Modele experimentale realizate pe animale de laborator Generalitati

Motto: Science is built up of facts, as a house is built of stones; but an accumulation of facts is no more a science than a heap of stones is a house. ~ Henri Poincar, Science and Hypothesis, 1905

Cuprins
a. Stabilirea clar a obiectivelor experimentului b. Alegerea modelului experimental c. Stabilirea variabilelor independente i dependente d. Alegerea designului i stabilirea programului experimental e. Randomizarea i identificarea factorilor de variabilitate care ar putea influena procesul investigat f. Realizarea protocolului experimental g. Efectuarea experimentului i colectarea datelor h. Analiza statistic a rezultatelor experimentului

a. Stabilirea clar a obiectivelor experimentului este foarte important pentru: - obinerea informaiilor ntr-un mod raional i economic - alegerea modelului experimental care ofer maximul de informaii cu un numr minim de investigaii efectuate - realizarea unui numr minim de repetri ale aceluiai experiment - utilizarea unui numr minim necesar de animale de laborator - minimalizarea disconfortului sau durerii animalului de laborator. Orice cercettor care planific un experiment pe animale de laborator ar trebui s ia n considerare n primul rnd aspectele etice implicate utiliznd cei 3 R stabilii de Russell and Burch (1959): - replace oricnd este posibil se recomand nlocuirea animalelor de laborator cu culturi celulare sau simulri computerizate - refine minimalizarea durerii i stressului pentru animalul de laborator - reduce folosirea numrului minim de animale necesare pentru atingerea obiectivelor studiului experimental.

b. Alegerea modelului experimental Conform Oxford English Dictionary un model este o reprezentare a unui obiect sau proces real care este folosit pentru testarea unor ipoteze de lucru sau pentru simplificarea unor probleme complexe. Un model experimental animal poate fi definit ca un organism viu care prezint un proces patologic natural sau indus i care este foarte asemntor cu acelai proces patologic ntlnit la om (de ex. modele experimentale animale utilizate pentru studiul inflamaiei sau durerii). Utilizarea unui model experimental are multiple limitri. Pot fi extrapolate rezultatele obinute cu ajutorul modelului la situaia real de la care s-a pornit? Ce probleme etice sau legale determin utilizarea anumitor modele? Un model experimental animal trebuie s ndeplineasc mai multe criterii: - o reproducere ct mai exact a fenomenului patologic observat la om - posibilitatea unei game largi de investigaii - identificarea factorilor care difereniaz modelul experimental animal de procesul patologic aa cum este descris la om
2

- posibilitatea extrapolrii datelor - posibilitatea de a utiliza mai multe specii de animale pentru acelai model - realizare facil a modelului experimental animal. Etapa premergtoare alegerii unui model experimental implic 3 pai importani: 1. Identificarea celui mai potrivit model experimental pe baza informaiilor actuale n ceea ce privete evoluia procesul patologic studiat la animalul de laborator 2. Efectuarea unor teste care s valideze i s standardizeze modelul experimental 3. Stabilirea relevanei rezultatelor obinute la specia utilizat i a

posibilitii de extrapolare a rezultatelor la om Modelul experimental ales trebuie s permit testarea corespunztoare a ipotezei de lucru i evaluarea unor parametri relevani pentru obiectivele experimentului. De exemplu, pentru testarea efectului hipoglicemiant al unei substane se poate folosi un model experimental care presupune inducerea diabetului zaharat la obolan sau pentru testarea efectului analgezic se folosete un model experimental care presupune inducerea durerii i cuantificarea acesteia dup administrarea substanei presupus analgezice. Dup alegerea modelului experimental ce va fi folosit, se alege specia de animal de laborator pe care se va aplica respectivul model.

c. Stabilirea variabilelor independente i dependente Dup ce s-a stabilit modelul experimental care va fi utilizat, se identific variabilele independente factorii de influen (de ex.greutatea, tipul de tratament aplicat, etc) i variabilele dependente rspunsurile sistemului parametrii masurati (de ex. valoarea tensiunii arteriale sistolice sau volumul edemului inflamator, etc.)
Factori de influen (substana administrat) Rspunsuri (parametrii msurai n timpul experimentului)

SISTEM (animalul de laborator)

n general, variabilele independente sunt reprezentate de tratamentul aplicat (substanele administrate) fiecrui lot de animale. Variabilele dependente sunt reprezentate de parametrii evaluai n timpul experimentului i pot fi de tip cantitativ (date numerice obinute prin msurtori) sau calitative (scoruri, aprecieri calitative de genul 0, +, ++, +++). Este de preferat utilizarea parametrilor cantitativi deoarece numrul necesar de animale este mai sczut dect n experimentele care evalueaz parametrii calitativi. Nu se recomand transformarea parametrilor calitativi n parametri cantitativi i astfel calcularea de medii i deviaii standard. Caracteristicile parametrilor masurati: Sensibilitatea unui parametru este cu att mai mare cu ct respectivul parametru este capabil s deceleze diferene mai mici de variaie. Cu ct sensibilitatea este mai mare cu att exist un risc mai mic de rezultate fals negative. Cu alte cuvinte, cu ct sensibilitatea este mai mare cu att exist un risc mai mic ca pe baza acelui parametru s se spun c nu s-a ntmplat nimic cnd de fapt s-a ntmplat un eveniment. Specificitatea unui parametru este cu att mai mare cu ct acel parametru are calitatea de a varia numai cnd variaz boala evaluat. Cu ct specificitatea este mai mare cu att exist un risc mai mic de valori fals pozitive. Fiabilitatea se evalueaz prin aprecierea reproductibilitii i concordanei. Reproductibilitatea se refer la faptul c acelai parametru msurat de mai multe ori n aceleai condiii de acelai investigator furnizeaz de fiecare dat aceeai valoare. Concordana se refer la faptul c acelai parametru msurat de mai multe ori n aceleai condiii de investigatori diferii ofer rezultate apropiate. Stabilitatea se refer la faptul c acelai parametru msurat la intervale diferite de timp furnizeaz aceeai valoare dac boala nu a evoluat. n fine validitatea apreciaz n ce msur parametrul utilizat msoar cu adevrat ceea ce se dorete a se msura.

Variabilele care vor fi analizate se stabilesc nainte de efectuarea fiecrei experiene i nu este recomandat modificarea lor (de ex. modificarea dozei n timpul experienei) sau introducerea de noi variabile n timpul experienei. n afar de variabilele independente i dependente definite de experimentator, n orice studiu experimental intervine un anumit numr de variabile necontrolate (ritmul circadian, etc.) care trebuie luate n considerare cnd se realizeaz designul experimental i analiza datelor (vezi randomizarea). d. Alegerea designului i stabilirea programului experimental

Designul experimental reprezint modalitatea de alctuire (randomizare, etc.) a loturilor utilizate n experiment, tratamentul aplicat fiecrui lot, momentul testrii/testrilor fiecrui lot. n realizarea designul experimental trebuie s se in cont de: obiectivele studiului, de datele existente privind caracteristicile farmacodinamice i farmacocinetice ale substanelor folosite, de tipul de animal folosit n experiment, precum i de modelul experimental utilizat. Din motive etice i economice este foarte important ca designul unui experiment realizat pe animale de laborator s fie corect i s foloseasc numrul minim necesar de animale pentru ndeplinirea obiectivelor tiinifice fr a mpiedica observarea unor efecte biologice importante i fr a fi necesar repetarea experimentului. n general, o singur experien nu este suficient pentru atingerea obiectivelor experimentale iar n acest caz este necesar un program experimental care s organizeze i s structureze activitatea experimental. Acest program trebuie s includ o succesiune logic i economic de experiene care s urmreasc obiectivele experimentale. Pot fi realizate experimente monofactoriale n care se variaz o singur variabil independent dar acest tip de experimente sunt neeconomice. Se prefer experimentele factoriale care permit varierea simultan a mai multor factori dup un anumit algoritm care permite i studiul interaciunilor dintre factori. Designul experimental depinde de obiectivele studiului i trebuie planificat n detaliu naintea de nceperea efectiv a experimentului, realizndu-se protocoalele de experiment i stabilindu-se metoda statistic de analiz a datelor. Un experiment cu un design corect evit apariia erorilor i are suficient putere statistic pentru detectarea efectelor biologice importante. Designul experimental nu trebuie s fie foarte complicat pentru a evita apariia greelilor n execuia sa.

n realizarea designul experimental trebuie s se in cont de faptul c este obligatorie folosirea de loturi martor/control negativ crora nu li se aplic factorul de influen (tratamentul) testat ci doar un tratament placebo (de ex. excipientul medicamentului testat) sau niciun tratament. Uneori este necesar i folosirea de loturi referin/control pozitiv crora li se aplic un factor de influen cu efect demonstrat n modelul experimental utilizat. De exemplu n testarea unei substane cu presupus efect antidiabetic se folosete un lot control negativ cruia i se administreaz doar excipienii substanei testate (excipienii substane fr activitate biologic) i un lot control pozitiv cruia i se administreaz insulin (substan cu efect hipoglicemiant clar demonstrat i la animalele diabetice). Se pot folosi diferite tipuri de design experimental:

- Designul paralel este cel mai folosit i presupune testarea mai multor loturi in paralel; pentru toate loturile experiena ncepe i se termin n aceleai timp; succesiv, se folosete cte un subiect din fiecare lot (nu se testeaz nti un lot apoi al doilea, etc ci primul subiect din primul lot, apoi primul subiect din lotul 2, etc.). Analiza statistic a datelor obinute ntr-un experiment cu design paralel este simpl iar rezultatele obinute pentru fiecare lot pot fi analizate mai nti independent i apoi comparate.

Lotul A Lotul B Lot control

Moment iniial

Moment final

Aplicarea diferitelor tratamente pentru fiecare lot n parte (factorul de influen variabila independent) Msurarea parametrilor prestabilii (rspunsul sistemului variabila dependent)

- Designul in bloc presupune utilizarea unor criterii de grupare a animalelor n blocuri (de ex. vrsta, sexul). n cadrul blocurilor se aplic designul paralel. Acest tip de design este simplu dar experimentele sunt mai dificil de realizat i necesit un numr mare de animale pentru o bun randomizare. - Designul de tip cross-over presupune ca animalul de laborator s fie supus succesiv mai multor tratamente sau proceduri.

Lot A : C Lot B : T Wash-out

Lot B : C Lot A : T

Perioada I

Perioada II

De exemplu, n prima perioad a experimentului lotul A este lotul control (A:C) iar lotul B este lotul tratat (B:T). Dup o pauz (wash-out) n care se presupune c animalul de laborator revine la starea iniial, anterioar perioadei I, (fapt care nu se prea ntmpl n cazul animalelor de laborator!) ncepe perioada II n care lotul B devine lotul control (B:C) iar lotul A, lotul tratat (A:T). Acest tip de design experimental prezint unele avantaje: sunt necesare mai puine animale de laborator iar fiecare animal este propriul su martor, dar dezavantajele sunt importante: n perioada de wash-out nu toate animalele revin la starea iniial, prelucrarea statistic a datelor este mai complicat iar loturile trebuie s fie foarte omogene pentru obinerea unor rezultate fiabile.

- designul factorial permite testarea unor posibile interaciuni ntre diferite tratamente sau proceduri i diferite caracteristici ale animalului de laborator. De exemplu testarea efectului a 3 substane asupra oarecilor - 3 linii genetice diferite (vezi tabelul de mai jos). Numrul de oareci necesari pentru fiecare lot va fi evaluat statistic (ecuaia Meads) pentru a se putea evalua corect rezultatele obinute. Linia genetic Substana 1 Substana 2 Substana 3 Control NMR1 4 4 4 4 C57B 4 4 4 4 CB6F 4 4 4 4
7

- designul secvenial nu se folosete n experimentele realizate pe animale de laborator ci doar n studiile clinice n care nu este posibil recrutarea n acelai moment a unui numr suficient de pacieni, ci succesiv. Dup stabilirea unui design experimental, pot fi efectuate studii pilot realizate pe un numr mic de animale (1-3/lot) pentru testarea logisticii experimentului i pentru a obine eventuale date n ceea ce privete posibilul rspuns care pot fi folosite n stabilirea numrului de animale /lot pentru urmtoarele experimente: exploratorii sau de confirmare. Experimentele exploratorii sunt realizate atunci cnd nu exist date n ceea ce privete un anumit tratament sau cnd se testeaz toxicitatea unei substane i au un numr mare de variabile dependente msurate. Experimentele de confirmare folosesc date obinute n experimentele exploratorii i vizeaz msurarea unui numr redus de variabile dependente care prezint interes i sunt menionate n ipoteza de lucru a experimentului.

e. Randomizarea i identificarea factorilor de variabilitate care ar putea influena procesul investigat n orice experiment intervin variabile care pot influena rezultatul final, cele mai importante fiind: - Variabilele auxiliare specia, rasa, tulpina, sexul, condiiile de mediu care pot fi controlate de experimentator - Variabile aditionale ca ritmul circadian, erori de msurare care pot fi controlate partial - Variabile aditionale ca diferentele interindividuale care nu pot fi controlate de experimentator. Aceste variabile ar trebui notate i luate n considerare la analiza datelor dar de cele mai multe ori, n mod greit, sunt ignorate. Pentru a minimaliza intervenia acestor tipuri de variabile asupra rezultatelor experimentului, la formarea loturilor de animale se folosete tehnica randomizrii. Randomizarea presupune mprirea animalelor de laborator n loturi omogene minimaliznd influena diferenelor interindividuale asupra procesului investigat (diferene genetice, de vrst, greutate, etc.). Este recomandat ca animalele folosite ntr-un experiment s fie din aceeai ras ct mai uniforme din punct de vedere fenotipic, fr diferene semnificative n ceea ce privete vrsta, greutatea i condiiile de mediu n care au fost crescute), s provin din aceeai surs (cresctorie), s fie sntoase (animalele bolnave nu trebuie folosite n proceduri experimentale). Animalele de laborator trebuie
8

gzduite n condiii de mediu standard pentru a evita stressul care reprezint un alt factor important de variabilitate. Pentru randomizare se folosesc programe statistice care atribuie numere aleatorii fiecrui subiect. Loturile obinute dup randomizare trebuie s fie omogene i, ideal, s conin acelai numr de animale de laborator. Dup randomizarea animalelor utilizate ntr-un experiment ar trebui realizat secretizarea astfel nct s fie evitat intervenia unor elemente subiective n msurarea rezultatelor. Secretizarea presupune codificarea tratamentelor (substanelor) aplicate, animalelor folosite i a diferitor probe (cnd este cazul) i necunoaterea acestei codificri de ctre persoanele care realizeaz efectiv experimentul. Ulterior, dup nregistrarea rezultatelor i analiza lor, schema de codificare este dezvluit i are loc interpretarea final a datelor.

f. Realizarea protocolului experimental Protocolul experimental trebuie realizat obligatoriu nainte fiecrei experiene/experiment efectuat i presupune descrierea detaliat a materialelor necesare i a modului de lucru. - Materialele necesare se realizeaz o list complet a tuturor materialele necesare desfurrii corespunztoare a experienelor (animalele de laborator necesare, substanele administrate, eprubete, pahare Berzelius, baghete sticl, seringi, cronometre, etc. absolut toate materialele care vor fi utilizate) - Modul de lucru se descrie foarte detaliat i cu rigurozitate paii care vor fi parcuri n timpul experimentului astfel nct acesta s se desfoare n cele mai bune condiii: 1. Prepararea soluiilor de administrat 2. Modul de administrare se descrie n amnunt tehnica folosit pentru administrarea substanelor la animalul de laborator 3. Identificarea fiecrui animal de laborator de obicei prin realizarea unor marcaje standard de culori diferite caracteristice fiecrui lot utilizat n experiment i fiecrui animal de laborator, modalitatea de randomizare aplicat

4. Cntrirea animalelor de laborator nainte de experiment o etap foarte important deoarece de obicei se administreaz doze/kg corp 5. Ordinea i intervalul de administrare al substanelor se realizeaz un orar n care se noteaz fiecare animal de laborator folosit n experiment n funcie de ordinea de administrare a substanelor (de ex.primul oarece din lotul A, dup 5 minute primul oarece din lotul B, dup nc 5 minute al doilea oarece din lotul A, etc. ntr-un experiment cu design paralel care folosete 2 loturi de oareci, A i B). 6. Descrierea amnunit a testului care va fi efectuat 7. Definirea modului de msurare a parametrilor evaluai 8. Ordinea de testare a animalelor de laborator i intervalul dintre testri se realizeaz un orar n care se noteaz fiecare animal de laborator n ordinea testrii. Ora
8:00 8:05 8:10 .......... Soarece Greutate Vol. soluiei administrate (se calculeaz funcie de concentraia soluiei i de doza administrat/kg corp V1 V2 V3

A1 (primul oarece din lotul A) B1 (primul oarece din lotul B) A2 (al doilea oarece din lotul A)

X1 X2 X3

Ex. de orar de administrare: experiment cu design paralel realizat pe 2 loturi de oareci; administrarea substanelor se efectueaz din 5 n 5 minute.
Ora 9:00 9:05 9:10 .......... Soarece A1 (primul oarece din lotul A) B1 (primul oarece din lotul B) A2 (al doilea oarece din lotul A) Parametrul 1 Parametrul 2

Ex. de orar de testare: experiment cu design paralel realizat pe 2 loturi de oareci; testarea oarecilor se realizeaz la o or dup administrarea substanelor cu urmrirea a 2 parametri; testul dureaz 5 minute ceea ce justific alegerea intervalului de 5 minute n cazul administrrii substanelor. 10

Pentru a obine rezultate corecte i pentru a reduce numrul factorilor care ar putea influena desfurarea experimentului (experienelor), protocolul experimental trebuie s fie complet, riguros i s corespund designului experimental stabilit. Toate persoanele implicate n efectuarea experimentului trebuie s cunoasc protocolul experimental i sarcinile care le revin (pentru a evita ncurcturile !!! )

g. Efectuarea experimentului i colectarea datelor

Dup stabilirea designului i protocolului experimental, se poate trece la realizarea efectiv a experimentului/experienei. Experimentele trebuie realizate n condiii standard de mediu n camere special amenajate n acest scop. Toate manevrele (administrarea substanelor, msurarea parametrilor, etc.) trebuie realizate de persoane calificate care cunosc bine protocolul experimental i este recomandat ca o anumit manevr s fie efectuat de o singur persoan. Animalele de laborator trebuie manipulate cu blndee (pentru a nu le induce un stress suplimentar) de persoane crora le place lucrul cu animale de laborator. Msurarea parametrilor trebuie realizat cu rigurozitate i conform definiiilor din protocolul experimental.

Exemple de modele experimentale utilizate pentru testarea a diferitor clase de medicamente

Conform definitiei, modelul experimental presupune inducerea unui proces patologic la animalul de laborator. Cu ajutorul modelelor experimentale se testeaza diferite efecte ale medicamentelor.

Medicamentele analgezice testarea acestei clase de medicamente presupune inducerea durerii la animalul de laborator prin diferite procedee si observarea efectului medicamentului testat asupra durerii. Testul torsiunilor presupune inducerea durerii prin aplicarea unui stimul chimic Injectarea intraperitoneala la oareci, a unei substane iritante (fenilquinona sau acid acetic diluat), provoac micri reflexe de contorsionare a trunchiului animalului ca manifestare a durerii profunde. In acest test, efectul analgezic al unei substane administrate n prealabil, se manifest prin scderea numrului de torsiuni efectuate de animalele testate sau chiar inhibarea complet a producerii lor. Se consider torsiune : ntinderea animalului, urmat de torsiunea trunchiului, retracia abdomenului i opistotonus, astfel nct trenul posterior apas suprafaa pe care se afl animalul. O substanta cu efect analgezic scade numarul de torsiuni efectuate.
11

Testul placii incalzite presupune inducerea durerii prin aplicarea unui stimul termic. Animalul este plasat pe o plac nclzit la aproximativ 55C, temperatura ce trebuie meninut constant n timpul experimentului. Timpul de reacie se msoar n momentul n care animalul atinge placa i pn cnd ncepe s-i ling labele sau s sar. Un medicament analgezic creste timpul pana la aparitia primelor semne de disconfort.

Medicamente antiinflamatorii testarea acestor medicamente presupune producerea unei

zone de inflamatii prin diferite metode. Testul cu caragenina metoda pletismometrica - inflamaia este produs prin injectarea de carageenina la nivel plantar. Se msoar volumul edemului inflamator cu ajutorul unui pletismometru. Administrarea unui medicament antiinflamator va scadea volumul zonei inflamate.

Medicamente sedative pentru testarea acestor medicamente se poate folosi un test care permite masurarea activitatii locomotorii stiindu-se ca sedativele scad acest tip de activitate. Testul de explorare simpla - permite msurarea activitii motrice in situaii libere a fiecarui animal de laborator (oareci). Se foloseste o cutie de plexiglas, transparenta pe a carei podea sunt marcate 20 de carouri cu latura de 8 cm (4 x 5 carouri). Fiecare soarece estet pus ntr-un col al cutiei (acelai col pentru toi oarecii) i timp de 5 minute se numr carourile prin care oarecele trece cu toate cele 4 lbue. Un medicament sedativ scade numarul de carouri parcurse de soarecele tratat. Medicamente anxiolitice animalul de laborator este pus in situatii cunoscute a induce o stare
de anxietate. Testul labirintului suspendat se bazeaza pe frica de inaltime si spatii deschise a soarecilor. Se foloseste un dispozitiv alcatuit din 4 brate perpendiculare. 2 brate sunt inchise au o platforma inconjurata de pereti, iar celelalte 2 brate sunt deschise sunt formate doar din platforma. In mod normal un soarece va explora mult mai mult timp bratele inchise decat cele deschise. Un medicament anxiolitic scade anxietate produse de spatiile deschise si inaltime astfel incat soarecele va petrece un timp mai mare in bratele deschise.

Medicamentele antiepileptice se induc convulsii animalului de laborator prin stimulare cerebrala electrica sau chimica (pentetrazol). Antiepilepticele impiedica producerea convulsiilor induse electric sau chimic. Medicamentele antidiabetice testarea lor presupune inducerea diabetului zaharat (DZ) la
animalul de laborator. In prezent exista modele experimentale atat pentru diabetul zaharat de tip I cat si pentru cel de tip II. Evaluarea antidiabeticelor urmareste efectul acestora asupra simptomelor DZ (polifagie, polidipsie, poliurie, scadere ponderala, etc.) sau asupra modificarilor metabolice ce apar caracteristic in DZ. De exemplu, administrarea de aloxan la sobolan determina distrugerea selectiva a celulelor beta-pancreatice cu producerea DZ de tip I.

12