PROTEOMIK &

METABOLOMIK
PROTEOMIK
studi skala besar ttg protein, khususnya struktur dan
fungsi Protein.
adalah bagian penting dari organisme hidup
adalah komponen utama dari jalur metabolisme fisiologis
sel.
Istilah "proteomik" pertama kali diciptakan pada tahun
1997 untuk membuat analogi dengan genomik, penelitian
gen. Kata "proteome" adalah campuran dari "protein" dan
"genom", dan diciptakan pada dasarnya oleh Marc Wilkins
pada tahun 1994 ketika bekerja sebagai mahasiswa PhD
Proteome adalah komplemen seluruh protein, Sekarang diketahui
bahwa mRNA tidak selalu diterjemahkan menjadi protein, dan jumlah
protein yang dihasilkan untuk suatu jumlah tertentu tergantung pada
mRNA gen itu ditranskripsi dari dan pada keadaan fisiologis sel saat ini.
Proteomika menegaskan kehadiran protein dan menyediakan ukuran
langsung dari jumlah ini.
Sebuah mRNA diproduksi dalam jumlah yang berlimpah mungkin akan
menurun cepat atau diterjemahkan secara tidak efisien, sehingga
dihasilkan sejumlah kecil protein.
Banyak protein mengalami post-translasi modifikasi yang sangat
mempengaruhi kegiatan mereka, misalnya beberapa protein yang tidak
aktif sampai mereka menjadi terfosforilasi.
Metode proteomik
1. Phosphoproteomics
2. Glycoproteomics digunakan untuk studi modifikasi
pasca-translasi.
Modifikasi pasca-translasi
Tidak hanya menyebabkan perbedaan terjemahan dari
mRNA, protein banyak juga mengalami berbagai
modifikasi kimia setelah translasi. Banyak modifikasi
pasca-translasi yang penting untuk fungsi protein.


Fosforilasi
Fosforilasi: terjadi pada banyak enzim dan protein secara struktural
dalam proses sinyal sel.
Penambahan fosfat untuk asam amino tertentu yang paling sering
adalah pada serin dan treonin dimediasi oleh serin / treonin kinase,
Tidak jarang protein yang dimediasi oleh tirosin kinase
menyebabkan menjadi target untuk mengikat atau berinteraksi
dengan protein lain yang mengenali domain terfosforilasi.
Karena fosforilasi protein adalah salah satu yang paling banyak
dipelajari dlm modifikasi protein "proteomika" ,
maka upaya diarahkan untuk menentukan set protein terfosforilasi
dalam tipe sel atau jaringan tertentu dalam keadaan tertentu.
3. Ubiquitination
Ubiquitin adalah protein kecil yang dapat
ditempelkan pada substrat protein tertentu dengan
enzim yang disebut ligases ubiquitin E3.

Menentukan protein poli-ubiquitinated dapat
membantu dalam memahami bagaimana jalur
protein diatur.
Selain fosforilasi dan ubiquitination, protein dapat berperan
dalam proses (antara lain), asetilasi metilasi, oksidasi
glikosilasi, dan nitrosylation.
Beberapa protein menjalani SEMUA modifikasi ini, sering
tergantung waktu dalam kombinasi, yg tepat
menggambarkan kompleksitas yang potensial ketika
mempelajari struktur dan fungsi protein.
Protein berbeda yang dibuat di bawah pengaturan yang
berbeda
Proteomics Uses
1. identifikasi potensi obat baru dalam pengobatan
One of the most promising developments to come from the study
of human genes and proteins has been the identification of
potential new drugs for the treatment of disease. This relies on
genome and proteome information to identify proteins
associated with a disease, which computer software can then use
as targets for new drugs.
For example, if a certain protein is implicated in a disease, its 3D
structure provides the information to design drugs to interfere
with the action of the protein. A molecule that fits the active site
of an enzyme, but cannot be released by the enzyme, will
inactivate the enzyme.

This is the basis of new drug-discovery tools, which
aim to find new drugs to inactivate proteins involved
in disease. As genetic differences among individuals
are found, researchers expect to use these
techniques to develop personalized drugs that are
more effective for the individual.
A computer technique which attempts(berusaha) to fit
(cocok)millions of small molecules to the three-
dimensional structure of a protein is called "virtual
ligand screening". The computer rates the quality of
the fit to various sites in the protein, with the goal of
either enhancing(peningkatan) or disabling(tidakmampuan) the
function of the protein, depending on its function in
the cell.


A good example of this is the identification of new
drugs to target and inactivate the HIV-1 protease.
The HIV-1 protease is an enzyme that cleaves a
very large HIV protein into smaller, functional
proteins. The virus cannot survive without this
enzyme; therefore, it is one of the most effective
protein targets for killing HIV.


2. Biomarkers
Understanding the proteome, the structure and function of each
protein and the complexities of protein-protein interactions will be
critical for developing the most effective diagnostic techniques and
disease treatments in the future.

An interesting use of proteomics is using specific protein
biomarkers to diagnose disease.
A number of techniques allow to test for proteins produced during a
particular disease, which helps to diagnose the disease quickly.
Techniques include western blot, immunohistochemical staining,
enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or mass spectrometry.
The following are some of the diseases that have characteristic
biomarkers that physicians can use for diagnosis.


3. Alzheimer's disease
In Alzheimers disease, elevations in beta secretase create
amyloid/beta-protein, which causes plaque to build up in the
patient's brain, which is thought to play a role in dementia. Targeting
this enzyme decreases the amyloid/beta-protein and so slows the
progression of the disease. A procedure to test for the increase in
amyloid/beta-protein is immunohistochemical staining, in which
antibodies bind to specific antigens or biological tissue of
amyloid/beta-protein.
4. Heart disease
Heart disease is commonly assessed using several key protein based
biomarkers. Standard protein biomarkers for cardiovascular diseases
include interleukin-6, interleukin-8, serum amyloid A protein,
fibrinogen, and troponins. Cardiac troponin I (cTnI) increases in
concentration within 3 to 12 hours of initial cardiac injury and
remains elevated days after an acute myocardial infarction. A
number of commercial antibody based assays as well as other
methods are used in hospitals as primary tests for acute heart
infarctions

Analisisis Metabolomik
Analisis semua proses metabolisme jaringan maupun sel
yang berfungsi menghasilkan senyawa metabolit untuk
setiap spesies, meliputi analisis kimia menggunakan Mass
Spektrofotometer, pengembangan struktur kimia, serta
bioinformatik untuk mengetahui struktur kimia serta
membangun sistem data sehingga dapat menjelaskan
sistem biologi bahan alam.
Analisis Metabolomik : Analisa kualitatif (Identifikasi)

Metabolomik menggunakan instrumen analisis canggih
untuk secara akurat mengukur, secara massal, dengan
biokimia (metabolit) yang membentuk suatu organisme.
Metabolisme - jaringan kompleks reaksi kimia yang
mengubah metabolit ke produk akhir - menentukan cetak
biru genetik organisme (genom).
Metode analisis
metabolomik

Perumpamaan :
Metabolomik bagaikan proses memotret
keberadaan berbagai objek dalam suatu target
sehingga berbagai senyawa yang ada disitu dari
yang pendek-tinggi, gemuk-kurus, harus terekam
secara Accurate (teliti) dan Precise (tepat). Maka
harus di pilih metode instrumentasi yang sesuai
kriteria sensitivitas dan selektivitas dan dapat
mengakomodasi dan deteksi berbagai senyawa
dengan ranger BM rendah ke tinggi sesuai dengan
tujuan analisis.

Analisis metabolomik
A.metabolomik harus dipastikan senyawa kimia yang
ada di dalam tanaman, organ, herba, bahkan jaringan
objek analisis. Maka BM (Berat Molekul) harus bisa
diungkap oleh metode terpilih itu. Pengetahuan
tentang berat molekul tidak cukup karena beberapa
senyawa memiliki BM yang sama, maka analisis yang
kita pilih selain dapat menggambarkan BM juga harus
dapat memberikan gambaran strukturnya.

Metode analisis
metabolomik
1. M.sidik jari
2.Penanda kimia
Instrument :
1. analisis menggunakan Mass spectroscopy paling sesuai
untuk tujuan ini karena deteksi ini akan memberikan pola
fragmentasi, sehingga dapat mengkonstruksi suatu molekul
berdasarkan fragmen yang terdeteksi.
2. analisis lain yang reliable adalah NMR (Nuclear Magnetic
Resonance) karena senyawa apapun akan memiliki geseran
kimia (Chemical Shift) yang khas tidak memiliki oleh
senyawa lain, seperti sidik jari pada manusia.
3. Untuk analisis metabolomik yang paling memenuhi
syarat ketentuan maka metode tandem/hyphenated
method yang memenuhi ketentuan seperti GC-MS, LC-MS,
dan NMR.

Salah satu tantangan dari sistem biologi dan genomik
fungsional adalah untuk mengintegrasikan proteomik,
transcriptomic, dan informasi metabolomic untuk
memberikan gambaran yang lebih lengkap dari organisme
hidup

Dewasa ini metabolomik dikembangkan ke arah
analisis kuantitatif metabolit sekunder total yang
berperan dalam aktivitas biologis-farmakologis
tertentu dalam suatu sampel obat herbal yang
disebut metabonomics
Keuntungan analisa
metabolomik
1. Tidak membutuhkan preparasi yang rumit,
2. Sampel yang dibutuhkan sangat kecil,
kurang dari 0,1 gram atau bahkan cukup 1
mg
3. Hasil lebih objektif karena menghindari
berbagai partisi berkali-kali dan
4. secepat mungkin sampel dianalisis
sehingga sangat menguntungkan.
Kendala analisa kuantitatif
metabolomik
1. Pentingnya database yang akurat
2. Penentuan metode penyarian yang efisien dan menarik semua
senyawa dan terkait dengan aktivitas farmakologi.
3. Pemisahan metabolit yang terkandung dalam sampel.
4. Metode deteksi terpilih yang tepat.
5. Identifikasi dan kuantifikasi analit yang tepat.
6. Analisis statistic yang sesuai untuk menggambarkan komponen-
komponen dalam ekstrak yang berperan.

Contoh penelitian berbasis
metabolomik
flatfish
Aplikasi metabolomik untuk
mengidentifikasi komponen bioaktif:
komponen antibakteri dari ekstrak buah
takokak (Solanum torvum Swart
Maser, Wahyu Haryati
URI: http://repository.ipb.ac.id/handle/123456789/68038
Date: 2014
Buah takokak (Solanum torvum Swartz.) digunakan sebagai tanaman
model. Buah takokak dikeringkan dan tepungkan, kemudian difraksinasi
bertingkat menggunakan kombinasi pelarut yang memiliki polaritas
yang berbeda-beda. Fraksi yang dihasilkan dianalisa profil metabolitnya
secara komprehensive dengan kromatografi cair pada berbagai panjang
gelombang. Bioaktivitas yang diukur adalah aktivitas antibakteri
terhadap Bacillus cereus dengan metoda difusi sumur. Kedua kelompok
data ini kemudian dianalisa secara statistik menggunakan Orthogonal
Projection to Latent Sructure (OPLS). Dengan metoda OPLS, waktu
retensi pada panjang gelombang tertentu yang berkorelasi positif
secara signifikan dengan bioaktivitas dapat diidentifikasi. Puncak
kromatogram pada waktu retensi pada panjang gelombang tersebut
kemudian dipekatkan dengan teknik kromatografi preparative dan
selanjutnya dianalisis dengan LC-MS..
lanjutan
Dari data built-in library yang ada pada LC-MS dapat
diperkirakan jenis senyawa aktif yang terkandung dalam
fraksi tersebut. Fraksi buah takokak menunjukkan aktivitas
antibakteri yang cendeung rendah. Aktivtas tertinggi
didapat pada fraksi 100% metanol. Hasil pengukuran MIC
menunjukkan bahwa pada konsentrasi 10 mg/ml dan 15
mg/ml ekstrak takokak mampu menghambat pertumbuhan
bakteri sebesar 89.8% dan 94.0% berturut-turut
Dari hasil uji TLC (Kloroform/metanol: 7:3, UV 245 dan 366
nm, pewarnaan vanilin), diperkirakan fraksi tersebut
mengandung flavonoid, alkaloid dan saponin. Analisis profil
metabolit dilakukan dengan menggunakan HPLC dengan
kolom Symmetri C-18.5 ?m, 150x4.6 mm (Waters), fasa
gerak air (pH 3) dan asetonitril dengan sistem gradien
dimulai dari 2% air (pH 3) hingga 100% asetonitril selama 12
menit. Analisis dilakukan setiap interval 10 pada panjang
gelombang 210 ? 400 nm sehingga total dihasilkan 540
kromatogram. Pada data dari kromatogram dilakukan
binning setiap interval waktu retensi 0.04 menit dan untuk
setiap puncak dilakukan kuantifikasi secara relatif terhadap
total respon. Data kemudian dikonversi kedalam bentuk
excel sehingga dapat dijadikan data untuk analisis OPLS.
lanjutan
Tahap pengolahan data mentah ini sebenarnya dapat
dilakukan secara otomatis menggunakan software seperti
AMIX atau OPUS dari Bruker yang sayangnya tidak tersedia
di lab tempat melakukan penelitian sehingga dilakukan
secara manual. Dengan waktu penelitian yang relatif
singkat, target penelitian tidak sepenuhnya tercapai.
Matriks data kedua (profil metabolit) belum siap untuk
diolah lebih lanjut dengan OPLS sehingga belum dapat
diketahui waktu retensi yang berkorelasi signifikan dengan
aktifitas antibakteri buah takokak. Tahap terakhir yang
direncanakan yaitu pemekatan peak terpilih hasil analisis
OPLS dan analisisnya dengan LC-MS juga belum sempat
dilaksanakan sehingga belum dapat diketahui jenis senyawa
antibakteri yang terdapat dalam ekstrak buah takokak.

Next:
Pelajari Produksi human therapeitics