Óleos e Gorduras IAL Cap16

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LEOS E
GORDURAS
XVI
CAPTULO
Captulo XVI - leos e Gorduras
Mtodos Fsico-Qumicos para Anlise de Alimentos - 4 Edio
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XVI
LEOS E GORDURAS
A
s determinaes feitas na anlise de leos e gorduras so geralmente as dos
chamados ndices, que so expresses de suas propriedades fsicas ou qumicas
dos mesmos e no as porcentagens dos seus constituintes. Assim, so determi-
nados os ndices de iodo, saponicao, perxidos e as constantes fsicas como
o ponto de fuso e o ndice de refrao. So estes ndices que, juntamente com as reaes
caractersticas, servem para identicao e avaliao da maioria dos leos e gorduras, sen-
do o resultado da anlise baseado neste conjunto de dados.
Os mtodos de cromatograa em fase gasosa so, desde h muito tempo, aplicados
para o conhecimento da composio dos cidos graxos destes compostos.
325/IV Determinao da acidez
A determinao da acidez pode fornecer um dado importante na avaliao do es-
tado de conservao do leo. Um processo de decomposio, seja por hidrlise, oxidao
ou fermentao, altera quase sempre a concentrao dos ons hidrognio. A decomposi-
o dos glicerdios acelerada por aquecimento e pela luz, sendo a rancidez quase sempre
acompanhada pela formao de cidos graxos livres. Estes so freqentemente expressos
em termos de ndice de acidez, podendo s-lo tambm em mL de soluo normal por
cento ou em g do componente cido principal, geralmente o cido olico. Os regula-
mentos tcnicos costumam adotar esta ltima forma de expresso da acidez. O ndice de
acidez denido como o nmero de mg de hidrxido de potssio necessrio para neu-
tralizar um grama da amostra. O mtodo aplicvel a leos brutos e renados, vegetais e
animais, e gorduras animais. Os mtodos que avaliam a acidez titulvel resumem-se em
titular, com solues de lcali-padro, a acidez do produto ou solues aquosas/alcolicas
do produto, assim como os cidos graxos obtidos dos lipdios.
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Material
Balana analtica, frasco Erlenmeyer de 125 mL, proveta de 50 mL e bureta de 10 mL.
Reagentes
Soluo de ter-lcool (2:1) neutra
Soluo fenolftalena
Soluo de hidrxido de sdio 0,1 M ou 0,01 M
Procedimento As amostras devem estar bem homogneas e completamente lquidas.
Pese 2 g da amostra em frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 25 mL de soluo de
ter-lcool (2:1) neutra. Adicione duas gotas do indicador fenolftalena. Titule com so-
luo de hidrxido de sdio 0,1 M ou 0,01 M at o aparecimento da colorao rsea, a
qual dever persistir por 30 segundos.
Clculos
v = n de mL de soluo de hidrxido de sdio 0,1 M gasto na titulao
f = fator da soluo de hidrxido de sdio
P = n de g da amostra
Notas
Para converter o ndice de acidez em soluo molar, divida o resultado por 1,78. Para
expressar o ndice de acidez como acidez em cido olico, divida o resultado por 1,99.
Para transformar a acidez em cido olico em acidez em soluo normal, divida o resul-
tado por 3,55.
No caso de produtos com baixo teor de cidos graxos, por exemplo, leos e gorduras
renados, use soluo de NaOH 0,01 M para a titulao.
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Referncia bibliogrca
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1.:
Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p.
245-246.
326/IV Determinao do ndice de perxido

Este mtodo determina todas as substncias, em termos de miliequivalentes de
perxido por 1000 g de amostra, que oxidam o iodeto de potssio nas condies do teste.
Estas substncias so geralmente consideradas como perxidos ou outros produtos simi-
lares resultantes da oxidao da gordura. aplicvel a todos os leos e gorduras normais,
incluindo margarina e creme vegetal, porm suceptvel e portanto qualquer variao no
procedimento do teste pode alterar o resultado da anlise.
Material
Balana analtica, frasco Erlenmeyer de 125 ou 250 mL com tampa esmerilhada, proveta
de 50 mL, pipeta graduada de 1 mL, bureta de 10 mL com sub-divises de 0,05 mL.
Reagentes
cido actico
Clorofrmio
Soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N ou 0,01 N
Amido solvel
Iodeto de potssio
Soluo de cido actico-clorofrmio (3:2) v/v
Soluo saturada de iodeto de potssio Pese 30 g de iodeto de potssio e adicione 21 mL
de gua. Conserve a soluo em frasco mbar e utilize no mesmo dia da sua preparao.
Soluo de amido 1% m/v
Procedimentos
leos e gorduras normais Pese (5 0,05) g da amostra em um frasco Erlenmeyer de
250 mL (ou 125 mL) . Adicione 30 mL da soluo cido actico-clorofrmio 3:2 e agi-
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te at a dissoluo da amostra. Adicione 0,5 mL da soluo saturada de KI e deixe em
repouso ao abrigo da luz por exatamente um minuto. Acrescente 30 mL de gua e titule
com soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N ou 0,01 N, com constante agitao. Continue
a titulao at que a colorao amarela tenha quase desaparecida. Adicione 0,5 mL de
soluo de amido indicadora e continue a titulao at o completo desaparecimento da
colorao azul. Prepare uma prova em branco, nas mesmas condies e titule.
Margarina e creme vegetal Funda a amostra, com constante agitao, em placa aquece-
dora ou em estufa a (60-70)C. Evite aquecimento excessivo, particularmente prolongado
temperatura acima de 40C. Uma vez completamente fundida, remova a amostra da
placa at que a camada aquosa se separe. Decante o leo e ltre em papel Whatman n 4
ou equivalente. A amostra deve estar clara e brilhante. Proceda a determinao conforme
o descrito para leos e gorduras normais.
Nota: se o volume gasto na titulao da amostra for menor que 0,5 mL, usando soluo de
tiossulfato de sdio 0,1 N, repita a determinao com soluo 0,01 N. No caso do branco,
o volume gasto no deve exceder a 0,1 mL da soluo de tiossulfato de sdio 0,1 N.
Clculo
A = n de mL da soluo de tiossulfato de sdio 0,1 (ou 0,01 N) gasto na titulao da
amostra
B = n de mL da soluo de tiossulfato de sdio 0,1 (ou 0,01 N) gasto na titulao do
branco
N = normalidade da soluo de tiossulfato de sdio
f = fator da soluo de tiossulfato de sdio.
AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Ofcial methods and recommended
praticces of the American Oil Chemists` Society. 4
th
ed. Champaign, USA, AOCS,
1990. [AOCS Ocial method Cd 8-53].
327/IV Determinao do ndice de refrao
O ndice de refrao caracterstico para cada tipo de leo, dentro de certos limites.
Est relacionado com o grau de saturao das ligaes, mas afetado por outros fatores
tais como: teor de cidos graxos livres, oxidao e tratamento trmico. Este mtodo
aplicvel a todos os leos normais e gorduras lquidas.
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Material
Refratmetro de Abb equipado com escala-padro e algodo.
Reagente
ter de petrleo ou outro solvente.
Procedimento
Ajuste da aparelhagem Ajuste previamente o refratmetro de Abb com gua. Faa cir-
cular uma corrente de gua a 40C pelo aparelho. Deixe estabilizar a temperatura. Ajuste
a 40C para leos e a 60C para amostras com ponto de fuso mais alto. A temperatura
do refratmetro deve ser controlada a 0,1C e, para isto, prefervel usar banho de gua
controlado termostaticamente e com circulao de gua. O instrumento calibrado se-
guindo as instrues do fabricante, com lquido de pureza e ndice de refrao conhecidos
ou, em alguns casos, satisfatrio usar um prisma de vidro de ndice de refrao terico
de 1,333 20 C. Se o refratmetro for equipado com um compensador, uma lmpada
eltrica como a de vapor de sdio, torna-se necessria.
Tratamento da amostra Funda a amostra, caso no esteja lquida. Filtre para remover
quaisquer impurezas e traos de umidade. A amostra deve estar completamente seca.
Certique-se que os prismas estejam limpos e completamente secos e ento coloque no
prisma inferior algumas gotas da amostra. Feche os prismas e trave rmemente. Deixe por
1 a 2 minutos at que a amostra atinja a temperatura do aparelho. Ajuste o instrumento
e a luz para obter a leitura mais distinta possvel e, ento, determine o ndice de refrao.
A leitura na escala dar diretamente o ndice de refrao absoluto a 40C, com quatro
casas decimais. Realize pelo menos trs leituras e calcule a mdia. A variao das leituras
deve ser igual a 0,0002. Limpe os prismas entre as leituras com algodo umedecido com
solvente e deixe secar.
Clculo para correo da temperatura
R+ K (T- T) = R
R = leitura temperatura T (C)
R= leitura temperatura T (C)
T = temperatura padro (C)
T = temperatura na qual a leitura de R foi feita (C)
K = 0,000365 para gorduras e 0,0003885 para leos
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Referncias bibliogrcas
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: M-
todos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 247.
practices of the American Oil Chemists Society. 4
th
ed. Champaign, USA, A.O.C.S.,
1990. [A.O.C.S. Ocial method Cc 7-25].
328/IV Determinao do ndice de saponicao

O ndice de saponicao a quantidade de lcali necessrio para saponicar uma
quantidade denida de amostra. Este mtodo aplicvel a todos os leos e gorduras e
expressa o nmero de miligramas de hidrxido de potssio necessrio para saponicar
um grama de amostra.
Material
Frascos Erlenmeyer de 250 mL, condensador de gua e banho-maria ou chapa aquecedo-
ra com controle de temperatura.
Reagentes
Soluo de cido clordrico 0,5 M
Hidrxido de potssio
Soluo de fenolftalena
lcool
Soluo alcolica de hidrxido de potssio a 4% m/v
Procedimento Funda a amostra, se no estiver completamente lquida. Filtre em papel
de ltro para remover impurezas e traos de umidade. A amostra deve estar completa-
mente seca. Pese uma quantidade de amostra, de tal modo que sua titulao corresponda
de 45 a 55% da titulao do branco. Esta massa normalmente de (4-5) g. Adicione
50 mL da soluo alcolica de KOH. Prepare um branco e proceda ao andamento analtico,
simultaneamente com a amostra. Conecte o condensador e deixe ferver suavemente at
a completa saponicao da amostra (aproximadamente uma hora, para amostras nor-
mais). Aps o resfriamento do frasco, lave a parte interna do condensador com um pouco
de gua. Desconecte do condensador, adicione 1 mL do indicador e titule com a soluo
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de cido clordrico 0,5 M at o desaparecimento da cor rsea.
Clculo
A = volume gasto na titulao da amostra
B = volume gasto na titulao do branco
f = fator da soluo de HCl 0,5 M
Nota: algumas amostras so mais difceis de serem saponicadas, requerendo mais de 1
hora de saponicao.
th
ed. Champaign, USA. A.O.C.S.,
1990. [A.O.C.S. Ocial method Cd 3-25].
329/IV Determinao do ndice de iodo pelo mtodo de Wijs
O ndice de iodo de um leo ou gordura a medida do seu grau de insaturao e
expresso em termos do nmero de centigramas de iodo absorvido por grama da amostra
(% iodo absorvido). O mtodo de Wijs aplicvel a todos os leos e gorduras normais
que no contenham ligaes duplas conjugadas. Cada leo possui um intervalo caracte-
rstico do valor do ndice de iodo. A xao do iodo ou de outros halognios se d nas
ligaes etilnicas dos cidos graxos.
Material
Balana analtica, agitador magntico, estufa, cronmetro, papel de ltro qualitativo,
frasco Erlenmeyer de 500 mL com tampa esmerilhada, proveta de 50 mL, pipetas volu-
mtricas de 2, 5, 20 e 25 mL e bureta de 50 mL.
Reagentes
cido clordrico
Iodo
Tetracloreto de carbono
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Tiossulfato de sdio (Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O)
Amido solvel
Iodeto de potssio
Soluo de Wijs
Soluo de iodeto de potssio a 15% m/v
Soluo de indicador de amido a 1% m/v.
Soluo de tiossulfato de sdio a 0,1 M
Procedimento Funda a amostra, caso no esteja no estado lquido (a temperatura da
fuso no dever exceder o ponto de fuso da amostra em 10
o
C). Filtre atravs de papel de
ltro para remover algumas impurezas slidas e traos de umidade. Pese aproximadamente
0,25 g em frasco Erlenmeyer de 500 mL com tampa e adicione 10 mL de tetracloreto de
carbono. Transra com auxlio de bureta, 25 mL de soluo de Wijs no frasco Erlenmeyer
que contm a amostra. Tampe e agite cuidadosamente com movimento de rotao,
assegurando perfeita homogeneizao. Deixe em repouso ao abrigo da luz e temperatura
ambiente, por 30 minutos. Adicione 10 mL da soluo de iodeto de potssio a 15% e 100
mL de gua recentemente fervida e fria. Titule com soluo tiossulfato de sdio 0,1 M at
o aparecimento de uma fraca colorao amarela. Adicione 1 a 2 mL de soluo indicadora
de amido 1% e continue a titulao at o completo desaparecimento da cor azul. Prepare
uma determinao em branco e proceda da mesma maneira que a amostra.
Clculo
M = molaridade da soluo de Na
2
S
2
O
3
V
B
= mL gasto na titulao do branco
V
A
= mL gasto na titulao da amostra
P = n g da amostra
Notas
Quando o ndice de iodo for determinado em material contendo sistemas de duplas
ligaes conjugadas, o resultado no uma medida do total de insaturao, mas um valor
emprico indicativo da sua quantidade na molcula.
Por ser de difcil preparao, recomenda-se a aquisio no comrcio do reagente de Wijs.
Armazene as solues de Wijs em frasco mbar, temperatura ambiente e ao abrigo da luz
e da umidade.
Devido toxicidade, o tetracloreto de carbono est sendo substitudo por ciclohexano.
Se o leo apresentar um ndice de iodo superior a 100, como por exemplo, os leos de ori-
gem marinha, o tempo de reao com a soluo de Wijs dever ser maior que 30 minutos.
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th
ed. Champaign, USA, A.O.C.S.,
1995 [A.O.C.S. Recommended Practice Cd 1 25].
330/IV Determinao do ndice de iodo por clculo
O ndice de iodo determinado por clculo aplica-se anlise de triglicerdios e de
cidos graxos livres e seus produtos hidrogenados. Este mtodo determina o ndice de
iodo de leos comestveis diretamente da composio de cidos graxos insaturados obti-
dos a partir da anlise por cromatograa em fase gasosa.
Procedimento Determine a composio de cidos graxos da amostra a ser analisada por
cromatograa em fase gasosa (344/IV).
Clculos
(% cido palmitolico x 0,950) + (% cido olico x 0,860) + (% cido linolico x 1,732)
+ (% cido linolnico x 2,616) + (% cido gadolico x 0,785) + (% cido ercico x 0,723)
= ndice de iodo dos triglicerdios
(% cido palmitolico x 0,990) + (% cido olico x 0,8986) + (% cido linolico x 1,810)
+ ( % cido linolnico x 2,735) + (cido gadolico x 0,8175) + (% cido ercico x 0,7497)
= indice de iodo dos cidos graxos livres
Nota: para leos com contedo de matria insaponicvel superior a 0,5% (ex.: leos de
peixe), o resultado tende a ser inferior ao determinado pelo mtodo de Wijs.
th
ed. Champaign, USA, A.O.C.S.
1995. [A.O.C.S. Recommended Practice Cd 1c-85].
331/IV Determinao do ndice de Bellier

Na anlise dos leos, a determinao do ndice de Bellier utilizada para a identi-
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cao do azeite de oliva.
Material
Chapa aquecedora, termmetro com divises de dcimos de grau, pipetas de 2, 5 e 50 mL,
frasco Erlenmeyer de 125 mL e refrigerante de reuxo.
Reagentes
Soluo alcolica de hidrxido de potssio a 8% m/v
cido actico (1+3)
lcool a 70% v/v
Procedimento Transra lentamente, com o auxlio de uma pipeta, 1 mL da amostra
para um frasco Erlenmeyer de 125 mL. Adicione 5 mL da soluo alcolica de hidrxido
de potssio a 8%. Adapte ao frasco Erlenmeyer um refrigerante de reuxo. Aquea em
chapa aqquecedora por 10 minutos. Esfrie at (25-30)C. Adicione 50 mL de lcool a
70%. Agite e adicione 1,5 mL de cido actico (1+3). Agite e adapte ao frasco um term-
metro de 50
o
C, dividido em dcimos de grau, de maneira que o bulbo do termmetro
mergulhe no lquido. Se houver turvao, aquea lentamente at cerca de 10
o
C acima
do ndice suposto. Resfrie o frasco, gradualmente e agitando sempre em um banho de
gua da seguinte maneira: mergulhe sucessivamente o frasco durante 10 segundos, retire
e agite por 10 a 20 segundos. A temperatura deve baixar lentamente.Tome, como ndice
de Bellier, a temperatura na qual nota-se o incio da turvao.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1: M-
todos qumicos e fsicos para anlise de alimentos, 3 ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 255.
332/IV Determinao do ponto de fuso
Os leos e gorduras naturais, de origem vegetal e animal, so misturas de glicer-
dios e de outras substncias e consistem de inmeros componentes. Estas substncias no
exibem um ponto de fuso denido e nem preciso. Portanto, o termo ponto de fuso
no implica nas mesmas caractersticas das substncias puras de natureza denitivamen-
te cristalina. As gorduras passam por um estgio de amolecimento gradual antes de se
tornarem completamente liquefeitas. O ponto de fuso deve ser denido por condies
especcas do mtodo pelo qual determinado e, neste caso, a temperatura na qual a
amostra torna-se perfeitamente clara e lquida. O mtodo do tubo capilar aplicvel para
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todas as gorduras animais e vegetais normais.
Material
Aparelho para determinao do ponto de fuso, tubos de ponto de fuso, tubos capilares
de vidro, termmetro com a especicao da A.O.C.S. : H 6-40 ou 7-45, bquer de 600
mL, papel de ltro e funil de vidro.
Procedimento Funda a amostra e ltre em papel de ltro para remover qualquer im-
pureza e resduo nal de mistura. A amostra deve estar absolutamente seca. Mergulhe
completamente pelo menos 3 tubos capilares limpos na amostra liquefeita, de maneira
que a gordura que a uma altura de 10 mm. Funda o nal do tubo (onde a amostra est
localizada) numa chama pequena, mas no queime a gordura. Coloque os tubos num
bquer e deixe em refrigerador entre (4 - 10)C durante 16 horas. Remova os tubos do
refrigerador e prenda-os com uma rolha de borracha ou de qualquer outra maneira ao ter-
mmetro, de modo que as extremidades inferiores dos tubos de fuso estejam no fundo
junto com o bulbo de mercrio do termmetro. Mergulhe o termmetro num bquer de
600 mL, contendo gua at a metade de seu volume. O fundo do termmetro deve estar
imerso a 30 mm na gua. Ajuste a temperatura inicial do banho de (8 - 10)C abaixo do
ponto de fuso da amostra no incio do teste. Agite o banho de gua com um pequeno
uxo de ar ou com outros mtodos adequados e fornea calor de maneira que aumente
a temperatura na faixa de 0,5C por minuto. As gorduras passam normalmente por um
estgio de opalescncia antes da completa fuso. O aquecimento contnuo at que os
tubos estejam completamente claros. Observe a temperatura na qual cada tubo se torna
claro e calcule a mdia de todos os tubos. Esta deve estar dentro de 0,5C. Considere esta
mdia como o ponto de fuso.
Nota: as amostras devem estar completamente liquefeitas quando os tubos forem coloca-
dos no refrigerador. uma boa prtica passar o fundo dos tubos que contm a amostra
momentaneamente por uma chama, antes de serem levados ao refrigerador.
praticces of the American Oil ChemistsSociety. 4
th
1990. [A.O.C.S. Ocial method Cc 1-25].
333/IV Reao de Kreis
Chama-se rancidez a alterao no odor e sabor dos leos e gorduras, provocada pela
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ao do ar (rancidez oxidativa) ou de microrganismos (rancidez cetnica). O mtodo
vlido para leos normais e gorduras lquidas. A oroglucina reage em meio cido com
os triglicerdios oxidados, dando uma colorao rsea ou vermelha, cuja intensidade au-
menta com a deteriorao devido, provavelmente, presena de aldedo malnico ou de
aldedo epidrnico.
Material
Pipeta de 5 mL, provetas de 10 mL e proveta de 50 mL com boca esmerilhada.
Reagentes
cido clordrico
Soluo de oroglucina em ter a 0,1% m/v
Procedimento Transra, com auxlio de uma pipeta, 5 mL de substncia fundida para
uma proveta de 50 mL com boca esmerilhada. Adicione 5 mL de cido clordrico e agite
por 30 segundos. Adicione 5 mL de uma soluo de oroglucina a 0,1% em ter. Agite
novamente por 30 segundos e deixe em repouso por 10 minutos. Na presena de substn-
cias ranosas, a camada inferior apresentar uma colorao rsea ou vermelha.
Nota: se a intensidade da colorao for fraca, compare a camada inferior com uma quan-
tidade anloga de soluo de permanganato de potssio a 0,0012% (transra 3,8 mL de
uma soluo 0,01 M para um balo volumtrico de 100 mL e complete o volume com
gua). Se a intensidade for a mesma ou inferior, o resultado pode deixar de ser levado em
considerao, caso os caracteres sensoriais do produto forem satisfatrios.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:
Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 260.

334/IV Determinao da umidade e matria voltil
A determinao da umidade e matria voltil um dos parmetros legais para a
avaliao da qualidade de leos e gorduras, sendo realizada por aquecimento direto a
105C.
Procedimento Faa a determinao conforme mtodo 012/IV alterando os intervalos
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de tempo de pesagem de trs para uma hora, at peso constante.
Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985. p .22.
335/IV Determinao de impurezas insolveis em ter
Este mtodo, aplicvel para todos os tipos de gorduras e leos, determina sujidades
e/ou outras substncias estranhas insolveis em ter de petrleo.
Material
Banho-maria, estufa, dessecador, proveta de 50 mL e cadinho de Gooch.
Reagente
ter de petrleo
Procedimento Use o resduo resultante da determinao da umidade e matria voltil.
Adicione 50 mL de ter de petrleo no resduo e aquea em banho-maria para dissolver
a gordura. Filtre em cadinho de Gooch com ajuda de vcuo. Lave com cinco pores
de 10 mL de ter de petrleo a quente, permitindo que cada poro escoe primeiro
para depois adicionar a outra poro. Lave completamente com ter de petrleo. Seque o
cadinho e aquea at peso constante em estufa a (101 1)C. Esfrie em dessecador at a
temperatura ambiente e pese.
Clculo
p = massa das impurezas insolveis no ter de petrleo
P = massa da amostra seca
AMERICAN OIL CHEMISTS` SOCIETY. Ofcial methods and recommended
th
1996. [A.O.C.S. Ocial method Ca 3a-46].
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Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985, p.
262.
336/IV Determinao de resduo por incinerao (cinzas)
Este mtodo determina o resduo remanescente depois de incinerao sob con-
dies especcas de teste. Aplicvel para gorduras animais e leos vegetais e marinhos.
Fundamenta-se na perda de peso que ocorre quando o produto incinerado a 550C,
com destruio da matria orgnica sem aprecivel decomposio dos constituintes do
resduo mineral ou perda por volatilizao.
Material
Cpsula de porcelana de 50 mL ou cpsula de platina de 100 mL, bico de Bnsen, tela de
amianto, trip, balana analtica, mua, papel de ltro e dessecador.
Procedimento Coloque o papel de ltro contendo os insolveis totais em ter obtido
conforme 335/IV em uma cpsula de porcelana de 50 mL ou cpsula de platina de 100
mL, previamente aquecida em mua a 550C por 1 hora, resfriada em dessecador at a
temperatura ambiente e pesada. Carbonize em bico de Bnsen com chama baixa. Incine-
re em mua a 550C. Resfrie em dessecador at a temperatura ambiente. Pese. Repita as
operaes de aquecimento e resfriamento at peso constante.
Nota: a combusto da amostra deve ser feita em capela, com exausto forada.
Clculo
p = n de g de resduo
P = n g da amostra
praticces of the American Oil Chemists`Society. 4
th
IAL - 609
1990. [A.O.C.S. Ocial method Ca 11-55]
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1:
Mtodos qumicos e fsicos para anlise de alimentos. 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985.
p. 263.
337/IV Determinao da densidade relativa
Este mtodo determina a razo da massa da amostra em relao da gua por uni-
dade de volume a 25C e aplicvel a todos os leos e gorduras lquidas.
Material
Picnmetro com junta esmerilhada de 50 mL, banho-maria mantido temperatura de
(25 0,1)C e termmetro com subdiviso de 0,1C.
Procedimento Funda a amostra, ltre com papel de ltro para remover as impurezas
e traos de umidade. Aquea temperatura de (20-23)C. Encha o recipiente do picn-
metro, adicionando a amostra cuidadosamente pelas paredes para prevenir a formao de
bolhas de ar. Tampe e coloque em banho-maria na temperatura de (25 0,1)C. Con-
serve o conjunto imerso na gua e espere atingir a temperatura acima especicada por
30 minutos. Remova com cuidado o leo que tenha escorrido pela lateral do recipiente.
Retire do banho e seque, evitando o manuseio excessivo. Pese e calcule a densidade.
Clculo
A = massa do recipiente contendo leo
B = massa do recipiente vazio
C = massa da gua temperatura de 25C
praticces of the American Oil Chemists` Society. 4
th
1990. [A.O.C.S. Ocial method Cc 10a-25].
338/IV Teste do frio
1 Edio Digital
610 - IAL
Este mtodo mede a resistncia da amostra cristalizao e comumente usado
tambm como ndice de winterizao e vericao da remoo da estearina no proces-
so. aplicvel a todos os leos vegetais normais, renados e em gordura animal isenta de
umidade.
Material
Banho-maria a 25C, banho de gelo a 0C, frasco especial para leo de 115 mL, funil e
papel de ltro.
Procedimento Filtre uma quantidade suciente da amostra (200-300) mL diretamente
com papel de ltro. Aquea a poro ltrada. Agite a amostra continuamente durante o
aquecimento e remova do calor quando a temperatura atingir 130C. Abastea um frasco
especial para leo completamente at o gargalo com a amostra e tampe hermeticamente.
Coloque o frasco num banho de gua a 25C e vede o banho com parana. Mergulhe o
frasco contendo a amostra em banho de gelo, de modo que o conjunto que coberto com
gua e gelo. Reabastea com gelo freqentemente, se necessrio, para manter o banho
solidamente empacotado, caso contrrio, a temperatura poder subir acima de 0C.
essencial que a temperatura do banho se mantenha a 0C. Ao nal de cinco horas e meia,
remova o frasco do banho e examine rigorosamente os cristais de gordura ou turvao
formada. No confundir cristais com pequenas bolhas de ar. Para o teste ser positivo, a
amostra precisa estar completamente clara, lmpida e brilhante.
Notas
A nalidade do tratamento a quente remover traos de impurezas, umidade e destruir
algum ncleo de cristais.
Recomenda-se utilizar um fundo preto iluminado para melhor visualizao do resultado
do teste, devendo a amostra car a uma distncia de 2 metros.
AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Ofcial methods and recommended prac-
ctices of the American Oil Chemists Society. 4
th
ed. Champaign, USA, A.O.C.S. 1990.
[A.O.C.S. Ocial method Ce 11-53].
339/IV Determinao de matria insaponicvel
IAL - 611
Matria insaponicvel inclui aquelas substncias que freqentemente se encon-
tram dissolvidas nas gorduras e leos e que no podem ser saponicadas por tratamento
usual com soda, mas so solveis em solventes normais para gorduras e leos. Incluem-se
neste grupo de componentes, lcoois alifticos de alto peso molecular, esteris, pigmentos
e hidrocarbonetos. O mtodo aplicvel para gorduras e leos animais e vegetais, no
sendo adequado para gorduras e leos contendo quantidade excessiva de matria insapo-
nicvel, como os leos marinhos. Este mtodo tambm no aplicvel para alimentos
com elevado teor de gordura.
Material
Extrator de gordura de capacidade de 200 mL com tampa de vidro, frascos Erlenmeyer
ou Soxhlet de 100 a 200 mL, funil de separao de 500 mL, sifo de vidro e balana
analtica.
Reagentes
lcool a 95% v/v
lcool a 10% v/v
Soluo de hidrxido de potssio a 50% m/v
ter de petrleo
Soluo de hidrxido de sdio 0,02 M
Soluo de fenolftalena
Procedimento Pese cerca de 5 g de amostra bem misturada em um frasco Erlenmeyer
ou Soxhlet. Adicione 30 mL de lcool a 95% e 5 mL de KOH a 50%. Aquea e deixe
em reuxo por 1 hora ou at completa saponicao. Transra para o funil de separao,
ainda quente, usando um total de 40 mL de lcool 95%. Complete a transferncia com
gua quente e depois fria at um volume total de 80 mL. Lave ainda o frasco com um
volume de 5 mL de ter de petrleo e transra para o funil. Esfrie at temperatura ambiente e
adicione 50 mL de ter de petrleo. Insira a tampa e agite vigorosamente por um minuto at o
total clareamento das duas camadas. Use sifo de vidro para remover completamente a ca-
mada superior sem incluir qualquer poro da camada inferior. Receba as fraes de ter
de petrleo em um funil de separao de 500 mL. Repita a extrao pelo menos seis vezes,
usando pores de 50 mL de ter de petrleo, agitando vigorosamente em cada extrao.
Lave os extratos combinados no funil de separao trs vezes, usando 25 mL de lcool
a 10%, agitando vigorosamente e retirando a camada alcolica depois de cada extrao.
Evite remover qualquer parte da camada de ter de petrleo. Transra o extrato de ter
de petrleo para um bquer tarado e evapore at a secagem em banho de gua. Depois de
1 Edio Digital
612 - IAL
todo o solvente ter sido evaporado, complete a secagem em estufa a vcuo temperatura
de (75-80)C e presso interna de 200 mm de Hg. Esfrie em dessecador e pese. Depois
da pesagem, dissolva o resduo em 50 mL de lcool a 95% a 50 C previamente neutra-
lizado contendo fenolftalena como indicador. Titule com NaOH 0,02 M at o ponto de
viragem. Corrija a massa do resduo para cidos graxos livres contidos, usando a seguinte
relao: 1 mL de 0,02 M de NaOH equivalente a 0,0056 g de cido olico. Faa um
branco sem a presena de leo ou gordura e proceda da mesma maneira que a amostra.
Clculo
A = massa do resduo obtido aps secagem a vcuo
B = massa de cido graxo determinado por titulao
C = massa do branco.
P = n de gramas da amostra
th
ed. Champaign, USA,. A.O.C.S.
1990. [A.O.C.S. Ocial method Ca 6a-40].
340/IV Prova de Halphen-Gastaldi
Esta prova considerada especca para a presena de estruturas ciclopropnicas
contidas no cido esterclico ou cidos de estruturas similares. Detecta, qualitativamente,
a presena de leo de semente de algodo em leos e gorduras animais ou vegetais.
Material
Pipeta de 5 mL, tubo de ensaio, banho-maria e proveta de 10 mL.
Reagentes
Soluo de enxofre em sulfeto de carbono a 1% m/v
Piridina.
Procedimento Transra 5 mL da amostra para um tubo de ensaio. Adicione 5 mL de
IAL - 613
uma soluo de enxofre em sulfeto de carbono a 1% e uma gota de piridina. Adapte ao
tubo de ensaio um tubo de segurana. Mergulhe o tubo em banho-maria durante 15
minutos. Recolha o sulfeto de carbono destilado em um bquer com gua. Na presena
de leo de semente de algodo, aparecer uma colorao vermelha ou vermelho-cereja. A
intensidade de cor depende da quantidade de leo de semente de algodo presente.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1:
264-265.
341/IV Prova de Holde
Este mtodo detecta, qualitativamente, a presena de leo de amendoim em leos
e gorduras animais ou vegetais.
Material
Pipetas de 1 e 5 mL, tubo de ensaio graduado e bico de Bnsen.
Reagentes
Soluo alcolica de hidrxido de potssio a 3,3% (lcool a 90%) m/v
lcool
Procedimento Transra 0,65 mL da amostra para um tubo de ensaio graduado. Adi-
cione 5 mL de soluo alcolica de hidrxido de potssio a 3,3% (lcool a 90%). Aquea
at a ebulio e saponique durante dois minutos. Esfrie e adicione uma quantidade de
lcool a 90% equivalente ao evaporado. Coloque em banho a 18C, por 10 minutos. Na
presena de leo de amendoim, aparecer uma turvao ou um precipitado gelatinoso,
dependendo da quantidade de leo de amendoim presente.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1:
Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3. ed. So Paulo: IMESP, 1985.
p. 265
1 Edio Digital
614 - IAL
342/IV Prova de Villavecchia-Fabris
Este mtodo detecta, qualitativamente, a presena de leo de ssamo (gergelim) em
leos e gorduras animais ou vegetais.
Material
Pipetas de 1 e 5 mL, proveta de 10 mL e tubo de ensaio.
Reagentes
Soluo alcolica de furfural puricado a 1% (lcool a 95%) m/v
cido clordrico
Procedimento Transra 5 mL da amostra para um tubo de ensaio (se a amostra for
muito espessa, adicione 5 mL de ter de petrleo). Adicione 0,2 mL da soluo alcolica
de furfural a 1% (lcool a 95%) e 5 mL de cido clordrico. Agite o tubo durante 30
segundos. Deixe em repouso at separao das camadas. Na presena de leo de ssamo
(gergelim), a camada cida apresentar uma colorao vermelha persistente.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v 1:
Mtodos Qumicos e Fsicos para Anlise de Alimentos, 3 ed. So Paulo: IMESP, 1985. p. 265.
343/IV Determinao da extino especca por absoro na regio do ultravioleta.
Este mtodo descreve o procedimento para o exame espectrofotomtrico de
azeite de oliva e outros leos e gorduras na regio do ultravioleta. A anlise espectro-
fotomtrica na regio do ultravioleta pode fornecer informaes sobre a qualidade
de um leo, seu estado de conservao e alteraes causadas pelo processamento.
A absoro em 232 e 270 nm, comprimentos de onda especicados no mtodo,
devida presena de sistemas dienos e trienos conjugados, respectivamente. Estes
compostos so formados por oxidao e/ou reno do leo. Azeites de oliva virgem de
boa qualidade e armazenados sob condies adequadas contm poucos produtos de
oxidao os quais absorvem prximo a 232 nm. Em alguns casos particulares, azeites
de oliva virgem alterados podem exibir caractersticas espectrais prximas dos leos
renados.
IAL - 615
Neste mtodo, o leo ou gordura em questo dissolvido em solvente apropriado
e a extino da soluo determinada nos comprimentos de onda especicados, usando
como referncia o solvente puro. Estas absores so expressas como extines especcas
(a absorbncia de uma soluo a 1% do leo no solvente especicado, numa espes-
sura de 1 cm), convencionalmente indicadas por K.
Material
Espectrofotmetro UV/VIS com leituras individuais para cada comprimento de onda,
cubetas de quartzo com caminho ptico de 1 cm, bales volumtricos de 25 mL, colunas
de vidro cromatogrcas com comprimento de 450 mm, dimetro interno de 35 mm,
provida de tubo de descarga com 10 mm de dimetro aproximadamente e mua.
Reagentes
Ciclohexano ou isoctano, grau espectrofotomtrico
Alumina bsica
Hexano, grau cromatogrco
Azeite de oliva virgem
leo de amendoim renado
Preparao da alumina Coloque alumina, previamente dessecada em mua a (380 -
400)
o
C por 3 horas, em um frasco hermeticamente fechado. Adicione gua na proporo
de 5 mL para 100 g de alumina. Feche o frasco de imediato e agite repetidamente. Deixe
em repouso por pelo menos 12 horas antes de usar.
Vericao da atividade da alumina Prepare a coluna cromatogrca com 30 g de alu-
mina. Passe atravs da coluna uma mistura consistindo de 95% de azeite de oliva virgem
(k < 0,18 a 268 nm) e 5% de leo de amendoim renado (k > 4 a 268 nm). Se aps a pas-
sagem atravs da coluna a mistura apresentar uma extino especca maior que 0,11 a 268
nm, a alumina aceitvel. Caso contrrio, o nvel de hidratao deve ser aumentado.
Procedimento A amostra a ser analisada deve estar perfeitamente homognea e livre de
impurezas. leos lquidos temperatura ambiente devem ser ltrados atravs de papel de
ltro temperatura de aproximadamente 30C. Gorduras slidas devem ser homogenei-
zadas e ltradas temperatura no superior a 10C acima do ponto de fuso. Pese aproxi-
madamente 0,25 g da amostra em um balo volumtrico de 25 mL. Dissolva e complete
o volume com ciclohexano ou isoctano e homogeneze (soluo A). A soluo resultante
1 Edio Digital
616 - IAL
deve ser perfeitamente lmpida. Se ocorrer opalescncia ou turbidez, ltre rapidamente
atravs de papel de ltro. Transra 5 mL desta soluo e dilua a 25 mL com o ciclohexa-
no ou isoctano em balo volumtrico (soluo B). Encha uma cubeta com a soluo A e
mea a absorbncia a 270 nm, usando o mesmo solvente como referncia, em espectro-
fotmetro previamente calibrado. Procedendo da mesma maneira, mea a absorbncia da
soluo B a 232 nm. Os valores de absorbncia obtidos devem estar compreendidos na
faixa de 0,1 a 0,8. Quando o valor obtido da extino especca a 270 nm for superior
ao limite mximo legal estabelecido para a classicao do azeite, torna-se necessria a
puricao por coluna cromatogrca com alumina ativada, como segue: transra 30 g
de alumina previamente ativada em suspenso com hexano para coluna cromatogrca.
Remova o excesso de hexano deixando o nvel do solvente a 1 cm da alumina. Dissolva
10 g de leo em 100 mL de hexano homogeneizado e livre de impurezas, conforme j
descrito neste procedimento e passe esta soluo pela coluna. Colete o eluato e evapore
todo o solvente sob vcuo e proceda como descrito anteriormente.
Clculo
K
= extino especca no comprimento de onda

A

= absorbncia medida no comprimento de onda
c =concentrao da soluo em g/100 mL
l = caminho ptico da cubeta em cm
Nota: a anlise espectrofotomtrica do azeite de oliva inclui a determinao da variao
da extino especca:

K = Extino especca no comprimento de onda para a mxima absoro em torno de
270 nm
th
1990. [A.O.C.S. Ocial method Ch 5-91].
IAL - 617
344/IV Anlise por cromatograa em fase gasosa dos steres metlicos de cidos
graxos
A determinao da composio de cidos graxos a partir da anlise dos steres
metlicos auxilia no estudo de fraudes e na avaliao do contedo nutricional de leos
e gorduras de origem vegetal ou animal. Por este mtodo, os steres metlicos de cidos
graxos so separados, identicados e quanticados por cromatograa em fase gasosa. O
mtodo aplicvel para a determinao de steres metlicos de cidos graxos contendo de
4 a 24 tomos de carbono, obtidos a partir de cidos graxos de leos e gorduras.
Material
Cromatgrafo a gs com sistema de injeo para coluna capilar (com capacidade de divi-
so da amostra) e coluna empacotada (com o menor volume morto possvel), forno com
variao mxima de 1C para colunas empacotadas, 0,1C para colunas capilares e com
temperatura programvel (fundamental para anlise de steres metlicos de cidos graxos
com menos de 16 tomos de carbono na molcula); detector de ionizao de chama
(DIC); seringa de 10 L graduada em 0,1 L e registrador ou integrador ou computa-
dor.
Coluna empacotada
A coluna deve ser construda com um material inerte s substncias que sero analisadas,
isto , vidro ou ao inox. Deve possuir comprimento de (1-3) m e dimetro interno de
(2-4) mm.
Suporte de empacotamento So empregadas, normalmente, terras diatomceas que
sofreram lavagem cida e silanizao. O tamanho das partculas deve estar compreen-
dido na faixa de (60-120) e (125-250) mesh, sendo que a variao entre elas no deve
ser superior a 25 m.
Fase estacionria Pode ser empregado um lquido viscoso polar de polisteres, isto ,
polisuccinato de dietileno glicol (DEGS), polisuccinato de butanediol, poliadipato de
etileno glicol. A fase estacionria deve corresponder de (5-20)% do empacotamento da
coluna.
Condicionamento de uma coluna nova Desconecte a coluna do lado do detector e
gradativamente aquea o forno a aproximadamente 10C acima da temperatura de ope-
rao, sempre passando o gs de arraste. Mantenha esta temperatura, passando pela co-
luna o gs de arraste com uxo de (20 - 60) mL/min por aproximadamente 16 horas e
por mais 2 horas a 20C acima da temperatura de operao. Cuidado para no exceder a
1 Edio Digital
618 - IAL
temperatura mxima recomendada pelo fabricante.
Coluna capilar
Tubo O tubo da coluna feito de material inerte, normalmente slica fundida. O di-
metro interno pode variar de (0,2-0,8) mm. A superfcie interna do tubo sofre um trata-
mento apropriado, antes de ser depositada a fase estacionria. O comprimento da coluna
varia normalmente de (25 - 100) m.
Fase estacionria As fases estacionrias so lmes de polietileno glicol, polisuccinato de buta-
nediol, ciano propil siloxanos, entre outras. A espessura do lme pode variar de (0,1 - 0,25) m.
Instalao e condicionamento da coluna Tome os devidos cuidados na instalao das
colunas nos fornos, ajustando as coneces para evitar vazamento dos gases ou quebra da
coluna e reduzindo os espaos mortos. Condicione a coluna sempre passando o gs de
arraste e programe o aquecimento da temperatura do forno a 3C/min a partir da tem-
peratura ambiente at 10C abaixo da temperatura de decomposio da fase estacionria
(verique as recomendaes do fabricante). Mantenha esta temperatura por 1 hora at
estabilizar a linha de base.
Reagentes
Gs de arraste para DIC: hidrognio (coluna capilar), nitrognio, hlio ou argnio (pu-
reza 99,999%).
Gases auxiliares para o DIC: nitrognio, hidrognio (pureza 99,999 %) e ar super seco
(livre de hidrocarbonetos).
n-Hexano grau cromatogrco.
Padres de referncia: mistura de steres metlicos de cidos graxos ou padres individu-
ais de steres metlicos (ampolas seladas com mg dos padres) ou um leo de composio
conhecida, de preferncia similar ao leo ou gordura a ser analisado.
Solues-padro de referncia Dissolva o contedo da ampola (mg) dos padres de
referncia em n-hexano e transra para um balo volumtrico de 100 mL ou de outro
volume apropriado. Complete o volume com o mesmo solvente.

Procedimentos
Condies otimizadas de operao Para coluna empacotada, considere as seguintes va-
riveis: tamanho e dimetro interno da coluna, temperatura da coluna, uxo do gs de
arraste [proporo ideal: nitrognio, hidrognio e ar sinttico 1:1:10 (exemplo: N
2
(gs
de arraste) 30 mL/min, H
2

30 mL/min e ar sinttico 300 mL/min)], resoluo requerida,
IAL - 619
tamanho da amostra para anlise. O tamanho da amostra escolhido deve situar-se dentro
da faixa linear de resposta do detector.
Para coluna capilar considere as mesmas variveis citadas para a coluna empacotada. A
ecincia (nmero de pratos tericos) obtida para cada componente separado por uma
coluna capilar deve ser ao redor de 100000 ou no mnimo 3000 pratos por metro de
coluna.
Dependendo do tipo de amostra e da coluna disponvel deve-se otimizar as condies de
anlise para se obter a melhor ecincia e resoluo dos componentes. Para a anlise de
steres metlicos de cidos graxos de leos vegetais, recomenda-se, por exemplo,as condi-
es do mtodo Method Ce 1h-05 ou a descrita abaixo:
Coluna de fase estacionria ciano propil siloxona de 50 a 100 m, com 0,25 m de espes-
sura do lme e 0,25 mm de dimetro interno.
Gs de arraste, hidrognio, velocidade linear entre (15 - 25)mL/min, razo de diviso da
amostra 1:50.
Exemplo: coluna de 50 m
Temperatura programada da coluna de 80 a 220C, sendo a velocidade de aquecimento
de 5C por minuto. Mantenha a 220C por 10 minutos.
Temperatura do injetor: 230C
Temperatura do detector: 240C
Determinao da ecincia e resoluo Analise uma mistura de steres metlicos dos
cidos esterico e olico com propores equivalentes dos dois compostos. Calcule o n-
mero de pratos tericos n (ecincia) e a resoluo pelas frmulas:

dR
1
= distncia de reteno, medida em mm, do incio da injeo ao mximo do pico
do metil estearato.
w
1
e w
2
= larguras dos picos do metil estearato e oleato, respectivamente
= distncia entre os mximos dos picos do metil estearato e metil oleato
As condies de anlise que devem ser escolhidas so as que produzirem:
n = 3000 pratos tericos por metro de coluna (no mnimo) para o estearato de metila
R = 1,25 (no mnimo)
1 Edio Digital
620 - IAL
Nota: deve-se trabalhar com temperatura do forno da coluna programvel na anlise de
amostras contendo cidos graxos com pesos moleculares muito diferentes. Diversos equi-
pamentos possuem softwares que calculam os parmetros de desempenho da coluna,
auxiliando na seleo rpida da melhor condio de anlise.
Determinao dos steres metlicos Prepare a amostra como descrito em um dos pro-
cedimentos a seguir: 054/IV, 055/IV ou 056/IV. Injete no cromatgrafo de 0,1 a 2 L
da soluo de steres metlicos de cidos graxos de padres puros ou obtidas conforme
descrito acima. Analise a mistura de padres de referncia de steres metlicos de cidos
graxos de composio conhecida nas mesmas condies empregadas na anlise da amos-
tra e determine o tempo de reteno (ou distncia de reteno) para cada ster metlico.
Construa o grco do logaritmo do tempo de reteno em funo do nmero de tomos
de carbono dos cidos graxos. Em condies isotrmicas de anlise, o grco para steres
de sries homlogas e cadeia linear, deve ser uma reta. As retas so praticamente paralelas
para diferentes sries homlogas. Empregando-se os grcos obtidos como descrito acima,
pode-se identicar um ster de cido graxo de uma srie homloga por interpolao.
Na prtica utiliza-se o clculo de ECN, isto , nmero equivalente de carbono, para iden-
ticao de cidos graxos de uma srie homloga.
Os valores de ECN so calculados a partir dos valores dos tempos de reteno dos com-
postos.
Agi = cido graxo a ser identicado
n e n+i = nmero de tomos de carbono de padres homlogos de cadeia reta, eludos
antes e depois do cido graxo a ser identicado.
t
Agi
= t
Agi
- t
0

t
Agi
= tempo de reteno corrigido
t
Agi
= tempo de reteno da substncia a ser identicada
t
0
= tempo de reteno de uma substncia no retida. (Ex: butano, pentano em colunas
polares).
t
Agn
+ t
Agn+i
= tempos de reteno corrigidos de padres homlogos de cadeia reta, eludos
antes e depois do cido graxo a ser identicado.
(inormalmente igual a mltiplos de 2)
IAL - 621
Com determinada programao de temperatura (aumento linear de temperatura) a equa-
o simplicada para:
Clculos
Normalizao
Exceto em casos excepcionais, assuma que todos os componentes da amostra estejam re-
presentados no cromatograma. Desta forma a soma das reas de todos os picos represen-
tar 100% dos constituintes (eluio total). Se o equipamento incluir um computador ou
integrador, utilize seus recursos para o clculo. Caso contrrio, determine a rea de cada
pico multiplicando a altura pela largura na meia altura. Quando necessrio, considere
as vrias atenuaes utilizadas durante o registro dos cromatogramas. De uma maneira
geral, quando no esto presentes quantidades signicativas de componentes com menos
de 12 tomos de carbono, calcule a porcentagem de rea do pico correspondente ao cons-
tituinte, em relao soma das reas de todos os picos. O resultado ser expresso como
porcentagem de rea do componente (ster metlico).

A
Agi
= rea do pico correspondente ao componente i
A = soma das reas de todos os picos.
Normalizao com fatores de correo
Os fatores de correo da resposta do detector so determinados quando esto presentes
na amostra cidos graxos com menos de 12 tomos de carbono e/ou cidos graxos com
grupos secundrios ou, ainda, quando se utiliza um detector de condutividade trmica.
Estes fatores devem ser usados para converter as porcentagens de rea dos picos em por-
centagem de massa dos componentes. Determine os fatores de correo com a ajuda de
um cromatograma obtido da anlise da mistura de padres de steres metlicos, de com-
posio conhecida, nas mesmas condies de anlise da amostra.
1 Edio Digital
622 - IAL
Para a mistura padro:

M
Agi
= massa do componente i na mistura padro.
M

= massa total dos vrios componentes na mistura padro
Do cromatograma da mistura padro, calcule:

A
Agi
= rea do pico correspondente ao componente i
A

= soma da rea de todos os picos.
Geralmente os fatores de correo so calculados com relao ao K
C16
(ster metlico do
cido palmtico). Assim os fatores relativos so:
Expresse o resultado em % de massa (m/m) do componente (ster metlico):

Pode ser feito o clculo terico dos fatores de correo do detector de ionizao de chama
(DIC):

Agi
Agi
Agi
Agi
Agi
Agi Agi
Agi Agi
IAL - 623
K
Agi
= fator de resposta para o cido graxo i
M
Agi
= massa molecular do ster metlico de cido graxo i
n
Agi
= nmero de tomos de carbono do ster metlico do cidos graxo i
A
c
= massa atmica do carbono (12,01)
Pesos atmicos utilizados no clculo:
Carbono = 12,01; Hidrognio = 1,0079; Oxignio = 15,994.
Fator relativo de resposta do DIC para cada componente com relao ao C
16:0
:
K
Ag i
= fator relativo de correo, para o cido graxo i
K
C16
= fator de resposta do DIC para o C
16:0
K
Agi
= fator de resposta do DIC para o cido graxo i
A determinao dos fatores de correo de resposta do DIC especialmente importante
para os cidos graxos de baixo peso molecular (C
4:0
; C
6:0
), como por exemplo, para os
derivados de gordura de leite e para os de alto peso molecular, como os de leos de peixe,
pois nestes casos os fatores relativos desviam de forma considervel da unidade.
Clculo com padro interno (PI)
Empregue o mtodo de padronizao interna para determinar o valor absoluto de um cido
graxo na amostra ou na quanticao de cidos graxos com baixo peso molecular (4 a 6 to-
mos de carbono) juntamente com cidos graxos de alto peso molecular (16 a 24 tomos de
carbono) na mesma amostra. steres metlicos de cidos graxos com nmero mpar de carbo-
nos so freqentemente usados como padro interno (Ex: C
5:0
; C
11:0
; C
13:0
; C
19:0
ou C
23:0
).
Expresse o resultado em % de massa do componente (ster metlico):
C
1 Edio Digital
624 - IAL
M

= massa em miligramas da amostra
A
PI
= rea do PI
M
PI
= massa em miligramas do PI
A
AGi
= rea correspondente ao componente i
K
Agi
= fator de correo da resposta do DIC para o cido graxo i (relativo a K
C16
)
K
PI
= fator de correo da resposta do DIC para o PI (relativo a K
C16
)
Nota: quando o resultado for expresso em gramas de cidos graxos por 100 g de leo,
deve-se multiplicar pelo fator 0,956.
th
ed. Champaign, USA: A.O.C.S.,
1995 (A.O.C.S. Ocial Method Ce 2-66: Preparation of methyl esters of long chain
fatty acids).
th
ed. Champaign, USA: A.O.C.S.,
1995 (A.O.C.S. Ocial Method Ce 1-62: Fatty acid composition by gas chromatogra-
phy).
th
ed. Champaign , USA: A.O.C.S.,
1995 (A.O.C.S. Ocial Method Ce 1d-91 Determination of fatty acids in edible oils
and fats by capillary GLC).
AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY. Ofcial methods and recommended prac-
tices of the American Oil Chemists Society. 4
th
ed. Champaign , USA: A.O.C.S.,
1997 (A.O.C.S. Ocial Method Ce 1f-96 Determination of cis and trans fatty acids in
hydrogenated and rened oils and fats by capillary GLC).
INTERNATIONAL STANDARD ORGANIZATION. IS0 5508: Animal and
vegetable fats and oils Analysis by gas chromatography of methyl esters of fatty acids.
ISO 5508. 1990E
INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1
266.
IAL - 625
345/IV Determinao de tocoferis e tocotrienis por cromatograa lquida de alta
ecincia
Este mtodo quantica tocoferis (alfa, beta, gama e delta) e tocotrienis em leos vegetais
ou gorduras. Baseia-se na dissoluo da amostra em solvente orgnico e injeo direta em
cromatgrafo a lquido para a separao e quanticao dos tocoferis e tocotrienis.
Material
Sistema de cromatograa a lquido de alta ecincia (CLAE) composto de: bomba de
alta presso, dispositivo para injeo da amostra, detector de uorescncia ajustado para
os comprimentos de onda de 290 nm de excitao e 330 nm de emisso (na indispo-
nibilidade de detector de uorescncia, utilize o de UV ajustado em 292 nm), coluna
analtica de CLAE (250mm x 4mm) empacotada com micropartculas de slica de 5 m,
pr-coluna de slica; espectrofotmetro UV/VIS; rotavapor; bales volumtricos mbar
de 25, 50 e 100 mL; pipetas volumtricas de 10 mL e pipetas automticas (20 a 200 L
e 200 a 1000 L).
Reagentes
Padres de , , , - tocoferis de alta pureza (superior a 95%).
Metanol.
n-Hexano.
Isopropanol
Fase mvel para CLAE Hexano - isopropanol (99,5:0,5).
Nitrognio seco
Nota: todos os solventes devem ser grau CLAE
Soluo-padro estoque de -tocoferol Pese cerca de 10 mg do padro em um balo
volumtrico mbar 100 mL e complete o volume com n-hexano. Pipete 10 mL desta so-
luo para um frasco mbar e remova o solvente num rotavapor. A temperatura no deve
exceder a 40
o
C. Retire o frasco e remova o solvente residual com nitrognio. Adicione 10
mL de metanol, com pipeta volumtrica, e agite para dissolver o tocoferol. Mea a ab-
sorbncia desta soluo a 292 nm e calcule a concentrao (como g/mL de -tocoferol)
dividindo-se o valor da absorbncia lida por 0,0076.
1 Edio Digital
626 - IAL
Solues-padro estoque de , , -tocoferis Prepare a soluo-estoque para cada
um dos padres de , , -tocoferol e proceda como descrito para a soluo-padro de
-tocoferol. Mea a absorbncia de cada uma das solues nos comprimentos de onda
indicados abaixo e utilize os respectivos fatores para o clculo da concentrao e pureza.
296 nm -tocoferol = 0,0089
Notas
Os fatores citados so derivados dos valores da absoro especca dos tocoferis nos res-
pectivos comprimentos de onda.
Estoque as solues-padro em frasco de vidro mbar, ao abrigo da luz e sob refrigerao
pelo perodo de uma semana.
Soluo de trabalho de mistura de tocoferis Combine volumes apropriados das solu-
es-padro estoque para obter solues de trabalho com concentraes dos tocoferis
entre 1 e 5 g/mL. Escolha no mnimo cinco pontos para a curva de calibrao. Utilize
n-hexano nas diluies.
Nota: Quando utilizar detector UV prepare uma soluo mais concentrada dos padres.
Procedimentos
Otimizao dos parmetros analticos Condicione a coluna, se necessrio. Ajuste o u-
xo da fase mvel [n-hexano/isopropanol (99,5:0,5 v/v)] em 1 mL/min e deixe pelo menos
30 min. Injete cerca de 20 L da mistura dos padres de tocoferis e, se necessrio, ajuste
a proporo de isopropanol da fase mvel e o uxo. O uxo da fase mvel adequado deve
estar entre (0,7 - 1,5)mL/min. O tempo de reteno do -tocoferol no deve ser menor
que 5 minutos. O Fator de resoluo (R) para o e -tocoferol no deve ser menor que
1,0. Fator de resoluo (R) calculado por:
Rd
1
= distncia de reteno do -tocoferol
Rd
2
= distncia de reteno do -tocoferol
W
1
= largura da base do pico do -tocoferol
W
2
= largura da base do pico do -tocoferol
IAL - 627
Preparao da amostra A amostra lquida de leo deve ser homogeneizada (no ltre).
Para amostra slida, transra uma certa quantidade representativa (no menos que 10%
do peso total da amostra) para um bquer e homogeneze cuidadosamente. Faa a fuso
em um banho-maria onde a temperatura no exceda a 40
o
C. O preparo da amostra deve
ser feito na ausncia de luz. Pese com preciso, entre 0,2 e 0,5 g da amostra de leo e
transra para um balo volumtrico de 25 mL com n-hexano. Agite para dissolver e com-
plete o volume com o mesmo solvente. Quando utilizar um detector de uorescncia,
podem ser necessrias algumas diluies para a obteno de um cromatograma adequado.
A amostra deve estar protegida da luz durante os procedimentos de preparo e deve ser
analisada no mesmo dia.
Determinao de tocoferis na amostra Injete 20 L da amostra e identique os toco-
feris (e tocotrienis) presentes por comparao com os tempos de reteno dos padres.
Registre as reas dos picos dos tocoferis e dos tocotrienis. Faa duas determinaes su-
cessivas para cada tocoferol, usando alquotas-teste preparadas recentemente. O resultado
nal deve ser a mdia de duas determinaes obedecendo a exigncia da repetitividade
(vide resultados estatsticos do estudo colaborativo do mtodo IUPAC 2432).
Curva de calibrao Injete cerca de 20 L das solues de mistura dos padres de
tocoferis. Repita a injeo e verique se os cromatogramas obtidos so reprodutveis.
Construa as curvas de calibrao pelo mtodo de padronizao externa.

Clculos
A quanticao dos tocoferis feita por padronizao externa. Os teores dos tocoferis
so calculados a partir de curvas de calibrao construdas pelos softwares dos equipamen-
tos ou em planilhas de clculo (ex: excel). Para a construo da curva utilize no mnimo
cinco pontos, isto , no mnimo cinco nveis de concentrao de cada padro. As curvas
obtidas relacionam a concentrao dos padres e a resposta do detector (rea).
O teor de -tocoferol presente em uma amostra, em g/g, dado por:
C = concentrao do padro de -tocoferol (g/mL)
A = medida da rea do pico obtido pelo padro de -tocoferol
a = medida do rea do pico obtida pela amostra de -tocoferol
m = massa da amostra
D = fator da diluio
Os teores de , e -tocoferis da amostra so calculados como o procedimento anterior
usando os dados do cromatograma do correspondente padro de tocoferol.
1 Edio Digital
628 - IAL
Nota: os tocotrienis contidos na amostra podem ser estimados usando os valores de C
e A para o correspondente tocoferol. De acordo com a literatura a intensidade da uo-
rescncia para os tocoferis a mesma do correspondente tocotrienol e a absorbncia no
UV similar.
INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY. IUPAC
2432: Determination of tocopherols and tocotrienols in vegetable oils and fats by high
performance liquid chromatography. Pure & Appl. Chem., v. 60, n. 6. p. 887-892,
346/IV Determinao de tocoferis e tocotrienis por cromatograa lquida de alta
ecincia em produtos processados contendo steres de tocoferis.
Produtos processados contendo steres de tocoferis, como por exemplo, margari-
nas, so saponicados e a matria insaponicvel obtida dissolvida em solvente orgnico
e injetada em cromatgrafo a lquido para a separao e quanticao dos tocoferis e
tocotrienis.
Material
Balana analtica, banho-maria, rotavapor, bales mbar de fundo chato de 50 e 100 mL
com boca esmerilhada, funis de separao mbar de 250 mL, ltros de vidro, provetas de
10 e 50 mL, papel de ltro e balo volumtrico de 50 mL.
Reagentes
lcool aproximadamente 95%
cool absoluto a 99%
Pirogalol
Soluo de KOH a 60% m/v
ter etlico livre de perxidos (contendo 0,1% m/m de pirogalol)
HCl 0,01 M
Sulfato de sdio anidro
Procedimento Pese cerca de 2 g da amostra em balo de fundo chato mbar de 100 mL.
Adicione aproximadamente 8 mL de lcool 95%, para dissolver completamente a amostra.
Agite levemente o frasco. Adicione 100 mg de pirogalol e agite para dissolver. Purique
com nitrognio, adicione 4 mL de soluo aquosa de KOH 60%. Passe nitrognio e
IAL - 629
tampe o frasco. Coloque o frasco em um banho-maria temperatura de 26C e agite
vigorosamente por 10 minutos. Todas as operaes devem ser realizadas na ausncia de
luz direta (use frascos de vidro mbar ou os envolvam com papel alumnio). Adicione 50
mL de gua ao frasco e transra o contedo quantitativamente para um funil de separa-
o de 250 mL. Lave o frasco com 50 mL de ter etlico livre de perxidos e transra as
lavagens para o funil. Agite vigorosamente o funil de separao por 1 minuto, abrindo a
tampa ocasionalmente para liberar a presso formada. Deixe em repouso para que ocorra
a separao das camadas. Retire a camada aquosa (camada inferior). Faa mais quatro
extraes da camada aquosa com 30 mL de ter etlico isento de perxidos e combine
os extratos etreos em outro funil de separao. Lave o extrato etreo combinado com
50 mL de gua (agitando cuidadosamente para evitar formao de emulso) e a seguir
com 30 mL de HCl 0,01 M. Separe as fases. Despreze a fase aquosa. Filtre a frao etrea
passando por cerca de 3 g de Na
2
SO
4
anidro, com a ajuda de um funil e papel de ltro.
Colete o ltrado em balo de fundo chato mbar para adaptar em um rotavapor. Remova
o ter sob presso reduzida, no excedendo a temperatura de 40C. Se o resduo lquido
permanecer no frasco, adicione lcool absoluto 99% e evapore at secura. Lave as pa-
redes do frasco com n-hexano e transra o contedo quantitativamente para um balo
volumtrico de 50 mL. Complete o volume. Dilua adequadamente a amostra e proceda
conforme 345/IV.
INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY. IUPAC
2432: Determination of tocopherols and tocotrienols in vegetable oils and fats by high
performance liquid chromatography. Pure & Appl. Chem., v. 60, n. 6. p. 887-892,
1988.
Colaboradores
Emy Takemoto, Mrio Tavares, Miriam Solange Fernandes Caruso, Regina Sorrentino Minazzi
Rodrigues e Sabria Aued Pimentel

Óleos e Gorduras IAL Cap16

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IAL - 593

= extino especca no comprimento de onda

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