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TSI Agar Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido

sulfhdrico. Fundamento En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Frmula (en gramos por litro) Extracto de carne 3.0 Pluripeptona 20.0 Cloruro de sodio 5.0 Lactosa 10.0 Sacarosa 10.0 Glucosa 1.0 Sulfato de hierro y amonio 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Rojo de fenol 0.025 Agar 13.0 pH final: 7.3 0.2 Siembra A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio. Incubacin A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis. Resultados 1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. Instrucciones Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolucin total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico. Microorganismo Pico/Fondo Produccin de gas Produccin decido sulfhdrico + + + -

E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603 P. mirabilis ATCC 43071 S. typhimurium ATCC 14028 S. enteritidis ATCC 13076 S. flexneri ATCC 12022 P. aeruginosa ATCC 27853 A: cido K: alcalino Caractersticas del medio Medio preparado: rojo Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.

A/A A/A K/A K/A K/A K/A K/K

+ + + + -

Presentacin x 100g :Cdigo: B02-134- x 500g :Cdigo: B02-134-06 05 LIA: Lisina Hierro Agar Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es

el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro. Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio. Frmula (en gramos por litro) Peptona de gelatina 5.0 Extracto de levadura 3.0 Glucosa 1.0 Lisina 10.0 Citrato de hierro y 0.5 amonio Tiosulfato de sodio 0.04 Prpura de bromocresol 0.02 Agar 15.0 pH final: 6.7 0.2 Siembra Por puncin profunda con aguja de inoculacin. Incubacin En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 C. Resultados 1- Decarboxilacin de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2-Desaminacin de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. Instrucciones Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolucin completa. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncin.

3-Produccin de cido sulfhdrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y fondo) Microorganismos Proteus mirabilis ATCC 43071 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Salmonella enteritidis ATCC 13076 Providencia spp. Citrobacter freundii Morganella spp.* Edwarsiella spp. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922 Color en el pico de Color en la base Ennegrecimiento flauta del tubo del medio Rojo Amarillo Negativo Prpura Prpura Positivo Prpura Prpura Positivo Rojo Amarillo Negativo Prpura Amarillo Positivo Rojo Amarillo Negativo Prpura Prpura Positivo Prpura Prpura Negativo Prpura Prpura Negativo

*Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la lisina. Caractersticas del medio Medio preparado: color violeta. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Presentacin x 100g :Cdigo: B02-106- x 500g :Cdigo: B02-106-06 05 MIO Medio. Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de indol. Fundamento Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y triptena. Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarillo. Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de inoculacin.

Crecimiento Movilidad

Indol

Ornitina decarboxilasa

La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color prpura. El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo. Frmula (en gramos por litro) Dextrosa 1.0 Extracto de levadura 3.0 Peptona 10.0 Triptena 10.0 Clorhidrato de L-ornitina 5.0 Agar 2.0 Prpura de bromocresol 0.02 pH final: 6.5 0.2 Instrucciones Suspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin hasta completa disolucin. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121C.

Siembra A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por puncin profunda con ansa recta. Incubacin En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37 C. Resultados 1-Movilidad: -Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas all de la lnea de siembra. -Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra. 2-Ornitina decarboxilasa: -Resultado positivo: color prpura. -Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violceo en la superficie del medio. 3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. -Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

Microorganismo E. coli ATCC 25922 Bueno K. pneumoniae ATCC Bueno 700603 P. mirabilis ATCC 43071 Bueno

+ +

+ -

+ +

Caractersticas del medio Medio preparado: prpura transparente a ligeramente opalescente. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Presentacin x 100g :Cdigo: B02-163-05

x 500g :Cdigo: B02-163-06

Christensen Medio (Urea Agar Base). Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad uresica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos. Fundamento En el medio de cultivo, la triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentacin de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella. Frmula (en gramos por litro) Triptena 1.0 Glucosa 1.0 Cloruro de sodio 5.0 Fosfato monopotsico 2.0 Rojo de fenol 0.012 Agar 15.0 Instrucciones Suspender 24 g de polvo en 950 ml de agua destilada. Dejar reposar 2 minutos. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 50C y agregar 50 ml de una solucin de urea al 40% previamente esterilizada por filtracin o cloroformo. Fraccionar en tubos de hemlisis y solidificar en pico de flauta con fondo profundo.

pH final: 6.8 0.2

Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubacin. Se rEcomienda no punzar la capa profunda para controlar el color. Incubacin En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 C. Resultados Microorganismo Proteus mirabilis ATCC 43071 K. pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922 S. flexneri ATCC 12022 S. typhimurium ATCC 14028 Actividad uresica Positiva Positiva dbil Negativa Negativa Negativa Color del medio Rojo-Rosado Rojo-Rosado Amarillo Amarillo Amarillo

Limitaciones -Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, como ser Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, viran al color rojo-rosado de todo el medio de cultivo luego de varios das de incubacin. -No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone facilmente. Caractersticas del medio Medio preparado: amarillo Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Presentacin x 100g :Cdigo: B02-109-05 Simmons Citrato Agar Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa. Fundamento En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de

x 500g :Cdigo: B02-109-06

nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa. Frmula (en gramos por litro) Citrato de sodio 2.0 Cloruro de sodio 5.0 Fosfato dipotsico 1.0 Fosfato monoamnico 1.0 Sulfato de magnesio 0.2 Azul de bromotimol 0.08 Agar 15.0 Instrucciones Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar en posicin inclinada.

pH final: 6.9 0.2 Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar. Incubacin A 35-37 C, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 das de incubacin. Resultados -Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Microorganismo Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 S. typhimurium ATCC 14028 E. coli ATCC 25922 S. flexneri ATCC 12022 Citrato permeasa Positivo Positivo Negativo Negativo Color del medio Azul Azul Verde Verde

Limitaciones -Si se usa un inculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualizacin azul de un resultado positivo. -Inculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.

-Cuando se siembra una serie de pruebas bioqumicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculacin antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgnica puede originar resultados falsos positivos. Caractersticas del medio Medio preparado: verde. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C. Presentacin x 100g :Cdigo: B02-132-05

x 500g :Cdigo: B02-132-06

XLD ESPECIFICACIONES El Agar XLD (por sus siglas Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es utilizado para el aislamiento y diferenciacin de bacilos entricos Gram negativos, especialmente del gnero Shigella y Providencia. El Agar XLD fue desarrollado por Taylor para incrementar la eficiencia en el aislamiento e identificacin de patgenos entricos, particularmente de Shigella. Los patgenos son diferenciados no slo de los no patgenos fermentadores de lactosa, sino tambin de varios no patgenos no fermentadores de la lactosa o sacarosa. Este medio presenta la ventaja de facilitar el crecimiento de grmenes exigentes ya que otros medios contienen inhibidores excesivamente txicos. El Agar XLD est incluido en la USP para los mtodos de lmite microbiano y las pruebas de presencia-ausencia de Salmonella. En este medio el extracto de levadura provee la fuente de nitrgeno, carbono, vitaminas y cofactores. La xilosa, lactosa y sacarosa son los carbohidratos fermentables. El tiosulfato de sodio y el citrato frrico son adicionados para ver la produccin de H2S. El rojo de fenol acta como indicador. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el agar es adicionado como agente solidificante. Xilosa 3.5 Extracto de Levadura 3.0 L- Lisina 5.0 Rojo de Fenol 0.08 Lactosa 7.5 Desoxicolato de Sodio 2.5 Sacarosa 7.5 T iosulfato de Sodio 6.8 Cloruro de Sodio 5.0 Agar Bacteriolgico 13.5 Citrato Frrico de Amonio 0.8 pH 7.4 0.2

Mtodo: Suspender 55g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Evitar el sobrecalentamiento. Enfriar a una temperatura entre 45- 50C y vaciar en placas de Petri estriles. Procedimiento: Las muestras fecales o hisopos rectales pueden ser sembradas directamente en las placas. Las muestras pueden ser enriquecidas previamente utilizando Caldo Tetrationato o Caldo Selenito. La degradacin de la xilosa, lactosa y sacarosa genera la produccin de cido cambiando el color del medio de rojo a amarillo. La produccin de H2S bajo condiciones alcalinas, da colonias con el centro negro. Esta reaccin es inhibida en condiciones cidas. La descarboxilacin de la lisina en ausencia de fermentacin de lactosa o sacarosa, ocasiona la reversin del medio a alcalino y el color del medio regresa a rojo. Almacenamiento: 2-30C. Caducidad: 5 aos en frasco cerrado. AGAR SS: SALMONELLA SHIGELLA AGAR. Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. Fundamento Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo (B02-120-05). Frmula (en gramos por litro) Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 5.0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares 8.5 Citrato de sodio 8.5 Tiosulfato de sodio 8.5 Citrato frrico 1.0 Agar 13.5 Verde brillante 0.00033 Rojo neutro 0.025 pH final: 7.0 0.2 Instrucciones Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullicin durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

Siembra Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo. Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. (B02-101-05) o de agar Mac Conkey (B02-114-05). Incubacin Durante24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis. Resultados Microorganismos Salmonella typhimurium ATCC 14028 Shigella flexneri Shigella sonnei Proteus mirabilis ATCC 43071 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Colonias Transparentes, centro negro Incoloras Incoloras Transparentes, centro negro Rosadas a rojas Rosadas cremosas y mucosas Incoloras, de muy escaso crecimiento

Caractersticas del medio Medio preparado: rojo naranja. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C. Presentacin x 100g :Cdigo: B02-138-05

X 500g :Cdigo: B02-138-06

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