SALMONELLA

OBJETIVOS
Conocer el fundamento de la reaccin de Widal. Realizar la prueba de Widal. Identificar los diferentes anticuerpos presentes en el suero. Hallar el ttulo de anticuerpos presentes en el suero. Interpretar los resultados y ttulos encontrados.

SALMONELLA

A diferencia de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae, Salmonella no son habitantes normales del intestino humano (excepto en portadores despus de la infeccin). Causan enfermedad diarreica, que puede ser grave. Se trasmiten desde los animales y los productos de estos hacia el hombre, en el cual producen enteritis, infeccin general y fiebre intestinal. Son bacilos gramnegativos, mviles, no esporulados. Todos excepto S. typhi, carecen de cpsula. Capaces de respiracin aerobia y anaerobia.

SALMONELLA

Sus antgenos son: Los antgenos O, estn constituidos por los polisacridos de la pared celular. Flagela H Capsular Vi (virulencia).

IDENTIFICACION DE LABORATORIO

Existe una serie de tcnicas utilizadas en microbiologa distintas de las tcnicas clsicas de cultivo e identificacin. El diagnstico de una infeccin por Salmonella se realiza aislando este microorganismo mediante cultivos. Su aislamiento a partir de sangre, orina y heces indica el diagnstico. Toleran la bilis. No delicados. Oxidasa negativa. No fermentan la lactosa. Producen cido y gas a partir de la glucosa (excepto S. typhi, que es anaerognico). La identificacin final de las cepas aisladas se basa en las caractersticas bioqumicas y las pruebas de aglutinacin con antisueros monoespecficos, estas pruebas constituyen el mtodo de diagnstico serolgico ms empleado.

IDENTIFICACION DE LABORATORIO

Sobreviven a la congelacin en el agua durante periodos prolongados. son resistentes a ciertos productos qumicos (verde brillante, desoxicolato)que inhiben a otras bacterias intestinales, por lo que son de utilidad su inclusin en los medios con la finalidad de aislar salmonellas. Medios de cultivo selectivos para el aislamiento de Salmonella: Agar Desoxicolato Citrato, Salmonella Shigella, Hektoen Entrico, Xilosa Lisina Desoxicolato, Sulfito Bismuto. La serotipificacin y la tipacin con fagos es til para investigar los brotes epidmicos.

Agar Desoxicolato Citrato ADC

El medio contiene 3 veces mayor cantidad de sales biliares que el agar Mac Conkey, es muy til para seleccionar especies de Salmonella en muestras abundantemente contaminadas con bacilos coliformes u organismos grampositivos. Los citratos sdico y frrico retardan el desarrollo de Escherichia. Coli. La lactosa es el nico hidrato de carbono. El rojo neutro detecta la produccin de cido. Las colonias de E. coli son pequeas y rojo intenso. Los no fermentadores de lactosa, forman colonias grandes incoloras. Salmonella, Shigella, Proteus.

Agar Salmonella Shigella

El agar SS es un medio altamente selectivo, que inhibe el desarrollo de la mayora de los coliformes y permite el crecimiento de Salmonella y Shigella. La alta concentracin de sales biliares y citrato de sodio inhibe a todas las bacterias Grampositivas y muchas Gramnegativas, incluyendo a los coliformes. La lactosa es el nico carbohidrato y el rojo neutro detecta la produccin de cido. El tiosulfato de sodio es una fuente de S, permitiendo la deteccin del H2S por el precipitado negro formado con el citrato frrico. Colonias incoloras, son lactosa (-) y H2S (-), Salmonella y Shigella. Las Colonias lactosa (+) se colorean de rojo, Escherichia coli. Colonias incoloras con centro negro, son lactosa (-) y H2S (+), Proteus, Salmonella.

Agar Hektoen Entrico H.E.

La alta concentracin de sales biliares inhibe el desarrollo de todas las bacterias Grampositivas y retarda el desarrollo de muchas cepas de coliformes. La fucsina cida reacciona con el azul de timol, virando al amarillo al bajar el pH del medio por accin de los cidos que se pueden producir a partir de tres hidratos de carbono (Lactosa, Sacarosa y Salicina). El tiosulfato de sodio es una fuente de S y la produccin de H2S se detecta por el citrato frrico. Lactosa (+) forman colonias color naranja brillante a rosa salmn. Escherichia coli. Lactosa (-) muestran colonias semitranslcidas de color verde azulado Colonias negras, productoras de H2S. Salmonella.

Agar Sulfito Bismuto S.B.

El agar SB es altamente selectivo para Salmonella typhi y es uno de los medios ms sensibles para detectar H2S producido por este organismo. Este medio contiene: glucosa en la frmula: la fermentacin de glucosa produce reduccin del sulfito, con formacin de sulfuro de hierro y colonias negras. El metal pesado bismuto y el verde brillante son inhibidores del desarrollo de todas las bacterias Grampositivas y de la mayora de las Gramnegativas, excepto la Salmonella. Las colonias de Salmonella typhi son negras con brillo metlico. Las colonias de Salmonella enteritidis forman colonias negras y sin brillo. Las colonias de Salmonella paratyphi forman colonias verdosas.

IDENTIFICACION DE LABORATORIO

La deteccin de anticuerpos circulantes (prueba de Widal) puede ayudar en el diagnstico de la fiebre entrica. Es importante el estadio de la enfermedad para valorar el significado de un ttulo elevado de aglutininas. Los bacilos tficos pueden aislarse en la sangre, las heces y la orina, antes que la prueba de aglutinacin de una reaccin positiva. A medida que aumenta el ttulo de aglutininas, disminuye el nmero de cultivos positivos. Las reacciones de aglutinacin tienen por finalidad demostrar la presencia de anticuerpos en el suero del enfermo a partir de la primera semana de la enfermedad. La demostracin de anticuerpos en el suero contra las especies de Salmonella, resulta til para el diagnstico de las formas tifoideas y puede constituir el nico resultado positivo de laboratorio, si los mtodos de cultivo fallan.

REACCION DE WIDAL
FUNDAMENTO

Se trata de una reaccin de aglutinacin, donde los anticuerpos actan sobre los antgenos constituidos por bacilos muertos. Los anticuerpos se denominan aglutininas y los antgenos bacilares aglutingenos. La reaccin de Widal es un mtodo serolgico que se utiliza frecuentemente para el diagnstico de la fiebre tifoidea, de las fiebres intestinales y de la fiebre ondulante. La reaccin mide el ttulo del suero para suspensiones de grmenes conocidos. La reaccin de Widal puede realizarse en placa de vidrio (microscpica) o en tubos (macroscpica).

REACCION DE WIDAL
INTERPRETACION DE RESULTADOS

La reaccin de Widal se considera positiva cuando la aglutinacin se observa en una dilucin 1/80 o mayor, lo que indicara infeccin tifoidea, siempre que el paciente no haya recibido vacunas antitficas. La reaccin negativa no excluye el diagnstico. Por lo comn la aparicin de las aglutininas especficas ocurre entre el 6 y 8 da de evolucin de la enfermedad y as el ttulo aglutinante alcanza la mayor intensidad al llegar al vigsimo da, comenzando luego el desarrollo paulatino. En algunos casos, la persistencia de un ttulo aglutinante elevado se prolonga durante un lapso muy grande. Ttulos pequeos de aglutinacin que pueden llegar hasta 1/40 se observan en otras infecciones y en la tuberculosis.

REACCION DE WIDAL
INTERPRETACION DE RESULTADOS

La reaccin de Widal es intil para efectuar el diagnstico temprano de la fiebre tifoidea, puesto que la positividad no se obtienen antes de los 4 a 8 das de enfermedad. Por eso se aconseja recurrir en principio al hemocultivo o urocultivo. Cuando transcurre cierto tiempo el hemocultivo o urocultivo dejan de ser adecuados, y aumenta la importancia de la reaccin de Widal. La vacunacin antitfica puede ser responsable de reacciones positivas durante varios aos. Pueden observarse reacciones inespecficas con antgeno de Salmonella O grupo D en suero de pacientes con influenza. Tambin se encontraron reacciones inespecficas en pacientes con enfermedad heptica crnica activa y consumidores de narcticos.

REACCION DE WIDAL
INTERPRETACION DE RESULTADOS

Los anticuerpos H aparecen hacia el 10-12 da y se elevan a cifras muy superiores (1/160). Despus de la curacin, disminuyen lentamente y persisten durante meses y aos, por lo que pueden encontrarse ttulos altos en los vacunados o en antiguos tifoideos con enfermedades interecurrentes. Los anticuerpos O aparecen hacia el 8 da, su tasa se eleva progresivamente para alcanzar cifras del orden de 1/320 en el perodo de estado. Despus de la curacin, disminuyen rpidamente y desaparecen en el curso de algunas semanas. Las aglutininas O, en cambio, tienen gran valor a ttulos bajos. La presencia de una tasa significativa de anticuerpos O, tiene mucho ms valor para el diagnstico de una infeccin actual o reciente que la presencia de anticuerpo H, que pueden no ser ms que la prueba de una infeccin antigua.

REACCION DE WIDAL
CURVA DE EVOLUCIN DE LAS TASA DE ANTICUERPOS pg 130

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PREPARACION DEL ANTIGENO
1. ANTIGENOS FLAGELARES (H) Se siembra en frasco con caldo una cepa activa y mvil de Salmonella typhi, incubando durante 24 horas a 37 C. Luego se pasan unas dcimas de ml del cultivo a tubos inclinados o frascos con agar, continuando la incubacin a 37 C de 18 a 24 horas. El cultivo desarrollado se lava con 5 a 10 ml de solucin salina estril formolada (1.4% de formol). Se agita y se coloca en refrigerador a 6-8 C. Se inspeccionan a diario los cultivos para cerciorarse de la esterilidad y se preparan diluciones de la suspensin que contengan 1,000 millones de microorganismos por ml, conservndose en frascos estriles, oscuros y refrigerados.

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PREPARACION DEL ANTIGENO
2. ANTIGENOS SOMATICOS (O) Se procede igual pero partiendo de cepas inmviles, suspendindose los microorganismos en solucin salina fenolada (0.5% de fenol). Despus de agregar la mitad de volumen de alcohol absoluto se incuba a 37 C, 18 a 24 horas, comprobndose luego la esterilidad del medio. Se lleva la concentracin a 1,000 millones de grmenes por ml con una concentracin alcohlica entre 2.5 y 4%.

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PROCEDIMIENTO
1. MUESTRA Suero limpido, no debe inactivarse ni calentarse ya que los anticuerpos son termolbiles. 2. REACTIVOS Antgenos Febriles Salmonella, suspensin de antgenos bacterianos. Antgenos Paratyphoid A (Salmonella antgeno flagelar a). Antgenos Paratyphoid B (Salmonella antgeno flagelar b). Antgenos Typhoid H (Salmonella antgeno flagelar c) Antgenos Typhoid O (Salmonella antgeno somtico d). 3. MATERIAL Placa de vidrio Micropipetas automticas Reloj Fuente de luz

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4. METODO DE AGLUTINACION EN PLACA En una placa de vidrio, colocar en cada pocito 40ul de suero y agregar una gota de suspensin de antgeno, mezclar y agitar la placa en forma circular durante 3 minutos. Observar la presencia o ausencia de aglutinacin utilizando una fuente de luz. Tfico H Tfico O Paratfico A Paratfico B Antgenos 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota Suero 40 ul 40 ul 40 ul 40 ul

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4.1. TITULACION Empleando micropipetas apropiadas colocar en cada pocito 80ul, 40ul, 20ul, 10ul y 5 ul de suero. Colocar 1 gota de antgeno sobre cada gota de suero. Mezclar el suero y el antgeno utilizando una varilla. Agitar la placa durante 3 minutos en forma circular. Observar la aglutinacin utilizando una fuente de luz. Los grados de aglutinacin se interpretan de acuerdo a la siguiente escala: Aglutinan 100% 4+ Aglutinan el 75% 3+ Aglutinan el 50% 2+ Aglutinan el 25% 1+ Negativo, no aparece aglutinacin.

REACCION DE WIDAL

4.1. TITULACION Las diluciones del suero en la titulacin en placa se muestra a continuacin. Volumen de suero 80 ul 40 ul 20 ul 10 ul 5 ul Ttulo 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320

REACCION DE WIDAL

VALORACION DE RESULTADOS En un tratamiento precoz con cloramefenicol puede, en algunos casos, frenar o impedir la aparicin de anticuerpos O. No se encontrarn ms que las aglutininas H aisladas. En el curso de una fiebre tifoidea, la presencia de anticuerpos O y cifras muy dbiles de anticuepos Paratyphi A y B. Esto se debe a que estos tres grmenes tienen en comn un factor de su antgeno somtico, el responsable de estas aglutinaciones cruzadas. S un sujeto vacunado tuviera, a pesar de la vacunacin, una fiebre tifo-paratfica, se hallaran en el serodiagnstico, adems de los anticuerpos H, reflejo de la vacunacin, aglutinina O del grmen infectante, mientras que el ttulo de las aglutininas H correspondientes se elevara. Resultados falso positivos se evidencian: Curso de paludismo, Tifus exantemtico, Lupus eritematoso, Yersinia pseudotuberculosis, algunas levaduras.

ENFERMEDADES

La Salmonella no es un habitante normal del intestino humano (excepto en portadores despus de la infeccin). Se trasmiten desde los animales y los productos de estos hacia el hombre, en el cual producen enteritis, infeccin general y fiebre intestinal. La enfermedad diarreica es la manifestacin ms comn de infeccin por especies de Salmonella distintas de S. Typhi y S. Paratyphi. Estas ltimas especies invaden el cuerpo desde el tracto gastrointestinal para causar enfermedad sistmica: tifoidea y paratifoidea (fiebres entricas).

ENFERMEDADES

LA ENTEROCOLITIS Se caracteriza por una invasin en el tejido epitelial y subepitelial de los intestinos delgados y grueso. Las cepas que no invaden no causan enfermedad. Los microorganismos penetran a travs y entre las clulas mucosas de la lmina propia, causando inflamacin y diarrea. La diarrea se produce como consecuencia de la invasin por Salmonellas de las clulas epiteliales en la porcin terminal del intestino delgado. Las bacterias emigran hasta la lmina propia de la regin ileocecal, donde se multiplican estimula una respuesta inflamatoria que confirma la infeccin al tracto gastrointestinal y media la liberacin de prostaglandinas. Las prostaglandinas a su vez activan el AMP cclico y la secrecin de lquidos, lo que da lugar a diarrea.

ENFERMEDADES

LA ENTEROCOLITIS Al contrario de la enterocolitis por Shigella, en donde la dosis infectantes es muy pequea (100microorganismos), la dosis por Salmonella es mucho mayor (100,000 microorganismos). El cido gstrico es una defensa importante del husped; la gastrectoma o el uso de anticidos abate la dosis infectante de modo significativo. DATOS CLINICOS La S. Typhimurium es la causa ms comn de enterocolitis. Despus de un perodo de incubacin de 6 a 48 horas, los sntomas comienzan con nuseas y vmitos, que luego progresan a dolor abdominal y diarrea, que puede variar de leve a grave, con o sin sangre. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO El microorganismo se asla con mayor facilidad de una muestra de heces.

La Gastroenteritis es la Manifestacion ms comn de la Infeccion por Salmonella

Ingestin de Salmonella enteritidis
Se adhiere a las clulas epiteliales en la porcin terminal del intestino delgado
La bacteria penetra en las clulas y emigra a la lmina propia de la regin ileocecal Se multiplica en los folculos linfoides, causando hiperplasia e hipertrofia reticuloendoteliales

Los leucocitos polimorfonucleares confinan la infeccin al tracto gastrointestinal La respuesta inflamatoria media tambin la liberacin de prostaglandinas Estimula la produccin de AMPc y la secrecin activa de lquido

DIARREA

ENFERMEDADES

EN LA TIFOIDEAY OTRAS FIEBRES ENTERICAS La infeccin comienza en el intestino delgado, pero hay pocos sntomas gastrointestinales. Los microorganismos entran a los fagocitos mononucleares de las Placas de Peyer, se multiplican y luego se propagan a fagocitos hepticos, de vescula biliar y esplnicos. De este modo se produce bacteriemia, que acompaa al comienzo de la fiebre y a los otros sntomas, quiz debida a una endotoxina. La supervivencia y proliferacin del microorganismoen fagocitos es una carcterstica sorprendente de esta enfermedad, as como su predileccin por invadir la vescula biliar, hecho que puede conducir al establecimiento del estado de portador y a la excrecin de bacterias por heces durante largos perodos.

ENFERMEDADES

EN LA TIFOIDEAY OTRAS FIEBRES ENTERICAS DATOS CLNICOS La fiebre tifoide es causada por S. Typhi, y en la fiebre entrica por S. Paratyphi A y B, el comienzo de la enfermedad es lento, predominando fiebre y estreimiento en lugar de vmitos y diarrea. Despus de la primera semana, conforme la bacteriemia se vuelve sostenida ocurren fiebre alta, delirio, abdomen sensible y esplenomegalia. Las manchas rosceas, es decir, paulas rosa en el abdomen, se relacionan con la fiebre tifoidea, pero slo rara vez aparecen. En la tercera semana, la enfermedad comienza a resolverse, pero pueden producirse complicaciones graves como hemorragia o perforacin intestinal. Cas 3% de los pacientes con fiebre tifoidea se vuelven portadores crnicos. Este ndice es ms elevado en mujeres que han padecido enfermedad biliar. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO Un hemocultivo es el procedimiento que tiene mayor probabilidad de revelar al microorganismo durante las dos primeras semanas de la enfermedad.

ENFERMEDADES

LA SEPTICEMIA Se produce slo en alrededor de 5 a 10% de las salmonelosis y se presenta en una de dos situaciones: en pacientes con una enfermedad crnica subyacente como anemia por clulas falciformes, cncer o en nios con enterocolitis. El curso sptico es ms indolente que el desarrollado por muchos otros bacilos gramnegativos. La bacteriemia siembra en numerosos rganos, con osteomielitis, neumona y meningitis como las secuelas ms comunes. Los tejidos con lesiones previas, como infartos u aneurismas, son a menudo sitios de bscesos metastsicos. DATOS CLINICOS La causa ms frecuente es producida por la S. Choleraesuis. Los sntomas empiezan con fiebre y enterocolitis ligera o sin ella, y luego prosiguen a sntomas focales relacionados con el rgano afectado, a menudo huesos, pulmn o meninges.

Enfermedades Clnicas producidas por Salmonella

Fiebres intestinales
Perodo de incubacin Iniciacin Fiebre 7 a 20 das Insidiosa

Septicemias
Variable Sbita

Gastroenteritis
8 - 48 horas Sbita

Gradual, despus una meseta Ascenso rpido, alta con estado tifoideo temperatura en sptica Variable

despus Generalmente baja agujas

Duracin de la enfermedad Varias semanas

2 a 5 das Nuseas, vmitos, diarrea la comienzo

Sntomas gastrointestinales A menudo constipacin temprana; A menudo no hay ms tarde, diarrea sanguinolenta Hemocultivo

Positivo durante la primera y Positivo durante la fiebre alta Negativo segunda semana de la enfermedad Positivo de la segunda semana en Pocas veces es positivo adelante; negativo al principio de la enfermedad Despus del comienzo, rpidamente positivo

Coprocultivo

CURSO DE LA FIEBRE TIFOIDEA

Frecuencias relativas con que son positivos los cultivos de sangre, orina, heces y pruebas de aglutinacin durante el curso de la fiebre tifoidea. Pg 128

TRANSMISION

Diseminacin en animales; se encuentran en la cadena de alimentos (especialmente en pollos, huevos, carne, leche y crema). Se adquieren por ingestin de alimentos contaminados o de persona a persona (por va fecal-oral) S. typhi slo es patgeno para el hombre. Diseminacin por va fecal-oral, habitualmente a travs de agua o alimentos contaminados. Los portadores son una fuente importante de infeccin.

Ciclo de Transmisin de Salmonellas entre los Animales y el Hombre

Alimentos de origen animal

comida de animales domsticos Animales salvajes efluente

Alimentos humanos

HOMBRE

excretas

HOMBRE

Taxonoma de las Salmonellas

La clasificacin de Ewing limita el gnero a slo tres especies. La clasificacin de Kauffman reconoce cada salmonella serolgicamente distinta. Estas especies se disponen despus en grupos. Son alrededor de 1500 serotipos, nombrados por lo general por la ciudad en que se aislaron. Las dems distinciones serolgicas se reconocen como subtipos.

CLASIFICACION DE EWING
Tres especies: Salmonella cholerae-suis (un serotipo) Salmonella typhi (un serotipo)

Salmonella enteritidis (>2000 serotipos)

CLASIFICACION DE KAUFFMAN-WHITE
Grupo A B C1 D Nombre S. paratyphi A S. paratyphi B S. typhimurium S. paratyphi C S. cholerae-suis S. virchow S. typhi S. enteritidis Antgeno somtico (O) 1, 2, 12 1, 4, 5, 12 1, 4, 5, 12 6, 7, Vi 6, 7 6, 7 9, 12, Vi 1, 9, 12 Antgeno flagelar (H) Fase I a b i c c r d g. m Fase II 1, 2 1, 2 1, 5 1, 5 1, 2 -

VARIACIN

Los microorganismos pueden perder los antgenos H y convertirse en no mtiles. La prdida del antgeno O se acompaa de un cambio en las colonias, de lisa a rugosas. El antgeno Vi se puede perder en parte o por completo. tambin se puede adquirirse o perderse los antgenos en el proceso de transduccin.

INMUNIDAD

Las infecciones por S. typhi y S. paratyphi suelen conferir cierto grado de inmunidad. La reinfeccin a menudo es ms leve que la primer infeccin. Los anticuerpos circulantes contra los antgenos O y Vi se relacionan con la resistencia a la infeccin y a la enfermedad.

TRATAMIENTO

Se efecta con cloramfenicol, trimetropim con sulfametoxazol. Es un problema la resistencia mltiple a los frmacos transmitida de manera gentica por los plsmidos entre las bacterias intestinales. En la mayor parte de los portadores, los microorganismos persisten en la vescula biliar (sobre todo si hay clculos). La enterocolitis es una enfermedad que se resuelve de manera espontnea, sin tratamiento. Puede requerirse restitucin de lquidos y electrlitos. El tratamiento con antibiticos no acorta la enfermedad ni reduce los sntomas; en realidad, puede prolongar la excrecin de microorganismos, incrementar la frecuencia del estado de portador y seleccionar mutantes resistentes al antibitico. Para fiebres entricas y septicemia, el tratamiento es la ampicilina o el cloramfenicol. La ampicilina deber usarse en portadores crnicos de S. Typhi. Para abolir el estado de portador, puede requerirse colecistectoma. Los abscesos focales se drenarn con ciruga, siempre que sea factible.

PREVENCION

Las Salmonelosis se previenen con reglamentos de salud pblica y medidas de higiene personal. Son importantes el tratamiento de aguas negras, la cloracin del suministro de agua que se controla por investigacin de bacterias coliformes contaminantes. Los cultivos de heces de manejadores de alimentos para detectar portadores, el lavado de manos antes de trabajar con alimentos. La pasteurizacin de la leche y el cocimiento apropiado de las aves de corral y las carnes. Se disponen de dos vacunas que confieren cierta proteccin contra S. Typhi: Una se compone de acetona exterminadora de microorganismos S. Typhi y se administra de manera intramuscular. La otra consiste en S. Typhi vivo atenuado y se toma de modo oral.