Manual de Prcticas

Laboratorio de: Biotecnologa de Cultivos Celulares

PRCTICA 3. ESTIMACIN DE CLULAS INDIFERENCIADAS DE PERITONEO DE RATN CON CMARA DE NEUBAUER

OBJETIVO GENERAL El alumno determinara estimar las concentraciones de clulas indiferenciadas de peritoneo de ratn.

OBJETIVOS ESPECFICOS Reafirmar su destreza en el manejo de animales de laboratorio. Reafirmar sus conocimientos en la obtencin de clulas indiferenciadas de peritoneo de ratn. Aprender a utilizar y hacer estimaciones en cmara de Neubauer

INTRODUCCIN La Cmara de Neubauer es un instrumento utilizado en medicina y biologa para realizar el recuento de clulas en un medio lquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, lquido cefalorraqudeo, lquido sinovial, etc. Esta cmara de contaje est adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las cuales se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula de dimensiones conocidas. Se cubre la cmara con un cubrecmaras que se adhiere por simple tensin superficial. Luego se introduce el lquido a contar, al que generalmente se ha sometido a una dilucin previa con un diluyente, por capilaridad entre la cmara y el cubrecmara; puesto que tiene dos zonas esto permite hacer dos recuentos simultneamente. Para contar las clulas se observa el retculo al microscopio con el aumento adecuado y se cuentan las clulas. Con base en la cantidad de clulas contadas, conociendo el volumen de lquido que admite el campo del retculo, se calcula la concentracin de clulas por unidad de volumen de la muestra lquida inicial.

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MATERIALES Y REACTIVOS

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litro de solucin externa para mastocitos con pH final 7.2 fresca (ver anexo) Hielo Un ratn adulto

1 jeringa de insulina 1 jeringa de 5 mL 1 plancha de 20x20 cm de unicel 4 alfileres con cabeza de plstico. 1 pipeta desechable de 3 mL 1 tubo Falcon de 15 mL 1 caja de unicel chica (para tortillas) 2 tubos Eppendorf 1 microscopio ptico 1 centrfuga para tubos de 15 mL 1 centrfuga para tubos tipo Eppendorf Portaobjetos Cubreobjetos Estuche de diseccin quirrgica Guantes ltex Cubrebocas Micropipeta de 1 a 20 L Puntas para micropipeta

Ejemplo: Se cuenta con 2 mL de una suspensin celular de la cual se transfieren 50 L a un tubo o a un parafilm. Se diluyen con 50 L del colorante azul de tripano. Se coloca un volumen adecuado en la cmara de Neubauer y se cuenta los cuatro campos de 16 cuadrados cada uno (figura 1).

Figura 1. Cmara de Neubauer.

Volumen de 1 recuadro de 16 cuadrados (lado x lado x altura =1 mm x 1 mm x 0.1 mm = 0.1 mm3). Si los cuatro campos presentan los siguientes resultados:

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32 28 30 26

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32 + 30 + 28 + 26 = 116/4= 29

Se obtiene el promedio de clulas por recuadro de 16 cuadrados (0.1mm3), en este ejemplo es de 29 clulas, quedando 29 cel/0.1 mm3. Se toma en cuenta la dilucin al medio realizada con el colorante azul de tripano (factor de dilucin de 2). Por lo que se multiplica 29 x 2 = 58 cel/0.1 mm3. Despus se calcula la cantidad de clulas por mL (cm3) multiplicando por 104, es decir 58 x 104 = 580,000 cel/ml. Finalmente se calcula el nmero total de clulas viables de la suspensin. En este ejemplo como partimos de 2 mL de la suspensin celular, tendremos: 580,000 x 2 mL = 1.16 x 106 clulas totales.

MTODOS 1.- Se preparar una solucin externa para mastocitos (por el tcnico del laboratorio) 2.- Se dormir el ratn, en una cmara de disecacin saturada con halotano. 3.- Una vez que est dormido el ratn se fijar en la placa de unicel con los alfileres. 4.- Se toman 5 mL de solucin externa para mastocitos y se infiltra en forma perpendicular intraperitoneal. 5.- Se procede a dar un masaje suave y ligero en el peritoneo para que se suelten la mayor cantidad de clulas. 6.- Se diseca la piel del abdomen del ratn con tcnica asptica y por capas hasta llegar al peritoneo. 7.- Se incide el peritoneo con mucho cuidado, con una incisin de 3 a 4 mm. 8.- Con la pipeta desechable de 3 mL, se empieza a aspirar la solucin infiltrada con las clulas. 9.- Se colocan en los tubos Falcon de 15 mL, que deben estar sumergidos en hielo. 10.- Cuando aspiren toda la solucin, se abre completamente la cavidad abdominal y se verifica que no se produjo peritonitis y se aspira los restos de la solucin. 11.- Se centrifuga a 3000 rpm por 3 min. 12.- Se decanta el sobrenadante y se resuspende las clulas con 2 mL de solucin externa para mastocitos. 13.- Se toman 50 L y se coloca sobre el portaobjetos, posteriormente se coloca el cubreobjetos. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Guanajuato Pgina 3

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14.- Se coloca en la platina bajo el microscopio ptico y se enfoca. 15.- Se analiza la morfologa de las clulas indiferenciadas del peritoneo as como los mastocitos del peritoneo. 16.- Se toman dos alcuotas de 100 L cada una y se coloca en los tubos Eppendorf independientemente, a la alcuota 1 se le agrega 5 L de azul de tripano y 1000 L de solucin hipotnica se suspende en vortex y se deja en hielo por 5 min a la alcuota 2 se le agrega igualmente 5 L de azul de tripano y 1000 l de solucin externa de mastocitos se deja 5 min en hielo. 17.- Se toman 50 L de cada una de las alcuotas se coloca sobre la cmara de Neubauer y se realiza una estimacin de vivas y muertas. 18.- Se toman notas de los pasos y se registran sus observaciones.

OBSERVACIONES, DISCUSIONES Y CONCLUSIN

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