Métodos Ecotoxicológicos para La Evaluación de Suelos Contaminados Con Hidrocarburos

Mtodos ecotoxicolgicos para la evaluacin de suelos contaminados con hidrocarburos
MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN

DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs
MARA DEL CARMEN CUEVAs DAZ, GUILLERMO EsPINOsA REYEs, CsAR ARTURO ILIZALITURRI HERNNDEZ Y ANIA MENDOZA CANT EDITOReS
Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT) Instituto Nacional de Ecologa (INE) Universidad Veracruzana Fondos Mixtos COnacYT
Primera edicin: 2012
D.R. Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales
Blvd. Adolfo Ruiz Cortines 4209. Col. Jardnes en la Montaa C.P. 14210. Delegacin Tlalpan, Mxico, D.F. www.semarnat.gob.mx Instituto Nacional de Ecologa (INE-SEMARNAT) Perifrico Sur 5000. Col. Insurgentes Cuicuilco C.P. 04530. Delegacin Coyoacn, Mxico, D.F. www.ine.gob.mx
ISBN 978-607-7908-62-3 Impreso y hecho en Mxico Printed in Mexico
ndice
AGRADECIMIENTOs PRLOGO
Ania Mendoza Cant
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INTRODUCCIN
Mara del Carmen Cuevas Daz y ngeles Martnez Toledo
1 TCNICAs PARA EL ANLIsIs DE ACTIVIDAD ENZIMTICA EN sUELOs

Marisol Montejo Martnez, Cinthya Paulina Torres Lpez, ngeles Martnez Toledo, Jos Alfredo Tenorio Lpez, Mara del Roco Cruz Coln, Fernando Rafael Ramos Morales y Mara del Carmen Cuevas Daz
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2 EVALUACIN DE LA TOXICIDAD DE LOs sUELOs MEDIANTE BIOENsAYOs CON LOMBRICEs

Adriana Palafox Alejo, ngel Hctor Hernndez Romero, Jaime Lpez Luna, Mara del Carmen Cuevas Daz
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3 EVALUACIN DE LA TOXICIDAD DE LOs sUELOs MEDIANTE BIOENsAYOs CON sEMILLAs Mara del Carmen Cuevas Daz, Joahana de la Luz Rosaldo Santiago,
Jaime Lpez Luna
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4 ENsAYO COMETA EN FAUNA TERREsTRE

Donaji J. Gonzlez-Mille, Guillermo Espinosa-Reyes, Csar Ilizaliturri-Hernndez, Jos de Jess Meja Saavedra, Yolanda Jasso-Pineda, Fernando Daz-Barriga
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5 REQUERIMIENTOs DE CONTROL DE CALIDAD EN BIOENsAYOs

Mara del Carmen Cuevas Daz, Guadalupe Pinette Medina, ngel Mario Lpez Hidalgo, Jess Samuel Cruz Snchez, Mara de Lourdes Nieto Pea
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Agradecimientos
Agradecemos al Fondo Mixto Veracruz por haber nanciado el proyecto 37127 Aplicacin de residuos agroindustriales en la recuperacin por cultivo slido de un suelo contaminado con hidrocarburos y evaluacin ecotoxicolgica, ya que hizo posible realizar este trabajo en la regin sur del estado de Veracruz. Como fruto de este esfuerzo, compartido con estudiantes de la Universidad Veracruzana, integrantes del cuerpo acadmico y colaboradores externos, se desarrollaron los captulos uno, dos, tres y cinco de este libro. Asimismo, agradecemos el apoyo de PEMEX Renacin Ductos por la disposicin mostrada hacia el desarrollo del proyecto y por facilitarnos el acceso a sus instalaciones para tomar muestras de suelo; al Ingenio Cuatotolapan de Juan Daz Covarrubias por donar la cachaza y el bagazo de caa de azcar necesarios para las pruebas de laboratorio y de campo; a la compaa CEISA por las facilidades otorgadas en la instalacin de la biopila en campo; a las autoridades universitarias que impulsan el desarrollo de la investigacin en los diferentes campus asentados en territorio veracruzano. En cuanto al cuarto captulo, es fruto del esfuerzo de los colaboradores y amigos de la Universidad Autnoma de San Luis Potos (UASLP), quienes han utilizado especies de esta regin de Veracruz. A ellos les damos las gracias por la conanza depositada para la elaboracin de este libro. Por nuestra parte, los investigadores de la UASLP queremos agradecer al Instituto Nacional de Ecologa (convenio A1-047), al Fondo Sectorial SEMARNAT9
CONACYT, as como al Departamento de Toxicologa Ambiental y al Centro Colaborador de la Organizacin Mundial de la Salud en Evaluacin del Riesgo en Salud y Salud Ambiental Infantil, ambos de la Facultad de Medicina de la UASLP, por permitirnos el uso de su infraestructura.
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MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs
Prlogo
Ania Mendoza Cant
Mxico, al ser uno de los principales pases productores de petrleo en el mundo, cuenta con una amplia infraestructura para la extraccin, la distribucin, el almacenamiento y la transformacin de este recurso natural. Debido a diversas causas naturales y humanas, dicha infraestructura est sujeta con frecuencia a fugas y derrames a lo largo de las distintas etapas del ciclo de vida del petrleo y sus productos derivados. Aunque se han presentado derrames importantes en el mar, la mayora de las emergencias ambientales relacionadas con estas sustancias ocurren en la zona terrestre y, como consecuencia, uno de los recursos naturales ms afectados es el suelo. La contaminacin con petrleo, y en general con hidrocarburos, puede afectar con distinta intensidad las diversas funciones del suelo, dependiendo del tipo de producto y de la cantidad liberada. Los efectos adversos pueden presentarse como alteraciones de sus propiedades fsicas, como por ejemplo con la formacin de una capa impermeable que reduce el intercambio de gases y la penetracin de agua; de las propiedades qumicas, como seran los cambios en las reacciones de xidoreduccin; o de las propiedades biolgicas, como podra ser la inhibicin de la actividad de la microora (bacterias, hongos, protozoos, etc.) o daos en las plantas y los animales que viven dentro o sobre el suelo e, inclusive, en sus consumidores o depredadores. Para enfrentar esta problemtica, la mejor estrategia es sin duda la prevencin; sin embargo, tambin es necesario llevar a cabo acciones para remediar los suelos
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que ya se encuentran afectados o para evaluar los impactos de los derrames que eventualmente se produzcan. Las pruebas de toxicidad (bioensayos y biomarcadores) son herramientas que nos permiten caracterizar dichos impactos y tambin evaluar la eciencia de los mtodos de remediacin. El presente libro busca, por tanto, brindar a los investigadores, estudiantes y profesionistas involucrados en estas tareas, procedimientos detallados para realizar esas pruebas en algunos de los organismos o las especies ms utilizadas con esos nes en Mxico y en el mundo. Este libro est integrado por cuatro captulos en los que se describen cuidadosamente los protocolos para llevar a cabo las pruebas con organismos representativos de diferentes niveles dentro de la red alimenticia de los ecosistemas terrestres. En cada uno de ellos se detalla su campo de aplicacin; los materiales, reactivos y soluciones necesarios; el procedimiento de prueba, paso por paso; y los clculos para evaluar los resultados. Asimismo, se incluye un quinto captulo con recomendaciones generales sobre el aseguramiento y el control de calidad de las pruebas, un aspecto fundamental para obtener resultados conables y comparables. Este es un libro que rene la experiencia alcanzada por varios investigadores mexicanos tras varios aos de aplicar estas pruebas, y es una de las pocas publicaciones en espaol enfocada a la aplicacin de las pruebas de toxicidad especcamente en suelos contaminados con hidrocarburos.
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Introduccin
Mara del Carmen Cuevas Daz y ngeles Martnez Toledo
En el estudio de las ciencias ambientales se reconoce que las sustancias forman parte integral del planeta Tierra. Desde los primeros tiempos, el hombre ha dependido de los recursos que la naturaleza le proporciona, desde los minerales hasta las sustancias obtenidas de plantas y animales. No obstante, el avance cientco y tecnolgico, aunado al rpido crecimiento poblacional, al desarrollo agrcola e industrial acelerado y a los cambios en los estilos de vida, lo han llevado a buscar nuevas fuentes de recursos y a producir sustancias sintticas, incluso totalmente desconocidas para la naturaleza (Theodorakis et al., 1998; Staniskiene et al., 2006; Zheng et al., 2007). Actualmente es difcil concebir alguna actividad en la sociedad moderna en la cual no intervenga o haya intervenido el uso de combustibles y de una gran variedad de productos qumicos naturales y sintticos, tanto en el hogar como en los lugares de trabajo e incluso en las actividades de recreacin. De ah que se considere que numerosas sustancias son o han sido la base del progreso, y que su aprovechamiento en una gran variedad de procesos productivos sea identicado como un factor que genera desarrollo, ingreso y empleo para millones de personas. Sin embargo, este proceso no solo ha trado benecios, sino tambin importantes problemas ambientales derivados del manejo de las sustancias peligrosas y del incremento en la generacin de residuos y emisiones contaminantes que afectan a los ecosistemas y a la propia humanidad. Las sustancias pueden ocasionar distintos efectos adversos; algunos de los ms conocidos son los siguientes (Yarto et al., 2007):
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Envenenamientos y enfermedades diversas que se presentan tanto en los humanos como en especies de la ora y la fauna. Daos a los materiales que entran en contacto con ellas. Deterioro de la calidad de los diferentes compartimentos del ambiente (aire, agua, suelo, sedimento y alimentos). Accidentes que involucran explosiones, incendios, fugas o derrames. Hasta principios de la dcada de 1970 se pensaba que la contaminacin era un fenmeno circunscrito a las zonas donde se generaban los contaminantes. Por ello, en cada pas la preocupacin se limitaba a las regiones ms contaminadas. Sin embargo, poco a poco se ha cobrado conciencia de que la contaminacin es un problema que afecta a todos y que, por lo mismo, su control es responsabilidad de todos. Por lo tanto, el problema de la contaminacin se ha vuelto un fenmeno global (Flores, 2004), al cual Mxico no es ajeno. En Mxico, al igual que en el resto del mundo, las principales actividades productivas, como la minera, la extraccin y la renacin del petrleo, la petroqumica y la industria qumica bsica, han trado sin duda grandes benecios econmicos; sin embargo, al mismo tiempo han ocasionado graves problemas ambientales (Volke y Velasco, 2002). Entre ellos, la generacin de grandes cantidades de desechos y residuos peligrosos y la incidencia de fugas, derrames y accidentes qumicos han incrementado el nmero de sitios contaminados. En nuestro pas no existe un registro cabal de todos estos sitios; no obstante, las estimaciones ms conservadoras registran un nmero de varios miles, la mayora de los cuales no han sido sucientemente caracterizados para identicar el riesgo que representan para los ecosistemas y la poblacin humana (Cortinas de Nava, 2000). De acuerdo con datos publicados por el Instituto Nacional de Estadstica y Geografa (INEGI, 2000), la supercie de suelo degradado por causas atribuibles a la contaminacin fue de 25 967 km2 en 1999. Con respecto a los sitios industriales o de disposicin de residuos registrados en 2009, se detectaron 11 sitios contaminados con hidrocarburos en Veracruz, 5 en Tamaulipas y 8 en Oaxaca (SEMARNAT, 2010). Por su parte, en referencia a las emergencias ambientales, Sarmiento et al. (2003) reportan que en el periodo de 1993 a 2003 se present en Mxico un promedio de 521 emergencias asociadas con materiales y residuos peligrosos. Dentro de los compuestos peligrosos ms comnmente involucrados se identicaron el petrleo, con el 42.1 % y sus derivados,
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con el 20.02 % (gasolinas, combustleo, disel); el gas licuado del petrleo, con el 3.19 %, el natural, con el 2.30 %, y otras sustancias que constituyeron el 27.71 %. Estas estadsticas muestran la magnitud de los impactos ocasionados por los hidrocarburos. Varios autores han desarrollado diversas investigaciones sobre los efectos de distintos tipos de hidrocarburos (hidrocarburos aromticos, compuestos orgnicos voltiles, hidrocarburos halogenados, dioxinas y furanos, etc.) sobre los compartimentos ambientales y sobre la salud de los seres humanos y la biota (Castellas et al., 1995; Ekundayo et al., 2001; Bostrm et al., 2002; Timmerman et al., 2003). Con respecto a los compartimentos ambientales, se ha encontrado que el suelo es particularmente vulnerable a estos compuestos, ya que su presencia puede afectar las funciones edcas, ya sea al alterar negativamente sus propiedades fsicas y qumicas o al daar sus procesos biolgicos y ecolgicos, como son los ciclos de nutrientes, los ujos de energa o las interacciones entre organismos. En relacin con los efectos sobre los organismos, los estudios han mostrado que los hidrocarburos ejercen una accin txica variada, la cual depende principalmente de la concentracin y la frecuencia de la exposicin (ATSDR, 1995 y 1998). Estos contaminantes ejercen su accin txica sobre los sistemas respiratorio, endcrino, nervioso central, digestivo, inmunolgico y reproductivo de los seres vivos, con efectos directos sobre los rganos encargados de las funciones principales en tales sistemas (Klaassen, 2001; Albert, 2006). Ante esta problemtica, es necesario evaluar la salud de los ecosistemas a travs de herramientas de monitoreo. Una de estas herramientas la constituye el uso de bioensayos y biomarcadores, los cuales no solo permiten determinar el grado de contaminacin inicial en un sitio, sino tambin evaluar la eciencia de las medidas de remediacin emprendidas para sanearlo. Los bioensayos, tambin llamados pruebas de toxicidad, y los biomarcadores han sido ampliamente utilizados en el campo de la ecotoxicologa, la cual se ocupa del estudio del efecto y el destino de los agentes txicos en los ecosistemas acuticos y terrestres (Larrain, 1995). Se usan como una medida de las respuestas biolgicas que permiten estimar la presencia o la concentracin de las sustancias txicas (Suter, 2007) en el medioambiente. Adems, son herramientas tiles para la evaluacin de riesgos ecolgicos debido a que permiten llevar a cabo diversas acciones: demostrar que los contaminantes estn biodisponibles; caracterizar el efecto txico que producen los contaminantes (por ejemplo, una reduccin de la supervivencia, el crecimiento o la reproduccin, o una alteracin en el comportamiento); caracteI NTRODUCCiN
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rizar la distribucin espacial de las sustancias txicas; establecer metas de limpieza o remediacin; monitorear acciones de intervencin; y determinar la viabilidad de las comunidades ecolgicas despus de la remediacin (USEPA, 1994). En los bioensayos, los organismos de especies sensibles se exponen a las sustancias presentes en las matrices contaminadas, bajo condiciones controladas de laboratorio. Posteriormente, a un tiempo de crecimiento o incubacin dado, se mide una respuesta biolgica que sea ecolgicamente relevante y fcil de estandarizar. Por su parte, los biomarcadores evalan directamente en campo el estado o condicin real de los individuos expuestos. Lo ideal es medir con ellos una alteracin bioqumica o siolgica en los organismos que pueda asociarse especcamente con la exposicin a los contaminantes presentes en el ambiente. La desventaja de los biomarcadores es que pocas veces cumplen con esta condicin ideal y con frecuencia es difcil relacionar el dao observado con los contaminantes detectados. Todos los componentes de un ecosistema actan como receptores de los contaminantes. A pesar de ello, la salud de la biota (ora y fauna) se atiende generalmente en segundo plano, despus del riesgo para la salud humana. Sin embargo, el uso de bioensayos y biomarcadores permite detectar efectos en la biota que pueden representar una alerta temprana del riesgo potencial hacia la poblacin humana antes de que desarrolle algn tipo de enfermedad. La base del xito de estos estudios radica en que los periodos de latencia de algunas enfermedades son generalmente ms cortos en los animales, y en que estos pueden estar expuestos a mayores concentraciones que los humanos debido a sus hbitos y conductas. En estos estudios se parte del hecho de que para algunas sustancias txicas los mecanismos de accin son similares para los humanos y los animales (Fox, 2001). Los bioensayos y la respuesta de los biomarcadores ante la presencia de compuestos txicos pueden ser utilizados para detectar cambios en la salud del suelo, evaluar sitios contaminados con hidrocarburos y monitorear procesos de biorremediacin. Debe resaltarse, por lo tanto, que el mayor reto en la evaluacin del impacto y del riesgo ambiental como parte del manejo ambiental integral es proyectar las consecuencias ecolgicas que representan los efectos nocivos que ejercen los agentes contaminantes en organismos indicadores, tambin llamados centinelas.
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REFErENCIAS
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I NTRODUCCiN
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1 Tcnicas para el anlisis de actividad enzimtica en suelos

Marisol Montejo Martnez, Cinthya Paulina Torres Lpez, ngeles Martnez Toledo, Jos Alfredo Tenorio Lpez, Mara del Roco Cruz Coln, Fernando Rafael Ramos Morales y Mara del Carmen Cuevas Daz
INTrOdUCCIN La calidad y la salud de los suelos se miden a travs de distintos indicadores que evalan su funcionamiento (Doran et al., 1999). Para medir la calidad, se considera qu tan adecuadas son sus propiedades fsicas y qumicas para permitir el intercambio de gases, la retencin de humedad y de nutrientes, la penetracin de races, entre otros. Por su parte, para medir la salud del suelo se toma en cuenta la eciencia de procesos como los ciclos de nutrientes y los ujos de energa. En este contexto, uno de los indicadores que se ha utilizado es la magnitud de la actividad de diferentes enzimas involucradas en los procesos antes mencionados. Las enzimas son molculas de naturaleza protenica producidas por los seres vivos y que se encargan de acelerar reacciones qumicas o hacer posibles aquellas reacciones que de otra manera no se produciran. Dicho de otro modo, son catalizadores biolgicos que, al reducir la energa de activacin necesaria para las reacciones, transforman las sustancias involucradas en el metabolismo celular (incluyendo el anabolismo o reacciones de construccin, y el catabolismo o reacciones de destruccin). La velocidad de la reaccin catalizada por una enzima depende del pH, de la fuerza inica, de la temperatura y de la presencia o ausencia de inhibidores (Burns, 1982). La mayora de las enzimas actan dentro de las clulas, pero algunas son extracelulares. La actividad enzimtica del suelo es importante porque reeja el estado en el que se encuentran sus poblaciones microbianas y su relacin con la biolo19
ga del suelo, la produccin de biomasa, la degradacin de contaminantes y la conservacin de ecosistemas (Doran, 2002; Gianfreda y Ruggiero, 2006). En agricultura, la actividad enzimtica y otros indicadores biolgicos, como la biomasa microbiana, se emplean como una medida de la fertilidad y del impacto de esta actividad en los suelos (Garca-Ruiz et al., 2008); en anlisis ambiental, como un indicador de contaminacin (Schinner et al., 1993), y en biotecnologa, como medida de la eciencia de los tratamientos biolgicos para remediar suelos impactados por diferentes contaminantes, incluyendo los hidrocarburos (Margesin et al., 2000a). La liberacin de enzimas es un proceso constante y, aunque las plantas y animales intervienen, son los microorganismos los que contribuyen en mayor medida a este proceso, debido a su gran biomasa, su alta actividad metablica y su corto ciclo de vida (Cern y Melgarejo, 2005). Dicha liberacin puede ocurrir por secrecin o por lisis celular cuando los organismos mueren (Joinville et al., 2004). De las enzimas liberadas, solo un pequeo porcentaje se encuentra estabilizado, lo cual permite que estas enzimas pueda soportar procesos que naturalmente ocurren en el suelo, como la desnaturalizacin abitica, la adsorcin, la inactivacin o la degradacin por proteasas. En el caso de suelos contaminados con hidrocarburos, Wyszkowska y Kucharski (2000) han reportado una disminucin de la actividad enzimtica, en particular de ureasas, deshidrogenasas y fosfatasas. Una diferencia se presenta con las lipasas, las cuales muestran una gran actividad en suelo contaminado con hidrocarburos, probablemente porque intervienen ms directamente en el proceso de biodegradacin de estos compuestos (Margesin, 2005). En este captulo se describen algunos mtodos enzimticos que son tiles para evaluar el comportamiento enzimtico de suelos contaminados y biorremediados. DETErMINACIN dE LA ACTIVIdAd ENZIMTICA UrEASA
Fundamento del mtodo

La ureasa es una exoenzima que cataliza la reaccin de hidrlisis de la urea, el principal producto celular nitrogenado de la degradacin de las protenas y los cidos nucleicos, el cual es ms fcil de eliminar que otras formas de nitrgeno (como el amoniaco) porque es soluble en agua y menos txico (Science in School, 2008). En dicha reaccin, la urea se rompe para formar dixido de
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carbono y amonio, como se describe en la siguiente reaccin (Quintero-Lizaola et al., 2005):

H2NCONH2 + H2O 2NH3 + CO2 La ureasa se encuentra principalmente en semillas, microorganismos e invertebrados. En las plantas, es un hexmero (consiste en seis cadenas idnticas) y se encuentra en el citoplasma. En las bacterias, consiste en dos o tres subunidades diferentes. Para su activacin necesita unir dos iones de nquel por subunidad (Science in School, 2008). Su pH ptimo es 7.4, y su temperatura ptima 60 C (Kandeler y Gerber, 1988). Muchos animales excretan urea en la orina. Los microorganismos del suelo se alimentan de la orina del animal, produciendo ureasa para transformar la urea en amoniaco, que es entonces fcilmente accesible a las plantas. Por ello, la ureasa es abundante en el suelo (Garca et al., 2003). De esta manera, esta enzima participa en ciclo del nitrgeno, el proceso por el cual el nitrgeno de las protenas y otros compuestos se recicla constantemente (Science in School, 2008). Adems, como la urea es aplicada como fertilizante, es comn encontrar esta enzima en suelos agrcolas. La mayora de las tcnicas empleadas en la determinacin de la ureasa cuantican la liberacin de amonio de un suelo incubado. Varias de ellas dieren en el uso de soluciones tampn o de tolueno (Tabatabai y Bremner, 1972; Cern y Melgarejo, 2005). Otros mtodos utilizan la urea residual para estimar la propia hidrlisis de este compuesto (Douglas y Bremner, 1970). En este manual se describe el mtodo de Tabatabai y Bremner (1972) porque es una tcnica sencilla que puede realizarse con equipamiento y reactivos bsicos de laboratorio. El mtodo se basa en la determinacin de amonio liberado en muestras de suelo incubado con solucin de urea durante 2 h a 37 oC en presencia de tolueno, para inhibir el crecimiento de los microorganismos (Alef y Nannipieri, 1998; Quintero-Lizaola et al., 2005). Esta tcnica es fcil de realizar y de bajo costo, y sus resultados varan de 12.98 a 336.7 moles NH3/g h. Actualmente existe un nuevo mtodo para medir la actividad de la ureasa, el de Sinsabaugh et al. (2000), que es ms rpido, pero ms costoso. En los ltimos aos los estudios sobre la ureasa se han dirigido a determinar la inuencia de los parmetros biolgicos y qumicos sobre su actividad. Se ha encontrado que la correlacin con la biomasa microbiana no es signicativa, y que
TCNiCAS
PARA EL ANLiSiS DE ACTiViDAD ENZiMTiCA EN SUELOS
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esta enzima es afectada por los metales pesados, la concentracin de oxgeno y la disponibilidad de nitrgeno en diferentes tipos de suelo (Garca et al., 2003). Los estudios realizados por Trasar-Cepeda et al. (2000) indicaron que existe sensibilidad a la contaminacin por hidrocarburos y euentes de taninos al determinar un ndice de actividad del suelo con la inclusin de varias enzimas, como ureasas, fosfomonoestereasas y -glucosidasa, as como la biomasa microbiana y el contenido de nitrgeno total.
Campo de aplicacin
Esta tcnica es til para evaluar suelos contaminados con hidrocarburos, como disel y petrleo, para suelos biorremediados, y tambin para medir la actividad enzimtica en el ciclo del nitrgeno en suelos agrcolas y naturales.
Material y equipo
Bureta de 25 mL Matraces volumtricos de 10, 25, 50, 100 y 1000 mL Pinzas para bureta Pipetas volumtricas de 1, 5 y 10 mL Soporte universal Autoclave Balanza analtica Estufa de incubacin Equipo de destilacin microkjeldhal Mua Potencimetro
Es necesario esterilizar el material en autoclave.
Reactivos
cido brico (H3BO4) de 99.5 % de pureza cido sulfrico (H2SO4) de 98 % de pureza Agua destilada Amortiguador TRIS (hidroxi metil aminometano) grado ultrapuro ( 99 %) Cloruro de potasio (KCl) grado analtico Etanol de 95 % de pureza Hidrxido de sodio (NaOH) de 98.7 % de pureza Indicador de rojo de metilo Indicador de verde de bromocresol xido de magnesio (MgO) grado analtico
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Sulfato de plata (Ag2SO4) grado analtico Sulfato de amonio (NH4SO4) grado analtico Tolueno grado analtico Urea de 99.9 % de pureza
Soluciones
Solucin de cido sulfrico 0.005 M. Disolver 0.2 mL de cido sulfrico al 98 % en un matraz aforado que contenga 500 mL de agua destilada y aforar a 1000 mL. Solucin de amortiguador TRIS 50 mM pH 9. Disolver 6.1 g de TRIS en 700 mL de agua destilada, ajustar el pH a 9.0 con H2SO4 (0.2 M) y aforar con agua destilada a 1000 mL. Solucin de cloruro de potasio 2.5 M y sulfato de plata. Disolver 100 mg de Ag2SO4 y 188 g de KCl en 700 mL de agua destilada y aforar a 1000 mL con agua destilada. Solucin indicadora de cido brico. Disolver 0.066 g de verde de bromocresol y 0.033 g de rojo de metilo en etanol (95 %) y aforar a 100 mL. Tomar 10 mL de la solucin indicadora y agregarlos en un matraz volumtrico de 500 mL. Mezclar 10 g de H3BO4 con 350 mL de agua destilada caliente hasta disolver perfectamente. Despus, enfriar y aadir la solucin al matraz. Agregar gota a gota la solucin de NaOH0.05 M hasta observar un vire de color rosa a verde ligero. Finalmente, aforar con agua destilada. Solucin estndar de amonio. Disolver 0.234 g de NH4SO4 en agua destilada y diluir en 1000 mL. La concentracin nal de N-NH4 en esta solucin es de 50 g/mL. Solucin de hidrxido de sodio 0.05 M. Colocar 0.2 g de NaOH y adicionar 500 mL de agua destilada agitando lentamente y aforar a 1000 mL. Solucin de xido de magnesio. Calentar 1 g de MgO por muestra de suelo a analizar a 600-700 C en mua durante 2 h. Esperar a que disminuya la temperatura en la mua y guardar en un desecador. Solucin de urea 0.2 M. Disolver 0.12 g de urea en 8 mL de amortiguador TRIS y aforar a 10 mL. Es necesario preparar la solucin diariamente y guardar a 4 C.
TCNiCAS
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Procedimiento
Incubacin de las muestras Colocar 5 g de suelo en un matraz volumtrico de 50 mL, agregar 0.2 mL de tolueno y 9 mL del amortiguador TRIS, mezclar perfectamente. Adicionar al matraz 1 mL de la solucin de urea y mezclar, tapar el matraz e incubar por 2 h a 37 C (gura 1.1). Una vez concluido el periodo de incubacin, agregar 35 mL de solucin de KClAgSO42.5 M, agitar y dejar reposar la solucin a temperatura ambiente durante 5 min. Aforar el contenido a 50 mL con KCl-AgSO4, con agitacin.
FIGURA 1.1. INCUBACIN DE LAs MUEsTRAs DE sUELO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD DE LA UREAsA
Controles Los controles se preparan mediante el procedimiento descrito anteriormente, pero aadiendo 1 mL de la solucin de urea 0.2 M despus de haber agregado la solucin de KCl-AgSO4 (Alef y Nannipieri, 1998; Quintero-Lizaola et al., 2005). Estimacin del amonio desprendido Tomar 20 mL de la muestra incubada y verterlos en un matraz de destilacin de 100 mL, agregar 0.2 g de MgO y destilar hasta colectar 20 mL en un matraz
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Erlenmeyer (colocado a la salida del equipo microkjeldahl) con 5 mL de la solucin indicadora del cido brico (gura 1.2). Titular el destilado con H2SO40.005 M. Cada 1 mL de H2SO4 0.005 M es equivalente a 70 g de N-NH4.
FIGURA 1.2. DEsTILACIN DE MUEsTRAs PARA EsTIMAR EL AMONIO DEsPRENDIDO
Clculos
La actividad de la ureasa en suelos se expresa en g de N-NH4/g de suelo seco por 2 h. Para obtener la actividad de cada muestra se utiliza la siguiente frmula: V(M - C) x 70 Au = sh x ss Donde
g N - NH4 Au = activudad de la ureasa, en g de suelo sexo x 2h
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M = volumen de H2SO4 gastado en la muestra, en mL C = volumen de H2SO4 gastado en el control, en mL g N - NH4 70 = factor de conversin, en mL de H2SO4 ss = peso en base seca de un gramo de suelo sh = peso de suelo utilizado, en g V = volumen total de la suspensin, en mL Ejemplo: clculo de la actividad enzimtica de la ureasa de una muestra de suelo en cuyo anlisis se gastaron 6.0 mL de H2SO4. A su vez, en el blanco la cantidad de H2SO4 requerido fue de 5.7 mL. Se consider lo siguiente: a) que para tal anlisis se utilizaron 5 g de suelo (sh); b) el peso en base seca de un gramo de suelo es 0.70 g (ss); y c) el volumen de la suspensin fue de 50 mL (V). Au = 300 g N - NH4 g de suelo seco x 2
Au =
(50)(6.0 - 5.7) x 70 5 x 0.7
Control de calidad
La reaccin de la ureasa sigue un curso lineal hasta por 5 h; pasado este tiempo las soluciones no presentarn un resultado ptimo. Todo el material debe encontrarse en condiciones estriles debido a que las enzimas ureasas son muy sensibles y puede haber respuestas de interferencia por factores diversos.
CUADRO 1.1. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA LA PRUEBA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA UREAsA
Duracin de la prueba Temperatura de incubacin 26
3h 37 C
CUADRO 1.1. CONTINA

Tiempo de incubacin Cantidad de suelo Nmero de rplicas Respuesta a medir Control positivo 2h 50 g 3 o ms Amonio liberado Adicin de urea posterior a la adicin de KCl-Ag2SO4
DETErMINACIN dE LA ACTIVIdAd ENZIMTICA dE LA LIPASA

Las lipasas son enzimas ubicuas que se encuentran en prcticamente todos los seres vivos. Juegan un papel esencial en la digestin, el transporte y el procesamiento de los lpidos (triglicridos, ceras, grasas y aceites). Son importantes porque son responsables de disgregar las grasas de los alimentos para que puedan ser absorbidas por los organismos. Son una subclase de esterasas que interviene en el catabolismo de las grasas y aceites, al romper y modicar los enlaces ster de los lpidos y sus derivados. Su reaccin principal es la hidrlisis de acilglicridos, es decir, la ruptura del triacilglicerol a diacilglicerol y a monoacilglicerol, cidos grasos y glicerol. Sin embargo, tambin participan en reacciones de sntesis y transestericacin de acilglicridos y fosfoglicridos. Estas enzimas pueden tener actividad intracelular o extracelular. Su actividad ptima se encuentra a temperaturas cercanas a los 30 C, pH neutro y en presencia de aireacin (Snchez-Ferrer, 1998). Adems de la digestin de grasas, las lipasas en los microorganismos se encargan de la reconstitucin celular y del metabolismo lipoprotico, funciones esenciales para su supervivencia y para el mantenimiento de su funcin ecolgica como organismos descomponedores en los ciclos biogeoqumicos naturales. Sin embargo, estas enzimas tambin han mostrado su utilidad en procesos industriales y en la biorremediacin de suelos contaminados. La medicin de la actividad de la lipasa ha resultado til para monitorear la biorremediacin de suelos contraminados con hidrocarburos de petrleo, en particular con disel (Margesin et al., 1999; Margesin et al.,2000b). Esta actividad aumenta con el incremento inicial del contenido de aceites pesados, debido a que es inducida por los productos liberados durante la biodegradacin y que actan de sustrato
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para las diferentes enzimas hidrolasas, incluidas las lipasas. Se ha observado que esta actividad no aumenta en el caso de suelos contaminados con hidrocarburos aromticos policclicos, pero s en suelos contaminados con disel (Mills et al., 1978; Margesin et al., 2000a). Existen varios mtodos para determinar la actividad de la lipasa, que incluyen los basados en titulacin, los que detectan productos uorescentes (Cooper y Morgan, 1981) y los colorimtricos, que usan cromgenos como los p-nitrofenilsteres (Shirai y Jackson, 1982). El mtodo que aqu se describe es el colorimtrico desarrollado por Margesin et al. (2002). En este mtodo, el p-nitrofenilbutirato (p-NPB) acta como sustrato, y la actividad cataltica de la lipasa se determina al cuanticar el p-nitrofenol (p-NP) producido por la hidrlisis del sustrato, a pH ptimo (7.25). La actividad de la lipasa se incrementa a medida que hay mayor contaminacin por hidrocarburos (Margesin et al., 2002; Margesin, 2005). Esta tcnica es rpida y sencilla, y no es costosa como los mtodos uorimtricos.
Campo de aplicacin
Esta tcnica puede aplicarse a suelos contaminados con hidrocarburos, como disel y petrleo, as como para controlar los procesos de biorremediacin de suelos.
Material y equipo
Matraces aforados de 10, 25, 100 y 500 mL Pipetas de 5 mL Tubos de 10 mL Tubos de ensaye de 10 mL Autoclave Balanza analtica Bao mara Centrfuga refrigerada Espectrofotmetro UV-VIS
Es necesario esterilizar el material en autoclave.
Reactivos
Agua destilada Fosfato monobsico de sodio (NaH2PO4) Hidrxido de sodio (NaOH) p-nitrofenilbutirato (p-NPB) de 98 % de pureza
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p-nitrofenol (p-NP) de 98 % de pureza 2-propanol de 99.7 % de pureza
Soluciones
Solucin amortiguadora de fosfatos 100 mM pH 7.25. Pesar 6 g de NaH2PO4 y disolverlos en 400 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7.25 con una solucin de NaOH 1N y aforar a 500 mL con agua destilada. Guardar en refrigeracin a 4 C durante 15 das. Solucin de hidrxido de sodio 1N. Disolver 4 g de NaOH en agua destilada (fra y previamente hervida) y aforar a 100 mL. La solucin puede permanecer a temperatura ambiente durante 15 das. Solucin de p-nitrofenol (p-NP) 100 g/mL. Disolver 2.5 mg de pNP en la solucin amortiguadora de fosfatos y aforar a 25 mL con la misma solucin. Guardar en refrigeracin a 4 C durante una semana. Antes de utilizarla, vericar que el pH de la solucin sea de 7.25. Solucin de p-nitrofenilbutirato (p-NPB)100 mM. Tomar 175.8 L equivalente a 209.2 mg de pNPB, disolver y aforar a 10 mL con 2-propanol. Guardar a -20 C durante 15 das o preparar cada vez que se utilice.
Procedimiento
Incubacin de la muestra y cuanticacin del p-nitrofenol Agregar en un tubo para centrfuga 0.1 g de suelo hmedo, adicionar 5 mL de la solucin amortiguadora de fosfatos y preincubar en bao mara a 30 C durante 10 min. Posteriormente, adicionar 50 L de solucin de p-NPB, mezclar e incubar en bao mara a la misma temperatura durante 10 min. Inmediatamente despus, colocar los tubos en un bao con hielo durante 10 min, con el objetivo de detener la reaccin. Centrifugar los tubos a 2000 rpm durante 5 min a una temperatura de 2 a 4 C. Enseguida, introducir los tubos en el bao de hielo, pipetear el sobrenadante y medir su absorbancia a 400 nm (Margesin, 2005). Si los valores de absorbancia son muy altos, diluir las muestras con la solucin amortiguadora de fosfatos.
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Preparacin de la curva de calibracin Para cuanticar la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de p-NP se utiliza la solucin amortiguadora de fosfatos para mantener el pH en un valor ptimo. Se preparan 5 muestras de 0.1 g de suelo en los tubos para centrfuga, los cuales tendrn concentraciones desde 25 hasta 125 g de p-NP. A cada tubo se agregan las soluciones de p-NP y amortiguadora de fosfatos, como se muestra en el cuadro 1.2. Se agita cada uno de los tubos durante unos segundos en el vrtex.
CUADRO 1.2. RELACIN DE REACTIVOs A ADICIONAR
Nmero de muestra mL de solucin p-NP 100 g/mL mL de solucin amortiguadora de fosfatos Concentracin nal de p-NP (g) 1 0.25 4.75 25 2 0.50 4.50 50 3 0.75 4.15 75 4 1.00 4.00 100 5 1.25 3.75 125
Posteriormente, se incuban los tubos durante 10 min a 30 oC en bao mara. Terminado el tiempo de incubacin, se centrifugan a 2000 g durante 5 min a una temperatura de 2 a 4oC. Inmediatamente despus de haber centrifugado los tubos, se mide la absorbancia a 400 nm en el espectrofotmetro, utilizando como blanco los reactivos sin adicin de estndar. Controles Los controles para cada suelo que se analice se preparan de la misma manera que las muestras, pero sin adicionar suelo. Para ello se realizan cuando menos 3 rplicas en las que se agregan nicamente 5 mL de solucin amortiguadora de fosfatos, se preincuban en bao mara a 30 C durante 10 min y se contina el mismo procedimiento que se us para las muestras.
Clculos
La actividad de la lipasa en suelos se expresa en g de p-NP/g de suelo seco por 10 min. Los valores obtenidos de absorbancia en las muestras analizadas son interpo30
lados en la curva de calibracin para obtener la concentracin de p-NP. Para obtener la actividad de cada muestra se utiliza la siguiente frmula (Margesin, 2005): AL = M-C sh x sc g p - NP g de suelo seco x 10 min M = concentracin de p-NP de la muestra de suelo, en g C = concentracin de p-NP del control, en g sh = peso del suelo (0.1 g) sc = peso del suelo seco, en g Ejemplo. Clculo de la actividad enzimtica de la lipasa de una muestra de suelo que contiene 267.47 g de p-NP. El control tiene una concentracin de p-NP de 122.75 g, y el peso del suelo seco (sc) es igual a 0.0766 g. AL = (267.47 - 122.75) g p - NP 0.1 x 0.0788 g g p - NP g de suelo seco x 10 min
Donde AL = actividad de la lipasa, en
AL = 18,892.87
Control de calidad
Se recomienda hacer la curva de calibracin de p-NP en presencia de una muestra de suelo, debido a que el p-NP producido durante la reaccin se adsorbe a esta matriz en diferentes proporciones dependiendo de las caractersticas del suelo. Este bioensayo requiere de mantener el pH dentro de los lmites de 7.2 a 7.3 debido a que el enlace ster de p-NPB es muy lbil.
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CUADRO 1.3. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA LA PRUEBA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA LIPAsA
Cantidad de suelo Temperatura de incubacin Tiempo de incubacin pH Nmero de rplicas Control negativo Material de los recipientes de prueba
10 g 30 C 10 min 7.2 a 7.3 3 o ms Sin adicin de suelo Vidrio
DETErMINACIN dE LA ACTIVIdAd ENZIMTICA dE LA dESHIdrOGENASA

Las enzimas deshidrogenasas pertenecen al grupo de las oxidorreductasas, es decir, a las enzimas que remueven electrones (oxidan) o aaden electrones (reducen) a varios sustratos (Ros-Velzquez et al., 2008; Rodrguez-Zavala, 2006). La principal actividad de las deshidrogenasas es eliminar tomos de hidrgeno de la molcula del sustrato y transferirlos a un cofactor o coenzima (como algunas vitaminas o los nuclotidos NAD, NADP, FAD y FMN) que es reducido al recibir dichos tomos. De esta manera el sustrato queda oxidado y normalmente aparece con un doble enlace entre el oxgeno y el carbono, en las posiciones en las que antes estaba presente un grupo hidroxilo (OH) (RosVelzquez et al., 2008). Las deshidrogenasas estn presentes en todos los seres vivos, en particular en levaduras y bacterias. Son claves en el metabolismo energtico de las clulas, ya que participan en la gluclisis (degradacin de la glucosa a piruvato), la fermentacin (degradacin anaerobia de la glucosa para obtener energa en forma de ATP) y el ciclo de Krebs (ciclo subsiguiente a la gluclisis de donde se obtiene ms ATP) (Ros-Velzquez et al., 2008). Estas enzimas intervienen en los procesos de destoxicacin y en el metabolismo de la vitamina A (Ros-Velzquez et al., 2008). La actividad de la deshidrogenasa ha sido utilizada como un indicador de la actividad microbiana del suelo (Barajas-Aceves, 2008). La actividad de la deshi32
drogenasa es mayor en suelos anaerbicos o en inundados en comparacin a los suelos incubados en condiciones aerobias (Makoi y Ndakidemi, 2008; Subhani et al., 2001). La medicin de esta actividad comprende distintos sistemas de enzimas, las cuales intervienen en procesos de deshidrogenacin, representados por la siguiente reaccin (Paolini, 2003): XH2 + A X + AH2 Donde XH2 = compuesto orgnico (donador de hidrgenos) A = aceptor de hidrgenos Se ha encontrado una correlacin positiva entre esta actividad y el contenido de hidrocarburos en el suelo. En una primera fase se observa un aumento de la actividad de las deshidrogenasas en el suelo como reejo de la adaptacin y el crecimiento exponencial de los microorganismos, debido a la disponibilidad de nuevas fuentes de carbono introducidas por los hidrocarburos. Posteriormente, y como una consecuencia de la biodegradacin, esta actividad decrece cuando el contenido de hidrocarburos disminuye debido a una menor disponibilidad de los compuestos (Margesin, 2005). En esta seccin se describe el mtodo de Casida (Casida et al., 1964; Casida, 1977; Barajas-Aceves, 2008), el cual se basa en el uso de una sal soluble, en este caso cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolium (TTC), como aceptor terminal de electrones. Despus de incubar las muestras de suelo 24 h a 37 oC, esta sal es reducida formando trifeniltetrazoliumformazan (TPF) de color rojo. Una vez extrado el TPF con un disolvente como metanol o acetona, su concentracin es cuanticada por colorimetra (Trevors, 1984; Alef y Nannipieri, 1998). Esta tcnica es fcil de realizar y sus resultados son conables; sin embargo, tiene las desventajas de que algunos de los reactivos que requiere no son fciles de adquirir y de que, comparado con el mtodo del iodonitrotetrazolioformazn (INT), el TTC es menos soluble en agua y puede reducirse en presencia de grandes cantidades de oxgeno (Von Mersi y Schinner, 1991).
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Campo de aplicacin
La actividad de la deshidrogenasa es utilizada para monitorear los suelos contaminados con hidrocarburos de petrleo, como el disel, y durante los procesos para su biorremediacin.
Material y equipo
Embudos de separacin Matraces aforados de 50 y 100 mL Papel aluminio Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL Tubos de ensayo de 16 x 150 mm Balanza analtica Espectrofotmetro UV-VIS Estufa de incubacin Vrtex
Reactivos
Acetona o metanol grado analtico cido clorhdrico grado analtico Agua destilada Amortiguador TRIS (hidroxi metil aminometano) grado ultrapuro ( 99 %) Carbonato de calcio (CaCO3) grado analtico Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) de 98 % de pureza 1,3,5-trifenilformazano (TPF) de 98 % de pureza
Soluciones
Solucin de cido clorhdrico 0.2 M. Disolver 8.14 mL de cido clorhdrico al 38 % en un matraz aforado que contenga 250 mL de agua destilada y aforar a 500 mL. Solucin amortiguadora de TRIS pH 7.6. Disolver 12.1 g de TRIS en 700 mL de agua destilada, ajustar el pH a 7.6 con HCl (0.2 M) y aforar con agua destilada a 1000 mL. Solucin de 1,3,5-trifenilformazano (TPF). Disolver 50 mg de TPF en 80 mL de metanol (o acetona) y aforar a 100 mL con el mismo disolvente. Solucin de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) al 3% (en peso/volumen). Disolver 3 g de cloruro de 2,3,5-TTC en 75 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.
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Procedimiento
Incubacin de las muestra Se pesan, por separado, tres porciones de suelo de 2 g cada una y se colocan en tubos de ensayo forrados con papel aluminio (ya que el TTC y el TPF son sensibles a la luz). A cada tubo se le adicionan 0.0335 g de CaCO3, 0.5 mL de la solucin de TTC al 3 % y 1.75 mL de agua destilada. Los contenidos son mezclados en el vrtex. Los tubos son incubados durante 24 h a 37 oC. Todo este procedimiento debe realizarse con luz difusa. Extraccin y medicin del 1,3,5-trifenilformazano Al nalizar la incubacin, el TPF formado por la reduccin del TTC se extrae en un embudo de separacin con 5 mL de metanol (gura 1.3), agitando durante 5 minutos. Despus, se ltra. Este procedimiento se repite aadiendo metanol hasta llegar a un volumen de 40 mL. El extracto total se deposita en un matraz de 50 mL para aforar. Se analizan las muestras en el espectrofotmetro a una longitud de onda 485 nm, usando metanol como blanco.
FIGURA 1.3. EXTRACCIN DE 1,3,5-TRIFENILFORMAZANO (TPF)
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Preparacin de la curva de calibracin de 1,3,5-trifenilformazano Se toman 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 y 4.0 mL de la solucin de TPF en matraces volumtricos de 50 mL. Se adicionan 8.3 mL de solucin de amortiguador TRIS pH 7.6 a cada matraz y se aforan con metanol (o acetona) a 50 mL. Las concentraciones nales que se obtienen son 0, 5, 10, 20, 30 y 40 g TPF/mL. Se lee en espectrofotmetro a una longitud de onda de 485 nm. Controles Los controles se preparan con 5 mL de solucin amortiguadora TRIS sin adicionar TTC, y se tratan igual que las muestras.
Clculos
La actividad de la deshidrogenasa en suelos se expresa como g TPF/g suelo por da. Los valores obtenidos de absorbancia en las muestras analizadas son interpolados en la curva de calibracin para obtener la concentracin del TPF. Como blanco se utilizan los controles de suelo. Para obtener la actividad de cada muestra se utiliza la siguiente frmula:
AD = V {[TPF]M - [TPF]C} sc g TPF
Donde: AD = actividad de la lipasa, en
g de suelo seco x d [TPF]M = concentracin de TPF en la muestra de suelo, en g/mL [TPF]C = concentracin de TPF en la muestra de suelo, en g/mL sc = peso del suelo en base seca de 1 g de suelo hmedo, en g V = volumen de metanol (o acetona) adicionado a la suspensin, en mL
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Ejemplo Clculo de la actividad enzimtica de la deshidrogenasa de una muestra de suelo cuyo anlisis reporta que contiene 2.72 g TPF/mL. Para este clculo se considera los siguiente: a) el peso seco de 1 g de suelo sin secar es 0.6634 g; b) la concentracin de TPF del blanco es 0.82 g TPF/mL; y c) el volumen de metanol adicionado a la suspensin fue de 40 mL. AD = 114.56 g TPF g de suelo seco x d
Control de calidad
Este mtodo no debe utilizarse en suelos contaminados con cobre, ya que este elemento puede inhibir la actividad de la deshidrogenasa, por reduccin de la absorbancia de TPF (Garca et al., 2003). El TTC puede ser txico para los microorganismos (Howard, 1972). La lectura debe realizarse en oscuridad o luz difusa para evitar que los resultados se alteren.
CUADRO 1.4. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA LA PRUEBA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA DEsHIDROGENAsA
Cantidad de suelo Luz Temperatura de incubacin Tiempo de incubacin Nmero de rplicas Control negativo Cuanticacin Material de los recipientes de prueba
20 g Difusa u oscuridad 37 C 24 h 3 o ms 5 mL de TRIS, sin adicin de TTC Espectrofotomtrica 485 nm Vidrio
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DETErMINACIN dE LA ACTIVIdAd ENZIMTICA dE LA CATALASA

Durante los procesos biolgicos (metabolismo) se generan especies qumicas conocidas como radicales libres, los cuales se caracterizan por presentar un electrn desapareado y por ser muy reactivas. Entre estos radicales, las especies reactivas derivadas del oxgeno (EROS) resultan de gran inters debido a su estructura birradical y al gran nmero de procesos que las generan y en los que pueden verse involucradas. Las principales EROS son el anin superxido (O2-), el radical hidroxilo (OH), el oxgeno singlete y el perxido de hidrogeno (tambin llamado agua oxigenada) (H2O2). Estas especies oxidantes estn implicadas en el dao celular que se ha asociado con el desarrollo de cncer, enfermedades inamatorias, senectud celular y enfermedades neurodegenerativas, entre otros procesos patolgicos. En los organismos existe un sistema de proteccin antioxidante formado por enzimas y compuestos de bajo peso molecular. Una de las enzimas que intervienen en esta proteccin y en el mantenimiento del balance oxidante/antioxidante es la catalasa (UACH, 2009). La catalasa forma parte de los sistemas de destoxicacin de las clulas animales y vegetales, y de bacterias aerobias y anaerobias facultativas. La reaccin especca que cataliza es la ruptura del H2O2 para formar agua y oxgeno. El H2O2 se forma en el transporte de electrones de la cadena respiratoria y en ciertas reacciones de hidroxilacin y oxigenacin (Alef y Nannipieri, 1998). La catalasa se relaciona con la actividad microbiana del suelo por ser una enzima intracelular presente en microorganismos aerobios y en la mayora de los anaerobios facultativos. Se han empleado muchos mtodos para determinar la actividad de la catalasa, los cuales miden la cantidad de oxgeno liberado (O2) o el H2O2 remanente. El oxgeno puede cuanticarse por volumetra de gases o cromatografa de gases. El H2O2 se determina por volumetra o colorimetra (Garca et al., 2003). En esta seccin se describe el mtodo de Johnson y Temple (1964) descrito por Garca et al., (2003), que mide el H2O2 residual, para lo cual se adiciona una cantidad determinada de H2O2 al suelo incubando a 20 C durante un tiempo determinado en el que acta la enzima, segn la siguiente reaccin:
2H2O2 2H2O + O2
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El H2O2 residual se valora con permanganato potsico. Esta valoracin se basa en la reduccin del permanganato potsico por el H2O2 en solucin cida, segn la siguiente reaccin: 5H2O2 + 2MnO4- + 6H+ 5O2 + 2Mn++ + 8H2O
Campo de aplicacin
Este ensayo es aplicable a suelo contaminado con hidrocarburos (como petrleo o disel) y a suelo biorremediado.
Material y equipo
Cantidad de suelo Luz Temperatura de incubacin Tiempo de incubacin Nmero de rplicas Control negativo Cuanticacin Material de los recipientes de prueba 20 g Difusa u oscuridad 37 C 24 h 3 o ms 5 mL de TRIS, sin adicin de TTC Espectrofotomtrica 485 nm Vidrio
Reactivos
cido sulfrico (H2SO4) al 98 % de pureza Agua destilada Permanganato de potasio (KMnO4) grado analtico Perxido de hidrgeno (H2O2) al 30 % de pureza Oxalato de sodio grado analtico
Soluciones
Solucin de cido sulfrico 1.5 M. Se depositan 82.6 mL de H2SO4 de 98 % en matraz aforado y se lleva a 1000 mL. Solucin de permanganato de potasio 0.01 M. Se pesan 1.5804 g de KMnO4 y se
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depositan en un matraz Erlenmeyer. Se adicionan 400 mL de agua destilada, agitando con agitador magntico y calentando hasta su disolucin completa. Se deja enfriar, se ltra y se afora a 1 000 mL utilizando un matraz aforado. Se guarda en frasco mbar. La solucin se debe valorar cada vez que se utilice con oxalato de sodio para conocer su normalidad. Solucin de perxido de hidrgeno 1:100. Se toma una alcuota de 1 mL de H2O2 (agua oxigenada) al 30 %, se afora a 100 mL. Esta solucin debe prepararse inmediatamente antes de su uso.
Procedimiento
Pesar 0.5 g de suelo (tamizado en una malla con tamao de poro < 2 mm) y depositarlo en un matraz Erlenmeyer, agregar 40 mL de agua destilada, tapar el matraz y agitar por 30 min en agitador rotatorio (a una velocidad aproximada de 30 vueltas por min).
Transcurrido el tiempo, adicionar 5 mL de la solucin de H2O2 (1:100), tapar nuevamente y agitar por 10 min. Aadir 5 mL de la solucin de H2SO41.5 M con la nalidad de parar la reaccin enzimtica y estabilizar el H2O2 remanente; posteriormente se ltra. Medicin del perxido de hidrgeno remanente Se toma una alcuota de 25 mL del ltrado de cada muestra y se titula lentamente con la solucin de KMnO4 0.01M, con agitacin (con agitador magntico). Para llegar al vire se debe ser muy observador, ya que las primeras gotas del permanganato se decoloran lentamente pero luego la reaccin se hace ms rpida. El punto nal de la valoracin lo seala la aparicin del primer color rosa permanente. Controles Los controles se preparan sustituyendo los 5 mL de H2O2 por un volumen igual de agua destilada y se adicionan al suelo; se procede de la misma forma que para las muestras problema. Tambin se prepara un blanco con 40 mL de agua destilada, 5 mL de H2O2 (1:100) y 5 mL de H2SO41.5 M. A este blanco no se le adiciona suelo, pero s
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H2O2. Sirve para indicar la cantidad de H2O2 que podra poseer la muestra como remanente al nal de la incubacin, si la actividad de la catalasa fuese nula. Se obtiene una solucin de perxido 8.8 mM (con 0.44 mmoles de H2O2). El procedimiento de titulacin es igual, tanto para los controles como para el blanco. La concentracin inicial del H2O2 que se aade al suelo se determina por la valoracin con la solucin de KMnO4 0.01M del blanco sin suelo y con H2O2.
Clculos
Para calcular la actividad de la catalasa del suelo, se emplea la siguiente frmula: [B - (M - C)] x N x V x 1 AC = SS Donde AC = actividad de la catalasa, en
mmoles de H2O2 consumidos
g de suelo seco x h B = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoracin del blanco sin suelo y con H2O2 M = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoracin de las muestras C = cantidad de KMnO4 (en mL) gastados en la valoracin del control correspondiente a cada muestra de suelo N = normalidad exacta de la solucin de KMnO4 0.5 = valor constante que procede del clculo para conocer los mg de H2O2 que reaccionan con el KMnO4 [peso molecular del H2O2 (34 dividido por estado de oxidacin de (2)] y del clculo para obtener la cantidad de H2O2 en mmoles (1/ peso molecular del H2O2) V = factor de dilucin; en este caso es 50 mL/25 mL ss = factor relativo a la cantidad de suelo seco utilizado (aqu se toma una muestra de 0.5 g de suelo hmedo y se pone a secar en la balanza de humedad. Al nal se reporta el peso que corresponde en suelo seco y ese valor es al que se reere G) t = factor de tiempo (6) porque son 10 minutos; se reporta hora (60/10 =6)
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Ejemplo Clculo de la actividad enzimtica de la catalasa de una muestra de suelo de la cual se tienen los siguientes datos: B = 10.4 mL de KMnO4 M = 10.7 mL de KMnO4 C = 0.1 mL de KMnO4 N = 0.0145 N V=2 G = 0.3770 g de suelo seco Al sustituir en la frmula se obtiene el siguiente resultado: AC = 0.2076 mmoles de H2O2 consumidos g de suelo seco x h
Control de calidad
En esta tcnica enzimtica el color rosa plido indica el viraje. Ya que el H2O2 es muy inestable y la muestra antes de titular es de color transparente, se debe nalizar la titulacin en cuanto aparezca el primer color rosa permanente durante la titulacin.
CUADRO 1.5. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA LA PRUEBA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA CATALAsA
Cantidad de suelo Nmero de rplicas Control negativo Blanco de prueba Cuanticacin Material de los recipientes de prueba Cuanticacin Material de los recipientes de prueba
10 g 3 o ms 5 mL de agua destilada sustituyen a 5 mL de H2O2 Sin suelo pero con H2O2 Permanganimetra Vidrio Espectrofotomtrica 485 nm Vidrio
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CONSIdErACIONES GENErALES PArA EL CONTrOL dE CALIdAd EN LOS MTOdOS ENZIMTICOS
Para garantizar resultados reproducibles en los mtodos descritos en este captulo, deben atenderse las siguientes consideraciones: La limpieza del material de vidrio y su proteccin del polvo son muy importantes para evitar interferencias. Se recomienda lavar el material de vidrio con un detergente no inico. Con la nalidad de asegurar un buen procedimiento, los materiales para las determinaciones enzimticas se deben separar. Los recipientes de prueba deben ser resistentes a las reacciones y no deben adsorber el sustrato o los productos generados en la reaccin. Cada tcnica debe realizarse de acuerdo con el procedimiento descrito ya que si se cambian algunos valores, como por ejemplo la concentracin del sustrato, se pueden obtener resultados incorrectos. En cuanto a la utilizacin de solucin tampn o amortiguadora, existen diferencias segn los mtodos; algunos autores (Kandeler y Gerber, 1988; Von Mersi y Schinner, 1991) no utilizan ninguna, pero otros s la utilizan para ajustar el pH del suelo (Sinsabaugh et al., 2000). En la mayora de los mtodos enzimticos descritos la solucin amortiguadora empleada es la que se aade al suelo antes de su incubacin. Cualquier cambio de tipo o concentracin de tampn puede afectar los resultados, por lo cual deben comprobarse los efectos que el cambio tendra sobre la actividad enzimtica. La temperatura y el tiempo de incubacin deben ser los indicados para cada tcnica, usualmente 37 C. El incremento de la temperatura aumenta la velocidad de reaccin; sin embargo, si esta llega a ser muy alta, las enzimas pueden desnaturalizarse. Si el tiempo no es correcto se obtendran resultados errneos porque la relacin de actividad por unidad de tiempo cambiar (Garca et al., 2003).
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2 Evaluacin de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con lombrices

Adriana Palafox Alejo, ngel Hctor Hernndez Romero, Jaime Lpez Luna, Mara del Carmen Cuevas Daz
INTrOdUCCIN Las lombrices de tierra son un grupo fundamental de la fauna del suelo, ya que constituyen gran parte de la biomasa animal edca en varios ecosistemas, tanto en zonas templadas como tropicales. Asimismo, desempean un papel ecolgico primordial por su inuencia en la descomposicin de la materia orgnica, el desarrollo de la estructura del suelo y el ciclo de los nutrientes (Ros, 2005). Las lombrices causan importantes modicaciones fsicas en el suelo (galeras, madrigueras y hoyos) que mejoran el ambiente para el desarrollo de otros organismos (como los microorganismos) e incrementan la disponibilidad de hbitats y alimento para las plantas y otros animales (Lavelle, 1997; Brown et al., 2000). Adems, aumentan la porosidad, facilitan la formacin de agregados y mejoran la estructura del suelo, promueven la oxigenacin y la inltracin de agua, incrementan el transporte de nutrientes y compuestos qumicos agrcolas hasta las capas profundas (Subler et al., 1997; Edwards y Bohlen, 1992), contribuyen a la formacin del suelo y a reducir la erosin. Sus efectos son especialmente importantes en suelos con estructura pobre (Ros, 2005). Durante su proceso de alimentacin, succionan o chupan la tierra de las galeras que excavan y digieren de ella las partculas vegetales y animales en descomposicin. De esta manera, transforman los residuos orgnicos en humus, el cual devuelven al suelo al expulsarlo por el ano junto con la tierra. As, participan en la
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fertilizacin del suelo al incrementar su carga microbiana y su contenido de nitrgeno (Elliot et al., 1990). Adems, participan de manera importante en el ciclo del carbono, ya sea incrementando su mineralizacin o disminuyendo su descomposicin al formar agregados estables en los cuales este elemento queda protegido (Ros, 2005). La contaminacin del suelo con compuestos orgnicos, metales pesados, plaguicidas y lluvia cida puede afectar a las poblaciones de lombrices. Estos contaminantes se acumulan en sus tejidos y pueden constituir un problema para el gran nmero de animales que se alimentan de ellas, debido a su potencial biomagnicacin (Edwards y Bohlen 1992). Las lombrices se emplean con frecuencia como organismos de prueba para evaluar la toxicidad de los suelos (Cuevas-Daz et al., 2008). La especie de lombriz ms utilizada en las pruebas estandarizadas es Eisenia andrei (Bouch, 1972). Esta especie se distribuye naturalmente en casi todo el hemisferio norte; es considerada un bioindicador de la calidad de los suelos, ya que solo es capaz de desarrollarse y reproducirse en condiciones adecuadas de humedad (85 %), temperatura (25 a 30 C), pH del suelo (6.5 a 7.5) y alimentacin (material orgnico agropecuario, industrial y domstico). Adems, E. andrei es un organismo de fcil manejo en el laboratorio (Kaplan et al., 1980), casi no contrae enfermedades, tiene un ciclo reproductivo corto (alcanza su madurez sexual en aproximadamente 2 meses) y es extremadamente prolca (deposita cada 7 a 10 das una cpsula o huevo con un contenido que ucta de 2 a 20 embriones) (Domnguez et al., 2005; Santamara y Ferrera, 2002). Cuando est sexualmente madura, desarrolla una estructura sobre la epidermis que se denomina clitelo, donde crecen los cocones o cpsulas en los cuales uno o varios huevos son depositados. Posteriormente esta cpsula pasa hacia los segmentos anteriores de la lombriz y es colocada en el suelo. Los juveniles se desarrollan dentro de la cpsula y despus emergen de ella. CAMPO dE APLICACIN Los bioensayos con lombrices se emplean para evaluar la toxicidad de suelos contaminados con hidrocarburos, porque de esta manera se puede predecir el impacto de las mezclas complejas de compuestos como el petrleo e hidrocarburos aromticos policclicos sobre los organismos. Estas pruebas tambin son tiles para monitorear la biorremediacin de suelos contaminados con hidrocarburos, tanto en laboratorio como en campo (Salanitro,
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1997; Meier et al., 1997), ya que la reduccin de la contaminacin no siempre viene acompaada de una disminucin de la toxicidad del suelo debido a la transformacin incompleta de los contaminantes o a la formacin de metabolitos ms txicos (Phillips et al., 2000). Los bioensayos con lombrices pueden realizarse directamente con las muestras de suelo o con sus extractos (elutriados); sin embargo, en este captulo solo se describen las pruebas directas en suelo. PrUEBA dE MOrTALIdAd EN LOMBrICES

Este bioensayo es una prueba aguda, con exposicin de 14 das, en la cual se mide la mortalidad a travs de la concentracin letal media (CL50), la cual representa la concentracin del suelo problema que ocasiona la muerte (dao mximo) en el 50 % de las lombrices que han sido expuestas.
Material y equipo
Recipientes de vidrio (dimetro de 4.5 Balanza analtica cm y altura de 7 cm) Guantes Micropipeta de 100 a 1000 L Papel aluminio Potencimetro Papel ltro Pinzas Pipetas volumtricas (capacidad de 1-100 mL) Puntas para micropipeta de 100 a 1000 L Tela sinttica (organza)
Reactivos
Agua desionizada 2-cloroacetamida 99 % Soluciones amortiguadoras comerciales para medir pH de 4, 7 y 10
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DE LA TOXiCiDAD DE LOS SUELOS MEDiANTE BiOENSAYOS CON LOMBRiCES
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Soluciones
Solucin stock de 2-cloroacetamida. Se pesan 225 mg de 2-cloroacetamida y se diluyen en 10 mL de agua (o 4.5 g en 200 mL de agua). Esta solucin equivale a 22.5 mg de 2-cloroacetamida por mL de agua. Se prepara nicamente la solucin stock que se va utilizar en la prueba.
Organismos de prueba
Para esta pruebas se usan lombrices de la especie E. andrei que presenten clitelo y con un peso promedio de 0.30 g. Estas lombrices se cultivan en contenedores o en lechos de 1.0 m de ancho por 1.5 m de largo, en un sitio con sombra, rodeado de tela mosquitero para evitar que otros animales penetren y se alimenten de las lombrices. En el laboratorio son mantenidas en contenedores plsticos. Las lombrices pueden ser alimentadas con estircol equino o vacuno, o residuos agroindustriales, como cachaza o bagazo de caa de azcar, as como residuos de jardinera (con pH cercano a 7 y conductividad inica menor a 6 mS). Siempre se debe administrar el mismo tipo de alimento para evitar variaciones en el crecimiento de las lombrices (OECD, 1984; CuevasDaz et al., 2008). Se ha probado una mezcla 50:50 de estircol precomposteado de equino y cachaza de caa de azcar, la cual ha funcionado bien. Para producir sucientes lombrices se deben colocar aproximadamente 20 kg de residuos por 1 kg de lombrices. El precomposteo consiste en dejar el estircol y la cachaza en composteo durante 10 a 15 das previos a la colocacin de lombrices, para que la etapa termoflica en donde la temperatura llega alcanzar hasta 65 C no inhiba el desarrollo de la lombriz (Santamara, 1996). Se ajustan la humedad y el pH para que posteriormente las lombrices sean depositadas. Las lombrices se pueden conseguir del cultivo que se mantiene en la seccin de lombricompostaje de la Facultad de Ingeniera en Sistemas Agropecuarios de la Universidad Veracruzana, ubicada en Acayucan, Veracruz (gura 2.1)
Suelo
Se recomienda realizar los bioensayos inmediatamente despus de la toma de muestras del suelo problema; pero si esto no es posible, las muestras pueden ser preservadas a 4 C en la oscuridad hasta 15 das en recipientes de vidrio.
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FIGURA 2.1. MDULO DE LOMBRICOMPOsTA DE LA FACULTAD AGROPECUARIOs (FISPA) DE LA UNIVERsIDAD VERACRUZANA
DE
INGENIERA
EN
SIsTEMAs
El suelo se pasa por una malla para tener un tamao de partcula menor o igual a 4 mm, ya que en este caso los organismos se introducen en el suelo. Para la prueba se requiere una cantidad total de 1000 g de suelo problema. De este se toman 100 g para determinar la humedad (WSDE, 1996; DOF, 2003), el pH (DOF, 2003; OECD, 1984) y el contenido de hidrocarburos totales del petrleo (HTP) o hidrocarburos aromticos policclicos (HAP), conforme lo indica la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 (DOF, 2005). Se requieren cuatro rplicas del suelo problema, adems de un control negativo (suelo no contaminado) y un control positivo (suelo con 2-cloroacetamida) para comprobar la sensibilidad de las lombrices. El control negativo debe ser un suelo no contaminado y con la misma textura que el suelo problema, al cual se le ajusta la humedad de la misma forma en que se procedi para el suelo problema. Tambin se puede utilizar como control negativo un suelo articial.
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Humedad del suelo

Se debe calcular la humedad que requiere del suelo experimental. Para ello, se coloca una cpsula de porcelana a peso constante. Se pesan 25 g de suelo y se anota el peso de la muestra, incluyendo el peso de la cpsula. Se seca en un estufa de 103 a 104 C durante 24 h, despus se coloca en un desecador para enfriar y se pesa nuevamente. Se anota el peso total. Posteriormente se realizan los siguientes clculos (WSDE, 1996): [Pi - Pf] [M - (Pi - Pf)]
Hs =
x 100
Donde Hs = humedad del suelo (%) Pi = peso inicial (peso de la muestra + peso constante de la cpsula, en g) Pf = peso nal despus de secar (peso de la muestra seca + peso constante de la cpsula, en g) M = peso inicial de la muestra utilizada (25 g) Ejemplo: Hs = x 100 = 25% [25 - (41 - 36)]g [41 - 36]
Humedad requerida en el suelo experimental

El suelo debe presentar una humedad del 35 a 45 %. Para ajustarla se realiza el siguiente clculo, en el cual se determina la cantidad de agua que debe suministrarse a los suelos durante las pruebas (WSDE, 1996; Cuevas-Daz et al., 2008). Hf = Hr - Hs Donde Hf = humedad a adicionar o faltante en el suelo (%)
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Hr = cantidad de humedad requerida para la prueba (35-45 %) Hs = humedad inicial del suelo (%) W= M x Hf x f 100 Donde W = cantidad de agua para adicionar (mL) M = peso de la muestra (g) f = factor de conversin (1mL/g) Hf = humedad a adicionar o faltante en el suelo (%)
Ejemplo
Clculo del agua requerida para tener una muestra de suelo de 50 g (M) con 45 % de humedad (Hr), sabiendo que su humedad inicial es de 25 % (Hs). Hf = (45 - 25)% = 20% W= 50 g x 20% x 1 mL/g 100 = 10 mL de agua
Preparacin del control positivo

Se utiliza una concentracin de 38.5 mg/kg de suelo de 2-cloroacetamida para obtener la concentracin letal, pero si se desea realizar otras concentraciones se recomiendan 19.25 y 77 mg/kg (WSDE, 1996). Para preparar, por ejemplo, la concentracin de 38.5 mg/kg para 300 g de suelo (se incluyen tres rplicas), se tiene lo siguiente: CTOX = M x f x C CTOX = cantidad del compuesto txico de referencia (2-cloroacetamida) a adicionar (mg) M = peso de la muestra (g) f = factor de correccin (1 kg/1000 g)
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C = concentracin neta de 2-cloroacetamida (mg/kg) Ya que M = 300 g y C = 38.5 mg/kg, entonces: CTOX = 300 g x 1 kg 1000 g x 38.5 mg kg
CTOX = 11.55 mg Para determinar la cantidad de solucin stock de 2-cloroacetamida para adicionar al suelo, se realiza el clculo siguiente (WSDE, 1996): VS = CTOX S
Donde VS = volumen de solucin stock a adicionar (mL) CTOX = cantidad de 2-cloroacetamida (mg) S = concentracin de la solucin stock (mg/mL) Ejemplo: considerando el resultado obtenido de la cantidad de 2-cloroacetamida (CTOX) que es necesario agregar a una muestra de suelo de 300 g, as como la concentracin de la solucin stock igual (S), se calcula el volumen de solucin stock a adicionar. 11.25 mg 22.5 mg/mL
VS =
= 0.51 mL
De manera que si se tiene un suelo control de 300 g con una humedad requerida de 45 %, entonces: VSD = 300 g x 0.45 = 135 g = 135 mL Lo anterior es la cantidad de solucin stock diluida en agua (VSD) que es ne54
cesario agregar al suelo control. La cantidad de agua y stock que forman dicha dilucin se calcula de la siguiente manera: Vw = VSD - VS = (135.00 - 0.51) mL = 134.49 mL Lo anterior signica que debemos diluir 0.51 mL de la solucin stock en 134.49 mL de agua y agregarlos al suelo control; dicho paso debe realizarse en una campana de extraccin, utilizando para el suelo un contenedor plstico o de vidrio.
Procedimiento
Preparacin de los organismos La prueba de mortalidad tiene una duracin de 14 das. Antes de iniciar las pruebas, las lombrices deben vaciar sus intestinos, para lo cual se depositan en cajas de Petri sobre papel ltro humedecido con agua desionizada durante 5 h (gura 2.2). Finalmente, son lavadas, secadas y pesadas.
FIGURA 2.2. LAVADO DE LOs ORGANIsMOs
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Desarrollo de la prueba
En los recipientes de vidrio se depositan de 50 a 100 g de suelo problema con una humedad del 45 % y un pH entre 6 y 7. El suelo control y las rplicas deben mantenerse en las mismas condiciones de humedad y pH. Posteriormente se depositan 10 lombrices por recipiente (gura 2.3), y estos se cubren con la tela sinttica (organza). La tela evita la prdida de humedad, pero permite que exista circulacin de aire dentro de los recipientes (gura 2.4).
FIGURA 2.3. COLOCACIN DE LOs ORGANIsMOs EN LOs RECIPIENTEs DE PRUEBA
Los recipientes se mantienen a una temperatura de 22 2 C con luz continua. Transcurridos los primeros 7 das, se vaca el contenido de cada recipiente en uno nuevo y se observa el comportamiento, as como los movimientos de las lombrices ante estmulos de tacto. Las lombrices son nuevamente depositadas en los contenedores originales para continuar con la prueba durante los restantes 7 das. La humedad es medida y ajustada al 45 % (WSDE, 1996; Cuevas-Daz et al., 2008). Las lombrices no deben alimentarse durante los 14 das que dura la prueba.
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FIGURA 2.4. RECIPIENTEs DE PRUEBA CUBIERTOs CON ORGANZA
Al trmino de la prueba (14 das), las lombrices son sacadas de los recipientes y depositadas en unos nuevos para determinar la mortalidad. Se cuentan los organismos vivos, el movimiento y las reacciones ante los estmulos de tacto. Las lombrices que no responden a esos estmulos se consideran muertas. Tambin se pesan para registrar su ganancia de peso al trmino de la prueba. Finalmente, se mide la humedad y el pH de los suelos (problema y controles).
Clculos
Se calcula la concentracin letal media (CL50) por el mtodo de Probit o SpearmanKarber recortado. Para ello, se incluye el control y las rplicas. Mtodo Spearman-Karber Se determinan los logaritmos naturales de las concentraciones, y los datos de mortalidad se convierten en probabilidad considerando las muertes y el nmero total de lombrices en la prueba; se establecen intervalos de los logaritmos de las concentraciones. Para obtener la frecuencia relativa, se calcula la diferencia de las probabilidades de muerte en el intervalo. Posteriormente se multiplica la frecuencia relativa
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por la media de la concentracin de los logaritmos del intervalo, y a la sumatoria se le aplica el antilogaritmo para obtener la CL50 con base en los datos crudos. Hasta aqu se considera el mtodo cuando la mortalidad aumenta conforme lo hacen las concentraciones. En el anexo 1 se incluye un ejemplo de este mtodo. Si la mortalidad no es proporcional al aumento de concentracin, se aplica el mtodo de Spearman-Karber recortado. Dado que hasta aqu el rango de probabilidad de muertes es muy abierto (de 0 a 1 o de 0 a 100 %), y el valor de la CL50 podra no ser exacto por la dispersin de datos, se hace un recorte del rango de probabilidad en un 10 %, tanto en el lmite superior como en el inferior. En lugar de ir de 0 a 1, ahora ir de 0.1 a 0.9 o del 10 al 90 %, que es un rango ms estrecho en donde se esperara la mayora de las muertes (ver anexo 1). La nueva probabilidad ser de 0.1, y se deben interpolar los valores para obtener el valor correspondiente a la concentracin logartmica. Para ms detalles, revisar Hamilton et al. (1977). Mtodo Probit Los datos de supervivencia se expresan como porcentajes de mortalidad eliminando los valores extremos que, si la prueba se realiz bien, deben corresponder a 0 % y 100 %; para ello se utiliza la tabla de conversin Probit (ver anexo 2), transformando los porcentajes de mortalidad restantes mediante dicha tabla. Se construye una grca representando en el eje de las ordenadas los porcentajes de mortalidad transformados, y en el eje de las abscisas el logaritmo de las concentraciones. Se hace un ajuste a la recta de la grca mediante el mtodo de mnimos cuadrados y se interpola el valor de la CL50 desde el valor Probit que corresponde al 50 % de mortalidad. A este valor se le saca su antilogaritmo o se sustituye el valor de y (0.5) en la ecuacin de la recta ajustada, lo que da un valor ms exacto (Serrano, 2010). Para comprobar el ajuste se emplea la prueba de chi cuadrada, lo que permite comparar los puntos de la grca obtenidos experimentalmente y segn lo esperado por el ajuste (Castillo, 2004).
Reporte
Para elaborar el reporte se recomienda incluir los siguientes puntos:
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El tipo de contaminante presente en el suelo problema y su concentracin. La mortalidad (CL50) registrada en el suelo control y en las rplicas del suelo problema. La concentracin ms baja del suelo problema que ocasiona el 100 % de mortalidad. El peso de las lombrices al inicio y al nal de la prueba. La humedad y el pH de los suelos, registrados al inicio y al nal de la prueba. Se pueden utilizar hojas de reporte como las que se incluyen en los anexos 3 y 4.
Control de calidad
La mortalidad en el suelo control no puede exceder el 10 %. El peso de las lombrices en el suelo control no debe ser mayor del 20 %, en relacin con el peso inicial. Se debe asegurar que las lombrices se encuentren saludables antes del experimento, para lo cual deben responder a los estmulos de tacto y escapar de la luz (Bembridge, 1998; Frnd et al., 2010). Se debe conservar la misma temperatura durante todo el experimento. Los resultados no se consideran aceptables si en el control negativo, o sea sin compuestos txicos, la supervivencia es menor del 90 %. Se debe probar la sensibilidad del organismo antes de la toma de muestra de suelo con el control positivo. Las lombrices deben provenir de una misma poblacin para evitar variaciones en la prueba. En la tabla 2.1 se resumen las condiciones generales del bioensayo.
TABLA 2.1. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA LA PRUEBA AGUDA CON LOMBRIZ DE
TIERRA
Duracin del bioensayo Temperatura Humedad del suelo pH del suelo Contenedores de prueba Cantidad total de suelo requerida Cantidad de suelo requerida por rplica
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14 das 22 2 C 45 % 6.5-7 Recipientes de vidrio 200 a 400 g 50 a 100 g 59
TABLA 2.1 CONTINA

Especie de prueba Edad del organismo al inicio de la prueba Nmero de organismos por rplica Nmero de rplicas Rgimen Respuesta a medir Control negativo Control positivo Eisenia andrei Ms de 2 meses (clitelada) 10 4 Sin alimento Supervivencia Suelo no contaminado 2-clorocetamida
PrUEBA dE EVASIN O MIGrACIN dE LOMBrICES

Este ensayo es una prueba aguda (se desarrolla en 48 h) que se puede aplicar como una alternativa a la prueba de mortalidad. Se basa en la evaluacin de efectos subletales caracterizados por el comportamiento de evasin de las lombrices, para la cual se mide el nmero de lombrices que se desplazan desde un suelo contaminado y que, por tanto, evaden la exposicin. Dicho comportamiento se calcula a travs de la concentracin efectiva media (CE50), que indica la concentracin a la que el comportamiento de evasin es el 50 % de los organismos expuestos, comparado con el control. Esta prueba se usa para evaluar si el hbitat es funcional para la lombriz (Feisthauer, 2003; Hund et al., 2003).
Material y equipo
Frascos de vidrio (dimetro de 4.5 cm y altura de 7 cm) Guantes Papel aluminio Papel ltro Pinzas Pipetas volumtricas de 1 a100 mL Puntas para micropipeta de 100 a 1000 L Tela sinttica (organza) Contenedor de prueba Balanza analtica Micropipeta de 100 a 1000 L Potencimetro
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El contenedor de prueba es un recipiente redondo de acero inoxidable o PVC con un dimetro de 21 cm, altura de 5 cm y espesor de 3 mm; tiene seis cmaras unidas en forma radial con paredes (placas) de 6 cm de ancho, 5 cm de altura y un espesor de 2 mm, y una cmara central con un dimetro de 8 cm y paredes de espesor de 2 mm. Las paredes y la cmara central estn intercomunicadas con cinco arcos y dos arcos, respectivamente, los cuales tienen una dimensin de 0.5 cm de altura y 1 cm de ancho (gura 2.5).
FIGURA 2.5. CONTENEDOR CON sEIs CMARAs: A) CONTENEDOR COMPLETO, B) DIMENsIONEs EXTERNAs Y C) DIMENsIONEs INTERNAs
a)
6 cm
8.3 cm
2 arcos de 0.5 x 1 cm
6 arcos en cada pared de 0.5 x 1 cm
20 cm de dimetro
b)
10 cm de altura
Seguros
25 cm de dimetro
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FIGURA 2.5 CONTINA
c)
10 cm de altura
Dimetro de 6 cm y 1 cm de altura
Reactivos
Agua desionizada cido brico > 98 % grado analtico o 2-cloroacetamida de pureza del 99 % Soluciones amortiguadoras comerciales para medir pH de 4, 7 y 10
Soluciones
Solucin stock de 2-cloroacetamida o de cido brico. Se puede utilizar la solucin stock de 2-cloroacetamida del bioensayo agudo de 14 das (ver seccin anterior) o se puede preparar una solucin stock de cido brico. En este ltimo caso, para 625 g de suelo en base seca, se pesan 25 g de H3BO3, se depositan en un matraz y se afora a 1 L con agua desionizada.
Se emplean lombrices adultas cliteladas de la misma especie que en la prueba de mortalidad (E. andrei), con un peso de 0.250 a 0.500 g cada una. El cultivo y
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la alimentacin de las lombrices se realizan de la misma forma que en la prueba aguda.
Suelo
El suelo problema (4 kg) se tamiza a travs de una malla de 4 mm. Se determina su pH y su capacidad de retencin de agua. En funcin de los resultados de estas determinaciones se realiza el ajuste a un pH de 6.5 a 7.0 y un contenido de humedad del 70 %. Las concentraciones de muestra provienen del suelo contaminado y de las fases del proceso de biorremediacin, por lo que se obtienen suelos o muestras con concentraciones diversas. Para la prueba se utilizan diferentes concentraciones del suelo problema, as como un control negativo y uno positivo.

Una vez preparada la solucin stock de cido brico (o 2-cloroacetamida), se procede a adicionarla al suelo, considerando 2000 mg de H3BO3 por kg de suelo. El volumen de solucin stock a adicionar se calcula de acuerdo con la concentracin de la solucin stock y con la cantidad de suelo (EC, 2004). As, la cantidad de H3BO3 (en base seca) que se agrega es la siguiente: H3BO3 = (2 g H3BO3/1000 g suelo seco) x 625 g suelo a utilizar H3BO3 = 1.25 g Como se necesita determinar el volumen de solucin stock a adicionar, entonces: H3BO3 = 1.25 g H3BO3/(25 g H3BO3/1000 mL agua) H3BO3 = 50 mL de solucin stock Tambin se requiere la humedad del suelo (Hi), la capacidad de campo (Hcc), el porcentaje de humedad requerido (Hrq) y la cantidad de humedad a adicionar o faltante (Hf). Hf = (Hcc x Hrq)- Hi Hf = (56.35 x 70/100) -18.6 Hf =20.84 %
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Como se debe calcular el volumen de agua a adicionar (Vaa) e incluir la cantidad de suelo a utilizar (Ps), entonces: Vaa= (Hf x Ps)/100 Vaa = (20.84 x 625)/100 Vaa = 130.28 mL de agua Pero considerando que se tienen que adicionar 50 mL de solucin stock, se saca la diferencia: 130.28 mL agua 50 mL de solucin stock = 80.28 mL que se deben adicionar de agua. Se preparan concentraciones de 1000, 500, 100 y 50 mg/kg de suelo diluyendo la solucin stock, para lo cual se procede de la manera antes descrita.
Procedimiento
Preparacin de los organismos Previamente a la prueba, las lombrices se depositan en cajas de Petri con papel ltro humedecido con agua desionizada, para que vacen sus intestinos durante 5 h. Posteriormente son lavadas, secadas y pesadas. Desarrollo de la prueba Se pesan 100 g del suelo problema y del suelo control, y se colocan en el contenedor de seis cmaras, alternando el suelo control y el suelo contaminado en diferentes concentraciones. Posteriormente se depositan 10 lombrices en la cmara central. La migracin de la lombriz es lenta, por lo que, si despus de 10 min no se observa migracin, se acerca una lmpara para disminuir el tiempo de espera y acelerar el movimiento hacia los compartimentos, cuidando de no daar a la lombriz (gura 2.6). Cada contenedor tendr cuando menos cuatro rplicas. Para evitar que las lombrices escapen, los contenedores deben ser cubiertos con tela de organza y papel aluminio perforado con pequeos oricios, lo cual facilitar la circulacin de oxgeno dentro del contenedor y evitar la prdida excesiva de humedad. Los contenedores deben ser colocados en un lugar donde la luz sea mnima y la temperatura no exceda los 25 C (Hund y Wiechering, 2001).
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FIGURA 2.6. EXPOsICIN DE LAs LOMBRICEs A LA LUZ PARA FAVORECER sU MIGRACIN
Al trmino de 48 h, las paredes de las cmaras son tapadas con una placa divisoria con dimensiones de 12 cm de altura, 8.3 cm de ancho y espesor de 0.5 mm (gura 2.7) para evitar el movimiento de la lombriz hacia las cmaras vecinas. El suelo y los organismos de cada cmara debern ser sacados para registrar el nmero de lombrices en cada una de ellas, as como para evaluar su movimiento ante los estmulos de tacto y registrar su peso al nal de la prueba.
FIGURA 2.7. CONTENEDOR CON PLACA INTERMEDIA
Placa divisoria
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Clculos
Si es una prueba de concentraciones mltiples, que tienen cuatro o ms concentraciones y un contenedor por cada concentracin (alternando suelo limpio y contaminado), la evasin se determina aplicando la siguiente frmula a cada rplica (ISO, 2008; De Silva y Van Gesten, 2009): E= C-P L x 100
Donde E = evasin (%) C = nmero de lombrices en el control P = nmero de lombrices en el suelo problema L = nmero total de lombrices expuestas Con estos datos se puede calcular la CE5, que es la concentracin de suelo contaminado que genera una respuesta evasiva del 50 %. En ocasiones, como margen de seguridad ante la alta toxicidad de los suelos contaminados, se establece la CE20, que es la concentracin que provoca una evasin del 20 %. Ambos indicadores toxicolgicos se calculan por el mtodo Probit o Spearman-Karber. El manejo del software libre, como el Trimmed Spearman Karber Method (USEPA, 1999b) y el Probit Program (USEPA, 1999a) es muy sencillo: simplemente se ingresan los datos en orden creciente de concentracin con su respectiva respuesta, y el programa automticamente hace una comparacin entre el suelo control y los tratamientos. Cabe destacar que el programa Trimmed Spearman Karber Method solo permite calcular la CE50 o la CL50. Los indicadores adicionales, como el CE20, deben obtenerse con el programa Probit. Si es una prueba con un solo nivel de contaminacin y al menos cinco rplicas, alternando suelo contaminado con suelo control (por ejemplo para probar la toxicidad de un suelo biorremediado), se registra el nmero de lombrices supervivientes en el suelo control y en el problema. Se determinan los promedios y la desviacin estndar de las cinco rplicas. El software estadstico se puede encontrar en siguiente liga de la pgina de USEPA: http://www.epa.gov/eerd/stat2. htm#probit.
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Los dos grupos de datos se comparan unidireccionalmente utilizando la prueba t de Student de una sola cola (one-tailed Students t-test) o algn otro mtodo estadstico sensible a la comparacin de pares. Debe tomarse en cuenta que en un anlisis de doble cola el efecto puede ser positivo o negativo, y aun as sera estadsticamente signicativo. Por lo anterior, debe hacerse una prediccin de la direccin del efecto antes de realizar el anlisis, es decir, establecer si se espera predileccin por el suelo control (evasin del suelo contaminado) o predileccin por el suelo contaminado. Una vez realizado el anlisis con las consideraciones pertinentes, la prueba de doble cola se convierte en una prueba de una sola cola dividiendo entre 2 el valor de p que se obtiene en la salida y comparndolo con el nivel de signicancia de la prueba. Si los resultados muestran direccin opuesta a la prevista, el valor de p en esta direccin debe obtenerse sustrayendo el valor de p de la prueba de una sola cola (1-p). Debe notarse que si el resultado presenta una direccin opuesta a la prevista, la prueba podra no ser estadsticamente signicativa, aun cuando la prueba de doble cola s lo sea. Basndose en lo anterior, los resultados de las pruebas de evasin que muestren un nmero promedio de lombrices signicativamente menor en el suelo problema o contaminado, con respecto al suelo control, indican una respuesta evasiva al suelo problema o una respuesta preferencial por el suelo control. Si la mortalidad no es mayor o igual al 50 % en al menos una concentracin, no se puede calcular la CL50, por lo que se informa como efecto del 0 % de mortalidad (EC, 2004). Para evaluar si el suelo analizado es un hbitat adecuado para las lombrices, se evalan los siguientes criterios: si el 50 % de los organismos se encuentran en el suelo contaminado o tratado, se considera que no muestran preferencia por ningn tipo de suelo y que dicho suelo es un hbitat adecuado. Por su parte, si el porcentaje de lombrices en el suelo contaminado es del 20 %, se considera que el suelo tiene efecto sobre los organismos y, por lo tanto, que es txico o de baja calidad (Hund et al., 2003; Hund et al., 2005; Ricardo et al., 2010). Estos criterios sirven de gua; sin embargo, se recomienda tomar como una base ms conable los resultados estadsticos de la prueba.
Reporte
Para elaborar el reporte se recomienda incluir los siguientes puntos:
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El tipo de contaminante presente en el suelo problema y su concentracin. Las caractersticas del suelo problema (pH, contenido de humedad y capacidad de campo). Las caractersticas de los organismos de prueba (edad al inicio de la prueba, condiciones de cultivo, fuente de alimento, nmero de organismos utilizados en cada equipo de prueba, etc.). El porcentaje de distribucin del organismo al nal de la prueba (nmero de lombrices en cada cmara) y el registro de los movimientos ante los estmulos de tacto. La concentracin ms alta de suelo problema que no causa mortalidad (NOAEC, no observed adverse effect concentration), que es la mxima concentracin a la que no se observan efectos adversos, y la LOAEC (low observed adverse effect concentration), que es la mnima concentracin a la que se observa un efecto (estos efectos no necesariamente implican mortalidad; pueden ser movilidad de la lombriz, produccin de enzimas antioxidantes, nmero de huevos eclosionados, etc., dependiendo de la prueba que se est trabajando). Los parmetros toxicolgicos NOAEC y LOAEC se determinan por prueba de hiptesis, utilizando el mtodo o la prueba de Dunnett, que permite comparar los tratamientos (suelo contaminado) con el control. La concentracin ms baja del suelo problema que ocasiona el 100 % de comportamiento de evasin. El peso de las lombrices al inicio y al nal de la prueba. Los valores de humedad y pH del suelo registrados durante la prueba.
Control de calidad
Cada mes o cada vez que se efecte el bioensayo se debe realizar una prueba con el control positivo para determinar la viabilidad de los organismos. Para que los resultados de la prueba de evasin sean vlidos, el nmero de lombrices muertas o perdidas debe ser menor del 10 % por tratamiento. Se debe controlar en todo momento las condiciones de temperatura durante la prueba.
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TABLA 2.2. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA LA PRUEBA DE EVAsIN O MIGRACIN DE LOMBRICEs DE TIERRA.
Duracin del bioensayo Temperatura Humedad del suelo pH del suelo Contenedores Cantidad total de suelo requerida Cantidad de suelo requerida por rplica Especie de prueba Edad del organismo al inicio de la prueba Nmero de organismos por rplica Nmero de rplicas Rgimen Respuesta a medir Control negativo Control positivo 48 h 22 2 C 45-70 % 6.5-7 Redondos de seis cmaras 4 kg 100 kg Eisenia andrei Ms de 2 meses (clitelada) 10 4 Sin alimento Movimientos migratorios Suelo no contaminado cido brico
Prueba de reproduccin en lombrices

Fundamento del mtodo La prueba de reproduccin evala el efecto subletal que ejerce la exposicin a un suelo contaminado sobre la formacin de cpsulas y el nmero de descendientes de las lombrices (Kapanen e Itvara, 2001). Esta es una prueba crnica con un tiempo de duracin de 56 das. Material y equipo
Frascos de vidrio (dimetro de 4.5 cm y altura de 7 cm) Guantes Papel aluminio Papel ltro Pinzas Balanza analtica Micropipeta de 100 a 1000 L Potencimetro
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Pipetas volumtricas de 1 a 100 mL Puntas para micropipeta de 100 a 1000 L Tela sinttica (organza)
Reactivos
Agua desionizada Carbendazim con pureza mayor al 97 % cido brico (H3BO3) con pureza mayor al 98 % Soluciones amortiguadoras comerciales para medir pH de 4, 7 y 10
Soluciones
Solucin stock de carbendazim Se pesan 6 mg de carbendazim y se mezclan en 10 mL de acetona, lo que proporciona una concentracin de 0.6 mg de carbendazim/mL. Solucin stock de cido brico (H3BO3) Para preparar esta solucin se sigue el mismo procedimiento descrito para la prueba de evasin.
El organismo de prueba utilizado es la lombriz de tierra de la misma especie que en las pruebas anteriores (E. andrei). Al inicio de la prueba, los organismos deben haber alcanzado la edad adulta, y presentar clitelo y un peso promedio de 0.300 g, con un rango de 0.300 a 0.600g. Para cultivar y alimentar a las lombrices se deben seguir los procedimientos descritos en la prueba aguda.
Suelo
Se requieren 1000 g de suelo problema, previamente cribado a travs de una malla de 4 mm. Se toman 100 g de este suelo para determinar su capacidad de retencin
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de agua, contenido de humedad, pH (DOF, 2003; Ortiz y Ortiz, 1990; OECD, 2004) y contenido de HTP (USEPA, 1996b; DOF, 2006) o HAP (USEPA, 1986). Se necesitan cuatro rplicas del suelo problema, as como un control negativo y un control positivo. El suelo problema es el suelo contaminado o el suelo biorremediado.

De acuerdo con la gua actualizada OECD 222 (OCDE, 2004), se utiliza carbendazim como compuesto txico de referencia para esta prueba; sin embargo, la gua EC (2004) recomienda el H3BO3. Si se van a realizar simultneamente la prueba de evasin y la de reproduccin, lo mejor es emplear el H3BO3, ya que funciona como compuesto txico de referencia para ambas pruebas. Para adicionar el carbendazim o el H3BO3 al suelo, se realizan los clculos y el procedimiento descrito para las dos pruebas anteriores.
Procedimiento
Preparacin de los organismos Antes de realizar la prueba, las lombrices son colocadas durante 5 h en cajas de Petri con papel ltro humedecido con agua desionizada, con el n de vaciar sus intestinos. Posteriormente son lavadas, secadas y pesadas. Desarrollo de la prueba Este bioensayo se desarrolla en un tiempo de 8 semanas (56 das), evaluando la respuesta de las lombrices cada 7 das. Se adicionan 50 a 100 g de suelo problema en los recipientes de vidrio y se aade el 5 % de una mezcla (50:50) de estircol equino precomposteado y cachaza de caa de azcar, como alimento. Se ajusta la humedad del suelo a entre 45 y 60 % de la capacidad de campo, y el pH a un valor entre 6.0 y 7.0. Con los controles se realizan los mismos ajustes. Se depositan 10 lombrices en cada recipiente y se cubren con organza y papel aluminio perforado para evitar la prdida de humedad y permitir la circulacin de aire dentro de los recipientes. Se pesan los recipientes para llevar el control de
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humedad por diferencia de peso; otra opcin es utilizar una balanza de humedad, como el analizador marca Kern, en donde se deposita un gramo de muestra. Se preparan los controles negativo y positivo con cuatro rplicas, al igual que el suelo problema (Kula y Larink, 1997). Los contenedores se mantienen a una temperatura de 22 2 C, con un fotoperiodo de 18 h de luz y 6 de oscuridad (ISO, 1998). Las lombrices son alimentadas cada semana, adicionando un 5 % de mezcla de estircol equino y cachaza en proporciones de 50:50. A los 7 das de haber iniciado la prueba, se vaca el recipiente de cada una de las rplicas sobre uno nuevo y se determina la mortalidad de las lombrices por la ausencia de movimientos o reacciones ante estmulos de tacto. Posteriormente, las lombrices supervivientes son colocadas de nuevo en los recipientes originales de prueba para proseguir con el desarrollo de la prueba. Se mide el contenido de humedad del suelo y, si es necesario, se ajusta nuevamente. A los 28 das de prueba, las lombrices adultas son separadas para ser contadas y pesadas, y para examinar y registrar los cambios en su morfologa o comportamiento ante los estmulos de tacto. Una vez contados, las lombrices jvenes y los capullos (gura 2.8) se dejan en el contenedor durante las siguientes cuatro semanas. Cada una de las rplicas y controles se revisa cada 7 das hasta nalizar los 56 das (8 semanas), para llevar un registro del nmero de lombrices muertas, los movimientos, el peso y el nmero de capullos producidos por las lombrices supervivientes. Al trmino de los 56 das, los contenedores se vacan para realizar la cuenta de las lombrices jvenes y de los capullos. Las lombrices juveniles son observadas para determinar sus movimientos y su peso, y tambin se pesan las lombrices adultas. Se mide la humedad y el pH del suelo (EC, 2004; Cuevas-Daz et al., 2008). Para facilitar la cuenta de lombrices juveniles, los contenedores se pueden colocar en un bao mara a una temperatura de 50 a 60C; despus de 20 min, las lombrices juveniles tienden a subir a la supercie, y as se pueden retirar para contarlas (ISO, 1998).
Clculos
Para evaluar los efectos en la reproduccin, se emplean los siguientes parmetros:
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FIGURA 2.8. CAPULLOs DE LOMBRIZ
Se calcula la CL50 a partir de los datos de mortalidad y la CE50 a partir de los resultados de las concentraciones, para estimar la concentracin en donde se reduce un 50 % la reproduccin. Para ello, se pueden emplear los mtodos Probit o Spearman-Karber recortado. Se calcula la NOEC (no observed effect concentration), que corresponde a la concentracin mxima del suelo problema en la cual no se observan efectos en las lombrices. Se calcula la media y la desviacin estndar del nmero de lombrices juveniles en cada rplica por cada concentracin. Posteriormente se comparan estos parmetros entre las diferentes concentraciones y en relacin con los controles a travs de un anlisis de varianza (ANOVA) y una prueba de comparacin de medias (por ejemplo, la prueba de Dunnet), con un intervalo de conanza del 95 %.
Reporte
Para elaborar el reporte, al igual que en las otras pruebas, se recomienda incluir los siguientes puntos (USEPA, 1996a; ISO, 1998; OECD, 2004): El tipo de contaminante presente en el suelo problema y su concentracin. Las caractersticas del suelo problema (pH, contenido de humedad y capacidad de campo) antes, durante y al trmino de la prueba. Las caractersticas de los organismos de prueba (especie, nombre, edad al inicio de la prueba, condiciones de cultivo, fuente de alimento, nmero de organismos utilizados en cada equipo de prueba, etc.). Detalles de preparacin del suelo. Descripcin de los contenedores usados y el volumen de suelo empleado.
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Condiciones de la prueba, como temperatura, intensidad de la luz, ciclos de luz y oscuridad. Una tabla con los resultados de mortalidad por concentracin, rplica y control. Peso de las lombrices adultas al inicio y de las lombrices adultas supervivientes despus de 4 semanas de prueba por cada recipiente. Nmero de juveniles por contenedor. La LC50, la mayor concentracin en donde no se observa efecto (NOEC) y la concentracin ms baja en donde se observa efecto (LOEC). Descripcin de patologas o cambio de comportamiento (por ejemplo, disminucin de la ingesta de alimento). Asimismo, se deber anotar cualquier desviacin del procedimiento o suceso inusual.
Control de calidad
Los capullos, lombrices juveniles y adultas deben manipularse lo menos posible para evitarles daos y estrs. Cuando la manipulacin sea necesaria, como en el caso de mover los organismos del rea de cultivo al contenedor, se debe realizar de forma rpida y correcta, utilizando guantes o pinzas con puntas redondas. Se debe llevar el control de la humedad para evitar que la falta de esta afecte a las lombrices. No debe presentarse una diferencia en humedad del suelo mayor del 10 % entre el inicio y el nal (ISO, 1998). Para que los resultados de esta prueba sean vlidos, la variacin en reproduccin entre las rplicas del control negativo debe ser menor al 30 %, o su productividad debe ser de al menos un promedio de 3 lombrices juveniles por adulto, y la mortalidad del total de lombrices debe ser menor al 10 % despus de 28 das (Kula, 1997).
TABLA 2.3. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA LA PRUEBA DE REPRODUCCIN CON
LOMBRICEs DE TIERRA
Tiempo de prueba Temperatura Contenido de humedad del suelo pH del suelo Alimento
56 das 22 2 C 45 a 70 % 6 a7 Estircol de equino y vacuno, residuos de jardinera y cachaza
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TABLA 2.3 CONTINA

Contenedores de prueba Cantidad total de suelo requerida para la prueba Cantidad de suelo requerida por contenedor Organismo prueba Edad del organismo al inicio de la prueba Nmero de organismos por rplica Nmero de rplicas Control negativo Control positivo Recipientes de vidrio de 4.5 cm de dimetro y 7 cm de altura 1000 g 50 a 100 g Eisenia andrei Al menos 2 meses (lombrices cliteladas) 10 4 Suelo no contaminado Carbendazim o cido brico
Consideraciones generales para el control de calidad en las pruebas con lombrices

Para asegurar la calidad de los bioensayos con lombrices, se debe tener en cuenta los siguientes aspectos: La preparacin del suelo problema debe realizarse en un lapso no mayor de 24 h en una campana de extraccin. Si esto no es posible, entonces el suelo se almacena a una temperatura de 4 C por un lapso no mayor de 14 das, ya que puede presentarse la prdida de algunos componentes voltiles del suelo. Las condiciones particulares requeridas en cada prueba deben mantenerse dentro de los rangos especicados para cada una de ellas. Las lombrices deben provenir de un cultivo puro conocido, y no deben ser usadas cuando han estado sometidas a estrs debido a condiciones extremosas, como falta de comida y cambios bruscos de pH o temperatura (Presley et al., 1996), ya que esto puede afectar los resultados. Todas las lombrices deben presentar su clitelo bien formado al inicio de las pruebas, para garantizar una uniformidad en su estado de madurez y, por lo tanto, en su sensibilidad a los contaminantes. La precisin de los bioensayos debe determinarse a travs de la construccin de una carta control. Dicha carta se puede iniciar realizando cuatro pruebas con un compuesto txico de referencia, como se indic en cada uno de los bioensayos. Con los resultados de estas pruebas se calculan la media, la desviacin estndar y coeciente de variacin (WSDE, 1996). Cada mes debe repetirse al menos una
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de estas pruebas para mantener un registro continuo de la sensibilidad de nuestro cultivo de lombrices. REFErENCIAS
Bembridge, J.D. 1998. Recommendations from the Second International Workshop on Earthworm Ecotoxicology, Amsterdam, Netherlands. En: Sheppard, S., Bembridge, J., Holmstrup, M., Posthuma, L. (editores). Advances in Earthworm Ecotoxicology. Society of Environmental Toxicology and Chemistry, EUA. Brown, G.G., Barois, I., Lavelle, P. 2000. Regulation of soil organic matter dynamics and microbial activity in the drilosphere and the role of interactions with other edac functional domains. European Journal of Soil Biology. 36, 177-198. Castillo, G. 2004. Ensayos toxicolgicos y mtodos de evaluacin de calidad de aguas. estandarizacin, intercalibracin, resultados y aplicaciones. Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo, Instituto Mexicano de Tecnologa del Agua. Mxico. Cuevas-Daz, M.C., Roldn-Martn, A., Ferrera-Cerrato, R., Rodrguez-Vzquez, R. 2008. Ensayo de toxicidad aguda con Eisenia andrei. En: Ramrez Romero, P., Mendoza Cant, A. (compiladoras). Ensayos toxicolgicos para la evaluacin de sustancias qumicas en agua y suelo. La experiencia en Mxico. Instituto Nacional de Ecologa, Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales, Mxico. De Silva, P.M.C.S., Van Gestel, C.A.M. 2009. Comparative sensitivity of Eisenia andrei and Perionix excavatus in earthworm avoidance test using two soil types in the tropics. Chemosphere. 77: 1609-1613. Diario Ocial de la Federacin (DOF). 2003. Norma Ocial Mexicana NOM-021-SEMARNAT-2000. Establece las especicaciones de fertilidad, salinidad y clasicacin de suelos, estudio, muestreo y anlisis. Publicado el 23 de abril. Diario Ocial de la Federacin (DOF). 2005. Norma Ocial Mexicana NOM-138-SEMARNAT/SS-2003. Lmites mximos permisibles de hidrocarburos en suelos y las especicaciones para su caracterizacin y remediacin. Publicado el 28 de marzo. Diario Ocial de la Federacin (DOF). 2006. Norma Mexicana NMX-AA-134-SCFI-2006. Suelos. Hidrocarburos. Fraccin pesada por extraccin y gravimetra. Mtodo de prueba. Publicado el 12 de octubre. Domnguez, J., Velando, A., Ferreiro, A. 2005. Are Eisenia ftida (Savigny, 1826) and Eisenia andrei Bouche (1972) (Oligochaeta, Lumbricidae) different biological species? Pedobiologa. 49, 81-87.
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ANEXO 1. EJEMPLO dE LA APLICACIN dEL MTOdO SPEArMAN-KArBEr PArA CALCULAr LA CONCENTrACIN LETAL MEdIA (CL50) (HAMILTON ET AL., 1977) El siguiente ejemplo es una prueba con lombrices expuestas a concentraciones crecientes de pireno. Se utilizaron 5 contenedores con 10 lombrices en cada uno. Se calcul el logaritmo natural (ln) de las concentraciones, y al nal de la prueba se cuanticaron las lombrices muertas. La mortalidad se convirti en probabilidad en funcin del nmero total de lombrices en cada contenedor. En la siguiente tabla se resumen los resultados obtenidos.
Contenedor 1 2 10 50 2.303 10 0 0 3.912 10 2 0.2 3 200 5.298 10 6 0.6 4 800 6.685 10 10 1 5 3000 8.006 10 10 1
Concentracin (mg/kg) Logaritmo natural de la concentracin Nmero de lombrices Nmero de muertes Probabilidad de muerte (p muerte)
Posteriormente se establecieron intervalos de los logaritmos de las concentraciones y se calcul la frecuencia relativa de las muertes por diferencia de probabilidad en dichos intervalos (p muerte en 3.912 p muerte en 2.303 = 0.2 0 = 0.2). Entonces se obtuvo la sumatoria del producto de la frecuencia relativa y el promedio de los intervalos (= 4.860) para calcular CL50= e4.860 = 129.024 mg/kg. En la siguiente tabla se resumen dichos clculos.
1 Intervalos del logaritmo natural de la concentracin Frecuencia relativa (2.3033.912) (3.9125.298) (5.2986.685) (6.6858.006) Total
0.2
0.4
0.4
80
Promedio por intervalo 2X3 =4.860
3.107
4.605
5.991
7.345 0 4.860
0.621 1.842 2.396 CL50= CL50= 129.024 mg/kg e4.860
Idealmente se espera que la mortalidad se incremente con las concentraciones y que no se presenten muertes en el control, pero en toxicologa esto no suele ser comn. Entonces se recurre al mtodo Spearman-Karber recortado que, para nes ilustrativos, se explicar a continuacin utilizando los mismos datos.
Ejemplo de la aplicacin del mtodo Spearman-Karber recortado

En el ejemplo anterior, el rango de probabilidad de muerte se manej totalmente abierto, del 0 al 100 % (0 a 1), y la CL50 podra no ser muy exacta si se presentara mayor dispersin de los datos. Por lo tanto, se recorta en un 10 % el rango de probabilidad en los lmites superior e inferior. Ahora se tiene un rango de probabilidad ms estrecho, del 10 al 90 % (0.1 a 0.9), donde se espera que caiga la mayora de las muertes. Entonces se debe calcular el logaritmo del intervalo de concentracin cuando p = 0.1 y p = 0.9, para lo cual se utiliza una grca de probabilidades y los intervalos de concentracin. De esta forma, para p = 0.1 el logaritmo natural de la concentracin es igual a 3.107, y para p = 0.9 es igual a 6.338.
1.1 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 2.303 3.912 5.298 6.685 In de la concentracin 8.006
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Se genera una nueva tabla de valores con probabilidades de 0.1 a 0.9, donde se conservan los valores logartmicos del intervalo de concentracin, pero se recalculan las probabilidades considerando el recorte del 10 % que se hizo en el lmite superior e inferior, quedando una p total del 80 % (0.8). Con este ajuste se normaliza la probabilidad y se obtiene un rango que va nuevamente del 0 al 100 % (0 a 1). Con estos nuevos valores se establecen los intervalos de concentracin y se sigue el procedimiento explicado anteriormente para calcular la CL50. La tabla siguiente resume esos clculos.
Nuevos datos Logaritmo natural de las concentraciones Nueva probabilidad (p-0.1)/0.8 1 Intervalos del logaritmo natural de las concentraciones Frecuencia relativa 3 Promedio por intervalo 2X3 =4.923 3.107 0 (3.1073.912) 0.125 3.509 0.439 LC50= e4.923 3.912 5.298 6.338 1 Total 1 4.923
0.125 0.625 (3.912(5.2985.298) 6.338) 0.5 0.375 4.605 5.818 2.302 2.182 CL50=137.414 mg/kg
Ntese que la CL50 es igual a 129.024 mg/k con el mtodo Spearman-Karber, e igual a 137.414 mg/kg con el mtodo Spearman-Karber recortado. El recorte puede ser cualquier porcentaje dependiendo de la dispersin de los datos, de si se presenta mortalidad en el control y de si la mortalidad es o no proporcional al incremento de las concentraciones. El software para este ltimo mtodo (USEPA, 1999b) puede ajustar automticamente el recorte de acuerdo con los datos alimentados en el programa, y permite calcular la CL50 de manera muy sencilla y rpida.
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ANEXO 2. TABLA dE CONVErSIN dE VALOrES PrOBIT

% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 % 99a
a
0 3.72 4.16 4.48 4.75 5.00 5.25 5.52 5.84 6.28 0.0 7.33
1 2.67 3.77 4.19 4.50 4.77 5.03 5.28 5.55 5.88 6.34 0.1 7.37
2 2.95 3.82 4.23 4.53 4.80 5.05 5.31 5.58 5.92 6.41 0.2 7.41
3 3.12 3.87 4.26 4.56 4.82 5.08 5.33 5.61 5.95 6.48 0.3 7.46
4 3.25 3.92 4.29 4.59 4.85 5.10 5.36 5.64 5.99 6.55 0.4 7.51
5 3.36 3.96 4.33 4.61 4.87 5.13 5.39 5.67 6.04 6.64 0.5 7.58
6 3.45 4.01 4.36 4.64 4.90 5.15 5.41 5.71 6.08 6.75 0.6 7.65
7 3.52 4.05 4.39 4.67 4.92 5.18 5.44 5.74 6.13 6.88 0.7 7.75
8 3.59 4.08 4.42 4.69 4.95 5.20 5.47 5.77 6.18 7.05 0.8 7.88
9 3.66 4.12 4.45 4.72 4.97 5.23 5.50 5.81 6.23 7.33 0.9 9.09
Valores entre 99.0 y 99.9
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ANEXO 3. FOrMATO dE rEPOrTE dE rESULTAdOS dE LA PrUEBA dE MOrTALIdAd EN LOMBrICES
84 Efectos subletales (da 14) Tipo Porcentaje Lombrices vivas Datos da 14 Fecha: ___ /___ / ___ Humedad pH Temperatura Lombrices (%) (C) vivas Da 7 Da 14
Tipo de lombriz
Peso de la lombriz (g)
Datos iniciales Fecha: ___ / ___ /___ Humedad pH Temperatura (%) (C)
Observaciones y comentarios
Responsable tcnico
ANEXO 4. FOrMATO dE dATOS dE LA PrUEBA AGUdA
Datos generales
Duracin de la prueba Fecha de inicio Tipo de lombriz Tipo de contaminante
Datos especcos
pH de la muestra de suelo Nmero de lombrices Nmero de rplicas Total de lombrices en el control negativo Lombrices vivas en el control negativo Observaciones y comentarios Responsable tcnico
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3 Evaluacin de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con semillas

Mara del Carmen Cuevas Daz, Joahana de la Luz Rosaldo Santiago, Jaime Lpez Luna
INTrOdUCCIN Las plantas son esenciales en los ecosistemas porque son las responsables de transformar la energa solar en energa qumica, al tiempo que absorben dixido de carbono. De esta manera proveen de alimento y oxgeno al resto de los organismos. Adems, las plantas son uno de los componentes ms importantes de los ecosistemas terrestres porque proporcionan refugio y sitio de anidamiento para numerosos organismos, y participan de forma primordial en el reciclaje de nutrientes y en la estabilizacin de los suelos (Wang y Freemark, 1995). El dao a las plantas por los contaminantes puede afectar directamente a la estructura y la funcin de un ecosistema, al reducir la produccin primaria, incrementar el lavado y erosin del suelo y degradar el hbitat de la vida silvestre. Los efectos letales de los contaminantes sobre las plantas pueden signicar prdidas ecolgicas y econmicas muy importantes; incluso los efectos subletales tienen un impacto signicativo sobre la produccin de alimentos y el desarrollo de la vegetacin natural, e implicaciones adversas para los organismos pertenecientes a niveles superiores en la cadena alimenticia (Wang y Freemark, 1995). En los bioensayos de toxicidad con semillas se evalan los efectos adversos de los contaminantes en el proceso de germinacin y en el desarrollo de las plntulas durante los primeros das de crecimiento. Como respuesta se determina la inhibicin en la germinacin y de la elongacin de la radcula y del hipoctilo. Es
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importante destacar que durante la germinacin y los primeros das de desarrollo ocurren numerosos procesos siolgicos en los que la presencia de un compuesto txico puede interferir y alterar la supervivencia y el desarrollo normal de las plntulas. La divisin celular de los pices radiculares puede afectarse, retardando el proceso de mitosis o alterando el proceso de alargamiento radicular, por lo que la totoxicidad de un compuesto puede ser determinada a travs de la medicin de dichas respuestas (Uribe, 2008). Algunas plantas son ms sensibles que otras a los efectos de los contaminantes; sin embargo, se sabe que generalmente las comunidades vegetales son afectadas por los suelos contaminados con hidrocarburos del petrleo. Estos compuestos afectan en particular a las races y los brotes de plantas jvenes (Adam y Duncan, 2002). Para el desarrollo de estas pruebas se han empleado diversas especies, tanto de importancia econmica (ornamental o de cultivo), como ecolgicas (nativas); sin embargo, el trigo (Triticum aestivum) y el sorgo (Sorghum vulgare) son las que han sido ampliamente utilizadas. En este captulo est basado en los procedimientos de prueba recomendados por el protocolo 208 de la Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico (OECD, 1984), la gua OPPTS 850.4200 de la USEPA (1996a) y el ensayo de Uribe, 2008. CAMPO dE APLICACIN Estas pruebas se pueden aplicar directamente a suelos contaminados con hidrocarburos (como el petrleo o disel) o a suelos que han sido sujetos a algn tratamiento de remediacin. Tambin pueden ser aplicados a extractos de estos mismos suelos. PrUEBA dE TOXICIdAd AGUdA CON EXTrACTOS dE SUELO

Este bioensayo es una prueba aguda, con exposicin a 14 das, en la que se exponen las semillas a varias diluciones de los extractos del suelo problema, y posteriormente se mide la inhibicin de la germinacin y del crecimiento temprano de las plntulas, y la produccin de biomasa a travs de las concentraciones efectivas
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medias (CE50), las cuales representan las concentraciones de los extractos de suelo que ocasionan una inhibicin del 50 % en cada una de estas respuestas, comparadas con la respuesta mxima observada en el control negativo. MATErIAL Y EQUIPO
Cajas de Petri Contenedores de vidrio Pyrex de 150 x 75 mm Vasos de precipitados Pyrex de 125 y 300 mL Matraz Soxhlet Matraz volumtrico de 100 mL Papel ltro del No. 1 o 40 Pipeta graduada de 10 mL Regla graduada o vernier Matraz aforado de 500 mL Balanza analtica Cmara oscura con temperatura controlada Horno
REACTIVOS cido brico (H3BO3) con pureza > 98 %, de preferencia 99.5 % Agua destilada 2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio con pureza > 98 % Diclorometano grado HPLC Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5 % o blanqueador comercial Sulfato de sodio anhidro (NaSO4) grado analtico SOLUCIONES Solucin de cloruro de trifeniltetrazolio al 1 %. Pesar 10 g de 2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio y depositar en matraz aforado de 1000 mL, aforando y mezclando suavemente con agua destilada. El pH debe estar entre 6 y 8. Solucin de hipoclorito de sodio al 5 %. En un matraz aforado de 500 mL, adicionar 25 mL de NaClO y aforar con agua destilada, agitando lentamente. Se puede utilizar blanqueador comercial, que contiene comnmente 6 % de hipoclorito. Solucin de cido brico. Pesar 25 g de H3BO3, depositar en un matraz y aforar a 1 litro con agua desionizada.
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DE LA TOXiCiDAD DE LOS SUELOS MEDiANTE BiOENSAYOS CON SEMiLLAS
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EXTrACTOS dE SUELO Se depositan 40 g de suelo en charolas de vidrio o aluminio para su secado a temperatura ambiente (25-30 C) durante 48 h; no colocar al sol. Se realiza una trituracin hasta obtener partculas nas y homogneas, con la nalidad de mejorar la extraccin del hidrocarburo. Finalmente se coloca en un frasco limpio y seco. Los extractos de suelo pueden ser preparados mediante la extraccin con diclorometano empleando el mtodo de Soxhlet. Para ello se mezclan de 5 a 10 g de suelo seco y triturado. Se le adiciona sulfato de sodio anhidro en relacin 1:1 suelo:sulfato, y se deposita en un cartucho de celulosa. El cartucho se coloca dentro de la columna de extraccin del Soxhlet (USEPA, 1996b; Fernndez-Linares et al., 2006). Se adicionan 140 mL de diclorometano en el matraz baln, y de 4 a 5 perlas de ebullicin para evitar proyecciones del disolvente por el calentamiento. Las parrillas deben mantenerse a 55 C. A partir del primer reujo, se cuenta el tiempo para lograr un total de 6 reujos por h durante 6 h. Finalizada la extraccin, se pasa el matraz bola a un rotavapor y se evapora a sequedad. Se recupera el concentrado en un vial de 50 mL; este concentrado sirve como solucin para realizar las diluciones, en funcin de las concentraciones deseadas y de la concentracin existente en el suelo muestra. Se preparan cinco concentraciones del extracto de suelo en orden logartmico, por ejemplo 0.1 1, 10, 100, 1000 mg/L. Para ello, se usa la concentracin mayor y de esta se preparan las diluciones. Por ejemplo, si se requieren 100 mL de extracto con una concentracin de 1000 mg/L y se parte de una de una concentracin de 10000 mg/L, se toman 10 mL de esta solucin y se lleva a 100 mL con el disolvente empleado. De la solucin de 1000 mg/L se toman 10 mL y se afora a 100 mL para obtener una concentracin de 100 mg/L, y as sucesivamente. OrGANISMOS dE PrUEBA En estos bioensayos se utilizan semillas de trigo (Triticum aestivum), sorgo (Sorghum vulgare), maz (Zea mays), soya (Glycine max), lenteja (Lens culinari) o jitomate (Lycopersicum esculentum). Todas las semillas deben ser certicadas o de tipo orgnico. Como control de calidad de las semillas debe realizarse una prueba de viabilidad antes de realizar los ensayos de toxicidad. Una vez determinada la viabilidad de los lotes de semillas, estos deben guardarse en recipientes a prueba de humedad a 5 C, en oscuridad y ambiente seco.
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Preparacin de las semillas

Para desinfectar las semillas, estas se sumergen en la solucin de hipoclorito de sodio durante 15 min, luego se lavan con agua destilada y nalmente se colocan en un contenedor con agua destilada durante 15 min para eliminar los residuos del hipoclorito. PrOCEdIMIENTO
Prueba de viabilidad
Antes de realizar los bioensayos de toxicidad, se deber determinar la viabilidad de las semillas mediante el mtodo qumico de cloruro de trifeniltetrazolio (Moore, 1985) modicado. Este mtodo, tambin llamado prueba rpida de germinacin, consiste en probar en un periodo de 24 a 48 h la capacidad de germinacin de un lote (ms una rplica) de 50 semillas tomadas al azar. Esta prueba se basa en la actividad de las enzimas deshidrogenasas, particularmente las deshidrogenasas del cido mlico, que reduce la sal de tetrazolio en los tejidos vivos de las semillas. En esta reaccin los iones H+ son transferidos a la referida sal. Cuando la semilla se sumerge en la solucin de cloruro de trifeniltetrazolio, ocurre la reaccin de reduccin en las clulas vivas y se forma un compuesto de color rojo (trifenilformazn) que indica la presencia de actividad respiratoria en las mitocondrias y, consecuentemente, que el tejido es viable. Los tejidos muertos (no viables) no reaccionan con la solucin y conservan su color natural (Russi et al., 2007). Para llevar a cabo la prueba de viabilidad se siguen los pasos que a continuacin se describen: 1 Se remojan 50 semillas de la especie seleccionada en agua destilada o en papel ltro humedecido con agua destilada durante 4 a 18 h a temperatura ambiente. 2 Si se usan semillas grandes, como las del maz, estas se tien en un vaso de precipitados de 250 mL adicionando aproximadamente de 150 a 200 a mL de la solucin de cloruro de trifeniltetrazolio. Si son semillas ms pequeas, como las de tomate, se utiliza un vaso de precipitado de 125 mL y se adicionan de 80 a
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100 mL de la misma solucin. Se dejan reposar 2 h si son semillas pequeas y hasta 24 h si son semillas grandes (tabla 3.1) a una temperatura de 30 C en la oscuridad (Moreno, 1984; Moore, 1985). 3 Se lavan las semillas con agua corriente bajo un ujo reducido y posteriormente se observa el cambio de coloracin en el embrin (gura 3.1).
TABLA 3.1. TIEMPO DE IMBIBICIN CON TRIFENILTETRAZOILO. FUENTE: MOORE, 1985; KAMEsWARA, ET AL., 2007; DEL VALLE, 2008 FIGURA 3.1. SEMILLAs VIABLEs DE TRIGO EN LAs QUE sE APRECIA LA TINCIN CON TRIFENILFORMAZN
Semilla (h) Avena, trigo, maz y soya Sorgo Frijol Tiempo de imbibicin o remojo 8 10 12 envueltas en toalla de papel hmedo, despus 4 h de remojo
DESArrOLLO dE LA PrUEBA
Previamente a la prueba, las semillas deben ser desinfectadas con hipoclorito de sodio, conforme el procedimiento anteriormente descrito. Se coloca papel ltro en el interior de las cajas de Petri y se adicionan 2 mL del extracto de suelo. Este paso se repite para cada una de las 5 concentraciones
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preparadas con el extracto de suelo. Se colocan 15 semillas de las especies seleccionadas en cada caja de Petri, dejando suciente espacio entre ellas. En el caso del control negativo, slo se adicionan 2 mL de agua destilada al papel ltro y se depositan las 15 semillas. De la misma manera, se prepara un tratamiento control con el disolvente empleado para preparar los extractos del suelo (Fernndez-Linares et al., 2006), as como un control positivo agregando 2 mL de la solucin de cido brico (EC, 2005). Una vez preparadas, todas las cajas de Petri deben ser colocadas en la cmara oscura a una temperatura controlada de 22 2 C. Cuando se observe que al menos el 65 % de las semillas en el control negativo han germinado y sus radculas muestran un tamao de al menos 5 mm de largo, deben evaluarse las variables de respuesta en todos los tratamientos. Para ello, se extraen las plntulas de las cajas de Petri. Con la regla o el vernier se mide la altura de las plntulas (longitud del hipoctilo) y la longitud de la radcula (gura 3.2). Para determinar la produccin de biomasa, se pesan las plntulas en una balanza analtica, para lo cual previamente se colocan en cajas de Petri y se meten en la estufa a 75 C durante 20 a 24 h para eliminar la humedad.
FIGURA 3.2. PLNTULAs DE TRIGO
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Clculos
Una vez que los datos han sido registrados, se realizan los siguientes clculos: El porcentaje de viabilidad de cada especie seleccionada. El porcentaje de las semillas germinadas en cada especie. El promedio, la desviacin estndar y el porcentaje de produccin de biomasa y de elongacin de la radcula y el hipoctilo de las plntulas de cada especie seleccionada.
Parmetros toxicolgicos
Con los datos de germinacin, produccin de biomasa y elongacin radicular y del hipoctilo, se elabora una curva dosis-respuesta donde se marcan los siguientes parmetros toxicolgicos: la CE50 (concentracin efectiva media), la NOAEC (concentracin mxima en la que no se observan efectos adversos) y la LOAEC (concentracin mnima en la que se observan efectos adversos). La CE50 se calcula con el mtodo Probit (USEPA, 1999a; Daz-Baez et al., 2004) o de Spearman-Karber recortado (Hamilton et al., 1977) para cada una de las especies seleccionadas. Dichos mtodos se describen en el captulo 2. Los valores de la NOAEC y la LOAEC se obtienen estadsticamente mediante el anlisis de comparacin de medias por una prueba de Dunnett. En este tipo de pruebas no se puede establecer con precisin la mortalidad (CL50) de una plntula, por lo que se utilizan otros parmetros, como los ya descritos, que indiquen otros efectos txicos. Sin embargo, los bioindicadores, como germinacin, produccin de biomasa y elongacin de raz y tallo, deben estandarizarse previamente, puesto que el software disponible est diseado para calcular concentraciones letales (CL50). Para estandarizar los datos, la germinacin promedio de los tratamientos se establece como porcentaje en relacin al control, el cual se asume como 100 %. Posteriormente, se consideran solo los efectos negativos, que se obtienen calculando la disminucin del porcentaje de germinacin de los tratamientos con respecto al control (100-% de germinacin con respecto al control). Con estos datos se construye la curva dosis-respuesta y se calcula la CE50 utilizando el software libre Trimmed Spearman Karber Method (USEPA, 1999b). Antes de ingresar los datos en el programa, se establece que el nmero total de individuos de prueba en el control y en cada concentracin de los tratamientos equivale a 100 (100 %).
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Se asume que no existe mortalidad en el control (equivale a cero), y como dato de mortalidad de los tratamientos se ingresa la disminucin del porcentaje de germinacin con respecto al control. El valor de la CE50 calculado nos indicara entonces la concentracin a la cual el porcentaje de germinacin disminuye un 50 % con respecto al control negativo. Se procede de la misma manera para produccin de biomasa, elongacin de radcula e hipoctilo y cualquier otro bioindicador de toxicidad, en donde la CE50 indicara una disminucin del 50 % de respuesta con respecto al control negativo. La NOAEC y la LOAEC se obtienen estadsticamente mediante el anlisis de comparacin de medias de los valores naturales (datos crudos), utilizando la prueba de Dunnett que compara cada uno de los tratamientos con el control. La concentracin del tratamiento que sea estadsticamente diferente del control equivale a la LOAEC, es decir a la concentracin mnima en la cual se observa un efecto adverso. La concentracin mxima que no sea estadsticamente diferente del control equivale al valor de NOAEC, que es la concentracin mxima en la que an no se observan efectos adversos. Estos parmetros toxicolgicos son de gran importancia porque se utilizan para calcular ndices de riesgo. Se puede consultar informacin toxicolgica adicional en Lpez-Luna et al., 2009. REPOrTE Para elaborar el reporte se recomienda incluir los siguientes puntos (ISO, 1993): Tipo de contaminante presente en el suelo problema y su control Tipo de suelo, su origen y caractersticas. Variedad de semilla o detalles de otras especies empleadas Condiciones del crecimiento de la semilla Tipo de contenedor, dimensiones y cantidad de suelo utilizada. Cualquier problema o desviacin del protocolo
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TABLA 3.2. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA LAs PRUEBAs DE sEMILLAs EXPUEsTAs
A EXTRACTO DE sUELO
Duracin de la prueba Temperatura Condiciones de iluminacin Recipientes de prueba Cantidad de extracto de suelo requerida por rplica Especie de prueba
14 das 22 2 C Oscuridad hasta germinacin Cajas de Petri con papel ltro humedecido 2 mL Trigo (Triticum aestivum), sorgo (Sorghum vulgare), maz (Zea mays), soya (Glycine max), lenteja (Lens culinari) o jitomate (Lycopersicum esculentum) 15 3 Inhibicin de la germinacin, de la elongacin de la radcula y el hipoctilo, y de la produccin de biomasa Agua destilada y el disolvente empleado en la extraccin cido brico
Nmero de semillas por rplica Nmero de rplicas Respuesta a medir
Control negativo Control positivo
PrUEBAS dIrECTAS dE TOXICIdAd AGUdA EN SUELO

Este bioensayo es una prueba aguda, con exposicin a 14 das, en la que se exponen directamente las semillas al suelo problema (prueba de tratamiento nico) o a sus diluciones (prueba de tratamientos mltiples), y posteriormente se mide la inhibicin de la germinacin, del crecimiento temprano de las plntulas y de la produccin de biomasa. En la prueba de tratamiento nico se determina si el suelo produce esta inhibicin comparada con el control negativo, mientras que en la prueba de tratamientos mltiples se determinan las concentraciones efectivas medias (CE50), las cuales representan las concentraciones del suelos problema que ocasionan una inhibicin del 50 % en cada una de estas respuestas, comparadas con la respuesta mxima observada en el control negativo.
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MATErIAL Y EQUIPO
Bolsas plsticas de 0.05 X 0.015 m o frascos de vidrio Pyrex con dimetro de 5.5 cm y 5 cm de altura Cajas de Petri Cristalizadores de vidrio de dimetro de 15 cm y 7.5 cm de altura, o de 8 cm de largo, 6 cm de ancho y 4 cm de altura Matraz volumtrico de 100 mL Papel ltro del No. 1 o 40 Pipeta graduada de 10 mL Regla o vernier Balanza analtica Balanza granataria Cmara con temperatura y fotoperiodo controlados Criba de malla 10 con abertura de 2 mm Estufa Mortero
Reactivos
Acetona o diclorometano grado HPLC cido brico (H3BO3) con pureza mayor al 98 % Agua destilada Agua tipo II Arena o suelo sin contaminar 2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio de 98 % de pureza Hipoclorito de sodio (NaClO) grado analtico
Soluciones
Solucin de cloruro de trifeniltetrazolio al 1 %. Adicionar 10 ml de cloruro de trifeniltetrazolio en 500 ml de agua, mezclar y aforar a 1000 mL. Solucin de hipoclorito de sodio al 5 %. Tomar 25 mL de NaClO y depositar en un matraz aforado que contenga 100 mL de agua destilada, aforar a 500 mL con agua destilada y mezclar. Solucin de cido brico. Pesar 25 g de H3BO3, depositar en un matraz y aforar a 1 litro con agua desionizada, mezclar depositando una barra magntica en el matraz Erlenmeyer y agitar durante 15 min.
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Suelo
Para las pruebas en las que solo se evala la toxicidad del suelo problema como tratamiento nico, el suelo se seca a temperatura ambiente. Posteriormente se tritura con un mortero para homogenizarlo y se criba para eliminar las piedras. Se depositan 8 g de suelo en las bolsas de plstico, para facilitar el crecimiento de las plantas. Se ajusta el contenido de humedad del suelo con agua destilada a un valor entre el 28 y el 30 % de la capacidad de campo. Para las pruebas en las que se evalan distintas concentraciones del suelo problema, este se mezcla con suelo similar al del sitio contaminado para obtener diluciones de 0, 25, 50, 75 y 100 %. Para ello se pesan 30 g de suelo de las diferentes diluciones y se depositan en los frascos de vidrio (Meier et al., 1997). Otra forma es realizar el bioensayo con el suelo contaminado y el suelo tratado (biorremediado) sin realizar mezclas. Cada tratamiento debe realizarse por triplicado.
Para las pruebas directas en suelo, se recomiendan las mismas especies mencionadas anteriormente en este captulo. PrOCEdIMIENTO
Prueba de viabilidad
Antes de realizar los ensayos de toxicidad, se debe probar la viabilidad de las semillas de las especies seleccionadas. Para ello se sigue el procedimiento descrito con anterioridad en este captulo.
Preparacin de las semillas

Para desinfectar las semillas, estas se sumergen en la solucin de hipoclorito de sodio durante 15 min, luego se lavan con agua destilada y nalmente se colocan en un contenedor con agua destilada durante 15 min para eliminar los residuos del hipoclorito.
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Desarrollo de las pruebas

Para la prueba de tratamiento nico, en cada bolsa se deposita una semilla hasta completar un total de 15 por cada especie seleccionada (gura 3.3).
FIGURA 3.3. PREPARACIN
NICO DE LOs RECIPIENTEs PARA LA PRUEBA CON sEMILLAs DE TRATAMIENTO
Para las pruebas de tratamientos mltiples, se depositan 10 semillas por cada especie en los frascos de vidrio. Deben prepararse 3 rplicas por cada dilucin (Sharifi et al., 2007). Tambin se prepara el control negativo con arena o suelo no contaminado (con aproximadamente un 3 % de materia orgnica) y agua destilada, el control del disolvente (diclorometano, acetona o dimetilsulfxido) con arena (OECD, 2006), y el control positivo con arena adicionada de cido brico (EC, 2005). Existen guas o protocolos, como OECD, 1984 e ISO, 1993, que no incluyen un compuesto txico de referencia. El control positivo con cido brico debe emplearse cada vez que el lote de semillas sea nuevo, o en las pruebas del control de bioensayo que se realizan cada dos meses. Posteriormente las bolsas o los frascos se incuban en la cmara oscura a una temperatura de 22 2 C hasta que se observa un 65 % de germinacin de las
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semillas del control negativo (Saterbak et al., 2000). Despus de este periodo, las plntulas se mantienen bajo un rgimen de 16 h de luz y 8 de oscuridad. Dependiendo del ciclo de cada especie, se determina el porcentaje de germinacin despus de varios das. Un crecimiento de la radcula mayor a 5 mm se considera un indicador de la germinacin. Diariamente se observan las plantas y se anota cualquier cambio que se aprecie, como cambios en la coloracin o necrosis de las hojas. Posteriormente, al nalizar la prueba, se determinan los parmetros de produccin de biomasa y de elongacin del tallo y la raz, como se describi anteriormente en este captulo. Durante toda la prueba es necesario mantener un contenido de humedad del suelo de 70 5 % de la capacidad de campo (USEPA, 1996a). Para ello, cada tercer da se adiciona agua tipo II (con una conductividad especca 1.0 umhos/ cm a 25 C, cuenta total bacteriana de 0/mL y valor mximo de materia de 0.1 mg/l) a cada bolsa o frasco, en forma manual con una pipeta graduada o mediante atomizacin, hasta alcanzar el peso exacto del suelo (considerando el peso de la bolsa o el frasco).
Clculos
Al trmino de la prueba se realizan los siguientes clculos: El porcentaje de viabilidad de las semillas estudiadas El porcentaje de las semillas germinadas en cada especie seleccionada El promedio, la desviacin estndar y el porcentaje de produccin de biomasa y de elongacin de la raz y el tallo de las plantas de cada especie
Parmetros toxicolgicos
Con los datos anteriores se elabora una curva dosis-respuesta y se calculan los parmetros toxicolgicos de la CE50, la NOAEC y la LOAEC para la germinacin, la elongacin de la raz y el tallo y la produccin de biomasa. Los parmetros toxicolgicos se obtienen como se describi previamente, con la excepcin de que los valores de concentracin quedarn expresados como porcentaje de adicin de suelo contaminado, es decir, la CE50 equivaldr a la proporcin (%) de suelo contaminado que provoca el 50 % de disminucin de la germinacin con respecto a un suelo control libre de contaminantes. La LOAEC sera la proporcin de suelo contaminado mnima que genera un efecto adverso, y la NOAEC sera la propor100
cin de suelo contaminado mxima que no genera efectos adversos. De la misma manera se procedera para produccin de biomasa y elongacin de raz y tallo, comparando los tratamientos con un suelo control de caractersticas similares al suelo contaminado. REPOrTE Para elaborar el reporte se recomienda incluir los siguientes puntos: El tipo de contaminante presente en el suelo problema y su concentracin Las caractersticas del suelo problema (pH, contenido de humedad y capacidad de campo) antes, durante y al trmino de la prueba Las caractersticas de las semillas de prueba (semillas certicadas u orgnicas, especie, variedad, familia, nombre comn, nmero de semillas utilizadas en cada contenedor, estacin de cosecha, etc.) Nmero de rplicas, condiciones de incubacin y esterilizacin de las semillas Los valores de humedad y pH del suelo registrados durante la prueba
TABLA 3.3. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA LAs PRUEBAs DE sEMILLAs EXPUEsTAs
DIRECTAMENTE AL sUELO PROBLEMA
Tipo de prueba Temperatura Duracin Tipo de contenedores Cantidad de suelo requerida por contenedor Organismo prueba
Nmero de organismos por rplica Nmero de rplicas Control negativo Control positivo
Directa en suelo 22 2 C De 10 a 21 das en funcin de la especie Recipientes de vidrio de 4.5 cm de dimetro y 7 cm de altura o bolsas plsticas 30 g Trigo (Triticum aestivum), sorgo (Sorghum vulgare), maz (Zea mays), soya (Glycine max), lenteja (Lens culinari) o jitomate (Lycopersicum esculentum) 10 De 3 a 4 Suelo no contaminado cido brico
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Control de calidad
El protocolo 208 de la OECD (1984) y la gua OPPTS 850.4200 de la USEPA (1996a) establecen que deben considerarse los siguientes aspectos durante estas pruebas: Las pruebas de tratamientos mltiples deben contar con un mnimo de tres concentraciones y un control negativo. Se debe sembrar por rplica como mnimo cinco semillas, que deben ser lo ms homogneas posible en cuanto a tamao. El tamao de los recipientes de prueba debe ser adecuado para permitir el crecimiento normal de las semillas. Las plantas deben ser regadas segn los requerimientos de su especie. Debe buscarse que las semillas que se usen en estas pruebas presenten un porcentaje de germinacin mayor al 90 %, as como baja variabilidad (CV < 30 %) en la elongacin de la radcula y el hipoctilo. Debe garantizarse que la germinacin ocurra a la temperatura ptima de la especie y probar si este proceso de da mejor en presencia o ausencia de luz. Si no es posible tener un lote de semillas con una germinacin mayor o igual al 90 %, se debe aumentar el nmero de semillas por rplica hasta un mnimo de 18 semillas germinadas. Si existe variacin en elongacin de la radcula o del hipoctilo en el control negativo, se debe aumentar el nmero de rplicas para reducir el error. Si las semillas son de diversos tamaos, deben eliminarse los extremos, es decir, las ms grandes y las ms pequeas, y utilizar solo la fraccin de semillas de tamao medio. En el caso en que el control negativo no alcance ms del 50 % de germinacin, debe repetirse la prueba, estableciendo seis concentraciones como mnimo (incluyendo aquellas en donde se encontr efecto adverso) y el control negativo.
Observaciones
La inhibicin de la elongacin de la radcula y el hipoctilo constituyen indicadores subletales muy sensibles para la evaluacin de efectos biolgicos en vegetales, que aportan informacin complementaria a la proporcionada al estudiar el efecto en la germinacin.
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REFErENCIAS
Adam, G., Duncan, H. 2002. Inuence of diesel fuel on seed germination. Environmental Pollution. 120, 363-370. Daz-Baez, M.C., Bulus-Rossini, G.D., Pica-Granados, Y. 2004. Mtodos estadsticos para el anlisis de resultados de toxicidad. En: Castillo, G. (editora). Ensayos Toxicolgicos y Mtodos de Evaluacin de Calidad de Aguas. Estandarizacin, Intercalibracin, Resultados y Aplicaciones. Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo, Instituto Mexicano de Tecnologa del Agua. Mxico. Del Valle, G.C., 2008. Calidad siolgica y efecto de la presencia de semillas verdes de soja (Glycine max L) en lotes destinados a simiente. Tesis de maestra. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Crdoba. Argentina. Environment Canada (EC). 2005. Biological test method: test for measuring emergence and growth of terrestrial plants exposed to contaminants in soil. EPS 1/RM/45/ 2005 with 2007 amendments. Method Development and Application Section. Environmental Technology Center. Ottawa, Canad. Fernndez-Linares, L.C., Rojas-Avelizapa, N.G., Roldn-Carrillo, T.G., Ramrez-Islas, M.E., Zegarra-Martnez, H.G., Uribe-Hernndez, R., Reyes-vila, R.J., Flores-Hernndez, D., Arce-Ortega, J.M. 2006. Manual de tcnicas de anlisis de suelos aplicadas a la remediacin de sitios contaminados. Instituto Nacional de Ecologa, Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales. Mxico. Hamilton, M.A., Russo, R.C., Thurson, R.V. 1977. Trimmed Spearman-Karber method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environmental Science and Technology. 11, 714-719. International Standard Organization (ISO), 1993. Soil quality-Determination of the effects of pollutants on soil ora. Parte 1. Method for the measurement of inhibition of root growth.ISO-11269-1. Suiza. Kameswara, R.N., Hanson, Ehsan, D.M., Ghosh, K., Nowell, D., Larinde, M., 2007. Manual para el manejo de semilla en bancos de germoplasma. Bioversity International. Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin. Roma, Italia. http://www.bioversityinternational.org/leadmin/bioversity/publications/pdfs/ 1261.pdf. Consultado en agosto de 2011. Lpez-Luna, J., Gonzlez-Chvez, M.C., Esparza-Garca, F.J., Rodrguez-Vzquez, R. 2009. Toxicity assessment of soil amended with tannery sludge, trivalent chromium and hexavalent chromium, using wheat, oat and sorghum plants. Journal of Hazardous
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semillas de cebolla Allium cepa y soya Glycine max. 2008. En: Ramrez-Romero, P., Mendoza-Cant, A. (compiladoras). Ensayos toxicolgicos para la evaluacin de sustancias qumicas en agua y suelo. La experiencia en Mxico. Instituto Nacional de Ecologa, Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales. Mxico. Wang, W., Freemark, K. 1995. Use of plants for environmental monitoring and assessment. Ecotoxicology and Environmental Safety. 30, 289-301.
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4 Ensayo cometa en fauna terrestre

Donaji J. Gonzlez-Mille, Guillermo Espinosa-Reyes, Csar Ilizaliturri-Hernndez, Jos de Jess Meja Saavedra, Yolanda Jasso-Pineda, Fernando Daz-Barriga
INTrOdUCCIN El genoma es el conjunto de informacin gentica necesaria para el funcionamiento de un ser vivo; dicha informacin est codicada en las molculas de ADN. Todos los componentes bsicos del ADN (bases nitrogenadas, azcares y grupos fosfodisteres) son posibles blancos de alteraciones qumicas por agentes genotxicos, como algunos hidrocarburos aromticos policclicos (HAP) presentes en el petrleo crudo y sus productos derivados (Albert, 2004). La teora de la mutacin somtica del cncer establece que los daos del genoma que producen mutaciones son la base para el desarrollo de varios tipos de cncer. Segn esta teora, un slo impacto en el ADN, ocasionado por algn agente genotxico (en el sitio adecuado y que no sea reparado correctamente), puede tener consecuencias severas para la clula. De manera general, estos impactos al ADN se pueden dividir en mutaciones puntuales, aductos, aberraciones cromosmicas y rupturas de la molcula. El ensayo cometa es una prueba ampliamente utilizada para detectar el dao in vitro o in vivo causado al ADN por agentes genotxicos en clulas individuales (Fairbairn et al., 1995; Rojas et al., 1999; Tice et al., 2000). Se caracteriza por ser un mtodo sensible, rpido, sencillo, de bajo costo y aplicable a varios tipos de clulas de eucariontes (Mckelvey-Martin et al., 1993; Collins et al., 2008). Esta tcnica, descrita por Singh et al. (1988), permite analizar
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la migracin del ADN debido a rupturas simples en la hebra del ADN y a sitios lcali lbiles (Speit y Hartmann, 1999). Consiste bsicamente en analizar clulas individuales que son lisadas y sometidas a una electroforesis. Durante la electroforesis los fragmentos de ADN migran fuera del ncleo celular hacia el nodo y forman una cauda o cola que, al ser observada con el microscopio de uorescencia, tiene la apariencia de un cometa. La magnitud del dao es evaluada de acuerdo al nmero de clulas afectadas, a la longitud de la cola y a la intensidad de la uorescencia de los fragmentos. Con algunas modicaciones, esta tcnica puede usarse para evaluar la induccin de enlaces cruzados (proceso de intercambio de secciones de ADN entre dos cromosomas) y la alteracin de los mecanismos de reparacin y muerte celular (apoptosis) (Fairbairn et al., 1995; Speit y Hartmann, 1999; Tice et al., 2000). En este captulo se describir la tcnica del ensayo cometa para determinar el dao al ADN en diferentes especies de fauna terrestre. Inicialmente se detallar el mtodo usado en linfocitos humanos (Singh et al., 1988), y posteriormente se mencionarn las adecuaciones realizadas para las especies de fauna silvestre que fueron evaluadas (sapos y lombrices de tierra).
CAMPO dE APLICACIN El ensayo cometa ha sido utilizado en estudios de monitoreo (Lebailly et al., 1997; Dhawan et al., 2009) en sapos y lombrices de tierra con la nalidad de recabar evidencia sobre el estrs ambiental al que han estado expuestos estos organismos en sitios que presentan suelos contaminados con hidrocarburos. ENSAYO EN LINFOCITOS HUMANOS

Este mtodo se basa en la observacin de clulas individuales (linfocitos) con la nalidad de evaluar la fragmentacin del ADN ocasionada por la exposicin a contaminantes genotxicos. Consiste bsicamente en los siguientes pasos: obtener las clulas, jarlas con agarosa en un portaobjetos, someterlas a una solucin de lisis con la nalidad de romper su membrana celular, desenrollar el ADN en una solucin amortiguadora, realizar la electroforesis y la determinacin del dao al material gentico.
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Material y equipo
Agitadores magnticos Caja portalaminillas Charola de aluminio de 30 x 20 cm Chupones Cubrebocas Cubreobjetos de 24 x 50 cm Frascos mbar de 250 y 500 mL y 1 L con tapn Frascos de vidrio para bao de 50 mL Gasa Guantes de nitrilo Matraces aforados de 50, 250 y 500 mL y 1L Micropipetas de 0.5-10, 5-50, 20-200 y 200-1000 L Papel absorbente Papel aluminio Estufa Bao Cmara de electroforesis Fuente de poder Agitador mecnico basculante para tubos Balanza analtica Bao mara Cmara de electroforesis Campana de extraccin Cronmetro Cuarto fro a 4 C Horno de microondas Lmpara de luz amarilla Microscopio equipado con luz uorescente y el software Komet 4.0 (o con ocular graduado) Refrigerador Placa de agitacin Potencimetro Vrtex
Papel encerado Papel ltro No. 1 Papel Paralm Pipetas Pasteur Pipetas serolgicas de 5 y 10 mL Pinzas de diseccin Portaobjetos esmerilados de 25 x 75 mm Probetas de 50 y 100 mL Puntas para micropipetas de 0.5-250, 5-300 y 100-1000 L Tijeras Tubos Eppendorf de 2 mL Tubos cnicos de 25 y 50 mL Tubos Vacutainer con heparina
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COMETA EN FAUNA TERRESTRE
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Vasos Coplin de polipropileno Vasos de precipitado de 1 L y 2 L
Reactivos
cido clorhdrico (HCl) grado analtico cido etilendiaminotetraactico (EDTA) para biologa molecular Agarosa de bajo punto de fusin para biologa molecular Agarosa regular para biologa molecular Agua desionizada Bromuro de etidio grado analtico Cloruro de sodio (NaCl) grado analtico Dimetilsulfxido (DMSO) para biologa molecular, pureza 99.9 % Etanol anhidro grado analtico Hidrxido de sodio (NaOH) en perlas grado analtico Triton X-100 grado analtico Trizma Base grado analtico
Soluciones
Solucin de agarosa regular al 1 %. Se pesa 0.25 g de agarosa y se disuelve en 25 mL de agua desionizada. Para ayudar a disolverla se utiliza el horno de microondas a una temperatura de 30 C entre 7 y 10 s y se agita; de esta manera se procede de forma repetitiva hasta que se disuelva completamente. La agarosa se vierte en un frasco y se coloca en un bao a una temperatura de 50 C. De preferencia, esta solucin debe prepararse cada vez que se realice un nuevo ensayo. Solucin de agarosa regular al 0.6 %. Se pesan 0.075 g de agarosa y se disuelven en 12.5 mL de agua desionizada. Se realizan los mismos pasos que se describen para la solucin anterior. De preferencia, esta solucin debe prepararse cada vez que se realice un nuevo ensayo. Solucin de hidroxido de sodio 10 N. Se pesan 200 g de NaOH para disolverse en 500 mL de agua desionizada. La solucin se debe preparar en una campana de extraccin con la ayuda de un bao mara y una placa de agitacin. Las perlas de NaOH deben agregarse de forma paulatina en un vaso de precipitado con agua desionizada hasta disolverse. La solucin se afora en un matraz de 500
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mL y se ltra posteriormente con papel No. 1. Se almacena en un frasco mbar debidamente etiquetado en el cuarto fro (4 C). Esta solucin se puede almacenar en estas condiciones hasta por 30 das. Solucin de lisis. Se pesan 146.1 g de NaCl (2.5 M), 1.2 g de Trisma Base (10 mM), 8 g de NaOH (0.2 M) y 37.2 g de EDTA (100 mM) para disolverse en 890 mL de agua desionizada. En la placa de agitacin se coloca un vaso de precipitado de 1 L y se agregan aproximadamente 500 mL de agua desionizada. Se agregan los reactivos en el siguiente orden: el NaCl, el Trisma Base y, de forma alternada, el NaOH y el EDTA, es decir, se pone un poco de NaOH y despus un poco de EDTA y as sucesivamente. Cuando los reactivos estn disueltos, se mide el pH, el cual deber tener un valor de 10. Con una pipeta Pasteur se deber agregar gota a gota la solucin de NaOH 10 N para elevar los valores de pH. En el caso de que el pH exceda el valor de 10, se deber agregar gota a gota HCl concentrado hasta obtener el valor deseado. Posteriormente se agregan 100 mL de DMSO y 10 mL de Tritn 100 X. La solucin se afora en un matraz de 1 L y se ltra posteriormente con papel No 1. Se almacena en un frasco mbar debidamente etiquetado, a 4 C durante por lo menos 1 h para antes de ser utilizada. Solucin de cido etilendiaminotetraactico 200 mM. Se pesan 3.72 g de EDTA para disolverse en 50 mL de agua desionizada. El EDTA se debe agregar de forma paulatina en un vaso de precipitado con agua desionizada hasta disolverse. La solucin puede prepararse con la ayuda de una placa de agitacin. Cuando el reactivo est disuelto se mide el pH, el cual deber tener un valor de 10. Para ajustar el pH se utiliza la solucin de NaOH 10 N o HCl concentrado, como se indic para preparar la solucin de lisis. La solucin se afora en un matraz de 50 mL y se ltra con papel No. 1. Se almacena en un frasco mbar debidamente etiquetado, en el cuarto fro (4 C) y en ausencia de luz directa. Esta solucin se puede almacenar en estas condiciones hasta por 30 das. Solucin amortiguadora para electroforesis. En un vaso de precipitado se agregan 48 mL de la solucin de NaOH 10 N, 8 mL de la solucin de EDTA 200 mM y 1544 mL de agua desionizada. Se mezcla y se mide el pH, el cual debe tener un valor de 13 o mayor. Para ajustar el pH se utiliza la solucin de NaOH 10 N o HCl concentrado, como se indic para preparar la solucin de lisis. La solucin se afora en un vaso de precipitado de 2 L y se ltra con papel No 1. Se almacena en un frasco mbar debidamente etiquetado, en el cuarto fro (4 C).
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Solucin de Trisma Base 0.4 M. Se pesan 12.12 g de Trisma Base para disolverse en 250 mL de agua desionizada. El Trisma deber agregarse de forma paulatina en un vaso de precipitado con agua desionizada hasta disolverse. Se mezcla y se mide el pH, el cual deber tener un valor de 7.5. La solucin puede prepararse con la ayuda de una placa con agitador. Para ajustar el pH se utiliza la solucin de NaOH 10 N o HCl concentrado, como se indic para preparar la solucin de lisis. La solucin se afora en un matraz de 250 mL y se ltra con papel Whatman No. 1. Se almacena en un frasco mbar debidamente etiquetado, en el cuarto fro (4 C). Solucin de agarosa de bajo punto de fusin al 0.5 %. Se pesan 0.125 g de agarosa de bajo punto de fusin y se disuelven en 25 mL de agua desionizada. Para ayudar a disolverla se utiliza un horno microondas a una temperatura de 30 C entre 7 y 10 s y se agita; de esta manera se procede de forma repetitiva hasta que se disuelva completamente. La agarosa se vierte en un frasco y se coloca en un bao a una temperatura de 37 C. De preferencia, esta solucin debe prepararse cada vez que se realice un nuevo ensayo. Solucin stock de bromuro de etidio. Se pesan 0.002 g de bromuro de etidio y se disuelven en 10 mL de agua desionizada. Esta solucin debe ser protegida de la luz directa, por lo que debe almacenarse en un frasco mbar o, en su defecto, en un tubo cnico de polipropileno cubierto con papel aluminio. El manejo del bromuro de etidio debe hacerse en todo momento con guantes de nitrilo, y debe evitarse el contacto directo con la piel. Solucin de trabajo de bromuro de etidio. A partir de la solucin stock de bromuro de etidio, se toma 1 mL y se disuelve en 9 mL de agua desionizada. La concentracin nal del bromuro de etidio deber ser de 0.05 mM. Esta solucin debe ser protegida de la luz directa, por lo que debe almacenarse en un frasco mbar o, en su defecto, en un tubo cnico de polipropileno cubierto con papel aluminio. El manejo del bromuro de etidio debe hacerse en todo momento con guantes de nitrilo, y debe evitarse el contacto directo con la piel.
Procedimiento
Preparacin de camas de electroforesis Para la preparacin de las camas de electroforesis deben usarse guantes en todo momento. Se colocan las laminillas con el esmerilado hacia arriba en un vaso de precipitado con etanol anhidro, se tapan con papel Paralm y se dejan por un tiem112
po mnimo de 15 min. Mientras este tiempo transcurre, se cortan trozos de gasa en forma de cuadros y se preparan con aluminio las charolas donde se colocarn las laminillas. Las laminillas se toman con una pinza por el lado esmerilado y se limpian con la gasa. Posteriormente se colocan en las charolas y se rotulan por la parte esmerilada. A cada laminilla se le colocan 150 L de agarosa regular. La agarosa se distribuye por toda la laminilla con la ayuda de la punta del dedo limpio. Las laminillas con la cama de agarosa se colocan en las charolas y se secan en el horno a una temperatura de 65 a 70 C. Una vez que estn bien secas y fras, pueden ser almacenadas en cajas portalaminillas. Se deben utilizar antes de 2 semanas, de lo contrario se desechan. Preparacin de las laminillas en el vaso Coplin En el vaso Coplin se agregan 50 mL de la solucin de lisis. Esta solucin se vierte con una probeta. El vaso debe almacenarse en el cuarto fro por lo menos 1 h antes de su uso. Los portaobjetos o laminillas se sumergen en el vaso Coplin por lo menos 1 h antes de pasar a la electroforesis. El tiempo de permanencia de las laminillas en estas condiciones no debe exceder de 2 semanas. Preparacin de las clulas Se obtiene una muestra de sangre (3 mL) en un tubo Vacutainer con heparina y se coloca en el agitador hasta que la muestra se encuentre completamente homogenizada, para evitar su coagulacin. Con ayuda de la micropipeta, se toman alcuotas de 15 L de la muestra de sangre y se colocan en el fondo de los tubos Eppendorf; despus se agregan 225 L de agarosa de bajo punto de fusin y se homogeniza con el vrtex. De la mezcla se toman 75 L y se colocan sobre una cama de electroforesis, y enseguida se les coloca un cubreobjetos. Las laminillas se colocan en la charola de aluminio para llevarse a refrigeracin 5 min. Transcurrido el tiempo, se retira de forma delicada el cubreobjetos de la laminilla y se agregan de 75 a 80 L de agarosa de bajo punto de fusin. Se coloca un nuevo cubreobjetos y se pone en la charola para llevarse a refrigeracin 5 min ms. Transcurrido el tiempo, se retira de forma cuidadosa el cubreobjetos y se desecha. Las laminillas se colocan en pares (espalda con espalda) en el vaso Coplin con la solucin de lisis.
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Electroforesis
En el cuarto fro se coloca la cmara de electroforesis en la mesa. Debe asegurarse que la cmara est en posicin totalmente horizontal, y para ello se verica que la burbuja indicadora se encuentre en posicin centrada; de lo contrario, se ajustan las patas hasta la posicin adecuada. Despus, la cmara se conecta a la fuente de poder, de acuerdo con el color y la polaridad de los cables (rojo-positivo, negronegativo). El trabajo a partir de este momento debe realizarse en completa oscuridad y solo con ayuda de la lmpara de luz amarilla, con la nalidad de no daar el ADN con la luz. Se coloca la solucin de electroforesis en la cmara, hasta la plataforma por ambos lados, sin que la solucin se junte. Despus se colocan las laminillas en la cmara, tomndolas con las pinzas por la parte esmerilada y asegurndose de que estn en la direccin correcta. Se vierte la solucin de electroforesis hasta cubrir las laminillas, asegurndose de que no queden burbujas debajo de las laminillas. Las laminillas se quedan en la solucin de electroforesis durante 20 min (tiempo de desenrollamiento). Mientras transcurre este tiempo, se conguran los parmetros de la fuente de poder a 25 V, 300 A y 20 min. Transcurrido el tiempo, se coloca la tapa y se procede a encender la fuente de poder con los parmetros congurados previamente. Se observa unos segundos la formacin de espuma y un valor constante de 300 A, lo que indica que la electroforesis se est llevando a cabo correctamente. Si el valor de 300 A disminuye, se deber colocar ms solucin de electroforesis por un costado de la cmara hasta obtener el valor deseado. Despus se coloca la placa metlica que cubre la cmara. Una vez nalizado el tiempo de la electroforesis se debe apagar la fuente, para quitar la tapa. Las laminillas se sacan con las pinzas y se secan por debajo con papel absorbente. Las laminillas se colocan en la charola de lavados y se les agrega solucin de Trisma Base 0.4 M, aproximadamente el volumen completo de una pipeta Pasteur por muestra. Se dejan reposar 5 min y se repite el lavado. Se escurren y se les agrega etanol anhidro, aproximadamente el volumen completo de una pipeta Pasteur por muestra. Se dejan reposar 5 min ms y se repite el lavado con etanol. Finalmente, las laminillas se escurren y son colocadas en el vaso Coplin con etanol anhidro otros 5 min. Se sacan, se limpian por debajo con papel absorbente, se dejan secar y se guardan en una caja portalaminillas.
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Tincin de las clulas Inmediatamente antes de la observacin al microscopio, a la laminilla que se va a leer se le agregan 25 L de la solucin de trabajo de bromuro de etidio y se le coloca un cubreobjetos. Lectura de resultados Se toma una laminilla previamente teida y se coloca en el microscopio. Se enfoca con el objetivo de 20X hasta ver de forma adecuada el campo. Despus se procede a la lectura con la tcnica circular (la lectura se inicia en el centro de la laminilla y se continua la lectura en crculos o zig-zag (se empieza a leer la laminilla desde el extremo superior izquierdo hacia el extremo superior derecho y se continua a partir de este punto con movimientos en zig-zag). En el software Komet v 4.0 se pulsa Experiment y se le asignan 2 ID (muestras), despus se pulsa Live. El programa contabiliza 100 clulas (50 muestra y 50 duplicado). En caso de no contar con el software de anlisis de imgenes, la cuanticacin del dao en las clulas se puede realizar con un ocular graduado, con el cual se deber medir la longitud de la cola (en micras) de 100 clulas.
Clculos
El panel de expertos del taller internacional de procedimientos y pruebas sobre genotoxicidad (IWGTP, sus siglas en ingls) menciona que para reportar los resultados obtenidos mediante el ensayo cometa, es recomendable el uso de dos medidas: el Olive Tail Moment (OTM, denido como el producto de la longitud de la cola y la fraccin de ADN total de la cola. Solo se obtiene en caso de contar con el software Komet 4) y las categoras de dao de acuerdo con la longitud de la cola del cometa (las cuales se usan cuando no se cuenta con el software mencionado) (Kumaravel et al., 2009) (gura 4.1). Si el anlisis se lleva a cabo con el software Komet 4, se obtendr una serie de parmetros (entre ellos el OTM), los cuales con generados de las diversas medidas de dao que se toman de las clulas. En la gura 4.2 se muestra un ejemplo de pantalla del software durante la medicin del dao en las clulas. Una vez nalizada la cuanticacin del dao en las clulas se obtiene una hoja de clculo (gura 4.3)
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FIGURA 4.1. MEDICIN DEL OLIVE TAIL MOMENT (OTM) Y CATEGORIZACIN DEL DAO DE ACUERDO CON LA LONGITUD (EN MICRAs) DE LA COLA: 0 = sIN DAO; 1 = DAO LEVE; 2 = DAO MODERADO; 3 = DAO ALTO; 4 = DAO GRAVE
en donde se tienen los datos de todos los parmetros obtenidos de cada una de las clulas medidas por individuo, adems de algunas medidas estadsticas de tendencia central, dispersin y variabilidad de estos mismos parmetros por individuo.
FIGURA 4.2. EJEMPLO DE PANTALLA DE SOFTWARE KOMET DURANTE LA MEDICIN DE LAs CLULAs
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FIGURA 4.3. EJEMPLO DE HOJA DE CLCULO OBTENIDA DE LA CUANTIFICACIN DEL DAO EN LAs CLULAs
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Como se mencion anteriormente, en caso de no contar con el software de medicin se pueden establecer categoras de dao en las clulas a partir de la longitud de la cola del cometa. Las categoras de dao que se pueden asignar en las clulas de acuerdo con el tamao de la cola del cometa son las siguientes: 1) Clase 0 -sin dao-, dao no visible; 2) Clase 1 -dao leve-, la longitud de la cola es menor que el dimetro del ncleo; 3) Clase 2 -dao moderado-, la longitud de la cola es de 1 a 2 veces el dimetro del ncleo; 4) Clase 3 -dao alto-, la longitud de la cola es de 2 a 3 veces el dimetro del ncleo; y 5) clase 4 dao grave-, la longitud de la cola es ms de 3 veces el dimetro del ncleo (Kobayashi et al., 1995). El puntaje total de las 100 clulas se obtiene por la multiplicacin de la suma del nmero de clulas en cada clase por la clase de dao (0-4), y el rango va de 0 (todas sin dao) a 400 (todas con el mximo dao) (ver ejemplo en la tabla 4.1).
TABLA 4.1. EJEMPLO DE CLCULOs POR CLAsE DE DAO
(n) 2 7 5 8 Clase 0 0 0 0 0 1 25.5 12.4 2.6 3.8 2 63.5 75.6 54.6 46.6 3 11 12.0 42.8 49.6 4 0 0 0 0 Clulas analizadas 200 700 500 800 Scores 185.5 199.6 240.2 245.9
En la tabla 4.2 se presenta un resumen de las condiciones recomendadas para la realizacin del ensayo en linfocitos humanos.
TABLA 4.2. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA EL ENsAYO COMETA EN LINFOCITOs
HUMANOs
Volumen de muestra Volumen de agarosa Tiempo de desenrollamiento Tiempo de electroforesis Luz Temperatura Nmero de rplicas
15 L 225 L 20 min 20 min Desenrollamiento y electroforesis en ausencia de luz Desenrollamiento y electroforesis a 4 C 2
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TABLA 4.2 CONTINA

Nmero de clulas a evaluar Respuesta a medir 100 (50 por laminilla) Olive Tail Moment (OTM) o longitud de la cola del cometa
MOdIFICACIONES rEALIZAdAS EN EL ENSAYO COMETA PArA SU APLICACIN EN FAUNA SILVESTrE
Sapos
Se recomienda el uso de los sapos ya que, por su ciclo de vida, durante su etapa adulta se consideran organismos terrestres. Adems, la distribucin ecolgica de estos organismos coincide con la presencia de muchos sitios impactados por hidrocarburos en las costas del golfo de Mxico. Para la captura de los organismos se propone utilizar trampas de barrera y embudo. Las trampas se pueden elaborar de material plstico como barrera y botes de 20 L como recipientes de colecta. La trampa debe estar conformada por tres vrtices con una extensin de 5 m por vrtice (gura 4.4). La tcnica de captura consiste en colocar las trampas de barrera sobre las orillas de las riberas o de las charcas. La disposicin de la trampa puede hacerse de forma lineal o de forma cruzada, dependiendo del terreno. Deben ser colocadas por la tarde y revisadas en el transcurso de la noche y por la maana. Tambin pueden realizarse trayectos nocturnos en reas de 1 ha y recolectar los organismos con red y a mano. Los organismos pueden irse colocando en cubetas y mantenerse ah hasta la toma de muestras. La muestra de sangre de los sapos (1 a 2 mL) puede obtenerse por puncin cardiaca con jeringas heparinizadas. Posteriormente, la sangre se almacena en tubos Vacutainer con heparina y se mantienen en agitacin hasta que la muestra est completamente homogenizada. Es importante recalcar que no debe utilizarse EDTA como anticoagulante ya que puede lisar los eritrocitos de algunas especies de anbios y reptiles. El ensayo se realiza siguiendo el mismo procedimiento descrito para los linfocitos humanos, a excepcin del volumen de sangre y los tiempos de desenrollamiento y electroforesis. Debido a la densidad de clulas nucleadas (eritrocitos) en la sangre de los anbios, es necesario diluirla. Para ello se toman alcuotas de 10 L
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FIGURA 4.4. TRAMPA DE BARRERA Y EMBUDO: A) EsQUEMAs DONDE sE MUEsTRA LA UBICACIN DE LAs CUBETAs (AL FINAL DE CADA BARRERA sE COLOCA UNA CUBETA ENTERRADA AL RAs DE sUELO); B)
TRAMPAs COLOCADAs EN LOs sITIOs DE MUEsTREO
a)
b)
de la muestra de sangre y se colocan en el fondo de los tubos Eppendorf, despus se agregan 300 L de agarosa de bajo punto de fusin y se homogeniza con el vrtex. De esta mezcla se toman alcuotas de 15 L y se colocan en el fondo de los tubos Eppendorf, despus se agregan 225 L de agarosa de bajo punto de fusin y se homogeniza con el vrtex. A partir de este paso se contina con el procedimiento descrito para los linfocitos. En la electroforesis nicamente se deber modicar el tiempo de desenrollamiento del ADN a 5 min, y el de electroforesis a 10 min. En la tabla 4.3 se presenta un resumen de las condiciones recomendadas para realizar el ensayo en sapos.
Lombrices
Se recomienda el uso de lombrices de tierra para este ensayo ya que, al ser componentes importantes del edafn (fauna del suelo), tienen un papel primordial en los ciclos biogeoqumicos, en la aireacin y en la adicin de nutrientes al suelo. Adems, son organismos que viven en contacto directo con el suelo, que es una de las matrices ambientales importantes cuando se realiza una evaluacin
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TABLA 4.3. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA EL ENsAYO COMETA EN ERITROCITOs
DE sAPO
Volumen de muestra Volumen de agarosa Tiempo de desenrollamiento Tiempo de electroforesis Luz Temperatura Nmero de rplicas Nmero de clulas a evaluar Respuesta a medir
10 L (1a dilucin) 15 L (2a dilucin) 300 L (1a dilucin) 225 L (2a dilucin) 5 min 10 min Desenrollamiento y electroforesis en ausencia de luz Desenrollamiento y electroforesis a 4 C 2 100 (50 por laminilla) Olive Tail Moment (OTM) o longitud de la cola del cometa
de riesgo. Los resultados de varios estudios ecotoxicolgicos muestran su utilidad como organismos bioindicadores de la salud del suelo (Ogunseitan, 2002; Espinosa-Reyes et al., 2010). La captura de las lombrices es manual; para ello se delimita un rea determinada en el sitio de estudio y posteriormente se trazan al azar varios transectos de aproximadamente 50 m (la distancia puede variar dependiendo del sitio donde se realice la colecta de los organismos). Con una pala de jardinera, se excava el suelo para poder recolectar lombrices. Con la nalidad de estresar lo menos posible a los organismos, se debe extraer un terrn completo (de aproximadamente 2 kg de suelo). Posteriormente se coloca en una bandeja y se transporta al laboratorio. En las lombrices, las clulas con las que se realiza el ensayo cometa se denominan celomocitos. Estos desempean en los invertebrados muchas de las funciones de las clulas sanguneas de los vertebrados, tales como la defensa y la fagocitosis. En las lombrices de tierra se obtiene una mezcla de celomocitos con medio de cultivo RPMI. Se utilizan 30 L de esa mezcla (procedimiento descrito ms adelante) y se sigue el mismo mtodo de desenrollamiento y electroforesis que se describi para linfocitos, pero se modica el tiempo de desenrollamiento del ADN a 5 min y el de electroforesis a 5 min.
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Material y equipo
Para las pruebas con lombrices, adems del material y equipo mencionados para los ensayos en linfocitos, se requiere de agujas de insulina.
Reactivos
Para las pruebas con lombrices, adems de los reactivos mencionados para los ensayos en linfocitos (ver seccin 4.3.3), se requiere medio de cultivo comercial Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640).
Procedimiento
Obtencin de uido celmico
Se colocan 150 L de medio RPMI 1640 en un tubo Eppendorf de 2 mL. Dentro de este medio se coloca una lombriz previamente enjuagada en agua corriente. La lombriz se mantiene dentro del tubo durante 2 min, y en este lapso se le estimula dndole dos punciones con una aguja de insulina hasta que libere el uido celmico (gura 4.5).
FIGURA 4.5. PROCEsO DE OBTENCIN DEL FLUIDO CELMICO: A) CAPTURA; B) LOMBRIZ EN EL TUBO EPPENDORF; C) PUNCIN CON AGUJA DE INsULINA
COLOCACIN DE LA
No deben hacerse ms de dos punciones para no estresar al organismo. La mezcla del medio RPMI y el uido celmico se homogeniza en un vrtex durante 5 s. De esta mezcla se obtienen 30 L, se colocan en un tubo Eppendorf y se les
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agregan 200 L de agarosa de bajo punto de fusin. Se homogeniza en el vrtex durante otros 5 s. Finalmente se obtienen 75 L de esta mezcla y se colocan en una laminilla. En la tabla 4.4 se presenta un resumen de las condiciones que se recomiendan para la realizacin del ensayo cometa en lombrices.
TABLA 4.4. REsUMEN DE LAs CONDICIONEs RECOMENDADAs PARA EL ENsAYO COMETA EN CELOMOCITOs
DE LOMBRIZ DE TIERRA
Volumen de muestra Volumen de agarosa Tiempo de desenrollamiento Tiempo de electroforesis Luz Temperatura Nmero de rplicas Nmero de clulas a evaluar Respuesta a medir
30 L 200 L (1 dilucin) 5 min 5 min Desenrollamiento y electroforesis en ausencia de luz Desenrollamiento y electroforesis a 4 C 2 100 (50 por laminilla) Olive Tail Moment (OTM) o longitud de la cola de cometa
Control de calidad
Para el adecuado desarrollo y la obtencin de resultados conables con estos ensayos, es necesario atender los siguientes aspectos: Las soluciones de agarosa deben manejarse con cuidado para asegurar una adecuada migracin de las clulas durante la electroforesis. Hay que cuidar que no hierva durante su preparacin; si esto sucede, se debe desechar. Se debe cuidar que en las soluciones se disuelva por completo y que no deje residuos en suspensin; esto se reconoce por su tonalidad completamente transparente. Si esto no sucede, es necesario se prepararla de nuevo. Si la agarosa se solidica antes de preparar las laminillas o las clulas, la solucin debe prepararse de nuevo. Para obtener una capa uniforme de agarosa, hay que tener cuidado de no pasar muchas veces el dedo sobre la laminilla, pues esto podra causar migracin irregular de las clulas. Durante el manejo del bromuro de etidio debe evitarse el contacto debido a sus propiedades genotxicas. Es necesario manejarse en todo momento con guantes de nitrilo y evitarse el contacto directo con la piel.
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Durante la preparacin de las soluciones se recomienda utilizar agitacin y agregar los reactivos en un orden especco; esto no debe alterarse, para garantizar la adecuada disolucin de todos los componentes. Se recomienda colocar papel encerado en los tapones de los frascos mbar donde se almacenen las soluciones, para evitar que se peguen. Las muestras de sangre humana tienen una viabilidad para su uso en el ensayo, y por ello deben evaluarse antes de 3 h. Durante la preparacin de las clulas es necesario tener cuidado de no formar burbujas al mezclar la sangre con la agarosa en la laminilla, de no tocar la cama de agarosa en la laminilla con la punta de la pipeta, y de colocar espalda con espalda las laminillas en el vaso Coplin. Con ello se puede evitar que las muestras se daen y que se presente migracin irregular de las clulas durante la electroforesis. Durante la colocacin de las laminillas en la cmara de electroforesis, deben enjugarse las pinzas cada vez que se desee tomar una nueva laminilla. Dentro de la cmara, se debe jar la parte posterior de las laminillas y colocar en la direccin correcta con respecto al ujo elctrico para evitar que se pierdan las muestras. REFErENCIAS
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5 Requerimientos de control de calidad en bioensayos

Mara del Carmen Cuevas Daz, Guadalupe Pinette Medina, ngel Mario Lpez Hidalgo, Jess Samuel Cruz Snchez, Mara de Lourdes Nieto Pea
Es de primordial importancia considerar que en la realizacin de pruebas biolgicas se requiere del control de los aspectos que garantizan la conabilidad de los resultados. La garanta de la credibilidad de los resultados implica que el laboratorio mantenga estndares de calidad, los cuales se establecen en la Norma Mexicana NMX-EC-17025-IMNC-2006 (DOF, 2006) Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibracin. Dicha norma considera los siguientes aspectos: organizacin y administracin del laboratorio, sistema de calidad y auditora, personal, distribucin y medioambiente, instrumentos y equipos de medicin, trazabilidad en las mediciones y mtodos de medicin y prueba. A continuacin se describen dichos aspectos agrupados en tres rubros generales: aspectos del laboratorio, aspectos relativos a los organismos de prueba y aspectos del desarrollo de los bioensayos. ASPECTOS rELACIONAdOS CON EL FUNCIONAMIENTO dEL LABOrATOrIO Dentro de los parmetros normativos que deben cumplir los laboratorios de ensayo y calibracin, es necesario considerar antes que nada su capacidad para implementar los mtodos requeridos, de acuerdo con la capacidad de su personal y el equipo con el que cuentan. El laboratorio debe garantizar el control adecuado de los ensayos, desde su inicio con la colecta o recepcin de las muestras hasta la entrega nal
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del reporte. Para ello debe demostrar que mantiene y actualiza regularmente sus equipos, que su personal es conable, que cuenta con una adecuada formacin y capacitacin, que conoce las tcnicas requeridas y que realiza revisiones peridicas para detectar posibles desviaciones en los procedimientos.
Organizacin del laboratorio

Especcamente, en lo que corresponde a la organizacin y funcionamiento del laboratorio, el primer punto a considerar es que todo el personal debe conocer y respetar el organigrama del laboratorio, en el cual se deben establecer con claridad las funciones y las responsabilidades de todos y cada uno de los integrantes.
Control de documentos
Debe establecerse un control de documentos que garantice el seguimiento adecuado de cualquier trmite a realizar. En estos documentos debe incluirse uno que constate, antes de la realizacin de cada prueba, la competencia tcnica y humana del laboratorio para realizarla; en este es necesario indicar el tipo de prueba que se realizar, si el ensayo ha sido implementado en el laboratorio previamente o no, las necesidades materiales, tcnicas y de personal capacitado para realizarlo, y la aceptacin o cancelacin de su realizacin de acuerdo con el anlisis efectuado.
Cadena de custodia
Como se recomienda en el caso de las evaluaciones de sitios contaminados (DazBaez et al., 2004), la validacin de las tcnicas de anlisis de muestras requiere que durante el muestreo se documente toda la secuencia de personas que hayan estado en posesin de la totalidad o parte de la muestras. Es necesario establecer una cadena de custodia, la cual debe constar en los registros internos del laboratorio y debe contener al menos los siguientes datos: tamao de la muestra, lugar de colecta, anlisis efectuado y nombre del analista.
Evaluacin del desempeo del personal

De manera verdica y de acuerdo con el periodo que determine el responsable del laboratorio (tomando en cuenta el nmero de ensayos que se realizan y la solicitud
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de los clientes), debe llevarse a cabo una evaluacin del desempeo del personal con base en la trazabilidad y la incertidumbre de las pruebas que realizan. De acuerdo con la poltica de la Entidad Mexicana de Acreditacin (EMA, 2011), el clculo de la incertidumbre constituye una parte indisoluble de los resultados de las mediciones; es un elemento indispensable de la trazabilidad de las mismas. Sin embargo, dicho clculo no puede sustituir al pensamiento crtico, la honestidad intelectual y la habilidad profesional. La evaluacin de la incertidumbre no es una tarea de rutina, ni puramente matemtica; depende del conocimiento detallado de la naturaleza de los mensurandos y de las mediciones. Por lo tanto, la calidad y la utilidad de la incertidumbre indicada en los resultados de una medicin dependen, en ltima instancia, del entendimiento, el anlisis crtico y la integridad de aquellos que contribuyen a la asignacin de ese valor; es decir, de la capacidad y preparacin del personal. ASPECTOS rELACIONAdOS CON LOS OrGANISMOS dE PrUEBA Para controlar las variables que afectan a los organismos de prueba es muy importante tomar en cuenta los procedimientos establecidos para su cultivo y mantenimiento, y seguir estrictamente las indicaciones marcadas en ellos, con especial nfasis en los siguientes puntos:
Condiciones ambientales
Debe darse un seguimiento adecuado de las condiciones en las que se cultivan o mantienen los organismos y en las que se realizan los ensayos. As, el organismo seleccionado debe someterse a una etapa de observacin con la nalidad de garantizar que no ha sido daado durante el transporte ni por el cambio de condiciones ambientales. Cualquier cambio en estas puede producir resultados equvocos. En el caso de las pruebas de actividad enzimtica, por ejemplo, debe controlarse la temperatura, el pH y el contenido de humedad del suelo de acuerdo con los requerimientos especcos para asegurar la actividad ptima de cada enzima (Moss, 1969).
Estado de salud de los organismos

Los organismos seleccionados para las pruebas deben ser observados con cuidado para determinar su condicin de salud. Si durante el tiempo de observacin se
R EQUERiMiENTOS
DE CONTROL DE CALiDAD EN BiOENSAYOS
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registran signos de dao o una mortandad mayor al 1 %, se considera que dicho lote de organismos no es adecuado y no debe ser usado en los ensayos (Serrano, 2010). De manera similar, durante las pruebas los organismos del control negativo deben mostrar una mortalidad mnima (< 1 %) o nula, de lo contrario los resultados de esas pruebas deben ser desechados. En el caso de pruebas crnicas y durante el mantenimiento de los organismos, se debe comprobar la calidad nutricional y la ausencia de contaminantes en el alimento que se les proporciona.
Carta control
Para cada especie de organismos se debe contar con una carta control de la prueba, en donde se lleve un registro histrico de su sensibilidad, de la estabilidad de su respuesta y de la repetibilidad de sus resultados. Las pruebas que muestren resultados fuera de los lmites superior o inferior de esta carta control deben ser descartados. ASPECTOS rELACIONAdOS CON EL dESArrOLLO dE LOS ENSAYOS
Condiciones generales
La condicin ideal es que los ensayos que se realicen sean pruebas estandarizadas, es decir, que sus resultados demuestren estadsticamente que existe una relacin directa entre la concentracin del compuesto txico al que se exponen y la respuesta biolgica de los organismos. Esto implica que el ensayo se realiza mediante un mtodo normalizado o, en el caso en que el procedimiento empleado por el laboratorio no cuente con esta caracterstica, se requiere su validacin mediante el clculo de los parmetros estadsticos clsicos de toda prueba experimental, como la media y la desviacin estndar, adems del coeciente de variacin. Se deben considerar adems las cartas control que nos permiten tener presentes los rangos de validez de las mediciones, tomando en cuenta el intervalo de conanza del 95 % recomendado por los estadsticos. De acuerdo con Daz-Baez et al. (2004), esta carta control es el medio de referencia para evidenciar el control de la sensibilidad de la especie empleada a un compuesto txico de referencia, de la estabilidad de la respuesta biolgica y de la repetibilidad (exactitud) de los resultados. Se recomienda que estas mediciones se realicen con un mnimo de 5 lecturas y se vayan incorporando datos hasta llegar a 20.
130
Colecta y preservacin de muestras

Si se llevan a cabo, los protocolos de muestreo y manipulacin o preservacin de las muestras deben ser incluidos como parte de procedimientos estandarizados. Cualquier alteracin de las muestras debido a su transporte, almacenamiento, tamizado, mezcla o toma de submuestras puede afectar los resultados de los ensayos (USEPA, 2009). Por ello, deben seguirse estrictamente todos los pasos e indicaciones descritos en dichos procedimientos, adems del ya indicado para llenar el registro correspondiente a la cadena de custodia. MANTENIMIENTO, CALIBrACIN Y EVALUACIN dEL FUNCIONAMIENTO dE LOS EQUIPOS Todos los equipos deben recibir mantenimiento preventivo de manera regular y, en caso necesario, mantenimiento correctivo. Dicho mantenimiento debe ser efectuado por empresas competentes para brindar este servicio. El funcionamiento cotidiano de todos los equipos debe evaluarse peridicamente mediante tcnicas de trazabilidad y clculo de incertidumbre. Antes de realizar cualquier medicin, los equipos, sin excepcin, deben ser calibrados de acuerdo con sus requerimientos especcos. Para esta calibracin deben emplearse materiales y reactivos certicados.
Condiciones y limpieza del material

Ningn material que se use para el cultivo o el mantenimiento de los organismos o para la realizacin de las pruebas debe afectar su desarrollo. La cristalera empleada para las mediciones volumtricas debe ser de vidrio de borosilicato resistente al calor. Los recipientes plsticos que se usan son generalmente de polmeros como PVC, polipropileno o poliestireno. Estos se seleccionan segn el uso que se les vaya a dar y las condiciones a las cuales se les vaya a exponer. De acuerdo con ello, se toma en cuenta que pueden ser afectados por el calor, por compuestos corrosivos o por disolventes orgnicos. Para el caso de las pipetas y las buretas, estas no debern estar rotas de la punta. Adems, las llaves de las buretas deben cerrar fcil y hermticamente, y no deben formar gota en la punta despus de un periodo de 60 s.
R EQUERiMiENTOS
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Todo el material, pero en especial la cristalera, debe sujetarse a un procedimiento de limpieza que garantice la ausencia de contaminacin. Para el caso del material de vidrio se recomienda seguir el siguiente procedimiento: Si el material se expone a compuestos txicos orgnicos, dos das antes de la prueba se lava el material con detergente no inico adecuado para muestras biolgicas, se enjuaga con abundante agua, y se deja en solucin de mezcla crmica (mezcla de 100 g de dicromato de potasio en un litro de cido sulfrico tcnico diluido en una proporcin 1:4) cuando menos una hora (la mezcla crmica puede ser sustituida por algn producto sin cromo, como el Sulfoclean o tambin se puede emplear cido muritico comercial). Posteriormente se enjuaga con agua destilada o desionizada, se escurre y se seca en la estufa a 110 C. Si la forma del material diculta su secado espontneo, como en el caso de las pipetas, se le adiciona acetona, la cual es eliminada mediante el secado en la estufa. Si el material se expone a compuestos inorgnicos, se sumerge en cido muritico comercial (contiene del 30 al 32 % de cloruro de hidrgeno) cuando menos una hora, se enjuaga con agua destilada o desionizada y se seca en la estufa a 110 C. Una vez que el material ha sido lavado, debe protegerse del polvo, ya sea tapndolo con papel aluminio o guardndolo en estantes adecuados.
Reactivos
Salvo que otra cosa se especique, todos los reactivos que se emplean deben ser grado analtico ACS. Asimismo, los compuestos txicos de referencia que se usen para evaluar la sensibilidad de los organismos de prueba o como controles positivos en los ensayos deben ser certicados, presentar una pureza del 99 % y ser solubles en agua. Estos ltimos deben usarse exclusivamente para los bioensayos. En cuanto a las concentraciones de los compuestos txicos de referencia, se debe emplear un intervalo adecuado para evaluar la respuesta de los organismos. El agua con la que se preparen las soluciones y diluciones, con la que se enjuague todo el material y con la que se mantengan o cultiven los organismos de prueba debe ser de alta calidad, como el agua tipo I, en donde los compuestos o elementos no son detectables prcticamente; as por ejemplo, la concentracin de carbono orgnico total es menor de 100 gl-1, el contenido de bacterias menor de 10 UFC/mL, la conductividad elctrica de 0.056 Scm-1 y el contenido de slice menor de 3 gl-1 (ASTM, 1991).
132
Soluciones
Debe garantizarse que las soluciones se encuentren correctamente preparadas e indicar en su etiqueta el nombre de la solucin, su concentracin, fecha de preparacin y vencimiento, y nombre del laboratorista. Para el caso de soluciones para volumetra, como por ejemplo cidos o bases, se debern valorar cuando sean utilizadas para corroborar su normalidad o molaridad. Las soluciones deben almacenarse en recipientes de vidrio o plstico segn el tipo de producto. Por ejemplo, se recomienda colocar las soluciones de hidrxido de sodio (NaOH) en recipiente de plstico, para evitar efectos sobre el vidrio, o almacenar las soluciones sensibles a la luz en frascos mbar. Tambin se deben preservar en condiciones que impidan su degradacin, ya sea en refrigeracin, ausencia de luz, etc. Para la preparacin exacta de una solucin deben utilizarse pipetas y matraces volumtricos. Cuando sea posible, se pueden preparar soluciones madre o stock, que posteriormente se diluyen en la proporcin adecuada para obtener las soluciones de trabajo (Harvey, 2002). Para el caso de los compuestos txicos de referencia, sus soluciones patrn deben ser valoradas con reactivos certicados antes de la realizacin de los ensayos (Daz-Baez et al., 2004). RPLICAS Y CONTrOLES En todos los ensayos debe garantizarse, como mnimo, la preparacin por triplicado de todos los tratamientos. Esto permite obtener un adecuado nmero de datos para el manejo estadstico de los resultados y para el clculo de los parmetros de toxicidad, como la CL50 o la CE50. En cuanto al nmero de individuos por tratamiento, ste depende de las caractersticas del organismo en estudio; sin embargo, debe seleccionarse considerando el nivel de signicancia y el tipo de anlisis estadstico que se aplicarn. En cada prueba se debe incluir un control positivo, a una concentracin cercana a la CE50 o la CL50, y un control negativo, para conocer el porcentaje del efecto mximo. En caso necesario, se debe incluir adems un control del vehculo empleado para disolver el contaminantes de inters. Tambin se debe incluir un blanco de procedimiento, cuya respuesta de toxicidad no debe ser mayor al 10 %.
R EQUERiMiENTOS
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Suelo usado como control negativo

En las pruebas que se realizan directamente en suelo, un factor importante que puede ocasionar errores es la seleccin del suelo que se usa como control negativo, tambin conocido como suelo de referencia. Con frecuencia es difcil conseguir un suelo igual al suelo problema y que pueda usarse como referencia. Para ello se recomienda buscar uno que presente caractersticas sicoqumicas lo ms similar posible al suelo problema. Por lo tanto, debe llevarse a cabo una caracterizacin general de las propiedades tanto del suelo problema como del que se vaya a usar como control negativo. De manera similar al control negativo, el uso de suelo articial contaminado como control positivo puede producir resultados distintos con respecto al suelo problema debido a las diferencias en su composicin y en la interaccin de los contaminante con sus componentes (Eijsackers, 1997). La adicin de arcilla al suelo puede cambiar sus propiedades y hacerlo ms o menos incompatible con el crecimiento o el desarrollo de los organismos de prueba, por lo que la composicin del suelo debe seleccionarse en funcin del bioensayo que se vaya a realizar (ISO, 2003).
Determinacin de la respuesta
En la mayora de la pruebas la respuesta que se mide es la mortalidad o ciertos efectos subletales. La muerte de los organismos es fcil de reconocer en casi todas las especies; sin embargo, en ocasiones la observacin a simple vista no es suciente, por lo que se debe recurrir a estmulos mecnicos para determinar esta respuesta. En lo que respecta a los efectos subletales, se debe tener en cuenta el comportamiento de los organismos, como por ejemplo la velocidad y la frecuencia de desplazamiento, la respuesta a estmulos mecnicos, o cualquier otra caracterstica propia de la especie en estudio (Serrano, 2010). Es importante mencionar que todos los aspectos anteriormente descritos se encuentran relacionados y, por ello, debe darse un seguimiento puntual de todos, de manera que se controle integralmente el desarrollo de las pruebas y se garantice la obtencin de resultados conables.
134
REFErENCIAS
American Society for Testing and Materials (ASTM). 1991. Estndares de calidad de agua. Wasserlab. D1193-91. http://www.wasserlab.es/castellano/PDF/estandares_calidad_agua.pdf. Consultado en agosto de 2011. Daz-Baez, .M.C., Sobrero, C., Pica Granados, Y. 2004. Aseguramiento y control de calidad de bioensayos. En: Castillo, G. (editora). Ensayos Toxicolgicos y Mtodos de Evaluacin de Calidad de Aguas. Estandarizacin, Intercalibracin, Resultados y Aplicaciones. Centro Internacional de Investigaciones para el Desarrollo, Instituto Mexicano de Tecnologa del Agua. Mxico. Eijsackers, H. 1997. Soil ecotoxicology: Still new ways to explore or just paving the road. En: Van Straalen, N.M., Lokke, H. (editores). Ecological Risk Assessment of Contaminants in Soil. Chapman and Hall. Londres. Inglaterra. Entidad Mexicana de Acreditacin (EMA). 2011. Poltica de Incertidumbre en mediciones. http://www.ema.org.mx/descargas/ensayos_aptitud/politicas/politica_intertidumbre_mediciones.pdf. Consultado en febrero de 2011. Harvey, D. 2002. Qumica Analtica Moderna. Mc Graw Hill. Espaa. International Organization for Standardizations (ISO). 2003. Soil Quality. Guidance on the ecotoxicological characterization of soils and soil materials. ISO 15799:2003. Suiza. Moss, A. D. 1969. Accuracy, precision and quality control of enzyme assays. Journal of Clinical Pathology. 24, 22-30. Diario Ocial de la Federacin (DOF). 2006. Norma Mexicana NMX-EC-17025IMNC-2006, evaluacin de la conformidad. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibracin. Publicado el 24 de julio. Serrano, G.R. 2010. Introduccin al anlisis de datos experimentales. Tratamiento de datos en bioensayos. Universitat Jaume I. Espaa. United States Environmental Protection Agency (USEPA). 2009. Soil Toxicity and Bioassessment. Test Method for Ecological Risk Assessment. Ofce of Environmental Health Hazard Assessment. EUA.
R EQUERiMiENTOS
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Mtodos ecotoxicolgicos para la evaluacin de suelos contaminados con hidrocarburos, editado por Mara del Carmen Cuevas Daz, Guillermo Espinosa Reyes, Csar Arturo Ilizaliturri Hernndez y Ania Mendoza Cant se termin de imprimir y encuadernar en los talleres de Impresora y Encuadernadora Progreso, S.A. de C.V. (iepsa), Calzada de San Lorenzo 244, 09830, Mxico, D.F. durante el mes de marzo de 2012 Se tiraron 400 ejemplares

Métodos Ecotoxicológicos para La Evaluación de Suelos Contaminados Con Hidrocarburos

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Mtodos ecotoxicolgicos para la evaluacin de suelos contaminados con hidrocarburos

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN

Primera edicin: 2012

D.R. Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales

ISBN 978-607-7908-62-3 Impreso y hecho en Mxico Printed in Mexico

1 TCNICAs PARA EL ANLIsIs DE ACTIVIDAD ENZIMTICA EN sUELOs

2 EVALUACIN DE LA TOXICIDAD DE LOs sUELOs MEDIANTE BIOENsAYOs CON LOMBRICEs

4 ENsAYO COMETA EN FAUNA TERREsTRE

5 REQUERIMIENTOs DE CONTROL DE CALIDAD EN BIOENsAYOs

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs

1 Tcnicas para el anlisis de actividad enzimtica en suelos

Fundamento del mtodo

carbono y amonio, como se describe en la siguiente reaccin (Quintero-Lizaola et al., 2005):

Es necesario esterilizar el material en autoclave.

PARA EL ANLiSiS DE ACTiViDAD ENZiMTiCA EN SUELOS

PARA EL ANLiSiS DE ACTiViDAD ENZiMTiCA EN SUELOS

(50)(6.0 - 5.7) x 70 5 x 0.7

Duracin de la prueba Temperatura de incubacin 26

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs

CUADRO 1.1. CONTINA

DETErMINACIN dE LA ACTIVIdAd ENZIMTICA dE LA LIPASA

Fundamento del mtodo

Es necesario esterilizar el material en autoclave.

p-nitrofenol (p-NP) de 98 % de pureza 2-propanol de 99.7 % de pureza

PARA EL ANLiSiS DE ACTiViDAD ENZiMTiCA EN SUELOS

Donde AL = actividad de la lipasa, en

10 g 30 C 10 min 7.2 a 7.3 3 o ms Sin adicin de suelo Vidrio

DETErMINACIN dE LA ACTIVIdAd ENZIMTICA dE LA dESHIdrOGENASA

Fundamento del mtodo

PARA EL ANLiSiS DE ACTiViDAD ENZiMTiCA EN SUELOS

PARA EL ANLiSiS DE ACTiViDAD ENZiMTiCA EN SUELOS

Donde: AD = actividad de la lipasa, en

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs

20 g Difusa u oscuridad 37 C 24 h 3 o ms 5 mL de TRIS, sin adicin de TTC Espectrofotomtrica 485 nm Vidrio

PARA EL ANLiSiS DE ACTiViDAD ENZiMTiCA EN SUELOS

DETErMINACIN dE LA ACTIVIdAd ENZIMTICA dE LA CATALASA

Fundamento del mtodo

PARA EL ANLiSiS DE ACTiViDAD ENZiMTiCA EN SUELOS

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs

CONSIdErACIONES GENErALES PArA EL CONTrOL dE CALIdAd EN LOS MTOdOS ENZIMTICOS

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs

2 Evaluacin de la toxicidad de los suelos mediante bioensayos con lombrices

Fundamento del mtodo

DE LA TOXiCiDAD DE LOS SUELOS MEDiANTE BiOENSAYOS CON LOMBRiCES

FIGURA 2.1. MDULO DE LOMBRICOMPOsTA DE LA FACULTAD AGROPECUARIOs (FISPA) DE LA UNIVERsIDAD VERACRUZANA

DE LA TOXiCiDAD DE LOS SUELOS MEDiANTE BiOENSAYOS CON LOMBRiCES

Humedad del suelo

Humedad requerida en el suelo experimental

Preparacin del control positivo

DE LA TOXiCiDAD DE LOS SUELOS MEDiANTE BiOENSAYOS CON LOMBRiCES

FIGURA 2.4. RECIPIENTEs DE PRUEBA CUBIERTOs CON ORGANZA

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs

14 das 22 2 C 45 % 6.5-7 Recipientes de vidrio 200 a 400 g 50 a 100 g 59

DE LA TOXiCiDAD DE LOS SUELOS MEDiANTE BiOENSAYOS CON LOMBRiCES

TABLA 2.1 CONTINA

PrUEBA dE EVASIN O MIGrACIN dE LOMBrICES

Fundamento del mtodo

MTODOs ECOTOXICOLGICOs PARA LA EVALUACIN DE sUELOs CONTAMINADOs CON HIDROCARBUROs

6 arcos en cada pared de 0.5 x 1 cm

DE LA TOXiCiDAD DE LOS SUELOS MEDiANTE BiOENSAYOS CON LOMBRiCES