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ACTIVIDAD PEROXIDASA Y PSEUDOPEROXIDASA EN EXTRACTO DEL FRUTO DE Daucus carota Y SANGRE HUMANA Angulo, Diana; Estrada, Luis F.

y Gutirrez, Gustavo.
Espacio de Laboratorio de Bioqumica Facultad de Ciencias Naturales Universidad Icesi 1. RESULTADOS Se llevaron a cabo, en trminos generales, dos grupos de ensayos: con muestras nativas y con muestras desnaturalizadas a fin de determinar si la actividad peroxidasa; descomposicin del perxido de hidrogeno H2O2 en oxgeno molecular O2 y agua H2O, se debe a la actividad de una enzima (Peroxidasa) u otro tipo de agente qumico (Pseudoperoxidasa). Los resultados obtenidos en los ensayos con muestras nativas se encuentran en la tabla 1, en contraste, los resultados obtenidos con las muestras de extracto de fruto de Daucus carota y sangre humana desnaturalizadas se encuentran en la tabla 2. Cabe anotar la funcin de la bencidina, un reactivo incoloro que al oxidarse en presencia de oxgeno (Generado por la descomposicin del H2O2) genera un viraje de color caracterstico. Tabla 1. Resultados de ensayos con muestras nativas
Muestra (mL) Zanahoria Sangre diluida Bencidina (gotas) H2O2 (Gotas)

Tabla 2. Resultados de ensayos con muestras desnaturalizadas


Muestra (mL) Zanahoria Sangre diluida Bencidina (gotas) H2O2 (Gotas)

Resultado

Positivo

Negativo

Adicionalmente, se puso a prueba la persistencia de la enzima en un tejido de algodn, manchndola con una muestra nativa de sangre, enjuagndola con agua y posteriormente realizando sobre sta la prueba con perxido de hidrgeno y bencidina generando un positivo como resultado. Tabla 3. Ensayo: presencia de actividad peroxidasa sobre una tela con residuos de sangre Material
Tela con residuos de sangre

Resultado Positivo

Resultado

Positivo

Positivo

Nota: Al agregar perxido de hidrgeno sobre la tela no se observ la formacin de burbujas, sin embargo si se gener el cambio de color al agregar la bencidina.

2. ANLISIS DE RESULTADOS

Es pertinente, en primera instancia, comentar un poco acerca del reactivo que hizo posible: La bencidina. Comenzando por el rearreglo que hace posible su sntesis con relativa facilidad (Figura 1)[1,2], ste compuesto de relativa sencillez estructural ofrece una alternativa sencilla para la determinacin de la presencia de sangre sobre superficies como las telas, lo que resulta en una aplicacin sin precedentes en criminalstica, dado que como puede observarse en la tabla 3, aun enjuagando con abundante agua la superficie; es posible detectar la presencia de actividad peroxidasa; intuyendo as la presencia de sangre.

Figura 2. Esquema de reaccin, oxidacin de Bencidina Continuando, es conveniente definir los trminos peroxidasa y Pseudoperoxidasa, dnde el ltimo hace referencia a un compuesto no enzimtico capaz de catalizar la descomposicin del perxido de hidrgeno (Permanganato de sodio, por ejemplo), mientras el primero hace referencia a una enzima con actividad peroxidasa. El mtodo planteado permite diferenciar la presencia entre una y otra sustancia ya que si existe actividad peroxidasa antes de someter la muestra a altas temperaturas pero dicha actividad desaparece luego del calentamiento es posible intuir que el catalizador es termolbil, tal como las enzimas, pero si dicha actividad no desaparece despus del calentamiento es posible afirmar que se trata de un catalizador no termolbil como los permanganatos y se estara hablando de actividad pseudoperoxidasa. Al contrastar a tabla nmero 1 con la nmero 2 es fcil notar quin es quin, como puede observarse la actividad peroxidasa en la muestra de sangre desapareci despus del calentamiento, mientras que la del extracto de zanahoria no, por tanto se puede afirmar que se trata de un compuesto pseudoperoxidasa mientras que la reaccin es de tipo enzimtico en el caso de sangre.

Figura 1. Rearreglo en sntesis de bencidina La formacin del compuesto coloreado que genera la oxidacin de la bencidina (Figura 2) [3] es rpida y adems es favorecida por el hecho de que la descomposicin del perxido de hidrogeno (de la cual se obtiene el oxgeno necesario para llevar a cabo la oxidacin) es, termodinmicamente hablando, muy [4] favorable lo cual hace que el resultado sea de inmediato observable.

3. CONCLUSIONES Es posible afirmar que la descomposicin del perxido de hidrogeno en la sangre es de tipo enzimtico. Por las pruebas realizadas despus del proceso de calentamiento se concluye que la zanahoria cuenta con compuestos tipo pseudoperoxidasa. Con el ensayo de la tela manchada de sangre y posteriormente enjuagada se demostr que la presencia de las peroxidasas persiste despus del lavado, por tanto sugiriendo que es posible determinar facilmente la presencia de sangre residual en una prenda.

4. BIBLIOGRAFA
1. H. J. Shine, H. Zmuda, K. H. Kwart, A. G. Horgan, C. Collins, B. E. Maxwell: Mechanism of the benzidine rearrangement. Kinetic isotope effects and transition states. Evidence for concerted rearrangement, in: J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 955956 2. H. J. Shine, H. Zmuda, K. H. Kwart, A. G. Horgan, M. Brechbiel: Benzidine rearrangements. 16. The use of heavy-atom kinetic isotope effects in solving the mechanism of the acid-catalyzed rearrangement of hydrazobenzene. The concerted pathway to benzidine and the nonconcerted pathway to diphenyline, in: J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 25012509 3. Philip David Josephy, Michael Novak (2013) Reactive electrophilic metabolites of aromatic amine and amide carcinogens Frontiers in Bioscience S5, 341-359. 4. Polmar, Norman; Kenneth J. Moore (2004). Brassey's. ed. Cold War Submarines: The Design and Construction of U.S. and Soviet Submarines. pp. 35 36