You are on page 1of 21

Penerapan Rekayasa Genetik Teknik DNA Rekombinan dalam Bidang Kesehatan

1. Pendahuluan 1.1 Latar Belakang Dewasa ini kemajuan teknologi dalam suatu ilmu pengetahuan telah berpengaruh pada kedalaman penelitian suatu ilmu. Prosedur baru mengantikan prosedur lama sehingga pekerjaan yang dulunya sulit dan lama menjadi sangat mudah dan cepat. Inti teknologi biologi molecular dipengaruhi oleh perkembangan teknik dari berbagai bidang. Sebagai contoh, sekuensing DNA dan sekuensing protein, amplifikasi fragmen DNA dengan P !, atau identifikasifragmen DNA atau molekul !NA dengan pelacak, telah menjadi pekerjaan rutin pada penelitian biologi molecular. Setiap prosedur ini diperoleh dari informasi yang diperoleh dari penelitian sifat dna, replikasi DNA dan protein. Prosedur kerja ini telah menjadi bagian dari rekayasa genetic yang digunakan untuk mengisolasi, karakterisasi, manipulasi dan pemindahan suatu fragmen DNA. 1.2 Skenario D "en bagi protein P diisolasi dan sekuens DNA#nya telah ditentukan. "en tersebut ditemukan mengandung $.%%% bp sekuens pengkode dan dua situs en&im retriksi 'co!I,#"AA(( #. Satu diantara kedua situs tersebut terletak $)% bp kearah dalam gen dari kodon start dan satunya lagi $)% bp kearah dalam dari kodon stop *lihat ilustrasi dibawah ini+. (elah ditemukan suatu protein P defektif, dan gennya pun telah diklona serta di# sequencing. Dalam gen yang abnormal, salah satu sekuens tersebut telah berubah menjadi , " A(( #.

-ita ingin tahu apakah sel#sel janin mengandung gen normal atau abnormal. .adi, DNA dari sel#sel janin dipotong dengan 'co!I dan fragmen#fragmennya dipisahkan pada gel agarosa. -emudian, fragmen# fragmen itu ditransfer ke sebuha membrane nilon. Probe bagi gen normal berhibridisasi ke sebelah dalam fragmen 'co!I /%% bp dan juga akan berhibridisasi dengan sekuens gen abnormal pada daerah yang sama. 0kuran fragmen#fragmen DNA janin bisa diestimasi dengan cara

melakukan running *melanjutkan fragmen DNA pada gel agarosa+, bersama fragmen#fragmen DNA yang diketahui ukurannya pada gel yang sama.

1.3 Sasaran Belajar

# # # # #

1ahasiswa mampu mengerti dan memahami definisi gen. 1ahasiswa mampu mengerti dan memahami struktur gen. 1ahasiswa mampu mengerti dan memahami pengertian, teknik, dan tujuan dari DNA rekombinan. 1ahasiswa mampu mengerti dan memahami pengertian, teknik, dan tujuan dari rekayasa genetik. 1ahasiswa mampu mengerti dan memahami pengertian dan penyebab dari mutasi.

2.

si

!"#" $ind $ap

De%inisi

Struktur

G&N

Rekayasa Genetik

DNA Rekombinan

De%inisi Teknik Tujuan

De%inisi Teknik $an%aat Tujuan

!"!" Pembahasan

!"!"#" Gen

!"!"#"#" De%inisi Gen Istilah gen diciptakan oleh 2. .ohannsen pada tahun $3%3. "en adalah suatu unit instruksi untuk menghasilkan atau mempengaruhi suatu sifat herediter tertentu. "en terdiri dari DNA yang diselubungi dan diikat oleh protein. Secara kimia dapat disebut bahwa unit informasi genetic adalah DNA. Penelitian 1endel menunjukkan bahwa sebuah gen adalah suatu factor diskrit yang mengontrol suatu fenotipe tertentu. 2alaupun sifat fisik gen belum berhasil dipahami sebelum pertengahan abad kedua puluh, penelitian para ahli genetika menetapkan gen sebagai unit biologis dasar hereditas. Penelitian# penelitian yang dilakukan belakangan menunjukkan bahwa gen terdiri atas DNA, bukan protein. Salah satu konsep paling awal mengenai kerja gen untuk menjelaskan kelainan#kelainan metabolic pada manusia menyatakan bahwa masing#masing gen bertanggung jawab bagi sebuah reaksi en&imatik spesifik.$

!"!"#"!" Struktur Gen Struktur Gen Prokariot Secara umum gen prokariot tersusun atas beberapa bagian penting yaitu4 promoter, bagian structural, dan terminator. Secara skematis, struktu gen pada prokariot secara umum dapat dilihat pada gambar. (ranskripsi diawali dari nukleotida yang terletak beberapa basa di sebelah hulu dari gen structural. 0jung gen structural berupa kodon S(5P *(AA,(A", atau ("A+, tetapi transkripsi dilakukan sampai beberapa basa di sebelah hilir dari kodon S(5P yaitu sampai pada daerah terminator. $

"ambar $. Struktur "en Prokariot $

Struktur Gen pada $anusia '&ukariot( 1anusia memiliki banyak sekali gen#gen, dan kumpulan dari gen#gen ini disebut genom yang berada dalam sebuah kromosom. Secara umum struktur utama dari gen manusia adalah DNA. -ebanyakan gen manusia umumnya terdiri dari Sembilan ekson per gen, walaupun beberapa lebih. Saat gen berekspresi !NA mensintesis salinannya pada gen yang menyebabkan intron sama dengan ekson, peristiwa ini disebut spicing.Perbedaan umum gen manusia yaitu oleh adanya 678 dan 673#$, karena hanya terdapat segmen gen saja, sedang pada indi9idu sel ( segmen gennya saling berhubungan pada 9ariasi combinasi yang nantinya malah menghasilkan fungsi reseptor yang berbeda. $

"ambar 7. Struktur "en pada 1anusia $ Dari seluruh pembahasan diatas dapat diketahui bahwa struktur umum pada gen manusia adalah DNA dan !NA, sedangkan 9ariasi#9ariasi yang ada hanyalah bagian dari keseluruhan akti9itas genom. !"!")" DNA Rekombinan !"!")"#" De%inisi DNA Rekombinan DNA rekombinan adalah DNA yang mengalami perubahan karena penyisipan suatu sekuens deoksinukleotida yang sebelumnya tidak terdapat dalam molekul DNA yang sudah ada dengan cara en&imatik atau kimiawi. 7 DNA rekombinan *rDNA+ adalah bentuk DNA buatan yang dibuat dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang tidak akan biasanya terjadi bersama#sama.: Dalam hal modifikasi genetik, itu adalah diciptakan melalui pengenalan DNA yang rele9an ke dalam DNA organisme yang ada, seperti plasmid bakteri, untuk kode untuk atau mengubah sifat berbeda untuk tujuan tertentu, seperti resistensi antibiotik. Ini berbeda dari rekombinasi genetika dalam hal itu tidak terjadi melalui proses alam dalam sel, tetapi direkayasa. Sebuah protein rekombinan adalah protein yang berasal dari DNA rekombinan. !"!")"!" Teknik Teknologi DNA rekombinan (eknologi DNA rekombinan telah mungkinkan bagi kita untuk4 mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan. .adi, (eknologi DNA !ekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen#gen di dalam tabung reaksi. (eknik#teknik tersebut meliputi4 # (eknik untuk mengisolasi DNA. # (eknik untuk memotong DNA. # (eknik untuk menggabung atau menyambung DNA. # (eknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup. :,;

Teknik Blotting 0ntuk melihat potongan DNA atau !NA spesifik di antara ribuan molekul <pencemar= diperlukan perpaduan sejumlah teknik yang secara kolektif disebut blot transfer.

"ambar :. Prosedur Blot Transfer 7 Pada Southern *DNA+ blot transfer, DNA yang diisolasi dari suatu sel atau jaringan dicerna dengan satu atau lebih en&im restriksi. ampuran ini diteteskan ke dalam sebuah sumur pada gel agarosa atau poliakrilamid dan dipajankan dengan arus listrik searah. DNA, karena bermuatan negatif, akan bermigrasi kea rah anoda> fragmen lebih kecil akan bergerak paling cepat. Setelah waktu tertentu, DNA akan mengalami denaturasi akibat pajanan terhadap basa ringan dan dipindakan ke atas kertas nitroselulosa atau nilon, dalam suatu replica yang identik dengan pola pada gel, dengan menggunakan teknik blotting yang dirancang Southern. DNA terikat pada kertas karena pajanan terhadap panas, dan kertas kemudian mengalami pemajanan terhadap pelacak cDNA berlabel, yang berikatan dengan fragmen komplementer pada filter. Setelah dicuci bersih, kertas dipajankan dengan film sinar ? yang diciptakan untuk mengungkapkan beberapa pita spesifik yang sesuai dengan fragmen DNA yang dikenali oleh sekuens di pelacak cDNA. Pada hakikatnya baik !NA maupun Northern, teknik blot-nya serupa. Pada !NA dilakukan elektroforesis sebelum blot transfer. @al ini memerlukan beberapa tahap berbeda dengan tahapan yang dilakukan pada pemindahan DNA, terutama untuk memastikan bahwa !NA tetap utuh, dan umumnya agak lebih sulit. Pada protein, atau Western, blot, protein dielektroforesis dan dipindahkan ke nitroselulosa dan kemudian dilacak dengan antibody spesifik atau molekul pelacak lain. Pada kasus Southwestern blotting, suatu protein blot tang serupa dengan yang diperlihatkan di bawah Western dipajankan dengan asam nukleat berlabel, dan kompleks protein#asam nukleat yang terbentuk kemudian dideteksi dengan autoradiografi. 7 7

&lektro%oresis 'lektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul dalam suatu campuran di bawah pengaruh medan listrik. 1olekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh, jika dua molekul mempunyai masa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke electrode. 'lektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi, danpemurnian fragmen DNA. Selain itu elektroforesis gel poliakrilamid dapat juga digunakan untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian protein. (eknik ini merupakan teknik sederhana, cepat dan dapat memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradien. :,; &lektro%oresis Gel Agarosa Agarosa, yand disari dari ganggang laut, merupakan polimer dengan dasar struktur D#galaktosa dan :,A#anhidroB#galaktosa. "el agarosa mempunyai daya pemisahan lebih rendah jika dibandingkan dengan gel poliakrilamid, tetapi mempunyai rentang pemisahan lebih besar. DNA dari 7%% basa sampai )% kilobasa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. "el agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi hori&ontal dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap. :

"ambar ;. Alat 'lektroforesis "el Agarosa : DNA campuran dimasukkan dalam sumuran gel. DNA bermuatan negatif bergerak kekutub positif. Cragmen DNA berukuran pendek bergerak lebih cepat daripada yang lebih panjang.

"el agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dalam buffer dan kemudian dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. .ika medan magnit di berikan antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada p@ netral, bergerak ke anoda. -ecepatan mifrasi ini ditentukan oleh ukuran *panjang+ DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan yang digunakan.
:,;

(eknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang terdapat pada bakteri. @asil Percobaan Bederberg dan (atum *$3;A+ menunjukkan bahwa bakteri mempunyai mekanisme seksual. 1ekanisme seksual pada bakteri ini menyebabkan terbentuknya kombinasi gen#gen yang berasal dari dua sel yang berbeda. 1ekanisme seksual pada bakteri ini merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya. .adi mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif *tidak menghasilkan anak atau &uriat+. ; (ransfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. # Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel *sel donor+ ke dalam sel bakteri lainnya *sel resipien+ melalui kontak fisik antara kedua sel. # Trans%ormasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. Ingat4 "riffith *$378+, A9ery dkk *$3;;+ # Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan fage. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat ber#integrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinan. ; Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat# perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah4 en&im restriksi, en&im DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, en&im transkripsi balik, pelacak DNAD!NA. # &n*im restriksi digunakan untuk memotong DNA # &n*im DNA ligase digunakan untuk menyambung DNA # Plasmid digunakan sebagai 9ektor untuk mengklonkan gen atau mngklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri.

#Transposon digunakan sebagai alat untuk mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda.

melakukan

# Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan. # &n*im traskripsi balik digunakan untuk membuat DNA berdasarkan !NA. # Pela+ak DNA , RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. 7,; Eerdasarkan mekanisme bakteri, perangkat bakteri, dan beberapa teknik diatas, DNA rekombinan dapat dibuat paling tidak melalui tiga pendekatan, yaitu4 $+ 1engestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total menjadi fragmen#fragmen, memilih fragmen yang dikendaki, mengklonkan fragmen yang telah terpilih, 7+ 1engestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total menjadi fragmen#fragmen, mengklonkan semua fragmen DNA pada 9ektor yang sesuai, menguji setiap klon untuk mendapatkan gen yang diinginkan, :+ Sintesis gen atau fragmen DNA yang diinginkan secara langsung dan mengklonkan gen atau fragmen DNA hasil sintesis. :,;

10

"ambar ). Prosedur -loning :,; !"!")")" $an%aat Teknologi DNA Rekombinan (eknologi DNA !ekombinan telah memberikan banyak manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupan manusia sehari#hari. Eeberapa jenis obat#obatan, 9aksin, bahan pangan, bahan pakaian dan lainnya telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi DNA !ekombinan. Dalam kehidupan kita sehari#hari, secara langsung maupun tidak langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan hasil penggunaan teknologi DNA !ekombinan. ontoh4 insulin telah digunakan untuk mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada manusia diobati dengan insulin manusia. Saat ini insulin manusia telah berhasil diproduksi secara masal dengan menggunakan bakteri. -emampuan bakteri untuk memproduksi insulin manusia ini adalah karena manusia telah berhasil memasukkan dan mengintegrasikan gen yang menyandikan insulin manusia kedalam genom bakteri. ontoh lainnya adalah kapas transgenik. -apas transgenik pernah ramai dibicarakan di media masa kita pada awal abad 7$ ini. Salah satu kapas transgenik adalah kapas#bt. (anaman kapas#bt telah mengandung gen penyandi toksin yang berasal dari bakteri Bacillus turingiensis *Et+. (oksin tersebut dapat membunuh hama kapas sehingga kapas#bt tersebut tahan terhadap serangan hama. Eakteri penghasil insulin dan tanaman kapas#bt tersebut merupakan sebagian dari hasil rekayasa yang dilakukan manusia terhadap makhluk hidup dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan. ) !"!")"-" Tujuan Penerapan Teknologi DNA Rekombinan Isolasi gen spesifik dari genom keseluruhan memerlukan suatu teknik yang akan membedakan satu bagian dari sejuta. Identifikasi suatu regio regulatorik dengan panjang yang hanya dapat mencapai $% pb memerlukan sensiti9itas satu bagian per : F $%8, suatu penyakit seperti anemia sel sabit disebabkan oleh perubahan satu basa, atau satu bagian dari : F $%3. (eknologi DNA rekombinan cukup kuat untuk melaksanakan semua tugas ini. 7 11

Pemetaan Gen $enentukan Lokasi Gen Spesi%ik di Kromosom Tertentu Penentuan lokasi gen dapat mendefinisikan peta genom manusia. @al ini sudah mengahasilakn informasi bermanfaat dalam mendefinisikan penyakit manusia. @ibridisasi sel somatic dan hibridisasi in situ adalah dua teknik yang digunakan untuk melakukan hal ini. Pada hibridisasi in situ, yaitu prosedur yang lebih sederhana dan langsung, ditambahkan suatu pelacak radioaktif ke penyebaran metafase kromosom pada kaca obyek. Fluorescence in situ hybridization (CIS@+ adalah teknik yang sangat sensiti9e juga digunakan untuk tujuan ini. Dengan teknik ini, lokasi gen sering diketahui di pita atau regio tertentu pada kromosom. 7 Protein Dapat Diproduksi untuk Kepentingan Riset dan Diagnosis (ujuan praktis riset DNA rekombinan adalah menghasilkan bahan yang dapat digunakan dalam bidang biomedis. 1emiliki dua manfaat berbeda4 1. Dapat menghasilkan bahan dalam jumlah besar yang tidakdapat diperoleh dari metode pemurnian kon9ensional. 1isalnya interferon, las!inogen acti"ating factor jaringan. 2. Dapat menghasilkan &at yang terdapat pada manusia. 1isalnya insulin, hormon pertumbuhan. 7 Teknologi DNA Rekombinan Digunakan dalam Analisis $olekular Penyakit 1. 6ariasi "en Normal 2. 6ariasi "en yang 1enyebabkan Penyakit 3. 1utasi (itik 4. Delesi, Insersim dan (ata#0lang DNA 5. Analisis Sisilah 6. Diagnosis Pranatal 7. #estriction Frag!ent $ength Poly!or his! *!CBP+ G Polimorfisme Nukletida (unggal *Single %uclotide Poly!or his! *SNP+ 8. Polimorfisme DNA 1iktosatelit

12

9. !CBP G 6N(! dalam -edokteran Corensik 10. (erapi "en 11. @ewan (ransgenik 7,;,) DNA kromoson bakteri dipotong dengan en&im restriksi endonuklease dan disisipkan pada plasmid. -emudia plasmid rekombinan dimaskkan dalam sel inang dan sel yang membawa plasmid rekombinan dimasukkan dalam sel inang dan sel yang membawa plasmid rekombinan diidentifikasi dan ditumbuhkan. # DNA dari organisme donor diekstraksi, dipotong dengan en&im restriksi endonuklease, disambung *ligasi+ dengan dan 9ector sehingga membentuk molekul DNA rekombinan * DNA donor tersisipkan pada DNA 9ector+. DNA rekombinan ini dimasukkan ke dalam sel inang. Pemasukkan DNA ke dalam sel bakteri *&schericia coli' dinamakan transformasi. Sel bakteri yang membawa DNA rekombinan*transforman+ dipisahkan *diseleksi+ dari sel yang tidak membawa 9ector. -emudian sel#sel ini diidentifikasi dan di karakterisasi terhadap sel transforman yang membawa DNA yang diinginkan. .ika diperlukan, DNA rekombinan dapat dimanipulasi sehingga gen yang dibawa itu dapat terekresi menghasilkan protein dalam jumlah banyak.

&n*im Restriksi 'n&im restriksi digunakan untuk memotong DNA. Pada tahun $3A%, 2erner Arber G @amilton Smith menemukan en&im dari mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda. 'n&im tersebut sekarang dikenal dengan en&im retriksi atau endonuklease restriksi. 'n&im tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya ; sampai dengan A pasang basa. 'n&im tersebut sekarang dikenal dengan nama en&im restriksi atau en&im endonuklease restriksi. Secara alami, bakteri menghasilkan en&im restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya *yang masuk ke dalam sel bakteri+. Sampai saat ini sudah banyak jenis en&im restriksi yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap en&im restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan en&im tersebut, Setiap en&im restriksi mengenal sekuens dan situs 13

pemotongan yang khas. 'n&im restriksi memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada bagian tertentu. Eagain pada DNA yang dikenai kasi pemotongan oleh en&im restriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan nukleotida *urutan basa+ tertentu yang dikenal oleh en&im restriksi sebagai tempat atau bagian yang aka dipotongnya. 7 (abel $. 'ndonuklease !estriksi (ertentu dan Spesifitas Sekuensnya 7

Salah satu contoh en&im restriksi ini adalah en&im 'co!I yang telah diisolasi pertama kali oleh @erbert boyer pada tahun $3A3 dari bakteri &scherichia coli. 'n&im 'co!I memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah "AA(( *sekuens pengenal bagi 'co!I adalah "AA(( +. Di dalam sekuens pengenal tersebut, en&im 'co!I memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotongpada bagian atau situs antara " dan A. Pada DNA untas ganda, sekuens "AA(( ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. 'n&im 'co!I ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara " dan A. Sebagai akibatnya, potongan# potongan atau fragmen#fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. 0jung seperti ini yang dikenal dengan istilah stic(y ends *ujung 14

tumpang#tindihDujung lengket+ atau blunt ends *ujung tumpul+. 7#;

"ambar A. 0jung Bengket atau Stic(y &nds 7

"ambar /. 0jung (umpul atau Blunt &nds 7

2.2.4. Rekayasa Genetik !"!"-"#" De%inisi Rekayasa Genetik !ekayasa genetik adalah tindakan sengaja untuk memodifikasi DNA *substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas perwarisan sifat+. Dalam arti luas, (ettaman&i melukiskannya sebagai bentuk#bentuk manipulasi dan pergantian tatanan gen dari organisme hidup. !ekayasa genetic adalah suatu teknik bioteknologi yang digunakan untuk mentransfer gen dari suatu organisme ke organisme lain untuk mendapatkan produk baru dengan cara membuat DNA !ekombinan. !ekayasa genetik adalah proses mengidentifikasi dan mengisolasi DNA dari suatu sel hidup atau mati dan memasukkannya dalam sel hidup lainnya. Sebelum dimasukkan, materi genetik tersebut dapat direkayasa di laboratorium. Sering pula dsebut dengan (eknik DNA !ekombinan D(eknik 15

PlasmidD(ransplantasi "en. A !"!"-"!" Teknik Rekayasa Genetik (ahapan dalam !ekayasa "enetik $. Isolasi DNA, 7. 1anipulasi DNA, :. Perbanyakan DNA dengan Polymerase hain !eaction *P !+ ;. 6isualisasi hasil manipulasi DNA, ). DNA rekombinan, A. -loning "en A #" solasi DNA 0ntuk mengeluarkan DNA dari sel maka teknik pemurnian DNA secara biokimia dilakukan dengan merusak dinding sel yang telah dilarutkan dalam larutan penyangga tertentu dengan menggunakan berbagai jenis deterjen. Dengan terbukanya lapisan sel maka DNA dapat dikeluarkan dan diendapkan dengan penambahan alkohol. A,/ !" $anipulasi DNA Eeberapa perangkat penting4 - "unting 0ntuk memotong molekul DNA, dengan menggunakan en&im. 'n&im yang dikenal dengan nama en&im restriksi. BemDperekat 0ntuk menggabungkan molekul DNA, en&im yang berperan adalah en&im ligase. "ergaji 0ntuk membelah molekul DNA, dengan pemanasan atau yang dikenal dengan denaturasi *suhu H 3%I + atau dengan larutan Na5@ *konsentrasi %,; 1+. 7,A,/ )" Perbanyakan DNA dengan P.R Suatu reaksi en&imatis untuk melipatgandakan suatu urutan nukleotida tertentu secara in 9itro. / P.R 'Polymerase Chain Reaction( 16

Poly!erase )hain #eaction *P !+ adalah metode untuk amplifikasi *perbanyakan+ primer oligonukleotida diarahkan secara en&imatik urutan DNA spesifik. (eknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan $%)#$%A#kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada seJuence yang tidak rele9an *misalnya dari total DNA genomik+. Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan P ! adalah memiliki pengetahuan, urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga oligonucleotides tertentu dapat diperoleh. @al ini tidak perlu tahu apa#apa tentang urutan inter9ening antara primer. Produk P ! diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil# panas dari (hermus aJuaticus *(aJ DNA polimerase+ dan menggunakan pengatur siklus termal otomatis *Perkin#'lmerD etus+ untuk menempatkan reaksi sampai :% atau lebih siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan P !, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung di9isualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium. 7,/ P ! *Poly!erase )hain #eaction+ merupakan suatu teknik perbanyakan *amplifikasi+ potongan DNA secara in "itro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in "i"o yang bersifat semi konser9atif. 7 P ! memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel * in "i"o+. Pada proses P ! dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan *templat+ yang mengandung DNA#target *yang akan diamplifikasi+ untuk pembentukan molekul DNA baru, en&im DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat *dN(P+, dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon :K. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara 5@ pada karbon :K dengan gugus )K fosfat dN(P yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dN(P yang dikatalisis oleh en&im DNA polimerase ini berlangsung dengan arah )KL:K dan disebut reaksi polimerisasi. 'n&im DNA polimerase hanya akan menambahkan dN(P yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat. / P ! melibatkan banyak siklus yang masing#masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan *denaturasi+ rantai DNA templat, penempelan * annealing+ pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan * e*tension+ primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh DNA polimerase. 17

Polymerase hain !eaction *P !+ dapat digunakan untuk4 1. 2. 3. 4. Amplifikasi urutan nukleotida. 1enentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi. Eidang kedokteran forensik. 1elacak asal#usul sesorang dengan membandingkan <finger print=. A,/ -" /isualisasi 0asil $anipulasi DNA 0ntuk menganalisis hasil manipulasi DNA dapat dilihat melalui elektroforesis. Pita DNA pada gel dapat dilihat dengan menggunakan berbagai teknik, yaitu sebagai berikut4 - Pemberian &at warna ethidium bromide, - 6isualisasi langsung semua pita DNA di bawah sinar 06 dengan menggunakan alat transiluminator dan dilakukan pada ruangan khusus yang gelap, - @asil 9isualisasi DNA kemudian difoto. / 1" DNA rekombinan - DNA rekombinan merupakan gabungan antara DNA 9ektor dan DNA asing yang merupakan gen target. - Penggunaan teknik DNA rekombinan untuk diagnosis penyakit. - @asil daripada teknologi pengklonan. - (eknik yang terlibat disebut sebagai penjuruteraan genetik . 7 2" Kloning Gen Suatu teknik untuk menghasilkan banyak salinan dari satu gen tunggal, kromosom, atau keseluruhan indi9idu. - -ultur jaringan atau mikropropagasi merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman dengan menempatkan sejumlah kecil sel yang berasal dari tanaman induk yang kemudian ditumbuhkan dalam medium kaya nutrien yang mengandung hormon pertumbuhan. - 0ntuk kloning ini diperlukan plasmid dan en&im untuk memotong DNA, serta en&im untuk menyambungkan gen yang disisipkan itu ke plasmid. /,8 ara 1enyisipkan "en .ika kita ingin memasukkan suatu gen manusia ke dalam sel lain, gen perlu diisolasi, sehingga dapat disisipkan dalam sel baru. ontoh, gen insulin manusia diisolasi kemudian digabungkan dalam sel bakteri '. coli selanjutnya gen yang disisipkan tersebut menyebabkan sel bakteri memproduksi protein insulin manusia, yang dapat diberikan pada penderita diabetes. 7,/,3 18

"ambar 8. !ekayasa "enetik 1. Penyiapan molekul DNA kromosom yang mengandung gen yang akan di# kloning. 2. Pemotongan molekul DNA kromosom, untuk memperkecil ukurannya serta analisa ukuran hasil pemotongan. Pemotongan ini diatur sedemikian hingga fragment molekul DNA *gen+ yang dikehendaki tidak terpotong. 3. Peng#insersi#an Cragment DNA yang mengandung suatu gen yang akan diklon ke suatu molekul DNA sirkular *disebut dengan 9ektor+ untuk menghasilkan suatu molekul DNA rekombinan *chimaera+. 4. Eagaimana memasukkan *insersiDtransformasi+ molekul DNA rekombinan kedalam sel inang *host cell+, umumnya bakteri atau sel hidup lainnya. 5. Eagaimana menumbuhkan sel hasil transformasi pada suatu medium untuk dapat diseleksi lebih lanjut nantinya. 6. Eagaimana 9ektor dengan gen terinsersi *molekul DNA !ekombinan+ menggandakan diri menghasilkan sejumlah kopi yang sama. 7. Eagaimana sel inang membelah diri dan tentunya dengan mengkopi juga seluruh molekul DNA rekombinan yang ada di dalam sel#nya. 8. Setelah sejumlah kali ulangan pembelahan, suatu koloni, atau klon dengan kandungan molekul DNA rekombinan yang sama akan dihasilkan. 9. Setelah itu bagaimana memilih diantara koloni#koloni sel yang tumbuh, $ atau lebih yang mengandung DNA rekombinan yang dimaksud. 7,3 Eagaimana mendapatkan *mengisolasi+ DNA rekombinan dari sel pembawanya untuk diteliti lebih lanjut semisal ditentukan urutan DNA#nya, dan untuk di#insersi#kan ke dalam 9ektor ekspresi sehingga dapat diproduksi lebih banyak. 3 !"!"-")" Tujuan dan $an%aat Rekayasa Genetik 0ntuk memajukan perkembangan teknologi dalam bidang biologi dalam upaya perkembangan ilmu maupun pengobatan. 1anfaat !ekayasa "enetik 1. Pembuatan insulin manusia dari bakteri 19

2. 3. 4. 5.

(erapi gen Pembuatan antibiotik, 9aksin Pembuatan serum -loning

3. Penutup )"#" Pembahasan Skenario

Dapat dilihat bahwa pada gen defektif tidak disebelah kiri tidak mengalami pemotongan oleh en&im restriksi. Di dalam kasus ini en&im restriksi yang digunakan adalah &co#+. Sehingga kemungkinan yang terjadi adalah adanya gen yang abnormal, salah satu sekuens telah berubah menjadi #" A(( # yang seharusnya mengikuti en&im restriksi &co#+-" A(( #, seperti contoh gambar dibawah ini.

Dengan menerapkan rekayasa genetik teknologi DNA rekombinan kita dapat mengetahui suatu DNA itu normal atau abnormal. Seperti dalam kasus kita dapat mengetahui apakah sel#sel janin bersifat normal ataupun abnormal. -arena teknologi DNA rekombinan memiliki banyak manfaat dalam menunjang pemeriksaan kesehatan terutama pada masalah genetic. 3.2. Kesimpulan

Sel normal atau sel yang abnormal dapat diketahui dengan menerapkan teknik DNA rekombinan. Da%tar Pustaka 1. 2. 'lrod SB, Stansfield 2D. "enetika. .akarta4 Penerbit 'rlangga> 7%%/.h./%#$. 1urray !-, "ranner D-, !odwell 62. Eiokimia harper edisi 7/4 "enetika molecular, DNA rekombinan, dan teknologi genomic. .akarta4 Penerbit Euku -edokteran '" > 7%%3.h.;$;#:;. 3. 20 News 1edical. !ecombinant DNA. Diunduh dari http4DDwww.news#

medical.netDhealthD!ecombinant#DNA#2hat#is#!ecombinant#DNA# *Indonesian+.aspF, $; Desember 7%$7. 4. (jahjoleksono A. (eknologi DNA rekombinan. Diunduh dari

http4DDweb.ipb.ac.idDMtpbDfilesDmateriDgenetikaDdnarekombinanDteFtdnarekombi nanpdf.pdf , $; Desember 7%$7. 5. News 1edical. !ecombinant DNA applications. Diunduh dari

http4DDwww.news#medical.netDhealthD!ecombinant#DNA#Applications.aspF, $; Desember 7%$7. 6. 7. 8. Nuwono (. Eiologi molecular. .akarta4 Penerbit 'rlanga> 7%$%.h.$:/#)% hang 2. Eioetika. Nogyakarta4 Penerbit -anisius> 7%%3.h.$$3#7:. Sudjadi. Eioteknologi kesehatan. Nogyakarta4 Penerbit -anisius> 7%%8.h.;)# 3). 9. Fried GH, Hademenos GJ. Schaums outline biologi edisi 2. Jakarta: Penerbit Erlangga; 2006.h.79-86.

21