Universidad de Nario

Laboratorio de bioqumica
Fermentacin de la glucosa
Integrantes:
Anamaria pinza Figueroa
Pablo Moreno
Diego Jimnez
RESUMEN:
Durante esta prctica de laboratorio se trabaj en la obtencin de los productos formados en la
fermentacin de glucosa por accin de la levadura y lactobacillus, adems de realizar algunas
pruebas para la identificacin de estos; tales como: determinacin de piruvato con nitro prusiato
de sodio, determinacin de piruvato con 2-4 dinitrofenilhidrazina, determinacin de etanol,
determinacin de etanol a cido sulfocromico a acetaldehdo y determinacin de cido lctico.

INTRODUCCION:

La glucolisis es el proceso por el cual la
glucosa se transforma en piruvato con
formacin de ATP. En ausencia de oxgeno,
luego de la glucolisis se lleva a cabo la
fermentacin, donde se produce etanol y
CO2 y/o cido lctico, dependiendo del
organismo que lo efectu; en el primer caso
las levaduras son las responsables. Ambas
rutas de fermentacin (produccin de etanol
y cido lctico) son similares hasta la
formacin de piruvato, manteniendo
similares las etapas de conservacin de
energa que conducen a la formacin de ATP.
La glucolisis no solo es la va principal para el
metabolismo de la glucosa que conlleva a la
produccin de acetil- CoA y a su subsiguiente
oxidacin en el ciclo del cido ctrico, sino
que tambin proporciona una va importante
para metabolizar fructosa y galactosa
derivada de los alimentos.
METODOLOGIA.
1. preparacin del filtrado.
En dos tubos de ensayo se pipeteo 10 ml de
glucosa, a un tubo se le aadi 5 ml de
suspensin de levadura y en el otro 5 ml de
la suspensin de lactobacillus. Se tap los
tubos con papel aluminio y se los coloco en
un bao mara entre 35-40 C durante una
hora, luego se aadi a cada tubo 2 ml de la
solucin de cido tricloroacetico.
2. determinacin de piruvato con nitro
prusiato de sodio.
En un tubo de ensayo se calent hasta
ebullicin 2 ml del filtrado y se le agrego 1 g
de sulfato de amonio slido y se le adiciono 2
gotas de solucin de nitro prusiato de sodio y
se mezcl vigorosamente, se dej deslizar
por las paredes del tubo amoniaco
concentrado hasta que se formaron dos
capas.
3. determinacin de piruvato con 2,4-
dinitrofenilhidrazina
A dos ml del filtrado se le agreg 1 ml de
solucin saturada de 2,4-
dinitrofenilhidrazina, se mezcl
vigorosamente y se coloc 3 gotas de la
mezcla en un tubo de ensayo, se agreg 1 ml
de solucin de hidrxido de sodio al 10% y se
diluyo con agua destilada hasta 5 ml.
4. Determinacin de etanol
A 2 ml del filtrado se le agreg 0.2 g de
carbonato sdico. Despus de disolverlos se
coloc el tubo en un bao mara
manteniendo a unos 70 C y se fue
aadiendo gotas de yodo- yoduro hasta que
no desapareci el color del yodo; llegando a
este punto se dej los tubos unos tres
minutos ms en el bao de agua caliente y
luego se enfri en un bao de agua fra.
5. determinacin de etanol mediante su
oxidacin con cido sulfocromico a
acetaldehdo.
A 1ml del filtrado se le aadi 0.5 ml de
solucin sulfocromica diluida, tras mezclar
bien el conjunto se calent en un bao de
agua hirviente.
6. determinacin del cido lctico
A 1 ml de filtrado se le agreg 1 ml de ter
etlico y se agito intensamente el conjunto;
una vez separadas las fases se recogi la fase
etrea (correspondiente a la parte superior)
y se le aadi un volumen igual de solucin
de cloruro frrico.
Resultados y discusin.
Pruebas Tubo con
levadura
Tubo con
lactobacillus
piruvato con nitro
prusiato
+ +
piruvato con
fenilhidrazina
+ +
Determ. De etanol
con carbonato
+ -
etanol
+ -
cido lctico - +
1. determinacin de piruvato con nitro
prusiato de sodio.

Se pueden cambiar las condiciones
fisiolgicas para que la enzima piruvato
descarboxilasa funcione a una velocidad
muy por debajo de su actividad mxima,
o se puede usar un agente como el nitro
prusiato de sodio que atrape el
intermediario y que forme un compuesto
que no puede metabolizarse.
La piruvato descarboxilasa no es activa
en soluciones ligeramente alcalinas, de
manera que el
piruvato se acumula y su presencia
puede demostrarse por la reaccin con
nitro prusiato de sodio, entonces se
desactiva la enzima piruvato
descarboxilasa en solucin alcalina dbil,
entonces el nitro prusiato de sodio
reacciona con el piruvato formando un
anillo de coloracin verde
EL nitroprusiato de sodio DETECTA
GRUPOS CETONICOS COMO EL
PRESENTE EN LOS PIRUVATOS
H3C-CO-COO-
2. Determinacin de piruvato con 2,4-
dinitrofenilhidrazina.
Las observaciones anteriores se deben a que
los intermediarios metablicos como el
piruvato se encuentra presentes en bajas
concentraciones, por lo tanto para
demostrar su existencia como intermediarios
en el proceso metablico es necesario que se
impida que sean transformados en otros
compuestos. La 2,4-dinitrofenilhidracina
puede usarse para detectar cualitativamente
los grupos carbonilo de cetonas y aldehdos.
El resultado es positivo cuando hay un
precipitado rojo o amarillo, de esta manera
la coloracin que se presento en nuestros
resultados fueron de coloracin roja.

3. Determinacin de etanol con carbonato
sdico
Los resultados de esta prueba fueron
positivos para la muestra con levadura
presentndose una precipitacin en la base
de color amarillo y en la parte superior de
color blanco, adems de presentar cierto
olor caracterstico al yodoformo; en la
muestra con lactobacillus no se presento
este tipo de reaccin determinante del
etanol, se presento una precipitacin de
color amarillo ocre.
Fueron positivos para la muestra con
levadura debido a que la ruta metablica que
sigue es el de la fermentacin alcohlica para
formar acetaldehdo y seguidamente el
etanol, Cuando se usan yodo y carbonato
sdico como reactivos, una reaccin positiva
produce yodoformo. El yodoformo (CHI
3
) es
una sustancia de color amarillo plido, es
insoluble en agua, y tiene un olor a
antisptico. Se formar un precipitado visible
de este compuesto a partir de una muestra,
slo cuando est presente una metilcetona,
etanal, alcohol secundario de metilo, o
etanol.

-En las reacciones mostradas se indica el
esquema general del proceso de prueba de
yodoformo, el alcohol utilizado es alcohol
isopropilico, KI (lugol)-
4. determinacin de etanol mediante su
oxidacin con cido sulfocromico a
acetaldehdo.
Los resultados de esta prueba dieron
positivos para la levadura, presentndose un
color verde, mientras que en lactobacillus se
formo un precipitado dando la prueba
negativa.
La oxidacin de un alcohol produce un
compuesto carbonilico. Dependiendo del
alcohol y del agente oxidante puede resultar
que se obtenga un aldehdo, una cetona o un
cido carboxlico; en nuestro caso un
acetaldehdo. El etanol es un alcohol primario
Por lo general es difcil obtener el
acetaldehdo, porque la mayor parte de los
agentes oxidantes que pueden oxidar al
alcohol primario, tambin oxidan al aldehdo.
El cido crmico oxida a un alcohol primario
y llega hasta el cido carboxlico.
Esquema general: -paso 1-
El cido crmico es protonado, casi de
inmediato se rompe el enlace con el cromo
para formar agua, la parte parcialmente
positiva del cromo se une con la negativa del
alcohol para formar un ster cromado:



-paso 2- El agua se protona formando un in
hidronio, se forma el doble enlace con el
oxgeno para formar un aldehdo, el cromo se
reacomoda para formar el ion cromito ms
estable:



5. determinacin del cido lctico.
La fermentacin lctica es una ruta
metablica anaerbica que se desarrolla en
el citoplasma de la clula, en este proceso la
glucosa se oxida parcialmente para obtener
energa y acido lctico. El acido lctico se
identifica en los sistemas D y Dm que siguen
la ruta de la fermentacin lctica, dada la
adicin de el lactobacillus proveniente del
yogurt. El mtodo empleado para su
determinacin colorimtrica, es la adicin de
cloruro frrico (formacin de lactato ferroso
que presenta una coloracin amarillo
verdoso).

--- ESQUEMAS DE LAS REACCIONES DE FERMENTACION ALCOHOLICA Y LACTICA---










Conclusiones.
mediante esta prctica de laboratorio se logro
identificar los productos procedentes de las
rutas metablicas, mediante el uso de algunas
pruebas que identificaban sus grupos
funcionales.