Determinacion De Cobre Y Zinc En Cabello Por Espectrofotometria De Absorcion Atomica

DOCUMENTO Qumica Clnica 2003; 22 (1) 13-18 Metodologa recomendada para la medicin del contenido de zinc en especmenes biolgicos Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular. Comit Cientfico. Comisin de Elementos Traza1. Documento C Fase 3 Versin 3. Documento preparado por: Elisa Herrero Huerta y Almudena Vigil Rodrguez. ndice 0. Introduccin 1. Objeto y campo de aplicacin 2. Revisin de tcnicas analticas 2.1. Espectrometra de fluorescencia molecular 2.2. Fluorometra de absorcin molecular 2.3. Espectrometra de absorcin atmica de llama 2.4. Espectrometra de absorcin atmica con atomizacin electrotrmica 2.5. Otras tcnicas 3. Procedimientos analticos recomendados 3.1. Obtencin de especmenes a) Suero b) Orina c) Otros d) Informacin semiolgica 3.2. Procedimiento de medida de la concentracin de zinc en el suero y en la orina por espectrometra de absorcin atmica de llama a) Condiciones analticas b) Preparacin de la muestra c) Preparacin de patrones d) Caractersticas metrolgicas 3.3. Procedimiento de preparacin de diferentes tejidos para la medida de zinc por espectrometra de absorcin atmica de llama a) Condiciones analticas b) Preparacin de la muestra c) Preparacin de patrones d) Caractersticas metrolgicas 3.4. Control de calidad a) Materiales de control b) Programas de evaluacin externa de la calidad 4. Intervalos de referencia 5. Conclusiones. 6. Bibliografa. 0 INTRODUCCIN El zinc es un metal de transicin con peso atmico 65,38 g/mol que pertenece al grupo IIB del Sistema Peridico. Por oxidacin forma iones sencillos divalentes y no presenta qumica redox. 1 Composicin de la Comisin: JA Cocho de Juan, JF Escanero Marcn, MD Fernndez Gonzlez, L Garca Beltrn, A Garca de Jaln Comet, M Gonzlez Estecha, J Gonzlez Revaldera, E Herrero Huerta, A Montel Ruiz de Alda, C Pintos Virgs, V Seijas MartnezEchevarra Es un elemento esencial en nutricin humana (1-3). En 1869, Raulin descubri que era necesario para el crecimiento del Aspergillus nger (4). Vallee (5), en 1956, public la primera evidencia de deficiencia nutricional de zinc en el hombre y en 1963 Prasad et al. (6) la describieron en adolescentes egipcios. Posteriormente Halsted et al. (7, 8) observaron alteraciones similares en jvenes iranes de ambos sexos. Su presencia resulta imprescindible para el funcionamiento de ms de 200 metaloenzimas entre las que figuran la DNApolimerasa dirigida por DNA, la RNApolimerasa dirigida por DNA (9), la DNA-polimerasa dirigida por RNA,la timidinquinasa, la anhidrasa-carbnica intraeritrocitaria, la alcoholdeshidrogenasa, la superxido-dismutasa, la carboxi-peptidasa y la fosfatasa-alcalina (10). Por su participacin en la actividad de dichas enzimas interviene en gran variedad de procesos biolgicos como son la expresin gnica (11), la divisin celular, el crecimiento, la funcin sexual, la inmunidad celular, la cicatrizacin de heridas o la agudeza de gusto y olfato (12,13). Existe una alteracin gentica autosmica recesiva denominada acrodermatitis enteroptica caracterizada por una severa dermatitis acral y periorificial (14,15). En esta patologa, aunque el defecto bsico no est claro, s se sabe que el metabolismo del zinc est alterado, ya que tras la administracin de suplementos exgenos del elemento se revierte parcialmente la sintomatologa. En la

acrodermatitis enteroptica tambin se observan alteraciones de la inmunidad celular y del metabolismo del cobre (16). En pases desarrollados existen grupos poblacionales que, dependiendo de los factores nutricionales y el estado metablico, pueden ser ms susceptibles a la instauracin de una deficiencia nutricional de zinc. Dietas pobres en protenas de origen animal y ricas en fibras y fitatos presentan baja biodisponibilidad del elemento, (17-19) como ocurre en el caso de los vegetarianos (20); presencia aumentada de iones como PO43-, Cu(II), Fe(II), Al(III) conducen al mismo efecto (21,22). En los ancianos, el dficit es muy frecuente debido a la ingesta inadecuada y a la deficiente absorcin intestinal propia de la edad (23-25). Se deben vigilar tambin aquellos estados fisiolgicos en los que exista una demanda anablica elevada tales como la lactancia (26), el crecimiento (27,28) y el embarazo (29-31). Determinados estudios relacionan concentraciones bajas de zinc plasmtico con un aumento de prematuridad y recin nacidos con bajo peso corporal (32-34). El dficit de zinc tambin afecta a la sntesis de DNA en la cresta neural causando un desarrollo insuficiente del tubo neural (33). El metabolismo del zinc puede verse comprometido durante el embarazo si, administrndose simultneamente dosis farmacoQumica Clnica 2003; 22 (1) 13

DOCUMENTO Qumica Clnica 2003; 22 (1) 13-18 lgicas de folatos y hierro, concurre algn tipo de patologa (33). El dficit de zinc puede presentarse, como una complicacin adicional, asociado a diferentes patologas como son: el sndrome de malabsorcin (35), la nutricin parenteral prolongada (36), la insuficiencia renal crnica (37-39), la cirrosis heptica (40) y el alcoholismo (24, 41); y tambin a aquellos procesos que cursan con intensa destruccin celular e incremento del catabolismo tales como la ciruga (42), los traumatismos (43), las quemaduras (44), las neoplasias (45), las infecciones agudas (46) y el infarto agudo de miocardio (47-49). La intoxicacin por este elemento es poco frecuente salvo en el mbito industrial (fiebre por humo de zinc) (50). La necesidad del zinc en nutricin humana llev al desarrollo de tcnicas analticas para su medicin en especmenes biolgicos. En un principio, se utilizaron mtodos colorimtricos que requeran etapas previas de desproteinizacin, lo que implicaba un mayor riesgo de contaminacin (51). En 1955 Walsh (52) describi la aplicacin de la espectrometra de absorcin atmica en anlisis qumicos, permitiendo la omisin de estas etapas. De esta manera, se logr un aumento de la sensibilidad analtica y una elevada exactitud puesto que solo era necesario realizar una dilucin previa de las muestras (51). da precisin y alta fiabilidad, presentando un coeficiente de variacin inferior a un 7%; sin embargo, requiere un gran volumen de muestra, es lenta y cara (53). 2.3. Espectrometra de absorcin atmica de llama Es la tcnica analtica ms utilizada en el Laboratorio Clnico para la medicin de la concentracin de zinc porque presenta una elevada sensibilidad y especificidad analtica, es rpida y requiere un volumen pequeo de muestra (53,55,56). La muestra, diluida, es aspirada y conducida a la llama mediante un nebulizador. En sta, los tomos de zinc en estado fundamental absorben la luz emitida por una lmpara de ctodo hueco del mismo metal. La llama utilizada est compuesta por acetileno y aire. La lnea de resonancia correspondiente a los tomos de zinc cuantificados se asla de la emisin de fondo de la llama mediante una red de difraccin. 2.4. Espectrometra de absorcin atmica con atomizacin electrotrmica En esta tcnica se ha sustituido la llama por un tubo de grafito en cuyo interior se deposita la muestra previamente diluida. sta se somete secuencialmente a un programa de tiempos y temperaturas para conseguir su evaporacin, mineralizacin y posterior atomizacin. La precisin y exactitud son muy elevadas. El lmite de deteccin del ensayo es de 0,010 mol/L (57). La masa caracterstica es 0,45 pg y su especificidad analtica es adecuada. Sin embargo, la elevada sensibilidad inherente a esta tcnica disminuye su aplicacin, ya que para evitar la contaminacin se deben tomar medidas muy laboriosas (58). 2.5. Otras tcnicas Las tcnicas polarogrficas presentan lmites de deteccin bajos (59, 60). La voltametra de redisolucin andica, la fluorescencia por rayos X (61) y la activacin neutrnica no resultan tiles en la prctica asistencial diaria porque son procedimientos costosos, lentos y requieren un adiestramiento especializado. En el caso de la activacin neutrnica su utilizacin se limita al anlisis multielemental de materiales de referencia (62). Otras tcnicas utilizadas son la titulacin electrotrmica (63), el anlisis por resonancia fluorescente, los mtodos radioqumicos y la espectrometra de masas con induccin acoplada de plasma (ICP-MS) (53). 1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIN En este documento se realiza una revisin de las tcnicas analticas comnmente utilizadas para la medida de la concentracin de zinc en especmenes biolgicos as como de los procedimientos analticos y se propone uno para ser empleado dentro del mbito del laboratorio clnico. 2 REVISIN DE TCNICAS ANALTICAS 2.1. Espectrometra de fluorescencia molecular. Esta tcnica se basa en la reaccin de zinc con

un cromgeno dando lugar a un producto coloreado que absorbe en el espectro visible. En un principio se han utilizado diferentes reactivos de color cuyo uso hace indispensable etapas de digestin y extraccin lo que supone muchas probabilidades de contaminacin y obtencin de resultados errneos (52,53). Actualmente se utiliza el 2-(5-bromo-2 piridilazo)-5-(N-propil-Nsulfopropilamino)- fenol que evita las etapas previas anteriormente citadas precisando nicamente desproteinizacin con cloruro de guanidina. Para evitar la presencia de falsos positivos, este compuesto se utiliza junto con el citrato, la dimetilglioxima y la salicilaldoxima con el objetivo de enmascarar su reaccin con hierro, cobre y nquel, que se pueden encontrar en altas concentraciones en diferentes especmenes biolgicos (53). Esta tcnica se caracteriza por presentar una elevada precisin y exactitud. El lmite de deteccin se ha estimado en 1,15 mol/L (54). 2.2. Fluorometra de absorcin molecular Se basa en la formacin de un complejo entre el zinc y el 8quinolinol estabilizado con goma arbiga, que presenta una marcada fluorescencia a 517 nm cuando se excita a 375 nm. Bajo estas condiciones solamente el zinc puede ser medido sin interferencias por parte de otros elementos qumicos tanto en sangre como en orina (52). La estabilidad de la fluorescencia decrece despus de 45 minutos. Es una tcnica con una eleva3 PROCEDIMIENTO ANALTICO RECOMENDADO La espectrometra de absorcin atmica de llama (SAAF), descrito en el punto 2.3., permite la medicin del contenido de zinc en diferentes especmenes biolgicos. La cuantificacin de la concentracin de zinc se puede realizar mediante una simple dilucin de la muestra. Es el mtodo de eleccin por varias razones: rapidez, practicabilidad, coste y bajo riesgo de contaminacin. Cabe destacar que es el procedimiento analtico elegido por el grupo de trabajo de elementos traza de la Sociedad Francesa de Biologa Clnica (55). La SAAF (espectrometra de absorcin atmica de llama) permite medir el contenido de zinc con una elevada precisin en suero, sangre total y eritrocitos. En el estudio multicntrico realizado por la comisin de elementos traza (SEQC) para medir cobre y zinc, la espectrometra de absorcin atmica de llama cumpli con los valores requeridos de lmite de deteccin (0,009 mol/L), linealidad, recuperacin y reproducibilidad (77). 14 Qumica Clnica 2003; 22 (1)

Metodologa recomendada para la determinacin del contenido de zinc en especmenes biolgicos 3.1. Obtencin de especmenes a) Suero y plasma sanguneo Para una adecuada obtencin de la muestra es necesario un conocimiento previo de todos aquellos factores preanalticos que pueden influir en la medicin. Se recomienda la utilizacin de tubos de poliestireno y polipropileno sin aditivos, para evitar la contaminacin en sistemas de vaco que emplean tapones de goma. La heparina es el anticoagulante de eleccin, en el caso de la utilizacin de plasma sanguneo (64,65). El plasma presenta una ventaja frente al suero, y es que en la medicin de la concentracin de zinc se ha de minimizar la liberacin del elemento procedente de eritrocitos y plaquetas, siempre que la centrifugacin y separacin del plasma sean inmediatos (66). Se debe evitar la presencia de hemlisis porque los eritrocitos presentan un contenido de zinc 10 veces superior que el suero (67). Se aconseja una recogida de la muestra a primera hora de la maana puesto que el zinc presenta ritmo circadiano (68). b) Orina zinc en orina no aporta ninguna informacin excepto en aquellas situaciones en las que la fraccin ultrafiltrable aumenta de forma significativa, como son estados que cursan con intensa destruccin celular, cuadros de intoxicacin o tras el tratamiento con compuestos quelantes (64,70). El contenido de zinc intraleucocitario (76) es idneo a la hora de confirmar un dficit agudo por ser el leucocito la clula sangunea de vida media ms corta, pero los valores de referencia varan tanto en funcin de la poblacin celular separada como de la relacin mononucleares/polimorfonucleares (69). Presenta otro inconveniente que es la falta de estandarizacin en la forma de expresin de los resultados obtenidos (69). El pelo tampoco es til a la hora de valorar el estado nutricional pues su contenido en zinc se modifica ms lentamente que en otros tejidos, y presenta variaciones en funcin de la raza, el origen geogrfico, edad y color del cabello, por lo que su anlisis debe ser reservado a estudios poblacionales (69). 3.2. Procedimiento de medida recomendado de la concentracin de zinc en el suero y en la orina por espectrometra de absorcin atmica de llama a) Condiciones analticas El zinc urinario se determina en orina de 24 horas. Se requiere la presencia de cido ntrico ultrapuro para evitar el intercambio de iones metlicos con la pared del contenedor, puesto que la matriz urinaria es pobre en compuestos quelantes del metal (69). Un pH