Tehnica ELISA

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

Biochimie Medicina dentara
Ce este ELISA?

Tipuri

Aplicatii

Principiu
ELISA
Biochimie Medicina dentara
ELISA
Biochimie Medicina dentara
Ce este?
Evaluarea prezentei si concentratiei anticorpilor si
antigenilor dintr-o proba

Primele studii au fost facute in 1971 folosita pentru
screeningul HIV

O tehnica biochimica folosita in special in imunologie

Primul si cel mai comun test folosit pentru detectarea
unui patogen dintr-o proba

Avantaje - sensitiva (0.01-10ng/ml)
- cantitativa
- reproductibila
- format de kit


ELISA
Biochimie Medicina dentara
Tipuri
ELISA Calitativa
- rezultatele sunt pozitive sau negative
ELISA Cantitativa
- densitatea optica a probei este comparata
cu un standard



ELISA - indirecta
- competitiva
- sandwich (directa)
ELISA
Biochimie Medicina dentara
Aplicatii Evaluarea cantitativa/calitativa a anticorpilor si antigenilor
dintr-o proba

Medicina: metoda de diagnostic - HIV, holera, boli
venerice, gripa aviara sau porcina, hormoni
(sarcina)

Industria alimentara: detectarea alergenilor din mancare
lapte, alune, oua

Toxicologie: detectarea drogurilor

Cercetare
ELISA
Biochimie Medicina dentara
Principiu Ce este un antigen?
Ce este un anticorp?
Anticorp
Antigen
Epitop
Enzyme-linked immunosorbent assay: numele sugereaza
3 componente
Anticorp - permite detectia analitului de interes
Faza solida - suportul unde are loc adsorbtia
Enzima - determina schimbarea de culoare-semnalul

ELISA
Biochimie Medicina dentara
Primul anticorp
Antigenul
Al doilea anticorp
conjugat cu enzima
ELISA-sandwich
direct
Principiu
2
1
3
ELISA
Biochimie Medicina dentara
Principiu
substrat
produs
standard
proba
Tehnica PCR
Polymerase Chain Reaction
Biochimie Medicina dentara
PCR
Ce este PCR?

Tipuri

Aplicatii

Principiu
Biochimie Medicina dentara
PCR
Ce este?
Biochimie Medicina dentara
Polymerase Chain Reaction (Reactia in lant a
polimerazei)

Mullis & Faloona Specific synthesis of DNA in
vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction,
1987

Mullis: Premiul Nobel, Chimie, 1993

Amplificarea cu ajutorul unei enzime (ADN-
polimeraza) a numrului de copii ale unei regiuni
specifice dintr-un lan ADN

Kary Mullis
PCR
Tipuri
Biochimie Medicina dentara
Exista multe variatii ale acestei tehnici: long PCR, late PCR
in situ PCR, colony PCR, single cell PCR

Cele mai folosite:

- standard PCR
- RT-PCR ( real-time)
PCR
Aplicatii
Biochimie Medicina dentara
Testarea unor mutatii (ex.: fibroza chistica, gene tumorale)

Testare prenatala (si screening preimplantare)

Infectii virale (HIV), bacteriene (BK)

Teste de histocompatibilitate

Medicina legala

Teste de paternitate

Identificarea de persoane

Cladistica


clade
PCR
Principiu
Biochimie Medicina dentara
Materiale

ADN de amplificat: Sange, Sperma, Par, Periuta de
dinti, Insecte (in chilhlimbar), Mumii, Amprente, Urina

Primeri (oligonucleotide, amplimeri) : 20-30 de
dezoxiribonucleotide complementare extremitatilor 5
sau 3 ale fragmentului de amplificat

ADN-polimeraza : enzima care catalizeaza
polimerizarea dTNP in catene ADN (elongarea
primerilor)

dNTP (dezoxiribonucleotid trifosfati)

Solutie tampon
Colectare probe ADN
PCR
Principiu
Biochimie Medicina dentara
Etapele PCR

Denaturarea ADN-ului dublu catenar

Cuplarea primerilor de ADN-ul simplu
catenar

Extensia primerilor
PCR
Principiu
Biochimie Medicina dentara
Denaturarea ADN
94-98 C, 20-30 de secunde
ADN-ul este desfasurat in doua
lanturi ADN simplu-catenare
complementare
Cuplarea primerilor
50-65 C, 20-40 de secunde
Lant dublu-catenar hibrid
primeri si ADN de amplificat

Extensia primerilor
ADN-polimeraza: Se leaga de
lantul hibrid Citeste
secvena lantului ADN-tinta;
Alungeste primerii prin
adaugarea de dNTP, pe baza
regulii complementaritatii

PCR
Principiu
Biochimie Medicina dentara
Amplificarea

MW: dimensiuni cunoscute
1: ~1850 bp
2: ~800 bp
3: nu s-a amplificat
4: ~800 bp
5: benzi multiple

Vizualizare produsi de amplificare