Universitatea de tiine Agronomice i Medicin Veterinar Bucureti Facultatea de Medicin Veterinar Master: Igiena alimentelor de origine animal i sntate

public

LUCRARE DE DIZERTAIE
METODE MODERNE DE MONITORIZARE A IGIENEI IN INDUSTRIA LAPTELUI DETECTIA ATP PRIN BIOLUMINISCENTA

Coordonatori: ef lucrri Dr. Stelian Britreanu Conf. Dr. Mihaela Popp

Masterand POPAZU (ROMANCIUC) CLAUDIA MARIA

Bucureti - 2011 1

CUPRINS Introducere 1. 1.1. 1.2. Partea I-a STUDIU BIBLIOGRAFIC Detectia ATP prin bioluminiscenta Utilizarea metodei ATP/bioluminscenta la monitorizarea igienei suprafetelor 1.2.1. 1.2.2. 1.3. Istoric Principiul metodei Utilizarea metodei ATP/bioluminscenta la monitorizarea igienei ( calitatii microbiologice ) a apei ca materie prima 1.3.1. 1.3.2. 1.4. Istoric Principiul metodei Utilizarea metodei de detectia a ATP prin bioluminiscenta la monitorizarea igienei laptelui crud, pasteurizat, ESL 10 7 9 10 3 5 5 7

(Extending Shelf Life) si UHT 1.4.1. 1.4.2. Istoric Principiul metodei Partea a II-a CERCETRI PERSONALE: Material si metoda Studiu comparativ intre metoda microbiologica si ATP /bioluminiscenta in monitorizarea starii de igiena a unor suprafete din spatiul de productie / ambalare intr-o fabrica de lactate Rezultate si discutii CONCLUZII Bibliografie

INTRODUCERE
Industria alimentara, in general, si industria lactatelor, in special, adopta din ce in ce mai multe sisteme pentru siguranta alimentelor si managementul calitatii care sunt mai proactive si preventive decat cele folosite in trecut si care se bazau pe testarea produsului final si inspectie vizuala [Griffiths et al., 2003]. Ultimii 25 de ani au fost dedicati dezvoltarii de noi metode pentru Asigurarea Calitatii Managementul Calitatii si sistemul Analiza Riscului si Punctelor Critice de Control ( Hazard Analysis and Critical Control Point HACCP) [Dostalek etal., 2005]. In Romania a fost adoptat standadul SR EN ISO 22000/ 2005 (Sisteme de management al sigurantei alimentelor. Cerinte pentru orice organizatie din lantul alimentar), care stipuleaz c o organizatie din lantul alimentar trebuie sa demonstreze capacitatea sa de a controla pericolele pentru siguranta alimentului, pentru a se asigura ca alimental este sigur in momentul consumului uman. Acest sistem de management combina urmatoarele elmente cheie, recunoscute in general, pentru a asigura siguranta alimentelor pe tot lantul alimentar, pana la consumatorul final: - comunicare interactiva; - sistem de management; - programe preliminare; - principii HACCP. Pentru ca sistemul HACCP sa fie eficace sunt necesare metode rapide de analiza pentru monitorizare si verificare. Monitorizarea uzuala consta in supravegherea parametrilor fizici si chimici ai procesului (temperature de pasteurizare, timp, pH) in timp ce validarea performantelor HACCP necesita teste pentru detectia unor patogeni ca Salmonella, Echerichia coli O157:H7 etc. Starea de igiena a suprafetelor din zona de productie a produselor lactate este un element esential in producerea de alimente sigure, de calitate. Igienizarea unor astfel de suprafete se face fie in mod automat (sistemul Clean in place" =CIP), fie manual, n funcie de natura suprafetelor ce trebuie curatate [Pater P.,1994]. In general, igienizarea cuprinde o etapa de indepartare a reziduurilor de alimente cu ajutorul unor detergenti si o etapa de dezinfectie pentru a distruge microorganismele. Pentru a se demonstra eficienta igienizarii, trebuie implementat un sistem de verificare. O igienizare neeficace poate conduce la esecul indepartarii microorganismelor si / sau resturilor de produs de pe suprafetele de testat.

Microorganismele ramase pe suprafetele din fluxul tehnologic in urma unui ciclu de igienizare neeficace reprezinta un risc direct pentru urmatoarele loturi de produs care vor intra in contact cu aceste suprafete. Reziduurile de produse ramase pe suprafetele din fluxul tehnologic, in urma unui ciclu de igienizare neeficace, contin suficienti nutrienti pentru a transforma, printr-o crestere rapida, o contaminare initiala mica cu microorganisme, intr-o populatie mare. Acest lucru se poate intampla in perioada de dupa igienizare si pana la urmatoare utilizare [Pater P.,1994]. Suprafetele care vin in contact (direct sau indirect) cu alimentele si care sunt dificil de curatat ar trebui sa fie in centrul atentiei in procesul de monitorizare. Suprafetele de contact direct cu alimentele sunt suprafetele unde prezenta oricarui contaminant va conduce, in final, la contaminarea produsului finit. Suprafetele de contact indirect sunt cele in care exista potentialul de a fi imprastiate alimente, praf sau lichide (prin imprastiere, picurare sau cadere accidentala in produs). Suprafete dificil de curatat pot include zone care se infileteaza manual, zone cu inele, zone cu suprafete de forma neregulata, colturi, crapaturi si gauri. Pana in perioada 80, singura metoda disponibila, pentru a evalua starea de igiena a unei suprafete care vine in contact cu alimentul, era metoda conventionala, in placi, cu mediu de cultura (agar). Metodele clasice furnizeaza informatii despre numarul de microorganisme de pe o suprafata si detecteaza microorganisme specifice. In schimb, nu furnizeaza informatii despre reziduurile de alimente remanente [Martin E.,2003]. Insa, aceasta metoda este legata, in particular, de eficienta dezinfectiei i n mai mic msura de curatenie. Informatiile nu sunt obtinute intr-un timp care sa permita actiunea de recuratare in timp util, cand rezultatele sunt inacceptabile [Ramsay C., 2002]. Avantajele testelor microbiologic sunt: identific microflora prezent, metodele de lucru sunt bine documentate i nivelul de contaminare poate fi cuantificat. Dezavantajele testelor microbiologice sunt: necesita peste 24 ore pentru rezultate, rezultatele pot fi variabile, in functie de viabilitatea celulelor i nu iau in considerare si alte tipuri de reziduuri (reziduuri de produse alimentare care reprezinta nutrienti pentru bacterii). Din aceste motive, industria produselor lactate a cautat tehnici rapide si sensibile pentru a monitoriza starea de igiena a suprafetelor din fluxul tehnologic, ambalajelor, echipamentelor, apei, produsului finit. Termenul de valabilitate al produselor lactate, si in special al laptelui de consum si al altor produse lactate care nu contin culturi lactice, este afectat in principal de contaminarea bacteriana postpasteurizare Analiza de ATP cu ajutorul bioluminiscentei determina continutul de ATP atat pe o suprafata de contact cat si in probe de produse lactate. 4

Aceasta metoda, in contrast cu metoda traditionala, poate transforma monitorizarea retrospectiva intr-o evaluare practica a tuturor aspectelor legate de igienizare: curatenie si dezinfectie. ATP detectat din lapte si produse lactate cat si de pe suprafetele care vin in contact cu laptele are trei surse: ATP liber, ATP din celulele somatice si ATP microbial [Nelson W.H., 1991]. Deci, prin aceast metod este detectat att prezena reziduurilor alimentare de pe suprafete, ct i prezena microorganismelor, astfel c metoda reprezint un indicator bun pentru aprecierea strii de igien a suprafeelor testate. Deoarece reacia bioluminiscenta este foarte rapid, rezultatele testrii obinndu-se n cteva minute, fa de cteva zile necesare n metodele tradiionale de determinare a microorganismelor prin cultivare n plci, echipa nsrcinat cu efectuarea cureniei poate relua operaiunea, dac se detecteaz deficiene n activitatea ei. Cu alte cuvinte, dac pe suprafa se gsesc concentraii ridicate de ATP, suprafeele pot fi curate din nou nainte de nceperea activitii de producie. Simplitatea i rapiditatea metodei de determinare a ATP-ului prin bioluminiscen a condus la dezvoltarea mai multor sisteme pentru monitorizarea strii de igien, care n prezent sunt disponibile comercial. ns, nainte de a implementa n practic testrile pe baz de ATP, pentru evaluarea strii de igien ntr-o fabric, trebuie determinate criteriile de difereniere a suprafeelor murdare de cele curate, n uniti RLU (Relative Light Units). Acest lucru trebuie fcut n timpul procesului de producie, n momentele n care se cunoate c suprafeele sunt murdare sau curate. Lucrarea de fa abordeaz ca metod modern de monitorizare a igienei in industria laptelui, detectia ATP prin bioluminiscenta, fiind structurat n dou pri: - studiu bibliografic: in care se prezint diferite modalitati de aplicare a analizei ATP prin bioluminiscenta la determinarea gradului de igiena in industria lactatelor ; - certcetari personale: care cuprinde un studiu comparativ intre metoda microbiologica si ATP /bioluminiscenta in monitorizarea starii de igiena a unor suprafete din spatiul de productie / ambalare intr-o fabrica de lactate.

Partea I-a STUDIU BIBLIOGRAFIC

I.1. Detectia ATP-ului prin bioluminiscenta.

Prima explicaie stiinific a bioluminiscenei a fost elaborat de fizicianul Robert Boyle, in 1672 [Day , 2009]. Introducnd sub un recipient un cotlet de viel alterat care n ntuneric degaja lumina a remarcat c stralucirea scade progresiv. Cnd aerul era lsat s ptrund sub recipient, lumina si recpta intensitatea. Se demonstra astfel c bioluminiscena este n strns legatur cu reaciile chimice care nceteaz n absena oxigenului si c orice superstiie legat de acest fenomen nu si gsea justificarea. Abia n 1885 zoologul francez Raphael Dubois [Lynch T., 1999], a descoperit cele dou substane din corpul plantelor si animalelor care dau nastere la lumina printr-o reacie chimic. Aceste substane sunt luciferina si oxiluciferina. Bioluminiscena este procesul biologic de producere a luminii de ctre organismele vii. n organismele bioluminiscente se sintetizeaz o substan fotogen numit luciferina (Fig 1) care sub aciunea O2 si a enzimelor catalizatoare (luciferaze) se oxideaz. Reacia este exoterma iar modificarea energiei libere este folosit pentru a excita o molecul la o stare foarte bogat n energie. Pentru revenirea moleculei astfel excitate la starea de baz se produce o emisie de lumin.

Fig. 1 Structura luciferinei [ Ceresa L., 2006 ] ATP-ul este o molecula care actioneaza ca mediu major de stocare a energiei pentru celulele vii [Ceresa L., 2006]. Molecula de ATP are urmatoarea structura ( Fig. 2) :

Fig.2. Structura ATP

Hidroliza gruparilor fosfat elibereaza energie si conduce la o varietate de reactii biochimice in interiorul celulelor. Deci, molecula de ATP poate fi folosita ca un marker al contaminarii cu celule [Ceresa L., 200] Cea mai comuna metoda pentru detectia ATP bazata pe masurarea bioluminiscentei foloseste sistemul luciferin/luciferaza si consta in oxidarea luciferinei de catre enzima

luciferaza, in prezenta oxigenului si a sarurilor de magneziu, cu emiterea de lumina (Fig 3) [Griffiths, 2003]:

Fig. 3 Oxidarea luciferinei cu emitere de lumina

ATP reactioneaza cu complexul enzimatic luciferin-luciferaza, lumina emisa fiind masurata cu ajutorul unui luminometru si exprimata in RLU (Relative Light Units). Cantitatea de ATP este direct proportionala cu cantitatea de lumina emisa. Domeniul de aplicare a detectiei ATP prin metoda masurarii bioluminiscentei este destul de variat. Faptul ca ATP este prezent atat in microorganisme cat si in reziduurile de produs alimentar este un dezavantaj in cazul in care aceasta tehnica se vrea aplicata la determinarea incarcaturii microbiene a unor alimente, dar este un mare beneficiu atunci cand tehnica este aplicata pentru a determina gradul de igienizare al suprafetelor din zona de productie [Ramsay C., 2002]. Reziduurile de alimente contin o mare cantitate de ATP, fie in celule intacte fie sub forma libera.

I.2. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin bioluminiscenta la monitorizarea starii de igiena a suprafetelor
1.2.1. Istoric Tehnica ATPbioluminiscenta este din ce in ce mai des folosita pentru masurarea eficientei igienizarii suprafetelor si ustensilelor folosite. Daca procesul de igienizare nu a fost eficient, suprafetele vor ramane contaminate cu reziduuri de produs sau microorganisme. Prin metoda clasica (inoculare in agar) se poate detecta doar contaminarea microbiana (se poate urmari numai eficienta dezinfectarii) a suprafetei de testat, dar nu se poate obtine nici o informatie despre gradul de curatare (reziduuri de produs) . Prin metoda ATP-bioluminiscenta, pe de alta parte, se pot detecta ambele surse de ATP: microorganisme si /sau reziduuri de produs in doar cateva minute, fiind un indicator mult mai real al gradului de igienizare. Cateva studii au comparat rezultatele obtinute prin cele doua metode pentru evaluarea starii de igiena a suprafetelor. Unele dintre ele au raportat corelatii bune intre metode [Seeger si Griffiths. 1994; Kiriakides et al., 1991; Bautista et al. , 1992]. Altele au obtinut o slaba corelatie intre cele doua metode [Griffiths et al., 1997; Carrick et al., 2001]. Cateva din discrepantele gasite pot fi explicate fie prin natura diferita a suprafetelor si a contaminarii (prezenta sporilor, de exemplu), fie prin capacitatea diferita a tampoanelor folosite de a colecta microorganismele. Viabilitatea redusa a bacteriilor in timpul uscarii poate de asemenea sa aiba un impact major in ambele tehnici. Nu in ultimul rand, prezenta detergentilor , dezinfectantilor sau altor chimicale pot sa interfere cu reactia de bioluminiscenta [Velasquez, 1997] conducand la rezultate fals negative. In ciuda acestor dificultati, tehnica ATP-bioluminiscenta a fost folosita cu succces ca un pas initial in monitorizarea igienei, in special in planurile HACCP. Cu toate ca kiturile ATP existente sunt suficiente pentru 90% din nevoile industriei alimentelor (sensibilitate si acuratete satisfacatoare), in cazul unei fabrici de lactate este nevoie se se detecteze nivele mici de contaminare bacteriana care pot sa fie inca prezente. In acest caz, se foloseste un amestec de enzime pentru a amplifica nivelul redus de ATP [Hawronski et al., 1994]. Reactivul de amplificare consta intr-o mixtura de luciferaza, myokinaza si piruvat-kinaza care, impreuna cu substratele lor (luciferina, AMP si fosfoenolpiruvat), amplifica, efectiv, tot AMP in ATP (Fig. 4):

Fig 4. Schema reactiei de amplificare pentru ATP

Timpul de reactie pentru a se obtine jumatate din maximum de semnal luminos este direct proportional cu ATP si poate fi folosit ca indicator al curateniei. O alta metoda a fost propusa de Sakakibara et al. [1999] . Detectia simultana a ATP, AMP si RNA a fost realizata prin reactia de cuplare a piruvat ortofosfat dikinazei (PPDK) cu luciferaza (Fig. 5):

Fig.5 Schema reactiei de determinare a bioluminiscentei pentru ATP si AMP.

Limita de detectie a metodei a crescut de aproape o suta de ori fata de metoda uzuala care folosea ATP ca un index.

1.2.2.Principiul metodei Indiferent de numele producatorului de luminometre si kitu-uri de analiza a ATP de pe suprafete prin bioluminiscenta, principiul metodei este acelasi, fiind simplu si implicand urmatoarele etape [Pater P. ,1994]: 10

- se recolteaza tampoane de sanitatie de pe suprafata de testat si orice microorganism sau reziduu de produs care s-a recoltat este transferat intr-o eprubeta ce contine un diluant sau un extractant; - extractantul distruge peretii celulari ; - ATP continut in celulele somatice sau microbiene, impreuna cu ATP liber din reziduurile alimentare, este eliberat in solutie; - detectia de ATP este realizata prin aditia de complex enzimatic luciferin/luciferaza, care va conduce la producerea de lumina; - cantitatea de lumina (exprimata in RLU) este cuantificata cu ajutorul unui luminometru, fiind direct proportionala cu cantitatea de ATP din proba. In tabelul 1 sunt cateva kit-uri de analiza a ATP prin bioluminiscenta si cateva luminometre disponibile comercial. Tabel 1.Luminometre i kituri de detectie ATP prin bioluminescen Producator Biotrace LTD Lumac BV Kit analiza Detergent rece Detergent rece MI 500 Light fotomultiplicator Luminometru detector Multi-Line Numerator de protoni-fotodioda

11

1.3. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin bioluminiscenta la monitorizarea calitatii microbiologice a apei de proces in industria lactatelor
1.3.1. Istoric Apa potabila in industria lactatelor se foloseste in mai multe scopuri: - materie prima in anumite produse ; - la clatirea finala a tuturor instalatiilor, tancurilor , masinilor de ambalat, cisternelor cu care se transporta laptele. Deoarece laptele si produsele lactate reprezinta un mediu optim pentru inmultirea bacteriilor, o contaminare extreme de mica a apei folosite in procesul tehnologic conduce la o contaminare de proportii a produsului finit. Avand in vedere acest lucru, starea de igiena a apei de proces este un punct critic de control care se monitorizeaza cu mare atentie. In acest caz, calitatea microbiologica a apei (igiena) trebuie analizata foarte atent si repede, pentru a avea un raspuns rapid inainte de a o folosi ca si materie prima in productie [Bagur E., 2009], sau ca si apa la clatirea finala a instalatiilor dupa dezinfectie. Metoda standardizata de analiza a NTG din apa (EN ISO 6222), cu inoculare in agar, presupune urmatoarele etape (Fig. 6): - 1 ml apa de analizat se inoculeaza in mediu nutritiv; - incubarea probei la temperature specifica metodei, 72 h; - enumerarea coloniilor; - exprimarea rezultatului in nr. cfu/ml. Deoarece limita de detectie este de 1 cfu/ml, s-a imbunatatit aceasta metoda introducandu-se metoda filtrarii pe membrane (Fig. 6) [SARTORIUS, Controlul microbiologic al produselor farmaceutice], care consta in urmatoarele etape: - 100 ml de apa se filtreaza aseptic printr-un filtru cu dimensiunea porilor de 0.45 m, care va retine toate microorganismele prezente in proba; - filtrul se transfera aseptic intr-o placa Petri in care se afla fie mediu nutritiv solidificat (Fig.6) fie un cartonas impregnat cu mediu nutritiv (Fig 7) [SARTORIUS, Controlul microbiologic al produselor farmaceutice]; - incubarea probei la temperature specifica metodei, timp de 72 h; - dupa expirarea timpului de incubare se numara coloniile formate si se raporteaza rezultatul in nr. cfu/100ml .

12

Fig. 6. reprezentarea schematic a metodei microbiologice de analiz a NTG din ap

13

In cazul in care se utilizeaza cartonase impregnate cu mediu , se procedeaza ca mai jos (fig. 7):

Fig. 7 Indicatii de lucru cartonase impregnate cu mediu nutritive (CMN)

14

In fig. 8 [SARTORIUS, Controlul microbiologic al produselor farmaceutice] sunt cateva exemple de placi inoculate cu apa potabila, pe care au crescut diverse microorganisme :

Fig.8. NTG - Exemple de placi dupa incubare

Prin aceasta imbunatatire limita de detectie a ajuns de la 1 cfu/ml la 0.01 cfu/ml. Cu toate ca limita de detectie a fost imbunatatita de 100 de ori, timpul de obtinere a rezultatelor a ramas acelasi .Intarzierea in obtinerea rezultatelor poate conduce la imposibilitatea de a mai lua actiuni corective, apa respectiva fiind deja introdusa in produs la momentul obtinerii rezultatelor. Astfel, s-a impus de la sine gasirea unei noi metode de analiza a calitatii microbiologice a apei, cu ajutorul careia sa se obtina rezultate rapide care sa permita luarea unei decizii in ceea ce priveste utilizarea sau neutilizarea apei ca materie prima, la un lot nou de produs . ATP/bioluminiscenta incepe sa devina o alternative foarte rapida (<5 min.) pentru detectia bacteriilor in apa de baut in comparative cu metoda conventionala care dureaza 3 zile [Deininger et al., 2001]. Ceresa L. ET AL., [2006], descrie un sistem de detectie ATP in apa, Pallchek Rapid Microbiology System, cu ajutorul caruia este analizata apa de proces, rezultatele exprimanduse absent/present. Acelasi sistem de analiza a apei, dar cu imbunatatiri, este descris si de Bagur E. [2009].

1.3.2. Principiul metodei.

Sistemul Pallachek [Bagur E., 2009] ( Fig. 9 ) consta intr-un luminometru portabil si un set de reactivi : - un extractant, care va extrage ATP-ul intracelular al fiecarei celule microbiene prezente in proba;

15

- substratul luciferin/luciferaza care, in reactia cu ATP va genera o cantitate de lumina direct proportionala cu cantitatea de ATP .

Fig. 9 Sistemul Pallachek Rapid Microbiology

Cu ajutorul sistemului de mai sus se poate detecta ATP-ul prin bioluminiscenta in doua moduri: direct si indirect. Metoda directa are o limita de detectie de 1000cfu/proba [Bagur E., 2009]. Acest lucru o face aplicabila probelor la care se stie din istoric ca nivelul de contaminare depaseste aceasta limita. Timpul de analiza este de 1 minut dupa ce proba a fost filtrata. Etapele de lucru in cazul metodei directe sunt redate schematic in fig. 10 [Bagur E., 2009], si constau in: - filtrarea unui anumit volum de apa, in functie de clasa de puritate estimata a probei (vezi Tabelul 2); - masurarea imediata a ATP/bioluminiscenta; - interpretarea datelor obtinute conform tabelului 2.

Fig. 10 Metoda directa de detecie a ATP-ul prin bioluminiscenta: etapele de lucru

16

Avantajele metodei directe sunt timpul scurt de raspuns (aprox. 30 min) si simplitatea. Rapiditatea cu care se obtine rezultatul ofera posibilitatea identificarii rapide a unui rezultat in afara limitelor si aplicarea imediata a unor actiuni corective . Volum proba filtrata Clasa 1 1000 ml 100 ml 10 ml Nivel estimat de <1 cfu/ml contaminare + = valoarea RLU> 1000cfu/ volum proba filtrata; - = valoarea RLU< 1000cfu/ volum proba filtrata Clasa 2 + <10 cfu/ml Clasa 3 + + <100 cfu/ml Clasa 4 + + + <1000 cfu/ml

Tabel 2 Metoda directa: interpretarea datelor Cel mai important dezavantaj il reprezinta sensibilitatea metodei, limitand aplicarea sa la probele cu un nivel relativ ridicat al contaminarii (>1000cfu/proba) [Bagur E., 2009]. Pentru apa de process, folosita in industria lactatelor, limita interna stabilita in marea majoritate a fabricilor de lactate, este de <1cfu /100ml (aceasta fiind limita de detectie a metodei ISO-metoda cu filtrare). Pentru acest caz, se poate folosi metoda indirecta. Este tot o metoda calitativa (absent/present), in cadrul careia ATP este masurat dupa o preimbogatire a probei. Dupa filtrarea probei , membrana este incubat peste noapte in mediu nutritiv lichid, pentru a obtine o crestere microbiana si, in consecinta, o amplificare a semnalului bioluminescent obtinut. Etapele de lucru sunt urmatoarele (Fig. 11) [Bagur E., 2009]: - proba de apa este diluata astfel incat sa se obtina 100 ml din dilutiile 1/10 si 1/100; - 100 ml proba ca atare precum si ambele dilutii sunt apoi filtrate ; - cele 3 membranele sunt transferate aseptic in cate 10 ml mediu nutritiv lichid si incubate 24 h; - se filtreaza 8 ml mediu din fiecare proba si se masoara valoarea ATP ca si la metoda directa.

17

Fig. 11 Metoda indirecta de detecie a ATP-ul prin bioluminiscenta: etapele de lucru

Tabelul 3 [Bagur E., 2009] centralizeaza posibilele limite de detectie pentru aceasta metoda. Tabel 3. Metoda indirecta de detecie a ATP-ul prin bioluminiscenta: interpretarea datelor Volum proba Clasa 1 1 1/10 1/100 Nivel estimat de <1 cfu/100ml contaminare + = valoarea RLU> 1cfu/ volum proba filtrata; - = valoarea RLU< 1cfu/ volum proba filtrata Clasa 2 + 1-10 cfu/100ml Clasa 3 + + 10-100 cfu/100ml Clasa 4 + + + 100-1000 cfu/100ml

Avantajul acestei metode este ca rezultatul este obtinut intr-un timp mai scurt decat prin metoda clasica. Aplicarea metodei ATP /bioluminiscenta in analiza probelor de apa intr-o fabrica de lactate permite aplicarea rapida a unor actiuni corrective , ca [Bagur E., 2009]: - repetarea recoltarii probelor si reanalizarea lor atunci cand limitele sunt depasite; - infirmarea sau confirmarea rapida a unui rezultat in afara limitelor; - alertarea rapida a departamentului de productie pentru a nu folosi apa cu limite depasite si pentru a trece la actiuni corective ; - analiza rapida a probelor de apa dupa ce s-au aplicat actiunile corective de remediere a neconformitatii (limite depasite). 18

1.4. Utilizarea metodei de detectia a ATP prin bioluminiscenta la monitorizarea igienei laptelui
1.4.1. Istoric Industria lactatelor, ca si alte sectoare ale industriei alimentare, a cautat sa dezvolte metode mai rapide pentru controlul calitatii microbiologice a materiei prime principale, laptele, precum si a produselor lactate. Conform legislatiei (Ordinul MAPAM 1106/2003), incepand cu 1 ianuarie 2009, NTG pentru laptele crud trebuie sa fie <100 000 cfu/ml. Deci, metoda de analiza aleasa trebuie sa aiba o limita de detectie cel putin egala cu aceasta valoare. Metoda standardizata de analiza a NTG din lapte crud (SR EN ISO 4833-2003) are limita de detectie de 1cfu/ml si presupune urmatoarele etape de lucru: - prepararea de dilutii zecimale ( 1/10, 1/100, 1/1000); - inocularea a cate 1 ml din fiecare dilutie in placi Petri cu mediu nutritiv; - incubarea placilor la 30C, timp de 72h; - enumerarea coloniilor pe placa si exprimarea rezultatelor in nr. cfu/ml. Dezavantajul major al acestei metode il reprezinta timpul mare de obtinere a rezultatelor (72 h), fapt ce face imposibil controlul microbiologic al laptelui materie prima inainte de a fi descarcat din cisterna. Cu aceasta metoda nu se poate face decat o monitorizare bazata pe istoric. Prima descriere a unei metode rapide de detectie ATP in lapte contaminat cu bacterii a fost facuta de catre Sharpe et al., in 1970. Dezavantajul acestei metode il constituie limita de detectie de 1x106cfu/ml , cu mult peste limita impusa de legislatia actuala. Cel mai important factor care influenteaza limita de detectie a acestei metode o reprezinta ATP nonbacterial din lapte. ATP-ul nonbacterial din lapte provine din 2 surse: ATP nativ secretat in timpul lactatiei si ATP din celule somatice. Procedurile recente de detectie ATP bacterian din lapte crud prin bioluminiscenta au limita de detectie de 1x104 iar timpul de analiza este de 5-10 min [Dostalek et al., 2005].

1.4.2. Principiul metodei Diferite studii descriu metode de determinare a gradului de contaminare micobiana a laptelui crud prin tehnica detectiei ATP pe baza bioluminiscentei [Bautista et al, 1992; Griffiths, 1991; Samkutty et al., 2001]. Principalele etape de lucru in cazul acestor metode sunt:

19

- incubarea probei de lapte cu un agent de lizare a celulelor somatice, pentru a elibera ATP din acestea; - filtrarea probei pe o membrana care va retine microorganismele; in acest mod se elimina ATP ul nonbacterial provenit din ambele surse; - lizarea microorganismelor retinute pe filtru pentru eliberarea ATP microbial; - analiza ATP prin bioluminiscenta. Acuratetea acestei metode este destul de redus (0,2-0,87 log UNITS) [Griffith M W, 2003]. Pentru imbunatatirea acuratetii metodei, se poate introduce o etapa de preincubare a probei la 15,60C, timp de 18 ore [Samkutty ey al., 2001]. Acest lucru a dus la cresterea coeficientului de regresie liniara a detectiei ATP comparativ cu metoda standard de la 0,58 la 0,80. O alta abordare este aceea de a folosi un reactiv de concentrare,Enliten, care clarifica laptele , microorganismele fiind apoi separate prin centrifugare. Combinarea acestui tratament cu detectia ATP/bioluminiscenta a condus la scaderea limitei de detectie la 104cfu/ml, analiza putandu-se efectua in 6-7 min. [Pahuski et al., 1991]. Introducerea unei etape de preincubare inainte de analiza ATP a condus la largirea ariei de aplicare a metodei si la laptele pasteurizat, UHT, ESL sau sterilizat.[Griffiths M W, 1993].

20

Partea a II-a CERCETRI PERSONALE

Studiu comparativ intre metoda microbiologica si ATP / bioluminiscenta in monitorizarea starii de igiena a suprafetelor din spatiul de productie intr-o fabrica de lactate

21

II.1.Scopul lucrarii
Cercetrile proprii au avut ca obiective prezentarea unei metode de detectia a ATP de pe suprafete care vin in contact direct cu produsul si un studiu comparativ intre rezultatele obtinute prin metoda microbiologica clasica si metoda de detectie ATP prin bioluminiscenta, pe probe recoltate de pe suprafete din fluxul de productie al unei fabrici de produse lactate, inainte si dupa efectuarea procedurilor de sanitizare.

22

II.2. Material si metoda

In cursul lucrarilor practice am folosit un aparat UNI-LITE NG (producator BIOTRACE) si teste "CLEAN-TRACE surface ATP", "CLEAN TRACE-water Total ATP" si "CLEAN TRACE-water FREE ATP" ( producator 3M). Tehnica de detectie ATP prin bioluminiscenta s-a folosit in paralel cu metoda standardizata de determinare a NTG, la evaluarea procedurilor de curatenie si dezinfectie a unor suprafete din fluxul tehnologic de fabricatie al produselor lactate, in cadrul unei fabrici de produse lactate din judetul Ilfov. 2.1.Suprafete testate. S-au recoltat probe de pe mai multe suprafete care vin in contact direct cu produsul, de pe fluxul tehnologic de productie al laptelui de consum , pasteurizat la temperatura inalta: tanc lapte crud, tanc lapte degresat, tanc smantana, tanc standardizare, tanc aseptic de umplere, linia aseptica de ambalare, cuva umplere masina ambalare, capete de dozare masina de ambalare. Diagrama de flux a acestui produs este redata in fig. 12.

Fig. 12. Diagrama de flux lapte de consum

23

Probele s-au recoltat inainte si dupa aplicarea unor proceduri diferite de igiena.

2.2. Proceduri de igienizare . Intregul proces de spalare si dezinfectie a instalatiilor din fluxul tehnologic este automat, fiind cuprins intr-un sistem CIP (Clean in place). Sistemul CIP este constituit din tancuri care contin solutii de detergenti, acizi, dezinfectanti si apa de clatire de la care solutiile respective sunt conduse cu ajutorul unor pompe prin toate instalatiile din fluxul tehnologic, fara ca acestea sa fie deschise. Ciclul unei igienizari complete cuprinde urmatoarele etape: 1. indepartarea reziduurilor de produs prin prespalare cu apa la temperatura de aproximativ 40oC, timp de 2 minute; 2. spalarea instalatiilor cu solutie NaOH (soda caustica), 1%, incalzita la o temperatura de 70oC, timp de 25 minute; 3. clatirea cu apa la 25oC, pentru indepartarea reziduurilor de soda caustica ; 4. dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm; In cadrul acestui experiment, s-au aplicat atat cicluri complete de igienizare cat si cicluri incomplete, pentru a se observa eficienta igienizari, pentru fiecare procedura in parte. Planul de experiment in ceea ce priveste procedurile de igiena aplicate a fost urmatorul: Procedura A: indepartarea reziduurilor de produs prin prespalare cu apa la temperatura de aproximativ 40oC, timp de 2 minute; Procedura B: - indepartarea reziduurilor de produs prin prespalare cu apa la temperatura de aproximativ 40oC, timp de 2 minute; - dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm; Procedura C, ciclul complet. Procedurile de igienizare A-C s-au aplicat in zile diferite, pe parcursul a 4 luni. 2.3. Plan de recoltare probe pentru analiza microbiologica si pentru analiza ATP prin bioluminiscenta. Probele s-au recoltat inainte si dupa fiecare procedura A-C, conform planului de recoltare si analiza din tabelul 4.

24

Tabel 4: Plan de recoltare si analize probe Nr. Locul crt recoltarii Procedura de igienizare aplicata
*inainte Ziua 1 1 tanc lapte crud inainte Ziua 2 dupa inainte Ziua 1 2 tanc standardizare Ziua 2 dupa inainte dupa inainte Ziua 1 3 tanc aseptic de umplere Ziua 2 dupa inainte dupa inainte Ziua 1 4 linia aseptica de ambalare Ziua 2 dupa inainte dupa inainte 5 cuva umplere masina ambalare Ziua 1 dupa inainte Ziua 2 dupa inainte 6 Capete de dozare masina ambalat Ziua 1 dupa inainte Ziua 2 dupa *dupa **1 pb. NTG **1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP 1 pb. NTG 1 pb. ATP

Procedura A

Procedura B

Procedura C

*inainte: inainte de aplicarea procedurii de igienizare respective / dupa: dupa aplicarea procedurii de igienizare respective ** 1 pb. NTG: 1 proba recoltata pentreu analiza NTG / 1pb. ATP: 1 proba recoltata pentru analiza ATP.

In total, s-au recoltat 144 de probe, din care 72 pentru analiza microbiologica NTG (36 de probe recoltate inainte de aplicarea procedurilor de igienizare si 36 de probe recoltate dupa aplicare procedurilor de igienizare) si 72 pentru analiza ATP/bioluminiscenta (36 de probe recoltate inainte de aplicarea procedurilor de igienizare si 36 de probe recoltate dupa aplicare procedurilor de igienizare). 25

2.4. Proceduri de recoltare probe pentru analiza microbiologica si pentru analiza ATP prin bioluminiscenta. Probele pentru analiza ATP/bioluminiscenta s-au recoltat cu ajutorul unor teste 3M CleanTrace Surface ATP, pentru ATP de pe suprafete (producator 3M) (Fig. 13).

Testul 3M Clean-Trace Surface ATP reprezinta un dispozitiv de unica folosinta ce contine un tampon pentru colectarea unei probe de pe o suprafata ( Instructiuni de utilizare de la producator, pentru Test 3M Clean-Trace Surface ATP).

Tamponul este pre-umezit cu un agent cationit care faciliteaza recoltarea probei de pe suprafata.

Fig. 13 Test Clean-Trace Metoda de recoltare este cea specificata in instructiunile de utilizare de la producator si consta in urmatoarele etape: -se lasa testele Clean Trace la temperatura camerei pentru cel putin 10 min inainte de utilizarea lor; -imediat inainte de utilizare se scoate tamponul de sanitatie din eprubeta testului si se tamponeaza o suprafata de testat de 10x10 cm , urmand aceleasi reguli ca si in cazul metodei de recoltare pentru analiza microbiologica; -se reintroduce tamponul in eprubeta testului , cu manerul inserat in pozitia originala a dispozitivului neutilizat.

Fig. 14 Luminometru 3M Clean-Trace 26

Probele astfel recoltate s-au analizat imediat, la locul de recoltare , folosind un luminometru portabil, 3M Clean-Trace NG Luminometer, producator 3M ( fig. 14), astfel: Pentru analiza microbiologica, recoltarea probelor s-a executat folosind tampoane de sanitatie sterile, in tuburi cu capac, sterile (swab tube, Greiner Biotrace , cat no.420161, fig. 15).

Fig. 15 Tampoane de sanitatie Greiner

Metoda de recoltare este conform SR ISO 18593:2007 si consta in urmatoarele etape: - se umecteaza vata din varful tamponului prin imersare in eprubeta in care s-au introdus in prealabil 10 ml solutie de neutralizare sterila; - se preseaza varful tamponului pe peretii eprubetei pentru a indeparta excesul de lichid; - se pune varful tamponului pe suprafata de investigat si si se plimba pe o arie de aproximativ 100cm2, in timp ce se roteste tamponul intre degetul mare si aratator, in doua directii in unghi drept una fata de cealalta; - se introduce tamponul in eprubeta cu solutie de neutralizare si se agita pe vortex 10sec ; aceasta reprezinta suspensia initiala ( 10ml). Probele au fost analizate in maxim 30 min de la recoltare, conform metodei specificate in SR EN ISO 4833-2003. Microbiologia produselor alimentare si nutreturilor. Metoda orizontala pentru enumerarea microorganismelor.Tehnica de numarare a coloniilot la 30oC

2.5. Modul de lucru 2.5.1. Analiza ATP prin bioluminiscenta. Se porneste luminometrul cu 1-2 minute inainte de analiza, pentru a intra in regim de functionare. Dispozitivul de unica folosinta in care s-a introdus tamponul dupa recoltare contine la baza sa reactivul combinat luciferin/luciferaza , sigilat cu o folie penetrabila.

27

Se apasa tamponul pana la baza dispozitivului, penetrand folia protectoare iar ATP ul colectat cu ajutorul tamponului va reactiona cu reactivul (fig. 16).

Fig. 16

Dupa activare, testul se agita rapid (5 secunde), ca in fig. 16, dupa care se introduce imediat in aparat (fig. 14) si se citeste rezultatul afisat pe ecranul

aparatului, exprimat in RLU (fig. 17)

Fig. 17

La recomandarea producatorului, s-au respectat urmatoarele reguli de utilizare: - dispozitivul de testare s-a tinut in pozitie verticala in momentul activarii, agitarea realizndu-se dintr-o parte in alta, nu mai mult de 5 secunde , citirea efectuandu-se imediat; - nu se agita dispozitivul in nici o alta pozitie decat cea indicata mai sus; - activarea dispozitivelor s-a realizat pe rand, unul cate unul, imediat inainte de analiza; - luminometrul s-a tinut in pozitie verticala in momentul in care s-au realizat determinarile de luminiscenta; - la finalul analizelor, se verifica sa nu ramana un dispozitiv in camera de citire a luminometrului. 2.5..2. Analiza NTG (Numar Total de Germeni) Analiza NTG s-a realizat conform. SR EN ISO 4833-2003. S-au inoculat cate 2 placi Petri/proba cu cate 1 ml din suspensia initiala obtinuta conform punctului 1.3. S-a folosit mediu de cultura PCA ( plate count agar) cu urmatoarea compozitie:

28

Extract de drojdii Digest pancreatic de caseina Glucoza Agar Apa distilata

2,5 g 5,0 g 1,0 g 15,0 g 1000 ml

S-a verificat pH-ul si s-a ajustat , astfel incat dupa sterilizare acesta sa aiba valoarea 7,00,2 la 25C. Mediul astfel preparat se sterilizeaza in autoclav la 121C timp de 15 minute. Flacoanele cu mediu se racesc pe baia de apa la 451C, aceasta fiind temperatura de lucru. Placile s-au incubat la 370C, timp de 72h. S-au ales placile care contin mai putin de 300 colonii si s-au numarat aceste colonii. Exprimarea rezultatelor s-a realizat astfel: - pentru placile care, dupa incubare, nu contin nici o colonie: <1 cfu/10cm2 - pentru placile care, dupa incubare, contin mai putin de 300 colonii calcularea numarului de cfu/10cm2 ( N) se realizeaza folosind urmatoarea formula:

CxV N= A unde: C - este numarul de colonii pe 1ml lichid de dilutie=10cm2 (pe placa), egal cu media aritmetica a valorilor celor doua placi utilizate; V - este volumul de apa deionizata din eprubeta, in ml (=10ml); A - suprafata investigata (aprox. 100cm2), in cm2; D - inversul factorului de dilutie ( D=101=10) x D= C

29

II.3. Rezultate si discutii.

Probele recoltate s-au analizat atat pentru NTG cat si pentru ATP. Rezultatele obtinute sunt cuprinse in tabelele 5,6 si 7, de mai jos. Limitele admise pentru fiecare loc de recoltare sunt stabilite intern, de catre echipa HACCP a fabricii de lactate, in functie de diferite criterii dintre care cel mai important este gradul de pericol pentru siguranta alimentara si legislatia in domeniu. In cazul analizei ATP, limita admisa de 10 URL a fost stabilita prin testari repetate ale unei suprafete din inox care a fost igienizata si dezinfectata in laborator, aceasta valoare fiind considerata limita de detectie ATP. Toate rezultatele 10 URL sunt considerate negative. Pentru analiza ATP nu exista limite maxim admise legiferate. In cazul analizelor NTG, limitele admise pentru tancul de lapte crud si pentru tancul de standardizare s-au stabilit intern iar pentru celelalte puncte de recoltare s-au preluat limitele din legislatie [Ordin MS 976/1998]. Asa cum se poate observa in toate cele trei tabele, toate rezultatele analizelor probelor recoltate inainte de a se aplica orice procedura de igienizare sunt in afara limitelor admise, atat in cazul analizelor NTG cat si in cazul analizelor ATP. Acest lucru demonstreaza faptul ca, in 100% din cazuri, acolo unde a existat contaminare microbiana am avut si rezultat ATP pozitiv (>10URL), datorat atat incarcaturii microbiene cat si reziduurilor de produs lactat care contine si ATP non-bacterian. In cazul punctelor de recoltare 3-6, fiind vorba despre suprafete care in timpul procesului de productie trebuie sa fie aseptice, valorile NTG inainte de aplicarea unei proceduri de igienizare depasesc cu putin limita admisa in timp ce valorile ATP sunt comparabile cu cele de la punctele de recoltare 1 (lapte crud) si 2 (lapte caruia i s-a aplicat o pasteurizare joasa). Obtinerea unor valori mari pentru ATP si mici pentru NTG in acest caz ca se datoreaza faptului ca pe suprafetele respective exista o cantitate mare de produs lactat pasteurizat ramas de la lotul precedent (care contine ATP non-bacterian) dar o incarcatura microbiana mica. In cazul aplicarii procedurii de igienizare A (spalare 2 min. cu apa la 400C), chiar daca valorile NTG si ATP au scazut (tabel 15), nu s-au plasat in limitele admise. Acest lucru demonstreaza ca aceasta procedura nu este eficienta nici pentru a indeparta contaminarea microbiana nici in cazul indepertarii urmelor de produs lactat.

30

Procedura B de igienizare a constat in prespalare cu apa la temperatura de aproximativ 40oC, timp de 2 minute, urmata de dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm. Valorile rezultatelor analizelor NTG au scazut simtitor in comparatie cu procedura A, unele dintre ele fiind in limitele admise (puncte de recoltare 2-6) altele nu (punct de recoltare 1) (tabel 16). Acest lucru demonstreaza ca aceasta procedura nu este 100% eficienta in combaterea contaminarii microbiene. In cazul analizelor ATP toate valorile obtinute au fost in afara limitelor admise, chiar daca , pe acelasi punct de recoltare, prin analiza NTG s-au obtinut valori in limitele admise (tabel 16, pct. 3 si 5 de recoltare). Aceste rezultate se pot explica prin absenta bacteriilor viabile pe suprafetele respective ( efect datorat cel mai probabil dezinfectantului) si prezenta de reziduuri de produs lactat steril (care contin ATP nonmicrobian). Deci, chiar daca dezinfectia a fost eficienta in unele cazuri, indepartarea tuturor resturilor de prodius lactat nu sa realizat pentru nici un punct de recoltare, acestea putand deveni suport de crestere pentru o eventuala post-contaminare microbiana In tabelul 17 sunt prezentate valorile obtinute in cazul aplicarii procedurii de igienizare C, in cursul careia au fost parcurse urmatoarele etape: - indepartarea reziduurilor de produs prin prespalare cu apa la temperatura de aproximativ 40oC, timp de 2 minute; - spalarea instalatiilor cu solutie NaOH, solutie de concentratie 1%, incalzita la o temperatura de 70oC, timp de 25 minute; - clatirea cu apa la 25oC, pentru indepartarea reziduurilor de soda caustica; - dezinfectie cu acid peracetic, 250ppm; Toate valorile obtinute, atat pentru NTG cat si pentru ATP s-au incadrat in limitele admise in proportie de 100%., demonstrand eficienta procedurii de igienizare atat in indepartarea resturilor de produs lactat cat si la dezinfectie.

31

Tabel l 5: Rezultate obtinute in cazul aplicarii procedurii de igieniare A

PROCEDURA A Rezultate probe recoltate inainte de aplicarea procedurii NTG ( cfu/cm2) >300(foto 1) ATP (RLU) 8623 Rezultate probe recoltate dupa aplicarea procedurii NTG ( cfu/cm2) >300 ATP (RLU) 3562

Locul recoltarii Nr. punct de recoltare

tanc lapte crud (limite admise: NTG<10cfu/cm2; ATP20RLU)

>300

5593( vezi foto15)

>300

2698

tanc standardizare (limite admise: NTG<10cfu/cm2; ATP20RLU)

254

8002

39 (vezi foto 7)

845

148 (vezi foto 6)

3596

37 (vezi foto 8)

821 (vezi foto 13)

tanc aseptic de umplere (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

9 (vezi foto 5)

8236

659

2563

767 (vezi foto 14)

linie aseptica de ambalare (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

8056

659

10

6658

776

cuva umplere masina ambalat (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

10

3698

356

14

8065

822 (vezi foto 17)

capete de dozare masina ambalat (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

3911

299

11

8220

698

32

Tabel 6: Rezultate obtinute in cazul aplicarii procedurii de igieniare B

PROCEDURA B Rezultate probe recoltate inainte de aplicarea procedurii NTG ( cfu/cm2) >300 ATP (RLU) 6694 Rezultate probe recoltate dupa aplicarea procedurii NTG ( cfu/cm2) 39 ATP (RLU) 1654

Nr. punct de recoltare

Locul recoltarii

tanc lapte crud (limite admise: NTG<10cfu/cm2; ATP20RLU)

>300

4023 ( vezi foto16)

48

1123

tanc standardizare (limite admise: NTG<10cfu/cm2; ATP20RLU)

165 ( vezi foto4)

7694

14

423

236

5110

256

tanc aseptic de umplere (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

2658

<1

59

5698

<1(vezi foto 2)

59 (vezi foto 12)

linie aseptica de ambalare (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

6894

125

4986

<1

67

cuva umplere masina ambalat (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

8214

<1

136

9123

<1

110

capete de dozare masina ambalat (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

10

6524

98

7499

<1

69

33

Tabel 7: Rezultate obtinute in cazul aplicarii procedurii de igieniare C

PROCEDURA C

Nr. punct de recoltare

Locul recoltarii

Rezultate probe recoltate inainte de aplicarea procedurii NTG ( cfu/cm2) >300 ATP (RLU) 9658

Rezultate probe recoltate dupa aplicarea procedurii NTG ( cfu/cm2) <1 ATP (RLU) 10

tanc lapte crud (limite admise: NTG<10cfu/cm2; ATP20RLU) >300 6532 <1 10 (vezi foto 9)

200 2 tanc standardizare (limite admise: NTG<10cfu/cm2; ATP20RLU) 166

5648

<1

6894

<1

7 (vezi foto 10)

tanc aseptic de umplere (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

5656

<1

10

11

7546

<1

linie aseptica de ambalare (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

6568

<1

10

10

6689

<1

10

cuva umplere masina ambalat (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

3945

<1

12

5055

<1

capete de dozare masina ambalat (limite admise: NTG<1cfu/cm2; ATP10RLU)

5565

<1

8496

<1

10

Tabel 8. Rezultate obinute la tratamentul suprafeelor

Nr. crt. 1 2 3 4 Tratamentul suprafetelor testate fara igienizare procedura A procedura B procedura C numar probe 36 12 12 12 NTG rez. in limite rez. peste limite 0 36 0 7 12 12 5 0 rez. in limite ATP rez. peste limite 0 36 0 0 12 12 12 0

34

II.4. Concluzii.

1. In cazul probelor recoltate inainte de aplicarea celor trei proceduri de igienizare testate precum si in cazul probelor recoltate dupa aplicarea procedurii de igienizare A, exista o corelatie de 100% intre analizele NTG si analizele ATP. Rezultatele NTG se explica prin prezenta incarcaturii microbiene pe suprafetele testate, iar valorile foarte mari ale ATP se datoreaza prezentei reziduurilor de produs lactat in cantitati relativ mari si incarcaturii microbiene (ATP nonmicrobian si ATP microbian). 2. In cazul aplicarii procedurii de igienizare B, din totalul de 12 probe analizate 7 au avut rezultate NTG negativ in timp ce rezultatul ATP a fost pozitiv. Acest lucru demonstreaza ca pe aceste suprafete nu mai exista incarcatura microbiana (NTG negativ), dar exist totusi urme de produs lactat steril, purtator de ATP nonmicrobial (ATP pozitiv). Analizele de ATP pozitive in cele 7 cazuri si NTG negativ indica faptul ca procedura B este eficienta in cazul contaminarii microbiene dar nu si in cazul reziduurilor de produs lactat. 3. La aplicarea procedurii C toate rezultatele pentru NTG si ATP sunt in limitele admise, fapt ce dovedeste ca aceasta procedura este eficienta pentru ambele scopuri: indepartarea urmelor de produs si a contaminarii microbiene. Rezultatele analizelor NTG si ATP au fost n corelaie de 100%. 4. Testul NTG a fost util la aprecierea dac suprafata testata are sau nu contaminare microbiana, dar nu a dat nici un indiciu despre prezenta reziduurilor de produs lactat steril, care poate deveni sursa de hrana pentru o eventuala contaminare minora a acelei suprafete. 5. Testul ATP a permis atat detectarea contaminarii microbiene, cat si a prezentei reziduurilor de produs lactat pe aceste suprafete. Aceste rezultate, alturi de rapiditatea obtinerii rezultatelor, fac din testul ATP un instrument valoros in cadrul planurilor HACCP din industria lactatelor.

35

Bibliografie
1. Bagur E. (2009), Concurent evaluation of both compendial and rapid method (ATP bioluminescence) for monitoring water quality, European Pharmaceutical Review, Issue 3. 2. Bautista DA, McIntyre L, Laleye L, and Griffiths MW (1992), The application of ATP bioluminescence for the assessment of milk quality and factory hygiene, J. Rapid 091 Methods Automat. Microbiol. 1, 17993 3. Carrick K, BarneyM, Navarro A, and Ryder D (2001), The comparison of four

bioluminometers and their swab kits for instant hygiene monitoring and detection of microorganisms in brewery, J. Inst. Brewing 107(1), 317. 4. Ceresa L., Ball P.(2006).Using ATP bioluminescence for microbiological measurements in pharmaceutical manufactutring. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods, Volume II, 233-250 5. Day, J. C. (2009). Bioluminescent beetles. http://www.bioluminescentbeetles.com (Accesat 14.06.2010) 6. Deininger RA , Lee J (2001), Rapid determination of bacteria in drinking water using ATP assay , Field analytical chemistry and technology 5(4), 1859. 7. Dostalek P., Branyik T. (2005) Prospects for rapid bioluminescent detection methods in the food industry. Czech J. Food Sci, vol 23, no.3: 85-92 8. Griffiths CJ, Davidson CA, Peters AC, and Fielding LM (1997), Towards a strategic cleaning assessment programme: hygiene monitoring and ATP luminometry, an options appraisal , Food Sci Technol Today 11, 1524 9. Griffiths M W (1991), Rapid estimation of microbial numbers in dairy products using ATP technology. 10. Griffiths M.W, Brovko L. (2003). ATP bioluminescence.

http://www.crcnetbase.com/doi/pdf/ 10.1201/9780203485712.ch8 11. Hawronsky JM, Chittock RS, Wharton CW, and Holah J T (1994), Low level bacterial contamination measured using a novel Bioluminescent assay, in Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamentals and Applied Aspects, eds. AK Campbell, L J Kricka and P E Stanley, Chichester, John Wiley & Sons, pp. 41114. 12. Kyriakides A. L., Costello SM, Easter MC, and Johnson I (1991), Rapid hygiene monitoring using ATP bioluminescence, in Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status, eds. P E Stanley and L J Kricka, Chichester John Wiley & Sons, pp. 519 22.

36

13. Lynch T. (1999), Bioluminescence in Fireflies. The luciferase-luciferin reaction in Photinus pyralis. http://www.byteland.org/naturalist/dubois.htm (Accesat 14.10.2010) 14. Martin E., (2003). Hygiene monitoring in support of food safety. Society for food hygiene technology, UK. 15. Murphy, S.C.; Kozlowski, S.M.; Blander, D.K.; Bandler, D.K.; Boor, K.J. Evaluation of adenosine triphosphate-bioluminescence hygiene monitoring for trouble-shooting fluid milk shelf-life problems. J. Food Sci., 81, 817-820, 1998 16. Pater P. (1994) .Rapid analysis techniques in food microbiology .Blackie Academic & Professional, Westwr Cleddens Road, Bishopbrigges, Glasgow, G64 2NZ, UK. 17. Ramsay C. An overview of rapid hygiene testing using ATP bioluminescence (2002) http://users.metropolia.fi/~karisv/Nanopinta/ATP-1.pdf 18. Raugel P J (1999).Rapid food analysis and hygiene monitoring. Kits, instruments and systems. 19. Sakakibara T, Murakami S, Eisaki N, Najajiama M, and Imai K (1999), An enzymatic cycling method using pyruvate orthophosphate dikinase and firefly luciferase for the simultaneous determination of ATP and AMP (RNA), Anal. Biochem. 268(1), 94101. 20. Samkutti P J, Gough RH, Adkinson RW, and McGrew P (2001), Rapid assessment of the bacteriological quality of raw milk using ATP bioluminescence, J Food Protec. 64(2), 208212. 21. Seeger K, and Griffiths M. W. (1994), ATP bioluminescence for hygiene monitoring in health care institutions, J. Food Protect. 57, 50912 22. Velasquez M and Feirtag (1997), Quenching and enhancement effects of ATP extractants, cleansers, and sanitizers on the detection of the ATP bioluminescent signal, J. Food Protec. 60(7), 799803. 23. ****SR EN ISO 4833-2003. Microbiologia produselor alimentare si nutreturilor.Metoda orizontala pentru enumerarea microorganismelor. Tehnica de numarare a coloniilor la 30 grade C. 24. ***Ordin al Ministrului Sanatatii nr. 976 din 16 decembrie 1998 pentru aprabarea Normelor de igiena privind productia, prelucrarea, depozitarea, pastrarea, transportul si desfacerea alimentelor 25. ***Ordinul MAPAM 1106/2003 privind aprobarea Programului de actiuni pentru mbunatatirea calitatii si salubritatii laptelui materie prima 26. ***Quick Start Guide UNI-LiteNG Biotrace 27. ***SR EN ISO 4833-2003. Microbiologia produselor alimentare si nutreturilor. Metoda orizontala pentru enumerarea microorganismelor.Tehnica de numarare a coloniilot la 30oC

37

28. ***SR ISO 18593:2007. Microbiologia alimentelor si nutreturilor. Metode orizontale privind tehnicile de esantionare de pe suprafete folosind placi de contact si tampoane 29. ***User Guide for the 3M Clean-Trace rapid hygiene monitoring system.

38

ANEXA

Foto 1: Placa Petri analiza NTG pct. recoltare 1, fara igienizare

Foto 2 : Placa Petri analiza NTG pct. recoltare 3, procedura B

39

Foto 3: Placa Petri analiza NTG pct. recoltare 6, fara igienizare

Foto 4 : Placa Petri analiza NTG pct. recoltare 2, fara igienizare

40

Foto 5: Placa Petri analiza NTG pct. recoltare 3, fara igienizare

Foto 6 : Placa Petri analiza NTG pct. recoltare 2, fara igienizare

41

Foto 7: Placa Petri analiza NTG pct. recoltare 2, procedura A

Foto 8: Placa Petri analiza NTG pct. recoltare 2, procedura A

42

Foto 9: rezultat analiza ATP, pct. recoltare 1, procedura C

Foto 10: rezultat analiza ATP, pct. recoltare 2, procedura C

43

Foto 11: rezultat analiza ATP, pct. recoltare 3, procedura C

Foto 12: rezultat analiza ATP, pct. recoltare 3, procedura B

44

foto 13: rezultat analiza ATP, pct. recoltare 2, procedura A

foto 14: rezultat analiza ATP, pct. recoltare 3, procedura A

45

foto 15: rezultat analiza ATP, pct. recoltare 1, fara igienizare

foto 16: rezultat analiza ATP, pct. recoltare 1, fara igienizare

46

foto 17: rezultat analiza ATP, pct. recoltare 5, procedura A

47