Microscopia Eletrnica em Biologia

Mrcia Attias Instituto de Biofsica UFRJ mattias@biof.ufrj.br

1

Um pouco de histria

Amostras biolgicas e o ME

Clulas:
Frgeis Hidratadas Muito espessas para o feixe de eltrons Ambiente no interior do ME: vcuo e calor

Porque as clulas no podem ser observadas vivas no Microscpio Eletrnico ?

No pode haver gua na coluna do microscpio As clulas tm de ser resistentes ao feixe As clulas precisam apresentar contraste As clulas tm de ser cortadas em fatias finas
5

FIXAO
Preservao da integridade morfolgica x molecular

Fixao de amostras

Fixar matar a clula preservando sua estrutura

Pode ser Qumica ou Fsica: congelamento

Fixadores qumicos

Permanganato de Potssio (KMnO4)

Contrastao negativa

Estruturas macromoleculares Clulas vrus

9

Fixadores qumicos

Formaldedo
Instvel, preparado a partir de paraformaldedo. No forma ligaes cruzadas. Degrada rapidamente em metanol Preserva antigenicidade da amostra Penetrao rpida

10

Fixadores qumicos

OsO4 tetrxido de smio

Liga-se aos cidos graxos insaturados Age como contrastante Age como mordente

Famous first electron micrograph of an intact cell was published in The Journal of Experimental Medicine in March 1945, in "A Study of Tissue Culture Cells by Electron Microscopy," by Keith R. Porter, Albert Claude, and Ernest F. Fullam. The cell is a cultured fibroblast originating from a chick embryo, which was grown by Porter on polyvinyl film, then peeled off and transferred to a wire specimen grid. The cell was fixed with osmium tetroxide, washed and then dried in order to prevent evaporation in the electron microscopeUs vacuum chamber. Magnified 1600 times

11

Fixadores qumicos

Glutaraldedo (Sabatini, 1963)

Forma ligaes cruzadas com protenas Melhor preservao estrutural Penetrao mais lenta que o formaldedo

12

13

14

Solues tampo

Os fixadores so sempre diludos em solues tampo para

Manter o equilbrio osmtico do material Manter o pH prximo ao fisiolgico

Tampes mais comuns

Fosfato de Sdio Cacodilato de Sdio

15

Perguntas mais frequentes

Que fixador usar? Fixar por imerso ou por perfuso? Qual a concentrao de Glutaraldedo, formaldedo, tetrxido de smio? Recomenda-se adicionar o ferrocianeto de potssio na psfixao? Sacarose, NaCl, cido tnico. Qual seu papel na fixao? Quanto tempo se deve deixar a amostra no fixador? Quanto tempo se deve lavar para retirar o fixador? A que temperatura deve ser a fixao? Que tamanho deve ter a amostra? Como selecionar o tampo?

16

a mais utilizada. O protocolo padro compreende as seguintes etapas:

Fixao Qumica por imerso

fixao primria lavagem ps-fixao (ou fixao secundria) lavagem desidratao infiltrao em resina polimerizao da resina

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

17

Passo a passo da fixao

18

Amostras precisam ser bem pequenas

19

Palavra chave:

DIFUSO

20

Proteo contra vapores e solues

21

Ps-Fixao

22

DESIDRATAO

23

Desidratao

A amostra passada por concentraes crescentes de etanol ou acetona

24

Infiltrao em resina
Em seguida, o fluido de transio ser substitudo por uma resina lquida. Resina no estado lquido Este processo feito gradualmente ao longo de 24 horas.

25

Tipos de resina

EPOXI

METACRILATOS

Hidrofbicas Polmeros de trama mais fechada Polimerizao a 60oC

Hidroflicas Polmeros de trama mais aberta Polimerizao a baixa temperatura sob U.V.

26

 Quando as amostras estiverem completamente infiltradas na resina elas sero distribudas em moldes e levadas estufa...

27



Na estufa a resina se solidificar. Os blocos contendo as amostras podem ser retirados e desenformados.

48 horas 60oC

28

Em seguida, os blocos so preparados para serem cortados em fatias ultrafinas.

Nmero de identificao

amostra
29

Ultramicrotomia

As amostras precisam ser cortadas em sees ultrafinas para que o feixe de eltrons possa atravess-las. Isto feito num ultramicrtomo 30

brao bloco

espelho dgua diamante

O bloco preso no brao do instrumento. A cada oscilao do brao, h um pequeno avano. Ao passar pelo gume de diamante da faca, uma fina fatia flutua sobre o espelho dgua
31

32

33

Os cortes flutuam sobre um espelho dgua

Cortes ultrafinos (60 a 100 nm)

34

Os cortes so recolhidos em telas de cobre

Cada tela tem 3 mm de dimetro !

35

A grade ento inserida no microscpio eletrnico de transmisso

36

37

1965
38

Consideraes sobre fixao qumica

De acordo com os fixadores e solues utilizados possvel identificar seletivamente espcies moleculares ou protenas, havendo metodologias especficas para a localizao ou realce de vrios componentes celulares.

39

Princpios da Fixao a frio

Congelamento instantneo do momento celular Evita: sofrimento, difuso de solutos, deformao osmtica, alterao bioqumica Problemas: velocidade de fixao em funo da espessura da amostra
40

Mtodos de congelamento

Criofratura

41

42

43

Mtodos de congelamento

Plunge Freezing

44

Mtodos de congelamento

Congelamento por Alta presso (High pressure freezing)

45

Crio-Substituio (freeze substitution)

46

Crio-eletronmicroscopia

47

48

49