PRCTICA NMERO 6

FISIOLOGADELEVADURAS

UNIDAD2. MICOLOGA |

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FISIOLOGA DE LEVADURAS

INTRODUCCIN Las levaduras son hongos unicelulares, tienen forma oval o esfrica, midiendo de 3 a 15 micras de dimetro. La gran mayora de estos hongos se reproducen por gemacin, tanto sexual como asexual.

criptococosis, enfermedades que se caracterizan por ser oportunistas y tener una elevada incidencia en pacientes desnutridos, inmunocomprometidos, pacientes sujetos a prolongados tratamientos con antibiticos o quimioterpicos. Cabe aclarar que en algunas ocasiones estos hongos pueden estar como flora normal. Se sabe que el 75 al 80% de las muestras recolectadas en el laboratorio y que presentan forma levaduriforme corresponde a C. albicans. Por todo lo anterior es importante la correcta identificacin de las levaduras, las pruebas ms comnmente usadas son: a) Desarrollo de tubo germinativo. Esta prueba determina la formacin de seudohifas o tubo germinativo en Cndida albicans.

Reproduccin de levaduras. Muchos hongos de importancia mdica e industrial presentan esta forma. A nivel industrial tenemos los hongos levaduriformes que producen vitaminas, vinos, cerveza, la levadura del pan, etc. Koneman y Roberts idearon un esquema til para clasificar los hongos ms comnmente aislados en el laboratorio de Bioqumica Clnica, que consiste en determinar si el hongo es un moho ya sea hialino o demateaceo, o bien si el hongo es una levadura. Por otra parte los hongos levaduriformes de importancia mdica que ms comnmente se presentan son: La Cndida albicans y el Criptococcus neoformans causan la candidiasis y la
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A) Tubo germinal de Cndida albicas obtenido en suero humano a las 3 horas de incubacin a 37 C. B) Blastoconidio con pseudohifa.

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b) Produccin de ureasa. Esta tcnica se basa en el hecho que el C neoformans, C. krusei, algunos hongos del genero Rhodotorula ssp. y Trichosporum ssp. producen ureasa, esta tcnica es altamente sensible (99.5%) para detectar el C. neoformans.

Prueba de la fenoloxidasa (C. neoformans positivo).

Cryptococcus neoformans ureasa positivo (tubo de la derecha positivo). c) Reduccin de nitrato. Esta tcnica es til para diferenciar el C. neoformans, se basa en el hecho que este hongo es incapaz de reducir nitritos. d) Prueba de L-dopa-citrato frrico. Esta prueba es til para detectar la presencia de C. neoformans, ya que este hongo es capaz de producir fenoloxidasa, enzima que puede ser detectada por la L-dopa-citratofrrico.

e) La asimilacin y fermentacin de carbohidratos, denominadas; Auxonograma y Zimograma respectivamente. Estas pruebas son tan selectivas que pueden determinar el gnero y la especie del hongo levaduriforme. El Auxograma se realiza en placa de Petri que contiene un medio con escaso contenido de fuentes de carbono y se evala la asimilacin de carbohidratos, que son colocados en el medio de cultivo desde que se sembr el hongo por identificar.

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f) Tambin existen pruebas comerciales para identificar levaduras como son; el sistema APIYeast-Ident, API 20C y el Uni-YeastTek System. Que se basan en la asimilacin de carbohidratos. Pruebas eficientes, precisas pero muy caras.

Auxograma en agar noble. El Zimograma se realiza en tubo de ensaye que contiene un carbohidrato especfico en solucin, en una campana de Durham invertida se coloca la levadura y se evala la fermentacin del carbohidrato especfico.

Tubos con medio para la prueba de zimograma.

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OBJETIVOS: 1. Conocer las necesidades fisiolgicas de las levaduras. 2. Comprender y realizar las tcnicas de Auxonograma y el Zimograma, para la identificacin de levaduras. 3. Conocer la importancia clnica e industrial de identificar levaduras. MATERIAL POR EQUIPO: Cepa de C. albicans, en un tubo 18X150 con tapn de rosca. Cepa de C. stellatoidea, en un tubo 18X150 con tapn de rosca. Suero humano o de carnero o conejo, 3 mL Una caja de agar harina de maz. Dos cajas de agar base de levaduras ms prpura de bromocresol. Un tubo de 13X100 conteniendo una solucin estril de los siguientes carbohidratos: Manitol. Glucosa. Lactosa. Sacarosa. Maltosa. Trealosa. Galactosa. Dos tubos de solucin salina estril al 0.85%. Dos tubos 13 X100, con caldo maltosado ms PBC con campana de Durham. Dos tubos 13X100, con caldo sacarosa ms PBC con campana de Durham. Dos tubos 13X100, con caldo trealosa ms PBC con campana de Durham. Dos tubos 13X100, con caldo lactosa ms PBC con campana de Durham. Dos tubos 13X100, con caldo glucosa ms PBC con campana de Durham. Dos tubos 13X100, con caldo manitol ms PBC con campana de Durham. Dos tubos 13X100, con caldo galactosa ms PBC con campana de Durham. Diez discos de papel filtro estriles, en un tubo 18X150 con tapn de rosca. Un mechero. Cinco pares de hisopos estriles. Un microscopio. Cubreobjetos y portaobjetos.

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MTODO

e) Observe al microscopio en busca del desarrollo del tubo germinal y reporte el resultado.

I) Produccin de Clamidioesporas. a) Divida por la mitad la caja de agar harina de maz y en cada mitad siembre cada cepa en forma de Z. b) Incube a 37C por 24 a 48 horas. c) Tome una pequea muestra de cada mitad en un portaobjetos y agregue una gota de solucin salina. d) Observe al microscopio y reporte el tipo de desarrollo.

Produccin de tubo germinal. III) Auxonograma. a) Cada cepa de levadura se suspende en solucin salina fisiolgica estril. b) Introduzca en cada tubo un hisopo estril y siembre masivamente cada levadura en su respectiva caja con prpura de bromocresol. c) Humedezca los discos de papel filtro estril (marcar los discos con lpiz), con cada una de la soluciones de carbohidratos, deje secar el exceso y coloque todos los discos en la caja de Petri ya sembrada. d) Se incuba a 37C por 24 a 48 horas. e) Se reporta el crecimiento de cada levadura alrededor de cada uno de los discos. f) Se interpreta de la siguiente forma; un crecimiento indica que hubo asimilacin de ese carbohidrato por parte del hongo, un halo de

Produccin de Clamidioesporas II) Produccin de Tubo Germinal. a) En dos tubos de ensaye coloque aproximadamente 1 mL de suero de conejo, carnero o humano. b) Inocule una asada de cada cepa de hongo. c) Incube a 35C durante 3 horas. d) Al trmino de la incubacin, tome una gota de la solucin de cada tubo, en su respectivo portaobjetos y se coloca un cubreobjetos.
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inhibicin alrededor del disco indica que no hubo asimilacin de la azcar por parte del hongo. ** Compare los resultados obtenidos con los reportados en la bibliografa. ** IV) Zimograma. a) Inocule cada cepa de levadura en cada tubo que contiene el carbohidrato ms prpura de bromocresol. b) Incube a 37C por 24 a 48 horas, lea y reporte los resultados. c) Interprete cualquier cambio o gas detectado, indica fermentacin del carbohidrato. ** Compare los resultados obtenidos con los reportados en la bibliografa. ** DIAGRAMA DE FLUJO I) Produccin de Clamidioesporas.

II)

Produccin de Tubo Germinal. Inocular asada de cepa de hongo en tubo con suero e incubar.

Colocar una gota en portaobjetos, cubrir y observar al microscopio.

III)

Auxonograma. Sembrar masivamente cada levadura en caja correspondiente.

Dividir medio agar harina de maz y sembrar en forma de Z.

Incubar y despus observar al microscopio agregando una gota de solucin salina.

Colocar discos humedecidos en cajas ya sembradas e incubar.

Reportar crecimiento de cada levadura.

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IV)

Zimograma.

REFERENCIAS 1. Herrera T, Ulloa M. El reino de los hongos. Mxico: Editorial Fondo de Cultura Econmica y UNAM; 1990. 2. Koneman R. Micologa prcticas de laboratorio. Argentina: Editorial Panamericana; 1993. 3. Rippon J. Tratado de micologa mdica. Mxico: Editorial Interamericana; 1990.

Inocular levadura en cada tubo con carbohidrato y purpura de bromocresol e incubar.

Reportar si hay fermentacin.

CUESTIONARIO 1. Cul es la diferencia entre asimilacin y fermentacin de un carbohidrato, por parte de una levadura? 2. Describa someramente la moniliasis, candidiasis sistmica y la criptococosis. 3. Describa en qu consisten los sistemas de identificacin API-20C y Uni-Yeast-Tek System. 4. Qu otras tcnicas de identificacin de levaduras hay y que no se incluyeron en la prctica (dos)? 5. Por qu motivo, se sembr en Z en la caja de agar harina de maz?

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