Validacin Mtodos Analticos

Cuantitativos, Cualitativos y
Semicuantitativos.
Rigoberto Marcelo Yez Vera
Diciembre 2011
Norma NCh2547.Of 2003
5.5 Procedimientos Analticos.
5.5.2 El laboratorio debe usar slo
procedimientos validados.
VALIDAR VERIFICAR
Validacin
Confirmacin mediante el examen
y la obtencin de evidencias
objetivas que aseguran el
cumplimiento de una serie de
requerimientos particularmente
definidos para aplicaciones
concretas

(ISO 8402-1994 o NCh2000 ISO 8402).

VALIDACIN DE MTODOS
CUANTITATIVOS
Parmetros de calidad (desempeo analtico):
- LINEALIDAD
- EXACTITUD:
-PRECISIN: *Repetibilidad
*Reproducibilidad
-VERACIDAD, Trazabilidad
- INCERTIDUMBRE
-SELECTIVIDAD/ESPECIFICIDAD/INTERFERENCIAS
- SENSIBILIDAD
- LMITE DE DETECCIN
- LMITE CUANTIFICACIN
- ROBUSTEZ

Concentracin
R
e
s
p
u
e
s
t
a

d
e
l

i
n
s
t
r
u
m
e
n
t
o

Intervalo
lineal
LL
LC
LD
LL = L. de linealidad
LC = L. de Cuantificacin
LD = L. de Deteccin
ANLISIS CUANTITATIVO
-LINEALIDAD
Capacidad del mtodo analtico de obtener
resultados linealmente proporcionales entre la
concentracin del analito y su respuesta.
Anlisis estadstico:
*Curva regresin y = a + b x
*Coeficiente de determinacin r
2

*Anlisis de varianza (regresin) con
Estimacin falta de ajuste
Error residual puro.
ANLISIS CUANTITATIVO
Si p>0,05 es
significativo y por
ende los datos
tienden a ser lineales.
1 Seleccin del modelo: Normalmente una lnea recta
y = a + b x

2 Establecimiento del diseo experimental:
dominio experimental: rango de concentraciones
distribucin de las medidas
nmero de medidas.

3 Estimacin de los parmetros del modelo. Regresin
por mnimos cuadrados.

4 Validacin del modelo: ANOVA.

ETAPAS DE LA REGRESIN
Linealidad: Curva de Calibracin IgG
INMUNONEFELOMETRA
X log(X) Y log(Y) Y log(Y)
11,675 1,067 1263 3,101 948 2,977
5,8375 0,766 935 2,971 672 2,827
2,9188 0,465 665 2,823 408 2,611
1,4594 0,164 408 2,611 215 2,332
0,7297 -0,137 207 2,316 103 2,013
0,3648 -0,438 120 2,079 35 1,544
Concentracin (mg/dL) Medicin 1 Medicin 2
Medicin instrumental (seal): intensidad de la luz dispersada
por los complejos antgenos-anticuerpos.
CONCENTRACION mg/dL
L
E
C
T
U
R
A

0 2 4 6 8 10 12
0
200
400
600
800
1000
1200
CURVA CALIBRACION IgG
log conc.
l
o
g

l
e
c
t
u
r
a

INMUNONEFELOMETRA
-0.5 -0.1 0.3 0.7 1.1
2
2.2
2.4
2.6
2.8
3
3.2
3.4
CURVA CALIBRACIN IgG
Exactitud
Grado de concordancia entre el resultado
de una medicin y el valor de referencia
aceptado o verdadero

Nota: El trmino exactitud cuando se aplica a
un conjunto de resultados de mediciones implica la
combinacin de los componentes aleatorios y de un
error sistemtico comn o de un componente de sesgo
(Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)



Exactitud
(Norma ISO 3534-1)
-Precisin: grado de concordancia entre
resultados de mediciones obtenidas
independientes bajo condiciones establecidas.
-Veracidad: grado de concordancia entre el valor
medio obtenido a partir de una serie de
resultados y un valor de referencia aceptado.

Exactitud = Precisin + Veracidad
Precisin
La precisin depende slo de la distribucin de errores
aleatorios y no tiene ninguna relacin con el valor
verdadero o el valor especificado.
-Repetibilidad
-Precisin intermedia o reproducibilidad
intralaboratorio
-Reproducibilidad

(Norma ISO 5725-1 e ISO 3534-1)


REPETIBILIDAD:
Es la medida de la precisin de un mtodo
efectuado en las mismas condiciones, sobre el
mismo analito, con el mismo mtodo,con el
mismo operador, utilizando el mismo instrumento
de medida y durante un corto intervalo de tiempo.
PRECISIN:
Grado de concordancia entre resultados de mediciones
obtenidas de una serie repetida de anlisis, sobre una
muestra homognea, bajo condiciones establecidas
(Norma ISO 3534).
ANLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIN
Media
Desviacin estndar
Coeficiente de variacin
Anlisis de varianza F (comparacin de la
desviacin estndar)

Estudio homogeneidad muestra:
Anlisis de varianza (F)
Prueba de tde Student.
ANLISIS ESTADSTICO DE LA PRECISIN
REPETIBILIDAD INMUNONEFELOMETRA PARA LA
DETERMINACIN IgG.
Homogeneidad muestra
Muestra Contramuestra
n 6 6
Media 1557.50 1554.67
s 52.129 82.199
CV 3.347 % 5.287 %

t calculado = 0.0713 < t tabla
5;0.025
= 2.571
REPRODUCIBILIDAD:
Es la medida de la precisin de los resultados de
un mtodo analtico efectuado sobre el mismo
analito, pero en condiciones diferentes (diferentes
equipos utilizados, el operador, el perodo de tiempo,
etc.)
ANLISIS CUANTITATIVO VALIDACIN
PRECISIN
REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRA
PARA DETERMINACIN DE IgG
IgG mg/dL

DA 1 DA 2 DA 3

1556 1568 1564
1568 1543 1606
1624 1556 1585
1481 1598 1556
1598 1602 1535
1518 1413 1568

REPRODUCIBILIDAD INMUNONEFELOMETRA
PARA DETERMINACIN DE IgG
n 18 (en tres das diferentes)
media 1557.72
DE 12.27
CV 0.8 %
Precisin 99.2 %
Anlisis de Varianza
--------------------------------------------------------------------------------------
Fuente var. SC gl CM F P
--------------------------------------------------------------------------------------
Entre grupos 1496,78 2 748,389 0,28 0,7626
Intra grupos 40682,8 15 2712,19
--------------------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 42179,6 17
VERACIDAD:
Grado de concordancia entre el valor medio
obtenido de una serie de resultados y el valor de
referencia aceptado (certificado). Norma ISO 3534

Anlisis estadstico
Media experimental
Desviacin estndar experimental
Prueba de t de Student

ANLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIN
VERACIDAD INMUNONEFELOMETRA
PARA DETERMINACIN DE IgG
MRC DB Lote 084705 931,8
IgG mg/dL 942,3
n = 10 951.8
924,8
918,6
927.1
920,5
938,4
935,2
918,8

Media experimental 930.9
Media certificada 925.0
Valor exp. MRC
media 930,9 925
s (DE) 11,0545

t calculado = 1,6963 <t (tabla)
9;0.025
= 2,262
p = 0,124
( )
s
n

t
/2 1, - n

=
VERACIDAD INMUNONEFELOMETRA
PARA DETERMINACIN DE IgG
Se acepta la hiptesis de nulidad Ho. Existe trazabilidad
Incertidumbre
Magnitud asociada con el resultado de
medicin que caracteriza la dispersin de los
valores que razonablemente podran ser
asignados al mesurando


Incertidumbre
-Incertidumbre estndar:
Incertidumbre de un resultado de medicin
expresada como desviacin estndar.
-Incertidumbre estndar combinada:
Incertidumbre estndar como resultado de una
estimacin mediante la propagacin de errores con
base en las incertidumbres individuales.
-Incertidumbre expandida
Incertidumbre estndar que se expresa como un
intervalo de confianza.


gl = n - 1 (grado libertad)
nivel o = 0,05
CLCULO DE INCERTIDUMBRE
EXPANDIDA
U
MRC IgG exp.
= 7,9 mg/dL



( )
n
s
t U 1 - n /2;
x
=
SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD

Capacidad del mtodo analtico para medir en
forma exacta un analito particular dentro de
una mezcla compleja, sin interferencia de otras
sustancias o analitos.
ANLISIS CUANTITATIVO
VALIDACIN
Magnitud influyente, magnitud que no es el mesurando pero afecta al
resultado de la medicin (interferencia).
Interferencia de la seal
Algunos compuestos presentes en la muestra
por un artefacto aumentan o disminuyen la
magnitud del mecanismo de deteccin.
Ejemplos:
Fluorescena, EDTA , Azida de Sodio, Lpidos,
Complemento, Fibringeno, Albmina
Deteccin y control de interferencias
Son difciles de detectar pues se desconoce el resultado
verdadero. Se obtienen de los datos del fabricante o de
literatura. El laboratorio debe establecer requisitos de
ausencia de interferencia para valores definidos de las
magnitudes.

Verificar resultados de pacientes con condiciones clnicas
asociadas con interferencias (enfermedades hepticas,
fallas renales, embarazo, incongruencias con cuadro
clnico.

Inspeccionar las muestras visualmente buscando
hemlisis, ictericia, lipemia o evaluarlas usando
ndicadores sricos.
ESTUDIO DE INTERFERENCIAS
1 Prueba de dilucin lineal (las interferencias no se
comportan linealmente con la dilucin).

2 Analizar la muestra por otro mtodo (comparacin de
mtodos).

3 Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir
sustancias potencialmente interferentes.

4 Anlisis de muestras enriquecidas con el interferente.
SENSIBILIDAD
Es la capacidad de un mtodo analtico de
registrar ligeras variaciones de la concentracin.
m
s
b
=
ANLISIS CUANTITATIVO VALIDACIN
= Sensibilidad
b = Pendiente obtenida desde la regresin lineal.
Sm = desviacin estndar de la muestra.
LMITE DE DETECCIN (LD)

Menor concentracin o cantidad de analito detectable
con razonable certeza por un procedimiento analtico
dado. Concentracin que proporciona una seal en el
instrumento significativamente diferente de una
muestra blanco.
b
s * 3 y
LD
bl
b l +
=
ANLISIS CUANTITATIVO VALIDACIN
Ybl = seal promedio del blanco.
Sbl = desviacin estndar del blanco.
b = pendiente obtenida desde la regresin lineal del
analito.
LMITE DE CUANTIFICACIN (LC)

Es la menor concentracin de analito que puede
determinarse con precisin y exactitud razonables en
las condiciones establecidas y se expresa en unidades
de concentracin.
b
s * 10 y
LC
bl
bl +
=
ANLISIS CUANTITATIVO VALIDACIN
Ybl = seal promedio del blanco.
Sbl = desviacin estndar del blanco.
b = pendiente obtenida desde la regresin lineal del
analito.
ROBUSTEZ:

Grado de concordancia de los resultados al efectuar
cambios en las condiciones operativas y ambientales
normalizadas del mtodo.
ANLISIS CUANTITATIVO VALIDACIN
Capacidad de un procedimiento de permanecer
inalterado por pequeas pero deliberadas
variaciones en los parmetros del mtodo y provee
informacin de su comportamiento en la rutina.

Parmetros estudiar:
-Efectos del congelado-descongelado
-Tiempos de incubacin
- Cambio pH tampones
-Temperaturas de incubacin
-Longevidad de los reactivos
-Preparacin de la muestra
-Conservacin de la muestra.
ROBUSTEZ
NORMA NCh 2446.Of1999 Gua para la
validacin de mtodos de ensayo Principios y conceptos
generales

5 Procedimiento de validacin
5.1 Los laboratorios de ensayo y los organismos de
acreditacin deben contar con procedimientos y directrices
para planificar y controlar el proceso de validacin de
mtodos de ensayo. Sin embargo, la discusin anterior ha
indicado claramente que no puede desarrollarse un
procedimiento nico. En consecuencia, tiene que
desarrollarse una gama de diferentes alternativas de tcnicas
de validacin. Cun detallada deba ser la validacin, depende
de las circunstancias (necesidades, costos, posibilidades,
riesgos, etc.).
DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Espaola de
Bioq. Cln. y Patologia Molecular
SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIN DE EVIDENCIA
OBJETIVA DE LA VALIDACIN DE MTODOS NORMALIZADOS:
El Laboratorio Clnico debera establecer requisitos y verificar, al
menos las siguientes caractersticas metrolgicas:
1.-Error sistemtico (sesgo). El fabricante del calibrador deber
proporcionar la trazabilidad y la incertidumbre del valor asignado.
Deber proporcionar datos sobre la veracidad de los resultados.
Sin embargo, el Laboratorio debera obtener sus evidencias que el
proceso proporciona resultados satisfactorios

2.-Interferencias (magnitudes influyentes). El fabricante deber
proporcionar la informacin de las interferencias.

DOCUMENTO A, 0/2 de la Soc. Espaola de
Bioq. Cln. y Patologia Molecular
SOBRE RESPONSABILIDADES EN LA OBTENCIN DE EVIDENCIA
OBJETIVA DE LA VALIDACIN DE MTODOS NORMALIZADOS:
3.-Imprecisin interdiaria (reproducibilidad). Responsabilidad
Laboratorio.
4.-Lmite de deteccin. El fabricante deber propocionar
especificaciones de imprecisin, sensibilidad y lmite de deteccin.
El Laboratorio debera estudiar el lmite de deteccin cuando
observa diferencia.
5.-Contaminacin
6.-Verificar dilucin
Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ;
COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)
Recomendacin de validacin de mtodos de acuerdo
a la complejidad de la prueba o determinacin:

-Pruebas de mnima complejidad (waived tests). No
hay recomendacin para la validacin de mtodo.
Seguir directrices del fabricante.
Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ;
COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)
-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados
por el FDA los estudios de validacin de mtodos deberian seguir las
siguientes recomendaciones:
-Verificar los parmetros de calidad o especificaciones de
desempeo (demostrar resultados comparables a los establecidos por el
fabricante): -Exactitud
-Precisin
-Rango de los resultados analticos reportado por el
mtodo
-Verificar que los intervalos de referencia del fabricante
son apropiados para la poblacin de pacientes del
laboratorio.
Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ;
COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)
-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) aprobados
por el FDA
Actividades a realizar por el laboratorio:
-Comparacin de mtodos para estimar la inexactitud o
sesgo.
-Replicar muestra o control para estimar la imprecisin
-Hacer estudio de linealidad para estimar el
rango de la determinacin reportado por el fabricante
-Obtener valores de referencia para verificar intervalo de
referencia indicado por el fabricante
Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ;
COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)
-Pruebas de moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o
desarrollados en el laboratorio, la validacin de los mtodos requiere:
-Exactitud
-Precisin
-Sensibilidad analtica
-Especificidad analtica, incluyendo el estudio de sustancias
interferentes
-Rango de los resultados analticos reportado por el mtodo
-Intervalo de referencia (valores normales)
-Cualquier otro parmetro requerido para el desempeo del mtodo

Reglas CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)
Regulacin Validacin de Mtodos
(JCAHO, Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organizations;
CAP, College of American Pathologists ;
COLA, Commission on Office Laboratory Accreditation)
-Pruebas moderada y alta complejidad (Non-Waived tests) modificados o
desarrollados en el laboratorio
Actividades a realizar por el laboratorio:
-Comparacin de mtodos para estimar la inexactitud o sesgo.
-Replicar muestra o control para estimar la imprecisin
-Hacer estudio de linealidad para estimar el rango a reportar
-Lmite de deteccin para estimar interferencias permanentes
-Experimentos de recuperacin para estimar proporcin de
interferencias
-Obtener valores de referencia para estimar el intervalo de referencia
Mtodos Cualitativos y/o
Semicuantitativos
En los laboratorios de anlisis se generan
cada vez ms mediciones que dan respuesta
rpidas de tipo cualitativo.
Respuesta de tipo binario: Si / No .
Presencia o ausencia de determinado analito.
Presencia o ausencia de un determinado nivel del
analito.
Se denominan sistemas de screening.


Sistemas de Screening
Muchas veces se utilizan como una etapa previa
para luego realizar un anlisis cuantitativo.
Evita anlisis cuantitativos a muestras que dan
negativo.
A nivel microbiolgico generalmente en
identificacin bacteriana son diagnsticos y no
presuntivos.
Anlisis cualitativo
Sistema de
tamizaje
(screening)
Anlisis
cuantitativo
No se
analiza
> 2 ng/mL
< 2 ng/mL
NO
SI
Menor experimentacin.
Decisin rpida.
De fcil manejo, porttiles, etc.
Sin necesidad de equipos.
Ahorro.

Presencia del analito
Ausencia del analito
Mtodo Confirmatorio
Sistemas de Medida Cualitativos
Anlisis cualitativo clsico o sensorial:
Color: cambio, aparicin.
Olor.
Turbidez.
ELISA.
Crecimiento bacteriano.
Deteccin instrumental:
UV: fluorescencia, potenciometra.
Sensores: qumicos, bioqumicos, etc.
ELISA.
Anlisis cualitativo clsico o
sensorial
La respuesta binaria SI / NO se obtiene
directamente.
En general la presencia del analito se
determina por comparacin con un blanco.
Pruebas bateras bioqumicas
Se encuentran tambin las pruebas de Kits.
Son dispositivos comerciales para pruebas
concretas.
Contienen todos los reactivos necesarios.
Pueden contener algn instrumento sencillo.

Pruebas de kits:
Ltex para serotipificar Streptococcus.
Tiras de orina.
Pruebas rpidas para meningitis bacterianas.
API.
Mtodo de CIM por microdilucin en microplacas
Coaglutinacin.
Mtodo ELISA rpido para deteccin C. difficile

Anlisis cualitativo clsico o
sensorial
La determinacin se hace mediante una
medida instrumental:
Colorimetra.
Fluoresencia.

La presencia o no de un determinado analito
puede ser el nivel lmite de deteccin o a un
nivel superior.
Anlisis Cualitativo Sensorial
La respuesta instrumental que se obtiene se
transforma en respuesta binaria SI/NO e
implica un tratamiento de datos.
Primero hay que establecer la respuesta
instrumental:
Valor de absorbancia para la concentracin
correspondiente .
Si el valor es superior la respuesta es Si.
Ej. Mtodos automatizados para Hemocultivos.
Ej. Mtodos automatizados para CIM.
Ej. Estandarizacin automatizada a 0,5 MF.

Anlisis Cualitativo Sensorial
Mtodo de ELISA
Mtodo Semicuantitativo.
Se basan en una reaccin inmunolgica .
La deteccin puede ser sensorial o
instrumental.
Ej. Bacterias: C. difficile, E. coli .
Ej. Virus: Hepatitis, SIDA, Sarampin, etc.
Ej. Parsitos: Chagas
Autoinmunidad: ENA, AAN, DNA, etc.



Mtodos cualitativos tambin deben validarse.
Validar consiste en verificar y documentar su
validez a requisitos especficos.
La validacin implica como etapa previa la
definicin de los requisitos analticos o de
calidad.
Luego entonces la determinacin de estos
requisitos.
Los resultados se expresan diferente a los
mtodos cuantitativos.

Validacin Mtodos Cualitativos
Mtodos Cualitativos
Anlisis Cualitativo / screening

SI / NO
Con probabilidad
de error
Tambin tiene dos valores el primero binario y el
segundo es la probabilidad de error asociada a
la decisin tomada.
Se expresan en trminos probabilsticos.

Expresin de Resultados
Requisitos de Calidad
Mtodo Cuantitativo Mtodo Cualitativo

- Linealidad.
- Homogeneidad.
- Precisin:
- Repetibilidad.
- Reproducibilidad.
- Robustez.
- Veracidad (exactitud).
- Incertidumbre.
- Limite de deteccin.
- Lmite de cuantificacin.
- Rango de cuantificacin
- Selectividad e Interferentes.

- Especificidad.
- Sensibilidad.
- Valor predictivo positivo (VPP).
- Valor predictivo negativo (VPN).
- Exactitud diagnstica.
- Lmite de corte (cut-off).
- Incertidumbre o regin de error.
- Lmite de deteccin.
- Robustez.
Especificidad
Se define como la capacidad o habilidad del
sistema de detectar en forma exacta un
analito en una matriz.
Grado en que un mtodo se ve afectado por
otros componentes de la muestra
(interferencias) en su capacidad para
detectar en forma nica un analito en
particular en una matriz.
Se expresa como probabilidad.





Analito
presente
Analito
ausente
Mtodo
positivo
Verdaderos
positivos (VP)
Falsos
positivos (FP)
Mtodo
negativo
Falsos
negativos (FN)
Verdaderos
negativos (VN)
Proporcin de muestras sin el analito, cuyo mtodo es
negativo:
E = VN / (VN + FP)
Especificidad (E)
Capacidad del mtodo para detectar la
menor cantidad del analito particular en una
matriz sin interferencia de otros analitos.
Es la capacidad o habilidad del sistema de
detectar muestras positivas cuando
realmente son positivas.
Se expresa como probabilidad.
Concentracin de un analito necesaria para
producir una unidad de cambio de lectura
instrumental.

Sensibilidad
Analito
presente
Analito
ausente
Mtodo
positivo
Verdaderos
positivos (VP)
Falsos
positivos (FP)
Mtodo
negativo
Falsos
negativos (FN)
Verdaderos
negativos (VN)
Proporcin de muestras que contiene el analito cuyo
mtodo es positivo:
S = VP / (VP+FN).
Sensibilidad (S)
Falsos Negativos (FN)
Desviacin negativa.
El mtodo a validar da un resultado negativo
y el mtodo de referencia da positivo.
Corresponden a muestras que contienen uno
o ms analitos por encima del valor lmite
permitido y que en prueba de screening dan
respuesta negativa.
Se concluye con este resultado previo que la
muestra no contiene el analito en los niveles
fijados cuando si lo contiene.
Desviacin positiva
Corresponden a aquellas muestras que
realmente no contienen el analito en el nivel
definido y que por Ej. la prueba de screening
lo detecta.
Se produce cuando el mtodo a validar
proporciona un resultado positivo sin
confirmacin y el mtodo de referencia da un
resultado negativo.
Falsos Positivos (FP)
Exactitud Diagnstica
Proporcin de resultados correctos
(verdaderos positivos + verdaderos
negativos).
Es el grado de concordancia entre el
resultado obtenido en un ensayo y el valor de
referencia que debiera obtenerse.
Analito
presente
Analito
ausente
Mtodo
positivo
Verdaderos
positivos (VP)
Falsos
positivos(FP)
Mtodo
negativo
Falsos
negativos(FN)
Verdaderos
negativos (VN)
Proporcin de resultados correctos :
ED = (VP+VN) / (VP+FP+VN+FN)
Exactitud Diagnstica (ED)
Lmite de Corte o Cut-off
Limite de cuantificacin??
Nmero mnimo de microorganismos dentro
de una variabilidad definida que pueden
determinarse bajo las condiciones
experimentales del mtodo evaluado.
Aplicado a anlisis microbiolgicos
cuantitativos.
Resultados mtodos
Pacientes negativos Pacientes positivos
Lmite de Corte (cut-off)
Definiciones de Requisitos de
Calidad
Valor del Lmite de Corte (cut-off). Valor de corte del mtodo, dado
principalmente por el fabricante, sobre el cut-off resultados positivos y
bajo cut-off, resultados negativos. Se basa en una dicotoma
(presencia/ausencia, si/no, etc.).
C= 2ng/mL
Definiciones de Requisitos de
Calidad
Regin de Incertidumbre. Corresponde a la imprecisin del mtodo, es
un rango donde encontramos error Tipo I o (Falsos positivos) y Tipo II
o (falsos negativos) del mtodo.
C= 2ng/mL

Definiciones de Requisitos de
Calidad
Regin de Incertidumbre (*CLSI: EP12-A2):
C50: Concentracin del analito donde se produce un 50% de resultados positivos y un
50% de resultados negativos.
Intervalo C5 C95: Rango de concentraciones requeridas del analito donde a
concentraciones < de C5, son resultados concretamente negativos y > C95 son concretos
positivos.

Verdaderamente Negativas. Verdaderamente Positivas.
C50
Lmite de Deteccin
Cantidad mnima de analito que puede ser
detectado en una muestra pero que no
puede ser estimado con precisin o sea que
no necesariamente es cuantificado en las
condiciones del ensayo.
Aplicado a anlisis microbiolgicos
cualitativos.
Los resultados se expresan como detectado /
no detectado.
Robustez
Efecto Matriz:
Capacidad de un procedimiento de permanecer inalterado
por pequeas pero deliberadas variaciones en los
parmetros del mtodo y provee informacin de su
comportamiento en la rutina.
Identificar variables que pueden tener efectos significativos
en la respuesta del mtodo.
Analizar cada set en condiciones experimentadas dadas y
determinar el efecto de cada cambio.
Efectos congelado/descongelado, tiempos y temperaturas
de incubacin, cambios pH, preparacin y conservacin de
la muestra y reactivos.

Resumen
Definiciones Requisitos de Calidad
Especificidad. Proporcin de muestras negativas (no reactivas) que
son correctamente identificadas.
Sensibilidad. Proporcin de muestras positivas o reactivas
correctamente identificadas por la prueba.
Falso Positivo. Probabilidad de que la muestra clasificada como
negativa, d positiva por el mtodo.
Falso Negativo. Probabilidad de que la muestra conocida como
positiva, d negativa por el mtodo.
Valor Predictivo Positivo. Probabilidad que tiene una muestra de
ser realmente positiva, cuando el resultado de la prueba resulta
reactivo.
Valor Predictivo Negativo. Probabilidad que tiene una muestra de
ser negativo, cuando el resultado de la prueba es no reactivo.
Exactitud diagnstica analtica. Capacidad del mtodo para
detectar correctamente los positivos y los negativos.

Observaciones
Hay pruebas en las que tiene un impacto a
nivel de Salud pblica adems de individual
dar un resultado Falsos + o Falso -.
Ej. VIH
En resistencia antibitica es de mayor
impacto los falsos negativos, o sea informar
como sensible cuando es resistente.
De mayor trascendencia tambin en Falsos -:
Hemocultivos, meningitis, resistencia antibitica,
VIH, etc.

Mtodo ideal
Normal Enfermo
Valores mtodo
No falsos positivos o negativos
N
r

d
e

i
n
d
i
v
i
d
u
o
s

Realidad mtodos
Normal, sin el analito
Enfermo, con el analito
Valores
Mtodo
+2SD
Falsos
Negativos
Falsos
Positivos
N
r

d
e

i
n
d
i
v
i
d
u
o
s

Resultados mtodos
Pacientes negativos Pacientes positivos
Sin enfermedad
Con enfermedad
Verdaderos Positivos
Definiciones del ejemplo
Resultados mtodo
Pacientes negativos Patientes positivos
Sin enfermedad
Con enfermedad
Falsos
Positivos
Definiciones del ejemplo
Resultados mtodos
Pacientes negativos Pacientes positivos
Sin enfermedad
Con enfermedad
Verdaderos
negativos
Definiciones del ejemplo
Resultados mtodo
Pacientes negativos Pacientes positivos
Sin enfermedad
Con enfermedad
Falsos
negativos
Definiciones del ejemplo
Evaluador de los requisitos de
Calidad
Tablas de Contingencia. Diferencian las muestras en dos
categoras, (+)/(-) segn el mtodo, y establecen una tabla de
comparacin respecto del resultado obtenido mediante el criterio de
exactitud diagnstica analtica.
Criterio de exactitud diagnstica
Prueba a Evaluar POSITIVOS NEGATIVOS Total
POSITIVOS VP FP VP + FP
NEGATIVOS FN VN FN + VN
Total VP + FN FP + VN VP + FP +FN +VN
*CLSI: EP12-A2
Tablas de Contingencia
Las mas simples son las que diferencian las
muestras en dos categoras : positivo o
negativo.
Luego se establece una tabla de
comparacin respecto al resultado obtenido
con resultado de mtodo de referencia .
A partir de la tabla se calculan los cuatro
parmetros bsicos : falsos+, falsos-,
sensibilidad y especificidad.

Ventajas:
Son de fcil aplicacin en la mayora de los
bioensayos.
Desventajas:
o Dan una medida global de la capacidad del mtodo.
o Se estima que la muestra se comportar
estadsticamente de forma similar a las ya
analizadas.
o No se calcula una probabilidad de error en cada
muestra en particular.
o La capacidad de la tabla depende del nmero de
muestras analizadas.


Tablas de Contingencia
Teorema de Bayes. Calcula la probabilidad de dar verdadero
(positivo o negativo) un resultado cuando en realidad lo es, vale
decir, probabilidad que ocurra el evento A dado el evento B.
P(VPP) = P(p/a)* P(a) /P(p/a)*P(a)+P(p/b)*P(b)
P(VPN) = P(n/a)*P(a)/P(n/a)*P(a)+P(n/b)+P(b)

P(a): prob. de obtener un resultado positivo
P(b): prob. de obtener un resultado negativo
P(p/a): prob. de obtener un resultado (+)
cuando esta presente la enfermedad.
P(p/b): prob. de obtener un resultado (+)
cuando no esta presente la enfermedad.
Evaluador de los requisitos de
Calidad
Curvas ROC (Receiver Operating Characteristic o Curvas de
Operatividad Relativa). Se generan al evaluar las modificaciones en la
sensibilidad y especificidad que son resultantes de la modificacin que se
haga en los niveles de corte, de acuerdo al proceso de decisin clnica
para un analito determinado.



* A. Pulido, I. Ruisnchez, R.
Boqu , F.X. Rius
Evaluador de los requisitos de
Calidad
Sensibilidad vs. Especificidad.
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
ESPECIFICIDAD (Fraccin verdaderos
negativos)
S
E
N
S
I
B
I
L
I
D
A
D

(
F
r
a
c
c
i

n

v
e
r
d
a
d
e
r
o
s

p
o
s
i
t
i
v
o
s
)
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
1-ESPECIFICIDAD (Fraccin falsos
positivos, FFP)
S
E
N
S
I
B
I
L
I
D
A
D

(
F
r
a
c
c
i

n

v
e
r
d
a
d
e
r
o
s

p
o
s
i
t
i
v
o
s
)

Sensibilidad vs. 1- Especificidad.
Lectura de las Curvas ROC

* http://ludwig-sun2.unil.ch/~darlene/module4/

PROTOCOLO DE VALIDACIN DE UN
MTODO ANALTICO
- Identificacin
-Titulo
-Protocolo redactado por
-Protocolo aprobado por
-Objetivo -Alcance
-Factores crticos
-Seleccin y tratamiento muestra y MRC
-Identificacin equipo: certificado calibracin
-Mtodo analtico: PON
-Variables a determinar : anlisis estadstico
-Personal que desarrollar la validacin
-Criterio de aceptacin para cada parmetro de desempeo
-Conclusiones
-Registros -Referencias
INFORME DE VALIDACIN DE UN
MTODO ANALTICO
-Identificacin
-Titulo
-Informe redactado por
-Informe aprobado por

-Objetivo -alcance
-Responsabilidad
-Equipo, materiales, documentos
-Procedimiento
-Clculos y anlisis estadsticos
-Criterio de aceptacin vs Resultados
-Informe de desviaciones
-Informe resultados y conclusiones de
validacin del mtodo