Apostila Experimental

UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARABA
CENTRO DE CINCIAS E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUIMICA

MICROBIOLOGIA EXPERIMENTAL

PROFESSORAS:

ELIANE ROLIM FLORENTINO
HELVIA W. CASULLO DE ARAJO
WERUSKA BRASILEIRO FERREIRA

CAMPINA GRANDE
2010

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Microbiologia experimental
Prof.
a
Eliane Rolim elianerf@yahoo.com.br; Prof.
a
Helvia Casullo hwcasullo@ig.com.br;
Prof
a
Weruska Brasileiro weruska_brasileiro@yahoo.com.br

1.Tcnicas Bsicas em Microbiologia e Segurana Laboratorial

A finalidade das aulas prticas de microbiologia demonstrar ao estudante as
metodologias e princpios usados em laboratrio de microbiologia, reforando conceitos
tericos estudados. Nas aulas sero utilizados vrios microrganismos, os quais so bastante
vulnerveis e alguns patognicos. Desta forma, essencial observar normas de segurana
no laboratrio, para evitar principalmente contaminao dos estudantes, tcnicos e
professores e impedir a contaminao dos dispositivos experimentais por microrganismos
estranhos ao estudo.

1.1 Regras Gerais de Conduta e Segurana Laboratorial
O laboratrio um lugar que pode ter o seu potencial de risco de acidentes
diminudo desde que certas regras de conduta e segurana sejam obedecidas.
fundamental se ter critrio, planejamento, conhecimento e calma no trabalho.
O uso de bata de algodo branco, comprido e abotoado, essencial no laboratrio
de Microbiologia, pois o mesmo protege a roupa de contaminao. O aluno deve
usar calas compridas e sapato fechado para evitar acidentes, e aqueles de cabelos
compridos devem mant-los presos.
Deixar os materiais como bolsas, pastas, livros e cadernos em local reservado e
nunca sobre as bancadas de trabalho.
No comer, no beber, nem fumar no laboratrio.
Manter as mos, canetas, lpis e quaisquer objetos sem contato com a boca, olhos
ou ouvidos.
Lavar as mos com detergente e sec-las com papel toalha antes e depois da aula
prtica.
Nunca tentar identificar substncias pela textura, sabor ou odor.
Os extintores de incndios e a caixa de primeiro socorros devem ser colocados em
locais visveis e de fcil acesso.
Manter as bancadas limpas e organizadas.
Ler com ateno o rtulo do produto a ser usado.
Rotular todas as amostras, reagentes, solues, meios de cultura, etc.
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Trabalhar apenas com instrumentos adequados, tomando cuidado especial com os
vidros, que no dever conter pontas ou arestas cortantes.
Proteger o rtulo dos frascos ao verter o seu contedo.
No debruar sobre as bancadas.
Observar as propriedades dos reagentes, solues e meios de cultura para um
adequado acondicionamento e estocagem.
No permitir a entrada de pessoas estranhas no laboratrio.
Manter ateno constante nas aes executadas, evitando movimentao e
conversas desnecessrias que possam causar distraes e provocar acidentes.
O aluno deve deixar o laboratrio apenas aps ter terminado o trabalho prtico do
dia, sem dvidas nas tcnicas realizadas.

1.2. Normas de Trabalho em Microbiologia
No inicio de cada analise traar um plano de trabalho considerando o tempo
necessrio para cada analise e sua leitura.
Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranqila, constante e metdica, evitando
movimentos desnecessrios como troca de lugar, assento, etc.
Limpar e sanitizar a superfcie de mesas e balces antes e depois do trabalho de cada
dia.
Efetuar registros de analises, anotando o tipo do produto, procedncia, dia e hora da
entrada no laboratrio e qualquer outra observao previa anlise. Na anlise
propriamente dita anotar: mtodo, meio de cultura empregado e resultados obtidos.
Identificar as amostras antes de iniciar a analise e em geral, no descartar at obter os
resultados.
O material a ser analisado deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estreis
e nunca com as mos.
No cheirar os meios de cultura inoculados
Evitar salpicar mesas e pisos com gua ou solues corantes.
Usar bico de Bunsen, entre o material e o analista.
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Cuidado ao acender o bico de Bunsen. Observar se no existem produtos inflamveis
(lcool, ter, acetona etc.) nas proximidades da chama
No caso de derramamento do material inoculado, comunicar imediatamente ao
professor ou ao pessoal tcnico do laboratrio, sanitizar e esterilizar imediatamente (cobrir
a rea com sanitizante adequado e deixar de 15 a 30 minutos antes de limpar).
Vidrarias e materiais devem ser colocados aps o uso em recipientes adequados com
solues de desinfetante.
As pipetas devem colocar algodo na extremidade de suco para evitar contaminao
do material e do analista.
Os tubos de ensaios com cultura devero ser colocados nas estantes ou suportes
adequados, nunca nos bolsos do avental ou deitado sobre as bancadas.
Todo material contaminado (pipetas, bastes, lminas, lamnulas etc.), dever ser
colocado em recipientes adequados (provetas, cubas, ou vidros com desinfetantes), para
serem esterilizados posteriormente; nunca deix-los sobre a mesa de trabalho ou pia.
O material utilizado deve receber a seguinte seqncia de tratamento:
a) Esterilizao em autoclave a 121C durante 30 minutos
b) Lavagem em gua corrente e detergente
c) Secagem em estufa
d) Esterilizao - em autoclave a 121C durante 15 minutos
e) Armazenamento
Os cultivos aps a leitura devem ser esterilizados.
As laminas e lamnulas usadas devem ser colocadas em recipientes com desinfetantes
No retirar qualquer cultivo do laboratrio.
Manter registro do controle dirio de temperaturas das estufas.
Realizar o controle de temperatura ambiental em cmaras asspticas e fluxo laminar.
Analisar conservas e produtos esterilizados somente em cmaras asspticas ou fluxo
laminar.
Ao final do experimento, deve-se limpar a bancada, desligar os aparelhos, fechar o
bico de Busen e lavar as mos antes de sair do laboratrio

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2. Limpeza de Vidraria

2.1 Introduo
O bom desempenho da prtica laboratorial depende da mxima limpeza da
aparelhagem usada.
Para a limpeza da vidraria o cido ntrico ou cido clordrico so meios eficientes.
Os agentes de limpeza alcalinos tais como fosfatos tri-sdico e os detergentes
sintticos so muito teis, mas requerem uma enxaguagem prolongada para eliminao
completa de resduos.
A adio de algumas gotas de azul de bromotimol a 0,04g/L uma maneira de se
testar a presena de resduos alcalinos ou cidos.
Este indicador oferece a vantagem de cor do amarelo ao azul esverdeado na faixa de
pH 6,5 a 7,3.

2.2 Tcnicas de Lavagem
A lavagem deve ser realizada cuidadosamente para que no fiquem resduos cidos
ou alcalinos no material.
Toda a vidraria deve ser guardada limpa e seca. Materiais usados para anlises
microbiolgicas devem ser esterilizados antes e aps o seu uso.

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2.2.1 Limpeza de Material em Uso
Esterilizao em autoclave 121C durante 30 minutos
Retirar todo material lavar com gua da torneira
Deixar o material submerso em gua mais detergente
Escovar o interior de cada utenslio com soluo detergente utilizando escova prpria.
Enxaguar com gua de torneira
Verificar, aps essa operao, se a gua esta escorrendo livremente, sem que haja
reteno.
Enxaguar com gua destilada
Secar em estufa 160/170C durante 1 a 2 horas.

2.3 Preparo de Material Usado em Anlises Microbiolgicas

Preparo de Rolhas de Algodo
As rolhas de algodo so empregadas no vedamento de tubos e frascos em
microbiologia. O algodo utilizado geralmente hidrfobo (no absorvente).
Para se preparar uma rolha, corta-se um quadrado pequeno de algodo (cujo tamanho se
determina pela prtica), dobra-se no lado oposto para fazer um retngulo mais ou menos
3,7 cm de largura e enrola-se formando um cilindro justo. A rolha deve entrar
ajustadamente, devendo estar 1/3 fora da boca do tubo. A fim de se proteger a rolha de
algodo permitindo sua mltipla utilizao, aconselhvel envolver a extremidade da
mesma com um pedao de gaze. Uma rolha deve ser bem feita para poder ser empregada
varias vezes.

Alas de Platina ou de Nquel-Cromo
Empregada para transferncia de um cultivo para um meio de cultura fresco. A ala
empregada para fazer streak (isolamento de culturas) e tambm para inoculao por meio
de repique em tubos de ensaio contendo meio de cultura slido.
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Quando utilizar ala de platina nas prticas, a mesma dever ser aquecida at o rubro,
tanto antes do uso como depois dele. Antes de tocar o material de cultura, deve-se deixar a
ala esfriar, mantendo-a prxima de chama.

Ala de Platina
Pipetas
A pipeta empregada na microbiologia, para transferncia de culturas liquidas e
diluies sucessivas das amostras. O material deve ser aspirado lentamente, mantendo-se a
pipeta com o dedo, mdio e o polegar, com o indicador controlando a vazo do liquido.
importante manter o dedo indicador seco.
Na transferncia de culturas (principalmente em caso de tubos) deve-se evitar
escorrer o liquido nas paredes internas do mesmo. No trabalho com placas,
normalmente a ultima gota do liquido permanece na ponta da pipeta, devendo toca-la na
regio seca da placa. comum colocar-se algodo na extremidade superior da pipeta,
evitando contaminao por bactrias das vias areas superiores e tambm a finalidade de
impedir que o analista se contamine acidentalmente quando trabalhar com microrganismos
patognicos.
Para a esterilizao, as pipetas devem estar adequadamente limpas e secas. Devero
ser embaladas individualmente empregando-se o papel Kraft ou em conjunto utilizando
pipetadores de inox e, em seguida, procede-se a esterilizao.

Placas de Petri
As placas de Petri so usadas para cultivar com meios de cultura slidos. Essa
vidraria deve estar lavada, seca e posteriormente embalada e esterilizada. As placas podem
ser embrulhadas com papel Kraft individualmente ou em conjunto, de acordo com a
rotina de trabalho.
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As placas de Petri com meios de cultura, com ou sem crescimento de
microrganismos, s podero ser abertos nas proximidades da chama, para evitar
contaminao.
No preparo da placa para contagem do tipo pour plate deve-se abrir placa
somente o necessrio para permitir a introduo das pipetas.

Placas de Petri

3. Esterilizao
Esterilizar um material inativar todos os microrganismos nele existentes. Ao ato
de esterilizar, d-se o nome de ESTERILIZAO, ou seja, o processo capaz de destruir
ou eliminar todas as formas vivas de um material ou ambiente. Atravs da esterilizao dos
meios de cultura e dos instrumentos utilizados nos trabalhos de laboratrio, possvel o
isolamento e a manuteno de culturas puras.
A esterilizao pode ser feitas atravs de diferentes processos, empregando-se
agentes fsicos (calor, atrito, radiao, filtrao) e agentes qumicos. A esterilizao pelo
calor de larga aplicao em microbiologia.
Todo material para isolamento e cultivo de microrganismos no laboratrio ,
obrigatoriamente, esterilizado

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3.1 Mtodos de Esterilizao

3.1.1 Calor seco
Nos ambientes secos, eliminao dos microrganismos ocorre pela oxidao ou
queima das protenas presentes no material celular. Isso requer uso de temperaturas
elevadas durante determinados perodos (160C ou 170C durante 1 a 2 horas). A
utilizao do calor seco como processo de esterilizao demanda, geralmente, a
utilizao de estufas ou fornos apropriados (forno de Pasteur), ou a utilizao
direta da chama.
O calor seco ( como forno ou estufa) penetra nas substncias mais
lentamente que o calor mido (vapor) geralmente usado para esterilizar objetos de metal e
vidros.

3.1.1.1 Flambagem em chama direta
A flambagem realizada em chama direta com bico de Bunsen ou lamparina.
Consiste em se passar a ala ou agulha de platina sobre a chama at o rubro, com a
finalidade de esteriliz-las, ou ento as bocas dos tubos de ensaio, ou outros frascos, para
evitar possveis contaminaes pelo ar na transferncia ou inoculao das clulas.
As alas ou agulhas de platina devem ser mantidas em posio vertical ou
ligeiramente inclinadas, de maneira que toda extenso da ala ou agulha fique
demasiadamente rubra. importante observar que deve-se introduzir a ala na parte mais
quente da chama.
Em relao aos frascos e tubos, deve-se evitar aquec-los demasiadamente para
evitar a quebra. Pipetas no devem ser flambadas, pois com o aquecimento pede ocorrer um
dilatamento ocasionando diferenas no volume a ser medido.

3.1.1.2 Ar quente
Empregado para a esterilizao de placas de Petri, pipetas, tubos de diluio, tubos
de ensaios e outras vidrarias. As vidrarias devem ser embaladas em papel apropriado que
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adquire cor parda, no devendo escurecer muito, nem se tornar quebradio. 170 a 180c por
1 a 2 horas
Deve-se deixar o forno ou estufas de esterilizao esfriar por si, pois a abertura do
forno ainda quente provoca variao brusca de temperatura, podendo-se levar quebra do
material.

3.1.2 Calor mido
Esse mtodo de esterilizao provoca a inativao ou coagulao de protenas dos
microrganismos. Embora a maioria dos microrganismos morra as temperaturas inferiores a
100 C, existem bactrias que produzem endsporos resistentes a essa temperatura. A
utilizao do calor mido no indicada para a esterilizao de materiais que podem ser
afetados pela umidade ou pelas altas temperaturas, como alguns acares, protenas e
vitaminas. Geralmente, na esterilizao pelo calor mido utiliza-se o vapor d gua sob
presso ( autoclavagem) ou a tindalizao.

3.1.2.1 Temperatura a 100C
A gua fervente: a imerso de gua fervente empregada para a esterilizao de
instrumentos cirrgicos, seringas ou injeo. A fervura destri quase que instantaneamente
os germes patognicos no esporulados, todavia, no se deve esquecer que h esporos
resistentes ao da gua fervendo, durante 15 minutos ou mais.

3.1.2.2 Vapor fluente
Pode ser feito em autoclave com o orifcio de escapamento aberto.

3.1.2.3 Tindalizao
Consiste num processo de esterilizao fracionada, efetuado o aquecimento a
100C por em intervalos de 24 horas em trs vezes consecutivas. Tyndall (1877) verificou
que repetindo o aquecimento 2 ou 3 dias consecutivos, consegue-se destruir todas as
bactrias. D-se o nome de tindalizao ou esterilizao fracionada a esse aquecimento,
com intervalo adequado.
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1 aquecimento: destri apenas as formas vegetativas, no destruindo os esporos.
Resfriamento: germinao.
2 aquecimento: morte das formas vegetativas dos esporos poupados no primeiro
aquecimento. Resfriamento: germinao
3 aquecimento: morte dos possveis sobreviventes.
Este processo freqentemente empregado para esterilizao de meios de cultura
que se alteram a temperatura elevada, como soro, meios contendo acar e outros.

3.12.2 Temperatura superior a 100C Vapor sob presso
o meio mais eficaz de esterilizao, realizado em autoclave.
A autoclave consiste, essencialmente, de uma caldeira cilndrica de paredes
resistentes fechada superiormente, por uma tampa, que veda perfeitamente, devido
interposio de uma borracha e parafusos que se apertam.
No interior da caldeira existe um suporte sobre o qual se coloca uma cesta metlica
contendo o material a ser esterilizado. Entre o fundo da cesta metlica e o funda da caldeira
fica um espao que se enche de gua. A tampa da autoclave possui um orifcio de
escapamento, uma vlvula de segurana e um manmetro que indica presso e a
temperatura correspondente.

Eficincia Comparativa entre Calor Seco e Calor mido
O calor mido mais eficiente, pois tem um poder de penetrao maior que o calor
seco. Foi verificado que em um fardo de flanela exposto ao calor seco a 150C/4 horas, a
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temperatura atingida no centro sobe apenas a 83C, ao passo que a temperatura de 120C
em autoclave durante meia hora, a temperatura central chega a 117C.
A razo da maior eficincia do calor mido reside no fato que assim como outra
reao qumica, a termo-coagulao das protenas tambm catalisada pela gua.

4.0Filtrao
Na filtrao empregam-se filtros que so utilizados no laboratrio e na indstria para
esterilizar materiais que no podem ser esterilizados por autoclavao, como vitaminas,
protenas termossensveis. Inicialmente os filtros eram de cermica porosa ou de vidro
sinttico. Muitos deles foram substitudos por membranas filtrantes, filtros de membrana de
celulose extremamente finos (150m), com poros pequenos o suficiente para impedir a
passagem de microrganismo.

5 Contagem de Microrganismo

Introduo
O crescimento de microrganismo medido atravs da estimativa do nmero de
clulas que foram geradas por diviso binria durante uma fase de crescimento. Esta
medida expressa como o nmero de organismos viveis (vivos) por mililitro (mL) de
cultura. Existem vrios mtodos para contagem de microrganismos que so aplicados nas
anlises de alimentos e em anlises de gua.

5.1Contagem direta ou microscpica
Com a ajuda de uma cmara de contagem so contados o numero de clulas existentes em
um determinado volume do material. Um exemplo o mtodo de Breed utilizado
freqentemente na analise de leite cru e que preconiza a contagem do numero de clulas em
vrios campos microscpicos na quantidade de amostra. Atravs da relao existente entre
a rea do estendido e a rea do campo microscpico possvel se calcular o numero de
bactrias por mL.

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5.2.Contagem metablica
Mtodo baseado no aproveitamento de uma dada atividade metablica especifica das
bactrias sobre um dado substrato. Por exemplo: a prova de reduo do azul de metileno
que tambm praticada na anlise do leite cru.

5.3.Contagem de microrganismos viveis em placa
Semeaduras de material contaminado em placa (pour-plate ou superfcie) respeitando as
condies timas do microrganismo que se procura, isto , meio de cultura adequado,
temperatura, oxignio e tempo necessrio para favorece seu crescimento e permitir ao final,
a contagem das colnias formadas.

5.4.Semeadura em placas
O mtodo de contagem de microrganismos em placas um mtodo geral, que pode
ser utilizado tanto para a contagem de grandes grupos microbianos, como os aerbios
mesfilos, os aerbios psicrotrficos, os bolores e leveduras e os clostrdios sulfitos
redutores, como tambm para a contagem de gneros e espcies em particular como
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium perfringens, por exemplo. Esta
versatilidade decorrente do principio do mtodo que se baseia na premissa de que cada
clula microbiana presente em uma amostra ir formar, quando fixada em um meio de
cultura slido adequado, uma colnia visvel e isolada. Variando o tipo de meio (meio de
enriquecimento, meio seletivo, meio diferencial) e as condies de incubao (
temperatura e necessidade de oxignio), possvel selecionar o grupo, gnero ou espcie
que se deseja contar. Como as clulas microbianas muitas vezes ocorrem em
agrupamentos (pares, ttrades, cachos, cadeias, etc), no possvel estabelecer uma
relao direta entre o numero de colnias e o numero de clulas. A relao correta feita
entre o numero de Unidades Formadoras de Colnias (UFC), que podem ser tanto
clulas individuais como agrupamentos caractersticos de certos microrganismos.

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5.4.1Semeadura em profundidade ou pour-plate

Consiste em colocar 1,0 ou 0,1 mL do material, objeto de exame nas placas, agrega-se 15-
20 mL do meio de cultura fundido e resfriado a temperatura de 45C agitando-se com
movimentos rotativos por pelo menos 5 vezes, nos dois sentidos, isto , a favor dos
ponteiros do relgio e contra os mesmos. As placas assim preparadas devem ser incubadas
a temperatura e condies recomendadas pelo mtodo e classe de contagem realizada.
Incubar as placas invertidas e aps incubao proceder contagem das mesmas com ajuda
de um contador de colnias. Trabalhar sempre com 2 placas para cada diluio.

5.4.2 Semeadura em superfcie
Consiste em distribuir o meio de cultura a se trabalhar em prepara placas (15-20 mL)
esperar solidificar e uma vez preparada as diluies semeia-se 0,1 mL das diluies
escolhidas utilizando-se tambm duas placas para cada diluio. Estender toda alquota
semeada com uma ala de Drigalski. Ressalte-se que o Agar preparado e distribudo nas
placas para este procedimento deve ser usado imediatamente ou no mximo em 24 horas.
Para contagem procede-se da mesma forma do mtodo anterior.

5.4.3-Semeadura por gota (em superfcie)
Aps preparar o meio e distribui-lo em placas, esperar solidificar e dividir a placa em 3
segmentos iguais conforme desenho abaixo:
Em seguida, utilizando-se de uma pipeta especialmente calibrada, depositar 2 gotas (0,04
mL) de cada diluio sobre a superfcie do meio. Desta forma logramos semear 6 diluies
com o uso de apenas duas placas.

5.4.4Tcnica da membrana filtrante
Baseia-se na filtrao de um volume conhecido da amostra, atravs de uma membrana
estril de poros de 0,45mm de dimetro, que retm os microrganismos. Aps a filtrao, a
membrana transferida para uma placa de Petri contendo meio de cultura adequado e
incubado a temperatura, oxignio e tempo necessrio para favorece seu crescimento e
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permitir ao final, a contagem das colnias formadas. A filtrao feita em um aparelho que
consta de funil com tampa (para preservar a esterilidade da amostra), suporte de membrana
e frasco receptor. O frasco receptor conecta-se a uma bomba de vcuo, o funil esterilizado
por gua fervura em gua destilada durante 5 minutos.

Vantagens da tcnica
Permite a filtrao de grandes volumes de amostra. ideal para amostra que contem
de 1 a 2 bactrias por litro.
Perodos de incubao mais curtos
fcil de se utilizar, permitindo anlise de um numero grande de amostra em pouco
tempo.
Apresenta alta preciso e reprodutibilidade.
Desvantagem
Alto custo da membrana
As membranas ficam entupidas com amostras que possuam abundantes materiais em
suspenso.

6.0 Nmero mais provvel tubos mais provvel /NMP

Neste mtodo em um meio de cultura liquido, a partir de uma amostra representativa, se
colocam varias series de diluies (srie de 3 ou 5 tubos) paralelas e observar o crescimento
bacteriano. Este se manifesta atravs de turbidez e gs evidenciado nos tubos de Durham
colocados previamente dentro dos tubos de ensaios. Assim os tubos devem ser incubados a
temperatura e condies recomendadas pelo mtodo. Aps incubao a partir dos tubos
onde houve crescimento evidenciado pela presena de turbidez e/ou gs se determina o
numero mais provvel (NMP) consultando a tabela de McCrady onde este nmero estar
referido como sendo N.M.P./100ml ou grama da amostra analisada.

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7.0 COLILERT tecnologia de substrato definido

O Colilert usa uma tecnologia chamada Defined Substrate Technology (DST) para
analisar simultaneamente coliformes totais e E. coli. Dois nutrientes indicadores, ONPG e
MUG so as principais fontes de carbono no Colilert e so metabolizados pelas enzimas -
D-Galactosidase e -D-Glucoronidase indicando as bactrias coliformes e E. coli
respectivamente.
Os coliformes se desenvolvem no Colilert usando a Galactosidase para metabolizar o
ONGP e com isso a amostra incolor passa a amarela. A E. coli usa a Glucoronidase para
metabolizar o MUG e gerar fluorescncia quando a amostra exposta luz UV de 365 nm.
Como a maior parte dos microrganismos no coliformes no possuem essas enzimas, a
interferncia desses muito menor se comparados aos mtodos tradicionais. Os poucos no
coliformes que possuem essas enzimas so inibidos pela matriz antibitica especifica do
Colilert.
Assim essa forma de deteco muito diferente dos mtodos tradicionais, no h formao
de colnias. Aos aucares usados no Colilert permitem que coliformes estressados sejam
recuperados mais facilmente, pois exigem menor nvel de energia para ser metabolizados.
Isso no ocorre nos mtodos tradicionais, pois os meios de cultura nesses mtodos utilizam
aucares comuns como a lactose e tambm, utilizam altos nveis de sais e detergentes a fim
de inibir os no coliformes e por isso prejudicam a recuperao de coliformes
principalmente os injuriados.

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AULA PRTICA N 1
PRESENA DE MICRORGANISMOS NO AMBIENTE

Introduo:
Os microrganismos so encontrados nos mais diversos ambientes, podendo estar em
suspenso ou depositados com a poeira em vrias superfcies, entre elas e as mucosas do
homem. O meio aqutico foi, provavelmente, o ambiente primordial para os diversos
microrganismos, os quais se diversificam e colonizaram outros ambientes. Nas partculas
de poeira, os microrganismos esto presentes em grandes quantidades e, portanto, so
passveis de entrar em nosso organismo atravs de diversos mecanismos. Os
microrganismos presentes no ar depositam-se na superfcie de nosso corpo, cabelos, pele e
mucosas, bem como nos alimentos e bebidas.
Vivemos, portanto, em completa interao com os microrganismos e precisamos
aprender a conviver com eles. Felizmente, a maioria das espcies microbianas benfica ou
incua e uma baixa proporo de microrganismos causa prejuzos ao homem.
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As atividades no laboratrio de microbiologia consistem no isolamento,
conservao e manipulao de culturas de microrganismos A prtica assptica de
fundamental importncia para prevenir que microrganismos contaminantes venham a
crescer nos meios artificiais de estudo. Atravs de tcnicas simples, possvel demonstrar a
presena de microrganismos em diversos locais do ambiente onde nos encontramos.

Objetivos
Reconhecer materiais, equipamentos e normas do laboratrio de microbiologia
Averiguar a presena de microrganismos no ambiente de trabalho, na pele.
Averiguar o efeito da higienizao das mos

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Procedimentos: verificao de contaminao ambiental
AR
Expor uma placa de Petri contendo o meio de cultura (gar nutriente):
1. Manter a placa aberta durante 15 minutos;
PELE
2. Tocar os dedos ou expor ao contato de materiais como fio de cabelo, solo
etc.
RESPIRAO
3. Falar ou tossir sobre o meio de cultura;

Manter uma placa sem exposio ao ambiente, como testemunha.
Identificar as placas, anotando na tampa o tipo de exposio a que foram
submetidas, data, nome do aluno, turma e disciplina.
Incubar as placas na posio invertida temperatura de 35C durante 48 horas.
Avaliar a presena de colnias, sua abundncia e diversidade.

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AULA PRTICA N 2
OBSERVAES E PREPARAES MICROSCPICAS

1.0 Introduo
1.1Microscopia
A Microbiologia pode ser definida como o estudo de organismos muito pequenos
para serem vistos claramente e individualizado pelo olho humano sem nenhuma ajuda. Para
visualizao de microrganismos, necessita-se de aumentos, os quais so conseguidos com o
uso de um microscpio. O termo microscpio deriva do latim, micro, que significa
pequeno; e, do grego Skopos, que significa olhar.
O microscpio rotineiramente utilizado no laboratrio o microscpio ptico
composto. Seu princpio de funcionamento baseia-se no aumento da imagem por um
conjunto de lentes convergentes, associado a uma forte iluminao do campo de
observao, fornecendo uma imagem translcida dos microrganismos.
O microscpio desse tipo utilizado na microscopia de campo claro. Ele permite
um aumento til de aproximadamente mil vezes, e a maioria equipada com quatro
objetivas: a objetiva de imerso e objetivas a seco, sendo uma de grande, outra de mdio e a
ltima de pequeno aumento. A essas objetivas so suplementadas as oculares que, em geral,
fornecem aumento de dez vezes. O aumento total fornecido pelo microscpio obtido pela
multiplicao do poder de aumento da objetiva pelo poder de aumento da ocular. Com o
uso de oculares mais potentes, o aumento total pode ser ampliado de duas a trs vezes.
Contudo, o aumento de mil a duas mil vezes o limite da ampliao til obtido como
microscpio ptico. A limitao no uma questo de aumento, mas do poder de
resoluo, ou seja, da capacidade de distinguir e separar dois pontos adjacentes. O poder de
resoluo funo do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numrica, que
uma caracterstica do sistema de lentes utilizado. O limite de mxima resoluo obtido
com o menor comprimento de onda da luz visvel e com a objetiva de maior abertura
numrica.
Ao longo dos anos, algumas modificaes foram introduzidas no microscpio com a
finalidade de aumentar ou melhorar a visibilidade:
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a) Microscopia de campo escuro:
Ela baseada no efeito Tyndall, segundo o qual a poeira existente no ar invisvel a
olho nu, tornando-se visveis como pontos brilhantes. Os microscpios de campo
escuro tm um condensador especial que impede a penetrao dos raios luminosos
na objetiva, mais deixa passar a luz refratada por um objeto presente na lmina.
Assim a imagem do objeto surge luminosa e brilhante.
Sua utilizao recomendada para a visualizao de preparados a fresco, como a
gota pendente, em que o objeto a ser observado tem ndices de refrao muito
prximos aos do ambiente e que seria invisvel, ou quase, com a microscopia de
campo claro. Ex: espiroquetas.

b) Microscopia de luz ultravioleta
Esse tipo de microscopia permite observar objetos menores do que os observados
em microscopia com luz visvel. No entanto, como o comprimento de onda no
muito menor, o aumento obtido de apenas duas vezes. Como a luz ultravioleta no
visvel a olho nu e no atravessa o vidro, h a necessidade de lentes de quartzo e
de mquina fotogrfica. Isso torna o custo elevado, por isso um mtodo pouco
utilizado.
Entretanto, algumas modificaes tornaram esse tipo de microscopia bastante til na
identificao de microrganismos

b.1) Microscopia de fluorescncia
Ela baseia-se no fato de que determinadas substncias, ao absorverem a energia da
luz ultravioleta, emitem luz de comprimento de onda maior (visvel), permitindo a
observao de substncias que absorvem especificamente essa radiao.

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b.2) Microscopia de imunofluorescncia
uma modificao da tcnica anterior que tem grande utilidade, usa-se a
conjugao de anticorpos com substncias fluoresecentes, tendo, assim, grande
aplicao na identificao de microrganismos principalmente patognicos e estudos
ecolgicos.

c) Microscopia de contraste de fase
Usa objetiva e condensador especial que tm por objetivo permitir uma observao
mais ntida sem o aumento da imagem. Os ndices de refrao no so mudados,
mas acentuam-se as diferenas existentes.
Ela utilizada no estudo de clulas vivas, particularmente das estruturas celulares,
em que o ndice de refrao pouco diferente do ndice do ambiente e no seria
possvel a observao com microscpio comum.
d) Microscopia eletrnica
Usa-se feixe de eltrons, o que permite conseguir aumento de at 250.000 vezes.
Isso permite a visualizao de partculas virais e avaliao da ultraestrutura das
clulas. No entanto, o procedimento sofre limitaes devido necessidade de
preparo do material (dessecao, congelamento etc.) os quais podem afetar a
morfologia e impedir a visualizao dos microrganismos vivos.

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1.2 Partes do Microscpio
O microscpio ptico constitudo de um sistema de lentes e de um suporte mecnico, cada
um dos quais apresentando vrias partes:
a) P ou base: parte que sustenta todo o aparelho;
b) Corpo ou brao: pea que faz a ligao entre o p e a parte superior do aparelho;
c) Platina: dispositivo retangular localizado paralelamente base, destinado
recepo da lmina, o qual uma perfurao central para dar passagem luz;
d) Charriot: conjuntos de parafusos destinados movimentao da lmina no plano
horizontal;
e) Fonte de luz: lmpada localizada na base do aparelho;
f) Filtro: placa de vidro colorida que pode ser encaixada sobre a fonte de luz para
torn-la mais apropriada observao do material;
g) Diafragma ou ris: dispositivo localizado acima do filtro para controlar a
intensidade do feixe de luz que atinge o orifcio da platina.
h) Condensador: Conjunto de lentes localizado logo abaixo da platina, o qual serve
para concentrar e tornar paralelo o feixe de luz, fornecendo a iluminao
necessria e uniforme do objeto em estudo;
i) Parafuso do condensador: Localizado na lateral do brao, serve para controlar a
posio do condensador;
j) Revlver: pea circular na qual se inserem as objetivas, as quais podem ser
trocadas atravs da rotao;
k) Objetivas: Os microscpios mais comuns possuem quatro objetivas, que
proporcionem aumento de quatro, dez, quarenta e cem vezes;
l) Canho: parte superior do microscpio onde so encaixadas as lentes oculares;
m) Lentes Oculares: Lente superior do microscpio que se encaixa no canho
atravs delas que o observador olha. A ocular geralmente produz aumentos de
10 vezes, entretanto, existem oculares de 5 e 15 aumentos;
n) Parafuso macromtrico: parafuso situado na lateral do microscpio, que permite
grandes avanos ou recuos da platina em relao objetiva;
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o) Parafuso micromtrico: geralmente encaixado sobre o parafuso macromtrico,
de menor dimetro, que permite pequenos avanos ou recuo da platina( ajuste
fino);
p) Trava: alavanca que fixa o movimento do parafuso macromtrico em uma
determinada posio, impedindo a movimentao ascendente da palatina,
protegendo as objetivas contra possveis choques e a quebra de lminas.

1 Preparaes Microscpicas
A perfeita visualizao dos microrganismos e/ou de suas estruturas s possvel se,
alm da escolha do tipo mais eficiente de microscopia, a preparao estiver adequada. A
escolha do tipo de preparao depende da informao desejada e do microrganismo a ser
avaliado. Duas tcnicas gerais so empregadas: a fresco e Fixados e corados.
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1.1 A fresco
As preparaes deste tipo permitem o exame de organismos nas condies
normais de vida

1.2 Fixados e corados
As preparaes fixadas e coradas so usadas para verificar as caractersticas
morfolgicas dos microrganismos, sendo bastante utilizadas na identificao, pois tornam
mais fcil a visualizao das formas e permitem a verificao do comportamento tintorial
do organismo em relao s coloraes diferenciais. As etapas dessas preparaes so:
Preparo do esfregao;
Fixao;
Colorao

1.2.1 Preparo e fixao de esfregao
A preparao inicial do esfregao do tipo de cultura disponvel. Ele constitudo de
uma camada muito fina de material sobre a lmina e deve ser secado ao ar. A fixao do
material na lmina pode ser feita pela ao do calor, lcool, formol, cido actico e outros
produtos, e destina-se a imobilizar os constituintes celulares, fixando o esfregao na lmina,
atravs de precipitao ou coagulao do material protico.

2.0 Objetivo
Identificar as diferentes partes do microscpio e manuse-lo adequadamente;
Aprender a focalizar preparados no microscpio;
Compreender o princpio do funcionamento do microscpio ptico composto;
Aprender a utilizar a tcnica de preparao microscpica a fresco entre lmina e
lamnula.
Preparar e fixar esfregaos de culturas em meios slidos e lquidos.

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3.0 Materiais

Cultura de microalgas em meio lquido
Lminas para microscopia
Ala de platina
Microscpio ptico
leo de imerso
Bico de Bunsen

4.0 Procedimentos Para Preparao a Fresco

1. Coloca-se uma ou duas gotas no centro da lmina de cultivo de microalgas,
recobrindo-se em seguida com uma lamnula e levando-se ao microscpio para a
focalizao;
2. Coloca-se a lmina preparada a fresco sobre a platina, fix-la e, com o auxlio do
charriot, ajustar o campo a ser observado sobre a abertura que existe na platina;
3. Focalizar, com o auxlio do macromtrico, aproximando a objetiva de menor
aumento o mximo possvel da lmina. Observa-se, atravs da ocular, a imagem
obtida e, a partir deste ponto, usa-se o macromtrico afastando-se a objetiva da
lmina at a observao da imagem procurada. Em seguida, usa-se o micromtrico
para focalizar e obter melhor nitidez da imagem. Necessitando-se de um aumento
maior, gira-se o revlver para a objetiva seguinte e torna-se a focalizar com
micromtrico, e assim sucessivamente.
4. Para observar a preparao com objetiva de imerso, colocar uma gota de leo de
cedro sobre a lmina e girar o revolver para colocar a objetiva de imerso em foco;
5. Olhando pelo lado, fazer descer o canho como parafuso macromtrico, at que a
lente frontal da objetiva fique encostada no leo de imerso;
6. Mover o parafuso micromtrico at conseguir uma boa focalizao.

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Preparao de lmina a fresco

3.1 Procedimentos para preparo e fixao de esfregao

a) Culturas em meio lquido
Retirar uma gotcula da cultura com ala de platina esterilizada e colocar no centro
da lmina, tomando cuidado para no atingir as bordas. Esterilizar a ala de platina
na chama.
Secar o esfregao ao ar.
Fixar o esfregao passando a lmina, com o lado do esfregao virado para cima, trs
vezes sobre a chama do bico de Bunsen. Aps resfriamento, procede-se colorao.
a) Culturas em meio slido Colocar uma gotcula esterilizada na lmina.
Colocar uma gotcula de gua esterilizada na lmina;
Retirar uma pequena quantidade da cultura e misturar com gua;
Espalhar o material no centro da lmina, tomando cuidado para no atingir as
bordas. Esterilizar a ala de platina na chama.
Fixar o esfregao passando a lmina, com o lado do esfregao virado para
cima, trs vezes sobre a chama do bico de Bunsen.

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AULA PRTICA N 3
COLORAO DE GRAM

1Introduo
As coloraes podem ser simples (azul de metileno, Giemsa) ou diferenciais (Gram,
Ziehl-Neelsen). As simples so efetuadas pela aplicao de um nico corante, sendo as
clulas geralmente coloridas de maneira uniforme. Nas diferenciais entre elas ou entre
estruturas de uma mesma clula.
A colorao com azul de metileno utilizada principalmente na avaliao da
morfologia, pois os danos causados clula so menores devido ao menor nmero de
manipulaes. Ela realizada colocando-se o corante sobre o esfregao previamente
fixado. Deixa-se corar por 3-5 minutos, escorre-se o corante, lava-se em gua corrente e
deixa-se secar para posterior observao ao microscpio. A colorao de Giemsa utilizada
em clulas que no possuem parede celular e a Ziehl- Neelsen para a identificao de
microrganismos cido- resistentes.
A Colorao de Gram a tcnica de colorao diferencial mais importante e mais
utilizada em bacteriologia, foi introduzida pelo dinamarqus Hans Christian Joachim Gram,
em 1884. muito utilizado at hoje na sistemtica bacteriana. Alm das caractersticas
morfolgicas, este mtodo permite evidenciar determinadas propriedades das bactrias, as
quais so classificadas em Gram positivas e Gram negativas, de acordo com diferenas
na composio e estrutura da parede celular.

1.1 Finalidades da colorao de GRAM
A parede celular de bactrias Gram- positivas composta basicamente por
peptdeoglicano, que constitui uma espessa camada ao redor da clula. Imersos nesta
camada, podem estar presentes outros polmeros, como cidos lipoteicicos e
polissacardeos. Nas bactrias Gram negativas o peptideoglicano constitui uma camada
basal delgada, sobre a qual se encontra uma outra camada, composta por lipoprotenas,
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fosfolipdeos, protenas e lipopossacardeos, denominada membrana externa. A colorao
de Gram consiste, basicamente, em tratar bactrias sucessivamente com cristal violeta,
lugol, lcool e Safranina ou fucsina. O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactrias
Gram- positivas quanto nas Gram- negativas, formando um complexo de cor roxa. O
tratamento com lcool a etapa diferencial; nas Gram- positivas, o lcool no retira o
complexo cristal violeta+ lugol, pois a sua ao desidradante faz com que a espessa camada
de peptdeoglicano se torne menos permevel, retendo o corante. Nas Gram-negativas,
devido pequena espessura da camada de peptdeoglicano, o complexo corado extrado
pelo lcool, deixando as clulas descoradas. O tratamento com safranina ou fucsina no
altera a cor roxa das Gram- positivas, ao passo que as Gram- negativas, descoradas pelo
lcool tornam-se avermelhadas.
A diferena de comportamento das bactrias frente colorao de Gram significa a
existncia de diferenas marcantes e fundamentais entre as bactrias Gram- positivas e
negativas:
Na permeabilidade da parede celular;
Na composio qumica e estrutura bacteriana;
No metabolismo.
Estas diferenas que refletem na patogenicidade.

Gram- Positiva Gram - Negativa

Objetivo:
Discutir o mecanismo da reao de Gram;
peptdeoglicano
Membrana
citoplasmtica
Membrana
citoplsmatica
Membrana
externa
Espao
periplsmatico
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Familiarizar o estudante com as vrias etapas da tcnica de colorao;
Caracterizar as diferentes espcies bacterianas de acordo com sua reao
colorao de Gram.

Material: Lmina; Bico de Bunsen; Estufa; Microscpio; Cristal violeta; Lugol; Safranina
e lcool.

Procedimento
2. Lavar a lmina com gua e sabo e/ou lcool e ter. Secar a lmina e verificar se
toda gordura foi removida.
3. Colocar uma ou duas gotas do liquido contendo a suspenso na lmina. Espalhar
sobre uma rea de cerca de 1,5 cm de dimetro.
4. Deixar o esfregao secar temperatura ambiente ou em estufa.
5. Passar o esfregao 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen para fixao do
mesmo.
6. Adicionar o Cristal violeta, aguardar 1 minuto.
7. Aplicar soluo de Lugol esperar 60 segundos. Lavar com gua.
8. Descorar com lcool absoluto at que todo o corante seja removido.
9. Corar com Safranina esperar por 30 segundos. Lavar e secar.
10. Examinar ao microscpio com a objetiva de imerso.

OBSERVAES:
1. Quando o material a ser analisado for viscoso, deve-se proceder diluio
usando-se uma gota de gua destilada.
2. A fixao do esfregao faz-se necessria para manter o microrganismo aderido
lmina.
3. O Lugol uma substancia mordente empregada com o objetivo de fixar o
corante clula.
4. O lcool agente descorante que remove o corante de certas bactrias.
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5. Cultivos antigos de algumas bactrias Gram positivas podem perder a
propriedade de reter o Cristal violeta, e, conseqentemente, podero se corar
com a safranina.

Gram positiva (roxa) Gram negativa (vermelha)

Exerccio
Com os conhecimentos que voc adquiriu, indique a colorao de cada tipo de clula
bacteriana aps o uso de cada reagente, durante o procedimento de colorao:
PROCEDIMENTO GRAM + GRAM -
Cristal de violeta
Lugol
lcool
Safranina

Esquematizar os preparados observados:
a)Bactrias Gram- positivas b) Bactrias Gram- negativas

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AULA PRTICA N 4
PREPARAO E ESTERILIZAO DE MEIOS DE CULTURA

1INTRODUO

1.1Meios de culturas
O estudo dos microrganismos, sua identificao e a avaliao de suas populaes nos
diferentes materiais e ambientes requerem seu cultivo nas condies de laboratrio.
Meios de cultura so substratos adequados ao crescimento, multiplicao e
desenvolvimento de microrganismos fora de seu habitat natural.
Os primeiros meios utilizados foram naturais e lquidos como o caldo de pimenta, a urina,
o sangue e o leite.
O cultivo dos microrganismos exige que determinadas condies sejam atendidas. As
exigncias nutritivas e ambientais so viveis como o tipo de microrganismo, tornando
impossvel a produo de um nico meio que satisfaa todas as condies de todos os tipos
de microrganismos. Por outro lado, difcil e impraticvel a formulao de um meio de
cultura ideal para cada tipo de microrganismo. No cultivo de bactrias heterotrficas, o
meio mais utilizado o caldo nutriente (CN) e a sua respectiva forma slida, o gar
nutriente (AN). Para fungos, o meio comumente utilizado o gar dextrose ou Sabouraud.
No preparo de um meio de cultura necessrio conhecer as exigncias nutricionais dos
microrganismos. So considerados componentes essenciais do meio de cultura:
a) Fonte de energia: no caso de microrganismos quimiotrficos, esta exigncia
satisfeita pela presena de compostos orgnicos ou inorgnicos especficos a ser
oxidados, como por exemplo o enxofre ou o amnio. Para os fotossintetizantes, h a
necessidade de luz, que deve ser fornecida pelo ambiente.
b) Fonte de carbono: para microrganismos heterotrficos, h a necessidade da
presena de compostos orgnicos, enquanto que para os autotrficos necessrio
CO
2
, que pode ser suprido pelo ambiente.
c) Fonte de nitrognio: protenas, aminocidos, nitrato, amnio ou N
2
.
d) Fatores de crescimento: Vitaminas.
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e) Fonte de minerais: P, K, S, Ca, Fe, Mg, Mn, Zn, Cu etc.
f) gua
Devido s dimenses dos microrganismos, alm dos nutrientes, o meio de cultura deve
suprir algumas condies ambientais:
a) pH: cada organismo exige um pH adequado para seu crescimento. A maioria das
bactrias, por exemplo, exige um pH em torno de 7.
b) Atmosfera: presena de O
2
,CO
2
; condies para o crescimento de aerbios,
anaerbios, facultativos ou microaerfilos.
c) Presso osmtica: regulada pelos constituintes do meio. Para organismos marinhos
e haloflicos, h necessidade da adio de uma certa quantidade de sal, de modo a
obter a concentrao adequada para seu crescimento.
Nem todas as condies ambientais podem ser controladas no meio de cultura.
Temperatura, luz, presso hidrosttica e, na maioria das vezes, a atmosfera devem ser
controladas no ambiente (incubadora ou estufa).
Alguns nutrientes, como as substncias termolbeis (vitaminas, acares, aminocidos e
antibiticos), exigem cuidados especiais. Eles devem ser esterilizados por filtrao, sendo
adicionado aos meios aps a autoclavagem e resfriamento acima do ponto de solidificao
do meio.

1.1 Classificao dos meios de cultura
1. Quanto origem:
a) Naturais: aqueles que j existem prontos na natureza. Ex: leite, sangue, caldo
de frutas, caldo de cana e outros.
b) Artificiais: aqueles que so elaborados. Ex: gar nutriente.

2- Quanto composio:
a) Complexos: so aqueles que no apresentam uma composio qumica
definida, como os que contm extrato de carne ou extrato de levedura, sangue,
leite, ovos e outros.
b) Sintticos: meios que tm a composio qumica definida.
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3- Quanto ao estado fsico:
a) Slidos: so meios que j existem na natureza no estado slido, ou que
foram tornados slidos pela adio de uma substncia solidificante como o gar (
1,5%), a gelatina ou a slica-gel. So utilizados para o isolamento e avaliao de
populaes (contagens), ou mesmo para o cultivo normal. Ex: fatias de batata e gar
nutriente. O gar-gar o solidificante mais utilizado em microbiologia. Ele um
polissacardeo extrado de algas marinhas do gnero Gelidium, constitudo de
unidades monomtricas de galactose e cido galacturnio. Foi introduzido na
microbiologia por Robert Koch e at hoje vem sendo utilizado devido a suas
seguintes caractersticas:
inerte para a maioria dos microrganismos;
transparente;
neutro;
Possui ponto de fuso a 100 C
Possui ponto de solidificao de 40-45C, o que permite a sua mistura com
microrganismos ou com substncias que se alteram em temperaturas
elevadas (Ex: protenas).
b) Semi slidos: meios que apresentam consistncia intermediria, como por
exemplo o meio semi-slido ( 0,5% de gar) utilizado para a verificao da
mobilidade ou para a caracterizao de microrganismos microaerfilios.
c) Lquidos: so meios utilizados na forma de caldo. Eles permitem obter
maior concentrao celular em menor tempo. O crescimento de microrganismos
unicelulares pode ser avaliado nesses meios pelas mudanas de turvao. Ex: Caldo
nutriente.

4- Quanto finalidade
a) Meios gerais ou bsicos: so aqueles que permitem o crescimento de um
grande nmero de espcie microbiana dentro de um grupo: gar nutriente para
bactrias, Sabouraud ou gar dextrose para fungos.
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b) Meios enriquecidos: so meios de culturas adicionados de misturas
complexas e naturais como leite, sangue, soro e extrato de tecidos animais ou
vegetais, que permitem o crescimento de microrganismos nutricionalmente mais
exigentes (fastidiosos). Ex: gar sangue para isolamento e cultivo das bactrias
dos gneros Neisseria, Staphylococcus e Streptococcus.
c) Meios seletivos: So aqueles que possuem uma composio ou uma ou mais
condies que seleciona o tipo de microrganismo que vai crescer. So muito
teis no isolamento e na identificao. Ex: meio SS gar para Salmonella e
Shigella.
d) Meios indicadores ou diferenciais: so aqueles que destacam (indicam)
determinadas caractersticas metablicas do microrganismo. So tambm muito
teis no isolamento e na identificao. Ex: meio Mac Conkey, para bactrias
entricas.
e) Meios de enriquecimento: So aqueles que permitem o desenvolvimento
diferenciado de microrganismos, favorecendo o crescimento de um grupo em
detrimento de outros.
f) Meios de dosagem: so empregados na dosagem de substncias, tais como
vitaminas, aminocidos e desinfetantes.
g) Meios de transporte, estocagem ou manuteno: mantm a viabilidade
dos microrganismos por mais tempo. Por exemplo, a presena de glicose no
meio de cultura faz com que o microrganismo se multiplique mais rapidamente,
exaurindo toda a fonte de energia. A mudana do tipo de acar permitir um
crescimento mais lento, e a cultura sobreviver mais tempo.

Meios desidratados
A maior parte dos meios de cultura pode ser obtida na forma desidratada e neste
caso alguns aspectos devem ser obtidos:
1.3 Armazenamento e conservao
Anotar em livro prprio a data da recepo dos meios de cultura e ingredientes
empregados na formulao.
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Armazena-lo de acordo com as especificaes contidas no rotulo, em uma rea de
pouca umidade, afastada da luz direta do sol, das autoclaves, estufa de secagem e
qualquer outra fonte de calor.
Quando especificado no rotulo, manter sob refrigerao.
Aps o uso assegurar-se de que o frasco esta bem fechado e armazena-lo em local
prprio.
Descartar o meio caso o p no esteja fluindo facilmente ou se houver alteraes na
cor e/ou consistncia.

1.4 Pesagem
Ao preparar meios e cultura deve-se usar primeiro o estoque mais velho. No se
deve abrir um novo lote de meio ate que o anterior tenha esgotado.
Usar uma balana cuja exatido se verifique freqentemente. Os meios desidratados
so hidroscpicos e desta forma, a pesagem deve ser feita rapidamente e em local de
pouca umidade.

1.5 Dissoluo
Usar vidros bem lavados e enxaguados. No usar gua suspeita de conter cloro,
cobre ou detergentes. Usar gua deionizada ou destilada.
Antes a aplicar calor dissolver meios desidratados deve-se ler o rotulo. Alguns
meios no devem ser submetidos a temperaturas acima de 55C, (Caldo urea, Agar
urea) enquanto que outros meios desidratados devem ser aquecidos a fim de garantir a
completa dissoluo e distribuio uniforme dos ingredientes.
O aquecimento deve ser feito sob agitao continua e suave, evitando que o mesmo
se queime no fundo do frasco. A agitao do meio durante o aquecimento deve ser feita
com cautela porque alguns meios, especialmente os que contm Agar, podem formar
espuma e transbordar.
Os meios que contm Agar devem permanecer, em geral durante 5 a 10 minutos em
repouso na gua, antes de serem aquecidos, para permitir que as partculas de Agar se
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reidratem adequadamente, elevando a solubilidade do Agar resultando em gel mais
uniforme.
O meio preparado deve ser distribudo em frasco ou tubo (permitindo uma pequena
folga da tampa) apropriado e levado para esterilizao.
Ao distribuir o meio em recipientes adequados, no devemos colocar mais de 2/3 da
capacidade do mesmo.

1.6 Esterilizao
Alguns meios no devem ser esterilizados em autoclave. Em alguns casos, os meios
devem ser esterilizados por filtrao, outros so to seletivos que no necessitam de
calor nem de filtro (Agar Salmonella-shiguella, Agar citrato desoxicolato, Caldo de
tetrationato, Caldo de selenito). A atividade seletiva destes meios destruda durante a
autoclavao.
O microbiologista dispe de numerosos filtros de diferentes tipos e poros de
tamanhos variveis. Os filtros de membrana (Millipore, Belford, Mass) so
provavelmente o sistema de filtro mais usado e podem ser empregados com adaptadores
prprios permitindo a esterilizao de grandes volumes.
Na esterilizao por autoclavao o meio no deve ser tratado deficientemente ou
excessivamente. O excesso de tratamento em um meio pode acarretar um erro pior do
que a subesterilizao. necessrio pr-aquecer meios em volumes maiores, para evitar
demora em alcanar a temperatura de esterilizao. Nunca deve ser autoclavado mais de
dois litros por recipiente. Antes de esterilizar o pH do meio deve ser comprovado em
potencimentro (ajustado com tampes). Esta medida deve ser tirada a 25C e
normalmente no precisa ser ajustada. A adio de componentes pode afetar o
equilbrio do meio.

1.7Armazenamento do meio pronto
De forma geral, os meios prontos devem ser armazenados a temperatura entre 2 e
8C (geladeira). O efeito nocivo comumente associado ao armazenamento a
desidratao. Esta no ser problema em meios lquidos e sim em meios em placas,
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principalmente em laboratrios pequenos onde certos meios so usados ocasionalmente.
Estes meios em placas devem ser conservados em sacos plsticos, selados, para
minimizar a perda de umidade, e estocados em posio invertida. Todos os meios
devem ser levados a temperatura ambiente antes de seu uso.
Meios como Agar padro, Agar batata e outros, podem ser guardados em volumes
para serem adicionados em placas (15 mL). No momento da analise sero fundidos e
resfriados.

2.0 Objetivo:

Familiarizar o aluno na preparao e esterilizao de meios de cultura

3.Procedimento
3.1 preparo do meio lquido
Pesar o meio de cultura indicado pelo professor de acordo com as especificaes do
fabricante, em papel alumnio ou vidro de relgio e, transferi-lo para um becker;
Colocar a quantidade de gua de acordo com a quantidade do meio a ser preparado.
Dissolver na chapa de aquecimento
Medir o pH e se necessrio ajustar pela adio de NaOH ou HCl 1N
.Distribuir em tubos (na proporo de 5,0 ml)
Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos;
3.1 preparo do meio slido
Pesar o meio de cultura indicado pelo professor de acordo com as especificaes do
fabricante, em papel alumnio ou vidro de relgio e, transferi-lo para um frasco de
Erlenmeyer;
Colocar a quantidade de gua de acordo com a quantidade do meio a ser preparado.
Dissolver na chapa de aquecimento at completa dissoluo do meio de cultura
Colocar a boneca (tampa) e a coifa de papel com nome do meio e a data do preparo
Medir o pH e se necessrio ajustar pela adio de NaOH ou HCl 1N
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Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos;
Seqencia do preparo de meio de cultura para a produo de meio lquido (caldo), slido
(gar)

Instrues para o Manejo da Autoclave
1.Adicionar a quantidade de gua se necessrio para evitar danos resistncia;

Cesto de Inox Resistncia
coberta com gua
MEIO AGAR OU
CALDO
gua destilada
Dissolver
Corrigir pH
Esterilizar em autoclave
Armazenar
Distribuir
Agitao
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2.Colocar o material na cesta de inox devidamente acondicionado
3.Tornear a tampa, apertar os parafusos por porcas sempre opostas, de forma que a tampa
encaixe perfeitamente sobre o friso existente para isto.

4.Abrir a vlvula de vapor e ligar a corrente eltrica ou ligar e aceder o gs.
5.Ao sair vapor pela vlvula de forma contnua, esperar 5 minutos para a expulso de todo
ar e s ento fechar a vlvula.
6.Vigiar o manmetro e a vlvula de segurana. Quando a vlvula deixar escapar vapor,
verificar a presso.
7. Quando a temperatura atingir 121 C, controlar para que permanea estvel (regular
mediante vlvula de escape do vapor).
8. Inicia-se a contagem de esterilizao, geralmente de 15 a 30 minutos.
9. Desligar o aparelho, deixar esfriar e diminuir a presso.
10.Esperar que o ponteiro do manmetro desa at o zero e ento abrir a vlvula de vapor

Manmetro

Vlvula de vapor
Manmetro
Parafusos
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11. Terminando o tempo necessrio para esterilizao, pode-se abrir lentamente o orifcio
de escapamento, para a presso descer mais rapidamente;
12.Abrir autoclave somente quando a presso interna for igual externa. A abertura
antecipada da autoclave muito perigosa. O lquido com temperatura acima de 100 C no
evapora quando a presso elevada, baixando bruscamente a presso, o lquido evapora
rapidamente, podendo causar uma violenta exploso, fazendo saltar rolhas e meios, alm de
causar queimaduras no operador.

Autoclave com tampa aberta

Importncia da Eliminao do Ar Residual na Autoclave
O ar um mau condutor de calor. A ao esterilizante do vapor devida facilidade
com que ele se condensa sobre as superfcies mais frias dos objetos a serem esterilizados,
cedendo-lhes o seu calor latente. O ar interfere nessa condensao, formando um filme
protetor em torno do material evitando assim a penetrao do calor.

Tampa
Chave de controle
do termostato
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AULA PRTICA N 5
PREPARO DE DILUIO

1.0 Introduo
Para utilizar os mtodos para efetuar a contagem de microrganismos geralmente
utiliza-se diluio em srie por ser difcil realizar a contagem de milhares ou centenas de
colnias. Assim sendo, efetua-se a diluio da cultura que se pretende contar antes de
plaquear (transferir) um volume conhecido de cultura para a placa slida.
Para se fazer uma diluio em srie, comea-se com organismos em meio lquido.
Acrescentando 1 ml deste meio a 9ml de gua diluio, cria-se uma diluio de 1:10;
acrescentando 1 ml da diluio 1:10 a 9ml de gua de diluio , cria-se uma diluio de
1:100, e assim por diante. O nmero de bactrias por mililitro de fluido reduzido em 9/10
a cada diluio.

IMPORTANTE:
Para se determinar o nmero de unidades formadoras de colnias na cultura original, deve-
se multiplicar o nmero de colnias encontradas na placa pelo o fator de diluio; se esta
for uma frao deve-se usar o denominador. Um fator de diluio de 1000 seria expresso
por 1:1000.

Objetivo
Familiarizar o estudante coma tcnica de diluio, para utilizar nas tcnicas de contagem de
microrganismos.

Procedimento
1. Preparar uma srie de tubos estries contendo 9 mL de liquido de diluio estril.
2. Com uma pipeta estril, transferir 1 mL da amostra ao primeiro tubo contendo 9mL
do liquido de diluio estril, esta diluio 1/10. Etiquetar o tubo com a diluio
correspondente.
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3. Agitar a amostra energicamente para obter uma boa distribuio das bactrias na
massa liquida.
4. Descartar a pipeta usada
5. Usando nova pipeta estril, transferir assepticamente 1 mL da diluio 1/10, esta a
diluio 1/100. Etiquetar o tubo.
6. Descartar a pipeta usada.
7. Agitar o tubo de diluio 1/100
8. Usando nova pipeta estril, transferir assepticamente 1 mL da diluio 1/100 a outro
tubo de diluio com 9 mL diluio, esta a diluio 1/1000. Etiquetar o tubo.
9. Da mesma forma, segue-se preparando maiores diluies 1/10.000; 1/100,000
quantas forem precisas.

Lquido de Diluio
Utilizar soluo Ringer diluda a . A composio a seguinte
Cloreto de sdio 9,0 g
Cloreto de potssio 0,42g
Cloreto de clcio anidro 0,24g
Bicarbonato de sdio 0,20g
gua destilada 1000mL
Antes do uso, selecionar parte da soluo acima trs partes da gua destilada. O
liquido de diluio deve ser acondicionado em garrafas apropriadas que contenham 99;
90 ou 9mL aps esterilizao.

OBSERVAES
Todo material usado deve ser esterilizado.
Em cada diluio, deve-se descartar a pipeta usada. O uso da mesma pipeta
no preparo de duas diluies consecutivas implica incorporar diluio
maior, bactrias provenientes de diluio anterior que, por exemplo ficaram
nas pipetas. O erro assim causado altamente significativo e a contagem
final no ter validade.
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AULA PRTICA N 5 -
CONTAGEM DE MICRORGANISMOS EM PLACAS

Objetivo:
Familiarizar o estudante com uma das tcnicas de contagem, para avaliao do crescimento
de bactrias.
Procedimento:
A) Contagem em superfcie
Preparar diluies decimais da cultura transferindo1 ml para o tubo contendo 9ml de
gua de diluio, diluio de fator 10 (concentrao 1:10 ou1/10)
Homogeneizar a suspenso.
Transferir, a partir da diluio anterior, 1 ml para outro tubo contendo 9 ml de gua
de diluio, homogeneizar a suspenso, e assim sucessivamente, de modo a obter as
diluies: 10
2
; 10
3
;10
4
;10
5
;10
6
;10
7
.
Colocar o meio de cultura nas placas e deixar solidificar;
Identificar as placas marcando o nome, turma, data, diluio (10
5
;10
6
;10
7
) e
repetio (I, II e III);
Inocular as placas, previamente identificadas com 1ml das respectivas diluies;
Espalhar rapidamente lquido, com ala de Drigalski, at que este seja absorvido
pelo meio.
Colocar as alas em soluo desinfetante;
Incubar as placas na posio invertida temperatura adequada no mnimo 24 horas.
Escolher a diluio cujas placas apresentem de 30 a 300colnias.
Proceder a contagem das colnias;
Calcular o nmero de bactrias ( UFC unidades formadoras de colnias) /ml da
cultura original utilizando a seguinte frmula.
N
de bactrias ( UFC)/mL = mdia do n de colnias x fator de diluio

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B) Contagem pelo mtodo pour plate
Preparar as diluies e identificar as placas conforme descritos no procedimento de
contagem em superfcie.
Inocular as placas com 1 ml das respectivas diluies.
Verter o meio de cultura a 50C e misturar realizando movimento de rotao no
sentido horrio e no sentindo anti- horrio durante alguns segundos.
Deixar solidificar.
Incubar as placas na posio invertida temperatura adequada durante no mnimo
24 horas.
Escolher a diluio cujas placas apresentem de 30 a 300 colnias.
Proceder a contagem das colnias.
Calcular o nmero de bactrias (UFC)/mL da cultura original utilizando a seguinte
frmula:
N
de bactrias ( UFC)/mL = mdia do n de colnias x fator de diluio

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Esquema de contagem em placa
Repeties Diluio utilizada Contagem
1
2
3
Mdia =

II UNIDADE TEMTICA

AULA PRTICA N 6
ANLISE MICROBIOLOGICA DE GUA TCNICA DOS TUBOS
MLTIPLOS

1.Coleta de Amostras
As guas a serem coletadas para o exame bacteriolgico devem ser colhidas com
esterilidade e em pontos representativos da planta de tratamento, do sistema de
distribuio ou do manancial. A anlise deve ser feita atravs dos mtodos padres a fim
de poder comparar os resultados obtidos em diferentes pocas e em diferentes regies.

2.Frascos de Coleta
Deve-se utilizar frascos escuros com tampas de boca larga e capacidade mnima de
120 mL. O frasco ser esterilizado, com tiossulfato de sdio (100mg de tiossulfato por 1
litro de gua), se destinado gua clorada ou sem tiossulfato para outros tipo de gua. A
tampa e o gargalo do frasco devem ser protegidos com papel tipo Kraft ou papel
alumnio.
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3.Coleta de Amostra de Torneira
No deve fazer coletas em torneiras com vazamento. Abre-se a torneira, deixa-se
correr a gua para eliminar a que ficou retida na tubulao. Fecha-se, seca-se com um
pano limpo. Esteriliza-se a torneira com um cotonete grosso de algodo embebido em
lcool e aceso. Abre-se novamente a torneira deixa-se sair um pouco de gua. Abre o
frasco, enche deixando 2 cm de ar para poder agitar a amostra antes da anlise. Fecha o
frasco e a torneira.

4.Coleta de Amostra de Piscina
Recomenda-se coletar gua da superfcie e a 30 cm de profundidade. Na superfcie
forma-se um filme de gorduras proveniente do corpo do banhista, e o nmero de bactrias
maior e no necessariamente representativo da massa de gua restante. O frasco deve
conter tiossulfato e as coletas devero ser feitas na hora de maior concorrncia.

5.Coleta de Amostra de Rios, Lagos, etc.
O ponto de amostragem depender do que se deseje pesquisar. Em reservatrios
naturais utilizados como fonte de gua potvel, os pontos de coleta sero prximo ao
ponto de captao e na mesma profundidade que este.
No devem coletar-se amostra nas bordas dos reservatrios, rios, etc, porque nesta
regio a gua mais poluda e h acmulos de matria orgnica e crescimento de plantas
e insetos o que eleva o teor bacteriolgico e o resultado no seria representativo.
6. Balnearios
Os pontos de coleta so os lugares mais concorridos; amostras devem ser tomadas
na hora de pico, a freqncia de coleta ser aumentada na poca de chuva.
Todos os fracos com amostras devem ser etiquetados com data, hora lugar e
profundidade da coleta. Outros parmetros que so teis na analise dos resultados so
temperatura da gua no momento da coleta e pH.
s vezes precisa-se de barcos, frascos para coleta em profundidade, etc. Para
mergulhar frascos em rios, lagos etc, passa-se arame pelo gargalo, deixando-se um
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extremo comprido, sustenta-se a garrafa pela base e coloca-se na gua e se mexe em
contra-corrente desde o extremo do arame.
7. Conservao da Amostra
As amostras devem chegar ao laboratrio sem modificao de sua populao
bacteriana. A situao ideal proceder nas amostras 2 horas seguintes coleta. Quando
no possvel, deve-se conservar em isopor com gelo para manter a temperatura inferior
a 10C. Nestas condies a amostra se preserva durante 6 horas e deve ser processada nas
2 horas seguintes (ou seja, em um total de 8 horas aps a coleta).

8. Procedimento das Anlises:
8.1. Ensaio Presuntivo
2. Semear trs series de 5 tubos, utilizando 10mL;1mL e 0,1mL em caldo lactosado (CL)
ou caldo lauril triptose (CLT), contendo tubos de fermentao (Duhan) invertido. Para
inoculaes das pores de 10 mL da amostra, usar o CL ou o CLT em concentrao
dupla.
3. Identificar os tubos anotando a amostra a data e as pores da amostra. Identificar
tambm os frascos de diluio.
4. Homogeneizar a amostra
5. Preparo de diluies: Com uma pipeta estril de 1 mL e obedecendo aos cuidados de
assepsia, transferir 1 mL da amostra para um frasco contendo 9 mL do liquido de
diluio, antecipadamente identificado. Prepara-se assim, a primeira diluio decimal (10
-
1
), sendo que 1 mL da mesma corresponde a 0,1mL da amostra. Homogeneizar.
6. Com uma pipeta estril transferir 10 mL da amostra para os 5 tubos da primeira serie
contendo o meio CL ou CLT de concentrao duplo. Desprezar a pipeta, homogeneizar os
frascos.
7. Com uma pipeta estril transferir 1 mL da amostra para os 5 tubos da segunda serie
contendo o meio CL ou CLT. Desprezar a pipeta, homogeneizar os frascos.
8. Com uma pipeta estril transferir 1 mL da diluio 10
-1
para os 5 tubos da terceira
serie contendo o meio CL ou CLT. Desprezar a pipeta, homogeneizar os frascos.
9. Colocar a estante contendo os tubos inoculados na estufa a 35C durante 24-48 horas.
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10. Aps esse perodo de incubao, retirar os tubos da estufa para efetuar a primeira
leitura dos resultados. Para isso, agitar cada tubo e verificar a presena de turbidez e/ou
gs nos tubos. Descartar os tubos negativos.

FIGURA COM TUBOS POSITIVOS

8.2. Ensaio Confirmativo para Coliformes a 35C
O ensaio confirmativo efetuado utilizando-se o caldo lactosado verde bile
brilhante 2% (CLVBB) para determinao de coliformes totais e caldo EC para
coliformes termotolerante.
1. Identificar os tubos de CLVBB, contendo tubos de Duhan invertido, correspondente
respectivamente a cada tubo de CL ou CLT com resultado presuntivo positivo.
2. Agitar bem o tubo de CL ou CLT com resultado presuntivo positivo e, com uma haste
de madeira ou ala de platina, repicar o material e inocular no tubo correspondente de
CLVBB. Agitar
3. Incubar os tubos de CLVBB inoculados, durante 24-48 horas a 35C
4. Proceder a leitura aps o tempo de incubao, considerando como teste confirmativo
para coliformes totais todos os tubos que apresentarem gs nos tubos de Duhan
invertido com ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformes
totais na tabela em anexo.
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EXEMPLO:
TUBOS 1 2 3 4 5 TUBOS +
10 mL + + - - - 2
1 Ml + - - - + 2
0,1mL (10
-1
) - - - - - 0

De acordo com a tabela o NMP de CT = 21g/100mL

8.3. Diferenciao para Termotolerantes
Esta diferenciao, feita a partir dos tubos positivos de CL ou CLT.
1.Identificar os tubos com caldo EC, contendo tubos de Duhan invertido, correspondente
respectivamente a cada tubo de CLVBB com resultado presuntivo positivo.
2.Agitar bem o tubo de CLVBB com resultado presuntivo positivo e, com uma haste de
madeira ou ala de platina, repicar o material e inocular no tubo correspondente de caldo
EC. Agitar
3.Incubar os tubos de caldo EC inoculados, durante 24 horas a 44,5C
Proceder a leitura aps o tempo de incubao, considerando como teste confirmativo para
coliformes termotolerantes todos os tubos que apresentarem gs nos tubos de Duhan
invertido com ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformes
termotolerantes na tabela em anexo.
Se a finalidade do ensaio for o exame completo, prosseguir a partir dos tubos CLVBB com
resultado positivo no ensaio confirmativo.
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84. Ensaio Completo (Opcional)
1. Identificar placas contendo o meio solidificado Agar eosina azul de met ileno
(EAM), correspondendo a cada uma, a um tubo de CLVBB com resultado positivo.
2. Flambar e resfriar uma ala de platina.
3. Agitar e inclinar o tubo de CLVBB e mergulhar a extremidade da ala de platina no
liquido do tubo a uma profundidade de, aproximadamente, 1 cm.
4. Depositar o inculo em um ponto das bordas da placa de Agar EAM, gira-la e
iniciar seu espalhamento na superfcie do primeiro quadrante, tomando cuidado para
que a parte encurvada da ala toque apenas a superfcie do meio, evitando racha-lo.
5. Girar novamente a placa e continuar o espalhamento no segundo quadrante.
6. Proceder dessa maneira ate completar a semeadura em toda superfcie do Agar.
7. Fechar e incubar a placa em posio invertida durante 24 horas a 35C.
8. Aps o perodo de incubao, efetuar a leitura, considerando as colnias tpicas de
coliformes as colnias nucleadas, com ou sem brilho metlico.
9. Considerar como colnias atpicas de coliformes as colnias rosas, mucoides,
opacas e sem ncleo e, como colnias negativas, todos os outros tipos de colnias.

2 Contagem total de microrganismos hetertrofos aerbios
1. Meio de cultura: Agar padro para contagem(APC)
2. Tcnica
Pipetar assepticamente pores de 1mL das diluies selecionadas,
transferindo-as para as placas de Petri devidamente identificadas. Semear em
duplicatas, utilizando no mnimo duas diluies diferentes. Adicionar a cada placa
aproximadamente 15mL do meio previamente fundido.
O espao de tempo decorrido entre a semeadura e a adio do meio no deve
utrapassar a 20 minutos.
Homogeneizar cuidadosamente, em movimento de vai-vem, sentido horrio e ante-
horrio.
FIGURA DAS PLACAS COM MOVIMENTO
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Como prova de esterilidade, adicionar 15mL do meio previamente fundido em placa
sem amostra. Deixar solidificar em superfcie plana
Incubar s placas invertidas em estufa a 35C por 48 horas
Aps o perodo de incubao selecionar as placas que contenha entre 30 e 300 colnias
Clculo
Calcular a media aritmtica dos resultados encontrados em uma mesma diluio e
multiplicar pela diluio
Exemplo:
Diluio 10
-2
placa 1 = 36 colnias
Diluio 10
-2
placa 2 = 39 colnias
36 + 29/2 = 37,5 x 100 = 3750 colnias

N de bactrias = 3,7 x 10
3
UFC/ mL da amostra

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AULA
PRTICA N 7

ANLISE MICROBIOLOGICA DE GUA TCNICA
COLILLERT

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AULA PRTICA N 8

ANLISE MICROBIOLGICA DE ALIMENTOS FRESCOS
CARNES/QUEIJOS/LINGUIAS

A qualidade global de um alimento determinada por diversos fatores de natureza
fsica, qumica nutricional e microbiolgica.

1 DIA DE TRABALHO
Procedimento
1. Pesar 25 ou 10 gramas da amostra
2. Emulsionar as 25 gramas da amostra em 225 mL ( 10 gramas da amostra em 90mL)
do liquido de diluio estril (diluio 1/10)
3. Homogeneizar
4. Pipetar 9 mL em frascos de diluio
5. Preparar diluies 1/100; 1/1000 e 1;10.000
6. Trabalhe sempre junto a chama do bico de Bunsen e no esquecer de agitar e
flambar os tubos antes de pipetar.

1 Determinao das Bactrias do Grupo Coliformes
Meios de cultura utilizados: Verde Bili Brilhante 2%; (CLVBB); Caldo EC e Eosina
Azul de Metileno
1. Organize seu material de trabalho. Identifique os tubos segundo o esquema
Amostra:
Diluio:
Data:

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1. Organize em uma estante 3 series de 3 tubos cada um contendo o meio de
cultura Verde Bili Brilhante 2%; (CLVBB);
2. Inocule : 1 mL da diluio 1/10 na primeira serie. Agite
1mL da diluio 1/100 na segunda serie. Agite
1 mL da diluio 1/1000 na terceira serie. Agite.
3.Incube a 35C por 24 horas.

2 DIA DE TRABALHO

1. Aps as 24 horas separe os tubos + (aparecimento de turbidez e gs nos tubos de
Dunran).
Fazer leitura na tabela do NMP e multiplique o resultado por 10. Descarte os tubos
negativos. Voc tem os resultados para coliformes a 35C.
2. Identificar os tubos com caldo EC, contendo tubos de Duhan invertido, correspondente
respectivamente a cada tubo de CLVBB com resultado positivo.
3. Agitar bem o tubo de CLVBB com resultado positivo e, com uma haste de madeira ou
ala de platina, repicar o material e inocular no tubo correspondente de caldo EC. Agitar
4. Incubar os tubos de caldo EC inoculados, durante 24 horas a 44,5C

3 DIA DE TRABALHO
Proceder leitura aps o tempo de incubao, considerando como teste confirmativo para
coliformes a 45C todos os tubos que apresentarem gs nos tubos de Duhan invertido com
ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformes a 45C na tabela em
anexo, MULTIPLIQUE O RESULTADO POR 10.
CONFIRMATIVO PARA E. COLI

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2 Contagem de Staphylococcus

Meios de cultura utilizados:
Identifique as placas. A identificao deve ser feita na tampa das placas:
Amostra:
Diluio:
Data:

Preparao das placas

Para o plaqueamento em superfcie, as placas devem ser previamente preparadas,
adicionando 15 a 20 mL do meio j acidificado nas placas. Antes de usar o meio deve estar
solidificado
Preparar 3 diluies adequadas da amostra.
Inocular 0,1 mL de cada diluio na superfcie das placas, previamente preparadas, e
usando uma ala de Drigalski, espalhar o inculo por toda superfcie do meio, at que todo
o excesso de liquido seja absorvido.
Nota 1. Usar pipeta de no Maximo 1,0 mL para a transferncia do inoculo de 0,1 mL. No
assoprar a pipeta nem mudar a ponta de posio para liberar a ultima gota.
Nota 2. Fazer o espalhamento da placa de maior para a placa de menor diluio, flambando
a ala de Drigalski com etanol 70%, entre uma placa e outra. Resfriar a ala na parte interna
da tampa da placa antes de coloca-la em contato com o inculo.
Aguardar que as placas sequem (mnimo 15 minutos).
Incubar as placas no invertidas a 25C durante 48 horas.
Todas as anlises sero feitas em duplicatas.
Selecionar as placas que contenham de 50 a 150 colnias, multiplicar o resultado por 10 para
levar em conta o volume 10 vezes menor inoculado na placa.
N de Staphilococcus = media das colnias contadas nas placas x10 / diluio
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AULA PRTICA N 9

ANLISE MICROBIOLGICA DE ALIMENTOS PROCESSADOS
LEITES / SUCOS / NECTAS / REFRIGERANTES

Sob o aspecto microbiolgico, o exame de um determinado alimento fornecer informaes
importantes sobre a qualidade da matria prima utilizada, higiene e sanitizao da
manipulao do alimento.

1 DIA DE TRABALHO

Preparao da amostra
Abertura da embalagem:
Homogeneizar bem a amostra
Antes de abrir as embalagens, deve-se desinfetar a rea externa com lcool a 70% . Flambar
a tesoura que vai se utilizada para cotar a ponta da embalagem.
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1. Pipetar 9 mL do liquido de diluio em frascos de diluio
2. Preparar diluies 1/10; 1/100; 1/1000 e 1/10.000.

DETERMINAO DE COLIFORMES PELO MTODO DOS TUBOS MLTIPLOS
(NMP)

Meios de cultura utilizados: Caldo Lactosado Verde Bili Brilhante 2%; (CLVBB) e
Caldo EC.
Amostra:
Diluio:
Data:
2. Organize em uma estante 3 series de 3 tubos cada um contendo o meio de cultura
Caldo lactosado verde bili brilhante (CLVBB)
3. Inocule : 1 mL da amostra na primeira serie. Agite
1 mL da diluio 1/10 na segunda serie. Agite
1mL da diluio 1/100 na terceira serie. Agite.
4 .Incube a 30C por 24 horas.

2 DIA DE TRABALHO

Dunran). Fazer leitura na tabela do NMP e multiplique o resultado por 10. Descarte os
tubos negativos. Voc tem os resultados para coliformes a 30C.
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ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformes a 45C na tabela em
anexo,

2. CONTAGEM TOTAL DE BACTERIAS AEROBIOS MESOFILOS

Selecionar 3 diluies adequadas da amostra e inocular 1,0 mL de cada diluio em placas
de Petri estreis e vazias, abrindo as placas apenas o suficiente para inserir a pipeta,
prximo ao bico de Busen.
Nota 1: depositar o inculo fora do centro da placa, pois isso facilitar a posterior mistura
com o meio de cultura.
Verter nas placas inoculadas, 15 a 20 mL de Agar Padro para Contagem (APC),
previamente fundido e resfriado a 45C. Misturar o inoculo com o meio de cultura
movimentando suavemente as placas, numa superfcie plana, em movimentos em
forma de oito e/ou em movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido horrio e 8 a
10 vezes no sentido anti horrio
Nota 2: o meio de cultura deve ser resfriado em gua corrente a 45C, secar o frasco, para
evitar respingos de gua nas placas, no memento do plaqueamento. Evitar agitao com
movimentos bruscos para que no haja formao de bolhas no meio.
Nota 3: A mistura do meio com o inoculo deve ser feita imediatamente aps a adio do
meio, para no haver risco de solidificao do agar. A movimentao das placas deve se
feita cuidadosamente, para evitar respigos de mio nas bordas ou nas tampas das placas.
Aguardar a completa solidificao do meio de cultura, nas placas. Aps
solidificao inverter as placas e incubar a 35C por 48 horas.
Contar as colnias com auxilio de uma lupa, em um contador de colnias. Calcular
o nmero de unidades formados de colnias (UFC) por mL da amostra multiplicando o
numero de colnias pelo inverso da diluio inoculada. Usar notao exponencial e apenas
uma casa decimal depois da vrgula na apresentao dos resultados.
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AULA PRTICA N 10

ANLISE MICROBIOLGICA DE MEL DE ABELHA
1 DIA DE TRABALHO
Procedimento
7. Pesar 25 ou 10 gramas da amostra
8. Emulsionar as 25 gramas da amostra em 225 mL ( 10 gramas da amostra em 90mL)
do liquido de diluio estril (diluio 1/10)
9. Homogeneizar
10. Pipetar 9 mL em frascos de diluio
11. Preparar diluies 1/100; 1/1000 e 1;10.000

1 Determinao das Bactrias do Grupo Coliformes
Meios de cultura utilizados: Verde Bili Brilhante 2%; (CLVBB); Caldo EC e Eosina
Azul de Metileno
Amostra:
Diluio:
Data:
3. Organize em uma estante 3 series de 3 tubos cada um contendo o meio de
cultura Verde Bili Brilhante 2%; (CLVBB);
4. Inocule : 1 mL da diluio 1/10 na primeira serie. Agite
1mL da diluio 1/100 na segunda serie. Agite
1 mL da diluio 1/1000 na terceira serie. Agite.
3.Incube a 35C por 24 horas.

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2 DIA DE TRABALHO

Dunran).
Fazer leitura na tabela do NMP e multiplique o resultado por 10. Descarte os tubos
negativos. Voc tem os resultados para coliformes a 35C.
ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformesa 45C na tabela em
anexo, MULTIPLIQUE O RESULTADO POR 10.
CONFIRMATIVO PARA E. COLI

3. CONTAGEM TOTAL DE BOLORES E LEVEDURAS

Selecionar 3 diluies adequadas da amostra e inocular 1,0 mL de cada diluio em placas
de Petri estreis e vazias, abrindo as placas apenas o suficiente para inserir a pipeta,
prximo ao bico de Busen.
Nota 1: depositar o inculo fora do centro da placa, pois isso facilitar a posterior mistura
com o meio de cultura.
Verter nas placas inoculadas, 15 a 20 mL de Agar Batata, previamente fundido e resfriado a
45C. Misturar o inoculo com o meio de cultura movimentando suavemente as
placas, numa superfcie plana, em movimentos em forma de oito e/ou em
movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido horrio e 8 a 10 vezes no sentido
anti horrio
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Nota 2: o meio de cultura deve ser resfriado em gua corrente a 45C, secar o frasco, para
evitar respingos de gua nas placas, no memento do plaqueamento. Evitar agitao com
movimentos bruscos para que no haja formao de bolhas no meio.
Nota 3: A mistura do meio com o inoculo deve ser feita imediatamente aps a adio do
meio, para no haver risco de solidificao do agar. A movimentao das placas deve se
feita cuidadosamente, para evitar respigos de mio nas bordas ou nas tampas das placas.
Aguardar a completa solidificao do meio de cultura, nas placas. Aps
solidificao inverter as placas e incubar a 25C por 3 dias.
Contar as colnias com auxilio de uma lupa, em um contador de colnias. Calcular
o nmero de unidades formados de colnias (UFC) por mL da amostra multiplicando o
numero de colnias pelo inverso da diluio inoculada. Usar notao exponencial e apenas
uma casa decimal depois da vrgula na apresentao dos resultados.

Remoo de sujidades ou resduos
Lavar com gua e detergente neutro, com auxlio
de escovas ou esponjas.
Utilizar soluo sanificante (Ex: Soluo clorada
(100-200 ppm) ou lcool 70% ou Quaternrio de
amnio)
Elimina ou reduz microrganismos patognicos,
sem risco sade.
Lavagem
+
Sanificao

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARABA

CENTRO DE CINCIAS E TECNOLOGIA

de bactrias ( UFC)/mL = mdia do n de colnias x fator de diluio

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