Extraccin de antgenos de excrecin y secrecin de

Fasciola hepatica en ganado ovino

Liria S. Calahorrano, N. David Zapata,
Escuela Politcnica del Ejrcito (ESPE), Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ingeniera en
Biotecnologa, .Sangolqu-Ecuador.
E-mail: liria.calahorrano@gmail.com, ndavidzc@hotmail.com


RESUMEN

El trematodo, Fasciola hepatica causa la enfermedad parasitaria conocida como fasciolosis,
enfermedad que ocasiona prdidas econmicas por decomiso de hgados en mataderos y
disminucin en la produccin de leche y carne. El objetivo de esta investigacin fue extraer los
antgenos de excrecin de Fasciola hepatica en ganado ovino. Se obtuvieron 6 hgados del
matadero municipal de la ciudad de Quito, de los cuales se extrajeron las fasciolas. Se aplicaron
diferentes protocolos de extraccin, y se analiz la cantidad de protena total con el mtodo
Biuret. Una cromatografa de capa fina para identificar los aminocidos presentes y acercarnos
al tipo de antgeno que posee el extracto. Los protocolos de extraccin no presentaron
diferencias y los antgenos presentes tienen una gran probabilidad de pertenecer a la familia de
las cistenas proteasas.

Palabras clave: ovinos, Fasciola heptica, antgenos de excrecin y secrecin, fasciolosis
ABSTRACT

The trematode, Fasciola hepatica parasite causes a disease known as fasciolosis, which causes
economic losses by seizure of livers in slaughterhouses and decreased production of milk and
meat. The objective of this research was extracted antigens of excretion and secretion of Fasciola
hepatica in sheep. We obtained 6 livers of the municipal slaughterhouse of Quito, which flukes
were removed from these livers. We applied different extraction protocols and analyzed the
amount of total protein with the Biuret protocol. A thin layer chromatography to identify the
amino acids and the type of approach that has antigen extract. Extraction protocols are not
different; antigens have a high probability of belonging to the family of cysteine proteases.

INTRODUCCIN

La Fasciola hepatica es un tremtodo que parasita un gran nmero de vertebrados como
caballos, cerdos, ovinos, bovinos, incluyendo al hombre (Prez et al., 2009; Paz-Silva et al., 2010).
La fasciolosis es una enfermedad de importancia debido a las prdidas econmicas y
productivas que provoca en el ganado bovino (Kassuku et al., 1986; Hammond & Sewell, 1990;
Wamae e Ihiga 1991; Menkir et al., 2007), por los efectos patognicos de este parsito en el
organismo. Los adultos de F. heptica tienen un cuerpo plano de hoja, de unos 30mm de largo
y 15mm de ancho, son de color gris-rosado a parduzco (Contreras, 2000).
La fasciolosis tiene una distribucin mundial en rumiantes (Arias, et al., 2011), con mayor
frecuencia en Europa, zonas montaosas del sur del continente Asitico, este y sur de frica, en
las regiones templadas y tropicales del continente Americano, en Nueva Zelanda y en Australia
(Boray, 1985). En Amrica Latina se ha reportado en pases como Ecuador, Venezuela y Per en
animales y en seres humanos (Prez, 2003).
El contagio ocurre cuando el pastoreo del ganado se realiza en zonas hmedas, que permiten el
desarrollo del hospedador intermediario, el caracol del gnero Lymnaea (Salazar et al., 2006;
Arias et al., 2011). La infeccin generalmente ocurre cuando el ganado se alimenta de pasto
contaminado con la fase infecciosa (metarcercariae) del parsito (Marcos et al., 2007); por tanto,
la fasciolosis puede ser considerada como una zoonosis originada por agua contaminada.
El diagnstico de F. hepatica en el hospedador definitivo puede realizarse a partir de la
necropsia de animales muertos (Chvez, 2010), a travs de la observacin de los parsitos
adultos en el hgado y sus lesiones, y la observacin de huevos mediante anlisis coprolgicos
(Dennis et al., 1954; Kleiman et al., 2005). Generalmente son tcnicas utilizadas despus de que el
animal presenta sntomas relacionados a una alta carga parasitaria.
Otros mtodos de diagnstico son tcnicas moleculares y los ensayos inmunoenzimticos
(ELISA) (Dumnigo & Villalvilla, 1998), los cuales usan muestras de suero para demostrar la
presencia de anticuerpos en contra de los antgenos del parsito (Arias et al., 2011), pueden
detectar infecciones tempranas con baja carga parasitaria. Adems, se justifica el uso de
mtodos inmunolgicos debido a la baja sensibilidad de los exmenes coprlogicos (Cabrera et
al., 2001; Espino et al,. 1987) en contraste con la alta especificidad y sensibilidad del ELISA.
Se ha demostrado que durante la infeccin de F. hepatica se liberan compuestos con actividad
antgenica (Keegan & Trudgett, 1992; Arias, 2001; Lomba, 2005). Los antgenos ES estn
compuestos por molculas de naturaleza glicoproteica (Colmenares et al., 2007), que pueden
generar reacciones cruzadas. Los antgenos de ES de 8, 10, 11, 14, 17, 23 -30 kDa del verme
adulto de F. hepatica pueden tener una buena sensibilidad y especificidad (70-100%) por
Western Blot (Daz, et al., 1998; Espino, et al., 2000; Kim, et al., 2003; Silva et al., 2005), el trabajo
asumir que se trabaja con estos antgenos. La F. heptica es un parasito incidente en el
Ecuador, sobre todo en la region andina (Cali, 2012).
En los antgenos de ES (excrecin-secrecin), un componente importante son las cistena
proteinasas con 25-26kDa, las cuales forman parte del arco de precipitacin Fharc2 usado para
serologa en humanos y ganado bovino, caprino, ovino, entre otros (Crdova et al., 1999), dentro
de este grupo la familia de las catepsinas son muy importantes por su alta sensibilidad y
especificidad (Tantrawatpan et al., 2005). El objetivo de esta investigacin es la extraccin y
purificacin de antgenos de ES de Fasciola hepatica, de manera que estos antgenos tengan un
potencial uso para el desarrollo de tcnicas de diagnstico.
MTODOS

Recoleccin y muestreo.- En la Empresa Municipal de Rastro de Quito, se recolectaron
parsitos de hgados, provenientes de ovejas sacrificadas, para ello se seleccionaron 6 hgados
infestados y fueron 6 hgados y fueron transportados en un cooler refrigerado, a los
laboratorios de Biotecnologa de la Universidad de las Fuerzas Armadas (ESPE).Los gusanos
adultos de F. heptica fueron extrados de los conductos biliares de los hgados.

Extraccin y obtencin de los antgenos ES.- Los antgenos fueron obtenidos segn el
protocolo descrito por Guobadia y Fagbemi (1995). De manera general, los parsitos adultos se
separaron en grupos de 10 individuos, se lavaron 3-4 veces con solucin salina tamponada con
fosfato (PBS) 0.01 M (pH 7,2), con el fin de eliminar restos de sangre y bilis. Se incubaron
durante de 24 horas, para purificar los antgenos se centrifug a 4000 rpm a 4 C durante 30
minutos y se recogi el sobrenadante que contena los productos de ES de los parsitos. Para
comprobar si la filtracin influye en la extraccin del antgeno se realizaron dos tratamientos
con 6 repeticiones cada uno, el primero consiste en filtrar a travs de un poro de membrana de
4.5 m y el segundo sin filtrar. Finalmente, se almacen en tubos falcn las muestras en
refrigeracin a -20 C.

Determinacin de la cantidad de protena (Protocolo de Biuret).- Primero se realiz la curva
de calibracin con un patrn estndar, albumina de suero bovina (Gibco) que fue diluida a
diferentes concentraciones como se muestra en la Tabla 1. La ecuacin de la curva de
calibracin se obtuvo mediante correlacin de los datos de absorbancia con los de cantidad de
protena. Se procedi a descongelar las muestras de antgenos a -20C, a 2 mL del antgeno se
aadieron 2 mL de KOH y 4 gotas de CuSO4,La lectura se realiz a una longitud de 545 nm, en
un espectrofotmetro Genoma (Jenway). Se midieron las absorbancias de las muestras.

Hidrolisis cida y cromatografa en capa fina de los aminocidos. De 24-48 horas se coloco 1
mL del extracto en 50ml HCl a 110C. La reaccin de la cromatografa se realiz con nihadrinina
en silica gel y el diluyente butanol: cido actico: agua en proporcin 40:20:40.

Anlisis Estadstico.- Se utiliz el paquete estadstico R. Se realiz la prueba de t para dos
muestras con supuestas varianzas iguales para mostrar si existe diferencia significativa entre las
medias de cada tratamiento. Se trabaj con un = 5%.

RESULTADOS
La curva de calibracin se realiz con Newborn Calf Serum (suero de ternero neonato),
(Gibco). La concentracin del blanco no se encontraba disponible en el recipiente, as que se
trabaj con una concentracin aproximada de 45 mg/Ml de suero de ternero neonato. Se
realizaron diferentes disoluciones del blanco para obtener una curva que nos permita detectar
la concentracin en un rango preciso.

Tabla 1. Parmetors de la curva de calibracin de suero de ternero neonato

Tubo
(No.)
Suero patrn
(mL)
Agua
(mL)
Concentracin total de protena*
(mg/mL)
Absorbancia
1 0 2,0 0 0
2 0,2 1,8 4,5 0,24
3 0,4 1,6 9 0,321
4 0,6 1,4 13,5 0,348
5 0,8 1,2 18 0,349
6 1,0 1,0 22,5 0,365
7 1,2 0,8 27 0,411
8 1,4 0,6 31,5 0,454
*Newborn Calf Serum, New Zealand Origin (45mg/mL) http://www.southerncrossbiotech.com/nbcs.htm


La curva de calibracin muestra que a medida que se aumenta la concentracin de la protena,
la absorbancia tambin aumenta. Lo que permite realizar una regresin lineal (una lnea que se
ajuste a la mayor cantidad de puntos, Figura 1), para obtener una ecuacin de primer grado: y =
0,011x + 0,137, despejando el valor de x, llegamos a la ecuacin de inters: x=90.9 y-12.5,
concentracin en funcin de absorbancia, de esta manera se puede interpolar las
concentraciones de protena total conocida la absorbancia de la muestra. Se debe notar que el
coeficiente de correlacin, R
2
=0.748 es debido a la medicin del blanco; sin embargo, se acepta
la ecuacin obtenida porque la mayora de puntos atraviesan la grfica.
Comment [L1]: COMO SE AJUSTO NO
ENTIENDO??????
Comment [L2]: NO ME EXPLICAN ESTA CURVA
DE CALIBRACION EN MATERIALES Y METODOS


FIGURA 1. Curva de calibracin.


Se analizaron los protocolos, filtrar (F) y sin filtrar (SF) despus de la centrifugacin para la
obtencin del antgeno. Cada tratamiento posee 6 repeticiones, se midi la absorbancia con el
protocolo de biuret. A partir de la absorbancia y con la ecuacin:
x(concentracin)=90.9y(absorbancia)-12.5, se obtuvieron los resultados que se muestran en la
Tabla 2.

Tabla 2. Anlisis de las muestras de antgenos
Muestra Absorbancia Protena
Total
(mg/mL)
Muestra Absorbancia Protena
Total
(mg/mL)
F1 0,233 8,6797 SF1 0,341 18,4969
F2 0,283 13,2247 SF2 0,346 18,9514
F3 0,291 13,9519 SF3 0,306 15,3154
F4 0,302 14,9518 SF4 0,304 15,1336
F5 0,269 11,9521 SF5 0,277 12,6793
F6 0,232 8,5888 SF6 0,238 9,1342
F: Filtrado, SF: Sin Filtrar
Segn la prueba t se pudo evidenciar que existe una direferncia significativa entreSe
realiz una prueba t para determinar si existe una diferencia significativa entre cada protocolo.
Se aplic Ho: 1- 2=0, bilateral y una signifancia del 5%. El valor p se muestra en la Tabla 3,
13.19% (mayor a 5%), por lo que se acepta la hiptesis nula. En otras palabras no existe una
diferencia significativa entre la media de ambos tratamientos. Sin embargo, se debe notar que
dentro del mismo tratamiento existe variacin entre las repeticiones debido a ciertas varias
dentro del mismo protocolo, de las cuales se discute despus.

Tabla 3. Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales
Filtrado Sin Filtrar
Media 11,8915 14,9518
Varianza 7,323053076 13,54770328
Varianza agrupada 10,43537818

Diferencia hipottica de las medias 0

Grados de libertad 10

Estadstico t -1,640856242

P(T<=t) dos colas 0,131861477

y = 0.011x + 0.1374
R = 0.7484
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 10 20 30 40
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Protena total (mg/mL)
Curva de calibracin
Comment [L3]: POR FAVOR ESCRIBIR UN BUEN
TTULO ENTENDIBLE Y COMPLETO LA FIGURA HABLA
POR SI SOLA
Comment [L4]: NO ME EXPLICAN EN
MATERIALES Y METODOS ESTO DE LOS
PROTOCOLOS FILTRAR O SIN FILTRAR
Comment [L5]: ESTO VA EN MATERIALES Y
METODOS
Valor crtico de t (dos colas) 2,228138842


En la cromatografa de capa fina se consiguieron los siguientes valores de Rf (coeficiente de
correlacin). Despus de la hidrolisis cida de las protenas, lo que permiti la separacin de
los aminocidos.






Tabla 4. Coeficientes de correlacin obtenidos de la cromatografa de capa fina(propanol 80%)
Rf (experimental) Aminocido Rf (terico)
38 Ala 39.5
16.2 Asn 16.5
14.3 Asp 14.5
11 Cis 11.5
22.9 His 23
21.2 Glu 21.5
50 Val 51

Los aminocidos presentes en el extracto de F. heptica son: alanina, asparragina,cido aspartico,
cistena, histidina, glutamina, valina que son parte de las proteasas presentes en los antgenos
de excresin secrecin.


DISCUSIN

En el protocolo de Biuret, existe un error en la calibracin debido al valor de R
2
es 0.748, lo que
demuestra que no todos los datos se correlacionan. La causa ms probable fue el blanco al
momento de encerar, se debi haber cometido un error en este momento. Sin embargo, la
linealizacin es la adecuada considerando el dato inicial. No existe una diferencia significativa
entre los dos tipos de tratamientos: filtrado o sin filtrar.

Existe una mayor cantidad de protena en el tratamiento que es sin filtrar ya que permite el paso
de ms molculas, en cambio con el filtro el paso de molculas disminuye. Sin duda se debe
realizar otras comparaciones para comprobar que efectivamente no existe diferencia, ya que
dentro del mismo tratamiento, encontramos gran cantidad de varianzas. Se debe destacar que
los tratamientos las repeticiones de la 2 a la 5 son semejantes, en contraste con la 1 y 6 que
forman otro grupo.

La familia de las cistena proteasas engloba a todas aquellas proteasas que presentan un residuo
de cistena en su centro cataltico (Jordn et al., 2000). Otros aminocidos que forman parte del
sitio activo son la Glu, His y Asn (Brucchaus et al., 2003). Pueden ser identificados dentro de la
secuencia primaria debido a que estn rodeados por aminocidos bien conservados. El grupo
tiol es un centro nucloeflico debido a la cercana de la His, que dona electrones, el grupo
sulfhidrilo (Cys) y el imidazol (His) generan una dada liberadora de carga tiolato-imisazolium,
estabilizado por una asparagina y una glutamina, altamente conservadas (Sajid y McKerrow,
2002). Esta podra ser una indicacin por que se obtuvieron este tipo de aminocidos en la
comatografa de capa fina, as que es probable que dentro del extracto estn presentes este tipo
de protenas.

Los anticuerpos dirigidos contra las cistenas proteasas puede tener un efecto inhibitorio en su
actividad proteoltica, como los anticuerpos anti-captesina L de F. heptica (Smith et al., 1994).
Las cistena proteasas son muy inmunognicas por lo que se han utilizado en varios artculos
sobre antgenos de F. heptica. Las proteasas se requieren para la salida de los helmintos de los
Comment [L6]: FALTA EXPLICAR MEJOR ESTA
PARTE QUE PASO CON LOS DATOS DE EL PRIMER
ENSAYO CON EL SEGUNDO ES DECIR VERSUS
CROMATOGRAFIA HAY DIFERENCIA OBTUVIERON
ALGO?????
Comment [L7]: FALTA TRABAJAR EN DISCUSION
Comment [L8]: PORQUE ESTOS ERRORES NO SE
PUEDEN COMETER AL MOMENTO DE ENCERAR
Comment [L9]: EXPLIQUENME COMO ESTE
PARRAFO EMPATA CON SU TRABAJO, HAY QUE
MEJORAR LA REDACCION
quistes protectores o huevos (Ward et al.,1997; Lustigman et al., 1996; Sung y Dresden, 1986).
Las csteina proteasas son importantes para la invasin del hospedero por varios parsitos
(Keene et al., 1986; Reed et al., 1989). Por lo que es argumentado porque la cistena proteasa, se
debe encontrar en el extracto de F. heptica.

AGRADECIMIENTOS

A todos nuestros compaeros de Inmunologa, que nos ayudaron con su protocolo. A las
docentes Mara Augusta Chvez, Blanca Naranjo .. A la Lic Silvana Granda laboratorista de
la carrea de Biotecnologa por y al laboratorio de Biotecnologa por su apoyo en nuestra
investigacin, en especial a Silvana Granda.

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Comment [L10]: ESTE PARRAFO ES BUENA IDEA
PERO HAY QUE CONCATENAR CON LOS
RESULTADOS OBTENIDOS
Comment [L11]: DE QUE CARRERA ? DE QUE
UNIVERSIDAD??? SON DE POSGRADO O PREGRADO
Y PORQUE??? REDACTAR MEJOR
Comment [L12]: TODAS LAS CITAS DEL TEXTO
DEBEN ESTAR ENUMERADAS AQU Y VICEVERSA
CUIDADO????
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fasciolosis by enzyme linked immunosorbent assay using excretory-secretory products.
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