las Montaas Rocosas y tambin una tularemia y la enfermedad de Lyme. Todos estos gneros pueden causar la parlisis de la garrapata. Rhipicephalus se ha implicado en la transmisin de la fiebre manchada de las Montaas Rocosas y en ehrlichiosis del norte de Amrica, y la fiebre botonosa en el rea mediterrnea. Las garrapatas blandas del gnero Ornithodoros se dan en muchas zonas del mundo, incluido EE.UU. y son importantes vectores de fiebres recurrentes por espiroquetas (Borrelia recurrentis y las formas relatadas) (Spach. 1993; Murray, 1999). caros. Los caros son arcnidos microscpicos (menores de 1 mm) ampliamente distribuidos en el ambiente. Las especies con importancia mdica pueden afectar a los hombres, actuar de vectores o causar alergias al polvo. Los hombres son con frecuencia infestados tanto por Demodex tolliculorum como por Demodex brevis. caros de los fornculos, y Sarcoptes scabei. el acaro de la sarna. Los caros del folculo son minsculos (0,1 mm a 0,4 mm) y alargados, con patas achaparradas con las que se pueden asir de los folculos del pelo y de las glndulas sebceas (Lmina 55-18F). Suelen ser hallazgos incidentales en las preparaciones histolgicas cutneas. Aunque su presencia se ha asociado a varias condiciones cutneas, son frecuentemente hallados en individuos sanos, lo que hace su trascendencia incierta (Burns, 1992). Sarcoptes scabieies el acaro de mayor importancia mdica dada su capacidad para crear tneles serpigmosos por la capa superior de la epidermis. Se transmite por contacto personal y se puede encontrar principalmente en los espacios interdigitales, la cara flexora de las muecas y los antebrazos y, menos frecuentemente, en otras zonas como las mamas, las nalgas y los genitales externos. La inflamacin y el prurito intenso son secundarios a la creacin de los tneles y la produccin de excrementos y huevos. La clnica vara segn la sensibilizacin a los parsitos y a sus productos. Las lesiones se sobreinlectan con frecuencia. La aparicin de una dermatitis generalizada debida a la existencia de miles de caros en ancianos o inmunosuprimidos se conoce con el nombre de sarna noruega. El diagnstico se hace colocando los raspados cutneos de reas afectadas en hidroxido potsico al 20% o en aceite mineral para su aclaramiento y su examen al microscopio. La deteccin de huevos, larvas de seis patas o ninfas de ocho patas o adultos es diagnstico, pero a veces puede resultar difcil (Fig. 55-11: Lmina 55-18E). El diagnstico de sarna en una institucin o en una escuela puede causar seudoepidemias, en las que muchos desarrollan picores sin evidencia de enfermedad. Se debe tener cuidado para diagnosticarlos adecuadamente, para diferenciar los casos reales de las parasitosis psicgenas o ilusorias (Lynch. 1993; Orkin. 1985). Un nmero de caros animales pueden afectar a humanos para alimentarse de sangre, tanto como larvas como por adultos, cuando no tienen otros mamferos o pjaros disponibles. Las larvas de las ninguas (familia Trombiculidae) son un problema en muchas partes del mundo, ya que sus salivas pueden causar grandes reacciones inflamatorias con gran prurito. Estas larvas de seis patas, frecuentemente de color rojo, se unen a la piel en zonas donde la ropa aprieta, como es en los tobillos, caderas y muecas o axilas. En reas de Asia y Australia los caros Trombiculidae son vectores del agente del tifus de la maleza (Lae. 1993). Ciertos caros no mordedores juegan un papel en la rinitis alrgica, asma y ciertas lesiones cutneas. Las secreciones, excrementos y partes del cuerpo de Dermatophagoides larinae y de D. pteronyssinus son potentes alrgenos que se dan en el ambiente domstico (Frazier, 1980). Los test ordinarios realizados por un alerglogo pueden identificarles.

Clases de menor importancia mdica

Milpis. Los milpis son artrpodos similares a los gusanos con numerosos segmentos, cada uno de los cuales posee dos pares de patas que pueden encontrarse en y bajo la vegetacin. Aunque carecen de aparato bucal mordedor, algunas especies producen secreciones vesicantes desde las glndulas colocadas en los segmentos. Cuando se les agrede, las largas especies tropicales pueden lanzar un liquido a una distancia de varios centmetros. La exposicin de la piel o mucosas a estos lquidos causa quemazn y ampollas. Ciempis. Estos animales son ms planos que los milpis y tienen slo un par de patas por segmento; poseen largas antenas. Tienen un movimiento rpido y pueden causar picor con un par de pinzas frontales que estn modificadas a partir del primer par de patas. Aunque no suelen causar serios daos, las especies ms grandes (26 c m a 45 cm) del sur de EE.UU. y de las regiones tropicales son capaces de penetrar la piel al locarla, produciendo un picor urente y doloroso con inflamacin local. Aunque podran existir reacciones sstmicas en personas sensibilizadas, esto es raro (Goddard. 1996). Crustceos. Los crustceos de importancia mdica son principalmente los que sirven de huspedes a larvas de diferentes helmintos. Muchos gneros de cangrejos son huspedes intermedianos de diferentes especies de lombrices {Paragommus spp.) en todo el mundo. Los cefalpodos son zooplancton microscpicos que a veces sirven como husped intermediario para los nematodos D. medinensis y Gnathostoma spinigerum y para los cestodos Diphyllobothrium y Spirometra.

Figura 55-11. Sarcoptes scabiei. Diagrama de un surco subcutneo. (Ad = h e m b r a adulta; E = huevos; e = huevos embrionados; Ex = excrementos; Es = cascara de nuevo: So orificio de entrada.) (Atter Railliet fn Brumpt.)

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Tabla 55-11

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Infecciones parasitarias en huspedes comprometidos Anomalas predisponentes Sida (especialmente CD4 + < 200/u.l). trasplantes y quimioterapia Sida, trasplantes y quimioterapia Sida, probablemente otra inmunosupresin Sida, probablemente otra inmunosupresin grave Comentarios Referencias

Infeccin Protozoos intestinales Criptosporidiosis

Isosporiasis Ciclospondiasis Microsporidiosis

Giardiasis Protozoos sanguneos y tisulares Encefalitis granulomatosa amebiana

Inmunodefciencia comn variable, agammaglobulimemia ligada al cromosoma X

Diarrea grave (mayor 17 litros/dia). Puede tener afectacin extraintestinal incluidos pncreas, tracto biliar y pulmones Terapia limitada, no curativa Diarrea grave, afectacin extraintestinal (adenopatas). existe tratamiento disponible Diarrea grave similar a la criptospondioso e isosporiasis. Respuesta al Trimetroprima sulfametoxazol Varios sndromes: 1. Enfermedad mullisistmica 2 Enteritis con diarrea grave (ms frecuente) 3 Infeccin ocular 4. Sndrome hepatobiliar con granulomas, necrosis heptica, colangilis 5. Enfermedad del msculo esqueltico El examen de sedimentos de orina con una correla tincin permite el diagnstico de sndrome extraintestinal y algunos casos de enfermedad intestinal Diarrea crnica, malabsorcin. Sida no es una condicin predisponente

Winner y cois. (1993). Thielman yGuerranl(1998) Wittner y cois. (1993), Thielman y Guerran (1998) Wittner y cois (1993), Thielman yGuerrant(l998) Wittner y cois. (1993), Thielman yGuerrant(1998)

Thielman y Guerran (1998)

Sida y otros estados de inmunosupresin

Toxoplasmosis

Sida con CD4+ habitualmente < 100/(jl y otros estados de inmunosupresin, trasplantes cardiacos, donante seroposilivo y receptor seronegativo

Leishmaniasis

Sida, otra inmunosupresin

Habilualmente causada por el gnero de la Martinez y Visvesvara (1997) Acanthamoeba o Balamuthia. Causa infeccin subaguda o crnica del sistema nervioso central, pero puede ser aguda en los huspedes inmunodeprimidos con diseminacin Habitualmente especies o reactivacin de McCabe y Chirurgi (1993) quistes de infecciones previas. Con frecuencia enfermedad diseminada con afectacin multiorgnica o lesiones del sistema nervioso central multifocal. Puede causar neumonitis similar a la del Pneumocystis carinii. Puede dar coriorretinitis. Puede producirse tras trasplantes de mdula sea. El trasplante cardaco de donante seropositivo y receptor seronegativo puede dar una toxoplasmosis fatal Limitada influencia de la leishmaniasis cutnea Herwaldt (1999) Susceptibilidad a leishmaniasis visceral, pero no aumenta la gravedad. Mayor lacilidad de recada tras el tratamiento En sida, frecuentemente se afecta el sistema nervioso central, el miocardio y la piel Markell y cois. 1999). Mileno (1998)

Tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas) Babesiosis

Sida, linfoma linfoblstico, trasplantes cardacos, otras inmunosupresiones Esplenectomia

Helmintos Estrongiloidiasis

Inmunosuprimidos por trasplantes o quimioterapia, corticodes o linloma, El sida noes el mayor factor predisponente

Artrpodos Sarna

Habilualmente hay infeccin subclinica en los inmunocompetentes. Los esplenectomizados suelen desarrollar enfermedad clnica que puede ser latal Por automfeccin endgena; puede darse hipennfeccin o inleccin diseminada y presentarse como neumona o enfermedad iniestinal grave. Puede aparecer sepsis por gramnegalivo o meningitis con gramnegalivo por la translocacin bacteriana causadas por la larva invasora. Se debe descartar esta inleccin antes del tratamiento inmunosupresor en las reas altamente endmicas Deriva a una sarna noruega con afectacin general de la piel. A veces tiene gran prurito. Los pacientes tienen muchos caros y son muy contagiosos. Pobre respuesta al tratamiento

Markell y cois. 1999). Mileno (1998) Markell y cois. (1999). Mileno (1998)

Neoplasias, inmunodeprimidos por trasplantes, quimioterapia, sida

Markell y cois 1999). Mileno (1998)

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PARASITOLOGA MDICA

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Pentastmidos. Los pentastmidos. o gusanos de la lengua, son artrpodos que pierden las caractersticas morfolgicas tpicas. Los adultos son como gusanos que viven en las fosas nasales de ciertos reptiles, pjaros y mamferos. Las larvas se parecen a caros y residen en roedores, herbvoros y peces de agua dulce. Se han descrito inlecciones hepticas y pulmonares en el hombre tanto en Asia como en frica. Se han hallado adultos en la nasofaringe de personas en Oriente Medio y frica, donde causan una rinopata obstructiva conocida como halzn (Beaver. 1984: Strickland, 1999).

INFECCIONES PARASITARIAS Y HUSPEDES INMUNOSUPRIMIDOS

Los huspedes inmunosuprimidos padecen anomalas en su sistema inmune humoral o celular secundario a enfermedad, tratamiento o causa congenita. La malnutricin grave tambin puede comprometer a las defensas. En la mayora de los casos suelen deberse a alteraciones celulares (clulas T) secundarias a sida, neoplasias, quimioterapia, trasplantes, corticoides o a la combinacin de varias de ellas. Para la giardiasis, el factor predisponente es el defecto inmune humoral, y para la babesiosis es la esplenectomia. Con la pandemia del VIH y el sida especialmente grave, en pases subdesarrollados con alta incidencia de parsitos como la malaria, esquistosomiasis, ascariasis. amebiasis y filariasis, es una suerte que estas infecciones no causen especial gravedad en pacientes con sida. Algunas enfermedades parasitarias, como las causadas por Cryptosporidium. Toxoplasma y Slrongyloides. son ms graves en inmunosuprimidos, pero hay diferencias. Por ejemplo, mientras que la infeccin por Cryptosporidium y por Toxoplasma son particularmente problemticas en personas con sida, la infeccin por Slrongyloides no lo es, pero es un problema en los receptores de trasplantes y en los que reciben quimioterapia, La Tabla 55-11 recoge las infecciones parasitarias ms graves y/o ms frecuentes en los inmunosuprimidos. Las manifestaciones clnicas pueden ser distintas de las de la poblacin normal, como se cita en dicha seccin.

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1240

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
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CAPTULO

56

Patologa molecular de enfermedades infecciosas

Martin G. Cormican, M.D., Ph.D. Michael A. Pfaller, M.D

APLICACIONES DE MTODOS MOLECULARES EN MICROBIOLOGA CLNICA Deteccin de patgenos sin amplificacin de diana Pruebas de ADN para identificacin de cultivos Amplificacin del ADN para diagnstico Epidemiologa molecular

1241

ESTANDARIZACIN, CONTROL DE CALIDAD Y VALORACIN DE LA COMPETENCIA DE MTODOS DE DIAGNSTICO MOLECULAR BIBLIOGRAFA

1250 1251

En la pasada dcada, las tcnicas de biologa molecular han contribuido enormemente para que podamos entender la patogenia y epidemiologa de las enfermedades infecciosas. Como las tcnicas se han vuelto ms accesibles y refinadas, las que se ocupan del diagnstico y tratamiento de la infeccin humana han buscado dirigir el desafo de adaptar estos mtodos para resolver los problemas clnicos habituales, esto es, para el diagnstico de la enfermedad, para orientar el tratamiento y para el control infeccioso y epidemiolgico hospitalario La patologa molecular representa, cada vez ms, una parte del servicio diagnstico que una diversin esotrica para entusiastas. Como las tcnicas moleculares se han vuelto sistemticas, las preguntas del coste y potencial para contribuir al cuidado del paciente necesitan ser dirigidas en cada caso. En cuanto al valor del mtodo, est en funcin del grado en que facilita el trato con los problemas clnicos, no de la elegancia de la tcnica. Por tanto, el diagnstico molecular es el ms apropiado para agentes infecciosos que son difciles de detectar, o para identificar o determinar la sensibilidad antimicrobiana en un tiempo rpido, comparado con mtodos convencionales. Los principios de la biologa molecular relacionados con el diagnstico de laboratorio se comentan con detalle en los Captulos 58, 59. 63. 66 y 68. El diagnstico molecular de enfermedades infecciosas tiene una gran base de cidos nucleicos y necesita el aislamiento de cidos nucleicos de los microorganismos y material clnico, y el uso de enzimas endonucleasas de restriccin, electroforesis en gel y tcnicas de hibridacin de cidos nucleicos. Cada vez ms se estn utilizando tcnicas ms modernas para amplificacin de cidos nucleicos para material clnico. El anlisis de la secuencia de cido desoxirribonucleico (ADN) se ha ido automatizando. Aunque por el momento no es de uso general en el laboratorio, el anlisis secuencial proporciona el ltimo resultado de los organismos caracterizados, y cuando se acompaa con tcnicas de amplificacin, nos ha dado las directrices con las que hemos podido identificar a los microorganismos que no han podido cultivarse y que antes eran desconocidos en enfermedades infecciosas (Amann, 1994; Wilson, 1994). La tecnologa del trozo del gen tambin parece ofrecer un potencial considerable en el futuro para la caracterizacin de microorganismos en el laboratorio clnico. Una consideracin importante en la aplicacin general de las tcnicas moleculares es el coste. En el rea de diagnstico de enfermedades infecciosas, la mejora del paciente y la reduccin del coste de los antibiticos pueden hacer pesar ms que el aumento de los costes del laboratorio. En la actualidad no se han demostrado esos ahorros en muchas aplicaciones diagnsticas de mtodos moleculares. En el caso de enfermedades transmisibles.

el coste puede estar justificado por una mejora de las medidas de control para la infeccin para proteger a los pacientes y cuidar la salud de los trabajadores. La epidemiologa molecular puede hacer una verdadera contribucin a la deteccin y control de la extensin de la infeccin, con capacidad para reducir los porcentajes de infeccin nosocomial y la peticin de antibiticos caros utilizados para tratar organismos resistentes En este punto, sin embargo, la mayora de la justificacin del gasto en diagnstico molecular y epidemiologa es especulativo: sin embargo, los costes del equipamiento, reactivos y expertos son sustanciales, y el director del laboratorio debe tambin considerar las cuestiones econmicas (Kant, 1995). El nivel de inversin justificada debe determinarse en una institucin dada, y en algunos casos usar el servicio de laboratorio de referencia puede presentarse como la opcin ms eficaz.

APLICACIONES DE MTODOS MOLECULARES EN MICROBIOLOGA CLNICA

El uso de mtodos moleculares para la identificacin y deteccin directa de los microorganismos en la microbiologa clnica se est desarrollando gradualmente y ya hay varios productos disponibles comercialmente (Tablas 56-1 a 56-3). Los usos prcticos incluyen el uso de pruebas de cidos nucleicos para una deteccin directa de organismos en el material clnico o para la identificacin de organismos previamente aislados. Adems, las tcnicas basadas en la amplificacin pueden utilizarse para la deteccin e identificacin y para definir caractersticas selectas (p. ej., genes resistentes a los antibiticos) de organismos. Finalmente, los mtodos moleculares proporcionan un gran significado de caracterizacin de organismos, asi como a nivel de subespecies. en investigaciones epidemiolgicas.

Deteccin de patgenos sin amplificacin de diana

La deteccin de microorganismos patognicos por la prueba del ADN, directamente a partir de muestras, ha sido ampliamente investigado usando una variedad de formatos de hibridacin y generadores de seales. El desarrollo de productos comerciales se ha focalizado en el diagnstico directo de enfermedades transmitidas por va sexual y patgenos respiratorios utilizando pruebas de hibridacin fase solucin y pruebas etiquetadas con ster acridina (Tabla 56-1).

1242 Tabla 56-1

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

P r u e b a s d e A D N para la deteccin de p a t g e n o s *
Formato de h i b r i d a c i n Fase solucin Fase solucin Fase solucin Fase slida Placa microtiter Fase solucin Fase solucin Fase slida Placa microtiter Fase slida Placa microtiter Sistema informador Hibridacin ADN/ARN y quimioluminiscencia Slot blot con digoxigenina Hibridacin Hibridacin Cadena ramificada de ADN Ester acridina Ester acridina Cadena ramificada de ADN Cadena ramificada de ADN Estado Comercial' Comunicado Comercial' Comercial Comercial''
1

Organismo Virus del papiloma humano Virus del herpes simple Citomegalovirus Virus de la hepalitis B

Chlamydia Neisseria
VIH

trachomatis gonnorrhoea

Comercial*' Comercial" Comercial'' Comercial'

1

Virus de la hepatitis C

'La tabla contiene ejemplos de mtodos disponibles y no pretende ser exhaustiva. Las pginas web de los principales labricantes son una fuente til paia una mloimacion actualizada Oigene. Silver Spring. MD Murex/Abbol. Abbott Park, IL. ''Chiron. Emeryville, CA "Gen-Probe, Irte., San Diego. CA.
:

Un diagnstico directo por una prueba de hibridacin es rpido y est libre de los problemas de contaminacin asociados con la amplificacin de dianas y es menos susceptible a la inhibicin que otros muchos procedimientos de amplificacin. Una limitacin de la prueba de hibridacin estndar es el requerimiento para detectar 10' o ms copias. Para algunas aplicaciones, se debe valorar un mtodo rpido, conveniente, y que no se base en el cultivo con este nivel de sensibilidad, y las estrategias de seales de amplificacin pueden detectar nmeros tan bajos como 500 genes/ul (Shan, 1994; Murphy, 1999). Incluso los formatos de amplificacin de seales ms sofisticados no parecen mejorar la sensibilidad analtica de los mtodos basados en la amplificacin de dianas, que pueden detectar menos de 50 copias de genes/ml (Erali. 1999). La gran sensibilidad de los ensayos de amplificacin parece ser la venlaja en ensayos de calidad; sin embargo, la tecnologa de pruebas sensibles se est utilizando para muchos ensayos. En enfermedades infecciosas, la prueba de hibridacin basada en la membrana (Southern blot, ranura/punto blot) parece improbable que sea una herramienta significativa en el diagnstico del laboratorio en un futuro. El formato basado en la membrana es quizs el ms aplicable para el anlisis de un gran nmero de muestras asi como para buscar aplicaciones. L a clasificacin del virus del papiloma humano (HPV) y la deteccin segura del HPV

en pruebas diagnsticas fue posible al principio por pruebas de ADN. Una variedad de todas las pruebas genmicas y pruebas de oligonucleotides para los tipos ms comunes de HPV (p. ej.. tipos 16 y 18 comnmente asociados con carcinoma uterino cervical y los tipos 6 y 11 asociados con enfermedad benigna) han sido descritas y se han utilizado tanto el titulaje isotpico c o m o el no isotpico (Faulkner-Jones, 1993; Lorinez, 1992; ngel, 1992). Los formatos Southern blot y ranura/punto blot tambin se han investigado para el diagnstico de toxoplasmosis cerebral y malaria falciparum entre otros, pero an no han sido utilizados en los laboratorios diagnsticos. Los sistemas comerciales han utilizado la hibndacin de fase solucin con un titulaie no isotpico. Aquellos que no utilizan seal de amplificacin sern considerados en primer lugar. Los productos titulados con ster acridina PACE 2 (Gen-Probe) con una deteccin quimioluminiscente son quiz los ms utilizados. Otras tcnicas para la aproximacin diagnstica son los sistemas de ensayo de captura de hbridos (HCA) (Digene y Murex). Tanto el Gen- Probe c o m o los ensayos de captura de hbridos usan un titulaje con prueba no radiactiva que permite una larga vida. Adems, el formato es relativamente sencillo y puede utilizarse para un nmero pequeo o grande de muestras. Las pruebas Gen-Probe (titulacin con ster acridina) para la deteccin de la Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae estn disponibles comercialmente. Se puede utilizar una muestra clnica para detectar ambos patgenos. El proceso entero se realiza en un nico tubo, y la seal quimioluminiscenle se lee en un luminmetro y se interpreta relativamente para un control positivo o negativo. L a liabilidad del equipo Gen-Probe para detectar C. trachomatis en muestras clnicas se ha evaluado en luncion del cultivo celular y mtodos inmunolgicos. Al igual que los mtodos inmunolgicos, pero a diferencia del cultivo, el mtodo no depende de la viabilidad de los patgenos. En un estudio comparativo reciente, el mtodo Gen-Probe era ms sensible que el enzimoinmunoensayo Chlamydiazima (EIA). pero menos sensible que un ensayo comercial de amplificacin de dianas (AMP-CT, Gen-Probe) (Wylie. 1998). El ensayo GenProbe para N. gonorrhoeae se ha evaluado en un nmero de estudios que recientemente han sido revisados con exhaustividad (Koumans. 1998). Los supervisores dicen que el ensayo puede ser ms til en situaciones donde la optimizacin del cultivo es difcil. Un punto significativo adicional es el requerimiento continuo de cultivo para propsitos mdico-legales. Los HCA para detectar el HPV. el virus del herpes simple (VHS) y el citomegalovirus (CMV) ya han sido descritos. Los ensayos HCA se han descrito c o m o ms sensibles que los cultivos para detectar tanto el V H Sc o m o el CMV. Unas modificaciones recientes del ensayo HPV estn dirigidas a mejorar la sensibilidad. El sistema HC es. sin embargo, menos sensible que la amplificacin de cidos nucleicos (Barret-Muir. 1958: Cope. 1997: Cullen. 1997: Poljiak. 1999). Las pruebas de ADN de cadenas ramificadas (Chiron) y Q|3 replicasa (Gene-Trak) (Shan, 1994) representan test de estrategias diagnsticas que incorporan una amplificacin de seal. Las pruebas de ADN de cadenas ramificadas se han desarrollado para la deteccin y cuantificacin del virus de la

Tabla 56-2 P r u e b a s c o m e r c i a l e s d e A D N para la identificacin de cultivos*

Organismo Formato de h i b r i d a c i n En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin En solucin Sistema informador Ester acridina sler acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridina sler acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridina Ester acridma Ester acridina Ester acridina Ester acridma Ester acridina

Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium-intracellulare Mycobacterium gordonae Mycobacterium kansasii Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Blastomyces dermatitidis Cryptococcus neoformans Neisseria gonnorrhoeae Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Escherichia coli Haemophilus influenzae Especies de Enterococcus Streptococcus agalactiae

'Las pruebas recogidas han sido desarrolladas por Gen-Probe Inc . San Die- | go. CA La tabla contiene ejemplos de las pruebas descrilas sin pretender sei exhaustiva. Las pginas web de los principales fabricantes son una fuente til para una informacin actualizada. J

CAPTULO 56

PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1243

Tabla 56-3

S i s t e m a s diagnsticos comerciales d e amplificacin de cidos nucleicos*

Tcnica de a m p l i f i c a c i n Transcnplasa inversa y PCR NASBA Deteccin de la a m p l i f i c a c i n Prueba de captura microtltulo' Prueba del oligonucletido suieto al abalorio magntico Prueba de captura microtltulo
1

Organismo Virus de la hepatitis C

VIH

PCR y transcriptasa inversa NASBA

tivo por hibridacin no depende de la capacidad para detectar cantidades pequeas de cidos nucleicos. La ventaja de la identificacin basada en la prueba sobre mtodos no moleculares es mejor para organismos de crecimiento lento, como las micobacteas u organismos para los que no hay sistemas de identificacin disponibles en el mercado. En este punto, la identificacin por hibridacin es relativamente cara, porque en muchos sitios los aislamientos para identificarlos se hacen de manera individual y hay que hacer un gran nmero de controles para cada aislamiento clnico. En este captulo se comentarn algunas de las pruebas descritas o disponibles en el mercado. La identificacin de las micobacteas cultivadas por un mtodo convencional es lenta, tarda mucho tiempo. Las pruebas de titulacin con ster acridina para el complejo Mycobacterium tuberculosis complex. Mycobacterium avium-intracellulare. M. gordonae y M. kansasii estn comercialmente disponibles (Gen-Probe. San Diego, CA). El uso de estas pruebas permite la identificacin del cultivo en un da de trabajo, y la especificidad y sensibilidad son excelentes (99% y 95,5%, respectivamente) (Goto. 1991: Walton, 1991; Richter. 1999). En algunas ocasiones, alguna variedad de M. tuberculosis puede no reaccionar con la prueba del complejo M. tuberculosis, y parece que hay subespecies de M. kansasii que no reaccionan con la prueba M. kansasii(Badak, 1999; Niemann, 1999). Los mtodos de identificacin del cultivo de Histoplasma capsulatum. Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis y Cryptococcus neolormans tambin estn disponibles (Stockman. 1993). Las evaluaciones indican que la especificidad es del 100% y la sensibilidad del 97% o ms para todas las especies excepto para B. dermatitidis (87.8%) Al repetir el test, la sensibilidad aument al 97.3% para B. dermatitidis y el 100% para otras especies. El sistema Gen-Probe N. gonorrhoeae se ha utilizado para la identificacin de cultivos N. gonorrhoeae, adems del uso para su aplicacin directa en especmenes clnicos (AccuProbe) se compara favorablemente con un sistema comercial de utilizacin rpida de carbohidratos (Quadferm. bioMrieux) y un sistema de coaglutinacin (Phadeback Monoclone GC test) para identificacin de N. gonorrhoeae cultivadas. Las pruebas de ADN tituladas con ster acridina son vlidas para la identificacin de cultivos de Staphylococcus aureus. Streptococcus pneumoniae. Escherichia coli. Haemophilus influenzae, Enterococus spp., Streptococcus agalactiae y Listeria monocytogenes. Estas pruebas se han utilizado para identificar organismos cosechados en los botes de hemocultivo que hayan sido positivos por centrifugacin (Davis, 1991). La identificacin se realiza en treinta minutos y es sencilla.

Prueba del oligonucletido sujeto ai abalorio magntico Prueba de captura microtitulo' Prueba del oligonucletido suieto al abalorio magntico Prueba de captura microtltulo' Prueba de captura microwell'

Cilomegalovirus

PCR NASBA

Mycobacterium tuberculosis

PCR SDA TMA LCR

Prueba do ster acridina"' Captura de anticuerpos del producto etiquetado Prueba de captura microtltulo' Captura de anticuerpos de producto etiquetado
1 1

Chlamydia trachomatis

PCR LCR NASBA

Prueba del oligonucletido suieto al abalorio magntico

1

TMA Neisscria gonnorrhoeae PCR LCR

Prueba del ster acridina" Prueba de captura microtitulo' Captura de anticuerpos de producto etiquetado |
1

"La tabla contiene eiemplos de las pruebas descritas, sin pretender ser exhaustiva Las paginas web de los principales fabricantes son una luente til para una informacin actualizada 'Roche. Indianapolis. IN 'Organon Teknika. Durham NC ^Becton Dickinson Cockeysville. MD "Gen-Probe, Inc.. San Diego. CA "Abbott. Abbotl Park. IL PCR: Reaccin en cadena de la pohmerasa: NASSA amplificacin basada en I la hebra de cido nucleico. SAD amplificacin por desplazamiento de hebra: ! TMA amplificacin mediada por transcripcin; LCR: reaccin en cadena de la | ligasa.

Amplificacin del ADN para diagnstico

La amplificacin de cidos nucleicos tiene el potencial para superar la principal limitacin de la hibridacin ampliando selectivamente las dianas especficas que estn presentes en concentraciones bajas para niveles detectables. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, Sistemas Moleculares Roche) fue la primera tcnica de amplificacin desarrollada y permanece c o m o el mtodo ms conocido y empleado. Nuevas tecnologas de amplificacin, la reaccin en cadena de la ligasa (LCR. Laboratorios Abbott), la amplificacin de hebras de cidos nucleicos (NASBA, Organon Teknika), la amplificacin por desplazamiento de la hebra (SDA. Becton y Dickinson) y la amplificacin mediada por transcripcin (TMA. Gen-Probe) forman las bases de los sistemas de diagnstico adicionales que estn disponibles en la actualidad. El desarrollo de los productos comercializados se ha centrado principalmente en sistemas para detectar infecciones virales especificas (virus de la hepatitis C. virus de la hepatitis B, CMV, VIH), en los agentes principales de las enfermedades de transmisin sexual (N. gonorrhoeae y C. trachomatis) y en el complejo M. tuberculosis. Los productos comerciales se disean con vista a que el usuario los acepte, prevenir la contaminacin, estandarizacin de reactivos y potenciales condiciones de reconversin. No est claro a qu nivel las diferencias son significativas entre los niveles de deleccin logrados utilizando diferentes estrategias de amplificacin. Se ha informado de un nmero de estudios comparando dos o ms mtodos de amplificacin para patgenos particulares (Brown. 1999; Griffith. 1997; Schepetiuk, 1997: Slary. 1998) y. en general, ninguno de los nuevos mtodos ha demostrado un nivel de sensibilidad mayor que la PCR. Los factores para elegir entre los sistemas pueden incluir el porcentaje de productos disponibles, el coste y la conveniencia de

hepatitis C (VHC) y el virus de la hepatitis B (VHB) (Urdea. 1991; Heerman, 1999). el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (Murphy 1999) y para la deteccin del gen mecA. asociado con resistencia a la oxacilina en estafilococos (Kolbert, 1998). Este ensayo de hibridacin se presenta en un formato similar al del inmunoensayo de enzimas. La prueba para hibridacin de dianas se da en una solucin, y despus se captura el hbrido para el microttulo por una prueba adicional unido al microtitulo. El lmite de deteccin de cidos nucleicos diana no es tan bajo como el conseguido con la amplificacin de la diana (Lunel, 1999; Yen-eberman, 1996; Zaaijer, 1994). Los resultados cuantitativos en un rango alto de concentraciones de dianas pueden ser tiles para detectar la carga viral, el pronstico y monitorizar la respuesta al tratamiento en muchas infecciones virales (Heerman, 1999; Yen-Lieberman.1996; Lunel, 1999).

Pruebas de ADN para identificacin de cultivos

Las pruebas de ADN tienen unas reglas establecidas para la identificacin de cultivos de microorganismos (Tabla 56-2). La identificacin del cul-

1244

SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

que pueda hacer en laboratorios individuales. Probablemente es ms prctico para un laboratorio elegir un sistema de amplificacin sencillo que les pueda proporcionar todos los test que ellos piden. En la Tabla 56-3 se resumen algunos de los patgenos que han recibido mayor atencin, y los mtodos de amplificacin que se han utilizado. El nmero de sistemas diagnsticos disponibles est constantemente aumentando, y las pginas web de algunos de los principales fabricantes dan informacin til y actualizada de los productos disponibles o en desarrollo. En la actualidad, los mtodos moleculares tienen una regla establecida para el diagnstico clnico y la direccin de un nmero de nlecciones virales, y puede volverse tambin valioso en el screening de donaciones de sangre (Roth, 1999). En el caso de algunos patgenos bacterianos, la evaluacin de la regla de los mtodos moleculares relacionados con el cultivo o mtodos inmunolgicos puede ser difcil de valorar. En la mayora de los estudios hay un numero de muestras que son positivas para los test de ensayos basados en la amplificacin, pero negativas por mtodos inmunolgicos o de cultivo. La clasificacin de los resultados de estos test son falsos positivos por amplificacin o falsos negativos por cultivo/deteccin de antgeno, tienen implicaciones importantes para los propsitos de calcular la sensibilidad y especificidad de los ensayos basados en la amplificacin y en juzgar los mritos relacionados con las diferentes actitudes para el diagnstico de laboratorio. Muchos investigadores han intentado tratar el problema utilizando la tcnica de anlisis diferentes. El valor y limitaciones de los anlisis diferentes crea controversias: los que la proponen la consideran como la actitud disponible ms prctica (Schachter. 1998). mientras que los que se oponen creen que el proceso tiende a predisponer resultados a favor de los ensayos basados en la amplificacin (Hadgu, 1996; Miller, 1998). Una dificultad adicional en la toma de decisiones concerniente al papel de ciertos ensayos, basados en la amplificacin, en el laboratorio clnico debe expresar las reservas en una revisin, considerando la calidad de muchos estudios publicados (Koumans, 1998).

La PCR tambin ha sido ampliamente estudiada para el diagnstico de la infeccin por CMV en pacientes trasplantados, y se ha descrito un sistema comercial para la deleccin de CMV por PCR (Long. 1998). Los problemas del diagnstico de enfermedad por CMV difieren del VHC y del VIH en que el virus es ubicuo, y por tanto su deteccin en sangre por cualquier mtodo no confirma la enfermedad clnica per se. El desafio en el diagnstico de CMV ha sido distinguir a los pacientes inmunocomprometidos que tienen o van a desarrollar la enfermedad relacionada con el CMV de aquellos en los que la infeccin por CMV no es clnicamente signilicativa. Por estas razones, el CMV estaba entre los primeros virus en los que la cuantificacin del virus por la PCR fue investigada (Gema, 1994). Ms recientemente, la deteccin del ARN-mensajero CMV. que representa la evidencia de una transcripcin activa del genoma viral, ha sido utilizada para detectar la enfermedad por C M Vy valorar las respuestas al tratamiento con informes micialmente favorables (Aono. 1998). La cuantificacin de los virus por mtodos moleculares ha sido reconocida ahora como de importancia significativa en relacin con VHC, VIH y VHB y, posiblemente, tambin con aquellos como el virus Epstein-Barr asociado con enfermedad linfoproliferativa En test de PCR cuantitativos, una cantidad conocida de una diana alterada por PCR o unas series de concentraciones conocidas de dianas alteradas se aaden a las reacciones de PCR que contienen dianas de ADN nativo a partir de una muestra de un paciente. Las cantidades relativas generadas a partir del nativo y una diana alterada o un patrn interno reflejan las cantidades relativas generadas en el sustrato de amplificacin, y esto permite su cuantificacin. El sistema de deteccin del generado se debe diferenciar de los originados del nativo y de la secuencia alterada del patrn estndar. Esto puede acompaarse por el uso del microtitulo wells que contengan tanto una prueba especifica para el tipo nativo c o m o una prueba especifica de diana modificada. Una aproximacin ms actual de la PCR cuantitativa es la tecnologa Taqman. que explota la actividad de la exonucleasa 3 -5 de la enzima polimerasa (Kimura. 1999). En adicin a los primeros, la mezcla de la reaccin contiene una prueba interna que se degrada durante el primer paso de extensin de cada ciclo de PCR La degradacin de la prueba interna causa un aumento de la seal fluorescente en la mezcla amplificada. L a seal fluorescente puede monilonzarse continuamente a travs del proceso de amplificacin, y la intensidad de la seal en relacin con el nmero de ciclos de amplificacin realizados es en funcin del nivel de templados presentes al principio. Esta aproximacin puede proporcionar una cuantificacin ms exacta sobre un rango ms amplio de concentracin inicial de dianas que la PCR cuantitativa convencional, en la que la concentracin del generado se determina en un punto del tiempo determinado en un nmero definido de ciclos. La cuantificacin del VHC puede ser importante en el pronstico y monitorizacin del tratamiento, y una vanedad de sistemas para la cuantificacin del VHC estn disponibles o han sido descritos. Los ms estudiados han sido quiz los mtodos RT-PCR (Roche, Monitor) y el ADN-ramilicado (Chiron, Quantiplex) (Hawkins, 1997; Jacob, 1997: Lu, 1998); sin embargo, el N A S B A (Organon) y la tecnologa PCR cuantitativa nueva (Roche Taqman) se han descrito ms recientemente (Lunel. 1999; Martel. 1999). La variedad de sistemas y el desarrollo crean los estatus definitivos acerca de los valores de la dificultad de los diferentes sistemas. Algunos asuntos importantes para tener en consideracin son el registro dinmico de los sistemas disponibles (el registro de concentraciones de genomas virales dentro del cual el mtodo es ms e x a c t oy reproducible). la variacin en la capacidad para detectar y cuantificar los diferentes genotipos virales VHC y las dificultades del desarrollo de un patrn adecuado para la calibracin. La cuantificacin del virus VIH se utiliza mucho para el pronstico y evaluacin de la respuesta al tratamiento de la elevada actividad antirretroviral (HAART) (Ledergerber. 1999). Los acercamientos tcnicos y los problemas asociados con la cuantificacin de ARN-VIH son por o general parecidos a esos que hemos comentado antes para el VHC (Erali. 1999; Triques. 1999). Tambin se ha publicado una aproximacin alternativa interesante para la cuantilicacin del VIH basada en la medicin de la actividad enzimtica de la transcriptasa inversa en el plasma (Garca-Lerma. 1998). La PCR ha sido estudiada y/o utilizada para el diagnstico de una variedad de otras infecciones virales, incluidas la infeccin por enterovirus (Pozo, 1998:

Diagnstico de infeccin viral

La identilicacin del VHC ha sido posible gracias a las tcnicas de biologa molecular: por tanto, no es sorprendente que la PCR y otros mtodos moleculares tengan un papel importante en su diagnstico. La serologia nos permite detectar una infeccin previa por VHC, pero no permite diferenciar entre la infeccin actual y una curacin espontnea. Como el VHC es un ARN-virus, la transcripcin inversa en cADN es un paso preliminar necesario para la amplilicacin por PCR. Y a se han descrito una variedad de reacciones PCR utilizando la transcnptasa inversa y la ADN-polimerasa. El mercado de Roche Diagnostic comercializa un producto (Amplicor RT-PCR) en el que la transcriptasa inversa y la amplilicacin se realizan por la misma enzima, la de Tth del Thermus thermophilus. y este proceso ha sido automatizado (COBAS Amplicor System) (Poljak. 1997). La deteccin del virus por mtodos moleculares confirma la infeccin reciente y tiene establecida una regla en el diagnstico clnico de la infeccin por VHC y en una respuesta monitorizada para el tratamiento. Para el diagnstico de infeccin por VIH se detectan anticuerpos especficos para el virus con un test serolgico, y como la acreditacin espontnea del VIH no es anticipada, generalmente se acepta la deteccin de estos anticuerpos inequvocamente como una evidencia de infeccin actual. En el caso de recin nacidos, la deteccin de anticuerpos puede reflejar una transferencia transplacentaria de anticuerpos maternos, y se requiere un perodo prolongado de seguimiento (mas de 18 meses) para confirmar la infeccin slo por mtodos serologicos. La deteccin de virus por mtodos moleculares tiene una regla para resolver el estado de esos nios y tambin para dirigir a esos pacientes de quienes el suero es, en repetidas ocasiones, indeterminado en los test serologicos. El VIH existe en la sangre como ARN-virus y como ADN-proviral incorporado en el genoma de clulas mononucleares de sangre perifrica. La transcriptasa inversa no es necesaria para detectar el ADN-proviral, pero se necesita para la deteccin o cuantificacin de ARN-VIH libre. Se ha publicado que el ensayo Amplicor Monitor es ms sensible que el A DNramificado o el NASBA para la deteccin del VIH (Bootman. 1999). y niveles de deteccin tan bajos como 20 copias de ARN-VIH/ml de plasma pueden conseguirse mediante el uso de protocolos de extraccin especficos para el ARN (Fischer, 1999).

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PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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Rotbart. 1994). VHS (Tremblay. 1997), virus JC (Garca de Viedma. 1999) y parvovirus (Jordn. 1998). Los mlodos basados en la amplificacin pueden llegar a aumentar su importancia en el diagnstico y tratamiento de la infeccin viral, como parece que aumenta el nmero de infecciones virales inlluidas por agentes antivirales especficos y, particularmente, en situaciones criticas, como en la infeccin del sistema nervioso central (Read. 1997).

Deteccin de patgenos bacterianos

En estos ltimos aos se han evaluado un gran nmero de ensayos de amplificacin para la deteccin del M tuberculosis complex (MTBC) en muestras respiratorias y no respiratorias. En general, la sensibilidad de estos ensayos es excelente (del 95% al 100%) para muestras en las que la extensin para bacilos cido-resistentes (BAAR) es positiva, pero es ms baja para muestras donde la extensin es negativa (con frecuencia del 50% al 80%) (leven, 1997; Piersimoni, 1998; Pfyfler, 1999; Tortoli, 1999), En mtodos de PCR que utilizan varios mtodos para la preparacin de las muestras y dianas para amplificacin, se asocian con falta de estandarizacin, como lo ilustra Noordhoek (1994), que encontr grandes variaciones en la capacidad de los laboratorios para detectar MTCB en muestras ciegas y para informar las muestras negativas correctamente. Para los laboratorios clinicos, los problemas de una estandarizacin pobre parecen reducirse por el uso de ensayos comerciales con un control central de la calidad de los reactivos y los procedimientos operantes. En general, los ensayos de amplificacin de cidos nucleicos para la deteccin de MTBC son ms sensibles que las extensiones BAAR, pero menos sensibles que el cultivo. En la actualidad, los ensayos comerciales estn aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) slo para los test de las extensiones BAAR positivas en muestras respiratorias. Aunque un nmero de estudios han comparado dos o ms mtodos basados en la amplificacin (Brown, 1999; Piersimoni. 1998; Tortoli. 1998). ninguno de los estudios hasta el momento ha sido lo suficientemente exhaustivo como para lograr sacar una conclusin firme. El cultivo conserva su papel central en el diagnstico de la tuberculosis porque los ensayos de amplificacin existentes no detectan todas las muestras positivas para cultivo, y es necesario aislar el organismo para un test de sensibilidad (y su tipificacin epidemiolgica, si estuviese indicada). Los mtodos de amplificacin son altamente especficos en distinguir MTBC de otras micobacteas que MTBC (MOTT) en muestras BAAR de extensiones positivas, esto nos permite iniciar un tratamiento adecuado y un control de la infeccin. En la actualidad, los test de amplificacin no pueden sustituir la extensin BAAR, porque el ltimo se utiliza para determinar el nivel de mfectividad de los pacientes (los pacientes con una extensin positiva son mucho ms infecciosos que los de extensin negativa) y para juzgar la respuesta inicial al tratamiento. No hay un contexto similar en el que interpretar los mtodos basados en la amplificacin. Adems, los mtodos de amplificacin responden una pregunta mucho ms especfica (est el MTBC presente'') que la extensin (estn presentes BAAR?). En la actualidad, el papel de los ensayos de amplificacin se complementa con los de microscopio y cultivo. La amplificacin de cidos nucleicos tambin se ha aplicado para otros patgenos bacterianos del tracto respiratorio. Legionella pneumophila es un patgeno enrevesado para el que un diagnstico rpido puede ser de una gran importancia. El sistema Legionella EnviroAmp (Perkin Elmer) puede tener aplicaciones para una deteccin rpida de Legionella es muestras roncoalveolares (Weir. 1998). De modo similar. Bordetella perlussis, Chlamydia pneumoniae y Mycoplasma pneumomae presentan dificultades particulares para el diagnostico de laboratono, que tiene que ser dirigido por PCR (Farrell. 1999; Grondahl. 1999: leven, 1997). Pueden ser prometedores para el futuro mltiples ensayos de PCR capaces de detectar y discriminar entre un gran nmero de patgenos respiratorios potenciales (virales y bacterianos) (Grondahl, 1999). El diagnstico de las enfermedades de transmisin sexual tambin ha sido un rea importante para el desarrollo de los ensayos de amplificacin. N. gonorrhoeae crece rpidamente en una agar convencional apropiado, y el cultivo tiene una alta sensibilidad y especificidad bajo condiciones ptimas (Koumans. 1998). N. gonorrhoeae es difcil de detectar, sin embargo, una adecuada recogida y transporte y condiciones de cultivo son criticas y puede que no sea fcil realizarlas en cualquier lugar. El cultivo de C. trachomalis

tambin es exigente, ya que requiere facilidades para el cultivo de tejidos, por tanto, los mtodos que no son de cultivo para la deteccin del anlgeno de Chlamydia han sido muy utilizados durante vanos aos. Casi lodos los mtodos de amplificacin se han descrito o desarrollado para la deteccin de C. trachomatis (Morre, 1998: Pasternack, 1999: Schepetiuk, 1997, Stary, 1998; Vincelette. 1999), En general, las evaluaciones publicadas indican que los mtodos basados en la amplificacin son especficos y ms sensibles que el cultivo celular o los mtodos inmunolgicos (Schepetiuk. 1997: Stary. 1998; Vincelette. 1999; Wyiie. 1998). En un estudio multicntrico reciente del automatizado test COBAS Amplicor CT/NG (Roche), la sensibilidad y especificidad variaban con el tipo de muestra (Vincelette. 1999). Para muestras uretrales de hombres, se public una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98,5%: para muestras endocervicales la sensibilidad era del 96.5% y la especificidad del 99,4%. y para la orina, la sensibilidad variaba del 94,4% al 95,1% y la especificidad del 99.8% al 100%. La realizacin de ensayos de amplificacin de las muestras de orina puede facilitar el screening para la infeccin del C. trachomatis. La remisin de muestras de orina parecen ser ms aceptables que los mtodos de recogida de muestras ms invasivos. Se han publicado comparaciones de diferentes mtodos de amplitcacin (Pasternack. 1999: Schepetiuk, 1997; Stary, 1998), pero en la actualidad no hay suficientes datos para determinar los mritos de cada uno de los diferentes sistemas. Ambos, tanto la PCR como el LCR. pueden tambin utilizarse para detectar N. gonorrhoeae: hay que examinar una sola muestra para ambos patgenos, y est disponible un ensayo PCR mltiple para la deteccin, tanto del patgeno N. gonorrhoeae como de C. trachomatis (Vincelette. 1999). El LCR ha sido publicado como ms sensible que el cultivo (Kehl. 1998). y puede tener posibilidades para ser aplicado en muestras de orina en el screening para N. gonorrhoeae en poblaciones de bajo riesgo (Kacena, 1998). Las limitaciones de algunos estudios de ensayos de amplificacin para la deteccin de N. gonorrhoeae se han resumido (Koumans. 1998). y esto, junto con la posibilidad de resultados falsos positivos con el Amplicor PCR con Neisseria subflava, enfaliza la necesidad del refinamiento de estas nuevas tecnologas (Farrel, 1999). Aunque los patgenos especficos que causan infeccin de los tractos respiratorio y urogenital han recibido mucha atencin, los ensayos de PCR tienen tambin su utilidad. Se han descrito ensayos de PCR que son tambin capaces de amplificar los genes ribosomales rARN de prcticamente cualquier bacteria y de un gran nmero de muestras clnicas U n a rpida secuencia de los productos amplificados y la comparacin de la secuencia de datos con las secuencias en una base de dalos ADN puede permitir la identificacin de una amplia variedad de organismos (Goldenberger, 1997: Tang, 1998). Esta aproximacin tambin ha sido til en buscar publicaciones para la deteccin e identificacin de patgenos que antes eran desconocidos o incultivables (Fredericks, 1996). El desarrollo de la tecnologa de trozo de gen puede aumentar el potencial de esta aproximacin a la amplificacin de un gen diana presente en todos los patgenos potenciales, seguido de una caracterizacin rpida del producto amplificado por hibridacin entre un margen amplio de pruebas especficas de las especies (Belgrader, 1998: Marshall, 1998).

Deteccin de hongos
La infeccin fngica invasiva es un problema creciente en muchos pases (Pfaller, 1994). Candida spp. estn entre las causas que encabezan la infeccin nosocomial del torrente sanguneo en EE.UU., y la aspergillosis es una causa significativa de mortalidad en pacientes trasplantados y otros pacientes inmunocomprometidos La infeccin fungica sislmica es diticil de diagnosticar a tiempo y puede que esto contribuya a una mortalidad elevada. La PCR ha sido estudiada para su posible uso en el diagnstico de candidemia (Bougnoux. 1999) y aspergillosis invasiva (Latge, 1999), y recientemente se ha descrito un test de PCR con una amplia especificidad para una variedad de patgenos fngicos (Van Burik, 1998). La aplicacin clnica de la PCR para el diagnstico de aspergillosis pulmonar invasiva es complicada por una alta frecuencia de muestras de lavados broncoalveolares positivos (BAL) de sujetos sanos, debido a la presencia transitoria de conidias en el tracto respiratorio. Es preferible utilizar el suero del plasma, dado que es menos probable la contaminacin con conidias. Se ha publicado recientemente que un test de PCR progresivo puede ser ms sensible que la deleccin de galactosa por el

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA 527-bp de la regin 16S rARN con anlisis de ordenador pueden servir para identificar bacilos gramnegativos aerbicos inusuales, y pueden tener tambin ms aplicaciones (Tang. 1998). Se ha hecho nfasis en la necesidad critica de generar y completar bases de datos genticas para asegurar la asignacin apropiada de las especies basada en la secuencia del gen 1 6 S rARN, (Fredericks, 1996; Tang. 1998). El potencial para la identificacin de organismos mediante el uso de textos universales para obtener un generado seguido por un uso rpido de una extensa serie de especies, o incluso pruebas especificas de subespecies para definir las especies'subespecies. puede aumentar m u c h o mediante el desarrollo de la tecnologa de los genes (Troesch, 1999).

anlisis de immunoabsorcin enzimlica (ELISA) para el diagnstico precoz de la Aspergillosis invasiva (Kawamura, 1999). Como las bacterias, la combinacin de un amplio espectro de PCR para amplificar un producto de todos o de la mayor parte de los hongos asociados con infeccin humana es una estrategia potencialmente importante (Van Burik, 1998). La amplilicacin podra seguirse de una hibridacin del producto amplificado para una serie de especies. En la actualidad, aunque parece que se van a publicar artculos promeledores. la PCR para el diagnstico de infeccin lngica invasiva no se ha utilizado mucho y no ha sido convincente que pueda compensar las limitaciones del cultivo en un diagnstico rpido de infeccin fngica invasiva en huspedes inmunocomprometidos.

Deteccin de resistencia antibitica Deteccin de parsitos

En los laboratorios clnicos, el diagnstico de infecciones con muchos parsitos protozoos depende de las heces vistas al microscopio, de una extensin de sangre o de mdula osea, o de tejido. La deteccin del antigeno en las heces en el caso de la Giardia lamblia y Cryptosporidium parvum es una alternativa. El examen microscpico de las muestras implica dedicarle mucho tiempo, requiere una gran habilidad y tiene una sensibilidad limitada para muestras que tengan pocos microorganismos. Por estas razones, la PCR puede mejorar la deteccin de parsitos protozoos en los laboratorios clnicos. En un estudio, el ensayo PCR amplificando la subunidad pequea rARN de Plasmodium fue ms sensible que el examen microscpico de un frotis grueso de sangre durante veinte minutos realizado por microscopistas entrenados en diagnosticar la malaria falciparum y para monitorizar la respuesta al tratamiento (Cicern. 1999). Se han obtenido resultados alentadores tambin para la deleccin de Babesia spp. en sangre y parsitos de Leishmania en sangre y mdula sea (Katakura. 1998; Krause, 1996). La deteccin en el lquido amnitico del ADN de Toxoplasma gondii puede facilitar un diagnstico rpido para la toxoplasmosis congenita (Gratzl. 1998). y se ha usado en el lquido cefalorraqudeo (LCR) para el diagnstico de toxoplasmosis cerebral. Tambin se ha descrito su uso para detectar Entamoeba histolytica. Cryptosporidium parvum y Microsporidium (Haque, 1998; Morgan, 1998). Los sistemas de amplificacin comerciales para detectar protozoos an no estn disponibles, as como otros patgenos han superado la calidad de la PCR para la deteccin de 7! gondii (Pelloux, 1998). La resistencia a los agentes microbianos es uno de los principales problemas de salud en esta dcada. Los mtodos moleculares han contribuido sustancialmente para que podamos entender la gentica de la resistencia antimicrobiana y la expansin de determinantes de la resistencia. Tambin tienen la posibilidad de contribuir a detectar pronto la resistencia en el marco clnico (Tabla 56-4) (Bergeron. 1998). Los test convencionales estandarizados de sensibilidad antibitica dependen del crecimiento Inicialmente. se necesita un cultivo puro del patgeno y, un da ms como mnimo para el test de susceptibilidad. Con mtodos de test de sensibilidad automatizados, como Vitek, los resultados pueden estar disponibles en unas horas para ciertos organismos. Los mtodos rpidos que dependen del crecimiento pueden ser menos aplicables para la deteccin de mecanismos de resistencia, en los que es necesario un perodo de induccin en presencia de antibiticos antes de que s e manifieste la resistencia. En el caso de resistencia meticilina/oxacilina en estafilococos, la resistencia puede expresarse de varias maneras, particularmente en el estafilococo coagulasa negativo (CNS), de modo que la resistencia antibilica clnicamente relevante puede ser difcil de detectar por los test de sensibilidad estandarizados, incluso despus de 48 horas de incubacin. Por todas estas dificultades, la deteccin molecular del gen mecA est siendo cada vez ms aceptada como mtodo de referencia entre los mtodos fenotpicos que han sido comparados. La PCR y, ms recientemente, las pruebas de ADN ramificado han sido ampliamente investigadas para la aplicacin para una deteccin rpida del estafilococo resistente a la meticilina (Kolbert, 1998; Marshall, 1997: Ramotar. 1998; Vannuffel, 1995). En el caso de los patgenos de crecimiento lento, especialmente MTBC. pueden pasar semanas entre el envo de las muestras y el informe final de la sensibilidad microbiana. Este retraso no fue considerado un gran problema durante aos porque haba disminuido la incidencia de tuberculosis y la resistencia antibitica era infrecuente. Los test de sensibilidad eran realizados principalmente para confirmar la sensibilidad y para monitorizar la potencial aparicin de resistencias. Desde finales de los aos 80, los consejos del tiempo de laboratorio en relacin al tratamiento de tuberculosis se han vuelto ms esenciales por una sene de razones. stas incluyen el resurgimiento global de la tuberculosis (incluso en pases desarrollados), el surgimiento y la expansin de la resistencia antibitica para MTBC y la aparicin de una poblacin no despreciable con el sndrome de mmunodeficienaa adquirida (sida), en la que la tuberculosis puede progresar rpidamente hasta producir la muerte si no se pone el tratamiento adecuado. La amplificacin de PCR de las secuencias de ADN del rpoB (resistente a la rifampicina) y los genes katG. mhA y ahpC (resistente a isoniacida), seguidas por la deteccin de mutaciones asociadas con resistencia mediante el polimorfismo conformacional de la hebra simple (SSCP). tiene una sensibilidad alta para la deteccin de resistencia a la rifampicina (>96%) y la isoniacida (87%) (Telenti. 1997). Ha sido recientemente publicado el uso de pruebas de ADN de alia densidad en combinacin con PCR para detectar mutaciones en el gen rpoB. Este mtodo tiene la posibilidad de detectar la resistencia a la rifampicina en pocas horas (Troesch, 1999) y podra, en principio, ser aplicado directamente a las muestras sin cultivo previo. Un reconocimiento rpido de las cadenas de MTBC resistentes a los antibiticos es importante para prevenir la expansin de la infeccin con esas cadenas en pacientes susceptibles y personal sanitario. Los mtodos moleculares tienen tambin aplicaciones para la deteccin de la resistencia a las medicinas en un gran espectro de organismos. Se ha publicado la deteccin de resistencia a la vancomicina en enterneceos, neumococos resistentes a la penicilina y en el gen b/a , |5-lactamasa del Hae;u

Identificacin de cultivos
La sensibilidad de mtodos basados en la amplificacin facilita su aplicacin para una deteccin directa de genomas de patgenos especficos en material clnico, pero tambin son valiosos para la identificacin de microbios cultivados. Una reaccin de amplificacin especfica para las especies puede identificar especies sencillas de particular importancia, como MTBC. De modo alternativo, una reaccin de amplificacin puede destinarse a una diana de un gnero especifico o una diana 'universal" y restringir la digestin mediante endonucleasa o hibridacin con mltiples pruebas, o puede utilizarse una determinacin secuencial del generado para identificar y discriminar entre una variedad de especies. Inicialmente se utilizaba la identificacin de cultivos por amplificacin para micobacterias de crecimiento lento, pero tambin tiene aplicaciones para otros patgenos inusuales. Es lgico y conveniente para un laboratorio utilizar la amplificacin para una deteccin directa para usar la misma tecnologa para la identificacin de cultivos donde sea posible. La amplificacin de especies especificas se ha utilizado para una identificacin rpida de M. tuberculosis. M. avium y M. intracellular cultivados (Ninet, 1999: Tortoli, 1998). La aplicacin de esta aproximacin a viales BACTEC positivos con un ndice de crecimiento bajo puede reducir dos o tres das el tiempo para la confirmacin de una diana de todos los miembros del gnero Mycobacterium, y la generacin de patrones especficos para las especies mediante la digestin del generado con endonucleasas de restriccin es un mtodo alternativo que puede discriminar entre ms de 30 especies de micobacterias (Devallois, 1997). Recientemente se han publicado mltiples pruebas de PCR para una diferenciacin entre MTBC. M. avium y otras micobacterias (Cormican, 1995; Kulski, 1995). Tambin se han utilizado mltiples PCR para una confirmacin rpida de toxigenicidad en los hallazgos de E. coli citotxico (Patn, 1988). L a amplificacin y la determinacin secuencial de una regin

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PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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Tabla 56-4 Deteccin d e los p r o b l e m a s d e resistencia a los antibiticos por m t o d o s moleculares Agente Meticilina Oxacilina Vancomicma Bela-lactmicos vanA. B. C. D' mecA" Gen Mtodo de deteccin Prueba de ADN estndar Prueba de ADN ramilicada PCR Prueba de ADN estndar PCR Prueba estndar PCR y RFLP PCR y secuencia PCR y secuenciamiento PCR y SSCP PCR y secuencia trozo de ADN PCR y PCR y SSCP PCR y secuencia PCR y RFLP PCR y secuenciamiento PCR y secuenciamiento PCR y secuenciamiento PCR y LIPA PCR y secuenciamiento Organismos Estafilococos

Enterococos Haemophilus influenzae Enterobacteriaceae N gonorrhoeae Enterobacteriaceae y cocos grampositivos Mycobacterium tuberculosis'

Ouinolonas Rifampicina

Mutaciones en gyrA. gyrB. parC y parE Mutaciones puntuales en rpoB

Isoniacida Etambutol Estreptomicina Aciclovir/lrmacos relacionados Foscarnet inhibidores transcriptasa inversa Inhibidores proteasa

Mutaciones puntuales en katG, inhA, ahpC Mutaciones puntuales en embB Mutaciones puntuales en rpsL y rrs Mutacin/delecin en el gen TK" Mutaciones puntuales en gen ADN-polimerasa Mutaciones puntuales en el gel RT* Mutaciones puntuales en el gen PROT"
-

M tuberculosis^ M tuberculosisM tuberculosis'* Herpes virus" Herpes virus" VIH VIH'

"El mecA codifica la proteina PBP2a' ligada a penicilina alterada, los mtodos fenotipicos pueden requerir 48 horas de incubacin o mas para detectar las resisten cias y poseen una sensibilidad menor del 100%. La deteccin de mecA tiene una potencial aplicacin clnica para circunstancias especificas 'La resistencia a vancomicina en enterococos puede ser descrita en uno de cada cualro genotipos de resistencia, de los cuales vanA y vanB son los de mayor importancia. La detecin genotipica de la resistencia es til en la validacin de los mtodos lenotipicos. La base gentica de la resistencia a |i-lactmicos es extremadamente compleja. El bla y el bla son los dos grupos mas comunes de plsmidos codificados que codifican la resistencia a las celalosporinas de tercera generacin y a los monopenmicos. 'Mycobacterium tuberculosis es un organismo de crecimiento muy lento Pueden ser necesarias cuatro o ms semanas para lograr los resultados del test de susceptibilidad fenotpica La deteccin de los genes de resistencia en M. tuberculosis tiene potencial aplicacin clinica a corlo plazo. "TK: timidina cinasa 'No hay mtodos fenolipicos suficientemente prcticos para la deleccin clinica sistemtica de la resistencia a los antivirales. Los mtodos genolipicos representan un mtodo prctico habitual para deteccin de resistencias antivirales 'RT transcriptasa inversa "PROT proteasa. PCR reaccin en cadena de la polimerasa; RFLP: polimorlismo en el Iragmento de restriccin. SSCP: polimorfismo en la conlormacion de la hebra simple LIPA: ensayo de la prueba lineal
! nu tN

mophilus inlluenzaeen el lquido cefalorraqudeo (Bergeron. 1998; Cockerill. 1999; Jones. 1997: O'Neill. 1999; Tenover. 1994). Tambin est cobrando importancia la deteccin de resistencia en los agentes antivirales desde que la resistencia a los medicamentos se ha reconocido como una barrera significativa para una quimioterapia efectiva de un nmero de infecciones virales. La deteccin fenotpica de resistencia a medicamentos en el VIH es compleja, requiere una gran dedicacin de tiempo y, por tanto, es poco prctica para propsitos clnicos. Las mutaciones especificas en el gen transcriptasa inversa VIH-1 y el gen polimerasa se asocian con resistencia a los agentes antirretrovirales y pueden detectarse por una gran variedad de mtodos moleculares. La deteccin de mulaciones en el genoma del VIH se relaciona con la deteccin de resistencia por test lenotpicos (Tedder, 1998). Un ensayo comercial, ensayo de la prueba lineal (LIPA), diseado para detectar mutaciones en seis codones importantes en el gen transcriptasa inversa, asociadas con resistencia a los frmacos, se ha desarrollado en un intento de facilitar una deteccin ms rpida; sin embargo, su realizacin puede no ser la adecuada para todas las mutaciones significativas (PuchhammaerStockl, 1999). Como en muchas otras circunstancias, donde se necesita hacer el screening de un gran nmero de mutaciones posible en el producto amplificado, el conjunto de pruebas de alta densidad (trozos de gen) puede ser til en el futuro (Gunthard. 1998). Los mtodos moleculares no parecen ser los sustitutos para una deteccin fenotpica de resistencia en la mayora de las situaciones clnicas en un futuro previsible. Estos mtodos pueden aplicarse directamente para muestras clnicas, y pueden, por tanto, ser apropiados para bacterias de crecimiento lento, sobre lodo en situaciones clnicas urgentes, y para la deteccin de

resistencia en virus. Adems, son aplicables a organismos no viables y pueden reducir los riesgos biolgicos asociados con la manipulacin de patgenos viables, como M. tuberculosis. Los mtodos moleculares tambin pueden tener ventajas particulares en relacin con los mecanismos de resistencia que se expresan slo despus de un perodo de incubacin largo, desde que los mtodos fenotpicos pueden no ser lo sulicientemente fiables a que no estn a tiempo en tales casos. Los mtodos moleculares para la deteccin de resistencia antimicrobiana estn limitados en muchos aspectos (Bergeron, 1998). Primero, la ausencia de un gen de resistencia conocido no excluye la posibilidad de resistencia por otro mecanismo. En trminos prcticos, la deteccin molecular se basa en la deteccin de genes individuales bien caracterizados en especies o generos en los que se espera que se produzca. Los mtodos moleculares no detectan los mecanismos de aparicin de nuevas resistencias, y no es probable que se apliquen para la deteccin de la expresin de genes resistentes en especies en las que no se ha observado previamente. Una segunda limitacin es que la presencia de un gen para resistencia antimicrobiana no obliga la expresin del fenotipo resistente. Por ejemplo. E. coli tiene un gen cromosmico para una |i-lactamasa similar a AmpC. pero, casi nunca se expresa. En principio esta limitacin no es insalvable s se utilizan preferentemente los ensayos para detectar mARN mejor que para detectar el gen cromosmico. Dadas estas limitaciones, parece probable que por el momento los mtodos moleculares para detectar la resistencia antimicrobiana se vayan a quedar como herramientas de laboratorios de referencia, tiles en la monitorizacin a gran escala de los mecanismos de resistencia, y como estudios de la realizacin de los mtodos fenotpicos.

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

Tabla 56-5 Mtodos de epidemiologa molecular* Mtodo Polimorfismo de los fragmentos de restriccin Enzimas cortantes frecuentes Ejemplos Mycobacterium tuberculosis Enterococcus faecium Staphylococcus aureus Clostridium difficile Staphylococcus aureus Stenotrophomonas mallophilia Candida albicans Enterobacter cloacae Serratia marcescens Klebsiella pneumoniae Mycobacterium tuberculosis Candida albicans Enterobacter cloacae Acinetobacter baumanii Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Virus de la hepatitis C Staphylococcus aureus Virus de la hepatitis C Virus de la hepatitis C Virus de la hepatitis B Clostridium difficile Staphylococcus aureus Neisseria meningitidis Entamoeba histolytica Comentario Gran nmero de bandas Ahora poco empleado Escasas bandas Electroforesis de pulso de campo Aplicacin muy amplia Escasas bandas Automatizado Escasas bandas Perfil basado en secuencias especficas RAPD y otros Pequea cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Pequea cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Pequea cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Pequea cantidad de ADN Puede bastar extracto crudo Permite una deteccin de cambios de la secuencia menor en un rea especilica Ahora poco empleado til para la amplia definicin de las relaciones dentro de una especie

Enzimas cortantes infrecuentes

Riboescritura

Prueba de hibridacin de elementos repetitivos PCR y productos de electroforesis

PCR y productos de prueba de hibridacin PCR, digestin de productos y electroforesis PCR y productos de secuenciamiento PCR y polimorfismo conformacional de la hebra simple Electroforesis de proteina en gel de poliacrilamida Electroforesis de enzima multilocus

La labia contiene eiemplos de mtodos disponibles y aplicaciones y no pretende ser exhaustiva. __

Epidemiologa molecular
La variedad de herramientas disponibles en la aclualidad de epidemiologa molecular es considerable (Tabla 56-5), y en particular ha existido una proliferacin de mtodos basados en la amplificacin. Un anlisis exhaustivo de los mritos relativos de estos mtodos de aproximacin diagnstica est ms all del propsito de este captulo. Es importante destacar que no hay una tcnica universalmente aplicable y que la opcin de un uso particular depende de las especies estudiadas, de aquello a lo que la peticin hace referencia y de la conveniencia de la tcnica. Las tcnicas moleculares son tiles para responder preguntas de una clnica presente y para el control de infecciones, y no estn limitadas para usos de investigacin. Los ejemplos incluyen clarificar el significado de mltiples aislamientos de Staphylococcus epidermidis de un paciente particular y predecir una respuesta para el interferon en la infeccin por el virus de la hepatitis O La evidencia molecular de identificacin del S. epidermidis realizada en diferentes momentos sugiere que el hallazgo es clnicamente significativo, y los genotipos VHC 1 a y 1b parece menos probable que respondan al interferon que otros genotipos (MartinotPeignoux. 1998; Vandelli. 1999). Las tcnicas moleculares tambin sirven de ayuda para detectar la emergencia y extensin de las cepas de un organismo con resistencias poco usuales a los frmacos usados, asi como la patogenicidad para determinar la eficacia de los procedimientos de control de la infeccin, y en la definicin de la fuente de epidemias o infeccin debida a la comida o productos teraputicos.

Mtodos de tipificacin molecular ADN-dependientes

La bibliografa relativa a la tipificacin molecular ADN-dependiente, y en particular a la tipificacin por amplificacin, se ha convertido en un laberinto de acrnimos y variaciones sutiles. Para poner algn orden en esta rea, es til considerar dos aspectos de cada mtodo: el mtodo tcnico (amplificacin, restriccin de enzimas, prueba o una mezcla de todas eHas) y el princi-

pio (una imagen del cromosoma o foco en secuencias que evolucionan rpidamente). Los mtodos de tipificacin basados en el ADN. se basan en la divergencia progresiva que se produce en la secuencia de clulas bacterianas idnticas sobre un gran nmero de generaciones de divisin celular. Cuanto ms parecida es la secuencia entre dos organismos aislados en pacientes distintos, ms probable es que lo se origin fuera de una fuente comn en el pasado. El grado de divergencia entre organismos puede advertirse en la secuencia entera de los cromosomas. El grado de resolucin ms alto para el mtodo requerira la secuencia de todos los cromosomas, pero esto no es prctico. Por tanto, la mayora de los mtodos desarrollados intentan identificar la variacin de la secuencia en puntos distribuidos de m a n e r a aleatoria por todo el cromosoma. Esta imagen es la base para el polimorfismo en el fragmento de restriccin (RFLP), electroforesis en gel por c a m p o pulsado (PFGE), y la tipificacin usando textos arbitrarios. La divergencia de la secuencia no se produce igual en todos los puntos del cromosoma. Algunos elementos especficos del cromosoma se alteran ms rpidamente con respecto a otra secuencia de nucletidos, o con respecto al nmero de copias del elemento y la distribucin de las copias por lodo el cromosoma. Los ejemplos de secuencias de rpido desarrollo, incluidas las secuencias de insercin (IS), transposones (Tn), secuencias tndem repetidas e integrones (In). Un grupo de mtodos de tipificacin ha empleado estas secuencias altamente variables para estudiar la relacin entre los microbios. Algunos mtodos utilizan una combinacin de la digestin total del cromosoma seguida de una bsqueda de secuencias repetidas. Algunas variables a tener en consideracin para elegir un mtodo de tipificacin para una aplicacin particular son su reproducibilidad (tanto en el propio laboratorio como en otros laboratorios), capacidad disenminativa, rapidez y relacin beneficio-coste. Cada vez ms, la inspeccin visual y la evaluacin cualitativa de los patrones de unin logrados por muchos de estos mtodos de tipificacin estn siendo complementadas por el uso de anlisis cuantitativos monitorizados. y estn apareciendo estudios de los mtodos de anlisis disponibles (Gener-Smidt, 1998; Olive, 1999). La

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PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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capacidad para Transferir rpidamente las imgenes dgitalizadas de patrones de unin a un laboratorio central con la posibilidad de una comparacin rpida de cadenas, y la adaptacin de consensos a la asignacin de los tipos, es lo deseable para aumentar la capacidad de estas tcnicas para seguir la pista de la evolucin y expansin de cadenas especficas a nivel nacional e internacional. Las dificultades que hay que superar en los mtodos de tipificacin moleculares son considerables (Van Belkum, 1997). El anlisis estndar RFLP con enzimas cortantes frecuentes puede generar un gran nmero de bandas en el gel de electroforesis. El mtodo ha sido til en la tipificacin de una gran variedad de organismos. Por ejemplo, Bingen (1991) utilizaba RFLP para demostrar que el Enterococcus faecium resistente a la vancomicna aislado de un hospital francs no presentaba la extensin de una cadena sencilla resistente. Por la complejidad de los patrones de unin que hacen difcil el anlisis, este mtodo ha sido suplantado. Una solucin para la complejidad de los patrones es identificar y analizar slo un grupo que tenga una secuencia especfica en mltiples copias en el genoma. Esto se consigue por una trasferencia de bandas de ADN del gel de electroforesis a una membrana (Southern blot) y la consiguiente aplicacin de pruebas de ADN a la membrana. La secuencia multicopia que generalmente usamos es el gen ARN ribosmico. Este proceso, conocido como nbotipificacin, ha sido utilizado para estudiar las relaciones entre cadenas de muchas especies, y se han publicado estudios comparativos del valor del ribotipificacin en relacin con los mtodos de tipificacin tradicionales para algunas especies. Un sistema totalmente automatizado y un sistema rpido para la realizacin de la ribotipilicacin con una interpretacin asistida por ordenador (Ribopnnter. Quahcon. Wilmington. DE) est ahora comercialmente disponible. El Ribopnnter ha sido presentado para ser ms discriminatorio que la PCR para Salmonella entrica (Hilton, 1998); sin embargo, comparando el Rboprinter con la PFGE para la tipificacin de E. coli y Pseudomonas aeruginosa. ste era menos discriminatorio que la PFGE (Pfaller. 1996). Se h a sugerido que el Ribopnnter puede ser til como una herramienta de tipificacin de primera linea, pero que las cadenas que aparecen indistinguibles en la ribotipificacin pueden ser distinguidas en diferentes grupos en la PFGE. De un modo similar se utilizan las pruebas que hibridan las secuencias multicopias diferentes de 16S rARN. Entre las aplicaciones mejor estudiadas est el uso de una prueba para la secuencia de insercin IS6110 para el tipo MTBC. Este mtodo es relativamente lento y tiene un poder discriminatorio limitado para las cadenas de MTBC con pocas copias de la secuencia IS6110 (Yuen, 1993). Est bien estandarizado y ha sido muy informativo para definir la epidemiologa de la tuberculosis (Bradford. 1998; van Embden, 1993). Ms recientemente se han descrito un nmero de diferentes mtodos de tipificacin para MTBC para suplementar o sustituir el IS6110. La comprobacin de las partes digeridas por RLPF con las secuencias ricas en GC polimrficas multicopia (PGRS) puede ser utilizada para suplementar la tipificacin IS6110 para cadenas con un nmero bajo de copias IS6110 (Bradford, 1998). Un nmero adecuado de bandas para el anlisis de la mayora de los organismos (de 10 a 20 bandas) tambin puede conseguirse por PFGE (Allardet-Servent, 1989). PFGE utiliza la restriccin de enzimas para cortar el ADN en secuencias, lo que ocurre poco frecuentemente, produciendo un nmero limitado de fragmentos de ADN grandes. Este mtodo requiere que las fuerzas que causan las roturas aleatorias en el cromosoma bacteriano se eviten durante la preparacin del ADN para la digestin. Esto se acompaa de la inmersin de la bacteria en tapones de agar antes de la digestin de la pared celular. Tambin se debe emplear un sistema de electroforesis capaz de separar los grandes fragmentos de ADN. La separacin de los fragmentos grandes es posible gracias a una alteracin peridica de la direccin del campo elctrico utilizado en la cmara de electroforesis. La PFGE permite la separacin de cromosomas enteros, por lo que para las levaduras, que son eucariticas, debe generarse un cariotipo sin la digestin de la enzima de restriccin. La PFGE est considerada por algunos como el mtodo ms aplicable y el ms aceptado para la tipificacin molecular. Los principios para la interpretacin de los geles de PFGE han sido propuestos, y para muchos organismos es el estndar de fado pata la tipificacin molecular entre otros mtodos que han sido comparados (Tenover, 1993). Las limitaciones principales de PFGE son que es un mtodo relativamente lento y costoso; sin embargo, se ha avanzado al desarrollar protocolos rpidos de PFGE (Matushek. 1996). La PFGE es aplicable al estudio de la epidemiologa de

muchos patgenos, incluido S. ureos resistente a la meticilina (van Belkum, 1997), E faecium resistente a la vancomicna (Fridkin, 1998), Streptococcus pneumoniae penicilin resistente a la penicilina (Rudolph, 1998). Klebsiella pneumoniae productora de | lactamasa de amplio espectro (Lin. 1998). E. CO//0157 (Grif. 1998). Stenotrophomonas maltophilia (Sader. 1994) y especies Candida para las que se puede utilizar tanto el cariotipo como el anlisis RFLP (Cotmican. 1996). La amplificacin ADN por PCR se aplica para la tipificacin molecular en una variedad de modos. Una ventaja de las estrategias de tipificacin utilizando PCR es que slo se necesitan cantidades de ADN pequeas. De modo adicional, el ADN templado puede ser una preparacin bastante ordinaria, que generalmente no es el caso de los sistemas digestivos de enzimas de restriccin. De modo ms sencillo, las tipificaciones basadas en PCR incluyen el uso de uno o varios principios genricos que terminan en la amplificacin de varios fragmentos de varios tamaos. El nmero y tamao de los fragmentos amplificados depende de la secuencia del genoma microbiano, y se revela un patrn de unin especifico para el tipo de electroforesis en gel (NiRiain, 1994). Este mtodo de variaciones, con una titulacin aleatoria de la amplificacin del ADN polimorfo (RAPD) o amplificacin de la huella dactilar de ADN (DAF). tiene una gran aplicacin para una variedad de patgenos actuales, incluidos Enterobacter cloacae y Neisseriae meningitidis (NiRiain, 1994; Bar. 1998; Woods, 1994). La reproducibilidad de los patrones de unin utilizando textos genricos puede ser problemtica. Las uniones dbiles pueden aparecer y desaparecer fcilmente; sin embargo, parece que algunos grupos han superado estas dificultades (Bar. 1998). Por lo general, estas tcnicas puede que sean ms aplicables a una caracterizacin rpida y preliminar de un nmero pequeo de cadenas dentro de una institucin sencilla. Tambin est surgiendo una variedad de aplicaciones de PCR para la tipificacin de bacterias que usan la diversidad de secuencias repetitivas, c o m o el consenso intergnico repetitivo de enterobacterias (ERIC-PCR) y las secuencias repetidas extragnicas palindrmicas (REPS). Estos empleos han sido vlidos para tipilicar Acinetobacter spp. y otras muchas especies gramnegativas (Vila, 1996). La PCR tambin se ha utilizado en combinacin con la digestin de la endonucleasa de restriccin de todo el ADN cromosmico como polimorfismo amplificado de la longitud de los fragmentos (AFLP) tipificados. En esta tcnica, se amplifica un subgrupo de los fragmentos generados por una digestin de ADN cromosmico con frecuentes enzimas cortadoras. En el caso de E. coli, la utilizacin de cebadores con titulaciones fluorescentes necesita conocer el tamao de lodos los fragmentos en un secuenciador automatizado de ADN. y la disponibilidad de la secuencia completa del genoma E. coli K-12 ha resultado ser un mtodo m u y sofisticado (Arnold. 1999). El conocimiento de la secuencia del genoma del Haemophilus influenzae cadena Rd ha sido explotado de un modo similar para desarrollar un mtodo de tipificacin de PCR basado en el nmero variable de secuencias en tndem repetidas (VNTR) (van Belkum, 1997). El test de tipificacin de MTBC es otro mtodo que se asemeja bastante a la PCR. basada en la amplificacin de las secuencias espadadoras no repetidas situadas entre las pequeas unidades repetidoras (Sola. 1998). La PCR tambin se utiliza para amplificar zonas del genoma microbiano que evolucionan rpidamente, de modo que la conexin puede valorarse por una evaluacin de los producios para una variacin de la secuencia. Las zonas diana incluyen las regiones de espacio entre genes para ARN ribosmico en Aspergillus fumigatus y el gen coagulasa de S. aureus (Hookey. 1998: Radford. 1998). La variacin de la secuencia puede verse por la evaluacin de los patrones de unin producidos en la digestin del producto amplificado con enzimas de restriccin o secuenciacin del producto de PCR. Mtodos de tipificacin similares han servido para clasificar virus. La tipificacin del VHC es de particular inters, asi como un genotipo viral es significativo para predecir una respuesta parecida al tratamienlo con interlern-. La realizacin del genotipo del VHC se basa Irecuentemenle en la deteccin de la variacin de la secuencia en la regin 5 conservada sin traducir del genoma por RFLP. hibridacin para pruebas especficas del genotipo (Line Prob Assay. Innogenetics). por secuenciacin o por polimorfismo de la longitud de los fragmentos (Davidson, 1995; Murphy. 1994; Seme, 1997: Sreevatsan, 1998: Stuyver, 1996). Se ha reconocido la posibilidad de una clasificacin errnea de algunas cadenas donde la distincin se basa

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA PCR (Pelloux. 1998). y lo mismo pasaba con la deteccin de enterovirus (Muir, 1999). El potencial de incrementar la concordancia entre los laboratorios gracias a la estandarizacin de los reactantes y a los protocolos se enfatiza en un informe para lograr una realizacin satisfactoria de la PCR para Chlamydia trachomatis (Mahony, 1994) y el mayor empleo de los sistemas comerciales con reactivos estandarizados, asi como de los anlisis automatizados, pudiendo. en un futuro, reducir estos problemas. La preparacin de las muestras es un asunto critico en el que se busca un equilibrio entre la simplicidad de la preparacin (para lograr ser prcticos y disminuir los riesgos de contaminacin) y la profundidad (para asegurar la liberacin de los cidos nucleicos y la eliminacin de las sustancias inhibidores). Los controles se deben hacer para detectar la contaminacin (p. ej.; el examen por duplicado, controles negativos mltiples) y para monitorizar la degradacin de la diana o la existencia de inhibidores (control positivo en los lmites de deteccin, estndar interno para la amplificacin). El nmero adecuado de controles negativos es esencial y se deben llevar a cabo durante el proceso de preparacin de las muestras. Tan slo una parte de una muestra negativa es adecuada para este fin. La seleccin de controles y normas es muy problemtica cuando el agente infeccioso diana es m u y diverso (VIH y VHC) y cuando se requieren m u c h o s resultados. La complejidad de estos asuntos es evidente en publicaciones de sistemas comerciales para la cuantilicacion de VHC en que pueden no detectar los genotipos 2 y 3 de un modo tan eficiente como el genotipo 1 (Hawkins, 1997) y en las diferencias en la eficiencia de la hibridacin de clones de viriones derivados de ADN en ensayos para la cuantificacin de ADN VHB (Heerman, 1999). Una evaluacin detallada de parmetros que afectan el resultado de los ensayos para la cuantificacin ARN VIH est disponibles, y muchos de los principios identificados son por lo general aplicables (Lew. 1998). Para asegurarse de que ios reactivos son de una gran calidad y estn libres de contaminacin, es conveniente comprar lampones preparados en otro lugar. En este caso, el fabricante es el responsable de proporcionar los datos de la calidad analtica de los reactivos. Una valoracin de la calidad funcional relativa a los lotes previos puede ser adecuada. La contaminacin es un problema considerable para los laboratorios que utilizan PCR diagnsticas. Los estudios entre laboratorios han mostrado que las muestras negativas pueden dar resultados positivos en algunos laboratorios, y la explicacin ms probable es el sobrediagnstico de resultado. Claramente, las consecuencias sobre el cuidado de un paciente con un resultado falso positivo para VHC. VIH o MTBC son importantes. El fundamento de la prevencin de este sobrediagnstico en la mayora de los laboratorios en este punto es la separacin fsica de la reaccin PCR establecida y las zonas de anlisis del producto PCR con un flujo de trabajo estrictamente unidireccional. L a automatizacin de PCR puede tambin ayudar en la prevencin d e este fenmeno (Wilke, 1995), y la mayora de los fabricantes de equipos comerciales de diagnstico molecular han desarrollado, o estn en proceso de desarrollo, sistemas automatizados o semiautomatizados para minimizar la posibilidad de un error humano. Los resultados falsos positivos parecen ser poco frecuentes con el uso de sistemas de test comerciales automatizados (Vncelette, 1999). Adems de la prevencin del sobrediagnstico, los mtodos para prevenir la amplificacin de productos que contaminan la PCR estn disponibles. Los dos mtodos principales son aquellos que utilizan isopsoralen para modificar los resultados a un estado no amplificable, y la ADN uracilo-glucosilasa, para degradar lo generado antes de la amplificacin (Rys, 1993). En cualquiera de los sistemas que se utilicen, debera determinarse el impacto de la tcnica en el lmite de la deteccin de PCR. Tambin es importante para demostrar la electividad de la medida dar el coste aadido al procedimiento. La comprobacin funcional en cada uno de los lotes nuevos de enzimas es una comprobacin adecuada en la produccin y el procedimiento de reparto. Para la ADN pohmerasa, puede ser adecuada la comparacin con un lote previo de enzimas utilizando pruebas en el lmite de deteccin. Para la endonucleasa de restriccin se recomienda la digestin de ADN lambda. La reproducibilidad en muchas tcnicas moleculares es muy dependiente de un control preciso de la temperatura y del uso de un reactivo exacto. Lo primero y esencial para asegurar la calidad es la adquisicin de un instrumento de alta calidad. Dos veces al ao, o con ms frecuencia, se recomienda la monitorizacin de la temperatura y su correcta realizacin (Kopp, 1994). Las pipetas deben calibrarse dos veces al ao.

en una sola diferencia de los nuclelidos. y puede que sea necesaria la determinacin de la secuencia en la regin central para algunos subtipos (Seme, 1998). La secuenciacin directa del producto PCR obtenido con el equipo Roche Amplicor ha sido publicada y puede ser un acercamiento coste-beneficio para la determinacin del genotipo VHC (Holland, 1998). Unos mtodos similares han entrado en vigor para tipificar VIH y otros virus (Peltola. 1998). Los perfiles del plsmido se utilizan hoy da mucho menos que antes para la tipificacin molecular, aunque el estudio del resto del ADN del plasmado es importante para definir la epidemiologa de la difusin de los mecanismos de resistencia antimicrobiana. El estudio de los perfiles del plsmido conjuntamente con la tipificacin basada en el ADN cromosmico ha revelado que en algunos casos la propagacin nosocomial de las resistencias antimicrobianas puede reflejar la propagacin simultnea de las resistencias ocultas en un plsmido y su facilidad de difusin (Liu, 1998).

Tipificaciones moleculares no ADN-dependientes

Se han utilizado varios mtodos de tipificacin no basados en cidos nucleicos para estudios epidemiolgicos. La electroforesis de protenas en gel de poliacrilamida (PAGE) se ha utilizado para muchas bacterias, pero ya no se utiliza (Mulligan. 1988). La electroforesis enzimtica multilocus (MLEE) se basa en la movilidad electrotortica de un nmero de enzimas informativas. Las variaciones en la movilidad de las enzimas es la base de la tipificacin. La MLEE es demandada tcnicamente y puede verse como un modo de examinar las relaciones entre organismos en una escala de tiempo de evolucin ms larga que la que se proporciona por una inspeccin visual de los patrones de unin en muchos de los mtodos de tipilicacin basados en ADN. El estudio de la motilidad electrotortica de las enzimas informativas puede sustituirse por la determinacin de la secuencia de los fragmentos amplificados de los genes codificando las respectivas enzimas, una tcnica conocida como una secuencia tipificada multilocus (Vogel, 1998). Con el uso de los anlisis asistidos por ordenador de los patrones de unin obtenidos por mtodos de tipificacin basados en el ADN o de una secuencia de datos de ADN. se pueden definir los grados de relacin durante una escala de un periodo de evolucin grande de modo similar a MLEE (Arnold, 1999: Bart, 1998).

ESTANDARIZACIN. CONTROL DE CALIDAD Y VALORACIN DE LA COMPETENCIA DE MTODOS DE DIAGNSTICO MOLECULAR

Como para todo diagnstico, la calidad de los resultados comienza con el acierto de la peticin de la prueba y la calidad de la recogida de las muestras y su transporte. El laboratorio deber dar al mdico las directrices para saber qu muestras se pueden permitir, cmo recogerlas y cmo conservarlas, as como el tiempo necesario para ser remitida al laboratorio (vanse Caps. 1 y 57). En el laboratorio, el primer escaln en la valoracin de la calidad es la adecuada validacin de un test particular antes de su uso diagnstico y. cuando se emplee, se debe prestar mucha atencin para mantener los estndares de calidad. Estas directrices se han estipulado en recientes publicaciones de la Association for Molecular Pathology (1999) y del National Committee tor Clinical Laboratory Standards (NCCLS,1995). Pueden surgir problemas a diferentes niveles. El diseo de los test puede no ser capaz de distinguir toda la diversidad gentica de los taxones (clasificacin errnea del VHC subtipo 2c como 2b [Seme, 1987]) o bien solapar las caractersticas con taxones conocidos (falsos positivos de MTBC en pacientes con infeccin pulmonar por M. kansasiiy M. avium [Jorgensen. 1999]). Los problemas en el diseo pueden no ser reconocidos y su realizacin puede ser sobrestimada en las evaluaciones que no empleen adecuados test de referencia (Koumans. 1998). Un reciente informe de la pobre concordancia entre los laboratorios es el estudio de muestras ciegas para MTBC y para VHC mediante PCR (Noordhoek. 1994; Zaaijerr. 1993). donde se sugieren problemas operacionales en el diagnstico de laboratorio. En un estudio ms reciente. 4 de cada 15 laboratorios informaron de uno o ms falsos positivos en el diagnstico de toxoplasmosis med'ante prueba de

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PATOLOGA MOLECULAR DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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El servicio de calidad del laboratorio no termina con la generacin del resultado. El t i e m p oq u e tarda e n darlo es u n elemento esencial. Las guas para la interpretacin del resultado son particularmente importantes en relacin a los mtodos nuevos, ya que los mdicos pueden no estar familiarizados con las limitaciones de estos mtodos. Las guias para la limitacin apropiada del empleo de los test son importantes por razones financieras, estando implicados los asuntos de reembolso. Slo recientemente la Health Care Financing Administration (HCFA) ha asignado cdigos de pago para la deteccin e identificacin d e un nmero limitado de patgenos especficos [Health Care Financing Administration. 1999) Adems, no se sabe con certeza los test que sern reembolsados. Dada una realizacin previa, es improbable que el nivel de reembolso cubra completamente los costes de los test en todas las circunstancias. La participacin en programas de test de competencia es. obviamente, un aspecto importante y necesario para mantener la calidad de los servicios de diagnstico en el laboratorio de microbiologa. Los test de competencia para los mtodos moleculares utilizados en la deteccin e identificacin de agentes infecciosos estn solamente disponibles para unos pocos organismos. El College of American Pathologists (CAP) proporciona modelos de test para la prueba basada en cidos nucleicos para la deteccin e identificacin de N. gonorrhoeae y C. trachomatis (CAP Inspeccin HC5): identificacin de cultivos de micobacterias; y amplificacin basada en la deteccin de una variedad de organismos, incluidos VIH, VHC, CMV. MTBC y Borrelia burgdorferi (CAP Inspeccin ID). La seguridad de la calidad en el diagnstico molecular no es esencialmente diferente de los principios aplicados en otras reas de patologa clnica. La atencin a los detalles, los controles adecuados y un conocimiento de los problemas potenciales, junto con una cuidadosa conservacin, son esenciales.

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C A P T U L O

57

Manejo y recogida de muestras para el diagnstico de las enfermedades infecciosas

Goil L. Woods, M.D.
SANGRE FLUIDOS CORPORALES TEJIDOS OJO TRACTO RESPIRATORIO 1255 1257 1260 1260 1260 TRACTO URINARIO TRACTO GENITAL HECES PIEL Y LESIONES SUBCUTNEAS BIBLIOGRAFA 1262 1264 1266 1268 1269

Las claves para el diagnstico de las enfermedades infecciosas son una adecuada recogida y un adecuado manejo de las muestras. Las guias para la recogida y transporte de muestras y el procedimiento se explican en este captulo. Los principios generales se revisarn primero, seguidos de la explicacin de los tipos ms comunes de ejemplares encontrados en el laboratorio de microbiologa. Para una deteccin ptima de los patgenos responsables de la enfermedad infecciosa, las muestras deberan tomarse cuando la probabilidad de recoger el agente sospechoso sea mayor. Por ejemplo, la probabilidad de recoger la mayora de los virus es en la fase aguda de la enfermedad. Las muestras para bacterias se deberan recoger antes de la toma de antibiticos. El volumen de muestras recogido debe ser adecuado para el estudio microbolgico solicitado. Si el volumen recibido es insuficiente, el mdico o enfermera de la sala deben informar, y se deber sacar una muestra adicional o el mdico debe priorizar las peticiones solicitadas. Si la muestra se recoge con una torunda, la punta de polister vale para todos los microorganismos. El alginato calcico debera evitarse para recoger muestras para el cultivo de virus, porque podria inactivar el herpes simple, el algodn podra ser txico para Neisseria gonorrhoeae y los depresores de madera deberan evitarse porque la madera podra ser txica para Chlamydia trachomatis. Las torundas no son adecuadas para la deteccin de anaerobios, micobacterias u hongos, y su uso no debera permitirse cuando se sospechan estos microorganismos. Las muestras deberan obtenerse del sitio de la infeccin sin que se contaminaran con otros tejidos adyacentes ni secreciones. Todas las muestras, excepto las heces, deberan recogerse en un recipiente estril y ser etiquetadas con el nombre y el nmero de identificacin de la persona a la que pertenece la muestra, la fuente de la muestra y la hora a la que fue recogida. Despus de recogidas, las muestras deben ponerse en una bolsa de residuos biolgicos y ser transportadas al laboratorio tan pronto como sea posible. Si el retraso es inevitable, la orina, el esputo y otras muestras respiratorias, heces y muestras para la deteccin de Chlamydia trachomatis o virus deben ser puestas en el frigorfico para prevenir un crecimiento de la flora normal. El lquido cefalorraqudeo (LCR) y otros fluidos corporales, la sangre y muestras recogidas para determinar Neisseria gonorrohoeae deben dejarse a temperatura ambiente, porque el fro afecta adversamente a la determinacin de patgenos potenciales en estas fuentes.

Cada director de laboratorio debe establecer unos criterios para rechazar muestras Inadecuadas para cultivo. La mayora de los microbilogos coinciden en que las siguientes muestras deberan ser rechazadas. Cualquier muestra recibida en formol. Esputos recogidos hace 24 horas. Muestras de contenedores en los que se ha derramado la muestra. Muestras que han sido inyectadas en placas de agar que se han secado o estn caducadas. Muestras contaminadas con bario, tintes qumicos o agentes grasos. Muestras de sondas Foley. Muestras duplicadas (excepto hemocultivos) recibidas en un perodo de 24 horas. Las siguientes muestras deberan ser rechazadas para el cultivo de anaerobios: lavados gstricos, la orina de la mitad de la miccin, heces (excepto para determinar Clostridium difficile) para estudios epidemiolgicos o para el diagnstico de la bacteria asociada a la intoxicacin alimentaria (se explicar posteriormente), muestras orofarngeas. excepto las muestras obtenidas de tejidos profundos durante un procedimiento quirrgico, esputos, muestras de colostoma o ileostoma obtenidas con torunda y muestras superficiales de piel. Adems, deberan establecerse unas normas para el manejo de muestras que no estn etiquetadas o mal etiquetadas; dichas muestras no deberan ser analizadas hasta que se hubieran resuelto las diferencias. Con el manejo de todas las mueslras deben seguirse unas precauciones universales. Esto significa que hay que usar barreras adecuadas para prevenir la exposicin de piel y mucosas a las muestras. En todo momento deben llevarse guantes, mascarillas y gafas (o trabajar detrs de una proteccin de plstico), y deben llevarse trajes o delantales impermeables en situaciones que haya riesgo de que se derrame el contenido. Lo deseable sera que todos los recipientes para muestras, como minimo esos que contienen secreciones respiratorias y los que se someten especialmente para la deteccin de una micobacteria u hongo, se abrieran en una cabina de seguridad. Las muestras recogidas para aislar un virus deberan ser manejadas en una cabina de seguridad biolgica para evitar la contaminacin de los cultivos celulares. Cuando las muestras o cultivos tienen que ser transportados a travs del servicio postal de EE.UU. a un laboratorio de referencia, deben ser empaquetados de acuerdo al cdigo interestatal de transporte de agentes biolgicos.

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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

1255

Las muestras deben estar limitadas a no ms de 40 mi. Los cultivos de bacterias y hongos deberan crecer en unos tubos en un medio slido. El cierre del recipiente primario (tubo o vial) debera ser sellado con una cinta resistente al agua e introducido en un segundo contenedor (preferiblemente metal) rodeado por una cantidad de material suficiente para absorber el volumen total de la muestra por si el primer contenedor se rompiera o saliera. El segundo contenedor debe ser cerrado y puesto en un recipiente para transportar (hecho de cartn, fibra mecanizada o poliestireno), y etiquetado con una etiqueta oficial de agentes etiolgicos (disponible en los centros para la prevencin y control de enfermedades). Si una muestra debe ser transportada en hielo seco (que est considerado como material de riesgo), debe decir "Hielo seco, muestra clnica congelada". El hielo seco debera ponerse luera del segundo recipiente con el material empaquetado, de manera que el material no se pierda dentro del recipiente extemo si el hielo seco se evapora.

celulitis), instrumentacin de una superficie mucosa infectada (como ocurre en procesos dentales, cistoscopas, sondaje vesical, aborto provocado o sigmoidoscopia) o un procedimiento quirrgico de una zona contaminada (como reseccin transuretral de la prstata (RTU), histerectoma, reseccin de colon y desbridamiento de quemaduras infectadas). La bacteriemia transitoria tambin aparece al principio de muchas infecciones sistmicas y locales, c o m o meningitis, neumona, artritis pigena y osteomielitis. L a mayor parte d e las bacteriemas intermitentes se asocian con abscesos que n o se han drenado, mientras que una bactenemia continua es evidencia de una infeccin intravascular, como endocarditis bacteriana, aneurisma fngico. o un catter intravascular infectado. Una bacteriemia continua tambin se produce durante las primeras semanas de una fiebre tifoidea y brucelosis. Dos hemocultivos separados son casi siempre los adecuados para descubrir los patgenos responsables de las infecciones intravasculares (Werner, 1967). En un estudio de personas con infeccin intravascular, los porcentajes de positividad del primero, de los dos primeros y tres primeros hemocultivos por episodio sptico eran del 80%. 90%. 99%. respectivamente (Washington, 1975). Los datos de otro estudio mostraron que el 91% de los episodios spticos eran detectados en el primero hemocullivo, porcentaje que aumentaba hasta el 99% con el segundo hemocultivo (Weinstein. 1983). Por tanto, tres hemocultivos en un perodo de 24 horas deberan ser suficientes para detectar casi todas las bacterias potencialmente patgenas. El intervalo adecuado entre hemocultivos es desconocido, pero se ha sugerido que es de 30 a 60 minutos. Sin embargo, si es urgente el comienzo del tratamiento con antibitico, los hemocultivos deberan recogerse de sitios diferentes con un intervalo de pocos minutos antes de empezar el tratamiento. Los organismos como el estafilococo coagulasa negativo. Streptococcus viridans. Corinebactenum. Bacillus spp. y Propiontbacterium son contaminantes frecuentes de los hemocultivos, pero tambin podran ser verdaderos patgenos. Recoger dos grupos de hemocultivos por episodio febril ayuda a distinguir probables patgenos de contaminantes. Los ltimos, generalmente, estn presentes en un solo frasco del cultivo, mientras que los patgenos se recogen en ms de un frasco. Como puede haber ms de un episodio febril en un perodo de 24 horas y deben sacarse dos muestras de hemocultivo por episodio, debera estar permitido un mximo de 4 muestras. La mayora de las muestras sanguneas son extradas por venopuncin perifrica. La recogida de muestra arterial no parece que muestre mejor los microorganismos, y el hemocultivo recogido a travs de un catter intravascular se asocia con un aumento de supuestos contaminantes. Como con este ltimo mtodo con frecuencia se necesitan ms cultivos y tratamiento antibitico innecesario, no se recomienda hacer la recogida de sangre para cultivos de un catter intravascular, excepto para catteres umbilicales arteriales en nios (Reller. 1982: Cowett. 1976). Sin embargo, varios cultivos recogidos de un catter intravascular podran ser tiles para determinar si el catter es el foco de infeccin (Wmg. 1979). Los factores del husped tales como anticuerpos, complemento, clulas blancas fagocticas y agentes antimicrobianos podran impedir el crecimiento de los microorganismos en la sangre; por tanto, se han usado varios modos de contrarrestar estos factores. Diluir la sangre en un medio en una proporcin 1:10 produce una adecuada neutralizacin de la actividad bactericida en el suero (Washington, 1986). Incorpora de 0,025% a 0,05% de sodio pohanetolsulfonato en el medio del cultivo inhibe la coagulacin, la fagocitosis y la activacin del complemento e inactiva los aminoglucsidos. Entre los mtodos que contrarrestan la presencia de agentes antimicrobianos se incluye aadir penicilinasas al caldo para inactivar las penicilinas: usar resinas que se adsorban a los antibiticos o usar el sistema de centrifugacin para la lisis, por el cual se produce la N s i s de las clulas blancas y rojas, los microorganismos se concentran por medio de la centrifugacin y la concentracin se cultiva en un medio libre de antibiticos. Existen varios sistemas para analizar la sangre, cada uno con sus ventajas y desventajas (Wilson, 1996; Reimer, 1997). En los sistemas convencionales para analizar los cultivos, que usan un medio liquido enriquecido con nutrientes, se pueden cultivar la mayora de las bacterias. Para recuperar aerobios y anaerobios facultativos se utiliza soja triplica, peptona suplementada. infusin de cerebro-corazn. Columbia o caldo de brcela y lioglucato (THIOl o caldo de infusin de corazn anaerobio se usa para aislar anaero-

SANGRE
La deteccin de patgenos en la sangre es una de las (unciones ms importantes del laboratorio de microbiologa. El hemocultivo es imprescindible para identificar la bacteria responsable de la bacteriemia, la sepsis, las infecciones de vlvulas nativas y protsicas, la tromboflebitis infecciosa, los aneurismas fngicos y las infecciones de injertos vasculares. Los hemocultivos tambin son tiles en el diagnstico de algunas infecciones vricas e infecciones invasivas o diseminadas causadas por ciertos hongos, especialmente especies de Candida. Cryptococcus neolormans. especies de Fusarium e Histoplasma capsutalum. Los parsitos son detectados en la sangre por un examen microscpico de frotis de sangre perifrica. En general, la sangre deberia ser recogida para cultivo antes de empezar el tratamiento con antibiticos o cuando est presente uno o una combinacin de los siguientes sntomas: fiebre (38"C o ms), hipotermia (36"C o menos), leucocitosis (especialmente con desviacin a la izquierda), granulocitopenia o hipotensin. El tiempo de deteccin y la identificacin exacta de los organismos en la sangre depende de una adecuada recogida, del transporte y del proceso de la muestra. La tcnica para detectar todos los microorganismos en la sangre es la flebotoma. Para minimizar la contaminacin de la muestra sangunea con la flora de la piel, el lugar de la venopuncin deberia prepararse con un agente bactericida (el 70% de isopropanol o alcohol etlico) y despus con 1 % 2 % de solucin yodada o clorhexidina. Para una asepsia mayor, el lugar debera estar seco 1 2 minutos antes de la venopuncin Otros aspectos de la recogida de muestras varan para bacterias, virus y parsitos. Deteccin de bacterias y hongos. El momento ptimo para sacar los hemocultivos cuando se sospecha una bacteriemia o funguemia es antes del resfriado, pero como eso no se puede predecir, la mayora de los hemocultivos se recogen despus de comenzar con fiebre o catarro. La sangre se extrae con una aguja y una jeringa y, sin cambiar la aguja, se inyecta directamente en los frascos de hemocultivo o en otro sistema de hemocultivo (Krumholz. 1990). Los frascos o tubos inyectados deben invertirse inmediatamente varias veces para asegurar la mezcla, y sta deber transportarse al laboratorio a temperatura ambiente lo antes posible despus de haber sido recogida. Los hemocultivos nunca deben ponerse en el frigorfico. En adultos con bacteriemia, el nmero de unidades formadoras de colonias (CFU) por mi de sangre generalmente es bajo. En un estudio, por ejemplo, el 25% de los pacientes con Staphilococcus aureus y ms del 50% con Escherichia coli o Pseudomonas aeruginosa tienen menos de una colonia por mililitro de sangre (Henry. 1986). Dado este bajo nivel de bacteriemias en adultos, es recomendable recoger de 20 mi a 30 mi de sangre para el hemocultivo (Washington, 1986; llstrup, 1983). En recin nacidos y nios, la concentracin de microorganismos en la sangre es mayor, por lo que con recoger de 1 mi a 5 mi es suficiente (Dietzman, 1974). Las recomendaciones relacionadas con el nmero de muestras que hay que tomar estn basadas en la naturaleza de la bacteriemia. dependiendo de si es transitona, intermitente o continua. La bacteriemia transitoria sigue a un proceso de manipulacin de un foco de infeccin (un absceso, un fornculo o

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA cada vial que es impermeable para los iones, los componentes del medio y la sangre, pero permeable para el C0 . Si hay organismos presentes, liberan CO, en el medio, se difunde por la matriz del sensor y genera iones hidrgeno. El consiguiente descenso del pH aumenta la fluorescencia del sensor cambiando la seal transmitida a los componentes pticos y electrnicos del aparato. El ordenador genera curvas de crecimiento y los datos se analizan de acuerdo con unos algoritmos crecientes. Las botellas que han sido inoculadas se ponen en celdas individuales del aparato, donde los frascos de aerobios y anaerobios estn continuamente en movimiento. Los medios aerobios y anaerobios de poco volumen (de 5 mi a 7 mi de sangre) y de gran volumen (8 mi o 10 mi de sangre), el medio Peds-Plus (de 0,5 mi a 5 mi de sangre) y el medio Myco F Lytic son vlidos para hallar hongos y micobacterias (Waite. 1998).
2 :

bios. Por lo general se inoculan dos frascos, y uno de ellos se abre para asegurar el crecimiento de los aerobios. Dada la disminucin de las bacteriemias producidas por anaerobios, se est cuestionando la tcnica de usar un Irasco para aerobios y otro para anaerobios (Murray, 1992: Sharp, 1991), La inoculacin sistemtica en dos frascos para aerobios y hacer cultivos selectivos de anaerobios podra permitir la deteccin de ms bacteriemias y funguemias. Los frascos de cultivo se revisan diariamente durante 7 das para ver si hay crecimiento, indicado bien por turbidez, hemolisis, produccin de gas, un nmero discreto de colonias o por la combinacin de stos. Cuando el crecimiento es aparente, una extensin del cultivo se tie con una tincin de Gram y se examina al microscopio, y el caldo es subcultivado en un medio agar apropiado. Un subcultivo habitual de las muestras macroscpicamente negativas debera ser realizado del frasco abierto, y de 6 a 18 horas despus de haber inyectado. Hacer un subcultivo del Irasco de anaerobios es innecesario. Las ventajas de los cultivos convencionales son un coste ms bajo de material y un porcentaje menor de contaminacin. El principal inconveniente es el tiempo que se utiliza en los subcultivos peridicos. Un mtodo menos laborioso consiste en una botella con medio de cultivo al que se le aade una cmara que contiene un medio agar. Para subcultivar este sistema bilsico hay que dar la vuelta al frasco varias veces, permitiendo que la sangre y el medio agar se mezclen. Las colonias en el medio agar se usan para identificar y hacer test de sensibilidad. Para cultivar aerobios, bacterias resistentes y levaduras, este sistema es comparable a otros sistemas, siendo igual o mejor que ellos (Murray, 1991). Sin embargo, la rentabilidad para anaerobios podra ser mayor que en los medios de cultivo convencionales. El sistema de lisis por centrilugacin consiste en un tubo que contiene reactantes que inhiben la coagulacin y la cascada del complemento, produce la lisis de las clulas sanguneas y tampona los microorganismos durante la centrifugacin. Se aade la sangre al tubo, que se invierte varias veces para evitar la coagulacin, y se transporta al laboratorio lo antes posible. Lo ideal es que la muestra se procese inmediatamente, pero puede ser retrasada 8 horas sin efectos adversos para la recuperacin de los microorganismos. Para realizar el cultivo, el tubo es centrifugado durante 30 minutos a 3.000 x g, el sobrenadante se desecha y el sedimento se mezcla en una mezcladora colocndose en medio agar. Tambin se puede hacer lo mismo con los tubos ms pequeos de menor volumen de muestras de recin nacidos y nios. Las ventajas de la lisis por centrifugacin incluyen una recuperacin mayor de Staphylococcus aureus, algunas enterobactenas y hongos (es el mejor sistema para recolectar mohos, como el Histoplasma capsulatum), la disponibilidad directa de colonias para la identificacin y el test de sensibilidad y la capacidad de llevar a cabo varios cultivos. Adems, este sistema es flexible porque se pueden inyectar medios de cultivo especiales para recuperar organismos con unos requerimientos especficos de crecimiento, tales como especies para Legionelta y micobacterias. Sin embargo, el sistema es muy laborioso y es menos probable encontrar Streptococcus pneumonieae. Haemophilus influenzae o anaerobios y el riesgo de contaminacin aumenta. Estn disponibles en el mercado varios sistemas automticos para tener la sangre continuamente monitorizada (Wilson, 1996). La ventaja de estos sistemas es que eliminan la necesidad de hacer un subcultivo y acortan el perodo de incubacin habitual de 7 a 5 das (Woods. 1994; Reisner, 1999). Uno de estos sistemas est basado en el cambio de color ante la deteccin de CO, (Thorpe, 1990), gracias a una membrana que es impermeable para la mayora de los iones y componentes del medio y de la sangre, pero permeable al CO . Los frascos de aerobios y anaerobios con el inoculo se colocan en celdas en el aparato, proporcionndoles un movimiento continuo. Si hay bacterias, stas generan C0 que se libera en el medio; el pH entonces disminuye haciendo que el sensor cambie de verde a amarillo. Los cambios de color se monitorizan una vez cada 10 minutos por un detector del cambio de color. Los medios disponibles para utilizar con este sistema incluyen los medios habituales de aerobios y anaerobios que necesitan de 5 mi a 10 mi de sangre, el Pedi-BacT, que necesita 4 mi de sangre o menos, y FAN (neutralizacin cuidadosa de antibiticos), que intensifica el crecimiento de hongos y bacterias en pacientes con tratamiento antibitico.
? 2

Un tercer sistema detecta el crecimiento de los organismos en el caldo midiendo el consumo y/o produccin de gas (Zwadyx. 1994). Cada vial inoculado se ajusta con un conector desechable que contiene una aguja hueca. La aguja penetra en el tapn de la botella y conecta el cuello de la botella con el sensor. Los monitores del sensor cambian dentro del cuello de la botella por el consumo y/o produccin de gases (CO H y H,) producidos por el crecimiento de organismos y crea unos datos dentro del ordenador. Hay dos medios bsicos disponibles (medio aerbico y anaerbico) que contienen 80 mi de caldo y alojan de 0.1 mi a 10 mi de sangre, y frascos aerbicos y anaerbicos EZ Draw que contienen 40 mi de caldo y alojan de 0.1 mi a 5 mi de sangre.
r }

El hallazgo de algunas bacterias requiere un medio especial o una incubacin larga. Por ejemplo, cuando se sospecha brucelosis, la sangre debera sacarse al principio de la enfermedad y los hemocultivos deberan incubarse durante 3 4 semanas, aunque con los sistemas automticos la Brucella con frecuencia crece en menos de una semana (Bannatyne. 1997). Las infecciones producidas por Borrelia, excepto Borrelia burgdorferi (causante de la enfermedad de Lyme, ms frecuentemente diagnosticada serolgicamente), se diagnostican por la deteccin de espiroquetas en sangre perifrica durante un periodo febril. Los organismos se visualizan al microscopio de campo claro u oscuro en preparaciones en fresco mezclando una gota de sangre con una gota de citrato sdico, o bien en frotis grueso o fino teidos con Giemsa o tinte de Wright examinados por un microscopio de luz. Para aislar la Leptospira mterrogans en sangre, se debe aadir unas gotas de sangre fresca o anticoagulada, recogida durante la primera semana de la enfermedad, a cada uno de los 3 4 tubos de medio de cultivo semislido de leptospiras (el medio de Fletcher o el de Ellinghausen-McColloughJohnson-Harris). Podemos utilizar diferentes mtodos para aislar las micobacterias en las muestras de sangre. Un modo es mediante la lisis por centrifugacin, colocando el sedimento en un medio slido y/o lquido y, posteriormente, los cultivos se incuban durante ocho o ms semanas. Otra posibilidad, y quizs un mtodo ms rpido, es la inoculacin directa del medio Myco-F Lytic (momtorizado para el crecimiento por el apralo BACTEC 9000) o el medio 1 3A (monitorizado por el BACTEC 460TB). Deteccin de virus. Las muestras de sangre son tiles en el diagnstico tan slo en un nmero limitado de infecciones por virus (Tabla 57-1). La viremia generalmente se produce durante el periodo de incubacin o los dos primeros das despus de que los sntomas comiencen, por lo que la muestra de sangre debe tomarse al comienzo de la enfermedad. Una excepcin es la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que se detecta con facilidad en sangre perifrica, clulas mononucleares y plasma de la mayora de las personas seropositivas y, adems, en casi cualquier fase de la enfermedad. Una muestra de sangre recogida de una vena perifrica o de un catter intravascular es adecuada para detectar el virus. Los requisitos de la muestra dependen de cada virus (Tabla 57-1). Todas las muestras de sangre deberan ser llevadas al laboratorio lo antes posible. Si es inevitable un retraso en el anlisis, las muestras deberan estar toda la noche a 4C, excepto las muestras de plasma para la deteccin del ARN del VIH, que debe ser analizado dentro de las 6 primeras horas de la recogida de la muestra. Aqu vamos a hacer hincapi en la tcnica de deteccin del CMV y de los enterovirus empleados en la mayora de los laboratorios. Para la deteccin de otros virus, los de la Tabla 57-1, por lo general las muestras se mandan a un laboratorio de referencia.

Un segundo sistema de monitorzacin continua se basa en una tecnologa de lluorescencia (Nolte, 1993). Hay un sensor de CO en la base de
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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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Tabla 57-1 R e q u e r i m i e n t o s d e las m u e s t r a s para u n a ptima deteccin d e los virus hallados e n sangre Requerimientos de las muestras de sangre Virus Citomeqalovirus Enlorovirus Virus de la inmunodehciencia humana' Virus del herpes humano-6 Parvovirus B 1 9 Virus transmitidos por artrpodos' Modo de recoleccin Con anticoagulante' Con o sin anticoagulante' EDTA Heparinizado Sin anticoagulante Con o sin anlicoagulante Parte empleada para la deteccin Leucocitos Suero o leucocitos Clulas mononuclearcs o plasma Clulas mononucleadas Suero Leucocitos o cogulo homogeneizado Vo lumen (mi)
5 - 1 0 5 - 1 0 2 - 5 5 - 1 0 5 - 1 0 5 - 1 0

"Se puede utilizar hepanna o E D T A para ciloinegalovirus: para los enterovirus se puede usar heparina. citrato o E D T A 'Para monilorizar la carga viral de VIH en pacientes en tratamiento con terapia anlirretroviral Incluye a los v i r u s del este, oesle y la encefalitis equina venezolana, encefalitis de San Luis y California, fiebre amarilla, dengue y liebre de la garrapa la de Colorado EDTA: acido etileriediarninoletraactico, VIH: virus de la mmunodeficiencia humana.

Para la deteccin de CMV y enterovirus en sangre, se debe separar el componente sanguneo que tenga ms probabilidad de contener el virus y su inoculacin en un cultivo de clulas en monocapa que aguanten la replicacin viral o preparar una extensin para teir con anticuerpos monoclonales. El CMV se detecta con ms frecuencia en los neutrfilos, pero podra estar presente en las clulas mononucleares de la sangre perifrica; de este modo, para una deteccin adecuada, los neutrfilos y clulas mononucleares debehan ser cultivados o teidos (Howell, 1979). Los enterovirus se pueden obtener con igual probabilidad tanto de los leucocitos o clulas mononucleares como a partir del suero (Prather, 1984). Para separar los leucocitos hay que recoger sangre con anticoagulante, siendo el citrato o la hepanna sdica los anticoagulantes permitidos (Woods. 1987; Storch, 1994). Para separar el suero, la sangre se recoge en un tubo sin anticoagulante y se coagula a 4 C. Cuando se forma un cogulo, la sangre se centrifuga a 2.000 x g durante 10 minutos a 4 C y el suero se separa de un modo asptico. El tipo de cultivo celular para aislar el virus se debe seleccionar en funcin del virus que esperemos encontrar. Para aislar el CMV se recomienda emplear dos tubos de MRC-5 u otras clulas fibroblsticas humanas para cultivo. La incubacin celular en un medio que contenga 10 M dexametasona. durante un mnimo de 24 horas antes de la inoculacin, aumenta el porcentaje de deteccin de CMV y disminuye el tiempo para la aparicin del efecto citoptico (Thiele. 1988). Para aislar enterovirus. debera inyectarse MRC-5 y clulas primarias de rion de mono, y el porcentaje de aislamiento podria aumentar tambin mediante el empleo de clulas de rion de bfalo y clulas humanas de rabdomiosarcoma (Dagan. 1986). Las muestras de suero incubadas deben ser posteriormente examinadas para el efecto citoptico especifico del virus. Para las muestras de leucocitos, la capa celular de cultivo debe ser inoculada con 0,5 mi de muestra, aadiendo 1 mi de medio de mantenimiento y dejando en incubacin toda la noche. Posteriormente, la suspensin celular se coge y se lava con salmo estril amortiguado con fosfato, aadindose 1,5 mi de medio de mantenimiento, y se vuelve a colocar a cultivar.
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parsitos son las mismas y se van a exponer aqu, desde la ms simple a la ms compleja. La tcnica ms sencilla para detectar parsitos en la sangre es el examen directo. Para prepararlo se coloca una gota de sangre en un porta de cristal, se tapa con un cubre portas y se analiza inmediatamente. L a observacin directa es excelente para el diagnstico de tripanosomiasis, ya que los tripomasligotes y las microfilarias pueden, con frecuencia, verse en movimiento con un bajo o mediano aumento. El diagnstico definitivo se hace por la tincin de las muestras. La extensin usada en hematologa, teida de un modo similar, es una preparacin habitual para determinar las especies de Plasmodium. Babesia. Trypanosoma y microfilarias. Las extensiones para la bsqueda de parsitos se deben fijar y despus teirse manualmente con Giemsa. aunque la tincin hematolgica automtica es tambin vlida. Las muestras se deben observar inicialmente a bajo aumento para detectar microfilarias, que son objetos grandes (entre 100 pm y 200 pm) y que por lo general se ven con facilidad en los bordes de la extensin. Despus de localizadas, las microfilarias deberan estudiarse bajo una lente de aceite de inmersin para su correcta identificacin (vase Cap. 55). Despus de observarla con bajo aumento, la extensin se examina con un objetivo de gran aumento para buscar tripanosomas, y finalmente con el uso de aceite de inmersin para buscar e identificar Plasmodium, Babesia y Trypanosoma. Las extensiones ms grandes son tiles para detectar todos los parsitos antes mencionados y son parte de los requisitos minimos para su diagnstico. Se coloca una gota de sangre en un porta y con la esquina de otro porta se separa cuidadosamente para que ocupe 1 cm-. La preparacin se deja secar y sin fijarla se tie con Giemsa, permitiendo su deshemoglobinizacin.

FLUIDOS CORPORALES
Lquido cefalorraqudeo (LCR). El LCR se recoge para el diagnstico de meningitis y. menos frecuentemente, de encefalitis vricas. Una meningitis infecciosa es una emergencia mdica que requiere tratamiento urgente para evitar la muerte o secuelas neurolgicas serias; se divide en aguda, subaguda y crnica en funcin de la duracin de los sntomas (Tabla 57-2). Una presentacin aguda se produce en el 10% de los casos y la causa ms frecuente es infeccin bacteriana. Casi todas las personas con meningitis viral y el 75% de los que tienen meningitis bacteriana tienen un cuadro subagudo. mientras que el resto presentan meningitis crnica (los patgenos responsables estn recogidos en la Tabla 57-2). Los enterovirus son los causantes ms comunes de la meningitis y deberan ser los primeros en ser considerados en el diagnstico diferencial de meningitis en un nio o adolescente al linal d e

Adems de un cultivo convencional de las clulas debera realizarse un cultivo del centrifugado cuando se solicite CMV (Woods. 1987). Un mtodo ms sensible para detectar CMV en sangre es el test de la antigenemia, que se realiza tiendo la preparacin del citocenlrifugado de leucocitos con anticuerpos monoclonales contra protenas virales (pp 65) (Van Der Bij, 1988; Brumback, 1997), Deteccin de parsitos. Las muestras de sangre son tiles para el diagnstico de malaria, babesiosis. tripanosomiasis y algunas diarias. Las muestras deberan ser recogidas en tubos con anticoagulante y transportadas rpidamente al laboratorio. Si las extensiones deben ser enviadas a un laboratorio de referencia, deben fijarse con alcohol inmediatamente tras su preparacin. Las tcnicas utilizadas en el laboratorio para detectar esos

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA Tabla 57-4 Parmetros d e l liquido cefalorraqudeo normal y c a m b i o s en la meningitis infecciosa
- ~ ~ ^ ~ ~

Tabla 57-2 Pruebas c o m e r c i a l e s de A D N para la identificacin de cultivos* Sndrome Agudo ; Subagudo Crnico Duracin <24 horas t a 7 dias Al menos 4 semanas Probables patgenos Bacterias pigenas Enterovirus, bacterias pigenas Mycobacterium tuberculosis Treponema pallidum Brucella sp Leptospira interrogans Borrelia burgdorferi Cryptococcus neoformans Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Candida spp.

cwwu Normal Meningitis Aguda/subaguda bacteriana Crnica bacteriana tuberculosas, hongos Enterovirus

GB (clsAil)5 (linlocitos)

Protenas (mg/dl) 14-45

Glucosa (mg/dl) 45-100 (2/3 serum) baio ba|o

500-200 000 (PMN) 200-2 000 (linfocitos)

elevado elevado

200-2 000 elevado (al principio PMN; despus linfocilos) GB clulas blancas; PMN: leucocitos polimorfo nucleares. "Se citan las clulas habitualmente predominantes

normal

verano y principio de otoo. La bacteria productora de pus responsable de la meningitis vara segn la edad del paciente (Tabla 57-3). El LCR por lo general se obtiene mediante puncin lumbar, pero algunas veces se aspira de ventrculos directamente o se recoge de un cortocircuito. Al igual que para cultivo de sangre, tambin la asepsia de la piel es fundamental para extraccin y recogida del LCR, que se enva normalmente al laboratorio en tres tubos. Las sugerencias para realizar los test en cada tubo son: tubo 1. recuento celular; tubo 2, preparacin de extensiones para teir con la tincin Gram u otros tintes para cultivo; tubo 3. protenas y glucosa y. si est indicado, test especiales, como el del antigeno criptoccico, test serolgico para la sfilis, otros estudios serolgicos y citologa. Los parmetros normales de LCR y los cambios que se producen durante la meningitis en funcin del organismo causal se recogen en la Tabla 57-4, El LCR debe llevarse rpidamente al laboratorio y tiene que analizarse lo antes posible. Si el retraso es pequeo, la muestra debe dejarse a temperatura ambiente, salvo que se pida un cultivo viral, en cuyo caso habra que meter en el frigorfico una muestra (preferiblemente 1 mi, pero nunca menos de 0,5 mi) durante un breve espacio de tiempo. El proceso de analizar la muestra es diferente para bacterias, hongos, virus y parsitos y se expone de modo separado para cada grupo de microorganismos. Procesar LCR para un cultivo habitual bacteriolgico incluye su concentracin (si se recibe 1 mi o ms de muestra), preparacin de una extensin pequea para teir con tincin Gram y cultivo. La concentracin se consigue mediante la centrifugacin del lquido durante 1 5 minutos al menos a 1.500 x g. El sobrenadante se deja en un tubo estril, dejando como 0,5 mi de sedimento y liquido, que son completamente mezclados en una mezcladora o con la ayuda de una pipeta estril. Como alternativa, si se reciben 2 o ms mililitros, el fluido podra ser concentrado filtrndolo a travs

de un filtro estril desechable de 0,45 pm y usar el filtro para su cultivo (se explica ms adelante). Sin embargo, antes de filtrar la muestra, se ponen 0.5 mi en un tubo estril y se centrifuga para preparar las extensiones para teir con la tincin Gram (como ya se ha descrito) o. preferiblemente, se hace una preparacin citocentrifugada (Shanholtzer, 1982), Despus de preparar la extensin, el medio se inyecta como se explica en el Capitulo 50. Las muestras filtradas se colocan hacia abajo en la superficie de agar chocolate, y tras 24 y 48 horas de incubacin, se desplaza con una pinza estril a otro lugar para detectar las colonias formadas debajo de l. Adems de la tincin de Gram para las muestras y cultivo, los test de aglutinacin de ltex para la deteccin de antigenos de Streptococcus del grupo B. Streptococcus pneumoniae, algn serotipo de Neisseria meningitidis. E. coli (el antigeno capsular K1 hace una reaccin cruzada con el tipo B de Neisseria meningitidis) y Hemophilus inlluenzae tipo B. se debera realizar la tcnica del sobrenadante de una muestra centrifugada, la filtracin de una muestra previamente filtrada o de un muestra original. Estos test de ltex son ms tiles para diagnosticar las meningitis tratadas incompletamente (Maxson, 1994; Bhisitkul. 1994) y para confirmar una extensin positiva para la tincin con Gram. La realizacin sistemtica de los test de ltex debera descartarse porque, en comparacin con las muestras teidas con Gram, su sensibilidad no es significativamente mayor y son mucho ms caros (Perkins, 1995; Kiska, 1995). El diagnstico de la meningitis bacteriana crnica requiere u n a peticin especial, ya que el LCR se maneja de modo diferente para cada entidad. Para diagnosticar la brucelosis. el LCR se procesa como se ha descrito anteriormente para un cultivo bacteriano ordinario, pero los medios se incuban dos o tres semanas. Para leptospirosis. Leptospira interrogans, debera cultivarse el LCR de las primeras semanas de la enfermedad. Los medios especiales (mencionados antes) se inyectan con unas pocas gotas de LCR y se incuban como se ha explicado en el Captulo 50 El diagnstico de neurosfilis se basa en encontrar en el LCR los siguientes hallazgos: pleocitosis. concentracin de protenas aumentada, un test de laboratorio de investigacin de enfermedad venrea positivo (VRDL, LCR VRDL), que de momento es el nico mtodo til para la deteccin de anticuerpos para Treponema pallidum en el LCR (vase Cap. 52). El test de enfermedades venreas en el LCR se indica slo si la persona tiene el suero positivo para la sfilis (Albright, 1991). La muestra debera conservarse en el frigorfico hasta que se haya examinado. La afectacin del SNC por Borrelia burgdoferi (enfermedad de Lyme) tambin se diagnostica serolgicamente mediante la deteccin de IgM e IgG especificas en el suero y LCR. El anlisis del LCR para la deteccin de micobacterias slo est indicado en muestras con pleocitosis, elevacin de glucosa o protenas (Albright, 1991). Para una adecuada recuperacin del germen se recomienda el cultivo de al

Tabla 57-3 C a u s a s bacterianas m s habituales de meningitis aguda s e g n la e d a d Edad Neonalos-3 meses Organismos Streptococcus del grupo B Escherichia coli Listeria monocytogenes' Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Listeria monocytogenes Streptococcus del grupo B

4 meses-6 aos' Seis aos-45 aos >45 aos

"Puede producir meningitis en inmunosuprimidos en rodos los grupos de edad. 'La incidencia en EE.UU. de meningitis debida al Haemophilus inlluenzae tipo 0 ha disminuido drsticamente gracias a l a vai unacin

CAPTULO 57

MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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menos 5 mi. El fluido se cenlrifuga a 3.000-3.600 x g durante 30 minutos, se saca el sobrenadante, el sedimento se mezcla completamente en una mezcladora y se usa para preparar muestras para teir e inocular en medio apropiado (vase Cap. 53). El anlisis del LCR para la deteccin de hongos es el mismo que el descrito para la deteccin de bacterias en un cultivo habitual. Los organismos se concentran por centrifugacin o filtracin. Una preparacin obtenida por citocentrifugacin o una extensin del sedimento teido con Gram se examina, y se coloca en el medio adecuado para cultivo (infusin de cerebrocorazn o el agar de Shabi sin antibiticos). Para muestras filtradas, el filtro se corta con unas tijeras estriles en dos partes, cultivando una para bacterias y la otra para hongos. El cultivo de las muestras centrifugadas se hace colocando una parte del sedimento en diferentes lugares de la superficie del agar. Adems de los cultivos de LCR y las tinciones con Gram, hay disponibles unos test rpidos para el diagnstico de meningitis causada por Chptococcus neoformans: preparacin de tinta china, aglutinacin con ltex y ensayo mediante unin enzimtica inmunoadsorbente (ELISA), Los dos ltimos son especficos para el antigeno capsular. Las clulas encapsuladas del C. neoformans son visibles en el LCR mezclado con tinta china (una gota de sedimento de LCR con una gota de tinta china, disponible en tiendas de arte) en un cristal y examinadas bajo un gran aumento (Fig. 57-1). La sensibilidad de la tinta china es baja excepto en personas infectadas por VIH, por lo que el test de aglutinacin con ltex para el criptococo o la ELISA (que son altamente especficos y que tienen ms del 90% de sensibilidad) son los recomendados para el diagnstico. Estos dos ltimos test pueden ser hechos en un filtro de LCR (si la muestra fue concentrada por filtracin), en el sobrenadante de una muestra centrifugada o en LCR sin centrifugar. Un falso positivo en los resultados de la aglutinacin con ltex se debe a la presencia de Trichosporon beigelii en el fluido del test o a la aparicin de condensacin del agar en dicho fluido. Para evitar este ltimo problema, el test de ltex debera hacerse antes del cultivo o mejor en una muestra separada (Heelan, 1991). El anlisis del LCR para el diagnstico de infecciones virales consta de un cultivo convencional celular (principalmente para la deteccin de enterovirus), cultivo para virus causantes de encefalitis (equina occidental, equina oriental, equina venezolana, San Luis, japons y La Crosse) y test serolgicos. Adems, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) est siendo investigada como una herramienta para la deteccin de enterovirus, virus del herpes simple y para el anlisis del cido nucleico del CMV en LCR, pero en la actualidad no hay equipos disponibles en el comercio. Las lneas celulares para aislar enterovirus son las ya expuestas previamente para las muestras hemticas.

El LCR es en ocasiones enviado al laboratorio para el diagnstico de tripanosomiasis africana ( Trypanosoma gambiense o Trypanosoma rhodesiense) o infeccin con amebas libres (Naegleria fowlery y especies de Acanthamoeba). Una vez que se recibe la muestra en el laboratorio, debera analizarse inmediatamente. Las preparaciones frescas se preparan directamente de la muestra y del sedimento, agitando primero suavemente el tubo para prepararlo (paso necesario, porque los parsitos con frecuencia se quedan en la pared del tubo) y despus centrifugando la muestra a 250 x g durante 10 minutos. Las preparaciones se examinan en el microscopio con el condensador a baja potencia para permitir la visualizacin de trofozoitos o, preferiblemente, en un microscopio de contraste. Los cultivos de amebas de vida libre del LCR se hacen en unas placas de agar no nutriente cubiertas con una suspensin de E. coli o Enferobacler aerogenes. El fluido se centrifuga a 250 x g durante 10 minutos, el sobrenadante se mueve con una pipeta estril y el sedimento se mezcla con 0,5 mi de solucin salina y se coloca en el centro de la placa. El cultivo se incuba a 37C y se examina diariamente durante 10 das bajo el microscopio con un objetivo 10x (Martnez, 1991). Otros fluidos corporales. Se recogen del pericardio, de la cavidad torcica o de la peritoneal aspirando con una aguja y jeringa. El volumen adecuado para aislar la mayora de las bacterias es de 1 mi a 5 mi, pero lo ideal para recoger bacterias y hongos es de 10 mi a 15 mi, que por lo general estn presentes en pequeas cantidades. Por otra parte, para diagnosticar una peritonitis asociada a dilisis peritoneal ambulatoria crnica, la recogida de hasta 50 mi podria mejorar el aislamiento del patgeno causal (Dawson, 1985). Para transportar el fluido, se debe aspirar en un contenedor estril y debe ser llevado al laboratorio sin demora. Alternativamente, la muestra puede ser inyectada en ese momento directamente a los botes de cultivo; parece ser especialmente til una aproximacin para detectar bacterias en el liquido peritoneal (Luce, 1988). Los enterovirus, principalmente los Coxsackievirus A y B, estn entre las causas ms comunes de pericarditis infecciosa. Estos virus podran detectarse en el fluido pericrdico por un cultivo celular convencional, pero como no se detectan en todos los casos, la recogida de un exudado farngeo y de heces (que es donde ms probablemente se produzca el virus), adems del fluido pericrdico, es altamente recomendada para aislar el virus en personas en las que se sospecha una pericarditis enteroviral. Otros virus (herpes simple, varicela zster, CMV, Epstein-Barr, hepatitis B. virus parotiditis, virus influenza) son agentes infrecuentes de la pericarditis y. por general, no se detectan en el lquido pericrdico. El anlisis del lquido de las cavidades corporales para la deteccin de bacterias incluye la preparacin de una extensin para la tincin con Gram e inyectar el medio adecuado para cultivo. Como se ha mencionado antes, las muestras pueden inyectarse en ese momento o en el laboratorio. En el laboratorio, el fluido se centrifuga a 1.500-2.500 x g durante 20-30 minutos y el sobrenadante se separa dejando 0,5 mi donde se mezcla el sedimento y despus se usa para preparar las extensiones e inyectar el medio. Alternativamente se puede separar un volumen pequeo (0,5 mi) de fluido antes de la centrifugacin, y se usa para preparar una extensin para citocentrifugar. El lquido sin centrifugar tambin podra ser inyectado directamente para un sistema de hemocultivo en el laboratorio, dejando de 0,5 mi a 1 mi para preparar una extensin para hacer una tincin de Gram. Las muestras de fluido usadas para la deteccin de micobacterias se analizan como se ha descrito antes para el LCR. Los fluidos para el cultivo de hongos deberan estar concentrados mediante centrifugacin, como se ha descrito antes para las bacterias. El sobrenadante se separa dejando de 1 , 5 mi a 2,0 mi. donde el sedimento entero es mezclado. Una muestra de sedimento se aparta para la tincin con Gram, calcoflor blanco, rojo congo o tincin de plata. Lo ideal es que se inyecten de 0.5 mi a 1 mi de sedimento en un medio de cultivo de hongos (como para LCR), pero tambin es posible con menos volumen. Los fluidos corporales raramente se recogen para la deteccin de parsitos; sin embargo Enlamoeba histolylica podra encontrarse en el pericardio, cavidad pleural o peritoneal, debido a la rotura de un absceso en el hgado (en las cavidades peritoneal, pleural o pericrdica) o en los pulmones (cavidad pleural o pericrdica) o a la perforacin de lceras amebianas (en cavidad peritoneal). Los quistes hidatdicos no son frecuentemente diag-

Figura 57-1. Preparacin de tinta india de lquido cefalorraqudeo que nos muestra las formas de levaduras encapsuladas de Cryptococcus neoformans. (x 400.)

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA hielo hmedo. Se podra obtener un diagnstico rpido por una inmunofluorescencia directa o indirecta de las extensiones de clulas conjuntivas con anticuerpos especficos para virus, pero el cultivo celular es el mtodo ms sensible para detectar patgenos virales potenciales, por lo que siempre debera hacerse. Para detectar Chlamydia trachomatis, se debera teir con Giemsa una extensin preparada directamente de raspados conjuntivales y debe examinarse para clulas epiteliales con inclusiones intracitoplasmticas basofilicas diagnsticas de C trachomatis o. preferiblemente, con anticuerpos monoclonales. que son ms sensibles y especficos que la Giemsa. Para obtener buenos resultados con el test de fluorescencia directa de anticuerpos debera usarse el equipo que haya sido proporcionado por el fabricante (vase Cap. 49). Pasamos la torunda directamenle por la superficie del cristal, fijamos el material y el porta se lleva directamente al laboratorio y se deja a temperatura ambiente, o se mete un rato en el frigorfico. Los portas se tien de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y se ven al microscopio fluorescente para cuerpos elementales (vase Cap. 49). Se considerarn inadecuadas las muestras que tengan menos de 10 clulas columnares o escamosas metaplsicas. y los resultados deberan ser remitidos sin conclusin, dando una explicacin, y debera pedirse otra muestra. El cultivo es el mtodo de referencia para la deteccin de C. trachomatis y debera hacerse cuando hay una alta sospecha de diagnstico de conjuntivitis por Chlamydia y el test de fluorescencia directa de anticuerpos es negativo. Muestras corneales. Los raspados corneales y las biopsas son tiles para determinar el agente etiolgico de la queratitis, una infeccin que puede potencialmente producir prdida de visin y que requiere atencin inmediata. Se encuentran bacterias del 65% al 90% de los casos de queratitis, y Sfreptococcus pneumoniae. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y especies de Moraxella son los que encontramos con mayor frecuencia en EE.UU. Las muestras corneales se recogen con una esptula de platino estril y se usa para preparar las extensiones ponindolas directamente en los portas para teirlas e inocularlas en el medio de cultivo adecuado. Si solicitan un cultivo viral, los raspados deben colocarse directamenle en un medio de transporte viral y se llevan rpidamente al laboratorio o se dejan en el frigorfico un rato y luego se llevan con hielo hmedo. Por lo general, la conjuntiva y los prpados del ojo infectado y del no infectado se cultivan concomitanlemente para determinar la flora normal, que es til para valorar los resultados del cultivo de cornea. Cuando el cultivo de una Ulcera corneal se sospecha que va a ser negativo, el oftalmlogo debera hacer una queratectoma superficial o una biopsia corneal, que es muy til para la deteccin de hongos y Acanthamoeba.

nosticados por el anlisis de los lquidos de las cavidades corporales, tambin debido a que el quiste se rompe en un lugar contiguo a la cavidad El Huido recogido es generalmente claro y contiene "arena" hidatdica (vase Cap. 55]. pero alguna vez puede ser turbio debido a sobreinteccin bacteriana. En individuos con infeccin por filaras es raro que el anlisis de una preparacin en fresco de un fluido de una cavidad corporal pueda demostrar las microfilias, y en pacientes con hiperinfeccin por Strongyloides. las larvas podrian detectarse en los fluidos de las cavidades corporales.

TEJIDOS
La toma de muestras de tejidos mediante ciruga posee un riesgo considerable para el paciente y supone un gran gasto; por tanto, le corresponde al cirujano tomar una muestra suficiente para el estudio histopatolgico y microbiologico. Las torundas por lo general son poco adecuadas para este propsito. La histopatologia de la lesin sirve no slo para diferenciar entre infeccin y malignidad, sino tambin para distinguir entre un proceso supurativo y granulomatoso. En algunos casos los tintes especiales son tiles para establecer la etiologa del proceso. En lesiones crnicas el diagnstico diferencial incluye enfermedad debida a Aclinomyces. Brucella. micobacterias y hongos, y cualquiera de stos debera estar presente slo en un nmero pequeo; de nuevo queremos recalcar la necesidad de obtener muestras adecuadas para cultivo y anlisis. Las muestras obtenidas quirrgicamente para cultivo deben colocarse en un recipiente estril de boca ancha y. como regla general, el cirujano debera separar aspticamente el tejido en el quirfano y remitirlo a anlisis histopatolgico y microbiolgico. Es importante que exista una buena relacin entre histopatlogo y microbilogo, especialmente en casos de fiebre de origen desconocido, para lo que se realiza una laparotoma exploratoria y se toman varias biopsas. Los tejidos recibidos en el laboratorio deberan ser examinados, describiendo sus caractersticas antes de analizarlos. Debe ser entonces cuando se corta muy fino con las tijeras estriles y se deja en un mortero, donde se mezcla con un abrasivo estril en el caldo para hacer una suspensin al 20%. Esta suspensin se usa para inyectar todo el medio de cultivo necesario y despus se deja refrigerar durante por lo menos dos semanas antes de tirarlo.

OJO
Muestras conjuntivales. Los raspados conjunlivales o las muestras recogidas con torunda se recogen para determinar el agente etiolgico de la conjuntivitis. Las bacterias son los agentes etiolgicos ms comunes de las conjuntivitis inlecciosas, y los que con mayor frecuencia encontramos son: Streptococcus pneumoniae. Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis en adultos, y Haemophilus influenza. Streptococcus pneumoniae y Staphylococcus aureus en nios. El tracoma, que es causada por Chlamydia trachomatis, es la principal causa de ceguera en el mundo. C. trachomatis puede causar conjuntivitis de inclusin en recin nacidos y menos comnmente en adultos. Los virus son responsables del 15%-20% de los casos de conjuntivitis inlecciosas agudas y, en EE.UU., la mayora de las epidemias de conjuntivitis vricas las causan los adenovirus. Raramente los parsitos son los causantes de la conjuntivitis. Las clulas conjuntivas se obtienen de la parte superior e inferior de la conjuntiva tarsal usando una torunda humedecida en caldo de cultivo o una esptula estril de platino. Lo ideal es que las muestras se preparen y, si se sospecha una infeccin bacteriana o fngica, el que recoge la muestra debe inocularla directamente en el medio de cultivo. Si la preparacin directa de la muestra o la inyeccin del medio no fuese posible, se deberan recoger muestras con torunda. Las muestras deberan secarse al aire y rpidamente transportarse al laboratorio junto con el medio inyectado. Si se pide un cultivo viral, hay que recoger una segunda muestra (un raspado o con torunda), colocarla en un medio de transporte viral y llevarla pronto al laboratorio, o bien dejarla en el frigorfico durante un rato y despus transportarla en

TRACTO RESPIRATORIO
Muestras nasofarngeas. Las muestras de aspirados nasofarngeos, lavados y frotis se recogen sobre todo para el diagnstico de infecciones respiratorias virales, pero tambin para sarampin. Chlamydia trachomatis, neumona en nios, difteria y pertussis. Los frotis nasales tambin se usan para identificar los portadores del Staphylococcus aureus. Las aspirados nasofarngeos y los lavados son mejores que los Irots para determinacin viral, pero por lo general el frotis es ms conveniente. Los lavados o frotis se recogen para la deteccin de Bordetella pertussis: el frotis es la muestra preferida para detectar Chlamydia trachomatis y Corynebacterium difteriae. El aspirado se recoge con un tubo de plstico (como el que se utiliza para alimentar a los nios) junto con una jeringa de 10 mi o un catter para succionar. El lavado se obtiene con una pera de goma, metiendo y sacando de 3 ml a 7 mi de salino tamponado con fosfato. Para recoger muestras nasofarngeas con una torunda se tienen que sacar los m o c o s de la cavidad nasal, entonces se inserta una torunda pequea y flexible nasofarngea a travs del septo nasal a la faringe posterior y se mueve varias veces por la mucosa. Para detectar virus, las muestras nasofarngeas se colocan en un medio de transporte adecuado, con o sin antibitico (tales como infusin de ternera con 0,5% de gelatina, solucin salina de Hank o caldo sucrosa-fosfato), y se lie-

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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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van rpidamente al laboratorio o se dejan un rato en el frigorfico y se ponen con hielo lo antes posible. Los mtodos de deteccin de virus se explican con ms detalle en el Captulo 48. Para detectar Chlamydia trachomatis se recoge una muestra nasofarngea con una torunda con la punta de polister. que puede utilizarse para cultivo, para preparar una extensin para tincin directa con anticuerpos fluorescentes o posiblemente para ELISA (si el sistema es adecuado para muestras nasofarngeas). Los mtodos de deteccin se explican en el Captulo 49. Para cultivo de Chlamydia trachomatis, la torunda deberia colocarse en un medio 2-sucrosa fosfato que contenga agentes antimicrobianos y ser transportada al laboratorio lo antes posible, o bien ponerla en el frigorfico un poco tiempo. Para detectar Bordetella pertussis nos basta con inyectar el lavado o el frotis en el mismo lugar. Si esto no es posible, colocamos la muestra en un cultivo de casamino estril, llevamos la muestra rpido al laboratorio y se analiza dentro de la primera hora o segunda despus de recoger el cultivo, que es el mtodo ms sensible para detectar B. pertussis: se realiza la tincin directa de anticuerpos fluorescentes, que da unos resultados diagnsticos rpidos pero se asocian con muchos resultados falsos positivos y falsos negativos (Friedman. 1988). En la actualidad el medio recomendado para el cultivo es el agar Regan-Lowe (compuesto de agar carbn oxidado. 10% de sangre de caballo y que contiene cefalexina), mejor que el tradicional agar Bordet-Gengou (infusin de agar patata con el 20% de sangre de oveja). Las muestras que deben transportarse a un laboratorio de referencia para cultivarse deberan de inyectarse en un medio de transporte para Regan-Lowe. Para detectar a los portadores de Staphylococcus aureus, las secreciones nasales se recogen de la nariz con una torunda de polister que se coloca en un tubo para transportarla rpidamente al laboratorio. La muestra se coloca en un agar con el 5% de sangre de oveja, un medio selectivo para organismos grampositivos (agar colistina-cido nalidxico o agar alcohol fenil-etlico), o agar sal de manitol, un medio selectivo para Staphylococcus aureus y que ayuda a diferenciar las especies coagulasa positivo de las coagulasa negativo. Muestras de garganta. Los frotis farngeos que se hacen por lo general se recogen para diagnosticar las faringitis por Streptococcus del grupo A, y las muestras que se reciben en el laboratorio para cultivo ordinario slo deberan buscar este agente. Los lavados de garganta o frotis son tiles para detectar virus que se encuentran en la cavidad oral sin causar faringitis (virus del herpes simple, CMV o enterovirus), y los frotis deberan ser tiles para determinar el agente causante de la epiglotitis, una celulitis que progresa con el riesgo potencial de causar obstruccin de la va area (casi siempre debido a Haemophilus influenzae tipo B, aunque en ocasiones a Staphylococcus aureus o Streptococcus pneumoniae) y en el diagnstico de gonorrea, neumona por Mycoplasma pneumoniae, difteria y angina de Vincent. Los frotis de garganta se recogen sujetando la lengua con un depresor, introduciendo la torunda entre las amgdalas y detrs de la vula sin tocar las paredes laterales de la cavidad bucal y moviendo en todas las direcciones por la faringe posterior. Los frotis recogidos para detectar virus deberan colocarse en un medio de transporte para virus y, los que sean para detectar bacterias, en un tubo para transportar que contenga medio Stuart modificado. Los lavados de garganta para el diagnstico de infecciones virales se obtienen haciendo grgaras con 5 mi de medio de transporte viral que contenga antibiticos. Los lavados y frotis deberan llevarse pronto al laboratorio o dejarlos un rato en el frigorfico, si es inevitable un retraso. Para el diagnstico de faringitis por Streptococcus del grupo A, el cultivo es el ms sensible. Utilizar un medio selectivo aumenta la recuperacin de Streptococcus pyogenes, y si inhibimos la flora normal, disminuye el tiempo requerido para leer las placas y la interpretacin de colonias |i-hemolticas (Bellon. 1991). Cuando se solicita urgente un test directo para Streptococcus grupo A (hay varios disponibles comercialmente) se deben recoger dos muestras. Si el test directo es positivo, la segunda muestra debe desecharse; pero si el test directo es negativo, hay que cultivar la segunda muestra, porque la sensibilidad del test es slo del 70% (Bisno, 1991). Para determinar el agente causante de la epiglotitis, el mdico debera recoger un frotis en un lugar donde se pudiera intubar al paciente en caso de

ser necesario. Para detectar la Neisseria gonorrhoeae en la garganta, la muestra debera inocularse en ese mismo lugar, o tendra que ser transportada al laboratorio lo antes posible y ser inoculada tan pronto como sea posible en un medio selectivo, como el agar Thayer-Martin modificado. Si el retraso es inevitable, la muestra tiene que estar a temperatura ambiente. El frotis de faringe es la muestra para el cultivo de Mycoplasma pneumoniae, aunque para el diagnstico de la neumona por M. pneumoniae por lo general es suficiente con la clnica o un test serolgico. La muestra debe dejarse en el frigorfico hasta que se inyecte en un medio de cultivo adecuado (vase Cap. 49). Para el diagnstico de difteria se recoge una muestra nasofarngea y una (o mejor dos) de garganta y se llevan al laboratorio inmediatamente. Si el personal del laboratorio no tiene experiencia en la identificacin y recuperacin de Corynebacterium diphteriae, tienen que remitir las muestras secas en paquetes o tubos que contengan gel de silica u otro secante a un laboratorio de referencia. Para analizar las muestras de los individuos de los que se sospecha difteria, se preparan dos extensiones de una de las muestras de garganta; una se tie con Giemsa, para diferenciar la difteria de la angina de Vicent, y la otra con azul de metileno Loftier, para visualizar los granulos metacromticos profundos teidos de azul de las especies de Corynebacterium. diphteriae no puede identificarse por la morfologa de las clulas, por lo que deben realizarse cultivos. Las muestras nasofarngeas y de garganta deberan colocarse en un medio de suero de Lffler y en un medio que contenga telurito potsico. Adems tiene que inyectarse y analizarse una placa de agar de sangre de oveja para Streptococcus del grupo A. La angina de Vincent es una amigdalitis aguda, ulcerativa y necrotizante que puede ser causada por Fusobacterium necrophorum y otros anaerobios. Una enfermedad con esta clnica debera llamarse angina de Vincent si en las extensiones preparadas de una muestra farngea o la muestra de la lesin ulcerada encontramos gramnegativos, bacilos fusiformes y espiroquetas al teirlas con Gram. El cultivo del rea de alrededor no suele ser til porque existen muchas especies de anaerobios que estn presentes en la cavidad oral; sin embargo, deben realizarse cultivos de sangre porque la enfermedad suele acompaarse de sepsis. Esputo y aspirado traqueal. Los estudios microbiolgicos de los esputos (expectorado e inducido) y de las muestras de aspiracin traqueal son lo primero que se hace para determinar los agentes etiolgicos de la neumona. Lo mejor es que el esputo se recoja a primera hora de la maana antes de comer. El individuo deberia enjuagarse la boca con agua y despus recoger la muestra, preferiblemente de 5 ml a 10 ml, que resultar de una tos profunda. Para las personas que no tienen tos productiva se debera inducir, poniendo al individuo aerosoles de una solucin de cloruro sdico al 15% y glicerina al 10% durante aproximadamente 10 minutos o hasta que se inicie el reflejo de la tos. La aspiracin traqueal obtiene secreciones respiratorias bajas de pacientes con traqueostoma recogidas en un recipiente de Lukens. Los pacientes con traqueostoma enseguida se colonizan con gramnegativos y otros patgenos nosocomiales, y como la bacteria que coloniza el aparato respiratorio no puede ser diferenciada de la bacteria que causa la enfermedad invasiva por el cultivo de aspiracin traqueal, la interpretacin de los cultivos es muy difcil. Las muestras de esputo y de aspiracin traqueal deben llevarse al laboratorio o, si el retraso es inevitable, se dejan un rato en el frigorfico. Ambos tipos de muestras se deben someter a screening antes de colocarlas en las placas para hacer el cultivo, para determinar si lo que tienen son pocas secreciones o saliva (Morris, 1993). Una extensin obtenida de una parte de la muestra que consiste en material purulento se tie con Gram. Por lo general, las muestras que encontramos con ms de 10 clulas epiteliales por campo de bajo aumento estn significativamente contaminadas con saliva, por lo que deberan rechazarse. Las muestras con menos de 25 clulas epiteliales y ms de 25 neutrfilos por campo de bajo aumento probablemente se acepten (Murray, 1975). El nmero de neutrfilos no se suele tener en cuenta cuando se determina la calidad de la muestra, porque el individuo del que la hemos recogido puede estar neutropnico. Por lo general no se pide un screening en las muestras de esputo inducido y esputos no inducidos para la deteccin de Mycoplasma neumoniae, especies de Legionella y mcobacteria para valorar la calidad (Ingram, 1994; Havlik. 1995). Sin em-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA se meten en la cnula externa para evitar la contaminacin del cepillo cuando se retira el catter. Despus se coloca el cepillo en una solucin estril con 1 mi de suero salino. La muestra debe llevarse inmediatamente al laboratorio y analizarse lo antes posible. Si el retraso es inevitable, tiene que guardarse en el frigorfico. Para analizar la muestra, hay que agitarlo en la mezcladora donde se deja el cepillo. Las preparaciones del centrifugado se tien con una tincin Gram y con el asa de inoculacin calibrado de 0,01 mi, y se deja el cultivo en un medio apropiado Las colonias de ms de 1.000 organismos/ml en el cultivo (que corresponde a 10' organismos/ml de la muestra original) parece que corresponden con una infeccin (Baselski, 1994). Lavado broncoalveolar. Las muestras de lavado broncoalveolar son tiles para el diagnstico de neumona en pacientes ventilados que no han recibido tratamiento antibitico, y para detectar patgenos oportunistas en pacientes con neumona e inmunocomprometidos (Baselski. 1994). Sin embargo, para el cultivo de las especies de Legionella son preferibles las muestras de esputo, porque las muestras broncoalveolares se diluyen en salino y podran contener pequeas cantidades de anestsico local, que inhibe los organismos. Para recoger el fluido, la punta del broncoscopio se introduce cuidadosamente en la luz de la va area. A travs de la luz, se inyecta un volumen de salino (por lo general > 140 mi) en 3 4 alcuotas lavando 1 milln de alvolos. El volumen total que se saca varia en funcin del volumen metido, pero por lo general es de 10 ml a 100 mi. El tiempo que tarde en llevarse al laboratorio tiene que ser mnimo (<30 minutos), y una vez que est en el laboratorio debe analizarse lo antes posible. Si no puede evitarse un retraso, el liquido debera conservarse en el frigorfico. El anlisis de las muestras de lavado broncoalveolar para detectar virus incluye un examen microscpico directo y un cultivo celular. El anlisis de las preparaciones centrifugadas teidas con la tincin de Papanicolau permite detectar los cambios citopticos, tiles en especial para el diagnstico de neumona por CMV (Fig. 57-2) (Woods. 1990). Se recomienda teir las preparaciones centrifugadas del fluido con Gram: visualizar una o ms bacterias sin clulas escamosas epiteliales por campo de aceite de inmersin es altamente sugerente de una neumona bacteriana aguda (Baselski. 1994; Kahn, 1987). Las preparaciones centrifugadas tambin pueden teirse con tincin acido-resistenle. con anticuerpos especficos, como aquellos para delectar las especies de Legionella o Pneumocystis carnii. o con tintes no especficos para detectar Pneumocystis carinii u otros hongos (como tinte de plata, calcoflor blanco o Giemsa). Los datos indican que un cultivo cuantitativo de muestras de lavado alveolar es til para el diagnstico de neumona bacteriana aguda (Baselski. 1994). La muestra se inyecta en un medio agar usando un asa de inoculacin calibrado de 0,001 mi (como se vera despus para los cultivos de orina) La presencia de ms de 10.000 colonias/ml corresponde con la enfermedad. Para detectar micobacterias, las muestras deben ser descontaminadas y manejadas como se describe en el Captulo 53. Para detectar virus, debe hacerse un cultivo convencional y un cultivo centrifugado para CMV. Para recuperar los hongos, se debe inyectar el sedimento de una muestra centrifugada en un medio de cultivo primario.

bargo. los dalos de un estudio sugieren que la presencia de neutrflos en un screening de las muestras de esputo es un mtodo efectivo para evaluar la aceptacin del esputo para el cultivo y muestra micobacteriana. (McCarler, 1996). Las extensiones teidas con Gram que se han preparado de una muestra adecuada para cultivo se examinan con inmersin en aceite para determinar los diferentes organismos. La cantidad de organismos (raros, pocos, moderados o muchos) se estima para cada tipo de bacterias (p. ej.. cocos grampositivos en parejas, cadenas o racimos; bacilos grampositivos. diplococos gramnegativos y gramnegativos en varillas), diferenciando si son o no intracelulares. Las muestras de secreciones traqueales teidas con Gram en las que no se observan organismos deberan rechazarse (Gilligan, 1999). Los trozos de muestras aceptadas que contengan material purulento se inyectan como se describe en el Captulo 50: para muestras de individuos con fibrosis qustica. tambin se recomienda inyectar en un medio selectivo para Burkholderia (Pseudomonas) cepacia. Hay algunos organismos que no encontramos en un cultivo ordinario, y para aseguramos de que se detectan hay que pedir unos test especficos. Por ejemplo, cuando se sospecha enfermedad por Legionella, se recomienda un cultivo de Legionella y un test directo rpido (anticuerpos fluorescentes). El cultivo es el mtodo ms sensible y debera realizarse siempre. Las muestras de esputo y aspiraciones traqueales que vayan a ser sometidas a un cultivo para Legionella deberan diluirse 1:10 en un tubo con caldo tnpticasa que contenga pedas de cristal estriles, y se agita en una mezcladora o se trata lavndolo con una solucin acida para evitar el crecimiento de la llora bacteriana normal. Habra que inocular algunas gotas de la muestra de cada una de las dos placas de agar extracto de levaduras carbn tamponado con u-cetoglutarato, una con agentes microbianos y otra sin ellos. La tincin con fluorescencia directa de los anticuerpos, que puede darnos resultados en unas horas frente a los 57 das que tardan los cultivos, debera usarse para suplementar. pero no para sustituir el cultivo. Para una deteccin adecuada de micobacterias en los esputos, se recomienda recoger las muestras en tres das diferentes. El esputo y otras secreciones respiratorias deben descontaminarse para evitar el sobrecrecimiento bacteriano rpido de la flora respiratoria saprofita sobre las micobacterias de crecimiento. Este proceso y los mtodos para detectarlo se comentan en el Captulo 53. Todas las muestras destinadas para el cultivo de hongos se deben manejar en una cabina de seguridad biolgica. La calidad de las muestras debera determinarse con un screening de las extensiones teidas con Gram (como se ha descrito para las bacterias). Para el cultivo de hongos se deberan inyectar en el medio de cultivo muestras adecuadas de esputo no inducido, esputo inducido y aspiraciones traqueales. Por lo general, para el cultivo de hongos se recomiendan los siguientes principios generales: debera usarse un medio con y sin enriquecimiento de sangre con y sin cicloheximina; todos los medios deberan contener agentes antimicrobianos. Sin embargo, cuando se haga la seleccin, el director del laboratorio tambin debera considerar el coste y los tipos de hongos que se suelen encontrar en la poblacin. Las muestras de esputo inducido son tiles para el diagnstico de neumona por Pneumocystis carnii en personas con el sndrome de inmunodeficencia adquirida (sida) (Wolfson, 1990). Primero se analiza una extensin teida con Gram para ver si es representativa de secreciones del tracto respiratorio bajo. Las muestras aceptadas se tratan son un agente mucoltico (como W-acetil-L-cistena), y las extensiones se preparan y se tien para detectar P. carnii (vase Cap. 54). Muestras por cepillo telescopado. El cepillado es til para el diagnstico de neumona bacteriana en pacientes ventilados que no han recibido tratamiento antibitico, y probablemente es til para el cultivo de aerobios y anaerobios (Baselski. 1994). La muestra se recoge con un cepillo pequeo que obtiene de 0.01 ml a 0,001 mi de secreciones, colocado en un catter, dentro de una cnula doble. La cnula de luera tiene en la punta un tapn desplazable de polielileno glicol. Para obtener la muestra, se inserta la cnula, mediante broncoscopia, en el sitio deseado, la cnula de dentro se saca quitando el tapn (hidrosoluble) y se extiende el cepillado ms all de la cnula interna. Una vez que se ha tomado la muestra, el cepillo se mete en la cnula interna y ambos, el cepillo y la cnula interna,

TRACTO URINARIO
Los mtodos aceptados para recoger la orina incluyen recogida de la mitad de la miccin (preferiblemente la primera de la maana), sondaje y aspiracin suprapbica. Por lo general, las muestras de orina de 24 horas deberan desecharse, excepto cuando se pida especficamente detectar Schistosoma haematobium. Lo ms comn es que se recoja la miccin de la mitad de un modo limpio. Para mujeres, primero se limpia la zona periuretral y penneanal con unas gasas estriles, con jabn de delante hacia atrs, y se enjuaga con una gasa estril mojada y se seca con una gasa estril. Para hombres, limpiar el rea genital no va a mejorar la deteccin de bactenuria de modo significativo, por lo que no es necesario (Lipsky, 1984). Durante la miccin, las mujeres deben separar los labios, los hombres no circundados deben retirarse el prepucio. Los primeros mililitros de orina se desechan para limpiar las bacterias que normalmente colonizan la uretra, y la miccin central se recoge en un contenedor estril de boca ancha y se cierra fuertemente la tapa.

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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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aureus) (Pezzlo. 1988; Barn. 1990). Por consiguiente, para una correcta interpretacin del cultivo, se necesita comunicacin entre el mdico y el personal del laboratorio. Los cultivos de orina para bacterias se hacen inyectando el medio adecuado (vase Cap. 50) en una determinada cantidad de orina con un asa calibrado de plstico o alambre, diseado para repartir un volumen conocido. Un asa de 0,001 mi se utiliza para inyectar todas las muestras de orina, excepto las que se recogen en mujeres con sospecha de sndrome uretral agudo y aspiraciones suprapbicas. Las dos ltimas se inyectan con un asa de 0,01 mi. El asa adecuado se mete verticalmente en la muestra de orina bien mezclada, y el asa repleto de orina se saca y se extiende sobre una superficie de placa agar como se indica en la Figura 57-3. Sin remover el asa, se mete verticalmente otra vez en la muestra de orina y la muestra que sacamos se inyecta en una segunda placa. Para determinar el nmero de microrganismos por mililitro de la muestra original, se cuenta el nmero de colonias en la placa agar y se multiplica por 1.000 (s se ha usado un asa de 0,001) o por 100 (si se ha usado un asa de 0.01 mi). El crecimiento de 3 o ms especies en una recogida limpia de la mitad de la miccin por lo general indica contaminacin. En ese caso, los organismos se enumeran y se caracterizan mnimamente (p. ej.. Staphylococcus coagulasa negativa o bacilo gramnegativos lactosa positiva) y no se hace el test de sensibilidad. Uno o dos aislados presentes en un nmero mayor de 10.000 en una mitad de miccin limpia deberan identificarse y deberia hacerse un test de sensibilidad antibitica. Los organismos en un nmero menor de 10.000 se dejan, con las siguientes excepciones: un cultivo puro de Staphylococcus aureus es considerado significativo independientemente del nmero y debera hacerse un test de sensibilidad. Un crecimiento de 10 a 10 CFU/ml podra ser significativo en infecciones que tienen que ver con la sonda. En hombres con sintomatologa, un crecimiento de 10 CFU/ml o ms se considera infeccin, y se debera identificar el organismo, pero el test de sensibilidad se har slo si lo piden especficamente. Para todos los organismos aislados de una puncin suprapbica. se identifican y se hace el test de sensibilidad. Un crecimiento nico en un nmero de 100 o mayor de una mujer con sospecha de sndrome uretral agudo debera identificarse si hay piuria, y el test de sensibilidad debe hacerse slo si se pide especficamente.
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Figura 57-2. Preparacin cite-lgica de fluido del lavado broncoalveolar que nos muestra una clula alargada con inclusiones intranucleares e intracitoplasmticas. que se corresponden con el citomegalovirus. (Tincin de Papanicolau, 250x.) (Cortesa de Vicki J. Schnadig, M.D., Departamento de Patologa, Universidad de Texas, Rama Mdica, Galveston, TX.)

El sondaje se asocia con el riesgo de inducir una infeccin nosocomial y, por tanto, deberia estar restringido a personas que no pueden recoger la mitad de la miccin; por ejemplo, personas con una alteracin sensitiva o aquellos que no pueden miccionar por razones urolgicas o neurolgicas. Utilizando una tcnica estrictamente asptica, se introduce la sonda en la uretra, se desechan los primeros mililitros para limpiar los organismos que pueden haberse introducido por la punta de la sonda mientras se colocaba y la mitad de la miccin se recoge para cultivo. La orina puede recogerse de una sonda aspirando con una jeringa y una aguja del 28 a travs del conector de goma, teniendo cuidado de limpiar el punto de puncin. La orina no debe recogerse de la bolsa de orina, y las puntas de la sonda Foley no deberan ser aceptadas para cultivo, porque casi siempre estn contaminadas con organismos de la uretra. La aspiracin suprapbica se usa principalmente en neonatos. El procedimiento requiere que la vejiga est llena; la piel se desinfecta, se pincha la vejiga por encima de la snfisis del pubis, y con una aguja del 22 y una jeringa aspiramos aproximadamente 10 mi de orina. Todas las muestras deberan llevarse al laboratorio nada ms recogerse, y se deberan analizar dentro de las dos primeras horas despus de haber sido recogidas. Si el retraso es inevitable, deben meterse en el frigorfico un mnimo de 24 horas. Hay equipos que se comercializan que contienen conservantes para mantener las bacterias durante 24 horas a temperatura ambiente, pero no ofrecen ninguna ventaja con respecto a meterla en el frigorfico. El tracto urinario por encima de la uretra en personas sanas es estril, pero la uretra est normalmente colonizada con muchas bacterias, por lo que las muestras recogidas por mtodos no invasivos (media miccin, recogida limpia) son contaminadas durante su trnsito. Las bacterias comensales se diferencian de los patgenos por varios cultivos de orina, proceso nicialmente promovido por Kass (Kass, 1956). Al principio, un crecimiento de 10 o ms CFU de bacterias por mililitro de orina era altamente indicativo de infeccin, pero este criterio se ha modificado para las diferentes situaciones. Por ejemplo, en mujeres jvenes sexualmente activas con sintomatologa uretral aguda (disuria, frecuencia y urgencia), 10 CFU/ml se considera significativo en presencia de piuria concomitante (Stamm, 1982). Infecciones de orina reales asociadas con menos de 10 CFU/ml pueden producirse en bebs y nios, en hombres y en personas que estn sondadas, que se han tratado recientemente con antibiticos, con ingesta hdrica abundante (para diluir la orina), tienen sntomas y piuria concomitante. Obstruccin urinaria o pielonelritis adquirida por una diseminacin hematgena (especialmente infecciones debidas a levaduras y Stalilococcus
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Ms de la mitad de las muestras de orina que se llevan al laboratorio para cultivo no tienen crecimiento, o tienen niveles bacterianos por debajo de lo que se considera clnicamente significativo; por tanto, los test de screening que identifican de un modo rpido las muestras como "negativas" para el cultivo se han desarrollado en un intento de proporcionar resultados rpidos, eliminar las muestras negativas y permitir tener ms tiempo para las muestras positivas, mejorando la eficiencia y el coste. La comprobacin de la orina y los cultivos se corresponden cuando la referencia es 10 CFU/ml o ms, pero son menos adecuadas para un nmero menor de colonias (Pezzlo, 1988). Otras razones para considerar adecuado el screening de la bactenuria son la capacidad de detectar piuria y el coste. Este ltimo es especialmente importante cuando consideramos la automatizacin.
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Comprobar las muestras de orina con una tincin Gram es rpido y econmico. Encontrar uno o ms organismos por campo con aceite de inmersin en una extensin preparada de una muestra centrifugada se corresponde con bacteriuria con 10' o ms CFU/ml. La sensibilidad del tinte Gram. sin embargo, disminuye cuando se trata de un nmero menor de colonias, y continuar con el anlisis es una prdida de tiempo. Comercialmente hay disponibles tiras de reactivos que combinan la nitrato reductasa (una enzima presente en la mayora de los bacilos gramnegativos que causa infecciones del tracto urinario) y la esterasa leucocitaria (una enzima producida por neutrfilos), son mtodos baratos y fciles de manejar, pero su sensibilidad es demasiado baja para comprobar las infecciones del tracto urinario (Pezzlo. 1988).
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Hay sistemas de screening para la orina disponibles comercialmente. Un sistema de filtracin de colores proporciona resultados rpidos y detecta ms del 90% de las muestras positivas (incluidas las que contienen neutrfilos y slo ^0 CFU/ml), pero pueden dar falsos negativos para enterococos y Pseudomonas aeruginosa (Pezzlo. 1988; Shaw, 1997). La orina se pasa a travs de un filtro de papel que retiene las clulas y despus se pasa el tin-

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA

TRACTO GENITAL
Secreciones vaginales. Las secreciones vaginales son tiles para determinar el agente etiolgico de la vulvovaginitis y la vaginosis bacteriana (as llamada porque no es invasiva). En mujeres pospuberales, los patgenos ms comunes son Gardnerella vaginalis (asociada con anaerobios como especies de Mobiluncus), especies de Candida y Trichomonas vaginalis. Una preparacin en fresco es el test ms adecuado para el diagnstico, y puede ser realizado por el mdico all presente: los cullivos no son necesarios para el diagnstico, Para preparar la muestra fresca, se coloca la torunda de la muestra en un tubo que contiene cerca de 1 mi de salino y se agita con cuidado: una gota de esa suspensin se coloca en un porta de cristal. De modo alternativo, colocamos una gota de salino en el porta y la mezclamos con una muestra de material vaginal. Ponemos un cubreportas y calentamos la muestra pasndolo a travs de una llama o mantenindolo sobre una bombilla incandescente. Se examina el porta a bajo y gran aumento, buscando "clulas clave" (clulas epiteliales cubiertas con pequeas bacterias cocobacilos) (Fig. 57-4) compatibles con el diagnstico de vaginosis mespecfica, pseudohifas, sugestivo de candidiasis vaginal, y Trichomonas mviles. Adems de la muestra en fresco, tambin son tiles para el diagnstico determinar el pH vaginal y el test del olfato, que se realiza aadiendo KOH al 10% a una gota de muestra vaginal situada en el porta o en el espculo. El pH vaginal es de cerca de 4,5 en mujeres con candidiasis vulvovaginal, pero est por encima de 4,5 en aquellas con vaginosis o tricomoniasis. Un lest del olfato positivo (es decir, hay un olor acre como a pescado) se asocia por lo general con vaginosis bacteriana, pero en ocasiones con tricomoniasis. Muestras endocervicales y uretrales. Las muestras endocervicales se recogen para determinar el agente etiolgico de las cervicitis y para identificar las personas asintomticas con un organismo que causa enfermedad de transmisin sexual. Las muestras endocervicales se obtienen con la ayuda de un espculo humedecido slo en agua caliente, porque los lubricantes pueden contener agentes antibacterianos. Si se indica una muestra Papanicolau, e s a muestra debera recogerse primero. Las muestras para estudios microbiolgicos por lo general se recogen con una torunda, aunque en mujeres no embarazadas el uso de un cepillo endocervical podra aumentar la sensibilidad de los test de cultivo y no cultivo para Chlamydia trachomatis (Linder, 1987). Como se ha dicho anteriormente, en este capitulo se recomienda usar una torunda con la punta de polister y un recipiente de plstico. Si se utiliza un equipo para test que no sea para cultivo para detectar organismos, la muestra tiene que recogerse con la torunda que viene en el equipo o con lo que el fabricante diga. La muestra para detectar Neisseria gonorrhoeae hay que recogerla antes que la de Chlamydia trachomatis o la del virus del herpes simple (VHS). Antes de recoger las muestras para estos dos ltimos organismos, hay que sacar todas las secreciones de la cavidad cervical. La torunda o el cepillo se insertan 1 cm o 2 cm en el canal cervical (pasada la unin escamocolumnar), se frota firmemente contra la pared durante 10-30 segundos, con cuidado de no tocar la pared de la vagina, y se coloca en un medio de transporte adecuado o un sistema de tubo, que se utiliza para preparar un porta de cristal para la tincin directa con anticuerpos fluorescentes (para Chlamydia trachomatis) o para inyectar inmediatamente un medio agar para recuperar Neisseria gonorrhoeae. El manejo de las muestras vara en funcin del organismo que busquemos. Para aislar N. gonorrhoeae, est indicada la inyeccin directa de un medio agar, como Thayer-Martin modificado, dentro de un recipiente al que se haya aadido una pastilla para generar CO. . De otro modo, la muestra de la torunda puede colocarse en un sistema de transporte de lubo y se lleva al laboratorio lo antes posible. Si el retraso es inevitable, hay que dejar la muestra a temperatura ambiente, nunca en el frigorfico. Si utilizamos una muestra de ADN o amplificacin de cidos nucleicos para detectar Neisseria gonorrhoeae, tendremos que utilizar un equipo y seguir las instrucciones del fabricante para el almacenaje y transporte.

Figura 57-3. Tcnica para inocular orina en placas agar. (De Woods GL Gutierrez Y: Diagnostic Pathology of Infectious Diseases. Filadelfia, L e a 8 Febiger, 1993, c o n permise.)

te a travs del filtro. La intensidad del color del resultado, que se lee manualmente o con un fotmetro, se corresponde con el nmero de partculas adheridas al filtro. Un sistema bioluminiscente se basa en la reaccin de ATP (presente en todas las clulas vivas) con lucferina y luciferasa, que producen luz que se mide con un luminmetro. Se puede estimar el nmero de CFU en una muestra de orina por el ATP liberado selectivamente por las bacterias solas. Esta tcnica se compara favorablemente con el cultivo a nivel de 10 CFU/ml o ms. pero como necesita un tiempo de incubacin, los resultados tardan unas pocas horas. Un sistema de fotometra automatizada detecta la bactenuria midiendo los cambios de transmisin de la luz a travs de un medio de caldo inyectado con la muestra de orina. El crecimiento bacteriano hace que el medio se ponga turbio en 2 3 horas generalmente, pero los resultados negativos no pueden darse hasta pasadas 5-13 horas. Este sistema se compara favorablemente con un cultivo a nivel de 10 CFU o ms y tiene la capacidad de identificar el organismo y hacer el test de sensibilidad anlimicrobiana.
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Algunas bacterias no se detectan en un cultivo ordinario de orina, y cuando se sospecha de estos patgenos, se debe pedir un test especfico. Por ejemplo, una muestra de orina es vlida para detectar Neisseria gonorrboeae y Chlamydia trachomatis pata la amplificacin de cidos nucleicos. Las instrucciones del fabricante deben seguirse tanto para la recogida como para el anlisis. Leplospira interrogans puede detectarse en la orina despus de la primera semana de la enfermedad y hasta varios meses despus. La orina debera ser analizada lo antes posible, porque la acidez podra daar los organismos. Inyectamos una o dos gotas de orina sin diluir y de orina diluida 1:10 en 5 mi de medio Fletcher o de medio EllinghausenMcCullough-Johnson-Harris. que contienen 5-fluoracilo. El urocultivo para micobacterias se ve en el Captulo 53. Las levaduras deberan recuperarse de la orina en el medio que utilizamos para un cultivo bacteriano habitual, pero si se pide especficamente un cultivo para hongos, debe colocarse el sedimento de una muestra de orina centrifugada en un medio que contenga agentes antimicrobanos. como un inhibidor de mohos o el agar Shabi. Cuando las muestras de orina se cultivan para virus, deberan aadirse antibiticos (p. ej penicilina, gentamicina y anfotericina B) para minimizar la contaminacin bacteriana de los cultivos celulares. Las lineas celulares se seleccionan para la inoculacin basada en los virus que encontramos con ms frecuencia aislados: CMV, adenovirus y virus del herpes simple.

Para detectar Chlamydia trachomatis podran usarse mtodos de cultivo u otros (vase Cap. 49). Para el cultivo de clulas de Chlamydia, utilizamos

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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EI DIAGNSTICO DE IAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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normalmente como medio de transporte 2-sucrosa fosfato o sucrosa-glutamato-fosfato, y aadimos antibiticos (como gentamicina, vancomicina y nistatina o anfotericina B) para impedir el sobrecrecimiento de hongos y bacterias Para mantener con vida las clamidias. la muestra debe transportarse inmediatamente al laboratorio, o se deja almacenada en el frigorfico si el transporte no puede ser inmediato. En el laboratorio la muestra debe analizarse lo antes posible. Si no puede evitarse el retraso, las muestras deben dejarse en el frigorfico si pueden ser analizadas dentro de las siguientes 48 horas. Si se sabe de antemano que el retraso va a ser mayor, las muestras deben dejarse a - 7 0 C o ms fro, aunque el proceso de congelacin puede disminuir el porcentaje de aislamiento de C. Irachomatis en un 2 0 % (Mahoney, 1985). Para detectar los cuerpos elementales de Chtamydia por una tincin de fluorescencia directa de anticuerpos, se debe utilizar el equipo de recogido y seguir las instrucciones del fabricante. La torunda se da una vuelta en el porta que se va a observar al microscopio, se deja secar y se aplica un producto para fijar. Para el inmunoensayo enzimtico, las pruebas de cido desoxirribonucleico (ADN) y la amplificacin de cidos nucleicos, el equipo de recogida y transporte que deja el fabricante es el que hay que usar, salvo que el fabricante diga que vale olro sistema de transporte especifico. Tambin deben seguirse las instrucciones del fabricante para las condiciones de transporte, los requisitos de almacenamiento y el tiempo para analizarlo. Para detectar adecuadamente el VHS es necesario hacer un cultivo celular. El exudado se coloca en un medio de transporte viral y se lleva lo antes posible al laboratorio. Si el transporte inmediato no es posible, la muestra debe almacenarse en el frigorfico. Para pacientes que tengan una lesin visible en el crvix, los cambios virales citopticos pueden verse en las extensiones preparadas de raspados de la lesin base Las extensiones se lijan inmediatamente y se lien con el tinte Wright o Giemsa (preparacin Tzanck) o con anticuerpos monoclonales. Para diagnosticar las mismas enfermedades de transmisin sexual en varones, se deberia coger un exudado uretral o una muestra de la primera miccin, dependiendo del mtodo que se use para detectarlo. Lo ideal es que los exudados uretrales se recojan por lo menos dos horas despus de que el paciente haya miccionado. Las muestras para Neisseria gonorrhoeae son las primeras que se obtienen. Las condiciones en funcin del tipo de torunda y transporte son las mismas que las descritas para muestras endocervicales, aunque se usan torundas genitales que son ms pequeas. La torunda se inserta en la uretra 2 cm-4 cm, se rota en un sentido durante 5 segundos, se retira y se coloca en un medio de transporte adecuado, o se usa

para preparar extensiones para una tincin fluorescente directa de anticuerpos para detectar Chlamydia trachomatis o con tincin Gram para diagnosticar gonorrea (la deteccin de diplococos gramnegativos mtracelulares en una extensin uretral de hombres sintomticos nos proporciona un diagnstico de presuncin). Vesculas. Las muestras de lesiones vesiculares en los genitales se recogen para confirmar la infeccin por VHS. El lquido de la vescula se aspira con una aguja de pequeo calibre en una jeringa de tuberculina. Si slo hay presente una vescula pequea, se corta y la base se raspa con una torunda Dracon o un depresor para asegurarse de que recogemos las clulas. El liquido de la vescula o el exudado debe llevarse en un medio de transporte adecuado y analizado para cultivo convencional El VHS tambin se puede detectar directamente en la muestra por tincin directa de las extensiones, pero es menos sensible que los cultivos, y si es negativo, deberia hacerse un cultivo. Para hacer una extensin, las clulas recogidas con el depresor o torunda Dracon se extienden en el porta de cristal y se fija el material con acetona. Hay que teir la muestra con el tinte Papanicolau, Wright o Giemsa para detectar los cambios citopticos tpicos (Fig. 57-5). tintes que no distinguirn entre VHS o el virus varicela zster. o con anticuerpos monoclonales. lceras. El material de las lceras genitales se recoge para identilicar el patgeno responsable; VHS. Haemophilus ducrey. Treponema pallidum. Chlamydia trachomatis (serogrupos L,, L,, L ) y Calymmatobacterium granulomalis deberan ser considerados en el diagnstico diferencial. El protocolo de recogida, transporte y anlisis de las lesiones ulcerativas para detectar el VHS es el mismo que para las vesculas. En general, la sensibilidad de los test directos descritos antes y la recuperacin de virus son ms bajas en lesiones ulcerativas.
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Si hay sospecha de infeccin por Haemophilus ducrey, el material de la base de la lcera se recoge con dos torundas Dracon o algodn, se lleva en un medio de Stuart modificado al laboratorio y se deja en una habitacin a temperatura ambiente hasta que se analice. Una muestra se utiliza para preparar una extensin para teir con Gram. Si observamos muchos bacilos gramnegativos pleomrficos y cocobacilos organizados en grupos o cadenas, es sugerente de H. ducrey. Sin embargo, el cultivo es ms sensible y es necesario para confirmar. El segundo exudado se inyecta en un medio especial. Las espiroquetas de Treponema pallidum pueden detectarse en los genitales u otras lesiones, pero la sfilis por lo general se diagnostica serolgicamente. Deberan llevarse guantes cuando se manejen muestras obtenidas de estas lesiones. Para recoger las muestras, se limpia la superficie de la lesin (si hay varias lesiones, se debe recoger la ms reciente) con suero salino y se deja secar, y se quitan las costras si las hubiera. Raspamos la lesin superficialmente hasta que sangre un poco y aplicamos una presin pequea en la base. El exudado se recoge de la superlicie tocando el liquido con un porta de cristal o usando una pipeta capilar y pasando el liquido a un porta de cristal. Se pone un cubreportas y la muestra se examina inmediatamente al microscopio de campo oscuro. Otro modo es aspirar el material con una aguja de un calibre de 26 de la base, y despus se mete una gota de salino en la aguja. El material se extiende en un porta de cristal, se cubre con un cubreportas y se examina inmediatamente al microscopio de campo oscuro. Las espiroquetas de T pallidum tienen de 10 pm a 13 pm de longitud y 0,15 pm de ancho, tienen una cola ancha y regular y son puntiagudas al final. Los serogrupos L,, L^, L, de Chlamydia trachomatis pueden detectarse por cultivo de clulas en una biopsia de la lesin ulcerada o del material celular recogido de quitar primero cualquier exudado de la lesin y despus girando la torunda (en un palo de plstico) contra la base. El transporte y anlisis de las muestras son iguales que para los exudados endocervicales. Para una deteccin ideal de Calymmatobacterium granulomatis. se biopsia un tejido de una zona de granulacin activa e inmediatamente se transporta al laboratorio en un recipiente estril y seco, o en uno que contenga una pequea cantidad de salino sin conservantes. Las extensiones se preparan de un trozo de tejido aplastado y se tien con Giemsa o tinte de Dieterle. El diagnstico se basa en encontrar C. granulomatis caractersticos encapsulados dentro de los macrfagos.

Figura 57-4. Clulas clave" en una extensin de una muestra vaginal. (Tincin Papanicolau. 400x.) (Por cortesia de Vicki J. Schnadig. M.D., Departamento de Patologa, Universidad de Texas. R a m a Mdica. Galveston. TX.)

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA que llevar la muestra a un laboratorio de referencia, se recomienda aadir un conservante, como fosfato tamponador 0.03M. mezclado con un volumen igual de glicerol. El anlisis de las muestras de heces, o los exudados rectales para bacterias, se basa en el organismo o grupo de organismos que esperamos que estn presentes. Las muestras que se reciben para un cultivo bacteriano ordinario deben analizarse de modo que se pueda encontrar Shigella, Salmonella y Campylobacter jejuni/coli. En las instituciones peditricas, tambin sera razonable de modo sistemtico buscar Aeromonas. Las muestras se colocan directamente en un medio adecuado (vase Cap. 50); de manera alternativa, para detectar C. ejuni/coli. la muestra se puede filtrar utilizando un filtro de acetato de celulosa de 0,65 pm. y dejar el filtro en un agar sangre de oveja brcela o agar chocolate. Las especies de Aeromonas crecen en el medio utilizado habitualmente para el cultivo de bacterias de las heces, o de los exudados rectales, pero utilizar un medio selectivo (cefsulodina-irgasn-novobiocina [CIN] que contenga 4 mg/l de cefsulodina mejor que el tpico agar sangre de oveja con 10 mg/l de ampicilina) incubado a 25 C-30"C puede aumentar la eficiencia del screening.
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Figura 57-5. Clula giganle mullinucleada con inclusiones inlranucleares por virus herpes simple en una extensin de clulas endocervicales. (Tincin de Papanicolau, 400x.) (Cortesa de Vcki J. Schnadig, M.D. Departamento de Patologa. Universidad de Texas, R a m a Mdica. Galveston. TX.)

HECES
Las heces y, en algunos casos, los exudados rectales son tiles para determinar el agente etiolgico de la diarrea infecciosa o intoxicacin alimentaria, confirmando el diagnstico de botulismo, diagnosticando infecciones causadas por adenovirus, enterovirus, algunos patgenos de transmisin sexual, protozoos intestinales y helmintos y, en algunos casos, helmintos de los tractos respiratorio y biliar. La recogida, el transporte y el anlisis de estas muestras son diferentes para virus, bacterias y parsitos, y se explican ms adelante para cada grupo. Se prefieren las heces para detectar adenovirus, enterovirus y los virus responsables de la gastroenteritis. Las muestras se recogen en un recipiente limpio de tapa ancha. Si no puede obtenerse una muestra de heces, se inserta una torunda a travs del esfnter anal, se gira, se saca y se coloca en un medio de transporte viral que contenga agentes microbianos. Cualquiera de las muestras debe llevarse pronto al laboratorio, si no se pudiera, tiene que meterse un rato en el frigorfico y debe llevarse en hielo hmedo. Si hay que enviar la muestra a un laboratorio de referencia, debe almacenarse a -70C y tiene que transportarse en hielo seco. Se recomienda el cultivo celular para detectar adenovirus y enterovirus, aunque el test de ELISA es vlido para detectar adenovirus. Los rotavirus son los responsables de la mayora de las gastroenteritis virales y los nicos virus que se asocian con gastroenteritis, y que se detectan en muchos laboratorios virales. Lo ms corriente es que los rotavirus se detecten por ELISA; los equipos de aglutinacin de ltex tambin son vlidos, pero parece que son menos sensibles (Christensen, 1989). Las muestras se analizan segn las indicaciones del fabricante. El examen directo de las muestras de heces en el microscopio electrnico es el mtodo de referencia para detectar los rotavirus y es el que ms se usa para detectar calicivirus, astrovirus. el virus Norwalk y los virus similares al de Norwalk. Las heces tambin se prefieren para detectar las bacterias responsables de la diarrea infecciosa, aunque un exudado rectal es una alternativa vlida. Las muestras de heces tienen que recogerse en un contenedor limpio y de tapa ancha, y la muestra no tiene que contaminarse con orina, bario o papel higinico, Los exudados rectales, que se obtienen como se ha descrito antes para los virus, se colocan en un sistema de transporte de tubo que contenga medio Stuart modificado. Ambos tipos de muestras deben transportarse rpido al laboratorio y ser analizadas lo antes posible, porque la bajada del pH que se produce cuando las heces se enfran puede inhibir el crecimiento de algunos patgenos, especialmente Shigella. Si el retraso es inevitable, o hay

La prevalencia de la gastroenteritis causada por la shiga productora de toxinas (enterohemorrgica) Escherichia Coli (STEC), Yersinia enterocolilica, Vibrium cholerae u otras especies de Vibrio o Plesiomonas shigelloides es baja en la mayor parte de EE.UU.; por tanto, las peticiones especficas para detectarlo son ms eficientes. Como mnimo, las muestras de heces sanguinolentas deben analizarse para detectar la STEC, Para detectar la STEC, la muestra de heces podra inyectarse en agar sorbitol-MacConkey (que contiene un 1% o-sorbitol en lugar de lactosa), que es un medio que diferencia las STEC de manera aislada, las que no fermentan en sorbitol, de casi todas las coli. que son sorbitol-positivas. Un mtodo ms sensible que el cultivo para delectar STEC es la deteccin de toxina en las heces o en las heces filtradas (Kehl, 1997). Cuando se pide aislar Yersinia enterocolilica. el agar CIN se inyecta y se incuba a una temperatura ambiente. El organismo tambin puede recuperarse inyectando un medio tpico para el cultivo bacteriano ordinario (vase Cap. 50). La placa MacConkey se incuba a 35'C las primeras 24 horas y despus a temperatura ambiente durante otras 24 horas; las colonias de Y. enterocolilica son moradas y del tamao de una cabeza de alfiler. Las especies de Vibrio con frecuencia crecen en el medio que se utiliza habitualmente. pero para recuperarlas mejor se inyecta agar citrato tiosulfato sales biliares sucrosa (TCBS) y agua alcalina (para enriquecer). Plesiomonas shigelloides tambin crecen en los medios usados para cultivos ordinarios, pero como ms del 30% de P. shigelloides se aislan en lactosa fermentada, las colonias no se diferencian lo suficiente para reconocerlas en este medio, y hacer un screening de todas las colonias no es rentable. Por esta razn, el cultivo de heces o exudados rectales para P. shigelloides debe solicitarse de manera especfica. El uso de un medio selectivo-diferencial agar inositol sales biliares verdes brillantes es recomendable, pero no es imprescindible. Los exudados rectales que vayan dirigidos a detectar Chlamydia trachomatis se colocan en un medio de transporte y se llevan rpido al laboratorio, o se dejan un rato en el frigorfico. Los exudados recogidos para diagnosticar gonorrea se tratan como se ha dicho antes para las muestras endocervicales. Las muestras de heces o el contenido gstrico recogido de personas con un perodo de incubacin corto de una intoxicacin alimentaria deberan analizarse para Staphylococcus aureus y Bacillus cereus. El anlisis incluye la preparacin y examen de las extensiones teidas con Gram y cultivadas. Como los dos organismos pueden estar presentes normalmente en la comida, hay que hacer varios cultivos. Se hacen una serie de diluciones de la muestra (10 , 10' , 10' , 10* y 10' ) y se preparan en diluyente de gelatina tamponada, y 0,1 mi de la muestra sin diluir y cada una de las muestras diluidas se colocan en colistina cido naldixico o agar sangre alcohol feniletilico (selectivo para organismos grampositivos). Adems, para mostrar la produccin de endoesporas de B. cereus, se mezcla 1 mi de la muestra original con 1 mi de etanol puro, y la mezcla se deja una hora a temperatura ambiente. Las diluciones de la muestra se preparan como se ha dicho antes, y 0,1 mi de cada una, de la muestra diluida y de la de sin
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diluir, se colocan en agar sangre de oveja. Todas las placas se incuban a 35"C-37"C durante 18-24 horas y se cuentan las colonias. La presencia de 10'' CFU ms de S. aureus o B. cereus por gramo de muestra es significativa, especialmente si se encuentra en la mayoria de los individuos afectados. El diagnstico clnico de botulismo alimentario y botulismo infantil tiene que confirmarse detectando Closridium botulinum. la toxina botulinica o ambos en las heces. Lo ideal sera recoger 25 ml-50 mi de heces. 15 ml-20 mi de suero y una muestra del alimento sospechoso. La mayoria de los laboratorios no estn equipados para analizar las muestras de personas con sospecha de botulismo. En EE.UU., cuando se sospecha un caso de botulismo se debe notificar a los investigadores del CDC. asegurar el diagnstico, el tratamiento e investigar una epidemia potencial. Las enfermedades asociadas con Closridium dillicile. tales como colitis seudomembranosa y diarrea por antibiticos, estn producidas por las toxinas que produce el organismo y se diagnostican detectando la toxina A y B o ambas en heces. Ei mtodo de referencia para detectar la citotox m a es el ensayo de cultivo celular. Deben recogerse 25 g (25 ml-50 mi) de heces lquidas en un recipiente limpio de tapa ancha, y tiene que llevarse inmediatamente al laboratorio. La muestra debera analizarse dentro de las dos horas de la recogida o dejarla almacenada en el frigorfico. Para extraer la toxina, aclaramos la muestra de heces por centrifugacin a 2.000 x g durante 20 minutos o a 10.000 x g durante 10 minutos, y se filtra a travs de una membrana de 0,45 pm. Se preparan varias diluciones y se inyectan a una monocapa de clulas, que se incuban durante 24-48 horas. Por otra parte, la toxina A o ambas toxinas, la A y la B, deben detectarse en las muestras de heces por ELISA. Esta tcnica parece ser tan sensible como el cultivo celular y nos proporciona resultados en pocas horas (Merz, 1993; Whittier, 1993). La sensibilidad de los diferentes test de ELISA comercializados sin embargo vara (Lyerty, 1998; Fedorko, 1999). Un test de aglutinacin de ltex es vlido, pero no da resultados fiables (Lyerly. 1988). Para estudios epidemiolgicos, C. dillicile tiene que aislarse en las heces o exudados rectales ponindolo en un sistema de transporte anaerbico. Como hay muchas bacterias en las heces, hay que utilizar procedimientos selectivos para C. dillicile. La muestra de heces se diluye en gelatina tamponada (se recomienda 1:200). y ambas muestras, la diluida y la no diluida, se inyectan en un medio selectivo para C. dillicile. como el agar cicloserina cefoxitina fructosa yema de huevo (CCFA), y se incuban anaerbicamente 48 horas. C. dillicile tambin puede aislarse de otras formas, por ejemplo, con el mtodo de seleccin del alcohol, como se describe para Bacillus cereus. excepto que las muestras se ponen en un medio selectivo como el CCFA y se incuban anaerbicamente. Closridium pedringens es una de las causas de una intoxicacin alimentaria de larga incubacin (7-15 horas despus de tomar la comida contaminada); tambin puede causar la diarrea asociada a antibiticos, que es tpica en pacientes ancianos hospitalizados, y enteritis necrotizante. Para diagnosticar una intoxicacin alimentaria causada por C. pedringens tienen que hacerse varios cultivos de heces y transportarse en un medio anaerbico El material fecal, tanto el que est tratado con etanol como el que no est tratado, se diluye como se ha dicho antes para detectar las bacterias asociadas a una intoxicacin alimentaria de periodo de incubacin corto. Las placas de agar de alcohol leniletlico se inyectan y se incuban anaerbicamente durante 48 horas. Un recuento de esporas de 10 o ms por gramo de heces puede ser significativo, sobre todo si se encuentran en las muestras de la mayoria de los individuos. La toxina tiene que detectarse en la muestra de heces original, pero este test por lo general se realiza en los laboratorios de referencia. Un criterio similar se utiliza para diagnosticar la diarrea producida por C. pedringens durante el tratamiento antibitico.
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Lo ideal para el diagnstico de parsitos en el laboratorio es el examen de las muestras de heces para protozoos, parsitos y huevos de helmintos o larvas. Los laboratorios que realicen esos test deberan tener las condiciones adecuadas para manejar las muestras fecales y un buen microscopio con una escala para medir los organismos encontrados. Para identificar los protozoos intestinales, tambin se requiere teir las extensiones fecales. La muestra (que por lo general la recoge el paciente) puede recogerse sin tenerla que fijar, y se llevar al laboratorio si se piden estudios bacterianos y de parsitos. La muestra de heces reciente debe colocarse en un contenedor limpio, seco y de tapa ancha. No debe recogerse de la taza del bao y no debe contaminarse con orina, aceites, componentes antdarreicos o contraste radiolgico. Una vez recogida, la muestra tiene que llevarse inmediatamente al laboratorio. Primero se hacen los estudios bacteriolgicos, despus la muestra se pasa al personal que hace los test parasitolgicos, preferiblemente dentro de los 30-60 minutos despus de recoger la muestra. Los retrasos en el anlisis dan como resultado la degeneracin de trotozoitos de Entamoeba histolytica, que es el nico parsito por el que se requiere que la muestra sea reciente. Como es posible adquirir una infeccin en el laboratorio, se ha cuestionado el uso de muestras frescas para el examen parasitolgico. Si la muestra fecal se ha recogido slo para detectar parsitos, puede fijarse a la vez que se recoge. La muestra se lleva al laboratorio cuando la persona pueda, y el anlisis se hace segn la rutina del laboratorio. Hay varios equipos disponibles comercialmente para la recogida y transporte de las muestras fecales; la mayora tienen dos viales, uno con fijador (formalina) para trofozoitos y quistes, y otro con un fijador (solucin de Schaudinn) ms alcohol pohvinilo (PVA) para preparar las extensiones para teir. La pregunta de cuntas muestras son necesarias para identificar a todos los individuos con protozoos intestinales y helmintos an no tiene respuesta. Para el diagnstico de amebas, se recomienda que se recojan como mnimo tres muestras en tres das diferentes y que se analicen (Proctor, 1991). Para disminuir el coste, los mdicos deben pedir el anlisis de u n a muestra slo, porque cerca del 90% de las infecciones se diagnostican en la primera muestra (Montessori. 1987). Si no se encuentra ningUn parsito en la primera muestra, se debe pedir una segunda o tercera. Si se reciben dos o ms muestras al mismo tiempo recogidas en das diferentes, deben evaluarse como una sola (Peters, 1988). Los exmenes de heces de pacientes que han estado ingresados ms de tres das no son tiles (Siegel, 1990). El anlisis de las muestras lecales para parsitos incluye preparar una solucin salina y de yodo (Lugol) y teir las muestras frescas que se han recogido recientes (p. ej., aquellas que pueden analizarse dentro de las pocas horas de su recogida). A esto le sigue la concentracin de quistes y huevos de helmintos y. al final, la preparacin de extensiones para teir con el tinte tncromo. Las preparaciones frescas, de realizarse, deberan analizarse y prepararse antes de hacer la concentracin y el tinte tricromo. Si el diagnstico est claro con el anlisis de la muestra fresca (p. ej el diagnstico de giardiasis cuando encontramos Giardia en la muestra fresca), no es necesario hacer las otras pruebas. Sin embargo, en muchos laboratorios no se analizan las muestras frescas, porque cuando las reciben ya no estn frescas. La extensin fecal estndar, que tiene cerca de 2 mg de heces, se hace de una muestra fecal reciente del siguiente modo: se coloca una gota de salmo en un porta de cristal limpio: con un depresor se coge un poco de las heces y se mezcla con el suero salino con movimientos circulares (hasta que haya bastante muestra disuelta), y la mezcla se tapa con un cubreportas cuadrado de 22 mm. Una muestra est bien preparada si la dejamos encima de un pequeo papel escrito y podemos leer a travs de la extensin lo que hay escrito. La extensin que teimos con yodo la preparamos de la misma manera. Las dos preparaciones frescas, la de la solucin salina y la de la solucin yodada, pueden hacerse en el mismo porta de cristal, a la vez. mezclando las heces primero con suero salino y despus con yodo. La extensin de solucin salina nos mostrar protozoos y quistes de protozoos, adems de los huevos de helmintos y larvas. En la extensin teida con yodo no encontraremos Irofozoitos, porque el yodo los destruye, salvo que la muestra se haya fijado primero. La principal ventaja de la

En relacin con el cultivo bacteriano, las muestras de heces, por lo general, se destinan para aislar Mycobaclerium avium complex (principalmente de pacientes con sida), pero tambin se pueden aislar Mycobaclerium tuberculosis y otras especies de Mycobactehum. Analizar la muestra (de 1 g a 2 g de heces formadas o 5 mi de heces liquidas) incluye la descontaminacin y concentracin, preparacin de extensiones y la inoculacin de medio como se coment en el Captulo 53.

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA ser primarias (p. ej., las causadas por virus. Bacillus anthracis. Corynebacterium diphtheriae, Francisella lularensis, Pseudomonas aeruginosa, micobacterias u hongos) o lceras por decbito, que pueden ser colonizadas o infectadas con bacterias aerbicas y anaerbicas. La recogida, el anlisis y el transporte de los exudados de lceras cutneas para detectar virus son idnticos a los descritos anteriormente para vejigas y pstulas. El manejo de las muestras de lceras cutneas es diferente para hongos y bacterias, y se explica de modo separado para cada uno de los organismos que causa lesiones primarias y para las bacterias asociadas con lceras crnicas. Bacillus anthracis causa ntrax, una enfermedad rara en EE.UU.: se limita a personas que trabajan con lana importada bruta y otros productos animales contaminados con esporas de B. anthracis. El ntrax cutneo comienza con una ppula y un dolor, que se convierte en vesicular, despus hemorragia, necrtica, y se cubre con una escara. Para un diagnstico adecuado, se recogen dos exudados: uno para cultivos y el otro para preparar extensiones para teir con Gram y anticuerpos fluorescentes (esto ltimo debe hacerse en un laboratorio de referencia). Debido a la naturaleza peligrosa de B. anthracis. debe considerarse si se mandan las muestras de una persona sospechosa al laboratorio. Si las muestras se analizan en el laboratorio, tienen que manejarse en una cabina de seguridad. El exudado que se va a cultivar se inyecta en un agar sangre de oveja y se deja incubndose a temperatura ambiente. Corynebacterum diphtheriae es el causante de la difteria cutnea, que es una lesin ulcerativa que se cubre con una capa de tejido necrlico que semeja a una membrana. Para hacer un diagnstico real, se prepara una extensin con material del borde de la membrana, se tie con azul de metileno y se recogen dos exudados de la membrana. Una muestra se utiliza para cultivo ordinario y la otra para inyectar en un medio de cultivo adecuado para C. diphtheriae (expuesto anteriormente en muestras de la garganta). El ectima gangrenoso es una lesin cutnea ulcerativa que casi siempre se produce cuando hay acteriemia por Pseudomonas aeruginosa, pero rara vez se desarrolla cuando existe bacteriemia por otros bacilos gramnegativos. Lo ideal es recoger dos muestras de la base de la lcera: una se utiliza para preparar una extensin con tincin Gram y la otra para inyectar en medio de cultivo. Para hacer el diagnstico de la forma lcero-glandular de tularemia es necesario recoger dos exudados de material de la base de la lcera. Uno para cultivo ordinario y el otro para detectar Francisella lularensis, o para enviarlo a un laboratorio de referencia. Las micobacterias que podemos aislar son: Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium avium complex. Mycobacterium kansasii. Mycobacterium lortuitum-cheionae. Mycobacterium marinum, Mycobacterium haemophilum y Mycobacterium ulceraos. El exudado recogido con aguja y jeringa es vlido para recuperar las micobacterias. Para transportar el material, se mete dentro de un tubo estril, que se cierre bien, y se lleva pronto al laboratorio. No es recomendable recoger el exudado con una torunda de algodn, porque las micobacterias se quedan atrapadas en las fibras y es difcil sacarlas. Las muestras tienen que guardarse en el frigorficopoco tiempo hasta que sean analizadas (vase Cap. 53). Muchas bacterias aerbicas, facultativas, y anaerbicas colonizan las lceras cutneas crnicas, Para identilicar el organismo responsable, el cultivo de los tejidos profundos o una aspiracin profunda de material purulento recogido con aguja y jeringa nos proporciona la informacin bacteriolgica ms til. Para transportar el pus aspirado, lo colocamos en un tubo estril, lo tapamos bien y se lleva inmediatamente al laboratorio. El proceso de la muestra incluye preparar una extensin para teir con Gram e inyectar en el medio adecuado para cultivo de aerobios y anaerobios. Para detectar hongos, basta con un exudado del margen activo de la lcera (el transporte es como para las bacterias). El exudado con torunda de algodn es vlido, aunque debera descartarse esta prctica. Analizar las muestras para detectar hongos incluye preparar una extensin para examen microscpico directo (preparacin de hidrxido de potasio o los lintes sealados para las muestras de vesculas y pstulas) y la inyeccin en un medio de cultivo adecuado, tal como infusin cerebro-corazn, inhibidor de moho o agar Shabi, que contiene antibiticos y cicloheximna.

extensin teida con yodo es que permite visualizar mejor algunas caractersticas de los quistes. La solucin salina permite ver el movimiento de los trofozoitos. que es til para identificarlos. Para preparar las muestras frescas del material fijado con formalina, los contenidos se mezclan bien y se coloca una gota directamente en el porta y en una gota de solucin yodada. El examen de la extensin hecha con salmo se hace con un aumento medio (objetivo de 10x) al principio. Empezando por el vrtice superior izquierdo, movemos el porta horizontalmente. de derecha a izquierda. Repetiremos esta operacin hasta que terminemos de ver los 22 mm del porta. Debemos ver todos los huevos de helmintos, larvas y quistes de protozoos. El examen con el objetivo de gran aumento se har despus para detectar e identificar los protozoos, mirando aleatoriamente durante unos 5-10 minutos para cada preparacin. La tcnica para la concentracin, que puede hacerse tanto en muestras frescas como fijadas, es muy til porque permite el enriquecimiento de muestras con un nmero bajo de organismos. El mtodo ideal para un examen ordinario es la concentracin con ter-formaiina, que se ha hecho ms segura por el uso de etil-actico que con el ter-dietil. El tinte permanente de la extensin fecal para el diagnstico de infeccin por protozoos intestinales se considera el patrn de buena prctica en los laboratorios de Amrica del Norte. Los tintes se hacen en las extensiones preparadas con un pequeo cepillo mojado suavemente en solucin salina y se fijan en solucin Schaudinn antes de secarse. Las extensiones se hacen tambin de muestras recibidas fijadas en PVA: utilizando un depresor de madera, colocamos unas gotas de muestra en el porta, asegurndonos de que la pelcula toca los bordes del porta, para evitar que se caiga mientras se tie. y ocupa la mitad del porta. Despus de que la pelcula se seca completamente a temperatura ambiente, se tie. Ciertos parsitos intestinales, como Cryptosporidium, Microsporidium y Cyctospora, requieren tintes especiales para detectarlos, como se ha visto en el Capitulo 55.

PIEL Y LESIONES SUBCUTNEAS

Vejigas, bullas y pstulas. El liquido de una vejiga o una bulla puede extraerse con una aguja y una jeringa, y puede inyectarse este lquido a un tubo estril. Tambin se puede recoger una muestra de las vesculas y las bullas cortando la bulla y frotando la base con una torunda. Las muestras de las pstulas se recogen de modo similar, con una torunda quitando las costras que haya. Como mnimo hay que recoger dos exudados para preparar las extensiones para teir. Sin embargo, si lo que piden es buscar ms de un grupo de organismos (p. ej., virus y bacterias, o bacterias y hongos), lo ideal es recoger al menos tres exudados. Ante una sospecha de infeccin viral, la persona que recoge la muestra debe preparar una extensin en ese mismo lugar, pasando la torunda por todo el porta y dejndolo secar al aire. Todas las muestras tienen que colocarse en unos tubos para el transporte que contengan medio Stuart modificado. Sin embargo, si se pide una anlisis para virus, se recomienda colocar una torunda en un medio de transporte viral; y si se pide un cultivo anaerobio, la torunda debe colocarse en un medio de transporte anaerobio. Los exudados y extensiones tienen que llevarse inmediatamente al laboratorio. El anlisis de las muestras de vejigas o pstulas para detectar virus incluye un cultivo celular, y para el virus varicela zster, y posible VHS. ayuda tambin el examen de las extensiones teidas. Las muestras para cultivo se dejan en el frigorfico hasta que vayan a analizarse. El lquido que sacamos con la jeringa de una vejiga, que se recibe en medio de transporte viral, y los exudados, que se reciben en medio de transporte viral, se agitan en la mezcladora y se saca la torunda. El anlisis de las muestras para detectar bacterias y/u hongos incluye preparar una extensin para teir con Gram (para bacterias) o tinte de plata, calcoflor blanco o rojo Congo (para hongos) e inyectar en un medio de cultivo adecuado, como se explica en los Captulos 50 y 54. lceras cutneas. Las muestras que se recogen de las lceras cutneas, exudado o aspirado, son para estudios microbiolgicos. Las lesiones pueden

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MANEJO Y RECOGIDA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS

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Heridas infectadas y abscesos. Lo ideal es aspirar el material purulento con aguja y jeringa y transportarlo como se ha dicho para las lesiones ulcerativas. Si no se puede aspirar de la herida, es vlido un exudado recogido de la parte prolunda de la lesin. Para el cultivo ordinario, nos valen dos muestras; una para preparar una extensin y teir con Gram y otra para cultivo. Para encontrar anaerobios, debe recogerse un exudado ms y ser colocado en un sistema de transporte anaerobio. Todas las muestras tienen que llevarse pronto al laboratorio y ser analizadas lo antes posible. Si el retraso es inevitable, hay que poner las muestras en el frigorfico- excepto las de anaerobios, que hay que dejarlas a temperatura ambiente.

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SECCIN VI

MICROBIOLOGA MDICA
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S E C C I N

V I

Patologa molecular
Chester J. Herman, M.D., Ph.D. John Bernard Henry, M.D.

CAPTULO

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Introduccin a la patologa molecular

Chester J. Herman, M.D., Ph.D. John Bernard Henry, M.D.

REDEFINIENDO LA ENFERMEDAD FARMACOGENMICA Y TERAPIA GNICA ANLISIS DE DATOS

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GARANTA DE CALIDAD BIBLIOGRAFA

1274 1274

Hace algunos aos, la revista Time public un reportaje con una ilustracin en portada del viejo simboto de la profesin mdica, el caduceo, transformndose en una doble hlice de ADN. y encima el titulo "El Futuro de la Medicina'. Articulos como este, en la prensa de informacin general, son un ejemplo de cmo el pblico no profesional reconoce lo que la profesin mdica sabe desde hace algn tiempo que los avances de la biologa molecular y de la gentica estn transformando todas la reas de la medicina, y que estos avances aumentarn y se comedirn en el paradigma predominante de la ciencia mdica en el siglo xxi. La patologa se encuentra ahora a la vanguardia de esta transfonvacin. Las tcnicas moleculares ya han revolucionado, en muchas reas, los diagnsticos de laboratorio y han ampliado enormemente los horizontes para ejercer la patologa social y la acadmica. La revolucin es tan global y tan profunda como lo es el ltimo gran avance de la patologa, la inmunobiologia. ya que las tcnicas moleculares se aplican a todas las secciones del laboratorio. Y lo que es ms impoante. prometen liberar a la anatoma patolgica de su dependencia de los anlisis morfolgicos. El advenimiento de esta nueva tecnologa, aunque quizs intimide a algunos patlogos de formacin clsica, debera ser bienvenida por su conmocin cientfica intrnseca, por su promesa de rejuvenecer la prctica de la patologa tradicional y de lanzarla hacia nuevas direcciones, y por su autntico potencial para hacer que la patologa sea la especialidad mdica preeminente en la nueva era de la medicina molecular, segn avanzamos en el nuevo milenio. /Adaptado con el permiso de Wayne W. Grody. M.D.. Ph.D.) La patologa molecular se aplica a los anlisis de los cidos nucleicos para diagnosticar enfermedades, para predecir el pronstico de la enfermedad, conducir la terapia y para evaluar la susceptibilidad a la enfermedad antes de que sta se haga evidente. A pesar del poder de las tcnicas patolgicas moleculares y del hecho de que proporcionan nuevos puntos de vista, que antes eran imposibles, stas son complementarias a los anlisis tradicionales del laboratorio, no una sustitucin en la mayoria de las aplicaciones. Las aplicaciones significativas y las interpretaciones seguras de la mayora de las tcnicas moleculares requieren que stas se establezcan sobre una base firme de aplicacin de las determinaciones bien establecidas del laboratorio. Quiz, el mejor ejemplo de que estas lcnicas son complementarias es el hecho de que se deben emplear las tcnicas morfolgicas, la histopatologia y la citopatologia para garantizar que los lejidos y las clulas apropiadas se analizan molecularmente. De otro modo, el anlisis de lo que no sean tejidos o clulas diana puede conducir y conducir a resultados errneos y, a veces, a engaos peligrosos, a pesar de los mtodos tcnicos de alta calidad, que se interpretan con pericia y experiencia.

REDEFINIENDO LA ENFERMEDAD
La disponibilidad de la secuencia del genoma humano y la identificacin de todos los genes humanos han cambiado rpidamente nuestra forma de entender la salud, la susceptibilidad a la enfermedad y los precursores, y la enfermedad (Pandey, 2000) La capacidad para identificar el patrn de expresin gnica que hace nica la entidad de una enfermedad permite luego al patlogo definir especialmente enfermedades clnicamente diferentes, que pueden ser difciles o imposibles de distinguir, basndose slo en la morfologa o en otros datos del laboratorio (Heller, 1997; Golub, 1999). Tambin se delmen, ms claramente, las relaciones entre las enfermedades, y a veces cambian radicalmente, comparando los perfiles de expresin gnica de las enfermedades (Anbazhagan. 1999). En la direccin opuesta, la secuenciacion de los genes causantes de una enfermad y los anlisis de las mutaciones demuestran que las enfermedades tienen formes rustes no reconocidos previamente y que pueden incluir complejos de sntomas leves que no se han reconocido previamente de lorma aislada como sntomas de la enfermedad. Un ejemplo convincente de este aumento tan acusado de los sntomas de los que se compone la enfermedad es la fibrosis quistica (Friedman. 1999). Adems de las disfunciones pulmonares y pancreticas, leves y agudas, que estn aceptadas desde hace mucho tiempo como fibrosis quistica, se han asociado ejemplos aislados de la ausencia congenita bilateral de los vasos deferentes, la pancreatitis crnica y las dolencias sinopulmonares a las mutaciones del gen de la fibrosis quistica (FCRT). Estas son mutaciones frecuentes no asociadas a la forma clsica y aguda de la enfermedad. Reconocer que los complejos de sntomas expanden la definicin de las enfermedades sobre la base de las mutaciones de los genes, enfocar el tratamiento apropiado del paciente, en las formas ms leves o alpicas de la enfermedad, y definir la patobiologia, no slo de los genes enteros sino tambin de los exones y de los intrones especficos afectados.

FARMACOGENMICA Y TERAPIA GNICA

Los genes y las regiones no codificantes de los genomas tienen tales polimorfismos que en el genoma humano 1 de cada 1.000 pares de bases (pb) aproximadamente es distinto entre individuos diferentes. La secuenciacin de partes del genoma demuestra que algunos de estos polimorfismos estn en genes cuyas funciones son importantes en la respuesta a la terapia de algunos pacientes individuales (Evans, 1999). Los genes de las enzimas metabolizadoras de frmacos, activadores o mactivadores. y los genes de ligandos y receptores pueden mostrar poliformismos que disminuyen o aumentan los efectos teraputicos o la toxicidad de los frmacos que ya son ampliamente

1274

SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
de garanta de calidad son la estandarizacin de los mtodos y la comparacin de los resultados de los anlisis entre laboratorios. El National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) ha publicado los mtodos estandarizados para realizar los anlisis clnicos de patologa molecular ms comunes. La utilizacin de las directrices del NCCLS garantiza que los datos generados en los laboratorios de patologa molecular son el estndar de una prctica excelente. La comparacin entre laboratorios de la realizacin de los anlisis la proporciona el College of American Pathologists (CAP) (www.cap.org). Los exmenes de las comparaciones entre laboratorios del CAP incluyen las aplicaciones de la microbiologa molecular, de la gentica, de la hematologa, de paternidad e identidad y de las forenses en general. Si el patlogo aplica los estndares de garanta de calidad y utiliza las tcnicas patolgicas conociendo a fondo su fuerza y su debilidad, respectivamente, como se detalla en los siguientes captulos, seguir capitalizando las oportunidades que ofrecen estas tcnicas para mejorar la atencin al paciente y para comprender la patobiologia bsica. En resumen, la patologa molecular est penetrando e impregnando el laboratorio clnico en su conjunto, igual que lo hizo la inmunopatologia hace dos dcadas. Se seguirn rompiendo y disolviendo las barreras y los lmites sectoriales en esta transformacin de la medicina de laboratorio a travs del impacto de la nueva biologa de la medicina, "la biologa celular y molecular".

utilizados; esto explica algunas respuestas de hipersensibilidad que no se conocan o que no eran previsibles con anterioridad. Segn se correlacionan e identifican ms polimorfismos con la respuesta individual de los pacientes al tratamiento, el patlogo necesitar perfilar los polimorfismos corrientes en los pacientes que empiezan una terapia para enfermedades frecuentes, como la diabetes, la hipertensin, el cncer y las infecciones. La definicin del laboratorio de cada genotipo/fenotipo individual de los pacientes determinar los frmacos especficos y las dosis adecuadas para ese paciente. Esta evolucin sita al patlogo en una posicin ms definitiva para determinar la terapia apropiada que el pronstico tradicional de la evolucin de la enfermedad, basado en la morfologa de las lesiones o en las caractersticas del cultivo de los organismos infecciosos. Ms all de las alteraciones en genes individuales, los patrones de sobre e infraexpresin de muchos genes definen un perfil relacionado, en algunas enfermedades, para responder o resistirse a las terapias especificas. Adems, los genes afectados pueden no estar directamente relacionados con las rutas metablicas involucradas en la terapia afectada (Bubendorf, 1999). Del mismo modo, el laboratorio de patologa verifica el xito de la terapia gnica. Despus de que se introduce un gen, el tejido en el que el gen debe ser activo tiene que ser monitorizado para la expresin normal del gen introducido y para la (uncin y estructura normales del producto gnico. Es muy importante sealar que el laboratorio de patologa debe monitorizar tambin la integracin correcta de los genes transfectados, de modo que la integracin permita la expresin normal del gen y no produzca una funcin y estructura anormales en los otros genes del paciente.

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ANLISIS DE DATOS
Para capitalizar al mximo el poder de la patologa molecular, se estn desarrollando propuestas, completamente nuevas, para el anlisis de datos y para los datos relativos a los tratamientos de las enfermedades. La investigacin patolgica de la enfermedad y la biologa bsica han relacionado y analizado, tradicionalmente, slo uno o unos pocos marcadores, como los antgenos, las enzimas, las protenas estructurales y cosas por el estilo. Las tcnicas moleculares producen datos de muchos miles de genes, tanto de sus expresiones como de sus secuencias. El procesamiento de todos estos datos, organizarlos en perfiles de enfermedades o de pacientes, y el relacionar los diferentes perfiles exige nuevas propuestas de la bioinformtica. Estas propuestas requieren tambin que el patlogo trabaje ms estrechamente con los matemticos y que aprenda a utilizar herramientas analticas ms sofisticadas que las utilizadas tradicionalmente (Bitner, 1999).

GARANTA DE CALIDAD
Como con todos los mtodos del laboratorio, es necesario contar con programas de garanta de calidad para asegurar que los resultados de la patologa molecular son exactos y tiles. Dos componentes esenciales de los programas

CAPTULO

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Diagnsticos moleculares: tcnicas y principios bsicos

Elizabeth R. Unger Ph.D., M.D. Margaret A. Piper, Ph.D., M.P.H. BIOLOGA Y BIOQUMICA DE LOS CIDOS NUCLEICOS Estructura y composicin molecular Enzimas asociadas a los cidos nucleicos Replicacin del ADN Transcripcin del ADN a ARN Modificacin postranscripcional Traduccin de ARN a protenas Control transcripconal Mecanismos de reparacin del ADN Mutaciones del ADN ANLISIS DE LOS CIDOS NUCLEICOS Separacin electrofortica Hibridacin del cido nucleico 1280 BIBLIOGRAFA 1286 Ensayos basados en los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin RELACIN DE LA ENFERMEDAD CON LA EVALUACIN DEL LABORATORIO Diagnstico molecular Ms all del diagnstico 1286 1275

Ensayos de hibridacin: componentes bsicos Formatos de ensayos de hibridacin Mtodos de amplificacin

Los cidos nucleicos son las molculas clave de la vida. El cido desoxirribonucleico (ADN) reside en las clulas eucariotas y conserva toda la informacin necesaria para la conservacin del organismo, y transfiere esa informacin a las generaciones sucesivas. El cido ribonucleico (ARN) lleva la informacin del ADN al citoplasma de una clula y dirige la sntesis de las protenas que se necesita para la funcin del organismo. De la estabilidad del ADN y de la duplicacin exacta del ADN y su traduccin a proteina depende el estado de salud normal. La biologa celular moderna busca determinar los mecanismos bsicos de la funcin y de la estructura de la clula, y los estudios se enfocan cada vez ms a nivel del gen, las unidades del ADN que codifican protenas. Como consecuencia de esto, los mtodos de diagnstico se dirigen tambin hacia la evaluacin de los cidos nucleicos. El objetivo de esle capitulo es el de proporcionar la estructura conceptual para las aplicaciones diagnsticas de los anlisis de los cidos nucleicos.

Estructura y composicin molecular

El ADN es una molcula polimrica de doble hebra (dsDNA). larga, que existe predominantemente en forma de doble hlice dextrgira. Cada molcula de ADN de una hebra (ssDNA) est compuesta de un nmero pequeo de monmeros. El esqueleto del polmero del ssDNA es el azcar desoxirribosa. que est unida por grupos fosfato (Fig. 59-1A). Los enlaces fosfodister entre el carbono 3' de un residuo de azcar y el carbono 5' del siguiente le dan al esqueleto su estructura invariable y su direccionalidad 5' a 3'. Unida al carbono 1' de cada azcar est una de las cuatro bases posibles: la timina (T) y la citosina (C) (pirimidinas); la adenina (A) y la guanina (G) (purinas). Las bases pueden aparecer en cualquier orden secuencial y por eso forman la porcin variable del ssDNA. Los monmeros del polmero de una hebra son los cuatro deoxirribonucletidos trifosfato (dTTP. dCTP dATP, dGTP). cada uno se compone de una base, un trifosfato y una molcula de azcar. Durante la sntesis del ADN los nuclelidos se desprenden primero de dos grupos fosfato y luego se unen enzimticamente por dos enlaces fosfodister para formar una cadena. El ADN es una molcula extraordinariamente estable que slo pierde su conformacin normal por altas temperaturas, por el pH o en presencia de agentes desestabilizadores. La hlice de doble hebra es el estado ms energticamente favorable para el ADN. y el examen de los componentes del ADN explica este hecho. El azcar y los grupos fosfato son hidroflicos, en solucin forman enlaces de hidrgeno estables con las molculas de agua circundantes. Sin embargo, las bases son hidrofbicas y no son solubles en agua a un pH normal. Una molcula estable de ADN debe asegurarse que las bases no entran en contacto con el agua. Esto es posible cuando dos polmeros ssDNA antiparalelos (uno va en direccin 3 a 5 y el otro en direccin 5' a 3) giran alrededor del mismo eje. Esta ordenacin permite la formacin de los enlaces de hidrgeno planares entre la adenina y la timina y entre la guanina y la citosina (Fig. 59-18). Mientras que las dos cadenas tienen secuencias de bases en orden complementario, las

BIOLOGA Y BIOQUMICA DE LOS CIDOS NUCLEICOS

La bioqumica de cidos nucleicos es muy importante para la biologa celular moderna y dicta muchos aspectos de las aplicaciones diagnsticas. Muchas de las enzimas asociadas con la reparacin, la degradacin y con la sntesis de cidos nucleicos in vivo se han convertido en herramientas bsicas del laboratorio para la manipulacin y el anlisis del ADN y del ARN. Los mecanismos celulares que actan para dirigir y controlar la traduccin, la transcripcin y la replicacin del ADN dirigen la biologa bsica de la clula en la salud y en la enfermedad. La investigacin, el diagnstico y la terapia se dirigen, cada vez ms, al nivel molecular de la (uncin de la clula. Para comprender las aplicaciones diagnsticas actuales de la biologa molecular se necesita una visin general de los aspectos de la biologa y la bioqumica del cido nucleico, que se describen en esta primera seccin. Hay ms detalles disponibles en los libros de texto de biologa celular (Alberts, 1994).

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

l'IKIMIIMWs

I'LKINAS

Citosina

Guanina

Figura 59-1. Estructura repetida de ADN y pares de bases complementarios. A. Una cadena de ADN de una sola hebra. Las unidades de nucletidos reoetidas son unidas por enlaces toslodister que unen al 5 -carbono de un azcar al 3 -carbono de la siguiente. ('En el ARN el azcar es nbosa. que tiene un 2 -hidroxilo aadido a la desoxirribosa). S. Bases de purina y de pirimidina y la lormacin de pares de bases complementarios Las rayas sombreadas indican la formacin de enlaces de hidrgeno. ("En el ARN la timina es reemplazada por uracilo. que se diferencia de la timina en que le falta el grupo metilo) (Adaptada y por cortesa de Piper MA, U n g e r ER: N u c l e i c Acid Probes: A Primer lor Pathologists. Chicago, ASCP Press. 1989.)

hebras de la hlice tienen una estructura parecida a una escalera con peldaos (pares de bases [pb]) de tamao consistente. La flexibilidad de los enlaces entre molculas de oxigeno y carbono en el enlace fosfodister permite que la escalera se enrolle, formando una hlice regular, de modo que los pares de bases planares se quedan apilados uno encima de otro y no dejan sitio intermedio para las molculas de agua. Las series polimricas de enlaces de hidrgeno en los pares de bases mantienen las cadenas de ssDNA fuertemente unidas, y la conformacin helicoidal protege a los pares de bases del agua, quedando expuestos slo los esqueletos hidroflicos. El dsDNA es estable sobre un lmite de pH de 4-9 aproximadamente. Las soluciones con pH fuera de estos limites son capaces de romper los enlaces entre pares de bases y pueden ser la causa de que la hlice de ADN se desnaturalice o se desenrolle en dos rizos separados al azar. Tambin tienen el mismo efecto las altas temperaturas y los disruptores de los enlaces de hidrgeno, como la formamida. La transicin de la forma hlice a la form a rizo puede ser seguida espectrofotomtricamente a A (Fig. 59-2). A esa longitud de onda las bases absorben al mximo la luz ultravioleta, pero a una absorbancia molar menor en el dsDNA: cuando el dsDNA se convierte en ssDNA, la absorbancia aumenta de un 20% a un 30%. Debido a que a menudo se utiliza la temperatura para efectuar esta transicin, a este proceso se le denomina fusin, y a la temperatura a la cual se convierte el 50% del dsDNA en ssDNA se le llama punto de fusin o T. del ADN. La T de las molculas de ADN depende del contenido de pares de bases G-C frente a A-T relativo, ya que los tres enlaces de hidrgeno de los pares de bases G-C precisan ms energa para romperse que los dos enlaces de hidrgeno de los pares de bases A-T. Se puede revertir el proceso de tusin bajando la temperatura, as las dos hebras complementarias pueden rehacer la hlice original si se reforman los pares de bases en la conformacin lineal correcta.
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matina) de forma altamente estructurada. La estructura del cromosoma incluye varios niveles jerrquicos de cromatina empaquetada, de un nucleosoma "como cuentas en un collar" (146 pares nucletidos enrollados alrededor de un ncleo de histona) a asas altamente condensadas. cada una de las cules contiene alrededor de 100.000 pb de ADN. Cada ncleo de clula humana contiene 23 cromosomas de longitud caracterstica y secuencia de pares de bases nica. Estos cromosomas juntos constituyen el genoma humano.

La longitud de una molcula de ADN eucaritica es mucho ms larga que la clula misma. El ADN purificado y no degradado forma una solucin viscosa astringente que refleja la enorme longitud del ADN genmico (Fig. 59-3). Sin embargo, In vivo, el ADN se organiza en unidades regulares, altamente compactas, que se llaman cromosomas. Un cromosoma se compone de su hebra de ADN enrollada alrededor de protenas asociadas al ADN (cro-

'Icmperaliira I (.')

Figura 59-2. Curva de anillamienlo y fusin del cido nucleico helicoidal de d o b l e hlice. (Adaptada de Pioer MA. Unger ER: Nucleic Acid Probes: A Primer lor Pathologists. Chicago. ASCP Press, 1989, con autonzacion.)

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DIAGNSTICOS MOLECULARES: TCNICAS Y PRINCIPIOS BSICOS

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Tabla 59-2 E n z i m a s de cido nucleico y funciones asociadas Enzima F u n c i n in vivo

Las polimerasas mantienen unidos a los Polimerasas Polimerasas de ADN nucletidos de ADN o ARN para formar Polimerasas de ARN una molcula hija de una sola hebra, utilizando como molde el estiramiento de una molcula padre de una sola hebra Estas enzimas ejecutan la sntesis de acuerdo a las reglas de los pares de bases y actan en la direccin 5 a 3 La transcriptasa inversa, que se encuentra Transcnptasa inversa slo en los virus, cataliza la sntesis del ADN. tanto de un molde de ARN como de uno de ADN Unen los fragmentos de ADN formados por ADN ligasas las sntesis discontinuas en la replicacin del ADN o por las vas de reparacin del ADN. Nucleasas Las nucleasas "digieren" las molculas de DNasas, RNasas cido nucleico por medio de la rolura de los enlaces foslodister Endonucleasas Las endonucleasas digieren los cidos Exonucleasas nucleicos del centro de la molcula mientras que las exonucleasas empiezan en un extremo libre y pueden necesitar un extremo 3 o uno 5 Las nucleasas pueden tener la especificidad de una sola hebra, de doble hebra de ADN o de ARN Algunas polimerasas tienen actividad nuclear. Figura 59-3. Fologralia de ADN purificado que demuestra la naturaleza viscosa astringente del ADN genmico recortado mnimamente. Endonucleasas de restriccin Son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias de pares de bases de ADN cortas especficas y rompen la molcula de ADN slo en el sitio de reconocimiento.

El ARN difiere del ADN en su funcin, en estructura y en composicin qum i c a (Tabla 59-1). En el ARN. el azcar es ribosa. que contiene un grupo hidroxilo en la posicin 2' y se sustituye la timna por uracilo metilado (U). El ARN slo existe como una molcula monohebra y de longitud mucho ms corta que el ADN. La estructura del ARN es mucho ms irregular, por la naturaleza monohebra de la molcula, pero puede contener algunas secciones helicoidales. Las molculas de ARN con la misma secuencia de bases, sin embargo, formarn la misma estructura tridimensional como resultado de adoptar la conformacin ms favorable energticamente. El ARN es mucho menos estable que el ADN. debido no slo a la estructura monohebra, ms azarosa, sino tambin a su susceptibilidad a la hidrlisis alcalina va el grupo de hidroxilo 2 de la ribosa. El ARN tambin se degrada rpidamente por enzimas especficas de ARN que son ubicuas.

Enzimas asociadas a los cidos nucleicos

El ADN se debe duplicar antes de la divisin celular para que las clulas hija retengan una copia exacta de la informacin gentica contenida en los cromosomas paternos. El ARN debe ser sintetizado por todas las clulas en Tabla 59-1 C o m p a r a c i n de las caractersticas clave del ADN y del ARN Caracterstica Azcar Pares de bases Estructura Estabilidad ADN Desoxirribosa Timina-adenma Citosina-guanina Doble hebra Hlice-a Estable ARN Ribosa Uiacilo-adenma Citosina-guanina Una sola hebra Al azar (vase texto) Expuesto a hidrlisis de base Se degrada con DNasa Se degrada con RNasa Mantiene la informacin Lleva la informacin gentica en el ncleo gentica al citoplasma

funcionamiento para dirigir la sntesis de las protenas necesarias. El ADN se debe degradar durante la reparacin de los segmentos daados y el ARN se est degradando y resmtetizndose continuamente. Estas y otras funciones se ven afectadas por las enzimas que actan sobre los cidos nucleicos. La Tabla 59-2 enumera las principales categoras de enzimas especficas de los cidos nucleicos y sus funciones in vivo. Para el bilogo molecular, las enzimas purificadas in vitro se han convertido en herramientas de laboratorio, haciendo posible la ingeniera gentica y muchos ensayos de cidos nucleicos. Las enzimas especificas de cido nucleico incluyen a las polimerasas. que catalizan la formacin de enlaces fosfodister durante la sntesis: y las nucleasas. que hidrolizan estos enlaces. Las nucleasas especificas de ARN (RNasas) estn virtualmente presentes en todos los sitios, lo que hace mucho ms difcil trabajar in vilro con ARN que con ADN. Las endonucleasas de restriccin son una categora especial de nucleasas y se encuentran slo en bacterias, donde su funcin es destruir el ADN extrao. Las dianas de reconocimiento de las enzimas de restriccin estn situadas dentro de las molculas del ADN. no en uno u otro extremo, son de secuencia especifica y su longitud puede variar, aproximadamente, de 4 pb a 12 pb. Las enzimas de restriccin generan cortes especficos asimtricos o romos en la secuencia de reconocimiento (Fig. 59-4). En las siguientes secciones se vern las funciones n vivo y la utilidad in vitro de muchas de estas enzimas.

Replicacin del ADN

El proceso de duplicacin del ADN, conocido como replicacin semiconservativa. utiliza cada hebra de la molcula progenitora para dirigir la sntesis de una hebra hija (Virshup. 1990). Ya que la secuencia base de la hebra progenitora ordena la secuencia de la hebra hija, la replicacin es exacta y el producto de la replicacin son dos molculas de dsDNA. compuestas cada una de una hebra progenitora y una hebra hija con la misma y exacta secuencia de pares de bases. Aunque el concepto es simple, el proceso es complicado e involucra a un nmero de enzimas y protenas accesorias.

Funcin

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SECCIN VII

PATOLOGIA MOLECULAR la secuencia de ssDNA ordenando la secuencia ARNm que utiliza las mismas reglas de complementariedad de pares de bases (pares de bases de uracilo con adenina). Cuando se alcanza el fin del gen, se termina la sntesis de ARNm.

Modificacin postranscripcional
La molcula de ARNm se modifica de varas formas antes de enviarla al citoplasma (Rosenthal. 1994). El ARN mensajero contiene secuencias codificadoras de aminocidos (exones) y secuencias no codificadoras (intrones); los intrones son cortados de la molcula de ARNm antes de la sntesis de protenas. Un complejo molecular denominado maquinaria de procesamiento (Sharpe, 1988), que est compuesto de ARN de bajo peso molecular y de proteina. reconoce las secuencias del ARNm que identifican los lmites de un intrn. une a los exones flanqueantes y libera al intrn. El procesamiento debe ser exacto, ya que la suma o la resta de un solo nucletido en la unin de procesamiento podra cambiar el marco de lectura de 3 nucletidos en las siguientes secuencias de nucletidos. Otras modificaciones de la molcula de ARNm incluyen la suma de residuos de 7-melil-guanosina al extremo 5' en un nico enlace 5-5' fosfodister. A esto se le llama un cap. que ayuda a unir el ribosoma a la molcula de ARNm para iniciar la sntesis de protenas. Al extremo 3' se le aade una cola de poli-A, que puede ser necesaria para la estabilidad y el transporte al citoplasma. La seal de poliadenilacin es especificada, en parte, por la secuencia AAUAAA, que est, por lo general, en la regin 3' no traducida de la transcripcin del ARN. En este punto, la molcula de ARNm est preparada para dirigir la sntesis de su protena correspondiente.

Figura 59-4. Ejemplos de enzimas de restriccin de ADN y sus especificidades. A las enzimas se las denomina c o m o a las bacterias de las que son aisladas (donde N es cualquier base y N' es su pareja).

Para que la sntesis comience, primero hay que producir una pequea regin de una hebra. Esto no es favorable energticamente y se debe efectuar con protenas que desenrollen y separen las hebras de la hlice. A continuacin se sintetiza un oligonucletido corto de ARN complementario a la secuencia de una hebra. La polimerasa III de ADN acta con la sntesis del ADN y ms tarde el oligonucletido se corta y se sustituye con ADN por la polimerasa I de ADN. El ADN del cromosoma contiene muchos sitios de inicio para la replicacin y este proceso se produce simultneamente a travs del cromosoma. La polimerasa III de ADN es una enzima direccional y slo puede sintetizar ADN en direccin 5' a 3', ya que requiere una terminacin libre. Esto significa que puede ser sintetizada continuamente slo una hebra hija, denominada hebra lider. La otra hebra, denominada hebra recesiva, es cebada por primasa de ARN, que no requiere una terminacin libre. Se sintetiza discontinuamente en fragmentos cortos (fragmentos Okazaki) segn se abre la burbuja de replicacin. Entonces, estos fragmentos son unidos por la ligasa de ADN. La polimerasa III de ADN es tambin nica, porque tiene actividad exonucleasa y es a prueba de fallos de lectura. Si se aade un nucletido incorrecto a la cadena en crecimiento, es detectado y cortado por la porcin nucleasa de la enzima y entonces se aade el nucletido correcto. Esto ayuda a explicar la fidelidad extraordinaria del proceso de replicacin del ADN. Los mecanismos de reparacin postsntesis tambin contribuyen a la exactitud de la replicacin (vase ms adelante en Mecanismos de reparacin del ADN).

Traduccin de ARN a protenas

La sntesis de protenas necesita traducir el lenguaje de los nucletidos al de los aminocidos. Se utilizan 21 aminocidos diferentes en la sntesis de protenas; cada aminocido es especificado por uno o ms tripletes de nucletidos del ARNm. denominados codones. Debido a que un aminocido puede ser codificado por ms de un codn. al cdigo se le conoce c o m o cdigo degenerado. Por ejemplo, AAG es el codn para lisina y UCG es el triplete para serina. Por tanto, la secuencia que codifica un aminocido se lee en grupos de tres nucletidos que van en direccin 5' a 3': este es el marco de lectura de una secuencia que codifica protenas. Tres codones especficos no codifican para aminocidos, sino que sealan el extremo de un gen (codones de parada). La traduccin del cdigo de nucletidos de ARNm a protenas es mediada por ribosomas en el citoplasma de la clula. Un ribosoma se une al extremo 5' del ARNm y proporciona un ambiente qumico estable para todas las molculas involucradas en la sntesis de protenas. Los aminocidos son unidos en la secuencia correcta por la accin de pequeas molculas de ARN adaptadoras. denominadas ARNs de transferencia (ARNt). Cada molcula ARNt contiene una regin que es complementaria de un codn ARNm especial: el anticodn. El aminocido que corresponde al codn ARNm complementario del ARNt est unido a un extremo del ARNt. Un ARNt con el anlicodn complementario correcto se une al primer codn en la secuencia de ARNm. que siempre es AUG. Cuando otro ARNt especfico se une al codn siguiente, las enzimas ribosmicas catalizan la formacin de un enlace peptidico entre los dos aminocidos unidos al ARNt, eliminando la unin entre el primer aminocido y su molcula ARNt. El primer ARNt se desprende del hbosoma y un ARNt nuevo se une al codn siguiente. Mientras este proceso contina, el ribosoma se mueve a lo largo de la molcula de ARNm, completando la sntesis de la cadena de aminocidos. Cuando se llega al codn de parada (UAG, UGA o UAA), el ribosoma se desprende del ARNm. En realidad, a lo largo de la misma molcula de ARNm se pueden mover varios ribosomas, cada uno de ellos traduce el cdigo de ARNm dentro de una nueva molcula de protenas.

Transcripcin del ADN a ARN

A las secciones de ADN que especifican secuencias de aminocidos de protenas se las denomina genes; un gen contiene el cdigo de la secuencia de aminocidos para una protena, as como las secuencias de ADN necesarias para regular la produccin de esa protena. Aunque las secuencias codificadoras de genes son de suma importancia para la clula y para la funcin del organismo, como un todo, la gran mayora del genoma humano no est compuesto por genes. Sin embargo, no son bien conocidas las funciones de las regiones no codificadoras del ADN. A veces a estas secuencias se las denomina ADN basura, pero es ms que probable que desempeen funciones estructurales u otras, como permitir que se produzca la recombinacin, que an no han sido descubiertas. L a sntesis de la proteina comienza con la activacin del gen apropiado. Una copia del gen est hecha de ADN en forma de ARN. Debido a que la copia ARN lleva el cdigo del ADN en el ncleo de la clula al citoplasma donde se produce la sntesis de los aminocidos, este tipo de ARN recibe el nombre de ARN mensajero (ARNm). El ARN mensajero se sintetiza solamente de una hebra del gen del ADN; no se utiliza la hebra del ADN complementaria. Esto se realiza por medio de un proceso que se denomina transcripcin. La sntesis de ARNm se hace de idntica forma que la replicacin de ADN, con

Control transcripcional
Son necesarios los mecanismos de control del repertorio de la transcripcin gnica y de la traduccin de las protenas para permitir la diferenciacin

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DIAGNSTICOS MOLECULARES: TCNICAS Y PRINCIPIOS BSICOS

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celular y para la respuesta al estmulo ambiental. Algunos de estos mecanismos actan a nivel del ADN y controlan la transcripcin del ARNm (Rosenthal, 1994). Por ejemplo, los promotores son secuencias de ADN importantes para el inicio de la transcripcin del ARNm. Los promotores se encuentran secuencia arriba, como aguas arriba de un ro, (hacia el extremo 5) a una distancia relativamente invariable del inicio de la secuencia codificadora de protenas. Hay varias clases diferentes de secuencias consenso de los promotores (secuencias de nucletdos que estn en muchos ejemplos). Los promotores ms comentes son ricos en adenina y timina y son denominados cajas TATA. Al repetir las secuencias A-T, el ADN se desenrolla con ms facilidad, debido a que los enlaces de pares de bases A-T son ms dbiles que los enlaces de pares de bases G-C. Hay otras secuencias de promotores reconocidas, las cajas GC y el motivo CA. Despus de la activacin transcrpcional y por la unin de la polimerasa de ARN con sus cofactores. se produce y estabiliza una regin de ssDNA local. El ARN mensajero es sintetizado desde la regin local de ssDNA. y el ARNm es desprendido rpidamente a la vez que el ADN vuelve a su estado, ms favorable energticamente, de doble hebra helicoidal. Los amplificadores son secuencias de ADN que pueden aumentar la transcripcin del ARNm y se pueden encontrar en localizaciones diferentes relativas al gen que afecten. Los factores de transcripcin son protenas que se unen a los amplificadores y a los promotores y estimulan o inhiben, selectivamente, la transcripcin del ARNm (Papavassiliou. 1995). A su vez, los factores de transcripcin son controlados por acontecimientos celulares, como la fosforilacin, o por otras protenas, como las hormonas y los factores del crecimiento. Una red de comunicaciones qumicas intra y extracelulares puede asi seleccionar y controlar la sntesis de protenas necesaria. Debido a que el ARNm es mucho menos estable que el ADN, la vida media del ARNm es muy corta. Nuevas molculas del ARNm se estn transcribiendo continuamente a partir del ADN. A la vez que la clula responde a los cambios en las seales de transcripcin, los genes que estn transcritos en ARNm pueden cambiar rpidamente y dar como resultado la sntesis inmediata de nuevas protenas. Por tanto, la clula tiene la capacidad de ajustar su produccin proteica en respuesta a su ambiente.

sintetizada y cortan la regin que incluye el fallo. La polimerasa III del ADN y la ligasa restablecen la secuencia correcta y la integridad de la hebra hija. La importancia de este mecanismo en la estabilizacin del genoma se ha evidenciado por estudios recientes que asocian el cncer colorrectal no polipsico hereditario con defectos en las protenas reparadoras de errores. La escisin de bases repara las dianas pequeas, los aductores que no deforman la doble hlice, como los producidos por metilacn. oxidacin, reduccin o fragmentacin de bases por radiacin ionizante. La escisin de bases deja huecos de 34 nucletdos que luego se sellan con los nucletdos reparados: los cortes se sellan con ligasa. Los aductores de bulto ms grandes o los dimeros que distorsionan la hlice de ADN pueden ser causados, entre otros agentes, por la radiacin UV, los carcingenos y por los frmacos teraputicos. Estas lesiones se eliminan por la va de reparacin de escisin nucleotidica (REN), que utiliza un sistema de enzimas, compuesto de muchas protenas, para cortar un oligonucleotide de una hebra que contiene la lesin (Sanear, 1994). Luego el hueco se sella con la polimerasa ADN y se liga. Hay dos vas de reparacin de escisin nucleotidica: una, en la que las lesiones que bloquean la transenpcin son eliminadas rpidamente (reparacin acoplada a la transcripcin; Hanawalt. 1994), y dos, una va global que repara el ADN basura, incluyendo la hebra no transcrita de los genes activos. Algunas de las consecuencias posibles originadas por la prdida de actividad REN tienen como ejemplo la enfermedad xeroderma pigmentosa (XP). cuya causa son las mutaciones de REN. La XP acusa u n a extrem a sensibilidad a los rayos solares y. como consecuencia, aparecen cnceres de piel a una edad m u y temprana (Weeda, 1998). Los cortes no (recuentes de la doble hebra o los que se producen por la radiacin ionizante o por el dao oxidativo presentan problemas importantes. Si no se resuelven, se bloquearn la transcripcin y la replicacin de las secuencias involucradas. Para mantener la integridad genmica, local y total, se reparan los cortes de la doble hebra por mecanismos de reparacin de recombinacin no homologa o allica. Ahora queda claro que la reparacin de ADN juega un papel importante en la vida de la clula. Hay evidencias recientes que indican que varias protenas, que son protenas de reparacin primaria, tambin funcionan en la regulacin y en la transcripcin del ciclo de la clula. Por tanto, el proceso que concierne al ADN parece estar altamente integrado y se estudiar, cada vez ms. como un todo y en relacin a las enfermedades humanas.

Mecanismos de reparacin del ADN

Se deben minimizar los errores en la replicacin del ADN y los daos al ADN durante la vida celular normal para preservar la salud de todo el organismo. Hay varios mecanismos que actan para mantener normal la secuencia del ADN. Primero estn los mecanismos para anular los errores, que actan durante la replicacin del ADN. La polimerasa del ADN, que sintetiza nuevos polmeros de ADN. selecciona cada monmero de nucletdos sucesivo basndose en su complementariedad al nuclelido siguiente en la hebra molde. La fidelidad a este nivel es grande y en esta etapa se anulan la mayora de los errores en la sntesis. Sin embargo, a la hebra en crecimiento se le puede aadir, ocasional e incorrectamente, una base. Para corregirlo, la actividad a prueba de errores de lectura de la polimerasa reconoce el error, elimina la base incorrecta y contina de nuevo con la sntesis. Los mecanismos para anular errores reducen los fallos en los pares de bases en aproximadamente 1 entre 10 millones (Radman. 1988). Esto representa un aumento de 100.000 veces en eficacia, comparndolo con el ndice de error de 1 en 100 bases para la sntesis de oligonucletidos en fase slida in vitro. A pesar de la extraordinaria anulacin de errores en la replicacin del ADN, se producen equivocaciones ocasionales. An ms. el ADN puede ser daado por reacciones bioqumicas normales y por agentes no fisiolgicos, como la luz ultravioleta y los carcingenos ambientales. Hay varios mecanismos de reparacin que reparan el ADN daado (Yu, 1999) (Tabla 59-3). Los mecanismos de reparacin directos reparan los daos a travs de una reaccin en un solo paso. Por ejemplo, la O - metil-guanina ADN metiltransferasa repara los daos por alquilacn, transfiriendo el grupo alquilo desde la lesin al sitio activo de la enzima. Otro mecanismo de reparacin directo, caracterizado en Escherichia coli, puede existir, tambin, en las clulas humanas (Yu, 1999).
e

Mutaciones del ADN

A pesar de los extensos mecanismos de reparacin, se producen alteraciones de las secuencias de bases en el ADN (mutaciones), y en alguna medida deben producirse, para que contine el proceso de evolucin. Incluso para un organismo individual, algunas mutaciones son claramente dainas y pueden estar asociadas al cncer y a las enfermedades genticas hereditarias. Los estudios de estas enfermedades han conducido a la caracterizacin de varios tipos de mutaciones que se producen el genoma humano (Weatherall, 1987). stas pueden ser agrupadas, conceptualmente, en varias categoras principales (Tabla 59-4). Una mutacin puntual se encuentra en el gen de la (J-globina en

Tabla 59-3 Vas de reparacin del ADN Reparacin directa Reparacin de errores Repara ciertos tipos de lesiones del ADN en una reaccin de un solo paso Comprueba los errores cometidos cuando el ADN se ha replicado Elimina a cualquiera de las bases mal emparejadas y las reemplaza por las correctas. Repara los pequeos aductores que no deforman la hlice, como los originados por la metilacn. la oxidacin, la reduccin o la fragmentacin de la base mediante radiacin ionizante

Reparacin de la escisin de la base

La reparacin de errores (RDE) funciona inmediatamente despus de la replicacin del ADN para reemplazar las bases errneas por las correctas (Modrich, 1994). Algunas protenas RDE reconocen el erraren la hebra hija recin

Elimina los aductores de bulto del ADN. como los dimeros de timina y ciertos fotoproductos, asi como a los aductores qumicos y a los enlaces cruzados. Reparacin de la rotura Repara las roturas de la doble hebra de la doble hebra originadas por procesos fisiolgicos o por la radiacin ionizante y las agresiones oxidativas

Reparacin de la escisin del nucletido

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

Tabla 59-4 Tipos de m u t a c i o n e s de A D N y e j e m p l o s de las e n f e r m e d a d e s Mutacin Punto Delecin o insercin Delecin o insercin con frameshilt Descripcin Sustitucin de un solo par de bases. Sustraccin o adicin de codones de aminocido en mltiplos de tres Se conserva el marco de lectura Sustraccin o adicin de codones en no mltiplos de tres. El resultado es un desplazamiento del marco de lectura y una secuencia que codifica aminocidos completamente diferente a partir de la mutacin. Aumenta el nmero de secuencias en el ADN microsatlite. Origina la disrupcin de la expresin del gen Cambio intercromosOmico de segmentos largos de cromosoma Origina una nueva proteina con una funcin diferente. Enfermedad Anemia drepanocitica Distrofia muscular de Becker Distrofia muscular de Duchenn<

Amplilicacin o repeticin de los Irinucletidos Translocacin

Cromosoma X frgil Leucemia mielgena crnica

la anemia de clulas enfermas (Kan. 1992). Una base de timina reemplaza a una base de adenina y origina un cambio grave en la estructura de la hemoglobina. La delecin en el gen de la protena muscular distrfica es la causa de la distrofia muscular. En la variedad Becker de la enfermedad, las deleciones no interrumpen el marco de lectura, pero en la mayora de los casos de la variedad Duchenne, mucho ms grave, las deleciones s cambian el marco de lectura, eliminando eficientemente la funcin de las protenas (LiechtiGallati. 1989). El ADN humano contiene muchas secuencias cortas de nucletidos (ADN microsatlile) que algunas veces se agrupan en repeticiones en tndem y que se repiten muchas veces por todo el genoma humano. El nmero de repeticiones en tndem en lugares especiales es un carcter hereditario. Se ha observado que algunas repeticiones de trinuclelidos aumentan en nmero en asociacin con la enfermedad (Sutherland, 1994). En el sndrome del cromosoma X frgil, la expresin de la enfermedad est asociada a la amplificacin, ms all de un cierto limite, del nmero de una secuencia de repeticin trinucletida intragnica. La expansin de las repeticiones trinucletidas, ms all de un nmero crtico, rompe la expresin del gen. No siempre se pueden detectar las translocaciones por el anlisis del cariotipo cromosmico. A nivel del gen, una translocacin puede crear un gen de fusin, la combinacin de dos genes diferentes unidos de forma anormal en el sitio de la translocacin. Esto no slo puede crear una transcripcin del gen alterada, sino que tambin puede producir un gen bajo el control transcripcional de otro. Por ejemplo, el cromosoma Filadelfia. que se encuentra en la mayora de los casos de leucemia mielgena crnica, es el resultado de una translocacin recproca entre el gen c-abl. en el cromosoma 9, y una regin denominada regin de agolpamientos de puntos de sutura (raps), en el cromosoma 22. El gen de fusin producido por este reordenamiento cromosmico se compone de la mayor parte del gen c-abl y de una raps truncada, codilica una protena c-abl, que es ms grande que el producto normal, tiene una actividad enzimtica incrementada y se cree que interfiere con las vias de transduccin de seales que, normalmente, estn involucradas en el control de proliferacin y muerte de las clulas. Lo que determina el efecto ltimo en el producto proteico es el tipo de mutacin, asi como su localizacin en relacin al gen. Las mutaciones pueden no tener efecto sobre la expresin de la proteina o su actividad funcional: existen muchas protenas humanas, en variantes perceptibles, que no estn asociadas con la enfermedad. Las mutaciones que se producen en las regiones intrnicas se supone que no tienen ningn efecto. Sin embargo, incluso las pequeas mutaciones en regiones que codifican para dominios funcionales clave (exones) pueden alterar o eliminar funciones drsticamente. Las "mutaciones sin sentido" son mutaciones que transforman un codn de aminocido en un codn de parada, o viceversa, y dan como resultado productos proteicos anormalmente cortos o largos, respectivamente. Las mutaciones de sentido errneo son aquellas que cambian el cdigo de un aminocido a otro y que pueden alterar o no la funcin de la proteina dependiendo del cambio y de la funcin del aminocido. De igual forma, las mutaciones dentro de las secuencias que sealan los sitios de unin pueden eliminar exones e introducir intrones en el ARNm transcrito. Las mutaciones pueden producirse tambin en las secuencias reguladoras, como las promotoras y las amplificadoras, que producen efectos drsticos en los niveles de transcripcin,

ANLISIS DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Las propiedades bioqumicas nicas de los cidos nucleicos han sido el detonante para proporcionar informacin de la biologa o bioqumica de un sistema. Mientras que algunos ensayos, como la electroforesis. se aplican a otras unidades bsicas, como las protenas y los lpidos, la gran mayora son especficos para los cidos nucleicos En las siguientes secciones se describen brevemente los principios de las categoras de anlisis bsicas utilizados para caracterizar el ADN y el ARN. las separaciones electroforticas. los ensayos de hibridacin, las tcnicas de amplificacin y los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin. En la prctica, las categoras, a menudo, se combinan para producir nuevas variaciones del mismo tema. Por ejemplo, un ensayo completo puede involucrar a la amplificacin, la electroforesis y la hibridacin.

Separacin electrofortica
El esqueleto de azcar-fosfato repetitivo de los cidos nucleicos da c o m o resultado una carga neta negativa distribuida ligeramente sobre estas molculas lineales. Por tanto, el movimiento del ADN o del ARN en respuesta a un campo elctrico ser proporcional al peso molecular o a la longitud de la molcula. Esta propiedad se utiliza para caracterizar el tamao de los fragmentos de cido nucleico por separacin electrofortica. El formato es similar al que se utiliza para la separacin de protenas segn su tamao. Se ponen mltiples muestras en pocilios separados, en un extremo de un medio de separacin slido pero poroso. Cuando se aplica el voltaje, la muestra se mueve hacia el electrodo positivo de manera lineal, formando cada muestra u n a linea de migracin. Se conoce como ge/al medio electrofortico slido y a la repeticin de pocilios de muestra. Los tamaos estndar, a los que nos referimos como escaleras de ADN o ARN, son mezclas de cidos nucleicos de longitud de fragmento conocida que son analizados en una o ms lneas del gel. L a determinacin del tamao se hace comparando la distancia de migracin de una muestra desconocida con la escalera, bien ~a ojo" o por mediciones asistidas por ordenador. La composicin y la concentracin del medio de separacin determina el tamao de los fragmentos, los cuales se pueden separar en bandas diferentes. Otras variables que contribuyen a la resolucin son el grosor del gel, la longitud de la va de electroforesis, la duracin de la electroforesis y el voltaje aplicado. En la prctica, estos factores se gustan empiricamenle y se controlan tan cuidadosamente como es posible para asegurar la capacidad de reproduccin de da en da. La agarosa es el medio de separacin que se utiliza con ms frecuencia y. por lo general, conjuntamente con u n a cubeta de electroforesis horizontal, en la que se sumerge el gel en tampn. el gel sumergido. Las muestras se espesan con sacarosa o Ficoll y son cargadas en los pocilios del gel por medio del tampn (Fig. 59-5). Se obtiene un poder mayor de resolucin con acrilamida, utilizada normalmente en un lormato vertical, que permite la diferenciacin en longitud de un solo par de bases. El mtodo ms simple para visualizar las bandas separadas por electroforesis es la tincin con colorantes intercalados (p. ej.. el bromuro de etidio), que se insertan

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DIAGNSTICOS MOLECULARES: TCNICAS Y PRINCIPIOS BSICOS

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entre las bases emparejadas, y visualizando con transiluminadores de luz UV. La visualizacn directa requiere que la banda consiga un concentracin significativa. En algunas aplicaciones se pueden delectar los fragmentos de cido nucleico por fluorescencia o por radiactividad, marca que puede aumentar la sensibilidad. Las molculas en el ADN genmico son reducidas a fragmentos que se pueden resolver por electroforesis por medio de la digestin con enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin con una secuencia de reconocimiento relativamente simple producen fragmentos de menos de 50 kilopares de bases (kpb) de longitud. Los fragmentos de ADN extremadamente largos, medidos en megapares de bases (Mpb). se producen por la digestin con enzimas con una secuencia de reconocimiento compleja, y deben ser separados en sistemas electroforticos especiales utilizando un campo elctrico pulsado. La mayora de las aplicaciones de la electroforess de ADN utilizan condiciones no desnaturalizantes (es decir, los fragmentos que se resuelven en bandas son de doble hebra). Por el contrario, la mayora de las separaciones del ARN utilizan condiciones desnaturalizantes (bien fornamida o glioxal) para eliminar la estructura secundaria de las molculas monohebra. Las molculas de ARN, que son transcritas de ADN. son "premedidas" y relativamente pequeas, por lo que no se requiere digestin antes de la electroforess.

Figura 59-6. Ilustracin de la astringencia. Segn aumenta la astringencia de la hibridacin se toleran menos errores en un hibndo dplex Con la astringencia muy alta, incluso un error en un solo par de bases interrumpir el dplex.

Hibridacin del cido nucleico

La hibridacin es un concepto fundamental en la bioqumica del cido nucleico: se le define como la interaccin entre dos molculas monohebra de cido nucleico para formar una molcula dplex (de doble hebra), basada en el emparejamiento de bases complementarias de sus respectivas secuencias. La hibridacin es consecuencia directa de la estructura estable de doble hebra del ADN bajo condiciones fisiolgicas. Como se ha visto antes, la hlice est formada por dos hebras antiparalelas de ADN sujetas por la fuerza combinada de muchos enlaces especficos de hidrgeno entre pares de bases complementarios, asi como por una carcasa hidrofbica de bases de un ambiente acuoso. Lo importante de la reaccin de hibridacin es el hecho de que las uniones entre molculas complementaras separadas (hebras) sea reversible y especifica de secuencia de bases. Al proceso de reforma de la estructura de la doble hebra estable, cuando ninguna de las hebras est marcada, se le denomina amllamiento. Si una hebra est marcada (es decir, si tiene un marcador que puede ser detectado de alguna manera), a esa hebra marcada se la denomina sonda, y al proceso se le conoce como hibridacin, debido a que se forma una molcula hbrida entre una hebra marcada y otra sin marcar. Las molculas de ARN tambin pueden participar en el proceso de hibridacin. El emparejamiento de bases puede producirse entre hebras de ADN complementarias, entre el ADN y el ARN y entre hebras de ARN complementarias, dando como resultado estructuras dplex de ADN-ADN. ADN-ARN y ARN-ARN. Las estructuras ms

estables las forman las molculas dplex, con complementariedad exacta en la secuencia de bases, pero pueden formarse estructuras con diversos grados de error de ios pares de bases dependiendo de las condiciones. La inestabilidad relativa de estos dplex errneos se reflejar en la baja temperatura de su disociacin (por debajo de la T,,). Se pueden manipular las condiciones ambientales para controlar el grado de errores de los pares de bases que se tolerarn en una estructura dplex (es decir, la astringencia de la coincidencia de la secuencia) (Fig. 59-6). Una baja astringencia tiene que ver con las condiciones, como sal elevada, baja temperatura, ausencia de fornamida. que favorecen a la carcasa de bases hidrofbicas de un ambiente acuoso, incluso sin un alineamiento perfecto; la coincidencia no necesita ser perfecta. Las condiciones de alta astringencia -alta temperatura (cerca de T,). baja sal y fornamida alta- slo permitirn estructuras dplex perfectamente alineadas para permanecer en una conformacin helicoidal estable.

Ensayo de hibridacin: componentes bsicos

El proceso conocido como ensayo de hibridacin es el que utiliza la reaccin de hibridacin para analizar el contenido del cido nucleico de una muestra no conocida. La propiedad del emparejamiento de bases complementarias permite a los fragmentos de una composicin conocida (la sonda) interrogar a una desconocida por la presencia de secuencias (complementanas) de comparacin. Por tanto, todos los ensayos de hibridacin requieren varios elementos bsicos: una sonda, una muestra, condiciones controladas permisivas para el emparejamiento de bases complementarias y un mtodo para el descubrimiento de hbridos especficos de sonda-muestra. A continuacin se vern brevemente cada uno de estos elementos, as como las variaciones en los formatos que se han desarrollado para permitir la ejecucin y la interpretacin de los ensayos de hibridacin

Sonda
La sonda determina la especificidad de la reaccin de hibridacin. Por eso la sonda es capital para un ensayo de hibridacin, de la misma manera que el anticuerpo primario es capital para un inmunoensayo. Una sonda es un fragmento bien caracterizado de cido nucleico, bien de ADN o bien de ARN. En la mayora de los ensayos, y aunque se producen variaciones, la sonda es la que porta al grupo reportero para delectar molculas hibridadas dentro de la reaccin. Los grupos reporteros pueden ser radiactivos o no radiactivos (es decir, mareaje por afinidad). Figura 59-5. Fotografa de la carga de una muestra y su tincin mediante lampn en un pocilio de gel de agarosa en un apralo de electroforesis de gel sumergido. La mayora de las sondas son producidas por la tecnologa de cidos nucleicos recombinantes, como se ilustra en la Figura 59-7. Los plsmidos, segmentos de doble hebra cortos y circulares de ADN, son utilizados para pro-

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

Figura 59-7. Produccin de sondas clonadas. La insercin de un s e g m e n t o extrao conocido de ADN en un v e c t o r de plsmido p r o d u c eu n plsmido recombinante Los pismidos de este tipo son pequeos trozos circulares de ADN que se propagan mediante su cultivo en un husped bacteriano. El ADN plsmido se separa fcilmente del c r o m o s o m a bacteriano en base al tamao. El plsmido recombinante purificado puede s e r utilizado c o m o sonda. Esto produce una sonda de ADN de hebra doble c o n secuencias del inserto y del vector De forma alternativa, se p u e d e n purificar las secuencias del inserto del vector del plsmido y utilizarlas solas c o m o la sonda. Si el plsmido contiene una regin de ARN promotor, se pueden producir sondas de ARN utilizando u n a polimerasa de A R N para transcribir las secuencias del inserto. Como solamente se transcribe u n a hebra, las sondas de ARN que se producen son de una sola hebra. (Por cortesa y adaptada de U n g e r ER: In situ hybndization. Principies and praclice Clin I m m u nol Newslett 1990:10:120-126, copyright 1990 Elsevier Science.)

pagar las secuencias deseadas en las bacterias. El segmento que interesa se introduce en el plsmido, utilizando la digestin de enzimas de restriccin y ligacin, lo que da como resultado una nueva molcula "recombinada" que mantiene la capacidad de propagarse en la bacteria y que incluye a la secuencia de ADN que interesa. Las bacterias que contienen el plsmido recombinante pueden ser crecidas en cultivo y los pismidos pequeos y circulares pueden ser fcilmente separados del genoma bacteriano en base al tamao. As se obtienen muchas copias idnticas y por eso nos referimos al ADN como clonado. El plsmido purificado puede ser utilizado en ensayos donde las secuencias de vectores no interfieren con la especificidad de la reaccin. En muchas aplicaciones, la secuencia de ADN insertada es separada de la secuencia de vectores por medio de la digestin del plsmido aislado con la misma enzima de restriccin, utilizada originalmente en la construccin de la molcula recombinante. La sonda resultanle, por cualquiera de esos mtodos, es una molcula de ADN de doble hebra. Antes de utilizarlas, las sondas de doble hebra deben ser desnaturalizadas, y el reanillamiento de la sonda limita la extensin de la hibridacin de la sonda con una diana. El vector del plsmido que no contiene ADN clonado es un control negativo utilizado corrientemente para este tipo de sonda. Los vectores de los pismidos han sido construidos para incluir a las regiones promotoras de ARN adyacentes a la secuencia de ADN insertada. Estos pismidos recombinantes se usan para producir transcritos de ARN a partir del ADN insertado. El resultado es una sonda de ARN monohebra que no experimentar autohibndacin. El control de la orientacin del ADN insertado con respecto al promotor de ARN permite la produccin de transcritos en la direccin sentido (igual que el ARNm) o antisentido (complementaria al ARNm). En muchas aplicaciones, los transcritos de sentido forman sondas de control negativas, ideales para las reacciones de hibridacin con sondas antisentido. Una sonda de ARN enlazada no especiticamenle (es decir, el ARN no es una estructura dplex estable) puede ser eliminada utilizando RNasa especfica de ARN monohebra. Como el ARN es muy delicado, es necesario que las sondas sean manejadas con un cuidado extrem o para prevenir su degradacin (tcnicas estriles, agua tratada y material de cristal). Las sondas recombinantes. sean de ADN o de ARN. son genticamente complejas, lo que significa que pueden incluir muchas kilobases de informacin gentica, al contrario que las sondas producidas por mtodos sintticos, que son segmentos de ADN relativamente cortos. Las sondas de oligonucle-

tidos producidas por reacciones qumicas automatizadas son, normalmente, de 15 a 45 bases de longitud, sintetizadas para producir una secuencia de bases especfica. Se pueden disear sondas con una especificidad de hibridacin muy alta, en base a la informacin de secuencias disponible en los bancos de datos. Se pueden generar en direccin sentido o antisentido, con costes relativamente baios. Estas sondas cortas son monohebra. esparcidas en la diana y de hibridacin rpida, debido a su pequeo tamao, y extremadamente sensibles incluso a un solo error en los pares de bases. Debido a su limitada complejidad gentica, la susceptibilidad ltima que se consigue con las sondas de oligonucletidos es ms baja que la que consigue con las sondas recombinantes. Las mltiples sondas de oligonucletidos dirigidas a diferentes reas de la misma diana han sido utilizadas, en algunos casos, para aumentar la susceptibilidad, incrementando la representacin de la secuencia diana en la mezcla de la sonda. Este mtodo es anlogo a la ulilizacin de una mezcla de anticuerpos monoclonales que reaccionan frente a epitopos diferentes del mismo antigeno complejo. Se pueden generar sondas ms largas que las obtenidas por la sntesis qumica directa con la reaccin en cadena de la polimerasa o con otra tecnologa de amplificacin. Estas sondas pueden ser monohebra o de doble hebra, dependiendo de las condiciones empleadas, y pueden ser tan largas como el producto de la reaccin de amplificacin; en la mayora de los casos de 100 pb a 1 kben longitud.

Muestra
Mientras que la seleccin y la preparacin de las sondas es esencial para determinar la susceptibilidad y la especificidad del ensayo de hibridacin, no se debe olvidar que la preparacin de la muestra contribuye al xilo del ensayo. Para aplicaciones clnicas, las muestras de inters deben ser bastante diversas. Por ejemplo, un laboratorio de microbiologa podra contar con muestras de anlisis de sangre, de orina, de heces y de esputos. Puede ser difcil mantener la integridad de las dianas de ARN bajo en tales condiciones, e incluso el ADN puede ser degradado si no se maneja adecuadamente. El objetivo de la preparacin de la muestra es mantener la integridad del cido nucleico y hacer asequible la informacin gentica de la diana para la interaccin con la sonda. Para algunas aplicaciones, la necesidad de integridad de la diana aconsejar una congelacin inmediata o aadir lampones de lisina que contengan inhibidores de RNasa o de DNasa potentes. En otras aplica-

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DIAGNSTICOS MOLECULARES: TCNICAS Y PRINCIPIOS BSICOS

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ciones, la utilizacin de mtodos de recogida de muestras ms habituales permitir una preservacin adecuada de la diana. Las similitudes fisicas y qumicas de los cidos nucleicos, sea cual sea la fuente, permiten mtodos uniformes de purificacin y extraccin. En muchos ensayos, para eliminar inhibidores de enzimas que son aadidos al ensayo (como una enzima de restriccin o una polimerasa) y para maximizar la accesibilidad de la diana a la sonda, es preferible purificar extensivamente el ADN o el ARN. Sin embargo, los sistemas de purificacin completos consumen mucho tiempo y requieren una cantidad relativamente grande de muestras de partida. En muchas aplicaciones se pueden utilizar purificaciones de muestras relativamente abreviadas. Normalmente para las purificaciones se utiliza la lisis de la clula (mecnica, quimica o ambas), tratamiento de proteasa y extracciones orgnicas o inorgnicas.

recta de los anticuerpos. El primer mareaje por afinidad introducido en los cidos nucleicos fue la biotina, un mareaje por afinidad utilizado corrientemente en los inmunoensayos (Langer, 1981). La biotina por s m i s m a no genera seales, pero es delectada por la interaccin de alta afinidad con una molcula de avdina o estreptavidina. que a su vez se combina o conjuga con una enzima generadora de seales o fluorocromo. Muchos otros grupos funcionales se han desarrollado como marcas monoisolnicas. como la bromodesoxiundina. la digoxigenina y la sullona. En estos casos, la deteccin se consigue con anticuerpos de alta afinidad dirigidos contra el grupo funcional. Estos anticuerpos estn, por lo general, directamente enlazados a una enzima generadora de seales o fluorocromo que acta como un anticuerpo secundario marcado en una reaccin inmunoquimica. La biotina tambin puede ser detectada con un anticuerpo antibiotina ms que con una molcula de avdina o estreptavidina. Debido a que las marcas de afinidad son detectadas con protenas grandes, como la avidma o los anticuerpos, la disponibilidad de la marca al reactivo de deteccin es un factor crucial en la determinacin de la sensibilidad. El aumentar el nmero de marcas de afinidad no incrementar necesariamente el nmero de molculas detectaras que sern unidas al cido nucleico. Adems, y debido a que las marcas de afinidad son grandes, su sobremeorporacin en la molcula de cido nucleico puede conducir a un bloqueo espacial de la reaccin de hibridacin. Por estas razones, la actividad especifica de la marca de afinidad no controla directamente la sensibilidad de la deteccin. Una ventaja de la deteccin indirecta de las marcas de afinidad es que para la misma marca se pueden utilizar varios mtodos de deteccin (Fig. 59-8). Por ejemplo, la biotina puede ser detectada con avidina unida a una enzima con color subsiguiente o con una deteccin quimioluminiscente o con avidina con marca fluorescente. Para todos los mtodos no radiactivos, la parte de deteccin del ensayo es crucial para obtener una sensibilidad ptima. Una reaccin de hibridacin eficaz se puede frustrar por reactivos de deteccin con poco fondo y una generacin de seal subptima Para conseguir resultados ptimos, lo ms importante es elegir los marcadores de enzimas (peroxidasa frente a fosfatasa alcalina), el sustrato de la enzima (colorimtnco trente a quimioluminiscente) e incluso la procedencia de los reactivos.

Condiciones controladas permisivas para el emparejamiento de bases complementarias

La susceptibilidad y la especificidad de las reacciones de hibridacin son influenciadas, en gran medida, por el ambiente lisico-quimico durante la reaccin y la consecutiva deteccin/recogida de las molculas hbridas. En la prctica, el medio utilizado para controlar el ambiente de la reaccin de hibridacin es el cctel de hibridacin. Diseado empricamente, el cctel de hibridacin es una mezcla de reactivos seleccionados para favorecer la interaccin de los cidos nucleicos a travs de enlaces de hidrgeno especficos de secuencia, ms que en base a la carga. Sus componentes varan mucho, pero incluyen tampones, sales, desnaturalizantes como la formamida. polmeros de alto peso molecular, ADN o ARN portador y varios componentes ms que se le aaden para reducir el fondo (como detergentes, suero de bovino, albmina y Ficoll). A esta mezcla tan compleja se la denomina, con toda propiedad, un ccfe La luerza inica del cctel de hibridacin, y los lavados subsiguientes, es modulada, muy frecuentemente, por la concentracin de un tampn citrato sdico salmo (SSC). compuesto de 0.15 mol/I de cloruro de sodio. 0.015 mol/l de citrato de trisodio y un pH 7.0. La abreviatura de estas condiciones hace referencia a la fuerza del SSC. esto es. 2 x SSC. 0,1 x SSC. La astringencia final de la reaccin de hibridacin est controlada por la formamida y por la concentracin salina del cctel de hibridacin, por la temperatura de la reaccin de hibridacin y por la temperatura y la concentracin salina de los pasos de lavado.

Formatos de ensayos de hibridacin

Se ha desarrollado una amplia variedad de formatos de ensayos de hibridacin, cada uno de ellos diseado para resolver los problemas metodolgicos del ensayo de hibridacin: las condiciones que permiten el emparejamiento de las bases complementarias especficas, un mtodo para detectar hbridos y una interpretacin del resultado. Cada mtodo tiene su punto dbil y su punto fuerte, y la seleccin del formato la dicta el marco clnico y la pre-

Deteccin de hbridos
Se ha aplicado una amplia variedad de tcnicas para la recogida y el anlisis de hbridos especficos, que se vern brevemente ms adelante bajo el titulo de Formatos de ensayos de hibridacin. Una vez que se han recogido los hbridos especficos, los mtodos de deteccin van unidos, obviamente, a los mtodos de mareaje. Se han utilizado marcas radiactivas, como el lsloro-32 (*P), el yodo 125 ("'-I), el azufre-35 ( S), el carbono-14 ( C) y el tritio ( H). que se detectan por medio de la autorradiografa o por el contador de centelleo en muchas aplicaciones de investigacin y en las primeras aplicaciones clnicas. La actividad especifica de la marca influye directamente en la sensibilidad de la deteccin. Se han buscado, para las aplicaciones clnicas, alternativas al mareaje radioisotpico. Las sondas radiactivas tienen una vida media, relativamente corta, haciendo que uno de los reactivos claves en el ensayo de hibridacin sea inestable. Tambin han contribuido a la necesidad de encontrar mtodos no radiactivos el peligro que corre el personal del laboratorio y los costes de la eliminacin de los desechos radiactivos. Las sondas marcadas no isotpicamente son reactivos estables, facilitan enormemente la produccin industrial y la estandarizacin, lo que es crucial para la capacidad de reproduccin de los ensayos.
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El mareaje no isotpico y los mtodos de deteccin de los cidos nucleicos tienen muchas similitudes con los ensayos mmunoquimicos desarrollados por la deteccin de protenas no isotpicas. En algunas aplicaciones, los cidos nucleicos son enlazados directamente a un compuesto emisor de seal, normalmente a un fluorocromo. aunque ocasionalmente a una enzima. Esta situacin es igual para los inmunoensayos, en los cuales es marcado el anticuerpo primario. Los cidos nucleicos son detectados, ms cornentemente, en un ensayo de mltiples pasos, cuyo concepto es similar a la reaccin indi-

Suslralo (colormclrico o quimioluminisccntc)

Figura 59-8. Sistemas de deleccin de sondas de marcaje por afimdad. (Por cortesia de Unger ER. Piper MA: Nucleic acid biochemistry and diagnostic applications En Burlis CA. Ashwood ER led.]: Tietz Textbook ol Clinical Chemistry. 2" ed. Filadelfia. WB Saunders Company, 1 9 9 4)

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR reaccin de hibridacin. Estas desventajas se compensan, frecuentemente, por la conveniencia de disponer de un medio slido que nos lleve a travs de los mltiples pasos del ensayo. Hibridacin de punto o transferencia. En este formato de ensayo, mltiples muestras estn inmovilizadas en una repeticin geomtrica sobre una membrana de nailon o de nitrocelulosa. El nombre del ensayo deriva de la forma de cada muestra sobre la membrana. Cuando se aplican las muestras a mano, la forma es ms fortuita (mancha). Con la utilizacin de instrumentos de vaco, disponibles comercialmente. las muestras se aplican utilizando la succin, la forma de la muestra es ms regular, redonda (punto) o alargada (muesca). La matriz slida permite que mltiples muestras sean procesadas simultneamente a travs de todos los pasos del ensayo. El hecho de que estn expuestos todos los controles y muestras a exactamente los mismos reactivos y condiciones aumenta la estandarizacin del ensayo. La prolongacin de la preparacin de la muestra varia desde la purificacin completa de los cidos nucleicos, antes de su aplicacin al filtro, a la aplicacin directa de una muestra no purificada. El ensayo tolera algn grado de degradacin de la muestra. Los cidos nucleicos purificados tienen la ventala de que estn muy dispuestos a la interaccin con la sonda y no tienen apenas problemas con el fondo. Sin embargo, la purificacin individual de la prueba consume mucho tiempo y el trabajo es intensivo. Los mtodos que utilizan la aplicacin directa de la muestra no purificada llevan el experimento a travs de un procedimiento abreviado de purificacin que incluye, normalmente, la lisis y la desnaturalizacin, la digestin de la proteina y el lavado con detergente. Las ventajas de este mtodo son que se aplica a pequeas cantidades de material de partida y reduce el tiempo de preparacin de muestras. Sin embargo, la susceptibilidad final de la reaccin es ms baja y el fondo de las interacciones no especificas de las sondas puede hacer que el ensayo no sea fiable. L a interpretacin de los resultados de un ensayo de hibridacin mancha/punto es relativamente directa. Si ha tenido lugar la hibridacin se genera una seal en el punto especifico. Los resultados se pueden cuantificar. dependiendo de la marca utilizada para generar las seales, aunque normalmente se da una interpretacin simple de si o no (es decir, la muestra tiene ms o menos seal que las muestras contiguas y reconocen controles positivos y negativos). Suelen provocar errores de interpretacin las seales dbiles, que pueden ser el resultado de una cantidad muy pequea de dianas especficas o de una gran cantidad de dianas de reaccin cruzada dbiles. No hay informacin disponible sobre el tamao de los fragmentos que se hibridan. Se conoce como ensayo inverso de mancha/lineas de puntos a una variacin interesante del ensayo de mancha/punto. En este formato, que se aplica en situaciones en las que una muestra tiene que ser analizada con m u c h a s sondas diferentes y donde la muestra puede estar limitada, es la muestra la que porta la marca. Las sondas no marcadas o las dianas son fijadas a un soporte slido en repeticiones lineales o de matriz. Se identifican e interpretan las reas de formacin de hbridos especficos igual que en el ensayo estndar de mancha punto. Este lormato de ensayo es u n a forma til para identificar el producto de un ensayo de amplificacin (vide intra y Cap. 60), como en HLA (Bugawan, 1994) o para tipificar el papilomavitus humano (Gravitt, 1998), Hibridaciones Southern y Northern. Ambas hibridizaciones. Southern y Northern, combinan la separacin por electroforesis del cido nucleico a analizar, con su transferencia a un soporte slido y la hibridacin subsiguiente. Por tanto, este ensayo no slo da informacin sobre la presencia de hibridacin, sino que permite determinar el peso molecular de las especies hibridadas. Se dio el nombre de hibridacin de mancha Southern o manchas de Southern al procedimiento original en honor a su inventor, E M. Southern (Southern. 1975). En este ensayo, el cido nucleico a analizar es ADN, A la tcnica que utiliza ARN como cido nucleico a analizar se le dio, por analoga, el nombre de manchas Northern. (Y yendo an ms lejos con la analoga, las manchas western son un proceso similar en el que las protenas estn expuestas a la electroforesis y a la transferencia: a una mancha south-western se la ha descrito como una tcnica que mancha y separa al

gunla diagnstica especfica. No hay un ensayo perfecto, y a continuacin se describen, brevemente, varios de los formatos bsicos, con sus puntos fuertes y sus puntos dbiles especiales. Cada ensayo de hibridacin requiere controles positivos y negativos para su verificacin. Un control de muestras positivo es aquel que se sabe que contiene secuencias complementarias de la sonda. Se utiliza para establecer que la preparacin de la muestra es la adecuada para liberar la diana para el ensayo de hibridacin, y para garantizar que la sonda se hibridar con la diana especifica bajo las condiciones del ensayo. El control de muestras tambin se puede utilizar para montorizar la susceptibilidad del ensayo, si el control positivo se elige cerca de los lmites de deteccin ms bajos. Un control de muestras negativo (es decir, del que se sabe que no contiene secuencias complementarias de la sonda) se utiliza para montorizar la especificidad de las interacciones de la sonda diana. Los controles de la sonda incluyen secuencias de vectores o sondas marcadas no relacionadas, hibridadas y detectadas bajo las mismas condiciones del ensayo. Estos ltimos controles permiten la monitorizacin del fondo de la seal generada por la localizacin de la sonda a travs de interacciones no hibridadas, como carga o atrapamiento. En la prctica clnica se pueden emplear controles adicionales para montorizar cada paso del ensayo de hibridacin.

Hibridacin de fase lquida o solucin

En los ensayos de hibridacin lquida tanto la muestra como la sonda actan reciprocamente en solucin, lo que maximiza la cintica de la reaccin. Los cidos nucleicos de la muestra se purifican, generalmente, de protenas contaminadoras y de lpidos, que podran interferir en la obtencin de hbridos al final del ensayo, aunque el ensayo tolera alguna degradacin de la muestra. La muestra se desnaturaliza y se trocea al azar antes de aadirte la sonda de una hebra que no tiene capacidad de autohibridacin. Se puede detectar la hibridacin por la unin especfica de los hbridos a una matriz como la hidroxiapatita. que slo une estructuras dplex. Una vez que los hbridos estn unidos, la sonda no hibridada se puede eliminar eficientemente lavndola. La deteccin de la marca en la sonda ya unida permite la cuantificacin de la reaccin de hibridacin. En una variante de esta propuesta, un ensayo comercial (captura de hbridos) utiliza un anticuerpo especfico de ADN y ARN hbridos para unir especficamente estructuras dplex formadas de la diana de ADN y la sonda de ARN, Un anlisis alternativo incluye la digestin de la mezcla de reaccin de hibridacin con la nucleasa S1, que es una enzima que slo acta en el cido nucleico monohebra. Las estructuras dplex que son resistentes a la digestin pueden ser precipitadas por un tratamiento de cido tricloroactico. En el ensayo de proleccin por la hibridacin, la marca de la sonda est protegida de la degradacin qumica solamente cuando la sonda est insertada en una estructura dplex. En la actualidad se utilizan muchas otras variaciones del ensayo de hibridacin de fase de solucin. Lo que hace que este ensayo se adapte a las aplicaciones clnicas es la ptima cintica, la tolerancia a los pasos de purificacin abreviados y alguna degradacin de la muestra. Se puede conseguir la cuantificacin del producto de la reaccin, dependiendo del sistema de deteccin. El lormato de lase de solucin no permite la identificacin del tamao del producto hibridado. Las reacciones positivas bajas son difciles de interpretar, ya que los bajos niveles de las dianas especficas y los altos niveles de las dianas de reaccin cruzada dbiles darn resultados similares. La hibndacin en lase de solucin se puede adaptar al formato de 96 pocilios con un lector tipo del empleado en un ensayo mmunosorbente unido a enzima (ELISA), lo que permite anticipar un aumento de la automatizacin del ensayo.

Hibridacin de soporte slido

Las variaciones de los ensayos de hibridacin de soporte slido incluyen la hibridacin en puntos o por transferencia, la hibridacin Southern y Northern y la hibridacin m situ. En estos ensayos la hibridacin se produce en un ambiente bifsico, una fase slida (generalmente la muestra) y una fase lquida (generalmente la sonda). La cintica de la hibridacin de un cido nucleico unido a un soporte slido se retrasa enormemente y limita la extensin de la

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DIAGNSTICOS MOLECULARES: TCNICAS Y PRINCIPIOS BSICOS

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ADN seguida por la incubacin con soluciones de protenas, lo que permite la evaluacin de las protenas especficas de unin a ADN.) En estas dos ltimas tcnicas, la preparacin de muestras lleva mucho tiempo y el trabajo es intensivo. El ensayo no tolera la degradacin del cido nucleico de la muestra y requiere una cantidad relativamente grande de material de partida. En la hibridacin Southern, el ADN debe ser purificado con cortes mnimos. Esto se debe a que el tamao de los fragmentos se consigue a travs de la digestin con una o ms enzimas de restriccin. La degradacin y los cortes presentan roturas aleatorias en la muestra, lo que reduce la cantidad disponible para ser cortada especficamente en las secuencias de reconocimiento adecuadas. Las impurezas de la muestra pueden interferir con la actividad y la susceptibilidad de la secuencia de la enzima de restriccin. Las muestras digeridas parcial o inadecuadamente pueden producir tamaos de bandas espreos o dar como resultado una concentracin reducida de la banda especifica que ya no ser detectada durante la hibridacin. El material de partida para las hibndizaciones Northern es el ARN. y hay que tener un cuidado excesivo para evitar la degradacin durante la recogida y preparacin de las muestras, debido a la naturaleza ubicua de las RNasas. El ARN esta compuesto de fragmentos de tamaos determinados por la transcripcin y el procesamiento del ARN mensajero y ribosmico. No se digiere antes de la electroforesis, pero se separa bajo condiciones desnaturalizantes para eliminar la estructura secundaria. Los fragmentos separados por tamao en el gel de agarosa son luego transferidos a un filtro de nailon o de nitrocelulosa. La transferencia se produce de forma pasiva por la accin capilar, como se dise originalmente. En la mayora de las aplicaciones actuales se utiliza el vacio o la presin para acelerar la transferencia. Despus de ser transferidos, los cidos nucleicos estn inmovilizados por horneado o por uniones cruzadas generadas por luz UV y toda la membrana hibridada con sondas marcadas. A la hibridacin le sigue la deteccin por autorradiografia, colorimetria o quimioluminiscencia de bandas que contienen secuencias complementarias de la sonda. La interpretacin incluye la deteccin de las especies hibndadas y la determinacin del peso molecular de la molcula. Estos ensayos, tcnicamente muy exigentes, necesitan varios das para ser ejecutados, aunque pueden ser necesarios para aplicaciones clnicas en las que no se pueda obtener la informacin por medio de ningn otro formato. La presencia de bandas de pesos moleculares diferentes de muestras normales o de linea germinal (no alteradas por el desarrollo experimental) puede indicar un cambio en el material gentico. Hibridacin in sito. La hibridacin in situ es, simplemente, la deteccin de informacin gentica en un contexto morfolgico. Este tipo especializado de ensayo de soporte slido incluye el tomar tejidos morfolgicamente intactos, clulas o cromosomas adheridos a un portaobjetos de cristal de microscopio a travs del proceso de hibridacin. Se han aplicado mtodos de deteccin autorradiogrficos, colonmtricos y lluorescentes. La evaluacin del producto final es muy similar a la evaluacin de inmunoqumica, y es necesario tener experiencia en histopalologa. La fuerza de este mtodo recae en la unin de la evaluacin morfolgica microscpica con la deteccin de la hibridacin. Este mtodo tiene tambin aplicaciones en los anlisis citogenticos de cromosomas metalsicos esparcidos o de ncleos en mterfaz. La deteccin, en este contexto, se hace normalmente por fluorescencia, y a la tcnica se la denomina hibridacin in situ fluorescente (HISF). Se puede conseguir, rpidamente, la deteccin de aberraciones numricas o la translocacin de cromosomas utilizando sondas para dianas especificas. La HISF evita algunas de las dificultades de la citogentica convencional y puede tener una mayor susceptibilidad hacia algunas dianas. Aunque la HISF no puede reemplazar completamente a los canotipos, puede complementar y reducir la necesidad de la frecuencia de los anlisis citogenticos. Las nuevas variaciones de la HISF (Luke. 1998) explotan las posibilidades de automatizacin (HISF-rpida). y difusin de la informacin que se puede obtener de un solo ensayo. La FICTION (inmunofenotipado fluorescente y la citogentica de interfaz como una herramienta para la investigacin de neoplasmas) combina el inmunofenotipado con la HISF; la HISF de fibra hace posible el detectar y hacer un mapa de los puntos de rotura cromosmicos simultneamente. La HISF se explica con ms detalle en el Capitulo 62. La hibridacin in situ puede ser tediosa y de trabajo intensivo. Las recientes mejoras han dado como

resultado el procesamiento automatizado de portaobjetos durante el ensayo y son muy prometedoras en cuanto a que esta tcnica se adopte ms ampliamente. Tecnologa de los chips de ADN. Se ha desarrollado una nueva variacin de hibridacin de soporte slido (Pease. 1994) Utilizando chips de alcona miniaturizados y sntesis de fase slida generada por luz. se han construido repeticiones densamente empaquetadas de oligonuclelidos unidos. Los chips, que contienen todas las combinaciones de oligonucletidos relativamente cortos (p. ej.. 65.536 combinaciones para un octmero). se pueden hibridizar a una muestra marcada por fluorescencia (un formato de ensayo inverso de hibridacin de puntos). La fluorescencia localizada ndica la presencia de una secuencia complementaria, y por el alineamiento de secuencias superpuestas se puede ejecutar un anlisis rpido de secuencias. Hay muchas variaciones sobre este tema, incluidos los portaobjetos de cristal (microrrepeticiones) o los filtros (repeticiones de filtros de alta densidad) con las dianas de ADNc inmovilizadas. Este tema se expone con ms detalle en el Capitulo 61.

Mtodos de amplificacin
Es prcticamente imposible leer cualquier revista mdica sin encontrarse con. al menos, una aplicacin de la tecnologa de la reaccin en cadena de la pohmerasa (PCR). La PCR ha cambiado para siempre el mbito de los problemas de investigacin, que pueden ser solucionados eliminando prcticamente el problema del tamao limitado de las muestras. Se ha reconocido la importancia y elegancia de este concepto concedindole el Premio Nobel de Quimica a su inventor. Kary Mulls, menos de 10 aos despus de la publicacin de la primera aplicacin prctica de la PCR (Saiki. 1985). Ahora hay otras metodologas que han dado como resultado la multiplicacin de las dianas, las sondas y las seales. Todas ellas se pueden agrupar bajo el epgrafe de tecnologas de amplificacin y se exponen en el Capitulo 60

Ensayos basados en los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin

Los ensayos de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin (PLFR) son conocidos como los ensayos que utilizan la propiedad de las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restriccin para demostrar las variaciones de los polimorfismos en la secuencia de ADN de dos muestras. El ADN genmico o el ADN producido por la PCR. es digerido por una enzima de restriccin y los fragmentos son analizados por la electroforesis en gel. seguido de la visualizaron de la banda o del anlisis de manchas Southern con una sonda especfica de sitio. Los cambios en la secuencia del ADN pueden dar como resultado la alteracin de la secuencia de reconocimiento de la enzima. Esta alteracin puede introducir sitios de enzimas de restriccin adicionales, eliminar sitios de restriccin o insertar o eliminar secuencias entre los sitios de restriccin. Estos cambios se vern reflejados en el cambio del tamao de la banda visualizada en un gel o hibndizando a la sonda especfica de sitio. No todos los cambios, por supuesto, se vern reflejados en una secuencia de reconocimiento alterada, por eso el tamao de la banda inalterado tiene que ser interpretado en el contexto de los marcadores y de las frecuencias conocidas de los polimorfismos en la regin En algunos ensayos, en cada muestra se produce la digestin de una o varias enzimas de restriccin antes del anlisis de manchas Southern. Esta propuesta es m u y til para los estudios de familia, c o m o se ve en la Figura 59-9. Se pueden utilizar los polimorfismos en el ADN estrechamente enlazados a un gen de la enfermedad para predecir la herencia del alelo alterado. Muchos marcadores son especficos de locus y existen mapas cromosmicos de estos marcadores. Para establecer marcadores allicos. estas regiones que tienen el mximo de vanaciones y el mximo de polimorfismos son las de ms fcil utilizacin. Las reas de secuencias repetitivas dentro del cromosoma, conocidas como nmeros variables de repeticiones en tndem, son algunos de los marcadores ms polimrficos, y pueden dar lugar a un patrn complejo de bandas o 'huella gentica". En los estudios de familias con enfermedades hereditanas (gentica clsica) y para identificar regiones del genoma

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR gentica molecular. Se denomina clonacin posicional y es un proceso que utiliza el anlisis de enlaces PLFR de familias que portan y expresan la enfermedad, para localizar marcadores polimrficos que se acercan cada vez ms y ms al gen de la enfermedad, hasta que ste es localizado al fin. Los marcadores polimrficos, fuertemente unidos, que tienden a segregarse con la enfermedad, se pueden utilizar en los anlisis diagnsticos, clnicamente tiles, antes incluso de que el gen est completamente caracterizado y de que la protena producto est finalmente idenlificada. En esta lnea, primero se desarrollan y utilizan los anlisis moleculares de diagnstico, que luego se sustituyen por mtodos ms simples y econmicamente ms efectivos, dirigidos al nivel del producto gnico, cuando se ha entendido por completo el resultado de la mutacin.

Ms all del diagnstico

Los anlisis moleculares tienen el potencial para desarrollar al mximo el papel del laboratorio en reas que van ms all del diagnstico de la enfermedad. El anlisis molecular de las mutaciones somticas del cncer tiene la posibilidad de proporcionar informacin sobre el pronstico, de aconsejar la eleccin de una terapia ptima y de montorizar la respuesta a la terapia. Ahora se estn examinando en varios tipos de malignidades las implicaciones del uso de marcadores moleculares para detectar clulas neoplsicas, en ausencia de evidencia clnica o morfolgica de la enfermedad, conocida como enfermedad mnima residual (vase Cap. 65). Esta propuesta de utilizar marcadores moleculares para detectar la enfermedad puede anticipar las consecuencias de los mtodos secundarios de la prevencin del cncer (seleccin) y la valoracin de suficiencia de la reseccin quirrgica (evaluacin de mrgenes). La terapia gnica para las enfermedades genticas hereditarias, as c o m o para el cncer, se est llevando a la prctica y est basada en el conocimiento detallado de la enfermedad subyacente. La monitorizacin de estos pacientes para conocer la presencia y la actividad del gen teraputico introducido aadir otro aspecto a la evaluacin de la enfermedad del laboratorio.

Figura 59-9. Ejemplo del anlisis de los polimorfismos de la longitud de los fragm e n t o s de restriccin (PLFR). (M = madre; P = padre; H = hijo.) (Por cortesa y adaptada de Piper MA, Unger ER: Nucleic Acid Probes: A Primer for Pathologists. Chicago, ASCP Press, 1989.)

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RELACIN DE LA ENFERMEDAD CON LA EVALUACIN EN LABORATORIO

Los captulos siguientes describen las aplicaciones actuales de los diagnsticos moleculares. Est claro que esta nueva tecnologa ha mpactado en todas la reas de diagnsticos del laboratorio. Los mtodos moleculares tienen tambin el potencial de redefinir la evaluacin de la enfermedad por el laboratorio, para incluir resultados ms all del diagnstico de la enfermedad.

Diagnstico molecular
Las ventajas del enfoque molecular para los diagnsticos se expondrn detallando cada aspecto de las aplicaciones actuales. Sin embargo, es m u y importante recordar que estos nuevos anlisis moleculares probablemente no sustituirn a los anlisis tradicionales en un futuro inmediato. El coste y la complejidad de esta tecnologa tienden a restringir sus primeras aplicaciones para situaciones diagnsticas especiales, donde la informacin obtenida no se poda proporcionar por ningn otro mtodo. El aumento de la automatizacin y los mtodos diseados comercialmente rebajarn los costes, reducirn el nivel de los tcnicos especializados que se precisan para realizar los anlisis y el resultado ser la integracin de la tecnologa molecular en la lnea central de los anlisis del laboratorio. En el centro de la explosin de informacin actual de la ciencia mdica est la deteccin de las mutaciones y su asociacin con la enfermedad y en muchas de las aplicaciones de los diagnsticos moleculares. La capacidad de localizar un gen responsable de una enfermedad sin conocer la protena producto es una de las consecuencias ms importantes de la revolucin de la

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Reaccin en cadena de la polimerasa y otras tecnologas de amp ificacin

James C. Zimring, M.D., Ph.D. Frederick S. Nolte, Ph.D. MTODOS DE AMPLIFICACIN DE LAS DIANAS Reaccin en cadena de la polimerasa Amplificacin mediada por transcripcin/amplificacin del cido nucleico basada en secuencias Amplificacin del desplazamiento de la hebra MTODOS DE AMPLIFICACIN DE SONDA Reaccin en cadena de la ligasa Tecnologa invasora/enzima de rotura 1291 1287 MTODOS DE AMPLIFICACIN DE SEALES ADN ramificado Ensayo de captura de hbridos CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA 1294 1294 1294

El desarrollo de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) por Mulls y otros colaboradores (Saiki. 1988) tue un hito en la biotecnologa y anunci el comienzo de los diagnsticos moleculares. Aunque la PCR es la estrategia de amplificacin del cido nucleico ms ampliamente utilizada, se han desarrollado otras estrategias, y algunas de ellas tienen propiedades y ventajas nicas en su gnero. Estas estrategias estn basadas en la amplificacin de las dianas, de las sondas y de las seales. En las secciones siguientes se exponen los ejemplos de cada una de ellas. Estas tcnicas tienen una sensibilidad sin igual en la medicina de laboratorio y han originado nuevas oportunidades para que el laboratorio clnico sea efectivo en el tratamiento de los pacientes, en las reas de las enfermedades infecciosas, en el cncer y en los desrdenes genticos.

MTODOS DE AMPLIFICACIN DE LAS DIANAS

Todos los sistemas de amplificacin de las dianas comparten ciertas caractersticas fundamentales. Son procesos mediados por enzimas en los que una sola enzima o mltiples enzimas sintetizan copias de un cido nucleico diana. En todas las tcnicas, los productos de la amplificacin estn especificados por 2 oligonucletidos cebadores que se unen a las secuencias complementarias en las hebras opuestas de las dianas de doble hebra. Todo el resultado de la produccin de millones a billones de copias de la secuencia a amplificar es cuestin de horas y, en cada caso, los productos de la amplificacin pueden servir como moldes para las rondas de amplificacin subsiguientes Debido a esto, todas estas tcnicas son sensibles a la contaminacin con productos moleculares de anteriores amplificaciones y pueden originar reacciones de falsos positivos. Sin embargo, se han desarrollado diseos de laboratorio especiales, prcticas y flujos de trabajo para reducir, a niveles aceptables, la posibilidad de reacciones de falsos positivos.

equimolar de desoxirribonucletidos trifosfato (dATP. dCTP. dGTP y dTTP). de MgCI , KCI y un tampn de Tns-HCI. Los dos cebadores flanquean a la secuencia que va a ser amplificada, suelen ser de menos de 100 bases y son complementarios a las hebras opuestas de la diana. Para iniciar una PCR se calienta la mezcla de la reaccin, para separar las dos hebras del ADN diana, luego se enfra para permitir a los cebadores que se anillen al ADN diana de forma secuencia-especifica. Despus, la ADN polimerasa inicia la extensin de cada cebador desde sus extremos 3 en direcciones opuestas. Los productos de la extensin de los cebadores se disocian de la diana de ADN mediante calor. Cada producto de la extensin, lo mismo que la diana original, puede servir como un molde para las rondas subsiguientes de anillamienlo y extensin del cebador. Un ciclo de PCR consta de tres etapas: desnaturalizacin, anillamiento y extensin. Los productos de la PCR se duplican, tericamente, despus d e cada ciclo. Por eso, despus de n ciclos de PCR la secuencia de la diana se puede amplificar 2" veces. Todo el procedimiento se lleva a cabo en un termociclador programable que controla con exactitud la temperatura a la que se producen las etapas, la cantidad de tiempo en el que se mantiene la reaccin a las diferentes temperaturas y el nmero de ciclos. Lo ideal es que despus de 20 ciclos de PCR. se consiga una amplificacin del orden de millones de veces y despus de 30 ciclos, una del orden de billones de veces. En la prctica, la amplificacin puede que no sea completamente eficiente, debido a errores en la optimizacin de las condiciones de la reaccin o a la presencia de inhibidores de la ADN polimerasa. En estos casos, la amplificacin total est mejor descrita por la expresin (1 + e)", donde e equivale a la eficiencia de la amplificacin (0<e<1) y n es el nmero total de ciclos
?

PCR transcriptasa inversa

La PCR, como se la describi originalmente, tue una tcnica para la amplificacin del ADN. La PCR transcriptasa inversa (PCR-TI) se desarroll para amplificar las dianas de ARN. En este proceso, primero se produce el ADN complementario (ADNc). a partir de dianas de ARN. por transcripcin inversa, y ms tarde se amplifica el ADNc por PCR. De acuerdo a la descripcin original, la PCR-TI emplea dos enzimas: una TI termolbil, como la transcriptasa inversa del virus de mieloblastosis aviario (VMA-TI). y una ADN polimerasa termoestable. La sntesis del ADNc debe producirse a temperaturas ms bajas, debido a los requisitos de temperatura de la enzima termolbil. Esto presentaba problemas en cuanto al anillamiento de cebadores no especficos

Reaccin en cadena de la polimerasa

La PCR es una sencilla reaccin qumica, in vitro. que permite la sntesis de cantidades esencialmente ilimitadas de una secuencia de un cido nucleico diana. Esto se hace a travs de la accin de una polimerasa de ADN que, bajo las condiciones adecuadas, puede copiar una hebra de ADN. En su forma ms simple, la PCR consiste en ADN diana, un exceso molar de 2 oligonucletidos cebadores, una polimerasa de ADN termoestable, una mezcla

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR El concepto bsico detrs de la PCRc es la coamplifcacin en el mismo tubo de reaccin de dos moldes diferentes de longitud igual o similar y con las mismas secuencias de unin de cebadores. La garanta de la eficiencia de la ampliacin y la idntica termodinmica se debe a que ambos moldes se amplifican con el mismo par de cebadores. Se debe conocer la cantidad de uno de los moldes y. despus de la amplificacin, se tienen que poder distinguir los productos de ambos. En la PCRc se han utilizado diferentes tipos de competidores, pero, en general, aquellos que actan de una manera ms eficiente son los que tienen un tamao similar y una composicin de bases igual a la diana. Para acometer el problema de la eficiencia variable de la TI, en las PCR-TI cuantitativas se deberan utilizar competidores de ARN. El rendimiento del producto de la PCR est descrito por la ecuacin Y = /(1+e)\ donde Y es la cantidad de producto PCR, / es la cantidad de molde al principio de la reaccin, e es la eficiencia de la reaccin y n es el nmero de ciclos. Esta ecuacin, para la PCRc, est escrita para ambas muestras y es como sigue: competidor. Y = 4(1 + e) ; y diana, V, = f,(1 + e) . Dado que e y n son iguales para el competidor y la diana, el ndice relativo del producto Y,IY, depende directamente de su ndice de concentracin inicial l ll. y la funcin. V /y, = l U es lineal.
n n c c c c r

y a la extensin ineficaz del cebador a causa de la formacin de estructuras secundarias de ARN. Estos problemas se han superado con creces por el desarrollo de una ADN polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus thermophilus. que bajo las condiciones adecuadas puede funcionar eficientemente como una TI y como una ADN polimerasa (Myers. 1991). Las PCR-TI que utilizan esta enzima son ms eficientes y especficas que los protocolos anteriores que utilizan enzimas de TI termolbil convencionales. Se pueden obtener equipos comerciales (Roche) que emplean PCR-TI de una sola enzima para la deteccin del ARN del virus de la hepatitis C (VHC) y para determinar la cantidad del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-11 y de ARN-VHC en muestras clnicas.

PCR anidada
La PCR anidada se desarroll para aumentar tanto la sensibilidad como la especificidad de la PCR (Haqqi, 1988). Emplea dos pares de cebadores de amplificacin y dos rondas de PCR. Por lo general se utiliza un par de cebadores en la primera ronda de PCR de 15 a 30 ciclos. Los productos de la primera ronda de amplificacin estn sujetos, despus, a una segunda ronda de amplificacin utilizando la segunda serie de cebadores, que anillan en una secuencia interna a la secuencia amplilicada por la primera serie de cebadores. El aumento de la sensibilidad proviene del alto nmero total de ciclos y el aumento de la especificidad proviene del anillamiento de la segunda serie de cebadores a las secuencias que slo se hallan en los productos de la primera ronda. El alto ndice de contaminacin, que puede darse durante la transferencia de los productos de la primera ronda al segundo tubo para la segunda ronda de amplificacin, es la mayor desventaja de la PCR anidada. Esto se puede evitar bien por la separacin fsica de las muestras de la primera y de la segunda ronda, con una lmina de cera o de aceite, o bien diseando protocolos de amplificacin de un solo tubo. En la prctica, raramente se requiere para las aplicaciones clnicas el aumento de la sensibilidad que proporcionan los protocolos de la PCR anidada, y generalmente se confirma la identidad de un producto de amplificacin, hibridndolo con una sonda de cido nucleico.

En teora, para cuantificar una cantidad desconocida de dianas sin tener que utilizar una curva patrn es suficiente una sola concentracin de competidor. Sin embargo, generalmente se ejecuta la PCRc que utiliza vanas concentraciones de competidores dentro de la esperada y amplia concentracin de la diana, ya que el anlisis de dos especies de moldes presentes en una muestra, en cantidades enormemente diferentes, puede ser difcil e impreciso en la prctica. Por otro lado, este mtodo no proporciona resultados ms exactos que la utilizacin de una sola concentracin de competidores, segn recientes estudios de diferentes mtodos para la estandarizacin de la PCRc (Haberhausen, 1998). Los ensayos de la PCR cuantitativa para el citomegalovirus (CMV), el VIH-1 y el VHC (Sistemas Moleculares Roche), comercialmente disponibles, utilizan todos ellos una sola concentracin de un competidor para determinar la concentracin inicial de la diana.

PCR en tiempo real PCR mltiple

En la PCR mltiple estn incluidas en la misma mezcla de reaccin dos series, o ms, de cebadores, diseados para la amplificacin de diferentes dianas (Chamberiain, 1988). Con esta tcnica se puede co-amplificar en un solo tubo ms de una secuencia diana en una muestra clnica. Los cebadores que se utilizan en las reacciones mltiples deben ser cuidadosamente seleccionados para que tengan temperaturas de anillamiento similares y carezcan de complementariedad. Las PCR mltiples son ms complicadas de desarrollar y tienen menos sensibilidad que las reacciones de la PCR donde se usa una sola pareja de cebadores, pero permiten detectar mltiples dianas en una sola muestra en una reaccin. La PCR en tiempo real describe los mtodos por los que la deteccin y la amplificacin de la diana se producen simultneamente en el mismo tubo. Estos mtodos precisan de termocicladores especiales de precisin ptica, que son capaces de montorizar la emisin de fluorescencia de los pocilios de muestras. El software del ordenador que da soporte a los termocicladores monitoriza los datos, durante toda la PCR, de cada ciclo y genera un campo de amplificacin en cada reaccin. En su formato ms simple, el producto de la PCR es detectado al mismo tiempo que se produce, utilizando colorantes fluorescentes que se unen, preferentemente, al ADN de doble hebra. Uno de los colorantes que se utilizan en esta aplicacin es el SYBR Green I (Morrison, 1998). La fluorescencia es relativamente baja en el estado de no ligado, pero cuando se u n e al ADN de doble hebra, la fluorescencia se amplifica enormemente. El colorante unir a los productos especficos y no especficos de la PCR. Se puede incrementar la especificidad de la deteccin mediante un anlisis de la curva de separacin. El producto especfico amplificado tendr un pico de separacin caracterstico en su temperatura de separacin prevista (TJ, mientras que los dmeros cebadores y otros productos no especficos tendrn una T, diferente o darn unos picos ms amplios (Ririe, 1997). Tambin se puede incrementar la especificidad de la PCR en tiempo real incluyendo sondas de hibridacin en las mezclas de las reacciones. Estas sondas estn marcadas con colorantes fluorescentes o con combinaciones de fluorescencia y un colorante aplacador. En el ensayo de la PCR de nucleasa 5' (Taqman). la actividad 5' a 3' exonucleasa de la ADN polimerasa Taq se utiliza para cortar una sonda de hibridacin que es incapaz de alargarse durante la primera fase de alargamiento de la PCR (Holland, 1991). Este mtodo utiliza sondas de hibridacin fluorognicas de mareaje dual. U n colorante fluorescente sirve como reportero y su espectro de emisin es aplacado por el segundo colorante fluorescente. La degradacin de la sonda de hibridacin por la nucleasa libera al colorante reportero, y el resultado es un aumento del pico de emisin de fluorescencia. El aumento de la

PCR y PCR-TI cuantitativas

Puede existir una relacin lineal entre la cantidad de molde inicial y la cantidad de producto de la amplificacin. Sin embargo, ya que la cantidad final de producto de la PCR depende de la amplificacin exponencial de la cantidad inicial de molde, pequeas diferencias en la eficiencia de la ampliacin pueden conducir a enormes diferencias imposibles de predecir en el rendimiento del producto final (Clementi, 1993). Las diferencias tubo-a-tubo pueden depender de la preparacin de la muestra y de los procedimientos de purificacin del cido nucleico, de la presencia de inhibidores y de la actuacin del termociclador. Por estas razones, la simple cuantificacin del producto amplificado y la utilizacin de curvas de referencia de patrones externos no proporcionan una cuantificacin exacta del molde que estaba inicialmente presente en la muestra. Se han desarrollado varias estrategias basadas en la PCR para cuantificar exactamente las dianas de ADN y de ARN en muestras clnicas. Est generalmente aceptado que un mtodo de PCR competitivo (PCRc) es el ms fiable y robusto.

CAPTULO 60

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGAS DE AMPLIFICACIN

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emisin fluorescente indica que se ha obtenido el producto de la PCR especifico y que la intensidad de la fluorescencia es relativa a la magnitud del producto (Heid, 1996) La base de otro mtodo de PCR en tiempo real es la transferencia de energa por resonancia de fluorescencia (TERF) (Lay, 1997). Este mtodo necesita dos sondas de oligonucletidos especficos de secuencia especialmente diseadas. Estas sondas de hibridacin estn diseadas para hibridarse. una al lado de la otra, en la molcula del producto. El extremo 3' de una sonda est marcado con un colorante donador y el extremo 5' de la otra sonda est marcado con un colorante aceptador mediante un proceso denominado TERF. El colorante aceptar excitado emite luz en una longitud de onda ms larga que el colorante donador no unido, y la intensidad de emisin de luz del colorante aceptador es proporcional a la magnitud del producto de la PCR. Tambin se puede realizar la deteccin y la cuantificacin en tiempo real del producto de la PCR, utilizando guas moleculares (Tyagi, 1998). Las guas moleculares son sondas de oligonucletidos en forma de horquilla con un fluorforo aplacado internamente cuya fluorescencia se restablece cuando se unen a un cido nucleico diana. Estn diseadas de tal manera que la porcin del asa de la molcula de la sonda es complementaria a la secuencia de la diana. El tallo se forma por el anillamiento de secuencias de brazos complementarias en los extremos de la sonda. Un colorante fluorescente est insertado en un extremo de un brazo y una molcula aplacadora est insertada en el extremo del otro brazo. El tallo mantiene en contacto al fluorforo y al aplacador, de modo que no se produce ninguna emisin de luz. Cuando la sonda encuentra una molcula diana, forma un hbrido ms largo y ms estable que el tallo y sufre un cambio de conformacin que obliga al tallo a abrirse, lo que hace que el fluorforo y el aplacador se alejen el uno del otro, restablecindose la fluorescencia. Los mtodos de la PCR en tiempo real disminuyen el tiempo que se requiere para los ensayos de cido nucleico, debido a que no existen etapas de procesamiento post-PCR. Adems, y dado que la deteccin y la amplificacin tienen lugar en el mismo tubo cerrado, estos mtodos eliminan las manipulaciones postamplificacin, que pueden dar lugar a la contaminacin del laboratorio con el producto de amplificacin. Ms an, los mtodos de la PCR en tiempo real se prestan a las aplicaciones cuantitati-

vas, porque el anlisis se ejecuta en la fase temprana del registro de acumulacin del producto.

Amplificacin mediada por transcripcin/ amplificacin del cido nucleico basada en secuencias
La amplificacin mediada por transcripcin (AMT) y la amplificacin del cido nucleico basada en secuencias (AANBS) son dos tcnicas isotrmicas de amplificacin del cido nucleico, aunque en la prctica son ligeramente distintas, cuyo concepto es exactamente igual, por lo que se describen juntas (Kwoh, 1989; Compton. 1991). Esencialmente, estas tcnicas resumen el ciclo de vida del retrovirus n vilro convirtiendo el ARN en ADN y utilizando luego el ADN como molde para la transcripcin de copias mltiples de ARN. El proceso comienza cuando una diana de ARN. que en la mayora de los casos existir como una entidad de una sola hebra (Fig. 60-1, etapa 1), elimina la necesidad de desnaturalizacin termal del molde antes de la amplificacin. Un cebador de ADN especfico de secuencia se une a la diana de ARN (Fig. 60-1. etapa 2). Luego la transcriptasa inversa prolonga el cebador, creando un heterodplex de ADN-ARN (Fig. 60-1. etapa 3). El extremo 5' del cebador especifico de secuencia no es complementario a la diana; ms bien contiene al promotor de una T7 polimerasa bacterilaga. La presencia de este promotor T7 en el extremo 5' del cebador da como resultado la sntesis de una hebra de ADN complementaria a la diana inicial de ARN que contiene al promotor T7 en su extremo 5'. En el caso de la AMT, la enzima transcriptasa inversa degrada el molde inicial de ARN al mismo tiempo que sintetiza su ADN complementario. En la AANBS. una enzima separada. ARNsa H. degrada al molde inicial de ARN. La ARNsa H rompe selectivamente el ARN, que forma estructuras heterodplex con el ADN. pero no al ARN solo (Fig. 60-1, etapa 4). En ambos casos, el T7 que contiene ADN complementario es liberado de su ARN asociado, liberndolo para unirse a un segundo molde, que se une al extremo 3' de la molcula de ADN (Fig. 60-1, etapa 5). La ADN polimerasa se prolonga desde este segundo molde, dando como resultado la sntesis de una molcula de ADN de doble hebra que contiene un promotor T7 intacto. (Fig. 60-1, etapa 6).

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SECCIN Vil

PATOLOGA MOLECULAR tas endonucleasas de restriccin, que precisan, en su sitio de reconocimiento, de un dATP autntico. El cebador est diseado para contener, justamente, este sitio de reconocimiento, en este caso un sitio de Hinc II. La digestin del sitio de restriccin da como resultado una muesca en el cebador, pero deja al dATP[a-S] que contiene la hebra intacto (Fig. 60-2, paso 5). La muesca en el extremo 5' del cebador que contiene la hebra permite que la ADN polimerasa se alargue desde el sitio de la muesca en direccin 3 . desplazando al ADN, previamente sintetizado, segn se va alargando (Fig. 60-2, paso 6) En esta etapa, se utiliza el fragmento Klenow mutado de la ADN polimerasa I, que est perdiendo su actividad 5' a 3' exonucleasa. para que la hebra desplazada contine intacta. A la vez que el alargamiento desde el sitio de la muesca desplaza a la hebra existente, regenera un sitio de restriccin intacto. La presencia de dATP[i/.-S] en posicin 5 del sitio de restriccin restablecido no inhibe las digestiones subsiguientes por Hinc II. Por tanto, se puede producir una segunda digestin que regenere una muesca, y de esta manera se produce un sustrato para un segundo desplazamiento de la ADN polimerasa. Este proceso contina de forma cclica y da como resultado la amplificacin de la ADN diana. Para obtener una amplificacin exponencial, se utilizan dos cebadores, uno para cada hebra. En este caso, el producto del desplazamiento del cebador 1 hbrida al cebador 2 y genera un nuevo ADN de doble hebra con hemifosforotioato, que puede generar sus propios productos de desplazamiento, los cuales a su vez rehibridan al cebador 1, dando lugar a una amplificacin exponencial (Fig. 60-3). La metodologa inicial de la ADH tiene bastantes limitaciones, incluyendo la necesidad de la digestin de restriccin de la muestra, antes de la amplificacin de la diana, y que el producto de la amplificacin no contenga el m i s m o sitio de restriccin que el se ha utilizado para la digestin del cebador. Para superar la primera de estas limitaciones, se desarroll un sistema inteligente que utiliza cuatro cebadores para definir una regin diana. Para hacer ms fcil la explicacin, se expondr por etapas amplias, enfocndolo primero hacia una sola hebra. Claro que. en realidad, el resultado de este sistema es un proceso dinmico, con muchos procesos que suceden simultneamente. En este procedimiento, el ADN no digerido es separado (Fig. 60-4, paso 1), y un cebador igual al que se describe en la Figura 60-2 hbrida a su regin diana en el ADN (Fig. 60-4, paso 2). El extremo 3 del cebador que hibnda al molde es alargado, luego, a lo largo del molde por la ADN polimerasa, c o m o se ha descrito previamente (Figura 60-4, paso 3). En este caso, y dado que el ADN no ha sido digerido el extremo 5' del cebador no es un extremo saliente, sino que est simplemente no hibndado. Por esta causa, el extremo 5 del cebador no est sellado por la ADN polimerasa. En este punto, el segundo cebador hbrida hacia arriba (como las aguas de un ro) al primer cebador, lo que permite a la ADN polimerasa alargarse desde l en direccin 3 y desplazar a la hebra que contiene al primer cebador (Fig. 60-4, pasos 4 y 5). Tambin estn presentes otro par de cebadores, diseados para ejecutar la m i s m a tarea en la hebra opuesta. La amplificacin exponencial se produce a lo largo de las lneas, como se muestra en la Figura 60-3. debido a que los productos de un par de cebadores sirven como molde para el segundo par de cebadores. En realidad, lo que ocurre en el tubo de ensayo es ms complicado que todo esto, en l se forman vanos subproductos tericos a lo largo del proceso; sin embargo, aqu se describen los productos mas importantes del sistema. Las aplicaciones clnicas de la ADS incluyen la deteccin directa en muestras clnicas de M. tuberculosis, C. trachomatis y N. gonorrhoeae. La ADH ha demostrado tener una susceptibilidad lo suficientemente alta como para delectar slo de 10 a 50 copias de una molcula diana (Walker, 1992a). Utilizando una serie de cebadores diseados para amplificar una secuencia repetitiva, con 10 copias en el genoma de M. tuberculosis, el ensayo es tan susceptible que es capaz de detectar de una a cinco copias del genoma de la bacteria. La ADH ha sido adaptada, recientemente, para cuantificar ARN, aadindole una etapa de transcriptasa inversa (TI-ADH). En este caso, un cebador hbrida a la ARN diana y una transcriptasa inversa sintetiza a un ADNc. Este ADNc sirve luego como molde para la incorporacin del cebador y el desplazamiento de la hebra. Los productos del desplazamiento de esta hebra se alimentan despus en el lugar de la amplificacin descrito anteriormente. Se ha utilizado la TI-ADH para la determinacin de la carga viral del VIH (Nycz. 1998).

Esta molcula de ADN puede servir ahora como sustrato para la polimerasa T7. una enzima bacterifaga que reconoce especficamente al promotor 17 y que sintetiza copias mltiples de ARN (Fig. 60-1, etapa 7). Cada una de estas molculas de ARN, recientemente sintetizadas, es antisentido a la diana inicial, lo que les permite hibridar al segundo molde. Luego, la transcriptasa inversa, el segundo cebador, la ARNsa H y la ADN polimerasa utilizan esta molcula de ARN antisentido como un molde para sintetizar nuevos cebadores de ADN de doble hebra, quienes a su vez expresan ms molde de ARN. Asi, de esta lorma se produce una amplificacin exponencial. La A M T y la AANBS tienen algunas ventajas que las diferencian de otras tcnicas de amplificacin del ARN. Quiz la ms significativa de estas ventajas es que no se necesita la desnaturalizacin inicial para que se produzca la amplificacin. Por tanto, las secuencias de ADN de doble hebra no se separan nunca y por eso no son capaces de unirse a los cebadores en la reaccin. La contaminacin del ADN puede ser esencialmente problemtica cuando se utilizan tcnicas, como la PCR, para los ensayos de los transcritos del ARN de los genes retrovirales o de los genes eucariotas sin intrones. La AMT y la AANBS eliminan el problema de la contaminacin del ADN dando una determinacin falsamente elevada de ARN. Una segunda ventaja es que esta tecnologa utiliza procesos isotrmicos, lo que hace innecesario el uso de termocicladores muy sofisticados. Combinando esta tecnologa con guias moleculares o con otras sondas especificas de secuencia, que se pueden aadir directamente a la mezcla de la amplificacin, se crea un sistema de tubo cerrado que ayuda a prevenir la contaminacin cruzada con productos de amplificacin en el laboratorio. La AMT y la AANBS se han aplicado con xito en una amplia gama de sistemas de ensayo. Se han utilizado para detectar varios patgenos, incluyendo a virus, como el VIH, el VHC, el de la varicela, el virus zster, los citomegalovirus (CMV), el rinovirus, el del sarampin y el papilomavirus. y a bacterias, como Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae y Campylobacter ejuni. Adems, esta tecnologa ha cuantificado la carga viral del VIH y del VHC. Tambin se han realizado anlisis de genes, como la tipificacin del HLA y la mutacin del factor V de Leiden. En resumen, la AMT y la AANBS son tcnicas de amplificacin de ARN isotrmicas, con amplias aplicaciones y ventajas nicas sobre otros mtodos de amplificacin, en especial para la eliminacin de los problemas de contaminacin y, en particular, para aquellos relacionados con los genes sin intrones y los retrovirales. La combinacin de estas tcnicas con sondas fluorescentes permite la amplificacin en tiempo real, en tubo cerrado y en una etapa, sin necesidad de termocicladores.

Amplificacin del desplazamiento de la hebra

La amplificacin del desplazamiento de la hebra (ADH) es una tcnica isotrmica de amplificacin del molde que puede ser utilizada para detectar los rastros de ADN o de ARN en una secuencia especfica. La ADH, segn se la describi al principio, era un proceso de amplificacin conceptualmente directo y con algunas limitaciones tcnicas (Walker, 1992a. 1992b). Sin embargo, desde entonces ha evolucionado, y se ha convertido en una herramienta muy verstil que es tcnicamente simple, aunque conceptualmente compleja. Para explicar la ADH. primero hay que hablar de las metodologas iniciales y despus rastrear el desarrollo de la tecnologa ADH actual. El proceso de la ADH. segn se describi al principio, empieza con una digestin de restriccin de la muestra de ADN para generar un fragmento de ADN que ha reconocido los extremos 3' y 5' (Fig. 60-2. paso 1). Este ADN digerido es separado luego (Fig. 60-2, paso 2) por la presencia de un cebador cuyo extremo 3' hbrida al extremo 5' del ADN diana (Fig. 60-2. paso 3). El resultado es un fragmento de ADN con un extremo saliente 5' a ambos extremos. Luego, la ADN polimerasa se alarga desde el cebador, para sellar el fragmento de una sola hebra de la diana, y se alarga desde el molde, para sellar el Iragmento de una sola hebra del cebador (Fig. 60-2, paso 4). Esta sntesis del ADN se produce en presencia de dCTP. dGTP, dTTP y de desoxiadenosina 5-[t/.-thio) trifosfato (dATP[u-S]). La incorporacin de dATP (a-S) da como resultado una nueva hebra de ADN sintetizada (representada por lineas pespunteadas) que no puede servir como sustrato para cier-

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Digestion de restriccin Paso I Paso 2 p 3 S G-T-T-G-A-C '' La mayor ventaja de la ADH es que es un proceso isotrmico que, a dife3' rencia de la PCR. se puede ejecutar5 a' una mis ma|temperatura e; [ , \ (- despus de la desnaturalizacin inicial de la sonda. proceso elimina aso4 r Este __( \ \ < l . la necesidad de utilizar termocicladores caros. Otra de las ventajas s es s que las muestras se pueden someter a la ADH en un solo tubo, con tiempos de amplificacin que varan de 30 minutos a dos horas, La mayor desventaja de la ADH es el hecho lime II I de que, al contrario que la PCR, por la temperatura relativamente baja a la . 5' i i i i ii \ r que se realiza la ADH Maso* el resultado puede V _ _ ser la\ hibridacin \ , i , del cebador no S S especfico a secuencias que se hallan en las mezclas complejas, como el ?dianas, en ADN genmico. Es por eso que cuando hay poca abundancia de comparacin ai ADN de fondo, los productos 5' lde l a I amplificacin K i A I - no especfi6 r - - C\- \ - t -1 -G de esta tcnicos pueden anegarPaso el sistema, disminuyendo la susceptibilidad s ca Sin embargo, este problema se ha mitigado s mucho por la utilizacin de o solventes orgnicos que aumentan la astringencia a bajas temperaturas, y por la reciente introduccin de polimerasas ms termoestables capaces del desplazamiento de la hebra.
a s o
(

; ^ Molde desnaturalizado 5-

5' Reaccin en cadena de la ligasa '

En una reaccin en cadena 5' de la ligasa estndar (RCL), las sondas de 2oligonucletido se hibridan una junto a la otra en cada una de las hebras de ADN desnaturalizadas de dianas, de forma que se produce una "muesca". Una ADN ligasa termoestable sella la "muesca" uniendo el extremo 3' de una ^ sonda al extremo 5' de la otra. Cada producto ligado, as como la diana origi^' nal, sin/en de molde en yrondas subsiguientes de desnaturalizacin, anillamiento y el ligado, y el resultado es una acumulacin de productos exponencial +(Wu. 1989; Barany. 1991).

Una modificacin de esta tcnica, denominada espaciada RCL (G-RCL), y en que despus del anillamiento de las sondas al difiere de la RCL estndar molde se forma un pequeo hueco. Este hueco es rellenado por una ADN polimerasa termoestable y la muesca que se produce es ligada por una ADN ligasa + (Birkenmeyer. 1991). Aunque la RCL es til y se automatiza con facilidad, puede resultar difcil controlar la contaminacin por los productos del 5' G-T-T-G-A -C ligado. Hay en el mercado un equipo de combinacin G-RCL (Abbol) para Paso 7 r - - C-A-A-C-T-G 5' detectar en las muestras clnicas C. Irachomalis y N. gonorrhoeae. Figura 60-2. Representacin por medio de un di agrama de la ADH de una hebra. (Por cortesa y adaptada de Walker GT, Little MC. Nadeau JG: Isothermal m vitro ampliMTODOS DE AMPLIFICACIN DE SONDA fication ol DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc Natl Acad Sci USA. 1992b: 89:392-396.) (Vase texto para ms detalles.)
s y

Tecnologa invasora/enzima de rotura

Los mtodos de amplificacin de sonda difieren de los mtodos de amplificacin de diana en que los productos de la amplificacin contienen slo una secuencia presente en las sondas iniciales Los ejemplos de mtodos de amplificacin de sonda, con potencial comercial, son la reaccin en cadena de la ligasa (Wu, 1989), replicasa Qbeta (Kramer, 1989) y la tecnologa de enzima de rotura/invasora (Lyamichev, 1999). Sin embargo, slo se desarrolla comercialmente la tecnologa enzima de rotura/invasora y la reaccin en cadena de la ligasa. Los ensayos invasores son un mtodo de amplificacin de la sonda que se basan en el reconocimiento especfico y en la ruptura de estructuras de ADN particulares por miembros de la familia FEN-1 de las ADN polimerasas. Estas polimerasas rompern el extremo 5' saliente de una sola hebra de un dplex de pares de bases en forma de racimo (Fig. 60-5). Esta actividad enzimtica juega, probablemente, un papel esencial en la eliminacin de estructuras de cido nucleico complejas que afloran durante la replicacin y la reparacin del

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

5'-

Figura 60-3. Representacin por medio de un diagrama de la amplilicacin exponencial de la ADH de las dos hebras. (Vase texto para ms detal les.)

ADN. Dado que estas estructuras pueden darse en cualquier sitio del genoma replicante, la enzima reconoce la estructura molecular del sustrato sin tener en cuenta a la secuencia de los cidos nucleicos que construyen el complejo de ADN (Lieber, 1996). Esta actividad enzimtica ha demostrado ser una

herramienta muy til en los anlisis de ADN y es la base de los ensayos invasores. El ensayo invasor se basa en el hecho de que sintetizando sondas de A D N de una sola hebra superpuestas que pueden hibridar a una diana especfica,

Figura 60-4. Representacin mediante un diagrama de la reaccin de la ADH de un cebador dual. (Vase t e x t o para ms detalles.)

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ductos de ruptura de una sola molcula diana. Por esle motivo, se puede efectuar el ensayo invasor bajo condiciones isotrmicas, eliminando la necesidad de utilizar cualquier termociclador. La lectura del ensayo de ruptura depende de la capacidad para cuantificar y detectar especficamente al producto de la ruptura. Se pueden utilizar varios mtodos de deteccin. Third Wave Technologies ha desarrollado esta tecnologa, que comercializa un sistema para generar una lectura lluorescente de productos de ruptura especficos. Se han desarrollado varios ensayos invasores, incluyendo la mutacin del factor V Leiden, la cuantificacin del ARNm de citocmas y la deteccin del Slaphylococcus aureus resistente a meticilina. de la hepatitis B, del CMV y de puntos de mutaciones en genes humanos, como el ApoE (Rossetti, 1997: Ryan. 1999). El ensayo invasor tiene varias ventajas aadidas. Esta tecnologa se puede adaptar fcilmente para detectar puntos de mutacin de inters, diseando una regin solapante que rodee a la mutacin que ha de ser detectada, debido a que el solapamiento de la sonda mvasora slo necesita ser de un par de bases. La deteccin de estos puntos de mutacin no requieren de digestin de restriccin postreaccin, dado que los cebadores se rompern de forma diferencial en base a la presencia o ausencia de la mutacin en cuestin. Esto hace posible la localizacin de alelos mutantes asociados a las enfermedades hereditarias y mutaciones en patgenos asociadas a la resistencia, o la virulencia de los frmacos. Adems, y al contrario que las tcnicas de amplificacin, c o m o la PCR. la ADH y la AMT. en las que la secuencia diana se amplifica por ella misma, el ensayo invasor no aumenta el nivel de la secuencia de la diana. Por esta causa, el ensayo invasor es menos propenso a los problemas de falsos positivos ocasionados por la contaminacin cruzada del producto de amplificacin. Adems del ensayo invasor, tambin se puede utilizar el mtodo de ruptura para fabricar polimorfismos de la longitud de los fragmentos (de manera similar al polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin). Desnaturalizando el ADN genmico y enfrindolo rpidamente, se producen en el ADN estructuras secundarias de asas en lorma de horquilla que se reproducen velozmente y que pueden servir como sustrato para la ruptura. La digestin del ADN da como resultado un patrn preciso, que se ha utilizado con xito para el anlisis de la hepatitis C resistente al interfern-o. (Sreevatsan, 1998) y para detectar mutaciones especficas en los genes humanos (Rossetti, 1997). Esto ofrece un anlisis verstil del patrn de fragmentacin, debido al hecho de que las asas en forma de horquilla se producen con mucha mayor diversidad que la mayora de los sitios de reconocimiento de enzimas de restriccin.

Figura 60-5. Representacin grfica del complejo ternario reconocido mediante segmenlacin y los productos de la digestin producidos por la actividad de segmentacin.

creando la estructura reconocida por la ruptura, un miembro de la familia FEN-1 puede generar un producto de ruptura en respuesta a una diana especifica. Se disean dos cebadores que hibndan a la secuencia de la diana de manera superpuesta (Fig. 60-6). Bajo las condiciones adecuadas de anillamiento, el cebador 1 se puede fijar en la secuencia de la diana (Fig. 60-6. paso 1). El cebador 2 est diseado de tal forma que hbrida 3' al cebador 1 con una regin solapante entre el extremo 3 del cebador 2 y el extremo 5' del cebador 1. Bajo las condiciones adecuadas, el cebador 2 "invade" el sitio de unin del cebador 1, dando como resultado el desplazamiento equilibrado entre los cebadores (Fig. 60-6. paso 2). La ruptura slo romper los extremos salientes 5', por eso el extremo 5' del cebador 1 se rompe y se elimina (Fig. 60-6, paso 3). De esta manera, la secuencia de la diana acta como un andamio sobre el que se puede formar la estructura de ADN apropiada. La generacin de productos de ruptura indica la presencia de la diana, debido a que la estructura de ADN que se necesita para servir como sustrato de ruptura slo tendr lugar en presencia de la secuencia de la diana. La utilizacin de una enzima de ruptura termoestable permite que las reacciones transcurran a temperaturas suficientemente altas, de modo que, para poder existir, el cebador intercambie el equilibrio. Esto hace posible que se lormen mltiples pro-

Figura 60-6. Representacin mediante un diagrama del ensayo invasor. (Vase lexto para ms detalles.)

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR de 50 copias/ml. Hay, comercialmente disponibles, ensayos de ADNb para la cuantificacin del ADN del VHB, del ARN del VHC y del ARN del VIH-1 (Bayer). El Sistema 340, plataforma para el ensayo de ADNb. automatiza la incubacin, el lavado, la lectura y el procesamiento de datos.

Por eso se pueden utilizar nucleasas especificas de estructura para detectar dianas de cido nucleico en una secuencia especifica, que se emplean en los ensayos de puntos mulantes y que se aplican para generar diversos patrones de fragmentacin, que son capaces de distinguir genotipos complejos. Todas juntas, estas tecnologas aaden herramientas m u y poderosas a los anlisis de cidos nucleicos.

Ensayo de captura de hbridos

El sistema de captura de hbridos es un ensayo de captura de anticuerpos de hibridacin en solucin que utiliza la deteccin quimioluminiscente. El ADN diana en la muestra se desnaturaliza y se hbrida con una sonda de ARN especfica. Los hbridos de ADN-ARN son capturados por anticuerpos especficos de hbridos de ADN-ARN. con los que se recubre la superficie de un tubo. Los anticuerpos antihbridos acoplados a la fosfatasa alcalina unen a los hbridos inmovilizados. El anticuerpo de unin acoplado es detectado con un sustrato quimioluminiscente, y la luz que emite se mide en un luminmetro. La intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de ADN diana en la muestra. El ensayo de captura de hbridos para la deteccin de VPH (Cope, 1997) y del CMV (Mazzulli, 1999), en muestras clnicas, est disponible comercialmente (Digene).

MTODOS DE AMPLIFICACIN DE SEALES

En los mtodos de amplificacin de seales no se aumenta la concenlracin de sondas o de dianas. El aumento de la susceptibilidad analtica procede del aumento de la concentracin de molculas marcadas adheridas al cido nucleico de la sonda. Para amplificar la deteccin de la sonda, se han utilizado mltiples enzimas, mltiples sondas, mltiples capas de sondas y se han reducido los ruidos del entorno (Kricka, 1999). Los sistemas de amplificacin de las dianas tienen, generalmente, una mayor susceptibilidad analtica que los mtodos de amplificacin de seales, pero el desarrollo tecnolgico, especialmente en los ensayos de ADN ramificado, ha rebajado los limites de deteccin, en algunas aplicaciones, a niveles que pueden rivalizar con los ensayos de amplificacin de las dianas (Kern, 1996). Los ensayos de amplificacin de la seal tienen diversas ventajas sobre los ensayos de amplificacin de la diana. En los sistemas de amplificacin de la seal no se altera el nmero de las molculas diana, y el resultado es que la seal es directamente proporcional a la magnitud de secuencias de la diana, presentes en la muestra clnica. Esto reduce la preocupacin por los falsos positivos, debidos a la contaminacin cruzada, y simplifica el desarrollo de los ensayos cuantitativos. Puesto que los sistemas de amplificacin de la seal no dependen de procesos enzimticos para amplificar las secuencias de la diana, no se ven afectados por la presencia de inhibidores de enzimas en las muestras clnicas. Por consiguiente, se pueden utilizar menos mtodos difciles de extraccin del cido nucleico. Clsicamente, los sistemas de amplificacin de la seal utilizan sondas ms grandes o mayor cantidad de sondas que los sistemas de amplificacin de la diana y. en consecuencia, son menos susceptibles a los errores producidos por la heterogeneidad de la secuencia de la diana. Finalmente, el ARN puede ser medido directamente sin la sntesis de un ADNc intermediario.

CONCLUSIONES
En este captulo hemos proporcionado las bases para comprender los principios que subyacen en los mtodos de amplificacin de los varios cidos nucleicos y su fuerza y sus limitaciones relativas. La tecnologa ya ha tenido un tremendo impacto en el diagnstico de las enfermedades infecciosas y en los desrdenes genticos, y promete revolucionar la atencin y los diagnsticos de los pacientes con cncer. El poder real de la tecnologa se basa en su capacidad para derribar las disciplinas tradicionales de la medicina de laboratorio. La compresin, por medio de los principios bsicos de la tecnologa de amplificacin del cido nucleico, es importante para todos los que estn involucrados en el ejercicio de la medicina de laboratorio, dado que es la tecnologa que representa el futuro de los laboratorios clnicos.

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ADN ramificado
El sistema de la amplificacin de la seal del ADN ramificado (ADNb) es un ensayo de hibridacin en sandwich de fase slida que incorpora series mltiples de sondas de oligonucletidos sintticos (Nolte, 1998). La molcula amplificadora es la base de esta tecnologa; es una molcula de ADNb con quince ramas idnticas, cada una de las cuales puede unir tres sondas marcadas. Se utilizan varias sondas especificas de secuencia para capturar al cido nucleico diana sobre la superficie de un pocilio de microltulo. Una segunda serie de sondas especficas de diana tambin se une a la diana. Las molculas pre-amplificadoras se unen a la segunda serie de sondas dianas y hasta a ocho amplificadoras de ADNb. Tres sondas marcadas de fosfatasa alcalina hibridan a cada una de las ramas de la amplificadora. Se consigue la deteccin de las sondas marcadas unidas incubando el conjunto con un sustrato activable por una enzima, dioxetano, y midiendo la emisin de luz con un luminmetro. La seal que se produce es directamente proporcional a la cantidad de sondas en la muestra. La cantidad de sondas en la muestra est determinada en una curva estndar externa. La hibridacin no especfica de cualquiera de las sondas de amplificacin y los cidos nucleicos no dianas conduce a la amplificacin de la seal del entorno. En los ensayos de ADNb de tercera generacin se introdujeron isocitidina (isoC) e isoguanosina (isoG) en las sondas de amplificacin para reducir la hibridacin potencial de todas las bases no diana y no naturales (Collins, 1995). Los pares de bases isoC e isoG mutuamente, pero no con cualquiera de las cuatro bases, se producen naturalmente (Piccirilli, 1990). En los ensayos de ADNb, la utilizacin de sondas de isoC y de isoG aumenta la amplificacin especifica de la sonda sin un aumento concomitante en el entorno, con lo cual se amplifican enormemente los limites de la deteccin. El lmite de deteccin del ensayo de ADNb de tercera generacin de' ARN VIH-1 es

CAPTULO 60

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA Y OTRAS TECNOLOGAS DE AMPLIFICACIN

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C A P T U L O

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Tecnologas de la hibridacin en serie

Jacques Schrenzel, M.D. Jonathan R. Hibbs, M.D. David H. Persing, M.D., Ph.D.
TECNOLOGAS DE LOS TIPOS DE HIBRIDACIN EN SERIE Macroseries Microseries Sustratos de microseries Fabricacin de microseries Microseries de oligonucletidos Microseries de ADNc Bioinformtica 1296 APLICACIONES CLNICAS DE LA TECNOLOGA DE LAS MICROSERIES Secuenciacin de las series Series de expresin BIBLIOGRAFA 1302 1299

TECNOLOGAS DE LOS TIPOS DE HIBRIDACIN EN SERIE

Desde hace muy pocos aos, la tecnologa de la hibridacin en serie, que hace posible la ejecucin de miles de reacciones de hibridacin simultneas en un sustrato slido sin un solo proceso analtico, ha pasado de ser una teora a ser una realidad prctica. Estas determinaciones, masivamente paralelas, ofrecen oportunidades, antes inimaginables, de aplicaciones diagnsticas, que van de la secuenciacin del gen y la deteccin de polimorfismos genticos a la medicin de los perfiles de expresin del gen en las clulas cancergenas. Las sondas moleculares estn unidas a una superficie slida, en las series definidas, para permitir la discriminacin espacial de las numerosas reacciones que se producen simultneamente. La hibridacin en serie es el equivalente molecular de una hoja de extensin, donde cada clula o direccin revela un dato especfico, que normalmente se deducen del enlace de un ligando a su diana especfica. Los primeros mtodos basados en las series fueron aprovechados en los ensayos de inmunidad (Ekins, 1987, 1999). Las series tambin han sido propuestas para estudios paralelos sobre diferentes molculas, como las protenas, los lpidos, los carbohidratos y las molculas pequeas (Fodor, 1991; Guschin, 1997: Pirrung. 1992: Schena. 1998; Southern, 1996a). Al igual que las interacciones antgeno-anticuerpo en las inmunoseries, el principio fundamental de las series de cidos nucleicos se basa en la deleccin de interacciones intermoleculares especficas. En las series de cidos nucleicos, esta complementariedad se deriva del apareamiento de bases de nucletidos de las dos hebras (hibridacin). Los estudios anteriores sobre la desnaturalizacin y reformacin del dplex, realizados en soluciones de cido desoxirribonucleico (ADN), han hecho posible vaticinar la cintica de la hibridacin y el punto de fusin de los productos, como una funcin de la composicin del cido nucleico y de la concentracin de sal, Muchos de los primeros trabajos en este campo estn ligados al uso de membranas de nilrocelulosa (Gllepsie, 1965) en puntos/manchas (Kafatos. 1979). en sondas de linea y en manchas de Southern (Southern, 1975). Los rpidos cambios experimentados en este campo en los ltimos aos han sido liderados, en parte, por una convergencia tecnolgica sin igual de microfabricacin, robtica y bioinformtica, fomentados por las demandas de altas cantidades de anlisis genticos asociados al proyecto del genoma humano.

Muchos investigadores especulan ahora con que esta tecnologa puede sustituir, finalmente, a la microscopa de luz para la clasificacin de lipos de tumores, para la determinacin de la sensibilidad cromoteraputica, para la caracterizacin de respuestas inflamatorias y para determinar la identidad de un patgeno infeccioso, debido a la capacidad que tiene la tecnologa de hibridacin de la matriz para impactar en los procedimientos diagnsticos de muchos tipos. En la actualidad, muchos fabricantes de EE.UU. y del extranjero afirman que estn desarrollando matrices para la hibridacin. El propsito de este captulo es revisar las bases tericas de varios programas de hibridacin de la matriz y proporcionar una perspectiva sobre su utilizacin en el laboratorio clnico, tanto ahora como en el futuro.

Macroseries
El trmino macroseries se aplica a la fabricacin de series de hibridacin genticas en matrices macroscpicas, como las membranas de nailon o nitrocelulosa. La densidad de las macroseries va desde unas pocas docenas de sondas (tambin llamadas rasgos, en ingls features) hasta cientos e incluso miles de sondas depositadas sobre la membrana por impresin o por manchas de puntos, que luego se secan y se almacenan para su uso futuro. La membrana de nitrocelulosa es de inters histrico, ya que fue la primera matriz slida que se utiliz ampliamente en la hibridacin de cidos nucleicos. Este material ha dejado de ser popular debido a su fragilidad y a que es muy inflamable. El nailon y el cristal (sello de silicio) son los soportes estndar para hacer microseries. El nailon tiene varias desventajas si se le compara con el silicio, que ahora se ha convertido en la matriz preferida para las series de la hibridacin fvide infra). Adems de su naturaleza porosa, el nailon muestra una autofluorescencia alta, limitando la sensibilidad de la deteccin basada en la fluorescencia, debido a los altos valores de fondo. Esto ltim o evita, tambin, la posibilidad de desarrollar ensayos para medir relaciones. Esta propuesta utiliza dos dianas distintas, cada u n a marcada con un flor diferente (p. ej., las muestras que se toman antes y despus de la administracin de un frmaco recetado). Utilizando un control constante, como una de las sondas, y expresando una relacin de las dos seales fluorescentes emitidas, uno puede minimizar las variaciones sonda a sonda al igual que las diferencias interexperimentales (Brown. 1999; Duggan, 1999). Actualmente, el uso de las macroseries de nailon est limitado a aplicaciones especficas, por las cuales las sondas de inters parecen existir en los ensayos prefabricados. Por ejemplo, existen algunas series comerciales que con-

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TECNOLOGAS DE LA HIBRIDACIN EN SERIE

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tienen todos los genes de citosma conocidos y genes identificados dentro de las vas de transduccin de la seal que se activan durante los procesos infecciosos e inflamatorios. Estas series han sido tiles para el estudio de las respuestas del husped a los procesos infecciosos. Otras series, que incluyen todo sobre los oncogenes conocidos, han sido utilizadas en la investigacin del cncer (p. ej., Series del Atlas Humano Clontech, Palo Alto. Ca; o Genefilters Research Genetics, Huntsville, AL). El uso de las macroseries prefabricadas est limitado a los genes conocidos, y la capacidad limitada de las series de membranas limita su utilizacin como objetivo para descubrir genes. Algunos grupos han tenido xito produciendo series de nailon de alta densidad, a peticin de clientes, con el propsito de descubrir genes (Clark. 1999; Granjeaud. 1996: Gress, 1992; Pietu, 1996; Takahashi. 1995) La mayor desventaja de las series de nailon, por lo que a esto se retiere, ha sido el tamao de la membrana, que representa, prcticamente, una limitacin con respecto al volumen de la sonda que se debe utilizar, en especial cuando slo se dispone de pequeas cantidades de tejido. Debido a que se espera que las microseries. en vez de las macroseries, representen la plataform a elegida, el grueso de este captulo se centra en las microseries.

Microseries
Los ensayos de miniaturizacin ahorran tiempo, a la vez que reducen los costes en las aplicaciones de diagnsticos biomdicos y en la investigacin. El trabajo con volmenes ms pequeos reduce el consumo de reactivos y aumenta la concentracin de la muestra, por lo que mejora la reaccin cintica. Estas mejoras le permiten al investigador determinar cientos o miles de resultados en el tiempo que antes se necesitaba para un solo experimento. Ahora se pueden conseguir microseries de varios distribuidores comerciales, junto con la lectura y la fabricacin de equipos, a gusto del cliente, de series dedicadas a la investigacin especfica o a las aplicaciones diagnsticas (vide intra).

superficies (Beattie, 1 9 9 5 : Beier. 1999; Maskos, 1992; Matson, 1995). Hay una alternativa interesante que consiste en la declaracin de parches pequeos de poliacrilamina a los que los oligonucletidos presintetizados son unidos por microinyeccin (Guschin. 1997; Khrapko. 1991: Yershov. 1996). La densidad de empaquetamiento de las sondas unidas a las superficies slidas influir enormemente en el rendimiento de las matrices de hibridacin. La poca eficiencia del emparejamiento, que se encuentra, a menudo, en las matrices de cristal, puede dar como resultado una baja densidad de la sonda y bajos ndices de seal/ruido. Por otra parte, el empaquetamiento demasiado denso de los oligonucletidos sobre una superficie slida ongma un impedimento espacial. Este obstculo puede ser incluso ms impresionante con bio molculas ms largas, como los ADNc. Se puede aumentar el rendimiento de la hibridacin por hasta dos rdenes de magnitud introduciendo espaciadores entre la superficie y los oligonucletidos (Southern. 1999). Cuanto ms largo sea el espaciador, mejor ser la hibridacin, pero es interesante saber que hay una longitud del espaciador ptima, ms all de la cual desciende el rendimiento de la hibridacin (Duggan, 1999: Shchepinov, 1997). Por ejemplo, un espaciador de 40 tomos de carbono proporciona un aumento de la hibridacin de 150 veces, ya descrito (Shchepinov. 1997). Aproximadamente, la densidad de los oligonucletidos es de 0.1 pmol'mm en superficie de cristal, dos rdenes de magnitud menos que en el polipropileno aminado. Por eso, en la actualidad, la ventaja potencial de las matrices de cristal sobre las de plstico es una densidad ohgonucletida ptima asociada a un impedimento espacial ms bajo (Southern, 1999). Si se mejora la calidad de las superficies qumicas, algn da se podrn fabricar series sobre pelcula o sobre hojas de plstico, lo que reducir enormemente los costes de produccin,
7

Sustratos de microseries
La distincin principal entre las microseries y las macroseries consiste en la eleccin de un soporte slido y no poroso. Impidiendo la difusin de los cidos nucleicos diana, las superficies no porosas (sustratos de plstico, de cristal o de silicio) permiten una hibridacin cintica ms rpida y unos pasos de lavado ms fciles. La declaracin de las sondas sobre un sustrato slido es tambin ms receptiva para la automatizacin y posibilita densidades de serie ms altas con una definicin de la imagen ptima. Estos rasgos se aplican a cualquier tipo de microseries, desde los productos de oligonucletidos sintticos a los de los ADNc clonados o los de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Southern. 1999). Actualmente, la mayora de las microseries se desarrollan sobre cristal. Al contrario que en los derivados del plstico, la transparencia del cristal y la falta de autolluorescencia permiten la deteccin basada en la fluorescencia de bajo fondo. Sin embargo, ya que la ciencia de los materiales empieza a estar ms comprometida con las tecnologas de sene, puede que en el futuro inmediato, estn disponibles sustratos alternativos, incluidos el cristal baado y los sustratos de plstico.

La composicin terminal (extremo-5) de los oligonucletidos influencia su rendimiento. Como se esperaba, los extremos 5' ricos en G:C llevan a un rendimiento mejor que sus homlogos (la m i s m a composicin pero secuencias diferentes) (Maskos, 1993b). Por tanto, para minimizar esta contribucin, s e pueden considerar las propuestas para modificar el extremo 5' de los oligonucletidos (p. ej.. la adicin covalente de un nexo degenerado). Por otra parte, el saber que los errores en los extremos son menos desestabilizadores y. por tanto, ms difciles de discriminar por la hibridacin (Southern, 1999) ha llevado a introducir mejoras inteligentes para la deteccin de los acontecimientos de la hibridacin. Se han desarrollado mtodos enzimticos con una deteccin de astringencia mejorada (minisecuenciacin de fase slida [Pastinen. 1997. 1998; Syvanen. 1999]. anlisis de unidades de informacin gentica [Nikilorov, 1994] o ensayos de ligacin [Landgren, 1988: Nickerson. 1990], ya que las polimerasas y las ligasas son ms sensibles a los errores terminales ( c o m o oposicin a los internos). Marshall (1998) ha analizado las series que hay en el mercado. La fabricacin de microseries comprenden dos amplias categoras: las que se hacen depositando la sonda directamente sobre la superficie slida y las que se hacen por sntesis in situ. Hay un tercer mtodo, desarrollado por Nanogen (San Diego. CA), que se compone de oligonucletidos prefabricados caplurados sobre manchas electroactivas en chips de silicio (Cheng. 1998: Edman, 1997; Heller, 1998; Sosnowski. 1997). La modificacin del campo elctnco por electrodos independientes dirigibles espacialmente puede acelerar la hibridacin, y cuando la polaridad es invertida, proporciona un lavado astringente (Edman, 1997).

Fabricacin de microseries
Para obtener la inmovilizacin covalente sobre cualquiera de estas dos superficies, de cristal o de polipropileno, se requiere la funcionalizacin del extremo 3 (esto es, la modificacin qumica) de los oligonucletidos de cido nucleico, de los productos de la PCR, de los ADNc o de los oligmeros de pptidos y cidos nucleicos (Beier, 1999: Matson, 1995), Por ejemplo, el tratamiento de lminas de cristal con silano permite al cristal amino tratado unir sondas ligadas a grupos amino utilizando molculas bifuncionales, como una dialdehdo o una disotiacina (Case-Green, 1994; Guo, 1994). De forma alternativa, el cristal baado con un policatin (p. ej.. polilisina) permite la unin acoplada a la carga directa de las sondas de ADN polianinico (Maskos. 1993a), un paso de entrecruzamiento por ultravioleta aade enlaces covalentes a la interaccin inica. El enlace covalente es esencial para permitir los lavados astringentes y, por tanto, la discriminacin exacta de las especies hibridadas. Se han publicado varios protocolos para dirigir la activacin de las

Tecnologas de liberacin
Pat Brown y otros colaboradores fueron los que iniciaron la declaracin de molculas presintetizadas (Schena. 1995; Shalon. 1996). Se preparan las sustancias bioqumicas (p. ej.. las protenas, los pptidos. los oligonucletidos, los ADNc), se purifican y se almacenan en placas de microtitulos. Mecnicamente se depositan pequeas cantidades de molculas en las localizaciones exactamente definidas sobre una superficie slida, utilizando diversos sistemas robticos de precisin. Este mtodo es muy flexible en cuanto a la composicin bioqumica, a la topologa de la microserie (p. ej.. el tamao y la densidad de las manchas, las manchas de rplica para cada molcula) y a su facilidad para hacer prototipos. Los mtodos mecnicos permiten la sntesis de microseries de elevada a moderada densidad (hasta cerca de 16.000 sondas por cm- [Graves. 1999]). Es el mtodo elegido cuando se necesita gran nmero de microseries con la misma composicin, as como para secuencias largas que utilizan productos de la PCR. En la actualidad, varias compaas

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR contacto fsico con las superficies de las series; esta ltima propiedad puede ser relevante para el desarrollo de las series baadas con finas lminas de metales y que utilizan diferentes mtodos de deteccin (Heyse, 1998; Schmid, 1998). Se puede detectar una leve dispersin de las micropartculas que esln marcando a las secuencias dianas cuando, de inmediato, aflora en la superficie del cristal una ola evanescente. Este mtodo permite la medicin de afinidad en t i e m p o real con un poso m u y bajo (Stimpson. 1996).

estn fabricando y vendiendo senes prefabricadas (p. ej Micromax. NEN Life Science, Boston, MA) o repetidores basados en la deposicin (Cheung, 1999) como alternativa a la construccin de un repetidor (Brown, 2000). Los procedimientos de liberacin se componen de diferentes sistemas de microimpresin y han sido recientemente revisados (Bowtell. 1999). La mayora de los repetidores utilizan puntas microdispensadoras parecidas a una pluma estilogrfica (p. ej.. Cartesian Tecnologies. Irvine, CA), aunque se han desarrollado algunos sistemas originales, como la tcnica de pincho y anillo (Genetic MicroSystems. Woburn, MA). En general, y debido a la tensin superficial, a la electricidad esttica y a otros electos, la reproduccin de las senes impresas es ms baja que la sntesis in situ. y debe ser corregida por medio de experimentos separados (repetidos), por las rplicas de las manchas (en la misma plancha), por la deteccin de la lluorescencia multicolor y por otros algoritmos de deteccin especficos o por ambos (Chen. 1997). Debido a su flexibilidad y a su disponibilidad, la tecnologa de las senes impresas tendr, probablemente, el mayor impacto en los laboratorios clnicos y de investigacin en el curso de los prximos aos.

Microseries de oligonucletidos
Se ha estudiado ampliamente la termodinmica, la cintica de la hibridacin y los aspectos cuantitativos de la hibndacin de los oligonucletidos (revisado por Hoheisel, 1996; Wetmur. 1991). La utilizacin de los oligonucletidos en las series tiene ventajas y desventajas potenciales. Las desventajas potenciales son: una susceptibilidad ms baja que las series de ADNc, para la deteccin de mensajeros poco comunes o para la de dianas de hibndacin, y su poca capacidad, desde el potencial de la hibridacin, para predecir las caractersticas de la hibridacin y, por tanto, la intensidad esperada de la seal no parece correlacionarse bien con el contenido de G:C o con la temperatura de fusin (Graves, 1999; Lockhart, 1996), Basndose en estos conocimientos, las series de oligonucletidos se pueden hacer por la deposicin de oligonucletidos sintticos o por la sntesis in situ. Esle mtodo ofrece numerosas ventajas sobre la liberacin de los productos de ADNc o de la PCR. Las condiciones de la hibridacin pueden ser ms homogneas que en la serie del ADNc, con tal de que sta est diseada con oligonucletidos de tamaos equivalentes. Las series de oligonucletidos no requieren, necesariamente, del conocimiento anterior de las secuencias dianas. Se pueden dividir en dos campos: las series genncas (que representan a una matnz de oligonucletidos azarosa) o las series especializadas (por vanaciones moleculares de u n a diana prederminada). Las series genricas han sido propuestas c o m o una alternativa barata a la secuenciacin. Es posible "pasearse" por todas las posiciones a lo largo de una secuencia de nuclelidos si se utilizan todas las combinaciones posibles de un n-mer. Hyseq (Sunnyvale, CA) reclama una posicin de liderazgo en el campo de la secuenciacin por hibridacin. Esta propuesta inteligente est, actualmente, limitada por la complejidad del algontmo que se necesita para generar grupos (la conversin de una lista de n-mers hibridados en una secuencia significativa). Adems, si la secuencia que se est analizando contiene una regin repetida (la m i s m a secuencia aparece ms de una vez sin la molcula diana), el diagrama de reconstruccin tendr que desplegar un nmero correspondiente de puntos de ramificacin que derivarn a una secuencia ambigua. Una propuesta de este tipo depende del acceso azaroso de la sntesis. E s t e tipo de serie es el nico capaz de detectar las secuencias que faltan en las grandes bibliotecas electrnicas. Como contraste, las senes especializadas se utilizan para las secuenciaciones repetitivas (resecuenciacin) de la m i s m a diana para la deteccin de polimorfismos de nucletidos o de mutaciones funcionales. Esto implica el conocimiento de las dianas y sus variantes ms frecuentes, para incorporar grupos predeterminados de nucletidos en las series diagnsticas. Este mtodo se ha utilizado para la deteccin de polimorfismos genticos asociados a la resistencia a los frmacos del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), as c o m o para otros polimorfismos (vide inra). Las series de oligonucletidos tambin se pueden utilizar para definir los polimorfismos de un solo nucletido (Guo, 1994). incluso comparando dos muestras con fluorescencia multicolor (Chee, 1996). Ms adelante se describen otros ejemplos de este mtodo. La bsqueda de oligmeros de afinidad ms elevada ha abierto el camino para las modificaciones qumicas de las sondas y de los moldes de oligonucletidos para mejorar la cintica y la termodinmica de los enlaces. Las sondas de pptidos de cido nucleico (PAN) hacen que la hibridacin se efecte en una astringencia ms elevada, debido a la alta estabilidad de las PAN-ADN dplex (Corey. 1997). Las sondas mediadas de ARN (Corey, 1998) muestran afinidades similares relativas. Sin embargo, las P A N muestran condiciones de hibridacin ms rpidas que sus cidos nucleicos equivalentes, debido, fundamentalmente, a su estructura neutral de columna vertebral (Freeman, 1999). Por regla general, se puede decir que, a pesar de que sera una clara ventaja la reduccin de los tiempos de hibridacin de horas a minutos, se debe superar el problema que hay de no poder predecir los puntos de fusin de estos oligmeros de alta afinidad antes de su aplicacin en las microseries (Weiler.

Sntesis in situ
La sntesis in situ permite producciones ms altas, variaciones de chip a chip ms bajas, asi como densidades de sondas ms altas. Estos mtodos tambin permiten la fabricacin de series de "acceso al azar" genuinas. esto quiere decir que cada oligonucletido. en cualquier posicin, puede tener cualquier secuencia elegida (Southern, 1999). Las estrategias de combinacin se refieren a mtodos que han sido desarrollados para hacer microseries que contienen todas las secuencias de una longitud dada (tambin se las conoce como "senes genricas"). Las series de combinacin se han fomentado, principalmente, para estudiar el comportamiento de las hibndaciones a gran escala (Southern. 1994), o para la secuenciacin de los cidos nucleicos en estado slido (Drmanac, 1993a, 1993b, 1999. 1998: Lipshutz, 1993: Macevicz. 1991; Strezoska. 1991), Las tcnicas de fabricacin incluyen a las mscaras fotolitogrficas para controlar la activacin qumica por medio de pasos de fotodesproteccin (Fodor, 1991). de declaraciones por inyeccin de tinta (Stimpson, 1998), as como de barreras fsicas para la inundacin secuencial de los precursores (Maskos. 1993c). Affymetrix ha emparejado la desproteccin fotoqumica con la sntesis del ADN en fase slida adaptando las tcnicas de la industria de los semiconductores (Lipshutz, 1999; Lockhart. 1996: Pease, 1994). Los nexos sintticos modificados con grupos protectores transportables por medio de la fotoqumica son unidos a los chips de silicio. La fotodesproteccin localizada se produce por medio de rayos U V brillantes a travs de una mscara fotolitogrfica y deja que las unidades bsicas (desoxinuclesidos protegidos de hidroxilos) reaccionen con los grupos desprotegidos (Fodor. 1991). Los ciclos alternos de fotodesproteccin e incubacin con distintas unidades bsicas qumicas permiten la sntesis dirigida por rayos de los polidesoxinucletidos. Los ohgonucletidos sintetizados tienen una longitud prctica mxima debido a la eficiencia limitada de la fotodesproteccin (del 80% al 95% en cada ciclo) (Forman, 1999). Por tanto, la proporcin de 20-mers que muestra la secuencia predefinida est entre el 1% y el 36% (0.8E20 a 0.95E20) (Fodor. 1991). Las mscaras o barreras mecnicas permiten la limitacin de las reas de la superficie antes de ser inundadas por los precursores definidos. Las mscaras fsicas de formas diferentes (en forma de rombo, de circulo) permiten la sntesis in situ de un precursor dado en localizaciones conocidas. El desplazamiento secuencial de las mscaras, seguido por la inundacin de otro precursor, permite la sntesis de las series de combinacin extensas de desoxinucletidos (Maskos, 1993c; Southern 1992,1996b). A fecha de hoy, Affymetrix es capaz de sintetizar hasta 400.000 polidesoxinucletidos diferentes en un rea de 1,6 cm(Fodor, 1991). A pesar de su alto coste, este es el mtodo elegido para los estudios de la expresin gnica diferencial a gran escala, debido a su susceptibilidad, su capacidad de reproduccin y a la redundancia de informacin. Las tecnologas de inyeccin de tinta deben su desarrollo a la industria impresora y actualmente estn siendo desarrolladas por varias compaas Incyte Pharmaceuticals (Palo Alto, CA), Protogene (Palo Alto, CA) y Rosetta Inpharmatics (Kirkland, WA) (Blanchard, 1996). Esta tecnologa tambin est disponible en el mercado (Ink-Jet. Packard Instruments. Meriden, CT: Piezoelectric pump. GeSiM. Grosserkmannsdorf, Alemania). Esta propuesta ofrece versatilidad en las biomolculas que estn siendo liberadas y elimina la necesidad del

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TECNOLOGAS DE LA HIBRIDACIN EN SERIE

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1997). Adems de las sondas, tambin las dianas pueden ser modificadas qumicamente para localizar las seales amplificadas. Las regiones dianas ricas en pirimidina pueden generar seales ms altas de hibridacin aadiendo 5-metiluridina durante la transcripcin in vilro (Hacia. 1998).

Microseries de ADNc
Las microseries de las secuencias de ADNc permiten la monitorizacin basada en la hibridacin de genes similares. Por tanto, esta estrategia implica el acceso a los clones o la posibilidad de generar productos de la PCR. Hasta la fecha, las mejores estrategias utilizan la deteccin fluorescente de dos colores para discriminar entre una muestra y su control y para comprobar el nivel diferencial de la expresin. Pat Brown y sus colaboradores en la Universidad de Stanford fueron los pioneros y verificaron este mtodo (Schena. 1995,1996; Shalon. 1996). Las ventajas de este mtodo se basan en calcular una relacin en cada sonda, en controlar la calidad de la sonda, en las propiedades especficas de hibridacin de cada par de dianas o sondas y en la eficacia en el mareaje. Synteni (una compaa subsidiaria de Incyte. Palo Alto. CA) ha desarrollado para este propsito su microserie de expresin gnica (Schena. 1998). La compaa NEN Life Science vende ahora portas de cristal con 2.400 genes humanos conocidos (MicroMax). A pesar de que parecen intrnsecamente menos reproducibles, en la actualidad las microseries de ADNc ofrecen la mayor versatilidad en cuanto a la deposicin de las sondas se refiere, y a la accesibilidad de la tecnologa. Varias compaas estn ahora ofertando equipos para la fabricacin de senes y para la lectura de las matnces hibridadas. Las series de ADNc y las series de oligonucletidos de densidad elevada probablemente tendrn papeles complementarios relevantes, en los prximos aos, en los laboratorios de investigacin: las senes de densidad elevada se usarn, primordialmente, para el descubrimiento de locus de relevancia diagnstica, y las series dedicadas se utilizarn, cada vez ms. para los anlisis de densidad media a baja de los locus de relevancia diagnostica descubiertos por los anlisis de sene de densidad elevada.

cantidad de grupos de datos (generalmente una imagen utiliza de 10 a 50 megabites) que se tienen que almacenar en formatos estndar (BMP, GIF. JPG). El software procesador de imgenes mostrar una creciente automatizacin. Este software debe garantizar el ajuste apropiado de la gradilla y la deteccin de restos, as como identificar las caractersticas para obtener informacin significativa. El aspecto de las microseries que ms desafios encara empieza aqu, cuando las grandes cantidades de grupos de datos se han reunido y purgado de restos y esperan para el anlisis (Vingron, 1999). Se pueden utilizar dos estrategias. La hiptesis clsica del anlisis consiste en la agrupacin (utilizando vanas herramientas estadsticas) de genes que se comportan de forma similar. Entonces, se pueden deducir los genes potencialmente co-regulados o detectar la expresin diferencial. Sin embargo, estos datos son. slo, fortuitos. La otra estrategia asume que. despus de ejecutar un proceso estadstico o de visualizacin, los datos "hablan por si mismos" (Bassett, 1999; Brown. 1999). El software que est disponible comercialmente permite hacer estos anlisis, pero con frecuencia los investigadores tendrn que personalizar estos programas, e incluso puede que tengan que escribir sus propios algoritmos. U n o de los problemas logsticos que han surgido y que entraan ms desafios para las tecnologas de las microseries son las extensas bases de datos capaces de ser tratadas por la red. Y a est muy claro que probablemente la informacin significativa provenga de la comparacin entre experimentos mltiples, ms que de las deducciones de un experimento basado en un solo fragmento, siendo esto tan complejo. Por eso, debido a la imperiosa necesidad del reconocimiento del patrn, de la interpretacin multidimensional de los datos y de la comparacin cruzada del programa, las tecnologas de las microseries van a tener una ntima relacin con la bioinformtica, y la evolucin conjunta del hardware y del software parece ser inevitable (vase Cap. 6).

APLICACIONES CLNICAS DE LA TECNOLOGA DE LAS MICROSERIES

En los ltimos aos se han propuesto numerosas aplicaciones de la tecnologa de las microseries, que van de la clasificacin molecular de tumores a la identificacin y caracterizacin de agentes microbianos. Esto ha llevado a muchos a especular con que la tecnologa de las senes representa la "nueva ola" de los avances tecnolgicos, que va a tener un impacto prctico en los diagnsticos de las enfermedades humanas, precedida slo por la PCR, como tecnologa central en los laboratorios clnicos de diagnsticos moleculares. Esta seccin se centra en las aplicaciones, actuales y futuras, de la tecnologa de las series.

Problemas de la propiedad industrial

La tecnologa de las microseries es un campo que avanza rpidamente y en el que existe una competencia feroz. Por eso es importante enfatJzar el hecho de que se han registrado muchas patentes y de que algunas de ellas son directamente relevantes en los diagnsticos clnicos. Por ejemplo, Affymetrix (Santa Clara, CA) posee derechos sobre las patentes que son esenciales para las series de oligonucletidos de densidad elevada (Chee. 1998; Holmes. 1998), sin tener en cuenta los propsitos para los que fueron hechas. Si un laboratorio, presuntamente, decide desarrollar series de densidad moderada para anlisis de tumores y cobra por este servicio, este ensayo puede infringir los derechos de las patentes de Affymetrix si exceden las 400 unidades/cm. sin tener en cuenta de qu tipo es el mtodo de la sntesis (Fodor, 1998). Las tecnologas de las series que utilizan micromatnces de tampones de gel de poliacrilamida (elementos de gel tndimensionales), representan un mtodo nuevo que puede que no infrinja los derechos de Affymetrix (Guschin, 1997; Khrapko. 1991 Yershov, 1996). Esperemos que. como ocurri con las tecnologas de amplificacin de los cidos nucleicos, la competencia entre fabricantes rebaje los costes y permita la democratizacin de esta tecnologa tan poderosa.
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Secuenciacin de las series

Los datos de las secuencias de los cidos nucleicos son fundamentales para la biologa molecular moderna. Los mtodos convencionales (Maxam, 1977: Sanger, 1977) llevan tiempo, el trabajo es intensivo y son caros. Los mtodos de secuenciacin alternativos que utilizan la hibridacin en fase slida se propusieron en base a una teora (Bains. 1988; Khrapko, 1989) a menos de 1 5 aos del descubrimiento de estos mtodos (Southern. 1975). A los artculos tericos les siguieron despus los datos, que confirmaban los principios de la secuenciacin basada en la serie, de moldes cortos artificiales (Pannov, 1996: Pease, 1994; Southern, 1992). En 1999 se publico un artculo, muy bien escrito, sobre los mtodos de secuenciacin de las microseries (Hacia. 1999). Sin embargo, el lector puede advertir que muchos de los trabajos publicados y citados en esta rea provienen de investigadores con intereses financieros en uno o varios dispositivos patentados, y que estas publicaciones evalan, Ms que respaldar a un mtodo o dispositivo especial, este captulo trata de familiarizar al lector con los principios bsicos de las senes, En teora, cualquier secuencia de cido nucleico se puede romper en subgrupos de longitud n. Despus, todos esos oligonucletidos posibles, de longitud n (n-mers) se pueden situar en localizaciones estables sobre u n a superficie slida. El cido nucleico que va a ser secuenciado (el molde) se amplifica, si es necesario, se marca con una molcula fluorescente, luminiscente o radiactiva y se le permite que hibride a las series de unin de n-mers. La deteccin de la marca permite, al que est haciendo la secuencia, verificar un resultado con un n-mer en un locus particular en la superficie slida. L a

Bioinformtica
La bioinformtica es un componente esencial en las microsenes, desde que se empieza a disear la serie hasta los sofisticados anlisis de datos. Utilizando robots controlados por ordenador, las biomolculas pueden ser distribuidas, exacta y precisamente, en cualquier configuracin de gradilla deseada. Este paso es relativamente trivial y parece que se adapta bien a la capacidad de los instrum e n t o s que hay en el mercado (Bowtell. 1999). Sin embargo, se debe seguir con atencin el vinculo secuencia arriba entre cada punto y el pocilio (y la placa) de donde procede la biomolcula. El nuevo software (p. ej CloneTracker, BioDiscovery, Inc. Los Angeles, CA) garantiza la identificacin correcta de cada sonda durante la fabricacin de las microseries y el tratamiento de los datos para correlacionar rpidamente una seal con una sonda especfica. En los lugares donde se llevan a cabo las senes de tamao medio a grande, lo ms sensato es la utilizacin de un sistema de cdigo de barras. La obtencin de datos genera gran

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR interpretada, el instrumento de recogida de datos sigue siendo una "caja negra", sin las seales visuales que relacionan directamente a un nucletido especfico de la secuencia mencionada. Algunas veces, una imagen del cromatograma (de un secuenciador capilar) o del gel (de una secuenciacin de gel) puede resolver las ambigedades o las inconsistencias de los datos de la secuenciacin. Sin embargo, los usuarios de los secuenciadores actuales de microseries quiz tengan que aceptar que los datos primarios de los cuales se deduce su secuencia no pueden ser interpretados directamente, bien porque es demasiado complejo o bien porque la composicin y la localizacin en el chip de los oligonucletidos especficos sigue siendo un secreto industrial de los fabricantes, o por ambas cosas. Esto no tiene que ser, necesariamente, una desventaja para los laboratorios clnicos, aunque sea frustrante para los investigadores, ya que, en ellos, es cada vez ms corriente el uso de sistemas automatizados y de la interpretacin guiada por el ordenador. Para las aplicaciones clnicas, en general, una limitacin ms seria es intrnseca a la secuenciacin como una estrategia diagnstica. Debido al potencial de velocidad y de automatizacin, la secuenciacin de microseries resulta atrayenle como alternativa a los mtodos fenotipcos clsicos y. m u y notablemente, a la seleccin de resistencias a los frmacos. Como todas las estrategias de secuenciacin, las microseries tienen una sensibilidad limitada para los alelos minoritarios. Particularmente instructivo es el ejemplo de la identificacin de la resistencia a los frmacos en el VIH basada en la secuencia. La secuenciacin de microseries de aislados clnicos puede pronosticar correctamente algunos casos de resistencia a los frmacos basndose en mutaciones especficas (Race, 1998), y ya se est convirtiendo en una prctica estndar (Perez-Olmeda, 1999). Incluso suponiendo que la secuenciacin pueda detectar un alelo resistente cuando est representado en ms de o igual a un 1% de la poblacin vrica, hay razones, sin embargo, para dudar del valor proftico de una prueba negativa de resistencia. Pocos virlogos argumentaran que el 0,5% de prevalencia de la resistencia a los frmacos no sea importante en un virus que genera ms de un billn de copias al da.

intensidad de la seal en ese locus debera ser directamente proporcional al nmero de dominios en el molde correspondiente al n-mer en ese locus. De los mtodos para todos estos pasos, se ha dado una idea general en las secciones precedentes de este captulo. Para las aplicaciones de la secuenciacin, los n-mers que se ajustan al molde se agrupan, luego, en un orden definido por el anlisis de los n-mers con la secuencia solapante, que en principio es igual al ordenamiento de grupos por los programas de secuenciacin a gran escala. Piensen en un molde nonanuclelido que bajo condiciones astringentes es unido solamente a los locus que contienen cuatro tetrmeros en una serie con todos los 256 tetrmeros posibles: Tetrmero 5ACTG 5'CTGA 5'TGAC 5'GACT Intensidad 2 2 1 1

Desde las reas replegadas, no es muy til razonar que el molde nonanucletido fuera 5'ACTGACTGA. Este tipo de anlisis se hace directamente por ordenador. Desde el ordenador se puede automatizar el escner de la serie para detectar la marca, el mareaje mismo y, en alguna medida, incluso la extraccin y la amplificacin del ADN: es estupendo imaginar que una "caja negra" puede realizar todo esto en una tarde. Sin embargo, pensemos en un nonanucletido que une a los locus que contienen los siguientes tetrmeros: Tetrmero 5'TCTA 5'CTAC 5T A C T 5'ACTT 5'CTTC 5TTCT Intensidad 1 1 i 1

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Series de expresin
La expresin diferencial del gen es el problema fundamental de la biologa molecular. Generalmente, la pregunta que nos hacemos es" La expresin de qu gen est asociada con este resultado en particular?". Desde los viejos malos tiempos de sustraccin de bibliotecas y de manchas de Northern a los mtodos ms modernos de seleccin, como la demostracin de la diferencia (Liang, 1992) o la amplificacin de la diferencia (Lisitsyn, 1993), los mtodos siguen siendo caros, el trabajo intensivo y se emplea mucho tiempo. Las microseries son prometedoras en cuanto a afrontar este problema de una manera no solamente menos cara, con menos trabajo y ms rpida que con los mtodos antiguos, sino que permitirn los anlisis mucho ms complejos del problema en cuestin. Los mtodos ms antiguos se basan en la identificacin de uno o, a lo sumo, de un puado de secuencias para comparar entre muestras de control y experimentales. Los sistemas basados en las microseries ofrecen un programa para cuantificar la expresin de miles de genes al mismo liempo (Brown, 1999). Esto permite el anlisis de cassettes enteras de genes, o patrones de expresin del gen. nada menos que de uno, dos o tres genes al mismo tiempo. El mtodo que permite el estudio de los acontecimientos de la transcripcin puede estar anticuado, debido a que en la ciencia biomdica la mayora de los problemas de inters general involucran a varios genes que actan todos de acuerdo. Por lo general existen dos tipos de series para hacer los anlisis de expresin. En uno se pueden utilizar series de porciones enteras o sustanciales de ADNc o de exones. utilizando en la microserie secuencias largas de cientos de bases en locus individuales. Aunque la sntesis comercial se encuentra en el mercado, estas series se pueden preparar en cualquier laboratorio utilizando mecanismos hechos con componentes caseros (Brown, 2000: Schena. 1995). Esto permite hacer anlisis de la expresin personalizados a un precio razonablemente bajo y dando un rodeo a las patentes de fotolitografa. Por otra parte, estas series representan una pequea o ninguna variedad de alelos para cada gen, con poca distincin en la representacin entre las regiones variables y constantes del gen expresado. Alternativamente, se pueden utilizar series hechas de oligonucletidos solapantes, que incluyen las regiones d e diferenciacin de varios genes. Estas series se preparan por medio de la foto-

Esto podra representar 5' TCTACTTCT o 5' TTCTACTTC, y no hay manera de resolverlo por ordenador. Donde n es menos que la mitad de la longitud del molde, repetir la misma longitud como n/2 puede dar resultados ambiguos. El ordenador empieza a tener cada vez ms dificultades, ya que la longitud del molde llega a ser un mltiplo de n cada vez ms alto; en consecuencia, es deseable tener un n tan largo como sea posible para la secuenciacin de los dominios no conocidos. En la prctica, la longitud de n sigue limitada por la tecnologa, sin embargo, desde entonces 4" (el nmero de locus que se precisan para la representacin universal) excede a 1 milln por n = 10. Esto limita los mtodos actuales del nmero de oligonucletidos diferentes que pueden ser diferenciados sobre un chip fotolitogrfico (Lipshutz, 1999). Y una vez descritas estas limitaciones intrnsecas, en la actualidad es mejor reservar la secuenciacin basada en las microseries para los sitios ampliamente conservados, donde el conocimiento de la secuencia esperada es mucho mayor. Aqu, el nmero de locus que se precisan no necesita aproximarse a 4". ya que hay un nmero limitado de secuencias posibles para ser identificadas. La deteccin de polimorfismos de un solo nucletido de un gen fenotpicamente definido (Cronin. 1996; Hacia, 1996) es una estrategia arquetipica apropiada para la secuenciacin basada en las microseries. Sus aplicaciones especificas incluyen la deteccin de alelos de resistencia antimcrobianos (Kozal. 1996; Troesch, 1999), las mutaciones de puntos asociados con el cncer (Ahrendt, 1999), las secuencias especficas de especies en un sitio ampliamente conservado (Gingeras, 1998) y la identificacin de mutaciones en genes conocidos para determinar su papel en una enfermedad de origen desconocido (Halushka, 1999). A pesar de que los costes de esta tecnologa siguen siendo altos, es posible que bajen segn vaya aumentando la produccin. Suponiendo que los costes bajen, los mtodos de secuenciacin a travs de microseries sern, probablemente, los preferidos en las aplicaciones clnicas donde se requiera la secuenciacin repetitiva de la misma diana. Adems de los costes, la secuenciacin de microseries tiene algunas limitaciones tcnicas, incluso para sitios ampliamente conservados. En la mayora de los casos, mientras que al investigador se le proporciona la secuencia

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litografa, utilizando mtodos propios y mscaras complejas. Debido a esto son caros, y para los pequeos laboratorios su disponibilidad es limitada (Fox, 1999). No obstante, permiten que miles de genes a la vez detecten a todos los alelos conocidos y proporcionen informacin cuantitativa y detallada de cualquiera de las secuencias (incluidos los alelos patgenos) que estn representadas en la transcripcin. Incluso se puede detectar, rpidamente, la expresin de bajo nivel del gen con un alcance de ms de 1.000 (Lockhart. 1996). Las series de ADNc y las de oligonucletidos se han utilizado con xito para afrontar los eternos problemas de la biologa de la expresin. En 1999 se publicaron los aspectos prcticos y los mritos relativos de varios sistemas (Bowtell, 1999). La investigacin publicada en 1995. por Schena y cois, del laboratorio de Pat Brown, fue la de un resultado seminal en la utilizacin de senes de ADNc de alta densidad sobre cristal para el anlisis de la expresin (Schena, 1995). Los autores marcaron el ADNc de la Arabidopsis. cuyo genoma est entre los ms pequeos de cualquier eucariota. En un prototipo de los experimentos subsiguientes se marc a los ADNc de la hoja y de la raz de la planta con diferentes fluorocromos. Utilizando series de productos amplificados por PCR de clones seleccionados al azar de una biblioteca del ADNc de la Arabidopsis, los autores identificaron 26 genes, cuyo ndice de transcripcin era diferente en cinco veces o ms entre la hoja y la raz. Esta diferencia ambiental no era especialmente sutil, pero esta investigacin represent una desviacin notable de las publicaciones anteriores de la expresin diferencial, en las que el descubrimiento de cinco o menos genes expresados diferencialmente podra haber sido considerado un triunfo colosal. Las acciones subsiguientes efectuadas por el mismo laboratorio encontraron en las clulas humanas once genes regulados hacia arriba y seis regulados hacia abajo dos veces o ms por medio de un choque de calor de 43" C, as como tambin seis genes regulados hacia arriba dos veces o ms por exposicin a esteres de lorbol (Schena. 1996). En estos experimentos hibndaron el material del molde sobre, aproximadamente. 1.000 secuencias de genes a la vez. aumentando por dos rdenes de magnitud el nmero de acontecimientos de la transcripcin que podran ser asociados con un estmulo delinido en un bloque de experimentos. Desde estas primeras publicaciones, otros laboratorios han utilizado mtodos similares para descubrir 30 genes regulados hacia arriba por radiacin ionizante (Amundson. 1999), 62 genes expresados diferencialmente en neuronas afectadas de esclerosis mltiple (Whitney. 1999) y 89 genes expresados diferencialmente entre las clulas del carcinoma de las clulas renales y las clulas derivadas de un rion humano normal (Moch, 1999). Se han hecho progresos similares con programas de oligonucletidos fotolitografiados. stos se han utilizado para identificar 23 transcritos que median la respuesta a un gen asociado al cncer de m a m a (Harkmg, 1999). 94. 268 y 129 genes cuyos niveles de transcripcin cambiaron dos veces o ms despus de la exposicin a interfern (IFN) -a, y -y, respectivamente, de clulas derivadas de un librosarcoma (Der, 1998); y 258 transcritos cuyo nivel cambi cuatro veces o ms despus de la exposicin a otomegalovirus de fibroblastos humanos (Zhu, 1998). Las ltimas publicaciones citadas, que slo son unos pocos ejemplos de toda una gran y creciente documentacin, analizan aproximadamente 5.000 ADNc al mismo tiempo, en comparacin con los aproximadamente 1.000 de las primeras investigaciones de las microseries de ADNc. El nmero ms amplio se aproxima al nmero de secuencias codificantes de protenas en los genomas procariticos. La proporcin en aumento de estos anlisis de expresin de las microseries hace que estos mtodos sean especialmente atractivos para los estudios in vilro de las procariotas (de Saizieu. 1998). de las cuales ms de 20 se han secuenciado en su totalidad. Si bien la extraccin de ARN de las procariotas es menos precisa, desde que se debe utilizar ARN entero, en vez de ARN poliadenilado, como molde para la transcripcin inversa, la globalidad de este anlisis es una gran ventaja. Se puede capturar una imagen completa de genes de procariotas codificantes de protenas en una sola membrana de nailon (Tao. 1999). Tambin es posible una propuesta similar del genoma completo con eucariotas simples. El bloque Ye6100 de cuatro chips de oligonucletidos fotolitograliados contiene informacin secuencial acerca de ms de 6.000 marcos de lectura abiertos, lo que posibilita una evaluacin detallada de la respuesta Iranscripcional a travs del genoma completo de la levadura Saccaharomyces cerevisiae (Holslege. 1998: Jelinsky, 1999; Wodicka, 1997).

Adems de incrementar el numero total de las secuencias analizadas, las nuevas estrategias analticas de los datos de las microseries tambin estn mejorando los anlisis de la expresin de los genes. Estos mtodos hacen evidentes los lmites para analizar uno o varios genes a la vez, los cuales demuestran amplios grupos de genes que responden a estmulos individuales. Y lo que es peor, los genes cuyos niveles de transcripcin responden a un estmulo a menudo tambin responden a otros estmulos (Fambrough. 1999). En vez de analizar cada transcnptor como un pronosticador de resultados, los datos paralelos masivos que proporcionan las microseries permiten identificar familias enteras de genes implicados en acontecimientos biolgicos complejos (Eisen. 1998). El ao pasado se public un xito paradigmtico de esta propuesta, que fue la clasilicacin de las leucemias mediante el perfil de la expresin gnica (Golub. 1999). En este artculo los autores explican que empezaron por extraer cido ribonucleico (ARN) de las muestras de mdula sea de 38 pacientes con leucemias linfoblsticas y mielgenas. Los transcritos biotinlados del ADN derivados de esas muestras fueron hibridados por series de Affymetrix HU6800 con oligonucletidos representantes de ms de 6.800 genes humanos, luego marcaron los chips con ficoeritrina-estreptavidina para su cuantificacin en un escner confocal. Los autores identificaron 50 genes cuya expresin estaba asociada con una de las dos clases de leucemia por medio de la utilizacin de mtodos matemticos, desarrollados por este proyecto (Lander, 2000), y de procedimientos de verilicacin repetitiva. Despus probaron el modelo diagnstico verificado en clulas derivadas de la sangre y de la mdula sea de 34 pacientes adicionales con leucemia. El funcionamiento del modelo no fue perfecto en esta segunda verificacin, ya que no se pudieron hacer predicciones precisas sobre cinco pacientes. Por otra parte, el modelo s hizo predicciones diagnsticas seguras de 29 (85%) de estas muestras, todas las cuales eran correctas. Yendo an ms lejos con la ampliacin de estas tcnicas, los autores utilizaron su software GENECLUSTER para configurar un mapa de auto-organizacin (Tamayo, 1999) de los datos de la expresin de los 38 pacientes iniciales. Estos mapas identifican grupos de genes cuyos patrones de expresin estn asociados unos con otros. Los patrones de expresin que surgieron del mapa no slo identificaron a las leucemias linfoblsticas y mielgenas, sino que incluso pudieron distinguir entre la leucemia linfoide derivada de clulas T y la derivada de clulas B. Y lo ms importante es que, al contrario que en los anlisis iniciales, estos grupos de patrones de la expresin no estaban basados en el conocimiento previo de las bases para hacer diagnsticos. Lo que esto sugiere es que estos mtodos podran conformar una nueva y amplia base para la clasificacin de enfermedades poco clasificadas hasta ahora y para otros procesos biomdicos. Una de las aplicaciones clnicas obvias de esta estrategia es la identificacin del pronstico de las enfermedades con resultados variables. Esto ilustra la reciente identificacin de los perfiles de la expresin gnica asociados con la supervivencia, corta y larga, en el linfoma (Alizadeh, 2000). En este artculo los autores explican que extrajeron ARN poliadenilado de lineas d e clulas de leucemia y de linfoma, as como tejido linfoide humano normal Los ADNc marcados con fluorescencia de esos extractos fueron unidos a las series que contenan secuencias de 17.856 clones moleculares representantes de clulas B del medio germinal, de clulas de leucemia y de linfoma y de una coleccin de genes de respuesta a mitgenos o citocinas. Cada ADNc experimental fue hibridado a la serie en la presencia del ADNc de control m a r cado con un fluorocromo de contraste. Este ADNc control se hizo con u n a gran cantidad de ARN linfoide, cuyas alcuotas fueron utilizadas en c a d a experimento. Esto hizo posible la comparacin de los niveles relativos de la expresin entre todas las muestras experimentales. Los resultados se representaron y se analizaron con software disponible libremente (Eisen, 2000). Como ya se ha anticipado, los anlisis revelaron perfiles de la expresin caractersticos de la proliferacin y del estado de los restantes, as c o m o perfiles asociados a localizaciones anatmicas especficas, como el medio germinal, y perfiles asociados a los tipos de malignidad establecidos. No obstante, se hizo un avance significativo al identificar un nuevo perfil de la expresin gnica que podra pronosticar la supervivencia tan bien o mejor que los criterios clnicos existentes. En particular, el nuevo perfil identific correctamente a un subgrupo de pacientes con alto nesgo de mortandad prematura, incluso entre pacientes clasificados previamente por criterios clnicos de ser de bajo riesgo. Futuros avances en el diagnostico, la clasificacin y el pronostico

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR
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esperan a que los mtodos basados en las microseries los descubran en un futuro cercano. Como se ha enfatizado antes, el lector debera tomar buena nota de que lo que hace que esto sea posible no es el mero perfeccionamiento de los equipos, sino el desarrollo de ms estrategias analticas sofisticadas, para estar al da con los datos ms complejos generados por esos equipos (Bassett. 1999).

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CAPiTUlO 6 1

T E C N O L O G I A S D E LA H I B R I D A C I N E N SERIE

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C A P T U L O

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Aplicaciones de la citogentica en la patologa moderna

Constance K. Stein, Ph.D. DEFINICIONES CITOGENTICA Cromosomas Anomalas cromosmicas CLNICA Aplicaciones clnicas Desrdenes citogenticos Otros fenmenos citogenticos 1304 1305 RESUMEN BIBLIOGRAFA 1331 1331

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Cariotipo: Es la constitucin del cromosoma de un individuo. Tambin es una figura que muestra la disposicin de los cromosomas emparejados de una clula en una secuencia estndar. DEFINICIONES Diploide: Es la presencia de dos copias de cada cromosoma nico por cada clula. En el hombre los cromosomas estn dispuestos en pares y el nmeComo en todas las reas de la medicina, la gentica, para su comunicaro diploide (2N) es 46. cin, depende del uso apropiado de los trminos especficos. Las siguientes Haploide: Es una copia de cada cromosoma nico. En el hombre los gamedefiniciones proporcionan el vocabulario bsico para este campo. tos son haploides (N = 23). Gen: Es una secuencia de nucletidos que representan una unidad funcional Homocigoto: Ambos alelos estn en un locus al mismo tiempo. (En el sistema ABO, un complemento AA representa la homocigosidad). de la herencia; una regin de ADN que codifica para un producto, bien un Heterocigoto: Los dos alelos en un locus son diferentes. (En el sistema ARN o bien una protena. ABO, un complemento AO representa la heterocigosidad.) Cromosoma: Es una estructura altamente ordenada compuesta de ADN y Hemicigoto: La presencia de un cromosoma solamente o de un segmento protenas que porta la informacin gentica. En el hombre hay 46 cromodel cromosoma en vez de los dos normales; se aplica a los varones y somas ordenados en pares. machos con un cromosoma X solo. Autosoma: Son todos los cromosomas excepto los cromosomas X e Y, a los Genotipo: Es la constitucin gentica de un individuo o de un organismo (es que se les denomina cromosomas sexuales. decir, qu alelos estn presentes). (En el sistema ABO, AA, AO. BB. BO, Cromosomas homlogos: Son los cromosomas hermanos, miembros de AB y 00 son genotipos.) un par de cromosomas en el que uno es heredado de la madre y el otro del Fenotipo: Es la apariencia de un individuo como resultado de la interaccin padre. del genotipo y del medio ambiente. (En el sistema ABO. los tipos de sanLocus: Es la posicin de un gen en un cromosoma. gre A, B y 0 representan la expresin genotpica de los alelos de un indiviAlelo: Es una forma alternativa de un gen que ocupa el mismo locus. Un alelo duo determinado.) puede ser el resultado de una mutacin. Hay un mximo de dos alelos por Alelo dominante: Es un alelo que es expresado cuando est presente en una cada complemento del cromosoma diploide (un alelo por cromosoma), pero sola dosis (esto es, que "domina" a los otros alelos presentes). (En el sistedentro de una poblacin pueden existir mltiples alelos.

L a gentica, en la medicina actual, es uno de los campos que progresa ms rpidamente. La investigacin est identificando continuamente nuevos genes y mutaciones asociados con las enfermedades. Las nuevas tcnicas de laboratorio en gentica molecular y citogentica proporcionan mtodos mejores para el diagnstico y el tratamiento de los pacientes. Las perspectivas de la terapia gnica y las posibilidades de curar algunas enfermedades genticas son prometedoras. A la gentica se la define, en general, como el estudio cientfico de la herencia, pero en la medicina de los laboratorios clnicos el inters se centra en dos subespecialdades en este campo: 1 ) la gentica humana, el estudio de la herencia en el hombre, y 2) la gentica mdica, el estudio de las variaciones genticas humanas significativas para la medicina. La gentica mdica se puede subdividr en cinco grupos, dos campos especialmente clnicos (gentica clnica y gentica consultiva) y tres ciencias de laboratorio (citogentica, gentica molecular y gentica bioqumica). Este captulo desarrolla con mayor intensidad la citogentica, y en el Capitulo 66 se exponen los diagnsticos moleculares.

Mutacin: Es un cambio hereditario permanente en la secuencia del ADN genmico. ste se puede manifestar tanto en los niveles citognicos c o m o en los moleculares. No todas las mutaciones son sucesos negativos, Muchas de ellas son benignas (p. ej.. el color de ojos azul) y algunas tienen efectos positivos (p. ej., el carcter de clula falciforme en pases con un riesgo significativo de malaria). Un individuo que tenga una mutacin constitucional (es decir, una mutacin presente en cada clula del cuerpo) puede transmitir la mutacin a toda su progenie por la transmisin de lnea germinal. En algunos casos, de manera notable en el cncer, puede surgir una mutacin adquirida en una sola clula somtica. Esta mutacin estar limitada al clon compuesto de productos mitticos de la clula original mulante y no ser trasmitida a la progenie del individuo. En casos raros de mosaicismo gonadal puede aparecer en las gnadas una mutacin adquirida de novo, dando como resultado una poblacin mixta de gametos normales y mutantes. La progenie que recibe la nueva mutacin puede presentar un fenotipo que no est presente en ninguno de los progenitores.

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APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

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ma ABO, A es domname sobre 0, igual que un genotipo AO tiene como resultado a un fenotipo con el tipo de sangre A. De forma similar, la presencia de pigmento [T] es dominante de la ausencia de pigmento [t] [esto es. el albinismo], de manera que Tt tiene como resultado la pigmentacin.) Alelo recesivo: Es un alelo que est expresado solamente cuando es homocigoto en un organismo diplode. (En el sistema ABO, el grupo de sangre O slo se ve con un genotipo 00: O es recesivo de A y de B. Igualmente, el albinismo [t] es recesivo de la pigmentacin [T], y un fenotipo albino slo aparece con un genotipo tt.) Alelos codominantes: Son los alelos que muestran no dominacin o que no son recesivos el uno al otro en un organismo diploide, pero que cuando estn presentes juntos, ambos estn expresados completamente. (En el sistema ABO. A y B son codominantes, igual que un genotipo AB expresa antgenos A y B.) Clasificacin independiente: Es la clasificacin azarosa de los cromosomas (paternos y matemos) en los gametos: la oportunidad de heredar un cromosoma determinado de uno de los progenitores es del 50%. Enlace: Es la presencia de dos o ms genes en el mismo cromosoma que tienden a ser heredados juntos. Sobrecruzamiento: Es el intercambio fsico de material gentico entre los cromosomas homlogos. Recombinacin: Es la generacin de combinaciones allicas nuevas en los cromosomas, normalmente por entrecruzamiento. Mitoss: Es la divisin somtica de la clula en la que se replica el ADN y se distribuye, uniformemente, a dos clulas hijas iguales. Meiosis: Es la divisin celular en las gnadas que produce los gametos. Una sola replicacin del ADN es seguida de dos divisiones celulares, lo que reduce el contenido total de ADN de una clula de 2N a N. La recombinacin se produce para incrementar la diversidad gentica dentro de una poblacin. No disyuncin: Es el error de los cromosomas o de las cromtidas para separarse hacia los polos opuestos en la divisin celular. Normalmente da como resultado un cromosoma de ms o uno de menos en una clula.

no incluye 46 cromosomas ordenados en 23 pares (Fig. 62-1). Uno de los miembros de cada par se hereda de la madre y el otro del padre. Se sabe que 22 pares son autosomas y se presentan como homlogos los unos de los otros (es decir, que no se pueden distinguir unos de otros). El par 23. incluye a los cromosomas sexuales, que son homlogos en las mujeres o hembras que tienen dos cromosomas X y no homlogos (estructuralmente diferentes) en los hombres o machos que tienen un cromosoma X y uno Y (Fig. 62-1). Los genes son codificados en el ADN y estn ordenados a lo largo de la longitud de los cromosomas. La longitud absoluta de los cromosomas variar durante el ciclo celular, pero su mayor condensacin se alcanza en la metafase, que es cuando se puede observar a los cromosomas con ms facilidad. Debido a esto, los cromosomas de la metafase son la base de la mayoria de los estudios citogenticos.
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Estructura

del cromosoma

Un solo cromosoma en metafase est compuesto de dos dobles hlices de ADN. A cada doble hlice se la denomina cromtida: las dos cromtidas se mantienen unidas por una regin hasta ahora no replicada de ADN que se conoce como centrmero o constriccin primaria. El centrmero acta como una seal y divide al cromosoma en dos regiones diferentes conocidas como brazos (Fig. 62-2A). Al brazo ms corto se le designa brazo p y al ms largo brazo q. Cuando el centrmero est casi equidistante de ambos extremos, se dice que el cromosoma es metacntrico, pero si est ms cerca de un extremo que del otro, el cromosoma es submetacntrico (Fig. 62-26). Cmco pares de cromosomas acrocntricos modifican los brazos cortos con tallos que slo contienen copias mltiples de genes de ARNr cubiertos por una caperuza producida por un telmero modificado, denominado satlite (Fig. 62-2A). El extremo de un cromosoma es el telmero. Se sabe que estas regiones estn compuestas de ADN repetido en tndem con la secuencia (TTAGGG) que funciona para estabilizar a los cromosomas. Los mecanismos de la replicacin del ADN son de tal forma que no todo el ADN telmero se puede replicar en cada divisin, por lo que con el paso del tiempo se produce un acortamiento de los telmeros. Se da por sentado que la prdida total de los telmeros lleva a un aumento de las aberraciones cromosmicas, que, en parte, pueden ser las responsables del proceso de enveiecimiento humano (Harley. 1990; Wright, 1992: de Lange. 1998).

CITOGENTICA
A la citogentica se la define como la ciencia que combina los mtodos y los hallazgos de la citologa y de la gentica para investigar la herencia a nivel celular. Esto incluye la evaluacin cuidadosa de los cromosomas, estructuras compuestas de cido desoxirribonucleico (ADN) de doble hlice que estn unidas con protenas histonas y no histonas. Slo 16 aos despus de que Mendel estableciera que la gentica era un nuevo campo de la ciencia, Walther Fleming, en 1882. le el primero en observar cromosomas en clulas tumorales, haciendo de la citogentica uno de los campos ms antiguos de la gentica. Poco despus de comenzar el siglo xx se estableci la importancia de los cromosomas sexuales, y en 1959 se utilizaron por primera vez los estudios citogenticos en las investigaciones de los laboratorios clnicos. La capacidad para detectar cambios en la estructura de los cromosomas, y de correlacionarlos directamente con la enfermedad, y las anomalas fenotipicas en los individuos demostr que era un gran avance para los diagnsticos clnicos. Pasado el tiempo, se han acrecentado el nmero y los tipos de los estudios, y muchos de los anlisis que se han hecho se han convertido en el "estndar oro" para los diagnsticos. En la actualidad, cuando cada vez se clonan mayor nmero de genes de enfermedades, el nfasis en el desarrollo de anlisis moleculares de mutacin directa es cada vez mayor (vase Cap. 66). Todos estos estudios funcionan bien cuando el diagnstico se sabe o se sospecha, pero en ausencia de un desorden conocido, la citogentica an conserva su posicin como el nico anlisis de laboratorio clnico que es capaz, con un solo anlisis, de examinar la constitucin celular gentica de un individuo. En consecuencia, las aplicaciones clnicas de los anlisis citognicos se pueden encontrar en todos los campos y en todas las edades, desde el diagnstico prenatal a la evaluacin del cncer.

Cultivo

celular

Para hacer un anlisis cromosmico, las clulas de un paciente se deben cultivar in vitroa fin de obtener clulas en metafase. Como promedio, las clulas humanas se dividen una vez cada 24 horas, de forma que slo un 1% de la poblacin celular se divide en un tiempo determinado. Sin embargo, algunas clulas, como los linfocitos en un individuo sano y normal, no se dividen en absoluto, por lo que se han desarrollado tcnicas especiales de cultivo para estimular la divisin de las clulas y as aumentar la produccin de clulas en metafase. Especmenes. Se puede utilizar, prcticamente, cualquier muestra de clulas, siempre que contenga clulas viables y nucleadas. Sin embargo, se puede favorecer a ciertos tipos de clulas, que son fciles de obtener y de cultivar, por medio de preparaciones cromosmicas. La muestra preferida para hacer estudios citognicos sistemticos de nios y de adultos es la sangre perifrica heparinizada. Dado que muchos otros anlisis de laboratorio dependen de estas muestras, el obtener una alcuota para los estudios citognicos en general es fcil de organizar y no resulta doloroso para el paciente. En los desrdenes hematolgicos, las muestras de mdula sea son las que proporcionan mejores resultados, ya que son el foco del proceso de la enfermedad. Una fuente adecuada de clulas en metafase la proporcionan los cultivos de fibroblastos obtenidos de una biopsia de piel o de piel extrada con un sacabocados. No se utilizan, habitualmente. los tejidos del hgado, del rion, de los pulmones y de los msculos, debido a la naturaleza invasora de los mtodos utilizados para la extraccin de estas muestras; sin embargo, estos tejidos proporcionan, con frecuencia, una fuente excelente de material si se obtienen como resultado de una prdida fetal o poco despus de la muerte, durante la autopsia. Las muestras de productos de la concepcin pueden con-

Cromosomas
Para comprender las anomalas lo primero es comprender en qu consiste una serie de cromosomas "normales". El complemento del cromosoma huma-

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

Figura 62-1. Cariotipo del complemento de c r o m o s o m a humano de un hombre: los 46 cromosomas estn ordenados en pares. Obsrvese el par no homlogo de los cromosomas sexuales con un cromosoma X y un cromosoma Y.

Figura 62-2. A, Esquema de la anatoma del c r o m o s o m ad e metalase que muestra marcas importantes. Se contrasta la forma del metacntrico con la del acrocntrico, que tiene la estructura del brazo corto modificada y est integrada por tallos y satlites. En todos los casos, el brazo corto, o brazo p, est orientado hacia arriba y el brazo largo, o brazo q, est orientado hacia abajo. 8, La posicin relativa del centrmero puede variar, originando c r o m o s o m a s metacntricos. submetacntricos y acrocntricos.

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tener una mezcla de tejidos fetales y maternales, y por esta causa se requiere un cuidado extra al establecer el cultivo (De Martinville. 1984). Para los anlisis prenatales, la muestra ms corriente es el lquido amnitico. que se consigue por medio de una amniocentesis. Este procedimiento se ejecuta con una gua ecogrfica para evitar al feto cuando el mdico introduce una aguja, a travs del abdomen y del tero de la madre, en la bolsa amnitica. Esto se hace, generalmente, a las 16 18 semanas de gestacin, en ese momento se pueden extraer entre 20 mi y 30 mi de fluido amnitico (orina fetal) sin riesgo para el feto. Las clulas presentes en la muestra son derivadas del feto y proporcionan material tanto para el anlisis citogentico como para el anlisis gentico molecular. El liquido contiene o-letoproteina (AFP), as como otras protenas y enzimas que forman el sustrato para otros anlisis prenatales (vase Cap. 22). El riesgo de prdida fetal debido a la ammocentesis es de aproximadamente un 0,5%. Otro procedimiento prenatal es utilizar una muestra de vellosidad connica (CVS), que proporciona el tejido de la placenta en desanollo (vellosidades cortnicas) (Blakemore, 1988; Rhoads. 1989) El procedimiento transabdominal transvagmal se efecta a las 10 14 semanas de gestacin y tiene un riesgo de prdida fetal de, aproximadamente, 1 entre 100. Si no se extrae lquido amnitico. no se pueden hacer anlisis relacionados o de AFP, aunque es posible hacer anlisis estndar citognicos. bioqumicos y moleculares. El resultado de una muestra de sangre umbilical percutnea (MSUP) o cordocentesis se convierte en un espcimen de sangre fetal que puede ser utilizado para hacer un rpido cariotipo o para estudios moleculares. Este procedimiento se efecta en fases de gestacin ms tardas (>20 semanas) y conlleva un riesgo mayor de prdida fetal (del 2% al 5%). Todas las muestras clnicas para los anlisis citognicos se deben recoger de la forma ms estril posible. La presencia de hongos o bacterias harn peligrar, muy gravemente, el estudio, debido a que las clulas procarilicas crecern demasiado y dejarn fuera de combate a cualquier clula humana presente. Para maximizar el nmero de clulas viables, las muestras deben ser llevadas al laboratorio tan pronto como sea posible despus de ser recogidas. La sangre, la mdula sea, el liquido amnitico y la vellosidad corinica se deben mantener a la temperatura del lugar donde se vayan a analizar, mientras que el tejido slido se transporta sobre hielo hmedo. Esta diferencia de temperatura en el transporte se debe a las condiciones innatas de la muestra. Las clulas de la sangre, de la mdula sea y del lquido amnitico se comportan como clulas individuales en un sustrato liquido, y la integridad de la muestra no se pone en peligro siempre que se mantenga esta relacin a una temperatura cercana a la corporal. Sin embargo, la obtencin de tejidos necesita clulas para ser extradas del cuerpo, dejando a las clulas rotas o agonizantes en la periferia de la muestra. L a liberacin de enzimas lisosmicas facilita la degradacin de las clulas muertas y bajo condiciones adecuadas atacarn a las clulas vivas contiguas. Si la temperatura se baja a unos 4"C, se inhibir la actividad de las enzimas y as se mantiene la viabilidad de la muestra. Tcnicas de cultivo celular. Dependiendo del tipo de clula, se pueden utilizar tcnicas de cultivo, bien de suspensin (dotando) o bien de monocapa (fijadas a una superficie). Las clulas sanguneas y las de mdula sea se cultivan en suspensin y se alicuotan directamente dentro de un medio de cultivo apropiado. Las de mdula sea se cultivan, normalmente, durante 24 a 48 horas, mientras que los linfocitos. para obtener un resultado mximo, necesitan estar en cultivo tres o cuatro das. Adems, dado que normalmente los linfocitos no se dividen en cultivo, tienen que ser inducidos mediante la utilizacin de un mitgeno. normalmente la fitohemaglutinina (PHA). de esta manera se pueden recoger despus las clulas de la metafase resultantes por medio de un inhibidor mittico, como colcemida. Las clulas del lquido amnitico y el tejido slido se cultivan in silu como una monocapa. Primero se disgregan los tejidos y VC utilizando un tratamiento de colagenasa suave y a continuacin se esparcen las clulas individuales sobre cubres de cristal y se cubren con medios de cultivo. En las muestras de lquido amnitico, las clulas, antes de ser colocadas en placas, deben ser disociadas del lquido por medio de la centrifugacin, y se las deja para que formen colonias in silu. Los tiempos normales de cultivo son de 5 a 10 das para el VC y los amniocitos y hasta de dos semanas para los cultivos de tejidos slidos. Una vez que se ha conseguido el mximo crecimiento, se recolectan todos los tipos de clulas utilizando tcnicas similares. Las clulas son agrandadas

Figura 62-3. Diseminacin cromosmica de melafase. Los cromosomas de una sola clula segn se ven en un portaobjelos de microscopio.

hpotnicamente (hasta el punto de que la membrana de la clula se eslire, pero no se rompe) y luego son fijadas. Al soplar suavemente el cubre que contiene clulas lijadas de los cultivos in silu. se rompe la membrana de la clula y los cromosomas de la melafase se dispersan. Aunque en la mayora de los laboratorios todava se efectan estos pasos manualmente, se ha desarrollado un recolector robtico automatizado que puede procesar gran cantidad de cultivos con bastante eficiencia. En los cultivos de suspensin, las clulas fijadas se deben colocar, mediante un goteo, sobre una placa de microscopio limpia, la cual, mecnicamente, rompe las membranas y deja a los cromosomas ligeramente separados los unos de los otros, pero en u n a regin diferente ocupada por una sola clula (Fig. 62-3). Las placas, despus de secarlas con un secador, estn listas para la coloracin. En algunos casos se mejora la calidad de la coloracin envejeciendo las clulas a 65 C durante 30 a 60 minutos.

Coloracin
Los cromosomas se tien habitualmente utilizando Giemsa, un tinte de carga positiva que se une a una molcula de ADN de carga negativa. La tripsinizacin suave de los cromosomas antes de la tincin aparentemente debilita las interacciones de la proteina con el ADN, lo que da como resultado un patrn definido de regiones alternativamente claras y oscuras, al que se le denomina patrn de bandas (bandeo G para bandeo Giemsa) (Yunis. 1973: Burkholder. 1977; Holmqust. 1982). Cada par de cromosomas tiene un patrn de bandas nico que est representado esquemticamente como un ideograma (ISCN. 1995) (Fig. 62-4), y que se utiliza para identificar a cada cromosoma y a las sub-regiones cromosmicas. Si bien el bandeo G es el adecuado en la mayora de las situaciones, se puede obtener informacin adicional de la estructura del cromosoma utilizando otras tecnologas especiales de tincin. Las coloraciones especiales ms corrientes son el bandeo Q. el bandeo C y el bandeo R. En un principio se utiliz el bandeo Q. o tincin de fluorescencia de guinacrina, para hacer cariotipos ordinarios (Comings. 1975). Sin embargo, y debido a que la fluorescencia es transitoria, ahora ha sido reemplazado por el bandeo G, que admite u n a preparacin de coloracin permanente. En la actualidad el bandeo O se aplica principalmente para lograr una identificacin rpida del cromosoma Y . El extremo distal del brazo largo del cromosoma Y esta compuesto de heterocromatina y es la regin fluorescente ms brillante en una metalase humana (Fig. 62-5A). En los casos de genitales ambiguos, una preparacin rpida de bandeo Q puede, normalmente, contestar a la pregunta de si hay presencia o ausencia

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Figura 62-4. Ejemplos de ideogramas de los c r o m o s o m a s 1.7,14 e Y que muestran el patrn estndar de las bandas claras y de las bandas oscuras.

del cromosoma Y en el paciente. El bandeo C, constitutivo o bandeo de centrmero. se utiliza para evaluar la heterocromatina constitutiva o para determinar si un cromosoma tiene dos centrmeros (dicntrico). Normalmente el centrmero aparece como un solo punto oscuro en un cromosoma teido en su totalidad con una coloracin clara (Holmquist, 1979) En el caso de un cromosoma dicntrico, la presencia de dos regiones oscuras permitir identificar con claridad a los dos centrmeros (Fig. 62-5S). El bandeo R, o bandeo inverso, presenta a los cromosomas con el mismo patrn de bandeo que el que hemos visto en el bandeo G, pero las bandas claras y las oscuras estn invertidas, de ah su nombre. Debido a que los telmeros de los cromosomas tienen tendencia a ser pequeos, bandas de tincin claras, si se utiliza un bandeo G estndar puede que no sea fcil detectar una delecin. Sin embargo, en el bandeo R los telmeros se colorearan como bandas oscuras y su ausencia, como resultado de una delecin, es ms obvia.

ra del cromosoma. Para cumplir con los objetivos diagnsticos clnicos, en casi todas las circunstancias es suficiente el bandeo G de los cromosomas metafsicos. Sin embargo, quiz no se puedan resolver algunos desrdenes que estn asociados con deleciones muy pequeas del material cromosmico a este nivel. En estas situaciones se utilizan anlisis de alta resolucin. Las clulas se cultivan de manera que se puedan recolectar en una etapa ligeramente ms temprana de la divisin celular, la prometafase. En este m o m e n t o de la divisin celular, los cromosomas estn menos condensados. haciendo que sea ms fcil detectar la presencia de pequeas anomalas. El anlisis lo ejecuta un leenlogo examinando las clulas a travs del microscopio, y una vez que se ha completado el estudio se h a c e una determinacin de si el complemento de cromosomas es "normal" o "anormal". Para la documentacin se fotografan las clulas de la metafase utilizando una cmara de 35 m m montada en un microscopio. Luego se revela la pelcula, se hacen las copias, se recortan los cromosomas y se pegan en u n a hoja de papel con cinta adhesiva o con pegamento. Los pares homlogos estn organizados, de mayor a menor, en siete grupos a los que se les designan letras de la A la G. ms el par de cromosomas sexuales. Siguiendo la costumbre, el brazo ms corto, denominado brazo p, est orientado hacia arriba y el brazo ms largo, o brazo q, est orientado hacia abajo. El producto final es una ilustracin de los cromosomas de una clula especifica y se la conoce c o m o cariotipo (Fig. 62-1).

Anlisis del carie-tipo

Para efectuar un anlisis citogentico es esencial poder identilicar cada cromosoma, rpida y exactamente, y determinar cundo se presentan anomalas cromosmicas. El primer paso que hay que dar es contar el nmero de cromosomas presentes en la clula que se est evaluando. El nmero de centrmeros activos define el nmero total de cromosomas, que sern 46 en una clula diploide humana normal. El que haya cromosomas de ms o de menos indica una anomala numrica potencial. El cultivo in vitro puede dar como resultado artefactos de cultivo, por eso no se utiliza una sola clula para definir el complemento de cromosomas de un paciente, asi que para un estudio clinico tpico se necesitan analizar de 15 a 20 clulas: en los casos de mosaicismo o para otras situaciones especiales tal vez haya que evaluar de 10 a 30 clulas adicionales. Los cromosomas individuales se identifican basndose en el tamao total de cada cromosoma, en la posicin de su centrmero y en el patrn de bandeo. En este momento se debera detectar cualquier variacin en la estructu-

Imagen asistida por ordenador

Los cariotipos que proceden de fotografas dan una imagen de alta resolucin, pero requieren tiempo y esfuerzos significativos. En los ltimos aos los ordenadores han tenido un gran impacto en los laboratorios clnicos, ya que permiten la automatizacin de muchas tareas tediosas y s e han hecho un hueco en los laboratorios de citogentica bajo el formato de sistemas para hacer cariotipos asistidos por ordenador. En lugar de una cmara de 35 mm, se monta en el microscopio una videocmara DCA (dispositivo de carga ac-

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piada). Utilizando un software especialmente diseado, se capta la imagen de una clula en metafase usando un captador de imgenes estndar, se dgitaliza y aparece en el monitor del ordenador. Llegados a este punto, el software permite modificar la imagen, aclarndola, oscurecindola o cambiando el contraste, de modo que se pueden hacer mltiples modificaciones de los cromosomas, incluso enderezarlos e importar cromosomas de otros campos. Despus se puede hacer un cariotipo, utilizando una sub-rutina de reconocimiento del patrn que reconocer los cromosomas, automticamente, y los emplazar en sus lugares adecuados, en forma de cariotipo. La precisin de este procedimiento puede variar entre un 10% y un 85%, dependiendo del software y de la calidad de la imagen. Despus de que el ordenador haya capturado a su "mejor husped", las correcciones adecuadas las debe hacer un tecnlogo citogentico especializado. Una vez que los cromosomas estn correctamente posicionados se pueden hacer las amplificaciones cosmticas adicionales para eliminar los bordes rasgados o residuos de posos. Luego se imprime la versin final del cariotipo en una impresora de alta resolucin. Aunque la calidad total no es tan alta como la de una presentacin fotogrfica, la utilizacin del sistema por ordenador conlleva un enorme ahorro de tiempo. Un tecnlogo especializado puede tardar en hacer un cariotipo ordinario, desde la captura hasta la impresin, de 15 a 20 minutos por trmino medio. Otra gran ventaja de los sistemas asistidos por ordenador se encuentra en la microscopa de fluorescencia.

Hibridacin in situ fluorescente

Los tipos clsicos de coloracin citogentica que se han descrito son el resultado de los tintes que se unen al ADN o a las protenas de un cromosoma y que permiten su visualizacin por medio de la microscopa ptica. La hibridacin in situ. que es la combinacin de la biologa molecular y de la citogentica, abri otra puerta que hizo posible las investigaciones de las anomalas cromosmicas posteriores. En stas, en lugar de un tinte, es una sonda molecular (esto es, un fragmento de ADN) la que se une al cromosoma. En los primeros estudios se marc a la sonda con una mezcla radiactiva (normalmente tritio), de manera que, despus de su exposicin a un pelcula de rayos X durante un tiempo de 5 a 1 0 das, se pudo detectar un patrn de granos de plata que identificaban la localizacin cromosmica de la sonda. Esta tcnica facilit el poder hacer el mapa gnico por medio de la identificacin de los locus del gen (Trask. 1991). La autorradiografa tuvo su utilidad, pero slo se poda utilizar una sonda cada vez. necesitaba una cantidad de tiempo significativa y haba un grado de dispersin de los granos de plata que requera un anlisis estadstico de los datos obtenidos. A mediados de los aos 80 (del siglo xx), se desarroll una variante de esta tcnica que ha demostrado ser extremadamente til en las aplicaciones clnicas. Esta nueva tecnologa, la hibridacin in situ fluorescente (HISF), es ms rpida, ms especfica y permite la utilizacin de mltiples sondas en un solo procedimiento de hibridacin. Adems, en vez de sondas marcadas con radiactividad, se utiliza una tincin fluorescente que se visualiza a travs de la microscopa de fluorescencia (Ledbetter, 1989). A pesar de que la HISF se puede utilizar para hacer mapas de genes, la meta, en las aplicaciones clnicas, es determinar si hay un gen o una mutacin especfica, por eso la sonda molecular tiene que estar bien caracterizada y tiene que ser especfica para el locus en cuestin. Hay tres tipos bsicos de sondas. La sonda de secuencia nica aislada de un gen causante de la enfermedad clonado y que se utiliza para identificar la presencia o ausencia de ese gen (Cherf, 1989; Lindsay, 1993). Las sondas de coloracin del cromosoma son, en realidad, un cctel de muchos fragmentos de ADN nicos recogidos a lo largo de toda la longitud de un cromosoma, de modo que en la hibridacin siguiente todo el cromosoma emite luz fluorescente (Fig. 62-6A). Las sondas de secuencias repetitivas son aisladas de las regiones de telmeros o de centrmeros. Las sondas de centrmeros se utilizan, generalmente, para la enumeracin de los cromosomas (es decir, para detectar el aumento o la prdida de cromosomas especficos) (Figs. 62-66 y C) (Lichter, 1990). Las sondas de telmeros se utilizan, a menudo, para caracterizar los reordenamientos crpticos (esto es, para determinar si ambos telmeros de un cromosoma estn presentes y localizados en el cromosoma correcto o si se ha producido una delecin o reordenamiento). Tcnica HISF. La HISF combina los mtodos de la biologa molecular y de la citogentica, como en la hibridacin in situ original. Las clulas se cultivan y se recolectan, y se preparan las placas exactamente igual que para un estudio citogentico clsico. Luego se desnaturaliza el ADN de las placas y se deja que una sonda molecular de una sola hebra marcada con fluorescencia hibride al ADN cromosmico. utilizando una temperatura de anillamiento que favorece la hibridacin de las regiones homologas del ADN (Fig. 62-7A). Despus de un periodo de hibridacin adecuado, se eliminan los restos de la sonda por medio del lavado y al ADN no hibridado se le aplica una contracoloracin con otro fluorocromo para poder visualizar el complemento de cromosoma en su totalidad. La evaluacin de la clula se hace utilizando un microscopio fluorescente con la luz de una bombilla de mercurio de 100 W combinado con juegos de filtros excitadores apropiados. En un microscopio fluorescente tpico slo se pueden visualizar tres colores como mximo, debido a las limitaciones pticas de los filtros de cristal. Se puede utilizar una cmara de 35 m m unida al microscopio para la documentacin del estudio. Sin embargo, si se utiliza un sistema asistido por ordenador para obtener las imgenes fluorescentes, se obtienen resultados m u y superiores. Adems, los paquetes de software adecuados permiten la amplificacin de las seales dbiles y la nitidez de la imagen. Uno de los elementos de la HISF ms crticos es la eleccin de una sonda o sondas especficas, ya que ayudarn a dar respuesta a las preguntas clnicas. Por ejemplo, una de las aplicaciones clnicas de la HISF ms tiles es la deteccin de microdeleciones que son demasiado pequeas para poder ser vistas utilizando la citogentica clsica (Figs. 62-76 a D). El gen debe ser conocido y la sonda utilizada debe ser homologa a la regin del gen que es eli-

Figura 62-5. A. Metalase de bandeo-0 que muestra la fluorescencia brillante del c r o m o s o m a Y (flecha). 6, Cromosomas de bandeo-C que muestran a los centrmeros teidos de oscuro. Se detect un cromosoma dicntrico con dos bandas oscuras (dos flechas).

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR dor para los cromosomas de inters (Fig. 62-70). Se puede hacer el estudio en clulas en metalase, asi como en las de mterfaz. si se utiliza un sistema de color dual. Las sondas de coloracin de cromosomas son muy tiles para identificar reordenamientos complejos o cromosomas marcadores. Si un paciente tiene un cromosoma anormal con material extra de origen desconocido, se podra utilizar la tincin del cromosoma para identificar la fuente del ADN extra. Esto puede ayudar en el diagnstico o en el pronstico del individuo. En el caso de un paciente con 46 cromosomas, incluyendo un cromosoma X y un cromosoma marcador no identificado pequeo, ser importante determinar si el origen del marcador es un cromosoma X o uno Y. Esto se puede hacer utilizando tintes de cromosomas en los cromosomas X y en los Y marcados con lluorocromos diferentes. Las sondas HISF proporcionan mucha informacin cuando se evalan en las clulas en metalase, donde es posible identificar al cromosoma especifico al que hbrida la sonda. Sin embargo, en algunas preparaciones celulares quizs estn presentes muy pocas clulas en metalase, y en estos casos se puede obtener informacin con sondas de secuencia nica o de secuencia repetida en los ncleos de inlerfaz. Pero aqu aumentan los problemas tcnicos, debidos a la prdida azarosa de la seal, a las seales extra y a las seales solapadas en las clulas, asi que se deben contar clulas adicionales (un total de 50 a 200) para obtener un resultado estadstico significativo. HISF multicolor. Una de las ventajas que tiene la HISF sobre la vieja hibridacin in silu es su capacidad de hibridar mltiples sondas a una sola

minado, la regin critica. La hibridacin con la sonda deberia aparecer como una seal fluorescente slo en el locus diana. Si aparece una seal, es que est presente el ADN complementario a la sonda, por tanto no hay delecin. Sin embargo, la ausencia de la seal indica que existe la delecin (esto es, no hay secuencia de ADN presente en el cromosoma que es complementario a la sonda, por tanto la hibridacin no puede producirse). Un individuo no afectado deberia tener dos seales por clula en cada gen autosmico, una seal en cada cromosoma del par (Fig. 62-8A). Un individuo afectado por una delecin deberia tener una sola seal por clula, mostrando un cromosoma normal y otro delecionado (Fig. 62-86). Uno de los problemas de los anlisis de delecin es que lee la ausencia de seal como una indicacin positiva de la delecin. El fracaso de la hibridacin tambin puede tener como resultado la ausencia de la seal. Para eliminar esto como fuente de errores, se deben evaluar 20 clulas como minimo y todas las clulas deben concordar en el cmputo de la seal. Si se sospecha de que existe mosaicismo, se deben examinar clulas adicionales. Adems, las sondas de secuencia nica se utilizan actualmente en combinacin con una sonda control (Fig. 62-7C). La segunda sonda se localiza en el mismo brazo del cromosoma que el locus de delecin. Se puede marcar con el mismo lluorocromo que a la sonda de locus de delecin, pero se ha visto que resulta ms fcil interpretar los resultados de la hibridacin si se marca a la sonda de control del sitio con un luorocromo de color diferente. Se deben ver dos seales de control claras en todas las clulas evaluadas y luego se pueden registrar las seales que se corresponden con el locus de enfermedad. Esto proporciona un control de hibridacin, asi como un marca-

Figura 62-6. A. Sonda de tincin del c r o m o s o m a completo que hace resaltar a los dos c r o m o s o m a s X en una clula de m u j e r B y C. Sonda de centrmero de secuencia repetida para el c r o m o s o m a 21. B. A la izquierda se ve la tnsoma 21 en un ncleo de mterfaz y a la d e r e c h a en u n a metalase. C, Complemento normal de dos copas del c r o m o s o m a 21 visto en mterfaz (derecha e izquierda) y en u n a melafase (centro).

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APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

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Figura 62-7. A. Esquema de la tecnologa HISF. El ADN derivado de un gen conocido se separa quedando una sola hebra, se m a r c a con una seal fluorescente y luego se le hbrida de vuelta a los cromosomas de una clula en metafase. B.CyD. Dibujos de cromosomas metalsicos fluorescentes con sondas marcadas que hibridan a las dianas (flechas) 6. Seales duales que indican la hibndacin de ambos alelos del gen diana. C. El gen diana est sealado en rojo y la sonda de control en verde. Hibridacin completa de todos los alelos. D, Hibridacin de ambos controles (verde), pero la presencia de un nico gen diana solamente indica la delecin de un alelo.

Figura 62-8. Deteccin medame HISF de una microdelecin del cromosoma 22 asociada al sndrome DiGeorge y al sndrome velocardiotacial. A. Un individuo "normal" con no delecin muestra la presencia de una seal roja (locus de gen) y de una seal verde (locus de control) en c a d a cromosoma 22 B. Paciente con una delecin que se visualiza en un c r o m o s o m a con una nica seal verde solamente. El cromosoma 22 homlogo es "normal", con una seal roa y una seal verde.

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rojo:amanllo
13 21 IX Y 100:0 75:25 25:75 5(1:50

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13
21 IX

rojo
verde rosa

Y
X

blanco
amando

(l:l(K)

Figura 62-9. HISF multicolor A. Diagrama de tincin real de cinco sondas de combinacin. La tabla de la derecha muestra las proporciones de colores relativas para c a d a sonda utilizada. 8, Diagrama de la imagen obtenida de un ordenador de la m i s m a clula que muestra el color artificial q u e se le ha asignado (la clave se nuestra en el recuadro a la izquierda de la imagen).

placa y obtener un conocimiento mejor de los reordenamientos de cromosomas (Schrock. 1996; Speicher. 1996). Sin embargo, incluso aqui existen lmites. Una imagen fluorescente se produce por la luz de una bombilla de mercurio que pasa a travs del filtro estimulador, da en el fluorocromo de la placa y transmite la imagen del color adecuado a la lente del microscopio para su visionado. Cada fluorocromo requiere su propio filtro, por eso. para cada color adicional que se desee conseguir, la luz debe pasar a travs de diferentes grosores del cristal. Por tanto, las propiedades pticas de la luz y del cristal limitan a tres el nmero de colores que pueden verse. Sin embargo, con el advenimiento de los sistemas asistidos por ordenador, ya es posible distinguir mltiples colores en una sola hibridacin El ordenador no "ve" realmente ms colores, pero puede detectar, meior que el OJO humano, diferencias sutiles en las tonalidades. Para hacer un examen relativamente sencillo, se utilizan dos fluorocromos, que, mezclados en proporciones variables, dan una gama de colores (Fig. 62-9A). El ordenador registra cada color como una tonalidad diferente de gris y luego asigna un color nico a esa tonalidad para su presentacin en el monitor (Fig. 62-98). Esa imagen multicolor se puede imprimir despus, aunque los colores de la impresin son completamente diferentes a los que en realidad haba visto el sistema. A partir de la asignacin de un color nico por ordenador, se han desarrollado combinaciones de fluorocromos que permiten la deteccin de cada uno de los 24 cromosomas diferentes (Red. 1992a. 1992b; Divane. 1994).

patibles con la vida y que se detectan, principalmente, en tejidos procedentes de abortos espontneos. La triploida (Fig 62-1OA) puede estar causada p o r un error en la gametognesis de una de las divisiones meiticas que da origen a un gameto 2N. el cual, al ser fertilizado por un gameto haploide del otro progenitor, produce un zigoto triploide. Por otro lado, un complemento 3N puede estar derivado de la dispermia (fertilizacin de un huevo haploide por dos espermatozoides), y esto, generalmente, da como resultado una masa parcial hidatidiforme (vase Cap. 20) La tetraploida es un acontecimiento posmeitico y se presenta como una duplicacin de un complemento diploide (XXXX o XXYY). que seguramente se debe al error de una escisin de la divisin mittica temprana en el zigoto. Aneuploidia. Los errores de no separacin que dan como resultado la aneuploidia son ms corrientes. En estos casos un solo par de cromosomas no logra separarse correctamente en la divisin, originando un cromosoma extra o perdiendo un cromosoma por clula. Algunas veces pueden verse involucrados ms de un par de cromosomas, pero estos casos son extremadamente raros. Los errores de la no disociacin pueden producirse tanto en la meioss como en la mitosis. La no disociacin mittica temprana en el zigoto puede dar lugar a un individuo con el complemento de cromosoma aberrante en todas las clulas del cuerpo, pero un error en la divisin ms tardo produce un mosaico (un individuo con dos lineas de clulas que nicamente se diferencian en un solo cromosoma). Los errores meisicos producen gametos, bien con un cromosoma extra o bien con uno de menos (Fig. 62-11) (Angel. 1994). Una vez fertilizados, el primero dar una concepcin trismica al cromosoma no disociado (Fig. 62-1 Ofi) y el ultimo dar una monosoma. Tanto la trisomia como la monosoma pueden producirse en cualquier cromosoma, pero la mayora de slas son incompatibles con la vida y se eliminarn de forma espontnea. Por ejemplo, la trisomia 16 es la trisomia que se detecta, ms frecuentemente, en los tejidos procedentes de abortos espontneos, pero no se ha informado de ningn caso en seres nacidos vivos. Las trisomias autosmicas de seres nacidos vivos incluyen los cromosomas 13.18 y 21. Muy raramente se identifican pacientes con un complemento de cromosoma mosaico de trisomas 8. 9 22. Las tnsomas de los cromosomas sexuales son viables y estn bien documentadas (vide mira). La nica monosomia viable es la del cromosoma X (45,X). Ms adelante, en este capitulo se describirn las aneuploidas clnicamente significativas. En los ltimos aos se ha detectado un efecto secundario de las concepciones aneuploides. Dado que las trisomias y las monosomias son, en gran parte, incompatibles con la vida, se asumi que podran dar lugar a la prdida del feto. Pero ahora se sabe que un pequeo fragmento de estas concepciones aneuploides es "rescatado" y sigue adelante para originar nios nacidos vivos. En caso de una monosoma. el rescate se produce por la duplicacin del nico cromosoma existente, que da como resultado un complemento de c r o m o s o m a con isodisomia uniparental para ese cromosoma (dos copias del m i s m o cromosoma heredado de un progenitor) (Fig. 62-12) (Ledbetter. 1995). Esto est desento en vanos casos publicados, en los que se demuestra que un nio afectado de fibrosis cistica (FC) es homocigoto a la mutacin AF508, aunque los anlisis moleculares de ambos progenitores revelaron que slo uno de ellos era el portador de AF508 (Spence, 1988; Voss, 1989). Esto se interpreta c o m o que la

Anomalas cromosmicas
Los anlisis citogenticos clnicos se han convertido en una parte importante de la medicina clnica, ya que el descubrimiento de una anomala cromosmica especfica puede explicar un problema fsico o una anomala fenotpica en el paciente y se la puede asociar directamente con el diagnstico de la enfermedad. El propsito del ensayo clnico es determinar si un individuo tiene un complemento de cromosoma diferente del patrn estndar de 23 pares de cromosomas de morfologa conocida. Hay dos categoras bsicas de vanaciones detectables a travs de la citogentica; 1) numrica y 2) de cambio estructural.

Anomalas

numricas

En el hombre y en otros mamferos los cromosomas se producen en pares, por lo que de los 46 cromosomas slo hay 23 especialmente diferentes. Un conjunto de 23 incluye el nmero haploide (N) de cromosomas, que es el nmero de cromosomas en un gameto. En el momento de la fertilizacin, se unen dos complementos haploides para formar un zigoto con 46 cromosomas, que es el complemento diploide (2N). Los errores en la divisin pueden dar lugar a complementos de cromosoma que tengan ms de 46 cromosomas o menos de esta cantidad. A los mltiplos exactos del conjunto haploide del cromosoma se le denomina euploidia. Y aneuploidia al aumento o a la prdida de uno o unos cuantos cromosomas Euploidia. La diploida, que es el estado normal de las clulas humanas, es una lorma de euploidia. Las euploidas anormales incluyen la triploida (3N = 69 cromosomas) y a la tetraploida (4N = 92 cromosomas), que no son com-

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APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

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concepcin fue una monosomia 7 no viable rescatada por la duplicacin del crom o s o m a 7 existente, que por casualidad era el portador de la FC. En el caso de una trisoma tambin es posible una situacin similar. Volvemos a repetir que la mayora de las tnsomas no son viables, pero si se pierde uno de los tres cromosomas, se restablece una disoma para ese par de cromosomas. En un conjunto de tres cromosomas la prdida de un solo cromosoma originar, dos de cada tres veces, un complemento con un cromosoma paterno y uno materno Iheterodisomia biparental). La tercera vez. los dos cromosomas restantes son de un solo progenitor (esto es, disoma uniparental). En esta situacin, la diferencia est en cul de las divisiones meiticas se produjo el error. Una disociacin en la primera divisin tendr como consecuencia una heterodisoma, es decir, dos cromosomas homlogos pero heterocigotos (uno de la abuela y otro del abuelo): sin embargo, un error en la segunda divisin originar copias duplicadas de un solo cromosoma, esto es, la isodisomia (Figs. 62-11 y 62-13). Podria pensarse que mientras que estn presentes un par de cromosomas no debera importar su origen especfico, pero los datos indican, firmemente, que la evidencia es otra. Los problemas de disoma uniparental frente a biparental y de isodisoma frente a heterodisoma tienen una enorme importancia para comprender los fenmenos de impronta, un t e m a descrito con detalle en el Capitulo 66 (Nichols. 1998; Hall. 1990; Cassidy. 1992: Petersen, 1992).

1) equilibradas, si todo el material cromosmico est presente y es funcional, pero est ordenado en una conformacin diferente, o 2) desequilibradas, si hay prdida y/o adicin de material cromosmico. Las reordenaciones equilibradas son, en general, clnicamente benignas y tienen tendencia a ser trasmitidas de forma estable, aunque pueden aumentar el riego de errores en la meiosis. que originarn desequilibrios cromosmicos en los letos o en los nios nacidos vivos. Los complementos de cromosoma desequilibrados estn, generalmente, asociados a un fenotipo clnico anormal que a menudo incluye el retraso en el desarrollo y el retraso mental. La delecin es la prdida de una parte de un cromosoma y produce la monosomia parcial del cromosoma involucrado (Fig. 62-14). Las deleciones varan en tamao, desde bastante grandes a m u y pequeas, y pueden ser terminales (Fig. 62-15A). la prdida de un fragmento del cromosoma que contiene al telmero, o intersticiales (Fig. 62-156), la prdida de un trozo interno del cromosoma. Las roturas de los cromosomas, sobrecruzamientos desiguales, o los errores de no separacin comprendidos en las reordenaciones cromosmicas pueden dar como resultado una delecin. En general, las deleciones mayores originarn anomalas clnicas ms graves, debido a que faltan un mayor nmero de locus genticos. La duplicacin es la presencia de una copia adicional de un segmento del cromosoma, que origina una trisoma parcial en ese cromosoma (Fig. 62-14). Esta anomala puede ser tambin terminal o intersticial. Las duplicaciones autnticas parecen ser bastante raras y son, normalmente, espordicas. Las duplicaciones estn generadas por los mismos mecanismos que las deleciones y quiz sean la consecuencia recproca de estos procesos. Al igual que en las deleciones. cuanto mayor sea el fragmento duplicado del cromosoma, las anomalas clnicas tendern a ser ms graves. La inversin es el cambio de un segmento cromosmico respecto al ordenamiento gnico normal y necesita un mnimo de dos roturas en un cromosom a (Fig. 62-14). Las inversiones estn clasificadas como 1) paracntricas,

Anomalas estructurales del cromosoma

Los cromosomas no son estructuras estticas, sino que experimentan recombinaciones tanto en la meiosis como en la mitosis. Este es un proceso natural que es vital para generar variaciones en las especies, por eso est altamente regulado y rara vez se producen errores. Sin embargo, es posible que se produzcan reordenamientos cromosmicos que cambien la estructura de uno o de varios cromosomas. Estas anomalas son bastante variadas y con frecuencia son especificas del paciente. Las reordenaciones pueden ser

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Figura 62-10. Anomalas cromosmicas numricas. A. Complemento de cromosoma triploide (3N) con tres copias de cada c r o m o s o m a |69,XXY). Esta ilustracin contina en la pgina siguiente.

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

dos roturas que tienen lugar en el mismo lado del cenlrmero (esto es, en el mismo brazo), o 2) pericntricas, las roturas se producen en lados opuestos del centrmero y la inversin involucra a ambos brazos (Fig. 62-16/4). L a mayora de las inversiones son equilibradas, pero se pueden detectar anomalas clnicas si el cromosoma se rompe dentro de un gen e interrumpe la produccin normal de un producto gnico necesario. Existe un aumento del riesgo de error meitico y los portadores de la inversin muestran, frecuentemente, infertilidad o prdida fetal espontnea temprana debido a los productos cromosmicos desequilibrados. En la meiosis I, los cromosomas homlogos se emparejan y se origina la recombinacin. Para que un cromosoma invertido se empareje con su homlogo, se debe formar una estructura conocida como asa de inversin (Fig. 62166). Los gametos no sern impactados negativamente si no se produce la recombinacin y los cromosomas se separan normalmente. Sin embargo, el sobrecruzamiento dentro del asa de inversin puede originar producios meiticos desequilibrados. En la inversin paracntrica, los resultados de la recombinacin son, normalmente, no viables, por lo que hay una supresin de la recombinacin aparente (es decir, los nicos gametos viables producidos

proceden de cromosomas no recombmados) (Fig, 62-168). En las inversiones pericntricas es posible que los gametos con duplicacin cromosmica y delecin, o ambas, puedan ser derivados. En general, las inversiones pericntricas mayores pueden originar deficiencias en las duplicaciones ms pequeas y aumentan las probabilidades de que un nio nazca vivo, a pesar de que el desequilibrio cromosmico puede generar anomalas en ese nio. Una vez que se ha identificado al portador de la inversin, se puede utilizar el diagnstico prenatal para valorar los cromosomas del feto. Las translocaciones son las reordenaciones de dos o ms cromosomas no homlogos. Cada cromosoma se rompe una vez y los fragmentos se intercambian de lugar, originando dos (o ms) cromosomas derivados (Fig. 6214). Al igual que en las inversiones, la mayora de las translocaciones son equilibradas, y slo tienen ramificaciones clnicas cuando se elimina un gen estructural importante. Por otra parte, el peligro principal de una translocacin equilibrada es el de que el portador tiene un mayor riesgo de tener hijos vivos con anomalas cromosmicas. En la primera divisin meitica los cromosomas translocados adoptan una estructura en forma de cruz para que todos los alelos se empa-

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APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA No separacin - Meiosis II

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No s e p a r a c i n - M e i o s i s I

A
Figura 62-11. Los errores de la no separacin en la meiosis generan gamelos aneuploides. A, La no separacin en la meiosis I produce u n a copia extra del cromosoma A (heterodisoma) en dos gametos, pero tambin la falta de cualquier cromosoma A en los dos gametos restantes S. La no separacin en la meiosis II origina dos gametos con un complemento de cromosoma normal (abajo a a derecha), la falla de un gameto en el c r o m o s o m a A y un gameto con un c r o m o s o m a extra duplicado (dos copias del c r o m o s o m a A1 producen isodisomia en el crom o s o m a Al)

No separacin

Figura 62-12. Generacin de disoma uniparental por los errores de la no separacin. A la izquierda del diagrama se puede ver la heterodisomia originada por la reduccin de una trisomia a u n a disoma A l a derecha se observa la isodisomia producida por el rescate de la monosoma (la duplicacin del nico cromosoma que existe).

Heterdsomfa uniparental

Heterdsomfa hiparcntal

Isodisomia uniparental

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

Isodisomia uniparental

Heterodisomia uniparental

Heterodisomia biparental

Figura 62-13. Isodisoma Irente a heterodisomia. La conformacin nalural de una clula es la heterodisomia biparental: un cromosoma de cada padre. Los errores en la divisin pueden originar una distribucin aberrante de los cromosomas de a m b o s padres, de forma que se pueden producir dos copias de un cromosoma de uno de los padres (isodisoma uniparental) o dos cromosomas diferentes del mismo padre (heterodisomia uniparental).

El cromosoma que es el resultado de la divisin errnea del centrmero durante la divisin celular que produce dos copias de uno de los brazos del cromosoma pero al que le falta el otro brazo es un isocromosoma (Fig. 6214). Por tanto, el portador de esta reordenacin tiene una trisomia en el brazo duplicado y una monosomia en el otro brazo. El ejemplo mejor conocido es el isocromosoma del brazo largo del X. Esta configuracin produce una trisomia en el brazo largo y una monosoma en el brazo corto del X, y dado que se necesitan dos copias funcionales del brazo corto del X para que se desarrolle un ser del sexo femenino, esta anomala cromosmica es coherente con el sndrome de Turner (vase ms adelante en Aneuploidias cromosmicas sexuales). Los cromosomas acrocntricos tambin pueden formar isocromosomas (duplicacin inversa del brazo largo), pero esto produce la homocigosidad de todos los locus presentes, lo que puede llevar a expresar desrdenes recesivos que de otra manera no habran sido evidentes. Un cromosoma de anillo se produce cuando se pierden los dos telmeros de un cromosoma y el fragmento del cromosoma que queda se hace un circulo para restablecer la estabilidad cromosmica (Figs. 62-14 y 62-19). Desafortunadamente, estas construcciones son, por lo general, inestables, ya que la replicacin puede producir crculos entrelazados que llevan a la rotura del cromosoma y a su prdida cuando los homlogos intentan separarse en la anafase. Sin embargo, bajo ciertas circunstancias, los anillos pueden ser transmitidos de forma estable en lineas celulares. Esto se produce cuando el anillo contiene material gentico, que es esencial para la funcin celular normal. El cromosoma marcador es un cromosoma con un centrmero que s e transmite de forma estable a las clulas hijas, pero no puede ser claramente identificado debido a que es demasiado pequeo o a que el patrn de bandeo es demasiado ambiguo. La HISF ha sido de gran ayuda para determinar el origen de los marcadores. Conclusiones. Las anomalas cromosmicas, tanto las numricas como las estructurales, que producen un complemento de cromosoma desequilibrado estn asociadas a algn tipo de descubrimiento clnico anormal, y el tamao del desequilibrio es proporcional a la gravedad del problema. L a mayora de los individuos a los que les han diagnosticado una anomala cromosmica constitucional slo tienen un nico defecto cromosmico. Sin embargo, hay casos raros de personas que tienen dos o ms errores cromosmicos. Las anomalas cromosmicas adquiridas (vistas en clulas cancergenas) pueden ser ms complejas y pueden tener mltiples cambios, numricos y estructurales, en una sola linea celular.

rejen adecuadamente (Fig. 62-17). En la anafase los cromosomas altemos se deben segregar juntos para generar gametos equilibrados. Una de cada tres veces los cromosomas no se segregarn de esta manera y producirn gametos desequilibrados. A los errores ms corrientes se les denomina segregacin adyacente 1 y segregacin adyacente 2. A pesar de que ambos patrones producen deficiencias en la duplicacin del material cromosmico, la segregacin adyacente 2 es ms deletrea, ya que est caracterizada por la presencia de centrmeros homlogos en una sola clula. La viabilidad de un feto que recibe un gameto desequilibrado depende de los cromosomas y de los genes involucrados en la translocacin y del tamao de la duplicacin o de la delecin. Los cromosomas tambin pueden seguir un patrn de segregacin 3:1, en el cual tres cromosomas se separan en una clula y el resto de los cromosomas en una segunda clula. Esto produce desequilibrios totales del material cromosmico y por lo general es letal in tero. El diagnstico prenatal es posible una vez que se ha identificado al portador de la translocacin. Las translocaciones Robertsonian son una variacin de la translocacin clsica. Se producen, solamente, entre dos cromosomas acrocntricos y se presentan como una fusin de los brazos largos al centrmero, cuyo resultado es la prdida de los dos brazos cortos (Fig. 62-14). La prdida de los brazos cortos no es deletrea, dado que se localizan mltiples copias de los genes de ARNr en todos los cromosomas acrocntricos. Una persona portadora de la translocacin Robertsonian tiene 45 cromosomas, ya que dos cromosomas se han convertido en uno que es funcional. Estas personas estn ms expuestas a los errores de la no separacin meitica, cuyo resultado son hijos con una trisomia en uno de los cromosomas reordenados. El ejemplo ms corriente de esto es el de una persona con una translocacin Robertsonian en los cromosomas 13 y 14 que tiene hijos vivos con trisomia 13 (Fig. 6218). El hijo afectado tendr 46 cromosomas con dos copias libres de cromosomas 13 y la translocacin Robertsonian. Otra reordenacin corriente es la translocacin Robertsonian 14;21. que podria dar lugar a que su progenie tuviera una trisomia 21. Aunque las translocaciones robertsonianas ms corrientes se producen entre cromosomas acrocntricos no homlogos, es posible que se produzcan estas reordenaciones entre cromosomas homlogos. Por ejemplo, un individuo con una translocacin robertsoniana 21;21 tendr un total de 45 cromosomas, incluida la translocacin en la que los dos 21 estn unidos al centrmero. Este tipo de reordenacin es siempre virtualmente de novo, ya que los portadores de esta anomala, no es probable que tengan una progenie normal. Los gametos viables incluyen 1) una clula con la translocacin Robertsonian (dos copias del cromosoma 21), que si es fertilizada dar lugar a un nio con sndrome de Down, o 2) una clula sin copias del cromosoma 21, que si es fertilizada dar como resultado una monosoma 21, que es incompatible con la vida.

Nomenclatura
Con un campo tan amplio de variaciones cromosmicas. se hizo necesario desarrollar un sistema de clasificacin que hiciera posible que el complemento de cromosoma de cada individuo fuera descrito sucintamente y comprendido por todo el mundo. La primera nomenclatura citogentica proporcion una lnea de trabajo y desde entonces se ha ido desarrollando el "idioma". Actualmente, el estndar reconocido es el Sistema Internacional de Nomenclatura Citogentica (SINC). y la ltima revisin ha sido en 1995. La nomenclatura que describe a un complemento de cromosoma se divide en tres partes bsicas: 1) el nmero total de cromosomas, 2) el complemento de cromosoma sexual y 3) cualquier anomala cromosmica. Estas unidades estn enumeradas por orden y separadas por comas. As, una mujer o hembra aparentemente normal se debe codificar como 46.XX y un hombre o macho ser 46.XY. Si hay dos o ms lneas presentes, se enumeran secuencialmente separadas por una barra inclinada, y si est presente un clon diploide normal, siempre se le enumera al final (45,X/46,XX). A otros clones se les ordena por tamao, poniendo primero al clon ms grande. El nmero de clulas en cada clon se indica por un nmero encerrado en un parntesis angular (45,X[15]/47.XXX[3J/46,XX[12]. Para las anomalas numricas, el nmero de cromosomas se aumenta o se disminuye para indicar el cambio total, y el cromosoma especifico adquirido o perdido se anota al final. Por ejemplo, la trisomia 13 en una mujer o en una hembra se debe escribir 47,XX,+13 y la monosoma 8 en un hombre o en un macho se debe escribir 45.XY.-8. Sin embargo, para una variacin cromosmica sexual que se sabe que es constitucional, no es necesario utilizar el smbolo + o el -, ya que se puede notar directamente el cambio en el complemento de cromosoma. La monosoma X

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APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

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Figura 62-14. Represeniacin esquemlica d e las diferentes anomalas cromosmicas estructurales, descritas en el texto, asociadas c o n ejemplos de cada anomala. El primer panel muestra la conliguracin normal de un c r o m o s o m a generalizado, donde las letras A. B. C. D y E indican a los diferentes locus de genes y el centrmero est indicado por un punto entre los locus B y C Deleaon L a delacin c r o m o s b m i c a m u e s t r a las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la delecin terminal del brazo codo del c r o m o s o m a 4. Duplicacin: La duplicacin cromosmica muestra las conliguraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la duplicacin terminal del brazo corto del c r o m o s o m a 5 (las dos flechas indican la banda duplicada). El isocromosoma est originado por una divisin errnea del centrmero que produce duplicaciones invertidas del brazo corto y del brazo largo del c r o m o s o m a original. Ejemplo: el i s o c r o m o s o m a del brazo largo del c r o m o s o m a X Inversin: L a inversin cromosmica muestra las formas paracntnca y pencntrica. Ejemplo: la inversin pericntrica del cromosoma 9 (las flechas indican los centrmeros) Translocacin: Translocacin reciproca frente a Iranslocacin Robertsonian. Ejemplo: la transiocactn Robertsonian d e los c r o m o s o m a s1 4 y 21. Cromosoma anillo. Ejemplo: el anillo 18.

La ilustracin continua en el pagina siguiente.

SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

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a(18)

Figura 62-14. Continuacin. Representacin esquemtica de las diferentes anomalas cromosmicas, descritas en el texto, asociadas c o n ejemplos de cada anomala. El primer panel muestra la configuracin normal de un cromosoma generalizado, donde las letras A. B, C, D y E indican a los diferentes locus de genes y donde el cenlrmero est indicado p o r un punto entre los locus B y C. Delacin: La delecin cromosmica muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la delecin terminal del brazo corto del c r o m o s o m a 4. Duplicacin: La duplicacin cromosmica muestra las configuraciones terminal e intersticial. Ejemplo: la duplicacin terminal del brazo corto del c r o m o s o m a 5 (las dos flechas indican la banda duplicada). El isocromosoma est originado por una divisin errnea del centrmero que produce duplicaciones invertidas del brazo corto y del brazo largo del c r o m o s o m a original. Ejemplo: el isocromosoma del brazo largo del c r o m o s o m a X. Inversin: La inversin cromosmica muestra las formas paracnlrica y pericntrica. Ejemplo: la inversin pericntrica del c r o m o s o m a 9 (las flechas indican los centrmeros). Translocacin: translocacin recproca frente a translocacin Robertsonian. Ejemplo: la Iranslocacin Robertsonian de los cromosomas 14 y 21. Cromosoma anillo. Ejemplo: anillo 18.

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Figura 62-15. Ejemplos de deleciones cromosmicas A. Delecin del brazo largo disial del c r o m o s o m a 4 El cromosoma de la derecha es significativamente ms cono (Hecha) que el cromosoma normal de la izquierda, fl. Delecin intersticial del brazo largo del cromosoma 11. El ideograma de la izquierda muestra la regin de ADN que falta en el cromosoma que ha sufrido la delecin. A la derecha estn los cromosomas bandeados reales con el cromosoma 1 1 que ha sufrido la delecin a su derecha (las H e c h a s indican la delecin).

Figura 62-16. Inversin cromosmica. A. Diagrama de la inversin pericntrica del cromosoma 9 que utiliza los ideogramas para indicar los mecanismos de inversin. A la derecha se ven los cromosomas bandeados que demuestran esta inversin. 8 . Asa d e inversin que indica el emparejamiento de homlogos en la meiosis de un c r o m o s o m a normal y uno con una inversin paracntrica. Si la recombinacin se produce en el punto indicado por el crom o s o m a X en el asa, se generarn cromosomas recombinantes como se muestra abajo. En el caso de una recombinacin paracntrica. los cromosomas que se producen son dicnlncos o acntncos.

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PATOLOGA MOLECULAR

Figura 62-17. Translocacin cromosmica. En el diagrama se m u e s t r a la generacin de gametos procedentes de una translocacin hipottica durante la meiosis. Los c r o m o s o m a s se emparejan, en la meiosis 1. con una configuracin en lorma de cruz. La segregacin alterna generar gametos equilibrados. La segregacin adyacente 1. la adyacente 2 o la adyacente 3:1 producirn g a m e t o s desequilibrados, los cuales pueden originar un nio nacido con vida anormal. (Slo se muestra una de las distintas segregaciones 3:1 posibles.)

se pone 45.X y la adquisicin de un cromosoma sexual ser 47.XXY.47.XXX o 47.XYY. Por otro lado, si el cambio cromosmico sexual es adquirido, como en algunas lneas celulares cancergenas, se necesita un + o un - para indicarlo (es decir, 45.X-Y para un hombre o macho que haya perdido su cromosoma Y como resultado de su enfermedad). Los cambios estructurales en los cromosomas no afectan a los cromosom a s presentes, pero se deben anotar al final para clarificar el estatus del o de

los cromosomas reordenados. Para no alargar la nomenclatura, se han generado una serie de abreviaciones para las anomalas estructurales corrientes que acortan el total de la misma (Tabla 62-1). Una anomala estructural se indica con la abreviatura de la anomala seguida del cromosoma implicado y el punto de ruptura en el mismo. Para las reordenaciones en las que hay dos cromosomas implicados, los cromosomas se dan en un primer conjunto de parntesis (primero el nmero ms bajo o el cromosema sexual), seguido de

Figura 62-18. Los c r o m o s o m a s bandeados y los de a s c e n d e n c i am u e s t r a n la herencia de una translocacin Robertsonian de los c r o m o s o m a s 13 y 14. L a madre es la portadora de la translocacin (tlecha larga) en una lorma equilibrada, pero un error mektico origina la transmisin, de la m a d r e al hijo, de un c r o m o s o m ac o n la translocacin Robertsonian y d e otro c r o m o s o m a 13. El nio tiene trisomia 13 (las flechas cortas indican el 13S normal, la H e c h a larga indica la translocacin Robertsonian). Nota: la segunda copia del c r o m o s o m a 14 no falta, sino que est unida al centrmero del t e r c e rc r o m o s o m a 13.

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APLICACIONES DE LA CITOGENETICA EN LA PATOLOGA MODERNA Tabla 62-2

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A n o m a l a s c r o m o s m i c a s en las prdidas fetales e s p o n t n e a s y en nios nacidos con vida Prdidas fetales espontneas % 18 17 6,0 16 5.7 4,7 4,2 3.7 3.0 2.0 3.0 4,0 Incidencia en los nacidos vivos 1/10.000 1/60 000 0 0 0 1/700 0 0 1/8.000 1/10.000 1/2.100 2/1.000

Anomalas 45.X Triploidia Tetraploida Tnsomias 16 22 21 15 1 4 18 13 Translocacin desequilibrada Reordenamiento equilibrado

Figura 62-19. Cromosoma anillo. El c r o m o s o m a 18 normal est a la izquierda. A la derecha se indica el c r o m o s o m a de un solo anillo y el c r o m o s o m a de doble anillo. Los dalos proceden de Hook (1977). Jacobs ( 1992) y Mueller ( 1998) El c r o m o s o m a anillo de la parte superior es de un solo anillo, c o m o confirma la imagen de banda-C de la derecha (un solo centrmero oscuro). El c r o m o s o m a anillo de la parte inferior es m u c h o ms grande y la tincin de banda-C indica dos cenCitogentica prenatal trmeros oscuros, lo que lo confirma c o m o un c r o m o s o m a de doble anillo.

los puntos de ruptura de la reordenacin en el mismo orden relativo; esto es, t(4;9)(q21,2;p22) es una translocacin entre los cromosomas 4 y 9 con los puntos de ruptura 4q21,2 y 9p22. Los siguientes ejemplos incluyen a: Delecin: 46,XX.del(4)(p15) Duplicacin: Translocacin: Inversin: 46,XX,dup(11)(q23) 46.XY,t(4:9)(q21,2;p22) 46.XY,mv(9)(p11q21.1) Delecin terminal del brazo corto del 4 en la banda 15 Duplicacin terminal del brazo largo del 11 en la banda 23 Translocacin entre el 4 y el 9 Inversin pericntrica entre las bandas p11 yq21.1

Los estudios han demostrado que 1 de cada 13 productos de la concepcin tiene una anomala cromosmica, pero de stos, slo 6 de cada 1 . 0 0 0 nacen vivos, lo cual indica que son reconocidos y eliminados la mayora de los errores. Por ejemplo, de todas las concepciones 45.X, el 95% acabar espontneamente. La misma frecuencia en el fin del embarazo se registra en las trisomas de los nacidos vivos (no llegarn a trmino el 90% de las concepciones con trisoma 13. el 80% de las concepciones con trisoma 18 y el 65% de las concepciones con trisoma 21). Por trmino medio, el 15% d e todos los embarazos reconocidos termina con la prdida fetal de manera espontnea, y el 80% de stos se producen durante los tres primeros meses. De todos los abortos espontneos, el 60% se deben a anomalas cromosmicas (Tabla 62-2), y de stos el 52% se deben a trisomas autosmcas. La tnsomia ms comente que se ve en material procedente de un aborto, es la tnsomia 16. pero el tipo ms frecuente de error cromosomico en las prdidas espontneas es el 45,X. El diagnstico prenatal se ha convertido en el rea ms importante de los esludios citogenticos clnicos, debido a esta clase de informacin y a los conocimientos, cada vez ms amplios, de la gentica. Los datos de referencia ms corrientes deben contar con una historia familiar del o de los hijos anteriores con una anomala cromosmica. de niveles anormales de AFP en un anlisis (vase Cap. 22), de una anomala detectada por ecografia y de la edad de la madre. La razn exacta de este fenmeno no est clara, aunque los estudios sobre la poblacin han demostrado que en las mujeres de ms de 35 aos est aumentando la frecuencia de hijos nacidos con anomalas cromosmicas, especialmente trisomas (Hassold. 1985) El anlisis estadstico s eh a realizado, debido a la frecuencia relativamente alta de nacimientos con sndrome de Down, y muestra, claramente, la correlacin entre los nios afectados y la mayor edad de la madre (Fig, 62-20). Esto se est convirtiendo en un problema para una sociedad en la que las mujeres estn dejando los embarazos para edades ms tardas. Las anomalas cromosmicas ms comentes detectadas en los anlisis prenatales son las trisomas en los nacidos vivos y las aneuploidas d e los cromosomas sexuales. Pero debido a que stas son, normalmente, el resultado de un error de la no separacin meitica, el nesgo de reincidencia es m u y bajo. Ocasionalmente se identifica a un nio con una anomala cromosmica estructural equilibrada o desequilibrada. En estas circunstancias, se hace un anlisis del cariotipo de los dos progenitores biolgicos para diferenciar si el nio tiene una reordenacin heredada o una anomala de novo. Por ejemplo, en un nio con una translocacin equilibrada heredada, el nesgo de que la reordenacin cromosmica plantee cualquier problema es menor de un 1%. Sm embargo, si la translocacin aparentemente equilibrada que se ha visto en el feto no es detectada en ninguno de los padres biolgicos, se ha tenido que originar de novo en el nio y hay de un 5% a un 10% de nesgo de perjuicio para el nio. Desafortunadamente, encontrar una translocacin no equilibrada en un feto, a pesar del estatus portador de los padres, es u n a situacin grave y casi siempre origina algn tipo de defecto gentico en el

CLINICA Aplicaciones clnicas

Las anomalas citogenticas se pueden encontrar en individuos aparentemente normales, asi como en pacientes con anomalas fenotipicas o con desrdenes genticos diagnosticados. El diagnstico se puede producir en cualquier etapa de la vida. Se puede establecer la existencia de un sndrome cuando se observa que varios individuos, no emparentados, tienen un conjunto de rasgos iguales. Ya se sabe que las caractersticas asociadas a un sndrome tienen una base comn, las cuales son, con frecuencia, una anomala cromosmica especifica. Sin embargo, aunque un sndrome est definido por un conjunto de caracteres, los individuos afectados pueden ser viables y no todos mostrarn un fenotipo idntico.

Tabla 62-1

Abreviaturas c o m u n e s de a n o m a l a s cromosmicas Signiticado Centrmero Delecin Duplicacin Insercin Inversin Isocromosoma Mar Anillo TranslocacOn Robertsonian TranslocaciOn

Abreviatura cen del dup ins mv i marcador a rob l

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

Figura 62-20. Aumento del riesgo de una concepcin con s i n d r o m e de D o w n relacionado con el a u m e n t o de la edad materna. El nmero de nios nacidos con vida de madres con ms edad es m e n o r , debido a la intervencin de los diagnsticos prenatales, seguido de la interrupcin de embarazos anormales.

nio. Sin embargo, en esta situacin, el determinar si uno de los padres es el portador de la translocacin equilibrada proporcionar informacin sobre el riesgo de reincidencia en embarazos futuros.

Posnatal
Aproximadamente el 0,6% de los recin nacidos tienen una anomala cromosmica. Estos nios pueden presentar seales o sntomas de un sndrome definido o pueden tener anomalas clnicas no relacionadas con un desorden especfico, pero de las que, sin embargo, se puede sospechar que se deben a una anomala cromosmica. Los genitales ambiguos son un sntoma para examinar el complemento de cromosoma sexual de un recin nacido. Si un nio muere poco despus de su nacimiento, el anlisis citogentico puede proporcionar la informacin necesaria para comprender el porqu de esa muerte. Los hallazgos ctognicos para establecer el diagnstico debern estar correlacionados, siempre que sea posible, con los resultados de la autopsia.

Infancia y edad adulta

Un malentendido corriente sobre los desrdenes genticos es que porque son heredados el diagnstico ser obvio al nacer. De hecho, la presencia clnica de muchos desrdenes tarda en manifestarse y puede no ser expresada completamente hasta ms tarde en la vida. En consecuencia, algunos de los problemas diagnsticos ms difciles se dan en nios y adultos. Adems, para considerar el amplio alcance de las posibilidades citogenticas, tambin se deben tomar en consideracin las opciones bioqumicas y moleculares.

Gentica del cncer

Otra rea de la medicina en la que la citogentica est siendo cada vez ms importante es la oncologa. A pesar de que la amplitud de variabilidad en los hallazgos cariotpicos de la mayora de los tumores slidos hace que las decisiones sobre los tratamientos sean difciles, existen datos clnicos excelentes, de las leucemias y de los linfomas, que incluyen a reordenaciones cromosmicas especficas que estn directamente asociadas a la tumorignesis (Tabla 62-3; vase Cap. 65; Block, 1998). Al identificar estas anomalas se podr hacer un diagnstico a nivel citogentico, aunque en la prctica la citogentica es, generalmente, slo una parte de los datos que se utilizan para hacer un diagnstico. Una vez que se ha detectado una anomala cromosmica, se puede monitorizar el progreso de la enfermedad del paciente. Si el tratamiento tiene xito, la mayora de las anomalas cromosmicas ya no sern evidentes en la mdula sea y se dir que el paciente est en remisin, mientras el cariotipo sea aparentemente "normal". Sin embargo, si el tratamiento no elimina completamente la lnea celular aberrante, la remisin puede ser slo un intervalo, en el cual las clulas causantes de la enfermedad pueden estar detenidas a unos niveles tan bajos que no son detectables a travs de los anlisis de cariotipo rutinarios. Despus, en la recada, reaparecern las mismas anomalas cromosmicas, que pueden ir acompaadas de ano-

malas adicionales y/o de lneas celulares ms complejas, resultados acordes con progresin de la enfermedad. Un aumento en la complejidad de la recuperacin es lo que se conoce como la evolucin del cariotipo y. por lo general, el nmero y el tipo de las anomalas cromosmicas vistas estn correlacionados con un mal pronstico y con la gravedad de la enfermedad. La HISF de interfaz ha sido un elemento valioso para los estudios oncolgicos clnicos (Cremer, 1988: Anastasi, 1991). Muchas de las anomalas citogenticas importantes que se han visto en las leucemias son translocaciones, y se han desarrollado sondas HISF de combinacin que hibridan a los lados opuestos de los puntos de ruptura de la translocacin. Por ejemplo, la leucemia mielgena crnica (LMC) est caracterizada por una translocacin entre el proto-oncogen ABL en el cromosoma 9 (9q22.3) y el gen BCR en el cromosoma 22 (22q11.2). La reordenacin origina un gen quimrico en el cromosoma 22 derivativo. Para detectar la translocacin se utilizan un par de sondas: 1) se localiza al lado distal del locus ABL en el cromosoma 9 (rojo) y 2) situada en el lado proximal del locus BCR en el cromosoma 22 (verde). Cuando hay no translocacin presente, deberan estar presentes en cada clula dos seales verdes (que detectan cada alelo AS.) y dos seales rojas (que detectan cada alelo BCR) (Fig. 62-21 A). La presencia de una translocacin da una seal verde y una seal roja contiguas la una a la otra, y con la resolucin del microscopio de luz, las dos seales se unen, dando una sola seal amarilla. Por tanto, una clula con una translocacin tendr slo tres seales, una verde, una roja y una amarilla (Fig. 62-216). Aunque se puede hacer este estudio en clulas en metafase, la utilizacin de clulas de interfaz proporciona una muestra mucho ms grande con la que se puede h a c e r el ensayo ms rpidamente (Werner, 1997). De la misma manera se pueden comprobar otras translocaciones leucmicas. Otras aplicaciones de la HISF en oncologa incluyen 1) la utilizacin de una sonda de centrmero especfica del cromosoma 12 para anlisis de una poblacin de clulas de interfaz para las clulas de trisomia 12 indicativas de LLC. 2) la utilizacin de una sonda de cromosoma 7 para detectar la monosoma 7 en el sndrome mielodisplsico (SMD) y la leucemia mieloide aguda (LMA) y 3) la utilizacin de una sonda de cromosoma 8 para identificar la trisomia 8 en los desrdenes agudos y en los crnicos. Tambin ha tenido mucho xito la utilizacin de sondas de X e Y de diferentes colores, para evaluar el xito de un trasplante de mdula sea en el que el donante y el receptor eran de sexos diferenles. Despus del trasplante, el hombre que ha recibido clulas de un donante femenino debera tener un complemento XX, pero si se encuentra un nmero significativo de clulas XY, indicara un problema potencial o posiblemente el fallo del injerto, La HISF se puede repetir, a intervalos regulares, para monitorizar el progreso y para advertir de que empieza a proliferar la poblacin de clulas leucmicas del paciente. La HISF multicolor tambin se ha utilizado para evaluar las lneas celulares leucmicas. Es interesante hacer notar la discrepancia que hay, a menudo, entre lo que se detecta a travs de la citogentica habitual y lo que se ve utilizando la HISF (Veldman, 1997). Se ha sugerido que las clulas cancerige-

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APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

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Tabla 62-3 R e o r d e n a m i e n t o s cltogenticos c o m u n e s e n la leucemia y en el linfoma Desorden LMC (leucemia mielgena crnica) Reordenamiento cromosomico t(9;22)(q34 1q11 2) +8 'd 7q) segundo Ph' + 19 t(9;22)(q34 1;q11 2) + 11 t(8:21)(q22:q22) t(9.22)(q34.1;q11.2) I(6.9)(p23q34) t(7.11)(p15;p15) +8 t(15;17Kq22;q11-22) t(11;17Kq23:q21) mv(16)(p12q22) t(16:16)(p13:q22) del(16)(q22) mv(3)(q21q26). I(11;19)(q23:p13) +8 +22 I(8;16)(p11;p13) I(9;11)(p21-22:q23) t(11;19)(q23;p13) t/del(11q23) t(3.5)(q21-25:q31-35) inv(3)(q21q26). t(1.22)(p13;q13) +8 -7

Desrdenes citogenticos Sndromes de aneuploidas cromosmicas

Aneuploidas autosmicas. La causa ms comn del retraso mental es la trisoma 21 o sndrome de Down. La incidencia de este desorden es de 1 de cada 700 nacimientos y est caracterizado por hipotonia. caras aplanadas, cisuras palpebrales oblicuas, orejas pequeas, lengua protuberante, pliegue palmar transversal, defectos del corazn e hipogonadismo. Aproximadamente el 92.5% de todos los individuos con sndrome de Down tienen 47 cromosomas, incluidas tres copias del cromosoma 21 originadas por un error de no separacin en la meiosis (Tabla 62-4). Sin embargo, slo menos del 3% de los pacientes tienden a expresar un fenotipo menos severo y se manifiestan como mosaicos con dos lneas celulares que pueden incluir una lnea 46.XX o una 46.XY. Adems, alrededor de un 5% de los pacientes con sndrome de Down slo tienen 46 cromosomas, dado que el 21 extra es parte de una translocacin Robertsonian o de otras translocaciones. Con frecuencia, un nio con una translocacin indica la presencia de un padre portador de una translocacin, por lo que en estos casos es recomendable hacer un anlisis de cariotipo a ambos padres, para determinar si la pareja tiene un riesgo mayor de tener ms hijos con sndrome de Down en futuros embarazos. Los estudios citogenticos de los individuos con reordenaciones del cromosoma 21 han revelado que no es necesario que se triplique el cromosoma 21 en su totalidad para que est presente el fenotipo del sndrome de Down. A menudo, tres copias del brazo largo proximal producen presentaciones clnicas distintas de las del sndrome de Down. A la inversa, la triplicacin del brazo largo distal est directamente correlacionada con un claro fenotipo del sndrome de Down. Los anlisis de pacientes con reordenaciones citogenticas diferentes han identificado una regin conocida c o m o la regin crtica del sndrome de Down. la cual incluye bandas de la 21q22.12 a la 21q22.3 (Fig. 62-22). La presencia de tres copias de este fragmento del 21 es suficiente para establecer un diagnstico claro del sndrome de Down (Korenberg. 1990; Delabar, 1993). A pesar de que al hacer el mapa cromosmico se ha estrechado la regin crtica del sndrome de Down, los esludios comparativos entre pacientes con sndrome de Down e individuos con otros desrdenes asociados a genes localizados en el cromosoma 21 (Fig. 62-22) han dado correlaciones interesantes. Los anlisis de la estructura cerebral de pacientes con sndrome de Down o con Alzheimer, en particular, han revelado una anomala arquitectnica similar, lo que sugiere que la triplicacin y la mutacin del locus del gen de la proteina |3-precursora amiloide (PPA) pueden producir resultados negativos similares. Las otras dos trisomas de los nacidos vivos son la trisoma 13 y la tnsomia 18. La trisoma 13, el sndrome de Patau, con una frecuencia de 1 de cada 4.000 a 1 de cada 10.000 nacimientos, est caracterizado por cabeza pequea, labio leporino o paladar hendido, o ambos, ciclopa. pliegue palmar transversal, polidactilia de las manos, de los pies, o ambas, taln prominente, defecto septal ventricular y cuero cabelludo puntiagudo. Aproximadamente se diagnostica de trisoma 18 o sndrome de Edwards (Fig. 62-23A) a uno de cada 8.000 recin nacidos, que tienen poco peso al nacer, boca y mandbulas pequeas, delecto septal ventricular, hipoplasia de los msculos, un occipucio prominente, orejas malformadas y bajas, pies de base basculante y dedos cruzados. Por lo general, el sndrome de Down es bastante manejable, a pesar de que tiene, frecuentemente, consecuencias clnicas graves y los pacientes llegan a vivir veinte o treinta aos. La trisoma 13 y la trisoma 18 son mucho menos compatibles con la vida y los pacientes suelen morir durante el primer mes de vida. Si un individuo sobrevive al primer ao, el porvenir es sombro, ya que esos pacientes no aprenden a hablar, a caminar o a cuidar de s mismos. Por este motivo, la opcin de la interrupcin del embarazo, est entre los consejos para los casos con diagnstico prenatal de trisoma 13 y trisoma 18. Aneuploidas cromosmicas sexuales. Las aneuploidas cromosmicas sexuales son relativamente comentes (su Irecuencia, por lo general, es de 1 de cada 500 nacimientos) y son fenotipicamente ms leves que las aneuploidas autosmicas, debido al efecto de la inactivacin del cromosoma X y al nmero limitado de genes presentes en el cromosoma Y. L a

LMA (leucemia mieloide aguda) MI M2

M3 (APL) M4 (AMMoL)

I(3;3)(q21;q26)

M5 (AMoL)

M6 t(3;3)(q2l;q26) M7 Cualquier subtipo

20q9q K17q) LLA (leucemia linfoblstica aguda) hiperdiploida L1 L I , L2

L3

I(1;19)(q23;p13) del/t(12p) 1(4:11)(q21;q23) del(6q) I(9:22)(q34.1;q11.2) I(11:19)(q23:p13) +21 hiperdiploide, mn 50-56 I(8;14)(q24;q32) 1(8;22)(q24;q11) I(2:8)(p12:q23)

LLC (desrdenes imloproliferativos crnicos) Clula B Clula T Sndromes mielodisplsicos

+ 12 14q+ 14q+ 14q 11 reordenamientos 5q del(5)(q13q33) -7, del(7q) +8 + 19 dcl(20q)

as experimentan, realmente, un grado significativamente mayor de reordenaciones cromosmicas de las que se haban apreciado previamente y que algunas de las nuevas reordenaciones que se han detectado pueden evidenciar nuevos genes relacionados con el cncer. Sin embargo, llevar algn tiempo antes de que se pueda recoger un conjunto de datos significativos que proporcionen las correlaciones clnicas de estas nuevas reordenaciones.

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

Figura 62-21. Deteccin mediante la HISF de la translocacin 9:22 en la LMC. A. No hay translocacin presente, c o m o se ve por dos copias de c a d a sonda del c r o m o s o m a 9 (en rojo) y del c r o m o s o m a 22 (en verde) en la clula en metalase (a la derecha) y en la de interfaz (a la izquierda). 8. Translocacin en un paciente que ha sido detectada mediante la seal amarilla (Hecha) ms una seal verde y una roja (en clulas de interfaz).

causa, en la mayoria de los casos, es debida a cuatro desrdenes, tres trisomas y una monosoma. Todos son originados por errores de no separacin durante la meiosis y excepto el XYY. que es exclusivamente paterno, los otros desrdenes pueden ser originados tanto por el error materno como por el paterno. Los cariotipos aberrantes de los individuos con tres cromosomas X [47,XXX mujeres] o con un cromosoma X y dos cromosomas Y [47.XYY homTabla 62-4 Errores d e n o s e p a r a c i n q u e p r o d u c e n trisomia 21 detectados mediante tecnologa citogentica y molecular Citogenticos Meiosis materna I Meiosis materna II Meiosis paterna I Meiosis paterna II 70% 10% 10% 10% Moleculares 75% 20,6% 1,2% 3,2%

Dalos de Sherman (1991. 1994) Anlonarakls 1 1 9 9 2 )

bres] a menudo no son detectados en toda la vida. La incidencia de los nacimientos es relativamente alta. 1 de cada 1.000, pero salvo que son algo ms altos que la mayora, no tienen rasgos chocantes que pudieran indicar una anomala cromosmica. Algunas de estas personas tienen dificultades de aprendizaje generalizadas, por lo que pueden ser identificadas mediante los programas de rendimiento escolar. Tambin se puede detectar a las mujeres XXX y a los hombres XYY en las clnicas de infertilidad, aunque la anomala citogentica no est, generalmente, relacionada con el motivo de referencia, ya que las evaluaciones globales muestran que estas personas son completamente frtiles y que, por lo general, tienen hijos cromosmicamente normales. Los hombres X Y Y tienen ms riesgo de padecer problemas de conducta, y los primeros estudios sugirieron que tambin tienen tendencias criminales debido a la incidencia, ms alta de lo que se esperaba, de X Y Y en presos de instituciones penales (Jacobs, 1968; Price, 1970). Sin embargo, los trabajos posteriores muestran que la criminalidad, ms probablemente, se deba a la combinacin de mltiples causas y que los hombres XYY no son ms propensos a tener una conducta criminal que cualquier otro hombre (Witkm, 1976; Pitcher, 1982; Theilgaard, 1984).

Figura 62-22. A la derecha se ve el m a p a del c r o m o s o m a 21. que muestra la regin critica del sndrome de D o w n y las posiciones relativas de los locus asociados a vanos rasgos clnicos. A la izquierda se muestra otro m a p a de los locus (SUH1E = sindrome de Usher P P A = protena |5-precursora amiloidea [asociada a la enfermeoad de Alzheimer; DS01 = dismutasa superxida-1; ELA1 = esclerosis lateral amilrpica; DFNB8 = sordera 8: ETS2 = oncogn ETS-2; HPE1 = holoprosencefalia alobar-1 : COL6A1'COL6A2<COL18A1 = genes de colgeno.) (Los datos proceden de Korenberg [1990]; Delabar [1993]: OMIM [1999].)

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Figura 62-23. Cariolipos de los sndromes cromosmicos numricos A, Sndrome de Edwards (trisoma 18): 47.XX.+18.
La ilustracin continua en la pgina siguiente.

Los hombres con sndrome de Klinefelter (47.XXY) tienen tendencia a ser altos y delgados, de piernas relativamente largas, aunque en los primeros aos estos hallazgos rara vez los apartan de los dems nios. A algunos individuos se les identifica en el colegio por sus dificultades en el aprendizaje, pero las causas de referencia ms corrientes son hipogonadismo pospuberal. desarrollo del pecho como en una mujer, infertilidad debida a la pequenez testicular, tubos testiculares halinizados y azoospermia. En individuos con un complemento de cromosoma mosaico, incluida una lnea celular 46.XY [47.XXY/46.XY], se ve una forma ms leve del sndrome de Klinefelter con fertilidad potencial a causa de un desarrollo testicular normal. La llave de la fertilidad es la proporcin relativa de clulas XXY y XY durante la determinacin sexual en el primer zigoto y en los testculos. Un exceso de clulas XXY llevar al individuo a ser un verdadero Klinefelter, mientras aue un mayor nmero de clulas XY moderarn el fenotipo y aumentarn las probabilidades de que sea frtil. El sindrome de Turner: 45,X(Fig. 62-348) es la aneuploidia cromosmica sexual ms comnmente reconocida, presente en un fenotipo femenino. En la determinacin sexual, el desarrollo femenino normal depende de la presencia de dos cromosomas X aclivos. La regin critica de la diferenciacin femenina se ha estrechado a una regin del brazo corto del cromosoma X, justamente proximal al centrmero. Si esa regin no existe o est inactiva, se originar un individuo con el sndrome de Turner. Aproximadamente la mitad de todos los pacientes con sindrome de Turner tienen el complemento de cromosoma

45.X clasico, que representa la nica monosomia de los que nacen vivos viable. Normalmente, el nico cromosoma X es de origen materno e indica que una no separacin metica paterna es el origen del error ms corriente. Tambin puede haber cariotipos ms complejos adems del 45.X (Tabla 625) (Palmer, 1976). A los que ms les atae es a los individuos que tienen un cromosoma Y, completo o parcial, en al menos una lnea celular: stos tienen un nesgo mayor de gonadoblastoma. El fenotipo del sindrome de Turner es altamente variable. Los individuos afectados son tpicamente bajos (<1,50 m) con disgenia gonadal y dificultades de aprendizaje. Otros rasgos comunes son membrana cervical originada por higroma qustico in tero, nacimiento del pelo posterior bajo, anomalas renales y del corazn, cubitus valgus (aumento del ngulo de porte en el codo) y trax de caparazn. Los pacientes al nacer pueden presentar edemas en las manos y en los pies. Los pacientes con sndrome de Turner tienen una capacidad amplia para las habilidades mentales, y muchos tienen una inteligencia normal, pero algunos tienen detectos mentales significativos. Ms an, aunque en el sndrome de Turner la infertilidad se sola aceptar como el estndar, ahora se sabe que algunos pacientes se pueden reproducir con xito, normalmente los que tienen cariotipos mosaicos. Por tanto, y debido a la gran diversidad de las presentaciones, el asesoramiento prenatal a una pareja con un feto con un sndrome de Turner no identificado es extremadamente difcil. Sin embargo, la mayora de los pacientes nacidos vivos con sndrome d e Turner, por lo general, pueden tener vidas productivas, y los individuos afee-

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

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APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

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Tabla 62-5 Distribucin d e los c o m p l e m e n t o s d e c r o m o s o m a diferente q u e origina el s n d r o m e de Turner Porcentaje de casos % b 20 15 10 Anomala cromosmica 45.X 45.X,i(Xq) Deleciones del cromosoma X o anillos. o la presencia de un cromosoma Y Mosaicos 45.X/46.XX 41>.X/46. XY

lados levemente quiz no sepan que estn afectados por el desorden hasta que lleguen a la pubertad.

Otras anomalas cromosmicas sexuales

En los humanos, la determinacin sexual es el resultado de una va bioqumica compleja, que conlleva la interaccin de protenas producidas por genes presentes en los cromosomas X e Y, as como por los genes en los autosomas. El sexo natural, en los humanos, es el femenino, por eso se desarrolla un individuo femenino en ausencia de cualquier estmulo que defina a un varn. El primer desencadenante para el desarrollo de un varn es un gen localizado en el brazo corto del cromosoma Y. denominado FDT. factor que determina los testculos, que est localizado en la regin determinante del sexo del cromosoma Y (RSY) (Fig. 62-24). La protena producida por el FDT inicia la va para el desarrollo de un varn. Se han identificado vanos desrdenes asociados a mutaciones en distintos genes dentro de esa va que pueden originar genitales ambiguos o errores del genotipo o del fenotipo (un hombre fenotpico con un complemento de cromosoma sexual X X o una mujer tenolpica con un complemento XY). El origen de un hombre XX se puede atribuir, generalmente, a una o dos causas. La ms corriente de las dos es la virilizacin de un leto femenino, que con frecuencia es el resultado del desorden recesivo autosmico hiperplasia adrenal congnita (HAC). Este desorden lo produce la carencia de la

enzima 21 -hidroxilasa. que origina un bloqueo en la via de biosintesis normal y produce una acumulacin de andrgenos. Los niveles excesivos de hormonas masculinas en la circulacin femenina pueden dar origen a una persona de apariencia masculina, a pesar del complemento de cromosoma femenino. Adems, un feto femenino normal puede desarrollar genitales ambiguos, debido a la exposicin a un exceso de hormonas de la madre afectada de HAC, dado que los andrgenos son capaces de atravesar la placenta. Tambin se puede originar un hombre fenotpico con un complemento de cromosoma sexual XX a causa de una translocacin crptica entre el cromosoma X y el cromosoma Y. Los extremos distales de los brazos cortos de los cromosomas X e Y son homlogos, e incluyen a las que se denominan regiones seudoautosmicas (Fig. 62-24). Este es el primer lugar de apareamiento del cromosoma X y del Y durante la meiosis y se puede producir la recombinacin entre el alelo X y el Y. De forma ocasional se puede producir un acontecimiento de recombinacin fuera de las fronteras de la regin seudoautosmica, originando la transferencia de los nicos locus Y, incluyendo a la RSY. en la punta del cromosoma X. La cantidad de material cromosmico presente en este intercambio es extremadamente pequea y no puede ser detectada por medio de la citogentica. Un hombre con una translocacin tan equilibrada no tendr anomalas clnicas debido a que todos los genes estn presentes, aunque en localizaciones alternas. Sin embargo, si este hombre transmite su cromosoma X reordenado a un hijo que haya recibido un cromosoma X de la madre, el nio tendr un complemento de cromosoma XX aparente, pero tendr un fenotipo masculino o un fenotipo masculino Klinefelter debido a la presencia del gen FDT, que desencadena la via de desarrollo de un hombre. De forma recproca, la translocacin descrita antes puede originar una mujer Turner con un complemento XY aparente. La va para desarrollar a un hombre no se iniciar en un individuo con un cromosoma Y que no tenga el FDT y la RSY. y la determinacin sexual se decantar hacia una mujer. Sin embargo, la ausencia de dos copias intactas del brazo corto del X proximal impedir el desarrollo de una mujer "normal" y dar origen a un individuo con sndrome de Turner. Esta situacin es bastante infrecuente. En una mujer XY el resultado ms comn es la insensibilidad andrgena, que tambin es conocida como "feminizacin testicular". En estos individuos el cromosoma Y est intacto y el FDT est presente y es funcional. El problema surge en otra parte de la via bioqumica por un defecto del gen receptor de andrgeno que est localizado en el brazo largo del cromosoma X (Xq21.3). El FDT inicia el desarrollo de un hombre, pero la va estar bloqueada en el punto donde se necesita el producto del gen receptor de andrgeno para hacer un compuesto de testosterona con dihidrotestosterona. No se puede ir ms lejos en la diferenciacin de un hombre y por eso el fenotipo se revelar en una mujer. Sin embargo, estos individuos no son frtiles por la falta de algunos genitales internos funcionales y presentan, comnmente, una vagina ciega y testculos en el abdomen o conducto inguinal.

Anomalas

cromosmicas

estructurales

Se ha descrito un nmero razonable de sndromes directamente relacionados con una anomala cromosmica estructural. La mayora de ellos son bastante raros. A continuacin se explican algunos de los ms comunes (vase tambin Jones. 1997). El sndrome de Wolf-Hirschhorn. tambin conocido como 4p-sindrome. se debe a una aparente delecin terminal del brazo corto del cromosoma 4 [del(4)(p16|] (Fig. 62-14). Los resultados clnicos incluyen microcefalia. micrognalia, hipotonia, pliegues epicnticos y retraso en el desarrollo. Se asocia la apariencia facial caracterstica de estos individuos con el casco de un guerrero griego, debido a la nariz larga y a las cejas arqueadas. Las personas que tienen este desorden necesitan educacin especial y tienen un gran riesgo de padecer convulsiones. El Cri du chat o sndrome 5p- [del(5)(p15)j est caracterizado por un llanto como de gato, agudo y distintivo, en la infancia. Otros rasgos son poco peso al nacer y el crecimiento lento subsiguiente, hipotonia. microcefalia. hipertelorismo. pliegues epicntico. anomalas cardiacas y retraso mental. Los nios afectados tienen un desarrollo retrasado y pueden alcanzar los niveles sociales y cognitivos a los cinco o seis aos.

Figura 62-24. Diagrama de las localizaciones relativas del FDT, del R S Y y de las regiones seudoautosmicas del cromosoma X y del cromosoma t

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR involucrados en el sndrome de Miiler-Dieker. as que es un autntico sndrome de genes contiguos originado por una microdelecin. Una delecin ms pequea del gen LIS1 origina una lisencefalia aislada (Ledbetler, 1992). Los sndromes de microdelecin mejor conocidos son el sndrome de Prader-Willi (SPW) y el sndrome de Angelman (SA). Ambos comparten la misma delecin intersticial del brazo largo proximal del cromosoma 1 5 [del(15)(q11.2q11.2)], pero la presentacin clnica es significativamente diferente. Los pacientes con el sndrome de Prader-Willi cuando nacen son pequeos e hipotnicos, pero cambian durante el primer ao de vida y empiezan a ganar peso con rapidez. Si no se les pone una dieta controlada, pueden ser bastante obesos debido la sobrealimentacin. Tienen otras caractersticas, como manos y pies grandes, hipogonadsmo y mal genio. Aunque son retrasados en su desarrollo, la mayora se desenvuelve bien en las clases de educacin especial. A los pacientes con el sndrome de Prader-Willi se les puede internar en casas para grupos especiales, que les proporcionan un ambiente adecuado, debido a su temperamento y a la dificultad para controlar su dieta. Por otro lado, los pacientes con el sndrome SA tienen un retraso mental agudo. Aunque son muy amistosos, por lo general no pueden mantener una conversacin normal y la interrumpen, con frecuencia, con estallidos de risa inapropiados. Este desorden est tambin caracterizado por hiperactividad, estatura baja, microcefalia, convulsiones y ataxia. La delecin 15q se puede detectar en casi un 60% de los individuos con el SPW. y en los pacientes con SA slo entre un 10% y un 20%, por medio de un anlisis ordinario o criognico de alta resolucin. La utilizacin de la HISF ha proporcionado una herramienta para el diagnstico mucho mejor, y ahora se pueden establecer las deleciones en el 80% a 85% de los casos. Aunque se aceptaba que no todas las deleciones fueran visibles a nivel citogentico, pareca extrao que la HISF no fuera capaz de detectar una delacin en el 100% de los casos. Esto, unido al hecho de que el SPW y el SA parecen compartir la misma delecin aunque tienen fenotipos completamente diferentes,

Sndromes de microdelecin y sndromes de genes contiguos

Por definicin una microdelecin es una delecin muy pequea, normalmente slo una fraccin de la banda de un solo cromosoma. Las microdeledones pueden ser confundidas con deleciones moleculares, asi que es importante reconocer que, aunque las microdeleciones son pequeas, son significativamente ms grandes (>500 kb) que la delecin molecular tpica (1 par de bases [pb] a varios cientos pb), que slo se pueden resolver por medio de la tecnologa molecular (vase Cap. 66). El tamao real de una micro-delecin puede variar de un paciente a otro, y algunas pueden ser lo suficientemente grandes para identificarlas mediante un anlisis citogentico, aunque la mayora para ser detectadas necesitarn la utilizacin de la HISF. Aunque al principio se crea que las deleciones estaban dentro de los genes solos, ahora se ha demostrado que ciertos sndromes se deben, en realidad, a deleciones que abarcan porciones de varios genes no relacionados adyacentes. La presentacin clnica, por tanto, puede ser una combinacin de caractersticas, debido a la ausencia de varios productos gnicos diferentes. El tamao de la delecin y el nmero de genes afectados puede variar tanto que el fenotipo expresado puede ser significativamente diferente entre los individuos. A estos sndromes se les denomina colectivamente sndromes de genes contiguos y representan una serie dentro de la categora ms amplia de los sndromes de microdelecin (Tabla 62-6). El sndrome de Miiler-Dieker ilustra con claridad el solapamiento entre la microdelecin y los sndromes de genes contiguos. Este desorden se ha asociado con una microdelecin del brazo corto distal del cromosoma 17 (17p13.3), y los rasgos clnicos esenciales son lisencefalia (cerebro liso) y anomalas craneofaciales. La lisencefalia aislada (LSA) ha sido reconocida como una entidad independiente, as que el sndrome de Miiler-Dieker es una presenlacin ms compleja que une el defecto cerebral con los rasgos faciales caractersticos. El anlisis molecular muestra que hay al menos dos genes

Tabla 62-6 Microdelecin y sndromes de genes contiguos Trastorno Angelman (SA) DiGeorge (SDG) Icliosis Kallmann Larger-Giedion (SLG) Localizacin 15q11.2 22q1l.2. 10p, 4q, 6q Xp22.32 Xp22.3 8q24 11-q24.13 Genes UBE3A ?GCSL y otros Rasgos clnicos RM agudo, retraso en el desarrollo, boca grande, progriatia, ataxia, convulsiones
7

Cara caracteristica. paladar hendido, hipoplasia del limo y paratiroides, corazn delectuoso e hipocalcemia Piel escamosa, estatura baja, hipogonadismo, RM Hipogonadismo, incapacidad para oler Dismorfismo craneofacial. anomalas esquelticas, deficiencia mental de moderada a aguda Cerebro liso, retraso mental profundo, convulsiones Lisencefalia. microcefalia, trente alta, nariz pequea, micrognatia, orejas bajas Hipotonia al nacer, ojos almendrados, RM de moderado a agudo, ausencia de saciedad, lo que lleva a comer de ms. manos y pies pequeos, hipogonadismo Tumores del relinoblasto del ojo Nariz rota, columela prominente, maxilar superior hipoplsico, fisuras palpebrales inclinadas hacia abajo, dedos pulgar y primero del pie anchos, RM y lenhtud al hablar Braquicefalia, hipoplasia en media cara, puente nasal ancho. mandbula prominente, manos pequeas y anchas, hiperactividad. lentitud al hablar, conducta autodestructiva, RM

STS KAL1 TRPSI TRPSII EXT LISI LIS1 y otros? SNRPN

Lisencefalia (SIL) Miiler-Dieker (SMD) Prader-Willi (SPW)

17p13,3 17p13.3 15q11.2

Retinoblastoma Rubinstein-Taybi (SRT)

13q14.1-q14.2 16p13.3

Rb1 CBP

Smith-Magenis (SSM)

17p11.2

Sndrome velocardiofacial (SVCF) WAGR

22q11.2 11p13.3

?GCSL WT1 AN2 y otros? ELN

Defectos en el paladar, alae nasi hipoplsica con nariz larga, incapacidad para el aprendizaje, enfermedad cardiaca congnita Tumor de Wilms, aniridia, defectos genitourinarios y retraso mental

Sndrome de Williams (SEW)

7q11?

Cl bajo, hipersensibilidad auditiva, oos azules con un patrn en forma de estrella en iris, labios prominentes, voz ronca, estenosis artica supravalvular u otro defecto cardaco, hipercalcemia y envejecimiento prematuro de la piel

RM = retraso mental.
v
...

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

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WAGR

entre repeticiones directas que estn contiguas a la regin de delecin comn. Esta recombinacin intercromosmica generar una estructura de asa que, si se escinde, producir la delecin del segmento intermedio. Tambin se han detectado recombinaciones intercromosmicas entre repeticiones directas (Edelman, 1998).

Otros fenmenos citogenticos Sndrome del cromosoma X frgil

El sndrome del cromosoma X frgil es la segunda causa ms importante de retraso mental y la primera de retraso mental heredado. Herbert Lubs describi por primera vez este desorden en 1969, cuando se dio cuenta de que en los miembros de la familia afectados haba una correlacin entre el retraso mental y un cromosoma X "marcador" (Lubs, 1969). Posteriormente se conoce al cromosoma X marcador como el cromosoma X frgil, que es una rotura o abertura en la estructura del cromosoma X que se puede delectar por medio de la citogentica cultivando clulas en el medio de induccin adecuado (Fig. 62-26). Desgraciadamente no todos los individuos afectados expresan el cromosoma X frgil por medio de la citogentica, por lo que el anlisis clnico es imperfecto. Sin embargo, durante muchos aos fue el nico ensayo disponible y proporcion una muy necesaria confirmacin de los diagnsticos de muchos pacientes. En 1991 se clon el gen asociado al sndrome del cromosoma X frgil y se identific a la mutacin como la amplificacin de una secuencia repetida de tnnucletidos, algo que nunca antes se haba visto o asociado como un mecanismo causante de la enfermedad. Afortunadamente, esta mutacin se puede detectar a nivel molecular, y se ha desarrollado un anlisis clnico, altamente competente, que permite la deteccin directa de la mutacin del sndrome del cromosoma X frgil (Rousseau. 1991; Verkerk. 1991).

11

Figura 62-25. Diagrama del sndrome de genes contiguos WAGR que muestra la posicin relativa de los diferentes genes en el brazo corto del cromosoma 11.

sugera que pudiera haber otra causa que originara estos desrdenes. Ahora se sabe que el SPW y el SA son ejemplos de impresin gentica y que el proceso de la mutacin que origina las enfermedades es mucho ms complejo que una simple delecin del ADN (Nicholls, 1989; Robinson, 1991) (vase el Cap. 66 donde se explica la deteccin molecular y de impresin de los genes impresos). El sndrome de Williams ha sido asociado a una delecin del gen de elaslina (ELN) del brazo largo proximal del cromosoma 7 (7q11.23). Este desorden se caracteriza por anomalas cardacas, hipertensin, voz ronca, envejecimiento prematuro de la piel y anomalas en el comportamiento. La ausencia de elastina explica muchas de las anomalas fsicas asociadas a este sndrome, ya que se sabe que es una protena importante que da elasticidad a tejidos, como los del corazn, vasos sanguneos, piel y cuerdas vocales. Sin embargo, los problemas de conducta no se pueden atribuir a la falta de elastina, por eso actualmente se cree que el sndrome de Williams es, en realidad, un sndrome de genes contiguos y que la variabilidad del fenotipo est relacionada con el nmero de genes adyacentes que se delecionan en combinacin con el gen ELN. El sndrome de WAGR (tumor de Wlms, aniridia. defectos genitourinarios, y retraso mental) es un sndrome de genes contiguos muy bien caracterizado y est localizado en el brazo corto del cromosoma 11 (11 p13). Excepto por los defectos genitourinarios, que parecen ser debidos a una mutacin variante en el locus del tumor de Wilms. cada una de las otras tres anomalas han sido asociadas a un gen especfico, y stos estn ordenados en tndem en el brazo corto del cromosoma 11 (Fig. 62-25). El fenotipo de un individuo afectado variar dependiendo del tamao de la delecin. Estadsticamente, alrededor de uno de cada tres nios diagnosticados de aniridia desarrollarn tambin el tumor de Wilms. Por el contraro, slo 1 de cada 50 pacientes con tumor de Wilms tiene aniridia. Con deleciones ms grandes, tambin se pueden ver defectos genitourinarios y retraso mental. El sndrome velocardioacial es. posiblemente, el sndrome de microdelecin ms comn en los humanos, pero, muy a menudo, pasa desapercibido, debido al amplio espectro de los rasgos clnicos y a que puede presentarse de forma bastante leve. Este desorden se diagnostica, normalmente, en nios lactantes, debido a las dificultades que tienen para alimentarse, a los detectas cardiacos y a las dismorfologas faciales caractersticas. Cuando el individuo crece, se advierten discapacidades en el aprendizaje, poca estatura y prdida de audicin conductiva. Es interesante hacer notar que entre un 10% y un 15% de estos pacientes tienen un progenitor afectado, pero mucho ms levemente, por la misma delecin. Se cree que la delecin 3 Mb del brazo largo proximal del cromosoma 22 (22q11.2q11.2) se debe a la recombinacin

Sndromes de rotura
Los sndromes de rotura cromosmicos (Tabla 62-7) son un conjunto de desrdenes recesivos autosmicos que se agruparon juntos al principio a causa de que los resultados tenan en comn la fragilidad o inestabilidad cromosmica (Ariett. 1978). Por esta razn, los anlisis citogenticos fueron de gran ayuda para los diagnsticos. Los estudios moleculares han demostrado una causa comn adicional entre estos desrdenes, y es que la mutacin en cada uno de ellos origina un defecto en los mecanismos de reparacin del ADN de las clulas. Esto ayud a explicar otras caractersticas de los sndromes, ya que la incapacidad para reparar el ADN puede llevar a 1) la rotura o al aumento de la recombinacin, que se puede caracterizar por medio de la inestabilidad cromosmica, y 2) a mutaciones adicionales y defectos en la secuencia del ADN, que pueden originar el cncer. Con un mejor conocimiento de la mutacin especfica, la terapia gnica para el tratamiento se convierte en una posibilidad.

Figura 62-26. Cromosoma X frgil. Ideograma del cromosoma X frgil (izquierda) y un par de cromosomas con bandeo-G representativos que muestran, a la derecha, al cromosoma X frgil.

Tabla 62-7 Sndromes de rotura cromosomica Trastorno Anemia de Fanconi (AF) Caractersticas clnicas Pancitopenia, retraso en el crecimiento pre o posnatal, hipopiasia o falta de dedos pulgares, posibilidad de deformacin en ios brazos, pigmentacin oscura de la piel Retraso en el crecimienio. erupcin en la piel en forma de mariposa, posiblemente maligna Ataxia con degeneracin del SNC, telangiectasia en la cara, deficiencia de inmunidad celular, degenerativo, retraso en el crecimiento Locus gnico 1. Grupo A I6q24.3 2. Grupo C9q22.3 3. Grupo D3p22-p26 4. Grupo E6p21-p22 5. Grupos B E H sin mapa I5q26 1 Manifestaciones citogentcas Aumento de roturas cromosmicas detectadas mediante tratamiento con MMC y DEB Tipo de cncer Aumento del riesgo de L M A y fallo progresivo de la mdula sea Defecto de reparacin del ADN Miscelnea Terapia actual trasplante de medula sea

Sindrome de Bloom (BLM)

Aumento de CCH en respuesta a los rayos ultravioleta o incorporacin de BrdU

Actividad anormal de la ADN ligasa I

Alta frecuencia en la poblacin luda ashkenazi: 1 / 1 1 0e s portadora de esa frecuencia

Ataxia telangiectasia (AT)

1 1 q 2 2 . 3

Xeroderma pigmentos (XP)

Sensibilidad a los rayos solares, anomalas neurologicas. ataxia y espasticidad

Sndrome de Cockayne

Enanismo, envejecimiento prematuro, microcefalia, dficit neurolgico, degeneracin de la pigmentacin, sordera, sensibilidad a la luz del sol. RM

incidencia: 1 en 250 000 1. A-9q22.3 2. C-653p25 3. D19q13.2-ql3.3 4. E11p11.1-p12 5. F-16p13.1-13.2, 16p13.13-p13.3 5. G13q33 Cromosoma 5

Aumento de las roturas espontneas, aumento de anillos tnrradiaies y translocaciones, especialmente en el cromosoma 7 y en el 14 inducidas con bleomicma o con radiaciones ionizantes Aumento del CCH y reordenamiento cromosomico en respuesta a los rayos ultravioletas

Vanas leucemias y tumores slidos

Aumento en la incidencia de cancer de piel

i Falta de escisin de los los dmeros de timina 2. Defecto en la reparacin posreplicacin

Sensibilidad a los rayos ultravioletas

Aumento en la incidencia de cncer de piel

Posible deficiencia de ADN ligasa o defecto de la reparacin de la transcripcin asociada emparejada

MMC mitomicma C: DEB = diepoxybutano: CCH = camOio de la cromdtida hermana: SNC = sistema nervioso central. RM retraso mental: BrdU = bromodesoxiuridma: LMA = leucemia mieloide aguda

CAPTULO 62

APLICACIONES DE LA CITOGENTICA EN LA PATOLOGA MODERNA

1331

RESUMEN
La citogentica es una ciencia de laboratorio de trabajo intensivo, relativamente antigua, que todava se ejecuta de la misma manera en la que siempre se ha hecho, a pesar de que la llegada de los sistemas asistidos por ordenador para hacer cariotipos y el recolector robtico han aadido un elemento de tecnologa avanzada al laboratorio. Aunque una vez se vaticin que los diagnsticos moleculares eliminaran a la citogentica. eso no ha ocurrido, ya que la citogentica es an el nico ensayo clnico que puede proporcionar una visin general rpida de todo el genoma humano. En lugar de ser reemplazada, la citogentica ha cambiado con los tiempos para hacer (rente a los retos de las enfermedades que se han identificado recientemente y de las nuevas tecnologas. La utilizacin de la HISF ha rellenado el hueco entre la citogentica y los diagnsticos moleculares de tal manera que los dos campos proporcionan informacin complementaria para muchos casos. La citogentica contina siendo importante en la valoracin de las anomalas cromosmicas estructurales y numricas, y es el estndar oro para diagnosticar muchos desrdenes. Su lugar en la medicina de laboratorio clnica est asegurado (por lo menos hasta el momento en el que el escner tipo "Star Trek" est disponible).

BIBLIOGRAFA
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1332

SECCIN V I I

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C A P T U L O

63

Organizando un laboratorio de diagnstico molecular

Andrea Ferreira-Gonzalez, Ph.D. David S. Wilkinson, M.D., Ph.D. Carleton T. Garrett, M.D., Ph.D.

INSTALACIONES DEL LABORATORIO Diseo del laboratorio Mtodos de ayuda en el control de contaminacin EQUIPAMIENTO PERSONAL DE LABORATORIO Director del laboratorio Supervisor tcnico Tcnicos mdicos y tcnicos en biologa molecular Residentes, becanos y estudiantes graduados Adiestramiento y acreditacin FORMATOS DE PRUEBAS CLNICAS Pruebas de desarrollo propio Mtodos manuales basados en equipos Sistemas automatizados basados en equipos para pruebas moleculares SELECCIN DE PRUEBAS Codificacin CPT e ICD-9 Patentes

1333

VALIDACIN ANALTICA Y CLNICA DE LAS PRUEBAS MOLECULARES Reactivos especficos del sustrato 1339

1335 1335

Limitaciones especiales en relacin con las pruebas genticas CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD DE LA CALIDAD Control de calidad en el proceso de las pruebas Control de calidad del equipo de laboratorio Elementos del programa de seguridad de la calidad 1341

1337

ACREDITACIN DEL LABORATORIO Pruebas de los laboratorios clnicos Pruebas forenses de identidad humana y de paternidad CONCLUSIN

1342

1343 1343

1337 BIBLIOGRAFA

Durante la ltima dcada se ha adquirido una enorme cantidad de conocimientos con respecto a los genes y a sus funciones en las enfermedades humanas. Esle conocimiento nos ha permitido una mejor comprensin del proceso de muchas enfermedades. Como consecuencia, las enfermedades se definen cada vez ms en trminos de su patogenia molecular. Esto ha conducido al desarrollo de nuevos mtodos clnicos moleculares para su utilizacin en el diagnstico, pronstico, seleccin de modalidades teraputicas y vigilancia de las enfermedades (Ferreira-Gonzlez, 1996; Fredericks. 1999; Hodinka, 1998; Hruban. 1998; Sawyers, 1999; Tsongalis. 1999). Los mtodos clnicos moleculares representan una serie de tcnicas y reactivos en los que el principal analizado es el cido nucleico. Los cidos nucleicos pueden ser cido deoximbonucleico (ADN) o cido ribonucleico (ARN). Existen mltiples aplicaciones de esta tecnologa a diferentes reas del laboratorio clnico. Una de las principales ventajas de utilizar cidos nucleicos como sustrato analizado es que representa el marcador natural ms especifico de todos los organismos vivientes, esto es. el orden de los nucletidos que comprenden el genoma de un organismo. El nmero de disposiciones diferentes de los cuatro diferentes nucletidos, que puede estar presente en una molcula de ADN que slo es tan grande como el virus de menor tamao, es muchas veces superior al nmero total de los diferentes tipos de organismos vivos de esle planeta. As. la secuencia del ADN de cada organismo vivo contiene una informacin peculiar que se puede utilizar para su identificacin. Adems, los cambios en las secuencias del ADN son la causa de enfermedades genticas y malignas; por tanto, proporcionan una infor-

macin diagnstica y pronostica m u y importante Hasta hace poco, los principales mtodos de laboratorio para detectar diferencias en la secuencia de los cidos nucleicos no haban sido lo suficientemente sencillos o fiables c o m o para utilizarlos en el laboratorio clnico. Los avances recientes en la tecnologa y en la instrumentacin, asi como los esfuerzos para su normalizacin, han podido vencer muchas de estas limitaciones.

INSTALACIONES DEL LABORATORIO

La potencia del diagnstico molecular se deriva de la exquisita sensibilidad y especificidad proporcionada por el uso de cidos nucleicos como sustrato analizado. La alta sensibilidad se deriva de la amplificacin m vitro de secuencias especificas diana de cidos nucleicos presentes en la muestra procedente del paciente. La amplificacin in vitro crea millones o billones de copias de la secuencia blanco y permite asi detectar hasta una nica molcula diana en el espcimen del paciente. Al mismo liempo, sin embargo, esta alta sensibilidad presenta importantes desafios para el uso de esta tecnologa. Asi, una de las principales ventajas de esta tecnologa es tambin una de sus principales limitaciones. El cierre y apertura de los tubos de la microcenlrilugadora que contienen productos amplificados pueden producir microgotas en forma de aerosol que pueden transportar entre 10 y 100 copias de la secuencia diana amplificada. Estas microgotas pueden posteriormente depositarse en

1334

SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR mente el uso de campanas de "aire muerto" para el preparado de reactivos y organizacin de las reacciones, lo cual es an ms crtico en el caso de que ambos laboratorios deban estar combinados. Las campanas de aire muerto proporcionan un medio altamente controlado donde se pueden llevar a cabo el preparado de reactivos y reacciones. Es importante intentar localizar esta zona en una seccin de laboratorio que tenga poco trfico. No se deben introducir ARN, ADN o especmenes de pacientes tanto genmicos como plsmidos dentro de la caja de aire muerto donde se realiza la preparacin de los reactivos. Esta caja de aire muerto debe estar provisla de una luz ultravioleta para colaborar a esterilizar las superficies interiores. Las superficies de las cajas de aire muerto tambin se deben tratar con una solucin recin preparada de hipoclorilo sdico al 10% (leja) y posteriormente con una solucin de etanol al 75% despus de trabajar en la zona. Estas reas deberan contener un equipo e instrumentacin especficos que no se deben compartir con ninguna otra rea Esto debera comprender las pipetas, el agitador, las puntas, los tubos y otro instrumental similar. Se debe utilizar un traje y guantes especficos de laboratorio antes de trabajar en esta zona. La segunda rea o habitacin limpia dentro del laboratorio de preamplificacin es donde se lleva a cabo el acceso de los especmenes, su procesado y la adicin de cido nucleico a los tubos de reaccin adecuados. Esta rea debe estar provista con por lo menos un gabinete de bioseguridad ambiental para procesado de muestras y extraccin de cidos nucleicos adems del equipo de laboratorio especifico, que slo se debe utilizar para estos fines. Debera disponerse de otra cabina de bioseguridad medioambiental completamente separada si en este laboratorio se lleva a cabo cualquier tipo de cultivo tisular, y debera existir equipo de laboratorio separado dedicado a esta labor. Si en el laboratorio se utilizan extracciones de cidos orgnicos nucleicos, se debera disponer de una cabina de seguridad qumica para manejar los pasos que comprenden lenol y cloroformo durante el proceso de extraccin. Si se llevan a cabo extracciones tanto de ARN como de ADN en el mismo laboratorio de preampliicacin. se deberan realizar estos procedimientos en reas separadas del laboratorio y tener instrumentos especficos para cada uno. as como pipetas y puntas para cada mtodo. En circunstancias donde hay problemas de espacio y no es posible dedicar dos reas completamente separadas, la extraccin del ADN y del ARN debe llevarse a cabo en momentos diferentes o en das diferentes despus de limpiar a fondo las reas antes de trabajar. Como ya se ha descrito, todas las reas deberian limpiarse con una solucin al 10% de hipoclorito sdico preparado en el da y con una solucin de etanol al 75%. El laboratorio de postamplificacin es donde se realiza la amplilicacin in vitro y el anlisis de cido nucleico. Los instrumentos que se utilizan en este laboratorio no se deben compartir con las reas de preamplificacin Si se utilizan termocicladores para la amplificacin in vitro de los cidos nucleicos, se recomienda que se coloquen en este laboratorio. Si los termocicladores se colocan en el laboratorio de preamplificacin. bajo ninguna circunstancia se deben abrir los tubos de reaccin despus de la amplificacin en este cuarto. Adems, los termocicladores deben enchufarse en lneas especficas con su propio disyuntor de circuito para evitar cualquier fluctuacin en la electricidad que pudiera afectar a su funcionamiento. Normalmente, este laboratorio necesitar de ms espacio que los laboratorios de preamplificacin debido a los requerimientos de espacio de la instrumentacin y de los mtodos de anlisis del producto amplificado. La electroforesis en gel. por ejemplo, utiliza con frecuencia una cantidad significativa de espacio. Se recomienda disponer de una cabina de seguridad biolgica y de una incubadora por agitacin si se van a llevar a cabo mtodos de clonacin. Tambin es altamente deseable disponer de un cuarto oscuro con una procesadora automtica de radiografas y un congelador. Sin embargo, es preferible colocar el cuarto oscuro fuera del laboratorio de postamplificacin, de manera que se pueda tener acceso al m i s m o sin tener que entrar en el laboratorio de postamplilicacin.

los puntos de trabajo, instrumentos, mobiliario, suelo, polvo, pelos, piel expuesta: virtualmente cualquier superficie. Otra importante fuente de contaminacin puede ser el propio cido nucleico diana. Los mtodos de manejo de las muestras siempre deben estar protegidos contra la contaminacin cruzada de las muestras de los pacientes. La contaminacin por el propio cido nucleico diana nativo puede ser tambin el resultado del procesado de muestras de pacientes en un ambiente en el que el cido nucleico diana sea amplificado biolgicamente bien por clonacin o cultivando la clula o los microorganismos que lo contienen. As, es necesario disear cuidadosamente las instalaciones del laboratorio de diagnstico molecular para asegurar que hay un espacio suficiente y adecuado para el personal y el equipo, y tambin para minimizar el potencial problema de la contaminacin de especmenes con cido nucleico diana natural y/o cido nucleico procedente de una amplificacin m v//ra(Porter-Jordan. 1990).

Diseo del laboratorio

El espacio de laboratorio debe disearse para minimizar el riesgo de contaminacin y maximizar el flujo de trabajo. El uso de barreras de contencin mediante la utilizacin de reas de trabajo separadas fsicamente para el preparado de reactivos, acceso de muestras, extraccin de cidos nucleicos y anlisis del material amplificado es altamente deseable. Un laboratorio ideal est compuesto de tres habitaciones completamente independientes. Dos de estas habitaciones se consideran habitaciones limpias, dado que todas las tareas y ocupaciones antes de la amplificacin in vitro se realizan en estos cuartos. Estos cuartos se llaman habitaciones de preampliicacin. El tercer cuarto se considera un cuarto sucio, dado que se dedica a la amplificacin in vitro y al anlisis del material amplificado. Esta habitacin se llama la habitacin postamplificacin. Los sistemas de tratamiento del aire de cada uno de estos cuartos deben ser completamente independientes uno de otro. Si ello no es posible, el laboratorio de preampliicacin debe localizarse lo ms prximo posible a la fuente del aire. Si ello es posible, los laboratorios de preampliicacin deben estar dotados de filtros electrostticos de aire instalados en la entrada de aire a cada laboratorio. Estos filtros deben vigilarse de forma peridica, incorporando el cambio y limpieza de los filtros de aire en el programa de control de calidad del laboratorio. Ademas de los filtros de aire, los laboratorios de preamplificacin deben estar a presin positiva de aire. Esto impedir la entrada de cualquier contaminante areo en el laboratorio de preamplificacin cuando se abra la puerta. El laboratorio de postamplificacin debe estar a presin de aire negativa para impedir la salida de cualquier partcula de este laboratorio, con la consiguiente contaminacin del ambiente circundante. La construccin de una antesala en cada laboratorio es una forma barata de crear una presin diferencial en el laboratorio. Una antesala a presin positiva para el laboratorio de preamplificacin se puede crear utilizando un ventilador en el techo de la antesala que extraiga el rea de dentro del laboratorio y lo empuje hacia la antesala. Esta antesala a presin positiva tiene a grandes rasgos la misma funcin que tener todo el laboratorio bajo presin positiva. De lorma parecida, se puede construir fcilmente una antesala a presin negativa para la habitacin de postamplificacin haciendo que la turbina extraiga el aire de la antesala y lo sople hacia dentro del laboratorio. Esta antesala debe disponer de un mtodo de sellado alrededor de la puerta que separe la antesala del laboratorio para evitar que el aire que est dentro del laboratorio vuelva a salir hacia la antesala. Un punto importante es que la puerta que conduce hacia la antesala desde fuera y la puerta que comunica con el interior del laboratorio nunca deben abrirse a la vez. Un mtodo de seguridad adicional es aadir un suelo adherente en la entrada de cada antesala o laboratorio. El tamao de la antesala lo determina las actividades que se llevarn a cabo en la misma. Las antesalas deben tener suficiente espacio como para permitir que por lo menos dos individuos entren o salgan del laboratorio y se cambien las ropas de laboratorio a la vez. Adems, si se utilizan batas, gorros y cubrezapatos desechables especiales para el laboratorio, se necesitar espacio para su almacenamiento. En cada uno de los tres laboratorios se llevan a cabo diferentes actividades. La amplificacin m vitro nunca se lleva a cabo en los dos laboratorios de preamplificacin. Uno de estos ltimos se dedica a la preparacin de reactivos, y el otro al acceso y procesado de especmenes y al preparado de la reaccin. En caso de que el espacio sea limitado, las dos habitaciones de preamplificacin se pueden combinar en un solo laboratorio. Se recomienda alta-

Mtodos de ayuda en el control de contaminacin

La introduccin de prcticas sencillas en las actividades ordinarias puede ser til en el control de la contaminacin, tanto de las muestras c o m o de la amplificacin. Se debe seguir estrictamente un flujo de trabajo unidireccional en el que el personal lleve a cabo sus tareas primero en los cuartos limpios, y slo despus de completar su trabajo se muevan a la habitacin de postamplificacin. Ningn personal que haya trabajado en el laboratorio de postamplifi-

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ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNSTICO MOLECULAR

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cacin debe volver al rea de preamplificacin antes de ducharse y cambiarse de ropa. Se recomienda el uso de batas de laboratorio, gorros y cubrezapatos de un solo uso. Si se utilizan batas de laboratorio de tela, es necesario tener batas de laboratorio especiales para cada laboratorio, que deben mantenerse dentro de cada laboratorio y no se debe utilizar en las reas externas. El uso de batas con diterentes colores para cada zona es una forma de recordar al personal el estricto flujo de trabajo. Otro factor importante en el flujo de trabajo del laboratorio es la limpieza. El mtodo ms seguro es hacer que el personal del laboratorio guarde en bolsas la ropa sucia de cada laboratorio y lo coloque fuera del mismo para ser llevado a la lavandera. Si el personal de lavandera entra en los laboratorios, debe recibir las instrucciones de quitar primero la ropa sucia del cuarto de preamplificacin, despus del espacio de oficinas y despus de la sala de postamplificacin. No se recomienda proteger los mostradores de trabajo con papel absorbente que lleve plstico detrs, dado que el papel puede recoger polvo y, con l, material amplificado si no se cambia a menudo. Si se utiliza, este tipo de papel debe descartarse de forma inmediata despus de cada uso. El uso de leja parece ser el mtodo ms aceptado de descontaminar superficies. La descontaminacin de los mostradores, equipos de laboratorio y muebles debe llevarse a cabo enjuagndolos con una solucin fresca de leja al 10% y despus con una solucin de etanol al 75%, o incluso con agua para diluir la leja que podra corroer las superficies. Todas las puntas de pipeta deben contener un filtro hidrfobo para evitar cualquier contaminacin de la punta de la pipeta con las plantillas o con el material amplificado. La evaluacin de la hidrofobicidad puede conseguirse haciendo que la pipeta aspire por encima de su lmite superior una solucin coloreada, para determinar entonces si la punta de la pipeta se ha teido. Las puntas de pipeta deben desecharse en bolsas de plstico sellables, asegurndose de que las bolsas estn completamente selladas antes de desecharlas. Los guantes se deben cambiar de forma peridica o tan pronto como se sospeche cualquier contaminacin. Otro mtodo de prevenir la contaminacin por amplicones es tratarlos qumicamente de manera que no sean capaces de soportar amplificacin incluso si se transfieren de forma accidental a otra muestra. La contaminacin por amplicones se identifica por la presencia de seal positiva en un control negativo. El amplicn se puede destruir por vanos mtodos. El mtodo ms utilizado es por el uso de irradiacin UV. El tratamiento con UV del ADN induce el entrecruzamiento de las dos cadenas por formacin de dimeros de timidina. Este ADN entrecruzado ya no sirve como una plantilla eficaz. Una desventaja del tratamiento con UV es que es ms eficaz cuando el amplicn es de ms de 700 nucletidos de largo, y muchas pruebas comerciales utilizan amplicones de tamao ms pequeo. Otro mtodo para inaclivar o esterilizar amplicones es por medio de la incorporacin de trifosfato de desoxiuridina en vez de trifosfato de desoxitimidina en el amplicn durante la amplificacin (Udaykumar, 1993). En este mtodo se incorpora al amplicn trifosfato de desoxiuridina en vez de timidina. Despus de la amplificacin, si este amplicn que contiene uracilo se transfiere accidentalmente a otra muestra, el tratamiento de la muestra antes de la amplificacin con uracil-rV-glucosilasa (UNG) dar lugar a la destruccin del amplicn que contiene uracilo. El amplicn que contiene uracilo es un sustrato para el UNG, mientras que el ADN nativo que contiene timidina no lo es. El UNG elimina los residuos de uracilo del amplicn mientras que inicialmente deja intacta la estructura de fosfodisler del amplicn. Sin embargo, durante el primer paso de desnaturalizacin del mtodo de amplificacin, las uniones foslodisler se rompen en los puntos donde se localizaron los residuos de uracilo. El amplicn fragmentado ya no es por tanto capaz de actual como plantilla. El uso de UTP y de UNG ha demostrado ser eficaz si el amplicn que contiene uracilo no supera las 10M0 copias por reaccin (Espy. 1993). Tambin se han utilizado los isopsoralenos con cierto xito. Despus de la amplificacin, la exposicin a la luz UV de onda larga produce uniones entre los isopsoralenos y la citosina que existe en el material amplificado, haciendo ineficaz al amplicn como plantilla para la amplificacin (Jinno, 1990).
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les a travs de laboratorio y de vuelta hacia el rea administraliva. Es importante que el servidor de la red se someta diariamente a copias de seguridad.

EQUIPAMIENTO
El equipamiento de laboratorio necesario para llevar a cabo con xito las actuales pruebas diagnsticas moleculares puede incluir instrumentacin que no se suele encontrar en el tpico laboratorio clnico. Incluso donde hay una superposicin, es importante que el laboratorio de diagnostico molecular contenga su propio equipo a fines de control de la contaminacin. En la Tabla 63-1 se proporciona una extensa lista de equipo de laboratorio junto con sus precios aproximados. Algn equipo adicional especializado no incluido en esta lista, que pudiera ser til dependiendo de la perspectiva del men de pruebas, comprende un secuenciador automtico de ADN (45.000-125.000 dlares), un termociclador en tiempo real de la reaccin de polimerasa en cadena (PCR) (45.000-95.000 dlares), instrumentos de electroforesis capilar (50.000 dlares) e instrumentacin para la cromatografa lquida de alta resolucin (20.000-40.000 dlares).

PERSONAL DE LABORATORIO
Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de diagnostico molecular se clasifican como laboratorios de pruebas de alta complejidad segn la enmienda de

Tabla 63-1 Necesidades y c o s t e s a p r o x i m a d o s de equipamiento Descripcin Cantidad Coste' Termociclador de ADN Campanas de flujo laminar Refrigerador/congelador Congelador sin escarcha manual de 20"C Congelador a 70"C Microcentrifuga de cabeza angular. 14 O O O rpm Microcentrifuga horizontal. 14.000 rpm j Placa lavadora de micropocillos Lector de placa de micropocillos Balanzas electrnicas Medidor de pH Agitador/calentador de placas ! Bao de agua Alimentador de electioloresis j Apralos de electroforesis mmi-PAGE Torres de moldeado de geles mini-PAGE Sistema de fotodocumentacin Aparatos de electroforesis en gel de agarosa Procesador automtico de placas radiogrficas l Placas para aulorradiogratia (17 x 14 pulgadas) | Placas de autorradiografia (8x10 pulgadas) | Micropipetas normalizadas (tres tamaos) Sistema do verificacin de temperatura para el termociclador Estacin de trabajo de PCR Mezcladores por agitacin Sistema de pipetas neumticas Contador radiactivo Espectrofotmetro UV Contador Geiger Aparato secuenciador de ADN Alimentador para el secuenciador de ADN Hornos de hibridacin Computadoras y programas Centrifuga refrigerada de sobremesa Incubadora Bao de agua en seco Microcentrifuga refrigerada T O T A L |^ "Los precios son slo aproximados 2 2 2 2
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2 I 3 8 2 i 4 i 4 4 18 1 1 3 4

17 000$ 8 000$ 1.600$ 900$ 7000$ 3.200$ 2.500$ 6.500$ 7.500$ 2.000$ 1.000$ 500$ 2.000$ 2.000$ 3.200$ 990$ 9 000$ 1.600$ 3.800$ 1.600$ 800$ 3.780$ 1.400$ 1.500$ 750$ 800$ 2.500$ 8.000$ 485$ 1 600$ 2 000$ 4 000$ 10000$ 6 000$ 1 000$ 800$ 2800$ 1 2 8 . 1 0 5 S

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La transferencia de papel entre los laboratorios y la parte administrativa constituye una preocupacin. Esto debe reducirse tanto como sea posible, en especial para el papel de trabajo utilizado en el laboratorio de postamplificacin. Es m u y recomendable la instalacin de una red de ordenadores en el laboratorio con un cierto nmero de terminales en los diterentes laboratorios y en las reas administrativas para reducir o eliminar el movimiento de pape-

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR individuos ganan experiencia en un rea de la medicina de laboratorio de rpido crecimiento, y esto les puede proporcionar una ventaja cuando busquen empleo en el futuro. Como parte de su adiestramiento en diagnstico molecular, es importante para los residentes, becarios y estudiantes ganar experiencia en cada una de las diferentes reas de pruebas, incluyendo las enfermedades infecciosas, enfermedades genticas y cncer. El adiestramiento debe incluir los principios bsicos de biologa molecular: experiencia manual en optimizar, validar y llevar a cabo pruebas de diagnstico molecular, en interpretacin de resultados de las pruebas y en preparacin de informes para su revisin. Los directores de laboratorio deben familiarizar a aquellos que se estn adiestrando con los diferentes temas de tratamientos del laboratorio.

mejora de laboratorios clnicos de 1998 (CLIA'88) (Bachner. 1988: CLIA'88.1992). Esta ley impone unos requerimientos especficos de educacin y entrenamiento para el personal que trabaja en estos laboratorios. Adems, es importante tener en mente que estas pruebas no slo son ms complejas que las pruebas habituales de laboratorio, sino que tambin algunas de ellas se han desarrollado dentro de los mismos. Es ms. eslas pruebas se modifican constantemente para mejorar factores como la especificidad, la sensibilidad, el tiempo de realizacin y el flujo de trabajo como resultado de la introduccin de nuevas tecnologas.

Director del laboratorio

Segn CLIA'88. los directores de laboratorio de laboratorios de pruebas de alta complejidad deben ser bien un MD o un DO con experiencia en patologa clnica o anatmica, un MD o DO con dos aos de experiencia en direccin o supervisin de un laboratorio de pruebas de alta complejidad, o bien disponer de un grado doctoral en alguna de las ciencias biolgicas y tener dos aos de experiencia supervisando un laboratorio de alta complejidad. Las responsabilidades del director de laboratorio son la seleccin de pruebas, su implementacin y la resolucin de dificultades tcnicas. El director de laboratorio es tambin el responsable del desarrollo de programas de laboratorio para la validacin clnica y analtica de las nuevas pruebas moleculares y el desarrollo de guas y mtodos de accin que aseguren la realizacin fiable de las pruebas clnicas. Adems, el director de laboratorio debe ser responsable del desarrollo, implementacin y revisin del control de calidad y de los programas de calidad del laboratorio.

Adiestramiento y acreditacin
La certificacin del nivel doctoral del personal que trabaja en los laboratorios de diagnstico molecular puede seguir varias rutas diferentes dependiendo del tipo de grado doctoral, as como de otra experiencia en el adiestramiento. Una va abierta a los individuos que tienen bien un grado de licenciatura o que ya son doctores lo proporciona el Consejo Americano de Gentica Mdica (ABMG), que est destinado a individuos que proporcionan servicios en gentica mdica. El Consejo Americano de Gentica Mdica es un miembro del consejo americano de especialidades mdicas, que es la organizacin "madre" de estas sociedades y que proporciona certificados en patologia, pediatra, medicina interna, ciruga y aproximadamente otras 20 especialidades mdicas. La certificacin en gentica consiste en un e x a m e n general seguido de un examen de subespecialidad en gentica clnica, gentica mdica, citogentica clnica, gentica clnica bioqumica o gentica clnica molecular. Para ser candidato a un certificado por el ABMG. un individuo debe cumplir los criterios en el rea de la certificacin deseada. Para la certificacin en gentica clnica molecular, el candidato debe poseer un grado doctoral adecuado y haber completado dos aos de adiestramiento en un programa acreditado. El candidato debe presentar un libro de trabajo de 1 5 0 casos clnicos moleculares, haber completado una prueba en gentica clnica molecular y tener una lisia de competencia en varios mtodos firmada por el director del laboratorio en donde se ha invertido la milad del tiempo del adiestramiento. El examen se ofrece cada tres aos Recientemente, el Consejo Americano de Especialidades Mdicas aprob la solicitud de la Sociedad Americana de Patologa y de la Sociedad Amencana de Gentica Mdica con respecto a crear un certificado conjunto de su especialidad en patologa gentica molecular. Los candidatos para este certificado deben tener un grado de MD o de DO, haber sido certificados por sus respectivos consejos, tener una licencia en vigor sin restricciones para practicar la medicina o la osteopatia en EE.UU. y haber completado un ao de adiestramiento en un programa acreditado. Al da de hoy todava no hay programas acreditados, pero se ha anticipado que la primera aprobacin de un programa de adiestramiento tendr lugar aproximadamente en junio de 2000, con la aceptacin de los primeros candidatos tan pronto como en julio de 2001. Se espera que el examen de candidatos para el certificado de la subespecialidad en patologa gentica molecular tenga lugar en el ao 2002. Las normas de adiestramiento en patologa gentica molecular estn siendo todava definidas por las diferentes organizaciones que participan en el certificado. Adems del programa de certificacin anterior, el Consejo Americano de Bioqumica Clnica (ABCC) ha aprobado un programa de certificacin en diagnstico molecular que ser ofrecido por primera vez en junio de 2000. La ABCC es una corporacin independiente, sin nimo de lucro, que certifica a profesionales con nivel de doctor en bioqumica clnica y bioqumica toxicolgica. Las normas y regulaciones de la ABCC para certificar en diagnstico molecular se han establecido recientemente. Antes de la admisin al examen, el solicitante debe tener algn certificado en cualquiera de los siguientes consejos: ABCC. Sociedad Americana de Microbiologa Mdica, Sociedad Americana de Patologa, Sociedad Americana de Inmunologa de Laboratorio Mdico. Sociedad Americana de Bioanlisis o Sociedad Americana de Histocompatibilidad e Inmunogentica. Los solicitantes deben cumplir unos requisitos de experiencia y de formacin adems de proporcionar tres cartas de recomendacin que certifiquen la experiencia profesional del solicitante, su duracin de experiencia en ese campo, y asi sucesivamente. El examen se realizar dos veces al ao.

Supervisor tcnico
Segn CLIA'88. un supervisor tcnico debe cumplir uno de los siguientes criterios para calificarse para este puesto. El individuo debe poseer bien un MD o DO con un ao de experiencia en un laboratorio de pruebas de alta complejidad, un grado de maestro con dos aos de experiencia o un grado intermedio con cuatro aos de experiencia.

Tcnicos mdicos y tcnicos en biologa molecular

Los tcnicos mdicos y tcnicos en biologa molecular son los responsables de las tareas necesarias para las operaciones diarias de la agenda de pruebas de laboratorio. Son los individuos responsables del acceso y procesado de los especmenes, de llevar a cabo diariamente las pruebas, mantener los registros adecuados de pruebas y control de calidad, adherirse a los procedimientos escritos y a las polticas de control de calidad, identificar problemas y documentar el mantenimiento de los equipos. El mantenimiento de registros de los mtodos de laboratorio est complicado por el hecho de que los mtodos desarrollados en el propio laboratorio se modifican constantemente para mejorar el proceso de las pruebas. Adems, algunos instrumentos de laboratorio se usan solamente para las pruebas de diagnstico molecular y existe poca experiencia del laboratorio clnico con ellas. Debido a estos factores, es importante que el personal tcnico, y en particular el personal tcnico superior, tenga un alto sentido de entrega profesional y que muestre un constante inters y esfuerzo en mejorar su educacin y adiestramiento Es tambin importante que adquieran todas las habilidades avanzadas de laboratorio que sea posible y que reciban un adiestramiento cruzado en la mayora o todas las diferentes pruebas que se usen en el laboratorio. Es crucial para el personal tcnico comprender plenamente las bases cientficas de la metodologa y las aplicaciones e implicaciones clnicas de las diferentes pruebas moleculares.

Residentes, becarios y estudiantes graduados

La captacin de residentes, becarios y estudiantes de ltimos aos puede contribuir de forma significativa al xito de un laboratorio de diagnstico molecular. El valor de estos individuos proviene de su alto nivel de entrega profesional y de su visin acerca de la utilidad clnica de las pruebas individuales. Si tales individuos disponen de tiempo para trabajar en el laboratorio de diagnstico molecular, con frecuencia son capaces de desarrollar y validar rpidamente un nuevo mtodo de diagnstico molecular. A cambio, estos

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ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNSTICO MOLECULAR

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El certificado de subespecialidad en diagnstico molecular est siendo ofrecido a individuos con nivel no doctoral, incluyendo tcnicos mdicos y tcnicos de biologa molecular a travs de la Agencia Nacional de Credenciales para el Personal de Laboratorio (NCA). La NCA es una organizacin no lucrativa y no gubernamental que lleva a cabo el certificado del personal de laboratorio. Los tcnicos mdicos y los tcnicos en biologa molecular quedan certificados como especialistas de laboratorio en biologa molecular [LSp (MB)]. Existen tres vas para llegar al examen de la NCA. En una, los candidatos deben haber completado un mnimo de experiencia de trabajo de doce meses en un laboratorio de diagnstico molecular con todos los servicios. Otra va es haber completado un programa de licenciatura o poslicenciatura en biologa molecular patrocinado por una institucin o universidad acreditadas, que incluya seis meses de experiencia de trabajo en un laboratorio de diagnstico molecular con todos los servicios. La ltima va es ser un cientfico de laboratorio clnico certificado o equivalente y completar un programa de certificacin poslicenciatura en biologa molecular patrocinado por una facultad o universidad acreditadas y completar un equivalente de seis meses de experiencia a tiempo completo en un laboratorio de biologa molecular con todos los servicios. Este examen se ofrece dos veces al ao en ms de 80 centros a travs del pas e incluso en centros extranjeros seleccionados. Es probablemente deseable que todos los tcnicos que trabajen en un laboratorio de diagnstico molecular con todos los servicios, en particular el personal tcnico superior, dispongan de acreditacin en diagnstico molecular.

paso de la totalidad del mtodo es la responsabilidad del laboratorio que ofrece el test y se comenta ms adelante en otra seccin

Sistemas automatizados basados en equipos para pruebas moleculares

La disponibilidad de sistemas automatizados para desempear pruebas moleculares va en aumento. Estos instrumentos pueden desempear funciones nicas o mltiples en relacin con las pruebas moleculares. El ejemplo tpico de un instrumento automatizado de funcin nica es un termociclador, que lleva a cabo todos los pasos necesarios para la amplificacin de los cidos nucleicos. Otros instrumentos automatizados de funcin nica comprenden los extractores de cidos nucleicos, los sistemas automticos para la preparacin y dosificacin de reactivos y los secuenciadores automticos de ADN. Ms recientemente se han desarrollado tambin instrumentos automticos que realizan ms de una funcin. Un sistema automtico introducido por sistemas moleculares Roche es el analizador COBAS Amplicor. Este instrumento contiene un termociclador, un brazo robtico cartesiano en tres dimensiones, bloques de calentamiento, estaciones de lavado e incluso un lector de colorimetra. Se ha previsto que en un futuro prximo estn disponibles instrumentos completamente automatizados que incluyan estas tres funciones, as como la extraccin automtica de cidos nucleicos.

SELECCIN DE PRUEBAS FORMATOS DE PRUEBAS CLNICAS

Existen dos principales formatos de pruebas utilizados en la mayora de los laboratorios que realizan pruebas de diagnstico molecular. Los dos formatos son las pruebas propias desarrolladas por cada laboratorio, conocidas tambin como ensayos de recela propia, y los basados en reactivos proporcionados en forma de equipo por los fabricantes de sistemas mdicos.

Pruebas de desarrollo propio

Las pruebas de desarrollo propio son aquellos anlisis que se han desarrollado y validado por completo en el laboratorio que las lleva a cabo. Por lo general, estos anlisis utilizan una combinacin de reactivos que se compran por separado de diferentes fabricantes. Cada laboratorio determina las caractersticas de realizacin del anlisis para un estudio clnico y para una poblacin en particular de pacientes. La validacin analtica y clnica de la totalidad del proceso es responsabilidad de cada laboratorio.

Mtodos manuales basados en equipos

Con respecto a los mtodos manuales basados en equipos, el fabricante del sistema mdico puede proporcionar todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la prueba, o simplemente proporcionar reactivos de calidad controlada para llevar a cabo cualquier paso particular de la prueba. Un ejemplo del primer grupo es el equipo para controlar la carga viral en pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Estos equipos proporcionan reactivos necesarios para todos los pasos del proceso de la prueba, incluyendo el aislamiento de los cidos nucleicos, la amplificacin y la deteccin. Incluyen tambin informacin con respecto a la sensibilidad, especificidad y limites de tolerancia para cada proceso clnico en particular. Estos equipos pueden estar etiquetados por el fabricante como aprobados por la Food and Drug Administralion (FDA), como despachados por la FDA, solamente para uso de investigacin o para fines cientficos. La validacin analtica y clnica de estos equipos por los diferentes laboratorios es diferente dependiendo del etiquetado. Los mtodos de validacin sern analizados en una seccin posterior. Un ejemplo de la segunda categora de mtodos basados en equipos son aquellos disponibles comercialmente para la extraccin de cidos nucleicos, reactivos de amplificacin que comprenden controles y sistemas de deteccin para cidos nucleicos amplificados m vilro. En algunos casos un laboratorio desarrollar una prueba molecular combinando dos o ms equipos de fabricantes iguales o incluso diferentes. La validacin analtica y clnica de cada

El objetivo principal del laboratorio de diagnstico molecular es proporcionar de forma fiable y en tiempo adecuado resultados de pruebas referentes a muestras que parecen ser importantes para la atencin de los pacientes. Cuando se considera qu pruebas se deben ofrecer, se deben tener en mente algunas consideraciones clave. Es importante que cualquier nueva prueba mejore de alguna forma el tratamiento de los pacientes, y que esto sea adems eficaz con respecto al coste. Una nueva prueba puede proporcionar un mtodo ms barato o ms eficaz para diagnosticar o controlar una enfermedad. Es importante que las decisiones referentes a elegir pruebas se basen no solamente en el coste de realizar la prueba sino tambin en cmo la nueva prueba pueda afectar de forma global a los cuidados y atenciones del paciente. Hay algunas circunstancias donde las pruebas moleculares puede que parezcan aumentar el coste del tratamiento de los pacientes aadiendo una prueba nueva a la batera ya existente de anlisis para un proceso clnico particular. Sin embargo, al introducir la nueva prueba, el tratamiento de los pacientes podra ser ms eficaz. Por ejemplo, la introduccin de las pruebas de carga viral para el VIH-1 para controlar la progresin de la enfermedad y la eficacia del tratamiento farmacolgico en individuos infectados por VIH-1 han colaborado de forma significativa al tratamiento de estos pacientes. Un gran nmero de pacientes inleclados por el VIH-1 estn siendo tratados actualmente con una combinacin de entre dos y cinco frmacos diferentes, que incluyen inhibidores de las proteasas y frmacos no-nucleosidicos. que han resultado ser muy eficaces en reducir la morbilidad y la mortalidad en un gran nmero de pacientes infectados por VIH-1. Sin embargo, estos frmacos son muy caros, por lo que es importante tener medios eficaces de controlar su efectividad si deben proporcionar el mximo beneficio al paciente. Sin pruebas de carga viral los clnicos deberan basarse en recuentos de CD4 y en los sntomas clnicos, que pueden ser en ambos casos marcadores poco sensibles de efectividad farmacolgica hasta que uno se encuentra en las ltimas fases de la enfermedad por VIH (Ferreira-Gonzlez, 1995). El ejemplo anterior muestra el impacto sobre el tratamiento de los pacientes y la introduccin de una nueva prueba, pero hay otros ejemplos en los que la rentabilidad se ve favorecida sustituyendo pruebas ya existentes de laboratorio. Esto puede producirse si la prueba molecular proporciona una mejor sensibilidad o especificidad, o un tiempo de realizacin reducido que impacte directamente sobre el tratamiento del paciente. Por ejemplo, el tratamiento de pacientes con una posible infeccin por Mycobacterium tuberculosis necesita que sean tratados con frmacos que tengan una potencial toxicidad heptica y que sean aislados hasta que se confirme en el laboratorio el diagnostico de presuncin. La prueba habitual de laboratorio de examinar directamente un espcimen del paciente buscando la presencia de Mycobacterium tubrculo-

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SECCIN V I I

P AIOIOGA MOLECULAR nerar una factura. Hasta hace poco slo exista un nUmero limitado de cdigos CPT para las pruebas de diagnstico molecular. Los cdigos originales identificaban mtodos generales que comprendan partes de un estudio molecular, como la extraccin de cidos nucleicos, la digestin enzimtica, la amplificacin in vitro, y as sucesivamente. Ms recientemente, se ha aadido un nmero de nuevos cdigos CPT especilicos de prueba". Sesenta de estos nuevos cdigos son cdigos especficos de reactivos utilizados para las pruebas moleculares microbilogos. Los cdigos especficos de anlisis, como el que se utiliza para la deteccin del VIH mediante PCR, estn diseados para incorporar todos los pasos, procedimientos y reactivos utilizados en el anlisis. Tambin hay diferentes cdigos CPT para la deteccin del mismo microorganismo utilizando diferentes mtodos. Por ejemplo, la deleccin mediante una tcnica de sonda directa frente a la deteccin mediante amplificacin in vitro o la cuantificacin del organismo necesitan cada uno un cdigo CPT dilerente. Para las pruebas moleculares sin un cdigo CPT especfico del anlisis sigue siendo necesario utilizar una combinacin de cdigos generales CPT de procedimiento. En la Tabla 63-2 se listan ejemplos de cmo se pueden facturar pruebas con cdigos CPT especilicos del anlisis y pruebas que todava necesitan una combinacin de cdigos generales CPT d e procedimiento. Los niveles de reembolso para cualquier prueba individual estn establecidos por los terceros pagadores y pueden tener poca relacin con el coste real de llevar a cabo la prueba. En general, los terceros pagadores tienden a establecer niveles de reembolso de acuerdo con las tarifas establecidas por Medicare y por Medicaid. Para la facturacin de estas pruebas no se necesita la aprobacin de la FDA Recientemente, la FDA ha ordenado que para las pruebas no aprobadas por la FDA, donde se utilizan reactivos especficos del anlisis, y que incluyen esencialmente todas las pruebas moleculares, se debe aadir al informe una nota que indique que la prueba se desarroll, que sus caractersticas de capacidad se han determinado en el laboratorio y que esta prueba no ha sido ni prohibida ni aprobada por la FDA. Algunos terceros pagadores pueden negarse al reembolso de las pruebas que llevan u n a nota de este estilo, dado que creen que el coste de llevar a cabo tales pruebas debe ser soportado mediante ayudas de investigacin, incluso aunque las caractersticas y la utilidad clnica de la prueba hayan sido validadas por el laboratorio.

sis carece de sensibilidad pero es extremadamente rpida Por otro lado, el cultivo es exquisitamente sensible, pero puede tardar hasta seis semanas en proporcionar resultados. A la vista de este dilema, una prueba molecular que permita un diagnstico ms rpido con un mayor grado de sensibilidad y especificidad permitira interrumpir un tratamiento farmacolgico y un aislamiento en aquellos pacientes que no tienen la enfermedad, reduciendo as los costes para el paciente y mejorando la atencin mdica. La identificacin de las pruebas que se deben ofrecer en un centro mdico es sobre todo la responsabilidad de los directores mdico y tcnico del laboratorio de diagnstico molecular. A veces se puede ayudar en este aspecto revisando la lista de pruebas que el cenlro mdico realiza fuera del mismo. En otros casos, individuos clave como clnicos y patlogos pueden ser una fuente valiosa para identificar las necesidades de un centro mdico en particular. Es importante para los directores de laboratorio identificar claramente un rea donde exista una necesidad percibida de mejorar las herramientas disponibles para el diagnstico y el tratamiento de los pacientes. Durante el proceso de seleccin de pruebas, se debe llevar a cabo un ajuste real de las capacidades tcnicas dentro del laboratorio con las necesidades del mundo clnico real en cuanto a volumen de las pruebas, tiempo de realizacin necesario y costes asociados para llevar a cabo el anlisis. Una vez que se ha identificado un anlisis en particular, se deben abordar los diferentes sistemas para llevar a cabo el anlisis. Por ejemplo, se puede utilizar la hibridizacin de tipo Southern blot, mtodos de amplificacin in vitro de cidos nucleicos o incluso anlisis citogentico o de fluorescencia de hibridacin in situ (HISF) para realizar algunos anlisis. Asi. es importante tener en cuenta la condicin clnica y las ventajas e inconvenientes de cada uno de los diferentes sistemas para diagnosticar un proceso clnico en particular cuando se hace la eleccin final. El establecimiento de un periodo de pruebas para evaluar la utilidad clnica de una prueba en particular es una importante herramienta. S se disea con cuidado, este perodo permitir al laboratorio trabajar directamente con el usuario final de la prueba y proporcionar una va para que estos individuos comprendan la utilidad clnica de la prueba y sus limitaciones. Es importante definir con claridad las medidas que se puedan evaluar al final del periodo del estudio clnico y que dar lugar en ltima instancia a la realizacin o exclusin de la prueba.

Codificacin CPT e ICD -9

La facturacin de las pruebas de diagnstico molecular siguen el mismo procedimiento que cualquier otra prueba de laboratorio. Por lo general, se necesitan un cdigo de terminologa de procedimiento de facturacin (CPT) y un cdigo diagnstico de la clasificacin internacional de enfermedades (ICD9). Ms all de esto, el procedimiento es por lo general especfico de cada centro, basndose en los mtodos de facturacin manual e informatizada que tengan lugar en la institucin. Es importante determinar por anticipado la documentacin necesaria y los accesos informticos imprescindibles para ge-

Patentes
La inmensa mayora de los sistemas de amplilicacin in vitro son procesos patentados, y se debe obtener una licencia formal para el uso de estos procedimientos, o el laboratorio que los use ser susceptible de ser perseguido por inlraccin de patente. De forma tradicional, la licencia se obtiene para un procedimiento en particular adquiriendo un conjunto de reactivos, aprobado por la FDA y vendido por un fabricante que tiene la patente del proceso de amplificacin. Este abordaje es muy limitado para las pruebas de diagnstico

Tabla 63-2

Facturacin de diagnstico molecular Cdigo CPT 83890 83898 83892 83894 83912 Nmero de veces que se factura el cdigo CPT 1 Nombre o procedimiento de la prueba Aislamiento de cidos nucleicos Amplilicacin con sonda Digestin enzimtica Electroloresis en gel Interpretacin e informe Aislamiento de cidos nucleicos Transcripcin inversa Amplificacin con sonda Electroforesis en gel Interpretacin e informe VIH cuantitativo CMV cuantitativo VHC cuantitativo

Nombre de la prueba Factor V Leiden por PCR-RFLP

t(9:22) por RT-PCR

83890 83902 83898 83894 83912 87536 87497 87522

1 2 2
1 1

VIH-1 carga viral CMV carga viral VHC carga viral

1
1

CAPTULO 63

ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNSTICO MOLECULAR

133?

molecular, dado que existe un nmero muy limitado de pruebas que hayan sido aprobadas por la FDA. Asi. un laboratorio que utilice un proceso particular patentado para pruebas clnicas debe primero negociar una licencia con el propietario de la patente. Es m u y importante darse cuenta de que. dependiendo de la complepdad de la institucin que busca el acuerdo y de la complejidad del propio acuerdo, este proceso puede tardar entre tres meses y un ao para obtener una licencia que permita llevar a cabo y facturar el procedimiento con fines clnicos. Se deben tener unas consideraciones prcticamente idnticas con respecto al uso de informacin de secuencias necesarias para disear un estudio molecular. El uso para fines clnicos de informacin de secuencias para muchos genes de nuevo descubrimiento est frecuentemente patentado por los descubridores del gen, y el uso de la informacin de la secuencia sin una licencia incurre en las mismas responsabilidades de infraccin de patentes. Por desgracia, dado el actual medio y la diversidad de las fuentes de informacin de secuencias, no est siempre claro si la secuencia se ha patentado o quin es el propietario de la patente. Es recomendable, antes de llevar a cabo desarrollos de cualquier prueba basada en secuencias publicadas y donde se est pensando destinar una gran cantidad de recursos, verificar con los investigadores que primero descubrieron la secuencia el estado real de las patentes.

lizados de referencia, el Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa (NIST) ha desarrollado uno de los primeros materiales normalizados de referencia de cidos nucleicos para las pruebas de identidad humana Ms recientemente, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) introdujo un material normalizado de referencia para la hepatitis C para la validacin de pruebas de cidos nucleicos (NAT) para el estudio de sangre y productos sanguneos. Estn disponibles en el comercio paneles de referencia calibrados con respecto al material de referencia normalizado de la OMS (Boston Biomedica Inc, Boston, MA). Adems, se ha hecho un esfuerzo para desarrollar reactivos de referencia para el VIH-1 tanto por la FDA como por otras diferentes compaas. En ausencia de materiales normalizados de referencia, los laboratorios deben desarrollar su propio material de referencia para sus estudios de valoracin analtica y para la posterior vigilancia de los resultados de la prueba. La creacin de un material de referencia propio comprende el uso de mtodos establecidos de forma independiente para determinar la concentracin de cidos nucleicos diana. De forma alternativa, los laboratorios pueden llevar a cabo estudios que comparen sus resultados con otros mtodos ya establecidos. Por ejemplo, las muestras se pueden dividir para un estudio de comparacin con otro laboratorio que lleve a cabo una prueba molecular parecida. Las muestras utilizadas para la validacin analtica pueden ser de disposicin propia o puede ser necesario obtenerlas de una fuente externa, como de un laboratorio colaborador, una agencia gubernamental (centros para el control y prevencin de enfermedades [CDC], FDA o el Instituto Nacional de la Salud [NIH]) o incluso de un suministrador comercial. Una vez que se ha organizado un grupo adecuado de muestras, la validacin analtica sigue las normas habituales utilizadas en otra clase de pruebas. La determinacin de la sensibilidad y linealidad analtica se puede abordar llevando a cabo diluciones seriadas de muestras positivas para la diana que han sido estudiadas ya mediante otro mtodo, o analizando especmenes diananegativos a los que se han aadido cidos nucleicos diana purificados, microorganismos u otras clulas. La precisin de la prueba se valora haciendo determinaciones en un nmero de muestras de pacientes muchas veces en el mismo lote o en diferentes lotes a lo largo de varios das. Las muestras utilizadas para los estudios de precisin deberan abarcar el rango lineal dinmico de la prueba. Al igual que la precisin, la validacin de la linealidad puede llevarse a cabo utilizando diluciones seriadas de un espcimen positivo en un espcimen negativo. La valoracin de variables preanalticas. como lipidos. hemoglobina, bilirrubina. frmacos teraputicos y anticoagulantes presentes en el espcimen, puede realizarse aadiendo estas sustancias a especmenes negativos a los que se ha aadido una cantidad conocida d e microorganismos, clulas o "diana" purificada (Lion. 1996). La validacin clnica requiere la determinacin de dos probabilidades: la primera, la probabilidad de que si la muestra procede de un paciente con la enfermedad la prueba sea positiva (sensibilidad clnica); y segundo, la probabilidad de que si la muestra proviene de un paciente que no tiene la enfermedad la prueba sea negativa (especificidad clnica). La evaluacin de la sensibilidad clnica necesita pruebas de una cantidad adecuada de muestras de pacientes que hayan sido diagnosticados de la enlermedad La especificidad clnica se determina analizando muestras de pacientes diagnosticados c o n una enfermedad diferente que pudiera confundirse con la enlermedad indicada y que aparezca en el diagnstico diferencial. Basndose de forma conjunta en la especificidad y sensibilidad clnica de la prueba, junto con el conocimiento de la prevalencia de la enfermedad, se pueden calcular los valores predictivos positivos y negativos de la prueba y evaluar la probable utilidad clnica del anlisis. Desde el punto de vista prctico, la mayora de los estudios de validacin clnica son llevados a cabo comparando la sensibilidad y especificidad clnica del nuevo mtodo frente a un grupo de muestras procedentes de la poblacin objetivo que han sido estudiados mediante un "estndar oro" con respecto al sustrato analtico en cuestin. En algunos casos, las pruebas moleculares han parecido ser ms sensibles y/o especficas que las actuales pruebas "estndar oro". La resolucin de discrepancias entre la nueva prueba y la que se usa actualmente como mtodo "estndar oro" puede en un cierto nmero de casos dar lugar a dilemas que necesitan la utilizacin de un mtodo molecular diferente para resolver las discrepancias. Recientemente, la Association lor Molecular Pathology public un programa detallado de implementacin

VALIDACIN ANALTICA Y CLNICA DE LAS PRUEBAS MOLECULARES

La implementacin de una nueva prueba clnica necesita que sea validada tanto analtica como clnicamente. Durante la validacin analtica se determinan la sensibilidad analtica, la especificidad, la precisin y. para los estudios cuantitativos, la linealidad del mtodo. La sensibilidad analtica de la prueba es una medida del limite inferior de deteccin del mtodo en el sustrato diana. La especificidad analtica mide el grado en el que la prueba reacciona de forma cruzada con cidos nucleicos que no son la secuencia diana pretendida. La validacin clnica se centra en determinar la utilidad clnica de una prueba positiva o negativa en una enfermedad especifica. Es importante cuando se lleva a cabo la validacin clnica examinar una muestra transversal completa de los individuos que sern parte de la poblacin en la que se va a utilizar la prueba. La CLIA'88 define importantes diferencias entre la implementacin de una prueba aprobada por la FDA y una que no lo est. Los laboratorios que implementan una prueba aprobada por la FDA slo necesitan verificar las caractersticas de capacidad de la prueba para las indicaciones en poblaciones parecidas a aquellas para las que ha establecido el fabricante. Por otro lado, la implementacin de pruebas desarrolladas en el laboratorio necesitan una extensa documentacin de la capacidad de la prueba, adems de los pertinentes programas de control de calidad, para asegurar la capacidad diaria de la prueba (Ferreira-Gonzlez, 1997). El primer paso para introducir un anlisis molecular propio es optimizar cada paso del proceso analtico, lo cual incluye la extraccin de cidos nucleicos, amplificacin, deteccin, clculos e interpretacin de resultados. Cuando se optimizan por separado cada una de las fases, es importante darse cuenta de que en la mayora de los casos ser necesario volver a optimizar cuando todas las lases se realizan de forma conjunta. Despus de optimizar el anlisis, es importante valorar el impacto sobre las caractersticas de los resultados del mtodo de las diferentes variables preanalticas. como la clase de espcimen, el transporte, el manejo y la conservacin de la muestra y las sustancias que interfieren, como lipidos, hemoglobina, bilirrubina y as sucesivamente. Despus de la optimizacin, los laboratorios deben llevar a cabo una validacin analtica del mtodo. Esto puede ser difcil debido a la falta de normalizacin, paulas y materiales normalizados de referencia para un gran nmero de cidos nucleicos diana. Esto impacta de lorma negativa sobre la capacidad de un laboratorio para determinar la sensibilidad y precisin del mtodo. Diferentes organizaciones nacionales e internacionales estn dando pasos para desarrollar estndares, pautas y materiales normalizados de referencia. Diferentes sociedades profesionales, agencias federales y organizaciones sin nimo de lucro han desarrollado pautas y normativas para los diagnsticos moleculares (Tabla 63-3). Con respecto a los materiales norma-

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Tabla 63-3

SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

Guas y estndares de las pruebas de diagnstico molecular N o r m a s o estndares Direccin

Organizacin NCCLS

MM1-P Meiodos de diagnstico molecular para enfermedades genticas NCCLS 940 West Valley Rd. M M 2 - A Anlisis de redisposicin de genes de mmunoglobulinas y Suile 1400 receptores de clulas T Wayne. PA M M 3 - A Mtodos de diagnstico molecular para enfermedades infecciosas 19087-1898 M M - 5 Anlisis de amplificacin de cidos nucleicos para hematologa Wayne. PA molecular w w w nccls.org M M - 6 Diagnstico molecular cuantitativo para enfermedades infecciosas M M - 7 Hibrdizacin in situ fluorescente para gentica mdica M M - 8 Medida e interpretacin de repeticiones de trinucleOtidos Poltica de normas de estndares y pautas para los laboratorios de gentica clnica ABMG/ABGC/ACMG. Hibridizacin in situ fluorescente de mterfaz prenatal Administrative office. Declaracin de la ACMG sobre deteccin de marcadores mltiples en 9650 Rockville Pike. Bethesda. MD mujeres de 35 aos y mayores 20814-3998 Sndrome de X frgil: pruebas de diagnstico y portadores Normas de almacenamiento y uso de materiales genticos Normas sobre deteccin de marcadores mltiples en mujeres gestantes Normas sobre el uso de pruebas de apolipoprotena E para la enfermedad de Alzheimer Puntos a considerar: ticos, legales e implicaciones psicosociales de las pruebas genticas en nios y adolescentes Pruebas diagnsticas para los sndromes de Angelman y de Prader-Willi Declaracin sobre deteccin poblacional para la mutacin BRCA-1 en muieres judias ashkenazi Principios de deteccin: comunicado del subcomit sobre la deteccin del comil de practica clnica de la Sociedad Americana de Gentica Mdica Comunicado sobre pruebas en portadores de la enfermedad de Canavan Declaracin sobre pruebas genticas para la fibrosis quistica Normas para la histocompatibilidad molecular y pruebas nmunogenticas ASHI PO Box 15804 Lenexa. KS 66285-5804 w w w nhgri.nih.gov/ELSI/TFGT-linal

ACMG

ASHI

NIII-DOI

Grupo de trabajo de pruebas genticas que promueve unas pruebas genticas seguras y efectivas en Estados Unidos: comunicado final del grupo de trabajo sobre pruebas genticas

FDA

Das para la industria sobre la manufactura y valoracin clinica de pruebas m vitro para detectar in vitro secuencias de acido nucleico del VIH-1 www.fda.gov/cber/gdlns/nashivpdf Borrador de la gula para la industria y/o personal inspector de la FDA. normas previas a la comercializacin para anlisis en relacin con www.fda.gov/cdrh/ode/1353pdl el virus de la hepatitis C (VHC) que estn indicadas para el diagnstico o monitorizacin de la infeccin por VHC o enfermedades asociadas: borrador de guias Recomendaciones para desarrollo y operatividad domstica de pruebas de diagnstico molecular Guas para un control de mantenimiento de calidad para el anlisis de ADN Am J Clin Pathol 1999. 111 449 Crime laboratory Digest 1991; 18 44

AMP

Technical Working Group on DNA Analysis Methods

para la introduccin de la nueva prueba molecular (recomendaciones de 1999 de la AMP). La Tabla 63-4 proporciona una lista de tareas para llevar a cabo el proceso de pruebas clnicas.

Reactivos especficos del sustrato

El trmino reactivo analtico del sustrato (ASR) fue desarrollado por la FDA para referirse a los reactivos utilizados en las pruebas clnicas que confieren especificidad para detectar el sustrato objetivo. La FDA define los ASR como "anticuerpos, monoclonales y policlonales. receptores especilicos. protenas, lgandos. secuencias de cidos nucleicos y reactivos similares que por medio de unin especifica o reaccin qumica con sustancias de un espcimen estn diseados para su uso en una aplicacin diagnstica para la identificacin y cuantificacin de una sustancia qumica individual o ligando en especmenes biolgicos". Las sondas y cebadores utilizados para detectar ADN o ARN objetivos se consideran ASR. A fecha de

noviembre de 1998, los laboratorios clnicos que utilizan mtodos de tecnologa propia que contienen ASR deben cumplir la normativa final d e la FDA acerca de ASR publicados en el Registro Federal. Como parte de esta norma final, los laboratorios son requeridos para incluir una advertencia especfica en sus informes afirmando que "Esta prueba ha sido desarrollada y sus caractersticas de capacidad determinadas por (nombre del laboratorio). No ha sido aprobada por la administracin de frmacos y alimentos de Estados Unidos". Pero, al mismo tiempo, la FDA ha permitido a los laboratorios que aadan a esta coletilla que la prueba que utiliza ASR no precisa la aprobacin de la FDA, que la prueba se utiliza con fines clnicos y que el laboratorio ha sido certificado por la CLIA'88 para llevar a cabo pruebas de alta complejidad. Adems de la definicin de los ASR, la FDA ha propuesto un coniunto de controles y restricciones que deben aplicarse a su uso para asegurar su calidad y uniformidad, y para aclarar que los laboratorios que desarrollan ensayos propios son los responsables de vigilar las capacidades de la prue-

CAPITULO 63

ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNSTICO MOLECULAR

1341

ba. De forma interesante, estos controles se aplican tanto a los laboratorios que desarrollan ensayos propios que utilizan ASR como a los fabricantes de los reactivos para estos ensayos. Se solicita a los laboratorios que cumplan

Tabla 63-4 Actividad

Llevando a c a b o el proceso d e p r u e b a s clnicas Consideraciones Trabajar en el ambiente ms limpio Almacenar las soluciones de trabajo en alcuotas de un solo uso. Realizar control de calidad en cada nuevo grupo de reactivos antes de su uso en pruebas clnicas Utilizar una muestra con un bajo nmero de copias para valorar la sensibilidad Preparacin de las mezclas patrn para reducir errores y variabilidad. Establecer unos limites de tolerancia aceptables para cada tipo de espcimen que se deba analizar (temperatura de almacenamiento, tiempo de transporte, anticoagulanles, etc.) Distribuir protocolos para un adecuado manejo de las muestras a todos los usuarios potenciales. Recoger informacin clnica y analtica en formularios Los especmenes deben ser recibidos y almacenados en el laboratorio de preamplificacin (limpio). Desarrollar pautas para asegurarse contra la mezcla de muestras y para mantener la integridad de la secuencia objetivo Valorar los mtodos de extraccin buscando la presencia de inhibidores y tactores que disminuyen el rendimiento del objetivo Control interno aadido a la muestra en el momento de la extraccin para buscar falsos negativos debidos a inhibidores o determinar esta tasa por algn otro mtodo Si no se va a evaluar un control interno con cada muestra de un paciente, entonces la tasa de falsos negativos deberia figurar en el informe en una nota, en caso de que el resultado sea negativo. Optimizar las concentraciones de cebadores MgCl.., dNTP; volumen; condiciones del ciclado y del sistema de deteccin. Desarrollar pautas para reducir al minimo la posibilidad de contaminacin por el cido nucleico plantilla o el amplicn (vanse secciones del control de calidad) Los controles deben procesarse de la misma forma que las muestras de los pacientes Desarrollar pautas para organizar el anlisis y evitar la contaminacin cruzada de la muestra y los controles. Desarrollar guias para la interpretacin y los informes La interpretacin debo ser realizada por lo menos por dos individuos y de forma independiente. Desarrollar pautas para la distribucin de los informes.

los requisitos de certificacin de alta complejidad de la CLIA'88 y que determinen las caractersticas de los mtodos propios siguiendo las regulaciones de CLIA'88 Los fabricantes de ASR son requeridos para registrarse ante la FDA, para seguir las normas de buena manufactura y para que restrinjan la venta de esta clase de reactivo a los laboratorios certificados bajo la CLIA'88 para pruebas de alta complejidad. Adems, los fabricantes son responsables de comunicar a la FDA cualquier efecto adverso debido a fallos en el proceso de manufactura.

Preparacin de los reactivos

Limitaciones especiales en relacin con las pruebas genticas

Las pruebas genticas se llevan a cabo para el diagnstico y/o valorar el pronstico de trastornos de expresin fenotpica. para el diagnstico prenatal de enfermedades genticas, determinacin del estado de portador, y para realizar pruebas predictivas que valoren la probabilidad del futuro desarrollo del trastorno gentico. Cuando se ofrecen pruebas genticas se debe considerar un cierto nmero de limitaciones. La primera es que una prueba pudiera no detectar todas las posibles mutaciones que puedan estar presentes en un gen en particular que produce una enfermedad. Entre ejemplos de esto figuran el vasto nmero de mutaciones que se han identificado en el gen de la fibrosis qustica y los dos genes principales para el cncer de mama. As. una prueba negativa pudiera no asegurar completamente que la persona examinada no transporta una mutacin en un gen en particular. Al mismo tiempo, una prueba positiva puede comportar diferentes riesgos para el paciente en relacin con diferentes frecuencias de penetracin del trastorno en los distintos pacientes. Debido a la potencial complejidad con respecto a la interpretacin de resultados de pruebas genticas, es recomendable que un laboratorio que considere ofertar pruebas genticas coordine estrechamente el desarrollo y la oferta de la prueba con el personal profesional clnico que utilizar los resultados de las pruebas para el cuidado de los pacientes. Una consideracin aadida en relacin con las pruebas genticas son los esfuerzos a niveles tanto estatal como federal para imponer restricciones especiales en la realizacin de las pruebas genticas. Esto ha sido expresado de la manera ms frecuente con la proposicin de normas que necesiten un especial consentimiento informado de los pacientes antes de que su muestra pueda utilizarse en cualquier prueba que estudie directamente el ADN del paciente en busca de mutaciones o polimorfismos genticos. Es mas. estas normas propuestas podran restringir el uso de todas las muestras de cualquier tipo para la investigacin o para controles de pruebas clnicas a menos que se haya obtenido un consentimiento informado especifico para tal uso de lo que quede de las muestras de los pacientes. Esto hace preciso que los laboratorios que se propongan ofrecer pruebas de consejo gentico estudien los requerimientos reguladores actuales de las autoridades tanto federales como estatales y de las sociedades profesionales pertinentes.

4. Recogida de especmenes I

2.

3.

Procesado de los especmenes

1.

2.

Anlisis del espcimen a Mtodo de extraccin

1.

b Organizacin del mCtodo, amplificacin y deteccin 2.

CONTROL DE CALIDAD Y SEGURIDAD DE LA CALIDAD

Control de calidad en el proceso de las pruebas

El establecimiento de pruebas de diagnstico molecular, en particular de los mtodos de amplificacin, necesita una especial consideracin de cada fase del proceso, incluyendo la preparacin de reactivos, la recogida de muestras, la separacin de las mismas, la realizacin real del mtodo y la comunicacin de los resultados. Un mtodo de laboratorio bien elaborado y correctamente escrito es un factor clave para asegurar que el mtodo es reproducible. Es una de las ayudas ms importantes durante el adiestramiento prctico del nuevo personal o cuando el mtodo no se lleva a cabo con mucha frecuencia. El protocolo del mtodo debe escribirse siguiendo guias especificas del Comit Nacional de Normalizacin de Laboratorios Clinicos (NCCLS). como figura en sus guas GP-A2 para escribir un manual de procedimiento tcnico de laboratorio clnico. Para la interpretacin de los resultados es vital una cuidadosa seleccin de controles. Se utilizan varios tipos de controles durante la ejecucin d e un

Interpretacin e informe

1 2.

1342

SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

mtodo para asegurar que un mtodo especfico funciona de manera adediferir en ms de un par de minutos. Las fluctuaciones en los tiempos de ciclacuada. La CLIA'88 precisa controles positivos y negativos que deben llevarse do son un aviso de que el termociclador necesita ser ajustado y restaurado a a cabo en cada prueba clnica. El no ser capaz de obtener el resultado correcsu situacin original. Adems, el funcionamiento de las neveras y calentadoto para cualquiera de los controles invalida la prueba y necesita que se vuelres junto con la uniformidad del bloque de temperatura tambin se deben verivan a estudiar todas las muestras. Siempre que ello sea posible, los controficar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La verificacin de la les positivos y negativos deberan parecerse al espcimen del paciente. Es uniformidad del bloque de temperatura se debe llevar a cabo utilizando un ms. un control positivo debera contener la secuencia diana de cidos nucleitermopar con una sonda trmica. cos a una concentracin clnicamente relevante en un trasfondo de secuenOtros elementos importantes del equipo que se utiliza en prclicamenle cias negativas de cidos nucleicos diana. El control negativo debe contener cualquier fase del anlisis son las pipetas. Se debe poner un nfasis especial secuencias de cidos nucleicos que se espere estn presentes en una muesen su control de calidad y en su mantenimiento, dado que pueden ser una tra negativa. Adems de los controles positivos y negativos, en cada anlisis importante fuente de error. Todo el resto de equipo debe ser igualmente condebera incluirse un control "blanco" que contenga todos los componentes de trolado y mantenido de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. la mezcla de reaccin a excepcin de cidos nucleicos. En circunstancias Siempre que ello sea posible, el calibrado del equipo se debe llevar a cabo donde un resultado negativo influya de forma significativa sobre el diagnstiutilizando normas certificadas o materiales de referencia certificados. co, se debe incluir un control positivo interno. De otra forma, cuando se obtenga un resultado negativo, no estar claro si la ausencia de un amplicn se deElementos del programa de seguridad de la calidad be a la ausencia de la secuencia diana en la muestra del paciente o si se debe Todos los laboratorios de diagnstico molecular deben desarrollar un proa la presencia de inhibidores que supriman la reaccin de amplificacin. Este grama de seguridad de la calidad exlenso y por escrito. El objetivo del progracontrol positivo interno puede ser otro gen que siempre est presente en cada ma de seguridad de la calidad es vigilar y valorar, de lorma objetiva y sisteespcimen de ADN o ARN purificado del husped. De forma alternativa, pomtica, la calidad y adecuacin de los resultados de las pruebas. El programa dra ser una secuencia incluida dentro de la muestra de lorma especfica para de seguridad de calidad (QA) debe tratar cada una de las lacetas del proceevaluar la inhibicin del mtodo. Estos controles positivos internos son muy so de la prueba, desde la fase preanalitica hasta la fase analtica y postanatiles para valorar la presencia de cido nucleico amplficable. la ausencia de ltica del proceso. El programa debe incluir unas polticas y documentacin inhibidores y si las reacciones de deteccin y amplificacin se llevan a cabo escritas de la educacin y el adiestramiento del personal, educacin mdica de acuerdo con las normas. continuada, pruebas de eficiencia, inspecciones internas y externas, incluEl aadir controles para juzgar la sensibilidad de la reaccin tambin es yendo la documentacin o acciones correctoras de las deficiencias ciladas. importante. Se construyen tres o ms diluciones en las que no se pueda programas de control de calidad para las pruebas clnicas, luncionamiento del detectar la dilucin ms baja. Esle control es m u y til para vigilar no slo la equipo y seguridad. realizacin de la prueba a lo largo del tiempo sino tambin la presencia de El programa QA vigila los aspectos de pruebas clnicas que n o inciden niveles bajos de contaminacin del amplicn. directamente en la validacin analtica de los resultados de las pruebas y que Es importante que los mtodos de desarrollo propio implementen un prono son asi por lo general parte del programa del control de calidad. Algunos grama de control de calidad para valorar la potencia, la pureza y la capacide estos parmetros son el tiempo mensual de rotacin, las revisiones mendad de cada reactivo crtico utilizado en el proceso del anlisis. Cada reacsuales de los resultados anormales y normales, el desarrollo de criterios de tivo critico debe estudiarse antes de ser utilizado para pruebas clnicas. Se exclusin de muestras, la revisin del registro de especmenes rechazados y deben establecer lmites de tolerancia para cada reaclivo crtico, Siempre los indicadores de calidad de las pruebas. Adems, y como ya se ha mencioque ello sea posible, se deben establecer los niveles de tolerancia utilizannado, el laboratorio debe participar en programas de estudio de eficiencia. do una medida cuantitativa para evitar una valoracin sujetiva de la caliHay un cierto nUmero de pruebas para las que las diferentes asociaciones dad del reactivo critico. profesionales han desarrollado programas de eficiencia. La Coitege ot Amencan Pathologists ofrece diferentes programas independientes y combinados Control de calidad del equipo de laboratorio para el diagnstico molecular en enfermedades infecciosas, oncologa y Todo el equipo utilizado en los laboratorios de diagnstico molecular debe gentica. El programa de eficiencia en gentica se ofrece en colaboracin con tener un mtodo escrito de control de calidad que describa para cada parte la American Cotlege of Medical Genetics. Recientemente, el CDC ha hecho del equipo los mtodos de mantenimiento con sus registros asi como sus disponible un programa de evaluacin de resultados para Mycobacterium calibraciones. El mtodo de control de calidad debe estar escrito de acuertuberculosis y para el VIH-1. Para aquellas pruebas en donde no se ofrece un do con las normas publicadas por la NCCLS. Al igual que con otro equipo programa oficial de eficiencia, se recomienda altamente que se establezcan de laboratorio clnico, los lmites de tolerancia para juzgar la adecuacin de programas informales de eficiencia por medio del intercambio de muestras su funcionamiento y calibracin clnica, que se debe utilizar durante las entre los laboratorios que ofrecen los mismos sen/icios. pruebas clnicas, tambin deben estar claramente definidos y vigilados de manera peridica. Cuando las verificaciones de capacidad o calibracin caen fuera de los limites de tolerancia definidos para cualquier equipo en ACREDITACIN DEL LABORATORIO particular, el instrumento debe quedar inmediatamente fuera de servicio para reparacin. Despus de la reparacin, el equipo debe ser calibrado antes de volverlo a utilizar. Como parte del programa del control de calidad Pruebas de laboratorios clnicos desarrollado en cada laboratorio, todo el equipamiento, revisiones, calibraLos laboratorios que realizan pruebas en especmenes humanos con fines ciones y reparacin de cada parte del equipo deben estar documentados y de diagnstico, prevencin o tratamiento de una enfermedad estn sujetos a guardados de acuerdo con la poltica del laboratorio de retencin de doculas regulaciones federales impuestas por CLIA'88. CLIA'88 establece normamentos. tivas diseadas para mejorar la calidad en los laboratorios y expande la Los termocicladores son un elemento crucial en cualquier laboratorio de supervisin federal a prcticamente cualquier laboratorio clnico en EE.UU. Es diagnstico molecular que realiza amplificacin in vitro. Cualquier cambio en importante sealar que los laboratorios que llevan a cabo investigaciones no la capacidad de los termocicladores tiene un impacto directo en la precisin y estn sujetos a la CLIA'88 a menos que el laboratorio de investigacin expida sensibilidad del mtodo que se lleva a cabo con ese aparato. Al igual que con resultados especficos a los individuos analizados, a sus familiares y a los cualquier otro instrumento, el mantenimiento, el control de calidad y el calimdicos que los tratan. Esto se aplica incluso si en el informe final hay colebrado de los termocicladores deben seguir las recomendaciones del fabritillas que establezcan que los resultados de las pruebas deben utilizarse con cante. De forma breve, y como parte de la vigilancia del funcionamiento de los fines de investigacin solamente, o que la prueba sea gratuita CLIA'88 protermocicladores, la determinacin y documentacin del tiempo de ciclado, la porciona normativas especficas que se aplican a lodas las reas del proceso verificacin del punto de error y cualquier mensaje de error deberan tambin de la prueba, adiestramiento del personal, pruebas de eficiencia, control de quedar registrados. Los tiempos de ciclado entre diferentes lotes no deberan calidad y aseguramiento de la calidad. La legislacin y sus regulaciones aso-

CAPTULO 63

ORGANIZANDO UN LABORATORIO DE DIAGNSTICO MOLECULAR

1343

ciadas establecen un sistema de registro, as como sanciones y mtodos disuasorios para asegurarse de que se mantienen las normativas establecidas por las normas federales. Las regulaciones para implementar CLIA'88 fueron desarrolladas por el departamento de salud y servicios humanos (HHS) a travs del servicio de salud pblica. Se ha asignado al CDC la tarea de clasificar la complejidad de varias pruebas para sustratos analticos y para supervisar la implementacin de normativas. Recientemente, esta responsabilidad se ha transiendo a la FDA. La FDA estaba encargada de revisar y garantizar la seguridad y eficacia de las pruebas, y la administracin de finanzas sanitarias se destinaba a recoger tasas, expedir permisos, investigar a los laboratorios e iniciar acciones punitivas cuando era necesario. Bajo CLIA'88. las pruebas se han dividido como obsoletas, de microscopia, de moderada complejidad y de alta complejidad. La clasificacin de las pruebas en pruebas de complejidad moderada y elevada se desarroll asignando una puntuacin numrica a cada prueba Una prueba se considera como de complejidad moderada cuando recibe una puntuacin de 13 o menos. Cualquier puntuacin superior se considera como altamente compleja. El sistema de puntuacin tiene en cuenta algunos de los siguientes criterios: conocimientos necesarios para llevar a cabo la prueba, adiestramiento y experiencia, disponibilidad de calibraciones, control de calidad, pruebas de eficiencia, caractersticas operativas, grado de interpretacin y JUICIO , y asi sucesivamente. Las pruebas de diagnstico molecular se consideran pruebas de alta complejidad y. como tales, los laboratorios que llevan a cabo estas pruebas deben buscar la acreditacin del HHS. El HHS ha otorgado a la College ol American Pathologisls un nivel adecuado como agencia de refuerzo con respecto a estas normas aceptando el programa de acreditacin de la sociedad como equivalente o ms estricto en reas de control y aseguramiento de calidad que las normativas descritas en CLIA'88. Otras organizaciones, que tambin han recibido un nivel similar, incluyen la comisin sobre acreditacin de laboratorios, la comisin conjunta de acreditacin de organizaciones sanitarias, la Asociacin Americana de Osteopata, la Asociacin Americana de Bancos de Sangre (AABB) y la Sociedad Americana de Inmunogentica e Histocompatibilidad. Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de diagnstico molecular buscan en general la acreditacin a travs del programa de acreditacin CAP o de alguna de las dems organizaciones como un medio para cumplir las normativas reguladoras ya descritas. El CAP introdujo en 1993 una lista de patologa molecular que ha sido puesta anualmente al da desde entonces. Adems, la lista de revisin de patologa molecular constituye un buen recurso cuando se est desarrollando un laboratorio de diagnstico molecular con respecto al desarrollo de control de calidad, programas de aseguramiento de calidad, requisitos de los especmenes, misin de informes y temas similares.

CONCLUSIN
Los mayores conocimientos y las mejoras en la tecnologa han facilitado el rpido desarrollo de nuevas pruebas moleculares que ya se han hecho habituales en la prctica mdica (p. ej.. carga viral del VIH-1. pruebas de ADN para enfermedades genticas). La secuenciacin del genoma humano, que lleg a ser una prioridad nacional con la creacin del Proyecto Genoma Humano de fundacin general, se anticipa que estar completa para el ao 2002 2003. Ms recientemente, diferentes compaas privadas (Ciencias del Genoma Humano, Millenium Pharmaceuticals, Incyte Pharmaceuticals y Celera Genomics) se han unido a los esfuerzos de secuenciar el genoma humano. Adems, la creciente disponibilidad de tecnologa fiable de alto nivel, como los secuenciadores automticos de ADN, la PCR en tiempo real y los chips de ADN (Kunan. 1999). y asi sucesivamente, debera afectar de forma drstica a las pruebas de diagnstico molecular, proporcionando una tecnologa ms slida, un menor tiempo de ciclado y una reduccin de los costes. Las ciencias clnicas y bsicas se combinan para identificar nuevos marcadores moleculares que se puedan utilizar para el diagnstico de enfermedades infecciosas, genticas y neoplasias, asi como para la ciencia forense y la tipificacin de tejidos. Analizando cambios sutiles en los genes y/o la expresin de los mismos cuando una clula se infecta por un virus o se transforma, es posible ganar una informacin importante no solamente para ayudar al diagnstico sino tambin para el pronstico o incluso vigilar la progresin de la enfermedad. Los actuales esfuerzos en la estadificacin molecular de las neoplasias tanto slidas como hematopoyticas apuntan en esta direccin. Adems, el nuevo campo de la farmacogenmica. que busca interpretar la influencia del polimorfismo gentico sobre la eficacia y/o efectos secundarios de los agentes teraputicos, tendr un tremendo impacto en la futura atencin sanitaria. El diagnstico molecular esta todava en su infancia. El crecimiento y los cambios en este campo sern una caracterstica habitual en las pruebas clnicas y en un futuro previsible.

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Pruebas forenses de identidad humana y de paternidad

Los laboratorios que llevan a cabo pruebas de identidad con ADN o estudios forenses con ADN tambin deben estar acreditados para estos fines. Un medio de obtener la acreditacin es a travs de un programa ofrecido por la Sociedad Americana de Directores de Laboratorios Forenses (ASCLD) ASCLD ofrece un programa de acreditacin de laboratorios criminales. Esta acreditacin es un programa voluntario en el que puede participar cualquier laboratorio forense que realice anlisis con ADN para demostrar que sus procedimientos, operaciones, personal, mtodos, equipo, plan de seguridad fsica y mtodos de seguridad cumplen con las normas propuestas por el grupo tcnico de trabajo sobre mtodos de anlisis de ADN (TWGDAM). El Centro Nacional de Tecnologa en Ciencia Forense (NFSTC) ofrece ayuda a los laboratorios forenses que se estn preparando para la acreditacin ASCLD/Lab .adems de proporcionar certificados a los laboratorios de ADN que cumplen con las guias de la TWGDAM. Adems, la Asociacin Americana de Bancos de Sangre ha desarrollado pautas para las pruebas de paternidad que utilizan ADN y ofrece a travs de su organizacin acreditaciones adecuadas. El programa de acreditacin en pruebas de paternidad se basa en normas para realizar las pruebas de paternidad y cuida de la acreditacin y valoracin de los laboratorios que realizan estas pruebas. Hay ms de 40 laboratorios acreditados por la AABB para pruebas de paternidad. Esta acreditacin ayuda a los laboratorios a conseguir un control de calidad.

C A P T U L O

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Oncoproteins y deteccin tumoral precoz

Matthew R. Pincus, M.D., Ph.D. Paul W. Brandt-Rauf, M.D., Ph.D., D.P.H. William Koslosky, M.D. William Appruzzse, Ph.D.

BIOLOGA CELULAR Y MITOGNESIS Marcadores tumorales ONCOPROTENAS EN LA DETECCIN TUMORAL Factores de crecimiento Receptores de factores de crecimiento Protenas G Oncoprotenas nucleares

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EVALUACIN Y CONCLUSIONES Eficacia diagnstica de las oncoprotenas del suero

1351

1345

Orgenes de los tumores malignos Tamao tumoral y niveles de oncoprotena

BIBLIOGRAFA

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Deteccin de tumores mediante la medicin de la protena p53 Anticuerpos anti-p53 circulantes en la deteccin tumoral

un proceso de p a s o s mltiples que c o m i e n z a en la m e m b r a n ac e l u l a rc o m o resultado de la activacin de un r e c e p t o r de f a c t o r de crecimiento, q u ea c t i v a entonces a otras protenas citoslicas y de m e m b r a n a y a molculas s e g u n das m e n s a j e r a s que transducen la "seal" mitognica hacia el ncleo. Vas de transduccin de seales. S eh a n podido a c l a r a ra l g u n o s Marcadores tumorales pasos en la "via de transduccin de seales" implicados en la transduccin de la seal iniciada por el f a c t o r de c r e c i m i e n t o y que va h a s t a el ncleo, p e r o El c o n t r o l del p r o c e s od e la divisin celular en las clulas eucariticas. en u c h o s otros pasos n o estn c o m p l e t a m e n t e aclarados. U n a va bien estaespecial en las f o r m a s superiores de vida, es vital para los p r o c e s o s de proli- m blecida se r e s u m e en la Figura 64-1 para la va sealizadora mitognica induferacin y diferenciacin celulares. El delicado equilibrio entre estos dos procida p o r el oncogn ras. E s t a figura m u e s t r a que c u a n d o un r e c e p t o r de faccesos est regulado por numerosas protenas que interactan en la clula t o r de c r e c i m i e n t o se activa p o r su f a c t o r de crecimiento, a c t i v a a su v e z para asegurarse de que ste se mantiene. Casi todas estas protenas, muvaras protenas intermediarias (grb-2 y SOS) que activan la i m p o r t a n t e proc h a s de las cuales son crticas en la regulacin del ciclo celular, estn codifis t a proteina c a d a sp o r oncogenes. L a sm u t a c i o n e se n los o n c o g e n e sp u e d e n resultar e n tena G (esto es, la protena ligadora de GTP) lamada ras-p21. E de 21 kDa unida a la m e m b r a n a , que c o n t i e n e1 8 9 aminocidos, se a c t i v a la produccin de protenas que, o bien se activan de f o r m ap e r m a n e n t e para c u a n d o la protena SOS la i n d u c e para ligar GTP en l u g a r de GDP. En su e s t a e s t i m u l a r el crecimiento celular y su proliferacin ( c o m o la protena p21 codido activado (unida a GTP) ras-p21 activa directamente a ras (Moodie. 1993: f i c a d a por el gen ras), o q u e d a n inactivas para inhibir la proliferacin celular Slokoe, 1994), q u e a su v e zi n d u c e nu n ac a s c a d a secuencial de proleincina( c o m o la protena p53). A m b o s sucesos dan lugar a clulas tumorales maligsas: e s t o es, M A Pc i n a s a (MEQ) y la cnasa a c t i v a d a por mitgenos ( M A P ) nas. El c o n o c i m i e n t on o slo d e la existencia de e s t o so n c o g e n e s y de las codificada p o re lg e n ERK, c o m os em u e s t r ae nl a Figura 64-1. L aM A Pc i n a oncoprotenas codificadas p o r ellos, sino tambin de los m e c a n i s m o s mediansa activa directamente los factores de transcripcin nuclear, s i e n d o ios u n od e te los c u a l e s ejercen sus efectos, ha d a d ol u g a rau n a sn u e v a s series de ans t ai m p o r t a n t e protena f o r m a un c o m p l e j o heterodimrico c o no t r o lisis a l t a m e n t e sensitivos, tanto d el o so n c o g e n e sm u t a d o sc o m od e sus pro- ellos. E factor de transcripcin nuclear, jun. que se activa d i r e c t a m e n t ep o r la cinasa, tenas m u t a n t e s codificadas. Los mtodos que utilizan la amplificacin, c o m o la reaccin en c a d e n a de polimerasa (PCR) para los o n c o g e n e s mutados, se un cinasa (jnk). El complejo los-jun. lamado tambin AP1, se une a las region e s especficas del ADN genmico, i n d u c i e n d o la transcripcin de protenas e x p o n e n en otro p u n t o de e s t e texto. En este captulo v e r e m o s cmo la detecmitognicas tales c o m o las ciclinas. De f o r m a interesante, la transcripcin d e cin de estas protenas oncognicas, u oncoprotenas. que se encuentran en e s t a s protenas se bloquea por la protena antioncogn p53 (Fig. 64-1), que a e ls u e r od el o sp a c i e n t e sc o nt u m o r e s malignos, permite diagnosticar u n o m o baxy waf. t u m o r maligno, a m e n u d o en una fase p r e c o z del desarrollo tumoral. D e b i d o su vez induce la transcripcin de protenas antimitticas tales c q u ei n d u c e n la apoptosis. a que el hallazgo de niveles elevados de cualquiera de estas oncoprotenas o f o r m a sm u t a d a s de e s t a s protenas en el suero de un ser h u m a n o indica la En la Figura 64-1 se presentan tambin otras diferentes protenas n u c l e a presencia probable de un t u m o r maligno, nos referiremos en e s t a captulo a res importantes codificadas p o r oncogenes tales c o m o myc. u n a protena d e estas protenas c o m om a r c a d o r e s tumorales. 64 kDa que se sobreexpresa en el linfoma de Burkitt. E s t e oncogn protenico no est directamente en la va ras de transduccin de seal. De f o r m a inteLa oncogenesis, el p r o c e s o por el que las clulas n o r m a l e s se convierten resante, h a y lneas celulares que. c u a n d o se transfectan bien con el oncogn en malignas, c o m p r e n d e mltiples pasos, que se p u e d e n clasificar grosso ras o con el oncogn myc. n o sufren transformacin celular, pero c u a n d o se modo c o m o iniciacin tumoral y promocin tumoral. La propia mitognesis es BIOLOGA CELULAR Y MITOGNESIS

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ONCOPROTENAS Y DETECCIN TUMORAL PRECOZ

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Figura 64-1. Esquema de algunos de los componentes conocidos de la va de transduccin de seales ras empezando (arriba, a la izquierda) cuando un faclot de crecimiento se une a su receptor celular. El resto de los acontecimientos se explican en el texto. Abreviaturas: grb-2 = protena adaptadora que une a la vez p2l y la proteina o t a c t o r de intercambio de nucletidos de guanina. SOS: protena ras-p2i. definida en el texto: PLC = fosfolipasa C; DAG = diacil glicerol: PKC = proteina cinasa C; IP3 = mositol trifosfato: rat-\ = protena codificada por el oncogn p74. que funciona c o m o cinasa que fosforila otra cinasa de p e s o molecular 43 kDa. lamada MAP-2 cinasa cinasa. MEK. o M A P K K en la ligura: MAP-2 kinasa = proteina cinasa activada por mitgenos o protena cinasa-2 asociada a los microtbulos (MAP-2K en la figura); GAP = protena activadora de GTPasa [GAP], que promueve la hidrlisis del GTP a GDP unido a p2l : myc. tos y un = oncogenes nucleares que codifican protenas nucleares; NMP = protenas de la matriz nuclear

transfectan a la vez con ambos oncogenes. experimentan transformacin celular. Estos resultados indican que ras y myp pueden ser interdependientes, y son un excelente ejemplo prototipico de la naturaleza multifsica de la oncogenesis. Una caracterstica central de los fenmenos de transduccin de seal que se resumen en la Figura 64-1 es que las cascadas de activacin estn ordenadas y se encuentran bajo un estricto control regulador. Asi. por ejemplo, mientras SOS activa a ras-p21. la protena activadora de GTPasa (GAP) induce la hidrlisis del GTP unido a ras-p21, dando lugar a su inactivacin (Fig. 64-1). El M E K activado regula a la baja a SOS, disminuyendo el intercambio GDP; GTP por ras-p21 (Holt. 1996). Si una o ms protenas de vas como la que se muestra en la Figura 64-1 mutan de manera que no se puedan regular a la baja, es posible que se produzca una seal mitognica continua que en ltima instancia de lugar a neoplasia. Cuantas ms mutaciones de este tipo se produzcan, mas probable es que la clula sufra una transformacin maligna. As, lesiones progresivas en la via mitognica pueden corresponder con las mltiples fases de la carcinogenesis. La Tabla 64-1 resume los mecanismos por los que cada tipo de elemento de transduccin de seal ha resultado inducir la transformacin celular, empezando por los factores de crecimiento, progresando a los receptores de factor de crecimiento, despus a las protenas G y a las cascadas de cinasas. y finalmente a las protenas nucleares. Estos mecanismos se explican con ms detalle en cada seccin de este capitulo destinada a estas diferentes protenas de transduccin de seal.

Bioscience (Houston. TX) y Matritech (Newton. MA) Diferentes estudios utilizan tambin la tcnica de Western Blot o de Inmunoblot. como se ha descrito en otro captulo de este libro. Numerosos estudios han documentado alteraciones en los oncogenes, oncoprotenas o expresin de factores de crecimiento en lo que se refiere tanto a cido ribonucleico mensajero (ARNm) o protenas, en tejido tumoral en com-

Tabla 64-1

M e c a n i s m o s para la induccin de la carcinogenesis por e l e m e n t o s de la va mitognica Mecanismo de accin a) Sobreproduccin desde la clula y hacia sus proximidades b) Interaccin con factores de crecimiento con receptores de elevada afinidad a) Sobreexpresin que conduce a elevadas concentraciones de dimeros b) Prdida del dominio extracelular que da lugar a una dimerizacn permanente del receptor del factor de crecimiento y a una produccin continua de seales c) Sustituciones de aminocidos en el dominio transmembranoso que dan lugar a una dimerizacin permanente a) Sobreexpresin de proteina normal b) Sustituciones de aminocidos que cambian de forma permanente su conformacin a una lorma activada c) Mutaciones que eliminan dominios reguladores de las cinasas a) Sobreexpresin de las protenas de transcripcin y replicacin b) Mutaciones de protenas antioncognicas que las mactivan c) Mutaciones que eliminan dominios requladores

Elemento de la via 1 Factores de crecimiento

2. Receptores de factores de crecimiento

ONCOPROTENAS EN LA DETECCIN TUMORAL

La deteccin de protenas muladas de Iransduccin de seal o de niveles elevados de protenas de tipo "salvaie' en el suero o en los lquidos corporales es altamente sugerente de neoplasia: por tanto, se dispone ahora de muchos anlisis para diferentes oncoprotenas en forma de kit. incluyendo determinaciones de inmunoabsorcin ligada a enzimas (ELISA) para los factores de crecimiento como el factor- transformador de crecimiento (TGF-a) y factor de crecimiento fibroblslico (FGF). las protenas EGFr y neu/HER-2. ras-p-21 del receptor de factor de crecimiento y las protenas nucleares p53. myc y NMP22 de compaas tales como Oncogene Science (Uniondale. NY). Tritn

Protenas ciloslicas protenas G y cinasas

I 4 Oncoprotenas nucleares

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR la actividad de TGF-ji es escasamente detectable, sugiriendo que el tumor era la fuente de los niveles elevados del factor de crecimiento del suero. De forma interesante, en muchos pacientes con carcinoma hepatocelular se ha observado que TGF-|i est elevado en orina (Tsai. 1997). El uso de un ELISA con un anticuerpo monoclonal dirigido contra TGF-|j. ha revelado que TGF-p\ est elevado en una gran proporcin de pacientes con un cncer de vejiga invasivo pero no en pacientes con tumores de vejiga no invasivos ni en pacientes sin cncer (Klocker, 1994). Recientemente, se ha descrito un nuevo marcador tumoral para el cncer de vejiga que parece ser ms exacto para detectar los cnceres de vejiga tanto invasivos c o m o no invasivos, y que es la protena de matriz nuclear NMP22. detectada en orina y de la que se habla ms adelante. Asi, los estudios sricos en busca de TGF-|i son muy utiles para diagnosticar y hacer seguimiento de carcinomas hepatocelulares. Son menos tiles para el diagnstico de carcinoma de vejiga aunque, para el cncer de vejiga invasivo, este factor de crecimiento tiene una elevada sensibilidad y especificidad. TGF-u ha resultado estar elevado en un gran nmero de pacientes con tumores de clulas epiteliales (Chakrabarty, 1994: Katoh, 1990), de forma predominante en m a m a (casi el 100%), pulmn, estmago, colon e higado. A diferencia de ellos, los individuos normales tienen unos niveles sricos m u y baios. En lo que se refiere al higado. TGF-u ha resultado estar elevado en el suero de pacientes con carcinoma hepatocelular. pero no en pacientes con cirrosis. Los niveles elevados se redujeron en los pacientes que se habian tratado por un carcinoma hepatocelular (Tomiya. 1996). Estudios recientes confirman que TGF-u es un predictor eficaz de la produccin de tumores malignos en una fase precoz. Por ejemplo, de 36 pacientes que tenan una historia de asbestosis y que posteriormente desarrollaron un cncer, sobre todo un adenocarcinoma o un carcinoma pulmonar de clulas escamosas, ms de un tercio resultaron ser seropositives para TGF-u. L a s muestras sanguneas de todos estos pacientes se recogieron y despus se guardaron en el momento del diagnstico de la asbestosis y antes del diagnstico de un tumor maligno. De forma significativa, todos salvo uno de estos pacientes seropositives resultaron tener niveles elevados de TGF-u en la sangre almacenada (Brandt-Rauf. 1998). TGF-u parece ser as un excelente marcador para la presencia de tumores malignos. A diferencia del caso de TGF-p. estas elevaciones no son tumor-especficas. Aun as. parece claro que TGF-u es extremadamente til como herramienta de deteccin en pacientes en los que se busca un lumor maligno.

paracin con el tejido normal (Pimentel. 1989: Brandt-Rauf. 1998). Diferentes estudios han estudiado las oncoproteinas o la expresin de factor de crecimiento en lquidos biolgicos tales como orina o derrames, y han demostrado la posibilidad de utilizar estos pptidos y protenas como marcadores para la presencia de neoplasia (Niman. 1985; Yeh. 1989). Los siguientes estudios han confirmado estos hallazgos iniciales, dando lugar al uso clnico de estos marcadores para detectar la presencia de tumores malignos. El enfoque de este captulo se centrar por tanto en la identificacin de diferentes oncoproteinas y factores de crecimiento en el suero, plasma u orina de pacientes con cncer o con riesgo de desarrollar un cncer. En la Tabla 64-2 se presenta un resumen de algunos de los muchos (ms de 50) oncogenes conocidos y sus funciones en la clula. Aquellos de la Tabla 64-2 para los que se dispone de algn mtodo comercial se marcan con un asterisco.

Factores de crecimiento
Dado que varios factores de crecimiento parecen tener una funcin en la proliferacin celular durante la tumorognesis. y dado que los factores de crecimiento son segregados de forma activa al medio extracelular. son potencialmente objetivos atractivos para su deteccin en la sangre durante el desarrollo del cncer. Hasta la fecha, son vanos los esludios que han sido capaces de demostrar diferencias en los niveles sanguneos de factores de crecimient o entre los pacientes con cncer y los pacientes control que no lo tienen. Factor transformador de crecimiento (TGF) a y 13. TGF-u es un polipptido con 50 aminocidos que se une al receptor EGF. que se dimeriza tras unirse con EGF. TFG-|i es una familia de protenas etiquetadas desde |S. hasta |i . TGF-|, es un homodimero de dos subunidades de 12 kDa unidas por puentes disulfuro. Mientras que TGF-p" ha resultado ser elaborado por muchos tipos diferentes de tumores humanos malignos, se han encontrado niveles sricos elevados de este factor de crecimiento de forma predominante en tumores hepticos y de vejiga. Curiosamente, se ha encontrado que TGF-|) inhibe la mitosis de ciertas lineas celulares especificas en cultivo, tales como las clulas epiteliales bronquiales del visn. Asi. el suero de los pacientes que tienen tumores que elaboran este factor de crecimiento se puede analizar en su busca midiendo el grado de inhibicin de crecimiento celular.
s

La actividad TGF-ji. determinada por medio de esta tcnica, ha resultado estar notablemente elevada en pacientes con carcinoma hepatocelular pero no en pacientes control de la misma edad (Shirai, 1992). En el suero de los pacientes que se han sometido a una reseccin quirrgica de estos tumores,

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ONCOPROTENAS Y DETECCIN TUMORAL PRECOZ

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Factores de crecimiento derivados de las plaquetas. El factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, una protena de un peso molecular de 28 kDa, exisle como un dmero de cadenas A y B. en forma de dmeros A-A. A-B o B-B. Cada cadena se puede glucosilar aumentando su masa molecular hasta 30 kDa. Este factor de crecimiento, que se aisl originalmente de plaquetas, se une a un receptor de factor de crecimiento transmembranoso. La cadena B se codifica por el oncogn sis. Se ha encontrado que es un potente mitgeno en lineas celulares linfoides. mieloides y de fibroblastos. Tambin se ha estudiado en la sangre de pacientes con cncer. De forma global, este factor de crecimiento ha resultado estar elevado de forma significativa en ms de un 15% de pacientes con carcinomas, sarcomas y linfomas. pero en ninguno de los individuos normales. En pacientes con cncer de mam a exisle una excelente correlacin entre la fase del tumor y el nivel srico del factor de crecimiento (Ariad. 1991). Los niveles ms elevados predijeron supervivencias ms cortas. Factor de crecimiento fibroblstico bsico. El factor bsico de crecimiento fibroblstico (bFGF) es una protena que contiene 155 aminocidos. Es un factor de crecimiento para las clulas mesenquimales, pero tambin tiene concentraciones relativamente elevadas en el sistema nervioso central (SNC). De forma notable, se ha encontrado que bFGF est presente en altas concentraciones en el suero de pacientes con tumores de clulas epiteliales. De entre estos tumores, llama la atencin el carcinoma de clulas renales. Ms de un 50% de pacientes con esta enfermedad tienen niveles sricos m u y elevados de bFGF (Fujimoto. 1991; li. 1993), bien se mida mediante ELISA o mediante mtodos potenciados de quimioluminscencia. Este factor de crecimiento est tambin elevado en el suero de ms del 50% de pacientes con tumores del SNC. en el 90% de pacientes con cnceres de pulmn (li. 1993) y en alrededor del 60% de pacientes con linfomas (Kurobe, 1993). No est elevado, sin embargo, en el suero de grandes poblaciones de individuos normales (control). Recientemente, los niveles sricos elevados de bFGF han resultado ser un buen factor pro nstico en pacientes con carcinomas de pulmn de clulas no pequeas (Brattstrom, 1998). As. TGF-u y TGF-|i. PDGF y bFGF parecen todos ellos estar elevados en el suero de un nmero significativo de pacientes con tumores de clulas epiteliales, aunque no son completamente tumor-especficos. TGF- tiene una cierta especificidad para el cncer de mama y TGF-|5 para el carcinoma hepatocelular. bFGF se eleva en diferentes tumores malignos, incluyendo tumores de clulas no epiteliales, como los tumores del SNC y los linfomas. PDGF muestra poca especificidad en cuanto al tipo del tumor, pero sus niveles elevados en el suero indican la presencia de tumor maligno. Factor de crecimiento epidrmico y factor de crecimiento hepatocitario. Se ha observado que el factor de crecimiento epidrmico est elevado en el suero de algunos pacientes con cncer de estmago (Pawlikowski. 1989) y cncer de lengua (Bhatavdekar. 1993), pero h a resultado estar normal o disminuido en otros tumores (Nedvidkova, 1992). Se han descrito niveles sricos elevados de tactor de crecimiento hepatocitano en pacientes con carcinoma hepatocelular. Sin embargo, este factor de crecimiento parece ser nico en cuanto a que se encuentran tambin niveles elevados en enfermedades hepticas no malignas (Hioki. 1993), disminuyendo su utilidad como marcador tumoral.

Los receptores transmembranosos del factor de crecimiento codificados por la familia erbB de oncogenes (por ejemplo, erbS. que codifica el receptor EGF, tambin llamado EGFr. y neuvHER-2 [erbB-2]), son objetivos particularmente atractivos para la deteccin en sangre durante el desarrollo del cncer, ya que se ha observado que. en los tumores humanos inducidos por estos receptores, el mecanismo parece ser la protelisis del dominio extracelular de unin con el receptor (Figura 64-2, tercera ilustracin). Los dominios extracelulares liberados, llamados ECD, entran entonces en la circulacin y se pueden detectar lcilmente en el suero utilizando tcnicas convencionales de inmunoanlisis (Brandt-Rauf, 1994a. 1994b. 1998) Receptor EGF (EGFr). En pacientes con asbestosis se han estudiado las elevaciones de los niveles circulantes del ECD de este receptor de factor de crecimiento (Brandt-Rauf, 1992). que se sabe predispone a tumores malignos. Se ha encontrado que en estos pacientes, aquellos con niveles sricos de ECD de 636 fmol'ml o ms altos, o bien tienen un tumor maligno asociado al asbesto (carcinoma de pulmn o mesotelioma). o bien posteriormente desarrollan un tumor de esta clase. Se ha observado que muchos individuos normales tienen unos niveles sricos de ECD mucho ms bajos. As. EGFr parece ser un excelente marcador para los tumores inducidos por el asbesto, Estos resultados tienen tambin inters porque sugieren que el electo principal del asbesto como carcingeno es producir mutaciones en el gen EGFr. Receptor neu HER-2. Debido a la asociacin firmemente documentada entre el cncer de mama y las mutaciones en el gen neu'HER-2. muchos estudios han examinado el p185 erbB-2 ECD en la sangre de pacientes con cncer, en particular cncer de mama. En estudios previos sobre la sobreexpresin inducida por el oncogn neu de la proteina pl85 (Slamon. 1989). se encontr que el nivel de expresin del oncogn neu en el tejido de biopsias de cncer de mama se correlacionaba con la extensin del tumor, siendo el mejor indicador pronstico de tasas de supervivencia, excediendo la extensin de la afectacin de ganglios linfticos como indicador pronstico. Los resultados de la cuantificacin del p185 ECD en el suero de pacientes con cncer de mama corren paralelos con los resultados genticos previos Entre un 25% y un 50% de los pacientes con un cncer de mama en estadios III o IV tienen niveles elevados de p185 ECD en su suero (entre 40 y 1 9 0 veces ms altos que en el suero de los individuos control normales (Mor, 1990: Carney, 1991: Kath, 1993). En los pacientes de los que se dispone de un material de biopsia tumoral. hay una excelente correlacin entre los niveles sricos de ECD y la expresin a nivel lisular (Breuer. 1993.1994). Exisle tambin una excelente correlacin entre los niveles sricos de ECD y la recurrencia de la enfermedad (Brandt-Rauf, 1998), Los niveles de ECD en el suero tambin han resultado ser un excelente indicador pronstico para el cncer de m a m a (Molina, 1996). Dado que los niveles sricos de p185 ECD se correlacionan con la carga y con la fase del tumor, la deteccin del cncer de mama incipiente, utilizando los niveles sricos de p185 ECD. es menos eficaz para estos pacientes. De forma global, la tasa de deleccin de los tumores mamarios en estadios I y II utilizando los niveles sricos de ECD, basados en tcnicas ELISA convencionales, oscila entre un 10% y un 15%. Sin embargo, el uso de un mtodo ELISA sensible para el p185 ECD en pacientes con cncer de m a m a dio lugar al descubrimiento de un carcinoma in situ en un 43% de los pacientes con esta enfermedad (Breuer, 1993). Este ltimo resultado indica que el uso de anlisis ms sensibles para p185 ECD identifica un aumento significativo en el nmero de pacientes con carcinoma in situ (esto es, en una fase precoz de su desarrollo). Neoplasias pulmonares, pl 85 ECD est tambin elevado en un alto porcentaje de pacientes con cncer de pulmn. Las elevaciones de los niveles sricos de EGFr para la deteccin tumoral precoz se han empleado para estudiar a pacientes con una predisposicin conocida, como los que tienen neumoconiosis, a desarrollar estos tumores. En el 70% de los pacientes con neumoconiosis, se han encontrado niveles sricos elevados de p185 ECD antes del desarrollo manifiesto del tumor maligno. En casi el 1 0 0 % de los pacientes con este factor predisponente que tienen cncer de pulmn, el p 185 ECD del suero est bastante elevado (Brandt-Rauf, 1994a). Claramente, esta proteina es un indicador muy sensible de cncer de pulmn. Por el contrario, no se han encontrado elevaciones de pl 85 ECD en el suero de muchos individuos normales.

Receptores de factores de crecimiento

En cuanto a los receptores de factores de crecimiento, existen varios mecanismos por los que puede iniciarse una mitognesis incontrolada. Estos mecanismos se resumen en la Figura 64-2. Tanto para el receptor EGF como para la proleina del receptor del factor de crecimiento pl85. codificada por el oncogn neu (HER-2), y que se asocia intensamente con el cncer de mama (Slamon. 1989), el receptor dimeriza y activa las tirosmas cinasas que estn involucradas en la fosforilacin de protenas que transducen la seal mitognica hasta el ncleo. Existen tres mecanismos patolgicos conocidos que pueden dar lugar a una dimerizacin del receptor anormalmente prolongada y que produce una seal continua mitognica. Estos mecanismos son la prdida del dominio de unin extracelular (ECD); las mutaciones en el dominio transmembranoso que promueve la dimerizacin (Brandt-Rauf, 1990) y la sobreexpresin del receptor.

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

Figura 64-2. Mecanismos de la produccin continua de seales mitogmeas por parte de los receptores de factores de crecimiento. El e s q u e m a1m u e s t r a que estos receptores tienen tres dominios: un dominio extracelular, donde se une el factor de crecimiento (ECD): un dominio transmembranoso (TMD| y un dominio intracitoplsmico (ICD). Un lactor de crecimiento. GF. se une al receptor haciendo que se dimerice. poniendo en m a r c h a una cascada de fenmenos mtracelulares que se transducen h a s t a el ncleo (N). descrito en la Figura 64-1. Hay tres formas conocidas por las que se puede producir una seal celular continua a partir del r e c e p t o r de f a c t o r de crecimiento, dando lugar a una transformacin maligna de las clulas. El e s q u e m a 2 muestra el primero de ellos: sobreexpresin del receptor que da lugar a muchos procesos de activacin y a seales continuas hacia el ncleo. El e s q u e m a 3 muestra el segundo mecanismo, donde ECD o bien est ausente o bien es eliminado por proleasas intracelulares, dando lugar a una dimerizacin espontnea. El esquema 4 muestra el tercer mecanismo, en el que una mutacin del gen del receptor del lactor de crecimiento da lugar a una sustitucin de aminocidos (X en la Figura) en el dominio transmembranoso. dando lugar a la formacin de hlices-ix que se asocian (Brandt-Rauf, 1990) y dando lugar a una dimerizacin espontnea que p u e d e lener lugar en ausencia o presencia del ligando.

Carcinomas hepatocelulares. Se ha observado previamente que el factor de crecimiento TGF-p' puede ser un buen marcador del carcinoma hepatocelular. Hay ahora fuertes indicios de que p185 ECD es tambin un marcador sensible para esta enfermedad. Se ha encontrado que el p185 ECD del suero est elevado en casi un 100% en los individuos de raza oriental que tienen factores de riesgo conocidos de desarrollar esta enfermedad (Luo, 1 9 9 3 : Yu, 1994). Sin embargo, no se han observado elevaciones en individuos normales de edad y raza similares o en aquellos con factores de riesgo de tipo

exposicin para esta enfermedad pero que no desarrollaron posteriormente cncer. erbB-2 (p185) ECD en otros tumores. Se han encontrado tambin elevaciones en los niveles sricos de erbB-2 ECD en pacientes con cnceres colorrectales. pancreticos, prostticos, hepticos y ovricos (Wu, 1993) con frecuencias de deteccin ms bajas (del 15% al 20%). En estos casos se ha encontrado una excelente correlacin entre los niveles sricos y los niveles tisulares. Hay una correlacin directa entre los niveles sricos del p185 ECD y

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ONCOPROTENAS Y DETECCIN TUMORAL PRECOZ

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el tamao del tumor para los adenomas premaligos de colon (Brandt-Rauf. 1994b). Dado que las neoplasias de colon progresan por lo general a travs de fases bien definidas desde adenoma a carcinoma, aumentando el potencial maligno de los adenomas con el tamao, los niveles sricos de erbB-2 ECD pueden ser tiles para el seguimiento de esta progresin.

Protenas G
Como ocurre con los receptores de tactor de crecimiento, las protenas sealizadoras que se producen aguas abajo de los receptores de crecimiento se hacen oncognicas sobre todo por la sobreexpresin y sustituciones de aminocidos en posiciones crticas en sus cadenas polipeptdicas. Con menos frecuencia, y para algunas protenas, como ra (Figura 64-1; Tabla 64-2), la prdida de los dominios de regulacin tambin puede conducir a la oncogenesis. Las sustituciones de aminocidos en las protenas transductoras de seal hacen que estas protenas sufran cambios de conformacin que pueden dar lugar a que queden activadas de forma permanente para estimular la divisin celular (Pincus, 1992,1999). Este mecanismo se ha documentado bien para la prolena p21 codificada por el oncogn ras. en el que las sustituciones de la mayora de los aminocidos por glicina 1 2 o glutamina 61 dan lugar a una protena oncognica. Muchas protenas p21 con tal sustitucin han sido clonadas y microinyectadas directamente en clulas normales de cultivo tales como las clulas NIH 3T3 (Barbacid. 1987). Las clulas sufren una transformacin maligna que dura hasta que se melaboliza la protena mulante aadida y se elimina de las clulas. Las tormas mulantes oncognicas del gen ras y de su protena p2i codificada se han encontrado en aproximadamente uno de cada tres tumores de clulas epiteliales humanos habituales, en ms de un 90% de los tumores pancreticos humanos y en un 75% de los cnceres de colon humanos (Almoguerra, 1988; Forester. 1987). Una de las consecuencias de las sustituciones de aminocidos en p21 y presumiblemente en otras protenas transductoras de seal es la activacin anmala de vas alternativas y no reguladas de transduccin de seal. La proteina oncognica ras-p21 (p21 * en la Figura 64-1) ha resultado unirse directamente a un, el tactor de transcripcin nuclear y su cinasa activadora. un cinasa (JNK). Este proceso de unin da lugar a la activacin directa de estas protenas nucleares inductoras de transcripcin, cortocircuitanto as los controles celulares normales. Esta derivacin o via en cortocircuito se muestra en la parte derecha de la Figura 64-1 para p21' (Adler. 1995: Amar. 1997). Adems, la protena oncognica ras-p21 activa la protena cinasa C (Pincus. 1992), como se ilustra en la Figura 64-1. Como se mencion previamente, las protenas p21 codilicadas por el oncogn ras son protenas G asociadas a las membranas de 21 kDa que se han implicado en el proceso de transduccin de seales de crecimiento desde la membrana celular a las cinasas del citoplasma. Los cambios cualitativos (por ejemplo, mutaciones puntuales) y cuantitativas (por ejemplo, sobreexpresin i en p21 han sido identificadas como contribuidoras a la carcinogenesis humana (Barbacid. 1987). Gracias a mecanismos an sin definir, las protenas p21 ganan acceso al ambiente extracelular. As, las mayores cantidades de p2l o las formas muladas de lorma puntual de p21 pueden detectarse mediante inmunoblot con anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de clulas cultivadas que se sabe sobreexpresan p21 o que expresan p21 mulante, respectivamente (Brandt-Rauf, 1991). De forma anloga, realizando inmunoblot en ratones con tumores que sobreexpresan p21 o que expresan un p21 mutante se encuentran mayores cantidades de p2i o formas muanles de p21 en su suero, respectivamente (Hamer. 1991). Estos resultados sugieren que es posible realizar la deteccin de un aumento en p2l o encontrar p21 mutante en sangre de seres humanos. Debido a su papel central en la transduccin de seales mitognicas. se podra esperar encontrar protena p2l mulada y'o sobreexpresada en una amplia variedad de tumores humanos. De hecho, se ha identificado un p2l srico elevado en el suero de hasta un 68% de los pacientes con muchos cnceres diferentes, incluyendo cnceres de mama, prstata, colon, pulmn e higado. Por otro lado, slo un pequeo porcentaje de individuos normales han resultado tener niveles sricos detectables (Weissfeld, 1994). En cnceres humanos de pncreas y colon se ha encontrado una incidencia muy alta de ocurrencia de formas oncognicas del gen K-ras. Nuevos an-

lisis basados en la PCR han detectado en oncogn ras en las heces de un alto porcentaje de pacientes con cncer de colon. Se han encontrado resultados igualmente aleccionadores utilizando el esputo de pacientes con cncer de pulmn. Se han obtenido ahora resultados paralelos utilizando ELISA para la proteina p21 utilizando el suero de pacientes con carcinomas de colon y de pulmn. Se han encontrado niveles elevados (cinco veces superiores al del control) de p21 srico en hasta un 83% de pacientes con cancer de pulmn, mientras que en los sueros de individuos normales slo se han encontrado niveles bajos (Brandt-Rauf. 1991. 1998) Adems, se han realizado estudios en los que se ha llevado a cabo una PCR para genes mutantes k-ras con cambios de bases en los codones 12 y 13. de forma simultnea en el tejido tumoral y en el suero de pacientes con diferentes fases de cncer colorrectal (De Kok. 1997). En ms de un 90% de los pacientes con genes ras mulantes especficos encontrados en tejidos tumorales, se descubri el mismo gen mulado ras en sus sueros, de forma indiferente de la fase del tumor Previamente, cuando se habl de la protena p185 codificada por el oncogn neu, se hizo notar que se haban encontrado elevaciones en los n veles sricos de esta proteina en pacientes con neumoconiosis que progresaron despus hasta desarrollar tumores malignos sintomticos. Un estudio similar en los niveles sricos de p2l se ha llevado a cabo en pacientes con neumoconiosis. Para los pacientes con esla predisposicin, en un 39% s eh a encontrado mediante inmunoblot (Western blot) que tenan niveles sricos elevados de la proteina p21. Casi todos estos pacientes desarrollaron un tumor de pulmn maligno despus de haberse observado elevaciones de la proteina p21. As, y al igual que p185 ECD, el p21 srico elevado es un marcador biolgico precoz de enfermedad maligna en pacientes con una predisposicin conocida. Los estudios precedentes estn relacionados con la deteccin de niveles sricos elevados de p2l como indicadores de tumores malignos. Como se ha observado antes, un importante mecanismo de la oncogenesis inducida por la protena ras-p2l son las sustituciones de aminocidos en su secuencia que dan lugar a su activacin permanente. La identificacin de genes ras mutantes mediante PCR y secuenciacin directa del ADN aislado del suero o plasma en tres pacientes con cncer de pncreas ya se ha descrito (Sorenson. 1994). pero, hasta hace poco, no se habia comunicado la deteccin directa de protenas p2l mutantes en sangre humana (De Kok. 1997). Actualmente, sin embargo, las sustituciones oncognicas de aminocidos en la protena p21 se pueden identificar mediante el uso de anticuerpos monoclonales que reconocen sustituciones oncognicas especificas. Se ha encontrado p21 mutado en el suero de pacientes con una historia conocida de exposicin a cloruro de vinilo. un carcingeno. Este produelo qumico ha resultado predisponer a las personas a desarrollar angiosarcomas. Los estudios tisulares de estos angiosarcomas revelan que en las clulas tumorales un gen ras mutante coditica cido asprtico en lugar de la glicina que est normalmente en la posicin 1 3 en la cadena polipeplidica. Un anticuerpo monoclonal que reconoce la forma Aspl3 de la proteina p21 ha podido desarrollarse (Oncogene Science). Esta protena p2l mutante h a sido identificada en el suero del 80% de pacientes con angiosarcomas hepticos inducidos por cloruro de polivinilo. pero no en individuos normales (DeVivo, 1994). Es ms. existe una correlacin directa entre el grado de exposicin de los pacientes al cloruro de vmilo y la probabilidad de descubrir en su suero la forma oncognica de la protena. Se han obtenido otros anticuerpos monoclonales anti-p21 mutantes altamente especficos que reconocen sustituciones especlicas de aminocidos en las posiciones 12. 13, 59 y 61. El uso de estos anticuerpos en el suero de pacientes con factores de riesgo conocidos de desarrollar cncer parece ser muy prometedor para la deteccin precoz de los tumores.

Oncoprotenas nucleares
Como ya se ha mencionado, dos importantes protenas nucleares que parecen tener funciones crticas en la regulacin del crecimiento celular y la divisin celular son la proteina p53 que suprime el gen tumoral y la proteina p62'64 codificada por el oncogn c-m/epara la que se han desarrollado anlisis en suero. Adems, las protenas de matriz o esqueleto nuclear son los objetivos de las cinasas transductoras de seal tales como la cinasa MAP, segn se indica en la Figura 64-1.

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SECCIN V I I

PATOLOGIA MOLECULAR

Proteina p53. Se sabe que esta proteina funciona como un homotetrmero y, de esta forma, se une a secuencias especificas del ADN. El efecto es reprimir el proceso de la mitosis. As. p53 es una protena antoncogn. Se pueden producir mutaciones en p53 que lo nactiven. Esta inactivacin puede por s misma ser oncognica debido a que se elimina el control vital que esta protena ejerce sobre la mitognesis. Entre las mutaciones inactivantes estn las deleciones de todo el gen, como se ha encontrado en un nmero de cnceres de colon. Las mutaciones del gen p53 pueden producir sustituciones de aminocidos en la protena que, como en la protena p21, dan lugar a cambios de conformacin en la protena que resultan en su incapacidad para llevar a cabo su funcin antioncognica en la clula (BrandtRauf, 1996). Se han identificado muchas diferentes mutaciones puntuales en p53 en tumores humanos (Soussi, 1994). El efecto de estas mutaciones es la prdida de la funcin inhibitoria del crecimiento normal de p53 y. al mismo tiempo, algunas de estas mutaciones dan lugar a protenas p53 con unas vidas medias considerablemente aumentadas, de manera que las protenas muladas se acumulan en las clulas transformadas (Soussi, 1994). La oncoprotena c-myc se activa para dar lugar a la transformacin celular mediante sobreexpresin, de manera que, adems, se acumula en las clulas transformadas (Field. 1990). As, tanto para p53 como para myc p62<64. se pueden detectar aumentos en los niveles de estas protenas en clulas transformadas y en tumores humanos (Soussi. 1994: Field, 1990). Esta sobreexpresin da lugar aparentemente a una salida de las protenas hacia el ambiente extracelular. Estas protenas pueden por tanto no solamente detectarse en el suero y otros lquidos corporales, sino que estas protenas normalmente secuestradas se reconocen como extraas, de manera que algunos pacientes con cncer desarrollan anticuerpos frente a myc p53 o p62<64. Por tanto, las concentraciones elevadas de p53 o p62/64 o de anticuerpos frente a estas protenas en sangre perifrica son excelentes marcadores para el estudio de la carcinognesis humana.

Anticuerpos circulantes anti-p53 en la deteccin tumoral

Se han descrito anticuerpos sricos frente a p53 como un hecho frecuente en pacientes con varios tipos de cncer. La produccin de anticuerpos frente a p53 y otras oncoprotenas se ha atribuido a su acumulacin en clulas necrticas y a su consiguiente liberacin hacia la circulacin, donde se reconocen como sustancias extraas. Para p53. hay todava otra causa para el desarrollo de anticuerpos frente a p53 oncognico. Al igual que ras-p21 oncognico. las protenas p53 mutantes que contienen sustituciones de un nico aminocido en posiciones crticas de la cadena polipeptdica pueden volverlas oncognicas. Estas sustituciones de aminocidos inducen cambios importantes en la conformacin de la protena p53 (Adler. 1998; Brandt-Rauf, 1996). Entre estos cambios figura la exposicin de determinantes antignicos especficos que normalmente no quedan expuestos. Si la proteina difunde hacia la circulacin, es frecuente que se desarrollen anticuerpos contra estos determinantes. En diferentes estudios importantes (incluyendo un gran estudio de 1.392 pacientes con cncer), se encontraron elevaciones en los niveles sricos de anticuerpos anti-p53 en pacientes con cncer de ovario y de colon (15%); cncer de pulmn, incluyendo tumores de clulas pequeas (hasta un 25%), y cncer de mama, incluyendo carcinomas intraductales (hasta un 15%). Los individuos normales no tenan niveles sricos elevados de estos anticuerpos (Angelopolou, 1994). En un nmero significativo de pacientes en los que se ha seguido la presencia de anticuerpos anti-p53 en su suero, la aparicin de estos anticuerpos ha resultado preceder al desarrollo de tumores malignos. Se encontraron tambin anticuerpos anti-p53 en ms de un 20% de pacientes con cncer de vejiga (la mayora en lases ms avanzadas), en una alta proporcin de pacientes con carcinomas de pncreas y hepatocelulares, y en linfomas infantiles. Los estudios de seguimiento continuado de anticuerpos anti-p53 en pacientes con diferentes cnceres revelan que hasta la mitad de los pacientes c o n carcinoma hepatocelular. independientemente de su tamao, tienen niveles sricos notablemente elevados de ant-p53 (Ryder. 1996). Estos niveles elevados se correlacionan con la elevacin conocida de p53 en el suero de pacientes con esta clase de cncer, segn se coment antes. Es ms. los anticuerpos anti-p53 se han encontrado en el suero de pacientes con lesiones orales, y muchos de estos pacientes resultaron tener lesiones premalgnas (Kaur, 1997), indicando que los anticuerpos anti-p53 son marcadores para la deteccin precoz del cncer oral. Se ha encontrado tambin anti-p53 elevado en ms de un 50% de los pacientes con carcinoma de clulas escamosas del esfago (Shimada. 1998). En un reciente estudio prospectivo muy extenso de pacientes con cncer de pulmn, se encontraron niveles sricos de anti-p53 en el 100% de los pacientes con carcinomas de clulas grandes, en un 28% de los adenocarcinomas, en un 55% de carcinomas de clulas escamosas y en un 71% de carcinomas de clulas pequeas (Segawa. 1998). Estos resultados demuestran que los niveles sricos elevados de anti-p53 tienen especificidad para tipo tumoral para el carcinoma del pulmn, mostrando tasas elevadas de positividad para los carcinomas pulmonares de clulas grandes y de clulas pequeas. Protenas codificadas por el oncogn myc en deteccin de tumores. El gen myc codifica una protena con una masa molecular de 6 4 kDa cuya funcin es en gran medida desconocida. Existe una fuerte evidencia con respecto a que es un factor de transcripcin que. cuando se activa, desreprime la expresin de otros genes que codifican protenas que participan en la replicacin. Este oncogn est sobreexpresado en un nmero de tumores, incluyendo el linfoma de Burkitt, donde el gen myc del cromosoma 8 se trastoca a una larga regin terminal parecida a la de las repeticiones en una regin codificadora de nmunoglobulinas del cromosoma 14. Las regiones con repeticiones terminales largas permiten la expresin constitutiva de genes que son adyacentes a las mismas. Las protenas en relacin con c-myc y los anticuerpos trente a la protena c-myc han sido identificadas, al igual que p53 y sus correspondientes anticuerpos, en el suero de pacientes con cncer. La deteccin de esta protena de 62.64 kDa est dificultada por su corta vida media en el suero. Sin embargo, es posible detectar una protena especfica p40 relacionada con c-myc en el suero de estos pacientes, utilizando inmunoblot. Las frecuencias ms altas

Deteccin de tumores malignos mediante anlisis de la protena p53

Carcinoma hepatocelular. Se han encontrado niveles aumentados de p53 mutante mediante ELISA (ms de 0,3 ng/ml, en lmite superior en 100 individuos normales) en los sueros de un 20% de pacientes con carcinoma hepatocelular y en el 30% de pacientes con cirrosis, un grupo que se sabe tiene un mayor riesgo de desarrollar carcinoma hepatocelular (Virji. 1992). Dado que los pacientes con cirrosis tienen niveles elevados de p53 en su suero y un factor de riesgo conocido para desarrollar carcinoma hepatocelular, los niveles elevados de p53 pueden ser un indicador precoz de tumorognesis. Cncer de mama y pulmn. Se han realizado pocos estudios de p53 como marcador tumoral en el suero de pacientes con cncer de mama y de pulmn. Se han comunicado niveles sricos elevados de p53 mutante. determinados mediante ELISA en el 8% de pacientes con cncer de mama, disminuyendo los niveles con la reseccin quirrgica de los tumores (Rosanelli. 1993), indicando que los tumores eran la fuente del p53 elevado. No se han observado elevaciones de protena p53 en el suero de un individuo normal. Para el cncer de pulmn, se han observado elevaciones sricas de los niveles de p53 mutante, determinados mediante ELISA y mediante inmunoblot en hasta un 34% de pacientes con cncer de pulmn, pero no en individuos normales (Fontanini, 1994). En estos pacientes, la tincin inmunohistoqumica de biopsias tisulares obtenidas posteriormente mostraron niveles elevados de p53, correlacionndose con los hallazgos sricos. Cncer de colon. Un mecanismo que se cree es importante en el desarrollo de los carcinomas de colon es la delecin del gen p53 normal o las mutaciones de este gen que dan lugar a una protena antioncognica no funcionante. Se han encontrado elevaciones en los niveles sricos de p53. determinados mediante ELISA, en aproximadamente uno de cada cinco pacientes con carcinoma de colon y en aproximadamente uno de cada diez pacientes con adenomas de colon. Los individuos normales fueron negativos para la protena srica p53. Estos resultados tienen una sensibilidad relativamente baja de este marcador para el cncer de colon, posiblemente debido a que la deleccin del gen p53 se produce en un elevado porcentaje de los tumores estudiados.

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ONCOPROTENAS Y DETECCIN TUMORAL PRECOZ

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de encontrar proteina mycen el suero humano estn en el cncer de colon y de m a m a (aproximadamente el 20%). El tratamiento de estas dos clases de cncer da lugar a una notable disminucin en los niveles sricos de esta protena. Las recurrencias originan niveles elevados: por tanto, la protena c-myc es til para el seguimiento del curso de los tumores malignos. No se ha detectado en el suero de individuos normales Anticuerpos sricos antiproteina c-myc en la deteccin de tumores. Se han encontrado niveles sricos elevados de anticuerpos anti-c-myc en el suero de pacientes con cncer de colon y de recto (55% al 65%) y en el suero de pacientes tanto con leucemias mieloides como con linfoma de Burkitt. Se han descrito incidencias ms bajas de anticuerpos elevados en pacientes con cncer de mama (aproximadamente un 10%) y cncer de ovario (10%). No se han encontrado anticuerpos anti-c-myc en el suero de individuos normales. Deteccin del cncer de vejiga mediante las protenas de matriz nuclear. Como se puede ver en la Figura 64-1, uno de los objetivos de las protenas codificadas por oncogenes son las protenas de la matriz nuclear (NMP). conocidas tambin como protenas del esqueleto nuclear y protenas del aparato mittico nuclear. Estas protenas de 236 kDa son vitales para la correcta formacin del huso mittico. Contienen una cabeza globular y una cola separada por un dominio central en forma de bastn de hlice-r/. consistente en repeticiones de secuencias de siete elementos. Estas protenas varan segn el tipo celular, la fase de diferenciacin y el ciclo de la clula. De forma crucial, se ha identificado un nmero de NMP asociadas a tumores, especficas cada una de ellas para uno de cinco tipos tumorales (vejiga, prstata, mama, colon y hueso). El mejor estudiado es uno que est luertemente asociado con el carcinoma de clulas transicionales de la vejiga (TCC). NMP22. que funciona como una protena del aparato mittico nuclear, y que participa en la separacin de los cromosomas durante la mitosis (Hughes. 1999). La cantidad de esta protena en las clulas epiteliales transicionales malignas es entre 10 y 20 veces superior a la de las clulas normales. Se han desarrollado anticuerpos especficos para esta NMP. que se utilizan ahora en un ELISA comercial en la orina (Matritech. Newton. MA). La base del anlisis es que. dado que las clulas uroteliales malignas se desprenden hacia la orina, y que este NMT es especfico de las clulas cancerosas de vejiga, la elevacin de esta protena en orina puede detectarse en pacientes con cncer de vejiga. Mltiples estudios de pacientes que tienen cncer de vejiga en diferentes estadios revelan que la sensibilidad es prxima a un 90% en el cncer maligno e invasivo y un 75% en el carcinoma in situ. Este ltimo resultado es m u y alentador, dado que esta lase es la fase ms precoz detectable. Para los carcinomas no invasivos papilares y malignos, la sensibilidad es del 62%. La especificidad global para este marcador es superior a un 90%. La comparacin de la sensibilidad del NMP22 ELISA con la citologa muestra que los dos mtodos tienen una sensibilidad de un 83% para el carcinoma invasivo, pero para el grado I TCC. NMP22 tiene una sensibilidad del 61%. mientras que para la citologa aislada es de un 17% (Landman, 1998). Para los cnceres de grado II y III. el NMP22 ELISA es ms sensible, con un 78% y un 93%, en comparacin con la sensibilidad de las citologas de un 50% y 87%, respectivamente (Landman. 1998). Estos resultados sugieren que el NMP22 ELISA puede ser altamente eficaz como una herramienta de deteccin no invasiva para TCC. En la actualidad, este mtodo ha sido aprobado por la FDA como prueba de seguimiento para TCC en pacientes que han sido tratados para esta enfermedad. Se han llevado a cabo estudios clnicos en los que se realiz un NMP22 ELISA en la orina de pacientes que han sido tratados para TCC. entre 20 y 60 das despus del tratamiento, y que fueron despus sometidos a una cistoscopia entre dos y seis meses despus del tratamiento. Utilizando un punto de corte de 1 0 U/ml, un 86% de los pacientes con valores de NMP22 negativos (menos de 10 U/ml) resultaron tener cistoscopias negativas, y un 71% de los pacientes con valores superiores a 10 U'ml resultaron tener hallazgos positivos en la cistoscopia. A la vista del parecido de estas cifras con las obtenidas utilizando la citologa para detectar nueva aparicin de TCC. parece razonable concluir que el NMP22 ELISA podra constituir una prueba de deteccin eficaz para el TCC. Hace poco, de hecho, la prueba ha sido aprobada por la FDA para su uso como herramienta de deteccin. El uso de esta metodologa puede obviar la necesidad de llevar a cabo cistoscopias en muchos pacientes que estn seguidos por recidivas tumorales (Miyanaga. 1997).

EVALUACIN Y CONCLUSIONES
Existen unas vas bien delinidas para la transduccin de seales mitognicas entre la membrana y el ncleo de las clulas. Estas vias constan sobre todo de proteinas. cuyas mutaciones o sobreexpresiones pueden dar lugar a unas seales mitognicas no controladas y a cncer.

Eficacia diagnstica de las oncoprotenas del suero

Los resultados de los anlisis para las diferentes oncoprotenas que se co mentaron antes en suero y en orina (NMP-22) se resumen en la Figura 64-3 en lo que se refiere a algunos de los tumores ms (recuentes de clulas epi teliales. Tambin se muestran, junto con el carcinoma hepatocelular. los resultados correspondientes a los angiosarcomas hepticos. Los resultados de las determinaciones de las concentraciones de oncoprotenas en los lquidos corporales para grupos control de la misma edad y sexo se muestran c o m o las reas blancas en los grficos de barras de esta figura. De la Figura 64-3 parece claro que. de las protenas estudiadas hasta ahora, se producen altas tasas de positividad en ciertos cnceres, mientras que los grupos control muestran unas tasas de positividad m u y bajas. De forma interesante, y dado que las oncoprotenas estudiadas provienen de vias de transduccin de seal que participan en muchos tipos celulares diferentes, parece haber una cierta especificidad de oncoprotenas peculiares para ciertos tipos de cncer. Por ejemplo, el factor de crecimiento TGF-a est elevado en un gran nmero de tumores de mama: FGF est elevado en una alta proporcin de cnceres de pulmn: la protena p185 ECD (neu) est elevada en el suero de muchos pacientes con carcinomas hepatocelulares y cnceres de pulmn y en las fases ms avanzadas del cncer de mama; la protena C21 se eleva en carcinomas hepatocelulares, angiosarcomas hepticos y tumores pulmonares; c53 est elevada en los cnceres de pulmn, y el anticuerpo anti-myc est elevado en los cnceres de colon. Para estas protenas la sensibilidad en cuanto a deteccin de enfermedad es elevada y excede la de cualquiera de los antigenos oncofetales. Asimismo, la frecuencia con la que se producen estos factores de crecimiento u oncoprotenas es muy baja en el suero de los individuos que no tienen cncer en cada uno de los estudios llevados a cabo hasta la fecha en varios miles de pacientes. Por tanto, la especificidad al utilizar factores de crecimiento y oncoprotenas como marcadores tumorales es tambin relativamente elevada. Esta conclusin no implica que la ausencia de una determinada oncoprotena en el suero de un paciente implique la ausencia de un tumor maligno. Debido a la naturaleza en casos mltiples de la carcinogenesis, puede haber muchas oncoprotenas potencialmente anmalas. Cualquier otro grupo de oirs oncoprotenas puede tambin estar presente en el suero del paciente. De hecho, la Figura 64-3 indica tambin que la Irecuencia de deteccin de ciertas oncoprotenas en el suero de pacientes que tienen un tipo determinado de tumor puede ser relativamente baja. Por ejemplo, como se ve en la Figura 64-3A se ha encontrado c-myc elevado en el suero de aproximadamente un 8% de pacientes con cncer de mama: se ha encontrado la protena p185 ECD (neu) en hasta un 25% de pacientes con cncer de mama. Las bajas tasas de deteccin de estas oncoprotenas en estos tipos tumorales son el resultado del gran nmero de posibles pasos en la va donde se producen proteinas aberrantes o factores de crecimiento. As. los tumores que se producen en un tejido determinado pueden tener una multiplicidad de causas diferentes, dando lugar a la produccin de diferentes proteinas aberrantes en la cadena. Por tanto, el siguiente paso al utilizar estos marcadores oncoprotenicos en el diagnstico precoz del cncer es buscar mltiples marcadores en el suero de un paciente determinado. El descubrimiento de por lo menos un componente aberrante de la via de transduccin de seales se considera mucho ms probable.

Orgenes de los tumores malignos

La Figura 64-3 indica que el descubrimiento de un nivel elevado de una oncoprotena en el suero de un paciente no proporciona por lo general una informacin concluyeme con respecto al origen del tumor maligno. Por ejemplo, aunque se ha encontrado ras-p21 elevado, y con cierta especificidad, en angiosarcomas hepticos, de colon y de pulmn: y neuHER-2 (c-ert>2) p185

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SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

Figura 64-3. Grfico de barras con el resumen de resultados de los anlisis del suero para diferentes componentes de oncoprotenas de las vas mitogenicas de sealizacin para seis tipos tumorales: pulmn, mama, colon, vejiga e hgado: carcinoma hepatocelular y angiosarcoma hepatocelular. Para cada tipo de tumor, s e muestra la incidencia de deteccin en las ordenadas y en forma de porcentaje, y la oncoprotena se lista en la abscisa. En el tope de cada grfico de barras se muestra la frecuencia de elevacin de la oncoprotena en los grupos control c o m o un rea blanca dentro del grlico de barras. Para la mayora de los grficos de barras, esta frecuencia es cero, de manera que no aparece zona blanca. (TGF-ot. TGF-|i, FGF, PDGF y EGF = factor transformador de crecimiento u. factor transformador de crecimiento |3. (actor de crecimiento fibroblstico. factor de crecimiento derivado de las plaquetas y lactor de crecimiento epidrmico, respectivamente: erbB = receptor del f a c t o r de crecimiento epidrmico [EGF]; neu = proleina p185 que es parecida a la protena erbfl y que tambin se llama erbB-2 y HER-2; ras = proteina p21; NMP22 = protena de matriz nuclear que se eleva en el suero en los carcinomas de clulas transicionales del tracto urotelial; p53 = protena anli-oncogn: anti-p53 = anticuerpo anti-p53; myc = oncogn nuclear que codifica la proteina myc. y anti-myc = anticuerpo frente a la protena myc.)

ECD elevado en cnceres de colon, pulmn y mama, la elevacin de una de estas oncoprotenas en el suero de un paciente no permite identificar con exactitud el tejido de origen del tumor maligno. Dado que la va de transduccin de seales en la mayora de las clulas es muy parecida a la de otras, una elevacin en cualquier oncoprotena puede significar que exisle un tumor maligno en uno de muchos lipos celulares diferentes. Adems, quedan an por realizar muchos estudios de las correlaciones que hay entre la presencia de tumores y los niveles sricos de oncoprotenas. Por ejemplo, no hay datos publicados acerca de la produccin de formas detectables de protena mutante p2l en el suero de pacientes con carcinoma pancretico con grupos control formados por individuos de edad y sexo similares y con grupos que contengan pacientes con pancreatitis pero sin tumo-

res. Este es un estudio necesario, dado que un 90% de los cnceres de pncreas expresan ras-p21 oncognico (Almoguerra. 1988). Una forma de utilizar las oncoprotenas del suero para detectar tumores especilicos en una fase precoz de la progresin del tumor es en poblaciones que se sabe estn en riesgo de desarrollar cnceres especilicos debido a una historia de exposicin a carcingenos o mulgenos. como se produce en la exposicin ocupacional o por procesos mdicos preexistentes, observado en la exposicin al cloruro de vinilo que se asocia con el angiosarcoma heptico y en las neumoconiosis que se asocian con cncer de pulmn. Ambos procesos se asocian con niveles sricos elevados de protena rasp21: la ltima condicin se asocia tambin con niveles sricos elevados de neup185.

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ONCOPROTENAS Y DETECCIN TUMORAL PRECOZ

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Smith S, Hemminki K, el al: Serum oncoproteins and growth lac h a y indicadores de que pequeas lesiones pueden dar lugar a niveles signitors in asbestosis and silicosis patients. Int J Cancer 1992; 50:881. Brandt-Rauf PW. Pincus MR, Carney WP: The c-erbB-2 protein in oncogenesis: ficativos de ciertas oncoproteinas. Primero, en un nmero significativo de paMolecular structure to molecular epidemiology Crit Rev Oncog 1994b: 5:313. cientes con factores de nesgo conocidos para el cncer, las oncoprotenas Brandt-Raul PW, Luo JC, Carney WP, et al: The detection of increaseo amounts of s e descubrieron en su suero antes del desarrollo de un cncer detectable. the extracellular domain of Ihe c erbB 2 oncoprotein in serum during pulmonary Asi. en pacientes con asbestosis. el ECD d e la protena p185 erbB s e elev carcinogenesis in humans. Int J Cancer 1994a; 56:383 antes del diagnstico de los tumores pulmonares. La sobreexpresin del ECD Brandt-Raul PW. Chen JM. 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Bigmi D. et al: Levels of p53 anhgen m serum of non-small lung a niveles elevados de p185 ECD o ras-p21 en el suero de estos pacientes. cancer patients correlate with positive p53 immunohistochemistry on tumor sec lions, tumor necrosis and nodal involvement. Int J Oncol 1994; 5:553. T a n t o para la proteina ras-p21 c o m o para erb8-2-p185 ECD, existe una exceForester K. Almoguerra C. Han K, et al: Detection of high incidence of K-ras oncolente correlacin entre los niveles sricos de estos marcadores y el estado clgenes durmg human colon tumorigenesis. Nature 1987: 327:298. n i c o pre y poslratamiento del paciente. Aun asi. quedan p o r realizar estudios Fujimoto K. Ichimori Y. Kakizoe T, et al: Increased serum levels of basic fibroblast de correlacin entre el tamao del t u m o r y los niveles sricos de oncoprotegrowth factor in patients with renal cell carcinoma. Biocnem Biophys Res Commun 1991; 180:386. nas. 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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR
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Tcnicas moleculares en el diagnstico de neoplasias hematopoyiicas

David S. Viswanatha, M.D. Richard S. Larson, M.D., Ph.D.
PERSPECTIVA HISTRICA TCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNSTICO DE LEUCEMIA Leucemia mieloide crnica Leucemia linfoblslica aguda Leucemia mieloide aguda TCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNSTICO DE LINFOMAS Bases para el anlisis molecular gentico en los trastornos linfoides Anlisis de la reorganizacin gentica de los receptores antignicos para la determinacin de la clonalidad Significado y deteccin molecular de traslocaciones comunes cromosmicas asociadas al linfoma 1355 USO DE MARCADORES MOLECULARES PARA EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD RESIDUAL NUEVAS TECNOLOGAS EN EL DIAGNSTICO Y CONTROL DE LOS TUMORES MALIGNOS HEMATOLINFOIDES BIBLIOGRAFA

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PERSPECTIVA HISTRICA
Las tcnicas utilizadas en el diagnstico de neoplasias hematolinfoides comprenden la valoracin morfolgica, tinciones citoquimicas. anlisis de citometria de flujo y anlisis cariotipico. Aunque no todas estas tcnicas son necesarias en cada uno de los casos, el uso adecuado de estas tecnologas ha dado lugar a una mejora en la precisin diagnstica. An asi. recientemente se han desarrollado tcnicas moleculares ms sensibles que pueden detectar alteraciones genticas en las clulas leucmicas y del linfoma, proporcionando una especificidad y sensibilidad an mayores en el diagnstico. Estas tcnicas en continua mejora han hecho que se comprenda la amplia heterogeneidad clnica y biolgica de las neoplasias hematopoyticas tales como leucemias y linlomas. Adems, una gran seleccin de agentes quimioteraputicos. as como el trasplante de mdula sea, estn ahora disponibles para el tratamiento de las leucemias y los Imfomas A la vista de una mayor comprensin de la diversidad clnica y biolgica de estas neoplasias junto con mayores opciones teraputicas, la seleccin de la terapia ptima y el momento de administrarla pueden ser complicados. Sin embargo, estudios recientes que utilizan estas nuevas tecnologas moleculares han empezado a solucionar este dilema. El anlisis de los tumores hematopoyticos en busca de la presencia de traslocaciones de los cromosomas se ha limitado siempre a tcnicas menos sensibles y que consumen ms tiempo, como las tcnicas citogenticas y de Southern Blot. Los anlisis basados en la reaccin en cadena de polimerasa (PCR) del cido desoxiribonucleico (ADN) se desarrollaron originalmente como una alternativa, y han aumentado de forma drstica la sensibilidad de deteccin proporcionando una amplificacin exponencial de fragmentos de ADN. Estas tcnicas ADN-PCR se han adaptado a los tejidos tanto frescos

como fijados con parafina. De esta forma, se pueden detectar inmunoglobulinas y redisposiciones de genes de los receptores de clulas T y algunas traslocaciones cromosmicas en las clulas de linfoma. Sin embargo, la mayora de las traslocaciones cromosmicas de las clulas leucmicas no se pudieron delectar inicialmente utilizando esta tcnica debido a las grandes distancias genmicas a lo largo de las cuales se producen los puntos de rotura de los cromosomas. La llegada de la reaccin de la transcnptasa inversa de polimerasa en cadena (RT-PCR) ha permitido la deteccin de fragmentos de cido ribonucleico (ARN). Asi. los productos de fusin del ARNm transcribidos desde las traslocaciones cromosmicas pueden ahora detectarse en tejidos no fijados. Actualmente la RT-PCR se usa de forma sistemtica para detectar un gran nmero de traslocaciones en la leucemia linfoblslica y mieloblstica aguda. Las tcnicas moleculares tienen una importante funcin en la valoracin diagnstica de los pacientes con neoplasias hematopoyticas. Estas tecnologas comprenden el anlisis medanle Southern Blot y mtodos basados en PCR para detectar traslocaciones cromosmicas especficas. Estas tcnicas proporcionan una mayor sensibilidad diagnstica y tienen unas implicaciones pronosticas y teraputicas esenciales. Este capitulo trata las tcnicas moleculares diagnsticas que tienen utilidad clnica en el diagnstico de Imloma y leucemia. Un punto importante que no se puede enfatizar en exceso en la interpretacin de los estudios moleculares es que el anlisis de las pruebas moleculares, en un grado muy elevado, es un arte de morfologa. La interpretacin exacta y completa de los resultados moleculares se hace mejor en el contexto de los hallazgos histolgicos (esto es. cuanto ms se sabe acerca de la morfologa de las clulas, el contexto clnico y otros estudios complementarios, menos probable es que se cometa un error).

1356

SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

TCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNSTICO DE LEUCEMIA

Las leucemias agudas y crnicas representan expansiones clnales de precursores de clulas neoplsicas. Las leucemias agudas se dividen en dos grupos principales de acuerdo con una limitada diferenciacin linfocitaria o mieloide de las clulas precursoras: leucemia aguda linfoblstica (LAL) y leucemia aguda mieloblstica (LAM). Tambin existen la leucemia linfoctica crnica (LLC) y la leucemia mieloide crnica (LMC). Dado que las caractersticas biolgicas, diagnsticas y clnicas de la LLC se superponen con los linfomas Imfocilicos de clulas pequeas, la utilidad de las tcnicas de diagnstico molecular en casos de LLC se tratan en la seccin de linfomas. La presencia de traslocaciones cromosmicas especificas y no aleatorias en la leucemia aguda y crnica es importante para el diagnstico y el pronstico (Rubnitz. 1999: Melnick. 1999: Morgan. 1998: Larson. 1996). Las tcnicas de diagnstico molecular se usan sobre lodo para detectar estas traslocaciones en muestras diagnsticas y para la deteccin de enfermedad residual mnima (Tablas 65-1 y 65-2). A diferencia de muchas de las traslocaciones cromosmicas de los linfomas. las regiones de rotura entre dos genes que se transponen son grandes. Esta diferencia impide el uso de tcnicas de PCR basadas en el ADN para la deteccin de estas traslocaciones en la mayora de los casos de leucemia. Una excepcin notable a esta regla son las tcnicas de ADN-PCR de larga distancia que ya se han descrito, pero que todava no se usan de forma sistemtica en los laboratorios diagnsticos. Aun asi, en la mayora de los casos de leucemia con traslocaciones cromosmicas, se lorma un ARNm de transcripcin quimrico que se puede detectar mediante RT-PCR. Como el ARN no es por lo general estable en tejidos lijados con paralina, la RT-PCR se lleva a cabo en tejido fresco y no fijado.

das mediante Southern Blot. son comparables con los casos que tienen unos cromosomas Ph muy claros en el cariolipo. Utilizando tanto tcnicas moleculares como cilogenticas. se puede poner de manifiesto Ph en un 99% de los casos. El 1% restante ha sido llamado LMC Ph (-) o alpica por algunos autores. Sin embargo, es probable que represente otro tipo de trastorno mieloproliferativo crnico, de manera que no es sorprendente que tengan un comportamiento ms agresivo que LMC. RT-PCR detecta productos de diferente longitud que responden a protenas quimricas BCR-ABL de 190 kDa. 210 kDa y 230 kDa (Figura 65-1/4) (Kurzrock, 1978: Wada. 1995: Guo. 1991) Gorska-Flipot, 1990). Los puntos de rotura detectados medante RT-PCR pueden ser tiles para distinguir LAL. LMC. LAM y la leucemia neutroflica crnica (vase ms adelante en Leucemia linfoblstica aguda y Leucemia mieloide crnica). En la gran mayora de LMC de adultos y prcticamente todos los casos de los nios, est presente un producto de fusin p210 (Figura 65-1A 6). Los casos de LAL Ph (+) se asocian con la protena p190. aunque se han descrito casos raros de LMC y LAM con la protena de fusin ms pequea. En casos de leucemia neutrfila crnica est presente una gran protena de fusin p230. La p230 se ha comunicado tambin en casos de LMC, pero la revisin retrospectiva de estos casos sugiere que pueden en realidad ser CNL. Hay tambin dos tipos de transcripcin p210. b2a2 y b3a2 (Shtalid. 1988: Kurzrock. 1990). Aunque las diferencias definitivas pronosticas entre estos grupos son controvertidas, los pacientes con transcripcin b3a2 son ms propensos a tener recuentos plaquetanos elevados. Adems, la frecuencia relativa de b2a2 y b3a2 es diferente en la LMC de la niez y de la vida adulta, teniendo b3a2 dos tercios de los adultos y teniendo transcripciones de b2a2 una abrumadora mayora de nios con LMC.

Deteccin de la progresin de la enfermedad en la LMC

La progresin de la LMC a la fase acelerada o blstica (esto es. lase terminal) se asocia con la adquisicin de anomalas adicionales genticas y cromosmicas (Mitelman, 1993: Morris. 1990: Serra. 1993). La inestabilidad cromosmica del clon maligno es una caracterstica fundamental de la progresin de la enfermedad en la LMC. El t(9:22) sigue siendo la nica anomala de los cromosomas durante la fase crnica, y su expresin contina durante la crisis blstica. Sin embargo, del 70% al 80% de los pacientes desarrollan anomalas cromosmicas adicionales. A veces, estas anomalas de los cromosomas se pueden detectar en el tejido extramedular antes de las manifestaciones clnicas y hematolgicas de la crisis blstica. Los cambios cromosmicos secundarios se han comunicado en ms de 1.500 pacientes con LMC. Aunque n o existe una nica va a la progresin, la anomala cromosmica adquirida ms comn es la adquisicin de otro cromosoma Ph. Las anomalas que afectan a los cromosomas 8.17.19 y 22 son las siguientes ms comunes afectadas en la progresin de la enfermedad Dos pruebas moleculares que delectan el tamao o cantidad del producto de la transcripcin del ARNm BCR-ABL pueden ser tiles para evaluar la transformacin de LMC: la PCR cuantitativa y el tamao del producto del gen BCRABL (Serra. 1993; Lion, 1994: Preudhomme. 1999). Se han detectado dos tamaos de proleina de lusin BCR-ABL que corresponden a protenas con pesos moleculares de 190 kDa y 210 kDa. Por lo general, los casos de transformacin blstica en la LMC expresan la forma de 210 kDa. mientras que los nuevos casos de LAL con un cromosoma Ph expresan la forma de 190 kDa. Debido a que algunos casos de transformacin blstica de LMC se presentan sm una fase crnica previamente diagnosticada, la LMC subyacente se sugerir por la presencia de un producto p210. Adems, la presencia de una forma de 190 kDa en conjuncin con un producto de 210 kDa sugieren la evolucin a una fase terminal. Aunque ste puede ser el caso, se pueden tambin generar niveles bajos de productos p190 por medio de una rotura alternativa de la fusin de transcripcin p210. y no indica de forma universal una transformacin. En estos casos es crtica la correlacin morfolgica. La cantidad de mensaje BCR-ABL se puede determinar mediante PCR cuantitativa. Aunque no se utiliza mucho, esta prueba puede semi-cuantificar el nivel de transcripcin de ARNm BCR-ABL en pacientes con LMC. Aunque el nivel absoluto no es predictivo de una transformacin, un aumento desde unos niveles bsales previamente documentados para ese paciente puede predecir una inminente transformacin, por lo general en el plazo de seis meses.

Leucemia mieloide crnica Diagnstico

La LMC es un trastorno clonal de las clulas madre que se caracteriza por una proliferacin aumentada de elementos mieloides en todas las fases de diferenciacin. El diagnstico de LMC se basa en el examen microscpico de un frolis de sangre perifrica y de la biopsia de mdula. La documentacin de una traslocacin caracterstica entre los cromosomas 9 y 22. t(9:22) (p34.l :q11.21) (cromosoma Filadelfia [Ph]) confirma el diagnstico. La traslocacin recproca coloca el proto-oncogn ABL en el cromosoma 9 y prximo al gen BCR en el cromosoma 22 (Figura 65-1 A) (Kurzrock, 1988: First International Workshop. 1978; Heislerkamp, 1988:Tymmons. 1989; Chissoe. 1995: Papayannopoulou. 1977). Esta alteracin gentica da lugar a la formacin de una proteina quimrica. BCR-ABL. El producto de la fusin se expresa por lo general como una proteina quimrica de un peso molecular de 210.000 Da (p210) (Wada, 1995: Guo, 1991: Gorska-Flipol. 1990). P210 acta liberando los controles de la proliferacin de clulas madre o bloqueando la muerte celular programada, de forma que conduce a la proliferacin de este clon. Ms recientemente se han descrito puntos de rotura adicionales BCR-ABL y nuevas protenas de fusin (Wada. 1995). En una pequea proporcin de pacientes con LMC. tambin se ha visto que se producen traslocaciones complejas, en las que participan de forma universal el cromosoma 22 y. por lo general, el cromosoma 9 (Champlin. 1985; Bernstein, 1999: Kurzrock. 1988: First International Workshop. 1978). El conocimiento de estos ltimos hallazgos es crtico para la interpretacin de las pruebas moleculares para la presencia de t(9:22) (McCIure. 1994). Los pacientes con LMC y con un cromosoma Ph clsico demostrable mediante citogentica tienen una fusin molecular de los genes BCR-ABL. Esta traslocacin cromosmica puede tambin ponerse de manifiesto mediante anlisis Southern Blot (Kurzrock. 1988) o bien detectarse el producto de la transcripcin del ARNm de fusin mediante RT-PCR (Milelman. 1993). Aunque el Soulhem Blot y RT-PCR pueden no detectar traslocaciones complejas, Southern Blot detecta una traslocacin en una pequea minora de casos de LMC descritos como falsos negativos utilizando tcnicas citogenticas (Kantarjian. 1990: Martiat. 1991). Las caractersticas clnicas y hematolgicas de esta pequea cohorte de casos que son falsamente normales desde el punto de vista del cariolipo. pero que tienen redisposiciones BCR detecta-

CAPTUIO 65 TCNICAS MOLECULARES EN El DIAGNSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYTICAS

Cromosoma 9 Cromosoma 22 1(^:22) (q34;qll)

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Figura 65-1. A. E s q u e m a de una fusin que afecta a los genes BCR y ABL. El panel superior muestra el fenmeno de traslocaon de cromosomas t(9:22) (q34; ql 1). que dan lugar a la formacin de un gen de fusin BCR-ABL en el cromosoma 22q. El panel inferior muestra la estructura molecular del oncogn BCR-ABL. la transcripcin quimrica del A R N m y la proteina de fusin bcr-abl. El tipo de fusin-rotura que se muestra (una regin principal de rotura de BCR) se encuentra en la leucemia mieloide crnica y en un subconjunto de leucemias linfoblsticas agudas con positividad para el cromosoma Filadeltia. Como resultado de la fusin gentica, el hbrido de transcripcin BCR-ABL contiene secuencias BCR 5 unidas a casi toda la regin que codifica la tirosina cinasa ABL. En este caso, se forma una protena BCR-ABL de 210 kDa c o n una sobreactividad constitutiva de tirosina cinasa. El comportamiento aberrante de esta protena hbrida parece contribuir a la gnesis de la leucemia induciendo una transduccin de seal mitognica no supervisada. 8. Anlisis RT-PCR para deteccin de la fusin BCR-ABL Blot representativo de productos PCR Despus del aislamiento del ARN. se realiz u n a RT-PCR utilizando cebadores de oligonucletidos que cubren la unin de fusin de la regin principal de roturas (MBR). Los productos P C R se transfirieron a una membrana de nylon y se detectaron en esta situacin con una oligosonda especifica de la unin b3-a2. En las calles A, C y D: muestras de pacientes positivas para la fusin BCRABL b3-a2: en las calles B y E: muestras de pacientes negativas para la fusin; calle "" : clulas control negativas: calle V : clulas positivas control para la fusin b3-a2: calle Bl': control nulo (sin ARN).

Enfermedad residual y recidiva despus de la terapia

RT-PCR se ha aplicado tambin a la deteccin de enfermedad residual mnim a (MRD) (Tabla 65-1) (Siever. 1995). RT-PCR amplifica el ARNm quimrico formado por la traslocacin enlre el cromosoma 9 y 22 en la LMC. El producto amplificado da lugar a una banda especfica en la electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa. La sensibilidad puede aumentarse aun ms median

le anlisis Southern Blot del gel utilizando una sonda de oligonucletidos. RT-PCR se puede hacer como una tcnica de fase nica o de incubacin, ofreciendo cada una ciertas ventajas frente al anlisis cariotipico o el anlisis Southern Blot. La PCR de fase nica permite la deteccin de entre una de cada 10- a 10 clulas. La RT-PCR 'anidada' permite la deteccin de entre una de cada 10 a 10 clulas. Ambos tipos de RT-PCR son especilicas. relativamente baratas, tiles fuera del contexto de la investigacin y rpidas, estando disponibles los geles entre 24 y 48 horas despus de la obtencin del espcimen.
5 r

1358
Tabla 65-1

SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

C o m p a r a c i n de los m t o d o s P C R para la identificacin de leucemia residual

1

Anomala cromosomica 1(15:17)

Ventajas La deteccin se correlaciona con la recada Supervivencia prolongada en pruebas negativas

Desventajas

seis meses que siguen a un trasplante son difciles de interpretar por varias razones. Se pueden obtener falsos negativos debido a la escasez o "parcheado" del material celular, y algunos pacientes tienen resultados positivos que desaparecen despus de seis meses.

Leucemia linfoblstica aguda RT-PCR para t(1;19) (q23;p13)

Se ha observado que las traslocaciones cromosmicas no aleatorias adquiridas que se asocian con las leucemias humanas son marcadores fiables de clulas leucmicas. En la leucemia linfoblstica aguda, las ms comunes son t(1:19) (q23:p13) y t(12;21) (Tabla 65-2) (Amylon, 1997; Rubmtz, 1997; Privitera. 1996; Hunger, 1998). El uso de la RT-PCR en casos de LAL con estas traslocaciones puede proporcionar una informacin pronostica critica, as como el descubrimiento de enfermedad residual mnima. La t(1:19) Iq23:p13) es una traslocacin frecuente en la LAL infantil (Hunger, 1998: Privtera. 1996.1994). Esta traslocacin se produce en el 5% al 6% de todas las LAL infantiles, pero tambin se produce en aproximadamente un 25% de casos pre-B (positiva para inmunoglobulinas citoplsmicas). En general, la 1(1:19) conduce a la fusin de E2A. y el gen que codifica la protena hlice-asa-hlice (HLH) en el cromosoma 19. con PBX1. un "homeobox" que contiene el gen en el cromosoma uno. El hbrido E2A-PBX-lse expresa c o m o un conjunto de protenas quimricas oncognicas. En la mayora de los casos, los puntos de rotura genmicos de t( 1:19) se producen en un intrn nico de E2A y PBX1. dando lugar a ARNm quimricos transcritos que muestran un punto de unin uniforme. La presencia de este punto de unin uniforme permite la deteccin de la mayora de los casos de LAL con t(1:l9) mediante RT-PCR. La t(1:19) se ha asociado con un mal pronstico clnico, aunque la quimioterapia intensificada parece ser eficaz para anular su impacto pronstico adverso, Por tanto, la deteccin de t(1 ;19) en un caso de LAL de estirpe B tiene importancia pronostica y lerapulica. A pesar de su importancia en los especmenes diagnsticos, el anlisis medante PCR no cuantitativa para enfermedad residual mnima al trmino del tratamiento de consolidacin no parece ser de valor clnico o pronstico, debido a que no hay diferencia en la supervivencia libre de incidencias de los casos positivos o negativos para PCR de las LAL en remisin (Tablas 65-1 y 65-2).

t(8:21) inv(16) Anomalas 11q23 t(9;22)

t(i;i9) I(12;21) TCR-/ igH

No es prediclora de recada a menos que sea cuantitativa Se desconoce si predice la recada Se desconoce si predice la recada La deteccin tarda La deteccin precoz despus de un cierto (<6 meses) no periodo de tiempo se se correlaciona con correlaciona con el la recada de la LMC riesgo de recada en la LMC No predice la recada a menos que sea cuantitativa La deteccin se correlaciona con el nesgo de recada Se desconoce si predice la recada

RT-PCR tiene limitaciones en la LMC (Dhingra. 1992). La extrema sensibilidad del mtodo crea una cierta tasa de falsos positivos, sobre todo debido al arrastre de productos de reacciones previas a las nuevas muestras. La tasa de falsos positivos es normalmente ms alta con la RT-PCR "anidada" en relacin con la de fase simple debido a la mayor sensibilidad de la RT-PCR anidada. Adems, los controles negativos son crticos en ambos tipos de anlisis RT-PCR. Los falsos negativos producidos por la degradacin del ARN se pueden excluir utilizando una secuencia control de ARNm en paralelo. Adems, una pequea minora de los casos tienen puntos de rotura complejos (<5%), dando lugar a falsos resultados negativos en la RT-PCR. Las tcnicas de PCR y de Southern Blot parecen tener una sensibilidad similar frente a localizaciones atipicas de rotura: sin embargo, el anlisis cariotpico probablemente detecte estas traslocaciones poco habituales. Un alto riesgo de recidiva se ve anunciado por un RT-PCR positivo durante ms de seis meses despus de un trasplante de mdula sea (Hughes, 1991; Van Rhee, 1994: Xu. 1994). Los resultados positivos o negativos en los

RT-PCR para t(12;21)

Investigaciones recientes han demostrado que una t(12;21) es la traslocacin cromosmica ms frecuente en la LAL infantil, producindose en el 25% de todos los casos (Rubnitz. 1997; Amylon. 1997;Hoshino. 1997: Uphofl, 1997). Esta traslocacin es "crptica", queriendo decir que por lo general no se detecta mediante tcnicas citogenticas. pero que se detecta con frecuencia me-

Tabla 65-2

Traslocaciones recurrentes c o m u n e s y Enfermedad LAM-M3 LAM-M2 LAM-M4EO LAL Ph' adulta y peditrica LAL pre-B peditrica LAL pre-B peditrica LAL pre-B peditrica ("estirpe mixta") LAL. LAM y LAM secundaria adultas y peditricas Gen de fusin PML-RARct AML l-ETO CBFji-MYH 1! BCR-ABL
E2A-PBX1

Traslocacin t(15;17)(q24;q22) I(8;21)(q22;q22) invl6(p13;q22)o t(16;16)(p13;q22) I(9;22)(q34.q11) t(1;19)(q23:p13.3) t(12;21)(p13;q22) I(4;11)(q21:q23) Otras traslocaciones 11(q23)

Mecanismo Proteina quimrica Protena quimrica Protena quimrica Sobreexpresin de oncogn Proteina quimrica Protena quimrica Protena quimrica Protena quimrica

Deteccin RT-PCR RT-PCR RT-PCR SBH RT-PCR SBH RT-PCR. SBH RT-PCR RT-PCR. SBH RT-PCR, SBH

Frecuencia (%) 5 10-15 10 20 (adulto) 5 (peditrico) 5 20-25 3-4' Variable'

Sensibilidad" 1/10M0 VIOMO 1/10 -10

a 4

6 ;

1/W-10' 1/1OM0 1/10 1/10

4 4 f

TEL-AML I MLL-AF4 MLUoliOS

1/10'

" "Sensibilidad", tal c o m o se menciona, refleja el mtodo de deteccin ms sensible (por ejemplo. PCR). ' Casi un 80% de las LAL inlantiles. Variable: el porcentaje depende del subtipo de leucemia
!

C A P T U L O 65

TCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y T I C A S

1359

diante RT-PCR. El 1(12:21) da lugar a una fusin en el dominio HLH del gen TEL a los dominios de Iransactivacin y unin al ADN del gen AML /. El gen TEL es un miembro de la familia recientemente descrita ETS de factores de transcripcin, y el gen AML1 codifica la subunidad de unin al ADN (CBFot) del complejo de transcripcin del tactor de unin al "core". El gen TEL participa tambin en otras traslocaciones poco habituales, incluyendo t(5;12). t(9;l2), t(10;12) y t(12;22), que se encuentra sobre todo en trastornos mielodisplsicos y mieloprolilerativos. A diferencia de ello, el complejo del factor de unin al core AML1 'CDFji es el objetivo ms frecuente de las traslocaciones cromosmicas en los casos nuevos de LAM. estando alterado en t(8:21) e inv(16) en hasta un 30% de los casos. La funcin de la oncoprotena TEUAML1 sigue siendo desconocida, pero datos recientes sugieren que altera directamente la actividad transcripcional de AML1. necesaria para una hematopoyesis normal. Los estudios iniciales han indicado que la presencia de esta traslocacin identifica un subgrupo clnicamente diferente con un pronstico favorable a pesar de la ausencia de hiperploidia en estos pacientes (Tablas 65-1 y 652) Cuando se estratifica de acuerdo con la edad, recuento leucocilario. clasificacin de riesgo y rgimen teraputico, los pacientes con redisposiciones TEL tienen un pronstico significativamente mejor que aquellos con una lnea germinal TEL. De hecho, el poder predictivo de la redisposicin TEL en la LAL peditrica excede a todos los dems lactores de valoracin de riesgo. Las bases biolgicas o moleculares para el buen pronstico son desconocidas.

TCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNSTICO DE LINFOMAS Bases para el anlisis gentico molecular en los trastornos linfoides
Los linfomas no-Hodgkin (LNH) y las leucemias linfticas crnicas constituyen una enfermedad maligna relativamente comn enlre los adultos, y la incidencia de estos trastornos va en aumento (Ries. 1994). El abordaje anatomopatlogo tradicional para el diagnstico de LNH comprende el reconocimiento de las caractersticas clulas tumorales con microscopio ptico, p o r lo general suplementado mediante estudios con marcadores inmunofenotpicos. La aplicacin de mtodos de fenotipado cada vez ms sofisticados, incluyendo la citometra de flujo y la inmunoperoxidasa. ha mejorado de lorma considerable nuestra precision diagnstica y nuestra capacidad para subclasificar los tumores linfoides. Un paradigma central en el diagnostico del linfoma es la demostracin de la clonalidad. que est relacionada con el estado maligno. De nuevo, en muchos casos, la clonalidad se puede sugerir o establecer con ayuda de estudios de inmunofenotipado. mediante la demostracin de restriccin de cadenas ligeras en el caso de las neoplasias de clulas B o mediante expresin de antgenos aberrantes en la proliferacin de clulas T. Sin embargo, hay varios casos en los que los anlisis previos pueden ser insuficientes y la determinacin de la clonalidad linfoide sigue siendo un mtodo diagnstico clave. En este contexto, la valoracin molecular de las redisposiciones genticas de los receptores clnales de antigenos ha sido extremadamente valiosa en ciedas situaciones tcnicas, como muestras con caractersticas fenotpicas poco definidas, biopsias tisulares pequeas y tejidos impregnados con parafma. Los mtodos habituales de deteccin de clonalidad se emplean tambin ocasionalmente para distinguir los linternas de clulas grandes de la enfermedad de Hodgkm. para asignar lineas celulares en tumores hematopoyticos no diferenciados (esto es. de clulas B frente a clulas T) y para ayudar de forma general en el diagnstico de los trastornos linfoproliferativos de clulas T. Adems, la determinacin molecular de la clonalidad es a menudo necesaria para resolver el diagnstico definitivo de neoplasias linfoides con caractersticas que potencialmente se parecen a las hyperplasias benignas (por ejemplo, linternas centrofoliculares. linfomas de tipo "MALT" y leucemia linftica de clulas T granulares grandes) La identificacin de anomalas recurrentes, genticas y no aleatorias de los linfomas, producidas la mayora de las veces por fenmenos de traslocacin cromosmica. ha proporcionado otro conjunto adicional de herramientas diagnsticas y perspectivas biolgicas nuevas Los datos citogenticos y de gentica molecular de esta clase forman ahora una parle integral de las clasificaciones actuales de los linternas (Hams. 1994). La correlacin de redistribuciones genticas especficas con subtipos particulares de linterna proporcionan no solamente unos marcadores moleculares alternativos para la determinacin de la clonalidad, sino que, de forma ms significativa, ayudan a clasificar de forma precisa la enfermedad. Segn sigue aumentando nuestro conocimiento de la biologa de los linternas, el reconocimiento de entidades especficas basadas en criterios genticos moleculares probablemente lorme una faceta integral de los tralamientos "dirigidos al tumor". La seccin que sigue delalla los abordajes moleculares a la determinacin de la clonalidad de clulas B y T. la deteccin y significado de las traslocaciones comunes recurrentes en los linfomas y la aplicacin de tcnicas moleculares al seguimiento postratamiento de enfermedad mnima.

Leucemia mieloide aguda

Se ha utilizado RT-PCR en la LAM para la deteccin de anomalas 1(15:17), 1(8:21). inv(16). y Hq23 Tablas 65-1 y 65-2). Los anlisis basados en RT PCR en la LAM tienen las mismas ventajas y limitaciones tcnicas que en el LMC: sin embargo, es importante evitar la tentacin de aplicar los resultados de un anlisis especifico al grupo heterogneo de la LAM como todo. La importancia clnica de cada prueba debe determinarse individualmente como se explica ms adelante. La caracterstica traslocacin t 15:17) (q22:p21) est presente en casi todos los pacientes con leucemia promieloctica aguda (sistema de clasificacin de leucemias franco-americano-britnico [FAB] M3 LAM), constituyendo del 5% al 10% de todas las LAM (Miller. 1992). La traslocacin entre un receptor de cido retinoico (RAR-a) en el cromosoma 17 con el gen de la leucemia promieloctica (pml) en el cromosoma 15 da lugar en ltima instancia a una proteina de fusin PMLRAR-rx. L a proteina quimrica contribuye de forma aparente a la gnesis de la leucemia inhibiendo la diferenciacin o promoviendo la supervivencia celular mediante la inhibicin de la apoptosis. Los anlisis RT-PCR persistentemente positivos tienen una relacin directa con la recada, distinguiendo a un pequeo grupo de pacientes en los que la recada es casi segura (RT-PCR-posilivos) de un grupo ms grande en los que la recidiva es poco probable (RT-PCR-negativos). Adems, las pruebas a intervalos probablemente disminuyan los resultados clnicos ambiguos del grupo negativo al identificar pacientes propensos a recaer antes de la aparicin de una enfermedad manifiesta. La t(8;21) (q22;q22) se observa en el 6% al 18% de las LAM, con mayor frecuencia en la LAM FAB-M2 (Nucifora, 1993a; Chang, 1993: Nucifora, 1993b) A diferencia de t(9;22) y t( 15:17). los investigadores han detectado de forma persistente y repetitiva esta traslocacin en pacientes con remisin de larga duracin. As, a diferencia de p(15;17), en la LAM FAB-M2 la deteccin de t(8:21) no predice una recidiva inminente; sin embargo, dado que la deteccin de la traslocacin implica un peor pronstico y probablemente un abordaje teraputico diferente, el uso de la RT-PCR en la LAM (FAB-M2) es una posible alternativa al anlisis citogentico en el momento del diagnstico y terapia inicial. La inv(16) (p13q22) est presente en el 2% al 8% de las AMP peditricas, con mayor frecuencia en asociacin con una leucemia clasificada morfolgicamente como FAB-M4Eo (Liu. 1993: Claxton, 1994). Las anomalas 11q23. incluyendo t(4;11) son tambin comunes en LAM y en la LAL peditricas (Yamamoto, 1994). Inv(16) es un hallazgo favorable en la LAM. 1lq23 tiene un mal pronstico en la leucemia peditrica y en la LAM secundaria del adulto. La utilidad de 1lq23 y de inv(16) en la MRD no est bien estudiada hasta la fecha.

Anlisis de las reorganizaciones de los genes receptores de antgenos para la determinacin de la clonalidad Mecanismo de las reorganizaciones de los genes receptores de antigenos
Los genes de receptores antignicos se redistribuyen precozmente en el desarrollo de los linfocitos B y T en la mdula sea y en el timo, respectivamente. El proceso de redistribucin, o recombinacin gentica, afecta especialmente a la divisin y fusin de uno de los numerosos segmentos variables (V) del gen con un exn de unin (J). En algunos puntos, y notablemente en

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

los receptores |5 de las inmunoglobulinas de cadenas pesadas y clulas T, se interpone un segmento de diversidad (D) suplementario de los segmentos Vy J-. El segmento ensamblado V-J o V-D-J se une despus con la regin constante (C) del gen receptor del antgeno para producir una secuencia codificadora intacta capaz de traducirse en una protena funcional del receptor de antgenos (Sklar. 1992). Las clulas inmunes incapaces de producir protenas de receptor funcionales se destruyen mediante apoptosis. Para las clulas B inmaduras, el gen de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas del cromosoma 14(q32) es el primero en someterse a una redistribucin segmentaria, que se sigue a su vez por el gen K de cadenas ligeras en 2(p12). Si este ltimo intento es no productivo en ambos alelos, se selecciona el locus X en 22(q11) (Sklar, 1992). Para las clulas T, el receptor de las clulas 8 (T6) (14(q11)] y y (Ty) [7(p15]) inician este proceso en el timo; sin embargo, muchas de estas redistribuciones de los genes 5 o y fracasan en la produccin de receptores protenicos funcionales. As. la redistribucin contina en los locus TCR a y -p, localizados en los cromosomas 14(q11) y 7(q34). respectivamente, generando un receptor Tctp en una gran mayora (85% al 90%) de las clulas T (Sklar, 1992). Como punto importante en relacin con el anlisis molecular (ms adelante), prcticamente todas las clulas maduras Tup siguen portando una redistribucin del locus genticos Ty. Existe una enorme diversidad en los receptores de inmunoglobulinas y clulas T, que surgen del potencial de recombinacin gentica entre numerosos segmentos de genes V-, (D-) y J- en estos puntos. Adems, la actividad de la enzima desoxmucleotidil-transferasa terminal (TdT) aade de forma aleatoria bases de cidos nucleicos a las uniones de los segmentos reorganizados de los genes, aumentando an ms la diversidad de las secuencias. Como resultado de todo este proceso, los linfocitos individuales B y T transportan redistribuciones genticas peculiares y expresan en su superficie celular molculas inmunes de receptores de antgenos peculiares. En una expansin lnfoide policlonal, existe por lo general una distribucin altamente variable de redistribuciones genticas de receptores antignicos, mientras que en una poblacin monoclonal es caracterstica una redistribucin nica e idntica en cada clula. Este concepto se explota tanto en la hibridacin Southern Blot (SBH) como en los mtodos de PCR. para distinguir las proliferaciones policlonales ("benignas") de las monoclonales ("tumorales").

nicas SBH para detectar clonalidad linfoide depende de varios factores. Primero, el locus que se est estudiando debe ser anatmicamente favorable para su estudio medante digestin enzimtica e hibridacin con sondas. Ciertos locus, como el gen Ta, son muy grandes y difciles de valorar de forma adecuada con una buena sensibilidad utilizando un nmero prctico de digestin enzimtica restringida y sondas. Por el contrario, el locus Ty, y tal y como se explica ms adelante, es relativamente pequeo y de diversidad limitada, dando lugar a una escasa especificidad e impidiendo su uso en la SBH. Segundo, las sondas deben estar disponibles con facilidad para su uso en el diagnstico clnico. Las sondas pueden producirse a partir de un fragmento de ADNc (complementario) a la regin que nos interesa o mediante clonacin genmica. y en el comercio existen varias de ellas. Por ltimo, el mtodo SBH precisa del uso de un ADN no degradado, de alio peso molecular y procedente de fuentes (.Bulares frescas o congeladas. Dado que para la digestin enzimtica se utiliza una cantidad uniforme de ADN (por ejemplo, 5 pg), se puede obtener una estimacin de la proporcin de clulas clnales o de linea germinal en una muestra dada. Para la determinacin de la clonalidad de clulas B mediante SBH, se han utilizado tanto los genes de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas (IgH) como los de las cadenas ligeras (K, X). El gen IgH se valora frecuentemente mediante una sonda para la regin J (Willman. 1990: Cossman. 1988). La regin J de IgH es altamente informativa, dado que este locus es relativamente compacto, se define con facilidad mediante digestin enzimtica restringida y siempre participa en los fenmenos de recombinacin de las clulas B. El gen de las cadenas ligeras ic ha sido tambin estudiado mediante anlisis SBH. con una sonda de la regin J,, aunque una minora de casos de linfoma (aquellos con una recolocacin de las cadenas ligeras X) pueden ser pasados por alto debido a una delecn especfica del locus K (Medeiros. 1995). Las redisposiciones del gen de las cadenas ligeras X puede valorarse con una sonda de la regin constante (C,); sin embargo, este locus es altamente polimrfico con los estudios habituales de restriccin enzimlica y los resultados de las bandas son ms difciles de interpretar (Saueracker, 1992). El locus (3 de las clulas T (T,J ha resultado ser el ms til para la deleccin de la clonalidad de las clulas T mediante SBH, y esta regin comparte caractersticas estructurales parecidas a las del gen IgH. La complejidad del locus T se ve aumentada por la presencia de dos regiones D-, J- y C- disponibles para la recombinacin con el gran repertorio de segmentos de la regin V . Sin embargo, dado que las dos regiones C,, son de una secuencia casi idntica, las redistribuciones del gen T, se pueden identificar mediante SBH utilizando una sonda genmica C y digestin restrictiva adecuada del ADN objetivo (Figura 65-2/4) (Medeiros, 1995). Se ha descrito tambin el uso de sondas especficas de la regin J para detectar clonalidad en el locus T, (Medeiros. 1995). El locus T-y (T.) es por lo general poco adecuado para el anlisis SBH debido al nmero relativamente pequeo de segmentos redistribuidos de las regiones V y J. Esta capacidad limitada para la recombinacin segmentaria crea un conjunto relativamente pequeo de redistribuciones funcionales del gen T As, en una poblacin policlonal de clulas T. el SBH con una sonda de regin J, resuelve potencialmente varias bandas prominentes adems de los fragmentos esperados de linea germinal, a diferencia del anlisis SDH del locus T. donde los clones reactivos benignos individuales no pasan por encima del umbral de sensibilidad de deteccin (Cossman, 1988: Medeiros, 1995). Esta situacin conduce a la posibilidad de lamar errneamente "seudoclonales" a las bandas de los procesos reactivos de clulas T y, por el contrario, puede oscurecer la identificacin de un autntico gen monoclonal T.. en presencia de clulas benignas T coexistentes.
|( |t |( r

Tcnicas para detectar reorganizaciones de los genes de receptores antignicos

Hibridacin Southern Blot. Las tcnicas SBH se pueden considerar un abordaje molecular a "gran escala", que comprende una digestin restringida mediante endonucleasas de una muestra de ADN de alto peso molecular, seguida de separacin de fragmentos, inmovilizacin sobre una membrana y deteccin mediante una sonda radioisotpica especfica de uno o ms fragmentos objetivo de ADN (relativamente grandes) (Willman. 1990; Cossman. 1988). Esta tcnica se describe con detalle en el Captulo 59. De forma resumida, y para una regin estructuralmente no alterada (no reorganizada) del ADN objetivo, el anlisis por hibridacin Southern mostrar un cierto patrn de tamaos de fragmentos o de bandas, una configuracin de lnea germinal, basada en la distribucin de determinados puntos de restriccin enzimtica dentro del locus en cuestin. Si esta regin del ADN se redistribuye, como en el caso de los locus de receptores antignicos de las clulas B y T, se producir un patrn de bandas diferente (como resultado de los cambios en las localizaciones en los puntos de restriccin enzimtica de linea germinal), y estos cambios se pueden reconocer con facilidad mediante hibridacin con una sonda especifica. La sensibilidad de SBH es tal que por lo menos un 5% de una poblacin de clulas deben contener la misma redistribucin de linea no germinal para poder detectarse. En una poblacin linlocitaria policlonal, las clulas individuales D o T son portadoras de redistribuciones peculiares de sus genes de receptores antignicos, y tericamente se debera esperar que generen una "escalera" o amplia distribucin de las redistribuciones cuando se analiza mediante SBH y con sondas adecuadas. Sin embargo, y en la prctica, en las proliferaciones policlonales no se ve este patrn de redistribucin, dado que incluso grupos expandidos y altamente seleccionados de clulas lnfoides reactivas no constituyen un 5% de las clulas totales en estas situaciones. Por contra, cada clula de una poblacin monoclonal contiene una redistribucin de los genes receptores de antgenos idntica, y la SBH identificar bandas reorganizadas y claras (lineas no germinales) (Figura 65-24). La aplicacin con xito de las tc-

Reaccin en cadena de polimerasa. Las recombmaciones de los genes de los receptores de inmunoglobulinas y clulas T pueden identificarse tambin por mtodos PCR. A diferencia de SBH, que detecta alteraciones genmcas estructurales relativamente grandes basndose en cambios en los puntos de restriccin enzimtica, la PCR est diseada para amplificar regiones cortas de ADN correspondientes al rea de fusin de segmentos del gen en los genes recombmados del receptor de antigeno. Bajo condiciones estndar de PCR. la configuracin del gen de receptor de antgenos de lnea germinal se amplifica con una baja eficiencia, o no se amplifica en absoluto, debido a las reas de tamao muy grande intervnientes de ADN entre los puntos d e cebado. Sin embargo, cuando los segmentos codificadores V-, (D-) y J se yuxtaponen en un gen recombinado, la amplificacin de la regin entre los ceba-

CAPTULO 65

TCNICAS MOLECULARES EN EL DIAGNSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYTICAS

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FR3-JH

Figura 65-2. A. Hibridacin Southern Blot en el locus T|i. Se muestra un ganglio linftico benigno (L) ADN de linea germinal piacentana (P) y un ganglio linftico a f e c t a d o por un linloma de clulas T (A). Cada una de las muestras le digenda con los enzimas de restriccin B a m H 1 (B), EcoR1 (E) y Hindlll (H) c o m o se indica. Despus de una electroforesis en gel y la transferencia a una m e m b r a n a de nylon, los f r a g m e n t o s del locus especifico T|i de cada digestin se detectan mediante hibridacin con una s o n d a etiquetada de forma radioactiva y expuestos a una placa radiogrfica. Los patrones de bandas de lnea germinal (no reorganizados) se presentan para las muestras L y P, y estas bandas se ven t a m bin en la muestra del linfoma (A). Sin embargo, la muestra del linfoma (A) muestra adems dos bandas concretas de lnea no germinal, o reorganizadas, tanto en las digestiones Bamhl c o m o Hindlll (flechas). Dado que se utiliza la m i s m a cantidad de ADN en c a d a canal, se p u e d e estim a r la cantidad relativa de enlermedad clonal en la muestra del t u m o r Obsrvese la t e n u e banda de linea germinal en la m u e s t r a de nodulo linftico benigno (L) en la digestin BamH1. indicando que aqui se us una cantidad insuficiente de ADN. B. E s q u e m a de la estructura parcial del gen IgH y de la estrategia PCR para la deteccin de la reorganizacin del gen IgH Se indican las regiones determinantes c o m p l e m e n t a r i a s (CDR) y las regiones m a r c o (FR) de la cadena pesada variable Ig funcional. Superpuestas estn las regiones V-, D- y J-. ilustrando la relacin de los s e g m e n t o s codificadores del gen con la estructura variable IgH de la cadena de anticuerpos. El s e g m e n t oV _ codifica la mayora de la regin variable en la molcula IgH. incluyendo la tercera regin m a r c o (FR-lll). El "CDR III" est formado p o r la unin de los s e g m e n t o s individuales V . D y J y es una regin a l t a m e n t e peculiar en la secuencia de c a d a clula B. La letra "n" indica focos de inserciones nucletidas n o c o n t e m p l a d a sp o r la enzima TdT durante la recombmacin VDJ. Para la deteccin m e d i a n t e PCR de la clonalidad. el ob|etivo es CDR III. Con la m a y o r frecuencia, esto se consigue m e d i a n t e el uso de un FR III de consenso y un conjunto de cebadores J (y D). Los mtodos alternativos pueden incluir cebadores de consenso FR ll-JH (B y D) o una familia de cebadores FRI especficos de secuencia para la regin V con un c e b a d o r de consenso JH (A y D). La PCR de amplificacin a travs de la regin de unin peculiar IgH produce una m a n c h a o distribucin de producios en un proceso de clulas B policlonal. o un producto nico de tamao definido en una poblacin monoclonal. C. I m a g e n representativa d e la PCR F R lll-JH (CDR III) para la deteccin de las reorganizaciones del gen d e las cadenas pesadas de i n m u n o g l o b u l m a s (IgH). Despus de la amplificacin de IgH CDR III m e d i a n t e la reaccin de polimerasa en cadena, los productos PCR se analizan en un gel de poliacrilamida y se ven bajo luz U V tras su tincin con bromuro de etidio. Las calles etiquetadas A a C representan m u e s t r a s de pacientes analizadas p o r duplicado L a calle A del paciente m u e s t r a una banda c l a r a m e n t e resuelta indicando una poblacin m o n o c l o n a l de clulas B A diferencia de ello, la calle del paciente C m u e s t r a una m a c h a dilusa de productos PCR. acordes con un proceso policlonal de clulas B La calle del paciente B no m u e s t r a ningn p r o d u c t o de amplificacin, indicando una ausencia de poblacin significativa de clulas B en la m u e s t r a En la ltima situacin, se necesita la amplilicacin de un ADN objetivo control interno no relacionado para excluir una m a l a calidad del ADN. Otras calles: L. escalera de peso molecular (tamao): calle *, control positivo de ADN: calle Bl. blanco (sin ADN).
H H K

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S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR

dores ahora muy prximos se lleva a cabo muy fcilmente mediante PCR. Los locus de ms amplio uso para la determinacin mediante PCR de la clonalidad linloide son los genes IgH y T . En la Figura 65-2B se muestra un esquema de la IgH PCR. Se han descrito varios abordajes para la IgH PCR. La tcnica que se aplica con ms frecuencia comprende la amplificacin a travs de la tercera regin determinante complementaria (CDR III) del gen reordenado IgH (Segal, 1994; Slack. 1993). El IgH CDR III est formado por la fusin de los exones V-, D-. y J-. La regin del gen V comprende casi 200 segmentos diferentes que se pueden agrupar en seis familias basndose en similandades de secuencia Las regiones D - y J contienen aproximadamente 15 y 6 segmentos del gen, respectivamente. La recombmacin aleatoria de estos segmentos crea asi una diversidad IgH significativa, aumentada an ms por la adicin de nucletidos funcionales sin plantilla por la enzima TdT. Como resultado, el CDR III es completamente nico en cualquier clula B dada y puede utilizarse como un potente marcador de clonalidad en las neoplasias de clulas B. Aunque el CDR III es extremadamente variable entre los linlocilos B, los mtodos de PCR de esta regin estn simplificados por el uso de cebadores consensuados. El extremo 3 de la regin contigua V conocida como la regin marco III (FR III). exhibe secuencias nucleotidicas que estn muy conservadas en la mayora de los segmentos del gen V . De lorma anloga, cada segmento J contiene regiones de secuencia idntica de nucletidos. Se pueden asi disear cebadores complementarios PCR para FR III y J que flanquean el CDR III. En una proliferacin policlonal de clulas B. pueden esperarse muchos miles de redistribuciones individuales CDR III. Dado que ninguna de estas poblaciones reactivas estn normalmente presentes por encima del umbral de sensibilidad del anlisis PCR (aproximadamente un 1%). en la electroforesis con gel se observa un patrn muy dbil de bandas mltiples (Figura 65-2C). En un proceso monoclonal de clulas B todas las clulas son portadoras de un CDR III idntico que se amplifica de forma preferencial durante la PCR. dando lugar a una llamativa banda clonal durante el anlisis con gel (Figura 65-2C). De forma ocasional, puede existir una segunda banda, indicativa de redsposiciones biallicas de IgH.
; H H H H

plo. 0.5 pg a 1 pg) en comparacin con SBH. PCR tiene una sensibilidad nominal de un 1%. y esto puede extenderse aun ms entre un 0.1% y un 0,001%, mediante optimizacin en aplicaciones especiales tales c o m o la deteccin de linfoma o leucemia residuales. Adems. PCR se puede llevar a cabo a partir de fuentes tisulares parafinizadas, frescas o fijadas, aunque algunos fijadores (por ejemplo. B5) o sustancias utilizadas por lo comn en el procesado de los ganglios linfticos o de la mdula sea pueden inhibir la PCR. Aunque los mtodos PCR son ms "simplistas" en comparacin, la tcnica es muy lbil frente a alteraciones "micromoleculares de las regiones objetivo de los cebadores de oligonucletidos. As. el uso de cebadores de consenso no amplificar redistribuciones poco comunes IgH o Tg que comprendan segmentos del gen que carecen de las secuencias complementarias conservadas. Quiz de forma ms significativa, las mutaciones de bases nucleotidicas o las delecciones en el ADN plantilla pueden impedir una unin eficaz de las secuencias de cebadores complementarias, dando lugar al fracaso de la PCR Tales situaciones se producen en algunos tumores linfoides B que han sufrido hipermutaciones somticas de la regin CDR III. Los ejemplos incluyen los linfomas de clulas centrofoliculares, algunos linfomas de clulas grandes y los linfomas con diferenciacin plasmacitoide. en los que la determinacin de clonalidad puede variar de un 35% a un 60% utilizando PCR IgH CDR III (Lombardo, 1996: Segal, 1995). L a tasa de deteccin de clonalidad en tumores de linfocitos B pequeos de origen no folicular (por ejemplo, linfoma linfoctico pequeo, linfomas de clulas del manto) es. por contra, prxima al 100%. Las leucemias Imfoblsticas agudas de clulas B y los linfomas pueden portar de forma ocasional una redistribucin clonal aislada D-J. o sufrir deleciones en la regin V., del gen. impidiendo asi el xito de los mtodos habituales de PCR CDR III (Height. 1996). Para valorar la clonalidad Cg existe un problema ms difcil. A pesar de la naturaleza funcional peculiar de cada reorganizacin de los segmentos V-J de Tg. la diversidad limitada de este locus puede dar lugar a amplicones PCR con un tamao muy parecido e incluso caractersticas secuenciales m u y similares. Esto puede crear dificultades para identificar una autntica poblacin clonal de clulas T cuando las clulas T policlonales coexistentes son numerosas, dado que las secuencias amplificadas similares pero no homologas pueden cear heterodplex" con los amplicones objetivo durante la electroforesis en gel. disminuyendo de forma notable la capacidad para detectar una banda monoclonal. Dadas estas limitaciones de la tcnica PCR, la SBH puede todava ser necesaria para resolver un problema difcil de clonalidad en una proliferacin linfoide. Dado que SBH valora la estructura de regiones genmicas de m a y o r tamao, la tcnica no es adecuada para aquellos temas mencionados antes para la PCR. SBH est considerada el mtodo de referencia para la determinacin de clonalidad en este contexto diagnstico y. afortunadamente, dado que la PCR es un mtodo m u y rpido, uno puede posteriormente revertir al anlisis SBH en caso de que los resultados de la PCR no sean determinantes. Sin embargo, la necesidad de cantidades adecuadas de ADN de tejido fresco o congelado en muchos casos no se pueden satisfacer, y esta limitacin debida a la muestra ha estimulado las mejoras en los anlisis y tcnicas PCR. Por ejemplo, se han utilizado conjuntos alternativos de cebadores para soslayar el fracaso de la amplificacin debido a alteraciones en las regiones CDR III o FR III que con una cierta frecuencia aparecen en la PCR del locus IgH. Se pueden combinar un cebador de la regin II marco (FR II) situado aguas arriba de esta regin de consenso o un nmero de cebadores VH "especficos de la familia" FR I con el cebador de consenso JH (Figura 65-20) (Ramasamy. 1992; Aubin. 1995: Deane, 1991). Estas maniobras sirven para aumentar el xito global de la deteccin de clonalidad desde aproximadamente un 65% (slo con la PCR estndar IgH CDR III PCR) hasta aproximadamente un 90% a expensas de un mayor trabajo y complejidad. Tambin se han utilizado de forma efectiva cebadores de PCR especficos de familia" para aumentar la deteccin de clonalidad en el locus Tg (Greiner, 1999). Los cambios en el anlisis de gel pueden tambin afectar de forma significativa la resolucin y. por tanto, la deteccin, de productos clnales de PCR. El uso de geles de poliacrilamida es por lo general ms informativo que los geles de agarosa, y las modificaciones en la composicin del gel pueden mejorar esto todava ms. En el caso de la PCR Tg. la generacin potencial de productos competidores pero mespeclicos de tipo heterodplex puede reducirse de forma sustancial mediante vanos mtodos preanalticos y de electroforesis en gel. favoreciendo as la deteccin de una autntica poblacin clonal (Bottaro.

El locus T aunque no es muy adecuado para SBH. ha sido, sin embargo, utilizado con xito para la determinacin de clonalidad de clulas T mediante PCR (Slack. 1993: Wood. 1994). Las redistribuciones del gen Tyse producen precozmente en los linfocitos T tmicos en desarrollo, y este evento gentico se retiene, aunque la inmensa mayora de clulas T inmaduras continan reorganizando los locus Ta y T|i, y en ltima instancia desarrollan un fenotipo Ta(l de receplor. El locus Ty proporciona as un marcador para valorar la clonalidad cuando se sospecha una neoplasia de clulas T. El locus Ty comprende once segmentos que codifican la regin V, agrupados en cuatro lamilias basndose en similaridades de secuencia. Existen cuatro segmentos funcionales de la regin J, incluyendo los exones conservados Jyl y Jy2. asi como los exones Jpl y Jp2 (McCarthy, 1992). La PCR de T. tambin se basa en la naturaleza peculiar de las redistribuciones luncionales en los linfocitos T individuales; la tcnica es a menudo informativa a pesar de la diversidad segmentaria limitada de este locus, y teniendo en mente algunas limitaciones (analizadas en la prxima seccin). Se pueden utilizar cebadores consensuados complementarios a las secuencias de homologa compartida en los segmentos gamma V- y Jpara simplificar el procedimiento de la PCR. De forma similar al caso de la PCR de IgH, los productos de amplificacin de las clulas T policlonales tienden a producir un patrn uniforme, mientras que la monoclonalidad se pone de manifiesto en forma de una o dos bandas discretas. Ventajas y limitaciones de SBH y PCR para la valoracin de la clonalidad linfoide. La decisin de utilizar PCR trente a SBH conlleva conocer varios factores tales como la fuente tisular. el tipo de trastorno linfoproliferativo que se estudia, la sensibilidad de cada uno de los mtodos y las frecuencias de falsos negativos y falsos positivos. En general, la tcnica PCR ha ganado una amplia popularidad para la determinacin de la clonalidad. principalmente debido a su relativa facilidad de llevarse a cabo y a su rapidez. El mtodo SBH es. por contra, m u y laborioso, ms caro, y necesita de entre dos y tres semanas para completarse. Adems, SBH se lleva a cabo por lo general con sondas etiquetadas con radiactividad. Otras desventajas de SBH son la necesidad de tejido fresco o congelado de buena calidad (para obtener un ADN de alto peso molecular) y una sensibilidad relativamente baja, en la proximidad del 5%. La PCR es ventajosa en cuanto a que su tiempo es en general de das, es ms barata y necesita una cantidad inicial de ADN mucho ms pequea (por ejem-

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T C N I C A S M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y T I C A S

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1994; Chhanabhai, 1997; Langerak. 1997). Por ltimo, la demostracin de traslocaciones cromosmicas recurrentes mediante tcnicas de PCR. sobre todo en un subconjunto de tumores de clulas B. proporciona otro marcador adicional de clonalidad si la PCR inicial de redisposicin de los receptores antignicos no tiene xito; esto se trata en la seccin siguiente. Para resumir. PCR y SBH son tcnicas clave y complementarias para la determinacin de la clonalidad en los trastornos lnfoides de clulas B y T. En general, los mtodos PCR son a menudo considerados como "punteros", reservndose la SBH para aquellos casos con un material adecuado y en los que se considera que un resultado negativo de la PCR no est de acuerdo con otros hallazgos clnicos o patolgicos. A este respecto, es importante tener en mente los conceptos de "tasa de deteccin" y "sensibilidad", en relacin con la tcnica PCR. La tasa de deteccin de la PCR IgH o Tg ser dependiente de un nmero de factores previamente descritos, como el subtipo de trastorno linfoproliferativo. el mtodo PCR (cebadores nicos frente a mltiples) y el tipo de anlisis de gel empleado. La PCR no detectar las redistribuciones clnales en todos los casos de tumores lnfoides malignos, y as el conocimiento de la tasa global de deteccin de un cierto mtodo PCR, o las mejoras obtenidas mediante avances de esta tcnica, es valioso para la interpretacin de resultados. Un ejemplo es el del linfoma folicular, que se asocia normalmente con una tasa de deteccin clonal IgH de un 40% a un 60% utilizando el mtodo PCR IgH CDR III (Segal, 1995). Combinando la PCR IgH con un anlisis PCR para identificar las redistribuciones del gen BCL 2, se pueden detectar hasta un 80% a un 85% de los casos (Segal, 1995). Por otro lado, la capacidad de un mtodo dado de PCR para resolver cantidades diminutas de un objetivo molecular, o su sensibilidad, se explota a menudo en circunstancias especficas tales como el seguimiento de la enfermedad residual mnima (por ejemplo, linfoma o leucemia) durante o despus del tratamiento. La sensibilidad se mide por lo general de forma dilucional, y se optimiza a menudo mediante secuenciacin de la regin recombinada funcional peculiar del gen del receptor de antgenos clonal y diseando cebadores "alelo"-especficos del tumor o sondas para utilizarse en la vigilancia de muestras posteriores de un paciente dado. Es esencial, dado que los estudios moleculares diagnsticos basados en PCR son capaces de conseguir elevados niveles de sensibilidad, tener gran cuidado para minimizar y eliminar la posibilidad de contaminacin de muestras en el laboratorio; incluso una cantidad diminuta de una plantilla contaminante extraa puede convertir un resultado PCR policlonal autntico en una interpretacin falsamente positiva de monoclonalidad, con las correspondientes consecuencias clnicas graves.

menudo proporciona informacin pronostica, o un marcador para la deteccin de enfermedad residual. En general, las traslocaciones cromosmicas en los linfomas resultan de la fusin de dos locus genticos, que se producen con ms frecuencia en el locus IgH del cromosoma 14(q32), En consecuencia, un protooncogn que normalmente est altamente regulado se activa de forma constitutiva, dando lugar a una marcada sobreexpresin de una protena oncognica. En otros casos, por ejemplo, el t(2;5) en un linfoma anaplsico de clulas grandes, se produce un gen de fusin quimrico y se expresa como un ARNm hbrido y protena. En cada caso, se cree que la interferencia con el crecimiento normal de las clulas lnfoides. su homeostasis o su muerte (apoptosis) parece tener un papel central en la gnesis de los linfomas.

Anomala t(14;18) (q32;q21)

La anomala 1{14:18) es la traslocacin ms comn de los linfomas de estirpe celular B. A nivel molecular, esta traslocacin da lugar a la yuxtaposicin del gen BCL2 con la regin J en el locus de las cadenas pesadas de inmunoblobulina (J) (Weiss, 1987; Cleary, 1985: Bakshi, 1985; Tsujimoto, 1985). Como consecuencia, el gen BCL2 queda bajo el control del elemento potenciador de IgH altamente activo, dando lugar a la sobreexpresin de la proteina bcl2. El gen producto de BCL2 es una molcula antiapopttica. capaz de abrogar el proceso normal de la muerte celular programada y proteger a las clulas d e una variedad de eventos citotxicos letales (Yang, 1996: Hockenberry. 1990). Las redisposiciones del gen BCL2 se encuentran en hasta un 85% de los linfomas de clulas foliculares centrales, aproximadamente en un 25% de los linfomas de clulas B grandes, y raramente en otros trastornos Imfoproliferativos B (Weiss, 1987: Horsman. 1995; Kouides. 1994). La estructura genmica parcial del locus del gen BCL2 se ilustra en la Figura 65-3A La mayor proporcin (60%) de puntos de rotura-fusin en el gen BCL2 se produce en un rea m u y pequea de aproximadamente 150 pares de bases (bp) en el segmento no codificador 3' del exn 3, conocido como regin principal de rotura (MBfl) (Cleary, 1985). Se produce un menor nmero de roturas (15% al 20%) en una segunda regin ms telomrica que se conoce c o m o la regin menor de acumulo (mcr) (Ngan. 1989; Cleary. 1986). Raramente, una regin 5' de BCL2 descrita como la "regin acumulo variante" (VCR) se redispone en las leucemias linfocticas crnicas de clulas B: normalmente, el locus VCR est afectado en traslocaciones con los genes de cadenas ligeras de las inmunoglobulinas (Dyer. 1994; Adachi, 1990). Las reorganizaciones del gen BCL2 pueden detectarse mediante tcnicas SBH utilizando sondas clonadas de los locus MBR y mcr (mostrado de forma esquemtica en la Figura 65-3A). aunque esto suele ser un mtodo laborioso (Horsman, 1995). La hibridacin fluorescente in situ (FISH) tambin ha resultado eficaz en la identificacin molecular citogentica del t(14:18) (Poetsch, 1996; Taniwaki, 1995). Sin embargo, y como resultado del acumulo relativamente agrupado de los puntos de rotura genmico en los locus MBR y mcr. se pueden emplear mtodos rpidos de PCR para detectar la mayora de las fusiones BCL2;J (Horsman. 1995; Uu, 1993; Ladanyi. 1992; Shibata, 1990; Pezella, 1989: Crescenzi, 1988: Lee, 1987). En la mayora de las situaciones, la regin
II

Significado y deteccin molecular de traslocaciones cromosmicas comunes asociadas al linfoma

La comprensin de la biologa de los linfomas no-Hodgkn se ha agrandado de forma sustancial con la identificacin de las traslocaciones cromosmicas recurrentes que se asocian con neoplasias en concreto (Tabla 65-3). La identificacin de estas anomalas genticas no solamente es muy til para el diagnstico (establecimiento de clonalidad, clasificacin de los linfomas), sino que a

Tabla 65-3

Traslocaciones c o m u n e s recurrentes en los linfomas n o - H o d g k i n Enfermedad FL MCL ALCL-T o nulo LCL, FL Burkilt SLL-P(LPL) Gen de fusin BLC-2/JH BLC-t/JH NPM-ALK BCL -6/otros c-MYC/lqH PAX5/JH Mecanismo Sobreexpresin de protena anii-apopltica Sobreexpresin de protena de ciclo celular (ciclma D1) Sobreexpresin de oncogn; proteina quimrica Eslado prolongado de centro germinal Sobreexpresin de oncogn Sobreexpresin del factor de transcripcin de clulas B Deteccin PCR, SBH. LD-PCR PCR. SBH RT-PCR, SBH LD-PCR PCR, SBH LD-PCR SBH, LD-PCR SBH Frecuencia* 85%-90% de FL 20%-30% LCL 70%-100% MCL 30%-40% ALCL 30%-40% LCL 5%-10% FL 100% 70%

Traslocacin I(14:18)(q32;q21) I(11:14)(pl3;q32) t(2;5)(p23;q35) 3(q27)locus I(8;14)(q24.q32) t(9;14)(p13:q32)

'La frecuencia indica los genes de lusin deteclados medame mtodos moleculares. PCR = reaccin en cadena de polimerasa; SBH = hibridacin Southern Blot; LD-PCR = PCR Oe larga distancia; FL = linloma lolicular; MCL = linloma de clulas del manto; ALCL = linfoma anaplsico de clulas grandes: LCL = linfoma de clulas grandes. SLL-P = linfoma Imlocitico pequeo-plasmaotoide (equivalente al linfoma linfoplasmocitoide |LPLJ).

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S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR

Figura 65-3. A. Esquema de la estrategia de deteccin para la reorganizacin del gen BCL2. La estructura g e n o m i c a parcial del gen 8CL2y su vecindad se m u e s t r a n en la tigura. La mayora de los puntos de rotura se producen en la regin pnncipal de roturas (MBR), localizada en el s e g m e n t o 3' (no codificante) del exn III del BCL2(recuadro gris claro grande). Una minora de las roturas BCL2se producen a ms de 20 kb aguas abajo del gen en la regin m e n o r de acmutos (mcr). Los recuadros s o m b r e a dos cortos ilustran el uso de sondas genmicas para la hibridacin Southern Blot Las flechas m u e s t r a n los c e b a d o r e s PCR BCL2 y m u e s t r a n un mtodo alternativo o e detectar fusiones del gen SC.2-J., (que no se m u e s t r a n a escala correcta) C o m o resultado del cmulo de puntos de rotura en los p u n t o st a n t o BCL2 M B Rc o m om c r , se pueden utilizar cebadores de consenso BCL2 para cada regin, combinados con un cebador de secuencia de consenso J., para detectar la mayora de las reorganizaciones BCL2 que s e producen en i o s linlomas (vase los detalles en el t e x t o ) B, I m a g e n representativa de una reorganizacin del gen BCL2 (lusn BCL2'V, delectada mediante PCR. Las calles A y D representan alcuotas del ADN de la m i s m am u e s tra del paciente. Una alcuota (A) se ha analizado en busca de una reorganizacin del locus BCL2 MBR, mientras que la otra (D) se ha estudiado en b u s c a de u n a roturafusin del locus SCL2 mcr. Las calles B y E muestran controles ADN-positivos para las fusiones MBR-J,, y mcr-J, respectivamente, y las calles C y F representan m u e s t r a s "en blanco" (sin ADN). Despus de la amplificacin PCR utilizando c e b a c o r e s adecuados M B Rym c r con un cebador de consenso J los productos P C R se analizaron en un gel de agarosa. se transfirieron a m e m b r a n a s de nailon y se d e t e c t a r o n utilizando sondas de secuencia especificas de regin M B R y BCR. El anlisis m u e s t r a claramente un producto de fusin MBR-J., en la m u e s t r a del paciente (calle A), confirmando la presencia molecular de la anomala t(14:18). El producto PCR d el a muestra del paciente difiere en longitud en comparacin con el control M B R p o s i t i v o (calle B). indicando que los puntos de rotura en la neoplasia individual son nicos al nivel ADN. ( T o m a d o de vlswanatha DS Detection of trie 1 ( 1 4 : 1 8 ) (q2l ;q32) associated BCL-2'JH gene lusion in non-Hodgkms l y m p h o m a . En Kiieen A [ed]: M o l e c u l a r Pathology Protocols Totowa, NJ. H u m a n a Press [septiembre 2000]. con autorizacin.)

interviniente de ADN genmico entre los cebadores opuestos es lo suficientemente corta como para permitir una amplificacin con xito. Esta estrategia se suele lograr utilizando cebadores oligonucleticos MBR y mcr colocados aguas arriba de las regiones de acmulos. en combinacin con un cebador J de consenso (Figura 65-3 A y B). De forma global, una tcnica habitual PCR como sta puede identificar aproximadamente los dos tercios de todas las fusiones del gen BCL2J., que surgen de t(l4:18) en los linfomas no-Hodgkin (Horsman, 1995). A diferencia de SDH, PCR se puede realizar a partir de material fijado y archivado, aunque el ADN extrado de fuentes embebidas en parafina puede estar comprometido debido a un entrecruzamiento y degradacin de las cadenas de alto peso molecular. Como resultado, la tasa de deteccin BCL2J para las fusiones de los locus tanto MBR como MCR es por lo general ms bajo en muestras de tejido incluidas en parafina en comparacin con las muestras de tejidos frescos o congelados. La aplicacin de la tcnica de ADN PCR de larga distancia (LD-PCR) para identificar y caracterizar ms la anatoma molecular de las fusiones BCL2/J,. ha sido descrita recientemente (Akasaka. 1998). Los anlisis de los productos LD-PCR han revelado puntos de rotura extendidos que se producen en la regin lejana 3 MBR y tambin 5' del locus mcr. correspondiendo en gran manera al resto de fusiones BCL2: que no se identifican mediante las tcnicas PCR normales.
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(FCC). tal y como se indic previamente (Segal. 1995). Sin embargo, la anomala BCL2/J,, es por lo general detectable mediante PCR en estos casos, proporcionando un marcador alternativo clonal para distinguir el linfoma folicular de una hiperplasia folicular alpica o florida pero benigna. Como corolario, el anlisis PCR para la fusin BCL2J,. se puede utilizar para diferenciar subtipos de linfoma no-Hodgkin de bajo grado de patrones morfolgicos potencialmente similares, c o m o el linfoma folicular frente a los lirfomas del m a n t o o del tipo de zona marginal. Las redisposiciones de los genes BCL2 estn m u y pero no absolutamente correlacionadas con la sobreexpresin de la protena bcl2. Por el contrario, es importante observar que muchos linlomas y leucemias de clulas B se asocian con una expresin desregulada BCL2 en ausencia de alteraciones genticas estructurales, presumiblemente debido a mecanismos epigenticos. La sobreexpresin de la proteina bcl2 parece en parte estar por debajo de la resistencia primaria del tumor a la quimioterapia (Gascoyne. 1997; Hill, 1996: Hermine. 1996). El uso de las lusiones BCLZX, c o m o marcadores clnales especficos del paciente para la valoracin cuantitativa de la enfermedad residual mnima ha sido descrito recientemente (Luthra, 1998a).

Anomala t(11;14) (q13;q32)

La t(11 ;14) est muy asociada con los linlomas de clulas del manto (MCL), aunque se ha encontrado raramente en casos de leucemia prolmfoctica, linfoma esplnco con "linfocitos vellosos (SLVL) y LLC. El 1(11 ;14) coloca al locus BCL1 adyacente al gen IgH, afectando casi siempre a la regin J . El gen de la ciclina D1 est localizado a una gran distancia telomrica de la mayora
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La identificacin de las redisposiciones del gen BCL2 en las proliferaciones linfoides neoplsicas es muy til en diferentes contextos clnicos, incluyendo el diagnstico y la subclasificacin de la enfermedad. Las redisposiciones clnales de los genes de las inmunogtobulinas con frecuencia no se detectan con las tcnicas normales PCR IgH en los linfomas de clulas centrofoliculares

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TCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y E T I C A S

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de puntos de rotura 11(q13)/flC. J. pero aun as es el blanco de desregulaciones transcripcionales o del gen IgH en las fusiones SCL J'J . La ciclina D1 es una protena de la fase precoz del ciclo celular requerida normalmente para la actividad de las cinasas 4 y 6 ciclina-dependientes (cdk4. tdk6). y este complejo promueve la progresin a travs de la transicin G,/S del ciclo celular en las clulas que proliferan. La sobreexpresin oncognica del tipo D1 de ciclinas parece asi tener una importante funcin en el desarrollo de MCL. Aunque los mecanismos moleculares de transformacin mediante la ciclina D1 desregulada no han sido bien aclarados hasta la fecha, este concepto se ve apoyado por el aumento de actividad mittica y el comportamiento clnico ms agresivo de MCL. en comparacin con otras neoplasias de Imfocitos pequeos B (Campo, 1999: Weisenburger, 1999; Argatoff, 1997: Samaha, 1998). La identificacin de t(H;14) o las reorganizaciones del gen BCL1 en la MCL es variable dependiente de la metodologa empleada y oscila entre menos de un 50% y un 100%. Independientemente, la expresin de la ciclina DI, bien mediante anlisis de ARNm o anlisis de protenas, est presente en ms de un 90% de los casos de MCL iRimokh. 1993: Oka. 1994; Bosch. 1994: De Boer. 1997; Yang. 1994; Zukerberg. 1995: De Boer. 1995: Alkan. 1995: Vasef. 1997: Soslow. 1997). La estrecha correlacin entre las anomalas SCLJ'ciclina D1 y las formas de MCL forman una faceta clave en el diagnstico de este linfoma.
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FISH han emergido posteriormente c o m o quiz la forma ms completa de resolver las fusiones BCLhJ,. en MCL (Coignel. 19%: Vaandrager. 1996). Clnicamente, MCL es una enfermedad agresiva, a pesar de tener la modologia de un "indolente" linfoma de linfocitos B pequeos (Campo. 1999: Argatoff. 1997; Samaha. 1998). De acuerdo con ello, el establecimiento correcto de este diagnstico es critico para el pronstico y la planificacin del tratamiento. Aunque la protena ciclina D1 puede detectarse mediante tcnicas inmunohistoquimicas (Yang, 1994; Zukerberg, 1995: De Boer, 1995: Alkan. 1995: Vasef. 1997; Soslow. 1997). los mtodos genticos moleculares para identificar las anomalas del locus BCL1 continan aplicndose ampliamente en esta situacin diagnstica. Entre las leucemias crnicas de clulas B, hay cada vez ms pruebas que indican que la expresin de la ciclina D1 en s misma puede s e r un determinante independente de mal pronstico (Levy, 1999), independientemente de sus clasificaciones morfolgicas especficas.

Anomalas que afectan al locus del gen 3(q27)

Recientemente se han identificado linfomas con aberraciones citogeneticas del cromosoma 3(q27) y del gen BCL6. A diferencia de otras traslocaciones asociadas a los linlomas. las fusiones del gen BCL6 pueden involucrar a un gran nmero de genes compaeros, muchos de los cuales no estn en relacin con los genes receptores de antigenos (Ohno, 1997: Chen. 1998; Ohshima. 1997). Un pequeo nmero de casos mostrar una clsica anomala t(3;14) q27;q32). que une al gen BCL6 con el locus IgH. mientras que otros pueden involucrar a los genes de las cadenas ligeras de inmunoglobulina. La aparente "promiscuidad' de las traslocaciones del gen BCL6 ha conducido al concepto de sustitucin promotora heterloga como mecanismo de la desregulacion de BCL6y la sobreproduccin de la correspondiente proteina bcl6 (Chen. 1998). La expresin de la proteina bcl6 se detecta en las clulas normales de los centros germinales. Modelos en ratn de "atontamiento" del gen BCL6 han mostrado que este gen es vital para la formacin del centro germinal normal y para las respuestas normales de anticuerpos dependientes de clulas T (Ye, 1997: Dent, 1997). Adems. BCL6 parece necesario para el control de las respuestas inflamatorias de tipo Th2 inducidas por c i t o c m a s mediante una regulacin normal a la baja de la expresin de una clase de molculas transductoras de seal (las protenas Stat) (Ye, 1997: Dent, 1997). De forma significativa, se han detectado reorganizaciones del gen BCL6en los linfomas asociados a los centros germinales, principalmente los tipos de clulas grandes (30% al 40%) o de clulas de los centros foliculares (10% al 15) (Ohno. 1997: Chen. 1998: Ohshima. 1997: Otsuki. 1995). Adems, una gran proporcin de estos linfomas muestran hipermutaciones somticas de la re-

El locus gentico BCL comprende una gran regin de la banda cromosmica 11(q13) (Fig. 65-4). Aproximadamente la mitad de las roturas BCL1 se producen en un rea bien definida, conocida c o m o la regin del acumulo principal de traslocaciones {MTC) (Williams, 1993a: Williams. 1991) El MTC est localizado a casi 1 2 C kilobases (kb) hacia el centrmero del gen de la ciclina DI. Se han definido otros puntos de rotura mediante anlisis Southern Blot que son o bien ms distales al MTC o localizadas en la regin 5' inmediata del gen de la ciclina D1 (Williams, 1991.1993b). El mtodo SBH, utilizando una nica sonda de la regin MTC, detectar casi todas las reorganizaciones de BCL1 del punto de rotura MTC, que suponen el 50% de todos los casos (Williams. 1993a). Con el uso de sondas genmicas mltiples, se puede tambin identificar el nmero ms pequeo de roturas que no estn en relacin con MTC. aumentando la tasa de deteccin SBH hasta un 70% (Williams, 1991). Sin embargo, esta complejidad tcnica, asi como la falta de disponibilidad habitual de sondas para mltiples regiones BCL 1. hace muy poco prctico SBH con fines diagnsticos sistemticos. Se ha utilizado con xito la tcnica PCR para identificar el subconiunto de fusiones BCL f/J que se producen en la estrechamente agrupada regin MTC. dando lugar a una deteccin mediante PCR de las reorganizaciones BCL1 de entre el 40% y el 50% (Pinyol. 1996). De forma notable, la gran regin de rotura formada por el locus BCL 1 presenta asi sustancales difi cultades para estos mtodos de diagnstico molecular. Los anlisis basados en
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Figura 65-4. E s q u e m a del locus BCL1 y de la estrategia para deteccin mediante PCR de las reorganizaciones SCL-IgH. La organizacin del locus BCL1 se muestra en el panel superior, con su orientacin centromrica Icen) y telomrica (tel) El gen de la ciclina D1 es el objetivo de la desregulacin por las reorganizaciones de la regin BCL 1 en el linloma de clulas del m a n t o (MCL), aunque la mayora de las roturas ocurren m u y centromncas en relacin con el propio gen. Los recuadros cortos en color rojo claro muestran dos sondas habituales para la deteccin de las reorganizaciones de la regin BCL1. La mayora de las roturas BCL1 se producen en la regin principal de a c u m u l o de traslocaciones (MTC). suponiendo aproximadamente un 50% de los casos en el MCL. La organizacin genmica de la regin MTC de la fusin BCL1-J., que surgen de t(H :14) se muestran en el panel interior. Las flechas verticales cortas m o i c a n el rea de cmulos de roturas M T C Debido al acumulo relativamente denso en este punto PCR puede detectar la mayora de las fusiones BCL1-J en relacin con MTC (vase el t e x t o para detalles). Las localizaciones relativas de los cebadores para la PCR BC(.;-J estn indicadas p o r flechas horizontales (las flechas de gran tamao indican un nico cebador de consenso para la secuencia JH).
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PATOLOGA MOLECULAR

gin reguladora 5' de BCL6, de lorma independenle de la presencia o ausencia de anomalas estructurales delectables del gen (Migliazza. 1995). El significado de la alteracin mutacional sin reorganizacin gentica est poco claro, dado que las clulas normales de memoria B (con linea germinal BCL6). muestran tambin este hallazgo, sugiriendo que las mutaciones somticas BCL6 se producen durante el proceso de activacin normal de los centros germinales (Shen. 1998). Aun as. la sobreexpresin de la protena bcl6 parece estar integralmente en relacin con la patognesis de los linlomas del tipo centro germinal, y esta situacin se puede inducir mediante la traslocacin de BCL6. o mediante otros mecanismos sin una reorganizacin del propio gen BCL6 (Allman. 1996). De acuerdo con ello, la presencia de protena bcl6 se observa en la gran mayora de linfomas de clulas grandes, linfomas foliculares y linfomas de Burkitt (Onizuka. 1995: Carbone. 1997; Flenghi, 1996: Pittaluga. 1996: Falim. 1997; Cattoretti, 1995). La deteccin de las reorganizaciones del gen BCL6 que se producen en los casos traslocados se puede conseguir mediante varios mtodos. Se ha utilizado ampliamente el anlisis SBH. dado que la mayora de estos casos muestran un cmulo de puntos de rotura que cubren la regin prxima 5'. el primer exn no codificante y el mtrn uno del gen BCL6 (Lo Coco. 1994; Oflit, 1994; Lee. 1987). Las aplicaciones ms recientes comprenden PCR para ADN de larga distancia [especficamente para la anomala t(3:14)] y tcnicas FISH (Akasaka, 1996; Ueda, 1997). El significado clnico de las anomalas BCL6 en el linfoma sigue hasta la fecha sin entenderse del todo. La desregulacin de BCL6 en el linloma indica un papel central en la patognesis de la enfermedad, presumiblemente por el atrapamiento de clulas linfoides en un estado de centro germinal, creando as un ambiente para la produccin de otros desarreglos genticos. Aunque la protena BC.6" est ampliamente expresada en las neoplasias linfoides asociadas a los centros germinales, la relevancia clnica del estado del gen BCL6 sigue siendo controvertida. Se ha comunicado una mayor frecuencia de reorganizaciones del gen BCL6 en los linfomas extranodales de clulas grandes (Liang, 1997: Offit. 1994), y un estudio ha sugerido un mejor pronstico para los linfomas de clulas grandes con reorganizacin del gen BCL6 (Offit, 1994). Sin embargo, la resolucin definitiva del significado clnico de las anomalas del gen 8CL6en el linfoma sigue necesitando estudios adicionales a gran escala.

A diferencia de ello, el tipo espordico de BL demuestra roturas C-MYC dentro de la regin 5' del gen, y se asocian tipicamente con fusin con la regin de cambio de inmunoglobulina. Estos datos indican que los fenmenos de traslocacin que afectan a C-MYC en estas variantes BL se producen en fases ligeramente diferentes en una clula B inmadura. Clnicamente, sin embargo, estas diferencias parecen ser insignificantes. L a s reorganizaciones del locus C-MYC o la presencia de 1(8:14) pueden detectarse mediante anlisis SDH. FISH. o PCR de larga distancia (Falini. 1997; Cattoretti. 1995, V a n Kneken. 1992: Siebert. 1998; Akasaka, 1998). Prcticamente, sin embargo, la presentacin clnica caracterstica y las caractersticas patolgicas de BL son con mayor frecuencia suficientes para el diagnstico, y la confirmacin molecular o citogentica de la afectacin C-MYC slo es necesaria para aquellos casos con una enfermedad leucmica primaria (LAL-L3) o en casos con caracteristicas no habituales. La presencia de reorganizacin del gen C-MYC en oros linlomas. como en el contexto de una transformacin secundaria o inmunodeficiencia, es por lo general indicativa de un comportamiento biolgico muy agresivo.

Anomala t(2;5) (p23;q35)

El linloma anaplsico de clulas grandes (ALCL) es un subtipo recientemente reconocido de linfoma no-Hodgkm que puede presentarse c o m o una enfermedad cutnea primaria, o ms comnmente como una forma sistmica que afecta a ganglios linfticos, visceras y piel. Este tumor se clasific con frecuencia en el pasado como una enfermedad Hodgkin de deplecion linfoctica. como una histiocitosis maligna, o incluso como una enlermedad maligna metastsica. Una caracterstica fenotipica en casi todos los casos de ALCL es la presencia del antgeno CD30 ("Ki-1"). un marcador de aclivacin y miembro de la familia de los factores de necrosis tumoral (Smith. 1993). Normalmente. ALCL es de estirpe de clulas T. aunque algunos tumores no expresan marcadores de estirpe asociada a clulas B o T (clulas "nulas"). Una minora de tumores son fenotipica o genticamente de tipo celular B. Se ha generado un sustancial inters en ALCL con el hallazgo de una anomala recurrente 1(2:5) en una proporcin significativa de casos de enfermedad sistmica (Rimokh. 1989: Masn, 1990: Kaneko, 1989). A nivel molecular, esta traslocacin yuxtapone el gen NPM con un nuevo gen lamado ALK (cinasa anaplsica de linfoma). El producto normal del gen NPM. llamado nucleofosmina. es una fosfoprotena nuclear de expresin ubicua que se cree es importante en el ensamblaje de los ribosomas. El gen ALK codifica una tirosina cinasa previamente desconocida que no se expresa normalmente en las clulas linfoides (Shiota, 1994a). Como resultado de la fusin del gen NPM-ALK. la actividad de tirosina cinasa de ALK queda sin regular, contribuyendo de lorma ostensible a la gnesis de los linlomas. L a fusin NPM-ALK difiere estructuralmenle de otras fusiones genticas asociadas a los linlomas, en cuanto a que se produce una protena y ARNm quimricos. An asi, la sobreexpresin del gen ALK restringido normalmente parece ser el principal mecanismo involucrado en la transformacin. Los puntos de rotura genmicos en casos de ALCL afectan de forma uniforme a las mismas regiones de intrones de ambos genes, dando lugar a la generacin de un ARNm de fusin constante NPM-ALK. Esta situacin h a permitido el uso de RT-PCR para detectar la transcripcin de fusin con una alta especificidad y sensibilidad (Elmberger, 1995: Wellmann. 1995: Ladanyi, 1994; Yee. 1996:Weiss. 1995; Downmg. 1995;Lamant. 1996). Adems, y dado que los intrones afectados son relativamente cortos, tambin se ha empleado con xito el LD-PCR genmico para identificar la anomala NPM-ALK (Ladanyi, 1996: Sarris. 1996: Lulhra. 1988b). Este ltimo mtodo necesita un ADN de alto peso molecular, pero elimina la necesidad del aislamiento del ARN y de la transcripcin inversa. Otras tcnicas, incluyendo el anlisis mediante sondas FISH y el SBH del locus NPM. tambin han sido descritas (Bullnch. 1994; MaIhew. 1997). Dado que la citogentica clsica es tcnicamente exigente y que se lleva a cabo con poca frecuencia en casos de ALCL, estos mtodos moleculares han servido para simplificar e incrementar la tasa de deteccin de esta lesin gentica. Clnicamente, los primeros dalos con respecto a ALCL indicaron una relacin entre la presencia de \{2:5)i NPM-ALK. la edad ms joven, y un pronostico favorable (Kadin. 1986: Nakamura. 1991; Bitter, 1990). De enlre subconjuntos slidamente definidos de ALCL (esto es, CD30+, estirpe T, morfologa

Anomalas que afectan al locus del gen 8(q24)

La alteracin gentica del locus C-MYC se ha asociado clsicamente con el linfoma de Burkitt (y con la leucemia Imfoblstica aguda, tipo LAL-L3): sin embargo, este gen tambin se ha implicado en la patognesis de tres tumores, incluyendo las transformaciones de alto grado (secundarias) de linfomas indolentes, linfomas asociados al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y ocasionales trastornos linfoproliferativos agresivos postransplante. Con mayor frecuencia, el gen C-MYC se trasloca al locus IgH por la anomala t(8;14). En otros casos. C-MYC se puede hacer adyacente a los genes de cadenas ligeras K- [2(pl2)J o X [22(q11)) (Croce, 1985). En cada uno de estos casos, C-MYC se coloca bajo la fuerte influencia transcripcional de potencador de las inmunoglobulmas. El C-MYC es normalmente un gen altamente regulado que est involucrado en la respuesta nuclear "precoz" a las seales citoplasmicas mductoras de crecimiento. El producto del gen C-MYC lorma un complejo que se une al ADN con un compaero proteinco. Max. para iniciar la transcripcin de varios genes situados aguas abajo y que son necesarios para su entrada en el ciclo celular y en la proliferacin celular (Blackwood, 1991). Max est a su vez regulado por dimerizacin con otras protenas tales como Mad. y estos complejos alternados actan para reprimir la actividad de transcripcin (Ayer, 1993,1995; Zervos. 1993). Como resultado de la traslocacin de C-MYCen el linfoma, el control normal de C-MYC se ve abrogado por el gen IgH. Esto a su vez da lugar a una sobreproduccin no supervisada de c-Myc. dando lugar a un aumento de los dimeros c-Myc M a x y a la transactivacin de mltiples genes objetivo cognatos. resultando en ltima instancia en una proliferacin celular no controlada (Amati. 1993). Los linfomas de Burkitt y LAL-L3 figuran entre las neoplasias humanas ms agresivas y de divisin ms rpida. La anatoma molecular de los puntos de rotura de la regin C-MYC ha sido bien estudiada en el linfoma de Burkitt (BL) con el t(8:14) (Neri. 1988; Yano, 1992). En el BL endmico, los punios de rotura C-MYC se producen bastante aguas arriba del gen y afectan principalmente al locus IgH JH en 14(q32).

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TCNICAS M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y T I C A S

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caracterstica), la fusin NPM-ALK se detecta entre un 50% y un 60% de los casos (Chan. 1999: Wellmann, 1995; Elmberger, 1995; Downing, 1995: Lamant. 1996). Sin embargo, las estimaciones acerca de la frecuencia de t2:5i NPM-ALK en la ALCL han variado de forma considerable, debido a diferencias en el mtodo de deteccin y en la definicin exacta de la enfermedad. Por ejemplo, aunque la gran mayora de los casos de ALCL positivos para 1(2:5). NPM-ALK son de fenotipo celular T o nulo", tambin se pueden encontrar casos ocasionales de estirpe B (Downing. 1995; Weisenburger, 1996: Hutchinson. 1997). De forma anloga, el t(2;5) o la fusin NPM-ALK se ha identificado en casos raros de ALCL que carece de la expresin de CD30 (Hutchinson. 1997) y de forma infrecuente entre linfomas de clulas grandes de estirpe celular B o T sin caractersticas otolgicas anaplsticas (Benharroch, 1998). Se han conseguido avances en los esfuerzos para definir mejor un grupo clnicamente relevante de ALCL con la aplicacin de anticuerpos especficos que detectan el segmento ALK en la protena de fusin (Benharroch, 1998: Pittaluga, 1997: Nakagawa. 1997: Shiota, 1994b; Pileri, 1997; Pulford. 1997). La presencia de proteina ALK en la ALCL se correlaciona estrechamente con la fusin NPM-ALK Es ms, las neoplasias ALK-positivas parecen asociarse con un resultado clnico muy favorable, en comparacin con aquellos tumores que carecen de esle marcador (Shiota. 1995: Falini. 1999; Gascoyne, 1999). Dado que la deteccin de la fraccin ALK se puede conseguir por mtodos inmunohisloqumicos, este mtodo puede servir como una alternativa uniforme y fcil en la evaluacin molecular, y es capaz de identificar casos raros de linfoma con sobreexpresin ALK debido a fenmenos genticos alternativos [por ejemplo. t(1:2) (q25:p23), nv(2)(p23)(q35)] (Masn, 1998: Wlodarska. 1998). Por ltimo, la identificacin de la anomala gentica \{2.bv NPM-ALK. o la expresin de la proteina ALK, son tiles para distinguir casos de ALCL de la enfermedad de Hodgkin, o de los tumores epiteliales indiferenciados (Herbst, 1995; Elmberger, 1995; Wellmann. 1995: Ladanyi. 1994: Yee, 1996: Weiss. 1995: Sarris. 1996). Sigue siendo controvertida la aparicin de \{2:5);NPM-ALK en la ALCL cutnea primaria (Wood. 1996; DeCoteau, 1996; Beylot-Barry. 1996).

tracin de transcripcin residual de una fusin EML-RARu despus del tratamiento se ha asociado con un riesgo muy elevado de recidiva, normalmente en el plazo de meses (Diverio, 1994,1998). A diferencia de ello, los pacientes con una AML t(8;21 (-positiva pueden lograr remisiones clnicas muy duraderas, a pesar de la presencia de un ARNm de fusin /-ErOdetectable a bajos niveles. Adems, la anomala AML1-ETO puede detectarse en individuos tratados con xito de forma independiente del tipo de terapia empleado (quimioterapia o trasplante de mdula sea) (Kusec. 1994: Jurlander. 1996) Por ltimo, en el caso de LMC, va emergiendo un cuadro ms complejo, estando en relacin la importancia pronostica del estado MRD con el intervalo despus del tratamiento (por lo general un trasplante de mdula sea). Los pacientes LMC con una conversin "precoz" a un estado PCR positivo para BCR-ABL (esto es. entre 6 y 12 meses), o aquellos que manifiestan una positividad persistente de la PCR a lo largo del tiempo, parecen tener un m a y o r riesgo de recidiva en un estudio de gran tamao: sin embargo, la previsin de los casos individuales es difcil y se puede modificar por factores adicionales en relacin con el tratamiento (como el tipo de trasplante o la enfermedad de injerto contra husped) (Radich. 1995). A pesar de la variabilidad en el valor prediclivo positivo para la recidiva de la enfermedad utilizando deteccin molecular de MRD en estas diferentes leucemias mieloides, como regla general, la positividad persistente de la PCR en mediciones seriadas se suele correlacionar con un mayor riesgo de recidiva. Es importante tener en cuenta que la ausencia de una enfermedad detectable mediante PCR se asocia fuertemente con un estado de remisin clnica. En la leucemia linfoblstica aguda peditrica existen cada vez ms pruebas que sugieren que la vigilancia de la MRD puede tener un papel clave en la identificacin de pacientes con un elevado potencial de recada. A diferencia de las leucemias mieloides. las reorganizaciones tumor-especificas de los genes de receptores de clulas T y de inmunoglobulinas (IgH) se han utilizado como marcadores clnales de leucemia linfoblstica residual. La enfermedad residual al final del tratamiento de induccin y a intervalos posteriores ha resultado correlacionarse con un peor resultado en la mayora de los estudios (Evan, 1998; Gruhn, 1998; Wasserman, 1992: Nizet. 1991; Jacquy, 1997; Steenbergen, 1995: Goulden, 1998). Recientes esludios amplios sobre la LAL peditrica son significativos en este aspecto, demostrando que los niveles de MRD leucmica equivalentes a aproximadamente una de cada 100 a 1.000 clulas son fuertemente predictivas de recidiva de la enfermedad a final del tratamiento de induccin y tambin a intervalos posteriores (Cave. 1998: Van Dongen. 1998). Adems, los anlisis senados de PCR a intervalos mltiples parecen aadir valor pronstico, connotando la positividad persistente de un mayor riesgo de recidiva. De nuevo, aquellos pacientes con una PCR persistentemente negativa en todos los intervalos se asocian con un estado de remisin continuada y un bajo riesgo de fracaso teraputico. Adems de estos hallazgos, otros investigadores, utilizando tcnicas PCR altamente sensibles, han sido capaces de demostrar niveles extremadamente bajos de MRD persistente en pacientes que mantienen una remisin clnica al final del tratamiento e incluso varios meses despus (Roberts. 1997). Estos datos sugieren en conjunto que las cantidades diminutas pero cuantiticables de LAL residual en los pacientes peditricos pueden ser una caracterstica constante a pesar de un tratamiento satisfactorio, pero el nivel relativo de MRD y el comportamiento de las clulas leucmicas residuales estn definitivamente en correlacin con el riesgo de un fracaso terapui . La capacidad de resolver cantidades cada vez mas pequeas de objetivos moleculares genticos especilicos ha proporcionado nuevas perspectivas a la biologa de la enfermedad, as como algunos potenciales fallos. La deteccin de las transcripciones de la fusin t(8;21).'AM/.f-ETO o las redisposiciones clnales de los genes receptores de antigenos en los supervivientes a largo plazo de LAM y LAL peditricas, respectivamente, indica claramente que las clulas tumorales residuales pueden residir en un estado "durmiente' o n o proliferativo. La distincin de estas clulas de las clulas tumorales con ms agresividad biolgica no es posible con estos anlisis moleculares, y la informacin clnica relevante puede ser poco concluyeme o verse oscurecida. Por ltimo, estudios recientes han demostrado la existencia en la sangre o en los tejidos de individuos sanos de genes de fusin asociados a la traslocacin de leucemia o linfoma, sugiriendo que la recombinacin gentica aberrante de bajo nivel puede ser un fenmeno relativamente comn, Los ejemplos comprenden la deteccin del t(9;22)/8Cfi-,48L y de t(14;18)/8CL?-/(jH(Biernaux,

USO DE LOS MARCADORES MOLECULARES PARA EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD RESIDUAL

La aparicin de tcnicas de biologa molecular para la deteccin de redisposiciones de los genes receptores de antigenos y de las traslocaciones cromosmicas ha proporcionado a su vez unas oportunidades especficas y sensibles para medir el riesgo de enfermedad tumoral despus de las intervenciones teraputicas de las leucemias y de los linfomas. La valoracin tradicional en esta situacin se ha limitado en gran manera al examen microscpico de puntos tisulares tales como la mdula sea. Sin embargo, las tcnicas PCR se pueden optimizar para la resolucin altamente sensible de cantidades submicroscpicas de enfermedad hemalopoytica, normalmente en las cifras de una clula anmala por cada 10-10 clulas benignas. La aplicacin de tecnologas basadas en la PCR para la deteccin de enfermedad residual mnima (MRD) ha permitido un seguimiento muy preciso de la "emtica" del tumor, adems de presentar una plyade de nuevas preguntas y precauciones. Los marcadores MRD comprenden los genes de fusin asociados a la leucemia o al linfoma, con las reorganizaciones clnales de los genes receptores de antigenos en los tumores lnfoides. Para la deteccin de MRD se han utilizado tanto tcnicas ARN (RT) PCR como ADN-PCR. Las tcnicas pueden dar lugar a una medicin cualitativa, estableciendo la presencia o ausencia de un marcador en particular a cierto nivel "umbral" de sensibilidad, o pueden elaborarse para conseguir varios grados de cuantificacin de las molculas diana. El significado clnico de MRD en las leucemias ha llegado a ser un lema importante y cada vez ms estudiado. Entre las leucemias mieloides. muchos subtipos estn caracterizados por genes de fusin con asociacn-traslocacin recurrente que sirven como marcadores peculiares moleculares de enfermedad. Los ejemplos ms comunes comprenden la leucemia promieloctica aguda (LPA) con la anomala 1(15; 17)'PML-flAflu, la leucemia mieloide aguda con la fusin t(8;21 )/AM. 1-ETO. y la LMC. asociada con la anomala t(9;22);BCR-ABL. Los datos generados a partir de los estudios MRD en estas leucemias han resultado ser intrigantes. Para los pacientes LPA, la demos-

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S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR

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Un desalio clave para la valoracin MRD es. por tanto, conseguir una sensibilidad tcnica suficiente para conseguir datos pronsticos significativos, a la vez que se minimiza el riesgo de resultados falsamente positivos que surjan de contaminacin de las muestras, o la potencial deteccin de eventos raros en clulas "durmientes'.

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T C N I C A S M O L E C U L A R E S EN EL D I A G N S T I C O DE N E O P L A S I A S H E M A T O P O Y T I C A S

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CAPTULO 65

TCNICAS MOLECULARES EN EL DIAGNSTICO DE NEOPLASIAS HEMATOPOYTICAS

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C A P T U L O

66

Diagnstico molecular de las enfermedades genticas

Wayne W. Grody, M.D., Ph.D. Walter W. Noll, M.D.

ELECCIN DE TCNICAS ELECCIN DE APLICACIONES CONCEPTOS ESPECIALES NICOS DE LOS TRASTORNOS MOLECULARES GENTICOS Heterogeneidad molecular Penetrancia variable y expresividad Entrecruzamiento Disomia uniparental Impronta Anticipacin Influencias epigenticas y herencia no mendeliana Frecuencias allicas y exploraciones masivas de la poblacin

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EJEMPLOS ESPECFICOS DE ENFERMEDAD Fibrosis quistica Distrofia muscular de Duchenne

1377

Anemia de clulas falciformes y otras hemoglobinopatas 1376 Trombofilias hereditarias Trastornos por expansin de repeticin de trinucletido Sndromes de Prader-Willi y de Angelman Cnceres familiares Hemocromatosis Trastornos del ADN mitocondrial FUTURO DEL DIAGNSTICO MOLECULAR BIBLIOGRAFA 1387 1388

L a gentica molecular diagnostica es una de las reas ms recientes y revolucionanas de la medicina de laboratorio y mantiene la esperanza de convertirse en la herramienta de diagnstico y cribado ms poderosa del siglo XXI. Con el ritmo trepidante del descubrimiento de nuevos genes patolgicos bajo los auspicios del Proyecto Genoma Humano (Human Genome Project) y el reconocimiento de que todas las enfermedades, incluyendo neoplasias y enfermedades infecciosas, tienen algn componente gentico, la utilidad de esta subespecialidad slo puede continuar expandindose. Por otra parte, su capacidad nica para diagnosticar enfermedad, tanto prenatal como presintomticamente, le confiere un papel primario en la medicina preventiva, un foco de urgencia en la era actual de contencin en el coste de los cuidados mdicos. Adems, la gentica molecular diagnstica conduce a la gentica molecular teraputica, ya que. esencialmente, las mismas secuencias gnicas normales usadas para detectar defectos genticos moleculares por hibridacin con cido desoxirribonucleico (ADN) pueden ser usadas para corregir tales defectos mediante terapia de sustitucin gnica. Puesto que esta ltima actividad incrementa su mbito y rango de utilidad, llegar a estar incluso ms entrelazada con las actividades del laboratorio de diagnstico molecular, sobre el que recaer la responsabilidad de la monitorizacin adecuada de la insercin y expresin del gen sustituido. Con todo, dicho progreso no se encuentra frenado por obstculos apreciables. Adems de la considerable solisticacin tcnica y dificultad de estos procedimientos, estos avances se ven envueltos inextricablemente con ciertos dilemas ticos espinosos. La diseccin de la sea constitucional ms fundamental de un paciente y los defectos innatos contenidos en ella, aumenta la problemtica acerca de la discriminacin gentica, estigmatizacin, diferencias tnicas, privacidad, consentimiento informado y confidencialidad. Ya que a nivel gentico molecular todo se convierte en una "condicin preexistente", la misma definicin de asegurabilidad puede necesitar ser revisada; ya existen sujetos sanos que han perdido la cobertura del seguro por haber encontrado ser portadores de una mutacin, incluso una recesiva (Billings, 1992). El descubrimiento de cualquier muta-

cin hereditaria en un individuo tiene unas implicaciones ms prolundas, q u e sobrepasan al paciente mismo que solicito la prueba de ADN (el probando"), extendindose al resto de miembros de la familia de esa persona, ninguno de tos cuales pudo haber consentido la exploracin o revelacin de este tipo de informacin. De hecho, con la nueva capacidad de las pruebas de ADN adquirida gracias a las tcnicas de amplificacin, como la reaccin en c a d e n a por la polimerasa (PCR). es muy fcil realizar anlisis genticos sin el consentimiento del paciente o incluso sin su conocimiento, ya que las pruebas se pueden h a c e r en diminutas porciones de tejido o muestras de lquidos obtenidas para otros propsitos no relacionados. El diagnstico prenatal y. p o r extensin, la deteccin precoz preconcebida de portadores genticos en las parejas, estn al da en el apasionado debate tico y religioso sobre el aborto. La terapia gnica. a pesar del consenso general de que debera dirigirse slo a clulas diana somticas, ms que a la linea germinal (e incluso este concepto est comenzado a cambiar), aumenta el espectro de la eugenesia entre los que no recuerdan pocas pasadas en que tales conceptos no fueron slo aceptados sino activamente defendidos. Gran parte de la gentica molecular diagnstica implica la evaluacin del riesgo de frecuencia o recurrencia de un trastorno en un individuo o familia. P o r razones que se describen ms detalladamente en este captulo, los resultados obtenidos en la prueba a menudo no se expresan en trminos de una concentracin numrica o una respuesta de si o no, sino como una probabilidad. El modo exacto y significativo de abordar estas complejas dudas en pacientes e incluso en los mdicos solicitantes, puede ser muy difcil, si no imposible. Por esta razn, y debido a las serias implicaciones ticas de estas pruebas, c o m o se describi antes, esta rea de la medicina de laboratorio, quiz ms que cualquier otra, requiere una estrecha comunicacin entre el laboratorio y el clnico solicitante o el consejero gentico. De hecho, muchas de estas pruebas deberan realizarse nicamente a peticin de un mdico genetista o un consejero gentico, ya que son los especialistas mejor cualificados para evaluar la idoneidad de la prueba y explicar los resultados al paciente. U n a estrecha y oportuna comunica-

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D I A G N S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N T I C A S

1373

cin asegurar que los pacientes obtengan el mayor beneficio y el menor riesgo de desvntalas de esta poderosa tecnologa.

ELECCIN DE TCNICAS
Con tantos genes, locus y mecanismos mutacionales conocidos de enfermedades genticas, la gentica molecular diagnstica se beneficia de la amplia gama disponible de tcnicas modernas de biologa molecular. stas incluyen transferencia Southern (Southern blotting). transferencia en mancha (do/ blotting). PCR. hibndacin m situ con fluorescencia (FISH). secuenciacin de ADN, polimorfismo conformacional de ADN monocatenario y otras. La eleccin de la tcnica a usar en un caso particular depender, en gran medida, del conocimiento actual del gen o genes asociados con la enfermedad en cuestin y su grado de heterogeneidad molecular. El primer criterio divide a casi todas las enfermedades genticas en dos categoras: aquellas en las que se ha aislado el gen causante y aquellas en las que no. La primera categora a menudo puede abordarse mediante anlisis direclo del gen o la mutacin: la segunda slo pueden enfocarse mediante anlisis de ligamiento, utilizando marcadores de ADN polimrfico cercanos en el mismo cromosoma, con tal de que se haya trazado el mapa aproximado de la enfermedad. El segundo concepto, la heterogeneidad, se refiere al nmero de genes diferentes o a la variedad de mutaciones dentro de un solo gen, que pueden causar la misma enfermedad. Cuanto mayor es la heterogeneidad, la prueba de ADN se convierte en ms difcil, laboriosa y cara (y ms compleja para informar los resultados). Las mutaciones responsables de algunos trastornos son tan numerosas y se extienden a travs de genes tan grandes que la deteccin directa no es factible, y se debe recurrir al anlisis de ligamiento aunque el gen causante haya sido identificado y clonado. En otros trastornos, una o ms mutaciones pueden ser tan frecuentes en determinadas poblaciones tnicas que su deteccin precoz puede proporcionar una prueba de suficiente rendimiento que justifique su enfoque directo, aunque se ignoren bastantes mutaciones informadas menos frecuentes. Para hacer tales pruebas practicas y con un coste razonable, se han ideado ciertas estrategias de multiplexacin para la deteccin simultnea de mutaciones, como se describe a continuacin. Con todo, el lector debera tener en cuenta que todo esto implica cierto compromiso en cuanto a la sensibilidad total de la prueba. Efectivamente, el campo de la gentica molecular diagnstica tolera, por necesidad, ciertas pruebas de deteccin precoz con sensibilidades notablemente por debajo de las que se consideraran aceptables en otros campos del laboratorio clnico. La decisin de justo cuan bajo debera ser el valor discriminante aceptable de sensibilidad, se convierte en gran medida en una decisin tica. La mayora de los genetistas han defendido que. al menos para las pruebas de deteccin precoz, los beneficios potenciales para la salud pblica de ofrecer una prueba de sensibilidad subptima superan los argumentos en contra de negarla, con tal de que se proporcionase una suficiente educacin y consejo a los pacientes de modo que entiendan el riesgo residual inherente en un resultado negativo de la prueba. Los anlisis directos de mutaciones se han simplificado de modo incalculable con la llegada de la PCR. Mediante la eleccin adecuada de cebadores [primers), esta tcnica permite al laboratorio acercarse a la mutacin precisa de inters o a un "punto caliente" (hot spot) dentro de un gen que contiene varias secuencias de mutacin posibles, usando cantidades m u y pequeas de muestra. Es valiosa para la deteccin de mutaciones puntuales y microdeleciones que normalmente pasan inadvertidas en una tcnica de transferencia Southern, a menos que se encuentren casualmente dentro de una secuencia de reconocimiento de la enzima de restriccin que est siendo utilizada. Una vez que se amplifica la regin que contiene la mutacin sospechada, se puede analizar mediante electroforesis en gel. secuenciacin o hibridacin con sondas de ADN. Ante una delecn que se sospecha reduce la longitud del producto amplificado {amplicn), ser suficiente la separacin molecular exacta de los productos de la PCR mediante electroforesis y tincin con bromuro de etidio (Fig. 66-1), De un modo alternativo, si la delecn o mutacin puntual rompe (o crea) una secuencia de escisin de una endonucleasa. se puede detectar por anlisis electrofortico de los productos de la PCR digeridos con esa enzima (Fig. 66-2). Otra opcin es hibridar los productos de la PCR con sondas oligonucleotdicas especificas de un alelo (ASO), fragmentos cortos de ADN que son complementarios a cualquiera de

Figura 66-1. Ejemplo de separacin electrolorlica de productos de PCR para la deteccin de mutacin. En este caso, las muestras de ADN del paciente se amplificaron usando cebadores que llanquean el codn 508 del gen de la librosis quistica CFTR), produciendo un solo fragmento de 160 bp procedente de individuos normales (caniles 1. 2. 4. 5 y 6). un solo fragmento de 1 5 7 bp procedente de un paciente homocigoto para la delecn trmucieolidica \F508 (carnl 7) y ambos fragmentos junto con una banda heterodplex (H) procedentes de sujetos heteroagotos (carriles 3, 8 y 9).

las secuencias diana normales o mulantes. Si la hibridacin, normalmente en forma de transferencia en mancha, se realiza ba|o condiciones suficientemente rigurosas, el ADN de la diana que contiene la mutacin hibridar slo con la sonda mutante y viceversa para el ADN de la diana normal. Para un cribado ms eficiente pueden mezclarse juntas sondas para varias mutaciones poco frecuentes (Fig. 66-3); mediante la "PCR multiplex", se pueden amplificar juntos varios puntos calientes de la mutacin. Como una variacin de este enfoque, muchas sondas allicas se pueden extender en un soporte slido para su posterior hibridacin con el ADN de la muestra (o los productos amplilicados). en forma de una "micromatriz" (microarray). Desde hace poco estn disponibles ciertos equipos de reactivos comerciales e instrumentos que detectan mutaciones puntuales por hibridacin diferencial con sondas/quencne/' o por electroforesis capilar y otras tcnicas sofisticadas. Existen disponibles varias tcnicas de cribado que exploran de un modo ms amplio varias mutaciones desconocidas de un gen patolgico. El polimorfismo conformacional de ADN monocatenario (SSCP) y la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) pueden detectar tericamente mutaciones puntuales en cualquier secuencia dentro de un gen; los nucletidos sustituidos debido a una alteracin de la topologa, dan lugar a ADN monocatenario y bicatenano incompatible. Estos mtodos evitan la necesidad de sondas ASO separadas y especificas para cada posible mutacin, aunque pueden realizarse slo con limitaciones, ya que no son 100% sensibles, L a prueba de protenas truncadas detecta mutaciones que originan la terminacin prematura del producto polipeptdico del gen; esto requiere un complicado mtodo de transcripcin/traduccin in vitro y solo encontrar mutaciones linalizadoras" (y algunas variantes del marco de lectura [Irameshifts] y de la eliminacin de intrones [splicing]). mientras pasa por alto sustituciones comunes de un solo nucletido (mutaciones sustitutivas [missense]). La nica tcnica que presenta un 100% de sensibilidad en la deteccin de todas las mutaciones puntuales posibles, al menos en teora, es la secuenciacin completa del ADN del gen. Desafortunadamente, con la tecnologa actual, este enfoque sigue siendo uno de los mtodos ms engorrosos y costosos para el uso clnico habitual; adems, se perderan mutaciones situadas fuera del gen estructural (p. ej.. en intrones. promotores o regiones intensificadoras [enhancer]). Los trastornos debidos a una expansin gnica por una mutacin de repeticin trinucleotidica pueden diagnosticarse mediante transferencia Southern o PCR y. en cualquier caso, por observacin de un fragmento diana de ADN mayor de lo normal. Los trastornos debidos a grandes deleciones se diagnostican a menudo mediante transferencia Southern por observacin de una prdida o disminucin en tamao de un fragmento diana, aunque tambin puede usarse la prdida de un producto de PCR amplificado normalmente desde esa zona o la aparicin de un "fragmento de empalme" {"junction ragment). L o s trastornos debidos a grandes deleciones o inserciones, asi c o m o las traslocaciones, se pueden diagnosticar a nivel cromosmico mediante FISH.

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S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR

Figura 66-2. Ejemplo esquemtico de deteccin de una m u tacin puntual mediante escisin diferencial con una e n z i m a de restriccin. En este caso, la mutacin de la anemia falciforme, sustitucin de T en lugar de A en el codn 6 del gen de la globina B, destruye una secuencia de escisin de la Msll: por tanto, la digestin del producto de PCR de la regin producir dos fragmentos d e ADN en individuos normales y slo uno en homocigotos HbS. La mutacin del primer nucletido de este codn, encontrada en la enfermedad de la hemoglobina C, no elimina la secuencia de reconocimiento de Msll (ya que la enzima p u e d e reconocer cualquier nucletido en esta posicin), no pudindose detectar por este mtodo.

Para esos trastornos con numerosas mutaciones desconocidas o en genes desconocidos, es posible un diagnstico predictivo mediante anlisis de ligamiento en ciertas familias. Debido a que los anlisis requieren la realizacin A D N d e numerosos pacientes mezclado A D N de un solo paciente

de pruebas comparativas de otros afectados y de hermanos no afectados y padres, no todas las familias sern accesibles o buscarn informacin para esta evaluacin. Tambin se requiere el conocimiento de marcadores de ADN polimrfico estrechamente ligados, preferiblemente en los flancos o incluso intragnicos, que pueden ser observados al cosegregarse de forma constante con cualquier fenotipo, normal o patolgico, dentro de la familia. Tradicionalmente. los marcadores usados han sido los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) detectados mediante transferencia Southern. Ms recientemente, los polimorfismos microsatlite. secuencias de oligonucleotides en tndem de longitud repetida variable, detectables mediante una P C R y una simple electroforesis en gel, son preferidos debido a su abundancia a travs del genoma, la naturaleza multiallica de sus polimorfismos y la relativa facilidad de la metodologa de la prueba. Genes muy grandes, como los de la neurofibromatosis y la distrofia muscular de Duchenne (DMD). tendrn normalmente microsatlites intragnicos a los que se puede acceder, minimizando las posibilidades de recombnacin entre la mutacin y el marcador. Las tcnicas de ligamiento son menos preferibles que los mtodos de deteccin directa de mutacin debido a la necesidad de analizar los mltiples miembros de la familia y porque la recombinacin meitica entre el gen y el marcador puede romper la fase aparente de ligamiento entre el padre y el descendiente, conduciendo a la interpretacin de los resultados c o m o falsos positivos o falsos negativos. Para cada centimorgan de distancia de m a p a entre los dos locus, se puede esperar un 1% de recombinacin (1 cM = 1 milln de pares de bases [bp]). Por ejemplo, en la Figura 66-4 se predijo que el feto estara afectado, ya que haba heredado el mismo fragmento RFLP superior que el hijo previamente afectado. Si la secuencia polimrfica de la endonucleasa de restriccin que est siendo analizado est a 5 cM de distancia del gen patolgico, se puede concluir que el feto tiene un 95% de riesgo de estar afectado.

Sonda ASO frente a una sola mutacin rara

Sondas ASO mezcladas frente a mltiples mutaciones raras

Figura 66-3. Estrategia para el cribado eficaz de mltiples mutaciones poco (recuentes mediante transferencia en m a n c h a usando sondas oligonucleotidicas especificas de un alelo (ASO). Numerosas muestras de A D N de pacientes se pudieron mezclar en una sola m a n c h a e hibridar con una sonda ASO: alternativamente, el ADN de un solo paciente se puede hibridar con una mezcla de mltiples sondas ASO p o c o frecuentes. En cualquier caso, la prueba ser negativa la mayora de las veces, ya que las mutaciones son m u y raras. Si es positiva, se requieren pruebas adicionales para determinar qu paciente o sonda produjo la seal de hibridacin.

ELECCIN DE APLICACIONES
En cierto grado, la eleccin de la tcnica depender tambin de la aplicacin (es decir, la razn por la que se realiza la prueba). En gentica mdica,

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DIAGNSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENTICAS

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dos en edad temprana para poder iniciar el tratamiento (diettico o farmacutico) antes de que aparezcan daos irreversibles. Actualmente, se estn empleando mtodos de gentica molecular de este grupo, principalmente como apoyo para la confirmacin de resultados positivos obtenidos por mtodos bioqumicos o enzimticos menos caros, aunque esta situacin podra invertirse en el futuro con mtodos moleculares que puedan automatizarse. Por definicin, la prueba de diagnstico gentico se realiza en un suieto sintomtico. Debido a que las pruebas de ADN para patologas genticas son absolutamente especficas de la enfermedad y las mismas enfermedades muy poco frecuentes, estos procedimientos no abarcan lo suficiente como para usarse en un extensivo diagnstico diferencial: los sntomas deben ser lo suficientemente sugerentes del trastorno en cuestin como para justificar la realizacin de la prueba. La prueba de ADN se debe sopesar frente a mtodos ms tradicionales con respecto al coste, conveniencia y utilidad. Por ejemplo, la electroforesis de hemoglobina puede ser mas conveniente y completa para clasificar una hemoglobinopatia sospechada que la prueba de ADN especfica para la mutacin de la anemia falciforme. Por otra parte, la prueba molecular puede ser ms ventajosa para presentaciones clnicas precoces o atpicas. Por ejemplo, la prueba molecular para mutaciones de la fibrosis qustica se puede realizar en recin nacidos cuando el anlisis tradicional de cloruros en el sudor es impracticable o poco fiable. Las pruebas de ADN tambin tienen la ventaja de trabajar bien en la autopsia, cuando los analitos bioqumicos clsicos no se pueden valorar. Figura 66-4. Ejemplo de anlisis de polimorfismos de la longitud de los Iragmentos de restriccin para el diagnstico prenatal de un trastorno autosmico dominante. En esta transferencia Southern, la banda superior procedente del padre es la nica que se segrega conjuntamente con el fenotipo patolgico, c o m o se observa en el hijo afectado. C o m o tambin el feto (?) fia heredado esta banda, se predijo que estara afectado. El riesgo preciso depende de la distancia de m a p a entre el gen patolgico y el marcador RFLP. Los anlisis presintomticos de ADN se aplican principalmente a trastornos dominantes de inicio tardo, en los cuales los descendientes de un padre afectado son conscientes de que tienen un 50% de riesgo de heredar la enfermedad y desean saber su estado antes del inicio clnico para informarse sobre decisiones reproductoras y de empleo o iniciar intervenciones de vigilancia y/o preventivas. Prototipos de trastornos de este grupo son la enfermedad de Huntington y los sndromes hereditarios del cncer, aunque tambin son relevantes enfermedades como la neurofibromatosis, sndrome de Marfan, enfermedad del rion poiiqustico en adultos y la esclerosis tuberosa. Este tipo de prueba ha sido la ms problemtica de la gentica molecular diagnstica desde el punto de vista psicosocial y tico, con un riesgo sustancial de graves consecuencias adversas del informe de los resultados, incluyendo el suicidio. Debido a esto, los protocolos de pruebas establecidos incluyen la condicin del consentimiento mlormado, la evaluacin clnica simultnea, el consejo gentico amplio antes y despus de la prueba y el apoyo psicosocial {Huntington's
Disease Society ol America. 1989: American College ol Medical Genetics.

estas aplicaciones consisten en cinco reas principales: cribado de portadores, deteccin precoz en recin nacidos, pruebas diagnsticas, anlisis presintomticos de ADN y diagnstico prenatal. El cribado de portadores es el trmino aplicado a la deteccin de mutaciones recesivas en sujetos sanos con el propsito de consejo gentico y planificacin familiar. Esta aplicacin se subdivide en el cribado de individuos con antecedentes familiares del trastorno y el cribado, basado en la poblacin, de gran nmero de individuos sin antecedentes familiares pero que tienen nesgo de padecer el trastorno debido a la prevalencia dentro de su grupo tnico o en la poblacin general. En cualquier caso, el propsito es identificar parejas de riesgo (es decir, tanto el hombre como la mujer son heterocigotos para mutaciones dentro del gen), las cuales tendran entonces un 25% de posibilidad de tener un hijo afectado en cada embarazo, aunque diferirn las estrategias de anlisis de los dos grupos. Obviamente, una persona cuyo hermano presenta el trastorno tiene mucho mayor riesgo de ser un portador que alguien de la poblacin general. Esa persona puede, por lo tanto, autorizar ms pruebas agresivas (p. ej., cribado para un nmero mayor de mutaciones o incluso anlisis de ligamiento) ms rentables que para un miembro de la poblacin general. Por otra parte, el acceso al ADN de un hermano afectado puede permitir la identificacin anterior de la mutacin, la cual hara posteriormente mucho ms fcil el anlisis de otros miembros de la familia. Por el contrario, el cribado basado en la poblacin se esfuerza, de modo caracterstico, en mantener el procedimiento de la prueba tan rpido y barato como sea posible, centrndose quiz en algunas de las mutaciones ms prevalentes y sacrificando la sensibilidad de la prueba por la rentabilidad y la conveniencia. Por supuesto, con antecedentes familiares negativos no hay miembros de la familia afectados para poder realizar una opcin de anlisis de ligamiento. Al igual que el cribado de portadores basado en la poblacin, la deteccin precoz en recin nacidos intenta identificar defectos hereditarios relativamente prevalentes (como las enfermedades genticas) en distintos individuos asintomticos. De hecho, las dianas patolgicas ms importantes, como la fenilcetonuria, galactosemia, anemia falciforme y fibrosis qustica, son trastornos autosmicos recesivos. En este caso, la meta es encontrar nios afecta-

1999). Finalmente, est la aplicacin clnica ms caracterstica de la gentica mdica: el diagnstico prenatal o la deteccin de enfermedad en el feto. Salvo algunas excepciones (como la hidropesa fetal de la |t-talasemia homocigota, dwarfismo tanatofrico y la osteogenesis imperfecta de tipo I), la mayora de los trastornos mendelianos. especialmente los errores innatos del metabolismo, no se expresan ni sintomtica ni bioqumicamente en el feto; asi. el diagnstico predictivo slo puede realizarse a nivel del ADN. Incluso para los trastornos que podran detectarse bioqumicamente, el ADN a menudo se muestra como un sustrato ms accesible, desde el punto de vista obsttrico, que los productos proteinicos o sustratos metablicos afectados. Mientras que los anlisis moleculares pueden realizarse en cantidades muy pequeas de lquido amnitico o muestras de vellosidad corimca obtenidas por mtodos habituales, incluso si se obtienen para otros propsitos, los anlisis bioqumicos requerirn una biopsia invasiva de tejido fetal profundo, a m e n o s que los productos proteinicos se expresen en fibroblastos (y asi, ammocitos). Por ejemplo, el anlisis de actividad de la (enilalanina-hidroxilasa para diagnosticar la fenilcetonuria requerira biopsia de hgado fetal, y la cuantificacin de distrofina para el diagnstico de la distrofia muscular de Duchenne requerira biopsia de msculo fetal. Es evidente que el objetivo fundamental del diagnstico prenatal es la identificacin de un feto afectado de una manera oportuna para poder ofrecer una opcin prctica de interrupcin del embarazo a la pareja. Mientras que algunos pueden argumentar una ventaja de la obtencin de diagnsticos prenatales para poder instaurar rpidamente una terapia en el nacimiento o para la tranquilidad psicolgica de una pareja si se observa que el feto no est afectado, es difcil justificar el nesgo de aborto en la amniocentesis y la obtencin de muestras de vellosidad corimca (CVS) realizadas para estos

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PATOLOGA MOLECULAR

propsitos. Para un feto afectado, a menos que se tenga la intencin de iniciar terapia en el tero, es perfectamente aceptable el tratamiento provisional en el nacimiento mientras se espera la prueba neonatal. Mientras que el consejo gentico prenatal no es siempre una normativa, con objeciones morales y/o religiosas respecto al aborto, tanto el consejero clnico como la prueba de ADN del laboratorio tienen un derecho legtimo y la responsabilidad para cuestionar la conveniencia de la peticin de una prueba prenatal, con su riesgo y coste acompaantes, en una pareja para quienes la interrupcin no es una opcin (igual se aplicara a las peticiones tardas de interrupcin del embarazo). Debido a estos problemas, esta prueba prenatal invasiva no se ofrece como una herramienta de cribado en la poblacin general a las mujeres sin historia familiar del trastorno en cuestin. El poder d e la PCR para permitir anlisis genticos de una sola clula ha abierto recientemente el camino para el diagnstico preimplante, enfocado normalmente a la realizacin de fecundacin in vitro y microdiseccin de un solo blastmero del embrin inicial (vase Cap. 21). Esta estrategia, ya aplicada a casos seleccionados con riesgo de fibrosis qustica (Handyside. 1992) y otros trastornos, podra ofrecerse a algunas parejas de riesgo que no consideran el aborto como una opcin, aunque tengan sus propias objeciones ticas (y econmicas). A pesar de estos dilemas mdicos y morales, la prueba d e gentica molecular prenatal, realizada en circunstancias apropiadas, se puede ofrecer a parejas de riesgo, muchas de las cuales han padecido ya el trauma de tener al menos un descendiente afectado, uno de los servicios ms valiosos de toda la medicina clnica.

de mutaciones que sustituya al anlisis de ligamiento o a tcnicas de exploracin de mutaciones. La expresividad variable se refiere a la aparicin de diferentes signos y sntomas del trastorno en sujetos que heredan la misma mutacin o mutaciones. Al igual que la penetrancia, la expresividad variable probablemente sea un reflejo de efectos gnicos diferenciales dentro de orgenes genticos distintos (en otras palabras, la modulacin de la expresin fenotpica mediante otros genes no allicos). sta tambin requiere averiguaciones y dificulta el consejo; adems, plantea cuestiones ticas en la consideracin del aborto en enfermedades de gravedad variable e impredecible (como la fibrosis qustica).

Entrecruzamiento
El fenmeno de recombinacn meitica entre cromosomas homlogos es, adems de la mutacin aleatoria, la principal fuerza conductora despus de la diversidad gentica y la evolucin en los organismos de reproduccin sexual. Su importancia en la gentica molecular diagnstica radica en la ruptura del ligamiento entre un gen patolgico y un marcador polimrfico cercano, dando lugar al diagnstico de falsos positivos o falsos negativos en los trastornos analizados mediante pruebas de ligamiento. Como se explic con anterioridad, se puede minimizar el riesgo eligiendo marcadores ms estrechamente ligados o en el flanco del gen patolgico. Esto es ms factible, porque el mapa del genoma humano presenta numerosos polimorfismos de repeticiones cortas en tndem, a los que puede accederse fcilmente con cebadores de PCR.

CONCEPTOS ESPECIALES NICOS DE LOS TRASTORNOS MOLECULARES GENTICOS

Aunque las tcnicas tratadas en este captulo de anlisis de ADN para el diagnstico de enfermedades genticas son generalmente las mismas que las usadas para el diagnstico molecular del cncer o enfermedades infecciosas, su aplicacin en aqullas ha revelado ciertos fenmenos inusuales que deben tenerse en cuenta cuando se est tratando con determinados trastornos hereditarios. Algunos de estos conceptos se conocen desde la poca de Mendel, aunque ahora se comprenden a nivel de ADN; otros han surgido ms recientemente como subproductos inesperados de la diseccin molecular de los genes especficos de enfermedad.

Disoma uniparental
Causa poco usual de trastorno recesivo de un solo gen. descubierta por primera vez en un paciente con fibrosis qustica (CF). de cuyos padres slo uno era portador (Spence, 1988). Mediante haplotipado de ADN usando marcadores polimrficos, se demostr que el paciente haba heredado dos copias del cromosoma 7 del padre portador que contenia el gen mutante de la CF y no el cromosoma 7 del otro padre. El fenmeno se h a observado en otros casos de CF y tambin en enfermedades que implican a otros cromosomas. Para algunas enfermedades, como los sndromes de Prader-Willi y de Angelman (vase ms adelante), la incidencia de disoma uniparental (UPD) se aproxima a la de otros mecanismos clsicos de mutacin de la patognesis molecular, justificando una prueba sistemtica para este fenmeno.

Heterogeneidad molecular
Muy pocos trastornos genticos se han asociado con una sola mutacin identificada de forma constante en todos los casos afectados (p. ej la mutacin sustilutiva en el codn 6 del gen de la (3-globina que causa la anemia falcforme). La gran mayora de los trastornos genticos se originan por ms de una, en ocasiones centenares de mutaciones diferentes dentro del gen patolgico (ej., el gen CFTR de la librosis qustica). incluso algunas veces por ms de un gen (ej., los genes TSC1 y TSC2 de la esclerosis tuberosa o los BRCA1 y BRCA2 del cncer familiar de mama y ovario). Obviamente, la identificacin en tales trastornos de las mutaciones causantes es tcnicamente mucho ms difcil, si no imposible. Una consecuencia de esta heterogeneidad molecular es que no todas las mutaciones producirn enfermedades igual de graves; algunas pueden causar slo formas leves, incluso sndromes relacionados con poco parecido con el fenotipo clsico. Toda esta variabilidad se aade a la gran complejidad del consejo gentico y de los anlisis genticos.

Impronta
La impronta se refiere a la expresin diferente de un gen en un descendiente, dependiendo de si lo ha heredado de la madre o del padre; a veces depende de otros factores epigenticos (Hall, 1999). Algunos genes slo se expresan o se desconectan cuando proceden del ovocito y otros slo cuando proceden del espermatozoide. Si un individuo hereda el alelo normal a travs de la lnea parental donde no se expresa, no puede contrarrestar una mutacin recesiva heredada del otro padre. El mecanismo molecular, al menos en algunos casos, parece ser la metilacin diferencial de regiones del cromosoma y elementos reguladores. sta es la base tanto de los casos de delecn c o m o de UPD de los sndromes de Prader-Willi y de Angelman (vase ms adelante).

Anticipacin
Este trmino se refiere al incremento progresivo en la gravedad y/o edad de inicio de un trastorno gentico en generaciones posteriores de una familia. Se caracteriza por estar asociada con trastornos por repeticin de trinucleotide como la distrofia miotnica y el sndrome X frgil, en los cuales el aumento de la gravedad puede correlacionarse con una mayor expansin de la regin de repeticin. En la enfermedad anterior, los hijos nacidos de madres afectadas son casos especialmente graves con inicio en la niez o a edad infantil, dando a entender tambin una influencia mediante impronta (Lpez, 1994). Lo contrario se observa en la enfermedad de Huntington, donde la expansin de repeticin de un trplete se produce con mayor probabilidad cuando se hereda del padre. Menos frecuentemente, se ha observado el fenmeno opuesto, la contraccin. Por estas razones es tan importante para el diagnstico y el consejo gentico en estos trastornos la separacin molecular exacta de los fragmentos de repeticin de trinucletido.

Penetrancia variable y expresividad

La penetrancia se refiere a la proporcin de individuos que, habiendo heredado un gen patolgico mutante, presentan el fenotipo patolgico. Normalmente se aplica a trastornos dominantes, y puede producir en el rbol genealgico de la enfermedad el aspecto llamativo de "salto generacional". Esto puede complicar tanto el diagnstico molecular como el consejo gentico, ya que podra no estar claro si el probando hered la enfermedad de un padre o en cambio, representa una nueva mutacin en la familia. sta es una caracterstica de trastornos genticos relativamente comunes, como el sndrome de Marfan y la neurofibromatosis; ambos genes se han identificado, pero en la mayora de los casos todava no es tan fcil trabajar con la deteccin directa

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D I A G N S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N T I C A S

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Influencias epigenticas y herencia no mendeliana

Los cambios epigenticos son cambios hereditarios, pero potencialmente reversibles, en la expresin gnica que no representan un cambio en la secuencia del ADN genmico de la clula. Los ejemplos ms destacados de herencia epigentica son las improntas genmicas (tratadas anteriormente) y la inactivacin del cromosoma X en mamferos; ambas implican el silenciamiento transcripcional de genes por metilacin de citosinas en dinucletidos CpG. El estado de metilacin del ADN se mantiene posteriormente a la replicacin del ADN mediante metilasas. que tambin actan sobre el ADN bcalenario hemimetilado para metilar la cadena de ADN recin sintetizada. El proceso se perpeta indefinidamente en divisiones celulares sucesivas. Una evidencia reciente sugiere que la metilacin de novo de los dobletes CpG puede tener lugar en los promotores de algunos genes supresores de tumores, silenciando estos genes y constituyendo esencialmente uno o ambos de los "impactos" en un gen supresor de tumor que conduce al desarrollo del tumor (Jones. 1999). Otra categora de herencia epigentica menos aclarada implica la propiedad de algunas protenas para regular la conformacin de protenas recien sintetizadas o ensambladas de forma autoperpetua. Los ejemplos ms caractersticos en mamferos son las enfermedades por priones, responsables de la encefalopata espongiforme ovina y la enfermedad de las vacas locas en animales y del curu y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos. La enfermedad se produce por la proteina prin, que tiene la misma secuencia de aminocidos que una protena normal pero est plegada con una conformacin anmala, y sirve aparentemente como una plantilla para la proteina recin sintetizada de tal modo que perpetua la anomala conformacional que origina la enfermedad.

una frecuencia de portadores tan elevada como de 1 de cada 30 en los ascendientes caucsicos del norte de Europa (y de forma decreciente en el s u r de Europa, hispanos, afroamericanos y asiticos), existan suficientes motivos para estudiar familiares de pacientes e incluso a la poblacin general con el fin de identificar parejas con un riesgo de 1 de cada 4 de tener un hijo afectado en cada embarazo. Pero ya que estos portadores son asintomticos y tienen niveles normales de cloruros en el sudor, se tuvo que esperar al aislamiento del gen en 1989 (Riordan, 1989: Kerem. 1989) Algunos aos antes se haba mapeado el cromosoma 7, permitiendo el diagnstico prenatal mediante anlisis de ligamiento en familias que buscaban informacin, realizando exploraciones masivas y analizando en otras familias, especialmente en las que no presentaban antedecentes familiares del trastorno; esto slo pudo considerarse una vez que el gen se clon y las mutaciones fueron identificadas. Sin embargo, el anlisis del ADN para la CF ha estado lleno de problemas y controversias. El gen consta de alrededor de 250.000 bp y codifica una gran protena de canal inico denominada regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR) (Collins. 1992). Lo ms notable es que el espectro de mutaciones observadas es notablemente heterogneo. Mientras que una delecin de tres nucletidos del codn "508 de la fenilalanina (designado como AF508) explica alrededor del 70% de las mutaciones en caucsicos (y significativamente menos en otros grupos tnicos), unas 800 mutaciones adicionales han sido informadas hasta ahora. La mayora de ellas son tan poco frecuentes que no es factible ni rentable incluirlas en los paneles de pruebas: slo alrededor de siete (adems de la \F508) explican ms del 1% de las mutaciones de CF en la mayora de las poblaciones caucsicas (Tsui. 1992) (Tabla 66-1). La sensibilidad del cribado de portadores con paneles estndar de mutaciones de entre 6 y 25 alelos vara desde un 97% en judos asquenazis (procedentes de Europa) (Abeliovich. 1992), un 75% a un 90% en caucsicos norteamericanos no asquenazis, alrededor del 60% en hispanoamericanos, el 50% en afroamericanos y menos del 10% en asiticos (Ober, 1992; Orozco, 1993; Curtis, 1993; Grebe, 1994; Macek, 1997). Tal sensibilidad variable y subptima en una poblacin tnicamente heterognea como la de

Frecuencias allicas y exploraciones masivas de la poblacin

Ya se ha hecho referencia a la aplicacin de estudios de deteccin de portadores para mutaciones recesivas en grupos amplios de poblacin. Para justificar el esfuerzo y el gasto requeridos al realizar una prueba de ADN en miles o millones de personas desde el punto de vista de la sanidad pblica, la incidencia de esta enfermedad debe ser lo suficientemente alta en la poblacin en general o en el grupo tnico o racial objeto del estudio. La ley del equilibrio de Hardy-Weinberg predice que la frecuencia del portador ser mucho ms alta para cualquier enfermedad aulosmica recesiva de incidencia apreciable. La enfermedad diana candidata debe ser lo suficientemente grave y/o favorable a alguna intervencin mdica en base a su identificacin. Diversos trastornos no parecen corresponderse con estos criterios. Mutaciones asociadas con hemocromatosis hereditaria y resistencia a la proteina C activada (factor V Leiden) se encuentran en el 5% al 7% de la poblacin caucsica, mientras que la frecuencia de portadores para la mutacin de la anemia falciforme se aproxima al 19% en la poblacin de afroamericanos. Las mutaciones de la fibrosis quistica. aunque de menor frecuencia, colocan a tal cantidad de parejas norteamericanas en riesgo que tambin se ha propuesto en niveles superiores como un objetivo vlido de cribado en la poblacin (vase ms adelante). Este desplazamiento de la prueba de gentica molecular fuera del campo de enfermedades raras y dentro del mbito de estudios comunes tendr un gran efecto en la medicina preventiva y la sanidad pblica y conducir a nuevos progresos en la automatizacin de las pruebas de ADN en aos venideros.

Tabla 66-1 Mutacin

AF508

Algunas mutaciones predominantes d e fibrosis qustica Comentario

EJEMPLOS ESPECFICOS DE ENFERMEDAD

Fibrosis qustica
Debido a la alta frecuencia de portadores en Amrica del Norte y norte de Europa, la naturaleza clnica grave, el patrn directo de herencia mendeliana (aulosmica recesiva) y a su gen bien estudiado aunque bastante complejo, la CF ha surgido como un trastorno paradigmtico para las pruebas de gentica molecular a gran escala. Dentro de su mbito se puede encontrar la gama completa de tcnicas de gentica molecular aplicables y un completo espectro de dilemas cientficos y ticos que surgen de la variabilidad climca de la enfermedad, la heterogeneidad molecular extrema de las mutaciones causantes y la llegada de nuevos tratamientos que incluyen la terapia de sustitucin gnica. Con

Delecin de 3 bp sm cambio del marco de lectura del codn phe, la principal mutacin de la CF presente hasta en un 70% de portadores de algunas poblaciones caucsicas G542X Mutacin sin sentido, alrededor del 3% de portadores c a u c s i c o s W1282X Mutacin sin sentido, presente en alrededor del 50% de portadores judos asquenazis G551D Mutacin sustituliva. alrededor del 3% de portadores c a u c s i c o s N1303K Mutacin sustituliva, 1-3% de portadores caucsicos y judos asquenazis R553X Mutacin sin sentido, alrededor del 1.5% de portadores c a u c s i c o s 3849 + 10kbC -*T Mutacin de una secuencia de unin exn-mtrn; 1.5 y 4%, respectivamente, de portadores caucsicos y ludios asquenazis; asociado con enfermedad pulmonar pero con niveles normales de cloruros en sudor 3905insT Mutacin insercin/cambio del marco de lectura, alrededor del 1.5% de portadores caucsicos R117H Mutacin sustituliva asociada con ausencia congnita de los conductos deferentes. frecuencia estimada del t%-5% 621 + IG -T Mutacin de una secuencia de unin exnintrn, alrededor del 1.5% de portadores caucsicos 1717 - IG -A Mutacin de una secuencia de unin exnintrn, alrededor del 1% de portadores caucsicos 3120 + IG Ea Mutacin de una secuencia de unin exnintrn encontrada en el 12% de pacientes afroamericanos

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PATOLOGA MOLECULAR

Estados Unidos y las dificultades que supone el consejo a pacientes en cuanto al riesgo residual de un anlisis negativo en un portador, ha hecho que la deteccin de portadores de mutaciones de la CF basada en la poblacin sea un tema polmico (Wilfond, 1990; Williamson, 1993: Grody, 1999). a pesar de que una declaracin consensuada recomienda que el estudio sea ofrecido a todas las parejas embarazadas y a aquellas que tienen planes de hacerlo (NIH, 1997). Aunque la mutacin AF508 se puede detectar mediante migracin diferencial en gel de poliacrilamida (Fig. 66-1) (Chong, 1990) y varias mutaciones producen patrones caractersticos de digestin por endonucleasas de restriccin, el estudio de laboratorio para 30 o ms mutaciones depende de estrategias con sondas ASO mezcladas (como la lustrada en la Fig, 66-3) o transferencias en mancha inversas (en las cuales los productos de PCR marcados del paciente se hibridan con una serie de sondas de oligonucletidos 'tipo salvaje" (wild-type) y mutantes inmovilizadas en un filtro (Chehab, 1992; Shuber, 1997). Hasta que existan avances tecnolgicos en la secuenciacin rpida y barata del ADN, la hibridacin en "micromatriz" y los anlisis de protenas para la funcin del CFTR, la sensibilidad de la prueba anteriormente citada probablemente seguir siendo la misma. Esto representa un problema especial para el consejo prenatal de parejas en las cuales la prueba de un cnyuge es positiva y la del otro negativa. No se puede ofrecer nada ms en cuanto al diagnstico prenatal, incluso si el cnyuge negativo es un portador, o si l o ella tienen una mutacin que no puede analizarse en el feto, lo que aumenta la ansiedad con respecto al embarazo en curso. Se ha propuesto evitar la cuestin en su conjunto adhirindose a un modelo de deteccin precoz de la CF basado en la pareja, en el cual los resultados se informan como negativos incluso si se observa que un cnyuge es portador (Wald. 1991); sin embargo, este enfoque aumenta las cuestiones ticas acerca de la no revelacin de informacin mdica y otros asuntos (Miedzybrodzka, 1991). Otro problema con el consejo gentico de la CF es el de la variable gravedad clnica del trastorno y la discrepancia de correlaciones entre genotipo y fenotipo. Ms all del hallazgo de que los homocigotos AF508 tienden a padecer insuficiencia pancretica, se sabe poco acerca de la gravedad de la enfermedad o complicaciones que puedan predecirse con fiabilidad a partir del conocimiento de un individuo afectado con dos mutaciones (Cystic Fibrosis Genotype-Phenotype Consortium. 1993). Incluso los homocigotos para AF508, considerada la mutacin "grave" prototpica, pueden mostrar un amplio rango en su grado de afectacin pulmonar (Burke, 1992). Por el contrario, existen mutaciones que originan enfermedad pulmonar aun manteniendo niveles normales de cloruros en el sudor (Highsmth, 1994); hay mutaciones y polimorfismos (como R117H y una extensin intrnica de politimidina) que no siempre producen CF sino algo de infertilidad masculina debido a la ausencia congenita de conductos deferentes (Gervais, 1993; Anguiano, 1992). Junto con la probable llegada de terapias efectivas de sustitucin gnica para la CF (Wilson, 1993), estos factores justifican el consejo gentico debido a la dificultad de los padres para tomar una decisin sobre el trastorno. Dada la heterogeneidad molecular y clnica de la mayora de trastornos genticos, probablemente estos problemas son la regla ms que la excepcin en la gentica molecular diagnstica.

1988: Prior, 1991). Slo con la llegada de la PCR multiplex se desarroll un sistema para la identificacin rpida y barata de ms del 98% de deleciones del gen y su localizacin en los exones especficos de ste (Beggs. 1990; Multicenter Sludy Group, 1992). En este sistema se identifica una delecn por la ausencia de uno o ms de los mltiples amplicones esperados en geles de electroforesis teidos con bromuro de etidio o en instrumentos de electroforesis capilar (ya que una delecn en el gen diana suprimir la secuencia o secuencias de hibridacin de uno o ms cebadores, causando un fallo en la PCR) (Fig. 66-5), El mapeado de su estructura fina junto con la secuenciacin revel importantes ideas sobre la patognesis molecular de la DMD y la variante allica ms leve, la distrofia muscular de Becker (BMD). Mientras que ambas suelen estar causadas por grandes deleciones en el gen. en la BMD se conserva, de modo caracterstico, el marco de lectura en el transcrito resultante, en tanto que las deleciones de la DMD producen ms a menudo mutaciones del marco de lectura y un producto proteinico ms truncado (Monaco. 1998). El tercio restante de pacientes en los que no se han detectado deleciones presenta normalmente mutaciones puntuales o microdeleciones/inserciones. Debido al tamao del gen. no es factible identificar estas lesiones directamente, debiendo volver al anlisis de ligamiento; tambin se ha estudiado el gen por anlisis conformacional (SSCO, DGGE) (Prior. 1993), Como en cualquier estrategia de ligamiento, esta aproximacin es posible slo en familias que buscan informacin, en las cuales el ADN de un sujeto previamente afectado est disponible para su estudio. Los protocolos iniciales dependieron de marcadores RFLP que flanquean el gen de la distrofina (Williams, 1986); ms recientemente, marcadores microsatlite intragnicos han permitido el haplotipado ms rpido y exacto del cromosoma basado en la PCR (Beggs. 1990). Alternativamente, pueden realizarse estudios a nivel protenico mediante la observacin de una distrofina disminuida o ausente en la DMD y una distrofina de peso molecular anmala en la BMD, mediante transferencia Western (Western blot) o nmunohistoqumica de biopsia de tejido muscular (Hoffman, 1988). Este procedimiento tiene limitaciones para el diagnstico prenatal, para el cual se requerira una biopsia de msculo fetal; sin embargo, el mtodo ha sido recientemente adaptado para amniocitos y clulas de vellosidad corinica, inducidas a diferenciarse hacia clulas musculares mediante tcnicas de transferencia gnica (Sancho, 1993). El diagnstico molecular de la DMD ha vuelto al punto de partida: la identificacin del gen sin conocer el producto proteinico ("gentica inversa"), para la identificacin y el uso diagnstico del producto proteinico desde el conocimiento del gen. Esta clase de evolucin se puede esperar en el diagnstico de labo-

1234512345

Distrofia muscular de Duchenne

Esta miopata progresiva ligada al cromosoma X fue el primer trastorno cuyo gen causante fue aislado mediante el proceso de "gentica inversa" (Rowland, 1988). Antes de su descubrimiento, las nicas pruebas que podan ofrecerse a familias de riesgo eran la deteccin de algunos portadores femeninos, aunque no todos, mediante el hallazgo de niveles sricos elevados de creatina cinasa, seguido de la determinacin prenatal del sexo con la opcin de interrumpir el embarazo en fetos masculinos (incluso aunque el 50% de estos embarazos fuesen normales). El consejo gentico se presta incluso a mayor problemtica porque alrededor de un tercio de los casos de DMD surgen a partir de nuevas mutaciones. Incluso despus de su descubrimiento, su traslado a la aplicacin clnica no fue fcil debido a que el gen, denominado "distrofina", demostr ser ms grande an que el descubierto, abarcando 2,5 millones de bp y compuesto de 79 exones (Ahn, 1993), El uso de sondas de ADNc de longitud completa o parcial para detectar la variedad de deleciones que se producen en dos tercios de los casos, fue un trabajo laborioso que llev mucho tiempo (Darras,

Figura 66-5. Anlisis mediante PCR multiplex para deleciones del gen de la distrofina en la dislrolia muscular de Duchenne. L a s muestras de A D N de c i n c o pacientes se amplificaron simultneamente con cinco pares de cebadores (mitad izquierda del gel) y nueve pares de cebadores (mitad derecha del gel) y los productos se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. La ausencia de u n a banda esperada de un producto de PCR es indicativa de una delecn. El paciente 2 carece de la banda superior en la plex-5 y de la segunda banda superior en la plex-9: stas corresponden, respectivamente, a deleciones en los e x o n e s 50 y 48 del gen de la distrofina. (La banda 4 de la plex-9 es tenue, pero est presente en todas las muestras.) (Foto cortesa de Dra. Kathryn E. Kronquisl.)

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DIAGNSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENTICAS

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ratono de muchas enfermedades genticas, ya que los estudios funcionales del producto de un gen son, por definicin, ms completos que intentar localizar innumerables mutaciones individuales a nivel del ADN,

Anemia de clulas falciformes y otras hemoglobinopatas

Debido a la larga historia de estudio de su producto proteinico, el diagnstico de los defectos moleculares de los genes que codifican los polipptidos de la globina no se hizo mediante tcnicas de "gentica inversa"; o mejor dicho, estos genes se clonaron por mtodos clsicos, usando anticuerpos antiglobina en la precipitacin polismica para aislar los cidos ribonucleicos mensaieros relevantes (ARNm). De esta manera, las mutaciones de la hemoglobina y en particular la que causa la anemia falciforme. fueron de las primeras en ser diagnosticadas a nivel de ADN. Una mutacin puntual de la clula falciforme se encuentra dentro (por tanto, destruyndola) de una secuencia de escisin para endonucleasas de restriccin (Msfll o Ddel) en el codn 6 del gen de la globina [J. proporcionando un mtodo rpido de deteccin usando transferencia Southern o digestin mediante enzimas de restriccin de los productos de PCR del gen de la globina [i (Hatcher, 1992) (Fig. 66-2). De forma alternativa, las secuencias de hemoglobina S y hemoglobina A se pueden distinguir mediante transferencia en mancha usando sondas de oligonucleotides especificas de un alelo complementarias a la secuencia normal o mulante (Conner, 1983). Estas tcnicas se pueden usar para el diagnstico, cribado de portadores o diagnstico prenatal; en este ltimo caso es obvia la necesidad de una obtencin invasiva de sangre letal y la electroforesis clsica de hemoglobinas. La prueba de ADN se vuelve importante para la confirmacin de apoyo de los resultados positivos y ambiguos de los estudios, incluso si se hacen por mtodos bioqumicos, puesto que ms estados han iniciado los programas de deteccin precoz de las clulas falciformes en recin nacidos. Una mutacin diferente en el codn 6, que origina la enfermedad de la hemoglobina C, no suprime la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restriccin (porque se da en una posicin de nucletido flexible para la enzima), por tanto puede distinguirse mediante sondas ASO (Maggio, 1993). Se debe tener en cuenta que ninguno de estos mtodos identificar los heterocigotos compuestos clula falciforme/(i-talasemia o hemoglobina C/p-talasemia. Las talasemias engloban tanto alteraciones cualitativas como cuantitativas en una o ms cadenas de globina; su diagnstico a nivel molecular es ms complejo que el de la anemia lalciforme. La u-talasemia es la ms sencilla, ya que normalmente se origina por la delecin de uno o los dos genes a contiguos en uno o los dos cromosomas 16. Se puede detectar mediante transferencia Southern o PCR, permitiendo la diferenciacin del portador imperceptible (prdida de un gen a), de la hidropesa fetal muy grave (prdida de los cuatro genes) y de los dos estados intermedios (Oron-Karni. 1998). El diagnostico molecular de la |i-talasemia es bastante ms complicado debido a la gran variedad de secuencias promotoras, de terminacin, de delecin, de unin exn-intrn y mutaciones del marco de lectura que se han documentado. Por esta razn, el anlisis de ADN para este trastorno se ha limitado a algunos laboratorios especializados.

Figura 66-6. Eiemplo de anlisis electrolortico m e d i a n t e PCR de la mutacin del tactor V Leiden. Un fragmento amplificado p o rP C R del gen del factor V que aparca el codn 506 presentar dos secuencias de escisin para la e n z i m a de restriccin Mn en el ADN normal, pero slo una si contiene la mutacin R506Q, que destruye una de las secuencias. Los patrones resultantes de la digestin mediante enzimas de restriccin mostrarn, respectivamente, dos. tres o cuatro bandas, dependiendo de si la mutacin es homocigota (carril derecho), esta a u s e n t e (carril izquierdo) o heterocigota (carril central). El fragmento ms corto m i g r a cerca de la parte inferior de la foto del gel y suele ser difcil de ver.

Trombofilias hereditarias
La fibrosis qustica no es el nico trastorno con una frecuencia de mutacin lo suficientemente alta como para justificar un cribado de la poblacin usando mtodos moleculares. Algunos genes, recientemente caracterizados, han revelado frecuencias de portadores de una magnitud superior a las de la CF. En este grupo se incluyen genes implicados en el sistema anticoagulante, que controlan la cascada de la coagulacin. El ms notable de tales alelos es la mutacin del factor V de Leiden: se trata de un solo cambio nucleotdico que produce la sustitucin de un aminocido (R506Q) en la proteina del factor V de la coagulacin, hacindola resistente a la escisin por la protena C activada (Bertina, 1994). El alelo es portado por el 5% al 7% de la poblacin caucsica y es responsable de ms del 90% de resistencia clnica a la APC, dando como resultado una tendencia al tromboembolismo venoso idioptico (Ridker, 1997a). Se ha informado que produce un nesgo relativo de trombosis siete veces superior al normal cuando se presenta en estado heterocigolo y alrededor de 80 veces en el estado homocigoto. El anlisis de la muta-

cin es sencillo porque, al igual que la mutacin de las clulas falciformes. sta elimina una secuencia de escisin de una endonucleasa de restriccin (Fig. 66-6); se han desarrollado mtodos automticos para mejorar el rendimiento de la prueba (Ryan, 1999). De igual modo que para la CF, existen controversias sobre a qu pacientes se debe proponer el estudio. A pesar del elevado nesgo relativo, el riesgo absoluto conferido por esta mutacin es ms bajo, con una penetrancia para los sntomas trombticos de alrededor del 10% a lo largo de la vida. Por tanto, la mayora de portadores no serian candidatos a terapia anticoagulanle a pesar del riesgo de hemorragia e idus; tampoco es seguro si tal estudio cambiara el tratamiento del paciente de un modo significativo. Se ha propuesto realizar el estudio en sujetos con factores de riesgo ambientales conocidos que actan de modo sinrgico con el riesgo del factor V de Leiden. como las mujeres que toman anticonceptivos orales. Aun aqu podra discutirse la obligacin de dichas mujeres con una prueba positiva a volver a mtodos menos eficaces de control del embarazo que podrian causar ms perjuicios que beneficios, aumentando la tasa de embarazos con sus propias complicaciones de vigilancia, algunas de las cuales, de forma irnica, son de naturaleza trombtica (Kupferminc. 1999). Hoy en da, la mayora de peticiones recibidas por los laboratorios de gentica molecular para el anlisis del factor V de Leiden son de pacientes que ya han padecido un episodio de tromboembolismo inexplicable. Junto con el factor V de Leiden. existen otras mutaciones hereditarias de elevada frecuencia allica que confieren riesgo trombtico. L a variante 20210A de la protrombina. un cambio de un solo nucletido en la regin 3' no traducida del gen de la protrombina. origina unos niveles altos de protrombina circulante y un fenotipo similar al del factor V de Leiden; se encuentra en el 1% al 2% de la poblacin general (Poort. 1996). La variante 677C-*T de la metilenoletrahidrofolato-reductasa, una enzima implicada en el metabolismo de la homocisteina, la portan el 30% al 40% de la poblacin general y se asocia con niveles plasmticos elevados de homocisteina y riesgo de trombosis vascular (incluida la arteriopatia coronaria). Las mutaciones para cada uno de

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estos factores pueden actuar de forma sinrgica con las otras, de modo que los pacientes que portan dos o incluso tres de estos defectos, incluyendo tambin las deficiencias menos frecuentes de protenas S y C, tienen mayor riesgo (Halbmayer, 1999; Ridker, 1997b; Koeleman, 1994), Las pruebas de ADN para varias de eslas mutaciones tromboflicas se pueden multiplexar en un solo anlisis (Hessner, 1999).

Trastornos por expansin de repeticin de trinucletido

Un tipo importante de mutacin patolgica se revel en 1991 con el descubrimiento de que la atrofia muscular bulboespinal ligada al cromosoma X (enfermedad de Kennedy, SBMA) y el sndrome X frgil (FRAXA) estaban asociados, respectivamente, con la amplificacin de secuencias inestables de repeticin de trinucletido en el gen del receptor de andrgenos (AR) y el gen FMR1 ("retraso mental del cromosoma X frgil"). Desde entonces, mutaciones patolgicas similares se han asociado con varios trastornos neurolgicos y musculares (resumidos en la Tabla 66-2), proporcionando una clasificacin molecular de las ataxias espinocerebelares (La Spada, 1994; Bates, 1994; Reddy. 1997; Hardy, 1998; vase tambin Online Mendelian Inheritance in Man [OfvllM], http;//www3.neb.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.html). En cada uno de estos trastornos, el gen afectado contiene normalmente una secuencia repetida de 3 bp. por ejemplo (CGG) en el gen FMR1, donde n es variable pero est claramente limitado en su intervalo. En el estado patolgico, el nmero de repeticiones del triplete se expande por encima del intervalo de normalidad, a veces de forma marcada. Son varios los mecanismos mediante los cuales estas secuencias de repeticin expandidas originan enfermedad, incluyendo el silenciamiento gnico y el aumento de la funcin txica de protenas mulantes. Actualmente hay una sola excepcin a la "regla del triplete" para las expansiones de repeticin patolgicas: una nueva expansin de repeticin de 12 bp en direccin 5' de la secuencia de inicio de transcripcin del gen de la cistatina B, asociada con una enfermedad autosmica recesiva poco frecuente, la epilepsia mioclnica progresiva de tipo 1 (Larson. 1999).

gen ancestral, que tienen un riesgo elevado de sufrir expansiones adicionales cada vez que se transmiten a otra generacin. Como el alelo con premutacin aumenta en tamao, se incrementa la probabilidad de que se expanda ms en la prxima generacin. Curiosamente, la expansin a una mutacin completa slo sucede en la meiosis femenina, nunca en la masculina, lo cual se corresponde con la observacin de que las hijas de hombres normales transmisores son siempre fenotipicamente normales. La Figura 66-78 ilustra u n a familia con FRAXA: un alelo con premutacin se transmite de la primera a la segunda generacin, expandindose a una mutacin completa en la tercera generacin. Se est investigando el mecanismo por el cual la repeticin expandida del triplete en la regin 5' no codificante del gen FMR1 produce el fenotipo FRAXA. Debido al tamao de las expansiones de repeticin, existe una metlacin progresiva de la regin reguladora del gen FMR1 y una expresin disminuida de la proteina FMR-1. Esta proteina de unin al ARN se expresa ampliamente durante el desarrollo del cerebro y de otros tejidos. Su prdida de expresin en el FRAXA puede alterar el desarrollo normal del cerebro y originar retraso mental (La Spada, 1994). Un escaso nmero de pacientes con sndrome X frgil tpico no presentan expansin de repeticin de tripletes o hipermetilacin gnica, pero presentan mutaciones de inactivacin que dan lugar a la prdida de expresin de la protena FMR1. Tambin se han descrito dos hermanos fenotipicamente normales con expansiones de repeticin completas del gen FMR1 y zonas frgiles visibles citogenticamente. pero sin hipermetilacin gnica y expresin normal de la protena FMR1 (Smeets. 1995). Estos hallazgos apoyan la hiptesis de que la responsable de este fenotipo patolgico es la prdida de expresin de la proteina FMR1. Familias poco comunes con retraso mental ligado al cromosoma X y una zona frgil demostrable citogenticamente en la regin cromosmica Xq2728, pero sin hipermetilacin o expansin de repeticin de (CGG)n en el gen FMR1. condujeron al descubrimiento de una segunda zona frgil ms distal en la regin Xq28 asociada con hipermetilacin y expansin de repeticin de (GCC). Individuos con expansin de la repeticin superior a 200 copias padecen alteracin mental leve. A diferencia del FRAXA. no existe una predisposicin sexual aparente en la transmisin del FRAXE (Knight, 1994). Se ha descrito otra zona frgil, an menos frecuente, con expansin d e repeticin de un trinucletido en la regin Xq28 distal al FRAXE, denominado FRAXF. No est claro si el FRAXF est asociado con disfuncin mental (Ritchie, 1994).

Sndromes XA frgil y XE frgil

El FRAXA, la causa ms comn de retraso mental hereditario (1 de cada 1.250 hombres), es la segunda causa de retraso mental de moderado a grave en hombres, tras el sndrome de Down. Los hombres afectados con este trastorno ligado al cromosoma X tienen tambin orejas grandes, cara alargada y nariz prominente. Aproximadamente 1 de cada 2.500 mujeres son portadoras heterocgotas de mutacin para el FRAXA, y una tercera parte de stas puede presentar evidencias de una ligera disfuncin mental. El sello citogentico del FRAXA es una "zona frgil" en la regin Xq27.3 del cromosoma X, causada por un defecto en la condensacin normal de la cromatina durante la mitosis. Aunque el patrn hereditario de la enfermedad est claramente ligado al cromosoma X. no se corresponde estrictamente con un patrn dominante o recesivo de expresin gnica. La principal caracterstica anmala ha sido la presencia de hombres fenofipicamente normales ("hombres normales transmisores") que son portadores obligados de la anomala gentica. Estos hombres son hijos de portadores demostrados del FRAXA: pasan el estado de portador a todas sus hijas y stas a su vez transmiten la enfermedad completamente expresada a una alta proporcin de sus hijos. El descubrimiento en 1991 de la anomala gentica que produce el FRAXA clarific inmediatamente su patrn inusual de herencia (Fu, 1991). La regin 5' no traducida del gen FMR1 situado en la posicin Xq27.3 del cromosoma X porta un triplete (CGG). repetido un nmero de veces variable. En sujetos normales, n vara hasta 50, pero en individuos con FRAXA clnicamente aparente, n es superior a 200 (denominada "mutacin completa"). Tanto los hombres como mujeres que portan un cromosoma X con n situado entre 50 y 200 (denominada "premutacin") son fenotipicamente normales, pero tienen un riesgo elevado de transmitir a sus hijos un alelo incluso de un tamao mayor. Esto se debe a la inestabilidad de los alelos con premutacin y su tendencia a aumentar en tamao durante las divisiones celulares meiticas que se producen en los gametos masculinos y femeninos. Los alelos de tamao normal son estables y se transmiten sin alteraciones. Parece que existe una mezcla de alelos con pequeas premutaciones en la poblacin, posiblemente de ori-

Trastornos

neurodegenerativos:

enfermedad de Huntington, atrofia muscular bulboespinal ligada al cromosoma X, ataxias espinocerebelares y atrofia dentatorubral-palidoluisana

La enfermedad de Huntington (HD), la atrofia muscular bulboespinal ligada al cromosoma X (SBMA), las ataxias espinocerebelares (SCA) tipos 1,2,3,6, 7 y 12 y la atrofia dentatorubral-palidoluisana (DRPLA) son enfermedades autosmicas dominantes o ligadas al cromosoma X (SBMA), caracterizadas por una degeneracin neuronal selectiva en el sistema nervioso central (SCN). En estos trastornos aparece una expansin de repeticin del trinucletido (CAG) en la regin codificante de un nuevo gen. que produce una elongacin anormal de una extensin de poliglutamina (La Spada, 1994). La protena anmala resultante forma inclusiones intranucleares en las neuronas. Se postula que las secuencias expandidas de poliglutamina en estas protenas conducen a alteraciones en sus propiedades de unin y a un aumento de su funcin que resulta txica para las neuronas de un modo selectivo. Se han observado inclusiones intranucleares. producidas por estas protenas anmalas, en vanos de estos trastornos (Reddy, 1997; Rubinsztein, 1999). Las repeticiones expandidas de los trastornos neurodegenerativos, as como otros trastornos de repeticin de tripletes, son inestables y tienden a incrementar su nmero en generaciones posteriores. Existe una correlacin positiva, aunque no absoluta, entre el nmero incrementado de repeticiones, el inicio precoz de la enfermedad y la gravedad clnica. Al contrario que el sndrome X frgil y la distrofia miotnica, en los que los principales aumentos del nmero de repeticiones suceden en la meiosis materna, la transmisin paterna produce las mayores expansiones en los trastornos neurodegenerativos.

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PATOLOGIA MOLECULAR

-o

Figura 6 6 - 7 . Deteccin de la expansin de repeticin de (CGG| en el sndrome X frgil. A, Diagrama de alelos normales, con premutacin y con m u t a cin completa en el locus del FRAXA. Cuando hay una expansin de la repeticin a una mutacin completa, la secuencia de la enzima de restriccin Eag I se metila y no se corta con la enzima. 6 , La familia de un paciente (cuadrado oscuro) con sndrome X frgil. Una transferencia Southern de ADN digerido con EcoR \IEag I de cada individuo en el rbol genealgico se examin con una sonda marcada de ADN que hbrida en 3' con la repeticin. Los tres sujetos de la parte derecha de la figura son normales (cuadrados y crculos claros). Obsrvese que cada uno de los dos hombres presenta una sola banda de 2,8 kb, mientras que la mujer tiene ambas bandas, una de 2,8 y otra de 5.2 kb. ste es el resultado esperado. La banda de 5,2 kb de la mujer es el cromosoma X inactivo normal (y, por tanto, metilado) de cada una de sus clulas. El ADN de este cromosoma est metilado y no se corta por Eag I. Sin embargo, la banda de 2,8 kb procede del cromosoma X activo no metilado (en este caso, Eag I cortar el ADN) de la m u j e r y de los hombres. El hombre afectado presenta una gran banda aumentada, c o m o consecuencia de una marcada expansin de repeticin de trinucletido adems de metilacin en la secuencia de la enzima de restriccin Eag I. Los tres individuos marcados por puntos negros son portadores de alelos con premutacin. En las mujeres, la distincin entre alelos normales y expandidos se observa ms claramente en el ADN procedente de sus c r o m o s o m a s X activos (no metilados). Aqu, hay bandas distintas de 2,8 kb y 3,0 kb. La resolucin no es tan buena en la parte superior del gel y los alelos de 5,2 y 5.4 kb apenas estn separados. Obsrvese que en la muestra de sangre perifrica procedente de la m a d r e del paciente afectado, la inactivacin del c r o m o s o m a X est sesgada con respecto a la expansin de repeticin: una proporcin m a y o r de cromosomas X normales de esta poblacin celular se ha inactivado aleatoriamente comparado con los cromosomas X que portan el alelo con premutacin. C, Separacin de repeticiones de trinucletido por electroforesis en gel posterior a la amplilicacin del locus mediante PCR (Levinson, 1994). Los carriles del 1 al 6 representan seis individuos diferentes; el carril M contiene un marcador de tamaos. Los productos de PCR se marcaron mediante la incorporacin de P-dCTP durante la reaccin de amplificacin y el gel seco se expuso sobre una pelcula de radiografa. Las mujeres heterocigotas presentan dos alelos, los hombres y las mujeres homocigotas muestran slo un alelo. Las bandas mltiples producidas con cada alelo se deben al fenmeno de "slippage" ("deslizamiento") de la ADN-polimerasa durante la reaccin de la PCR: la banda ms intensa se t o m ac o m o representativa del tamao real del alelo. (C, Cortesa de Dra. Anre Maddalena. Genetics & IVF Institute, Fairfax. VA.)
3 ?

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D I A G N S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N T I C A S

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En consecuencia, los casos de inicio juvenil de HD, DRPLA y las SCA se transmiten normalmente a travs del padre (Reddy, 1997). A diferencia de las SCA anteriormente descritas, la SCA 8 autosmica dominante no se asocia con una expansin del fragmento de poliglutamina, aunque si con una expansin de CTG no codificante (Koob, 1999), sta tambin difiere de las otras SCA en su patrn de inestabilidad de repeticiones, con expansiones predominantemente maternas, algunas m u y grandes. En este aspecto, la enfermedad se asemeja a la distrofia miotnica.

rar alelos que difieran en tamao por una sola unidad de repeticin. Esto e s de particular importancia cuando se necesita diferenciar entre alelos estables en el lmite superior de tamao y alelos con pequeas premiaciones o patolgicos. Sin embargo, cuando las expansiones de triplete son m u y grandes, como las manifestaciones completas de FRAXA o DM, puede ser imposible amplificar mediante PCR el gran segmento expandido de ADN: en este caso, se prefiere utilizar la transferencia Southern. La figura 66-7 ilustra el uso de transferencia Southern y PCR para detectar mutaciones completas del FRAXA y alelos del FRAXA con premutaciones.

Distrofia

miotnica Sndromes de Prader-Willi y de Angelman

Estos dos trastornos, cuyos genes estn situados aproximadamente en el mismo locus del cromosoma 15, casi siempre se estudian juntos, incluso aunque sean causados por dos genes diferentes y no tengan fenotipicamente casi nada en comn. El sndrome de Prader-Willi (PWS) se caracteriza por obesidad, retraso mental, hipoplasia genital y rasgos dsmrticos, mientras que el sndrome de Angelman (AS) presenta ataxia, rostro similar a una marioneta, retraso mental, sonrisa mantenida y crisis convulsivas. Pero comparten un potente mecanismo de impronta que determina la manifestacin de la enfermedad. Los dos trastornos suelen ser espordicos. El PWS. cuyo gen se desconoce, a menudo se origina por una delecn en la regin 15q11-13 del cromosoma paterno: slo el gen PWS paterno se expresa, por lo que resulta patolgico. Lo opuesto ocurre en el AS. causado por la delecn de un gen conocido (UBE3A). exclusivamente en el cromosoma heredado de la madre, que es el nico alelo que se expresa (Knoll, 1989; Matsuura. 1997). Por otra parte, el sndrome de Prader-Willi puede producirse por UPD en el cromosoma 15 materno, que porta slo la copia que no se expresa del gen; asimismo el sndrome de Angelman se origina por UPD en el cromosoma 15 paterno. Estos tenmenos se pueden delectar mediante FISH, haplotipado cromosmico con marcadores microsatlite o transferencia Southern con enzimas de restriccin sensibles a la mediacin que pueden distinguir la regin crtica materna metilada de la regin critica paterna no metilada (Lerer, 1994). Ms recientemente, se ha desarrollado un sistema de PCR diferencial que amplifica cualquier alelo metilado o no metilado cercano al gen SNRPN dentro de la regin critica, basado en la resistencia de las citosinas metiladas a la modificacin qumica por bisulfito sdico (Kosaki, 1997) (Fig. 66-8) Sin embargo, es importante tener en cuenta que ni la transferencia Southern ni los mtodos de PCR distinguirn entre los mecanismos de delecn o de UPD ni detectarn casos (ms frecuente en AS) debidos a mutaciones puntuales dentro del gen causante. Estos mtodos tambin distinguirn casos poco frecuentes de AS o PWS debidos a defectos primarios de impronta (Burger. 1997). los cuales tendran mayor riesgo de recurrencia.

La distrofia miotnica (DM) es un trastorno multisistmico autosmico dominante con un amplio rango de manifestaciones clnicas. En la infancia tarda o edad adulta temprana, los pacientes clnicamente ms caractersticos desarrollan miotona progresiva, debilidad y atrofia de los msculos distales de las extremidades y cara. Tambin es frecuente la aparicin de: cataratas, defectos en la conduccin cardiaca y atrofia leslicular. La enfermedad puede ser leve y consistir nicamente en cataratas que se desarrollan durante la vejez, o ser tan grave que presenta al nacimiento una degeneracin muscular marcada y retraso mental, seguido de muerte a edad temprana, A menudo se pueden observar todas las manifestaciones de la enfermedad en la misma familia, sucediendo en un patrn denominado por los genetistas como "anticipacin": en generaciones posteriores, la enfermedad se hace ms grave y con su inicio a edad ms temprana. La anticipacin est presente en todos los trastornos de repeticin de trinucletido, pero es ms llamativa en la DM, donde el fenotipo clnico puede progresar en tres generaciones desde cataratas a enfermedad congnita grave. La DM est causada por una expansin de repeticin de (CTG),, en la regin 3' no traducida del gen de la proteina cinasa miotonina en la regin cromosmica 19q13.3 (Mahadevan. 1992; Fu, 1992). En individuos normales, esta repeticin varia entre 5 y 35. y es genticamente estable. Las repeticiones CTG superiores a 50 son genticamente inestables y propensas a la expansin cuando se transmiten a generaciones posteriores. En el intervalo de 50 a 100, estas repeticiones suelen ser asintomticas o producir sntomas mnimos. Cuando estn presentes repeticiones mayores de 100, el fenotipo tpico de la DM es el ms probable. Aunque existe una correlacin entre la longitud de las repeticiones y la gravedad clnica, el nmero de repeticiones no es un indicador de pronstico fiable en un caso individual. Las expansiones extremas de 1.000 a 2.000 repeticiones observadas en la DM congnita se dan slo con la transmisin femenina de una repeticin inestable; la DM congnita siempre se hereda de la madre. No se conoce el mecanismo por el cual las repeticiones expandidas de trinucletido del gen de la proteina cinasa miotonina produce el fenotipo DM. Ya que la repeticin no se localiza en la regin codificante del gen. es posible que la expresin protenica est alterada o que estn perturbadas las interacciones reguladoras del ARNm.

Cnceres familiares
En cierto sentido, todos los cnceres son trastornos genticos causados por mutaciones en genes que controlan la proliferacin y diferenciacin celular. De un modo simplificado pero til, estos genes se pueden dividir en dos grupos: los que actan predominantemente para promover la proliferacin (profooncogenes) y los que actan de modo que impiden el crecimiento celular (genes supresores de tumores). Frecuentemente, estos sucesos mutacionales tienen lugar en una clula somtica, requiriendo alteraciones en varios protooncogenes o genes supresores de tumores antes de que se desarrolle un cncer caracterstico de esa clula particular (vase Cap. 64 para el estudio de oncogenes y genes supresores de tumores). En algunos individuos, la mutacin inicial puede darse en la linea germinal, heredada de un padre y presente en todas las clulas del organismo. Hasta la fecha, las mutaciones hereditarias cancergenas de la lnea germinal normalmente se han encontrado en genes supresores de tumores, aunque tambin se han observado en algunos oncogenes y en ciertos grupos de genes reparadores de ADN (Tabla 66-3). La mutacin hereditaria debera ser vista como un suceso inicial en el desarrollo del tumor y no c o m o suficiente por si sola para producir cncer: simplemente como el primer paso en una serie de mutaciones que finalmente conducen a un crecimiento celular incontrolado, anlogo a la primera mutacin somtica que inicia el desarrollo del tumor en cnceres espordicos.

Ataxia de Friedreich
La ataxia de Friedreich (FRDA) es la ms comn de las ataxias hereditarias, con una incidencia de 2 por cada 100.000 habitantes. A diferencia de otros trastornos de repeticin de trinucletido. la FRDA se hereda como una enfermedad autosmica recesiva y no muestra evidencias de anticipacin. La repeticin (GAA) expandida se localiza en el primer intrn del gen FRDA, reduciendo la expresin de la frataxina, una protena mitocondrial. Se desconoce la funcin de la Irataxina, aunque la disminucin de su expresin en pacientes con FRDA se asocia con respiracin mitocondrial defectuosa en el msculo esqueltico. El 97% de los alelos FRDA se deben a expansiones de (GAA); el resto se debe a otras mutaciones inactivantes que incluyen mutaciones puntuales (Lodi, 1999).

Anlisis de laboratorio de trastornos de repeticin de trinucletido

Las expansiones de repeticiones de trinucletido se demuestran rpidamente mediante transferencia Southern o PCR. Para la mayora de estos trastornos se prefiere la PCR, seguida por la separacin de los productos en un gel de electroforesis, debido a su rapidez, simplicidad y capacidad para sepa-

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Neg PWS

SECCIN V i l

PATOLOGA MOLECULAR

AS

desarrolla un solo tumor espordico. En un tercio de los casos, la primera mutacin del gen RB1 est presente en la lnea germinal del nio afectado, habindose heredado de un padre igualmente afectado o apareciendo como una nueva mutacin en la gametognesis. En este caso, la probabilidad de que el otro gen RB1 sufra una mutacin en al menos una clula precursora de la relina es superior al 90%. Como observ Knudson. en la mayora de pacientes con enlermedad familiar los tumores son bilaterales y multifocales (Knudson, 1971). dando a entender que varias clulas han sufrido mutaciones adicionales en RB1. No se sabe si las mutaciones RB1 por s solas son suficientes para la tumorognesis, aunque s parecen ser el suceso que lo inicia. El retinoblastoma familiar ha servido como un modelo de guia en la investigacin para la comprensin de muchos cnceres familiares. Esto ha conducido al descubrimiento de gran nmero de genes supresores de tumores importantes, no slo en la patognesis de algunos tumores familiares relativamente poco (recuentes, sino tambin en el desarrollo de tumores frecuentes como el carcinoma de m a m a de inicio precoz (Tabla 66-3) y el carcinoma de colon espordico (Weinberg, 1991).

Oncogenes: neoplasia endocrina mltiple de tipo 2

Hasta la fecha, slo existen algunos sndromes de cncer familiar, los cuales se sabe estn originados por una mutacin hereditaria de un oncogn. De ellos, los ms conocidos son la neoplasia endocrina mltiple de tipo 2A (MEN 2A) y sus variantes, el carcinoma medular de tiroides familiar (FMTC) y la neoplasia endocrina mltiple de tipo 2B (MEN 2B). Mutaciones de activacin en slo un alelo del protooncogn RET son suficientes para iniciar la lumorognesis en esle trastorno (Noli. 1999). Estos tres sndromes se caracterizan por hiperplasia de las clulas C tiroideas y carcinoma de tiroides. Las familias que padecen MEN 2A tambin presentan feocromocitomas y/o adenomas paratiroideos o hiperplasia paratiroidea. MEN 2B se caracteriza por la presencia de mltiples neuromas de mucosas de labios, boca y tracto gastrointestinal, hbito marfanoide, un curso clnico particularmente agresivo y una elevada proporcin de individuos afectados debido a nuevas mutaciones del gen RET. RET es una molcula de sealizacin con una zona receptora extracelular y una zona tirosina cinasa intracelular. Salvo algunas excepciones, las mutaciones conocidas de FMTC y MEN 2A son sustituciones de una sola base en uno de cinco codones en la zona extracelular: en cada caso se produce la sustitucin de una cistena por otro aminocido. Se conoce slo una mutacin de MEN 2B, la sustitucin de una sola base que produce una mutacin sustituliva en la zona tirosina cinasa. No se ha encontrado mutacin alguna en el 5% al 10% de familias afectadas con estos trastornos (Noli. 1999).

Figura 66-8. Anlisis electrofortico mediante PCR de patrones de metilacin de les sndromes de Prader-Willi y Angelman utilizando el mtodo del bisulfito sdico d e Kosaki (1997). En el sndrome de Prader-Willi, slo est presente el alelo materno metilado (banda superior), debido a la delecin del alelo paterno o a disomia uniparental para el alelo materno. En el sndrome de Angelman, slo est presente el alelo paterno no metilado (banda interior), debido a la delecin del alelo materno o a disoma uniparental para el alelo paterno. Tambin pueden realizarse anlisis similares mediante transferencia Soulhern usando enzimas de restriccin sensibles a la metilacin.

En comparacin con sus homlogos espordicos, los cnceres familiares suelen desarrollarse a una edad ms temprana, son frecuentemente multifocales y aparecen bilateralmente en los rganos pares. Knudson postul, observando estas caractersticas distintivas entre el retinoblastoma espordico y el familiar, que eran necesarios al menos dos sucesos mutacionales para producir un tumor (Knudson, 1971). En el caso de un tumor espordico, son necesarios dos sucesos mutacionales independientes en la misma clula para iniciar el desarrollo del tumor, mientras que en el caso del tumor familiar, la primera mutacin est ya presente en el nacimiento en cada clula del organismo, haciendo ms probable que un segundo suceso mutacional ocurra a una edad ms temprana y a menudo en ms de una clula. La hiptesis del "doble impacto" de Knudson es un concepto importante que ha guiado muchos estudios sobre la base gentica del cncer. La aclaracin de las mutaciones hereditarias en los sndromes del cncer familiar ha sido enormemente informativa, no slo para comprender estos trastornos poco frecuentes, sino tambin para entender los cambios fundamentales responsables de los cnceres ms comunes.

Genes reparadores de ADN: cncer de colon hereditario sin poliposis

Durante la bsqueda de posibles genes supresores de tumores c o m o causa de cncer de colon sin poliposis, se observ que secuencias polimrficas de repeticin de dnucletido (tambin conocidas c o m o microsatlites), como (CA), eran inestables en los tumores de individuos afectados. Debido a la demostracin de una inestabilidad similar en los microsatlites de bacterias con anomalas en los genes responsables de la reparacin de una incompatibilidad del ADN, la atencin se ha dirigido a la posibilidad de que genes humanos de reparacin del ADN, homlogos a los genes bacterianos, fuesen los responsables de las anomalas hereditarias del cncer de colon sin poliposis familiar (Fishel, 1993; Leach, 1993). De un modo anlogo a la iniciacin de la tumorognesis mediante genes supresores de tumores, la herencia de una copia de gen defectuoso MSH2. MLH1. PMS1. PMS2 o MSH6. seguido por la mutacin somtica de una segunda copia, origina clulas deficientes en la reparacin del ADN. Estas clulas acumulan con el tiempo mutaciones deletreas y se producen transformaciones malignas. No se comprende la aparente especificidad de tejido.

Genes supresores de tumores: retinoblastoma

Aunque los sndromes de cncer familiar debidos a mutaciones en genes supresores de tumores siguen un patrn dominante de herencia, los cambios a nivel celular a menudo parecen recesivos, ya que la tumorognesis se inicia (en la mayora de casos) slo cuando ambas copias del gen supresor del tumor estn inactivadas. La prdida del gen normal heredado del padre no afectado puede ser el resultado de una segunda nueva mutacin, pero ms a menudo es el resultado de la sustitucin por una copia duplicada del gen mutado heredado del padre afectado mediante mecanismos genticos como la no disyuncin cromosmica o la recombinacin mittica. Estos eventos tienen lugar en el retinoblastoma, un tumor de la retina originado por la prdida funcional de las dos copias del gen RB1. que codifica una protena, la RB, implicada en el ciclo celular y en la regulacin de la transcripcin. En la mayora de los casos, estos dos eventos mutacionales tienen lugar a nivel somtico y se

Anlisis de laboratorio de mutaciones del cncer familiar

La capacidad de analizar el ADN constitucional de un individuo para mutaciones hereditarias predisponentes al cncer tiene un enorme poten-

C A P T U L O 66

D I A G N S T I C O M O L E C U L A R D E LAS E N F E R M E D A D E S G E N T I C A S

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cial en la prevencin de enfermedades y su Iralamiento precoz: ya se ha convertido en el estndar de cuidados de algunos trastornos. Si se conoce una proporcin alta de mutaciones cancergenas en un determinado gen y estas mutaciones son relativamente pocas, su anlisis directo es sencillo y barato. De otro modo, si el gen es grande, si las mutaciones cancergenas son numerosas y estn ampliamente dispersadas o se producen en regiones del gen menos accesibles como intrones o secuencias reguladoras, los anlisis de mutacin deben estar menos dirigidos y ser capaces de explorar grandes extensiones de ADN en busca de anomalas. En estos casos, se pueden utilizar tcnicas como el anlisis SSCP. DGGE. el anlisis de hete-

roduplex o la secuenciacin directa de ADN. Los anlisis de truncacin de protenas (Powell. 1993) pueden ser tiles si un alto porcentaje de las mutaciones producen un producto protenico reducido. Estos mtodos pueden llevar mucho tiempo y ser costosos. Sin embargo, una vez que se identifica la mutacin en un sujeto afectado, el anlisis posterior de otros miembros de la familia es relativamente sencillo, ya que puede dirigirse especificamente a esa anomala. En la Figura 66-9 se ilustran varios mtodos de anlisis de mutaciones en el oncogn RETque origina la MEN 2A. Debido a que aproximadamente el 95% de familias con MEN 2A presentan una mutacin en uno de los cinco codones de la zona extracelular de RET. el anlisis de

Tabla 66-3 Trastorno

Cnceres familiares* Tumores asociados Gen APC PTCH BRCA1 BRCA2 PTEN p53 CHK2 CDHI CDKN2 MEN1 Localizacin cromosomica 5q21 9q22 17q?1 13q12 10q23 17p13 22 I6q22 9p21 11q13 Tumor genico APC PTCH BRCAt BRCA2 PTEN p53 CHK2 Cadherina 1 p16 Mon na

Genes supresores de tumores Poliposis adenomatosa familiar Sindrome basal-celular nevoide (de Gorlin) Cncer de marna familiar 1 Cncer de marna familiar 2 Sindrome de Cowden Sindrome de Li-Fraumeni

(aulosmicos dominantes) Carcinoma colorrectal. duodenal Carcinoma basal-celular, meduloblastoma Carcinoma de mama, ovrico Carcinoma de mama, de pncreas Carcinoma de mama, de tiroides Sarcomas, carcinoma de mama, leucemia, tumores cerebrales Carcinoma gstrico Melanoma Tumores de clulas de los islotes pancreticos, hipotisarios, paraliroideos Osteocondromas/sarcomas Neurofibroma/sarcoma, feocromocitoma Neuroma acstico, meningioma Tumores gastrointestinales Retinoblastoma, osteosarcoma Hemangioblastoma, carcinoma renal, feocromocitoma Tumor de Wilms

Cncer gstrico familiar Melanoma lamiliar Neoplasia endocrina mltiple tipo 1 ( M E N 1) Exostosis multiples Neurofibromatosis tipo 1 Neurofibromatosis tipo 2 Sndrome do Peutz-Jeghers Retinoblastoma Enfermedad de Von Hippel-Lindau

EXT1 EXT2 NF1 NF2 STK11 RB1 VHL WT1

8q24 11p12-p11 17q11 22q12 !9p13 13q14 3p25 11p13

EXT1 EXT2 Neurofibromna Merlina STK11 pRB VHL W11

Tumor de Wilms Oncogenes (autosomicos dominantes) Melanoma familiar Melanoma Neoplasia endocrina mltiple Carcinoma medular de tiroides, tipo 2 ( M E N 2) feocromocitoma. hiperplasia paratiroidea/adenoma Carcinoma renal papilar Carcinoma renal papilar hereditario de crecimiento Genes reparadores de ADN (aulosmicos Cncer de colon hereditario sin poliposis ( H N P C C ) dominantes) Carcinoma colorrectal. endometrial

CDK4 RET MET

I2q13 I0q12

CDK4 RET Receptor del factor del hepatocito

7q31

MSH2 MLH1 PMS1 PMS2 MSH6

2p16 3p21 2q32 7p22 2p16

MSH2 MLHI PMS1 PMS2 MSH6

Genes reparadores de Ataxia telangiectasia Sndrome de Bloom Anemia de Fanconi

ADN

(aulosmicos

recesivos) Linfomas otros Varios Leucemia mielgena aguda

Xeroderma pigmentoso

Carcinomas de piel de clula basal y de clula escamosa

ATM BLM FANCA FANCC FANCD FANCE FANCF XPA-XPE

11q22 15p26 16q24 9q22 3p26-p22 6p22-p21 I1p15 Varios

ATM BLM FANCA FANCC FANCD FANCE FANCF Varios

' Para una luente de informacin concisa, especialmente til, acerca de los sndromes del cncer lamillar, vase Lmdor. 1998 Esta disponible una informacin mas amplia en la pagina web Online Mendelian Innerilance m Man (OIM). http //www3 neb nlm nih gov/Omim/searchomim.html

1386

S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR

mutacin del ADN es muy eficaz en la identificacin presintomtica de portadores del gen de MEN 2A (Lips, 1994). La situacin es ms compleja con los genes supresores de tumores y de reparacin del ADN. Las mutaciones patolgicas en estos genes son numerosas y extendidas, a veces exclusivas de una determinada familia, y suelen necesitar una bsqueda costosa de mltiples secuencias de ADN hasta encontrar la mutacin. Desafortunadamente, incluso despus de una bsqueda exhaustiva de secuencias codificantes y tambin algunas regiones no codificantes, hasta la fecha slo se consigue una tasa de deteccin de mutaciones del 90% en el retinoblastoma familiar, siendo bastante ms baja en otros trastornos. Una complicacin adicional del anlisis de mutaciones de genes predisponentes al cncer est relacionada con el significado funcional de algunas mutaciones. Mientras que las mutaciones de truncacin de protenas en genes supresores de tumores normalmente son significativas, las mutaciones sustitutivas. que producen la suslitucin de un solo aminocido, pueden

ser completamente benignas. En muchos casos, son imposibles o impracticables estudios funcionales de supuestas mutaciones cancergenas, y el significado potencial de la mutacin slo puede evaluarse mediante grandes estudios clnicos de poblacin realizados durante largos perodos de tiempo. Por ltimo, el anlisis del riesgo de cncer slo es til si los resultados pueden afectar de forma positiva al Iratamiento clnico. En el caso de la MEN 2, el anlisis de mutacin en RET es bastante eficaz en la identificacin de sujetos con riesgo y, si la prueba es positiva, el tratamiento recomendado (tiroidectoma profilctica, seguimiento clnico durante toda la vida para el leocromocitoma y la hiperplasia/adenoma de paratroides) puede salvar la vida y tener poco riesgo asociado o morbilidad. La colonoscopia peridica y la extirpacin de plipos son efectivas en la prevencin del cncer colorrectal en sujetos con mutaciones positivas para el cncer de colon hereditario sin poliposis. Por el contrario, hasta la fecha existen pocas opciones atractivas, o ninguna, para prevenir el desarrollo de cncer en otros sndromes predisponentes como el sndrome de Li-Fraumeni o el cncer de m a m a familiar.

Figura 66-9. Anlisis de mutacin del protooncogn RE de la neoplasia endocrina mltiple tipo 2 A (MEN 2A). A. U n sujeto control (WT/WT) e individuos afectados de tres familias diferentes se examinaron, mediante secuenciacin directa, para mutaciones en el exn 11 del gen RET. En estos individuos se detectaron diferentes mutaciones sustitutivas heterocigotas en el codn 634, cambiando, respectivamente, la cistena normal por tirosina (C634Y), glicina (C634G) y fenilalanina (C634F). S. Exploracin de m u t a c i o n e s del exn 1 1 mediante anlisis de polimorfismo conformacional de ADN monocatenario (SSCP). La nica banda observada en la m u e s t r a del paciente indica un alelo mutado. Posteriormente, se identific p o r secuenciacin directa c o m o u n a mutacin en el codn 6 3 4 (TGC->CGC). Est tcnica suele ser una alternativa til en la exploracin mediante secuenciacin directa. C. Anlisis de mutacin p o r PCR y digestin con enzimas de restriccin en sujetos d e riesgo (carriles 1 a 8) de u n a familia q u e porta la mutacin C 6 3 4 Y . Esta mutacin (TGC->TAC) crea u n a secuencia de reconocimiento para Rsa I en el exn 11. Se gener un producto de PCR de 279 bp del exn 1 1 que inclua el codn 634 y le digerido con Rsa I. Normalmente, est presente una sola secuencia para Rsa I en este producto de PCR, y la digestin produce fragmentos de 2 4 4 y 35 bp. Cuando est presente la mutacin C634Y, se producen fragmentos de 169, 75 y 35 bp (carriles 4, 6, 7 y el control positivo). La presencia constante de la secuencia normal para Rsa I es una caracterstica de control m u y til, ya que su digestin garantiza que el anlisis est funcionando adecuadamente. Una vez que la mutacin se h a identificado en u n a familia, se facilita su estudio en el resto de m i e m b r o s familiares. (8, Cortesa de Dr. Brian Dawson, Universidad de T e x a s Southwesterm Medical Center, Dallas, TX.)

CAPTULO 66

DIAGNSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENTICAS

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Hemocromatosis
La hemocromatosis hereditaria (HH), reconocida desde el inicio por su manifestacin clnica completa con la triada cirrosis, diabetes mellitus y piel bronceada, se pens era un trastorno poco usual de sobrecarga de hierro que afectaba a 1 de cada 5.000 caucsicos. Sin embargo, cuando estudios genticos ligaron el gen causante de la enfermedad al locus HLA del cromosoma 6 y se utilizaron pruebas bioqumicas de sobrecarga de hierro (fundamentalmente saturacin de la transferrina), se reconoci que era bastante comn la predisposicin gentica subyacente a la sobrecarga de hierro. En efecto, la HH actualmente se reconoce como un trastorno autosmico recesivo con una frecuencia de portadores elevada de uno de cada ocho en personas con ascendencia del norte de Europa, siendo el trastorno gentico ms frecuente en la poblacin caucsica norteamericana. L a incidencia de homocigotos con riesgo es de 1 de cada 250, aunque slo una fraccin de ellos acumula suficiente hierro en exceso para ocasionar el dao histico asociado con el trastorno clsico. El conocimiento de la hemocromatosis hereditaria entr en una nueva era con la identificacin del gen HFE (denominado inicialmente HLA-H) dentro del locus del complejo mayor de histocompatibilidad en el cromosoma 6 (Feder. 1996). La protena HFE. aunque es una molcula similar a la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad. no se une ni presenta pptdos endgenos, y no parece tener ninguna funcin inmunolgica. Es decir, se acumulan evidencias de que la protena HFE mteracta con el receptor de la transferrina y modula la absorcin entrica del hierro de la dieta (Waheed. 1999). Mutaciones en el gen HFE afectan a esta funcin reguladora, originando una absorcin aumentada de hierro y su almacenamiento en los tejidos. Una sola mutacin sustitutiva en el gen HFE. la C282Y. que produce un cambio de lirosma en lugar de cisteina en el aminocido 282 de la proteina HFE. est presenta en estado homocigoto en el 80% al 90% de caucsicos con hemocromatosis. Un pequeo porcentaje de pacientes con hemocromatosis son heterocigotos compuestos, portando un cromosoma con una mutacin C282Y y otro con una mutacin H63D. La mutacin H63D es un polimorfismo comn, con una frecuencia de portadores del 20%; el nmero de heterocigotos compuestos afectados con hemocromatosis todava sugiere que el genotipo H63D contribuye a la sobrecarga de hierro. Aunque los homocigotos C282Y claramente presentan un riego elevado de desarrollar hemocromatosis. est menos claro el riesgo para personas con otros genotipos. Brandhagen combin los resultados de vanos estudios para estimar las odds ratos (OR) ("razones de probabilidad") para el desarrollo de sobrecarga de hierro en los genotipos siguientes comparados con el homocigoto "tipo salvaje": homocigoto C282. OR = 2.300; heterocigoto compuesto C282/H63D, OR = 49,4; homocigoto H63D, OR = 6,3: heterocigoto C282Y, OR = 3,1; heterocigoto H63D, OR = 1 . 6 (Brandhagen, 1999), Las mutaciones C282Y y H63D son sustituciones de un solo nuclelido y pueden analizarse fcilmente mediante una variedad de tcnicas, normalmente inicindose con una amplificacin por PCR. El anlisis de mutacin en el gen HFE es ms til para confirmar el diagnstico ante una sospecha de hemocromatosis en un sujeto con sobrecarga de hierro, y puede eliminar la necesidad de realizar una biopsia heptica, que es la tcnica de confirmacin del diagnstico. La flebotoma teraputica es bastante eficaz, pues reduce los depsitos de hierro en individuos afectados, pudiendo prevenir el desarrollo de enfermedad clnica. El anlisis de mutacin tambin es til en la evaluacin del riesgo en familiares de pacientes positivos para la mutacin. Sin embargo, es mucho menos efectivo como prueba de cribado, ya que se estima que del 10% al 15% de individuos que desarrollan hemocromatosis no portan una mutacin conocida en el gen HFE. Hoy en da, son ms tiles los estudios bioqumicos que calculan la sobrecarga de hierro, sobre todo el porcentaje de saturacin de la transferrina (Bacon, 1999).

requeridos para su traduccin y dos ARN ribosmicos (Hammans, 1994). El ADN mitocondrial se autorreplica y es transmitido nicamente por herencia materna, ya que la mitocondria de un espermatozoide no se incorpora al cigoto tras la fertilizacin del vulo. Las anomalas patolgicas del ADN mitocondrial pueden producirse por distintos mecanismos (Hammans. 1994: Jones. 1999). Grandes deleciones nicas (y menos frecuentemente duplicaciones) que aparentemente ocurren de forma espordica durante la oognesis son tpicas del sndrome de Kearns-Sayre, una miopata caracterizada por oftalmoplejia progresiva externa y retinopata pigmentaria. Una gran variedad de trastornos se caracterizan por pequeas deleciones mltiples y muestran patrones de herencia mendelanos autosmicos dominantes o aulosmicos recesivos, ya que aparentemente se deben a defectos indeterminados en genes nucleares importantes para la replicacin del ADN mitocondrial Los trastornos ms caractersticos desde el punto de vista gentico son los que siguen un patrn estricto de herencia materna, nunca presentan transmisin desde un hombre afectado y pasan de una mujer afectada tanto a sus hijos como a sus hijas. Estas enfermedades suelen deberse a mutaciones puntuales en uno de los genes que codifican un ARN de transferencia (p, ej., epilepsia mioclnica y fibras rojas rotas [MERRF] y miopata mitocondrial, encefalopata, acidosis lctica y episodios similares a ictus [MELAS]) o una protena mitocondrial (p. ej neuropata ptica hereditaria de Leber). Adems de las encefalomiopatas hereditarias, se cree que acumulaciones de mutaciones mitocondriales somticas, especficas de tejido, pueden contribuir al desarrollo de muchos trastornos degenerativos comunes de inicio tardo y quiz al mismo envejecimiento (Jones. 1999). La confirmacin de laboratorio de las grandes deleciones del ADN mitocondnal presentes en el sndrome de Keams-Sayre se consigue fcilmente mediante anlisis de transferencia Southern de ADN mitocondrial del tejido afectado, usando ADN mitocondrial completo marcado como sonda. Las mutaciones puntuales de otros trastornos se pueden analizar mediante otras tcnicas.

FUTURO DEL DIAGNSTICO MOLECULAR

De los ejemplos citados en este captulo, que representan algunos de los muchos trastornos hereditarios para los cuales se dispone de una prueba de ADN, es evidente que el diagnstico molecular de la enfermedad gentica es una de las aplicaciones ms apasionantes de la patologa molecular, repercutiendo en las dems debido el hecho de que casi todas las enfermedades presentan algn componente gentico. Se puede anticipar que la gentica molecular diagnstica asumir un papel ms predominante en la sanidad pblica y la medicina preventiva de lo que ha sido hasta el momento, debido a que el Proyecto Genoma Humano sigue descubriendo importantes genes patolgicos (sobre todo los de trastornos ms frecuentes) a una velocidad cada vez mayor, a la tecnologa de secuenciacin rpida del ADN y a que la deleccin multiplex de mutaciones contina mejorando. La llegada d e los "chips" de ADN que contienen miles de sondas algn dia podrn permitir el genotipado amplio y la prediccin de enfermedades durante el transcurso de la vida para cientos de trastornos a partir de una sola gota de sangre (vase Cap. 61). Frente a estos prometedores avances, habr que sopesar el impacto tico de tal "invasin" gentica y el posible potencial curativo de la terapia de sustitucin gnica. De estas inquietudes, ha surgido la opinin generalizada de que los resultados de las pruebas de gentica molecular son diferentes (principalmente debido a su poder predictivo) al resto de las informaciones mdicas y deben someterse a polticas ms rigurosas que protejan la privacidad, la confidencialidad, el consentimiento informado y la proteccin frente a la discriminacin. Otros creen que los resultados de estas pruebas, aunque de gran alcance, no necesitan ms carga emocional que otros estudios clnicos realizados en la medicina y patologa del laboratorio Sin embargo, muchos estados y pases estn buscando soluciones reguladoras al darse cuenta de sus posibilidades de abuso; en Estados Unidos, estn pendientes o ya aprobadas una variedad de iniciativas legislativas cuyo objetivo es salvaguardar la informacin gentica y la privacidad. Cualquiera que sea el acuerdo final alcanzado, no hay duda de que la gentica molecular ser quien conduzca la prctica mdica del siglo XXI, y prcticamente todo paciente, sano o enfermo, notar su impacto,

Trastornos del ADN mitocondrial

Adems de los 6 billones de bp del ADN que constituyen el genoma diploide nuclear en humanos, tambin se codifica inlormacin gentica vital en molculas de ADN mitocondrial. Estas molculas de ADN bicatenario circular de 16.500 bp estn presentes en 2 a 10 copias en cada una de las centenares de mitocondrias celulares. El ADN mitocondrial codifica 13 protenas de la cadena respiratoria y la adenosinatrilosfato-sintasa, 22 ARN de transferencia

1388

SECCIN

VII

P A I O I O G A MOLECULAR

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CAPTULO 66

DIAGNSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES GENTICAS

1389

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C A P T U L O

67

Pruebas de paternidad: empleo del ADN, polimorfismo y otros marcadores genticos

Herbert F. Polesky, M.D.
EXCLUSIN DE LA PATERNIDAD Poder de exclusin Probabilidad de exclusin acumulativa ELECCIN DE UN SISTEMA GENTICO PARA USO EN LAS PRUEBAS DE PATERNIDAD SISTEMAS CLSICOS Sistemas de antgenos eritrocitarios Sistemas de protenas sricas Enzimas eritrocitarias Antgeno leucocitario humano POLIMORFISMOS DEL ADN Pruebas de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin Reaccin en cadena de la polimerasa 1394 1391 1392 1390 OTROS TIPOS DE PRUEBAS INCLUSIN DE LA PATERNIDAD Clculo del ndice de paternidad Probabilidad de paternidad Estimacin de la paternidad con un padre ausente Reconstruccin de familias DOCUMENTACIN E INFORMACIN DE LOS RESULTADOS CONCLUSIN BIBLIOGRAFA 1398 1398 1401 1397 1397

En casos de paternidad dudosa "el laboratorio utilizar un grupo de pruebas... que incluye mltiples sistemas genticos independientes. Este grupo de pruebas proporcionar, salvo raras excepciones, un supuesto padre no excluido con un ndice de paternidad de al menos 99" (Standards lor Parentage Testing Laboratories, 1999). En el libro de Reyes (3:16-27), aparece una referenda de paternidad discutida citada con frecuencia, en la cual Salomn toma una decisin sobre la maternidad de un nio, amenazando con usar su espada para ofrecer un trozo del nio a cada demandante. Cuando la paternidad est en discusin, el arbitro de la verdad se suele encontrar ante un dilema similar al que se enfrent Salomn: falta de testigos del suceso y la probabilidad de que los protagonistas puedan no saber o decir la verdad. El descubrimiento del grupo sanguneo ABO por Landsteiner (1900) y el reconocimiento de que estas caractersticas medibles seguan las leyes genticas descritas por Gregor Mendel proporcionaron una prueba objetiva de laboratorio que poda usarse para apoyar a los tribunales cuando deben decidir si una persona ha sido falsamente acusada de paternidad. En Estados Unidos, las leyes sobre el uso de marcadores genticos para demostrar la no paternidad fueron promulgadas en 1935 (Schatkin. 1952). En aos posteriores aumentaron bastante los conocimientos acerca de sistemas tiles de marcadores genticos. En 1976. pautas conjuntas desarrolladas por una comisin de la American Medical Association-American Bar Association (AMA-ABA) recomendaron siete sistemas para las investigaciones de grupos sanguneos en caso de paternidad discutida (ABO, Rh. MNS. Kell, Duffy, Kidd y HLA) (Male, 1976). Tambin se reconocieron como tiles otros sistemas genticos tales como las protenas polimrficas del suero y las enzimas de los glbulos rojos. Se recomend el uso de estimaciones matemticas de la paternidad en los casos en los que no se observase exclusin. En 1983, como una continuacin del informe de la AMA-ABA y de la conferencia internacional (Airlie, 1982) sobre Inclusion Probabilities in Parentage Testing, la comisin sobre pruebas de paternidad de la American Association

ol Blood Banks (AABB) public Guidelmes lor Reporting Estimates ot Probability ol Paternity (Walker, 1983). que aconsejaba sistemas mltiples de anlisis (a elegir por el experto) para proporcionar pruebas de no paternidad con un 95% de probabilidad, cuando se analiza a un hombre al que se le ha acusado en falso, La Tabla 67-1 es un resumen de los sistemas usados en 1988. Cuando estas guas se desarrollaron, no se apreci la importancia en las pruebas sistemticas de paternidad de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) del acido desoxirribonucleico (ADN), descritos en 1980 (Botstem. 1980). Sin embargo, cuando se public en 1990 la primera edicin de los Standards lor Parentage Testing Laboratories, se incluyeron las peticiones especificas de pruebas de RFLP junto con los que actualmente suelen denominarse sistemas clsicos (antgenos de superficie de glbulos roios, antigenos leucocitarios humanos, enzimas eritrocitarias y marcadores genticos de protenas sricas). Este documento fue la base para la creacin de un programa de inspeccin y acreditacin que inclua datos concretos acerca de la identificacin de los sujetos analizados, los mtodos de anlisis, los clculos y el informe. En 1999 se public la cuarta edicin de estas normas.

EXCLUSIN DE LA PATERNIDAD
El objetivo lundamental de los anlisis de marcadores genticos en casos de paternidad discutida es identificar al padre biolgico de un determinado nio. Aunque esto no puede realizarse con absoluta certeza, los anlisis de marcadores genticos pueden proporcionar pruebas objetivas de no paternidad. Mediante el uso de mltiples sistemas genticos, es posible excluir a la mayora (> 99%). pero no a todos los que no son padres. En sistemas que siguen las leyes de la gentica mendeliana, las exclusiones se identifican mediante el hallazgo de excepciones al patrn hereditario esperado. Cuando se cuestiona la paternidad, la interpretacin de los resul-

CAPTULO 67

PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.

1391

Tabla 67-1

Informe de los s i s t e m a s utilizados p o r los laboratorios d e p r u e b a s d e paternidad: 250.000 casos a p r o x i m a d a m e n t e * Marcadores genticos Anlgenos erilrocitarios H LA serolgico Enzimas erilrocilarias Protenas sricas ADN RFLP PCR .,

en el padre en cuestin. El hallazgo de exclusin indirecta al menos en dos sistemas independientes suele ser una prueba suficiente para llegar a una conclusin de no paternidad.

Poder de exclusin
2-3 2-3 <1 <1 94 44 54 Antes del anlisis es posible proporcionar una estimacin de la posibilidad media de que el anlisis demuestre no paternidad si el acusado n o es el padre. Para cada sistema gentico se puede calcular un poder de exclusin medio (A) basado en las frecuencias gnicas (p,g) de los alelos en el sistema. En 1930, Wiener inform de una ecuacin general para un sistema de dos alelos: A - pq(j-pq). Se requieren frmulas ms compleas cuando el sistema presenta mltiples alelos (Walker, 1978). La ecuacin general tambin se ha adaptado (Brenner, 1990) para determinar A en sistemas que no presentan alelos diferenciados, como los sistemas de RFLP de ADN, del siguiente modo: A = h (1-rW)
2

T a s a de exclusin global. 28.3%. Porcenlaie de casos analizados por el mtodo Datos procedentes de American Association ol Blood Banks. Bethesda. MD. 1998.

(67-1)

tados de la prueba depende normalmente de que se asuma que la muestra definida como materna procede de la madre biolgica del nio. Deben compararse los fenotipos del nio y de la madre para determinar si los resultados son coherentes con los patrones hereditarios esperados. Un alelo presente en el nio pero no en la madre se denomina "gen obligatorio paterno" (OG). Si tanto el alelo del nio como el de la madre son idnticos, existen posibilidades alternas (dos) para el gen paterno. Si el hombre analizado no presenta la posibilidad de transmisin del OG y el marcador para el gen est ausente en la supuesta madre, la exclusin observada se denomina "directa" (Tabla 67-2). Este tipo de exclusin en uno de los sistemas clsicos, normalmente es suliciente para concluir que el hombre analizado no es el padre biolgico del nio en cuestin. En los sistemas de ADN. debido a que la frecuencia de mutacin es bastante superior a la observada en los sistemas clsicos, la exclusin de un solo locus no se considera prueba suficiente para establecer la no paternidad {Slandards. 1999). Tambin hay una exclusin directa cuando el nio o el hombre analizados son heterocigotos y los dos marcadores identificados estn ausentes en la otra persona. Este tipo de exclusin directa a veces se denomina "exclusin de dos haplotipos". En los casos en los que slo estn disponibles para el anlisis el nio y un supuesto padre, es posible establecer la no paternidad si el individuo estudiado o el nio tienen dos haplotipos. ninguno de los cuales est en el otro. La ausencia de un marcador gentico esperado en el nio cuando el padre en cuestin parece ser homocigoto para el gen se denomina "exclusin indirecta", tambin denominada a veces como homocigosidad inversa. Una exclusin indirecta no es prueba suficiente para concluir que el sujeto analizado no es el padre. La interpretacin de la homocigosidad inversa como una exclusin indirecta supone que los sujetos analizados presentan los dos alelos del locus idnticos. Este resultado puede representar la presencia de una mutacin en uno de los individuos analizados o es posible que est presente un inusual alelo nulo (nuil) (u otro alelo no detectado) tanto en el nio como

donde H es el porcentaje de homocigosidad y h el porcentaje de helerocigosidad observados del locus. En la Tabla 67-3 se muestran valores de A para sistemas seleccionados Un sistema altamente polimrfico tiene un poder de exclusin mayor que un sistema con slo algunos alelos o que presente uno o dos alelos frecuentes y numerosos alelos poco frecuentes.

Probabilidad de exclusin acumulativa

Cuando el anlisis incluye varios sistemas genticos independientes, se puede calcular la probabilidad de exclusin acumulativa (CPE) usando la frmula siguiente: CPE = 1-(1-P1) (1-P2) (1-P3)... (1-P/7) (67-2)

donde P es el A para cada sistema usado. Tal como se muestra en la Figura 67-1. como cada vez se usan ms sistemas, con cada prueba adicional se excluye a algn individuo ms. Con una batera de sistemas de marcadores de ADN apropiadamente seleccionada, es posible conseguir fcilmente u n a CPE igual o superior a 0,995.

ELECCIN DE UN SISTEMA GENTICO PARA USO EN LAS PRUEBAS DE PATERNIDAD

El modelo de sistema gentico para las pruebas de paternidad seria aqul en el que se puede encontrar un nico marcador tanto en el nio como en el supuesto padre. Actualmente, salvo la secuenciacin gmca, ninguno de los sistemas de marcadores proporciona hallazgos tan especficos. Por tanto, se usan mltiples sistemas genticos que renen ciertos criterios para las prue-

Tabla 67-2

Exclusin d e p a t e r n i d a d : fenotipo (genotipo) Hijo AB(ab) 3.25:4.76 11.12 A(aa, a"x") 3,25:4,76 11 (11.11 u 11,"x") 7.8 Jk(a+b-)[aa o a"x") 3,25 (3.25:3,25 o 3.25:"x" 11 (11,11 u 11, "x") 11 (11.11 u 11, "x") R2r (cDE/ce) Madre A(aa. ah) 3.25 5,31 8(8,8 o 8,"x") A(aa. a"x") 3,25.4,76 11.12 no disponible Jk(a+b+)(ab] 4.76 (4.76:4.76 0 4.76:"x") 11,12 no disponible R2 (cDE/cE) Hombre analizado O(hh) 3,25:5.66 12,14 BR 4,95:5.66 8.9 11.12 Jk(a-b+)|bb o b"x") 3.25:5.66 12(12.12 0 12, V) 12(12,12 0 12,"x") R1R2(CDe/cDE) o Rzr (CDE/ce)OG b 4.76* 11 (materno) a o V 3,25 o 4.76 11 o "x" 7u8 a o "x" 3.25 o "x" (materno) t 1 0 "x" 11 0 " X " r(ce) o Ro (cDe)

Tipo de exclusin Directa

Dos haplotipos

Indirecta

Probable

'Supone que la secuencia de restriccin es un alelo diterenciado La Irecuencia de Rz (CDE) esta entre 0.02 y 0.004. OG gen obligatorio paterno

1392

SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

Tabla 67-3 Poder de exclusl (A): sistemas de p r u e b a s seleccionados* Sistema ABO RH ACP D2S44 D7S467 D10S28 HUMvWA D7S820 DI3S317 "Los valores varan en poblaciones diferentes. A 0.166 0.283 0.239 0,95 0.93 0,96 0.65 0,523 0,417

SISTEMAS CLSICOS Sistemas de antgenos eritrocitarios

Los seis grupos sanguneos (ABO, Rh. MNS. Kell, Duffy y Kidd) han sido utilizados en las pruebas de paternidad. Las tcnicas de tipado utilizadas son las que se realizan de forma sistemtica en los laboratorios de inmunohematologia que incluyen las pruebas en tubo y en placas microtiler. Las normas de la AABB requieren que estas pruebas se hagan por duplicado, de forma independiente y con distintos reactivos. Cuando se utilizan reactivos de antiglobulina, deben realizarse pruebas para demostrar que las clulas no son reactivas. Slo es necesaria una prueba especfica de antiglobulina directa cuando todas las pruebas que utilizan antiglobulina son reactivas. Siempre que sea posible, debe hacerse un control de calidad de los reactivos de tipado, usando clulas control heterocigticas para demostrar la reactividad y especificidad del mtodo utilizado. Tradicionalmente. el grupo sanguneo ABO ha sido un estndar en los casos de paternidad discutida. Cuando se realiza el tipado de clulas y del suero, normalmente los resultados de las pruebas son inequvocos. Se debe tener cuidado cuando se utilizan reactivos monoclonales y los resultados no son los esperados (Stroup, 1990). Para la interpretacin de la paternidad basada en pruebas serolgicas, hay que tener en cuenta que slo se puede deducir un probable genotipo a partir del fenotipo observado, a no ser que el hombre analizado sea O (OO.hh), AB o si la supuesta madre es A o B y el hijo es O. Cuando las clulas lipan como A o AB, el subtipado, si se realiza, debe interpretarse c o n precaucin. En una variante poco frecuente, el fenotipo Bombay, existe un fallo en la expresin del antgeno esperado A o B: sin embargo, el suero de estos individuos contiene anti-H, lo cual sera detectado fcilmente utilizando clulas del grupo O para la determinacin inversa de grupo. Otro raro fenotipo informado es el cis AB, en el que se heredan A y B como un solo alelo AB (Salmn, 1984). El sistema Rh es uno de los sistemas de antgenos eritrocitarios ms informativos. Mediante las pruebas habituales con anti-D, -C, -E, -c, -e (en E-positivos) y -Cw (en C-positivos), es posible identificar 10 fenotipos comunes y numerosos genotipos probables. La secuenciacin gnica de la regin RH del cromosoma 1 indica la presencia de dos genes, uno para D y otro para CcEe (Colin, 1991). Cada persona presenta dos haplotipos, cada uno de los cuales tiene mltiples marcadores reconocidos por los reactivos de tipado. Los resultados de la prueba slo pueden sugerir el fenotipo ms probable de una persona. Tambin debe considerarse la raza de la persona que est siendo analizada, ya que las frecuencias de haplotipos difieren entre los grupos raciales. Aparte de los haplotipos ms comunes, se han descrito varios haplotipos poco frecuentes con antgenos esperados que se han perdido o suprimido (Tippett, 1987). La aparicin de uno de estos haplotipos en un tro puede originar una aparente exclusin materna o una exclusin indirecta del padre biolgico. Algunos anticuerpos anti-Rh reconocen antigenos compuestos (p. ej.. los antiC suelen contener anti-Ce [rhi] y no reaccionan con clulas que contienen el haplotipo CDE [Rz]). Cuando se encuentran hallazgos inusuales en el tipado de Rh, es importante usar antisueros y mtodos diferentes, junto con el estudio de otros miembros familiares. Con et sistema MNS es ms probable la identificacin de padres falsos que con cualquier otro sistema de antigenos eritrocitarios. Es importante ser cauto cuando se interpretan los resultados de la prueba, a la hora de asignar un genotipo a partir de un fenotipo observado. En sujetos de raza negra, un alelo observado frecuentemente, el S", puede ser mal interpretado como ausencia de un producto gnico esperado. Las personas que parecen ser homocigticas para Sos pueden ser realmente SS o sS". Este hallazgo puede producirse con M y N, pudindose lipar algunas personas como S negativo, s negativo. Normalmente, estas personas tambin son U negativo (Holliman, 1989). Otros alelos poco frecuentes, como M- y M', pueden dar resultados que parecen excluir la paternidad, cuando, de hecho, su existencia en un padre y un nio casi demuestran la paternidad.
U

bas de paternidad. Lo ideal es que el sistema presente mltiples alelos distribuidos en la poblacin, de modo que tenga un elevado poder de exclusin y el fenotipo menos usual presente una frecuencia que puede determinarse con fiabilidad. Todos los marcadores del sistema deben expresarse como codominantes (sin alelos nulos), deben conocerse las frecuencias de mutacin y stas deben ser bajas; los fenotipos deben ser estables en condiciones habituales de almacenamiento. Los mtodos para la deteccin de marcadores deben ser fiables, reproducibles y factibles para la gran mayora de laboratorios. Debe conocerse la gentica del sistema y a continuacin establecerse los patrones hereditarios (leyes mendelianas). El sistema debe ser independiente de otros marcadores analizados habitualmente. Si el sistema se crea para calcular estimaciones de paternidad, deben establecerse las frecuencias gncas en varias poblaciones. La mayora de los sistemas clsicos descritos anteriormente presentan uno o ms problemas que deben considerarse antes de su inclusin en la batera de pruebas. Es comn a estos sistemas el problema de los alelos nulos o variantes cuantitativas que dificultan la interpretacin cuando existe homocigosidad inversa. En algunos sistemas, las variantes se detectan por un mtodo o grupo de reactivos pero no por otro. Puede haber una variacin biolgica en la estabilidad de varios marcadores durante el transporte o almacenamiento. En algunos sistemas en los que se requiere el uso de anticuerpos, la variacin en los reactivos puede crear problemas a menos que se utilicen procedimientos de control de calidad apropiados. Algunos marcadores no se expresan completamente hasta una cierta edad, poniendo limitaciones en el uso de los sistemas seleccionados. En los sistemas de ADN, la mutacin o recombinacin es ms frecuente que en los sistemas clsicos, lo cual debe tenerse en cuenta en la interpretacin de los resultados. La terapia mdica, como la transfusin o el trasplante de clulas madre progenitoras (stem cell). puede dar como resultado la deteccin de caractersticas del donante en vez de marcadores hereditarios del sujeto analizado.

Figura 67-1. Poder de exclusin acumulativo. El porcentaje de la poblacin excluido por cada prueba adicional se vuelve cada vez ms pequeo. La probabilidad de exclusin global de las seis pruebas es del 95,3%. Si s e realizase una sptima prueba con A = 0,5, slo se excluira un 2,4% adicional de la poblacin ([1 - 0.953] x 0,5 = 0,0235).

Los reactivos para tipar los antigenos de los sistemas Kell, Duffy y Kidd suelen requerir antiglobulina para su deteccin. Cuando una muestra se analiza como heterocigtica para todos estos marcadores (Kk, Fy(a+b+) y JK(a+b+)j, es esencial determinar que la muestra es negativa en u n a prueba directa de antiglobulina. Todos estos sistemas presentan alelos nulos; son poco frecuentes en Kell y Kidd y muy frecuentes en Duffy. En sujetos de raza negra, el fenotipo ms comn es Fy(a-b-) (68%), y el gen FY tiene una fre-

CAPITUIO 67

PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL ADN, POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.

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cuencia de 0,80. Es frecuente la homocigosidad inversa; tambin es comn la aparente exclusin materna o una nica exclusin indirecta de paternidad. En la mayora de los estudios, raramente se encuentra el gen FY en sujetos blancos (Martin, 1983). Tambin se han utilizado para la determinacin de paternidad otros sistemas de grupos sanguneos como P , Lutheran. Lewis. Xg y pruebas para algunos de los antgenos de grupos sanguneos con alta y baja frecuencia. La posibilidad de obtener informacin til a partir de estos marcadores es limitada.

obtienen y almacenan de un modo apropiado. Las clulas recogidas en tubos con floruro no son tiles para el fenotipado de enzimas. Antes de la prueba, se prepara un hemolizado lavando los glbulos rojos con una solucin salina isotnica y diluyendo la mueslra (1:1) con agua destilada. La fosfatasa acida de los glbulos rojos (ACP1), tambin denominada EAP, presenta tres alelos comunes (A, B y C) y algunas variantes poco frecuentes (Miller. 1988). El tipado requiere la observacin tanto de la posicin de las bandas como de su intensidad de tincin. L a fosfoglucomutasa (PGM1) es una enzima polimrfica de los eritrocitos que presenta ms de 30 variantes (Dykes. 1984.1985). La prueba de IEF identifica cuatro alelos comunes (1Ao 1+ y 1B o 1-, 2Ao 2+ y 2B o 2-) y diez lenctipos. El fenotipado se determina haciendo reaccionar el gel con un sustrato que contiene glucosa-1-fosfato, glucosa-1 -6-dfosfato, mcotinamida-adenmadinucletido-fosfato (NADP) aceptor de hidrgeno, un preparado aceptordonador de electrones (monotetrazolio [MTT]. glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) y un colorante (azul medola). Se ha informado de recombmacin en el locus de la PGM1 (Wetterling, 1990), aunque es m u y poco frecuente. El locus de la PGM1 se encuentra en el cromosoma 1; se han identificado otros dos subsistemas de PGM, el PGM2 y el PGM3. controlados respectivamente por genes situados en los cromosomas 4 y 6. Estos dos subsistemas son muy poco polimrficos. Otras enzimas eritrocitarias utilizadas en la prueba de paternidad son la esterasa D (ESD) que presenta dos alelos frecuentes [ESD't. ESD'2). codificados por genes situados en el cromosoma 13; la glioxalasa 1 (GL01) con dos alelos comunes {GLOfl GL0t'2) codificados por genes del cromosom a 6 cercanos al MHC, pero independientes; la glutamato-piruvato transaminasa (GPT), una enzima lbil que requiere el mantenimiento fresco de las muestras, y la glucosa-6-foslato deshidrogenasa (G6PD), de utilidad limitada por encontrarse ligada al sexo. La ademlato-cinasa (AK), la adenosma-desaminasa (ADA) y la 6-foslogluconato deshidrogenasa (6PGD) son sistemas de enzimas eritrocitarias que se utilizan en los laboratorios forenses. Existen mtodos para la deteccin simultnea de estos marcadores independientes (Brinkmann. 1971). Estos sistemas no son demasiado tiles para la prueba de paternidad, ya que la mayora de las poblaciones presentan un alelo de alta frecuencia {AK'1 = 0.96-0.99; ADA'1 = 0.96-0,98: 6PGD'A = 0,97).

Sistemas de protenas sricas

Se emplean numerosos sistemas de polimorfismo gentico de las protenas sricas en la determinacin de la paternidad. En la mayora de estos sistemas, el tipado de los productos allicos se realiza mediante separacin electrofortica de las bandas proteinicas. que se detectan por tincin, inmunofijacin o reaccionando con un sustrato especfico. Cuando se encuentran variantes poco frecuentes, deben compararse con controles especficos o verificarse en un laboratorio independiente. En algunos sistemas se puede requerir la identificacin de alotipos comunes mediante isoelectroenfoque (IEF) y tcnicas convencionales. L a haptoglobma (HP), una ,-globulina que lija hemoglobina libre, fue la primera proteina descrita como polimdica. basndose en su separacin electrofortica en gel de almidn (Smithies. 1955). El sistema del componente especifico de grupo (GC) es uno de los sistemas de marcadores protencos ms informativos, excluyendo ms del 30% de hombres acusados en falso. Se puede realizar la separacin de los tres alotipos comunes 1s, 1f y 2. por isoelectroenfoque (Dykes. 1984) o usando la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Existen numerosas variantes muy raras que se han identificado como marcadores en poblaciones especficas. Estas variantes no se distinguen de los alelos comunes mediante el mtodo de transferencia en mancha utilizado para detectar los productos de la PCR. El factor B properdina (BF), una protena de la cascada del complemento, es fenotipado por electroforesis en gel de agarosa (Dykes. 1980). Los genes del BF y los marcadores del sistema C4 se localizan en el brazo corlo del cromosoma 6, dentro de la regin que codifica el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (Mauff, 1988). Debido a este ligamiento, las proporciones de probabilidad de los resultados de la prueba de estos sistemas y el HLA no son independientes y no deben multiplicarse para calcular el ndice de paternidad (Pl). Las molculas de mmunoglobulinas presentan varios polimorfismos detectados por inhibicin de la hemaglutinacin. Los polimorfismos de marcadores gamma (Gm) estn asociados con secuencias especificas de aminocidos de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina G (IgG). Cada una de las cuatro subclases de IgG presentan un grupo diferente de marcadores Gm (De Lange. 1988); por tanto, dependiendo del alcance del anlisis, una persona puede presentar un fenotipo complejo de Gm. Se han encontrado haplotipos diferentes en varios grupos raciales, haciendo de ellos un sistema til en los casos en que se sospecha un componente racial: estos marcadores estn presentes en las cadenas pesadas de IgM e IgA. no son tan polimrficos como los marcadores Gm y no son m u y tiles en las pruebas de paternidad. Los marcadores Km. anteriormente conocidos como Inv. son determinantes de las cadenas ligeras comunes a todas las clases de mmunoglobulnas. Otros sistemas de protenas sricas que se han empleado en pruebas de paternidad son: la transferrina (TF): el plasmingeno (PLG): el factor de estabilizacin de la fibrina (FXIII). constituido por dos subunidades independientes de pptidos polimrficos (FXIIIA y FXIIIB): la a-1 -antitripsina (Pl); la amilasa; el C3, y el C4.

Antgeno leucocitario humano (vase Cap. 40)

El sistema HLA. localizado en el brazo corto del cromosoma 6 humano, contiene varios locus: HLA-A. -B, -C. -D. -DR, -DP y -DQ Se ha publicado la secuenciacin completa del ADN de las regiones HLA-A y -B (Zemmour. 1992). Antes del uso extenso de las pruebas de ADN. la determinacin de antgenos HLA-A. -B por mtodos serolgicos fue el segundo sistema, tras los antgenos eritrocitarios, ms frecuentemente utilizados en las pruebas de paternidad en Estados Unidos (Polesky, 1999). Los marcadores DOA1 detectados por PCR tambin se utilizan en algunos laboratorios para pruebas forenses y de paternidad. El sistema H L A es m u y potente para la prueba de paternidad, debido a la gran diversidad de estos antgenos en la poblacin. Basndose en el estrecho ligamiento de las especificidades 40 A y 70 B, es posible identificar alrededor de 700 haplotipos y unos 180.000 fenotipos. Existe un desequilibrio de ligamiento entre HLA-A, -B (es decir, ciertas combinaciones de haplotipos, como HLA-A2, -B44 o -A1.-B8, suceden ms de lo esperado segn la frecuencia de los antgenos A1, A2, B8 y B44), Los AABB Standards requieren que el tipado serolgico de H L A para la prueba de paternidad incluya todos los antigenos HLA-A y -B reconocidos oficialmente en 1980 por el Committee on Nomenctature de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Tambin recomend que se realizase el tipado de otras especificidades conocidas de HLA si el laboratorio dispona de sueros apropiados de tipado. El tipado serolgico de HLA-. -B se realiza mediante un mtodo de hnlocitotoxicidad dependiente del complemento. Una suspensin de linfocitos, que contiene al menos un 80% de clulas viables, se incuba con mltiples antisueros. Si el anticuerpo es especfico para un antgeno presente en las clulas estudiadas, stas son destruidas en presencia de una cantidad adecuada de complemento reactivo. Se mide por la incapacidad de las clulas para excluir un colorante (Ray. 1982). Se recomienda el uso de muestras heparini-

Enzimas eritrocitarias
Los principios y los mtodos generales usados en el fenotipado de protenas sricas mediante electroforesis se aplican al polimorfismo de enzimas eritrocitarias. Los sistemas de deteccin dependen de la reaccin de la enzima con un sustrato. Se produce una prdida de actividad si las muestras no se

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SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

zadas para el tipado de HLA. que no se deben refrigerar antes de la separacin de los linfocitos. Lo ideal es que los Imfocitos se separen en una gradiente de densidad Hypaque-Ficoll en las 24 horas tras su obtencin. Los linfocitos, una vez separados, pueden conservarse durante algunos das en un medio de cultivo. Algunos de los reactivos disponibles en la actualidad son monoespecficos; los AABB Standards requieren que cada antgeno sea definido al menos por dos sueros monoespecficos diferentes o por tres sueros multiespecficos. En un caso de paternidad, todos los individuos deben tiparse en el mismo laboratorio, con el mismo mtodo y los mismos reactivos, para minimizar la variabilidad que se da cuando las clulas son upadas con reactivos diferentes. La interpretacin de los resultados de la prueba de HLA puede complicarse por un entrecruzamiento entre los locus A y B. Otro problema con el tipado de HLA es el fracaso para encontrar un 'MI house" (cuatro marcadores distintos). Pueden encontrarse blancos (alelos no definidos por los reactivos disponibles), dependiendo de la raza de la persona analizada. En la mayora de los casos, se observan blancos aprenles cuando la persona analizada es homocigtica para el marcador A o B. En otros casos, los antisueros reaccionan de forma cruzada con el marcador indefinido o los antigenos esperados no se expresan completamente (Lamm, 1983).

thern. 1975). Los fragmentos que representan los locus de inters se detectan mediante sondas marcadas que se unirn a una secuencia de bases complementaria entre dos secuencias de restriccin adyacentes. Antes de aadir la sonda, el ADN separado en el gel es despurinado y desnaturalizado. El ADN monocatenario resultante se transfiere desde el gel a una membrana (transferencia Southern) Una sonda marcada se hbrida con el ADN en la membrana. Usando determinadas temperaturas y otras condiciones definidas, la sonda de los locus se fijar a los fragmentos de ADN unidos a la m e m brana que comparten la misma secuencia (Maniatis, 1982). La localizacin de los fragmentos marcados en la membrana se consigue aadiendo un sustrato que reaccionar con una enzima fijada a la sonda o exponindola sobre una pelcula fotogrfica sensible (autorradiografia). si la marca es radiactiva (normalmente -^P) o quimioluminiscente. Es importante estandarizar los procedimientos e incluir controles adecuados cuando se realizan anlisis de sistemas de RFLP. Debe controlarse la cantidad de ADN extrado y usado en el sistema de prueba, debe verificarse la reactividad de la enzima utilizada para asegurar la digestin completa del ADN y cada recorrido electrofortico debe incluir un control de ADN humano de tamaos conocidos. Es importante emplear marcadores de tamao con mltiples fragmentos distintos que abarquen el rango de alelos observados normalmente en el locus del ADN que est siendo analizado. Los AABB Standards requieren que se realice la electroforesis de una mezcla del ADN del supuesto padre y del nio en el mismo carril. Esto es til para evaluar la presencia o ausencia de fragmentos de peso molecular parecido. La interpretacin de los resultados de un sistema de RFLP depende de la coincidencia de las bandas observadas en el nio y en los supuestos padres (Figs. 67-2 y 67-3). El nio debe presentar fragmentos que coincidan con ca-

POLIMORFISMOS DEL ADN

La prueba de polimorfismos del ADN es el mtodo utilizado con ms frecuencia para la prueba de paternidad por los laboratorios (Polesky. 1999). Normalmente, los anlisis de estos polimorfismos se basan en pruebas de RFLP y/o amplilicacin por POR. Los AABB Standards han definido los criterios para que un sistema de marcadores de ADN sea aceptado para su utilizacin en las pruebas de paternidad. Mediante estudios familiares, debe comprobarse que cada locus presenta herencia mendeliana y una baja frecuencia de mutacin y/o recombinacin. Su localizacin cromosmica debe estar registrada por el International Human Gene Mapping Workshop. Lo ideal es que las caractersticas del locus (sonda, enzima de restriccin, secuencia del cebador y tamaos de los fragmentos) estn documentadas en la bibliografa y exisla la posibilidad de pruebas confirmatorias en un laboratorio independiente. Las ventajas de los mtodos de ADN consisten en la disponibilidad de numerosos sistemas altamente polimrficos y con una probabilidad de exclusin muy alta; la posibilidad de sistemas de pruebas mltiples en un recorrido electrolortico; la capacidad para usar muestras que contengan clulas nucleadas, incluyendo sangre perifrica, frotis bucal y tejidos; el tamao minimo de muestra requerido y la detectabilidad de los marcadores desde el momento de la concepcin (Polesky, 1999).

Caso I
m M C AF nV M

Caso 2
C AF m
-

Sonda

Pruebas de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin

Se han descrito numerosos locus polimrficos de RFLP como parte de la investigacin llevada a cabo en el mapeo del genoma humano (Walson, 1992). La identificacin de un locus especfico requiere una corta secuencia marcada de nucletidos, complementaria a una nica secuencia de la regin del ADN que est siendo analizada. Las sondas tiles en la prueba de paternidad detectan fragmentos de restriccin polimrficos en un solo locus (diallico simple, insercin/delecin o repeticiones en tndem de nmero variable [VNTR]) (Baird, 1986). El ADN se extrae y purilica a partir de una muestra que contiene clulas nucleadas, como sangre perifrica o un frotis bucal. En ocasiones, la nica muestra disponible es tejido fijado. Deben utilizarse mtodos especiales para la obtencin y purificacin del ADN de estas muestras (Forsthoefel, 1992). Se emplea una enzima bacteriana especfica para escindir asimtricamente el ADN bicatenario aislado en las zonas donde est presente una secuencia definida de nucletidos (p. ej.. Eco Rl. la nucleasa de Escherichla col! RY 13 escinde AG o GA). El proceso de restriccin rompe el ADN en mltiples fragmentos de peso molecular variable. En numerosos locus. el tamao de estos fragmentos est determinado genticamente. La electroforesis en gel se emplea para separar los fragmentos de acuerdo con su tamao molecular (Sou-

Figura 67-2. Membrana hibndada con dos sondas m a r c a d a s que detectan los locus de RFLP D12S11 (A) y D17S79 (8). ADN procedente de dos tros digeridos con Pst 1. Escalas de tamao flanquean los dos tros. Se muestran la m a d r e (M), el hijo (C), el supuesto padre (AF) y u n a mezcla de supuesto padre/hijo (m'). En el caso 1, el AF se excluye mediante la sonda A. Mediante una cuidadosa observacin, se demostr que el carril de la mezcla presentaba cuatro bandas. En el caso 2, existe coincidencia para ambos locus entre el hijo y el supuesto padre. L o s alelos se designan por sus tamao en kilobases: los tamaos mayores estn situados en la parte superior de la membrana.

CAPTULO 67

PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.

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Cl

A P m* L C2 m

a que est fuera del rango de tamaos de deteccin utilizado (Chakraborty, 1994). El uso de pruebas de locus de RFLP junto con marcadores clsicos ha demostrado que los sistemas de RFLP presentan probabilidades de exclusin similares a los valores esperados (Endean, 1990b). Si se observa una coincidencia entre el hijo y el supuesto padre, se realizar el clculo de un ndice del sistema, similar a los presentados anteriormente en este captulo. Para calcular los ndices de paternidad utilizando los resultados de estas pruebas, se necesitan las frecuencias gnicas determinadas en muestras de poblacin adecuadas. Un problema frecuente con los sistemas de RFLP, no encontrado en los sistemas de marcadores clsicos, e s que los fragmentos (alelos) presentan una continuidad de tamaos, en vez de ser marcadores diferenciados. Es m u y difcil distinguir entre dos alelos de tamao parecido que puedan diferir slo en unos pocos pares de bases. Los errores de medicin y otras variaciones tcnicas menores del mtodo pueden afectar al tamao asignado a un alelo. Un laboratorio que realice pruebas de RFLP necesita determinar sigma (capacidad para reproducir resultados intra- e nterrecorrido electrofortico. usando las mismas muestras) y delta (diferencia de tamao mnima entre dos bandas que puede detectarse de modo sistemtico) para cada locu&sonda/combinacin enzimtica (Endean. 1990a) (Fig. 67-4). En la determinacin de las frecuencias allicas se emplean tcnicas de compartimentacin para compensar estas variaciones antes de asignar un valor a y (Alien, 1990). Uno de los mtodos divide el rango de tamaos de los alelos esperados en una serie de intervalos fijados de igual tamao. Para determinar la frecuencia allica de un "hombre al azar" (y), se usa el valor de la frecuencia del intervalo en el cual se encuentra la banda. Con este mtodo, la asignacin de valores a bandas cercanas al extremo superior o inferior del intervalo puede requerir la combinacin de datos procedentes de dos intervalos y dar c o m o resultado valores bajos del ndice. Un segundo mtodo, preferido por el autor, utiliza un intervalo variable. La frecuencia de y se determina contando todas las bandas observadas en un intervalo determinado por el tamao del fragmento delta (Tabla 67-4. Fig. 67-4). Usando este mtodo, el tamao del intervalo vara en relacin al tamao del alelo. Un tercer mtodo, conocido c o m o el principio del limite superior, fue propuesto por el National Research Councilen 1992 para garantizar que los datos forenses de identidad presentados a los tribunales fuesen prudentes. Consiste en fijar un lmite superior para el valor de y. Asi. incluso si el alelo es muy poco frecuente, el valor del ndice no exceder de un valor fijado (esto es, 20). Este mtodo contrarresta los errores de mueslreo y las posibles subestructuras de una poblacin. El Committee on DNA Forensic Science public en 1996 una actualizacin donde explica por qu este mtodo es mapropiado. asi como otras consideraciones estadsticas y de poblacin sobre las pruebas forenses y de paternidad.

Figura 67-3. M e m b r a n a con una sonda multilocus (DNF24) ADN procedente de un c a s o con dos hijos analizados. L o s carriles de izquierda a derecha muestran la madre, el hijo 1, el supuesto padre, una mezcla supuesto padre/hijo 1. la escala de tamaos, el hijo 2, una mezcla supuesto padre/hijo 2. El hijo 2 se excluy debido a que no se encontr coincidencia con las bandas marcadas por el signo +.

da uno de sus padres biolgicos. L a presencia de un fragmento del nio ausente tanto en la madre como en el hombre analizado es una prueba de no paternidad. Del mismo modo, cuando el hombre analizado slo tiene un nico fragmento detectado, se espera que est presente en su hijo. No debe excluirse la paternidad por los resultados de un solo sistema de ADN. Estos marcadores presentan una mayor frecuencia de mutacin que los sistemas clsicos, y pueden existir alelos nulos o un segundo fragmento no identificado debido

Reaccin en cadena de la polimerasa

La reaccin de la PCR, descrita inicialmente por Mulls y cois, en 1986, utiliza la termociclacin para desnaturalizar el ADN icatenario y promover la (jacin de cebadores especficos a secuencias diana que flanquean la regin de inters. Esta tcnica ha permitido definir un gran nmero de alelos dife-

Tamaflo de banda (kb) D I 2 S I 1 Pst 1

Figura 67-4. Determinacin de sigma y delta. Representacin grfica de mediciones en cinco muestras recorridas 10 veces para determinar la reproducibilidad (sigma) y l a capacidad para distinguir entre dos bandas (de'a) que tienen un tamao similar (AF-1, AF-2). Basndose en estas observaciones, sigma es 0,094 para la banda compartida por el hijo y la m a d r e (C-M. M2). Delta es 11,7. Esta figura se utiliza para seleccionar el tamao del intervalo que determina la frecuencia de y, utilizada para calcular el ndice de paternidad.

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Tabla 67 -4

SECCIN V I I

PATOLOGA MOLECULAR

Frecuencia de g e n e s obligatorios en s i s t e m a s de R F L P : u s o de delta para determinar el t a m a o del intervalo OG

3.54 1.85-3,54 3,95 1,96 6 68 14.95

Sistema
D2S44 D2S44 D7S467 D10S28 D12S11 D12S11

Delta
2.0 2,0 2,3 2,5 1,8 1.8

Intervalo
0,071 (3,47-3,61) 0 , 0 3 7 (1,81-1,89) 0,071 (3.47-3,61) 0,091 (3,86-4,04) 0,049(1,91-2,01) 0,120(6,56-6.80) 0,269(14,68-15.22)

Frecuencia'
18/2.500 = 0,007 (250/2.500 + 18/2.500) = 0,107 375/1 800 = 0,208 65/1.200 = 0.054 28/900 = 0.031 4/900 = 0.004

'Nmero de bandas observadas en el intervalo/bandas loiales del sistema en la base de dalos

rendados nicamente por cambios mnimos en su secuencia. Las ventajas de la PCR para las pruebas forenses y de paternidad son: necesita m u y poca cantidad de muestra de ADN genmico; no tiene que aislar previamente la secuencia para su amplificacin y ofrece una disponibilidad rpida de los resultados de la prueba y condiciones de almacenamiento de la muestra no demasiado rigurosas. Cuando se utilizan sistemas de PCR, es necesario monitorizar y validar el funcionamiento del termociclador. Debido a que minimas cantidades de ADN en la etapa de postamplilicacin pueden causar la contaminacin de muestras en la (ase de preamplificacin, es esencial ser cuidadoso en el diseo del laboratorio y del flujo de trabajo para separar los pasos de preamplilicacin de las reas en las que se realizan la amplificacin y deteccin de resultados (Budowle, 1995: Dieffenbach, 1993) (vase Cap. 63). Debe procesarse y analizarse un control negativo con cada lote de muestras para verificar que no haya contaminacin. Un problema asociado con la PCR es que si no se encuentra ningn producto, debemos asegurarnos de que la muestra no contiene ninguna sustancia que inhiba la amplificacin.

escalas allicas que contienen fragmentos de peso molecular conocido. Es posible el anlisis simultneo de varios sistemas si existen diferencias en el rango de tamaos de los alelos de cada locus Estos sistemas genticos no son tan polimrticos como los sistemas de RFLP. El primer sistema de AFLP usado en casos forenses y de paternidad fue la regin 3' hipervanable del locus de la apolipoprotena B (ApoB) formada por unidades de repeticin de 15 pares de bases (bp) de adenina y timina. Este sistema de marcadores contiene 23 alelos que varan entre 611 y 931 bp y una heterocigosidad media de 0,8. D1S80, un locus del cromosoma 1 (26 alelos de 16 repeticiones con un rango de tamaos entre 430 y 782 bp). se utiliza con frecuencia en los laboratorios de pruebas de paternidad. Existen en el genoma otros locus formados por unidades de repeticin de tres a siete nucletidos (Weber. 1989). Los alelos de estos locus de STR se definen por el nmero de unidades de repeticin del producto amplificado por PCR. Las muestras se mezclan con cebadores que se fijarn con el ADN del locus que presente la secuencia especifica. La mezcla se amplifica en un termociclador usando parmetros definidos cuidadosamente para maximizar la deteccin de los alelos. En una mezcla, pueden utilizarse varios cebadores con distintas marcas fluorescentes para detectar alelos de varios locus en u n a sola amplificacin. Los productos de PCR que difieren en longitud se separan por electroforesis en poliacrilamida utilizando capilares o geles. La deteccin se realiza mediante un explorador lser que detecta la m a r c a incorporada en el cebador o por tincin del gel con plata. La determinacin de tamaos se basa en la comparacin con una escala allica y/o inclusin de un estndar de tamaos para cada locus que se marca de forma diferente a la muestra Los AABB Standards tambin requieren que se incluya una muestra mezclada del hijo y del padre en cuestin. Se ha estandarizado una combinacin de 13 locus de STR para su uso en la obtencin de perfiles genticos de individuos condenados por varias causas criminales. Muchos de estos locus tambin se utilizan en pruebas d e paternidad. Los sistemas de marcadores de STR presentan alelos diferenciados y. por tanto, no son tan polimrficos como los sistemas de marcadores de RFLP. En algunos casos, estos sistemas tienen tres o cuatro alelos comunes (frecuencias de 0.15 a 0,25) y varios alelos inusuales (frecuencias menores de 0.01). Asi, para obtener una CPE y un ndice de paternidad altos, s e requiere analizar seis o ms locus de STR; Allord y cois, informaron en 1 9 9 4 de que ambos mtodos excluyeron a los mismos 13 supuestos padres (basados en dos o ms locus). Segn los sistemas de STR, la probabilidad de paternidad en 36 de los 37 hombres no excluidos estuvo por encima del 99%.

DQA1. polimarcador
La deteccin de los ocho alelos del locus HLA-DQA1 (Erlich. 1986) fue una de las primeras aplicaciones de la PCR en pruebas forenses y de paternidad. Los genes responsables de estos antigenos HLA de clase II fueron identificados mediante el uso de cebadores biotinilados especficos de secuencia (SSP) y de sondas oligonucleotdicas especficas de un alelo (ASO) en un sistema de transferencia en mancha inverso ("reverse dot blof). El ADN de la muestra se amplilica con los cebadores marcados. Posteriormente, la mezcla de reaccin se transfiere sobre una membrana que contiene una sene de sondas ASO inmovilizadas. Si un alelo est presente en la muestra, la secuencia amplificada hibridar con la mancha que contiene el ADN complementario. Despus de lavar para eliminar el ADN no fijado, las manchas que presentan ADN fijado se detectan por la reaccin de la biotina de la secuencia amplificada con un conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina. Se dispone de un equipo de reactivos (AmpliType PM) que utiliza el mtodo de transferencia en mancha para detectar marcadores en los siguientes locus: LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 y GC. La mayora de estos locus no son muy polimrficos (slo presentan dos o tres alelos). Dos de estos sistemas de marcadores detectan alelos encontrados por los mtodos clsicos (GYPA es igual que los antigenos eritrocitarios M. N; GC es igual que el sistema de protenas sricas).

ADN

mitocondrial

Repeticiones cortas en tndem (STR) y repeticiones largas en tndem (LTR)

Los polimorfismos del ADN suceden en locus con variaciones de la longitud. Estos sistemas con marcadores que presentan VNTR se identifican por PCR. Los polimorfismos de la longitud de los fragmentos amplificados (AFLP) se separan usando electroforesis en gel de alta resolucin (Boerwmkle. 1989). Los fragmentos producidos por la reaccin de la PCR se comparan con

La amplificacin por PCR seguida de secuenciacin puede utilizarse para identificar el polimorfismo de procedencia materna presente en la regin hipervariable del bucle D del ADN mitocondrial. En situaciones complicadas, las secuencias de ADN amplificado extradas de tejidos y huesos encontrados se comparan con las secuencias de ADN de descendientes maternos (Holland, 1994). Usando este mtodo, se ha demostrado que los posibles huesos de la familia del zar Nicols II (recuperados en Yekaterimburgo, Rusia) presentan un ADN materno similar a los descendientes vivos de la reina Victoria, la abuela materna de la zarina Alexandra (Ivanov. 1993).

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P R U E B A S DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES.

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OTROS TIPOS DE PRUEBAS

El estudio de la longitud del cromosoma Y se utiliz para excluir la paternidad (De la Chapelle, 1967). Tambin se ha usado la comparacin de marcadores fluorescentes sobre varios cromosomas para excluir la paternidad o proporcionar estimaciones de inclusin (Grtler, 1986). Se encontraron una serie de locus de STR en el cromosoma Y. Estos marcadores son tiles en la determinacin de la linea paterna. Se han descrito sondas mutlilocus para la identificacin de rboles genealgicos que detectan regiones hipervariables (Jeffreys. 1986). El mtodo utilizado es similar a la tcnica empleada para detectar marcadores de RFLP. Las relaciones entre los individuos se determinan comparando el nmero de bandas compartidas. Algunos investigadores han utilizado las repeticiones en minisatlites (MVR) (Jeffreys. 1991). Se han descrito sistemas de pruebas para el estudio de los genes del locus MHC. que emplean combinaciones de amplificacin gnica por PCR con cebadores especficos de secuencia, sondas oligonucleotidicas especficas de secuencia (SSOP) y secuenciacin directa, aunque no se usan en pruebas forenses o de paternidad de modo sistemtico (Alien. 1994: Bunce. 1995). Se han desarrollado mtodos para detectar polimorfismos de un solo nudetido (SNP). tambin denominados genetic bit analysis (GBA) (Nikiforov. 1994). Estos sistemas determinan el cambio de una sola base de una secuencia en una localizacin especfica. Debido a la limitada variabilidad de estos locus. se precisa analizar unos 50 para conseguir el mismo nivel de informacin que el proporcionado por un muitipiexe varios locus de STR.

efecto significativo sobre la conclusin de paternidad. En estas situaciones, tambin pueden ser tiles las comparaciones con las frecuencias de determinados grupos raciales. Si el hombre analizado no es excluido, siempre se puede argumentar que el nmero de pruebas fue insuficiente, que la prueba de exclusin se encontrar mediante el anlisis de otro sistema gentico o que el verdadero padre es un familiar cercano del hombre analizado. Esta linea de razonamiento slo sera correcta si el hombre analizado ha sido acusado en falso. Adems del poder de exclusin medio descnto con anterioridad, tambin es posible calcular la frecuencia con la cual un hombre no ser excluido al azar (RMNE), basndose en los fenotipos observados en la pareja madre-hijo (Salmn. 1983). Este valor est relacionado con el poder real de exclusin de las pruebas realizadas.

Clculo del ndice de paternidad

En los casos en los que se analiza un trio, normalmente se utiliza un enfoque general denominado "comparacin del mtodo del esperma" (Walker, 1978). Este clculo compara la probabilidad (x) de que un esperma procedente de un hombre con el fenotipo del hombre analizado pueda fertilizar el vulo de la supuesta madre y la probabilidad (y) de que lo haga el esperma de un hombre de la poblacin elegido al azar (Tabla 67-5). Las proporciones de probabilidad (x/'y) se calculan independientemente para cada sistema gentico, comparando el hombre analizado mediante las frecuencias de los OG o mediante la contribucin gentica paterna a una poblacin elegida al azar de la misma raza del hombre analizado. Posteriormente, estos valores se multiplican para calcular el Pl, que refleja las probabilidades genticas a favor de la paternidad, teniendo en cuenta los fenotipos del trio. En la Tabla 67-5 se muestran frmulas para el clculo de los ndices con vanas combinaciones de fenotipos. Los valores del ndice de paternidad en casos en los que n o se observa exclusin pueden tener un valor numrico desde mayor de cero hasta un nmero prximo a infinito. Los AABB Slandards actuales requieren para determinar la paternidad que la prueba tenga al menos un Pl de 99. Esto significa que la probabilidad de que el hombre analizado sea el padre es de 99 a 1.

INCLUSION DE LA PATERNIDAD
Si despus de mltiples sistemas independientes de pruebas el supuesto padre no es excluido, debe calcularse entonces una estimacin sobre la posibilidad de que la persona analizada pueda ser el padre biolgico. Se deben utilizar tablas adecuadas de frecuencias gnicas que proporcionen estimaciones de inclusin de la paternidad. En general, esto significa que se ha fenotipado al azar una poblacin de personas, que el tamao de la muestra es lo suficientemente grande como para proporcionar con mnimos etrores una estimacin de las frecuencias gnicas de los alelos del sistema y que los hombres analizados y los padres biolgicos proceden de la misma poblacin. Cuando se analizan mltiples sistemas, las diferencias observadas en las frecuencias gnicas de poblaciones procedentes de varias localizaciones geogrficas no son relevantes en el clculo de la probabilidad de paternidad (Hummel. 1981). En casos en los que el hombre estudiado tiene origen multirracial o procede de una poblacin para la que no existen tablas de frecuencia apropiadas, puede ser imposible proporcionar una estimacin precisa de la paternidad. Sin embargo, cuando se utilizan mltiples sistemas con un alto poder de exclusin y los valores del ndice de paternidad son altos usando una poblacin de referencia, existe un riesgo mnimo de que las frecuencias de una poblacin ms definida presenten un

Probabilidad de paternidad
Otra estimacin til, la probabilidad de paternidad, combina las pruebas genticas con suposiciones acerca de sucesos anteriores. Essen-Mller describi en 1938 este clculo basado en el teorema de Bayes (Tabla 67-6). La estimacin utiliza el Pl para resumir la informacin gentica y P (un valor para la probabilidad previa) para explicar las suposiciones de que el hombre analizado: 1. 2. 3. 4. No era estril Tuvo acceso durante el periodo de concepcin No es un familiar cercano del padre (primer grado) Otros posibles padres proceden de una poblacin con frecuencias gnicas similares

Si se utiliza una P de 0,5; sta asigna igual posibilidad previa al hombre analizado y a cualquier hombre no analizado. Usando este valor, la probabilidad de paternidad (W) es igual a (PI/PI + 1)100. Se pueden utilizar en este clcu-

Tabla 67-5 Clculo d e la proporcin del sistema* (ndice d e paternidad) Madre A A A A AB AB AB AB BC AC Hijo A A AB AB AB Al! AB AC BC AD Genes obligatorios (OG) a i
0

Hombre analizado A AB B AB A B AB AC BC BD

X 1 0.5 1 0,5 1 1 1 0,5 1 0.5

Y 0,25 0.25 0,4 0,4 0,65 0,65 0.65 0,3 0.7 0,05

Frmula para la frecuencia de Y P P g o p+q p+q p+q

r

X/Y 4 2 2,5 1.25 1,54 1.54 1.54 1.67 1.43 10

b aob aob aob c boc

q+r s

"Sistema hipottico con cuatro alelos codominantes p, q, ry s medidos por los marcadores A B, C y D

1398
s ' ' "
_

SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

Tabla 67-6 F r m u l a de la probabilidad de paternidad (W) Se utiliza el teorema de Bayes para combinar p con Pl p = probabilidad previa de sucesos no genticos Pl = resumen de los resultados de las pruebas genticas

compartir el gen obligatorio paterno en todos los sistemas. Se puede calcular un ndice de paternidad utilizando una frecuencia para x que tiene en cuenta la posibilidad de que el difunto pudiera transmitir el marcador (Fig. 67-5). Tambin se pueden realizar reconstrucciones utilizando datos procedentes de numerosos familiares supuestos, como se muestra en la Figura 67-6.

DOCUMENTACIN E INFORMACIN DE LOS RESULTADOS

Los resultados de las pruebas de paternidad suelen utilizarse en los procedimientos jurdicos. Aunque la mayora de las disputas de paternidad son acciones civiles, algunas jurisdicciones requieren documentos que muestren la cadena de custodia de las muestras de modo similar a los que se usan en asuntos cnmnales. Por tanto, deben documentarse todos los aspectos relacionados con los procedimientos utilizados, puesto que pueden estar expuestos a recusacin por alguna de las partes. Es muy importante documentar la identificacin de los individuos analizados, la obtencin y etiquetado de las muestras, los procesos analticos y la revisin de los resultados. Debe conseguirse la historia de transfusiones recientes (anteriores a tres meses) o de trasplante de clulas m a d r e hematopoyticas. Tambin se debe acompaar cada muestra con una identificacin fotogrfica y el adecuado consentimiento informado. Para un menor, el consentimiento debe proceder del tutor legal de la custodia del nio.

lo otros valores de probabilidad previa, aunque introducen un sesgo contra el hombre analizado si son superiores a 0.5 y contra la madre si son menores de 0.5. Los valores matemticos obtenidos a partir del clculo del Pl o de la probabilidad tienen una significacin especial debido a que en muchas jurisdicciones los valores informados pueden cambiar el estado legal de los interesados. Por ejemplo, la Minnesota Statute Section 257.55 transfiere el peso de la paternidad al hombre si la prueba indica que l es el padre con una probabilidad superior al 99%.

Los AABB Standards requieren que el informe de los resultados de la prueSe puede proporcionar una estimacin de la paternidad aunque uno de los ba incluyan lo siguiente: padres no est disponible para el anlisis. La situacin ms comn es aquella en 1. El origen racial/tnico asignado a los supuestos padres la cual se dispone de muestras del hijo y del supuesto padre, pero no de la 2. Los fenotipos de cada persona analizada madre. En esta situacin el hijo debe compartir al menos un gen de cada locus 3. Una opinin sobre si el supuesto padre puede ser excluido y la base con el hombre analizado. Las frmulas (Tabla 67-7) para estimar el ndice de para la exclusin, si la hubiera paternidad y su probabilidad son similares a las empleadas en el anlisis de tros, 4. El ndice de paternidad del individuo para cada sistema informado con la excepcin de que las estimaciones deben incluir un ajuste para la fre5. El ndice de paternidad combinado y la probabilidad d e paternidad cuencia del alelo transmitido por la madre ausente (Brenner, 1993). El clculo es expresada como un porcentaje, as como la probabilidad previa utilizams complicado si la mujer ausente y el hombre no analizado son de razas difeda en el clculo rentes (Traver, 1996). S el hombre analizado o el nio presentan dos marcado6. Una explicacin de los resultados no concluyentes o inusuales (posible res en un locus, ninguno de los cuales est presente en el otro individuo analimutacin observada) zado, el hombre analizado es excluido. Tambin se sugiere la no paternidad si el La informacin acerca de los locus de RFLP de los individuos analizados nio y el hombre analizado presentan homocigosidad inversa. debe incluir la endonucleasa de restriccin utilizada y la designacin d e la sonda usada. El fenotipo de los individuos debe informarse c o m o el tamao Reconstruccin de familias de los fragmentos de restriccin en pares de bases o pares de kilobases o el Existen numerosas situaciones para las que es importante establecer una nmero de repeticiones en sistemas de STR'AFLP. Una opinin de no paterrelacin entre los individuos. Esto ocurre cuando individuos, como los inminidad no es adecuada si existe una sola exclusin indirecta en un sistema clgrantes, intentan conseguir una condicin, descubrir si tienen en comn un sico o una exclusin aparente en un nico locus de ADN. En algunos casos, padre o cuando existe una cuestin relacionada con la herencia. Los familiares cuando el Pl residual es alto (vale para todos los sistemas excepto los que pueden presentar sistemas en los cuales no se comparte ningn gen, ya que presentan exclusiones aparentes), puede ser necesario realizar pruebas en nicamente un padre y un hijo comparten al menos un marcador de cada locus. sistemas adicionales cuando slo dos locus tienen resultados discrepantes. Se utilizan frmulas que tienen en cuenta los marcadores que pueden ser compartidos por descendientes para estimar la cercana de la relacin entre dos individuos (Wenk, 1986). Los hermanos verdaderos presentan una posibilidad CONCLUSIN de 0,25 de no compartir un marcador en un sistema, mientras que los hermanastras, tas o tios presentan una posibilidad de 0.5. En casos en los que el Mediante anlisis de mltiples sistemas genticos, pueden obtenerse pruesupuesto padre ha fallecido, se puede reconstruir su probable fenotipo si se rea- bas cientficas que ayuden a resolver los casos de paternidad discutida y liza la prueba en sus padres (Mayr. 1983). El hijo y los supuestos abuelos deben cuestiones sobre las relaciones de parentesco Aunque la tecnologa actual Tabla 67-7 Clculo de la p r o p o r c i n del sistema* (ndice de paternidad) c u a n d o slo se analiza un padre Hijo A A A AB AB AC BC AD Padre analizado A AB BC B AB AB A BD G e n e s paternos del hijo a a b ao b a d G e n e s obligatorios de otro p a d r e a a a ao b ao b ao c boc aod Frmula para calcular la proporcin del sistema 1/P 1/2p Exclusin M2q (p + q)IApq 1/4p Exclusin 1/4s

Estimacin de la paternidad con un padre ausente

a r c a c t o r e s A. B. C y D (frecuencias gnicas a = p. b = q. c = r y d = s) -Sistema hipaetico con cuatro m

CAPTULO 67

PRUEBAS DE PATERNIDAD: EMPLEO DEL A D N , POLIMORFISMO Y OTROS MARCADORES. HIJO Madre (Hi ..Abuelo.'* /.Abuela.'* Fenotipos posibles del presunto F r m u l a para calcular el ndice del

1399

Sistema

padre?

sistema

D12S11 (Pst1)

11.47; 12.85

12.85; 13,76

11,47

9,75; 11.47

11.47; 12,5

9.75; 12,5 11,47; 12,5 9.75; 11,47 11,47

0.5/p

D17S79 (Pst1)

3.31; 3.45

3,37; 3.45

3.31

3,45: 3,82

3,31; 3.52

3,31; 3.31; 3.45; 3.52:

3,45 3.82 3.52 3.82

0,25/p

vWA

16. 17

16. 17

16o 17

14. 15

16

14. 16 15. 16

0,5/p q

TPOX

8, 11

10, 11

8. 10

8, 10 8(8.8)

0.75/p

D7S820

10

10. 13

10

10

10

10(10. 10)

1/p

"La interpretacin asume que el supuesto padre fallecido es el rujo de las personas analizadas: p y g son las frecuencias de los genes obligatorios. En este caso se analizaron los supuestos padres del presunto padre fallecido para reconstruir su genotipo probable. En cada uno de los sistemas analizados, el gen obligatorio paterno (OG) est presente en uno de los supuestos abuelos del hijo. Nota: para vWA. cualquier alelo del hijo pudo ser materno. El ndice de paternidad y la probabilidad de paternidad se obtienen multiplicando los valores de cada sistema.

Figura 67-5. Anlisis de una familia para establecer la paternidad. En este caso, los supuestos padres del presunto padre fallecido fueron analizados para reconstruir su genotipo probable. En cada uno de los sistemas analizados, el gen obligatorio paterno (OG| est prsenle en uno de los supuestos abuelos del hijo Nota: pata vWa. cualquier alelo del hijo pudo ser materno. El ndice de paternidad y la probabilidad de paternidad se obtienen multiplicando lo valores de cada sistema.

1400
Sistema

SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR

Presunto padre 1 1,56. 3,24

Presunto padre 2 2,12. 2,61

Hijo 1

Hijo 2

Hijo 3

Hijo 4

D2S44

1,75. 3,24

1,75, 2,61

1,75. 2,12

1.75, 2,61

D7S467

3,71, 4.32

3,54

3.62. 3.71

3,54, 3,80

3,54, 3,62

3.54, 3,62

DI0S28

1,53, 1.92

1,75,2,42

1.53. L84

1.84, 2,42

1.75. 1.98

1.98, 2,34

vWA

14. 20

16. 17

15. 20

15. 17

16, 18

17, 18

IHOl

8, 9

6, 9

8, 9,3

6 9.3

6, 7

8, SL3

TPOX

8. 11

8, 10

8 (8,8)

8. 12

10, 12

8 (8.8)

CSF1PO

10, 11

11. 12

10, 14

12. 14

9. 12

11. 14

D5S818

13, 14

11, 12

10, 14

10. 12

12 (12, 12)

12(12, 12)

D7S820

8, 9

IO.

13

8, 11

io. u

10, 14

13, 14

D13S317

11. 12

8. 10

12, 14

8, 10

10 14

10 (10, 10)

D16S539

12. 15

9, 11

8, 15

8. 11

11, 13

9, 13

L o s cuatro hijos de este estudio familiar pudieron tener la m i s m a madre. El probable marcador materno de cada sistema se muestra en negrita y subrayado. El presunto padre 1 comparte un m a r c a d o r con el hijo 1 en todos los sistemas analizados. l fue excluido como el posible padre de los hijos 2, 3 y 4 (D2S44, D7S467. D10S28, vWa, D5S818, D7S820. D13S317 y D16S539). El presunto padre 2 se excluy c o m o el posible padre del hijo 1 (D2S44, D7S467, D10S28, vWa, TH01, CSF1P0, D5S818. D7S820, D13S317 y D16S539). Tambin tue excluido el presunto padre 2 c o m o el padre del hijo 4 debido a los hallazgos en D10S28 (el hombre analizado carece de 1,98 y de 2.34) y en TH01 (el hijo no presenta ni el 6 ni el 9 encontrados en el hombre analizado). Los hallazgos de una posible coincidencia entre el hijo 4 y el presunto padre 2 en nueve de los once sistemas sugieren que el verdadero padre podra ser un familiar o que se han producido dos mutaciones.

Figura 67-6. Estudio de u n a familia (la supuesta madre ha fallecido). Los cuatro hijos de este estudio familiar pudieron tener la m i s m a madre. El probable m a r c a d o r materno de cada sistema se muestra en negrita y subrayado. El presunto padre 1 comparte un m a r c a d o r con el hijo 1 en todos los sistemas analizados. l fue excluido c o m o el posible padre de los hijos 2.3 y 4 (D2S44, D7S467. D10S28. vWa. D5S818. D7S820, D13S317 y D16S539). El presunto padre 2 se excluy como el posible padre del hijo 1 (D2S44, D7S467, D10S28. vWa. TH01, CSF1PO, D5S818, D7S820, D13S317 y D16S539). Tambin fue excluido el presunto padre 2 c o m o el padre del hijo 4 debido a los hallazgos en D10S28 (el hombre analizado carece de 1 , 9 8 y de 2,34) y en TH01 (el hijo no presenta ni el 6 ni el 9 encontrados en el hombre analizado). L o s hallazgos de una posible coincidencia entre el hijo 4 y el presunto padre 2 en nueve de los once sistemas sugieren que el verdadero padre podra ser un familiar o que se han producido dos mutaciones.

C A P T U L O 67

P RUEBAS D E P A T E R N I D A D : E M P L E O DEL ADN, P O L I M O R F I S M O Y O T R O S M A R C A D O R E S .

1401

proporciona exclusiones de ms del 99% de hombres acusados en falso, no es posible excluir a todos los que no son padres, y tampoco es posible demostrar la paternidad mediante pruebas de laboratorio. Cuando no se encuentra exclusin, las estimaciones matemticas derivadas de las pruebas de marcadores genticos son una fuente significativa de datos que puede utilizarse para establecer la paternidad.

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C A P I T U L O

68

Pruebas forenses de identidad mediante anlisis del ADN

Victor W. Weedn, M.D., J.D. Rhonda K. Roby, M.P.H.
USOS DEL ADN VENTAJAS DEL ADN FRENTE A LA SEROLOGA TRADICIONAL POLIMORFISMOS MTODOS DE ANLISIS DEL ADN Anlisis de RFLP Pruebas de PCR Transferencias en mancha basadas en la PCR AFLP y STR Marcadores de gnero y del cromosoma Y Secuenciacin del ADN mitocondrial Instrumentacin 1403 1404 1404 1402 DEGRADACIN DEL ADN Y DAO AMBIENTAL RECOGIDA DE MUESTRAS EXTRACCIN DEL ADN NORMAS DE GARANTA DE LA CALIDAD DESAFOS LEGALES BASES DE DATOS DE ADN BIBLIOGRAFA 1410 1411 1411 1411 1412 1412 1413

El primer uso a gran escala de las pruebas de cido desoxirribonucleico (ADNI no se realiz en los diagnsticos mdicos, sino en los forenses (cnminalisticos y de anlisis de la paternidad) (Weedn, 1993). Se atribuye a Sir Alee Jeffreys el primer informe aparecido en la bibliografa cientfica, en el cual propone que el tipado de ADN podra ser de utilidad en la identificacin forense y acu el trmino "huella de ADN" en su articulo de Nalure (Jeffreys, 1985b, 1985c). Los laboratorios comerciales comenzaron el estudio de casos de paternidad y criminalisticos mediante el empleo de la prueba de ADN en 1986, (fecoes. 1986: Cellmark. 1987: Forensic Science Associates, 1986); a (males de 1988. los laboratorios criminalsticos gubernamentales incorporaron estas pruebas (FBI. diciembre de 1989, Virginia, marzo de 1989). Las pruebas forenses de ADN han reemplazado prcticamente por completo a la serologa tradicional como medio de anlisis de las muestras biolgicas. El conjunto de las pruebas forenses de ADN ha estado sometido a numerosos cambios en cuanto a mtodos y tecnologas, aunque parece haberse decidido actualmente por un grupo de 12 locus de STR, que sern los pilares de estas pruebas en un futuro prximo. Este grupo de locus se complementa con el anlisis de gnero (amelogenna) y con la secuenciacin del ADN mitocondrial. La principal plataforma instrumental es la electroloresis capilar, aunque tambin se estn empleando otras plataformas.

por diversas razones: 1) est presente en todas las clulas del organismo (excepto en los glbulos rojos maduros). 2) es el mismo en todas las clulas del organismo (excepto en los gametos sexuales haploides). 3) no cambia durante el curso de la vida (excepto mutaciones) y 4) es diferente en todos los individuos (excepto en gemelos idnticos). Slo recientemente, se ha considerado la prueba de ADN como una prueba de identificacin positiva, ms que nicamente una prueba estadstica (aunque firme) de identificacin. El FBI considera actualmente el resultado del perfil de ADN con un poder de discriminacin de 10 veces la poblacin de Estados Unidos, lo que permite asegurar que una determinada muestra de ADN procede de un determinado individuo. De acuerdo con el principio de transferencia de evidencias de Locard, normalmente se dejan restos biolgicos en la escena del crimen que pueden vincularse con el autor. La prueba de ADN vincula al sospechoso con la escena, pero no es por si misma una prueba del delito. Por ejemplo, la evidencia de restos de semen no demuestra una violacin (p. ej., el semen recuperado de una presunta vctima de violacin puede haberse depositado a travs de un contacto sexual consentido). Seguro que sera evidente un mayor impacto de la prueba del anlisis de ADN. con la salvedad de que en numerosos delitos: 1) no se encuentran pruebas biolgicas para analizar. 2) no existen muestras de ADN de referencia para su comparacin o no hay sospechoso, y 3) el tipado del ADN no es trascendente para el caso, el ADN no demuestra culpabilidad o inocencia. No obstante, la prueba de ADN ha supuesto una revolucin en los anlisis criminalsticos. Actualmente la prueba de ADN se realiza de modo sistemtico en el laboratorio criminalstico y es admitida en los tribunales. En Estados Unidos, se aplica aproximadamente a tres cuartas partes de los abusos sexuales y a u n a gran proporcin de homicidios. Las pruebas de ADN exculpan al sospechoso acusado en un tercio de los casos, no son concluyentes en u n a cuarta parte y descubren al sospechoso del delito en algo menos de la mitad de los casos. Slo son litigados una parte de los casos en los cuales se analizan restos de ADN. puesto que la mayora son acordados entre las partes. La escena del crimen presenta una gran cantidad de pruebas fsicas; sin embargo, muchas no se recuperan y otras no son remitidas a los laboratorios

USOS DEL ADN

Salvo por la presencia de testigos o en caso de confesin, la capacidad para identificar a una persona en la escena del crimen slo puede llevarse a cabo mediante la huella digital o una prueba de ADN (Peterson, 1991). Cualquier otra prueba slo sugiere una conexin sospechosa. Por ejemplo, los "pequeos detalles" de las marcas que el can de la pistola deja en una bala, pueden vincular especficamente esa bala con una determinada pistola, aunque no implicarn al presunto sujeto que la dispar. Las huellas digitales y el ADN permiten la identificacin directa del individuo, debido a que son personales y. como sucede normalmente en biologa, presentan variacin biolgica. Concretamente, el ADN es til como marcador de identidad

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P R U E B A S FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANLISIS DEL A D N

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de criminalstica (Parker, 1970), En un estudio, Parker y Peterson descubrieron que se podan recuperar objetos fsicos en el 95% de los casos de atracos residenciales, en el 85% de robos, en el 83% de lesiones y en el 100% de asesinatos. Durante el periodo que dur el estudio, slo se revisaron en el laboratorio 489 de los 8.203 casos delictivos informados. En un estudio posterior, Peterson (1984) slo encontr informes de laboratorio en una cuarta parte de los archivos liscales (la gran mayora de los delitos nunca se convirtieron en archivos fiscales), aunque con diferencias segn el tipo de delito (p. ej., cerca del 100% de asesinatos y menos del 20% de robos). Parker observ en su estudio que la mayora de escenas del crimen presentaban numerosas clases de pruebas fsicas, encontrndose de forma frecuente "sangre', "pelo" y "manchas de material orgnico, vegetal, animal y desconocidas" en prcticamente todas las categoras de delitos. Se registraron restos de sangre en el 2% de atracos residenciales, en el 14% de robos, en el 60% de lesiones y en el 60% de asesinatos. Se encontr material orgnico, vegetal y animal, junto a manchas desconocidas en el 35% de atracos residenciales. 15% de robos, 20% de lesiones y 40% de asesinatos. Se hall pelo en el 6% de atracos residenciales y en el 10% de robos. Se encuentra ADN tanto en semen y sangre como en saliva, pelo, clulas de la piel, orina, heces y otras muestras biolgicas. La saliva puede recuperarse a partir de chicles, colillas de cigarros, cartas o un vaso. Las raspaduras de uas y las uas rotas son tiles por s mismas como muestras con restos de ADN. La cinta del pelo y posiblemente otras ropas pueden presentar restos de ADN. Se han recogido muestras de referencia de ADN en cepillos de dientes, mquinas de afeitar, mechones de pelo de beb, muestras de biopsia. sobres y sellos. En el contexto criminalstico, se puede utilizar ADN para vincular un sospechoso a un delito, para exculpar a sospechosos falsamente acusados, para reconocer crmenes en serie y distinguir crmenes inspirados en otro; tambin pueden emplearse en la reconstruccin de un accidente, por ejemplo, para determinar quin conduca el coche medante la identificacin de las gotas de sangre en el lado izquierdo del parabrisas. Adems del uso del ADN como prueba en las escenas de los delitos, tambin se emplea en la identificacin de restos, cuando no estn disponibles las huellas digitales, dentales u otros medios tradicionales de identificacin (Weedn, 1998a). Los mtodos tradicionales de identificacin son dificultosos porque estn sujetos a la descomposicin, fragmentacin, incineracin parcial o ausencia de datos premortem de comparacin. Cualquier fragmento de tejido o hueso puede identificarse por anlisis de ADN. La disponibilidad de las familias como fuente de material de referencia para propsitos de comparacin supera los grandes obstculos de la identificacin mediante la huella digital y dental y la falta de datos premortem de comparacin. En la actualidad, algunos institutos forenses conservan una muestra de ADN, en forma de un pequeo carn con una gota de sangre, en el archivo procedente de las autopsias, por si posteriormente se cuestiona la identificacin o por si se necesita como material de referencia para investigaciones forenses. El ADN se utiliza en la determinacin de la especie y del gnero, as como en la identificacin del grupo y del individuo (Sensabaugh, 1999). Los anlisis de ADN de plantas y animales han sido fundamentales en la resolucin de algunos delitos. La identificacin de especie es importante en los casos de caza furtiva. En algunas ocasiones, se han localizado ciertos lugares o personas a travs de restos de animales y plantas dejados como prueba. El ADN se emplea para la prueba de paternidad (vase Cap. 67). Aunque normalmente se aplica en pruebas civiles de paternidad para apoyo econmico del hijo, tambin se realiza con propsitos criminalsticos, como en el caso del embarazo provocado por una violacin o en el caso de un beb abandonado. Las pruebas de identidad de ADN pueden usarse en la separacin de muestras muy mezcladas (Weedn, 1993b). Los laboratorios de patologa encontrarn una aplicacin de la prueba de identidad de ADN cuando las muestras son involuntariamente cambiadas o el material patolgico vara en una preparacin histolgica o citolgica. Las pruebas sanguneas de anlisis clnicos pueden ser variables. Las pruebas de estupefacientes en orina, cuya eficacia se ha puesto en duda debido a supuestos cambios de muestra, pueden resolverse mediante pruebas de ADN. El anlisis puede

emplearse para confirmar o refutar la identificacin de muestras de biopsia. Se puede determinar que un pequeo fragmento de tejido cancergeno ("variable") en una preparacin microscpica procede de alguien distinto al paciente.

La reina contra Pitchfork

La primera investigacin criminal b a s a d a en el tipado de ADN le realizada por A l e e Jeffreys utilizando una f o r m a inicial de anlisis de RFLP en un c a s o doble de violacin y asesinato en Inglaterra. En 1983, Linda Mann, d e1 5 aos d e edad, fue violada y estrangulada en el tranquilo c o n d a d o de Leieestersriire. N o se encontr ningn sospechoso. E n 1986. D a w n Ashworth. d e1 8 aos d e edad, le violada y estrangulada a una mila del primer asesinato. Richard Buckland, que s e haba c o m p o r t a d o de f o r m a sospechosa, fue a c u s a d of o r m a l m e n t e del s e g u n d o asesinato y declarado s o s p e c h o s o del primero. Jeffreys demostr que las m u e s t r a sd e s e m e n procedan del m i s m o hombre, a u n q u e no de Buckland. De este m o d o , antes de que el A D N luese u s a d o para c o n d e n a r a alguien p o r un crimen, sirvi p a r a d e m o s t r a r que alguien era inocente. La polica no tenia pistas, a p e s a r de las m i l e s de declaraciones, d a t o s informatizados y las 20.000 libras de r e c o m p e n s a . Pensando que el responsable deba ser un h o m b r e de la localidad, la polica pidi a todos los h o m b r e sd e la zona d e entre 1 3y3 0 aos que presentaran de f o r m a voluntaria una m u e s t r a de s a n g r e para su anlisis; prcticamente t o d o s los h o m b r e s lo hicieron; de hecho, un total de 4.500 h o m b r e s ofrecieron la m u e s t r ar e q u e rida (un h o m b r e se neg p o rm o t i v o s religiosos). Colin Pitchfork falt dos v e c e sa sus citas para dar sangre en enero de 1987. En la tercera cita, despus de intentar p a g a r a varias personas para sustituirle, persuadi con xito a su compaero de trabajo, lan Kelly, explicndole que le p r e o c u p a b a que l p u d i e s es e r "incriminado" debido a sus c o n d e n a s anteriores por exhibicionismo. P i t c h f o r k coloc la loto de K e ly en su pasaporte, hizo que K e ly practicase su firma y le instruy en detalles de su familia. Pitchfork consigui eludir a las autoridades. Sin embargo, m e s e s ms tarde, en septiembre de 1987, Kelly, m i e n t r a s beba en un bar, se jact a n t e sus amigos de cmo l habia donado sangre en lugar de su a m i g o Pitchfork. La polica se enter de la sustitucin. Kelly fue c o n d e n a d o por conspiracin para tergiversar el curso de la justicia. Posteriormente, Pilchfork fue analizado a d e c u a d a m e n t e . En unas semanas, la huella de ADN identific al seor Pitchfork c o m o el violador. E n la primavera de 1988, fue declarado culpable y sentenciado d ep o rv i d a a prisin (Wambaugh, 1989).

VENTAJAS DEL ADN FRENTE A LA SEROLOGA TRADICIONAL

Los marcadores genticos han sido m u y utilizados en medicina forense. Los anlisis criminalsticos de muestras biolgicas comenzaron con la aplicacin del grupo sanguneo ABO en estudios forenses a finales del siglo XX. Las pruebas serolgicas se ampliaron para incluir el tipado de antgenos y grupos sanguneos, isoenzimas de protenas sricas y anlisis de HLA. Muchas de estas pruebas tradicionales emplean reacciones inmunolgicas que presentan genes nulos y supresores, antigenicidad dbil, reacciones cruzadas, desnaturalizacin, agentes bloqueantes y modificacin microbiana. La prueba de ADN carece de estos impedimentos caractersticos de las reacciones inmunolgicas (Weedn, 1993a). Adems, el ADN es el determinante fundamental de todos los marcadores genticos. Un gen nulo o supresor es slo otra secuencia de ADN. Analizando el ADN. se estudia el cdigo gentico, ms que una informacin secundaria. Asimismo, debido a la degeneracin del cdigo gentico, existen ms diferencias en el ADN que las reflejadas en las protenas que ste codifica. La primera gran ventaja de la prueba de ADN frente al anlisis serolgico tradicional es que puede aplicarse a cualquier material de origen biolgico. El anlisis serolgico completo (los laboratorios criminalsticos han empleado tradicionalmente 12 marcadores genticos) slo puede realizarse en sangre y no en otros tejidos o lquidos biolgicos. Por ejemplo, los caractersticos mtodos tradicionales de serologa de un frotis vaginal en un caso de violacin, slo incluiran factor secretor. ABO si el factor secretor es positivo y fosfoglucomutasa (PGM). Prcticamente se puede utilizar cualquier vestigio de material biolgico para el anlisis de ADN, incluyendo sangre, pelo, saliva, semen e incluso orina. La segunda gran ventaja de la prueba de ADN, la ms divulgada, es el gran potencial de discriminacin de los perfiles de ADN, permitiendo una identificacin positiva. El anlisis del grupo sanguneo ABO puede distinguir aproxi-

1404

SECCIN VII

PATOLOGA MOLECULAR ADN. Se emplean distintos mtodos de anlisis de ADN para detectar los dos tipos de polimorfismos. Se encuentran polimorfismos de la longitud en el ADN repetitivo. Ms del 90% del genoma humano est compuesto de ADN no codificante o "junk", del cual, aproximadamente del 20% al 30% est compuesto de regiones repetitivas. Muchas de las regiones repetitivas varian en el nmero de repeticiones entre individuos diferentes, denominados locus de repeticiones en tndem de nmero variable (VNTR). Los fragmentos de ADN que contienen VNTR vanan en longitud y por tanto son tiles para el anlisis. Las repeticiones de dinucletido son las ms comunes, aunque las repeticiones ms grandes son de mayor utilidad para los propsitos forenses. Los RFLP. los polimorfismos d e la longitud de los fragmentos amplificados de ADN (AFLP) y las repeticiones cortas en tndem (STR), son ejemplos de tcnicas analticas de la longitud de los fragmentos. Existen polimorfismos de secuencia en fragmentos de ADN con un tamao similar. Los polimorfismos de secuencia consisten en diferencias de u n ao ms bases en la secuencia de ADN de una regin determinada del genoma. Las variaciones de secuencia pueden manifestarse como regiones de alelos alternativos o de delecciones. adiciones o susliluciones de bases. La mayora de los polimorfismos de secuencia son simples mutaciones puntuales dentro de regiones repetitivas y no repetitivas, conocidos como polimorfismos de un solo nucletido (SNP). Los SNP. las transferencias en mancha y las pruebas de ADN mitocondrial son ejemplos de pruebas basadas en la secuencia.

madamente uno de cada tres individuos y otros marcadores serolgicos pueden diferenciar uno entre miles, mientras que los perfiles de ADN actualmente presentan valores de discriminacin de uno entre trillones. Una tercera ventaja de las pruebas de ADN est en su sensibilidad, que es bastante superior a la de los marcadores serolgicos tradicionales. El anlisis mediante PCR es muy sensible, por encima de las pruebas iniciales de polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP). La prueba se puede realizar con xito a partir de muestras diminutas e incluso con restos imperceptibles de trazas de ADN. U n a cuarta ventaja del ADN es su resistencia a los factores ambientales (Kobilnsky. 1992). Es una molcula bastante resistente a los cidos fuertes, lcalis y detergentes, mientras que no lo son los determinantes de las protenas, lpidos e hidratos de carbono. Las protenas se desnaturalizan con relativa facilidad, siendo la conformacin de su estructura terciana muy importante para el tipado. Sin embargo, la informacin que se tipa en el ADN se encuentra dentro de la secuencia de nuclelidos. que es independiente del estado conformacional de la molcula. Asi, las pruebas de ADN se pueden realizar satisfactoriamente en muestras que son ms antiguas y que han estado expuestas a importantes agresiones ambientales, a diferencia de los marcadores tradicionales. U n a quinta ventaja es la capacidad para distinguir entre el ADN de los espermatozoides, el procedente de otras clulas y el bacteriano La mayor parte de los estudios realizados por los laboratorios crimnalsticos en Estados Unidos son de abusos sexuales. Los frotis vaginales contendrn bacterias, clulas epiteliales de la mujer y esperma del hombre. Esto representa un problema para las tcnicas de tipado serolgico tradicionales; en dos terceras partes de los casos, el semen no puede identificarse debido a que la mezcla de lquidos origina una mezcla de tipos serolgicos (Davies, 1982). Sin embargo, el ADN procedente del esperma se puede distinguir de otros ADN. mediante un procedimiento de lisis diferencial, debido a la cpsula de proteccin del espermatozoide (vase en el apartado "Extraccin del ADN"). Esto permite la individualizacin de la procedencia del semen, sin la confusin de datos que originan los restos distintos al semen. Las sondas de ADN son especificas de humanos o primates, de tal modo que la presencia de ADN bacteriano no es trascendente.

MTODOS DE ANLISIS DEL ADN Anlisis de RFLP

Durante la primera dcada de su aplicacin en los esludios de casos de individuos, el anlisis de RFLP ha sido el mtodo ms utilizado en los anlisis forenses de ADN (Southern. 1975; Weedn. 1989). Esta tcnica permite la separacin y visualizacn de los fragmentos de ADN por su tamao. La diana de los anlisis forenses de RFLP es el ADN repetitivo, los locus de VNTR. en los cuales el nmero de unidades de repeticin difiere entre los individuos. Los fragmentos de ADN que contienen VNTR se obtienen a partir de enzimas de restriccin que cortan el ADN cromosmico. La longitud de cada fragmento se denomina "alelo". Por tanlo. se analizan los fragmentos de ADN cortados ("restriccin") que difieren (son polimrficos) en tamao (longitud) entre los individuos (Fig. 68-1). Las primeras sondas empleadas por Jeffreys hibndaban de modo no especfico con numerosos locus dentro del genoma y producan un patrn complejo parecido a un cdigo de barras, especfico de cada individuo (Jeffreys, 1985b, 1985c). La comunidad forense propuso cambiar estas sondas multilocus (MLP) por sondas de un solo locus (SLP), en las cuales slo se originan un par de alelos, uno materno y otro paterno. Las SLP son ms sensibles, ms constantes y producen resultados que se manejan mejor mediante la estadstica de poblaciones tradicional. Una SLP de RFLP caracterstica puede tener aproximadamente una secuencia de repeticin de VNTR de 70 bases. Los fragmentos de RFLP varan en tamao entre 0.5 kb y 1 0 kb. Los seis pasos del anlisis de RFLP, despus de la extraccin de ADN y la cuantificacin, son: 1) digestin del ADN en fragmentos mediante enzimas de restriccin; 2) separacin de los fragmentos por tamao, utilizando electroforesis en gel de agarosa: 3) desnaturalizacin de los fragmentos de ADN bicatenaro en formas monocatenarias, mediante soluciones con pH bsico y transferencia e inmovilizacin de los fragmentos de ADN en una m e m b r a n a de nailon, un proceso conocido como transferencia Southern; 4) permitir que sondas radiactivas hibriden con los fragmentos inmovilizados en la membrana; 5) exposicin de la radiactividad procedente de las sondas sobre una pelcula de rayos X en un proceso denominado autorradiografia y 6) determinacin del tamao de los fragmentos, mediante comparacin de las bandas de la muestra con las bandas de fragmentos de un control en el autorradiograma resultante. El autorradiograma originado a partir de una sonda de un solo locus presenta dos bandas (alelos materno y paterno) en c a d a carril, en el c a s o de un sujeto heterocigoto, o una sola banda, en el caso de un individuo homocigoto. Aclualmente. la autorradiograla ha sido reemplazada por tcnicas de deleccin fluorescente o quimioluminiscenle. Se han desarrollado sistemas automticos de proyeccin de imgenes analticas (Fig 68-2).

Caso de inmigracin ghans

L ap r i m e r a ocasin en la q u es e emple la p r u e b a de ADN fue en el e s t u d i od eu n c a s o de inmigracin en 1985 U nc h i c op r o c e d e n t e de G h a n a intent e m i g r a r a Gran Bretaa, a f i r m a n d o que s um a d r e ya era residente. Las a u t o r i d a d e ss o s p e c h a r o n q u e el c h i c o era u np r i m oL o sm a r c a d o r e s genticos c o n v e n c i o n a l e s (16 s i s t e m a s q u ei n c l u y e n el H L A ) indicaron q u e el chico y la m a d r ee s t a b a n relacionados, p e r o n op u d i e r o n distinguir si la m u j e r era su ta o su m a d r e .P a r ac o m p l i c a r la cuestin, la m a d r e tuvo alguna d u d a en c u a n t o al p a d r e biolgico del chico y no existan musIras del p a d r e de G h a n a ni de n i n g u n a de sus h e r m a n a s . Jeffreys determin q u e el c h i c oyl a s tres h e r m a n a s tenian el m i s m op a d r e y la m i s m am a d r eT o d a s las b a n d a sd el ah u e la d eA D N del joven s o s p e c h o s on oe n c o n t r a d a se nl am a d r e coincidan con las b a n c a sd e t e r m i n a d a sc o m o paternas, p r o c e d e n t e s de las tres hijas. L a s posibilidades d eq u eu n ah e r m a n ad el am a d r e produjese e l mismo g r u p od eb a n d a s m a l e r n a s fueron insignificantes y. p o r consiguiente, se permiti al c h i c oe n t r a r en el pas p a r a unirse a su m a d r e (Jeffreys. 1985a).

POLIMORFISMOS
El ADN de cada persona es nico (excepto para gemelos idnticos), debido a la presencia de "polimorfismos", diferencias en el ADN entre los individuos. Sin embargo, gran parte de la secuencia del ADN es idntica entre los individuos; lo refleja el hecho de que tengamos dos brazos, dos piernas, una nariz, etc.. siendo ms parecidos que diferentes. Slo 1 de cada 1.000 pares de nucletidos difiere de media entre los individuos. No obstante, esto equivale a una media de 3 millones de pares de bases que difieren entre dos individuos cualesquiera, lo cual explica la gran variacin gentica entre individuos en cuanto al tipado sanguneo, color de ojos, color del pelo, temperamento y otras caractersticas. Aunque es grande la diversidad de las regiones codificantes del ADN (genes), tambin las regiones no codificantes del ADN dan lugar a una gran diversidad, soliendo utilizarse en las pruebas forenses de

CAPTULO 68

P R U E B A S FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANLISIS DEL A D N

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RFLP clsico

RFLP de VNTR

Figura 68-1. Dos tipos de anlisis de RFLP. El RFLP clsico est basado en el tamao del fragmento cortado por u n a enzima de restriccin en la secuencia de una mutacin o un polimorfismo. El anlisis de RFLP basado en locus hipervarlables varia en tamao debido a las repeticiones en tndem d e nmero variable (VNTR). (Modificado de National Research Council: ADN Technology in Forensic Science. Washington, DC. National Academy Press. 1992, con autorizacin.)

Los anlisis de RFLP o transferencia Southern son muy potentes y representan la tecnologa ms poderosa de tipado del ADN, produciendo valores de discriminacin de uno entre cientos de millones o incluso superiores. No obstante, es un proceso laborioso que lleva mucho tiempo (de seis a ocho semanas). Adems, requiere una cantidad sustancial de ADN no degradado (alto peso molecular) para el anlisis. La resolucin y la imprecisin de la medicin de los sistemas de RFLP no permiten determinaciones exactas diferenciadas por una sola repeticin. Esta imprecisin de la medicin origina una distribucin continua de las determinaciones allicas de tamao, en lugar de bandas allicas diferenciadas. Por tanto, empleando el anlisis tradicional de RFLP. no puede decirse con certeza que un fragmento determinado con un tamao de 4,32 kb sea el mismo u otro diferente que un fragmento determinado con un tamao de 4,33 kb. Aunque el anlisis de RFLP es una excelente tcnica forense, ha sido desplazada por tcnicas basadas en la PCR debido a su gran sensibilidad, aphcabilidad a muestras degradadas, produccin de resultados allicos diferen-

ciados, procesamiento ms rpido, simplicidad y capacidad para ser automatizadas.

Florida contra Andrews

T o m m i e Lee A n d r e w s se convirti en la p r i m e r ap e r s o n a en ser c o n d e n a d ap o r un crim e n de violacin, utilizando la p r u e b a de tipado de ADN. D u r a n t e la p r i m a v e r a de 1986, s ec o m e t i e r o nu n as e n ed ev i o l a c i o n e se nl az o n as u rd e Orlando, Florida. L ap r i m e r a victima fue N a n c yH o d g e . de 27 aos de edad. D u r a n t e 1986, se pens que el m i s m o h o m b r e haba sido el r e s p o n s a b l e de 23 incidentes, c o m oa c o s a r , forzar y e n t r a r en h o g a r e s de m u j e r e s y por t e n t a t i v a s de a b u s o ss e x u a l e s o violaciones. El modus operan* era caracterstico. P a s a d a la m e d i a n o c h e , el a g r e s o r , empuando un cuchilo, se introduca en el h o g a r de la victima, sorprenda a a m u i e r en la o s c u r i d a d y cubra su c a b e z ac o nu n a sbana o u n a manta. D u r a n t e el a b u s o sexual, l encenda y a p a g a b a la luz. T r a s la agresin, sola levarse su p e r m i s o de c o n d u c i r . En 1986. se r e g i s t r a r o n 23 incidentes. En lebrero de 1987, u n am u j e r de 27 aos de e d a d fue g o l p e a d a ,a c u chilada y r e p e t i d a m e n t e violada, m i e n t r a s sus dos hijos pequeos dorman en la h a b i tacin de al lado. Su c a b e z a le e n v u e l t a por un s a c o de d o r m i r .A g e n t e sv e s t i d o sd e

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Carril 12 3 4 5 6 7 8

SECCIN V I I

PATOIOGA MOLECULAR

Pruebas de PCR
La prueba de la PCR no slo ha revolucionado las ciencias biolgicas, sino tambin los anlisis forenses de ADN. Las pruebas de RFLP del ADN han sido reemplazadas por mtodos basados en la PCR, que incluyen sistemas de transferencia en mancha, AFLP, STR y secuenciacin directa del ADN mitocondnal. La PCR fue descrita por primera vez en 1985 (Saiki. 1985); su invencin se atribuy a Kary Mulls, que fue distinguido con el premio Nobel de qumica en 1993. El concepto inicial se demostr mediante el tipado de la cadena < < de la hemoglobina, aunque su primera aplicacin comercial fue el anlisis de transferencia en mancha del sistema H L A DQA1. El primer caso en el que las pruebas de ADN se introdujeron en un juzgado de Estados Unidos fue el de Pennsylvana contra Pestinikas en 1986. que consisti en el anlisis del sistema HLA DQ-H (Commonwealth ol Pennsylvana v Pestinikas. 19881 La PCR permite tipar el ADN de un modo rpido y sensible. La sensibilidad puede ser critica en temas lorenses. ya que ciertos tipos de pruebas no tienen el suliciente ADN como para poderse analizar mediante tcnicas tradicionales de serologa o anlisis de RFLP. Adems, el ADN diana, amplificado a partir del ADN original, puede detectarse incluso mediante tinciones no especificas de ADN, como la tincin con plata: asi, se evita la necesidad de emplear sondas marcadas frente a los fragmentos del ADN diana. Por consiguiente, los anlisis de PCR no requieren ni hibridacin ni transferencia Southern, permitiendo su automatizacin. Durante el proceso de amplificacin, los amplicones de ADN tambin se pueden marcar especficamente o modificar mediante una molcula seal (p. ej un fluorforo). Las pruebas basadas en la PCR. a diferencia de los RFLP. normalmente producen resultados tipables cuando la muestra de ADN est muy degradada, como en los tejidos de cadveres, sangre expuesta al medio ambiente e incluso tejidos teidos, fijados con formalina e incrustados con parafma en un portaobjetos de vidrio. Las tecnologas de PCR no son sensibles a la degradacin porque, en primer lugar, los locus del ADN diana son pequeos, y porque slo se necesita que algunas copias permanezcan intactas para producir cantidades detectables de producto amplificado. Por el contrario, los anlisis de RFLP son muy sensibles a la degradacin. Los fragmentos ms cortos, analizados mediante tcnicas de tipado del ADN basadas en la PCR. requieren sistemas de deteccin de alta resolucin. Estos sistemas de mayor resolucin presentan la gran ventaja de producir resultados dilerenciados (o semidiferenciados), es decir, resultados allicos, a diferencia de los anlisis de RFLP, que originan una gama de tamaos repartidos en distintos intervalos de confianza, ya que la imprecisin real es menor que la del tamao de los fragmentos allicos.

Figura 68-2. Autorradiografia de RFLP de un solo locus gentico en un caso de violacin. Los carriles de izquierda a derecha son: 1) escala de tamaos de fragmentos estndar de ADN: 2) K562, una linea celular estndar con dos bandas de peso m o l e c u l a r conocido; 3) muestra del control de calidad interno del laboralono: 4) m u e s t r a de referencia estndar del sospechoso: 5) m u e s t r a de referencia estndar de la victima; 6) escala de tamaos de fragmentos estndar; 7) fraccin de clulas epiteliales procedentes del frotis vaginal; 8) fraccin de espermatozoides procedentes del frotis vaginal; 9) escala de tamaos de fragmentos estndar de ADN. El perfil de ADN generado a partir de la fraccin de clulas epiteliales (carril 7) coincide con el perfil de ADN de la m u e s t r a de referencia estndar de la victima (carril 5). El perfil de ADN generado a partir de la fraccin de espermatozoides (carril 8) coincide con el perfil de ADN de la muestra de referencia estndar del sospechoso (carril 4). No se p u e d e excluir al sospechoso c o m o posible donante del ADN extrado de los espermatozoides del Irolis vaginal.

Las pruebas basadas en la PCR son potentes, aunque presentan algunas desventajas. En general, los sistemas genticos analizados mediante tecnologas basadas en la PCR tienen m e n o r poder de discriminacin (son m e n o s informativos) que los sistemas genticos de RFLP. No obstante, el p o d e r de discriminacin es aceptable, y se incrementa con sistemas adicionales. Otra desventaja es su susceptibilidad a la inhibicin por medio de diversos factores, como el hemo de la sangre. Tambin puede producirse una amplificacin preferente de un alelo sobre otro, onginando una "marginacin allica". Igual que en las pruebas de RFLP. los alelos de mayor peso molecular pueden no detectarse si la muestra de ADN est muy degradada. Adems, los cebadores especficos pueden ser ms eficaces con un alelo que con otro, provocando u n aumento en la produccin del alelo favorecido. Por otra parte, la sensibilidad p a i s a n o vigilaron el v e c i n d a r i o El c o c h e patrulla d er e c o n o c i m i e n t o descubri un vehextrema de los sistemas de PCR hace que sean susceptibles de contaminacin c u l oq u eh u i aat o d av e l o c i d a dp r o c e d e n t ed e la z o n a y lo sigui d u r a n t em i la sa n t e s d eq u es ee s t r e la s ec o n t r au np o s t eE lc o n d u c t o r .T o m m yL e eA n d r e w s ,f u ed e t e n i d o por ADN. De hecho, esta facilidad de contaminacin cruzada es la nica preocupacin importante de las pruebas de PCR. por lo cual deben tomarse las prec o m os o s p e c h o s o de m e r o d e a r ,t r a s la persecucin a e l e v a d av e l o c i d a d y el a c c i d e n t e . cauciones apropiadas. Aun asi. la PCR puede realizarse con fiabilidad, incluso l viva a tres m i la sd e la p r i m e r a vctima. N a n c yH o d g e .d e 27 aos de edad. A la maana siguiente, H o d g e le identific de e n t r e una s e n e de fotos. El t i p a d o sanguneo con pruebas no tiles en los anlisis de RFLP, slo demostr q u e l y el v i o l a d o rf o r m a b a np a r t e del t e r c i o de l a poblacin c o n el m i s m o tipo sanguneo Ni su cara, ra su voz fueron r e c o n o c i d a sp o r la seorita H o d g e . Pennsylvana contra Pestinikas L a habitacin e s t a b ao s c u r a y el violador h a b l a b a en voz b a j a El seor A n d r e w tenia u n ac o a r t a d a y la polica slo c o n t a b ac o nu n ap a r de h u e la s digitales en u n ap a n t a la L ap r i m e r av e zq u es e introdujo l ap r u e b ad eA D Ne nu n; u z g a d od eE s t a d o sU n x l o s e x t e n o r de la c a s ad e la victima. En o c t u b r ed e 1987. Lifecodes determin q u e el A D N fue en u nc a s o de 1986, a u n q u e la p r u e b a no fue la b a s ep a r a la disposicin del c a s o . de la s a n g r e de A n d r e w coincida con las m u e s t r a s de s e m e no b t e n i d a s de las v i c t i m a s . L o st r a b a j a d o r e sd eu n asilo h a b i a ns i d oa c u s a d o s del h o m i c i d i op o rn e g l i g e n c i ad eu n U nm e s ms tarde, s e perdi el juicio a p e s a r de q u eH o d g e identilic de f o r m a positia n c i a n oq u e pareca h a b e rm u e r t o de h a m b r e .S ec u e s t i o n a r o n los r e s u l t a d o sd el a va a A n d r e w s . Sin e m b a r g o , el 6 de n o v i e m b r e de 1987. A n d r e w sf u ec o n d e n a d o y sen- a u t o p s i a y se procedi a la exhumacin. En r e s p u e s t a , el mdico de la a u t o p s i a inicial t e n c i a d oa2 2 aos d e crcel en un j u i c i od e violacin d i s t i n t o .D u r a n t e1 9 8 8 en un aleg que los rganos i n t e r n o sh a b i a ns i d oc a m b i a d o sp o r los de o t r oc u e r p o . El c u e r n u e v o juicio s o b r e su acusacin inicial, se p r o d u j o un v e r e d i c t od ec u l p a b i l i d a dys e le po haba sido e m b a l s a m a d oye n t e r r a d o haca un ao L ap r u e b a de A D N del s i s t e m a conden a 78 aos a d i c i o n a l e s de prisin [State v Andrews. 1987| H L A DQ-a fue realizada p o r Ed B l a k e de la Forensic Soence Associates. El A D N esta-

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P R U E B A S FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANLISIS DEL A D N

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ba m u y degradado (el tamao m e d i o de los f r a g m e n t o s fue de 1 0 0 bp). L o s fragmentos amplilicados del l o c u sH L A de 82 bp p r o c e d e n t e s de los rganos internos coincidieron c o nl o sd eo t r o s tejidos del organismo. L o sa c u s a d o st u e r o nc o n d e n a d o sp o r h o m i c i d i o negligente, a u n q u e absueltos de la acusacin de m a n i p u l a r con el cuerpo.
(Commonwealth ol Pennsylvania v Pestinikas, 1988)

Transferencias en mancha basadas en la PCR

El protolipo de ejemplo de tcnicas de deteccin de polimorfismos de secuencia es la transferencia en mancha. La transferencia en mancha consiste en una serie de sondas de ADN para detectar secuencias diana. Una sonda oligonucleotdica especfica de secuencia (SSO), tambin denominada sonda oligonucleotidica especfica de un alelo (ASO), es un fragmento de ADN monocatenario lo suficientemente grande como para conferir especificidad, aunque lo bastante corto para desestabilizarse por un solo nucletido incompatible, uniendo asi nicamente la secuencia complementaria exacta. Las sondas SSO se emplean para detectar la presencia o ausencia de tipos alternativos de secuencias.

clsico de tipado del grupo sanguneo MN. GC es un polimorfismo de protenas sricas en humanos que ha sido isotipado durante aos por los laboratorios criminalsticos, empleando mtodos de anlisis de protenas. Los otros tres sistemas no han sido utilizados con anterioridad en estudios de casos criminalsticos. Cada uno de los sistemas Polimarker delecta nicamente dos o tres aletas. Cuando el sistema Polimarker se combina con DQA1. el poder de discriminacin se incrementa hasta uno entre dos mil. Las transferencias en mancha tambin se han utilizado en el anlisis de las regiones hipervariables del ADN milocondrial.

Illinois contra Dotson

La p r i m e r a vez que un a c u s a d o us la p r u e b a de ADN fue a partir de la apelacin de l ac o n d e n ad eG a r y Dotson p o r la violacin de C a t h l e e nW e b b en Illinois. 1977. D o t s o n le c o n d e n a d o por las a c u s a c i o n e sd e la seorita W e b b y el t e s t i m o n i od e imposicin legal en base al g r u p o sanguneo ABO. por el que f o r m a b a parte del 1 0 % de la poblacin caucsica con el m i s m o tipo de s e m e n que el e n c o n t r a d o en la r o p a interior d e la seorita Webb. Ms tarde. W e b b se relract de su acusacin c o n t r a Dobbson. Se descubri e n t o n c e s un error en el tipado del grupo ABO, r e v e l a n d o que, de hecho, el s e m e n poda p e r t e n e c e r al 66% de la poblacin. No obstante, D o t s o n no fue indultado. El profesor Jeffreys no fue c a p a z de tipar la m u e s i r a de 1 0 aos de antigedad usando la huella gentica de RFLP. Ed Blake, de la Foiensic Associates, e m p l e a n d o la p r u e b a del s i s t e m aH L A DQ-r< m e d i a n t e PCR, le c a p a z de e s t a b l e c e r una exclusin creble. Dotson le indultado en 1989 {Illinois v Dotson. 1989).

En los formatos tradicionales de transferencia en mancha, la muestra amplificada de ADN se fija a una membrana y se explora con una sonda ASO (cualquier sonda no fijada se lava); observndose un resultado positivo de la prueba por medio de la reaccin colorimtrica producida por una enzima ligada a la sonda. Los equipos de reactivos comerciales utilizan una transferencia en mancha inversa, en la cual la sonda se fija a la membrana y posteriormente se aade la muestra amplifica de ADN. Los resultados, positivos o negativos, de la pre- AFLP y STR sencia de una determinada secuencia se determinan visualmente; por tanto, los El anlisis de AFLP consiste en la separacin electrofortica por tamao de patrones de manchas azules de la tira indican un genotipo especifico. fragmentos polimrfcos de ADN producidos por amplificacin, en lugar de por escisin (anlisis RFLP). El HLA DQA1 (anteriormente conocido como DQ-) y el Amplitype Los locus de VNTR empleados en el anlisis de AFLP son ms pequeos PM+DQA1 (comnmente conocido como el sistema Polimarker) son sistemas que los locus de RFLP: por tanto, los fragmentos diana amplificados son ms comerciales de transferencia en mancha inversa empleados en criminologa pequeos. En consecuencia, los AFLP requieren geles de poliacrilamida de (PE 6/osysfems). Los equipos de reactivos de la prueba han demostrado ser alta resolucin, en vez de los geles de agarosa de baja resolucin utilizados en potentes anlisis, fciles de realizar. No se necesita ms equipo que un terlos anlisis de RFLP. La poliacrilamida es lo bastante fuerte como para que mociclador. El analista puede realizar la prueba en menos de un da. El anpueda manipularse, al contrario que la agarosa. evitando asi la necesidad de lisis se realiza de modo satisfactorio a pesar de que la muestra est degrala transferencia del ADN (transferencia Southern) a una membrana de nylon. dada, aunque los locus genticos ms grandes pueden no amplificarse cuanLa concentracin de productos amplificados por PCR es tan superior al ADN do estn presentes locus genticos ms pequeos. Estos sistemas de transpresente incialmente que no es necesaria la hibridacin del ADN diana ferencia en mancha se han introducido de modo generalizado en los tribunamediante una sonda marcada, pudindose teir directamente el contenido total les, y han recibido la aceptacin de los juzgados. de ADN con una tincin de plata u otra tincin no especifica. De modo alterEl HLA DQA1 es un sistema gentico nico. En la versin inicial, existan 21 nativo, se puede marcar el ADN durante el proceso de amplificacin, aadiengenotipos posibles del sistema, procedentes del emparejamiento de seis aledo una marca fluorescente. La imagen de los geles resultantes puede proyectas: 1.1, 1.2,1.3, 2, 3 y 4: el poder de discriminacin resultante sera de uno tarse automticamente sobre un escner de fluorescencia. Debido a la elimientre veinte. Posteriormente, el alelo 4 se fraccion en tres aletas distintos (4.1, nacin de la transferencia Southern y de la autorradiografia, el anlisis de 4.2 y 4.3). dando lugar a un mayor poder de discriminacin (Fig. 68-3). La lira AFLP se puede realizar en uno o dos das, en lugar de las semanas necesade transferencia en mancha Polimarker analiza cinco locus genticos diferenrias para tas anlisis de RFLP. tes: el receptor de lipoprotenas de baja densidad (LDLR), la glucoforina A (GYPA), la cadena y de la hemoglobina (HBGG). D7S8 y el componente especfico de grupo (GC) (Fig. 68-4). La glucoforina A es el sistema gentico Figura 68-3. Tiras de sondas de ADN del sistema AmpliType H L A DQA1 que muestran los resultados obtenidos en un caso de asesinato. Las tiras de la parte superior a la parte inferior son: 1) muestra de referencia estndar de la vctima (4.1,4.2/4.3); 2) muestra de reterencia estndar del sospechoso #1 (1.1); 3) muestra de referencia estndar del sospechoso #2 (4.1,4.2/4.3); 4) prueba de gota de sangre recuperada del apartamento del sospechoso (4.1. 4.2/4.3); 5) prueba de u n a muestra de pelo recuperada del cuerpo de la victima (4.1. 4.1); 6) control #1 o muestra de control de calidad positivo (1.1,4.1): 7) A D N de control #2 o control negativo (sin ADN). El perfil de ADN generado a partir de la prueba de la gota de sangre (tira 4) recuperada del apartamento del sospechoso coincide con el perfil de ADN de la muestra de referencia estndar de la victima (tira 1). No se puede excluir al sospechoso #2 (tira 3) c o m o el donante de la m u e s t r a de pelo (tira 5) procedente del cuerpo de la victima. La vctima no puede ser excluida c o m o donante de la prueba de la gota de sangre. Se puede excluir al sospechoso #1 (tira 2) c o m o el donante de la prueba de la muestra de pelo y de la mancha de sangre.

Puesto que se pueden separar las repeticiones de cada individuo, es posible la determinacin de aletas diferenciados. Los resultados de RFLP se

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Figura 68-4. Tiras de sondas de ADN del sistema A m p h T y p e PM que muestran los resultados en un caso de robo. T a n t o el sospechoso #1 c o m o el sospechoso #2 pueden s e r excluidos c o m o los donantes del material de la prueba. informan como determinados tamaos de banda con cierto grado de imprecisin; los resultados de AFLP se informan como alelos, determinados por el nmero de repeticiones. Lo ideal es que los alelos consten de secuencias repetidas con fidelidad, pero algunos alelos no concuerdan en la secuencia y otros presentan una repeticin parcial. Los sistemas de PCR actuales alcanzan la suficiente resolucin como para revelar diferencias ocasionales en la regin de repeticin, originando una ligera varancia de longitudes o cambio de movilidad, tambin denominado microheterogeneidad de alelos microvariantes. Los primeros AFLP descritos incluan: D1S80. DI7S30 (tambin denominado D17S5), colgeno A (ColA) y APOB (un polimorfismo 3' de repeticin de secuencia del locus de la apolipoprotena B). Estos AFLP iniciales consistan en secuencias de repeticin mayores de 8 bp, conocidos como "minisatlites" o regiones de "repeticin larga en tndem" (LTR). En la actualidad, el D1S80 es el sistema mejor desarrollado y est disponible comercialmente (Fig. 685). El locus D1S80 presenta un elemento de repeticin de 16 bp y sus fragmentos amplificados varan entre 369 bp y ms de 801 bp. Las regiones que presentan secuencias de repeticin de 2 bp a 8 bp. se denominan "microsatlites" o regiones de "repeticin corta en tndem" (STR)
Carril

(Butler, sitio web; Weedn, 1998c). Los fragmentos de STR son bastante ms pequeos que los de LTR, con longitudes medias del orden de 200 bp. En el genoma humano, existen ms de 30.000 locus distintos de STR conocidos. Se prefieren los fragmentos de STR ms cortos a los AFLP iniciales de LTR. debido a su menor susceptibilidad a la degradacin y a su amplificacin preferente. La "marginacin allica" no se observa con las pequeas STR. aunque se produce con los alelos de L T R ms grandes. Sin embargo, las repeticiones de dinucletido. bastante utilizadas en el mapeo gentico, no s e emplean en los laboratorios de medicina forense, debido a la produccin d e las denominadas "bandas shadow" y "bandas slutter". La mayora de las STR utilizadas son repeticiones de tetranucletido. Los Iragmentos ms pequeos de STR son ms apropiados para el anlisis por instrumentos automticos que los fragmentos de ADN ms grandes de los sistemas de RFLP. El anlisis automatizado de STR emplea ADN marcado con fluorescencia. Los fragmentos de ADN migran a un detector, donde cualquier producto de amplificacin marcado se lee en tiempo real o se lee off-line en un escner, tras completarse la electroforesis. El anlisis es bastante rpido debido a la amplificacin simultnea y al anlisis multiplexde grupos de sistemas genticos (Figs. 68-6 y 68-7).

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Figura 68-5. Gel oe la P C Rm a n u a l del sistem a AFLP D1S80 q u em u e s t r al o s productos del locus D1S80 procedentes de n u m e r o s o s individuos tipados m e d i a n t eG e n e A m pD e t e c lion System, seguidos por tincin con plata. La escala allica del sistema A m p l i F L PD 1 S 8 0 comienza con el alelo 14 y c o n t i e n e los alelos comprendidos entre el 16 y el 41. L o s carriles 1. 4. 7 y 10 son la escala allica del s i s t e m a AmpliFLP D1S80; el carril 2 es un control de tipo 16,31: el carril 3 prsenla el tipo 24.37; el canil 5 presenta el tipo 18; el carril 6 p r e s e n t a el tipo 28.31: el carril 8 presenta e tipo 1 8 , 2 5y el carril 9 p r e s e n t a el tipo 1 7 . 2 8

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P R U E B A S F O R E N S E S D E I D E N T I D A D M E D I A N T E A N L I S I S D E I ADN

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Figura 68-6. Imagen de gel generada por ordenador de un anlisis multiplex de STR automtico a partir de numerosos individuos. Cada fragmento amplificado de telos STR s e ha marcado c o n un fluorforo. Se han amplificado simultneamente nueve sistemas de STR. Aqu se demuestra la gran variacin existente entre los individuos.

Las STR fueron utilizadas en 1991 por el Armed Forces Institute o Pathology para identificar a las vctimas de la Guerra del Golfo, pero slo de modo reciente estn disponibles comercialmente. Se venden como sistemas multiplex. en los cuales se analizan simultneamente varios locus genticos (es decir, STR). El poder de discriminacin que se consigue, mediante la combinacin de ocho o nueve sistemas, es similar al de los anlisis de RFLP. Recientemente, el Federal Bureau o Investigatlon (FBI) Technical Workmg Group on ADN Analysls Methods (TWGDAM). junto con el FBI's Combined ADN Index System (CODIS) Workmg Group (el grupo de usuarios que supervisa la red informtica federal de base de datos del ADN). han publicado las paulas por las cuales se emplearn las STR especficas en los perfiles de ADN de los delincuentes condenados, para su inclusin en el CODIS. Se han seleccionado trece STR, con el objetivo de conseguir la potencia estadstica necesaria para identificar a un individuo entre el gran nmero de perfiles de STR incluidos en la base de datos nacional. Cada STR de las que constituyen este grupo fue elegida de acuerdo con los resultados de un estudio exhaustivo de colaboracin entre el FBI y el estado, quienes analizaron las STR disponibles en numerosos laboratorios bajo determinadas condiciones. Los 1 3 locus de STR se han convertido en el mtodo estndar de anlisis para el funcionamiento de la base de datos, as como para los estudios sistemticos de casos de individuos. Actualmente, se dispone de equipos de reactivos comerciales que incluyen los 1 3 locus de STR (PE Blosystems Protiler/Coliler. Promega Power Plex I & //).

Marcadores de gnero y del cromosoma Y

En la actualidad, la determinacin de gnero se realiza mediante el sistema de la amelogenina. Se han reconocido otros marcadores de gnero, aunque no se utilizan de forma generalizada, La amelogenina es til como determinante de gnero porque los alelos del cromosoma X y del cromosoma Y son de distinto tamao, diferencindose en los sistemas electroforticos. Por tanto, dos bandas indican un hombre y una sola banda indica una mujer. La determinacin de gnero supone una innovacin frente al resto de marcadores de identidad habituales, ya que proporciona informacin biolgica del fenotipo especifico del individuo de origen. La informacin sobre el gnero de la muestra de ADN puede ser esencial en la investigacin de los posibles sospechosos. La determinacin de gnero tambin es importante para clasificar las muestras como procedentes de la victima o del sospechoso. Los marcadores polimrficos del cromosoma Y se estn empleando en Europa, y estn investigndose en Estados Unidos, no para la determinacin de gnero, sino porque parecen tiles en el tipado de los frotis vaginales, donde la fraccin femenina contamina el ADN del esperma. Tambin se pueden emplear para caracterizar el linaje paterno (del mismo m o d o que el ADN mitocondrial se utiliza para caracterizar el linaje materno). La descripcin del linaje familiar de Thomas Jefferson se consigui empleando marcadores del cromosoma Y (Foster. 1998).

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Figura 68-7. Electroferograma de STR de un grupo multiplex de S T R procedente de un solo individuo (el original es en color). L o s electroferogramas consisten en una presentacin cuantitativa de los datos, u n a alternativa a la imagen virtual del gel, c o m o se m u e s tra en la Figura 68-6. El eje horizontal se m a r c a con unidades de tiempo arbitrarias y el eje vertical con unidades de fluorescencia arbitrarias. En este caso, se muestran nueve S T R y el m a r c a d o r de gnero amelogenina. Todos las STR muestran dos picos que indican alelos heterocigotos (cada alelo se reprsenla en un cuadrado junto al nmero de repeticiones): el marcador amelogenina representa un homocigoto X que indica una mujer. Las reas sombreadas indican las regiones en las cuales puede encontrarse el rango de alelos para cada locus de STR. Los sistemas multiplex se construyen para ser distinguidos mediante rangos de tamaos no superpuestos y separacin mediante colores (azul, verde y amarillo).

Secuenciacin del ADN mitocondrial

La secuenciacin del ADN mitocondrial (ADNmt) es una tecnologa accesoria reciente, que se aplica cuando existen cantidades muy pequeas de muestra de ADN o cuando ste est muy degradado, sobre todo en pelo (que prcticamente no contiene ADN nuclear) y en restos m u y reducidos (Butler. 1998a; Holland, 1999). El ADNmt tambin es til cuando existen limitaciones de las muestras de referencia, ya que se puede utilizar un nico familiar distante como referencia de la lnea materna (el anlisis del ADN nuclear requiere varios familiares cercanos). El ADNmt consta de una molcula circular de ADN de 16.569 bp de longitud. Slo se tipan polimorfismos de la secuencia, puesto que no contiene regiones significativas de ADN repetitivo. La regin del ADNmt que se analiza en la identificacin humana es el "bucle de desplazamiento" ("displacement loop") {D-loop). tambin conocido como "regin de control". Este locus abarca 1.100 bp y contiene dos regiones hipervariables. La secuenciacin directa es el mtodo ms eficaz para tipar el ADNmt, aunque tambin se han empleado los sistemas de transferencia en mancha. Una sola clula contiene desde cientos a miles de copias de ADNmt, pero slo una copia de ADN nuclear. Por tanto, cuando no puede uparse el ADN nuclear, en algunas ocasiones, puede tiparse el ADNmt. Las mitocondrias se heredan estrictamente de madre a hijo sin contribucin paterna, a diferencia del ADN nuclear. Slo existe una nica secuencia de ADNmt en la clula ("homoplasmia"), mientras que el ADN nuclear se encuentra en pares de cromosomas. En consecuencia, no hay recombinacin gentica. Una secuencia exacta de ADNmt se puede localizar a travs del linaje materno de una familia durante numerosas generaciones. Sin embargo, el poder de discriminacin de la secuenciacin del ADNmt est limitado, alrededor de uno entre cientos. Esta prueba es muy cara, y se realiza actualmente en m u y pocos laboratorios.

Inicialmente, los mtodos de STR empleaban tcnicas manuales de tincin con plata. En la actualidad, el anlisis de STR se realiza mediante electroforesis capilar con deteccin fluorescente en tiempo real (p. ej., PE-Bio 310): en cambio, una pequea parte de la comunidad realiza lectura del gel olf-tne mediante un escner (p. ej., Hitachi FMBio. Molecular Dynamics Fluorlmager. BioRad Multilmager). Para el funcionamiento de las grandes bases de datos se emplean instrumentos multicanal de deteccin en tiempo real (p. ej., PEBio 377 o 3700). Adems de la determinacin de los fragmentos, estos instrumentos tambin pueden utilizarse para la secuenciacin del ADN (p. ej., anlisis del ADNmt). Los anlisis por espectrometra de masas por tiempo de vuelo producen resultados de una gran precisin y de modo ms rpido (Butler, 1998b. 1999). Los sistemas basados en microchip han originado un gran entusiasmo. Algunos dispositivos de microchip permitirn el anlisis del ADN de modo sistemtico (p. ej., Nanogen. Cepheid). Las tcnicas de Taqman y beacon molecular son mtodos alternativos de biologa molecular que se utilizan en las plataformas actuales. La automatizacin completa no se limita a las plataformas de anlisis del ADN, Numerosos laboratorios emplean estaciones de trabajo robticas con circuito web, que pueden extraer, preparar y amplificar el ADN diana. Tambin han aumentando los sistemas de gestin de la informacin del laboratorio (LIMS).

DEGRADACIN DEL ADN Y DAO AMBIENTAL

El ADN es una molcula resistente que puede tolerar un notable rango de temperaturas, pH, concentracin salina y otros factores que destruyen los marcadores serolgicos clsicos. La validacin inicial de pruebas, realizada por los laboratorios de medicina forense, demostr que la mezcla de ADN con detergentes, aceites, gasolinas y otros adulterantes, no alteraba su tipado. No obstante, el ADN de la mayora de muestras sufre una progresiva fragmentacin aleatoria o "degradacin", que transforma el ADN de alto peso molecular en ADN de bajo peso molecular (Kobilinsky, 1992). La fragmentacin del ADN se debe fundamentalmente a la accin de enzimas autolticas tras la muerte celular, pudiendo participar tambin las desoxirrbonucleasas bacterianas. Transcurridos unos das, prcticamente no se aisla ADN de alto peso molecular de los tejidos. El ADN de alto peso molecular procedente de materiales desecados o congelados puede conservarse durante aos. Fragmentos residuales ms pequeos de ADN pueden persistir a pesar de la degradacin. El ADN mitocondrial suele conservarse cuando ya no se puede

Instrumentacin
Aunque la comunidad ha escogido un grupo de locus de STR para el anlisis sistemtico, las plataformas instrumentales en las que se realiza el anlisis no se han decidido. Las pruebas de RFLP se realizaban como tcnicas manuales muy laboriosas. La primera instrumentacin automatizada utilizada por la comunidad forense fue el lector de imagen computarizado para la autorradiografa de RFLP. La tecnologa basada en la PCR, junto a la separacin de fragmentos, transferencia en mancha y secuenciacin, son ms fciles de automatizar.

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PRUEBAS FORENSES DE IDENTIDAD MEDIANTE ANLISIS DEL ADN

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recuperar ADN nuclear, debido a su elevado nmero de copias (a menudo miles en cada clula). En consecuencia, el anlisis de ADNmt se emplea en la identificacin de restos de esqueletos antiguos. Se puede producir una degradacin rpida o un dao en el ADN bajo determinadas circunstancias (Parsons, 1997). La hidrlisis qumica del ADN es muy lenta y normalmente no es significativa. Sin embargo, los iones metlicos pueden catalizar la hidrlisis oxidativa. L a radiacin ultravioleta origina dimerizacin de timidina. Se ha descrito la despurinacin en el "ADN antiguo". A pesar de la fragmentacin, la informacin de la secuencia an est presente dentro de los fragmentos de ADN. La degradacin afecta sobre todo a las pruebas basadas en la determinacin de Iragmentos y a las pruebas que requieren secuencias grandes. Las pruebas tradicionales de RFLP requieren ADN de alto peso molecular no degradado, mientras que los anlisis de PCR pueden realizarse en muestras degradadas: se puede obtener ADNmt a partir de restos de esqueletos en los que no puede recuperarse ADN nuclear.

do adecuado de almacenamiento de algunas muestras de ADN (p. ej., gotas de sangre y huesos). Los tejidos fijados con formalina no son apropiados, aunque pueden emplearse para el anlisis de ADN por PCR. No debe desecharse ningn tejido ni liquido biolgico sin un previo anlisis de ADN.

EXTRACCIN DEL ADN

El paso inicial y ms crtico en cualquier prueba de ADN es la extraccin de ste a partir de la sangre u otras fuentes biolgicas. El ADN procedente de una muestra de sangre, un frotis vaginal u otra fuente histolgica, debe aislarse de otros componentes celulares y contaminantes ambientales mediante una tcnica de extraccin. El mtodo clasico y ms usual es la extraccin con cloroformofenol y la posterior precipitacin con etanol. Es un mtodo eficaz y fiable que ha resistido el paso del tiempo, aunque es engorroso. Un nuevo mtodo ms simple y rpido es el mtodo "Chelex" (Walsh, 1991). La muestra se hierve para liberar su contenido celular y posteriormente se aade Chelex-100 que fija los iones metlicos, inactivando nucleasas y polimerasas. Se obtiene bastante ADN. aunque relativamente de escasa pureza; no obstante, es suficiente para la mayora de pruebas basadas en la PCR. Est aumentando el uso de la extraccin con columna en fase slida (p. ej., las columnas Quiagen) c o m o medio de purificacin, sobre todo cuando se trabaja con grandes volmenes de muestras. El ADN obtenido es mucho ms puro que el separado con Chelex. sin embargo, es relativamente caro. Pueden ser eliminados contaminantes como los encontrados en cigarrillos y en ciertas pinturas. El empleo de partculas de silicona es otro excelente mtodo de purificacin del ADN cuando se precisa eliminar inhibidores. Numerosos laboratorios eliminan la fase de extraccin mediante la realizacin de la PCR directamente a partir de un triturado del material manchado. Esta tcnica es la ms empleada en papeles de liltro con manchas conocidas de sangre, procedentes de muestras de bancos de datos de delincuentes. Los frotis vaginales representan una consideracin especial de extraccin El ADN masculino se separa del ADN femenino mediante un proceso de lisis diferencial (Crouse, 1993). La traccin femenina se obtiene fcilmente a partir de las clulas epiteliales, por un procedimiento de extraccin estndar. La fraccin masculina se obtiene mediante la rotura de los puentes de hidrgeno de la cpsula protectora del espermatozoide con una solucin de ditiotreitol (DTT). Este sistema es eficaz en el anlisis de RFLP. para el cual se desarroll inicialmente; sin embargo, los sistemas ms sensibles basados en la PCR presentan "contaminacin" femenina en la fraccin masculina.

RECOGIDA DE MUESTRAS
L a obtencin apropiada de muestras es m u y importante en la medicina legal. En la escena del crimen, se debe reconocer la prueba antes de recogerla adecuadamente. Esto se suele conseguir con la ayuda de sustancias qumicas que hacen visibles las gotas de sangre. El patrn de salpicaduras de sangre se emplea para ayudar al investigador a interpretar y recoger de un modo inteligente las muestras procedentes de una pltora de gotas de sangre. La documentacin adecuada de la custodia, el embalaje y el precintado son tan importantes como la recogida inicial. Los lquidos biolgicos derramados en artculos que pueden recogerse (p. ej., sangre en un trozo de ropa) se deben obtener y empaquetar por separado. Cuando los lquidos biolgicos estn depositados sobre superficies u objetos que no pueden recogerse, el liquido se obtiene limpindolos con torundas estriles humedecidas con agua destilada estnl, hasta que la mancha sea recogida en su totalidad. Se ha descrito una tcnica para las marcas de mordiscos en el cuerpo (Sweet, 1997), que consiste en lavar con una torunda humedecida y a continuacin utilizar una torunda seca. Se debe recoger una torunda de control a partir de zonas no manchadas adyacentes a la mancha de lquido. Las torundas de las manchas y las torundas de control se secan al aire y se empaquetan por separado. La sangre no coagulada procedente del organismo sigue siendo la muestra de eleccin para los laboratorios de ADN; tambin la sangre anticoagulada con cido etilendiaminotetraactico (EDTA) y citrato-fosfato-dextrosa (CPD). La sangre anticoagulada con hepanna no se recomienda para la prueba de ADN. Aunque los glbulos rojos maduros no poseen ADN (ni nuclear ni mitocondrial). se obtiene bastante ADN de la circulacin a partir de los leucocitos. A pesar de que el hemo inhibe la reaccin de la PCR, la sangre es una buena luente de ADN para la prueba de PCR, ya que la actividad inhibitoria del hemo se diluye fcilmente. No obstante, en caso de una putrefaccin significativa, se prefieren otras fuentes de ADN. Prcticamente cualquier tejido puede emplearse para el tipado de ADN. Algunos tejidos de los que podra pensarse que son mejores fuentes de ADN debido a su mayor densidad celular y. por tanto, mayor concentracin de ADN, en la prctica son menos recomendables debido a su mayor velocidad de degradacin posmortem (Kobilinsky, 1992). Entre los tejidos blandos, el ADN heptico se degrada rpidamente mediante enzimas autolticas. mientras que el tejido cerebral constituye una buena fuente en periodos de tiempo intermedios posmortem. El hueso y los dientes son las fuentes ms estables de tejido posmortem. Se obtiene ADN informativo a partir de restos de esqueletos con decenas de aos. Generalmente, cuanto ms tiempo transcurrido posmortem y mayor descomposicin del cuerpo, la degradacin del ADN procedente de los tejidos del cadver es mayor. Hay que tener un especial cuidado para evitar la contaminacin de la muestra por otras fuentes de ADN. Las muestras se deben recoger utilizando guantes e instrumentos estriles. Siempre que sea posible, se debe obtener una biopsia de tejido no expuesto mediante una incisin. Las muestras se mantendrn refrigeradas, preferiblemente congeladas (aunque las congelaciones y descongelaciones repetidas destruyen los fragmentos grandes de ADN). La desecacin, incluso un sencillo secado al aire, puede ser un mto-

NORMAS DE GARANTA DE LA CALIDAD

Los laboratorios que realizan anlisis forenses de ADN son conscientes de que las normas forenses son muy estrictas y cuentan con la posibilidad de exmenes judiciales exhaustivos de sus procedimientos y prcticas. Existe un acuerdo general sobre los procedimientos de laboratorio apropiados para los anlisis forenses de ADN. La comunidad forense es pequea y esl bien comunicada: aunque los mtodos de tipado de ADN no estn estandarizados, los procedimientos son bastante uniformes. Cualquier variacin significativa o aparicin de un nuevo mtodo requiere una validacin. El FBI's TWGDAM. actualmente conocido como Scientitic Workmg Group on ADN Analysls Methods (SWGDAM). public las pautas iniciales de los procedimientos analticos del ADN que se convirtieron de tacto en normas ( Technical Worklng Group. 1989,1995). Estas normas fueron modificadas por el FBI's DNA Advisory Board (DAB) y aceptadas por el FBI Director de conformidad con el DNA Idenlilicalion Acl. un componente del proyecto de ley Crime, aprobado en 1994 (Federal Bureau ol Investigalion. 1998). Estas normas suponen la pnmera regulacin gubernamental en el campo de la criminalistica, aplicndose a los laboralonos criminalsticos que remiten los resultados del ADN al F8/'s National DNA Index System o que admiten ciertas cesiones federales. La American Society ol Crime Laboratory Directors (ASCLD) tiene un programa de acreditacin de los laboratorios de criminalstica. El American Board ol Criminalists (ABC) certifica a los criminalistas; adems tiene una categora especial para los analistas de ADN. Los analistas que trabajan en muestras de casos de individuos deben estar colegiados (o equi-

1412

S E C C I N VII

PATOLOGA MOLECULAR

valenle) en gentica, bioqumica y biologa molecular, y deben tener un ao de experiencia en biologa forense. Todas estas normas requieren pruebas de competencia, disponibles comercalmente (es decir, Coltege of American Pathologisls. Cellmark Diagnoslies y Collaborative Tesling Services) dos veces al ao para cada analista. Las comparaciones entre laboratorios han demostrado una gran precisin en las pruebas de RFLP realizadas por la comunidad forense de tipado del ADN. El estudio de competencia informa de las determinaciones medias del tamao de los fragmentos de RFLP que difieren en unas pocas bases y el rango de resultados situado dentro del intervalo de confianza 2.5%, empleado en la mayora de los laboratorios de criminalstica (Mudd, 1994). La exactitud y la reproducibilidad de las diferentes pruebas basadas en la PCR tambin son bastante buenas.

DESAFOS LEGALES
Nunca antes una prueba cientfica haba supuesto un desafo legal tan grande y tan divulgado como la prueba de ADN. La prueba de ADN es tan potente que la defensa no ha tenido ms remedio que acometer la prueba con gran vigor. El drama del tribunal se ha forjado en gran parte por las personalidades significativas implicadas. El furor pblico del debate legal ha conducido a percepciones errneas por el pblico profano acerca de la controversia que rodea a la tecnologa; aunque los casos legales son un mal camino para evaluar cualquier tecnologa, los temas legales no son cuestiones cientficas (Wooley, 1992). A pesar de los desafos del tribunal (Roberts, 1991,1992), la comunidad forense ha acogido esta tecnologa y la aceptacin judicial es actualmente habitual (Office of Technology Assessment, 1990; National Research Council, 1992,1996: Attorney General Jane! Reno's National Commisston on the Future olADN Evidence, sitio web). El primer desafio significativo y satisfactorio para la prueba de ADN fue el caso de Nueva York contra Castro en 1989, basado en la percepcin del juez de que el anlisis se haba realizado sin el rigor suficiente (People v Castro, 1989).

lidad de una coincidencia al azar. La discusin cientfica trata sobre lo grande que debe ser la estadstica, a menudo sutilezas sobre diferencias de un par de rdenes de magnitud en estimaciones de 1 entre 1 0 billones; aunque, a menudo, los tribunales han percibido la discusin como una falta de consenso y han dictaminado la interpretacin estadstica como totalmente inadmisible. Actualmente, existe un acuerdo general entre los genetistas de poblacin y los estadistas sobre la validez de la estadstica, disminuyendo los desafos de la defensa en este tema (Chakraborty, 1991; Lander, 1994). Una mezcla sustancial de datos de tipados del ADN, procedentes de poblaciones aisladas, demuestra que la variacin entre los individuos es bastante mayor que la variacin entre los grupos de poblacin; en consecuencia, las frecuencias generadas a partir de grandes grupos raciales son estimaciones suficientes. El National Research Council (NRC) ha publicado dos informes sobre el anlisis de ADN, dirigidos particularmente a temas estadsticos (National Research Council, 1992, 1996). El segundo informe del NRC indica pautas especficas sobre el mtodo estadstico de tratamiento seguido en la actualidad por los laboratorios criminalsticos (Technical Working Group. 1990; Attorney General Janet Reno's National Commission on ADN Analysis Methods, sitio web). Hoy en da, la defensa raramente desafa la admisin de la prueba de ADN, aunque reta, en menor medida, el peso de la prueba. El empuje de la defensa se dirige a la garanta de calidad, a la tasa de errores y, en el caso de las pruebas de PCR. a temas de contaminacin. Por otra parte, la recogida de pruebas y la manipulacin son objeto de mayor impugnacin que la prueba por s misma. Por ejemplo, la fundacin de la defensa de O. J. Simpson postul que la prueba haba sido colocada o manipulada. Por supuesto, se desafiar nuevamente a la tecnologa, le mismo que se introducen nuevos mtodos de tipado del ADN. Finalmente, hay que reconocer que la prueba de ADN es ms eficaz que los relatos de testigos presenciales y las pruebas de confesin.

BASES DE DATOS DE ADN

A lo largo de la historia, no se han podido investigar un gran nmero de casos, sobre todo de abusos sexuales, debido a la falta de sospechosos. Los El a c u s a d o Jos Castro y s u sa b o g a d o s defensores Neufeld y S c h e c k organizaron agresores sexuales son conocidos por presentar una alta tasa de reincidencia; el p r i m e r desafio con xito a la admisin de la p r u e b a de ADN. En 1987, el seor por ello, algunos estados empezaron a establecer bancos de datos de abusaCastro, un hombre hispano de 38 aos de edad, fue acusado del apualamiento dores sexuales, que se utilizarn para comparar perfiles serolgicos de conoh a s t al am u e r t e de su v e c i n aV i l m aP o n c e y de su hija de 2 aos de edad. Una pequea g o t a de s a n g r e del reloj que levaba el seor Castro le analizada por la cidos agresores sexuales con pruebas de casos de abusos sexuales. Aunque Ufecodes Corporation, determinndose que no perteneca a Castro, aunque si coinesto fue til en numerosas ocasiones, la eficacia de los bancos de datos estacida con la sangre de la vctima. La posibilidad de que otro h o m b r e hispano escogiba obstaculizada por el bajo poder de discriminacin de la prueba serolgica do al azar tuviese el m i s m o perfil de A D N le de 1 entre 1 8 9 millones. El juez decladel semen. Sin embargo, el anlisis de ADN, debido a su mayor poder de disr ser admisible la prueba de que el ADN no coincida con el de Castro, a u n q u e la criminacin, ha aumentado el poder investigador de tales bancos de datos al p r u e b a de que ste coincida con el ADN de P o n c e no le a d m i t i d a debido a fallos nivel de los archivos de huellas digitales. del laboratorio en el e m p l e o de tcnicas de anlisis aceptables. N o obstante, frente A partir de junio de 1998, todos los estados tienen la obligacin de poseer ao t r a prueba, el seor Castro se declar culpable de los asesinatos a finales de una base de datos de delincuentes condenados. La mayora de bancos de 1989. Tras l a conclusin del estudio y la declaracin d e culpabilidad, el juez Shendlm se inclin s o b r e el asiento y pregunt al a c u s a d o si la sangre era de la vcdatos estatales obtienen y tipan muestras de ADN procedentes de delincuentima, a lo que l contest que si, c o n f i r m a n d o los resultados de la prueba de ADN tes sexuales condenados. Tambin suelen incluirse los delincuentes violentos [People v Castro. 1989). condenados, sobre todo los autores de homicidios. La tendencia es ampliar el requerimiento de la obtencin de muestras de ADN en los delitos. A menudo, los delincuentes violentos ya han sido condenados por delitos anteriores. La La tecnologa forense del tipado de ADN ha experimentado progresos sigrecopilacin no slo sirve para capturar a grandes delincuentes, sino tambin nificativos y mejoras a partir de los procedimientos de garanta de calidad para intervenir antes de que se intensifique la conducta criminal del autor. (Mudd, 1994). Las autorradiografias de los casos iniciales, como las de Castro, no son representativas de las autorradiografias de calidad obtenidas posteriormente por la comunidad forense. Del mismo modo, los argumentos de la defensa han evolucionado con el tiempo. Inicialmente, la defensa desafiaba la validez de la tecnologa en s misma, aunque esto nunca ha sido un argumento vlido. La estrategia de la defensa que mayor xito reuna estaba en el reto de la interpretacin estadstica de una coincidencia de ADN. Aunque han planteado muchos condicionantes estadsticos, los argumentos actuales se han centrado en "la subestructura" y en el empleo de bases de datos adecuadas de frecuencias de poblacin; sta debera ser una base de datos caucsica, una base de datos italiana o una base de datos de Nueva York. Las diferencias en las frecuencias allicas entre los subgrupos tnicos pueden subestimar la posibiLos bancos de datos facilitan la comparacin de casos y sospechosos a travs de organismos y limites jurisdiccionales, incluso sin pistas o sospechas. El FBI ha creado un sistema de soware, el Combined ADN Index System (CODIS) y una red, conocida como National ADN ndex System (NDIS). que permite a las jurisdicciones comparar perfiles de ADN de casos de individuos sospechosos conocidos y de sospechosos desconocidos, con bases de datos de delincuentes condenados. El Reino Unido ha tomado medidas ms drsticas para establecer u n a completa base de datos nacional de ADN de criminales. Las muestras se obtienen de un rango ms amplio de categoras de delitos, a diferencia de la mayora de programas estatales de Estados Unidos, que se centran en los abusos sexuales. Las muestras se recogen a partir de detenidos, mientras

Nueva York contra Castro

C A P T U L O 68

P RUEBAS

F O R E N S E S DE I D E N T I D A D M E D I A N T E

ANLISIS

DEL

ADN

1413

que en Estados Unidos slo se obtienen de condenados. Los britnicos afirman que las posibilidades de encontrar al autor de un crimen, mediante una coincidencia de ADN, son de uno entre cada dos delitos (Weedn. 1998b).

BIBLIOGRAFA
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Apndices
Soluciones fisiolgicas, tampones, indicadores cido-base, materiales de referencia estndar y tabla de conversin de temperaturas.

Pesos ideales, superficie corporal e ndice de masa corporal (IMC)

Clculo aproximado del volumen sanguneo total (VST)

Tabla peridica de los elementos

Unidades del Sistema Internacional (SI)

A P N D I C E

Soluciones fisiolgicas, tampones, indicadores cido-base, materiales de referencia estndar y tabla de conversin de temperaturas

SOLUCIONES FISIOLGICAS
Una solucin fisiolgica es aquella que contiene varias sales a una concentracin aproximadamente equivalente a la de los lquidos corporales del hombre. La ms sencilla es la solucin salina fisiolgica que tiene la misma presin osmtica que la sangre. Tambin existen soluciones ms complejas, como por ejemplo, las que mantienen a los tejidos en un estado de metabolismo activo durante periodos prolongados. La Tabla A1-1 proporciona las frmulas de algunas soluciones isotnicas en relacin a la sangre.

Como la concentracin total de tampn/litro es de 0,1 M [acetato] + [cido actico] = 0,1 M Sustituyendo el valor del acetato en la Ecuacin 2; 1,38 [cido actico] + [cido actico] = 0,1M Por tanto, [cido actico] = 0,042 M [cido actico] = 2,52 g/l [acetato] ' = 0,058 M = 4,76 g/l Ejemplo 2. Si se mezclan 648 mi de cido dietilbarbitrico 0,025 M y 10 mi de dietilbarbiturato sdico 0,5 M y se diluyen hasta un litro, calcular el pH de la solucin (pK del cido dietilbarbitrico = 7,98 y concentracin molar = moles/litro). Existe la siguiente relacin entre la molandad y el volumen de una solucin: M1V1 = M2V2 (3) (2)

TAMPONES*
Los tampones permiten controlar los cambios de pH. En general, los tampones estn compuestos por un cido dbil y su sal o por una base dbil y su sal. La ecuacin de Henderson-Hasselbach pH = pK + log [sal]/[cido] (1)

donde M1 = molaridad de la solucin inicial V1 = volumen de la solucin inicial M2 = molaridad de la solucin final V2 = volumen de la solucin final Emplear la Ecuacin 3 para calcular los cambios de concentracin de la sal y el cido despus de diluir hasta un litro: [dietilbarbiturato sdico] = 0,025 x 0,648 = 0,0162 mol/l [cido dietilbarbitrico] = 0,5 x 0,01 = 0,005 mol/1 Calcular el pH de la solucin mediante la Ecuacin 1:

es til para calcular la relacin entre el cido (o base) y su sal correspondiente y es necesaria para obtener el pH deseado de un sistema tampn. Ejemplo 1. Si sabemos que el pH de un tampn acetato 0,1 M es de 4,9; calcular la concentracin de cido actico y acetato sdico del tampn (pK del cido actico = 4,76). Sustituyendo los valores de pH y pK en la Ecuacin 1: log [acetatojVfcido actico] = 4,9 - 4,76 = 0,14 |acetato]/[cido actico] = 1,38 acetato] = 1,38 [cido actico]
' Para un anlisis razonado, que incluye la preparacin de soluciones lampn con una luerza inica definida, consultar Bates RG: Determination ot pH-Theory and Practice, 2nd ed. New York. John Wiley and Sons, 1973.

pH =7,98-log (0,0162/0,005) = 7,98 - log 3.24 = 7,98 - 0,51 = 7,47 La mxima capacidad tampn se obtiene en el valor de pK del cido o la base dbiles. Por ejemplo, en el caso del cido actico con un pH de 4,76, es necesaria una mayor cantidad de cido para modificar el pH de un tampn acetato desde 4,76 hasta 4,66 que desde 4,2 hasta 4.1. La capacidad de tamponamiento eficaz abarca un rango de pH de, aproximadamente, una unidad a ambos lados del valor de pK del cido o base dbiles. En el caso del cido actico, sta se sita entre pH 3,8 y pH 5,8.

Tabla A1 -1

Soluciones fisiolgicas Salina Solucin de Locke 0,9 g 0,024 g 0,042 g 0,01-0,03 0,01-0,25 g

Solucin de Ringer 0.7 g 0,0026 g 0,035 g Solucin de Tyrode 0,8 g 0,02 g 0,02 g 0,1 g 0,1 g 0,01 g 0,005 g

Cloruro 0,85 g sdico Cloruro calcico Cloruro potsico Bicarbonato sdico o-Glucosa Cloruro de magnesio Fosfato monosdico Agua destilada 100 mi

Tampones fosfato de Sorensen

En general, estas soluciones tampn son tiles porque el rango de las mezclas vara entre pH 5 y 8. Pareparar soluciones 0,1 M de fosfato potsico monobsico (13,6 g/l) y fosfato sdico dibsico (14,2g/l). Mezclar ambas soluciones en las proporciones indicadas en la Tabla A1-2 para oblener el pH deseado del tampn.

100 mi

100 mi

100 mi

1418
Tabla Al-2
;

APNDICES

Tabla de S o r e n s e n para la mezcla d e t a m p o n e s KHjPCJ, Solucin (mi) 9,75 9,5 90 8,0 7.0 6.0 5.0 4.0 30 2.0 1.0 0,5 PH 5.288 5.589 5,906 6,239 6.468 6.643 6.813 6.979 7.168 7.381 7.731 8.043

Tabla A1-3 T a m p n tris (hidroxymetil) a m i n o m e t a n o mi 0,1 N HCI aadidos 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 200 225 25.0 275 30.0 32 5 35.0 37.5 40.0 42.5 45,0 pH resultante a23C 9,10 8,92 8,74 8.6? 8,50 8.40 8,32 8.23 8,14 8,05 7,96 7,87 7,77 7,66 7,54 7,36 7,20 pH resultante a 37 C 8,95 8,78 8.60 8,48 8.37 8.27 8.18 8.10 8.00 7.90 7.82 7,73 7,63 7,52 7,40 7,22 7,05

NA..HPO Solucin (mi) 0.25 0,5 1.0 2.0 3.0 4.0 5,0 6.0 7.0 8.0 9.0 9,5

Tabla A1 -4 Indicadores c i d o - b a s e COLOR Indicador"' Azul de timol (A) Narania de melilo (B) Azul de bromolenol (A)' Verde de Bromocresol (A)' Rojo de metilo (A)' Prpura de Bromocresol (A) Azul de Bromotimol (A) Rojo lenol (A)" Rojo neutro (B) Azul de Timol (A)' Fenolftaleina (A) Timolftaleina (A)
1 1

Rango de pH 1.2-2.8 3.1-4,4 3.0-4.6 4,0-5.6 4.4-6.2 5.2-6.8 6.2-7.6 6.4-8.0 6.8-8.0 8.0-9.6 8.0-10.0 9.4-10,6

Cantidad de indicador por 10 mi 1-2 golas de solucin acuosa al 0.1% 1 gota de solucin acuosa al 0,1% 1 gota de solucin acuosa al 0,1 % 1 gota de solucin acuosa al 0.1 % 1 gota de solucin acuosa al 0,1 % 1 gota de solucin acuosa al 0,1 % 1 gola de solucin acuosa al 0,1 % 1 gola de solucin acuosa al 0,1% 1 gota de solucin al 0.1% en alcohol al 70% 1-5 gotas de solucin acuosa al 0,1% 1-5 gotas de solucin al 0.1% en alcohol al 70% 1 gota de solucin al 0.1% en alcohol al 90%

cido Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo Amarillo Amarillo Amarillo Roio Amarillo Incolora Incolora

Alcalino Amarillo Naranja Azul-violeta Azul Amarillo Violeta Azul Rojo Amarillo Azul Roja Azul

Las letras A o B que figuran a continuacin del nombre del indicador significan que el indicador es un acido o una base respectivamente ' Para el rango cido i Sal sdica Para ei rango alacaimo
1

/ Tabla A1-5 cidos - y lcalis d e u s o f r e c u e n t e '

Solucin Concentracin de HCL Concentracin de H,SO Concentracin de HNO, Concentracin de cido lctico Concentracin de cido actico glacial Concentracin de NH,,OH
;

Peso molecular 36,46 98,08 63.02 90.08 60.08 35,05

Densidad especifica' 1,19 1,84 1,42 1.21 1.06 0,90

g/l' 440 1.730 990 1 030 1 060 250

Molaridad' 12 18 16 11 17.5 15

Normalidad' 12 3 1 6 11 17,5 15

Cantidad aproximada de mi para obtener 1.000 mi de una solucin 1 N 83 28 64 87 57 67

" Disponible comercialmonte ' Las cifras pueden variar ligeramente dependiendo dol lote o labricante

Tampn de tris (hidroximetil) aminometano*

El lampn de tris (hidroximetil) aminometano se utiliza en un rango de pH entre 7,0 y 9,0, pero su mejor capacidad tampn se sita entre 7,5 y 8,5. Es prcticamente ineficaz por debajo de pH 7,0 y por encima de pH 9,0. Una de las ventajas de este tampn es su excelente estabilidad. El

* Cuando se requieren tampones de molaridad superior, sustituir el HCI 0.1N por HCI 1N.

tampn puede prepararse pesando la cantidad apropiada de tris (hidroximetil) aminometano, disolvindola en agua, y ajustando el pH hasta el valor deseado con HCI. Por ejemplo, si se quieren obtener 100 mi de tampn 0,05 M, se colocan 0,6057 g de tris (hidroximetil) aminometano en un Irasco volumtrico de 100 mi. Se disueleven en unos 50 mi de agua. Se aade el HCI 0,1N, tal y como se indica en la Tabla A1-3. y se enrasa hasla el volumen final con agua destilada. La tabla muestra los valores de pH obtenidos al mezclar 0.6057 g de tris (hidroximetil) aminometano disuelto en agua con las cantidades indicadas de HCL 0.1 N y diluido con agua hasta 100 mi de volumen final.

APNDICE 1

SOLUCIONES FISIOLGICAS, TAMPONES, INDICADORES C I D O BASE,

1419

Tabla A 1 - 6 MRE 40h 83d 84k 136e 350a 723c 911b 912a 913 914a 915a 916a 917a 918a 919a 930e 931 934 937 955b

Materiales de referencia estndar ( M R E ) p a r a d e t e r m i n a c i o n e s clnicas Tipo de MRE % de la fraccin estoiquiomtrica de pureza de masa 99,972 99,9926 99,9911 99,984 99,9958 99,901 99.8 99,9 99.7 99,7
99.9

Uso certificado Estndar reduclomtrico Estndar reductomtrico Estndar acidomtrico Estndar de oxidacin Estndar acidomtrico Estndar acidimtrico Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Identidad y pureza Rango de longitud de onda (440-635 nm Rango de longitud de onda (302-678 nm Temperatura

Cantidad de unidad (iNg) 60 60 60 60 30 50 2,0 25 10 10 20 01 25 30 30 3 filtros Ampollas Uno de cada 50 Conjunto de 4 ampollas

Oxalato sdico Trixido de arsnico Ftalalo polsico cido Dicromato potsico cido benzoico Tris (hidroximetil) aminometano Colesterol Urea cido rico Creatinina Carbonato calcico Bilirrubina D-Glucosa (dextrosa) Cloruro potsico Cloruro de sodio Filtros de vidrio, transmitancia Filtros lquidos, absorbencia Termmetros clnicos de laboratorio (0, 25. 30, 37) Hierro (metal) Plomo en sangre

98,3 99.7
99,9817

99,89

99.90

Tabla A1 -7 Centgrado 110 100 95 90 85 80 75 70 65 60

!)h

C o n v e r s i n de t e m p e r a t u r a s Fahrenheit 230 212 203 194 185 176 167 158 149 140 131 122 113 111.2 109.4 107,6 1058 104,9 104 103.1 102.2 101.3 1F = -17,2C 1C = 33,8F Centgrado 38" 37,5 37 36,5 36 35,5 35 3 4 33 32 31 30 25 20 15 10 +5 0 -5 -10 -15 -20 Fahrenheit 100,4" 99.5 98,6 97.7 96,8 95,9 95 93,2 91,4 89,6 87,8 86
7

50
Ah

44 43 42 41 40,5 40 39,5 39 38,5

68 59 50 41 32 23 1 4 +5 -4

Para convertir los grados Fahrenheil en centgrados, restar 32 y multiplicar por 0.555. Para convertir los grados centgrados en Fahrenheil. multiplicar por 1,8 y sumar 32

INDICADORES CIDO-BASE*
Un indicador cido-base es un cido dbil o una base dbil, que en estado no disociado presenta un color y composicin diferentes a los de la forma ionizada. El cambio de color se produce en un rango estrecho de concentracin de iones de hidrgeno. Este rango se denomina intervalo de cambio de color y se expresa en trminos de pH (logaritmo negativo de la concentracin de iones de hidrgeno). Gran nmero de sustancias presentan propiedades de indicador, sin embargo, son pocas las empleadas en la prctica para neutralizar reacciones y determinar el pH. La Tabla A1-4 muestra algunos indicado-

res cido-base de uso frecuente. En general, los cidos dbiles deben titularse en presencia de indicadores que cambian en soluciones levemente alcalinas. Las bases dbiles deben titularse en presencia de indicadores que cambian en soluciones levemente acidas. La Tabla A1-5 incluye ciertos cidos y lcalis de uso comn. La disponibilidad de medidores de pH de precisin permite titular el pH deseado y puede remplazar el uso de indicadores en determinadas aplicaciones. Dean JA (ed): H a n d b o o k ot Chemistry, 1 3 t h ed. N e w York, McGraw-Hil, 1985. F a s m a n GD (ed): H a n d b o o k of Biochemistry and Molecular Biology. 3rd ed. Cleveland. CRC Press, 1976. Meinke WW: Standard Reference Materials for Clinical Measurements. Anal C h e m 1971;43:28A. The M e r c k Index: An Encyclopedia of Chemicals and Drugs. 1 2 t h ed. Whitehouse Station. NJ. M e r c k and Co., 1996.

B a s a d o en D e a n JA (ed): H a n d b o o k ol Chemistry, revised 1 3 t h ed. N e w York, McGraw-Hil, 1985.

P e s o s ideales, superficie corporal e ndice de masa corporal (IMC)

Tabla A2-1

C o m p a r a t i v a de las tablas de peso-estatura a partir d e datos actuariales: r e c o m e n d a c i o n e s de la c o m p a a d e seguros d e vida Metropolitan sin corregir por e d a d y r e c o m e n d a c i o n e s edad-especficas del centro de investigacin gerontolgica
METROPOLITAN 1983 PESOS* 25-59 a o s Hombres Mujeres 45-59 46-61 47-62 56-66 57-67 58-68 59-70 59-72 60-74 61-76 62-78 63-79 64-81 65-83 67-85 68-87 69-89 71-92 48-64 49-65 50-67 52-69 53-71 54-73 56-74 57-76 59-77 60-78 61-80 CENTRO DE INVESTIGACIN GERONTOLGICA" (RANGO DE PESO E D A D - E S P E C F I C O PARA HOMBRES Y MUJERES) 20-29 a o s 38-50 39-52 41-54 42-56 44-58 45-59 46-61 48-64 49-65 51-67 53-69 54-71 55-73 57-76 59-78 60-80 62-82 64-84 65-87 30-39 a o s 42-54 43-56 44-58 46-59 48-62 49-64 51-66 52-68 53-70 54-72 55-74 59-76 61-78 62-81 64-83 66-85 68-88 69-90 71-93 40-49 a o s 45-58 47-59 48-61 50-64 51-65 53-68 55-70 57-72 59-74 60-77 64-79 64-81 66-83 68-86 69-88 71-91 73-93 75-96 78-99 50-59 a o s 49-61 50-63 52-65 54-67 55-69 57-72 59-74 61-76 53-79 65-79 67-81 68-83 71-86 73-91 75-94 77-97 79-99 81-102 83-105 60-79 aos 52-64 54-67 56-69 58-71 59-74 61-76 64-78 65-79 67-81 71-83 72-89 73-91 76-94 78-97 80-99 83-102 85-105 87-108 89-111

Estatura (cm) 147 150 152 l!>!) 157 160 162 165 168 170 173 175 178 180 183 185 188 190 193

eV i d a Metropolitan (1983 Metropolian H e i g h ta n dW e i g h tT a b l e s .S t a t Bull ' Los valores de e s t a tabla se refieren a estaturas m e d i d a s sin calzado y pesos obtenidos sin ropa. La Compaa de Seguros d o m ou n a tabla de estatura y p e s o en sujetos veslidos ( T a b l a 1). Meiropol Lile ins Co, 1983; 64 (|Jan-Jun]:2) present u n a tabla de estatura y peso t o m a d o s en sujetos desnudos ( T a b l a 4), as c Ettinger WH Jr. Halter JB (eds): Principles ol Geriatric M e d i c i n ea n d Geronde Andres R: Mortality and obesity: T h e rationale for age-specific height-weight tables. In Hazzard WR. B i e r m a n EL, Blass JP. tology. 3rd ed N e w York, McGraw-Hil, 1994. p847. reproduccin autorizada.

APNDICE 2

PESOS IDEALES, SUPERFICIE CORPORAL E NDICE DE MASA CORPORAL ( I M C )

1421

Tabla A2-2 Tabla de ndice de masa corporal (IMC) Para utilizar esta tabla buscar la estatura apropiada en la columna de la izquierda y localizar en esa lnea el peso. La cifra que figura en la parte superior de la columna correspondiente equivale al IMC para ese peso y estatura. Se ha redondeado el peso en kilogramos IMC 1 9 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Peso corporal (kilogramos) 147 150 152 155 157 160 163 165 168 170 173 175 178 180 183 185 188 190 193 36 41 43 44
--13

Estalura (cm)

47 49 50 52 54 55 57 58 60 62 64 65 67 69 71 37

-4 45 46 48 40 51 53 54 56 58 59 61 63 00 67 68 70 73 74 38

45

47
(9 50 52 54 55 57 59 61 63

4
66 68 70 /1 74 76 78 39

48 1 9 51 53 54 56 58 60 62 64 65 68 69 71 73 75 78

8 0
B2 40

50 52 54 55 57 59 0I 63 I 4 66 68 70 73 75 77 79 81 83

52
I-i

56 58 59 61 64 00

54 56 58

0 0
00' 04 66 68 70 72 74 77 79 81

07
69 72 73 76 78 80 83

56 58 60 62 64 00 68 71 73 75 78 80

59 60 63 64 67 69 73 76 78

61 63 65 67 69 72 74 76 78 81
80

63 65 67
00

65
0 ,7

72 74 77 79 81

69 72 74 79 82 84 87 89 92 95 98

07 69 70
41

80
83 80

B6

8 0
84 87 0) 92 94

8 8
91 93 96 99 102 104 46

8 8 ;
90 00 95 98 100 45

8 0
86 88 01 93 43

8 4
8 , 7 89 43

8,
4!

0 7
44

y4 86 B9 92 94 97 too oo 103 102 106 105 109 108 112 47 48

77 79 80 84 87 90 92 95 98 101 103 107 109 112 115 49

69 72 74 77 79 80 87
'JO

93 95 98 101 104 107 110 113 116 119 0o

72 74 76 79 82 84 87 90 93 96 98 101 104 107 110 113 116 120 123 51

73 76 79 82 84 87

8 0
93 95 98 101 104 107 110 113 117 120 123 127 52

76 79 8! 84 87 80 93 95 98 101 104 107 110 113 117 120 123 127 130

IMC

Peso corporal (kilogramos) 147 150 152 155 157 160 163 165 168 170 173 175 178 180 183 185 188 190 193 78 -I 83 B e 89 92 95 38 101 104 107 110 113 117 120 122 127 130 134 80 B 3 86 88 92 04 98 101 104 107 110 113 117 120 123 127 130 134 138 82 85 88 91 94 97 100 103 107 110 113 117 120 123 127 131 134 137 142 84 B 8 90 93 97 100 103 106 109 113 116 119 123 127 130 134 137 141 145 B . 7 30 93 96 99 102 105 109 112 116 119 122 126 130 133 137 141 145 149 80 92
JO

Estatura (cm)

98 102 105 108 112 115 118 122 126 129 133 137 140 145 148 15?

91 94 98 101 104 108 111 1 14 118 122 125 129 132 137 140 144 148 152 156

93 96 100 103 107 110 113 117 121 124 128 132 136 140 143 147 151 156 160

95 98 102 105 109 112 116 120 123 127 131 135 139 143 147 151 155 159 164

98 101 104 108 112 115 119 122 126 130 134 138 142 146 150 154 159 163 168

100 103 107 110 114 117 121 125 129 133 137
11

145 149 153 158 162 166 171

102 105 109 112 116 120 124 128 132 136 140 144 148 153 157 161 166 170 174

104 108 111 115 119 122 127 131 135 139 143 147 151 156 160 165 169 174 170

106 110 113 117 121 126 129 133 137 142 146 150 155 159 164 168 173 177 182

108 112 116 120 124 128 132 136 140 145 149 153 158 162 167 171 176 181 186

111 114 118 122 126 130 134 139 143 147 152 156 157 166 170 175 180 184 190

112 117 121 125 129 133 137 142 146 150 155 159 164 169 174 178 183 188 193

Fuente

http//www.nhlbi.nih.gov/guidelines/obesity/bmi_lbl htm

I 422

APNDICES

Figura A2-1. Nomograma para determinar la superficie corporal en nios y adultos. De Boothby WM. Sanditord RB: Boston M e d Surg J 1921; 185:337, con permiso.

APNDICE 2

PESOS IDEALES, SUPERFICIE CORPORAL E NDICE DE MASA CORPORAL ( I M C )

1423

Figura A2-2. Nomograma para determinar la superficie corporal en ninos. (De DuBois EF: Basal Metabolism in Health and Disease. Philadelphia. Lea & Febiger, 1936.)

A P N D I C E

Clculo aproximado del volumen sanguneo total (VST)

Para calcular el volumen sanguneo total (VST) de un paciente, una de las aproximaciones habituales considera que a cada kilogramo de peso corporal le corresponden 70 mi de VST. Es til en muchos pacientes, sin embargo, en otros, especialmente en nios y adultos con sobrepeso, la cifra obtenida mediante este clculo proporciona una aproximacin inexacta del VST real. Para estos pacientes existen mtodos de estimacin del VST ms adecuados.

volumen sanguneo ms ajustada a cada individuo que la regla de 70 ml/ kg (Gilcher, 1996). Obeso Varones ! Mujeres 60 55 Delgado 65 60 Normal 70 65 Atltico 75 70

ADULTOS

NIOS
El clculo de Nadler y Alien es particularmente inexacto en nios, y en especial en varones prepuberales, a los que se recomienda aplicar los valores del sexo femenino para mejorar la estimacin (Kim. 2000). Pueden emplearse los siguientes valores de VST por kilogramo de peso corporal (Oski. 1993). Neonatos prematuros Neonatos a trmino Bebs y preescolares 89-105 ' 82-86 ml/kg 73-82 ml/kg

El Espectro de COBE emplea la frmula de Nadler y Alien para calcular el VST aproximado de los pacientes (COBE Spectra Apheresis System Operator's Manual, 1997). Esta frmula utiliza la estatura, el peso y el sexo del paciente para calcular el VST. La frmula especfica es la siguiente: Varones: VST(ml) = 604 + [367 x estatura (m)] + [32,2 x peso (kg)] Mujeres: VST(ml) = 183 + [356 x estatura (m)] + [33,1 x peso (kg)] EL VST tambin puede calcularse empleando el rea de superficie corporal (Shoemaker, 1989): Varones: VST = 2.740 ml/m Mujeres: VST = 2.370 ml/m
2 3 3

Otra aproximacin relativamente sencilla, que se muestra a continuacin, emplea la denominada "regla del cinco" de Gilcher, y es una estimacin de

COBE" Spectra'" Apheresis System Operator's Manual: Lakewood, CO, Gambro* BCT, 1997, p1. Shoemaker WC: Fluids and electrolytes in the acutely ill adult. In S h o e m a k e r WC, Ayres S. Grenvik A, et al. (eds): T e x t b o o k of Critical Care, 2nd ed. Philadephia, WB Saunders Company, 1989, p 1130. Gilcher RO: Apheresis: Principles and practices. In Rossi EC, Simon TL, M o s s GS, Gould SA (eds): Principles of Transfusion Medicine. 2nd ed. Baltimore, Wiliams & Wilkins, 1996, p 542. K i m HC: Therapeutic pediatric apheresis. J Clin Apheresis 2000; 15:129-157. Oski FA: The erythrocyte and its disorders. In Nathan DG, Oski FA (eds): H e m a t o logy ot Infancy and Childhood. 4th ed, Philadelphia, WB Saunders C o m p a n y , 1993, p 28.

El nuevo lormato IUPAC numera los grupos del 1 al 18. Tambin se mueslra el sistema numrico IUPAC previamente empleado por el Chemical Abstract Service (CAS). Para los elemenios radiactivos no presentes en la naturaleza, se muestra enlre parntesis el nmero de masa del isotopo ms es'able De Lide DR. Fredenkse HPR CRC Handbok ol Chemislry and Physics. 74ih ed 1993-1994. Boca Raion. FL. CRC Press. 1993. Leigh GJ (ed). Nomenclalure ol Inorganic Chemistry. Oxford. Blackwell Scientific Publications. 1990. Chemical and Engineering News. 1985,63:27.

A P N D I C E

Unidades del Sistema Internacional (SI)

H. Peter Lehmann, Ph D. John Bernard Henry, M.D.
El SI consiste en siete unidades bsicas de dimensin independientes que se enumeran en la Tabla A5-1, junto con los simbolos que corresponden a dichas unidades. La Tabla A5-2 muestra una serie de unidades derivadas del SI utilizadas en el laboratorio clnico. Hay dos tipos de unidades derivadas: las unidades coherentes, que derivan directamente de las unidades bsicas sin emplear (actores de conversin, y las unidades incoherentes, generadas a partir de las unidades bsicas y que contienen un factor numrico con el fin de obtener cifras ms prcticas. La Tabla A5-3 muestra los prefijos que se refieren a las fracciones o mltiplos de las unidades SI bsicas o derivadas. L a descripcin completa de las unidades SI y su aplicacin en medicina se encuentra en la publicacin de la Organizacin Mundial de la Salud The SI for the Health Proflessions (Worid Health Organization, 1977). Un compendio de cantidades y sus unidades SI recomendadas se describe en Tietz (1995). Para la conversin de las unidades SI recomendadas (Tablas A5-4 hasta A5-13). se aplicaron las siguientes normas: 1. Todos los intervalos de refencia se han convertido a unidades SI excepto en los casos en que las determinaciones no son cuantitativas. 2. Los nombres qumicos no se han modificado; por ejemplo, se mantiene el trmino urea en lugar de carbamida. 3. Los factores son los publicados por el Consejo Mtrico Nacional Americano (Lundberg, 1986; Young, 1987: Beeler, 1987), basado en los factores de la Comisin Mtrica de Canad (1981). 4. Los factores para la unidad bsica se calculan para un volumen de 1 litro. 5. El orden de magnitud de los factores se calcula para que los valores de las unidades SI rindan cifras convenientes- por ejemplo, se emplean prefijos para valores superiores a 1.000 o inferiores a 0,001. 6. El valor de las unidades SI recomendadas es equivalente al valor que resulta de aplicar el factor a las unidades convencionales. 7. Para compuestos de masa molecular relativa no definida (por ejemplo, protenas), los intervalos de referencia se convierten en cantidad de masa por litro. 8. Para mezclas de composicin indeterminada (por ejemplo, los fosfolpidos), los intervalos de referencia se convierten en cantidad de masa por litro o se basan en un estndar determinado -por ejemplo, DHEA para 17-cetosteroides. 9. Las cantidades de naturaleza relativa, normalmente expresadas en porcentaje -p. ej., fracciones de isoenzimas de LD- se representan como fracciones. 10. Las unidades enzimticas se reflejan como Unidades Internacionales por litro (U/litro). A pesar de que el katal es la unidad del SI que corresponde a la actividad cataltica (incluidos los enzimas), y se define como el nmero de moles de sustrato transformados por segundo en condiciones determinadas, sin embargo, su empleo es limitado.

Tabla A5-2 U n i d a d e s S I derivadas Cantidad rea Volumen Nombre de la unidad metro cuadrado* metro cbico' litro'
T

Smbolo de la unidad m-' m' L = dm '

: J

Concentracin masa kilogramo/litro' suslanca mol/litro Molalidad mol/kilogramo Densidad kilogramo/litro Fraccin de masa kilogramo/kilogramo Fraccin molar mol/mol Concentracin numrica nmero/litro Temperatura grado Celsio" Presin pascal' Frecuencia herzio" Aclaramiento litro/segundo Potencial elctrico voltio" Energa julio" ' Unidad derivada coherente I Unidad derivada incoherente Tanto ' L" como "I" son smbolos del litro.
1 :

kg/l mol/l kg/l kg/l kg/kg mol/mol L C = K - 273.15 Pa = kg/ms Hz = 1 cycle/s Us V = kg m7s A J = kg m /s
1 3 2 ?

11. Se mantiene la escala de pH para medir la concentracin de iones de hidrgeno. 12. Actualmente, se recomienda mantener la unidad de mm de Hg para referirse a la presin (P , P ). 13. Los porcentajes se expresan en el SI como fracciones, donde una fraccin es una cantidad indefinida que viene dada por el nmero de partculas definidas que constituyen un componente especfico dividido por el nmero total de partculas definidas del sistema.
c02 02

Beeler MF: SI Units and the AJCP Am J Clin Pathol 1987; 87:140. Lundberg GD, Iverson C. Radulescu G: N o w read this: The SI units are here. AJAMA 1986. 255:2329. The SI manual in health care. Ottawa, Sector 9.10 Health and Welfare. M e t r i cC o m mission of Canada, 1981. Tietz NW (ed): Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed. Philadelphia, WB Saunders Co., 1995. World Health Organization: The SI lor the Health Professions. Geneva. WHO, 1977. Y o u n g DS: Implementation of SI units for clinical laboratory data: Style speciications and conversion tables. Ann Intern Med 1987, 106:114, Tabla A5-3 Prefijo exa peta fera giga mega kilo heclo deca deci centi mili micro nano pico femto atto Prefijos Simbolo del prefijo E P T G M k h da d c m M n P f a Factor 10'" 10 tO 10 > i 10' 10' 10' 10 ' 10 10' 10 10 10 IO'
15 14 ( ; ? 9 , ? 5

_.

Tabla A5-1 U n i d a d e s bsicas d e l S I Cantidad Longitud Masa Tiempo Intensidad de corriente elctrica Temperatura termodinmica Intensidad lumnica Cantidad de sustancia Nombre metro kilogramo segundo amperio kelvin candela mol Smbolo m kg s A K ed mol

tt>"

APNDICE 5

U N I D A D E S DEL S I S T E M A I N T E R N A C I O N A L (SI)

1427

Tabla A5-4

Parmetros qumicos e n sangre total, suero y plasma I N T E R V A L O S DE R E F E R E N C I A TPICOS

COMPONENTE cido acatoactico cualitativa cuantitativa Acetona cualitativa cuantitativa Albmina cualitativa Alcohol etlico Aldolasa

SISTEMA Suero Suero Suero Suero Suero Suero y sangre total Suero adultos nios neonatos

U n i d a d e s convencionales Negativa 0.2-1,0 mg/dl Negaliva 0.30-2 0 mg/dl

Factor' 97,95

Unidades del SI recomendadas' Negativa 20-100 Mmol/I Negativa 20-340 pmol/l 32-45 g/l 32-56 g/l 38-50 g/l Negativa, pero representada como mmol/l 22-59 mU/l a 37 C Aproximadamente 2 veces los niveles del adulto Aproximadamente 4 veces los niveles del adulto 2.6-5.0 mmol/l 0.8-2.3 umol/1 12-70 pmol/l 23-47 Mmol/l 7-28 Mmol/l 30-220 U/1 0-40 U/1 < 0,4 Mmol/l 34-91 Mmol/l 40-114 Mmol/l Negativa -3.3 a +1.2 mmol/l -2.4 a +2.3 mmol/l 145-160 mmol/l 21-28 mmol/l 3.0-30.0 mg/l < 5 Mmol/l 2-17Minol/l 2-21 Mmol/l 17-205 MOI/I 7,38-7.44 7.36-7,41 4.7-5,3 kPa 5.3-6.0 kPa 12.7-13,3 kPa < 0,63 mmol/l 1.00-1.20 mmol/l 0.30-1.58 del total 2,30-2.74 mmol/l 19-24 mmol/l 21-28 mmol/l

172.95

3.2-4.5 g/dl (Iraccionamiento salmo) : 3,2-5.6 g/dl (electroforesis) 3.8-5.0 g/dl (unin a colorante) Negativa, pero representada como mg/dl 0,2171 3-8 Sibley-Lehninger U/dl a 37" C Aproximadamente 2 veces los niveles del adulto Aproximadamente 4 veces los niveles del adulto 3.6-7.0 mg/dl 0.01-0.03 mg/dl 20-120 ng/dl (difusin) 40-80 ng/dl (mtodo enzimatico) 12-48 pg/dl (mtodo con resina) 16-120 unidades Somogy/dl 0-4 U/dl < 7 ng/dl 0.6-1.6 mg/dl 0.7-2.0 mg/dl Negativa -3,3 a +1,2 mEq/l -2,4 a +2,3 mEq/l 145-160 mEq/l 21-28 mmol/l 0,3-3,0 mg/dl < 0.3 mg/dl 0.1-1,0 mg/dl 0,1-1,2 mg/dl 1.0-12,0 mg/dl 7,38-7,44 (arterial) 7.36-7,41 (venosa) 35-40 mm Hg (arterial) 40-45 mm Hg (venosa) 95-100 mm Hg (arterial) < 5 mg/dl 4.0-4,8 mg/dl 2.0-2,4 mEq/l 30-58% del total 9,2-11,0 mg/dl 4,6-5,5 mEq/l 19-24 mmol/l 21-28 mmol/l 22-26 mmol/l 24-30 mmol/l 24-30 mmol/l 35-40 mm Hg 40-45 mm Hg 1.05-1,45 mmol/l 1.15-1,50 mmol/l 1 1 0,1333
!

7,4

Nitrgeno ct-amino cido Acido S-aminolevulinico Amoniaco Amilasa Arginmsuccinico- liasa Arsnico cido ascrbico (vitamina C)
1

Suero Suero Plasma Suero Suero Sangre total Plasma Sangre total Suero, plasma o sangre total Sangre total varn mujer Suero Plasma Suero Suero

07139 76.26 0.5872 1,85 10 0.05055 56 78 1 1 1 10 17.10

Barbitricos Bases, exceso

Base total Bicarbonato cidos biliares Bilirrubina directa (conjugada) indirecta (no conjugada) total total en neonato Gases en sangre (vase Cap 9) PH Sangro total Pco
? ?

1 0,1333 0.1333 0,125 0,2500 0.5000 0,01 0,2500 0,5000 1

Sangre total Sangre total Suero Suero Suero Sangre total (arterial) Plasma o suero (arterial) Sangre total (venosa) Plasma o suero (venosa) Plasma o suero (venosa) Sangre total (arterial) Sangre total (venosa) Sangre total (arterial) Sangre total (venosa)

Po Bromuro Calcio ionizado total Dixido de carbono (contenido en CO,) Dixido de carbono

22-26 mmol/l 24-30 mmol/l 24-30 mmol/l 4.7-5,3 kPa 5.3-6.0 kPa 1.05-1.45 mmol/l 1.15-1.50 mmol/l La labia continua en la pagina siguiente

Capacidad de combinacin del CO. Presin parcial de CO.. (Peo,)

cido carbnico (CO ,H,)

428
Tabla A5-4

APNDICES

P a r m e t r o s q u m i c o s en sangre total, s u e r o y p l a s m a (continuacin) INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS

COMPONENTE

SISTEMA Plasma (venoso) Sangre total suburbano no fumador fumador gran fumador Suero Suero Suero Suero Suero Eritrocitos Plasma Suero o plasma Suero, plasma varn mujer Plasma 8 A.M. - 10 A.M. 4 P.M. - 6 P.M. Suero o plasma varn mujer Suero varn mujer Suero o plasma Suero o plasma y orina varn mujer Suero Suero

Unidades c o n v e n c i o n a l e s 1,02-1,38 mmol/l < 1,5% saturacin de hemoglobina l ,5-5.0% saturacin 5,0-9.0% saturacin 40-200 ug/dl 23-50 mg/dl 95-103 mEq/l 150-250 mg/dl (vara con la dieta, el sexo y la edad) 65-75% del colesterol total 0,65-1.3 pH unidades 0.5-1.3 pH unidades 8-18 U/l a 37 C 1.7-3,0 mg/dl 70-140 u. g/dl 80-155 ug/dl 5-23 ug/dl 3-13 (i g/dl 0,1-0,4 mg/dl 0,2-0,7 mg/dl 55-170 U/l a 37 C 30-135 U/l a 37" C 0,6-1,2 mg/dl (adulto) 0,3-0.6 mg/dl (nios < 2 aos) 107-139 ml/min 87-107 ml/min Negativa 52-65% de la proteina total 2,5-5,0% de la protena total 7,0-13.0% de la proteina total 8,0-14.0% de la proteina total 12.0-22,0% de la protena total Concentracin 3,2-5,6 g/dl 0.1-0,4 g/dl 0.4-1,2 g/dl 0,5-1,1 g/dl 0,5-1,6 g/dl

Factor"

Unidades del SI recomendadas* 1.02-1.38 mmol/l

Carboxihemoglobina (monxido de carbono hemoglobina)

0,01

Fraccin de hemoglobina saturada 0,015-0.050 0,050-0 090 0,7-3,7 timol/l 230-500 mg/l 95-103 mmol/l 3.88-6,47 mmol/l Fraccin de colesterol total: 0.65-0,75 0,65-1,3 unidades' 0.5-1,3 unidades 8-18 U/l a 37" C 88-156 umol/l 11-22 Mmol/l 13-24 u.mol/1 138-635 nmol/l 83-359 nmol/l 8-31 umol/l 15-53 Mmol/l 55-170 U/l a 37 C 30-135 U/l a 37 C 53-106 nmol/l 27-53 u.mol/1 1,78-2.32 ml/s 1.45-1.78 ml/s Negativa Fraccin de protenas totales: 0,52-0,65 0.025-0.05 0.07-0,13 0.08-0.14 0,12-0,22 32-56 ql 1 4 gl 4-12 gl 5-11 gl 5-16 gl

Beta caroteno Ceruloplasmina Cloruro Colesterol total (vase Cap. 12) esteres Colinesterasa (seudocolnesterasa) Citrato Cobre

0,01863 10 1 0.02586 0,01 1 i

52,05

0,1574

Cortisol

27,59

Crea li na

76,25

Creatina quinasa (CK)

Creatmina (vase Cap. 10) Aclaramiento de creatinina (endgena) (vase Cap. 9) Crioglobulinas Electroforesis de protenas albmina alfa-1 alla-2 beta gamma albmina alfa-1 alfa-2 beta gamma Grasas neutras (ver triglicridos) cidos grasos total (libres y esterificados) libres (no esterificados) Ferritina

1 88,40

0.01667

0,01 0,01 0,01 0,1 0,01 10

Suero

Fibringeno Fluoruro Folato

Suero Plasma Suero varn mujer Plasma Sangre total Suero Eritrocitos

9-15 mmol/l 300-480 uq/l 15-200 ng/ml 12-150 ng/ml 200-400 mg/dl < 0,05 mg/dl > 3,5 ng/ml (anlisis isotpico) 166-640 ng/ml (bioensayo) > 140 ng/ml (anlisis isotpico) Ninguna < 20 mg/dl 0,5-1,6 g/dl 2,3-3,5 g/dl 70-110 mg/dl 60-100 mg/dl

1 1 1 1 0,01 0,5263 2,266

9-15 mmol/l 300-480 umol/l 15-200 MO/' 15-150 M Q / I 2,00-4.00 g/l < 0,027 mmol/l 11-57 nmol/l > 5 nmol/l 376-1.450 nmol/l > 317 nmol/l Ninguna < 1,11 mmol/l 5-16 g/l 23-35 g/l 3.9-6,1 mmol/l 3,3-5.6 mmol/l
J

Galactosa

Gammaglobulina Globulinas totales Glucosa, en ayunas

Sangre total adultos nios Suero Suero Suero o plasma Sangre total

0,05551 10 10 0,05551

La tabla contina en la pgina siguiente

Tabla A5-4

P a r m e t r o s q u m i c o s en sangre total, suero y plasma (continuacin) I N T E R V A L O S DE R E F E R E N C I A TPICOS

COMPONENTE Tolerancia a la glucosa oral

SISTEMA Suero o plasma en ayunas 30 min 60 min 120 min 180 min Suero o plasma en ayunas 5 min 60 min 120 min 180 min Eritrocitos Suero Sangre total Suero Suero Suero Suero o plasma cualitativo cuantitativo Sangre total varn mujer Suero

Unidades c o n v e n c i o n a l e s 70-1l0mg/dl 30-60 mg/dl sobre nivel en ayunas 20-50 mg/dl sobre nivel en ayunas 5-15 mg/dl sobro nivel en ayunas Igual o inferior al nivel en ayunas 70-110 mg/dl Mximo de 250 mg/dl Descenso signiticativo Inferior a 120 mg/dl Nivel en ayunas 250-500 unidades/10' clulas 1 200-2 000 mlU/ml de concentrado de eritrocitos 5-40 IU/I 24-37 mg/dl < 10 ng/ml < 3 nmol/ml/min 60-270 mg/dl Negativa 0.5-5.0 mg/dl 12.0-16,0 g/dl 13,5-18,0 g/dl 140-350 U/ml

Factor* 0,05551

Unidades del SI r e c o m e n d a d a s 3.9-6.1 mmol/l 1.7-3.3 mmol/l por encima de nivel en ayunas 1.1-2.8 mmol/l por encima de nivel en ayunas 0.3-0.8 mmol/l por encima de nivel en ayunas Nivel en ayunas o inferior 3.9-6.1 mmol/l Mximo de 13.9 mmol/l Descenso significativo Inlenor a 6.7 mmol/l Nivel en ayunas 250-500 punidades/clula 1 200-2 000 U / 1 de concentrado de eritrocitos 5-40 U/1 a 37 C 0,78-1.20 mmol/l

intravenosa

Glucosa- 6-loslato deshidrogenasa (G6PD) y-Glulamiltransferasa Gluiatin Hormona del crecimiento Guanasa Haptoglobina Hemoglobina

1 1 I 0,03254 1 1 0,01 10 10 1 25,59'

<10|ig/l
<3 U/l a 37 C 0.6-2.7 g/l Negativa 5-50 mg/1 120-160 g/l 135-180 g/l 140-350 kU/l 193-524 mmol/l 248-579 mmol/l 966-1.517 mmol/l

(i-hiroxibutirico deshiclrogenasa 17- hidroxicosticosleroides

Inmunoglobulinas: IgG IgA

IgM
IgM igD igE Insulina Tolerancia a la insulina (0.1 unidades/kg)

Plasma varn 7-19 ug/dl mu|er 9-21 ug/dl tras 24 unidades USP de ACTH IM (tniramuscular) 35-55 ug/dl Suero 800-1,801 mg/dl 113-563 mg/dl 54-222 mg/dl 0,5-3,0 mg/dl 0,01-0.04 mg/dl Plasma anlisis isotpico bioensayo Suero en ayunas 30 min 11-240 plU/ml 4-24 ulU/ml Glucosa de 70-110 mg/dl Descenso hasta el 50% de los niveles en ayunas Nivel en ayunas 60-150 pg/dl 250-400 ug/dl 20-55% 50-240 unidades/ml a 25" C (unidades Wolfson-Williams Ashman) Negativa 25-125 ug/dl 5-20 mg/dl 3-7 mg/dl (lactato-piruvato) 80-120 unidades a30C (piruvato->lactato) 185-640 unidades a 30 C (lactato-piruvato) 100-190 U/l a 37 C 17-27% 27-37% 18-25% 3-8% 0-5%

0,01
III

8,0-18.0 g/l 1,1-5.6 g/l 0,5-2,2 g/l 5.0-30.0 mg/l 0.1-0,4 mg/l 79-1722 pmol/l 29-172 pmol/l Glucosa de 3,9-6 1 mmol/l Descenso hasta 0.5 de los niveles en ayunas Nivel en ayunas 10.7-26.9 jimol/l 44,8-71,6 umol/l Fraccin de la capacidad total de fijacin de hierro; 0,20-0,55 0,83-4,18 U/l a 25 C Negativa 866-4.334 nmol/l 0.6-2.2 mmol/l 0.3-0.8 mmol/l 38-62 U / 1 a 30" C 90-310 U/l a 30 C 100-190 U/l a 37 C Fraccin de LDH lotal 0.17-0,27 0 27-0,37 0 18-0.25 0 03-0.08 0.00-0.05
La labia contina en la pagina siguiente

7,175" 0.05551 0.01 0.1791 0.1791 0,01 0,0166

90 min Hierro lotal Suero Capacidad de fijacin de hierro Suero Saturacin de hierro Suero Isocitrico deshidrogenasa Cuerpos cetnicos 17-Ketosteroids cido lctico (como lactato) Lactato deshidrogenasa (LD) Suero Suero Plasma Sangre total venosa arterial Suero

34,67* 0,1110 0 48 048 1

Lclalo deshidrogenasa isoenzimas LD.(nodo) LD, LD, LD, LD, (ctodo)

Suero 0.01

1 4 3 0

APNDICES

Tabla A5-4

Parmetros qumicos e n sangre total, suero y p l a s m a (continuacin) INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS

COMPONENTE Lclalo deshidrogenasa (termoeslable) Tolerancia a la lactosa

SISTEMA Suero Suero

Unidades convencionales 30-60% del total Cambios en la glucosa srica a los de la prueba de tolerancia a la glucosa < 50 ug/dl 80-200 U/ml (Goldbarg-Rutenberg) 75-185 U/ml (Goldbarg-Rutenberg) 0-1.5 U/ml (Cherry-Crandall) 14-280 mlU/ml 400-800 mg/dl 150-250 mg/dl 10-90 mg/dl 150-380 mg/dl 9,0-15,0 mmol/l 8,0-11,0 mg/dl Negativa 0,5-1,4 mEq/l Indetectable

Factor* 0.01

Unidades del SI recomendadas Fraccin de LDH total: 0,30-0 60 Cambios en la glucosa srica similares a los de la pruea de tolerancia a la glucosa < 2.41 umol/l 19.2-48,0 U/l 18.0-44,4 U/l 0-417 U/l 14-280 U/l 4,00-8,00 g/l 3.88-6,47 mmol/l 0,11-2.15 mmol/l 1.50-3,80 g/l 9.0-15,0 mmol/l 2.58-3.55 mmol/l Negativa 0.5-1.4 mmol/l Indetectable

Plomo Leucina-aminopeptidasa (LAP) Lipasa Lpidos totales colesterol (vase Cap. 12) triglicridos (vase Cap. 12) fosfolpidos cidos grasos (libres) Fsloro en (oslollpidos Litio intervalo teraputico Hormona estimulante del tiroides de accin prolongada (LATS) Hormona luteinizante (LH)

Sangre total Suero varn mujer Suero Suero

0,04826 0,24 278 1 0,01 0,02586 0.01129" 0.01 1 0.3229

I

Suero Suero

Suero varn mujer

Magrogiobulinas totales Magnesio Metahemoglobina Mucoprotena Muraminidasa Mioglobina Nitrgeno no proteico (NPN) 5-Nucleotidasa Orntina-carbamiltransterasa Osmolalidad Oxgeno (vase Cap 9) presin (PO )
?

Suero Suero Sangre total Suero Suero Suero Suero o plasma Sangre total Suero Suero Suero Sangre total (arterial) Sangre tolal (arterial) Sangre total (arterial) Sangre total (arterial) Sangre tolal (venosa) Suero o plasma (venoso) Suero adultos neonatos (a trmino) Suero Suero

6-30 mlU/ml Pico en la mitad del ciclo: 3 veces el valor basal Premenopusico < 30 mlU/ml Posmenopusico > 35 mlU/ml 70-430 mg/dl 1,3-2,1 mEq/l 1,8-3,0 mg/dl < 0,24 g/dl < 1% de la hemoglobina lotal 800-200 mg/dl 4-13 mg/l < 90 ug/l 20-35 mg/dl 25-50 mg/dl 0-1.6 unidades a 37 C 8-20 mlU/ml a 37 C 280-295 mOsm/kg 95-100 mm Hg 15-23% de volumen 94-100% 7,38-7,44 7,36-7.41 7,35-7,45 < 3,0 mg/dl 1,2-3.5 mg/dl 0,13-0.63 U/la 37" C (p-nitrofenilfosfato) 20-130 IU/I a 37" C (p-nitrofenilfosfato en lampn AMP)

0,01 0,5000 0,4114 10 0.01 0.01

0.7139
:

6-30 IU/I Pico en la mitad del ciclo: 3 veces el valor basal Premenopusico < 30 IU/I Posmenopusico > 35 IU/I 0,7-4,3 g/l 0,65-1,05 mmol/l 0,74-1,23 mmol/l < 2,4 g/l Fraccin de hemoglobinal total <0,01 0,8-2,0 g/l 4-13 mg/l < 90 ug/l 14,3-25.0 mmol/l 17,8-35.7 mmol/l 0-1.6 unidades a 37" C 8-20 U/l a 37 C 280-295 mmol/kg 12.7-13.3 kPa Fraccin del volumen: 0,15-0,23 Fraccin saturada: 0,94-1.00

l 0.1333 0,01

contenido saturacin PH

7.38-7,44 7.36-7,41 7,35-7,45

Fenilalanina

60,54

< 182|imol/l 73-212 umol/l 2,2-10,5 U/l a 37" C 20-130 U/l a 37" C

Fosfatasa loslatasa acida toslatasa alcalina Fsloro en fostolipidos (vase lpidos totales) Fostolpidos (vase lpidos totales) Fsforo inorgnico

16,67 l

Suero adultos nios

2,3-4,7 mg/dl 4,0-7,0 mg/dl

0.3229

0,74-1.52 mmol/l 1,29-2,26 mmol/l La tabla contina en la pgina siguiente

Tabla A5-4

Parmetros qumicos en sangre total, suero y plasma (continuacin/ INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS

COMPONENTE Potasio Prolactina Protenas (ver Cap 13) totales albmina globulina Fraccionamiento de protenas Protoporlirina Piruvato Saliciiatos intervalo teraputico Sodio Sulfato inorgnico Sullohemoglobina Sulfamidas Testoslerona Tiocianato Pruebas de hormona tiroidea (vase Cap. 169 tiroxina total (T ) tiroxina libre (T, libre) captacin de T por resina
4 3

SISTEMA Plasma Suero varn mujer Suero

Unidades convencionales 3,8-5.0 mEq/l 1-25ng/ml 1-20 ng/ml 6.0-7.8 g/dl 3.2-4.5 g/dl 2.3-3.5 g/dl Vase electroforesis 15-50 mg/dl 0.3-0,9 mg/dl Negativa 15-30 mg/dl 136-142 mEq/l 0,2-1,3 mEq/l 0,9-6.0 en mg/dl as SO, Negativa Negativa

Factor" 1 1 10

Unidades del SI recomendadas' 3,8-5,0 mmol/l 1-25 ug/l 1-20 ug/l 60-78 g/l 32-45 g/l 23-35 g/l Ver eleclroforesis 0.27-0.89 nmol/l 34-102umol/l Negativa 1.08-2,17 mmol/l 136-142 mmol/l 0.10-0,65 mmol/l 0.09-0.63 mmol/l a SO, Negativa Negativa 10.4-41.6 nmol/l 1.0-3.3 mmol/l Negativa 71-161 nmol/l 12-30 pmol/l Fraccin de captacin relativa 0.25-0,38 100-260 ug/l 0.5-5 ulU/l 1.23-3 de nmol/l

Eritrocitos Sangre total Suero Plasma Suero Sangre total Suero o sangre total Suero o plasma varn mujer Suero Suero

0.01777 113.6 0.07240 1 0.5 0.1042

300-1.200 ng/dl 30-95 ng/dl Negativa 5.5-12.5 ug/dl 0,9-2,3 ng/dl 25-38% relativo de captacin 10-26 ug/dl 0.5-5 ulU/ml 80-200 mg/dl

0.03467 12,87 12,87 0,01 10

Suero Suero

tiroxina fijadora de globulina (TBG) tirotropina Iriyodotironina (T,) Translerasas aspartato amino-transferasa (AST o SGOT) alanina amino-transferasa (ALT o SGPT) gamma glutmicotransferasa (GGT) Triglicridos (vase Cap. 12) Troponina I Nitrgeno urico Aclaramiento de urea aclaramiento mximo aclaramiento estndar cido rico

0.0154 8-33 U/l a 37 C 1 1 1 0.01129' 0.357 0.01667 4-36 U/l a 37 C 5-40 U/l a 37 C 0.11-2.15 mmol/l 0.06 ug/l 0.01 ug/l 2.9-8 2 mmol/l 1.07-1.65 l/s 0.68-1,08 l/s o superior al 0,75 del aclaramiento normal 0,24-0,51 mmol/l 0,16-0,43 mmol/l 0,52-2,09 umol/l 0.52-2.09 nmol/l

Suero Suero

8-33 U/l a 37 C 4-36 U/l a 37" C 5-40 IU/I a 37 C 10-190 mg/dl < 2.0 mg/ml 8-23 mg/dl 64-99 ml/min 41-65 ml/min. o ms del 75% del aclaramiento normal 4,0-8,5 mg/dl 2,7-7,3 mg/dl 15-60 ug/dl 15-60 ng/dl

Suero Suero Suero Suero y orma

Vitamina A Tolerancia a la vitamina A

Suero varn mujer Suero Suero ayuno de 3 horas o 6 horas despus de 5000 unidades de vitamina A / kg en 24 horas Suero Suero Plasma Suero normal en malabsorcin

0,05948 0.03491 0.03491

Vitamina B,, Vitamina B,, no saturada capacidad de fijacin Vitamina C Xilosa, absorcin

200-600 ug/dl Valores en ayunas o ligeramente superiores 160-950 pg/ml 1.000-2.000 pg/ml 0.6-1.6 mg/dl 25-40 mg/dl entre 1 y 2 horas Mximo aproximadamente de 10 mg/dl Dosis: adultos 25 g de o-xilosa nios 0.5 g de o-xilosa/kg 50-150 tag/dl

0.7378 0.7378 56.78 0,06661

6,98-20.95 nmol/l Valores en ayunas o ligeramente superiores 118-701 pmol/l 738-1475 pmol/l 34-91 nmol/l 1.67-2.66 mmol/l entre 1 y 2 horas Mximo aproximadamente de 0.67 mmol/l 7,7-23,0 nmol/l

Zinc
1 1

Suero

0,1530

" Ficlor = tactor numrico (observar que no se presentan las unidades) Valor en unidades del SI = valor en unidades convencionales x tactor. Generalmente no determinado en sangre (las muestras de eleccin son la orina, el pelo o las uas, en los casos agudos se analiza el contenido gstrico) Unidad basada en la concentracin del ion de hidrgeno Como cortisol " Como DHEA "* Como trioleina Una (1) Unidad Internacional de insulina corresponde a 0.04167 mg del Cuarto Estndar Internacional (mezcla del 52% de insulina bovina y el 48% de insulina porcina)
1

1432

APNDICES

Tabla A5-5

Orina INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS

COMPONENTE cido aceloaclico Acetona Addis, recuento de

SISTEMA

Unidades c o n v e n c i o n a l e s

Factor* i l 1 0,001 2,774 0,07139 76,26 7,626 1 0.07139 0.1850 0.01335 56,78 5,678

Unidades del SI recomendadas' Negativa Negativa 1,8 x 10 12 h 0,5 x 10 12 h <5,0 x 10 12 h

1 3

Al azar Negativa Al azar Negativa recogida de 12 horas Leucocitos y clulas epiteliales 1.800.000/12 h RBC 500.0000/12 h Moldes hialinos: <5.000/12 h Al azar 24 h 24 h Al azar 24 h Al azar adulto nios 24 h 24 h 2h 24 h Al azar 24 h Al azar 24 h Al azar Al azar 24 h Al azar 24 h dieta normal dieta baja en calcio dieta rica en calcio Al azar 24 h Negativa 15-150 mg/d 2-26 ug/d Negativa 100-290 mg/d 0,1-0.6 mg/dl <0,5 mg/dl 1,5-7,5 mg/d 20-70 mEq/d 500-1.200 mg/d 35-260 unidades Somogyi/hora <50 pg/i 1 7 mg/dl >50 mg/d Negativa <0,5 pg/d Negativa Negativa <2 mg/l 1 + turbidez 100-240 mg/d < 150 mg/d 240-300 mg/d <14 pg/dl <100 ug/d (varia con el ejercicio fsico) <10 ng/d <100 ng/d 4-126 pg/d 0,1-1,6 mg/d 140-250 mEq/d

Albmina cualitativa cuantitativa Aldosterona Cuerpos alcaptnicos Nitrgeno u-aminocido cido 6-aminolevuilnico

Negativa 0,015-0,150 g/d 6-72 nmol/d Negativa 7,1-20,7 mmol/d 8-46 pmol/l <38 pmol/l 11-57 u.mol/d 20-70 mmol/d 35.6-85.7 mmol/d 6,5-48.1 U/h <0,67 j-mol/l 57-397 u.mol/1 >284 pmol/d Negativa <5,55 nmol/d Negativa Negativa <32 pmol/l 1 + turbidez 2,5-6,0 mmol/d <3,7 mmol/d 6,0-7,5 mmol/d <828 nmol/d <591 nmol/d <55 nmol/d <591 nmol/d 24-745 nmol/d 0.5-8,7 pmol/d 140-250 nmol/d

Nitrgeno amnico Amilasa Arsnico cido ascrbico Protena de Bence-Jones Berilio Bilirrubina cualitativa Sangre oculta Borato Calcio cualitativo (Sulkowitch) cuantitativa

111,0

16,44

0.02495 59.11* 5,911* 5,458 5,911 5.911* 5,458* 1

Catecolaminas

epinelnna norepinefrina catecolaminas libres totales metanefrinas totales Cloruro 24 h Prueba de concentracin Al azar - despus de restriccin de (Fishberg) lquidos gravedad especifica osmolalidad Cobro 24 h Coproporfinna Al azar adulto 24 h adulto nios 24 h Creatina varn mujer

> 1.025 >850 mOsm/kg <50 pg/d 3-20 pg/dl 50-160 pg/d <80 pg/d <40 mg/d <100 mg/d Superior en nios y durante el embarazo 20-26 mg/kg/d 1,0-2,0 g/d 14-22 mg/kg/d 0,8-1,8 g/d Negativa 10-100 mg/d 0,2-2.0 mg/d 0,2-1,8 mg/d Negativa <20 pg/d

1 1

0,01574 15,27 1,527

> 1,025 >850 mmol/kg <0,8 pmol/d 46-305 nmol/d 76-244 nmol/d <122 nmol/d <305 pmol/d <763 pmol/d Superior en nios y durante el embarazo 177-230 pmol/kg/d 8,8-17,7 mmol/d 124-195 pmol/kg/d 7,1-15,9 mmol/d Negativa 42-416 pmol/d 0,7-6.9 pmol/d 0.7-6.2 pmol/d Negativa <109 nmol/d La labia contina en la pgina siguiente

7,625

Creatinina

24 h varn mujer

8,840 8,840 8.840 8 840 4.161* 3,467

Cistina cualitativa Cistma y cisteina Deshidroepiandrosterona

cido dactico Epinelnna

Al azar 24 h 24 h varn mujer Al azar 24 h

5,458

APNDICE 5

UNIDADES

DEL

SISTEMA

INTERNACIONAL

DE

(SI)

1433

Tabla A5-5 Orina (continuacin) INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS COMPONENTE Eslrgenos lolales SISTEMA Unidades convencionales Factor* Unidades del SI recomendadas*

Iraccionados estrona (E,) estradiol (E.,) estriol (E ) Grasa cualitativa FIGLU (Acido Nformiminogiutmico)
3

h varn hembra ovulacin mximo luteinico menstrual embarazo posmenopusico 24 h. no embarazo mitad del ciclo
24

5-18

ug/d

3,468

1 7 - 6 2 nmol/d
97-347

28-100 22-80 4-25 ug/d 0.003468 3,468

ug/d Hasta 4 5 . 0 0 0 ug/dia Hasta 10 ug/dia

nmol/d nmol/d 1 4 - 8 7 nmol/d Ms de 1 5 6 nmol/d Ms de 35 nmol/d

76-364

Al azar 24 h tras 15 g de L-histidina 24 h 24 h adulto prepuberal posmenopusico mitad del ciclo 24 h Al azar 24 h

2 - 2 5 iig/d < 1 0 ug/d 2 - 3 0 ug/d Negativo < 3 mg/d

4 mg/8 <1

3.699 3.671 3.468

5,740

7 - 9 3 nmol/d < 3 7 nmol/d 7 - 1 0 4 nmol/d Negativa < 7 , 2 umol/d

2 3 . 0 umol/8 h

h
52,63 1

Fluoruro Hormona foliculoestimulante (FSH)

mg/d U/l U/l

U/l mg/d

< 5 3 umol/d
4-25 4-30

4-25 4-30

IU/I IU/I
IU/I

40-50 30-65

40-50

2 x basal

1 0,005551

Fructosa Glucosa cualilativa cuantitativa sustancias reductoras del cobre glucosa en azucares totales Gonadotropinas pituitarias (FSH y LH) Etiocolanolona

2 x basal 0 , 1 7 - 0 . 3 6 mmol/d Negativa

0,5-1,5 g/d

Negativo
0.5-1.5 g/d

1 1 0,005551 1

24

Media de 2 5 0 mg/d Media de 1 3 0 mg/d 1 0 - 5 0 U/l

Media de 2 5 0 mg/da Media de 0 . 7 2 mmol/da 1 0 - 5 0 lU/d

11-

hidroxiandrosterona

11-

hidroxietiocolanolona

11-

cetoandrosterona

11-

celoeliocolanolona

Lactosa Plomo Magnesio Melanina cualitaliva Mucina Muramidasa (lsozima) Mioglobina cualitativa cuantitativa Osmolalidad Pentosas pH Fenosullataleina (PSP)

h varn mujer 24 h varn mujer 24 h varn mujer 24 h varn mujer 24 h varn mujer 24 h 24 h 24 h Al azar 24 h 24 h
24

1.4-5,0 0.8-4,0 0.1-0,8 <0,5

mg/d mg/d mg/d

3.443

4,8-17,2 2,8-13,8

umol/d nmol/d

3.263

0,3-2,6

mg/d
mg/d mg/d mg/d mg/d mg/d mg/d 3.274 2.291 0,004826 0.5000 3.274 3.26

nmol/d < 1,6 nmol/d nmol/d nmol/d

0.2-0,6 0.1-1,1 0.2-1,0 0,2-0,8 0.2-1,0 0.2-0,8 14-40 < 100

0,7-2,0

0,3-3,63 0,7-3,3 0,7-2,6 0,7-3,3 0,7-2,6

nmol/d nmol/d

mg/d ug/d 6 . 0 - 8 , 5 mEq/d Negativa

100-150 1 3-36 mg/d

nmol/d nmol/d 4 1 - 1 1 7 nmol/d < 0 , 4 8 nmol/d 3 . 0 - 4 , 3 mmol/d Negativa

100-150 1.3-36 mg/d mg/d

mg/d

Al azar 24 h Al azar 24 h Al azar Orina recogida tras administracin de 6 fng de PSP i.v. 1 5 min min 6 0 min 1 2 0 min Al azar
30

Negativa < 4 mg/l 5 0 0 - 8 0 0 mOsm/kg de agua 2 - 5 mg/kg/d

4.6-8,0

I
1 1 1

Negativa < 4 mg/l 5 0 0 - 8 0 0 mmol/kg 2 - 5 mg/kg/d

4,6-8.0

20-50% 16-24%

colorante excretado

0.01

Fraccin de colranle excretado:

0.20-0.50 0.16-0.24 0.09-0.17 0.03-0,10

cido fenilpirvico. cualtitativo

colorante excretado 9 - 1 7 % colorante excretado 3 - 1 0 % colorante excretado Negativa

Negativa La tabla continua en la pgina siguiente

1434

APNDICES

Tabla A5-5 Orina (continuacin) INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS COMPONENTE Fsforo Porfobilingeno cualitativo cuantitativo Potasio Pruebas de embarazo SISTEMA Al azar Al azar 24 h 24 h Muestra matutina concentrada 24 h varn mujer pico embarazo nios 24 h varn mujer nios Al azar 24 h 24 h 24 h 24 h Al azar Unidades convencionales 0,9-1,3 g/d Negativa <1,0 mg/d 40-80 mEq/d Positiva en embarazo normal o en presencia de tumores productores de gonadotropina corinica <1,5 mg/d 1 -8 mg/d 1 semana despus de la ovulacin <50 mg/d Negativa 0,4-2,4 mg/d 0,5-2,0 mg/d Ms de 1 mg/d Negativo 40-150 mg/d 0,5-1,5 mg/d 75-200 mEq/d 55-70 g/d Disminuye con la edad hasta 30 g/da 1,016-1,022 (ingesta lquida normal) 1,001-1,035 (rango) Negativo 20-50 mEq/d 6-17 g/d 250-750 mg/d 0,3-1,0 unidades Ehrlich 0,05-2,5 mg/d o 0,5-4,0 unidades Ehrlich/dia 15-45 unidades/hora (Anson) 1.500-5.000 unidades/da (Anson) 2,972 Factor* 32,29

Unidades del SI recomendadas 29-42 mmol/d Negativa <4,4 pmol/d 40-80 mmol/d Positiva en embarazo normal o en presencia de tumores productores de gonadotropina corinica <4.7 pmol/d 3-25 pmol/d 1 semana despus de la ovulacin <156 pmol/d Negativa

4,420 1

Pregnanediol

3.120 3.120

Pregnanetriol

Protena, cualitativa Sustancias reductoras, total Sodio Slidos, totales Peso especifico

1 1 1 1 1

Azcares (excepto glucosa) Acidez titulable Nitrgeno ureico cido rico Urobilingeno Uropepsina Uroporfirinas cualitativa cuantitativa cido vanilmandlico (VMA) Volumen, total Zinc ' Como norepinetrina " Como normetanerina Basado en cistina * Basado en estriol
:

Al azar 24 h 24 h 24 h 2h 24 h Al azar 24 h

1 35 70 0,005948 1 1,693 1 7,37

1,2-7.1 nmol/d 1,5-5,9 nmol/d Ms de 3 j-mol/d Negativa 40-150 mg/d 0,5-1,5 mg/d 75-200 mmol/d 55-70 g/d Disminuye con la edad hasta 30 g/dia Densidad relaliva (U 20 C/agua 20 C) 1,016-1,022 (ingesta liquida normal) 1,001-1,035 (rango) Negativo 20-50 mmol/d 214-607 mmol/d 1.5-4,5 mmol/d 0,3-1,0 U 0.1-4,2 pmol/d 0.5-4,0 U/d 111-332 U/h 11-37 kU/h Negativo 12-36 nmol/d 7,6-37.9 umol/d 0,6-1,6 l/d 2,3-18,4 pmol/d

Al azar 24 h 24 h 24 h 24 h

Negativa 10-30 pg/d 1,5-7,5 mg/d 600-1.600 ml/d 0,15-1,2 mg/d

1,204
5,046 0.001 15,30

f~

Tabla A5-6

Lquido sinovial INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS Unidades convencionales <10 mg/dl Granulocitos <25% de clulas nucleadas Ausente Abundante <200 clulas/ml Elevado <3.5 mi Factor 0,05551 0.01 Unidades del SI recomendadas <0,56 mmol/l Fraccin del nmero de granulocitos: <0.25 de clulas nucleadas Ausente Abundante <200 x 10* clulas/litro Elevado <0,0035 1

COMPONENTE Diferencia de glucosa entre la sangre y el liquido sinovial Recuento celular diferencial Cogulo de fibrina Cogulo de mucina Recuento de clulas nucleadas Viscosidad Volumen

10" 0,001

APNDICE 5

UNIDADES DEL SISTEMA INTERNACIONAL DE (SI)

1435

Tabla A5-7

Liquido seminal INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS

COMPONENTE Licuefaccin Morfologa espermlica

Unidades convencionales A los 20 minutos >70% de espermatozoides normales y maduros

Factor

Unidades del SI r e c o m e n d a d a s A los 20 minutos

0,01 0,01 1 io 0.001

3

Fraccin numrica : >70% de espermatozoides normales y maduros Fraccin numrica: >0.60 >7,0 (valor medio = 7,7)

Motilidad espermlica PH Recuento espermtico Volumen

>60%
>7.0 (valor medio = 7,7) 60-150 x 10 /ml
f c

1,5-5,0 mi

60-150 x 10 /l 0,0015-0.005 I

Tabla A5-8

Lquido gstrico INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS

COMPONENTE Volumen residual en ayunas pH Secrecin acida basal (BAO)' Secrecin acida mxima (MAO) (tras estimulacin con histamina) Relacin BAO/MAO * Varia en luncin del sexo y la edad

Unidades c o n v e n c i o n a l e s 200-100 mi <2,0 0-6 mEq/h 5-40 mEq/h <0,4

Factor 0.001 1 1 1 1

Unidades del SI recomendadas 0,02-0,101 <2,0 0-6 mmol/h 5-40 mmol/h <0,4
-

Tabla A5-9

Hematologa INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS

COMPONENTE Volumen de hemates varn mujer Volumen plasmtico varn mujer Pruebas de coagulacin y hemostasis tiempo de hemorragia

Unidades convencionales 20-36 ml/kg peso corporal 19-32 ml/kg peso corporal 25-43 ml/kg peso corporal 28-45 ml/kg peso corporal Depende de la localizacin y orientacin de la incisin y del instrumento empleado, generalmente de 2 a 8 minutos. Depende de los reactivos de activacin y (osfolipidos empleados. generalmente de 25 a 35 segundos. 20-30 mg/dl 80-120 U/dl 1"M horas a 37 C Ninguno a las 24 horas y a 37 C Completo a las 4 horas y a 37 C 0.50-1.50 u/ml Cogulo insoluole en 5 mol/litro de urea a las 24 horas 200-400 mg/dl

Factor 0,001

Unidades del SI r e c o m e n d a d a s 0,020-0.036 l/kg peso corporal 0,019-0 032 l/kg peso corporal 0,025-0,043 l/kg peso corporal 0,028-0.045 l/kg peso corporal

0,001

Tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT) Antitrombina III inmunolgica funcional Tiempo de lisis del cogulo (actor de euglobina sangre tolal Retraccin del cogulo Factores de coagulacin Factor XIII (prueba de rastreo) Fibringeno Productos de degradacin de la fibrina (fibringeno) FDP srico D-dmeros plasmticos Plasmingeno inmunolgica funcional Proteina C Proteina S (total) Tiempo de protrombina

id 1 0

200-300 mg/l 800-1.200 U/l

1.000 0,01

500-1.500 U/l 2,0-4,0 g/l

<10 ug/ml <200 ng/ml 10-20 mg/dl 80-120 U/dl 0.7-1,4 u/ml 0.7-1,4 u/ml Depende del reactivo de tromboplastina empleado generalmente de 10 a 13 segundos Depende de la concentracin del reactivo de trombina empleado, generalmente de 17 a 25 segundos

I I I!)

<10 mg/l <200 ug/i 100-200 mg/l 800-1.200 U/l 700-1 400 U/l 700-1 400 U/l

I0 1 0 1 0

Tiempo de trombina

La tabla contina en la pgina siguiente

1436

APNDICES

Tabla A5-9

Hematologa (continuacin) INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS

COMPONENTE
Faclor de von Willebrand mmunolgica actividad del cofactor ristocelina Recuento sanguneo completo (CBC) hematocrito varn mujer hemoglobina varn mu|er recuento de eritrocitos varn mujer recuento leucocitario ndices de eritrocitos volumen corpuscular medio (MCV) Hemoglobina corpuscular media (MCH) Concentracin media de hemoglobina corpuscular (MCHC) Recuento diferencial de leucocitos (adulto) neutrfilos segmentados bandas eosinlilos basfilos linfocitos monocitos Hemoglobina A., Hemoglobina F Fragilidad osmtica

Unidades convencionales

Factor
10 10

Unidades del SI recomendadas

500-1 500 U/l 500-1.500 U/i

50-150 U/dl 50-150 U/dl

41.5-50.4% 35.9-44.6% 14.0-17.5 g/dl 12.3-15.3 g/dl 4.5-5.9 x 10"7pl 4.5-5.1 x 10"/|il 4.4-11,0 x 107pl 80-96 |_m
:

0.01

Fraccin de volumen: 0.415-0.504 0.359-0.446 140-175 g/l 123-153 g/l 4.5-5,9 x 10'TI 4,1-5,1 x 10'7I 4.4-11.3 x 1071 80-96 fL 27.5-33,2 pg Fraccin de concentracin: 0.334-0,355

10

10* 10' 1 1 0.01

27.5-33.2 pg 33.4-35.5%

Porcentaje medio 56% 3% 2,7% 0.3% 34% 4%

Rango de recuentos absolutos 1800-700/! 0-700/pl 0-450/1 0-200/1 1000-4800/pl 0-800/pl 1.5-3,5% de hemoglobina total

1010 10" 10r> 10' 0.01 0,01 % NaCI-171 % de Lsis-0,01

<2% & ci LISIS % (p/v) NaCI Fresco 0,2 0.3 97-100 0.35 90-99 0.4 50-95 0.4b 5-45 0,5 0.6 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 150 000-450 000/pl 0.5-1.5% 25.000-75.000 clulas/|il 24 loras a 37 95-100 85-100 75-100 65-tOO 55-95 40-85 15-70 0-40 0-10 0-5 0

Fraccin de Rango de media numrica recuento absoluto t,8-7.8 x 1071 0.56 0-0,70 x 1071 0,03 0-0.45 x 1 0 7 1 0.027 0-0,20 x 1071 0,003 1.0-4.8 x 1071 0.34 0-0.80 x 1071 004 Fraccin de masa: 0,015-0.035 de hemoglobina total Fraccin de masa: <0.02 Fraccin lisada NaCI 24 horas mmol/l Fresco a 37" 342 0,95-1,00 51.3 0.97-1,00 0,85-1.00 59 8 0.90-0,99 0,75-1.00 68 4 0,50-0,95 0,65-1.00 770 0.05-0,45 0,55-0,95 85.5 0-0,06 0,40-0,85 94 1 0 0,15-0,70 1026 0-0.04 111.2 0,010 1197 0-0,05 128 3 0 150-450 x 1 traccin numrica: 0.005-0.015 25-75 x 1071

Recuento plaquetario Recuento de reticulocitos Velocidad de sedimentacin (ESR) (Westergren) varones menores de 50 aos varones de 50 a 85 aos varones mayores de 85 a o s mujeres menores de 50 anos mujeres de 50 a 85 aos mujeres mayores de 85 a o s Viscosidad ndice de sedimentacin Zeta

106 0,01 10
6

< 15 mm/h <20 mm/h <30 mm/h <20 mm/h <30 mm/h <42 mm/h 1 4-1,8 veces la del agua 41-54% 1 0.01 14-1.8 veces la fraccin del agua: 0.41-0.54

Todos los porcenlaies se multiplican por 0.01 para obtener la traccin

APNDICE 5

UNIDADES DEL SISTEMA INTERNACIONAL DE ( S I )

1437

Tabla A5-10

Lquido amnitico INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS

COMPONENTE Aspecto periodo temprano de gestacin a trmino Albmina periodo temprano de gestacin a trmino Bilirrubina periodo temprano de gestacin a trmino Cloruro periodo temprano de gestacin a trmino Creatinma periodo temprano de gestacin a trmino Estriol periodo temprano de gestacin a trmino Lecitina / estingomielina temprano (inmaduro) a trmino (maduro) Osmolalidad periodo temprano de gestacin a trmino Pco periodo temprano de gestacin a trmino
2

Unidades convencionales

Factor

U n i d a d e s del SI r e c o m e n d a d a s Claro Claro o ligeramente opalescente 3,9 g/l 1,9 g/l

Claro Claro o ligeramente opalescente 0.39 g/dl 0.19 g/dl <0,075 mg/dl <0,025 mg/dl Aproximadamente equivalente al cloruro srico Generalmente 1-3 mEq/litro inferior al cloruro srico 0.8-1,1 mg/dl 1.8-4,0 mg/dl (generalmente >2 mg/dl) <10ug/dl <60 ug/dl <1:l >2:1 Aproximadamente equivalente a la osmolalidad srica 230-270 mOsm/kg 33-55 mm Hg 42-55 mm Hg (aumenta al llegar a trmino) 7,12-7.38 6,91-7,43 (disminuye al llegar a trmino) 0.60 0,24 g/dl 0.26 0,19 g/dl Aproximadamente equivalente al sodio srico 7-10 mEq/litro inferior al sodio srico (aumenta al llegar a trmino)

17.10 1

<1.3 umol/l <0.41 iimol/l

Generalemente 1-3 mEq/litro inferior al cloruro srico 71-97 umol/l 159-354 umol/l (generalmente >177 umol/l) <347 nmol/l >2 081 nmol/l <1:1 >2:1 Aproximadamente equivalente a la osmolalidad srica 230-270 mmol/kg 4,4-7,3 kPa 5.6-7,3 kPa (aumenta al llegar a trmino) 7.12-7,38 6,91-7,43

88,40

3,468
I 1 1

1 0.1333

riUI

PH periodo lemprano de gestacin a trmino Proleina total periodo temprano de gestacin a trmino Sodio periodo lemprano de gestacin a trmino

60 2.4 g/l 2.6 1.9 g/l

7-10 mmol/l inferior al sodio srico

Tincin, citolgica Rojo aceite 0 periodo temprano de gestacin a trmino Sulfato azul Nilo periodo temprano de gestacin a trmino Urea periodo lemprano de gestacin a trmino cido rico periodo temprano de gestacin a trmino Volumen periodo temprano de gestacin a trmino
s .

<10% >50% 0 >20% 18,0 5.9 mg/dl 30.3 11,4 mg/dl 3.72 0,96 mg/dl 9.90 2,23 mg/dl 450-1 200 mi 500-1.400 mi (aumenta al llegar a trmino)

0,01

Fraccin teida: <0,1 >0.5 Fraccin teida: <0,0 >0,2 3,00 0,98 mmol/l 5,04 1.90 mmol/l 221 57 nmol/l 589 133 umol/l 0,45-1,2 I 0.5-1.4 I (aumenta al llegar a trmino)

0,01

0,1665

59,48

0.001

1438

APNDICES

Tabla A5-11 Liquido cefalorraqudeo INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS COMPONENTE Albmina Recuento celular Glucosa Lactato deshidrogenasa (LDH) Protenas Electrotoresis de protenas prealbmina albmina alfa-1-globulina alfa-2-globulina beta glubulina gamma globulina Xantocroma Unidades convencionales < 10-30 mg/dl <5 clulas/uI 40-80 mg/dl Aproximadamente el 10% del nivel en suero 12-60 mg/dl 2-7% 56-76% 2-7% 4-12% 8-18% 3-12% Negativo Factor 10 10 005551
6

Unidades del SI recomendadas 100-300 mg/l <50 x 10-71 2.8-4,4 mmol/l Fraccin de la actividad: aproximadamente 0 1 del nivel en suero 120-600 mg/l

10 0,01 Fraccin: 0,2-0.07 056-0,76 0,02-0,07 0.04-0,12 0 08-0.18 0,03-0,12 Negativo

Tabla A5-12 Miscelnea INTERVALOS DE REFERENCIA TPICOS COMPONENTE Bilis, cualitativa Cloruro Aclaramientos creatinina, endgena Diodrast inulina PAH Azul de Diagnex (anlisis gstrico sin sonda) Grasa grasa total grasa neutra cidos grasos libres cidos grasos combinados/ conjugados Nitrgeno, total Sodio Tripsina, actividad Captacin de I " en el tiroides Urobilingeno cualitativo cuantitativo
V
|:

SISTEMA Heces al azar Sudor Suero y orina (pautados)

Unidades convencionales Negativo en adultos Positivo en nios 4-60 mEq/l 115 20 ml/mn 600-720 ml/min 100-150 ml/min 600-750 ml/min cido libre presente <5 g/24 h 10-25% de materia seca 1-5% de materia seca 5-13% de materia seca 5-15% de materia seca

Factor

Unidades del SI recomendadas Negalivo en adultos Positivo en nios 4-60 mmol/l 1,92 0.33 ml/s 10.00-12.00 ml/s 1.67-2.50 ml/s 10.00-12.50 ml/s cido libre presente <5 g/d Fraccin de la masa: 0,1-0,25% de materia seca 0.01-0,05% de materia seca 0.05-0,13%de materia seca 0,05-0,15% de materia seca Fraccin de masa: 0,1 de la ingesta 71-143 mmol/d 10-80 mmol/l Positivo (2+ a 4+) Fraccin de la ingesta: 0,075-0,25 en 6 horas Positivo 68-339 umol/d

1 0.01667

Orina Heces. 72 h

1 0,01 0.01 0.01 0.01 0.01 71,39 1 0.01

Heces. 24 h Sudor Hocos frescas, al azar

10% de la ingesta 1-2 g/24 h 10-80 mEq/l Positivo (2+ a 4+) 7,5-25% en 6 horas

Heces al azar Heces. 24 h

Positivo 40-200 mg/24 h 80-280 unidades Ehrlich/24 h

1 693

Tabla A5-13 Seleccin de valores de referencia peditricos S'-Fosfatasa cida neonato 2-13 aos S-Aldolasa neonato nio S-Foslatasa alcalina neonato nio S-a-fetoprotena neonato 2 semanas S-Amilasa neonato 1 ao S-Aspartato aminolransterasa neonato 1-3 aos S-Bilirrubina neonato
24 h 48 h 7,4-19,4 U/l 6,4-15,2 U/l

4 veces el valor del adulto 2 veces el valor del adulto

40-300 U/l 60-270 U/l

hasta 100 mg/l ndetectable actividad amilasa escasa o nula valores del adulto
16-74 U/l 6,30 U/l

PRETRMINO

A TRMINO 34-103 nmol/l (20-60 mg/l) 103-120 nmol/l (60-70 mg/l) 68-205 nmol/l (40-120 mg/l)

17-30 nmol/l (10-60 mg/l)

103-137 umol/l (60-80 mg/l) 171-257 umol/l (100-150 mg/l) 1,50-2,50 mmol/l 1.75-3,00 mmol/l 2.50-3,00 mmol/l 2,25-2,87 mmol/l (60-100 mg/l) (70-120 mg/l) (100-120 mg/l) (90-115 mg/l)

3-5 dias S-Calcio pretrmino. primera semana a trmino, ltima semana 1-2 aos 2-16 aos U -catecolaminas
:

NOREPINEFRINA 1 ao

EPINEFRINA

1-5 aos 6-15 aos > 1 5 aos U-Cloruro (varia con la ingesta de cloruro) beb nio S-Coleslerol sangre umbilical 1-2 aos 2-16 aos U-Cortisol (libre) 4 meses-10 aos 11-20 aos S-Creatina quinasa neonato 3 semanas-3 meses >1 ao

30-90 nmol/d (5,4-15.9 ng/d) 50-180 nmol/d (8,1-30,8 ug/d) 110-420 nmol/d (19 ,0-71.1 ug/d) 200-510 nmol/d (34,4-87.0 ug/d)

1-23 nmol/d (0.1-4,3 ng/d) 4-50 nmol/d (0,8-9 ,1 ng/d)

7-339 nmol/d (1.3-10.5 ng/d)

19-72 nmol/d (3,5-13,2 ng/d)

1,7-8.5 mmol/d

17-34 mmol/d
1,2-2,5 mmol/l (460-980 mg/l) 1.8-4.9 mmol/l (700-1900 mg/l) 3.5-6.5 mmol/l (1.350-2 500 mg/l)

6-74 nmol (2-27 ug/d)

2-152 nmol/d (0,7-55 ug/d)

3 veces el valor del adulto 1,5 veces el valor del adulto valores del adulto

S-Creatinina Valor de referencia superior hasta los 5 aos hasta los 6 aos hasta los 7 aos hasta los 8 aos hasta los 9 aos hasta los 10 aos > 10 aos S-Estradiol 0-2 aos 2-4 aos 4-6 aos 6-8 aos 8-10 aos 10-12 aos 12-14 aos 14-16 aos 16-26 aos Grasa fecal neonato pretrmino neonato a trmino 3 meses-1 ao 1 ao P-cios grasos no esterificados neonato 4 meses-10 aos S-Glucosa neonato pretrmino neonato a trmino beb S-Y-glutamicotransferasa neonato prematuro neonato-3 semanas 3 semanas-3 meses 1-5 aos 6-15 aos 16 aos-adulto S-Haptoglobina neonato 1 ao y mayores de 1 ao S-Inmunoglobulina IgG 0-5 semanas 6 meses 1 ao 5 aos 10 aos

44 nmol/l (5.0 mg/l) 53 nmol/l (6.0 mg/l) 62 nmol/l (7,0 mg/l) 71 nmol/l (8,0 mg/l) 80 nmol/l (9,0 mg/l) 88 nmol/l (10.0 mg/l) 106 nmol/l (12,0 mg/l) 0-26 pmol/l (0.7-pg/ml) 0-26 pmol/l (0-7 pg/ml) 0-51 pmol/l (0-14 pg/ml) 0-37 pmol/l (0-10 pg/ml)
0-367 pmol/l (0-100 pg/ml) 0-367 pmol/l (0-100 pg/ml) 0-367 pmol/l (0-100 pg/ml) 26-385 pmol/l (7-105 pg/ml) 26-1.175 pmol/l (7-320 pg/ml)

z o
o
m

cz

z
O >

hasta 0,40 excretado hasta 0,20 excretado hasta 0,15 excretado hasta 0,085 excretado
0-1,845 mmol/l 300-1.100 mmol/l
1,1-3.6 mmol/l (200-656 mg/l) 1,1-6,1 mmol/l (200-1.100 mg/l) 3.3-5.8 mmol/l (600-1.050 mg/l) 56-233 U/l 10-103 U/l 4-111 U/l 2-23 U/l 2-23 U/l 2-35 U/l

5 >
z o

>
o z >

haptoglobina detectable slo en 0,1-0,2 de valores del adulto

7.500-15.000 mg/l 1.500-7000 mg/l 1.400-10.300 mg/l 3.700-15.000 mg/l 4.400-15.500 mg/l

.a rab/a contina en la pgina siguiente

fe es -o

Tabla A5-13

Seleccin de valores de referencia peditricos* (continuacin) IgA ninguno 200-1.300 mg/l 200-1.300 mg/l 300-2.000 mg/l 500-2.300 mg/l IgM <200 mg/l 300-600 mg/l 300-1.600 mg/l 200-2.200 mg/l 300-1.700 mg/l Inulina 29-88 ml/minutos por 1,73 m de superficie corporal 40-112 ml/minutos por 1,73 nV de superficie corporal 62-121 ml/minutos por 1,73 m' de superficie corporal 78-164 ml/minutos por 1,73 m de superficie corporal
J ?

S-Inmunoglobuima 0-5 semanas 6 meses 1 ao 5 aos 10 aos S-Inmunoglobulina 0-5 semanas 6 meses 1 ao 5 aos 10 aos Aclaramiento de <1 mes 1-6 meses 6-12 meses >1 ao U-17-Cetosteroides 0-3 dias 1-3 aos 3-6 aos 6-9 aos 10-12 aos Adolescente

4 meses 1 ao 2-16 aos S-Potasio neonato pretrmino neonato a trmino 2 dias-2 semanas 2 semanas-3 meses 3 meses-1 ao 1-16 aos S-Testosterona
EDAD

1,55-2,62 mmol/l (48-51 mg/l) 1.26-1.94 mmol/l (39-60 mg/l) 0.84-1.61 mmo/l (26-50 mg/l) 4,5-7,2 mmol/l 5,0-7.7 mmol/l 4,0-6.4 mmol/l 4,0-6.2 mmol/l 3,7-5.6 mmol/l 3.6-5,2 mmol/l
VARN MUJER

0-0.2 u.mol/d (0-0.5 mg/d) <7,0 pmol/d (<2.0 mg/d) 2-10 pmol/d (0,5-3.0 mg/d) 3-14 prnol/d (0.8-4.0 mg/d) varn: 2-21 pmol/d (0,7-6,0 mg/d) mujer 2-17 pmol/d (0,7-5,0 mg/d) varn 10-52 nmol/d (3-15 mg/d) mujer: 10-42 pmol/d (3-12 mg/d) hasta 2 veces los valores del adulto
PRETRMINO A TRMINO

S-Lactato deshidrogenasa 1-3 dias S-Fsforo (inorgnico) neonato 6-10 das

0-2 aos 2-4 aos 4-6 anos 6-8 aos 8-10 aos 10-12 aos 12-14 aos 14-16 aos 16-18 aos 18-20 aos 20-25 aos S- Tiroxina 1-3 dias 1 semana-1 mes 1 4 meses 4-12 meses 1 -6 aos 6-10 aos

0,14-1.28 mmol/l (0-0.4 ng/ml) 0,17-5.55 nmol/l (0-1.6 ng/ml) 0,28-1,39 nmol/l (0,1-0,4 ng/ml) 0.21-9.72 nmol/l (0.1-2,8 ng/ml) 0,31-1,74 nmol/l (0,1-0,5 ng/ml) 0.29-10,06 nmol/l (0.1-2.9 ng/ml) 0.17-26.37 nmol/l (0-7.6 ng/ml) 3.12-19.43 nmol/l (0.9-5.6 ng/ml) 9.02-25.33 nmol/l (2,6-7,3 ng/ml) 13.88-24,98 mol/I (4,0-7,2 ng/ml) 11.80-38,86 nmol/l (3.4-11,2 ng/ml) 142-296 nmol/l (11,0-23,0 pg/dl) 116-232 nmol/l (9.0-18.0 pg/dl) 97-212 nmol/l (7,5-16.5 pg/dl) 71-187 nmol/l (5,5-14.5 pg/dl) 71-174 nmol/l (5,5-13,5 pg/dl) 64-161 nmol/l (5,0-12,5 pg/dl)

0.24-0,62 nmol/l (0,1-0.2 ng/ml) 0.24-0,69 nmol/l (0,1-0 2 ng/ml) 0.35-0,69 nmol/l (0,1-0.2 ng/ml) 0.52-1.04 nmol/l (0.1-0.3 ng/ml) 0,69-1.39 nmol/l (0.2-0.4 ng/ml) 0.69-1.74 nmol/l (0.2-0,5 ng/ml) 1,04-2.43 nmol/l (0.3-0,7 ng/ml) 1.21-3.30 nmol/l (0,3-1,0 ng/ml) 1.39-3.30 nmol/l (0,4-1,0 ng/ml) 1 39-3.30 nmol/l (0,4-1,0 ng/ml) 1.39-3,30 nmol/l (0,4-1.0 ng/ml)

1.81-2.58 mmol/l (56.0-80.0 mg/l) 1,97-3,78 mmol/l (61-117 mg/l)

1.61-2,52 mmol/l (50.0-78,0 mg/l) 1.58-2,87 mmol/l (49-89 mg/l)

* Inlormacin basada en Melles S (ed): Pediatric Clinical Chemistry. Washington, DC. American Association lor Clinical Chemistry. 1977. ' S = suero; U = orina; P = plasma ' Como DHEA. v __