Biossensor Condumetrico

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
INSTITUTO DE QUMICA DE SO CARLOS

R RR RENATO SOUSA LIMA ENATO SOUSA LIMA ENATO SOUSA LIMA ENATO SOUSA LIMA

Biossensor condutomtrico sem contato em microchip
contendo cido flico como biorreceptor

So Carlos
2010
R RR RENATO SOUSA LIMA ENATO SOUSA LIMA ENATO SOUSA LIMA ENATO SOUSA LIMA

Biossensor condutomtrico sem contato em microchip
contendo cido flico como biorreceptor

Dissertao apresentada ao Instituto de Qumica de So
Carlos da Universidade de So Paulo para obteno do
ttulo de Mestre em Cincias.

rea de Concentrao: Qumica Analtica.

Orientador: Prof. Dr. Emanuel Carrilho.

So Carlos
2010
EXEMPLAR REVISADO
Renato S. Lima

E EE EXEMPLAR REVISADO XEMPLAR REVISADO XEMPLAR REVISADO XEMPLAR REVISADO

Este exemplar foi revisado e alterado em relao verso original, sob a exclusiva
responsabilidade do autor.

So Carlos, 05 de setembro de 2010.

Renato Sousa Lima
DEDIDATRIA

Renato S. Lima

D DD DEDICA EDICA EDICA EDICATRIA TRIA TRIA TRIA

Dedico esta dissertao aos meus pais, Francisco Sousa Neto e Maria Aparecida de
Sousa Lima, e av (In Memorian), Ana Rosa Xavier, minhas referncias de vida, e aos meus
irmos, Francisco Sousa Jnior e Rosana Sousa Lima, pela amizade.

AGRADECIMENTOS

Renato S. Lima

A AA AGRADECIMENTOS GRADECIMENTOS GRADECIMENTOS GRADECIMENTOS

Aos professores Dr. Emanuel Carrilho, Dr. Mrio C. U. de Arajo, Dr. Wendell K. T. Coltro,
Dr. Ubirajara P. Rodrigues-Filho e Dr. Pedro A. P. Nascente pelos ensinamentos.

Ao Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron (LNLS), pelo acesso aos Laboratrios de

Microfabricao (LMF), Filmes Finos (LFF) e Microscopia e Tunelamento (LMT).

Aos tcnicos do LNLS Maria Helena (LMF), ngelo Gobbi (LMF e LFF) e Vnicius Pimentel
(LMT), por todo o suporte tcnico concedido durante o desenvolvimento deste trabalho.

Aos integrantes do grupo BioMics, em especial Gabriela, Thiago e Eduardo, pelas

discusses e amizade.

CAPES (agosto de 2008), CNPq (setembro de 2008 a fevereiro de 2009) e FAPESP (maro
de 2009 a agosto de 2010, processo 2008/07597-4), pelas concesses das bolsas de
mestrado e apoio financeiro para execuo deste projeto de pesquisa.
RESUMO

Renato S. Lima

R RR RESUMO ESUMO ESUMO ESUMO

LIMA, R. S. Biossensor condutomtrico sem contato em microchip contendo cido flico como
biorreceptor. 2010. Dissertao (Mestrado em Qumica Analtica) Instituto de Qumica de So
Carlos, Universidade de So Paulo, So Carlos, 2010.

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um biossensor contendo transduo
condutomtrica sem contato (C
4
D, capacitively coupled contactless conductivity detection) e cido
flico (FA) como biorreceptor em microchip, uma nova alternativa que poder ser utilizada na
determinao do biomarcador tumoral FR-. Essa espcie exibe interaes com FA altamente
especficas, com constantes de formao da ordem de 10
9
-10
10
. Os dispositivos microfludicos, os
quais consistiram de uma lmina de vidro (integrando os eletrodos), dieltrico (contendo a fase
biossensora) e substrato de poli(dimetilsiloxano) (PDMS, incorporando os microcanais), foram
fabricados utilizando-se processos de fotolitografia e deposio de filmes finos em fase vapor.
Objetivando melhorias nos nveis de deteco da C
4
D, estudos de sensibilidade com base em
parmetros da curva analtica foram conduzidos alterando-se a natureza do dieltrico e a
configurao dos eletrodos. Posteriormente, estudos de caracterizao foram realizados para as
superfcies modificadas com os intermedirios de imobilizao; condies reacionais distintas
(reagente, concentrao, solvente e tempo) foram consideradas. As tcnicas de microscopia
eletrnica de varredura e espectroscopia de fotoeltrons excitados por raios-X foram usadas,
respectivamente, a fim de se verificar a possvel formao de aglomerados e permitir determinaes
qualitativas e quantitativas sobre as composies qumicas das superfcies. Como resultado dos
experimentos de sensibilidade e caracterizao de superfcie, adotamos os parmetros seguintes
para os ensaios de interaes biomoleculares posteriores: filme de SiO
2
como dieltrico, eletrodos
seletivos C
4
D com formato retangular e orientao antiparalela e monocamadas automontadas do
reagente 3-aminopropil(trietoxisilano) como intermedirio de imobilizao de FA. As duas etapas
finais do trabalho foram: otimizao do tempo de funcionalizao com FA (3, 5 e 7 h) e
caracterizao da fase biossensora, realizada a partir de medidas de C
4
D e microscopia de fora
atmica (AFM). Para o primeiro caso, os microchips foram aplicados a um padro de anticorpo
monoclonal especfico a FA (-FA). Os ensaios biomoleculares indicaram uma adsoro efetiva de FA
junto superfcie de SiO
2
silanizada, sem a ocorrncia (ao menos em nveis significativos) de
impedimentos estricos de sua espcie bioativa. Dentre os tempos de funcionalizao investigados, 3
h foi aquele que resultou em uma maior sensibilidade do mtodo. Em termos da etapa de
caracterizao eletroqumica da fase biossensora, seus resultados mostraram haver correlao entre
a resposta analtica e as interaes FA/-FA. Em adio, conforme indicaram as medidas de AFM, no
houve alteraes drsticas na morfologia do substrato (SiO
2
) em funo dos processos de
modificao qumica de superfcie. Por fim, o uso da C
4
D como uma tcnica de transduo em
biossensores mostrou-se uma alternativa promissora para a anlise do biomarcador tumoral FR-.
Dentre outros aspectos, essa plataforma analtica requer uma instrumentao simples, barata e
porttil, no apresenta inconvenientes relacionados ao contato eletrodo/soluo, dispensa o uso de
mediadores redox e permite a determinao simultnea de multianalitos. Neste nterim, alteraes
no transdutor devem ser implementadas visando um aumento na sensibilidade do mtodo, o qual
representa seu fator limitante principal.

Palavras-chave: Sensor Qumico. Condutometria Sem Contato. Microfludica. Biomarcador Tumoral.
ABSTRACT

Renato S. Lima

A AA ABSTRACT BSTRACT BSTRACT BSTRACT

LIMA, R. S. Contactless conductometric biosensor in microchip containing folic acid as bioreceptor.
2010. Dissertao (Mestrado em Qumica Analtica) Instituto de Qumica de So Carlos,
Universidade de So Paulo, So Carlos, 2010.

This work describes the development of a biosensor containing capacitively coupled
contactless conductivity transduction (C
4
D) and folic acid (FA) as bioreceptor in microchip, a new
alternative that can be used in FR- tumor biomarker analysis. FR- exhibits highly specific
interactions with FA, showing formation constants of the order of 10
9
-10
10
. The microfluidic devices
consisted of a glass layer (integrating the electrodes), dielectric (containing the biosensor phase), and
poly(dimetilsiloxane) substrate (PDMS, incorporating microchannel). The microfabrication stage
evolved photolithography processes, metal adsorption via sputtering, and plasma-enhanced vapor
film deposition. In order to improve detection levels of C
4
D, sensitivity studies were conducted by
changing the dielectric nature and electrode configuration. Through flow analysis with given
electrolyte standards, the limits of detection and quantification were calculated based on analytical
curve parameters. Subsequently, researches were performed to characterize the modified surfaces
with immobilization intermediate considering reaction conditions distinct (reagent, concentration,
solvent, and time). The techniques of scanning electron microscopy and X-ray photoelectron
spectroscopy were employed, respectively, aiming to verify the clusters formation and allow
qualitative and quantitative determinations about the surfaces chemical composition. From the
results of sensitivity experiments and surface characterization, we adopt the following parameters
for the biomolecular interactions assays: SiO
2
film as dielectric, C
4
D selective electrodes with
rectangular shape and antiparallel orientation, and self-assembled monolayers of 3-
aminopropyl(triethoxysilane) as intermediary for immobilization of FA. The two final steps of the
work were: optimizing the FA functionalization time (3, 5, and 7 h) and phase biosensor
characterization, made from measures of C
4
D and atomic force microscopy (AFM). For the first case,
due to the absence of FR- standard for purchase, the microchips were applied to FA specific
monoclonal antibody (-FA). The biomolecular assay indicated effective adsorption of FA, without
occurrence (at least in significant levels) of steric hindrance of its bioactive specie. Among the
investigated times of functionalization, 3 h resulted in a higher sensitivity of the method. In terms of
biosensor phase electrochemical characterization stage, their results evidenced correlation between
analytical response and FA/-FA interactions. Additionally, as the AFM measurements showed,
drastic changes in the morphology of the substrate (SiO
2
) with the surface modification processes did
not occur. Finally, the use of the C
4
D as transduction technical in biosensors proved to be a
promissory alternative for FR- tumor biomarker analysis. Among other features, this platform has
not drawbacks related to the electrode/solution contact, dispenses the use of redox mediators,
allows the simultaneous determination of multianalytes, and employs an instrumentation that is
simple, cheap, and portable. Nevertheless, changes in the transducer should be implemented to
increase the method sensitivity, which represents its main limiting factor.

Keywords: Chemical Sensor. Contactless Conductometry. Microfluidics. Tumor Biomarker.
LISTA DE ILUSTRAES

Renato S. Lima

L LL LISTA DE ISTA DE ISTA DE ISTA DE ILUSTRAES ILUSTRAES ILUSTRAES ILUSTRAES

Figura 1.1. Estrutura qumica do FA. 23

Figura 1.2. Chip com fibras pticas adaptadas para conduo (C) e aquisio (A) da radiao. B,
bomba-seringa e V, vlvula solenide. 29

Figura 1.3. Microfabricao por fotolitografia-UV. (A) Ajuste do posicionamento do fotorresiste em
relao mscara; (B), exposio radiao UV; (C), substrato com canal para fotorresistes positivos
e (D), substrato com estrutura em alto relevo para fotorresistes negativos. 32

Figura 1.4. Esquema geral do processo de replicao: (A), moldagem e (B), desmoldagem. 35

Figura 1.5. Microchip contendo ouro (Au) depositado sobre uma lmina de vidro. 38

Figura 1.6. Componentes de um sistema analtico contendo sensor em interao com uma
biomolcula. 40

Figura 1.7. Ilustrao de um microchip C
4
D com eletrodos fixados sobre a sua lmina de cobertura. 51

Figura 1.8. Modelo eltrico referente ao sistema de deteco C
4
D. A, aplicao de sinal alternado de
alta frequncia sobre e
exc
e B, aquisio, amplificao e armazenamento do sinal analtico. 52

Figura 1.9. Efeito de assimetria de carga originando a resistncia dieltrica (A) e acoplamento
capacitivo eletrodo/dieltrico/soluo em C
4
D (B). q+ e q-, cargas consequentes da assimetria de
carga; , densidade de carga e
I
,
A
e
R
, mobilidades ideal, decorrente do efeito de assimetria e
resultante, respectivamente. 53

Figura 2.1. Camadas constituintes do BIA-C
4
D. C, canal e E, eletrodo 59

Figura 2.2. Layout para construo do molde vidro/SU-8. 60

Figura 2.3. Camada de PDMS contendo canais (C) e tubos de silicone (T) para acesso aos
reservatrios. 61

Figura 2.4. Layout para deposio dos metais por sputtering. 62

Figura 2.5. Placa de vidro com eletrodos depositados por sputtering. 64

Figura 2.6. Diagrama esquemtico do interior do microcanal na regio do transdutor. 65

Figura 2.7. Formao de APTS-SAM sobre superfcie de SiO
2
em solventes anidros. 66

Figura 2.8. Produto da reao entre APTS e FA. 67

Figura 2.9. Foto do BIA-C
4
D. S, substrato de PDMS contendo canais e mangueiras de silicone, e V,
vidro incorporando eletrodos, filme fino de SiO
2
e fase biossensora. 68

Figura 3.1. Instrumentao analtica suporte ao BIA-C
4
D. G, gerador de sinal; B, bomba-seringa; S
A
e
S
B
, seringas contendo amostra e tampo, respectivamente; T, mangueira de teflon (adaptada ao tubo
de silicone presente no chip); F, fonte de alimentao; C, caixa de Al com microdispositivo e circuito
de recepo (ver Figura 3.2); A, circuito de amplificao de sinais em caixa de Al e D, descarte. 71
LISTA DE ILUSTRAES

Renato S. Lima

Figura 3.2. Foto do porta-amostra (A), diagramas de fluxo (B-D) e sinais analticos tpicos (E,F). J,
jacars para conexes eltricas; R, circuito de recepo de sinais; b, fase biossensora e S
r
e S
w
,
respostas obtidas por e
rr
e e
wr
, respectivamente.

73

Figura 4.1. Microchips HCD (A) e C
4
D
alt
(B). S, substrato de PDMS contendo canais e mangueiras de
silicone, e V, vidro incorporando eletrodos e filme fino de SiO
2
. 77

Figura 4.2. Layout para deposio dos metais por sputtering em C
4
D
alt
. Os pads localizados no centro
da mscara apresentaram espaamento de 0,6 mm e dimenses iguais a 1,0 x 1,0 mm. 78

Figura 4.3. Sinais e curvas analticas correspondentes aos microssistemas C
4
D
SiO2
(A,B) e C
4
D
PDMS

(C,D). Condies experimentais: 400 kHz, 2,5 V
P-P
, vazo de 100 L.min
-1
para H
2
O e amostra e tempo
de amostragem em 15 s. 79

Figura 4.4. Sinais e curvas analticas obtidos para os microdispositivos contendo C
4
D (A,B), C
4
D
alt
(C,D)
e HCD (E,F). Condies experimentais: 400 kHz, 2,5 V
P-P
e vazo de 100 L.min
-1
para H
2
O e amostra. 82

Figura 5.1. Produto de polimerizaes verticais sobre a superfcie de SiO
2
envolvendo APTS. 87

Figura 5.2. Reator utilizado para modificaes qumicas e substrato imerso em soluo de silano. 88

Figura 5.3. Micrografias do 3-IUTS formado a partir de solues de tolueno sobre SiO
2
por 150 min
com 200 (A), 1.000 (B) (registrada para regio R
1
) e 5.000 (C) (registrada para regio R
2
) vezes de
aumento. Imagens reproduzidas da referncia 141. 90

Figura 5.4. Micrografias obtidas para SAM A.3 com 2.000 (A), 10.000 (B) (registrada para regio R
1
) e
30.000 (C) (registrada para regio R
2
) vezes de aumento. 91

Figura 5.5. Micrografias obtidas para SAM B.2 com 2.000 (A), 10.000 (B) (registrada para regio R
1
) e
2

Figura 5.6. Micrografias obtidas para SAM C.2 com 2.000 (A), 10.000 (B) (registrada para regio R
1
) e
2

Figura 5.7. Espectros obtidos para SiO
2
modificada com SAM A.1. Para cada componente, so
informados o valor de E
L
e a quantidade relativa percentual entre parnteses. 97

2
L

2
L

2
mostrados o valor de E
L

2
L

2
modificada com SAM B.1. Para cada componente, so
L

2
L
LISTA DE ILUSTRAES

Renato S. Lima

2
L
e a quantidade relativa percentual entre parnteses.

104

2
modificada com SAM C.1. Para cada componente, so
L

2
modificada com SAM C.2. Para cada componente, so
L

Figura 5.17. Relaes N/Si para as condies de silanizao investigadas. 108

Figura 6.1. Otimizao dos parmetros da C
4
D. 112

Figura 6.2. Sinais analticos registrados para os dispositivos BIA-C
4
Ds microfabricados segundo os
tempos de funcionalizao de 3 (A), 5 (B) e 7 h (C). Condies experimentais: 400 kHz, 2,5 V
P-P
, vazo
de 20 L.min
-1
para tampo (MES) e amostra (-FA) e tempo de amostragem em 15 s. 114

Figura 6.3. Sinais obtidos pelos sistemas: e
rr
/SiO
2
(S
r
), e
r
/SiO
2
/APTS-SAM (S) e e
wr
/SiO
2
/APTS-SAM/FA
(S
w
). Condies experimentais: 400 kHz, 2,5 V
P-P
, vazo de 20 L.min
-1
para tampo (MES) e amostra
(-FA) e tempo de amostragem em 20 s. 116

Figura 6.4. Micrografias de 5 m x 5 m das superfcies: SiO
2
(A), SiO
2
/APTS-SAM (B) e SiO
2
/APTS-
SAM/FA (C). 117

LISTA DE TABELAS

Renato S. Lima

L LL LISTA DE TABELAS ISTA DE TABELAS ISTA DE TABELAS ISTA DE TABELAS

Tabela 1.1 - Biomarcadores associados ao diagnstico e prognstico de cncer 45

Tabela 1.2 - Exemplos de biossensores (imunossensores) para anlise de biomarcadores de cncer 48

Tabela 4.1 - Valores de RSD (%) para a faixa de trabalho adotada 79

Tabela 4.2 - Valores de LOD e LOQ estimados para 95,0, 99,0 e 99,9% de confiana 80

Tabela 4.3 - Valores de RSD (%) para a faixa de trabalho adotada 81

Tabela 4.4 - Valores de LOD e LOQ estimados para 95,0, 99,0 e 99,9 % de confiana 82

Tabela 5.1 - Condies reacionais para silanizao de SiO
2
estudadas 86

Tabela 5.2 - Concentraes atmicas percentuais 95

Tabela 6.1. Valores de RMS, S
dr
e S
ds
calculados para as superfcies SiO
2
, SiO
2
/APTS-SAM e SiO
2
/APTS-
SAM/FA 117
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Renato S. Lima

L LL LISTA DE ISTA DE ISTA DE ISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ABREVIATURAS E SIGLAS ABREVIATURAS E SIGLAS ABREVIATURAS E SIGLAS

A - rea dos eletrodos.
Ab
FA
- anticorpo monoclonal especfico a FA.
AFM - microscopia de fora atmica (atomic force microscopy).
A
p
- rea integrada de pico.
APTS - 3-aminopropil(trietoxisilano).
APTS-SAM - SAMs do silano APTS.
ButCN - 4-(trietoxisilil)butironitrila.
C - capacitncia.
C
1
/C
2
- capacitores referentes aos sistemas eletrodo/soluo em C
4
D.
CAQI - Central de Anlises Qumicas Instrumentais.
CCD - deteco condutomtrica sem contato (contactless conductivity detection).
CCDM - Centro de Caracterizao e Desenvolvimento de Materiais.
C
4
D - deteco condutomtrica sem contato acoplada capacitivamente (capacitively coupled
contactless conductivity detection).
C
4
D
alt
- microdispositivo C
4
D contendo eletrodos segundo as dimenses e geometria
propostas por Kuba e Hauser.
C
4
D
PDMS
4
D contendo PDMS como dieltrico.
C
4
D
SIO2
4
D contendo SiO2 como dieltrico.
CD-R - discos compactos regravveis (recordable compact disc).
C
eq
- capacitncia equivalente.
C
exc
- capacitncia referente ao sistema e
exc
/soluo em HCD.
c
i
- concentrao das espcies inicas presentes na amostra.

Renato S. Lima

CNTFET - transistor de efeito de campo incorporando nanotubo de carbono (carbon
nanotube field-effect transistor).
C
o
- capacitncia de fuga (stray capacitance).
C
r
- capacitncia referente ao sistema e
r
/SiO
2
/soluo em HCD.
d - distncia entre eletrodo e soluo.
D - coeficiente de difuso.
DMSO - dimetil-sulfxido.
DCC - N,N-diciclohexilcarbodiimida.
DEM - Departamento de Engenharia de Materiais.
DO - deteco oscilomtrica.
e - carga elementar.
D -
campo eltrico gerado pela polarizao dos centros de carga de um dieltrico.
EDC - 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida.
E
Ci
- energia cintica de pico.
e
exc
- eletrodo de excitao.
EIS - espectroscopia de impedncia eletroqumica (electrochemical impedance
spectroscopy).
E
L
- energia de ligao.

ELISA - ensaio imunoabsorvente de ligaes enzimticas (enzyme linked immuno sorbent
assay).
e
r
- eletrodo receptor.
e
rr
- eletrodo receptor de referncia.
S
-

campo eltrico do sistema eletrodo/dieltrico/soluo em C
4
D.
e
wr
- eletrodo receptor de trabalho.

Renato S. Lima

FUNDP - Facults Universitaires Notre-Dame de la Paix.
GA - glutaraldedo.
HPLC - cromatografia em fase lquida de alta eficincia (high performance liquide
chromatography).
INCA - Instituto Nacional do Cncer.
i - fluxo de carga proveniente de e
r
.
i
d
- fluxo de carga que se direciona ao transdutor.
i
o
- parcela do fluxo de carga proveniente de e
r
associada a C
o
.
IQSC - Instituto de Qumica de So Carlos.
IrO
x
- xido de irdio.
J
D
- fluxo de difuso.
K
f
- onstante de formao.
L - condutncia.
LFF - Filmes Fino.
LISE - Laboratoire Interdisciplinaire de Spectroscopie lectronique.
LMF - Laboratrios de Microfabricao.
LMT - Laboratrio de Microscopia e Tunelamento.
LNLS - Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron.
LOC - lab-on-a-chip.
LOD - limites de deteco.
LOQ - quantificao.
MEV - microscopia eletrnica de varredura.
MIP - polmeros impressos molecularmente (molecularly imprinted polymers).
MMQ - mtodo dos mnimos quadrados.

Renato S. Lima

5-MTHF - 5-metiltetrahidrofolato.
NHS - N-Hidroxisuccinimida.
PC - policarbonato.
PDMS - poli(dimetilsiloxano).
PE - polietileno.
PECVD - deposio qumica em fase vapor assistida por plasma (plasma-enhanced chemical
vapor deposition).
PET - poli(etileno-tereftalato).
PFPE - perfluoropoliter.
PMMA - poli(metilmetacrilato).
PP - polipropileno.
PPF - filmes obtidos pela polimerizao por plasma.
PSA - antgeno seletivo ao cncer de prstata (prostate specific antigen).
PT - polister/toner.
PU - poliuretana.
PVC - poli(cloreto de vinila).
QCM - microbalana de cristal de quartzo (quartz crystal microbalance).
R
2
- fatores de correlao das curvas analticas.
r
i
- raio inico da partcula considerada.
RMS - rugosidade mdia quadrtica (root mean square).
R
s
- resistncia associada ao fluido eletroltico.
RSD - desvio padro relativo.
RT-PCR - reaes em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (reverse transcription-
polymerase chain reaction).

Renato S. Lima

SAM - monocamadas automontadas (self-assembled monolayers).
S
dr
- razo da rea superficial (surface area ratio).

S
ds
- densidade de picos (density of summits).
SELEX - evoluo sistemtica de ligantes por enriquecimento exponencial (systematic
evolution of ligands by exponential enrichment).
SPR - ressonncia plasmnica de superfcie (surface plasmon resonance).
S
r
- sinal de e
rr
.
Sulfo-LC-SPDP - hexanoato de sulfosuccinimida 6-[3-(2-piridilditiol) propilamino].
S
w
- resposta de e
wr
.
TBS - tampo TRIS salino (TRIS buffered saline).
Tg - tiroglobulina.
UA - uretana-acrilato.
UFSCar - Universidade Federal de So Carlos.
USP - Universidade de So Paulo.
UV - radiao ultravioleta.
UV-VIS - ultravioleta-visvel.
X
C
- reatncia capacitiva.
XPS - espectroscopia de fotoeltrons excitados por raios-X (X-ray photoelectron
spectroscopy).
z
i
- carga das espcies inicas presentes na amostra.
-FA - anticorpo monoclonal especfico a FA.
c - gradiente de concentrao resultante.
c
- permissividade eltrica da camada de isolamento do eletrodo.
e
- permissividade eltrica do eletrodo.

Renato S. Lima

o
- constante de permissividade.
- viscosidade da soluo.
u
i
- mobilidade efetiva das espcies inicas presentes na amostra.
BIA-C
4
D - microssistema contendo biossensor condutomtrico sem contato para anlise de
interaes biomoleculares.
TAS - microssistema para anlises totais (micro total analysis system).
SiO2
- densidade do substrato SiO
2
.
- seo de choque de fotoionizao.
- percurso livre mdio.

SUMRIO

Renato S. Lima

S SS SUMRIO UMRIO UMRIO UMRIO

APRESENTAO DO TEMA E ESTRUTURA DA DISSERTAO 19

CAPTULO 1 Consideraes Gerais e Objetivo Geral 22

1.1. cido Flico e Receptores de Folato 23

1.1.1. Conceitos 23

1.1.2. Diagnstico de Cncer Empregando FR- como Biomarcadores 24

1.2. Microssistemas Analticos 27

1.2.1. Miniaturizao em Qumica Analtica 27

1.2.2. Substratos 29

1.2.3. Tcnicas de Microfabricao 31

1.2.4. Tipos de Selagem 35

1.2.5. Mtodos de Deteco Integrados a Microchips 37

1.3. Biossensores 38

1.3.1. Fundamentos 38

1.3.2. Funcionalizao de Superfcie 42

1.3.3. Biossensores como Plataformas de Anlise de Biomarcadores Tumorais 44

1.4. Deteco Condutomtrica Sem Contato 50

1.4.1. Histrico 50

1.4.2. Teoria 50

1.4.3. Vantagens em Relao Condutometria Convencional 56

1.4.4. Tendncias 57

1.5. Objetivo Geral 57

CAPTULO 2 Microfabricao do BIA-C
4
D 58

2.1. Confeco dos Microcanais 59

2.2. Fabricao dos Eletrodos 61

2.3. Isolamento Eltrico dos Eletrodos 63

2.4. Construo da Fase Biossensora 64
SUMRIO

Renato S. Lima

2.5. Selagem 68

CAPTULO 3 Ferramentas e Rotina de Anlise 70

3.1. Instrumentao e Software 71

3.2. Rotina de Anlise 72

CAPTULO 4 Estudos de Sensibilidade do Transdutor 74

4.1. Microdispositivos 76

4.2. Natureza do Dieltrico: Experimental, Resultados e Discusso 78

4.3. Configuraes do Transdutor: Experimental, Resultados e Discusso 80

4.4. Concluses 84

CAPTULO 5 Estudo das Condies de Silanizao 85

5.1. Prembulo 86

5.2. Experimental 88

5.3. MEV: Resultados e Discusso 89

5.4. XPS: Resultados e Discusso 94

5.5. Concluses 109

CAPTULO 6 Estudo das Condies de Funcionalizao e Caracterizao da
Fase Biossensora 110

6.1. Estudo das Condies de Funcionalizao: Experimental, Resultados e Discusso 111

6.2. Caracterizao da Fase Biossensora: Experimental, Resultados e Discusso 115

6.2.1. Caracterizao Eletroqumica 115

6.2.2. Caracterizao Morfolgica 116

6.3. Concluses 118

CAPTULO 7 Concluses Gerais 119

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 122

SMULA CURRICULAR 135

A AP PR RE ES SE EN NT TA A O O D DO O T TE EM MA A E E E ES ST TR RU UT TU UR RA A D DA A D DI IS SS SE ER RT TA A O O

APRESENTAO DO TEMA E ESTRUTURA DA DISSERTAO
20

O projeto aborda quatro assuntos em destaque na qumica analtica moderna:
microssistemas analticos, biossensores de reconhecimento molecular por afinidade,
deteco condutomtrica sem contato e anlise de biomarcadores tumorais.
A dissertao apresenta-se sob a forma de captulos, quais sejam:

C CC CAPTULO 1 APTULO 1 APTULO 1 APTULO 1 - Aborda inicialmente aspectos relacionados ao cido flico, com destaque
para sua capacidade de atuar como biorreceptor do biomarcador tumoral FR-. Em seguida,
dada a relevncia que a miniaturizao em qumica analtica vem adquirindo nos ltimos
anos, substratos, tcnicas de microfabricao, modos de selagem e detectores integrados a
sistemas microfludicos sero discutidos. Em relao aos sensores qumicos, apresentaremos
aspectos histricos, convenes preconizadas pela Unio Internacional de Qumica Pura e
Aplicada (IUPAC), mtodos de funcionalizao de superfcie e uma breve reviso sobre o uso
de biossensores para a deteco de biomarcadores de cncer. Por fim, fundamentos
intrnsecos ao transdutor (condutometria sem contato) utilizado neste projeto sero
descritos;

C CC CAPTULO APTULO APTULO APTULO 2 22 2 - Apresenta os detalhes a respeito do processo de microfabricao da
plataforma analtica;

C CC CAPTULO APTULO APTULO APTULO 3 33 3 - Descreve sucintamente a instrumentao analtica empregada e a rotina
dos ensaios analticos;

C CC CAPTULO APTULO APTULO APTULO 4 44 4 - Retrata estudos sistemticos os quais tiveram por finalidade principal
suplantar os baixos nveis de detectabilidade da transduo condutomtrica sem contato. A
natureza do dieltrico e configuraes distintas para os eletrodos foram avaliadas atravs do
clculo das figuras de mrito preciso e sensibilidade, determinadas a padres de eletrlitos;
APRESENTAO DO TEMA E ESTRUTURA DA DISSERTAO
21

C CC CAPTULO APTULO APTULO APTULO 5 55 5 - Discute estudos de caracterizao realizados para superfcies modificadas
quimicamente com intermedirios de imobilizao, os quais consistiram de monocamadas
automontadas de organossilano. Condies reacionais (reagente, concentrao, solvente e
tempo) distintas foram investigadas. As tcnicas de microscopia eletrnica de varredura e
espectroscopia de fotoeltrons excitados por raios-X foram usadas, respectivamente, a fim
de se verificar a possvel formao de aglomerados e permitir determinaes qualitativas e
quantitativas sobre as composies qumicas das superfcies modificadas;

C CC CAPTULO APTULO APTULO APTULO 6 66 6 - Apresenta as duas etapas finais do trabalho, a saber: (i) otimizao do
tempo de funcionalizao com cido flico e (ii) caracterizao da fase biossensora. Para o
primeiro caso, haja vista a ausncia de padres de FR- para compra, os microchips foram
aplicados a um padro de anticorpo monoclonal especfico ao biorreceptor cido flico; as
intensidades dos sinais analticos em BIA-C
4
D foram consideradas como parmetro de
referncia na escolha do tempo a ser adotado. O processo de caracterizao, por sua vez, foi
realizado mediante medidas de condutncia e rugosidade. Adicionalmente, neste captulo
apresentada uma hiptese sobre o princpio de transduo do mtodo;

C CC CAPTULO APTULO APTULO APTULO 7 77 7 - Aborda concluses gerais sobre o mtodo desenvolvido.

C CA AP P T TU UL LO O 1 1
Consideraes Gerais e Objetivo Geral
CAPTULO 1 | | Consideraes Gerais e Objetivo
23

1.1. cido Flico e Receptores de Folato
1.1.1. Conceitos
Os folatos so vitaminas do complexo B e ocorrem fisiologicamente sob formas
reduzidas de molculas hidroflicas. Tais substncias exercem papel preponderante em um
grande nmero de processos bioqumicos essenciais para a vida, como a sntese de
nucleotdeos. O 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF) a forma de folato mais presente na
circulao, enquanto que o cido flico (FA) uma espcie oxidada e no fisiolgica dessa
vitamina.
1
A estrutura qumica do FA apresentada na Figura 1.1.

N
N
OH
N
N CH
3
NH
2
H
2
N
CONH CH
COOH
C
2
H
4
C OOH

Figura 1.1. Estrutura qumica do FA.

Dentre as fontes naturais de FA, temos: frutas ctricas, folhas verdes, alguns gros
(ervilha, arroz etc.), aspargos, brcolis, cenoura, abacate e amendoim. A deficincia desse
composto acarreta em diminuio da taxa de crescimento em crianas; em adultos, as
consequncias envolvem anemia megaloblstica e distrbios no trato gastrointestinal. Por
outro lado, embora oferea baixo nvel de intoxicao, um excesso de FA (ingesto diria
superior a 1 mg) pode mascarar a deficincia de vitamina B12, fundamental para uma boa
manuteno do sistema nervoso.
2

Para a captura de FA exgeno, as clulas animais possuem substncias denominadas
receptores de folato (FR), as quais so representadas por uma famlia de glicopolipeptdeos
6 6- -M Me et ti il lp pt te er ri in na a

2
24

com massa molecular aparente entre 38.000 e 45.000. Os FRs exibem interaes com FA via
o grupo amino (NH
2
) da 6-metilpterina (ver Figura 1.1). Essas interaes so altamente
especficas, com constantes de formao da ordem de 10
9
-10
10
e segundo uma
estequiometria de 1:1. Pesquisas sobre o genoma humano revelaram a existncia de quatro
genes distintos para os FRs: , , e . Tais isoformas possuem de 220 a 237
aminocidos, compartilham de 68 a 79% da mesma sequncia e apresentam oito ligaes
dissulfureto. Os FRs e , os quais esto presentes em maiores quantidades nas clulas,
contm trs e dois stios de N-glicosilao, respectivamente. Os nmeros de ligaes
dissulfureto e stios de N-glicosilao contribuem para a estabilidade do polipeptdeo.
1,3

1.1.2. Diagnstico de Cncer Empregando FR- como Biomarcadores
Cncer, conhecido tambm como cancro ou neoplasia maligna, o nome dado a um
conjunto de mais de 100 doenas que se caracterizam pelo crescimento no sistemtico das
clulas, as quais invadem tecidos e rgos podendo propagar-se para outras regies do
organismo atravs do sangue ou vasos linfticos. Esse crescimento celular aleatrio
consequncia de erros genticos que ocorrem no oncogene, responsvel pelo controle da
diviso celular, a mitose. Os processos de disperso das clulas tumorais (cancergenas,
neoplsicas ou malignas) e posterior estabelecimento em novos tecidos e rgos so
conhecidos como metstase e colonizao, respectivamente, com formao do denominado
cncer metasttico. O processo de metstase responde pela maior parcela de bitos dentre
as vtimas de cncer.
4

A incidncia do cncer tem crescido significativamente no contexto mundial em
consequncia direta s transformaes globais ocorridas nas ltimas dcadas, bem como a
25

urbanizao acelerada e os novos modos de vida e padres de consumo. Em 2002, foram
registrados mundialmente em torno de 10 milhes de novos casos e 6 milhes de mortes.
Estudos preveem que at o ano de 2020, esses nmeros iro aumentar para 15 e 12
milhes, respectivamente.
5
Nos pases mais desenvolvidos, o cncer figura como a segunda
maior causa de bito; nos Estados Unidos e no Canad, os cnceres de prstata, pulmo,
mama e colo lideram a lista de mortalidade dentre os diversos tipos dessa patologia.
6
No
Brasil, segundo dados do Instituto Nacional do Cncer (INCA), so registradas
aproximadamente 130 mil mortes anuais, um nmero menor apenas quando comparado ao
das doenas cardiovasculares. No mbito econmico, em 2008, os gastos federais no Brasil
com assistncia oncolgica aumentaram em 103% com relao ao ano de 2000.
5
Neste
cenrio, o diagnstico precoce fundamental na medida em que auxilia nos prognsticos
mdicos, conferindo maior possibilidade de cura aos pacientes mediante tratamento
teraputico medicamentoso e/ou cirrgico e menores gastos pblicos.
As tcnicas convencionais empregadas para deteco de clulas cancergenas
envolvem bipsia e posterior exame do tecido removido, utilizando-se fixao celular e
estudos sobre a morfologia das clulas. Esses testes, no entanto, no so individualmente
conclusivos, envolvem subjetividade em suas anlises, so extremamente invasivos e no
permitem o diagnstico precoce da doena. Uma alternativa a esses inconvenientes o uso
de biossensores (item 1.3) para deteco de biomarcadores em urina, sangue ou demais
fluidos biolgicos. Tal plataforma de anlise apresenta facilidade de operao, baixo custo,
rapidez, prescinde a realizao de etapas de preparo de amostra e, desde que o nvel do
biomarcador esteja correlacionado ao estgio patolgico, possibilita o monitoramento da
doena.
6,7
Adicionalmente, os biossensores possibilitam a determinao de multianalitos;
so exemplos as determinaes dos biomarcadores: AFP, ferricina, -hCG, CEA, CA 125, Ca
26

15-3 e CA 19-9;
8
AFP, -hCG, CEA e CA 125;
9
CEA e AFP
10
e PSA livre (PSA
f
) e total (PSA
t
).
11,12

Em oncologia, a deteco de diferentes bioanalitos, sequencial ou simultnea, aumenta o
poder de diagnstico dos mtodos analticos uma vez que os biomarcadores, em geral, no
so especficos a um tumor em particular, mas a uma srie deles.
13
As caractersticas
supracitadas representam vantagens tambm em relao a outras tcnicas de diagnstico e
monitoramento, como o uso de ferramentas moleculares (genoma e proteoma) e imagens
no invasivas para localizao de tumores.
6

Os biomarcadores so espcies que se encontram presentes em tecidos tumorais
determinados. Idealmente, essas substncias devem possibilitar uma distino entre clulas
normais e malignas com sensibilidade e seletividade apreciveis a partir da interao com
receptores especficos.
14
Do ponto de vista da sua localizao nas clulas, os biomarcadores
podem ser extra ou intracelulares. Nesse ltimo caso, geralmente so necessrias etapas de
pr-concentrao a fim de se conseguir uma sensibilidade analtica satisfatria.
6
Dentre os
mtodos desenvolvidos para esse propsito, incluem separaes imunomagnticas
15-17
e
centrifugao.
18
Embora a grande maioria dos biomarcadores de cncer apresente alta
afinidade, muitos exibem especificidade reduzida, como o caso do antgeno seletivo ao
cncer de prstata (PSA).
4
Esse inconveniente decorre do fato dos biomarcadores serem
acessveis no fluido biolgico quando tambm associados a clulas normais, o que vem a
reduzir drasticamente a especificidade das anlises. Neste contexto, os FRs- tm se
mostrado marcadores altamente sensveis e especficos.
Os FRs- so biomarcadores extracelulares e esto presentes sob maiores nveis de
concentrao em clulas cancergenas originadas do tecido glandular localizado, por sua vez,
no ovrio, no tero e na crvice. Tais biomarcadores no so acessveis diretamente via
corrente sangunea quando presentes em clulas normais, mas somente quando aderidos a
27

clulas malignas. Esse fenmeno confere especificidade a interaes com biorreceptores e
agentes teraputicos, sendo pois implementado nas reas de diagnstico e transporte e
desenvolvimento de novos medicamentos (triagens clnicas em seres humanos empregando-
se essas drogas se encontram em fase de execuo). Adicionalmente, o nvel de FR- est
diretamente correlacionado ao estgio tumoral dos pacientes, de modo que esse
biomarcador pode ser usado no apenas como ferramenta de diagnstico, como tambm de
monitoramento e tratamento do cncer.
1

Em funo das vantagens intrnsecas ao FR- como biomarcador tumoral, essa
espcie vem a representar uma alternativa das mais promissoras nos campos de diagnstico,
monitoramento e tratamento dessa patologia. Estudos recentes demonstraram o uso de
voltametria cclica,
19
microscopia de fora atmica (AFM)
20
e difratometria
21
como tcnicas
de transduo associadas a biossensores de FR- contendo FA como biorreceptor.

1.2. Microssistemas Analticos
1.2.1. Miniaturizao em Qumica Analtica
Da mesma forma que os microchips revolucionaram os universos da informtica e da
eletrnica na dcada de 80, o desenvolvimento de dispositivos microfludicos figura, no
momento, como uma verdadeira revoluo no campo da qumica analtica. Com efeito, o
interesse por sistemas de anlise qumica miniaturizados tem crescido substancialmente nos
ltimos anos. Um indicativo desse crescimento, bem como da importncia dos sistemas
microfludicos para a comunidade cientfica, a publicao frequente de artigos
relacionados ao tema em peridicos especializados.
22

28

O primeiro dispositivo em miniatura para fins analticos foi publicado em 1979: um
analisador base de silcio aplicado cromatografia em fase gasosa.
23
No obstante a
reduo do tempo de separao, esse microdispositivo no foi prontamente aceito no meio
acadmico em virtude da falta de experincia tecnolgica em mtodos de separao. Com
isso, na dcada de 80, as pesquisas em microfludica ficaram limitadas ao desenvolvimento
de sensores qumicos e ferramentas de anlise em fluxo (bombas, vlvulas e misturadores)
miniaturizadas.
24

Inicialmente, a finalidade principal para a miniaturizao dos sistemas de anlise
consistia em aumentar a eficincia analtica. Neste nterim, com a converso da escala macro
para a escala micro, outras vantagens foram advindas; so exemplos a reduo no consumo
de reagentes e amostras (da ordem de nL a pL) e os aumentos na frequncia de anlises, na
sensibilidade e na portabilidade, o que vem a viabilizar a realizao de anlises em campo.
22

Esses fatores so relevantes em aplicaes clnicas, nas quais o consumo reduzido de
amostras vem a resultar em maior comodidade e, em determinados casos, menor risco
sade dos pacientes.
25

As vantagens supracitadas, somadas ao desenvolvimento de novos substratos e
tcnicas de microfabricao, tm impulsionado a consolidao cientfica e comercial dos
microdispositivos analticos, com marco inicial datado em 1990.
26
Na ocasio, Manz, Graber
e Widmer propuseram o conceito de microssistema para anlises totais (TAS): sistema
miniaturizado plenamente capaz de realizar as etapas prvias e de medida de um
procedimento analtico com todos seus componentes (bombas, vlvulas, reatores etc.)
integrados.
27
Na sua essncia, o termo TAS est associado a procedimentos analticos.
Contudo, demais funes qumicas podem ser implementadas, de maneira que atualmente
esses sistemas so tambm conhecidos como lab-on-a-chip (LOC).
28

29

No que se refere evoluo dos microssistemas para anlises qumicas, convm
ainda ressaltar a atuao imprescindvel de diferentes ramos da cincia, sem os quais no se
tornaria possvel tal processo evolutivo. So exemplos: micromecnica (vem a partir da
tecnologia do silcio possibilitar a confeco de microestruturas para fins analticos);
cincia de materiais (proporciona a deteco em escalas diminutas a partir do uso, por
exemplo, dos sensores de fibra ptica como mostra a Figura 1.2) e microeletrnica (dispe
atualmente de circuitos integrados multifuncionais extremamente reduzidos).
29

Figura 1.2. Chip com fibras pticas adaptadas para conduo (C) e aquisio (A) da radiao. B, bomba-seringa
e V, vlvula solenide.

1.2.2. Substratos
Os primeiros microchips analticos resultaram de adaptaes da fotolitografia,
tecnologia ento desenvolvida nas dcadas de 70 e 80 pela indstria microeletrnica. Em
face ao amplo emprego do silcio para a confeco de circuitos integrados, esse material foi
o substrato pioneiro em microfludica. No entanto, em funo do seu custo elevado e
demais parmetros (transparncia ptica, inrcia qumica e propriedades eltricas)
inadequados para esse tipo de aplicao, o silcio foi substitudo gradualmente por vidro
(incluindo slica fundida) e quartzo.
22

B
Chip
A
C
V
30

No incio da dcada de 90, silcio, vidro e quartzo eram os substratos mais
utilizados.
26
Tais materiais, embora apresentem propriedades de superfcie adequadas para
uma srie de aplicaes, requerem instrumentao de alto custo e salas limpas para a
fabricao dos microcanais, restringindo, desse modo, o seu uso a poucos grupos de
pesquisa.
22
Neste contexto, os avanos tecnolgicos ocorrentes nas ltimas trs dcadas
possibilitaram o desenvolvimento de materiais diversos, entre os quais se destacam os
polmeros.
30
Para o campo da microfludica, essas substncias agregam caractersticas
significativas, como: custo reduzido, facilidade de microfabricao, transparncia ptica,
inrcia qumica elevada e permeabilidade aos gases O
2
e CO
2
, o que os tornam viveis para a
anlise de clulas biolgicas. O poli(dimetilsiloxano) (PDMS) o material polimrico mais
usado na fabricao de microestruturas.
31
Suas vantagens principais incluem: tempo de vida
prolongado, absoro de gua e condutividade reduzidas, alta temperatura de distoro e
baixa energia superficial (20 erg.cm
-2
), o que facilita o seu desprendimento de moldes em
processos de microfabricao por moldagem.
32
Com base em parmetros puramente fsicos,
o PDMS classificado como um elastmero,
33
o que vem a permitir a sua vedao contra
qualquer superfcie plana, reversvel ou irreversivelmente, e acarretar em maiores
facilidades na integrao de vlvulas, bombas, reatores e detectores aos microchips.
34

Pesquisas em microfludica empregando PDMS como substrato tm crescido
exponencialmente desde o ano de 2003.
26
Contudo, novos polmeros vm sendo utilizados
visando suplantar uma limitao intrnseca quele composto: a sua expanso quando
empregados solventes orgnicos, como: hexano, tolueno, diclorometano e acetonitrila.
35

Como exemplos de materiais polimricos alternativos, temos: perfluoropoliter (PFPE);
28

poliuretana (PU);
36
uretana-acrilato (UA);
37
poli(metilmetacrilato) (PMMA); policarbonato
(PC); polietileno (PE); polipropileno (PP);
26
poli(cloreto de vinila) (PVC); poli(etileno-
31

tereftalato) (PET) e polister/toner (PT).
22
Por outro lado, as principais desvantagens
associadas ao uso de polmeros como substratos em microfludica so: autofluorescncia e
baixas estabilidades mecnica, trmica e a solventes orgnicos.
38,39

Como alternativa aos substratos descritos at o momento, temos os microchips
hbridos vidro/elastmero.
40,41
Esses dispositivos aliam vantagens intrnsecas ao vidro [fluxo
eletrosmtico (EOF) estvel e valores apreciveis de condutividade trmica e estabilidades
mecnica, trmica e qumica] e aos elastmeros (facilidade de microfabricao).
26

1.2.3. Tcnicas de Microfabricao
Fotolitografia
A fotolitografia a tcnica mais utilizada na fabricao de microchips analticos.
42
Ela
consiste na gravao de estruturas micromtricas (10-100 m) em um substrato
fotossensvel (fotorresiste) mediante a incidncia de radiao ultravioleta (UV).
22
No
processo fotolitogrfico so utilizadas mscaras para exposio seletiva do substrato
radiao. A depender da natureza do material empregado, as reaes polimricas que se
sucedem nas regies expostas radiao podem resultar em substncias insolveis ou
solveis, sendo denominadas fotorresistes negativos e positivos, respectivamente. A etapa
de remoo das partes solveis do substrato, conhecida como revelao, realizada com
solventes orgnicos especficos.
29

Na Figura 1.3, ilustrado o processo de microfabricao por fotolitografia em
fotorresistes negativos e positivos empregando radiao UV. As mscaras para
polimerizao convencionais, com resoluo da ordem de 1 m, consistem de vidro
(transparente para o UV prximo) ou quartzo (transparente para o UV distante), recobertos
32

por uma camada de Cr que determina o layout microfludico de interesse. Mscaras com
resoluo da ordem de 30 m podem ser obtidas a partir do uso de fotolitos,
22
cuja
tecnologia mais rpida e economicamente mais atrativa.

Figura 1.3. Microfabricao por fotolitografia-UV. (A) Ajuste do posicionamento do fotorresiste em relao
mscara; (B), exposio radiao UV; (C), substrato com canal para fotorresistes positivos e (D), substrato
com estrutura em alto relevo para fotorresistes negativos.

Para a fabricao de microcanais por fotolitografia em materiais como silcio e vidro,
se faz necessrio um processo subsequente de corroso. Neste caso, a etapa fotolitogrfica
visa formao de mscaras para a reao corrosiva sobre o substrato, as quais podem ser
de materiais distintos,
22
como: metal/fotorresiste, fotorresiste e demais variantes nas quais
no se utiliza a fotolitografia. So exemplos o silcio
43
e o toner,
44
depositados sobre a
superfcie do substrato por processos envolvendo plasma e transferncia trmica,
respectivamente.
A fotolitografia pode tambm ser utilizada na microfabricao de eletrodos, processo
o qual requer uma etapa posterior de deposio metlica. Para tal, comumente so
empregadas tcnicas de deposio fsica em fase vapor, como evaporao trmica e
(A) (B)
(C) (D)
U UV V
M M s sc ca ar ra a
F Fo ot to or rr re es si is st te e
33

sputtering. Em ambas, o metal removido de uma dada superfcie fonte, ou por
aquecimento (evaporao trmica) ou pelo impacto contra ons altamente energticos
(sputtering), e, em seguida, difunde em direo ao substrato onde se condensa na forma de
filme com espessuras entre 50 e 250 nm.
45

Uma outra tcnica para microfabricao de eletrodos agrega processos de impresso
direta, transferncia trmica e corroso do substrato. Esse mtodo consiste em transferir
termicamente camadas de toner impressas em papel vegetal para a superfcie de discos
compactos regravveis (CD-R)
46
ou placas de circuito impresso,
47
resultando em eletrodos
de Au e Cu, respectivamente. As mscaras de toner definem as dimenses dos eletrodos, ao
passo que as reas no protegidas so expostas a reaes corrosivas em solues de KI/I
2
,
no caso dos CD-Rs, e de FeCl
3
, no caso das placas de circuito impresso. Para remoo do
toner, so usados algodes umedecidos em acetonitrila.
22
O uso de materiais polimricos na microfabricao de eletrodos envolve trs
inconvenientes. Primeiramente, uma vez que os coeficientes de expanso trmica dos
polmeros so cerca de uma ordem de grandeza maiores que os dos metais, gradientes de
temperatura elevados podem levar a rachaduras dos eletrodos. Ademais, o mtodo limita-se
principalmente a polmeros termorrgidos, como o SU-8. Isso ocorre por incompatibilidade
qumica de elastmeros e termoplsticos diante da etapa de revelao. O terceiro obstculo
diz respeito adeso ineficiente entre metais e polmeros, que pode ser contornado pelo
uso de agentes promotores de adeso (usualmente um segundo metal, como Ti ao serem
utilizados eletrodos de Au) ou por pr-tratamento da superfcie do polmero em plasma de
O
2
.
26

Moldagem
34

Embora as tecnologias de microfabricao convencionais propiciem a construo de
microestruturas com definio e resoluo excelentes, as mesmas envolvem alto custo de
implementao. Estima-se que para a instalao de um laboratrio de microfabricao
contendo sala limpa, estao fotolitogrfica, spinner e perfilmetro, dentre outros, se faz
necessrio um investimento superior a um milho de reais.
40

Neste cenrio, a pesquisa por mtodos de microfabricao alternativos e
economicamente viveis tornou-se um objetivo permanente da comunidade cientfica,
busca a qual fora impulsionada tambm pelo surgimento de novos substratos em
microfludica. Dentre esses mtodos, se destaca o processo de moldagem o qual apresenta
duas etapas primrias: a fabricao de um molde rgido contendo a imagem negativa do
sistema microfludico em alto relevo e a replicao do microdispositivo, que consiste em
transferir a estrutura do molde para o substrato.
48

A etapa de fabricao dos moldes aquela que agrega maiores tempo e custo
durante o processo de moldagem.
22
No entanto, o mesmo molde pode ser empregado por
diversas vezes em procedimentos de replicao. A depender das condies experimentais e
da razo de aspecto requerida para os microcanais, os moldes podem ser confeccionados
em silcio, vidro, quartzo, metal ou fotorresiste. Esse ltimo somente pode ser adotado
quando no forem envolvidas presses e temperaturas elevadas, de modo que no haja
deformao dos microcanais.
49
O fotorresiste e termorrgido SU-8 tem sido o mais
empregado para a fabricao de moldes e isso se deve a fatores como: resistncia qumica
elevada, possibilidade de deposio de filmes espessos e alta fotossensibilidade, o que
requer menor tempo de exposio.
50

Em termos da etapa de replicao, representada genericamente na Figura 1.4, um
mtodo bastante utilizado a moldagem por litografia macia. Neste processo, so
35

S Su ub bs st tr ra at to o
S Su ub bs st tr ra at to o c co om m c ca an na al l e em m
s su ua a s su up pe er rf f c ci ie e i in nf fe er ri io or r
M Mo ol ld de e
empregados polmeros no estado lquido, de baixa viscosidade, de maneira que os mesmos
conseguem recobrir integralmente o molde ao serem despejados. Por conseguinte, neste
caso, os moldes podem ser confeccionados em fotorresistes uma vez que no so aplicadas
presses elevadas na etapa de replicao.
50

Figura 1.4. Esquema geral do processo de replicao: (A), moldagem e (B), desmoldagem.

Mais especificamente, no processo de moldagem por litografia macia, polmeros
lineares so misturados com agentes de reticulao resultando na solidificao dos
substratos. Por fim, o conjunto molde/substrato ento desmoldado com consequente
obteno dos microcanais.
48
O PDMS o material mais empregado nesse processo.
22

1.2.4. Tipos de Selagem
O processo de selagem designa a vedao entre substrato, contendo os microcanais,
e lmina de cobertura, que pode possuir composio idntica ou distinta do substrato.
22
As
(B) (A)
36

duas tcnicas principais empregadas para esse propsito so a selagem direta e a selagem
com camada intermediria.
A selagem direta envolve a aplicao de presses elevadas em ambiente de alta
temperatura, sendo utilizada em microchips de silcio/silcio, vidro/vidro, silcio/metal e
vidro/silcio.
51
Nesse processo, imprescindvel que ambas as lminas apresentem
superfcies planas (de baixa rugosidade) e estejam extremamente limpas, o que implica em
eliminar cuidadosamente todos os resduos inerentes ao processo de gravao dos canais e
operar em ambiente livre de material particulado (sala limpa). Um exemplo desse mtodo
a selagem trmica assistida por campo.
52
Nessa tcnica, a vedao conseguida mediante
contato entre as lminas por presso a temperaturas entre 200 e 500
o
C e sob a aplicao de
um campo eltrico, gerado por meio de uma fonte de corrente contnua com tenses da
ordem de 0,3 a 1 kV.
Na selagem com camada intermediria, anteriormente ao alinhamento e contato
entre as placas, uma camada de ligante (metal ou adesivo) depositada de maneira
uniforme sobre a superfcie de uma das lminas (substrato ou cobertura).
51
Esse
procedimento vem a prescindir o uso de presses e temperaturas muito elevadas. Ademais,
o mtodo referente pode ser aplicado maioria dos substratos e requer, na maioria das
vezes, condies menos severas de limpeza com relao selagem direta, tornando o
processo significativamente mais barato. A principal limitao inerente a essa tcnica a
possibilidade de obstruo dos microcanais pela prpria camada intermediria, o que exige
cuidados especiais. Exemplos de selagem com camada intermediria so as denominadas
selagens adesivas, nas quais adesivos epxi ou fotorresistes so utilizados como ligantes
intermedirios.
53

37

Os processos supracitados envolvem reaes irreversveis entre o substrato e a
cobertura. Selagens reversveis, por outro lado, podem ser obtidas atravs do emprego de
substratos elastomricos. Neste caso, a vedao decorre de interaes de van der Waals,
no resistindo aplicao de presses superiores a 30 kPa. Seguindo o mesmo
procedimento, processos de carter irreversvel podem tambm ser conseguidos pela
simples oxidao da superfcie do elastmero em plasma de O
2
.
22

1.2.5. Mtodos de Deteco Integrados a Microchips
Diversas tcnicas de deteco tm sido empregadas em microdispositivos, dentre as
quais de destacam: fluorescncia induzida a laser (LIF),
54
espectrometria de massas (MS),
55

espectrometria no ultravioleta-visvel (UV-VIS)
56
e mtodos eletroqumicos.
57
A LIF, embora
apresente alta sensibilidade, em casos determinados aplicada apenas a substncias
fluorescentes. A MS, por sua vez, requer instrumentao de alto custo e de baixa
portabilidade ao passo que em absores na regio do UV-VIS, o caminho ptico reduzido
afeta adversamente a sensibilidade analtica. As tcnicas eletroqumicas surgem ento como
alternativas em potencial por portarem caractersticas como: (i) envolvem transduo direta
do sinal eltrico gerado; (ii) requerem instrumentao de baixo custo; (iii) apresentam, em
geral, altos nveis de detectabilidade; (iv) no so destrutivas, uma vez que as duplas
camadas eltricas que se estabelecem nas superfcies dos eletrodos so negligenciveis em
relao ao volume do seio (bulk) da soluo, e (iv) apresentam maior capacidade intrnseca
de miniaturizao, haja vista a possibilidade de integrar condutores e semicondutores
superfcie de substratos,
58
conforme mostra a Figura 1.5.
Amperometria e condutometria so os mtodos eletroanalticos usualmente
empregados em microfludica.
59
Os detectores amperomtricos apresentam sensibilidade e
38

seletividade maiores, pois envolvem processos faradaicos e respondem apenas a espcies
eletroativas (embora determinaes indiretas tambm sejam possveis). Por outro lado, a
condutometria uma tcnica universal, de modo que a sua resposta diretamente
dependente da concentrao, da mobilidade efetiva e da carga de todas as espcies inicas
presentes na amostra.
60
Por essas razes, a condutometria, em especial a condutometria
sem contato, tem sido bastante utilizada como um mtodo de deteco alternativo em
microchips.
33

Figura 1.5. Microchip contendo ouro (Au) depositado sobre uma lmina de vidro.

1.3. Biossensores
1.3.1. Fundamentos
Os sensores qumicos surgiram com a finalidade de permitir a realizao de anlises
em campo. Com o advento da automatizao instrumental durante a dcada de 70, foram
ento desenvolvidos os equipamentos modernos de anlise, robustos e de fcil operao.
Nos experimentos que envolviam coleta de amostras em locais remotos, entretanto, em
muitos casos era difcil ou at mesmo impossvel transportar as substncias ao laboratrio
Au
39

sem que houvesse decomposio qumica das mesmas. Esse episdio provou ser mais
simples e conveniente conduzir o instrumento at a amostra, e no a amostra ao laboratrio
de anlise. Por conseguinte, o desenvolvimento de tcnicas analticas portteis passou a ter
grande interesse da comunidade cientfica, com o decorrente surgimento dos sensores
qumicos tal como o eletrodo de vidro para medida de pH.
61

Em 1991,
62
a Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada (IUPAC) estabeleceu
uma definio para sensores qumicos: dispositivos que convertem informao qumica,
desde a concentrao de analitos at a composio de amostras, em sinais eltricos
(corrente, potencial, condutividade etc.) analiticamente teis. A informao qumica
primria, mencionada anteriormente, pode originar-se de fenmenos qumicos, bioqumicos
ou fsicos que envolvam a espcie de interesse. Conforme a IUPAC, um sensor qumico
formado por duas unidades funcionais bsicas conectadas em srie: o receptor, que
responde a parmetros especficos e, em geral, interage com o analito (ligante)
transformando a informao qumica em uma forma de energia determinada capaz de ser
transduzida, e o transdutor, responsvel exatamente por esse processo de transduo, o
qual acarreta em sinais eltricos analiticamente teis. Os receptores podem atuar sob trs
modos bsicos, a citar: reconhecimento molecular, trmico ou estrico.
61
O primeiro envolve
fenmenos de equilbrio entre analito e receptor em reaes de catlise ou afinidade
(anticorpo/antgeno, DNA/DNA, protena/cido nuclico, protena/receptor etc.).
13
O
segundo baseia-se em reaes fora do equilbrio que geram alteraes significativas de
temperatura e, assim, podem ser transduzidas em sinais eltricos. O reconhecimento
estrico, por outro lado, um mecanismo puramente fsico, em que a biomolcula
identificada com base nas suas dimenses. Um arranjo tpico de sistema analtico contendo
fase sensora mostrado na Figura 1.6.
40

Figura 1.6. Componentes de um sistema analtico contendo sensor em interao com uma biomolcula.

A definio estabelecida pela IUPAC a sensores qumicos veio a por fim em uma srie
de divergncias que havia no meio acadmico. Enquanto que alguns pesquisadores
consideravam o termo sensor como incluindo unicamente o elemento receptor, outros
seguiam a concepo conceitual na qual receptor e transdutor eram unidades constituintes
dos sensores. Neste contexto, importante destacar que o mesmo componente pode atuar
como receptor e transdutor, concomitantemente; o caso de xidos metlicos
semicondutores, como o SnO
2
. Essa espcie tem sua condutividade alterada quando em
contato com gases redutores especficos.
61
I In nt te er rm me ed di i r ri io o d de e I Im mo ob bi il li iz za a o o
L Li ig ga an nt te e
R Re ec ce ep pt to or r
Substrato
T Tr ra an ns sd du ut to or r
C Ci ir rc cu ui it to o d de e A Am mp pl li if fi ic ca a o o
C Co om mp pu ut ta ad do or r
41

Independente da definio pr-estabelecida para o termo sensor qumico, h uma
ampla concordncia a cerca de suas caractersticas ideais. So elas: (i) resposta rpida; (ii)
baixo custo; (iii) portabilidade; (iv) operao contnua e (v) sensibilidade, (vi) especificidade,
(vii) reprodutibilidade e (viii) estabilidade elevadas.
61
Adicionalmente, a depender do
parmetro especificidade, determinado principalmente pela interao receptor/ligante,
tornam-se prescindveis etapas de preparo de amostra e separaes cromatogrficas.
De acordo com a IUPAC, os sensores qumicos so classificados conforme o princpio
de transduo.
62
Consideremos abaixo os casos principais:
Eletroqumicos - Transformam o efeito de interaes eletroqumicas entre analito e
eletrodo em sinais eltricos. Esses dispositivos envolvem as tcnicas: potenciometria,
voltametria e espectroscopia de impedncia eletroqumica (EIS), dentre outras;
Eltricos - Baseiam-se em alteraes de propriedades eltricas que ocorrem no seio da
soluo, as quais podem estar associadas mobilidade efetiva do analito bem como
verificado em sensores condutomtricos e de transistores de efeito de campo;
pticos - Convertem variaes de fenmenos pticos, como absorbncia, reflectncia,
luminescncia, fluorescncia, ndice de refrao, efeitos fototrmicos e espalhamento da
radiao, em sinais eltricos. Sensores contendo ressonncia plasmnica de superfcie (SPR),
dentre outros, figuram como sensores pticos;
Magnticos - envolvem medidas de alterao nas propriedades paramagnticas de
matrizes gasosas, como oxignio;
Termomtricos - medem o calor absorvido ou liberado por reaes qumicas ou adsores
que envolvam o analito;
Sensveis massa - transformam variaes de massa de uma dada superfcie em sinais
eltricos. Tcnicas de transduo como microbalana de cristal de quartzo (QCM) e AFM
42

integram essa modalidade de sensor. Sensores piezoeltricos apresentam um cristal de
quartzo revestido com eletrodo de Au e so utilizados como microbalanas. Sensores
baseados em AFM, por sua vez, respondem a partir de variaes na frequncia de
ressonncia de um microcantilever, sobre o qual imobilizado o elemento receptor.
Os biossensores so considerados um grupo independente de sensores qumicos.
Segundo a IUPAC em conveno preconizada no ano de 1999,
63
esses dispositivos se
caracterizam por mecanismos bioqumicos de reconhecimento da biomolcula alvo via
receptor (biorreceptor ou funo de reconhecimento). Os biossensores podem ser
empregados para monitorar matrizes biolgicas e no biolgicas. Por outro lado, sensores
que no incorporam mecanismo bioqumico de reconhecimento no podem ser designados
como biossensores, mesmo que aplicados a processos biolgicos; so exemplos os sensores
de oxignio.
61

1.3.2. Funcionalizao de Superfcie
O processo de funcionalizao consiste em modificar quimicamente a superfcie
slida de um dado substrato com receptores visando construo de sensores qumicos. As
principais tcnicas de modificao de superfcie so: (i) adsoro fsica; (ii) adsoro
eletroqumica por redissoluo; (iii) incluso em matrizes polimricas (PU, PVC etc.),
polmeros intrinsecamente condutores (polianilina), gis (hidrogis, slica gel etc.), pares
redox inorgnicos (Fe(CN)
6
3-/4-
etc.) ou pastas condutoras (pasta de carbono etc.); (iv)
formao de ligaes covalentes com grupos bifuncionais e (v) deposio de tintas
condutoras a partir da tecnologia de screen-printing, mais conhecida como silk-screen. Essa
ltima comumente substitui o mtodo de incluso em aplicaes comerciais, nas quais
tcnicas com maior capacidade de produo em massa so requeridas.
61

43

Recentemente, novas tcnicas de funcionalizao tm sido desenvolvidas e aplicadas
na construo de biossensores, a saber: imobilizao em polmeros impressos
molecularmente (MIPs)
64
e em filmes obtidos pela polimerizao por plasma (PPFs).
65
Os
MIPs so de fcil preparao, possuem estabilidades trmica e qumica elevadas e tempo de
vida prolongado em condies ambiente de temperatura e umidade. Como limitaes
principais, a tecnologia de impresso molecular requer molculas modelo (forma pura do
analito) para sntese estereoqumica dos stios de ligao, o que, em alguns casos, pode
demandar um custo considervel, e acarreta em especificidade baixa frente a espcies
estruturalmente semelhantes s molculas modelo.
66
Os MIPs ainda apresentam afinidade
inferior dos anticorpos no tocante construo de sensores qumicos.
67
Neste contexto,
estudos de modelagem molecular tm sido aplicados na seleo de monmeros funcionais
mais sensveis e especficos.
68-70
No que concerne aos PPFs, o processo de polimerizao por
plasma resulta em filmes contnuos, mecanica e quimicamente estveis e fortemente
aderidos aos substratos, um fator crtico para a reprodutibilidade do biossensor.
65

O mtodo de funcionalizao via formao de ligaes covalentes aquele que
confere maior estabilidade fase sensora. Os grupos bifuncionais mais utilizados para
modificao de superfcies com biorreceptores so: glutaraldedo (GA), carbodiimida e
monocamadas automontadas (SAMs); esses grupos so tambm conhecidos como
intermedirios ou matrizes de imobilizao.
63
As SAMs so filmes finos que se constituem de
molculas orgnicas com comprimentos em torno de dezenas de nanmetros. Esses filmes
se originam de adsores espontneas entre tensoativos e a superfcie de substratos slidos,
podendo ocorrer em soluo ou em fase gasosa. As molculas de tensoativo vizinhas
interagem entre si por foras de van der Waals, o que acarreta em camadas altamente
densas e ordenadas.
71
No entanto, algumas dessas camadas podem conter interstcios de
44

dimenses moleculares, permitindo, desse modo, que molculas sejam adsorvidas no
especificamente pela superfcie da amostra.
61
As SAMs apresentam camadas estveis e de
fcil montagem, uma vez que so formadas a partir de um processo espontneo. Tais
propriedades, aliadas ordenao e densidade de suas camadas, as tornam amplamente
atrativas para a construo de sensores qumicos.
72
Em substratos de SiO
2
,
73
dentre as SAMs mais empregadas constam as espcies
derivadas do SiH
4
, denominadas silanos, em especial o 3-aminopropil(trietoxisilano) (APTS).
Esse reagente tambm utilizado na modificao de superfcies polimricas; Howarter e
Youngblood,
74
em 2007, reportaram um estudo de caracterizao sistemtico sobre a
silanizao (reao com silano) de 14 polmeros com APTS em solventes apolares, prticos e
base de ter.

1.3.3. Biossensores como Plataformas de Anlise de Biomarcadores Tumorais
Biomarcadores
Um amplo nmero de biomarcadores est correlacionado a diferentes tipos de
cncer. Dentre esses, se destacam genes (HNPCC, FAP, BRCA etc.) e protenas (receptores
de estrgeno, progesterona etc.), incluindo molculas do sistema imunolgico (antgenos
como PSA, CA 125, CEA e CA 15-3).
6
Na Tabela 1.1 apresentada uma lista de cnceres e
seus respectivos biomarcadores,
75-77
muitos dos quais se encontram em fase de
melhoramento das suas sensibilidade e especificidade ante as aplicaes clnicas
correlacionadas.
78

Para deteco de genes e anomalias genticas, frequentemente so empregadas
reaes em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR)
79
ou reaes de
45

hibridizao,
80
que ocorrem entre duas cadeias de cidos nuclicos de fitas simples. Esses
procedimentos so lentos e no portam especificidade adequada para aplicaes clnicas, o
que vem resultando, recentemente, em um aumento considervel no uso de protenas como
biomarcadores de cncer.
6
Por outro lado, marcadores volteis tm surgido como uma nova
vertente de pesquisa nas reas de diagnstico e monitoramento tumoral. Em estudos sobre
o cncer de mama, por exemplo, alcanos, alcanos metilados e dienos conjugados tm se
mostrado marcadores com especificidade razovel.
81

Tabela 1.1 - Biomarcadores associados ao diagnstico e prognstico de cncer
Tipo de Cncer Biomarcador
Bexiga FDP, BAT, NMP22, Ha-Hase, BLCA-4, CYFRA 21-1
Colo e Pncreas CEA, CA 19-9, CA24-2, p53, HNPCC, FAP
Leucemia Anormalidades Cromossmicas
Mama
CEA, CA 125, CA 15-3, CEABRCA1, BRCA2, MUC-1, NY-BR-1,
ING-1, BRCA , Receptores de Estrgeno e Progesterona
Pele NY-ESO-1, Tirosinase
Prstata PSA, PAP
Pulmo CEA, CA 19-9, NY-ESO-1, SCC, CYFRA21-1, NSE
Ovrio CA 125, CEA, AFP, hCG, p53, BRCA

Biorreceptores
Os biorreceptores mais amplamente empregados so anticorpos, mono ou
policlonais;
82-86
glicoprotenas as quais interagem com antgenos segundo um processo
reversvel, de segunda ordem do ponto de vista cintico e com afinidade e especificidade
elevadas. Os biossensores que se baseiam em reaes anticorpo/antgeno so conhecidos
46

como imunossensores, apresentam sensibilidade elevada e podem operar sob dois modos
de medida: direto, quando uma das espcies do sistema imunolgico ativa no que
concerne ao princpio de transduo empregado, e indireto, no qual uma terceira
substncia, ativa, adicionada ao sistema. No modo indireto, geralmente so empregados
catalisadores enzimticos segundo um mtodo denominado ensaio imunoabsorvente de
ligaes enzimticas; mais conhecido como teste ELISA. Nesses testes, a enzima mais
utilizada a peroxidase, que catalisa a reao de desdobramento do H
2
O
2
em H
2
O mais O
2
.
60

A limitao principal inerente utilizao de anticorpos como biorreceptores a sua
baixa estabilidade, o que vem a representar um obstculo comercializao dos
imunossensores. Molculas sintticas desse biorreceptor tm sido desenvolvidas visando
solucionar a desvantagem mencionada.
6
Em adio, esses compostos podem ser
modificados mais facilmente e eliminam o uso de animais; empregados na obteno de
anticorpos policlonais.
Desde 2001, bibliotecas combinatoriais vm sendo implementadas como
ferramentas de auxlio na seleo de biorreceptores sintticos, como peptdeos
87,88
e
aptmeros (DNA ou RNA de cadeia nica).
89
Embora possam ser sintetizadas quimicamente
sob quantidades apreciveis, as molculas de peptdeos exibem afinidade relativamente
baixa frente analitos especficos [constante de formao (K
f
) da ordem de 10
6
a 10
7
)
quando comparadas aos anticorpos (K
f
da ordem de 10
10
).
4
Os aptmeros, os quais so
sintetizados a partir da tcnica SELEX (evoluo sistemtica de ligantes por enriquecimento
exponencial), podem ser utilizados na deteco de genes associados a processos tumorais
graas afinidade (K
f
da ordem de 10
8
a 10
9
) e especificidade (menor dos anticorpos)
elevadas do seu mecanismo de hibridizao, verificado apenas entre duas fitas de cido
nuclico precisamente complementares.
80
Tais cidos nuclicos podem tambm ser usados
47

no reconhecimento de protenas; ao contrrio do que ocorre em complexos
anticorpo/antgeno, interaes DNA/protena conduzem a um decrscimo da resistncia
transferncia de carga em EIS.
90
Isso se deve ao carter eletroativo da guanina, o que, por
outro lado, torna o DNA perfeitamente adaptvel a transdutores eletroqumicos.
91,92

Intermedirios de Imobilizao
No mbito da deteco de biomarcadores de cncer, tcnicas e compostos diferentes
so empregados para promover a adeso de biorreceptores aos substratos. So exemplos:
incluso em gis de titnia
93
e silicato organicamente modificado,
94
incluso em matriz
polimrica de quitosana-co-polianilina
65
e formao de ligaes covalentes. Neste ltimo
caso, as substncias bifuncionais seguintes podem ser empregadas: GA,
95
1-etil-3-(3-
dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)/N-Hidroxisuccinimida (NHS)
96
e SAMs constitudas
de cistamina/GA
97
e APTS.
98
Com o intento de aumentar a quantidade de compostos
bifuncionais ancorados superfcie sensora, matrizes porosas como poli(etilenoglicol)/
nafion/polipirrol
99
e filme fino de xido de irdio (IrO
x
)
100
vm sendo implementadas como
materiais suporte. Essas matrizes so geralmente imobilizadas ao substrato por evaporao
do solvente ou eletrodeposio.

Transdutores
A Tabela 1.2 lista exemplos de biossensores empregados na anlise de
biomarcadores tumorais. Transdutores eletroqumicos faradaicos so os mais amplamente
empregados junto tecnologia de biossensores, fato atribudo s vantagens intrnsecas a
esses transdutores descritas no item 1.2.5. Adicionalmente, biossensores eletroqumicos
podem ser facilmente fabricados a partir da tecnologia de silk-screen.
6
Revises recentes
sobre o uso dessas plataformas para o diagnstico de cncer foram reportadas.
116,117

48

Tabela 1.2 - Exemplos de biossensores (imunossensores) para anlise de biomarcadores de cncer

Biomarcador Intermedirio de Imobilizao

Classificao do Biossensor Referncia
CEA IrO
x
/Protena A Impedanciomtrico 100
Gel de Sefarose Quimiluminescente 101
Matriz Polimrica de Quitosana Voltamtrico de Pulso Diferencial 102
SAMs de cido 3-(aminofenil)bornico Voltamtrico de Pulso Diferencial 103
Protena A Amperomtrico 104
Poli(etilenoglicol)/GA Voltamtrico de Onda Quadrada 105
Poli(etilenoglicol)/GA Voltamtrico de Onda Quadrada 106
Oligo(etilenoglicol)-COOH/EDC/NHS Baseado em SPR 107
PSA SAMs de Calixareno Baseado em AFM 108
3-Indoxil Fosfato Voltamtrico de Varredura Linear 109
hCG SAMs de Sulfo-LC-SPDP
Piezoeltrico 110
CA 125 EDC Condutomtrico 111
Ferritina Cistamina e Cistamina/GA Piezoeltrico 112
CEA Biotina Fluorescente 113
Angiopoietina 1

APTS Baseado em AFM 114
Quinase AbI Biotina Baseado em MS 115
Em todos os casos, anticorpos especficos aos seus respectivos biomarcadores foram usados como biorreceptores.
Sulfo-LC-SPDP a sigla utilizada para o reagente: hexanoato de sulfosuccinimida 6-[3-(2-piridilditiol) propilamino].

Em sistemas analticos contendo sensores qumicos, a especificidade governada
majoritariamente pela interao receptor/ligante, de maneira que nos ltimos anos tcnicas
de transduo universais tm sido frequentemente aplicadas na anlise de biomarcadores
tumorais. So exemplos, dentre essas tcnicas: EIS, SPR, QCM e AFM.
6,76

Sistemas Miniaturizados
Em aplicaes clnicas, sistemas analticos miniaturizados no apenas acarretam em
um maior desempenho analtico, bem como so essenciais para o desenvolvimento de
dispositivos point-of-care: sistemas integrados capazes de processar amostras clnicas em
49

campo (ambulncias, consultrios, casas dos pacientes etc.) para determinao de
diferentes tipos de biomarcadores.
13

Em 2003, Kojima e colaboradores
65
desenvolveram um microchip em substrato de
vidro com biossensor voltamtrico integrado para a deteco em batelada de AFP. O
dispositivo, de dimenses 17 mm x 17 mm, apresentou canais da ordem de 30 m x 30 m.
Tsukagoshi e colaboradores,
98
em 2005, propuseram um TAS o qual incorporava
imunossensor, EOF e transduo por quimiluminescncia. O biorreceptor foi imobilizado em
um dos reservatrios de injeo, de modo que as biomolculas alvo complexadas e livres
eram separadas pelo EOF aps incubao da amostra por um tempo pr-estabelecido. O
microchip (12,5 mm x 35,0 mm) continha canais com profundidade e largura em torno de 20
e 50 m, respectivamente. Esse mtodo foi validado mediante aplicao aos complexos:
HSA/ANTI-HSA (biorreceptor) e IAP/ANTI-IAP(biorreceptor). Em 2008, Teker
118
construiu um
transistor de efeito de campo tipo-p incorporando nanotubo de carbono (CNTFET)
conjugado com anticorpo monoclonal especfico ao biomarcador IGF1R. O nanotubo foi
integrado aos eletrodos (separados por 1 a 4 m) por tcnica de auto-montagem
eletrofortica, sendo os experimentos conduzidos aplicando-se 4 L de padro/amostra
sobre o CNTFET. Choi e Chae
119
desenvolveram em 2009 um dispositivo microfludico de
vidro/PDMS baseado em SPR e reaes proticas competitivas de adsoro/dessoro, as
quais ocorriam durante a rotina de anlise prescindo, desse modo, etapas de funcionalizao
de superfcie. A partir das diferentes foras de adsoro das protenas imunoglobulina G,
fibrinognio e tiroglobulina (Tg) sobre Au (eletrodos depositados em vidro), foi possvel a
determinao em fluxo de Tg; biomarcador do cncer diferenciado da tireide (DTC). Os
canais (confeccionados em PDMS) apresentaram largura de 2,1mm, ao passo que a vazo
variou entre 5 e 10 L.min
-1
.
50

1.4. Deteco Condutomtrica Sem Contato
1.4.1. Histrico
Medidas de condutividade baseadas no isolamento eltrico dos eletrodos em relao
soluo foram introduzidas por Zahn no ano de 1928 (apud BRITO-NETO et al.).
120
Surgia
ento uma tcnica inovadora no campo da eletroqumica/eletroanaltica; a deteco
condutomtrica sem contato (CCD), conhecida tambm como deteco condutomtrica sem
contato acoplada capacitivamente (C
4
D) ou, simplesmente, deteco oscilomtrica (DO), a
qual tem representado uma alternativa deteco condutomtrica convencional (com
contato). A C
4
D foi utilizada exaustivamente nas dcadas de 60 e 70 para determinaes no
invasivas e titulaes em alta frequncia. Esforos subsequentes resultaram na
miniaturizao da cela de deteco para anlises em fluxo, permitindo, assim, o uso dessa
tcnica em cromatografia em fase lquida de alta eficincia (HPLC) e em analisadores por
injeo em fluxo (FIA).
Detectores condutomtricos sem contato foram inicialmente integrados a um
sistema analtico miniaturizado em 2001.
121
Desde ento, acoplada eletroforese capilar,
essa tcnica tem se mostrado uma ferramenta til para determinao de analitos diversos,
incluindo biomolculas e ons orgnicos e inorgnicos. O baixo custo instrumental, a alta
compatibilidade de miniaturizao, a deteco universal, a facilidade de integrao com
eletroforese capilar e demais caractersticas intrnsecas C
4
D, como isolamento eltrico dos
eletrodos e simplicidade instrumental, foram sumamente primordiais para o seu sucesso em
microfludica.
33

1.4.2. Teoria
51

E El le et tr ro od do o
Posicionamento dos Eletrodos
Em C
4
D os eletrodos so isolados da soluo eletroltica por um dieltrico, de forma
que esses eletrodos podem ser posicionados sob dois modos: no mesmo plano ou fora do
plano com relao aos microcanais. No primeiro caso, os eletrodos so fabricados por
processos que envolvem fotolitografia e deposio metlica. O modo fora do plano
apresenta maior simplicidade, pois os eletrodos podem ser confeccionados com fitas
adesivas metlicas e fixados em uma das partes constituintes do microssistema (sobre a
lmina de cobertura ou sob o substrato).
122
A Figura 1.7 apresenta as camadas que
compem um microdispositivo C
4
D contendo eletrodos fora do plano dos microcanais.

Figura 1.7. Ilustrao de um microchip C
4
D com eletrodos fixados sobre a sua lmina de cobertura.

Princpio de Transduo
Bem como ocorre na condutometria convencional, em C
4
D h a ausncia de corrente
faradaica de maneira que o sistema eletrodo/dieltrico/soluo apresenta comportamento
similar ao de um capacitor de placas paralelas, entretanto com capacitncia dependente do
potencial aplicado.
123
Neste contexto, os eletrodos formam capacitores planares com a
soluo eletroltica bem como mostra a Figura 1.8, na qual esto presentes os seguintes
T Ta am mp pa a c co om m c ca an na ai is s e em m
s su ua a s su up pe er rf f c ci ie e i in nf fe er ri io or r
B Ba as se e
52

elementos: resistncia associada ao fluido eletroltico (R
s
), dois capacitores referentes aos
sistemas eletrodo/soluo (C
1
e C
2
) e um terceiro capacitor relacionado capacitncia de
fuga (C
o
), a qual decorre do acoplamento capacitivo direto entre os eletrodos.
124
Esse
fenmeno atrai uma parcela (i
o
) do fluxo de carga proveniente de e
r
(i), reduzindo a corrente
eltrica que se direciona ao detector (i
d
) e, assim, afetando adversamente o desempenho
analtico, sendo: i
d
= i - i
o
. Em linhas gerais, a C
4
D consiste na aplicao de um sinal alternado
de alta frequncia a um dos eletrodos na cela de deteco (eletrodo de excitao, e
exc
), o
qual gera a polarizao dos centros de carga do dieltrico. Esse fenmeno induz uma carga
na soluo eletroltica mediante a formao de uma diferena de potencial interfacial. Na
regio do segundo eletrodo (eletrodo receptor, e
r
), ocorre um processo anlogo ao
supracitado, com induo de corrente eltrica em e
r
.
120
Essa corrente encontra-se
relacionada diretamente concentrao e condutncia dos ons presentes em soluo.

Figura 1.8. Modelo eltrico referente ao sistema de deteco C
4
D. A, aplicao de sinal alternado de alta
frequncia sobre e
exc
e B, aquisio, amplificao e armazenamento do sinal analtico.

O sinal analtico em C
4
D est associado aos acoplamentos capacitivos que se
estabelecem entre as duplas camadas de capacitncia da soluo e os eletrodos, fenmenos
C C
2 2
C C
o o
A A

B B

R R
S S
e e
e ex xc c e e
r r
C C
1 1
D Di ie el l t tr ri ic co o

F Fl lu ui id do o

i i

i i
d d
i i
o o +

+

+

+

-

-

-

-

D Di ip po ol lo o d do o
d di ie el l t tr ri ic co o

53

os quais dependem diretamente da constante dieltrica da camada isolante dos eletrodos. A
constante dieltrica de um material expressa a capacidade de polarizao de seus centros de
carga, para a qual imposta uma resistncia em funo do efeito de assimetria de carga
conforme ilustra a Figura 1.9(A).
60
Esse efeito consequncia do alinhamento gradual das
densidades de carga dos dipolos do dieltrico com relao ao campo eltrico externo e
tende a reduzir a mobilidade desses dipolos, inibindo o processo de polarizao. Por outro
lado, o fenmeno de polarizao intrnseco ao dieltrico gera um campo eltrico (
D
) oposto
ao campo do sistema eletrodo/dieltrico/soluo (
S
) que, por sua vez, se ope ao processo
de carregamento desse sistema como mostra a Figura 1.9(B). Por conseguinte, uma maior
constante dieltrica vem a resultar em um menor valor de
S
, promovendo um aumento na
capacitncia (C) e, logo, da condutncia (L) referente ao acoplamento capacitivo entre
eletrodo e soluo (ver abaixo a relao matemtica entre L e C).
125

Figura 1.9. Efeito de assimetria de carga originando a resistncia dieltrica (A) e acoplamento capacitivo
eletrodo/dieltrico/soluo em C
4
D (B). q+ e q-, cargas consequentes da assimetria de carga; , densidade de
carga e
I
,
A
e
R
, mobilidades ideal, decorrente do efeito de assimetria e resultante, respectivamente.

E El le et tr ro od do o


S So ol lu u o o


(A) (B)
54

No mbito matemtico, L varia diretamente com os parmetros: rea dos eletrodos
(A), distncia entre eletrodo e soluo (d), concentrao (c
i
), carga (z
i
) e mobilidade efetiva
(u
i
) das espcies inicas presentes na amostra como demonstra a Equao 1.1:
60

L = F.(A/d).c
i
z
i
u
i
(1.1)

em que F a constante de Faraday. Conforme apresentado anteriormente, em C
4
D o
sistema eletrodo/soluo exibe comportamento similar a de um capacitor de placas
paralelas (ver Figura 1.8). Em microdispositivos contendo C
4
D, a espessura do dieltrico
(usualmente menor que 50 m) pequena o suficiente a ponto de podermos negligenciar os
efeitos de borda do campo eltrico. Assim, esse campo ser constante por todo o volume de
deteco. Nessas circunstncias, aplicando-se a lei de Gauss encontramos:
125

C =
o
A/d (1.2)

sendo
o
a constante de permissividade (8,85 pF.m
-1
). Adicionalmente, na presena de
dieltricos entre eletrodo e soluo C aumenta segundo um fator de proporcionalidade , a
constante dieltrica.
Substituindo (1.2) em (1.1):

L = FC/
o
.c
i
z
i
u
i
(1.3)

A Equao (1.3) mostra a dependncia entre resposta analtica em C
4
D (L) e capacitncia (C).

Sinal Alternado
55

A aplicao de um sinal alternado de alta frequncia, em geral com ondas
senoidais,
126
visa anulao do fluxo de difuso (J
D
) das espcies inicas presentes na
soluo, de maneira que a condutividade esteja correlacionada diretamente com o fluxo de
migrao dessas espcies. Nessas condies, as partculas oscilam em torno de uma dada
posio mdia, no gerando gradiente de concentrao resultante (c) com consequente
ausncia de transporte difusional conforme a primeira lei de Fick,
60
apresentada a seguir:

J
D
= D . c (Equao 1.4)

em que D representa o coeficiente de difuso da espcie.

Frequncia e Espessura do Dieltrico
Os capacitores formados em C
4
D caracterizam-se por uma impedncia (X
C
), tambm
denominada reatncia capacitiva, a qual inversamente dependente da frequncia (f) do
sinal de excitao, contudo aumenta com a espessura da camada de isolamento dos
eletrodos (d) como apresentado na Equao 1.2.
122
Dessa maneira, em sendo aplicados
sinais de alta frequncia e utilizadas camadas de isolamento no muito espessas (h uma
reduo de aproximadamente 75 % do sinal analtico quando d elevado de 125 a 425
m),
33
a impedncia imposta ao fluxo de carga no interior dos microcanais ser pequena o
suficiente para que as variaes de condutividade sejam mensurveis.

X
C
= d/2f
e
c
A (Equao 1.5)

sendo
e
e
c
as permissividades eltricas do eletrodo e da camada de isolamento,
respectivamente.
56

Condutncia e Concentrao
O parmetro u
i
diminui com a viscosidade da soluo () segundo a relao
matemtica:
60

u
i
= |z
i
|e/6r
i
(Equao 1.6)

cujas constantes envolvidas representam a carga elementar (e) e o raio inico da partcula
considerada (r
i
).
Substituindo (1.6) em (1.1), temos:

L = FeA
e
/6d . c
i
z
i
2
/r
i
(Equao 1.7)

Considerando-se um dado analito i e desde que A, d, e mantenha-se constante, L ir variar
linearmente em funo da concentrao desse composto (c
i
) como se segue:

L = k
.c
i
(Equao 1.8)

em que temos:

k
= FeAz
i
2
/6dr
i
= Faz
i
u
i
/d (Equao 1.9)

1.4.3. Vantagens em Relao Condutometria Convencional
Sistemas C
4
D conferem vantagens significativas em relao condutometria
convencional. So exemplos o uso de micro/nanocanais sem perda significativa da
sensibilidade e a ausncia de inconvenientes relacionados ao contato eletrodo/soluo,
quais sejam: passivao, degradao e formao de bolhas na superfcie dos eletrodos.
Adicionalmente, o no contato entre eletrodo e soluo eletroltica vem a permitir o uso de
uma ampla variedade de substratos para microfabricao e prescindir a etapa de limpeza

LIMA, R. S.; SEGATO, T. P.; GOBBI, A. L.; COLTRO, W. K. T.; CARRILHO, E. Dielectric Layer Doping: A New Alternative for Increasing Sensibility of
Contactless Conductivity Detection in Microchips. A ser submetido ao peridico Analytical Chemistry, 2010. 57

dos eletrodos; usualmente uma etapa lenta, que exige o uso de reagentes adicionais
anlise e que pode interferir no desempenho analtico.
127

1.4.4. Tendncias
Aplicaes a amostras biolgicas so bastante promissoras, bem como a
comercializao de microssistemas C
4
D destinados a esse propsito. No mbito terico,
necessrio aprofundar nossos conhecimentos sobre os fatores que governam a resposta
analtica desses detectores. Adicionalmente, modificaes na geometria e configurao dos
eletrodos devem ser implementadas de modo a solucionar aquele que figura como o fator
limitante principal da C
4
D: seu baixo nvel de detectabilidade. Dentre as alternativas j
propostas objetivando melhorias na sensibilidade dessa tcnica, temos: sinais de excitao
de alta tenso (centenas de volts); plano-terra para reduo de C
o
, a qual proveniente do
acoplamento capacitivo direto entre os eletrodos;
57
eletrodos semicirculares;
128
novos
materiais como dieltrico;
129
geometrias distintas para cela de deteco,
130
deteco
condutomtrica hbrida (HCD),
131
em que e
exc
mantido em contato com a soluo
eletroltica, e dopagem da camada dieltrica com TiO
2
(em fase de elaborao).

1.5. Objetivo Geral
O objetivo geral deste projeto desenvolver um sistema microfludico integrando
biossensor condutomtrico sem contato para anlise de interaes biomoleculares (BIA-
C
4
D) contendo o biorreceptor FA. Pretende-se, assim, a construo de uma nova alternativa
para a anlise do biomarcador de cncer FR-.

Microfabricao do BIA-C
4
D
CAPTULO 2 | | Microfabricao do BIA-C
4
D
59

As etapas principais para microfabricao do BIA-C
4
D, as quais sero abordadas a
seguir, so: (i) confeco dos microcanais em PDMS; (ii) deposio dos eletrodos sobre vidro;
(iii) isolamento eltrico desses eletrodos com filme de SiO
2
; (iv) construo da fase
biossensora sobre SiO
2
e (v) selagem PDMS/SiO
2
/vidro. Todas as etapas supracitadas foram
realizadas nos Laboratrios de Microfabricao (LMF) e Filmes Finos (LFF), ambos instalados
no Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron (LNLS, Campinas-SP). Na Figura 2.1 so
apresentadas as camadas constituintes do microdispositivo.

Figura 2.1. Camadas constituintes do BIA-C
4
D. C, canal e E, eletrodo.

2.1. Confeco dos Microcanais
Os microcanais foram confeccionados em PDMS empregando-se moldagem por
litografia macia. O molde consistiu de estruturas em alto relevo do fotorresiste negativo SU-
8 impressas sobre uma placa circular de vidro (5,0 cm de dimetro). Para sua fabricao, o
fotorresiste (Clariant Corporation) foi depositado por spinner (Headway Research Inc., mod.
EC101DT) a uma velocidade de 1.000 rpm e tempo de 30 s, resultando em uma espessura
aproximada de 40 m. A etapa de pr-cura do SU-8 foi feita em chapa aquecedora (Tecnal,
P PD DM MS S

S Si iO O
2 2
V Vi id dr ro o
E E

C

4
D

Fotoplotagem de layers em fotolito realizada pela empresa DGM Design, Curitiba-PR. 60

mod. TE-038) sob trs ciclos, quais sejam: 65C por 5 min, 95C por 15 min e 65C por 5 min.
Em seguida, o fotorresiste foi exposto radiao UV durante 55 s utilizando-se uma
fotoalinhadora da Karl Suss America Inc., mod. MJB 3 UV 200 (radiao com potncia de 10
mW.cm
-2
), e mscara impressa em fotolito
com configurao e dimenses conforme

discrimina a Figura 2.2. Posteriormente, foram conduzidas as etapas de ps-cura (sob os
mesmos ciclos da pr-cura) e revelao do SU-8 em soluo de 1-metxi-2-acetato 98 %
(MicroChem Corporation) durante 1 min sob agitao; aps lavagem com isopropanol
(Labsynth), obteve-se estrutura em alto-relevo (ver Figura 1.3) contendo largura igual a 250
m e altura em torno de 50 m, segundo dados obtidos por um perfilmetro da Veeco, mod.
dektak 3ST.

Figura 2.2. Layout para construo do molde vidro/SU-8.

Para a etapa de replicao, monmeros de PDMS (Sylgard 184 Elastomer) foram
misturados a um agente de cura especfico (Sylgard 184 Elastomer) na proporo 10:1
(m/m). Visando remover bolhas, a mistura foi mantida por 40 min em dessecador de vidro
(Hexasystens) adaptado a uma bomba de vcuo (Tecnal, Mod. TE-058). Em seguida, o
substrato foi despejado sobre o molde (foram usadas estruturas metlicas para delimitar a
rea de disperso do oligmero e peas de acrlico com vista a alinhar mangueiras de
4
D
61

silicone para acesso aos reservatrios), procedendo-se a polimerizao em chapa
aquecedora a uma temperatura de 100C e tempo de 45 min. Uma vez que o PDMS
apresenta baixa energia de superfcie e carter elastomrico, o substrato contendo os
microcanais pde ser desmoldado facilmente sem danificao do molde (ver Figura 1.4).
Na Figura 2.3 ilustrada uma foto da camada de PDMS incorporando os microcanais
(localizados em sua superfcie inferior), os quais apresentaram 250 m de largura e 50 m de
profundidade, e mangueiras de silicone contendo 1,0 mm de dimetro interno.

Figura 2.3. Camada de PDMS contendo canais (C) e tubos de silicone (T) para acesso aos reservatrios.

2.2. Fabricao dos Eletrodos
Os eletrodos foram fabricados em substrato de vidro usando os processos de
fotolitografia e deposio metlica via sputtering. A etapa fotolitogrfica visou-se
construo de uma mscara em fotorresiste positivo AZ 4210 (Clariant Corporation) para o
subsequente processo de deposio dos metais.
O fotorresiste foi depositado sobre uma placa de vidro de dimenses 6,2 cm x 6,2 cm
(Glass Tcnica) por spinner a 3.000 rpm durante 30 s, gerando uma espessura aproximada de
2,4 m. A pr-cura foi feita a 90C por 10 min em chapa aquecedora, seguida do processo
T

C

4
D

fotolitogrfico o qual perdurou por 55 s sendo utilizada mscara em fotolito
contendo
layout tal como mostra a Figura 2.4. A etapa de ps-cura do fotorresiste foi procedida sob a
mesma condio de sua pr-cura. Por fim, as partes solveis do AZ 4210 foram removidas
usando-se borato de potssio (MicroChem Corporation) 33% em gua (v/v) por 1 min sob
agitao (ver Figura 1.3). A lavagem foi feita com gua deionizada (Milli-Q, obtida com
resistividade maior que 17 Mcm). Os eletrodos apresentaram espaamento e largura
iguais a 1,0 mm e configurao antiparalela, tendo por objetivo reduzir os efeitos de C
o
; suas
extremidades excederam em 5,0 mm com relao ao centro da placa de vidro visando
facilitar o alinhamento da lmina de PDMS na etapa de selagem.

Figura 2.4. Layout para deposio dos metais por sputtering.

Realizada a fotogravao em fotorresiste positivo, procedeu-se a remoo de
resduos orgnicos em plasma de O
2
(Plasma Technology Inc., mod. PE 80); os valores de
potncia, presso e tempo foram de 100 W, 50 mTorr e 5 min, respectivamente. Em seguida,
foram realizadas deposies sequenciais dos metais Ti/Au/Ti por sputtering (Oerlikon
Balzers, mod. BA510, com sistema de bombeamento criognico), os quais apresentaram,
respectivamente, as espessuras: 20, 100 e 5 nm. Adotamos os parmetros seguintes:
presso inicial de 20 nBar, presso parcial de Ar igual a 4 Bar e tempo de pr-sputtering
4
D
63

equivalente a 2 min. As camadas de Ti tiveram por finalidade conferir aderncia dos
eletrodos ao vidro e SiO
2
(dieltrico depositado posteriormente para isolamento desses
eletrodos), dado que o Au exibe aderncia baixa frente a tais materiais.
41
A etapa de lift-off
foi feita em acetona (Labsynth).

2.3. Isolamento Eltrico dos Eletrodos
Para isolamento dos eletrodos, um filme fino de SiO
2
foi depositado por processo
qumico em fase vapor assistido por plasma (PECVD) sobre a placa de vidro. Foi utilizado um
equipamento da Vacutec, mod. VPS1500. Nesse processo, os gases SiH
4
e N
2
O so expostos
a um campo de radiofrequncia do qual resultam os radicais Si e O, que reagem entre si
formando camada(s) de SiO
2
. Abaixo, segue a reao global associada ao processo referente:

SiH
4
(g) + 2N
2
O(g) SiO
2
(s) + 2N
2
(g) + 2H
2
(g) (Reao 2.1)

Os gases reagentes SiH
4
(diludo em He 2%) e N
2
O foram introduzidos na cmara reacional
com vazes de 150 e 70 cm
3
.min
-1
, respectivamente, a uma presso de 1 Torr e temperatura
igual a 350
o
C. No interior do reator, o campo de radiofrequncia foi aplicado sob uma
potncia de 20 W e 13,56 MHz de frequncia. Com base em medidas perfilomtricas, o
dieltrico apresentou espessura em torno de 50 nm.
importante ressaltar que os xidos depositados em fase vapor apresentam maior
uniformidade quando comparados aos compostos crescidos termica ou quimicamente, o
que vem a representar uma vantagem no que concerne ao seu uso como substrato em fases
sensoras. O xido metlico formado a partir de reaes qumicas em fase vapor exibe baixo
4
D
64

grau de hidratao, prevenindo a formao de espcies protonadas (NH
3
+
no caso do APTS)
as quais resultam de interaes com o grupo OH presente na superfcie do substrato. Essas
espcies propiciam a ocorrncia de polimerizaes e/ou oligomerizaes homogneas (no
seio da soluo) com consequente depsito de aglomerados coloidais sobre o substrato,
inibindo a formao de camadas moleculares organizadas e reduzindo a reprodutibilidade
do processo de modificao de superfcie.
132
Na Figura 2.5, ilustrada uma foto da placa de vidro contendo os eletrodos. De modo
a permitir a conexo eltrica do transdutor instrumentao utilizada, as extremidades dos
eletrodos foram expostas a solues de HF (Mallinckrodt Baker Inc.), 10% (v/v) em gua, por
cerca de 20 s com vista a remover as camadas de SiO
2
e Ti, que apresentam condutividades
inferiores ao Au (mantido para conexes eltricas).

Figura 2.5. Placa de vidro com eletrodos depositados por sputtering.

2.4. Construo da Fase Biossensora
Neste projeto, so utilizados trs eletrodos (ver Figura 2.5); alm de e
exc
, atravs do
qual aplicado o sinal alternado (neste trabalho, foram utilizados sinais com onda senoidal)
de alta frequncia, h dois eletrodos receptores (eletrodo receptor de referncia, e
rr
, e
4
D
65

eletrodo receptor de trabalho, e
wr
) os quais so responsveis pela transduo das
informaes qumicas primrias em sinais eltricos. A funcionalizao com FA ocorreu
somente na regio da superfcie de SiO
2
localizada sobre e
wr
. Na Figura 2.6 so
apre150sentados os posicionamentos dos eletrodos e da fase biossensora no interior do
microcanal.

Figura 2.6. Diagrama esquemtico do interior do microcanal na regio do transdutor.

Visando delimitar a regio de construo da fase biossensora, uma membrana PDMS
(120 m de espessura) foi dispersa em SiO
2
por spinner a 1.000 rpm durante 10 s; a etapa de
cura foi realizada a 90
o
C por 5 min. Tal membrana no foi previamente oxidada em plasma
de O
2
de maneira a proporcionar uma interao SiO
2
/PDMS reversvel. Esse procedimento
garantiu a completa remoo do polmero aps as reaes de superfcie, evitando etapas
adicionais para limpeza do substrato.

Modificao com Intermedirio de Imobilizao
Estudos de caracterizao de superfcie (Captulo 5) conduziram ao uso de SAMs do
silano APTS (APTS-SAM), 3% (v/v) em etanol, como intermedirios de imobilizao das
P PD DM MS S

V Vi id dr ro o

e e
r rr r
e e
e ew wr r
e e
e ex xc c
F FR R- -
F FA A

I In nt te er rm me ed di i r ri io o

F Fl lu ui id do o

S Si iO O
2 2
4
D
66

molculas de FA. O APTS apresenta em sua estrutura trs grupos etxi (OCH
2
CH
3
); espcies
lbeis que sofrem reaes de substituio nucleoflica de segunda ordem do ponto de vista
cintico. A gua figura como um dos nuclefilos possveis, gerando grupos silanis (SiOH)
por reao de hidrlise os quais sofrem posterior condensao em superfcies de xidos
metlicos segundo uma reao denominada sililao ou silanizao, conforme mostra a
Figura 2.7.
73,133
Esse mecanismo ocorre de forma majoritria na presena de solventes no
anidros (como o caso do etanol, acetonitrila e acetona), ao passo que em solventes anidros
grupos OH presentes na superfcie hidratada do xido atuam como nuclefilos ante aos
grupos etxi do silano resultando na reao de silanizao.
74

Figura 2.7. Formao de APTS-SAM sobre superfcie de SiO
2
em solventes anidros.

Funcionalizao com Biorreceptor
O APTS apresenta em uma de suas extremidades o grupo organofuncional NH
2
, a
partir do qual o silano liga-se ao FA como ilustra a Figura 2.8. O principal obstculo referente
modificao de superfcies via ligaes covalentes est relacionado a uma possvel perda
da atividade biolgica dos biorreceptores, que decorre de impedimentos estricos do
componente bioativo desses compostos. Contudo, estudos mostram que quando a ligao
APTS/FA ocorre via o grupo carboxila do C
desse ltimo, o grupo NH

2
da 6-metilpterina
Si
NH
2
OC
2
H
5
OC
2
H
5
H
5
C
2
O
(- H
2
O)
Condensao
(+ H
2
O/- EtOH)
Hidrlise
S Si iO O
2 2
A AP PT TS S
OH

OH

OH

Si
NH
2
OC
2
H
5
OH
H
5
C
2
O
OH

OH

O

Si
NH
2
OC
2
H
5
H
5
C
2
O
4
D
67

(espcie bioativa do FA) mantm-se livre para interao com ligantes especficos como os
FRs-.
134

Si
NH
OC
2
H
5
O
H
5
C
2
O
N
N
OH
N
N CH
3
NH
2
H
2
N
CONH CH
COOH
C
2
H
4
C OO

Figura 2.8. Ligaes SiO
2
/APTS/FA.

Seguimos protocolo experimental semelhante ao relatado por Bhalerao e
colaboradores para funcionalizao com FA.
20
Brevemente, um excesso de FA
(aproximadamente 515 mg) foi dissolvido em DMSO (50 mL) a temperaturas entre 40 e 45
o
C.
A essa mistura, foram adicionados os catalisadores piridina (515 mL) e N,N-
diciclohexilcarbodiimida (DCC) (412 mL). DCC funciona como um agente reticulante
heterobifuncional entre o grupo amino do silano e o carbono C
do FA. Todos os reagentes

utilizados para funcionalizao com FA foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical Co.
Finalmente, a superfcie de SiO
2
silanizada foi incubada na soluo de FA mediante um
tempo de 3 h sob 40 a 45
o
C, empregando-se um ultrassom da Unique Group, mod. 1450. As
etapas de limpeza e secagem do substrato se deram, respectivamente, em etanol e fluxo de
N
2
.
S Si iO O
2 2
A AP PT TS S
F FA A

2
4
D
Confeccionados na Oficina Mecnica do IQSC/USP. 68

Consideraes Gerais
Todas as reaes de superfcie foram realizadas em ambiente fechado com relao
vizinhana, evitando possveis contaminaes do meio reacional e interferncias da radiao
externa sobre os processos de silanizao. Para tal, foram utilizados reatores de teflon
, os
quais consistiram de tampa e base. Os reatores, bem como todas as vidrarias utilizadas,
foram limpos utilizando-se soluo piranha [H
2
SO
4
(Quemis)/H
2
O
2
(Shynth) 3:1, v/v] por 30
min e gua deionizada em abundncia. Adicionalmente, a secagem de reatores e vidrarias
em fluxo de N
2
foi imprescindvel; pois a presena de gua em excesso no meio reacional
durante as silanizaes pode acarretar em hidrlises homogneas. Tais reaes possibilitam
a ocorrncia de polimerizaes e/ou oligomerizaes, o que inibe a formao de camadas
moleculares organizadas e reduz a reprodutibilidade do processo de modificao de
superfcie conforme supracitado.
74,135

2.5. Selagem
A etapa de selagem consistiu em integrar as lminas: vidro/eletrodos/SiO
2
/fase
biossensora e PDMS/microcanais/mangueiras de silicone. Neste projeto, empregamos
bombeamento com presso positiva para movimentao dos microfluidos, o que redundou
na necessidade de uma selagem irreversvel de modo a evitar possveis vazamentos nos
microcanais. Para isso, previamente ao contato entre as lminas, a superfcie de PDMS foi
exposta a um processo oxidativo em plasma de O
2
(condies iguais s descritas no item 2.2)
durante um perodo de 12 s. Nessas condies, so gerados grupos silanis que passam a
estabelecer ligaes covalentes com o Si.
22
Uma foto do BIA-C
4
D apresentada na Figura
2.9.
4
D
69

Figura 2.9. Foto do BIA-C
4
D. S, substrato de PDMS contendo canais e mangueiras de silicone, e V, vidro
incorporando eletrodos, filme fino de SiO
2
e fase biossensora.
S

V

Ferramentas e Rotina de Anlise
CAPTULO 3 | | Ferramentas, Rotina de Anlise e Tratamento Estatstico dos Dados
71

3.1. Instrumentao e Software
Em linhas gerais, a instrumentao analtica empregada constitui-se de quatro
componentes: (i) gerador de sinal alternado; (ii) transdutor condutomtrico sem contato,
incluindo os circuitos de aquisio e amplificao eltrica; (iii) bombas-seringa para
bombeamento hidrodinmico dos fluidos e (iv) computador para armazenamento e
manipulao dos dados gerados durante os experimentos. Na Figura 3.1 mostrada uma
foto contemplando os componentes que integram o sistema de anlise.

Figura 3.1. Instrumentao analtica suporte ao BIA-C
4
D. G, gerador de sinal; B, bomba-seringa; S
A
e S
B
,
seringas contendo amostra e tampo, respectivamente; T, mangueira de teflon (adaptada ao tubo de silicone
presente no chip); F, fonte de alimentao; C, caixa de Al com microdispositivo e circuito de recepo [ver
Figura 3.2(A)]; A, circuito de amplificao de sinais em caixa de Al e D, descarte.

O sinal de excitao para o circuito oscilomtrico foi aplicado a partir de um gerador
de funes da Minipa, mod. MFG 4202. Para o bombeamento dos fluidos, foram utilizadas
bombas-seringas da SyringePump, mod. NE 300. Em termos do transdutor, foi empregado
um circuito eletrnico similar ao desenvolvido por Fracassi da Silva e do Lago.
136
Para a
aquisio dos dados gerados pelo BIA-C
4
D, foram empregados uma interface da National
Instruments e software programado em ambiente LabView
(detalhes sobre hardware e

software descritos na referncia 122).

72

3.2. Rotina de Anlise
Na Figura 3.2 so ilustrados uma foto do porta-amostra, contendo o microdispositivo
e o circuito de recepo, diagramas de fluxo e exemplos de resposta obtidos pelo BIA-C
4
D.
O transdutor C
4
D sensvel a perturbaes fsicas externas que venham a interferir no
campo eltrico estabelecido pelos eletrodos; dessa maneira, o porta-amostra foi isolado do
meio externo utilizando-se uma caixa de Al. O BIA-C
4
D possuiu dois canais de entrada (para
amostra e tampo) e um de sada (para descarte) [Figura 3.2(A)], sendo amostra e tampo
transportados hidrodinamicamente por bombas-seringa. Monitoramos as variaes de
condutncia em tempo real sob um regime de anlise em fluxo, baseado na simples
comutao entre as bombas. A princpio, uma vez preenchidos os microcanais, a soluo
tampo bombeada por tempo necessrio para a estabilizao do sinal (aproximadamente
2 min). Em seguida, inicia-se a aquisio de potencial registrado pelos eletrodos receptores
[Figura 3.2(B)]. Decorridos alguns segundos, a amostra bombeada gerando alterao de
sinal em ambos os eletrodos [Figura 3.2(C)]. Aps as interaes biomoleculares alcanarem
o equilbrio, adiciona-se tampo em condies tais que possibilitem a regenerao da fase
biossensora [Figura 3.2(D)], acarretando em reduo gradual da resposta analtica
praticamente ao seu valor inicial. O sinal de e
rr
(S
r
) est correlacionado com a concentrao e
a condutncia da soluo eletroltica, enquanto que a resposta de e
wr
(S
w
) tambm se
encontra intimamente associada s interaes biorreceptor/ligante. Segundo estudos
realizados por EIS,
122
observa-se um aumento na capacitncia do sistema e
wr
/SiO
2
/soluo
na presena de macromolculas ancoradas ao dieltrico, o que vem a redundar em uma
elevao de S
w
[Figura 3.2(E)]. Em tais condies, a diferena S
w
- S
r
passa a estar relacionada
diretamente s interaes biomoleculares, representando o sinal analtico em BIA-C
4
D
[Figura 3.2(F)] (no Captulo 4 apresentada uma hiptese sobre o princpio de transduo).
73

As respostas analticas em C
4
D e BIA-C
4
D foram estimadas mediante o clculo da altura de
potencial mdia registrada previamente ao trmino da etapa de amostragem.

Figura 3.2. Foto do porta-amostra (A), diagramas de fluxo (B-D) e sinais analticos tpicos (E,F). J, jacars para
conexes eltricas; R, circuito de recepo de sinais; b, fase biossensora e S
r
e S
w
, respostas obtidas por e
rr
e
e
wr
, respectivamente.
0 10 20 30 40
6
3
0
-3
-6
(C) (D) (B)
S
i
n
a
i
s

A
n
a
l
t
i
c
o
s

(
V
)
S
w
S
r
Tempo (segundos)
0 10 20 30 40
6
3
0
-3
-6
(C) (D) (B)
S
i
n
a
l

e
m

B
I
A
-
C
4
D

(
V
)
Tempo (segundos)
S
w
- S
r
(E) (F)
(C) (D)
(A) (B)
b

e
wr
e
rr
e
exc

-
-
-
-

Estudos de Sensibilidade do Detector
CAPTULO 4 | | Estudo de Sensibilidade do Detector
75

Alteraes na natureza do dieltrico e na configurao e geometria dos eletrodos
foram avaliadas visando uma melhoria nos nveis de detectabilidade do transdutor. Nesta
etapa do projeto, os microchips no apresentaram fase biossensora, sendo apenas um dos
eletrodos receptores utilizados durante os experimentos de condutncia envolvendo
padres de um eletrlito determinado. A anlise estatstica dos dados foi realizada a partir
de uma planilha de validao desenvolvida por Ribeiro e colaboradores,
137
disponvel no
endereo: lqta.iqm.unicamp.br. Nessa planilha, os limites de deteco (LOD) e quantificao
(LOQ) so calculados com base em parmetros da curva de calibrao a 95,0, 99,0 e 99,9%
de confiana. Esse mtodo apresenta maior confiabilidade estatstica quando comparado s
demais tcnicas (visual e da relao sinal/rudo), pois no se relaciona a fatores qualitativos,
mas ao intervalo de confiana da regresso. Como estimativas da preciso e da sensibilidade
intrnsecas ao microdispositivos, consideramos o desvio padro relativo (RSD) e os valores
de LOD e LOQ, respectivamente.
Para construo das curvas de calibrao, foram realizadas sete medidas para cada
nvel de concentrao, sendo adotado o mtodo dos mnimos quadrados (MMQ) para
obteno das retas de regresso. Por conseguinte, os padres foram preparados com rigor
analtico de modo que os erros associados s suas concentraes (erros sistemticos) fossem
desprezveis em relao aos erros decorrentes das flutuaes dos sinais (erros aleatrios).
Adicionalmente, as solues padro foram preparadas de forma semelhante em cada nvel
de concentrao, tendo por finalidade evitar varincias sistemticas as quais
comprometeriam a hiptese da varincia constante (homocedasticidade) ao longo de toda a
faixa de trabalho. Por fim, os sinais analticos foram medidos segundo uma ordem no
sistemtica visando-se, assim, a no-correlao entre os erros aleatrios.
137,138
Todos os
fatores de correlao das curvas analticas (R
2
) foram inferiores a 1,0, implicando que
76

parcelas determinadas das variaes totais dos dados em torno das mdias no foram
explicadas pelos modelos de calibrao. Dado que essas parcelas podem afetar
adversamente o ajuste das curvas analticas, estudos adicionais foram efetuados de maneira
a avaliar a adequao do modelo linear s retas de regresso, quais sejam, anlise de
resduos e teste F de linearidade. A anlise do grfico de resduos permite detectar
problemas no ajuste da curva, como: desvios da linearidade, presena de amostras atpicas,
heterocedastidade (varincia no constante) e correlao entre os erros. Uma curva bem
ajustada dever apresentar erros homocedsticos, com distribuio uniforme e mdia zero.
O teste F, por sua vez, baseia-se na comparao entre os resduos do ajuste linear e do
ajuste quadrtico. O modelo de regresso mais adequado aquele que resultar em um
menor valor para a soma quadrtica dos resduos.
137

4.1. Microdispositivos
Microssistemas contendo C
4
D foram fabricados utilizando-se dois isolantes eltricos
dos eletrodos: filme de SiO
2
(C
4
D
SIO2
), depositado por PECVD, e membrana de PDMS
(C
4
D
PDMS
), depositada por spinner. Em ambos os casos, foram empregadas celas de deteco
de dimenses idnticas, descritas no CAPTULO 2. No que concerne deposio de PDMS,
monmeros do polmero e seu agente de cura foram dispersos sobre vidro por spinner a
1.000 rpm durante 10 s e, em seguida, curados a 90C em chapa aquecedora por 5 min. Esse
processo resultou em uma camada com espessura aproximada de 50 m.
Posteriormente aos estudos envolvendo os dieltricos SiO
2
e PDMS, configuraes e
geometrias distintas do transdutor foram avaliadas, a saber: cela de deteco reportada no
CAPTULO 2 seletiva a medidas de (i) C
4
D e (ii) HCD, e (iii) cela C
4
D alternativa, segundo as


dimenses e geometria propostas por Kuba e Hauser em estudos recentes (C
4
D
alt
).
130
Todos
esses microdispositivos apresentaram filme de SiO
2
como dieltrico. Na Figura 4.1 so
ilustrados os microssistemas contendo HCD e C
4
D
alt
.

Figura 4.1. Microchips HCD (A) e C
4
D
alt
(B). S, substrato de PDMS contendo canais e mangueiras de silicone, e V,
vidro incorporando eletrodos e filme fino de SiO
2
.

O modo de transduo hbrida [Figura 4.1(A)] foi estudado objetivando uma reduo
na resistncia ao acoplamento capacitivo e
exc
/soluo. Para fabricao do microssistema
incorporando HCD, uma pequena regio localizada sobre e
exc
foi exposta a HF, 10% (v/v) em
gua, por cerca de 20 s para remover as camadas de SiO
2
e Ti, mantendo-se o Au. Em
sequncia, durante a etapa de selagem, o PDMS foi alinhado ao vidro de forma a posicionar
o canal sobre a regio supracitada, estabelecendo-se, assim, um acoplamento capacitivo
direto entre o metal Au e os fluidos eletrolticos. O fotorresiste AZ 4210 foi empregado para
limitar a ao corrosiva sobre a rea do metal selecionada. No que concerne C
4
D
alt
[Figura
4.1(B)], adotada a fim de se reduzir os efeitos de C
o
, os eletrodos consistiram dos materiais
Ti/Pt/Ti; a natureza do material condutor no afeta a resposta obtida em C
4
D.
122
Na Figura 4.2 mostrado o layout da mscara em fotolito
usada para deposio dos

metais. Os eletrodos exibiram espaamento de 0,6 mm entre si e suas extremidades,
interconectadas por linhas (0,2 mm de largura) inclinadas a um ngulo de 45
o
na regio do
S

V

S

V

(A)

(B)
Au
78

microcanal, foram separadas por 10 mm de comprimento. As dimenses reduzidas dos
eletrodos na zona de transduo (1,0 mm x 1,0 mm) dificultaram o alinhamento da lmina
de PDMS com relao ao vidro durante a etapa de selagem, o que requereu o uso de uma
lupa eletrnica (Coleman) com vista a ampliar a regio.

Figura 4.2. Layout para deposio dos metais por sputtering em C
4
D
alt
. Os pads localizados no centro da
mscara apresentaram espaamento de 0,6 mm e dimenses iguais a 1,0 x 1,0 mm.

4.2. Natureza do Dieltrico: Experimental, Resultados e Discusso
Medidas a padres de LiClO
4
(Sigma-Aldrich Chemical Co) com os chips C
4
D
SIO2
e
C
4
D
PDMS
foram realizadas a fim de obter um estudo comparativo entre os dieltricos SiO
2
e
PDMS (gua deionizada foi usada como branco). Foram adotadas as condies
experimentais seguintes: 400 kHz; 2,5 V
P-P
; vazo de 100 L.min
-1
para H
2
O e amostra e
tempo de amostragem em 15 s. A partir dos dados de RSD, dispostos na Tabela 4.1, conclui-
se que os dispositivos apresentaram preciso interensaio (medidas a um nico chip)
satisfatria; os sinais foram homocedsticos em toda a faixa de trabalho. A Figura 4.3
corresponde s respostas e curvas de calibrao obtidas para C
4
D
SiO2
e C
4
D
PDMS
. O grfico de
resduos e o teste de linearidade validaram o ajuste linear para os modelos de calibrao. Os
valores de LOD e LOQ so discriminados na Tabela 4.2.
79

Tabela 4.1 - Valores de RSD (%) para a faixa de trabalho adotada
Nvel (C
4
D
SiO2
, mol.L
-1
) SiO
2
(dieltrico) Nvel (C
4
D
PDMS
, mmol.L
-1
) PDMS (dieltrico)

25 3,76 1,0 3,90
50 3,32 2,5 3,55
75 3,44 4,0 2,25
100 3,78 5,5 3,77

Figura 4.3. Sinais e curvas analticas correspondentes aos microssistemas C
4
D
SiO2
(A,B) e C
4
D
PDMS
(C,D).
Condies experimentais: 400 kHz, 2,5 V
P-P
, vazo de 100 L.min
-1
para H
2
O e amostra e tempo de amostragem
em 15 s.

0 10 20 30 40
0
-1
-2
LiClO
4
H
2
O H
2
O
100 mol.L
-1
75
50
25
Tempo (segundos)
S
i
n
a
l

C
4
D

(
V
)
20 40 60 80 100
0
1
2
S
i
n
a
l

C
4
D

(
V
)
Concentrao ( mol.L
-1
)
Inclinao = 0,015
R
2
= 0,9952
0 10 20 30 40 50 60
1
2
3
4
5
S
i
n
a
l

C
4
D

(
V
)
Tempo (segundos)
8,0 mmol.L
-1
6,0
4,0
2,0
LiClO
4
H
2
O H
2
O
1 2 3 4 5 6
0
1
2
3
Concentrao (mmol.L
-1
)
S
i
n
a
l

C
4
D

(
V
)
R
2
= 0,9988
Inclinao = 0,516
(A)
(C)
(B)
(D)
80

Tabela 4.2 - Valores de LOD e LOQ estimados para 95,0, 99,0 e 99,9% de confiana

LOD (mol.L
-1
)

LOQ (mol.L
-1
)

95,0% 9,0% 99,9% 95,0% 99,0% 99,9%
C
4
D
SiO2
8,51 11,60 15,77 12,87 14,55 16,81
C
4
D
PDMS
640,00 870,00 1.170,00 950,00 1.070,00 1.230,00

O microchip C
4
D
SiO2
exibiu nveis de detectabilidade consideravelmente inferiores
queles registrados para C
4
D
PDMS
. Esses sistemas diferiram entre si somente em termos da
natureza e espessura do dieltrico. SiO
2
e PDMS possuem valores de similares (em torno
de 2,5),
139,140
de maneira que a diferena de sensibilidade observada deve-se,
presumivelmente, menor espessura do filme de SiO
2
(50 nm para SiO
2
e 50 m para
PDMS). Isso acarreta em reduo da resistncia dieltrica imposta ao acoplamento
capacitivo eletrodo/soluo.
Os dados expressos na Tabela 4.2 confirmam a relevncia da espessura do dieltrico
sobre a sensibilidade em C
4
D. Neste contexto, o uso de um filme de SiO
2
com 50 nm de
espessura para isolamento dos eletrodos representa uma vantagem substancial frente aos
microchips que incorporam C
4
D citados na literatura. Nesses, a distncia eletrodo/soluo
apresenta usualmente valores de 40 m, para eletrodos semicirculares no mesmo plano, e
100 m, para eletrodos planares fora do plano.

4.3. Configuraes do Transdutor: Experimental, Resultados e Discusso
Para esse estudo, adotamos condies experimentas idnticas quelas citadas no
item 4.2, com tempo de amostragem de 20 s. Os valores de RSD, calculados para padres de
NH
4
Cl (Labsynth) e expressos na Tabela 4.3, evidenciaram uma preciso interensaio
satisfatria para os microdispositivos (gua deionizada foi usada como branco). Para 150
81

mol.L
-1
de eletrlito, houve saturao da resposta obtida por C
4
D
alt
; a janela de potenciais
considerada pelo software de aquisio de sinais foi igual a 10 V. Ademais, as respostas
analticas inerentes aos transdutores C
4
D e HCD apresentaram-se homocedsticas ao longo
da faixa de trabalho (exceto em 150 mol.L
-1
para C
4
D), enquanto que em C
4
D
alt
a varincia
aumentou gradualmente com a reduo nos nveis de concentrao.

Tabela 4.3 - Valores de RSD (%) para a faixa de trabalho adotada
Nvel (mol.L
-1
) C
4
D C
4
D
alt
HCD

50 3,86 6,47 3,40
75 3,48 3,09 2,23
100 3,68 2,44 2,42
125

3,37

1,44

2,71

150 1,61 - 3,95

A Figura 4.4 corresponde aos sinais analticos e suas respectivas curvas de calibrao
obtidas para os trs transdutores. O grfico de resduos e o teste de linearidade validaram o
ajuste linear para os modelos de calibrao. Os valores de LOD e LOQ, por sua vez, so
apresentados na Tabela 4.4. Embora a C
4
D
alt
tenha exibido os menores limites de
detectabilidade, seguida da HCD, observa-se que as alteraes na configurao e geometria
da cela condutomtrica sem contato no resultaram em um aumento estatisticamente
efetivo da sensibilidade a nveis de significncia de 95,0, 99,0 e 99,9%. Conclui-se, logo, que
a geometria da cela de deteco adotada em C
4
D
alt
no reduziu de forma eficiente o
acoplamento capacitivo direto entre os eletrodos (C
0
). Para o caso da deteco hbrida,
propomos uma base terica fundamentada em leis da fsica eltrica de modo a explicar os
resultados ocorrentes.
82

Figura 4.4. Sinais e curvas analticas obtidos para os microdispositivos contendo C
4
D (A,B), C
4
D
alt
(C,D) e HCD
(E,F). Condies experimentais: 400 kHz, 2,5 V
P-P
e vazo de 100 L.min
-1
para H
2
O e amostra.

Tabela 4.4 - Valores de LOD e LOQ estimados para 95,0, 99,0 e 99,9 % de confiana

LOD (mol.L
-1
)

LOQ (mol.L
-1
)

95,0% 99,0% 99,9% 95,0% 99,0% 99,9%
C
4
D 18,33 24,68 36,09 27,95 31,49 65,73
0 10 20 30 40
6
4
2
0
-2
-4
-
-
100
S
i
n
a
l

C
4
D

(
V
)
NH
4
Cl H
2
O H
2
O
50
75
125
Tempo (segundos)
150 mol.L
-1
-
40 60 80 100 120 140 160
2
4
6
8
10
S
i
n
a
l

C
4
D

(
V
)
Concentrao ( mol.L
-1
)
Inclinao = 0,042
R
2
= 0,9996
0 10 20 30 40
6
3
0
-3
-6
-
NH
4
Cl H
2
O H
2
O
S
i
n
a
l

C
4
D
a
l
t

(
V
)
125 mol.L
-1
100
75
Tempo (segundos)
50
-
40 60 80 100 120 140
4
6
8
10
Concentrao ( mol.L
-1
)
S
i
n
a
l

C
4
D

(
V
)
Inclinao = 0,063
R
2
= 0,9994
0 10 20 30 40
6
4
2
0
-2
NH
4
Cl H
2
O H
2
O
S
i
n
a
l

H
C
D

(
V
)
Tempo (segundos)
125
150 mol.L
-1
100
75
50
-
-
-
40 60 80 100 120 140 160
2
4
6
8
10
Concentrao ( mol.L
-1
)
S
i
n
a
l

C
4
D

(
V
)
R
2
= 0,9985
Inclinao = 0,040
(E)
(F)
(A)
(B)
(C)
(D)
83

Tabela 4.4 - Valores de LOD e LOQ estimados para 95,0, 99,0 e 99,9 % de confiana (Continua)

LOD (mol.L
-1
)

LOQ (mol.L
-1
)

95,0% 99,0% 99,9% 95,0% 99,0% 99,9%
C
4
D
alt
14,05 18,96 27,41 21,46 24,04 41,94
HCD 16,02 21,60 30,79 24,02 26,97 49,98

Em HCD, as capacitncias referentes aos sistemas e
exc
/soluo (C
exc
) e e
r
/SiO
2
/soluo
(C
r
) so dadas pelas equaes:
125

C
exc
=
o
A
e
/d (Equao 4.1)

e
C
r
=
Slica
o
A
e
/d (Equao 4.2)

sendo
slica
igual a 4,2 considerando-se o processo de deposio do dieltrico utilizado.
139

Em relao aos demais parmetros, C
exc
e C
r
diferem entre si apenas em termos de d;
enquanto que para o sistema e
r
/SiO
2
/soluo esse valor equivale a 50 nm, para o conjunto
e
exc
/soluo d tende a zero. Como consequncia, temos que C
exc
infinitamente superior a
C
r
. Por outro lado, considerando-se o modelo eltrico que descreve o sistema de transduo
(ver Figura 1.8), as capacitncias associadas aos eletrodos se combinam em srie. Por
conseguinte, a capacitncia equivalente (C
eq
) dada pela equao:
125

C
eq
= C
exc
. C
r
/( C
exc
+ C
r
) (Equao 4.3)

Em sendo C
exc
infinitamente superior a C
r
, obtm-se:

C
eq
C
r
(Equao 4.4)
84

de modo que em HCD a capacitncia equivalente relacionada aos sistemas eletrodo/soluo
uma funo somente de C
r
, varivel intrnseca regio: e
r
/SiO
2
/soluo. Fato semelhante
observado em celas eletroqumicas contendo microeletrodos polarizados ideais imersos em
eletrlito suporte. Nesses casos, em consequncia da maior rea do eletrodo de referncia,
a capacitncia intrnseca a esse eletrodo infinitamente superior quela inerente ao
eletrodo de trabalho.
123
Por fim, a Equao 4.4, aliada ao fato de que as celas de deteco
seletivas C
4
D e HCD no diferiram entre si em termos dos parmetros intervenientes em
C
r
, justificam os resultados ocorrentes, ilustrados na Tabela 4.4.

4.4. Concluses
O protocolo de microfabricao mostrou-se efetivo, sem ocorrncia de vazamento de
fluidos ou obstruo dos canais. O uso de filme de SiO
2
como dieltrico em C
4
D redundou
em nveis de detectabilidade apreciavelmente menores com relao aos valores obtidos
empregando-se membrana de PDMS, sendo pois utilizado nos experimentos subsequentes.
Em relao s alteraes na configurao e geometria da cela de deteco, essas no
resultaram em aumento significativo da sensibilidade a nveis de significncia de 95,0, 99,0 e
99,9%. Neste contexto, para os estudos de interaes biomoleculares, foram utilizados
microchips contendo C
4
D convencional, haja vista que esse transdutor apresenta maior
facilidade de selagem com relao C
4
D
alt
e prescinde a etapa de limpeza dos eletrodos, ao
contrrio do que ocorre em HCD.

Estudo das Condies de Silanizao
CAPTULO 5 | | Estudo das Condies de Silanizao
86

As condies reacionais adotadas para modificao qumica (silanizao) com o
intermedirio de imobilizao foram investigadas mediante um processo de caracterizao
de superfcies, no qual empregamos as tcnicas: microscopia eletrnica de varredura (MEV)
e espectroscopia de fotoeltrons excitados por raios-X (XPS).

5.1. Prembulo
As condies de silanizao investigadas so compiladas na Tabela 5.1.

Tabela 5.1 - Condies reacionais para silanizao de SiO
2
estudadas
Condio Silano Concentrao Fase Solvente Tempo de Reao (min)

SAM A.1 ButCN 1 mmol.L
-1
Acetonitrila 15
-1
Acetonitrila 30
-1
Acetonitrila 60
-1
Acetonitrila 150
-1
Acetonitrila 300
SAM B.1 APTS 1 mmol.L
-1
Acetona 60
-1
Acetona 120
-1
Acetona 180
SAM C.1 APTS 3% (v/v) Etanol 180
SAM C.2 APTS 3% (v/v) Etanol 300

As reaes de superfcie foram conduzidas empregando-se os reagentes 4-
(trietoxisilil)butironitrila (ButCN) (Sigma-Aldrich Chemical Co) e APTS, solventes anidros e
tempos que variaram entre 15 e 300 min. Os organossilanos ButCN e APTS tendem a formar
SAMs sobre a superfcie de SiO
2
, de maneira que concentraes e tempos reacionais
excessivos contribuem para a ocorrncia de dois fenmenos: (i) hidrlises seguidas de
87

condensaes homogneas de grupos silanis, que levam formao de oligmeros e/ou
polmeros e sua posterior adsoro sobre a superfcie do substrato, e (ii) polimerizaes
heterogneas, verticais ou horizontais, que decorrem de condensaes entre grupos silanis
do prprio reagente conforme ilustra a Figura 5.1. Ambos os fenmenos geram superfcies
mais porosas, com camadas de silano altamente desordenadas (aglomerados), inibindo a
formao de SAMs. Concentraes e tempos de reao muito baixos, por outro lado,
acarretam em reduo da rea de recobrimento efetivo do substrato pelo organossilano. Em
adio, uma vez que a gua presente nos solventes pode atuar como nuclefilo na etapa de
hidrlise, essas substncias tambm interferem no grau de adsoro dos reagentes.
73

Si
O
H
5
C
2
O
O
Si
OC
2
H
5
O
H
2
N
Si
OC
2
H
5
O
H
2
N
NH
2

Figura 5.1. Produto de polimerizaes verticais envolvendo molculas de APTS.

Os compostos ButCN e APTS diferem entre si apenas em termos dos seus respectivos
grupos organofuncionais, nitrila (CN) e NH
2
, respectivamente. Desse modo, ligaes
ButCN/FA somente so conseguidas aps converso do grupo CN do organossilano em
NH
2
. A escolha do ButCN como possvel matriz para modificao com FA est relacionada
menor reatividade da espcie CN frente ao grupo amino, o que vem a representar,
teoricamente, uma menor possibilidade de alteraes qumicas no especficas do stio ativo
do intermedirio de imobilizao.
88

5.2. Experimental
Como substratos para as subsequentes reaes de silanizao, filmes de SiO
2
foram
depositados por PECVD sobre placas de Si(100) de 1 cm
2
empregando-se o mesmo
equipamento e as mesmas condies adotadas para o isolamento eltrico dos eletrodos. Os
procedimentos de limpeza e modificao de superfcie foram realizados conforme descritos
no item 2.4. Na Figura 5.2 so mostrados o reator de teflon, utilizado para as silanizaes
(6,5 cm de dimetro interno e 4,2 cm de profundidade), e uma placa de Si(100) contendo
SiO
2
imersa em soluo de APTS.

Figura 5.2. Reator utilizado para modificaes qumicas e substrato imerso em soluo de silano.

As anlises de MEV foram realizadas em um equipamento da Zeiss, mod. LEO 440,
disponvel na Central de Anlises Qumicas Instrumentais do Instituto de Qumica de So
Carlos da Universidade de So Paulo (CAQI/IQSC/USP). Esse instrumento opera com
filamento terminico de tungstnio, cmara da amostra em alto vcuo com presso de 10
-5

Bar e detector de eltrons secundrios como modo analtico. Para promover aumento no
contraste das micrografias, as amostras foram inicialmente metalizadas com Au em um
sputter da Bal-Tec, mod. MCS 010. As medidas de XPS, por sua vez, foram feitas no Centro
T Ta am mp pa a
89

de Caracterizao e Desenvolvimento de Materiais, instalado no Departamento de
Engenharia de Materiais da Universidade Federal de So Carlos (CCDM/DEM/UFSCar), para
as quais empregamos um espectromicroscpio de superfcies da Kratos, mod. XSAM HS. Os
experimentos foram conduzidos em ambiente de ultra-alto vcuo (presso em torno de 7,5
nTorr) e utilizando-se radiao no-monocromtica K do Mg como fonte excitadora, com
energia de 1.253,6 eV e potncia de 50 W. Para subtrao do sinal de fundo, utilizou-se o
mtodo de Shirley.

5.3. MEV: Resultados e Discusso
As micrografias eletrnicas de varredura tiveram por finalidade registrar a possvel
formao de aglomerados, como mostra a Figura 5.3. Nessa figura so ilustradas
micrografias de uma superfcie de SiO
2
modificada com o reagente 3-imidazolilundecil-
trimetoxissilano.
141
Tais imagens demonstram a formao de filmes porosos, contendo poros
com tamanho mdio de 5 a 10 m e dispersos por toda a superfcie, os quais, possivelmente,
so consequncias de condensaes homogneas ou polimerizaes heterogneas,
conforme discutido anteriormente.
Micrografias com aumentos de 2.000, 10.000 e 30.000 vezes foram obtidas em
quatro pontos distintos e aleatrios para cada amostra. A nveis de resoluo de 3 m, 1 m
e 200 nm, as imagens indicaram no haver formao de aglomerados sob todas as condies
de reao investigadas. Nas Figuras 5.4, 5.5 e 5.6, so apresentadas micrografias referentes
s silanizaes com SAM A.3, B.2 e C.2, respectivamente.

90

Figura 5.3. Micrografias do 3-imidazolilundeciltrimetoxissilano formado a partir de solues de tolueno sobre
SiO
2
por 150 min com 200 (A), 1.000 (B) (registrada para regio R
1
) e 5.000 (C) (registrada para regio R
2
) vezes
de aumento. Imagens reproduzidas da referncia 141.
R
1
R
2
(A)

(B)

(C)

5,0 m

20,0 m

100,0 m

91

Figura 5.4. Micrografias obtidas para SAM A.3 com 2.000 (A), 10.000 (B) (registrada para regio R
1
) e 30.000 (C)
(registrada para regio R
2
) vezes de aumento.
R
2
R
1
(A)

(B)

(C)

15,0 m

2,0 m

600,0 nm

CAPTULO 5

Figura
(registrada para regio
APTULO 5 | | Estudo das Condies de Silanizao
Figura 5.5. Micrografias
(registrada para regio
(A)
(B)
(C)
Micrografias obtidas para SAM
2
) vezes de aumento
(A)

(B)

(C)

obtidas para SAM B.2
) vezes de aumento.
R
2

B.2 com 2.000 (A)
.
(A), 10.000 (B) (B) (registrada para regio
R
1
15,0 m
2,0 m
600,0 nm

1
) e 30.000
5,0 m

,0 m

nm

92
) e 30.000 (C)
92

93

Figura 5.6. Micrografias obtidas para SAM C.2 com 2.000 (A), 10.000 (B) (registrada para regio R
1
) e 30.000 (C)
2
) vezes de aumento.

R
2
R
1
(A)

(B)

(C)

15,0 m

2,0 m

600,0 nm

94

5.4. XPS: Resultados e Discusso
A tcnica de XPS foi utilizada para determinaes qualitativas e quantitativas sobre as
composies qumicas das superfcies modificadas com organossilano, como o grau de
contaminao dos substratos obtidos por PECVD e a taxa de adsoro dos reagentes.
Em substratos no condutores como SiO
2
pode ocorrer carregamento da amostra
devido ao efeito fotoeltrico, fenmeno no qual se baseia a tcnica de XPS. Nesses casos,
so formadas lacunas as quais geram um potencial eletrosttico maior sobre os fotoeltrons
vizinhos, resultando em deslocamentos homogneos das linhas espectrais em at 3 eV para
maiores valores de energia de ligao (E
L
). Paralelamente, o efeito de carregamento pode
conduzir a um alargamento dos picos e ligeira assimetria na regio de menor E
L
, o que vm a
afetar adversamente a resoluo das medidas.
142

Para correo de E
L
em decorrncia do carregamento das amostras, utilizou-se a
linha Si 2p de SiO
2
(E
L
terica igual a 103,3 eV) como referncia uma vez que sofre pouca
influncia em relao ao ambiente qumico do xido.
143
Para todas as condies reacionais
investigadas, no foram observados deslocamentos sendo a energia de ligao obtida para a
linha supracitada concordante com o valor terico. Presumivelmente, quatro fatores
principais contriburam para esse fenmeno, a saber: (i) flood-gun (acessrio neutralizador
de cargas do equipamento); (ii) radiao fonte no-monocromtica; (iii) constituio
apresentada pelas amostras (filme de silano sobre SiO
2
) e (iv) posicionamento das placas de
Si/SiO
2
em relao ao feixe incidente de raios-X. O flood-gun consiste de um dispositivo de
injeo de eltrons e ons Ag
+
sobre a superfcie da amostra; visa-se, assim, a neutralizao
das lacunas e do excesso de carga negativa decorrente dos eltrons injetados pelo acessrio,
respectivamente.
143
O emprego de radiaes no-monocromticas contribui para a
neutralizao da amostra em funo do fluxo de eltrons de baixa energia que emana da
95

fonte de raios-X e consequente da ionizao causada pela linha k do feixe. A constituio
apresentada pelas amostras tambm acarreta em neutralizao parcial das lacunas
presentes no substrato. Nesse caso, o processo se d a partir de eltrons secundrios
oriundos do dieltrico SiO
2
. Por fim, as placas de Si(100)/SiO
2
foram posicionadas a um
ngulo de 90
o
em relao ao feixe incidente de radiao com vista a reduzir os nveis de
polarizao.
144
Embora no houve deslocamentos espectrais, fez-se necessria a realizao de
ajustes das curvas devido baixa resoluo experimental dos espectros (1,2 eV 0,1 eV).
Tais ajustes, que tiveram por finalidade auxiliar na interpretao e caracterizao dos picos
espectrais, foram feitos com o software Winspec, cedido gentilmente pelo Laboratoire
Interdisciplinaire de Spectroscopie lectronique, instalado na Facults Universitaires Notre-
Dame de la Paix (LISE/FUNDP). As concentraes atmicas percentuais obtidas para as linhas
N 1s, Si 2p, O 1s e C 1s so expostas na Tabela 5.2. As anlises semi-quantitativas exibiram
preciso igual a +15 %. Nas Figuras 5.7 a 5.16, so discriminados os espectros exploratrios e
linhas de fotoemisso especficas (N 1s, Si 2p, O 1s e C 1s) registrados para os reagentes
ButCN e APTS. Visando correlacionar os picos ajustados aos tomos constituintes das
amostras, foram utilizados valores de E
L
referenciais descritos na literatura.
135,145-148

Tabela 5.2 - Concentraes atmicas percentuais
Condio N 1s Si 2p O 1s C 1s

SAM A.1 0,0 8,4 17,1 74,5
SAM A.2 1,6 26,7 55,7 16,1
SAM A3 1,4 27,7 59,1 11,8
SAM A.4 1,3 29,1 60,4 9,1
SAM A.5 1,5 27,7 58,9 11,9
96

Tabela 5.2 - Concentraes atmicas percentuais (Continua)
Condio N 1s Si 2p O 1s C 1s

SAM B.1 1,6 27,1 53,0 18,4
SAM B.2 1,6 28,1 53,4 17,0
SAM B3 1,7 28,4 56,3 13,6
SAM C.1 2,0 21,3 49,4 27,3
SAM C.2

2,2 21,6 48,3 27,9
97

2
modificada com SAM A.1. Para cada componente, so informados o valor de E
L
0 100 200 300 400 500 600
O 2s
Si 2p
Si 2s
C 1s
O 1s
Energia de Ligao (eV)
280 282 284 286 288 290 292
5000
10000
15000
20000
25000
C=O (288,2 eV/4,5 %)
C-OH, C-O-C ou C-N
(286,3 eV/13,3 %)
C-H ou C-C (284,3 eV/82,2 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico C 1s
528 530 532 534 536 538
1400
2100
2800
3500
4200
4900
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico O 1s
O-C=O (534,0 eV/
11,2 %)
SiO
2
(532,3 eV/88,8 %)
98 100 102 104 106 108 110
400
600
800
1000
1200
1400
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Si
3
N
4
(101,8 eV/7,4 %)
SiO
2
(103,3 eV/92,6 %)
Pico Si 2p
98

2
L
0 100 200 300 400 500 600
O 2s
O 1s
N 1s
C 1s
Si 2s
Si 2p
528 530 532 534 536 538
1000
2000
3000
4000
5000
O-C=O (534,0 eV/
12,2 %)
SiO
2
(532,4 eV/87,8 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico O 1s
98 100 102 104 106 108 110
700
1400
2100
2800
3500
X (104,8 eV/14,1 %)
Si
3
N
4
(101,8 eV/
0,7 %)
SiO
2
(103,3 eV/85,2 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico Si 2p
393 396 399 402 405
3300
3600
3900
4200
Pico N 1s
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
N-C (400,5 eV
/15,3 %)
NO
2
_
(403,1 eV/14,6 %)
Si
3
N
4
(398,6 eV/70,1 %)
99

2
L
0 100 200 300 400 500 600
O 2s
N 1s
C 1s
O 1s
Si 2s
Si 2p
528 530 532 534 536 538
700
1400
2100
2800
3500
4200
O-C=O (533,8 eV/
10,9 %)
SiO
2
(532,4 eV/89,1 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico O 1s
98 100 102 104 106 108 110
700
1400
2100
2800
X (104,8 eV/14,4 %)
Si
3
N
4
(102,1 eV/
5,8 %)
SiO
2
(103,3 eV/79,8 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico Si 2p
393 396 399 402 405
3750
4000
4250
4500
NO
2
_
(403,1 eV/16,5 %)
N-C (400,5 eV/24,6 %)
Si
3
N
4
(398,7 eV/58,9 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
100

2
modificada com SAM A.4. Para cada componente, so mostrados o valor de E
L
0 100 200 300 400 500 600
O 2s
Si 2p
Si 2s
C 1s
N 1s
O 1s
528 530 532 534 536 538
750
1500
2250
3000
3750
4500
O-C=O (534,0 eV/
18,0 %)
SiO
2
(532,4 eV/82,0 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico O 1s
98 100 102 104 106 108 110
700
1400
2100
2800
3500
4200
X (104,7 eV/21,0 %)
SiO
2
(103,3 eV/79,0 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico Si 2p
393 396 399 402 405
6800
7200
7600
8000
8400
NO
2
_
(403,1 eV/18,8 %)
N-C (400,3 eV/17,3 %)
Si
3
N
4
(398,4 eV/63,9 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico N 1s
N 1s
101

2
modificada com SAM A.5. Para cada componente, so mostrados o valor de E
L
0 100 200 300 400 500 600
O 2s
Si 2p
Si 2s
C 1s
N 1s
O 1s
528 530 532 534 536 538
750
1500
2250
3000
3750
4500
O-C=O (534,0 eV/
10,7 %)
SiO
2
(532,4 eV/89,3 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico O 1s
98 100 102 104 106 108 110
800
1600
2400
3200
4000
4800
Si
3
N
4
(102,1 eV
/5,4 %)
X (104,9 eV/14,5 %)
SiO
2
(103,3 eV/80,1 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico Si 2p
393 396 399 402 405
5100
5400
5700
6000
6300
NO
2
_
(403,0 eV/17,3 %)
N-C (400,2 eV/24,5 %)
Si
3
N
4
(398,4 eV/58,2 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico N 1s
102

2
modificada com SAM B.1. Para cada componente, so mostrados o valor de E
L
0 100 200 300 400 500 600
O 2s
Si 2p
Si 2s
C 1s
N 1s
O 1s
528 530 532 534 536 538
1500
3000
4500
6000
7500
O-C=O (534,1eV/
9,1 %)
SiO
2
(532,4 eV/90,9 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico O 1s
98 100 102 104 106 108 110
1200
2400
3600
4800
6000
X (105,0 eV/11,4 %)
SiO
2
(103,3 eV/88,6 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico Si 2p
393 396 399 402 405
3900
4200
4500
4800
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
NO
2
_
(403,2 eV/10,0 %)
N-C (400,4 eV/23,6 %)
Si
3
N
4
(398,5 eV/66,4 %)
Pico N 1s
103

2
L
0 100 200 300 400 500 600
O 2s
Si 2p
Si 2s
C 1s
N 1s
O 1s
528 530 532 534 536 538
1500
3000
4500
6000
7500
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
O-C=O (534,2 eV/
13,3 %)
SiO
2
(532,4 eV/86,7 %)
Pico O 1s
98 100 102 104 106 108 110
1200
2400
3600
4800
6000
Si
3
N
4
(101,7 eV/
1,4 %)
X (105,0 eV/17,7 %)
SiO
2
(103,3 eV/80,9 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico Si 2p
393 396 399 402 405
4550
4900
5250
5600
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico N 1s
NO
2
_
(402,9 eV
/12,9 %)
N-C (400,4 eV ; 23,3 %)
Si
3
N
4
(398,6 eV ; 63,8 %)
N 1s
104

2
L
0 100 200 300 400 500 600
O 2s
Si 2p
Si 2s
C 1s
N 1s
O 1s
528 530 532 534 536 538
2100
4200
6300
8400
10500
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
O-C=O (534,3 eV
/16,2 %)
SiO
2
(532,4 eV/83,8 %)
Pico O 1s
98 100 102 104 106 108 110
1500
3000
4500
6000
7500
X (105,0 eV/18,6 %)
Si
3
N
4
(101,7 eV/
1,4 %)
SiO
2
(103,3 eV/80,0 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico Si 2p
393 396 399 402 405
5600
6000
6400
6800
7200
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
NO
2
_
(403,2 eV/13,1 %)
N-C (400,4 eV/24,9 %)
Si
3
N
4
(398,6 eV/62,0 %)
Pico N 1s
105

2
modificada com SAM C.1. Para cada componente, so mostrados o valor de E
L
0 100 200 300 400 500 600
Si 2p
O 2s
Si 2s
C 1s
N 1s
O 1s
528 530 532 534 536 538
1400
2800
4200
5600
7000
SiO
2
(532,6 eV)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico O 1s
98 100 102 104 106 108 110
1400
2800
4200
5600
7000
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico Si 2p
SiO
2
(103,3 eV)
393 396 399 402 405
6120
6460
6800
7140
7480
Pico N 1s
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
NH
3
+
(402,0 eV/15,2 %)
N-C (400,2 eV/53,4 %)
Si
3
N
4
(398,8 eV/31,4 %)
106

2
modificada com SAM C.2. Para cada componente, so mostrados o valor de E
L
0 100 200 300 400 500 600
Si 2p
O 2s
Si 2s
C 1s
N 1s
O 1s
528 530 532 534 536 538
1400
2800
4200
5600
7000
SiO
2
(532,5 eV)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico O 1s
99 102 105 108
1300
2600
3900
5200
6500
SiO
2
(103,3 eV)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Pico Si 2p
393 396 399 402 405
6000
6400
6800
7200
7600
Pico N 1s
NH
3
+
(401,7 eV/14,3 %)
SI
3
N
4
(398,8 eV/27,3 %)
N-C (400,2 eV/53,4 %)
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
107

Com base nos dados de concentrao atmica e espectros de XPS, nota-se que a
amostra modificada com SAM A.1 apresentou uma quantidade excessiva de carbono. Uma
explicao para o fato ocorrido est relacionada manuteno da amostra durante 18 dias
na cmara de insero (pr-cmara) do espectromicroscpio, o que pode ter induzido sua
contaminao pelo vapor do leo da bomba de difuso. Os picos N 1s apresentaram forma
de linha assimtrica, sendo ajustados com trs componentes dois dos quais representam as
espcies: N-C (400,2 a 400,5 eV), que veio a confirmar a adsoro dos organossilanos pelo
xido SiO
2
, e Si
3
N
4
(398,4 a 398,8 eV). Para os substratos modificados com SAMs A e B, fez-se
presente a espcie NO
2
-
(402,9 a 403,2 eV), ao passo que as superfcie imersas em SAMs C
exibiram um componente relacionado ao on NH
3
+
(401,7 a 402,0 eV), resultado de
interaes entre os grupos SiOH e NH
2
do organossilano.
135
A presena de Si
3
N
4
e NO
2
-

atribuda ao processo de deposio do dieltrico por PECVD, que gera nitrognio como
produto das reaes em plasma (ver Reao 2.1). Adicionalmente, algumas linhas Si 2p
obtidas para SAMs A e B caracterizaram traos de nitreto metlico (Si
3
N
4
) em 101,7 a 102,1
eV. Nesses mesmos picos, por fim, fez-se presente uma espcie (X) em 104,7 a 105,0 eV, cuja
identidade qumica ainda desconhecida requerendo maiores estudos na literatura para sua
elucidao.
A partir dos dados de ajuste dos espectros de XPS, foi possvel calcular as razes
atmicas N(1s)
NC
/Si(2p)
SiO2
, sendo considerados os componentes NC (caracterizam as
adsores dos reagentes) e SiO
2
(inerente natureza do substrato). Os valores dessas razes
permitiram avaliar a eficincia das taxas de adsoro dos organossilanos, aps clculo
utilizando-se a Equao 5.1.

N(1s)
NC
/Si(2p)
SiO2
= A
p
[N(1s)
NC
]/A
p
[Si(2p)
SiO2
] . [Si(2p)
SiO2
]/ [N(1s)
NC
] .
[Si(2p)
SiO2
]/ [N(1s)
NC
] (Equao 5.1)
108

em que A
p
representa a rea integrada de pico (proporcional ao nmero de tomos no
volume analisado), a seo de choque de fotoionizao e o percurso livre mdio para as
linhas de fotoemisso citadas entre colchetes. Esse parmetro foi determinado como se
segue:

i
= [49/E
Ci
2
+ 0,11(E
Ci
)
1/2
]/
SiO2
(Equao 5.2)

sendo E
Ci
a energia cintica de pico e
SiO2
a densidade do substrato SiO
2
.
135
Na Figura 5.17
so mostradas as relaes percentuais N(1s)
NC
/Si(2p)
SiO2
.

Figura 5.17. Relaes N/Si para as condies de silanizao investigadas.

A partir dos resultados expostos na Figura 5.17, verifica-se que a relao N/Si se
manteve aproximadamente constante para as SAMs A e B aps 1 (A.3) e 2 (B.2) h de reao,
respectivamente. Esse fato pode ser atribudo saturao dos grupos SiOH presentes na
superfcie de SiO
2
disponveis para silanizao. No que concerne s amostras modificadas
com SAMs C, houve um aumento razovel na eficincia de silanizao quando comparadas
as condies C.1 e C.2.
0
2
4
6
8
10
12
14
R
a
z
o

N
/
S
i
Condies de Silanizao
C.2 C.1 B.3 B.2 B.1 A.5 A.4 A.3 A.2
109

5.5. Concluses
As tcnicas de caracterizao de superfcie empregadas indicaram uma adsoro
efetiva dos organossilanos pela superfcie de SiO
2
. Para todas as condies de modificao
investigadas, no foram observados aglomerados coloidais a nveis de resoluo espacial de
3 m, 1 m e 200 nm. Por outro lado, os substratos imersos em SAM C.2 exibiram uma taxa
de adsoro superior. Em adio, ao contrrio do que ocorre com o APTS, para a ligao
ButCN/FA se faz necessria uma converso do grupo CN do silano em NH
2
. Esse fato tende
a reduzir ainda mais a densidade de stios ativos da matriz para fixao das molculas de FA
superfcie do substrato. Logo, com base nos fatos apresentados, optou-se por utilizar
APTS-SAM sob a condio C.2 (etanol como fase solvente e 5 h de reao) para imobilizao
das molculas de FA nos estudos de interaes biomoleculares subsequentes.

Estudo das Condies de Funcionalizao e
Caracterizao da Fase Biossensora
CAPTULO 6 | | Estudo das Condies de Funcionalizao e Caracterizao da Fase Biossensora
111

Concludo o estudo das condies de silanizao, a etapa de funcionalizao com FA
foi investigada. Com base em protocolo experimental reportado na literatura (item 2.4),
20

microchips contendo eletrodos retangulares antiparalelos (CAPTULO 4) e o dieltrico SiO
2

com superfcie silanizada segundo a condio SAM C.2 (CAPTULO 5), foram fabricados
utilizando-se tempos de funcionalizao distintos. Devido ausncia de padres de FR-
para compra, os microchips foram aplicados a um padro de anticorpo monoclonal
especfico ao biorreceptor FA (-FA); as intensidades dos sinais analticos em BIA-C
4
D foram
consideradas como parmetro de referncia na escolha do tempo a ser adotado. Por fim,
visando uma caracterizao eletroqumica da fase biossensora, medidas de C
4
D foram
conduzidas com os sistemas: e
r
/SiO
2
, e
r
/SiO
2
/APTS-SAM e e
r
/SiO
2
/APTS-SAM/FA. Ademais, as
superfcies SiO
2
, SiO
2
/APTS-SAM e SiO
2
/APTS-SAM/FA foram analisadas por AFM para
caracterizao morfolgica dessas. Procedeu-se a silanizao sob a condio SAM C.2 nos
experimentos de caracterizao supracitados.

6.1. Estudo das Condies de Funcionalizao: Experimental, Resultados e Discusso
Anteriormente aos ensaios biomoleculares, valores absolutos do potencial de linha
de base (V
B
) foram obtidos preenchendo-se um microchip com MES 100 mmol.L
-1
pH 2,3
(tampo utilizado no monitoramento -FA) tendo por finalidade a seleo dos parmetros
timos de transduo, quais sejam: frequncia e potencial pico-a-pico. Na Figura 6.1 so
expressas as variaes de V
B
em funo da frequncia, entre 20 e 900 kHz, sob os potenciais
de 2,5, 6,0 e 9,5 V
P-P
, as quais se mostram similares quelas obtidas com dispositivo
convencional
149
e microchip PT contendo C
4
D.
150
Conforme pode ser observado na Figura
6.1, h um V
B
mximo (V
B
mx
) indicando o valor timo de frequncia de trabalho. Esse ponto
deslocado para menores valores de frequncias com o aumento do potencial pico-a-pico.
112

Ademais, para medidas que antecedem o V
B
mx
, so observados dois aspectos em comum
frente aos dados reportados na literatura medida que eleva-se o potencial: (i) reduo da
faixa linear e (ii) aumento da sensibilidade de V
B
(inclinao da reta) com relao s
variaes de frequncia. Para 2,5, 6,0 e 9,5 V
P-P
, os nveis de V
B
mx
foram registrados em 340
(7,7 V), 220-300 (8,3 V) e 180-260 kHz (8,5 V), respectivamente. Neste contexto, uma vez
que o aumento de potencial de 6,0 para 9,5 V
P-P
no acarretou em variaes significativas de
V
B
mx
, os ensaios biomoleculares subsequentes foram realizados aplicando-se 300 kHz de
frequncia e potencial pico-a-pico igual a 6,0 V
P-P
.

Figura 6.1. Otimizao dos parmetros da C
4
D.

Posteriormente, dispositivos BIA-C
4
D foram microfabricados imergindo as
superfcies de SiO
2
silanizadas em soluo de FA mediante tempos de 3, 5 e 7 h. Os
microchips foram aplicados a ensaios de interaes biomoleculares envolvendo o
biorreceptor FA e padro do ligante -FA, 100 g.mL
-1
em tampo TRIS salino (TBS), pH
7,3.
151
MES foi utilizado como tampo sob as condies: 100 mmol.L
-1
e pH 2,3. As condies
experimentais seguintes foram usadas: 300 kHz, 6,0 V
P-P
, vazo de 20 L.min
-1
para tampo e
amostra e tempo de amostragem igual a 20 s. -FA, TBS e MES foram adquiridos da Sigma-
0 200 400 600 800 1000
1,5
3,0
4,5
6,0
7,5
9,0
V
B

(
V
)
Frequncia (kHz)
2,5 V
6,0 V
9,5 V
113

Aldrich Chemical Co. Na Figura 6.2 so mostradas as respostas obtidas pelos microssistemas.
O decrscimo do sinal analtico verificado aps a etapa de amostragem (30 s) deve-se
regenerao da fase biossensora, que consiste em quebrar a ligao receptor/ligante
possibilitando, assim, novas interaes biomoleculares em uma anlise subsequente. O
fenmeno de regenerao foi realizado mediante a desnaturao (modificao estrutural)
da protena -FA, utilizando-se o pH como agente desnaturante; o ligante foi preparado em
um meio prximo da neutralidade, ao passo que a soluo tampo foi ajustada para pH 2,3.
Valores extremos de pH alteram a carga lquida da protena, causando repulses
eletrostticas entre suas cadeias de aminocidos e quebra de algumas ligaes de
hidrognio internas.
152

Os sinais expressos na Figura 6.2 indicam uma modificao efetiva das superfcies de
SiO
2
pelo FA, sendo verificadas elevaes em S
w
com relao a S
r
conforme esperado.
Admitindo-se que a concentrao 100 g.mL
-1
de -FA situa-se entre os limites de
quantificao e linearidade (faixa dinmica), a sensibilidade de calibrao do mtodo pde
ser estimada. Isso veio a permitir o clculo do LOD para os microssistemas,
153
cujos valores
foram: 16,9 (3 h), 22,6 (5 h) e 27,9 g.mL
-1
(7 h de funcionalizao). As percentagens de RSD
obtidas considerando-se 7 medidas para cada microchip foram de 5,69 (3 h), 7,86 (5 h) e
5,42 % (7 h de funcionalizao). A maior sensibilidade verificada para o tempo de 3 h pode
ser atribuda a questes de ordem estrica relacionadas a tempos reacionais superiores.
Embora acarretem em um nmero maior de biorreceptores ancorados ao intermedirio,
tempos prolongados de funcionalizao podem gerar impedimentos estricos do
componente bioativo dessas espcies os quais decorrem da alta densidade de molculas
junto superfcie da fase sensora.
61
A partir dos sensorgramas da Figura 6.2, observa-se
114

tambm que S
w
exibe taxas de acrscimo maiores quando comparado a S
r
. O aumento em
consequente das interaes FA/-FA responde, presumivelmente, por esse fenmeno.

Figura 6.2. Sinais analticos registrados para os dispositivos BIA-C
4
Ds microfabricados segundo os tempos de
funcionalizao de 3 (A), 5 (B) e 7 h (C). Condies experimentais: 300 kHz, 6,0 V
P-P
, vazo de 20 L.min
-1
para
tampo (MES) e amostra (-FA) e tempo de amostragem em 20 s.

Hiptese sobre o Princpio de Transduo do BIA-C
4
D
Dado que todos os demais fatores intervenientes na resposta analticas foram os
mesmos para e
rr
e e
wr
, o aumento em S
w
com relao a S
r
deve-se ao fenmeno das
interaes biorrecetor/ligante. Abaixo, segue uma hiptese sobre a causa que leva a essa
elevao do sinal.
APTS-SAM e FA apresentam em sua estrutura o grupo NH
x
(doador de eltrons), o
qual promove transferncias eletrnicas entre o substrato e o ligante em fases sensoras.
118

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
-2
0
2
4
S
i
n
a
l

B
I
A
-
C
4
D

(
V
)
Tempo (segundos)
MES -FA MES
S
w
S
r
0,71 V
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
-2
0
2
4
S
i
n
a
l

B
I
A
-
C
4
D

(
V
)
Tempo (segundos)
S
w
S
r
0,53 V
MES -FA MES
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
-2
0
2
4
S
i
n
a
l

B
I
A
-
C
4
D

(
V
)
Tempo (segundos)
0,43 V
S
w
S
r
MES -FA MES
(A)
(B) (C)
115

Esse fenmeno tende a gerar, em C
4
D, uma maior polarizao das molculas do dieltrico,
reduzindo
S
e, por conseguinte, aumentando a capacitncia do sistema e
wr
/SiO
2
/soluo
(item 1.4.2) conforme mostram medidas de EIS.
122
Com base nessas observaes, segue
nossa hiptese sobre o princpio de transduo do mtodo: em BIA-C
4
D, o sinal analtico
deve-se presena de grupo(s) doador(es) de eltrons dentre os constituintes da fase
sensora, o(s) qual(is) possibilita(m) transferncias eletrnicas entre o substrato e o ligante
gerando uma maior polarizao das molculas do dieltrico. Como consequncia, o campo
eltrico estabelecido pelo sistema capacitivo e
wr
/soluo reduzido elevando-se, assim, a
sua capacitncia. O fenmeno de transferncia de carga supracitado interfere nas respostas
obtidas por sensores baseados em transistores de efeito de campo.
118

6.2. Caracterizao da Fase Biossensora: Experimental, Resultados e Discusso
6.2.1. Caracterizao Eletroqumica
Em adio aos experimentos de condutometria utilizando-se os sistemas e
rr
/SiO
2
e
e
wr
/SiO
2
/APTS-SAM/FA (tempo de funcionalizao de 3 h), medidas foram realizadas sob as
mesmas condies a um microchip C
4
D incorporando somente o intermedirio de
imobilizao (e
r
/SiO
2
/APTS-SAM), cujos resultados so dispostos na Figura 6.3. No foram
observadas variaes nas respostas obtidas pelos sistemas e
r
/SiO
2
e e
r
/SiO
2
/APTS-SAM, para
os quais no h interaes com -FA haja vista a ausncia do biorreceptor FA. Neste
contexto, os dados de caracterizao obtidos se mostraram concordantes no que tange
correlao entre sinal analtico em BIA-C
4
D (S
w
- S
r
) e a ocorrncia de interaes
biomoleculares, sendo registradas elevaes de potencial para e
wr
/SiO
2
/APTS-SAM/FA.
116

Figura 6.3. Sinais obtidos pelos sistemas: e
rr
/SiO
2
(S
r
), e
r
/SiO
2
/APTS-SAM (S) e e
wr
/SiO
2
/APTS-SAM/FA (S
w
).
Condies experimentais: 300 kHz, 6,0 V
P-P
, vazo de 20 L.min
-1
para tampo (MES) e amostra (-FA) e tempo
de amostragem em 20 s.

6.2.2. Caracterizao Morfolgica
Os experimentos de AFM foram realizados no modo tapping (oscilante) com forca
constante em um instrumento da Digital Instrument, mod. MultiModeTM SPM, presente no
Laboratrio de Microscopia e Tunelamento (LMT) do LNLS. O mesmo possui resoluo
mxima de 512x512 pixels e deteco por feixe de laser. Empregamos pontas cnicas de Si
da NSG10, com angulo < 22
o
, raio e altura iguais a 10 nm e 10-15 m, respectivamente, e
cantilever retangular integrado. Varreduras de 2,5 m x 2,5 m foram efetuadas a
temperatura ambiente com velocidade de 1,0 Hz, sendo registrado o valor de 17,52 Hz para
a constante de mola do cantilever usado. A tcnica de AFM possibilitou uma anlise
morfolgica detalhada das superfcies SiO
2
, SiO
2
/APTS-SAM e SiO
2
/APTS-SAM/FA, para a qual
utilizou-se um tempo de 3 h para funcionalizao com FA. Parmetros de rugosidade e
grficos fractais foram determinados a partir do software Nanoscope 6.11 (programa
fornecido pelo fabricante do equipamento). Os parmetros de rugosidade estimados foram:
rugosidade mdia quadrtica (RMS, medida estatstica da magnitude de variao de uma
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
-2
0
2
4
S
S
i
n
a
l

B
I
A
-
C
4
D

(
V
)
Tempo (segundos)
MES -FA MES
S
w
S
r
117

quantidade varivel), razo da rea superficial (S
ar
, incremento da rea superficial relativa
rea do plano x,y projetado) e densidade de picos (S
dp
, nmero de mximos locais por rea).
As micrografias obtidas para as superfcies analisadas so expostas na Figura 6.4.
Com base nessas imagens, podemos concluir que no houve alteraes na topografia das
superfcies modificadas, indicando que o reagente APTS-SAM cresceu seguindo a morfologia
do dieltrico. Os valores de RMS, S
ar
e S
dp
calculados so apresentados na Tabela 6.1, a partir
dos quais se verifica a formao de superfcies levemente mais rugosas e com rea
superficial e densidade de picos maiores com os processos de silanizao e funcionalizao.
Os grficos fractais evidenciaram uma distribuio de matria uniforme para todas as
superfcies analisadas.

Figura 6.4. Micrografias de 5 m x 5 m das superfcies: SiO
2
(A), SiO
2
/APTS-SAM (B) e SiO
2
/APTS-SAM/FA (C).

ar
e S
dp
2
, SiO
2
/APTS-SAM e SiO
2
/APTS-SAM/FA
Superfcie RMS (nm) S
ar
(%) S
dp
(m
-2
)
SiO
2
0,4 0,8 5.621,7
(A)
(B)
(C)
5,0 m
5,0 m 5,0 m
5,0 m
5,0 m
5,0 m
118

ar
e S
dp
2
, SiO
2
/APTS-SAM e SiO
2
/APTS-SAM/FA
(Continua)
Superfcie RMS (nm) S
ar
(%) S
dp
(m
-2
)
SiO
2
/APTS-SAM 0,8 5,1 7.055,3
SiO
2
/APTS-SAM/FA 1,0 6,3 9.034,6

6.3. Concluses
Os ensaios envolvendo FA e -FA indicaram uma adsoro efetiva de FA junto s
superfcies de SiO
2
silanizadas, sem a ocorrncia (ao menos em nveis significativos) de
impedimentos estricos de sua espcie bioativa. Dentre os tempos de funcionalizao
investigados, 3 h foi aquele que resultou em uma maior sensibilidade do mtodo. Em termos
da etapa de caracterizao eletroqumica da fase biossensora, seus resultados mostraram
haver correlao entre a resposta analtica em BIA-C
4
D e as interaes biomoleculares. Por
fim, conforme indicaram as medidas de AFM, no houve alteraes drsticas na morfologia
do substrato (SiO
2
) em funo dos processos de silanizao e funcionalizao.

C CA AP P T TU UL LO O7 7
Concluses Gerais
CAPTULO 7 | | Concluses Gerais
120

Este trabalho descreve o desenvolvimento de um biossensor contendo transduo
condutomtrica sem contato e FA como biorreceptor em microchip, uma nova alternativa
que poder ser utilizada na determinao do biomarcador de cncer FR-. Recentemente, o
grupo estabeleceu colaboraes com a Fundao Pio XII Hospital de Cncer de Barretos, as
quais nos permitiro realizar anlises com amostras reais (plasma sanguneo) e, assim,
avaliar a especificidade e a viabilidade do BIA-C
4
D para ensaios de rotina.
Como vantagens intrnsecas ao mtodo desenvolvido, consideradas a partir dos
resultados e discusses presentes nos captulos anteriores, incluem: (i) consumo de
reagentes e amostras reduzido (da ordem de L); (ii) anlises rpidas (< 2 min); (iii) rotina de
ensaios simples; (iv) instrumentao de baixo custo e porttil; (v) possibilidade de fabricao
dos chips sem o uso de salas limpas e (vi) monitoramento das interaes biomoleculares
em tempo real. Em termos do transdutor condutomtrico sem contato, esse exibe duas
caractersticas sumamente relevantes, quais sejam: (i) permite determinaes diretas,
dispensando o uso de mediadores redox bem como ocorre em tcnicas eletroqumicas
faradaicas, e (ii) ausncia de inconvenientes relacionados ao contato entre eletrodo e
soluo eletroltica, como passivao, contaminao, formao de bolhas e necessidade de
limpeza dos eletrodos. Adicionalmente, a tcnica de transduo utilizada possibilita a
determinao simultnea de multianalitos em BIA-C
4
D mediante a simples implementao
de pares e
exc
/e
wr
contendo biorreceptores especficos para cada ligante de interesse.
Os baixos nveis de detectabilidade (da ordem de g.mL
-1
)
122
representam o fator
limitante do mtodo para determinaes analticas diversas. Como parmetro de referncia,
Acharya e colaboradores obtiveram LOD de 20 pg.mL
-1
para interaes FA/FR- empregando
difratometria imunomagntica como transdutor.
21
Neste contexto, o grupo vem
desenvolvendo pesquisas objetivando melhorias nos limites de deteco e quantificao da
CAPTULO 7 | | Concluses Gerais
121

C
4
D, como a dopagem da camada dieltrica com semicondutores em microssistemas
vidro/PDMS
Dieltrico
/PDMS. No que concerne a microdispositivos BIA-C
4
D, um novo
procedimento ser investigado o qual consistir em integrar eletrodos nanoestruturados
seletivos C
4
D. Visa-se, assim, elevar significativamente a rea superficial dos eletrodos
promovendo um aumento no nmero de portadores de carga e, logo, nos valores de
condutncia obtidos. O uso de eletrodos nanoestruturados em C
4
D indito, contemplando
conceitos prvios e propondo um mtodo inovador para o desenvolvimento de detectores
condutomtricos ultrassensveis.

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Paulo: Bookman, 2005.

S S M MU UL LA A C CU UR RR RI IC CU UL LA AR R

SMULA CURRICULAR
136

2. FORMAO ACADMICA
2010:
Doutorado em Qumica;
Universidade de So Paulo/Instituto de Qumica de So Carlos, USP/IQSC, Brasil;
Ttulo: Condutometria Nanoestruturada Sem Contato em Microchips: Fabricao,
Validao e Aplicao em Biossensores Tumorais;
Orientador: Emanuel Carrilho.
2008 - 2010:
Mestrado em Qumica (Qumica Analtica);
Universidade de So Paulo/Instituto de Qumica de So Carlos, USP/IQSC, Brasil;
Ttulo: Biossensor Condutomtrico Sem Contato em Microchip Contendo cido Flico
como Biorreceptor, Ano de obteno: 2010;
Orientador: Emanuel Carrilho;
Bolsista do(a): Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo.
2003 - 2008:
Graduao em Qumica Industrial;
Universidade Federal da Paraba, Joo Pessoa, Brasil;
Ttulo: Desenvolvimento de um Sistema em Escala Piloto para o Monitoramento Remoto e
Contnuo da Qualidade de guas;
Orientador: Jos Soares;
Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico.

1. DADOS PESSOAIS
Nome:
Renato Sousa Lima.
Endereo:
Universidade de So Paulo, Instituto de Qumica de So Carlos;
Av. Trabalhador So Carlense, 400/Grupo de Bioanaltica, Microfabricao e Separaes;
CEP 13560-970, So Carlos-SP, Brasil, Caixa-Postal: 780. Telefone: (16) 3373 8279.
SMULA CURRICULAR
137

3. PRMIOS
2010:
Trabalho premiado como melhor pster na 20
a
Reunio Anual de Usurios (RAU) do
Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron (LNLS), Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron
(LNLS), Campinas-SP.
2008:
Reconhecimento como melhor aluno no curso de Qumica Industrial do Centro de
Tecnologia da Universidade Federal da Paraba, Conselho Regional de Qumica da Paraba
(CRQ-PB).
2004:
Primeiro colocado no processo seletivo para admisso na Graduao em Qumica
Industrial pelo Centro de Tecnologia da Universidade Federal da Paraba - CT/UFPB - em
Abril de 2004.

4. ARTIGOS PUBLICADOS
1. Alexandre Fonseca; Raimundo Jnior, I. M.; Rohwedder, J. J. R.; Lima, R. S.; Arajo, M. C. U. A microfluidic
device with integrated fluorimetric detection for flow injection analysis. Analytical and Bioanalytical
Chemistry, v. 396, p. 715, 2010.
2. Gambarra Neto, F. F.; Glimaldo Marino; Arajo, M. C. U.; Galvo, R. K. H.; Pontes, M. J. C.; Medeiros, E. P.;
Lima, R. S. Classification of edible vegetable oils using square wave voltammetry with multivariate data
analysis. Talanta, v. 77, p. 1660, 2009.
3. Gaio, E. N.; Santos, S. R. B.; Santos, V. B.; Lima, R. S.; Arajo, M. C. U. An inexpensive, portable and
microcontrolled near infrared LED-photometer for screening analysis of gasoline. Talanta, v. 75, p. 792,
2008.
4. Almeida, L. F.; Vale, M. G. R.; Dessuy, M. B.; Silva, M. M.; Lima, R. S.; Santos, V. B.; Diniz, P. H. D.; Arajo,
M. C. U. A flow-batch analyzer with piston propulsion applied to automatic preparation of calibration
solutions for Mn determination in mineral waters by ET AAS. Talanta, v. 73, p. 906, 2007.
SMULA CURRICULAR
138
5. Gambarra Neto, F. F.; Lima, R. S.; Lira, W. S.; Glimaldo Marino, Arajo, M. C. U.; Medeiros, E. P.;
Nascimento, V. B. Biamperometric Determination of Tetracycline in Pharmaceuticals. Analytical Letters, v.
40, p. 3070, 2007.

5. ARTIGOS SUBMETIDOS/EM FASE DE ELABORAO
1. Santos, V. B.; Nascimento, E. C. L.; Lima, R. S.; Arajo, M. C. U.; Santos, S. R. B.; Fragoso, W. D.; Azevedo,
W. M. An optical pH-meter based on LED and polyaniline film. Talanta.
2. Lima, R. S.; Santos, V. B.; Guerreiro, T. B.; Arajo, M. C. U.; Gaio, E. N. Um sistema microcontrolado para
o monitoramento on-line, in situ e remoto de pH, Condutividade e Temperatura de guas. Qumica Nova.
3. Coltro, W. K. T.; Segato, T. P.; Lima, R. S.; Silva, J. A. F.; Emanuel Carrilho. Deteco Condutomtrica Sem
Contato: Fundamentos, Configuraes e Aplicaes. Qumica Nova.
4. Lima, R. S.; Coltro, W. K. T.; Rodrigues Filho, U. P.; Gobbi, A. L.; Emanuel Carrilho. Contactless Conductivity
Biosensor in Microchip Containing Folic Acid as Bioreceptor. Analytical Chemistry.
5. Lima, R. S.; Segato, T. P.; Coltro, W. K. T.; Emanuel Carrilho. Dielectric Layer Doping: A New Alternative for
Increasing Sensitivity of Contactless Conductivity Detection in Microchips. Analytical Chemistry.

Biossensor Condumetrico

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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

INSTITUTO DE QUMICA DE SO CARLOS

Ao Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron (LNLS), pelo acesso aos Laboratrios de

Aos integrantes do grupo BioMics, em especial Gabriela, Thiago e Eduardo, pelas

Sulfo-LC-SPDP a sigla utilizada para o reagente: hexanoato de sulfosuccinimida 6-[3-(2-piridilditiol) propilamino].

Fotoplotagem de layers em fotolito realizada pela empresa DGM Design, Curitiba-PR. 60

com configurao e dimenses conforme

Fotoplotagem de layers em fotolito realizada pela empresa DGM Design, Curitiba-PR. 62

desse ltimo, o grupo NH

do FA. Todos os reagentes

Confeccionados na Oficina Mecnica do IQSC/USP. 68

(detalhes sobre hardware e

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usada para deposio dos

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