TRANSCRIEREA GENETIC

Principii i definiii Transcrierea genetic reprezint procesul de sintez, catalizat enzimatic, a moleculelor de ARN, ca urmare a citirii informaiei codificate n molecule ADN. Procesul se desfoar pe baza legilor de complementaritate chimic dintre cele 2 catene ale unei molecule de acid nucleic dublu catenar i conduce la formarea de legturi fosfo-diesterice ntre ribonucleotide. Prin transcriere genetic se sintetizeaz toate tipurile de molecule ARN proprii celulelor, att la organisme procariote, ct i la eucariote, i anume: ARN mesager (ARNm), ARN ribozomal (ARNr), ARN de transfer (ARNt), ARN heterogen nuclear (ARNhn). Molecula ARN rezultat prin transcriere, nainte de orice alt procesare, poart numele de transcript primar. Procesul de transcriere a unei poriuni din ADN (denumit gen) presupune deci sinteza unei copii a informaiei genetice, copie care din punct de vedere chimic este o molecula de acid nucleic monocatenar, i anume ARN. Transcrierea ncepe n anumite zone din molecula ADN, zone numite promotori. Acetia au anumite secvene de nucleotide care i fac uor de recunoscut de ctre ARN polimeraze (enzimele ce sintetizeaz molecule de ARN). n zona promotorilor dublul helix ADN este desfcut de ctre ARN polimeraze, formndu-se o aa-numit bucl de transcriere. n interiorul acesteia, ARN polimeraza sintetizeaz o molecul de ARN, copiind informaia genetic de pe una din catenele ADN pe care o folosete ca matri. Primul nucleotid de pe catena ADN matri care este citit i cruia i corespunde u n prim nucleotid n catena ARN, este numerotat convenional cu +1 i denumit startpoint (punct de pornire a transcrierii). Urmtoarele nucleotide din matria ADN sunt numerotate +2, +3, +4 etc. Fa de poziia nucleotidului +1, se definesc 2 zone n matria ADN : - zona amonte (upstream), n care nucleotidele sunt numerotate cu semnul minus (-1, -2, -3 etc) - zona aval (downstream), n care nucleotidele sunt numeortate cu semnul plus (+2, +3, +4 etc) Procesul de transcriere pornit de la promotori continu pn n anumite zone din ADN, cu anumite secvene, zone denumite terminatori. n aceste zone, ADN polimeraza se desprinde de pe molecula de ADN, bucla de transcriere format n dublul helix ADN se nchide, iar transcriptul ARN este eliberat. O zon din ADN cuprins ntre un promotor i un terminator poart numele de unitate de transcriere. Din cele 2 catene ale moleculei de ADN, catena care este folosit ca matri pentru sinteza unui transcript ARN este complementar cu aceasta i este numit caten antisens. Catena ne-matri este denumit caten codificatoare sau caten sens. Admind c o gen reprezint o zon din ADN (sau mai exact, secvena de nucleotide de pe una din catenele ADN dintr-o anumit zon) ce codific un polipeptid (sau o molecul de ARNr, ARNt ARNhn), o unitate de transcriere poate include : - o singur gen, caz n care se numete transcriere monocistronic - sau mai multe gene, caz n care se numete transcriere policistronic

Dei exist i destule excepii, n general, transcrierea monocistronic este caracteristic organismelor eucariote, iar cea policistronic procariotelor

ARN polimeraza de la procariote Aceast enzim este una dintre cele mai mari proteine din celula bacterian, avnd o greutatea de 480 kd, un diametru de aproximativ 100 Angstromi i fiind vizibil i la microscopul electronic. O celul de E.coli conine n medie 7000 de molecule de ARN polimeraz. dimerizat, formul general a enzimei fiind 2a . este codificat de gena rpoA i este dimerizat. Ea are un prim rol n asamblarea tuturor subunitilor enzimei, proces ce se desfoar n ordinea: 2 2- 2-- 2-- CTD reprezint domeniul carboxidirect la ADN, recunoscnd secvena UP din structura promotorilor. NTD reprezint domeniul aminodirect la ADN, ci la subunitatea - linker polipeptidic ce are o structur flexibil i face legtura dintre cele 2 domenii terminale Subunitatea este codificat de gena rpoB i realizeaz formarea propriu-zis a legturilor fosfo-diesterice ntre ribonucleotide, acest proces desfurndu-se ntotdeauna n direcie 5 3. Subunitatea este codificat de gena rpoC i are rol n ataarea iniial, situsnespecific a ARN polimerazei la molecula de ADN (Figura 4.20). Subunitatea Celula procariot conine mai multe specii moleculare de subunitate , fiecare recunoscnd anumii promotori i, deci, transcriind anumite gene. Astfel, n celula de E.coli, cele mai des ntlnite specii moleculare de sunt: 70 are o g.m. de 70 kd i codificat de gena rpoD; acest recunoate cele 2 secvene consensus TTGACA i TATAAT, fiind folosit de celula bacterian n condiii generale de mediu. Ca urmare, marea majoritate a genelor bacteriene sunt transcrise cu ajutorul acestei subuniti 70. 60 are g.m. 60 kd, este codificat de gena rpoN i este folosit de celul n condiii de privare de azot. 32 are g.m. de 32 kd, este codificat de gena rpoH i este folosit de celul n condiii de oc termic; cu ajutorul acestei subuniti sunt transcrise genele de oc termic. 24 are g.m. 24 kd, nu este cunoscut gena codificatoare i este folosit de celul n condiii de oc termic extrem; se pare c 24 particip la transcrierea unui set de gene ce determin o moarte celular programat, o sinucidere celular (asemntoare proceselor de apoptoz de la celulele eucariote). Figura 4.20 Reprezentarea schematic a atarii ARN polimerazei procariote la promotori.

ARN polimerazele la eucariote n sine, procesul de transcriere la organismele eucariote se desfoar n mod similar cu cel de la procariote. Exist totui o serie de diferene.

Astfel, n timp ce la procariote exist o singur specie molecular de ARN polimeraz per celul, la eucariote exist, n majoritatea cazurilor 3 specii moleculare de asemenea enzime. Cele 3 ARN polimeraze de la eucariote sunt nrudite i structural i funcional. Cu toate acestea, cele 3 enzime iniiaz transcrierea de la promotori diferii i transcriu gene diferite : - ARN polimeraza I transcrie n mod special gene ce codific pentru ARN ribozomal - ARN polimeraza II transcrie mai ales gene ce codific ARN mesager - ARN polimeraza III transcrie mai ales ARN de transfer i o serie de molecule mici de ARN, de exemplu ARN nuclear mic i nucleolar mic Alte diferene importante apar i n ceea ce privete factorii de transcriere. Astfel, dac la procariote iniierea transcrierii necesit doar facotrul , la eucariote debutul acestui proces necesit mai multe proteine, denumite generic factori de transcriere generali. n general, structura promotorilor pentru ARN pol I i III este mai simpla dect a promotorilor pentru ARN pol II, dei i aceste 2 enzime necesit factori de transcriere. Trascriptia la ivelul diferitelor tipuri de promoteri Promotorul la eucariote Regiunile promotor la eucariote prezint o zon miez care cuprinde un set minimal de secvene necesare iniierii transcrierii de ctre ARN pol II. Un asemenea miez de promotor este de obicei format din 40 de nucleotide ce cuprind de multe ori i situsul START (nucleotidul +1) i este format din: - elementul BRE ce reprezint elementul de recunoatere a factorului de transcriere TFIIB (TFIIB Recognition Element) - cutia TATA la care se ataeaz factorul TBP (TATA Binding Protein); aceast protein reprezint de fapt o subunitate a factorului de transcriere TFIID - regiunea Inr (Initiator) la care se ataeaz factorul TFIID - regiunea DPE (Downstream Promoter Element = elementul n aval fa de promotor) la care se ataeaz tot TFIID Cei mai muli promotori de la eucariote includ doar 2 sau 3 din aceste regiuni (Figura 4.21).

4.2.3.1 Promotori procariote Promotorii reprezint secvene din structura ADN, aflate n amonte fa de ogen, la care se ataeaz n mod situs-specific (n funcie de secvena de nucleotide) ARN polimeraza. Un promotor de la procariote prezint 4 regiuni importante din punct de vedere funcional : - o secven hexameric (adic format din 6 perechi de baze) n jurul poziiei -35; este denumit generic hexamerul -35 - o secven hexameric n jurul poziiei -10, denumit generic hexamerul -10 - o regiune spaiatoare ntre cei 2 hexameri (ADN spacer) - o regiune situat ntre poziiile -40 i -60, bogat n A i T, denumit elementul UP (Upstream = amonte) Cei 2 hexameri i elementul UP au secven de nucleotide nalt conservat, secvenele consensus fiind 5-TTGACA-3 pentru hexamerul -35 i, respectiv, 5-TATAAT-3 pentru hexamerul -10 (Figura 4.18).

Cu ct secvenele de nucleotide din cei 2 hexameri sunt mai apropiate de cele de mai sus, cu att tria promotorului respectiv este mai mare, adic cu att ARN polimeraza se va ataa mai strns i cu att gena respectiv va fi transcris cu o rat mai ridicat. Cei 2 hexameri din promotori sunt recunoscui de subunitatea ARN polimerazei, iar la elementul UP se ataeaz subunitatea -CTD a acestei enzime.
Terminatori
Transcrierea genetic continu de la promotori pn la terminatori. Acetia reprezint regiuni din molecula ADN ce prezint o anumit secven de nucleotide: - 2 copii ale unei secvene poli-GC n repetiie invers; aceast regiune prezint complementaritate intracatenar i determin formarea n transcriptul ARN a unei structuri n ac -depr (hairpin) ce mpiedic avansarea ARN polimerazei - o regiune format din 4 10 adenine (ce corespunde pe transcript cu 4 10 resturi de uracil) care reprezint semnalul propriu-zis de terminare a transcrierii Dei regiunile terminator sunt identificate pe molecula ADN, terminarea transcrierii este de fapt realizat de catena ARN (Figura 4.19). Pn n prezent au fost identificate 2 clase de terminatori la procariote: - terminatori Rho independeni : sunt regiuni de tip terminator n care cele 2 secvene poli GC prezint complementaritate intracatenar perfect, realiznd o structur n ac-de-pr stabil - terminatori Rho dependeni : sunt regiuni terminator n care cele 2 poli-GC nu prezint complementaritate intracatenar perfect; n acest caz structura n ac -de-pr este stabilizat de ctre o protein numit proteina Rho (de la litera greceasc Rho - ) care alunec pe molecula ARN pn la acul-de-pr i l stabilizeaz.
Figura

Replicarea ADN este semi-conservativ O molecul de ADN este duplicat (replicat) prin polimerizarea unei noi catene complementare pe fiecare din vechile catene ale dublei helice de ADN. Majoritatea proceselor de replicare a ADN sunt bidirecionale Ca i alte procese din biologia molecular, i procesul de replicare se desfoar n 3 etape iniierea, elongarea i terminarea : Iniierea implic recunoaterea regiunii de pe o molecul ADN unde va ncepe procesul de replicare Elongarea cuprinde evenimetele ce se desfoar la o bifurcaie de replicare, unde catenele parentale sunt copiate n catene fiice Terminarea este o etap destul de puin cunoscut i se desfoar atunci cnd molecula parenatl a fost complet replicat

Etapele chimice ale replicrii ADN Din punct de vedere chimic, replicarea ADN presupune urmtoarele etape principale: desfacerea iniial a dublului helix ntr-o zon denumit regiune de origine a replicrii sinteza unor fragmente de ARN m.c. scurt ce ofer captul 3 -OH liber pentru sinteza primelor legturi fosfo-diesterice; aceste fragmente poart numele de primeri i sunt sintetizate de ARN polimeraze speciale denumite primaze

 n bucla de ADN desfcut procesul de replicare se va desfura n ambele direcii, formndu-se deci 2 bifurcaii de replicare n faa fiecrei bifurcaii de replicare dublul helix va fi desfcut prin intervenia topoizomerazelor (care dersucesc dublul helix) i a helicazelor (care desfac legturile de hidrogen dintre cele 2 catene); astfel, bucla de replicare se va lrgi n fiecare din cele 2 capete fiecare din cele 2 catene ale helixului parental va servi drept matri pentru sinteza unei catene noi sinteza catenelor noi se realizeaz de ctre enzime numite ADN polimeraze, pe baz de complementaritate cu catena veche folosit ca matri; nucleotidele sunt legate ntre ele prin formarea de legturi fosfo-diesterice; alungirea catenei noi se realizeaz n direcie 5 3 datorit faptul c ADN polimerazele nu pot sintetiza o caten nou dect n direcie 5 3, la fiecare bifurcaie de replicare, sinteza celor 2 catene noi are loc oarecum diferit : una din catenele noi este sintetizat continuu, pornind de la un singur primer: aceast caten este denumit catena conductoare (leading) (Figura 4.1) cealalt caten este sintetizat discontinuu, pe msur ce dublul helix parental este desfcut n continuare; aceast caten este denumit caten ntrziat (lagging) i este format din multe fragmente distincte, denumite fragmente Okazaki (de la numele celul care le-a descris prima oar) de aproximativ 100 nucleotide; fiecare asemenea fragment este iniiat de la un primer ntr-o faz mai avansat a replicrii primerii sunt ndeprtai att din structura catenei conductoare, ct i din cea ntrziat, dup care golurile sunt umplute tot de o ADN polimeraz aceste fragmente sunt apoi unite ntre ele prin refacerea legturilor fosfo -diesterice de ctre o ADN ligaz n timpul procesului de replicare monocatenele ADN (att cele vechi, ct i cele nou sintetizate) sunt stabilizate i protejate de aciunea nucleazelor, de ctre o clas special de proteine numite proteine Ssb (Single Stranded Binding) terminarea replicrii unei molecule de ADN difer ntre moleculele circulare i cele lineare la moleculele circulare, ntlnite n majoritatea cazurilor la cromozomul bacterian i la plasmide, cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc ntr-o regiune denumit ter. la moleculele ADN lineare din cromozomii de la eucariote, capetele acestora (telomerele) sunt replicate printr-un mecanism diferit, iar fragmentele sunt apoi unite de ADN ligaze Complementaritatea dintre bazele azotate de pe cele 2 catene ale moleculei de ADN determin o structur perfect adaptat funciei de replicare, fiecare dintre cele 2 catene servind drept matri pentru sinteza unei catene complementare. In majoritatea cazurilor, replicarea se realizeaz pe model semiconservativ, macromoleculele de ADN fiice fiind formate dintr-o caten veche i una nou La majoritatea organismelor (chiar i la genomuri virale) replicarea ADN se desfoar bidirecional, ceea ce presupune formarea a dou bifurcaii de replicare ce avanseaz de la secvena de origine a replicrii (denumit secven oriC pentru cromozomul bacterian) ctre regiunea de terminare a replicrii (denumit secvna ter n cromozomul bacterian). Dei procesul de replicare a moleculelor de ADN se desfoar enzimatic n mod similar la toate organismele, att la cele procariote, ct i la cele eucariote, totui exist suficiente diferene ntre cele 2 tipuri principale de organisme. Astfel, cromozomul bacterian este un replicon unic, adic are o singur secven de origine a replicrii. n contrast, cromozomii de la eucariote sunt fiecare dintre ei structuri multirepliconice (au mai multe regiuni de origine a replicrii ADN).

Enzimologia replicrii cromozomului bacterian

Cercetrile asupra procesului de replicare a moleculei ADN precum i asupra enzimelor implicate au debutat pe cromozomul de Escherichia coli i, ca urmare, majoritatea datelor experimentale provin de la bacterii (Figura 4.6).

4.1.2.1 Complexul primozom

Complexul primozom este format dintr-o serie de proteine ce determin iniierea replicrii ADN. Cele mai importante proteine sunt: primaza: la bacterii este denumit DnaG i este codificat de gena dnaG; aceast enzim sintetizeaz scurte fragmente de ARN ce au funcie de primeri, adic ofer capul 3-OH liber pentru polimerizare. proteinele de iniiere: n, n, n, DnaA, DnaB, DnaC i DnaT Iniierea replicrii presupune detaarea secvenei oriC de membrana plasmatic, dup ce, n prealabil, a fost atins o anumit mas celular (denumit mas de iniiere) i n urma acumulrii unei cantiti substaniale de fosfolipide acide pe faa intern a membranei plasmatice. Secvena oriC din cromozomul de E.coli are 245 bp i prezint 2 regiuni importante: o regiune cu 4 cutii dnaA (sunt formate din cte 9 bp, denumite 9-meri) la care se va ataa proteina DnaA o regiune cu 3 cutii de tip 13-meri, bogate n adenin-timin, la care se vor ataa complexe proteice DnaB-DnaC Zece pn la 12 molecule de DnaA se leag la cutiile dnaA, determinnd buclarea moleculei de ADN i, ca atare, desfacerea dublului helix n cutiile dnaB. Zonele monocatenare aprute se complexeaz cu proteina DnaB (cu funcie de helicaz), adus de proteina DnaC. Ulterior, primaza (DnaG) ncepe aici sinteza moleculelor de ARN primeri (Figura 4.7).

Topoizomerazele
Superspiralizarea cromzomului bacterian impune intervenia unor enzime care s realizeze relaxarea dublului helix ADN. Aceste enzime se numesc topoizomeraze i acioneaz asupra topoizomerilor ADN (Figura 4.9). Topoizomerii sunt molecule ADN cu structur primar i secundar identic i care difer n structura teriar. Dou molecule ADN d.c. ce au aceeai secven de nuceotide dar numr diferit de nlnuiri i suporarsuciri sunt topoizomere datorit diferenelor de natur topologic. La bacterii, ca de altfel i la eucariote, exist 2 clase de topoizomeraze cu mecanisme diferite de aciune (Figura 4.9) : topoizomeraze tip I induc rupturi monocatenare (i tranzitorii) n ADN topoizomeraze tip II induc rupturi bicatenare n ADN (Figura 4.10) La bacterii, topoizomeraza de tip I cea mai bine caracterizat este TopA de la E.coli, care relaxeaz suprarsuciri negative nalt rsucite. Topoizomerazele de tip II, n absena ATP, au rolul de a relaxa macromolecula ADN ca i TopA, n timp ce n prezena ATP induc suprarsuciri negative n moleculele circular covalent nchise (CCC) relaxate. Cea mai cunoscut enzim din aceast clas este ADN giraza, care poate introduce aproximativ 100 de suprarsuciri negative per minut.
Figura

ADN polimeraze
Procesul de replicare propriu-zis a ADN este realizat de un complex de enzime denumite ADN polimeraze. Cea mai important activitate enzimatic desfurat de o asemenea enzim este formarea de legturi fosfo-diesterice ntre nucleotide adiacente, cu creterea lanului n direcie 5 3. Toate ADN polimerazele descrise pn n prezent polimerizeaz n direcie 5 3 i nu pot realiza acest proces dect pornind de la capul 3OH liber al unei nucleotide. De obicei, acest cap este oferit de un scurt fragment monocatenar de ARN denumit primer. La bacterii au fost descrise 3 tipuri de ADN polimeraze ce coexist n aceeai celul: ADN polimeraza I (ADN pol I) este codificat de gena polA i are o g.m. de aprox 100 Md. n celula de E.coli exist circa 400 molecule de ADN pol I care are o vitez de polimerizare de 667 nucleotide / min. n afar de activitatea de polimerizare, aceast enzim poate desfura i activitate de exonucleaz (adic de desfacere de legturi fosfo-diesterice i eliminare de nucleotide dintr-o caten). Astfel, ADN pol I are un domeniu polipeptidic ce realizeaz activitate exonucleazic n direcie 3 5 , activitate foarte important ce i asigur enzimei i posibilitatea de a i corecta singur eventualele

erori de ncorporare a unor nucleotide mperecheate greit. Aceast funcie este denumit citire corect (proof-reading). Totodat, ADN pol I poate desfura i activitate exonucleazic n direcie 5 3, activitate ce i permite ndeprtarea primerilor ARN. ADN polimeraza II (ADN pol II) este codificat de gena polB. i aceast enzim poate avea i activitate exonucleazic 5 3. ADN polimeraza III (ADN pol III) este principala replicaza a cromozomului bacterian i reprezint un adevrat complex enzimatic format din cel puin 10 subuniti funcionale