UNIVERSIDAD DE LOS ANDES.

MRIDA VENEZUELA
FACULTAD DE INGENIERIA
ESCUELA DE INGENIERIA QUIMICA
DEPARTAMENTO DE QUIMICA INDUSTRIAL Y APLICADA
LABORATORIO DE ANALISIS INSTRUMENTAL
J. Guerrero, O. Garca, D. Canro

SEPARACION DE PIGMENTOS NATURALES POR CROMATOGRAFIA EN COLUMNA


RESUMEN
La tcnica de cromatografa en columna permite separar los pigmentos naturales como -carotenos y
licopenos del extracto de zanahoria, debido a que constituye un mtodo de separacin de los componentes de
una mezcla de acuerdo a su distribucin entre la fase estacionaria y la fase mvil las cuales son inmiscibles
entre s. Experimentalmente se realiz la separacin empacando una columna con almina, y haciendo eluir
los solventes seleccionados de acuerdo a su poder eluyente, utilizndose hexano seguido de una mezcla
50:50 hexano-cloroformo se obtuvo una separacin de los betacaroteno presentes en la muestra, los cuales
se identificaron cualitativamente por espectrometra de absorcin, ya que present los mximos de absorcin
caractersticos en el barrido de absorbancia vs longitud de onda. Utilizando las fases estacionaria y mvil
adecuadas, la cromatografa en columna permite separar los distintos pigmentos presentes en los vegetales y
plantas, teniendo una amplia aplicacin en la industria alimentaria y farmacutica.


INTRODUCCION TEORICA


La cromatografa es un mtodo de anlisis qumico basado en la separacin de los componentes
de una mezcla de acuerdo a la diferencia en su distribucin entre dos fases inmiscibles, fue
descubierto en 1909, por el botnico ruso Mikhail Tswett, que utilizo los principios de la adsorcin
selectiva para separar los pigmentos fuertemente coloreados de las hojas de las plantas. El
nombre se sigue empleando, aunque aplicado tambin a substancias incoloras. La tcnica agrupa
un conjunto importante de diversos mtodos, que permite separar componentes estrechamente
relacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros
medios[1, 2]

La cromatografa de adsorcin se fundamenta en poner en contacto dos fases o componentes
mutuamente inmiscibles, que no reaccionen qumicamente, una de las cuales es mvil y la otra
estacionaria. Las dos fases se eligen de tal forma que, los componentes de la muestra se
distribuyan de modo distinto entre la fase mvil y la estacionaria. La fase estacionaria, un slido o
un gel, contenido en una probeta de largo cuello, formando una columna. La fase mvil consiste en
una disolucin de material que se desea analizar en un disolvente apropiado que no se adsorba en
la fase estacionaria. A medida que la fase mvil pasa a travs de la fase estacionaria, se va
produciendo una adsorcin selectiva: aquellos componentes de la fase mvil que muestren mayor
afinidad de adsorcin con la fase estacionaria quedaran retenidos en las capas superiores de la
columna, y aquellos que muestren menor afinidad se absorbern ms tarde, ms abajo en la
columna. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan
en bandas o zonas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. El resultado es una
columna graduada o cromatograma en donde cada especie qumica se ha absorbido en una capa
concreta. [1, 3]

Cuando el transporte se ha realizado, se establece un equilibrio termodinmico entre las
concentraciones de las fases mvil y estacionaria, parmetro que se conoce como coeficiente de
reparticin. Este equilibro depende de forma fundamental de las propiedades fsicas y qumicas de
las fases, como son la concentracin de la disolucin mvil, la porosidad de la fase estacionaria,
los coeficientes de absorcin de cada especie, y la temperatura a la que se realice la mezcla. En
general, los equilibrios de distribucin implicados en cromatografa se describen por ecuaciones
sencillas que suponen la transferencia de un analito entre las fases estacionaria y mvil.

La adsorcin es la retencin de una especie qumica en los sitios activos de la superficie de un
slido, quedando delimitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie
interfacial. Esta retencin superficial puede ser fsica o qumica. La adsorcin depende de la
naturaleza de la sustancia adsorbida, de la temperatura, de la naturaleza y estado de subdivisin
del adsorbente, y de la concentracin. [3]

El fenmeno de adsorcin ocurre en la superficie del granulo de fase fija, y se fundamenta en la
atraccin entre el soluto y el adsorbente por formacin de uniones dipolo y formacin de puentes
de hidrogeno. La fuerza de interaccin depende no solo de los grupos funcionales, sino tambin de
factores estricos e ismeros estructurales.

La solubilidad relativa del soluto en la fase mvil va a depender de la polaridad del compuesto, ya
que si se trabaja en fase normal, los solutos mas polares sern mas retenidos, mientras que los no
polares corrern o se desplazaran, por la naturaleza del solvente. [2]


La cromatografa en columna se usa para la separacin y purificacin de compuestos orgnicos,
slidos o lquidos a escala preparativa, la separacin efectiva de los analitos en la muestra
depender de la adecuada seleccin de la serie de solventes a usar como fase mvil. Las variables
determinantes son el dimetro de la columna, la cantidad de adsorbente y eleccin del solvente.

Si se selecciona el solvente adecuado, aquellas molculas que presentan mayor afinidad qumica
con la fase mvil sern rpidamente desplazadas a travs de la fase estacionaria, y resultaran
separadas en un primer extracto. Mientras que las molculas con mayor afinidad qumica con la
fase estacionaria quedaran retenidas en la columna, a la espera de que el analista haga fluir a
travs de la columna, una nueva fase mvil con la que puedan desarrollar fuerzas intermoleculares
ms intensas, que las que se desarrollaron inicialmente con la fase estacionaria, generndose as
un segundo extracto.

Es necesario entonces que los solventes se utilicen de acuerdo a su poder eluyente en el orden
adecuado. Entendindose por elucin, el transporte de una especie a travs de una columna por la
adicin continua de nueva fase mvil. Una nica porcin de la muestra se introduce en la parte
superior de la columna, y a un tiempo final los componentes de la muestra se redistribuyen entre
las dos fases. [4]

El poder eluyente eluotrpico de los disolventes orgnicos ms habituales en cromatografa sigue
el siguiente orden descendente: Acido actico > Agua > Etanol > Acetona > Acetato de etilo >
Dietileter >Diclorometano > Cloroformo > tolueno > tetracloruro de carbono > hexano > pentano.
Su capacidad de elucin depende de su polaridad, del absorbente y de las especies a eluir.
La movilidad se ver afectada por las caractersticas del absorbente como: tamao del granulo.
Empaquetamiento, homogeneidad, distinta actividad entre otros, o por las estructura de soluto, es
decir, polarizabilidad, capacidad de formar puentes de hidrogeno, alto peso molecular, entre otras.
[3]

Tambin es importante en la cromatografa de columna, la altura a la que se ha quedado
determinada una especie qumica. Esta altura se relaciona directamente con el llamado tiempo de
retencin: cuanto mayor sea la afinidad de absorcin entre el soluto y la especie, menor tiempo de
retencin presentara. Otro parmetro caracterstico es el volumen de retencin, la cantidad
necesaria de fase mvil para transportar la especie desde la parte superior de la columna hasta el
detector. [4]

En un sistema cromatografico el tiempo de reaccin de un soluto particular es constante, y por lo
tanto puede utilizarse para identificar ese soluto. En caso de no ser conocido el tiempo de
retencin de una especie dada siempre se puede recurrir para su identificacin a tcnicas
auxiliares, generalmente espectrografa. [4]

El uso de la cromatografa est ampliamente extendido en el anlisis de alimentos, medicinas,
sangre, productos petrolferos y de fisin radiactiva. La cromatografa de columna, se usa para
separar grandes cantidades de material aproximadamente mayores a 100 mg, no se usa mucho en
el anlisis de alimentos ya que es una tcnica para la separacin cromatografca de mezclas de
sustancias. [5]

Tiene aplicaciones en la industria farmacutica es las separaciones de componentes de plantas
medicinales, de componentes de una sntesis orgnica, de colorantes, en la separacion e
identificacion de hioscina y de morfina, tambin de acido acetico, alcohol cetilico y metil-etil cetona,
entre otras. [2]

En cuanto al anlisis cualitativo, la cromatografa proporciona informacin acerca de las especies
de la muestra en cuanto a su tiempo de retencin o su posicin en la fase estacionaria tras el
periodo de elucin. Es tambin un buen mtodo que proporciona informacin cuantitativa acerca
de las especies separadas, basndose en la comparacin de la altura, o del rea, del pico del
analito con la de uno o ms patrones, mediante el mtodo de calibrado y patrones, el mtodo del
patrn interno, y por ltimo el mtodo de la normalizacin de las reas. [2]

En esta experiencia de laboratorio, la fase estacionaria se confinar a una columna de vidrio, y la
fase mvil se har fluir por gravedad a travs de su seno. La separacin efectiva de los analitos en
la muestra depender de la adecuada seleccin de la serie de solventes a usar como fase mvil. Si
se selecciona el solvente adecuado, aquellas molculas que presenten mayor afinidad qumica con
la fase mvil sern rpidamente desplazadas a travs de la fase estacionaria, y resultarn
separadas en un primer extracto. Mientras que las molculas con mayor afinidad qumica con la
fase estacionaria quedarn retenidas en la columna.

En este trabajo experimental, se estudia la relacin de distribucin de los pigmentos naturales
presentes en el extracto de zanahoria, cuando se somete a una separacin cromatogrfica en
columna en fase normal. En el extracto de zanahoria estn presentes dos compuestos principales
carotenos y licopenos.

Los carotenoides son compuestos solubles en lpidos, y son los encargados de dar color a los
frutos y vegetales, entre los ms importantes para el organismo se tienen los: -carotenos, -
carotenos, licopeno, criptoxantina, lutena y zeaxantina. El licopeno es el pigmento responsable del
color rojo que presentan los tomates, pomelos, sandas, pimentones, etc. El licopeno es un
colorante con una estructura qumica de cadena abierta con once dobles enlaces conjugados, de
estructura sencilla con una cadena aliftica formada por cuarenta tomos de carbono, ste se
absorbe mejor a travs de las grasas y aceites por su liposolubilidad y se encuentra presente en el
organismo humano tanto en la sangre como en tejidos.
La estructura del licopeno es la siguiente:

Figura 1. Estructura del Licopeno.
Por otro lado, el -caroteno es el primer carotenoide purificado. Es el responsable del color naranja
en las zanahorias. Es un hidrocarburo de cadena aliftica con dos anillos en los extremos.

Figura 2. Estructura del - caroteno.
Para la identificacin de los carotenoides se usan los espectros y caractersticas de absorcin
ntimamente relacionados con el nmero de dobles enlaces. El espectro de absorcin del -
caroteno posee dos mximos en 425-453nm y 480-481nm

Figura 3. Espectro de Absorcin del - caroteno.

Por otra parte, el licopeno presenta tres mximos de absorcin a 444, 471 y 502nm.















Figura 4. Espectro de Absorcin del Licopeno.


Metodologa experimental

El procedimiento de preparacin y acondicionamiento de una columna cromatografa empacada
se debe realizar con sumo cuidado, ya que, de est dependen los resultados de la experiencia,
para ello se debe pesar cuidadosamente una porcin de la fase estacionaria, en el caso especifico
de esta prctica se pesaron a (10.020.01)g de gel de Almina, posteriormente se debe introducir
en el fondo de la columna un soporte inerte con la funcin de contener el empaque, en nuestro
caso se utilizo como soporte algodn comprimido. Luego con ayuda de un embudo se introdujo la
fase estacionaria, se debe cuidar que dicha fase quede depositada de forma compacta y uniforme,
verificando que no queden espacios vacios y conglomerados, para evitar la formacin de caminos
preferenciales en el recorrido de la fase mvil. Finalmente se introdujo papel de filtro y algodn
comprimido en la parte superior de la columna. Se debe tomar nota de la altura y del dimetro del
lecho seco para la determinacin de su volumen. En el acondicionamiento de la columna, se utiliz
como solvente Hexano, luego de ser humedecida toda la columna se registro el flujo del solvente
contabilizando el numero de gotas por unidad de tiempo, y se determino el volumen del lecho
hmedo.

La fase estacionaria es la almina u xido de aluminio (Al2O3) es un adsorbente ligeramente
bsico debido a que en el proceso de extraccin de la almina a partir de la bauxita quedan
algunas molculas de hidrxido de aluminio adheridas a la almina, dndole a sta un carcter
bsico. La almina no consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de
slice, ya que, las formas comerciales tienen entre 100 y 400 m2/g como porosidad, es un
adsorbente de carcter polar, de tal forma que retendr con mayor avidez a los componentes
polares. Su estructura molecular es normalmente de cristales hexagonales y de tamao diminuto.

En esta experiencia se utilizo una columna con dimensiones de (10,10,1)cm de altura y 0,6 cm de
dimetro.

Finalmente se hizo pasar el extracto coloreado de zanahoria por la columna y se le aadi los
solventes adecuados para lograr una separacin adecuada de las bandas presentes en la muestra,
en este caso se us para la columna de almina inicialmente se utiliz como solvente el Hexano y
posteriormente una mezcla equivolumetrica de Hexano y Cloroformo, Luego de observar la
separacin de la banda de los compuestos en la muestra, se recolecto en un vaso de precipitado la
fraccin msica de la banda que sali de primero de la columna. No se logr recolectar sino solo
una banda de la columna.


Resultados y discusin
No todos los carotenoides tienen las mismas propiedades. Analticamente, el color de los
carotenoides es de gran importancia, ya que un cambio de color durante el anlisis es indicativo de
degradacin o de modificacin estructural de los pigmentos.
Los carotenos, como hidrocarburos, son sustancias lipoflicas solubles en ter, aceites y
disolventes no polares. Diferencias en su estructura se traducen a diferencias en su polaridad, de
modo que pueden ser separados por medio de cromatografa en columna al utilizar distintos
solventes como fase mvil. Adems, el color permite monitorizar su separacin mediante
cromatografa en columna y en capa fina.
En la prctica se llev a cabo la separacin de los pigmentos presentes en un extracto de
zanahoria, licopenos y -caroteno, por medio de cromatografa en columna. Se utiliz como fase
estacionaria Almina. Debido a que la fase estacionaria consista en un compuesto polar, el
eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes
que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares.
El primer pigmento en salir de la columna fue de color naranja siendo la fase que present mayor
longitud en la columna. Este sali luego de aplicar como solvente una mezcla de Hexano y
cloroformo, se continuo agregando solventes a la columna pero por cuestin de tiempo no se logr
extraer otro compuesto, ya que la velocidad con que la banda bajaba a travs de la columna era
demasiado lenta.
La fraccin que se logr extraer presento el siguiente espectro de absorcin:

Figura 5. Espectro de Absorcin la fraccin retirada de la columna.

En este caso el espectro de la fraccin presenta un mximo de absorbancia en 425nm y otro e
475nm. A pesar de la discrepancia presentada, la forma del dicho espectro se asemeja bastante al
espectro terico del betacaroteno (figura 3), de modo que es posible verificar, una vez ms, que el
pigmento de color amarillo corresponde al licopeno y el naranja al -caroteno.
Existen otros carotenos (como , , etc.) que pueden estar presentes en el extracto de zanahoria,
en menor proporcin, que podran encontrarse en las fracciones separadas en cada caso,
alterando la posicin de los mximos de absorbancia en los espectros obtenidos.
Por otro lado, en cuanto a la fase mvil, es indispensable para una buena separacin la eleccin
de los solventes adecuados en cada caso. Es por ello que es importante estudiar los distintos
solventes disponibles y realizar las experiencias con los solventes o mezcla de solventes
seleccionados hasta optimizar el proceso. Tambin hay que tomar en cuenta que para realizar la
optimizacin del sistema y lograr una mejor separacin hay que cambiar la polaridad del solvente
de manera gradual y no bruscamente para as evitar el arrastre de los diferentes compuestos.
Conclusiones:
Se obtuvo que por cromatografa en columna se lograron separar los -carotenos
presentes en el extracto de zanahoria.
Se encontr que los solventes que favorecen la separacin de los -carotenos en la
muestra estudiada son Hexano y Cloroformo en cantidades iguales, sin embargo estos no
lograron extraer los licopenos.
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0.14
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0.18
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350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Longitud de onda
Debido a que los -carotenos estudiados presentan grupos cromforos debido a los dobles
enlaces en sus estructuras es posible identificarlos por observacin debido a la coloracin
naranja que presentan, adems de que pueden ser identificados por espectrometra de
absorcin, ya que presenta mximos de absorcin caractersticos.
La cromatografa en columna permite separar los distintos pigmentos presentes en los
vegetales y plantas, teniendo una amplia aplicacin en la industria alimentaria y
farmacutica. Siempre y cuando se utilicen las fases estacionaria y mvil adecuadas, es
posible obtener la separacin ptima.

Referencias Bibliogrficas
[1] Skoog y Holler. (2001) Principios de Anlisis Instrumental. McGraw-Hill Interamenricana de
Espaa, S.A.U. Madrid, Espaa. Capitulo 26.
[2]http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_principios_y_aplicaci
ones.pdf
[3]http://www2.uadec.mx/pub/pdf/cienciacierta14.pdf
[4]http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/LIApregrado/archivos/Guia%20para%20cromatogr
afia.pdf
[5]http://elac.uca.edu.ni/pd/karlschen/files/745/2416/Cromatografia.pdf
[6]www.quimicuba.com.ar/Cromatog.ppt