III.

METODE PENELITIAN

A.Desain Penelitian Penelitian ini merupakan eksperimental laboratorik untuk mengetahui perbedaan tingkat kesembuhan antara luka bakar yang diberikan madu murni dan diberikan tumbukan daun pada tikus putih (rattus norvegicus ) jantan dewasa galur Sprague Dawley. Menggunakan post test only controlled group design.

B.Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilakukan di Pet House Fakultas Kedokteran Universitas ampung sebagai tempat adaptasi dan perlakuan pada hewan per!obaan" sedangkan pembuatan preparat dan pengamatannya dilakukan di aboratorium Patologi #natomi dan Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Penelitian dilaksanakan $ovember %&'(. ampung.

45

C. Sampel Penelitian )ampel pada penelitian ini berjumlah * ekor tikus putih ( Rattus norvegicus) jantan dewasa galur sprague Dawley berumur (+, bulan yang dipilih se!ara random. Pemilihan sampel digunakan dengan !ara simple random sampling. Pada uji eksperimental ini" variabel yang diuji adalah numerik berpasangan sehingga perhitungan sampel dihitung dengan rumus (-ahlan" %&&.).

-engan nilai / 0 1 2 (3/ 0 '".*)" 4 0 %& 2 (34 0 &"5,)" simpangan baku 0 ) dan perbedaan selisih rerata skor histopatologi yang diharapkan sebagai (

).

) 0 '"1

46

Maka jumlah minimal sampel adalah '5 ekor tikus. 6adi tiap perlakuan

dibutuhkan minimal * sampel ( 7*) untuk masing+masing perlakuan dan jumlah perlakuan sebanyak ( kali" sehingga total sampel minimal yang dibutuhkan adalah sebanyak '5 sampel yang didapatkan pada * ekor tikus putih dari populasi yang ada. $amun pada penelitian ini digunakan 5 ekor tikus putih" sehingga didapatkan '5 sample dan * sampel sebagai !adangan. #dapun perlakuan yang diberikan pada masing+masing tikus adalah

47

'). )ampel kontrol yaitu bagian tubuh tikus di daerah punggung bawah kanan yang diberi luka bakar derajat 88 dengan diameter % !m yang akan dibiarkan sembuh se!ara normal tanpa pemberian 3at akti9. %). )ampel perlakuan madu yaitu bagian tubuh tikus di daerah punggung kiri yang diberi luka bakar derajat 88 dengan diameter % !m" selama proses penyembuhan akan diberikan preparat madu diberikan se!ara topikal %:( kali sehari dan ditutup dengan kassa steril. (). )ampel perlakuan tumbukan daun binahong yaitu bagian tubuh tikus di daerah punggung kanan atas yang diberi luka bakar derajat 88 dengan diameter % !m" selama proses penyembuhan luka diberikan tumbukan daun binahong se!ara topikal %:( kali sehari dan ditutup dengan kassa steril. %:( kali sehari dan ditutup dengan kassa steril.

Tabel 2. 6enis perlakuan penelitian dan dosis yang diberikan pada setiap perlakuan.

Hewan Per!obaan ;ikus dengan uka bakar derajat 88

6enis Perlakuan Kontrol (tanpa pemberian 3at akti9

-osis #<uades %=> hari

Madu

;opikal %=> hari

;umbukan daun ;opikal %=> hari

48

binahong

D. K ite ia Inklusi dan Eksklusi Inklusi! a. )ehat (tidak tampak penampakan rambut kusam" rontok" atau botak" dan bergerak akti9) b. !. ?erjenis kelamin jantan ?erusia sekitar (:, bulan

Eksklusi! a. ;erdapat penurunan berat badan lebih dari '&2 setelah masa adaptasi di laboratorium b. )akit (penampakan rambut kusam" rontok atau botak dan aktivitas kurang atau tidak akti9" keluarnya eksudat yang tidak normal dari mata" mulut" anus" genital).

49

E.

Ba"an dan Alat Penelitian #.Ba"an Penelitian ?ahan penelitian yang digunakan yaitu @ madu murni "tumbukan daun binahong" plester" kassa steril" a<uadest" alkohol" obat anastesi lidokain" tikus putih (Rattus norwegicus) jantan dewasa galur Sprague dawley" pakan dan minum tikus "larutan 9ormalin '&2 untuk 9iksasi preparat histopatologi" alkohol" etanol" =ylol" pewarna hematoksilin dan eosin" entelan dan kamera digital untuk dokumentasi.

2.Alat Penelitian #lat penelitian yang digunakan adalah pisau !ukur dan gagangnya" gunting untuk men!ukur rambut>bulu tikus" penggaris" sarung tangan steril" bengkok" kom" solder listrik (ele!tro !auter) yang ujungnya dimodi9ikasi dengan logam aluminium berdiameter %!m" kipas angin" gunting plester" pinset anatomis" spuit '!! dan jarum" kassa steril" kandang serta botol minum tikus" mikroskop !ahaya" object glas" cover glass, deck glass" tissue cassette" rotary microtome" oven" water bath" platening table" autotechnicom processor" staining jar" staining rak" kertas saring" histoplast" dan para9in dispenser.

50

$.%a iabel Penelitian

#.%a iabel bebas &independent 'a iabel( Pemberian 3ak akti9 pada tikus putih (Aattus noerwegi!us) 6antan dewasa "yaitu madu murni dan tumbukan daun binahong

2.%a iabel Te ikat&Dependent 'a iabel( ;ingkat kesembuhan luka bakar se!ara mikroskopik dan mikroskopik

51

).De*inisi Ope asi+nal

Tabel 2. -e9inisi Bperasional %a iabel Madu Murni De*inisi Madu yang berasal dari petani" tanpa adanya !ampuran gula maupun air. Cang diberikan pada permukaan luka bakar. -aun binahong yang telah dehaluskan se!ara normal dengan !ara ditumbuk. Cang diberikan pada permukaan luka bakar uka bakar yang men!apai dermis" dan terbentuk" gelembung atau bula yang berisi !airan eksudat '.)ediaan dilihat pada pembesaran ,&= se!ara a!ak di setiap spesimen dari biopsi insisi luka yaitu@ pembentukan kolagen" tingkat pembentukan epitelisasi" sel radang dan jumlah pembentukan pembuluh darah baru. %. -iameter luka bakar Skala ,ku Katagorik

;umbukan daun binahong

Katagorik

uka ?akar -erajat 88

Brdinal

Dambaran mikroskopik kulit tikus

Brdinal

$umerik

52

-.P +sedu Penelitian #.Pe siapan ;ikus putih (Aattus norwegi!us) jantan dewasa )prague -awley yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Fakultas Peternakan 8nstitut Pertanian ?ogor .Penelitian ini menggunakan 5 ekor tikus putih (rattus

norwegi!us) galur )prague dawley" sebelumnya dilakukan adaptasi di laboratorium Patologi #natomi Fakultas Kedokteran Universitas ampung dan diberi pakan standar se!ukupnya selama E hari. )etelah masa adaptasi" tikus dipisahkan dan masing masing di masukan kedalam kandang.

2.Pembuatan Luka Baka De a.at II Fara pembuatan luka bakar derajat 88 (Handian" %&&*) @ a. b. ;entukan terlebih dahulu daerah yang akan dibuat luka bakar Hilangkan bulu dengan men!ukur sesuai dengan luas area luka bakar yang diinginkan !. d. Pasang perlak dan alasnya di bawah tikus yang akan dibuat luka bakar Fu!i tangan dan pakai sarung tangan

53

e.

akukan anestesi pada area kulit yang akan dibuat luka bakar dengan dosis &"% !! lidokain dalam % !! a<uades

9.

Dunakan solder listrik (electro cauter) yang ujungnya dimodi9ikasi dengan logam aluminium berdiameter % !m yang telah dipanaskan selama (& menit dan tempelkan pada kulit tikus yang telah diberika anastesi.

/.P +sedu Penan0anan Luka Baka De a.at II Pada 5 tikus yang masing masing mendapatkan ( luka bakar akan dilakukan ( perlakuan yaitu" a<uades (kontrol)" tumbukan daun binahong" dan madu murni. )ebelum diberikan preparat madu murni pada luka atau pemberian tumbukan daun binahong" luka dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan air a<uadest. ?erikut prosedur penanganan luka bakar yang akan dilakukan pada tikus per!obaan@ a. Fu!i tangan b. ;empatkan perlak yang dilapisi kain di bawah luka yang akan dirawat. !. Pakai sarung tangan steril dan siapkan kasa. d. #tur posisi tikus untuk mempermudah tindakan e. Blesi bagian luka dengan kasa yang telah dibasahi dengan madu setebal % mm hingga menutup seluruh permukaan luka untuk kelompok perlakuan Madu Murni . 9. Blesi bagian luka dengan tumbukan daun binahong setebal %mm sampai menutup luka tersebut

54

g. ;utup luka dengan kasa steril h. Untuk kelompok kontrol tidak diberikan 3at akti9 apapun" namun dibersihkan dengan a<uades.

1.P +sedu Ope asi+nal Pembuatan Slide Metode pembuatan preparat ?agian Patologi #natomi Fakultas Kedokteran Universitas ampung. a. Prosedur pembuatan blok para9in @ ') Brgan telah dipotong se!ara melintang dan telah di9iksasi menggunakan 9ormalin '&2 selama ( jam. %) ?ilas dengan air mengalir sebanyak (:1 kali. () -ehidrasi dengan @ a) b) !) d) e) 9) g) h) #lkohol E&2 selama &"1 jam #lkohol .*2 selama &"1 jam #lkohol .*2 selama &"1 jam #lkohol .*2 selama &"1 jam #lkohol absolut selama ' jam #lkohol absolut selama ' jam #lkohol absolut selama ' jam #lkohol =ylol '@' selama &"1 jam

,) Clearing dengan menggunakan@

55

Untuk membersihkan sisa alkohol" dilakukan clearing dengan =ylol 8 dan 88 masing+masing selama ' jam. 1) 8mpregnansi dengan para9in selama ' jam dalam oven suhu *1oF. *) Pembuatan blok para9in@ )ebelum dilakukan pemotongan blok para9in" para9in didinginkan dalam lemari es. Pemotongan menggunakan rotary microtome dengan menggunakan disposable kni e. Pita para9in dimekarkan pada water bath dengan suhu *&oF. -ilanjutkan dengan pewarnaan hematoksilin eosin.

b.

Prosedur pulasan Hemato=ylin : Gosin @ )etelah jaringan melekat sempurna pada slide" memilih slide yang terbaik selanjutnya se!ara berurutan memasukkan ke dalam 3at kimia di bawah ini dengan waktu sebagai berikut.

') -ilakukan depara9inisasi dalam@ a) b) !) arutan !ylol 8 selama 1 menit arutan !ylol 88 selama 1 menit Gthanol absolut selama ' jam

%) "ydrasi dalam@ a) b) !) () #lkohol .*2 selama % menit #lkohol E&2 selama % menit #ir selama '& menit Pulasan inti dibuat dengan menggunakan@

56

a) b) !) ,) a)

Haris hematoksilin selama '1 menit #ir mengalir Gosin selama maksimal ' menit anjutkan dehidrasi dengan menggunakan@ #lkohol E&2 selama % menit

b) #lkohol .*2 selama % menit !) #lkohol absolut % menit 1) Penjernihan@ a) #ylol 8 selama % menit b) #ylol 88 selama % menit *) $ounting dengan entelan lalu ditutup dengan deck glass

57

;ikus ' ;ikus % ;ikus ( ;ikus , ;ikus 1 ;ikus * ;ikus E ;ikus 5

-iadaptasi selama E hari Masing+masing tikus diberi luka bakar pada ( lokasi perlakuan dengan logam panas berdiameter % !m ;erdapat %, sampel luka bakar -iberi perawatan selama ', hari
Hari ke ' Hitung diameter luka bakar ada hari ke % H ', dan ', Perlakuan ' Perlakuan % Perlakuan ( -ibersihkan dengan dibersihkan dengan dibersihkan dengan a<uades ' = sehari a<uades dan dressing a<uades dan dressing madu '&&2 tumbukan daun binahong tebal %mm % = sehari tebal %mm % = sehari

;ikus dinarkosis -iambil sampel biopsi pada daerah luka bakar )ampel dikirim ke laboratorium Histologi dan Patologi Fakultas Kedoteran Unila untuk pembuatan blok para9in Pengamatan sediaan mikroskopik 8nterpretasi hasil )amba 2. -iagram alur penelitian

58

I. P +sedu penelitian mak +sk+pik 3 mik +sk+pik

I. Mak +sk+pik Penyembuhan luka dinilai dengan melakukan pengukuran pada hari pertama dan hari terakhir" untuk melihat penyembuhan luka se!ara makroskopis. -iameter luka bakar rata+rata dihitung dengan !ara seperti dibawah ini ()uratman et al." '..*).

Penilaian mikroskopis penyembuhan luka dilihat pada pembesaran '&= H ,&= pada 1 lapang pandang a!ak setiap spesimen menggunakan hasil pemeriksaan patologi anatomi dari biopsi insisi luka dengan menghitung tingkat pembentukan kolagen" tingkat pembentukan epitelisasi dan jumlah

pembentukan pembuluh darah baru dengan kriteria modi9ikasi $agaoka (%&&&).

II.

Mik +sk+pik Penilaian mikroskopis penyembuhan luka dilihat pada pembesaran '&= H ,&= pada 1 lapang pandang a!ak setiap spesimen menggunakan hasil pemeriksaan patologi anatomi dari biopsi insisi luka dengan menghitung tingkat

59

pembentukan

kolagen"

tingkat

pembentukan

epitelisasi

dan

jumlah

pembentukan pembuluh darah baru dengan kriteria modi9ikasi $agaoka (%&&&).

d= (')

d= d= (() (() d= (%)

d= (,)

)amba 4. -iameter uka ?akar.

uka yang terjadi diukur diameternya seperti gambar *. Kemudian dihitung diameter rata+ratanya dengan rumus sebagai berikut@

Keterangan @

0 -iameter luka hari ke =

Untuk mengukur persentase kesembuhan dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut@

Keterangan @

60

0 Persentase penyembuhan hari ke

0 diameter luka hari pertama

0 diameter luka hari ke

Tabel /. Penilaian mikroskopis. Pa amete dan Desk ipsi 6umlah sel polimor9onukleat per lapangan pandang ;erdapat '+1 sel polimor9onukleatper lapang pandang ;erdapat *+'& sel polimor9onukleatper lapang pandang ;erdapat ''+'1 sel polimor9onukleatper lapang pandang -erajat terjadinya epitelisasi Gpitelisasi normal>lapang pandang ke!il mikroskop Gpitelisasi sedikit>lapang pandang ke!il mikroskop ;idak ada epitelisasi>lapang pandang ke!il mikroskop 6umlah pembentukan pembuluh darah baru ebih % pembuluh darah baru>lapang pandang ke!il ( mikroskop '+% pembuluh darah baru>lapang pandang ke!il % mikroskop ;idak ada pembuluh darah baru>lapang pandang ke!il ' mikroskop -erajat pembentukan kolagen Kepadatan kolagen lebih dari jaringan normal>lapang pandang ke!il mikroskop Kepadatan kolagen sama dengan jaringan normal> lapang pandang ke!il mikroskop Kepadatan kolagen kurang dari jaringan normal>lapang pandang ke!il mikroskop Sk+ ( % '

( % ' ( % '

( % '

61

5.Pen0+la"an dan Analisis Data