Laboratorio de Bioconversiones

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES
INGENIERA BIOTECNOLGICA
PRCTICA 1 Determinacin de actividad enzimtica y efecto de la concentracin de enzima, pH, temperatura y fuerza Inica en la actividad enzimtica (alfa-amilasa).
La Prctica 1 incluye 6 mdulos de iniciacin de tcnicas analticas y manejo de equipo (1.1 a 1.6) necesarias para el curso y las tres ltimas estn enfocadas tema central relativa actividad enzimtica, parte fundamental del desarrollo del curso.
Contenido
1.1 Capacitacin para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio. ...... 2 1.2. Capacitacin para el uso de espectrofotmetros y centrfugas. ............ 7 1.3. Preparacin de reactivos requeridos en el laboratorio de bioconversiones. ................................................................................................. 13 1.4 Determinacin de crecimiento celular por turbidimetra (D.O.), peso seco, protena y cuenta directa en cmara de Neubauer. ........................ 14 1.5 Determinacin de azcares reductores y azcares totales. ................... 17 1.6 Determinacin de la concentracin de protena de las enzimas elegidas. ................................................................................................................. 20 1.7 Medicin de la actividad cataltica de enzimas y/o de extractos crudos enzimticos: Amilasas. ...................................................................................... 23 1.8 Efecto de la concentracin de enzima y fuerza inica en la actividad de la enzima elegida. ................................................................................................ 25 1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica. ...................... 27
Cada mdulo se llevar a cabo en una o ms sesiones, las cuales sern determinadas por el profesor, requirindose para toda la prctica un mximo de 9 sesiones (cinco semanas)

INGENIERA BIOTECNOLGICA 1.1 Capacitacin para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio. USO DE MICROPIPETAS AUTOMTICAS En las prcticas de Bioqumica los volmenes de las soluciones que se necesitan medir son del orden de microlitros (L). Para tomar estas cantidades con exactitud y reproducibilidad se emplean micropipetas, ya sean de volumen fijo o variable. Los errores de medida que se pueden cometer dependen principalmente del usuario y no de la micropipeta en s, a menos que esta no est bien calibrada. Para que las medidas sean correctas se debe de tener en cuenta las siguientes consideraciones: La pipeta debe de mantenerse siempre en posicin vertical durante todo el proceso de pipeteo, nunca inclinada. Tambin, cuando la pipeta no se utilice se debe dejar siempre en posicin vertical en el soporte de pipetas. Nunca la deje horizontalmente encima de la mesa y menos una vez que tenga lquido succionado. Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo miden solamente un volumen determinado. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un intervalo de valores determinado. En stas, no se deben ajustar volmenes superiores o inferiores a los que se recomiendan para cada pipeta. Los modelos que toman volmenes inferiores a 200 L usan puntas amarillas (o blancas), y las micropipetas que toman volmenes superiores a 200 L hasta 1 mL usan puntas azules (en algunos casos son blancas). Las pipetas que manejan volmenes mayores de 1 o de 0.5 y 10 L, pueden usar otro tipo de puntas especficas. La pipeta se agarra como si se tomara una empuadura. La parte superior debe de reposar sobre su dedo ndice (Fig. 1). Todas las pipetas tienen dos topes: 1) Primer tope para tomar el volumen calibrado. 2) Segundo tope para expulsar de forma ms eficiente el volumen tomado y se usa solo cuando se est expulsando el contenido. .
Si antes de tomar la muestra, se lleva hasta el segundo tope, se tomar un volumen mayor al deseado, un volumen ERRONEO- El segundo tope es para sacar de forma ms eficiente el volumen establecido

Posicin Inicial Primer Tope Segundo Tope
1 2
Fig. 1 Manera de asir una pipeta automtica y tomar una muestra (presin del mbolo). Tanto la presin como la liberacin del mbolo de la pipeta se debe de realizar lentamente y con suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar burbujas dentro de la punta de la pipeta, que alteraran los volmenes; as mismo se podra ensuciar la parte interna de la pipeta. Tambin se pueden formar burbujas o tomar un menor volumen si la punta no est bien ajustada a la pipeta. Procedimientos micropipeta para medir correctamente un volumen con una
1. Seleccionar la pipeta adecuada para medir el volumen deseado (que est dentro del intervalo establecido para la pipeta). 2. El volumen requerido se fija girando el mbolo (Fig. 2). Se debe girar suavemente (evitar estar cambiando constantemente los volmenes, para evitar descalibrar las pipetas).
Fig. 2 Manera de fijar el volumen deseado. 3. Colocar una punta desechable en el vstago de la pipeta (Fig. 3); asegurando que est bien sujeta, ejerciendo un ligero movimiento de torsin y presionando. Tener cuidado de no presionar mucho porque esto hace que la punta quede atorada fuertemente dificultando retirarla. 3

Figura 3
Figura 4
4. Tomar la muestra presionando suavemente el mbolo con el pulgar hasta el primer tope. 5. Introducir la punta de la micropipeta en la muestra no ms de 3 mm de la superficie de lquido, manteniendo la pipeta en posicin vertical (Fig. 4). 6. Succionar el lquido, relajando suavemente y controlando la presin con el dedo pulgar, sin permitir que el mbolo suba por s solo. Se espera un par de segundos con la punta introducida en el lquido. 7. Retirar la punta de la muestra. 8. Introducir la punta de la pipeta en el tubo o frasco donde se va a verter, colocando la punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la solucin. 9. Presionar el mbolo lentamente, llevndolo hasta el primer tope., continuando inmediatamente hasta el segundo tope, para expulsar la totalidad del lquido que est en la punta. 10. Con el mbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la pipeta, deslizando la punta a lo largo de la pared del tubo. 11. Llevar el mbolo a la posicin inicial, controlando con el dedo (sin permitir que el mbolo suba por s solo). 12. Sacar la punta de la pipeta, presionandoel expulsor de puntas o tirando de ella, (Fig. 5). En algunos casos se puede usar la misma punta, para homogenizar la mezcla, una vez adicionado el volumen, se introduce la punta en la mezcla y se baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope. El procedimiento completo se esquematiza en la Figura 6.

Figura 5
Figura 6
http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Quimica/Practica00/Micropi petas.htm TRABAJO PRCTICO Cada equipo realizar lo siguiente: 1. Elegir la micropipeta adecuada para 20, 200 o 1000 L. Seleccionar el volumen indicado en la tabla 1 y colocar la punta adecuada. 2. Tomarla muestra indicada como se indic anteriormente. 3. Transferir el lquido a un tubo Eppendorf, colocando la punta de la micropipeta en la pared interna del tubo Eppendorf al cual se va a transferir la muestra, depositar la muestra segn el procedimiento ya indicado.
4. Eliminar la punta en un recipiente determinado para este fin, colocando encima del recipiente la punta y presionando el pistn ubicado en la parte inferior, atrs del pistn de succin. Cada vez que se agregue un volumen seleccionado, se registrar su peso en la balanza (dependiendo de la sensibilidad de la balanza), cada volumen se har por duplicado. IMPORTANTE
Cuando se vaya a pipetear solvente voltiles, como diclorometano, acetona, cloroetileno, cloroformo, etc. Antes de tomar la muestra, se debe saturar la pipeta con el solvente. Esto se logra introduciendo la punta en el solvente y se baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope. Finalmente teniendo al punta en el solvente bajar el embolo hasta el primer tope y tomar toda la muestra llevando hasta la posicin inicial. Cuando no se satura, al sacar la punta el solvente se sale de punta, debido a que se volatiliza dentro de la misma. Cuando se tomas muestras viscosas o densas como el glicerol, debe esperar a que suba muy lentamente todo el volumen, al no hacerlo y retirar la punta entrar aire. Esto indica que an no se haba tomado todo el volumen y se debe repetir todo el procedimiento.

INGENIERA BIOTECNOLGICA Ensayar varias veces este procedimiento con las diferentes micropipetas as como cambiar los volmenes de acuerdo a las tablas 1 y 2: Tabla 1. Volmenes de agua a seleccionar para el uso de micropipetas.
1000 L 600 200 100 200 L 150 100 50 20 L 16 12 8 4 1
Tabla 2. Volmenes de glicerol a seleccionar para el uso de micropipetas.

1000 L 600 200 200 L 150 100 20 L 20 10
Practicar con el profesor la toma de muestras voltiles

INGENIERA BIOTECNOLGICA 1.2. Capacitacin para el uso de espectrofotmetros y centrfugas. Fotometra La fotometra o "medida de la luz" es un mtodo ptico de anlisis dentro del cual se encuentran la colorimetra y la espectrofotometra, que miden la cantidad de luz absorbida por sustancias colorido o colorido e incoloras respectivamente.
La luz es una forma de energa electromagntica, igual que los ultravioletas, infrarrojos etc. Que es irradiada a partir de una fuente energtica en lneas o rayos virtualmente rectos. Se propaga en el vaco sin necesitar sustancia transportadora. Dentro de su trayectoria rectilnea describe ciclos en forma de ondas regulares que vibran perpendicularmente a su direccin de desplazamiento y cuya longitud de onda se sita entre 380 y 780 nanmetros.
Longitud de onda: Es la distancia entre dos picos sucesivos de una onda. La luz que percibe el ojo humano es la luz visible y comprende desde 400 a 700 nm. Longitudes de onda superiores a 700 nm no son visibles para el ojo y se llama infrarroja; entre 100 y 400 nm es radiacin ultravioleta (UV). Las medidas de absorcin de luz se basan en dos leyes, la ley de Lambert y la ley de Beer. Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta. I0 I = I0 10 -K.L log = KL I donde: I = intensidad de luz transmitida I0 = intensidad de luz incidente K = coeficiente de extincin L = espesor de capa K es el coeficiente de extincin definen cuan fuertemente una substancia absorbe la luz a una dada longitud de onda, por unidad de masa o por concentracin molar. Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un medio absorbente (Fig 1), su intensidad disminuye exponencialmente a medida que aumenta la concentracin de la sustancia absorbente en el medio. I0 I = I0 10 K.C log = K C I donde C = concentracin de la sustancia absorbente

Sol.Absorbente concentracin C Luz Rayo incidente monocromtica Intensidad I0 Rayo emergente
Intensidad I L Espesor de la solucin Figura 1. Diagrama del paso de luz monocromtica a travs de una solucin
Estas dos leyes se combinan en la ley de Lambert-Beer: I = I0 10

-CL
I0 log I
= cL
donde = coeficiente de extincin molar es el coeficiente de extincin cuando la solucin contiene un mol por litro. El cociente de las intensidades se conoce como transmitancia (T) y se suele expresar como un porcentaje I T= I0 La expresin log A = D.O. = log I T y A quedan relacionados de la forma A = - log T = 2 - log %T ESQUEMA GENERAL DE UN ESPECTROFTOMETRO Espectrofotmetros: Los mtodos fotomtricos de anlisis utilizan los efectos de la interaccin de las radiaciones electromagnticas con las molculas. Los aparatos de medicin de la absorcin de la radiacin electromagntica se denominan "espectrofotmetros" y estn constituidos de forma general de (Fig 2): Una fuente de luz, un monocromador, que desdobla la luz en haces monocromticos, de un colimador que tiene una rendija de ajuste variable, pasando a travs del mismo slo luz de una determinada longitud de onda. La utilizacin de la luz monocromtica o de un intervalo pequeo de longitudes de onda es importante, ya que la ley de Lambert-Beer solo se cumple en estas condiciones. 8 I0 I0 - cL =10 I %T = I0 se conoce como absorbancia (A) o densidad ptica (DO) = c L ; para L=1, A = c x 100

INGENIERA BIOTECNOLGICA La luz que sale del colimador se hace pasar por la solucin y luego incide sobre el fototubo donde es detectada. La seal se enva a un registrador que convierte la seal a un registro anlogo, digital o grfico. En algunos colormetros este registro consta de dos escalas, una mide absorbancias (A) y la otra transmitancias (T). La escala de A va desde 0 a , la de T va desde 0 a 100, en sentido contrario.
Colimador
Fototubo
Monocromador
Celda con muestra
Registro
Fuente de luz
%T 0 A
100 0
Figura 2. Esquema de las partes bsicas de un espectrofotmetro Antes de realizar una medida, el aparato debe calibrarse, para lo cual se introduce una CELDA (o cubeta) con el blanco y se lleva a cien de transmitancia y a cero de absorbancia. Posteriormente, se introduce una celda con la muestra y se lee sea la transmitancia o la absorbancia a la longitud de onda determinada. Colormetros: Los mtodos colorimtricos son una aplicacin de la espectroscopa y se basan en la medida de la absorbancia de una solucin coloreada en la regin visible del espectro (400-700 nm). La fuente de luz suele ser una lmpara de wolframio. Los compuestos no coloreados se transforman en otros con color, susceptibles de ser medidos colorimtricamente, mediante reaccin con compuestos adecuados, y de esta forma se puede analizar en la regin visible del espectro compuestos coloreados y sin color y ampliar sus posibilidades de utilizacin.

INGENIERA BIOTECNOLGICA CAPACITACIN PARA EWL MANEJO DE ESPECTOFOTMETROS Actividad en laboratorio: Los maestros de laboratorio indicarn cmo operar y programar los equipos. El alumno deber anotar en su bitcora cada paso y realizar un diagrama de flujo de los pasos, as como las consideraciones que hay que tener en el manejo, mantenimiento y limpieza del equipo. Existen diferentes modelos de espectrofotmetros en los laboratorios de docencia, de investigacin y una gran gama en el mercado. Para el laboratorio se utilizarn dos o tres modelos, se debe aprender el manejo de cada uno. Para la lectura de muestras se utiliza celdas o cubetas de cuarzo o desechables de plstico, existen de diferentes volmenes de operacin 4, 2 y 1 mL. Antes de usar, siempre regstrese en la libreta de control del equipo.
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INGENIERA BIOTECNOLGICA CENTRFUGA BECKMAN J2-MC Antes de usar, siempre regstrese en la libreta de control del equipo. Rotores: JA-20 para 8 tubos de 45 mL JA-14 para 6 tubos de 250 mL. Asegrese de equilibrar los tubos de centrfuga con la muestra en una balanza. Se puede hacer con la misma sustancia o puede usar un contrapeso de agua. Para abrir: Mueva el interruptor a la posicin ON. Accione la palanca de apertura (al lado derecho de la puerta) Para programar: Oprima ROTOR e introduzca el nmero 14 20, dependiendo del tipo de rotor a usar. Oprima SPEED y teclee la velocidad (rpm). (verificar las velocidades mximas para cada rotor, para esto existe una tabla) Oprima TIME y teclee el tiempo (h : min). Oprima TEMP y teclee la temperatura ( C) Al terminar la seleccin, oprima ENTER. Para operar: Coloque cada par de tubos ya equilibrados en posiciones contrarias (encontradas).Los contrarios deben tener el mismo peso Coloque la tapa del rotor. Cierre la centrfuga. Permita que el equipo enfre a la temperatura indicada antes de comenzar el programa. Oprima el botn START para iniciar el programa. Se puede abortar oprimiendo el botn STOP. NOTAS: La palanca de apertura solo funciona con el equipo encendido. Apague el equipo manteniendo la puerta abierta para permitir que la cmara de la centrfuga se deshiele. Asegrese de secar la cmara. Proceda a cerrar el equipo.
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INGENIERA BIOTECNOLGICA CENTRFUGA HERMLE Z300 Antes de usar, siempre regstrese en la libreta u hoja de control del equipo. Cuenta con tres Rotores para: 24 tubos Eppendorf de 12 tubos Falcon de 6 Tubos Falcon de
1.5 mL 15 mL 50 mL
Para cambiar rotor: Utilice la llave del equipo. La rosca es izquierda. Girar a la derecha Girar a la izquierda Para abrir: Oprima el botn de
para aflojar, para apretar.
apertura.
El equipo solo se abre cuando el LED (foco o luz verde) est encendido, seal que el rotor se ha detenido y que es posible abrir. Precaucin al abrir, la tapa no tiene un tope, por lo que se requiere apoyarla lentamente. Para programar: Mantener oprimido el botn preset Seleccionar el tiempo (min/sec) girando la perilla Seleccionar la velocidad (rpm) girando la perilla
Para operar: Coloque cada par de tubos equilibrados en peso (con el mismo peso) en posiciones encontrada (contrarias). Los tubos deben estar equilibrados por par (no todos los del rotor), pero es imprescindible que los tubos encontrados tengas el mismo peso. Coloque la tapa del rotor (si ste posee una). Cierre la centrfuga. Oprima el botn start para iniciar el programa. Se puede parar oprimiendo el botn stop. En caso de que, por alguna falla en el suministro elctrico, la pantalla se muestre intermitente, desconecte el equipo, espere unos segundos y conctelo nuevamente. Proceda con la programacin.
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INGENIERA BIOTECNOLGICA 1.3. Preparacin de reactivos requeridos en el bioconversiones. laboratorio de
Reactivo de Bradford Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 mL de etanol al 95%. A esta solucin se le aaden 100 mL de cido fosfrico al 85% (w/v). La solucin resultante se diluye a un volumen final de 1L. Las concentraciones finales en el reactivo son 0.01% (w/v) de azul brillante de Coomassie G-250, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de cido fosfrico. Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser caf. Si tiene un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario. Reactivo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) 1. Disolver 30.0 g de tartrato de sodio y potasio en agua destilada hasta obtener un volumen final de mximo 50 mL. 2. Agregar 1.6 g de NAOH previamente disueltos en 10 mL de agua destilada. 3. Agregar 1.0 g de DNS previamente disuelto en 20 mL de agua destilada. 4. Aforar a 100 mL con agua destilada. 5. Guardar en obscuridad y en frasco mbar. Dejar reposar 15 min, en caso de uso inmediato. ES IMPORTANTE tener cuidado con los volmenes que se manejan, por que el volumen final no debe ser mayor a 100 mL. Para esto, se aconseja ir disolviendo el tartrato de sodio agregando agua hasta lograr el volumen final de 50 mL (no agregar 50 mL de agua a la sal por que dar un volumen mayor) . Solucin de Almidn 1% (p/v) Suspender 1g de almidn en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, el cual deber estar tibio o caliente. Posteriormente desnaturalizar calentando en bao de agua a 60 C durante 15 min, para pre-gelatinizar el almidn. Solucin de alfa-amilasa
La concentracin de enzima ser indicada por el profesor y ser en mg de protena o enzima por mL de regulador de fosfatos, 0.1 M, pH 7.0.
Solucin de antrona Disolver 0.2 g de antrona en 5 ml de etanol y aforar a 100 ml con H2SO4 al 75%. Para preparar el cido al 75%, se debe realizar en la campana de extraccin, en un bao de hielo, colocar el matraz o pobreta que contienen el agua en el bao e ir agregando lentamente por las paredes el cido. Usar material de seguridad, lentes y guantes.
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INGENIERA BIOTECNOLGICA 1.4 Determinacin de biomasa microbiana por turbidimetra o Densidad ptica (D.O.), peso seco y cuenta directa en cmara de Neubauer. La determinacin biomasa microbiana puede realizarse por varios mtodos tanto directos como indirectos, tres de estos son: 1. Densidad ptica (D.O.) o turbidimetra 2. Peso seco 4. Cuenta en cmara de Neubauer PARTE EXPERIMENTAL 1) Densidad ptica A partir de muestras obtenidas de una cintica de crecimiento, es decir del medio de cultivo a travs del tiempo, (o a partir de diluciones de un cultivo concentrado), obtener la densidad ptica de las muestras leyendo a 600 nm. Las lecturas no deben ser mayores a 1 de absorbancia, es ese caso es necesario realizar diluciones, para obtener el intervalo de lectura menor a 1. El blanco es el medio de cultivo fresco utilizado; as mismo, ste se debe usar para las diluciones en muestras que den lecturas mayores a 1. Se entregar un cultivo microbiano, el cual se leer la DO a 600 nm y a partir de la lectura se establecern 5 diluciones para leer. Con las lecturas graficar la densidad ptica vs. dilucin. La DO se puede graficar vs concentracin de protena extracelular, peso seco, numero de clulas, protena celular, etc. Haciendo posible correlacionarlas 2) Peso seco a) Etiquetar charolas de aluminio y ponerlas a peso constante a 60C por 24 horas en una estufa, enfriar en desecador y pesar. b) Tomar una alcuota de 10 a 15 mL de la suspensin celular (de cada dilucin hecha para DO) y colocarlo en un tubo de centrfuga. c) Centrifugar las muestras a una velocidad de 6000 rpm durante 5 min. Recuerde equilibrar los tubos antes de centrifugar. d) Eliminar el sobrenadante y resupender la pastilla celular en un poco de agua destilada y pasarla a una charola a peso constante y previamente pesada. e) Dejar las charolas en una estufa a 60C por 24 h o hasta que la pastilla este completamente seca, enfriar en desecador y pesar cada charola. f) El peso seco se obtiene de la diferencia entre el peso final y el inicial de cada charola. g) Graficar peso seco vs DO y vs no de de clulas/mL.
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INGENIERA BIOTECNOLGICA 3) Cuenta directa en Cmara de Neubauer La cmara de Neubauer es una cmara adaptada para ser utilizada en un microscopio de campo claro o de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, con el fondo marcado con una una cuadrcula (Fig 1). Es un cuadrado de 3 x 3 mm, subdividido en 9 reas de 1mm2 cada una. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie de cada rea y el cubreobjetos es de 0.1 mm3 (0.1 microlitros). Las diferencia entre las reas 1,3,7 y 9; 4,2,6,8 y la 5 son las subdivisiones, lo que permite en ese orden contar clulas de mayor a menor tamao, contando bacterias y levaduras en el rea 5, que cuenta con 25 subdivisiones y se observa en 40 o 100X Se deben contar el nmero de clulas de cuatro o cinco cuadros de un rea, la concentracin en la suspensin celular ser: Cl/mL = N X 104 X F (ecuacin 1)
Donde: N: La media de las clulas contadas (suma de clulas contadas por subdivisin/Nmero de subdivisiones contadas) 25: es el nmero de cuadrados en cada grilla. 104: factor para pasar el nmero de clulas en el cuadrado central (volumen = 0.1mm3 = 0,1L) a nmero de clulas por mL (1000mm3 = 1000L=1 mL) F: factor de dilucin
Figura 1. Grilla de conteo de la cmara de Neubauer (Fugelsang and Edwards, 2007). 15

INGENIERA BIOTECNOLGICA El conteo con la cmara se lleva a cabo de la siguiente forma: a) Limpiar cuidadosamente con papel de arroz la cmara de Neubauer. b) Colocar el cubreobjetos sobre los canales, tal como se indica en la figura 1. c) Agitar la suspensin celular para tener una muestra homognea. d) Con ayuda de una pipeta serolgica de 1 mL o con una pipeta automtica de 100 L, tomar 0.1 mL de la suspensin y colocar la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos; dejar que la solucin ingrese a la cmara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales. Si se forman burbujas se debe repetir la operacin, lavando y secando la cmara previamente. e) Colocar la cmara Neubauer en la platina del microscopio y enfocar con el objetivo 10x. f) Localizar el cuadro central de la rejilla (ubicando la cuadrcula de 25 cuadros de 0.04 mm2), hacer un cambio de lente al objetivo de 40x y contar el nmero de clulas de 4 o ms subdivisiones. Evitar contar dos veces la misma clula u omitir alguna. g) En caso de que el nmero de clulas sea muy elevado y se dificulte su conteo, ser necesario diluir la suspensin en una proporcin conocida, la que deber ser tenida en cuenta en la estimacin final. h) Calcular el nmero de clulas con la ecuacin 1
Fugelsang, K.C. and Edwards, C.G. (2007). Wine Microbiology. Practical applications and procedures., Edn. 2nd. (Springer, USA).
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INGENIERA BIOTECNOLGICA 1.5 Determinacin de azcares reductores y azcares totales.

1) Azcares reductores
Colocar 0.1mL mL de reactivo de DNS en un tubo Eppendorf, posteriormente adicionar 0.1, de la solucin problema. Se puede homogeneizar con la punta. Se puede sellar la tapa del tubo con Egapack, para evitar que se abran durante la ebullicin. Poner a bao mara (ebullicin) por 5 min. Llevarlo despus a hielo por 10 min. Aadir a 1mL de agua destilada. Agitar en el vortex y dejar hasta que est a temperatura ambiente, posteriormente: Leer la absorbencia a 540nm. 1.1 Curva tipo de maltosa. La curva patrn se realiza con maltosa en un rango de concentracin de 0 a 2.0 g/L Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1 y tratarla de acuerdo a la tcnica de azcares reductores. Tabla 1. Diluciones para la curva patrn de maltosa. Concentracin de maltosa en la muestra (g/L) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Volumen de la solucin de maltosa de 2 g/L (mL) 0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Volumen de agua destilada (mL) 1.00 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
Tubo 1. (Blanco) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotmetro.
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INGENIERA BIOTECNOLGICA Elaborar la curva patrn en donde se grafique en el eje de las ordenas (ejey) promedio de la absorbancia determinada a 540 nm y el en el eje de las abscisas (ejex) el promedio de la concentracin de maltosa determinada en g/L. Determina la ecuacin de la lnea recta que relaciona a los dos parmetros: y = mx + b En donde y representa la absorbancia determinada a 540 nm. x representa la concentracin de maltosa determinada en g/L. La curva patrn ser correcta cuando se obtenga una r mayor o igual a 0.98, con lecturas de absorbancia entre 0 y 1.
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INGENIERA BIOTECNOLGICA 2) Azcares Totales por el mtodo de Antrona Solucin de antrona: 0.2 g de antrona disuelta en 5 ml de etanol, y aforar a 100 Ml con H2SO4 al 75%. (ver prctica 1.3)
Adicionar 0.2 mL de muestra en un tubo Eppendorf, posteriormente adicionar lentamente 1 mL de solucin de antrona, agregar la antrona lentamente, es una reaccin exotrmica. Cuando este mtodo se realiza
con volmenes mayores ej 1 mL de muestra y 5 de antrona debe realizarse en frio (en bao de hielo porque es muy exotrmica)
Agitar en Vortex y luego llevar a ebullicin en bao Maria durante 10 min (cuidado de que no se abras los tubos, es muy cido, se recomienda sellar las tapas con una tira de Egapack). Enfriar en hielo (para detener la reaccin). Posteriormente sacar del hielo y dejar a temperatura ambiente Leer a 650 nm (cuando la muestra ya est a temperatura ambiente). 2.2 Curva tipo de sacarosa. La curva patrn se realiza con sacarosa en un rango de concentracin de 0 a 100 mg/L Preparar diluciones, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 2 y tratarla de acuerdo a la tcnica de antrona. Tabla 2. Diluciones para la curva patrn de sacarosa. Concentracin de sacarosa en la muestra (mg/L) 0.0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Volumen de la solucin de sacarosa 100 m g/L
Tubo 1. (Blanco) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
(mL) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
Volumen de agua destilada (mL) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotmetro. Determina la ecuacin de la lnea recta que relaciona a los dos parmetros: y = mx + b 19

INGENIERA BIOTECNOLGICA 1.6 Determinacin de protena. Objetivo Determinar la concentracin de protena de una solucin enzimtica con el mtodo de Bradford. Introduccin La determinacin de la concentracin de protenas puede realizarse por varios mtodos, entre ellos: 1. Leyendo la absorbancia a 280 nm, si se conoce el valor de su 280 [g-1L cm-1], por ejemplo para la albmina de suero bovino (BSA) su 280 [g-1L cm-1] es de 0.667. *280: coeficiente de extincin a 280 nm (en la regin Ultravioleta del espectro de luz) Si no se conoce el coeficiente, se puede hace una curva tipo con la albmina de suero bovino (BSA), como se indica en la tabla 3: Tabla 3. Curva patrn de BSA para lectura en 280 nm.
Sol. de BSA 1000 g/mL (mL) Agua destilada (mL) Concentracin de BSA ( g/mL)
0.0 0.10
0.2
0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90
1.0 0.0 1000
1.0 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Se lee la absorbancia a 280 nm ajustando el equipo con un blanco de reactivos (el que no contiene protena). Con los datos graficar, realizar una regresin lineal y obtener la ecuacin de la recta, con la que se calcular la concentracin de la protena problema.
20

INGENIERA BIOTECNOLGICA 2. Mtodo de Bradford: El mtodo de Bradford involucra la unin del azul brillante de Coomassie G-250 a la protena. Esta unin provoca un cambio en el mximo de absorcin de 465 a 595 nm y este incremento a 595 nm es lo que permite la cuantificacin. Dicha unin es independiente de la composicin de aminocidos de las protenas. La concentracin de protena se determina por medio de una curva tipo con Seroalbmina Bovina (BSA) y el reactivo de Bradford. Desarrollo experimental Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de BSA de 0 a 200 g/mL, a partir de una solucin de 200 g/mL, (Tabla 4). Agregando en un tibo eppendorf limpio las cantidad de solucions de BSA y agua como se indica en la tabla 4 para obtener un volumen final de .02 mL de muetra Tabla 4. Curva Tipo de albmina de suero bovino (BSA), para determinacin de protena por Bradford
(BSA) 200 0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25 g/mL (mL) Agua destilada 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0 (mL) Concentracin de BSA 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 (g/mL)
Posteriormente adicionar 0.75 mL de reactivo de Bradford, y dejar EXACTAMENTE 5 min y lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con el blanco de reactivos o agua (el que no contiene protena) La cantidad de protena contenida en la muestra se determina interpolando en la ecuacin obtenida con la curva tipo de seroalbmina bovina a diferentes concentraciones. PROBLEMA: Determinar la concentracin de una solucin de tripsina por espectrofotometra a 280 nm. . A partir de una solucin que contenga X mg/mL de tripsina (en agua destilada) hacer por triplicado 7 diluciones adicionando 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5 mL de la solucin de tripsina y agregar a cada uno agua destilada para llevar a un volumen final de 1.0 mL (0.99, 0.98, .095, 0.9, 0.8, 0.75 y .05 mL), de agua respectivamente) y leerlas a 280 nm. Posteriormente de estas diluciones que tengan lecturas dentro de la curva, tomar tres de ellas para hacer la determinacin de la concentracin por el mtodo de Bradford, considerando la sensibilidad de este mtodo.
21

INGENIERA BIOTECNOLGICA Informe 1. Establecer la curva patrn de protena con Bradford y otra por espectrofotometra a 280 nm. 2. Calcular la concentracin de protena de la solucin de tripsina usando los dos mtodos de determinacin de protena. 2. Discutir los resultados obtenidos. Cuestionario 1. 2. 3. 4. En qu se basa el mtodo de Bradford? En qu tiempo hay que leer la muestra en el mtodo Bradford y por qu? Cul es la ventaja del mtodo de Bradford? Qu otros mtodos de determinacin de protena existen, en que se basan y su intervalo de sensibilidad?
Referencia. Bradford, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
22

INGENIERA BIOTECNOLGICA INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA
1.7 Medicin de la actividad cataltica de enzimas y/o de extractos crudos enzimticos: Amilasas.
OBJETIVO Determinar la actividad enzimtica de la -amilasa y calcular las unidades de actividad enzimtica. DESARROLLO EXPERIMENTAL 1.Preparar una solucin de almidn: 1% (p/v): Se suspende 1g de almidn en 100 mL de regulador de fosfatos, 0.1M, pH 7.0, Posteriormente se desnaturaliza por calor en un bao de agua a 60 C durante 15 min, para pregelatinizar el almidn. Reactivos: Almidn 1.0 % (p/v) Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M Reactivo de DNS -amilasa Reactivo de Bradford 2. Realizar curva tipo de maltosa por el mtodo de azcares reductores DNS. Realizar la curva de maltosa de 0.0 a 2.0 g/L. y determinar por mtodo de DNS (prctica 1.5) 3. Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6) a la solucin de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva obtenida en la prctica 1.6. 4. Cintica de hidrlisis del almidn: Tener antes de iniciar un el bao de agua en ebullicin y otro de hielo. 1) Para cada muestra a la que se determinar actividad, tener listo un tubo eppeddorf de 1.5 mL con 0.1/mL del reactivo DNS (10 tubos). 2) Por separado poner en tubos Eppendorf de 1.5 mL, 0.95 mL de la solucin de almidn 1% a 20C.. 3) Aadicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa (excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener la reaccin en el tiempo exacto. Para el tiempo cero tomar inmediatamente 23

INGENIERA BIOTECNOLGICA 0.1 mL de la mezcla de reaccin (otra persona), transferirlo rpidamente a un tubo conteniendo 0.1 mL de reactivo DNS (ste ser el testigo). Realizar: un el Blanco sin agregar la enzima, es decir a los 0.1 mL de DNS, adiciones 0.1 mL de solucin de almidn. 4) Dejar que la reaccin se desarrolle a tres tiempos y por triplicado (9 tubos) 0.0 (testigo), 3.0 y 6.0 minutos exactamente. Transcurrido el tiempo EXACTO transferir 0.1 mL de la mezcla de reaccin a uno de los tubo que ya contiene 0.1 mL del reactivo DNS. 5) Tratar todos los tubos al mismo tiempo segn la tcnica de DNS: Poner en bao de agua a ebullicin durante 5 min, exactamente. Cuidar de que no entre agua a los tubos. 6) Transcurrido el tiempo sacra y poner en hielo o un bao de agua fra durante 10 min. 7) Posteriormente aadir 1.0 mL de agua destilada a dicha solucin. 8) Se homogeniza la solucin invirtiendo con la mano los tubos. 9) Se determina la absorbancia a 540 nm, ajustando a cero con el blanco, determinando la absorbancia para cada tubo testigo y problema (tiempo 3 y 6 min). La absorbancia del tubo testigo se resta al tubo problema con la finalidad de eliminar la absorbancia que no sea atribuible a la reaccin enzimtica. . 10) Se utiliza la curva patrn de DNS realizada con maltosa para determinar la concentracin de azucares reductores expresados como mg maltosa/ mL de la muestra. 11) Expresar la actividad enzimtica en unidades de actividad de alfa amilasa/mL. Considerar la siguiente definicin de una unidad de actividad alfa amilasa: cantidad de enzima que libera 1 mg de maltosa a partir de almidn despus de 1 min de reaccin con la enzima a 20C y pH 6.9 III. INFORME: 1. Elaborar la curva tipo Abs540nm vs concentracin de maltosa y determinar la ecuacin de la regresin lineal. 2. Calcular la actividad enzimtica en unidades de actividad enzimtica (U) y actividad especfica (Uesp).
U =
[ producto ]t1 [ producto ]t 0

t
U esp =
[ producto ]t1 [ producto ]t 0 (t )[ protena ]
3. Hacer la grfica de unidades de actividad de amilasa vs tiempo de reaccin. 4. Cules son los productos de esta reaccin? 5. Recopilar y comparar los resultados de todos los equipos, discutir si hay diferencias.
24

1.8 Efecto de la concentracin de enzima en la actividad enzimtica de una amilasa.

OBJETIVO Determinar el efecto de la concentracin de enzima en la actividad denzimtica. DESARROLLO EXPERIMENTAL Preparacin del sustrato: Almidn al 1.0 % en regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M preparado como se indic anteriormente. Reactivos: Almidn 1.0 % (p/v) Regulador de fosfatos pH 7.0, 0.1M Reactivo de DNS -amilasa Reactivo de Bradford 1. Determinacin de la concentracin de protena en la solucin enzimtica. Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6) a la solucin de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva obtenida en la prctica 1.6. 2. Efecto de la concentracin de la enzima en la velocidad de la reaccin enzimtica. a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 6, adicionando, por triplicado, 0.95 mL de sustrato a diferentes concentraciones. b) Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa (excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener la reaccin en el tiempo exacto a la reaccin c) Incubar los tubos por 5 min (tiempo de reaccin) en un bao o termomixer a 25C. d) Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS. 25

INGENIERA BIOTECNOLGICA e) Continuar la determinacin de DNS de acuerdo a lo indicado en la prctica 1.5 y 1.7. La reaccin se llevara cabo a pH (7.0), tiempo de reaccin y tempertaura constante, siendo la nica variable la concentracin de enzima . Tabla 6. Soluciones para determinar el efecto de concentracin de la enzima en la actividad enzimtica .
Tubo
Soluciones de Amilasa (mg/mL) Volumen de Sol. Sustrato (mL) Vol. de sol. de enzima en PO4 pH 7.0, 0.1M (mL)
Testigo* * 0.95
3P1 0.25 0.95
3P2 0.5 0.95
3P3 1.0 0.95
3P4 2.0 0.95
3P5 3.0 0.95
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
* 3P, significa 3 tubos Problema *Para cada concentracin de enzima se hace un testigo, para lo cual inmediatamente despus de adicionar los 0.05 mL de enzima, de pasa al tubo con DNS. Realizar el blanco con sol de almidn Procedimiento: A INFORME: 1. Hacer la grfica de unidades de actividad de amilasa vs concentracin de enzima. 2. Discutir los resultados de las actividades enzimticos obtenidos por todos los equipos del grupo.
26

1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica.

OBJETIVO Estudiar el efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica de una enzima: -amilasa. 1. Determinacin de la concentracin de protena en la solucin enzimtica. Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6) a la solucin de enzima proporcionada. Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva obtenida en la prctica 1.6. 2. Efecto de la temperatura en la actividad cataltica de las enzimas. a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 7, adicionando, por triplicado para cada temperatura a ensayar, 0.95 mL de sustrato (almidn al 1%) y llevarlos a la temperatura deseada ponindolos en un bao mara. Tabla 7. Soluciones y temperaturas para la prueba de efecto de la temperatura en la actividad enzimtica . Tubo
Temperatura de reaccin (C) Sol. de Almidn 1.0 % (mL)
Testigo* Uno por cada temperatura
3P1 25
3P2 35
3P3 45
3P4 55
3P5 65
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
0.95
*Sol. de Enzima en regulador PO4 pH 7.0 (mL)
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
*-Amilasa: 1.0 mg/mL 3P, significa 3 tubos Problema
27

b) c) d) e)
INGENIERA BIOTECNOLGICA Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa (excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener la reaccin en el tiempo exacto a la reaccin Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5 min (tiempo de reaccin) en un bao a cada temperatura. Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS. Continuar la determinacin de DNS de acuerdo a lo indicado en la prctica 1.5 y 1.7.
La reaccin se llevara cabo a tiempo constante de reaccin y concentracin de enzima constante, siendo la nica variable la temperatura de reaccin. 3. Determinacin de la concentracin de protena en la solucin enzimtica. Determinar, por triplicado, protena por el mtodo se Bradford (prctica 1.6) a cada solucin de enzima proporcionada (cada pH). Hacer diluciones si es necesario. Tomar 0.25 mL de muestra, adicionar 0.75 mL de sol. de Bradford, esperar 5 min y leer a 595 nm. Determinar la concentracin con la curva obtenida en la prctica 1.6. 4 Efecto del pH en la actividad cataltica de las Enzimas
Reactivos: Almidn 1.0 % (p/v) en Reguladores a diferentes pH Regulador de Acetatos pH 5.0 Regulador de Fosfatos pH 6.0, 7.0 y 7.5 0.1 M Regulador de Boratos pH 8.0, 9.0 y 10.0 Preparar las soluciones de enzima con el regulador de pH indicado por el profesor. a) Preparar una serie de tubos Eppendorf, como se indica en la tabla 8, adicionando, por triplicado para cada pH a ensayar, 0.95 mL de sustrato (almidn al 1%). b) Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa (excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos para poder detener la reaccin en el tiempo exacto a la reaccin c) Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5 min (tiempo de reaccin). d) Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS. e) Continuar la determinacin de DNS de acuerdo a lo indicado en la prctica 1.5 y 1.7.
28

INGENIERA BIOTECNOLGICA Tabla 8. Soluciones de enzima a diferentes pH para determinar el efecto del pH en la actividad enzimtica. Tubo
pH Sol. de almidn al 1.0 % (mL) Enzima + regulador al pH indicado (mL)
Testigo*
3P1 5.0
3P2 6.0 0.95 0.05
3P3 7.0 0.95 0.05
3P4 7.5 0.95 0.05
3P5 8.0 0.95 0.05
3P6 9.0 0.95 0.05
3P7 10.0 0.95 0.05
0.95 0.05
0.95 0.05
3P, significa 3 tubos Problema. * Para cada pH se hace un testigo. Seguir el mismo procedimiento indicado en el experimento del efecto de la concentracin de enzima. INFORME: 1. Hacer la grfica de Unidades de actividad de amilasa vs temperatura de reaccin. 2. Hacer la grfica de Unidades de actividad de amilasa vs pH de la reaccin. 3. Discutir los resultados de las actividades enzimticos obtenidos por todos los equipos del grupo.
29

Laboratorio de Bioconversiones

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1.8 Efecto de la concentracin de enzima en la actividad enzimtica de una amilasa.

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3P1 0.25 0.95

3P2 0.5 0.95

3P3 1.0 0.95

3P4 2.0 0.95

3P5 3.0 0.95

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1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica.

Testigo* Uno por cada temperatura

*Sol. de Enzima en regulador PO4 pH 7.0 (mL)

*-Amilasa: 1.0 mg/mL 3P, significa 3 tubos Problema

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3P2 6.0 0.95 0.05

3P3 7.0 0.95 0.05

3P4 7.5 0.95 0.05

3P5 8.0 0.95 0.05

3P6 9.0 0.95 0.05