Universidad San Francisco de Quito

Cultivo in vitro del mortio (Vaccinium floribundum Kunth)

Diana Trujillo










B.S. en Biotecnologa










Quito! "a#o $%%&
Universidad San Francisco de Quito
Colegio de Ciencias Biolgicas y Ambientales


HOJA DE A!OBAC"#$ DE %ES"S


Cultivo in vitro del morti&o 'Vaccinium floribundum (unt)*

Diana Trujillo





"ara de 'ourdes Torres! (h.D.
Directora del (ro#ecto ))))))))))))))))))))))))))))))





"ara de 'ourdes Torres! (h.D.
"iem*ro del Comit+ ))))))))))))))))))))))))))))))


,enancio -rahana! (h.D.
"iem*ro del Comit+ ))))))))))))))))))))))))))))))





Stella de la Torre! (h.D.
Decana del Colegio ))))))))))))))))))))))))))))))







Quito! "a#o del $%%.


Derec)os de Autor


/ Derechos de autor
Diana Trujillo
$%%.




Dedicatoria


Dedico este tra*ajo a mi 0amilia
1or a1o#arme durante toda mi vida!
1or darme la o1ortunidad de reali2ar mis
estudios!
# 1or tener con0ian2a en 3ue alcan2ara mi
o*jetivo.
!esumen

4l mortio (Vaccinium floribundum Kunth) es una *a#a 3ue crece en los 15ramos de
4cuador. (odra comerciali2arse # crearse un nicho en el mercado 1ara +sta! 1ero solo crece
de 0orma silvestre! 1or lo 3ue sera *ene0icioso o1timi2ar la 1ro1agaci6n de esta 1lanta. 4n
este tra*ajo se esta*leci6 el cultivo in vitro 1or germinaci6n de semillas # 1or *rotaci6n de
#emas a7ilares.
'as semillas germinaron des1u+s de $ semanas en un medio *asal sin hormonas!
8ood# (lant "edium ('lo#d 9 "cCo:n! ;.&%) modi0icado. Se o*tuvo rami0icaci6n
a*undante mas no elongaci6n de la 1lanta al usar una cito3uinina 0uerte! la trans 2eatina
ri*6side! T<=! (;mg>l) en com*inaci6n con 5cido?na0talenac+tico! @--! (%.%Amg>l). 4l
medio *asal sin hormonas o con $i(! B?(gamma!gamma?dimetilalilamino)1urina! 1ermitieron
la elongaci6n de las 1lantas # su enrai2amiento. 'a aclimataci6n de las 1lantas de mortio
todava est5 en 1roceso! investigando una 1osi*le 0alta de races 0uncionales. (ara la
introducci6n in vitro de #emas a7ilares se us6 los e7tremos a1icales de tallos # T<= (Cmg>l)
en com*inaci6n con @--! (%.;mg>l)! su*cultivando las #emas *rotadas a medios con $i( (D
6 A mg>l) 1ara su elongaci6n # 1ro1agaci6n. @o se o*tuvo regeneraci6n de retoos
adventicios usando hojas introducidas o 1rovenientes de 1lantas in vitro. Se encontr6 varias
com*inaciones de hormonas 3ue indujeron callo # otras 1ara crecimiento de callos.
4n esta investigaci6n se desarroll6 1rotocolos 1ara el cultivo in vitro del mortio!
sentando las *ases 1ara 0uturas investigaciones con esta es1ecie.


Abstract

"ortio (Vaccinium floribundum Kunth) is a 0ruit that gro:s in the high altitude
mountain regions o0 4cuador. Et has the 1otential to *e commerciali2ed and a niche in the
marFet could *e created! *ut it onl# gro:s in the :ild. There0ore! it :ould *e *ene0icial to
o1timi2e the 1ro1agation o0 this 1lant. En this stud#! mortio in vitro cultures :ere esta*lished
0rom seeds and *# a7illar# *ud gro:th.
Seeds germinated a0ter $ :eeFs in a *asal medium! modi0ied 8ood# (lant "edium
('lo#d 9 "cCo:n! ;.&%)! :ithout hormones. - strong c#toFine! trans?2eatin ri*oside! T<=
(;mg>l)! com*ined :ith na1thaleneacetic acid! @-- (%.%Amg>l)! allo:ed a*undant *ranching
*ut inhi*ited elongation o0 the 1lant. The use o0 *asal medium :ithout hormones or :ith $i(!
B?(gamma!gamma?dimeth#lal#lamino) 1urine! allo:ed elongation and rooting o0 1lants.
-cclimati2ation o0 mortio 1lants is still *eing investigated! 0ocusing on the lacF o0 a
0unctional root s#stem. To esta*lish cultures *# a7illar# *uds! a1ical segments o0 the stem
and T<=! (Cmg>l) com*ined :ith @--! (%.; mg>l) :ere used and gro:ing *uds :ere
trans0erred to media :ith $i( (D or A mg>l) 0or elongation and 1ro1agation. =egeneration o0
adventitious *uds! using introduced leaves or leaves 0rom in vitro 1lants! :as not achieved.
,arious com*inations o0 hormones that induced callus or 1ermitted callus gro:th :ere
0ound.
En this investigation! 1rotocols 0or the in vitro culture o0 mortio :ere esta*lished!
thus setting the *asis 0or 0uture research :ith this s1ecies.




%AB+A DE CO$%E$"DOS


DE!ECHOS DE AU%O! ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,-
DED"CA%O!"A ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,G4rrorH "arcador no de0inido.
!ESU.E$,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,G4rrorH "arcador no de0inido.
ABS%!AC% ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,G4rrorH "arcador no de0inido.
/, "ntroduccin ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, G4rrorH "arcador no de0inido.
;.;. 4l g+nero Vaccinium # el mortio.............................................. 0Error1 .arcador no de2inido,
;.$. Cultivo in vitro de tejidos .......................................................... 0Error1 .arcador no de2inido,
;.$.;. Ieneralidades ..................................................................................................................... $
;.$.$. Cultivo in vitro de Vaccinium............................................................................................. $
;.$.$.;. Ierminaci6n de semillas de Vaccinium in-vitro ....................................................... D
;.$.$.$. (ro1agaci6n in-vitro de Vaccinium .......................................................................... J
;.$.$.D. Entroducci6n in vitro de #emas a7ilares de Vaccinium ............................................. A
;.$.$.J. 4nrai2amiento # aclimataci6n ................................................................................... B
;.$.$.A. =egeneraci6n a 1artir de e71lantes ........................................................................... C
3, Ob4etivo 5eneral ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, G4rrorH "arcador no de0inido.
-, Ob4etivos Es6ec72icos ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 8
9, :rea de Estudio ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 8
;, Justi2icacin ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, /<
=, .ateriales ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, /3
B.;. "aterial ,egetal......................................................................................................................... ;$
B.$. Desin0ecci6n de semillas # tallos de mortio ............................................................................. ;$
B.D. (ro1agaci6n in vitro del mortio ............................................................................................... ;$
B.J. -climataci6n .............................................................................................................................. ;D
B.A. 4nsa#os de regeneraci6n ............................................................................................................ ;D
>, .etodolog7a ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, G4rrorH "arcador no de0inido.
C.;. Ierminaci6n in vitro semillas de mortio .................................................................................. ;A
C.;.;. K*tenci6n de semillas de mortio .................................................................................... ;A
C.;.$. Desin0ecci6n de las semillas ............................................................................................. ;A
C.;.D. Ierminaci6n de semillas de mortio ................................................................................ ;B
C.;.J. (ro1agaci6n de 1lantas de mortio ................................................................................... ;B
C.$. Entroducci6n in vitro de #emas a7ilares de mortio ................................................................... ;C
C.$.;. K*tenci6n de los tallos de mortio ................................................................................... ;C
C.$.$. Desin0ecci6n de los segmentos de tallos .......................................................................... ;C
C.$.D. Eniciaci6n de cultivo in vitro de mortio a 1artir de #emas a7ilares ................................ ;&
C.D. 4longamiento! enrai2amiento # aclimataci6n ............................................................................ ;.
C.D.;. 4longaci6n # enrai2amiento de 1lantas de mortio in vitro ............................................. ;.
C.D.$. K*servaci6n al microsco1io de cortes de tallo # races ................................................... $%
C.D.D. -climataci6n de 1lantas de mortio introducidas in vitro 1or semillas .......................... $%
C.J. 4nsa#os de regeneraci6n # 0ormaci6n de callo a 1artir de e71lantes de hoja o tallo ................. $;
C.J.;. Desin0ecci6n de hojas # tallos de 1lantas de mortio recogidas en el cam1o .................. $$
C.J.$. (rue*as de regeneraci6n # 0ormaci6n de callo ................................................................ $$
C.J.$.;. Lojas # tallos introducidos in vitro ........................................................................ $D
C.J.$.$. Lojas de 1lantas in vitro ....................................................................................... $D
C.J.$.D. Su*cultivo de callos ............................................................................................... $D
?, !esultados ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 39
&.;. Ierminaci6n in vitro de semillas de mortio ............................................................................. $J
&.;.;. Desin0ecci6n de las semillas ............................................................................................. $J
&.;.$. Ierminaci6n de semillas de mortio ................................................................................ $J
&.;.D. (ro1agaci6n de 1lantas de mortio ................................................................................... $J
&.$. Entroducci6n in vitro de #emas a7ilares de mortio ................................................................... $C
&.$.;. Desin0ecci6n de los segmentos de tallos .......................................................................... $C
&.$.$. Eniciaci6n de cultivo in vitro de mortio a 1artir de #emas a7ilares ................................ $C
&.D. 4longamiento! enrai2amiento # aclimataci6n ............................................................................ $.
&.D.;. 4longaci6n # enrai2amiento de 1lantas de mortio in vitro ............................................. $.
&.D.$. K*servaci6n al microsco1io de cortes de tallo # races .................................................... D%
&.D.D. -climataci6n de 1lantas de mortio introducidas in vitro 1or semillas ........................... D%
&.J. 4nsa#os de regeneraci6n # 0ormaci6n de callo a 1artir de e71lantes de hoja o tallo0Error1 .arcador no de2inido,
&.J.;. Desin0ecci6n de hojas # tallos de 1lantas de mortio ex vitro0Error1 .arcador no de2inido,
&.J.$. (rue*as de regeneraci6n # 0ormaci6n de callo ................................................................. D$
&.J.$.;. Lojas # tallos introducidos in vitro ......................................................................... D$
&.J.$.$. Lojas de 1lantas in vitro ......................................................................................... D$
&.J.$.D. Su*cultivo de callos ................................................................................................ DJ
8, Discusin ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, -;
..;. Ierminaci6n in vitro de semillas de mortio ............................................................................. DA
..$. Entroducci6n in vitro de #emas a7ilares de mortio ................... 0Error1 .arcador no de2inido,
..D. 4longamiento! enrai2amiento # aclimataci6n ............................................................................ D.
..J. 4nsa#os de regeneraci6n # 0ormaci6n de callo a 1artir de e71lantes de hoja o tallo ................. J%
/<, Conclusiones ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 9/
//, !ecomendaciones ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 93
/3, Bibliogra27a ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 9-
/-, %ablas ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 9=
/9, Figuras ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ;-




/, "ntroduccin


;.;. 4l g+nero Vaccinium # el mortio

'a 0amilia de las 4ric5ceas contiene alrededor de JA%% es1ecies (-sturi2aga et al!
$%%B). 4n los neotr61icos! ha# a1ro7imadamente &%% es1ecies de 4ric5ceas 3ue se
concentran en el 5rea andina! es1ecialmente en Colom*ia # 4cuador a alturas de ;%%% # D%%%
msnm. 4n esta 5rea! la geogra0a caracterstica # el elevado nMmero de microclimas # nichos
ecol6gicos contri*u#eron a la evoluci6n de di0erentes 0ormas de vida dentro de esta 0amilia.
4n los -ndes! estas es1ecies se encuentran ada1tadas! 1or lo general! a los am*ientes
hMmedos # 0ros de las montaas 1ero 1ueden tener 0ormas de vida e1i0ticas! her*5ceas!
terrestres o ar*ustivas! entre otras ('ute#n! $%%$).
4l g+nero Vaccinium '! uno de los g+neros m5s grandes de la 0amilia 4ricaceae!
com1rende J%% a JA% es1ecies distri*uidas en todos los continentes e7ce1to -ustralia #
-nt5rtida #! en el 5rea de los -ndes! ha# alrededor de J% es1ecies (-sturi2aga et al! $%%BN
De*nath Propagation! $%%B). 'as es1ecies de Vaccinium crecen 1or lo general en suelos
acdicos! arenosos! con tur*a o con materia org5nica. (roducen 0rutas comesti*les ins1idas o
de sa*or dulce o agrio (De*nath Propagation! $%%B). 4l cran*err#! lingon*err# # *lue*err#
(Vaccinium s11.) 0ueron domesticados reci+n en el siglo veinte # son! econ6micamente! los
cultivos m5s im1ortantes del g+nero Vaccinium. 4l ma#or 5rea de cultivo de estas tres
es1ecies es en @orteam+rica! 4uro1a # -sia (De*nath Propagation! $%%BN 'ute#n! $%%$).
'as 0rutas de Vaccinium muchas veces tienen cualidades medicinales # contienen
cantidades altas de vitamina C! 1ectina! celulosa # antocianinas. 4stas Mltimas son
com1uestos 3ue han mostrado tener 1ro1iedades antio7idantes! antitumorales! antiulcerales #
antiin0lamatorias (De*nath Propagation! $%%B). 'as hojas # 0rutos del lingon*err#
(Vaccinium vitis-idaea)! 1or ejem1lo! son usados 1ara tratar en0ermedades reum5ticas #
des6rdenes estomacales! 1ara *ajar niveles de colesterol # como desin0ectantes de vejiga #
riones (De*nath # "c=ae In Vitro, $%%;). (or otro lado! el cran*err# (Vaccinium
macrocarpon) contiene 1roantocianinas! las cuales a#udan a 1revenir las in0ecciones de vas
urinarias (De*nath # "c=ae! $%%A).
La# 1oca *i*liogra0a en lo 3ue res1ecta al uso de 4ric5eas neotro1icales! # es mu#
1ro*a*le 3ue no se est+ a1reciando o a1rovechando el 1otencial medicinal # econ6mico de
estas 1lantas o sus 0rutas. 4n 4cuador # Colom*ia! la es1ecie nativa m5s utili2ada es el
mortio (Vaccinium floribundum '.)! donde es utili2ada en mermeladas # en 1astelera
('ute#n! $%%$). 4l mortio crece desde ;J%% hasta JDA% msnm en los 15ramos o en 2onas
hMmedas en las montaas. 'a 0ruta es una *a#a es0+rica de color a2ul oscuro # 1e3uea (de
menos de ;cm de di5metro)! con sa*or 0uerte # agrio. 4stos 0rutos crecen en racimos de B a
;% 0rutos. 4l mortio es un ar*usto 1e3ueo 1ero 1uede crecer hasta D.Am de altura
(-sturi2aga et al! $%%B).
4l mortio es mu# comMn en los -ndes # crece de 0orma silvestre en las montaas!
1ero no ha# cultivos comerciales de +ste. 4l 0ruto 3ue se vende en los mercados locales o 3ue
se utili2a en re1osteras se o*tiene de 1lantas silvestres. 4n 4cuador es conocido m5s
comMnmente 1or ser usado en noviem*re en la 1re1araci6n de la colada morada! *e*ida
t1ica del Da de los Di0untos. 'a 0ruta es de 05cil uso! #a 3ue no necesita ser 1elada! # 1uede
ser consumida tam*i+n en 0resco o 1re1arada dentro de diversos 1latos (-sturi2aga et al!
$%%B). 4n noviem*re del $%%&! la caja de mortio se vendi6 1or J% d6lares (=evista 'deres!
$%%&).

;.$. Cultivo in vitro de tejidos

/,3,/, 5eneralidades

4l cultivo de tejidos de 1lantas in vitro se re0iere a una serie de t+cnicas en las 3ue se
cultivan 1lantas *ajo condiciones controladas # li*res de microorganismos. 4ntre los ti1os de
t+cnicas 3ue a*arca el cultivo in vitro de 1lantas est5n el rescate de em*riones! el cultivo de
1roto1lastos! el cultivo de callos # el cultivo de 6rganos! entre otros. Lo# en da! este
conjunto de t+cnicas sirven como herramientas 1ara la 1ro1agaci6n # mejoramiento de
1lantas. 'a e0iciencia en lograr estos 1ro16sitos # el ti1o de resultado 3ue se o*tiene in vitro
de1ende de varios 0actores 3ue a0ectan el crecimiento de las 1lantas (Taji et al.! $%%$).

/,3,3, Cultivo in vitro de Vaccinium

4l cultivo in vitro de 1lantas leosas 1resenta varias di0icultades 0rente a 1lantas
her*5ceas. "uchas es1ecies resultan ser recalcitrantes 1ara el cultivo in vitro! # 1or lo
general se ha visto 3ue con tejidos juveniles se tiene ma#or +7ito en las diversas t+cnicas del
cultivo de tejidos. -1arte de la edad del tejido! tam*i+n in0lu#e el genoti1o! el ti1o de tejido #
la estaci6n o +1oca del ao en 3ue se o*tuvo el e71lante (-huja! ;..$). Ktra o*servaci6n es
3ue las 1lantas leosas suelen ser sensi*les a las altas concentraciones de nutrientes en el
medio de cultivo! 1or lo 3ue 'lo#d # "cCo:n 0ormularon el 8ood# (lant "edium (8(")
con concentraciones m5s *ajas de ciertas sales (;.&%).
4l medio de cultivo 3ue se usa comMnmente en la 1ro1agaci6n de Vaccinium es el
8(" o modi0icaciones de +ste (De*nath Propagation, $%%B). Sin em*argo! Tetsumura et al.
($%%&) investigaron el e0ecto de di0erentes medios en la 1ro1agaci6n # encontraron 3ue!
des1u+s de numerosos su*cultivos! las 1lantas de *lue*err# 1ro1agadas en 8(" em1e2aron
a tornarse rojas! 1resumi*lemente 1or una 0alta de nitr6geno o micronutrientes. 4n cam*io! el
medio "urashige SFoog ("urashige 9 SFoog! ;.B$)! 1rodujo vitri0icaci6n! 1osi*lemente
1or un e7ceso de iones de amonio. Una me2cla de 8(" # "S 1ermiti6 un crecimiento
61timo.
Se ha llevado a ca*o un gran nMmero de estudios so*re la 1ro1agaci6n in vitro de
diversas es1ecies del g+nero Vaccinium. Se ha visto 3ue la e0iciencia de la 1ro1agaci6n es
in0luenciada 1or el *alance # ti1o de reguladores de crecimiento # 1or el ti1o de medio de
cultivo 3ue se utili2a. 4n los estudios 3ue se ha hecho con es1ecies de Vaccinium! se re1orta
3ue las 1lantas 1roducidas 1or el cultivo in vitro tienen un crecimiento vigoroso # su1erior en
el cam1o 0rente a 1lantas 1ro1agadas 1or m+todos tradicionales (De*nath Propagation!
$%%B).

;.$.$.;. Ierminaci6n de semillas de Vaccinium in-vitro

La# 1oca literatura en lo 3ue concierne a la germinaci6n de semillas in vitro de
Vaccinium. 4stos estudios se han llevado a ca*o en el lingon*err#! V. cylindraceum #
*il*err#. 4n general! los 1rotocolos de desin0ecci6n de semillas consisten en sumergirlas en
etanol o un 0ungicida # luego desin0ectarlas con hi1oclorito de sodio (@aClK) a
concentraciones de %.B hasta DO! # T:een $% 1or ;% hasta $A minutos. SegMn el 1rotocolo!
las semillas desin0ectadas se siem*ran directamente en el medio de cultivo! se remojan las
semillas antes de ser 1uestas en el medio! o se lleva a ca*o la germinaci6n so*re 1a1el 0iltro
mojado. 4l tiem1o de germinaci6n vara entre J das a $ semanas (De*nath! $%%DN (ereira!
$%%BN PaaFola et al.! $%%;).

;.$.$.$. (ro1agaci6n in-vitro de Vaccinium

(ara la 1ro1agaci6n de es1ecies de Vaccinium! se suele utili2ar cantidades *ajas de
sucrosa (Cao et al. ;..&)! # en un estudio en el lowbush *lue*err# se encontr6 3ue $% g>l era
la concentraci6n 3ue 1ermiti6 una mejor 1ro1agaci6n (De*nath! $%%J). 4n cuanto al 1L del
medio! +ste es un 0actor 3ue 1uede a0ectar a la 1roli0eraci6n de retoos # la 0ormaci6n de
races (KstrolucF5 et. al $%%J). 'as es1ecies de Vaccinium son acido0licas # tanto en el
*lue*err# (KstrolucF5 et. al $%%J)! en el cran*err# (De*nath! $%%&) # en el lingon*err#
(De*nath Influence of! $%%B) se suele usar medios de cultivo con 1L *ajo.
'a 2eatina o el $i(! B?(gamma!gamma?dimeth#lall#lamino) 1urine! son usados en
varios 1rotocolos de 1ro1agaci6n de es1ecies de Vaccinium (De*nath 9 "c=ae In Vitro,
$%%;N KstrolucF5 et. al! $%%J). 4n un estudio con V. cylandraceum se us6 medios con $.A #
Amg>l de $i( 1ara el crecimiento # multi1licaci6n de semillas germinadas! aun3ue tam*i+n se
dio crecimiento en medio *asal sin hormonas ((ereira! $%%B). (ara la multi1licaci6n de
lingon*err# # mil*err#! PaaFola et al ($%%;) 1ro*aron dos mediosQ "S modi0icado con $i(
(Amg>l) o con B-(! B?*en2#lamino1urine! (%.;mg>l) # @-- (%.%Amg>l). 'as semillas
germinaron en am*os medios 1ero no se dio multi1licaci6n en "S modi0icado con B-( #
@-- mientras 3ue en el medio con $i(! se vio multi1licaci6n des1u+s de $ meses. 4n varios
otros estudios se vio 3ue no ocurra 1roli0eraci6n en la ausencia de citoFininas (De*nath 9
"c=ae In Vitro, $%%;N KstrolucF5 et. al! $%%J)! 1resumi*lemente 1or la in0luencia de una
0uerte dominancia a1ical (De*nath! $%%J).
'a e0icacia de las hormonas usadas en la 0ase de multi1licaci6n generalmente vara
segMn el cultivar o es1ecie de Vaccinium. -s! no ha# un consenso so*re una ma#or e0icacia
de la 2eatina o el $i( 1ara la 1roducci6n de retoos de *uena calidad (De*nath 9 "c=ae In
Vitro! $%%;N KstrolucF5 et. al! $%%J). 4n ciertos 1rotocolos esta*lecidos 1ara la 1ro1agaci6n
se utili2a desde %.$ mg>l hasta J.J mg>l de 2eatina (De*nath Influence of! $%%BN Tetsumura et
al.! $%%&) 6 $.A mg>l hasta C.A mg>l de $i( (De*nath 9 "c=ae In Vitro! $%%;N @o+ et al.!
;..&). Un tratamiento comMn 1ara la 1ro1agaci6n del blueberry es la com*inaci6n de A mg>l
de $i( con $ mg>l de 2eatina (Cao et al.! ;..&N Cao 9 Lammerschlag! $%%%).
4n varios re1ortes! se logra la multi1licaci6n # la elongaci6n de Vaccinium en una
misma 0ase (De*nath $%%JN Ionale2 et al.! $%%%). De*nath ($%%J) encontr6 3ue la ra1ide2 de
multi1licaci6n # la altura de retoos del lowbush *lue*err# aumenta*a con la concentraci6n
de 2eatina. Ion2ale2 et al. ($%%%)! en cam*io! encontraron 3ue no se dio elongaci6n 1ero s
1ro1agaci6n en medios con 2eatina. 'os medios 3ue contenan A mg>l de $i( 1ermitieron
tanto elongaci6n como 1ro1agaci6n! de manera 3ue determinaron 3ue $i( es mejor 1ara la
1ro1agaci6n. De*nath 9 "c=ae (In Vitro! $%%;) encontraron 3ue el tamao! nMmero de
hojas # vigor era menor al utili2ar 2eatina en com1araci6n con $i(.
4n las 1lantas leosas! ha# cierta tendencia de algunas es1ecies de em1eorar en su
estado 0isiol6gico des1u+s de varios su*cultivos. 4ntre las anormalidades 3ue se 1resentan
son la hi1erhidricidad o una necrosis a1ical. Como resultado! la intensidad de 1roli0eraci6n se
1uede ver a0ectada a largo 1la2o (Ionale2 et al.! $%%%). Sin em*argo! se ha visto 3ue la
ra1ide2 de 1ro1agaci6n de Vaccinium (De*nath 9 "c=ae An efficient, $%%;)! la altura de los
retoos # vigor 1uede aumentar al hacer su*cultivos (De*nath! $%%J).

;.$.$.D. Entroducci6n in vitro de #emas a7ilares de Vaccinium

(ara la introducci6n in vitro de #emas en Vaccinium! ha# varias estrategias 3ue han
sido 1ro*adas! inclu#endo el uso de tem1eraturas *ajas! oscuridad o intensidad de lu2 (=eed
9 -*delnour?4s3uivel! ;..;). Sin em*argo! la ma#ora de re1ortes investigan el e0ecto del
medio de cultivo o de reguladores de crecimiento en la introducci6n (PaaFola et al.! $%%;N
De*nath! $%%J).
'a desin0ecci6n de los e71lantes en diversos estudios de esta*lecimiento de
Vaccinium consiste *5sicamente en un lavado su1er0icial del tallo! seguido 1or la
desin0ecci6n de los segmentos de tallo usando hi1oclorito de sodio # 0inalmente! varios
lavados con agua destilada est+ril. 'os segmentos de tallo se siem*ran en el medio de cultivo
# ha# ; a D #emas a7ilares en cada segmento ("einers et al.! $%%CN =eed 9 -*delnour?
4s3uivel! ;..;N Tetsumura et al.! $%%&).
'as hormonas m5s usadas 1ara la introducci6n de Vaccinium son el $i( # la 2eatina.
4n investigaciones con Vaccinium no se acostum*ra 1ro*ar B-( en ensa#os de iniciaci6n a
1artir de #emas 1or ser ine0ectivo 1ara este 1ro16sito (PaaFola et al.! $%%;). Usar $i( solo! en
muchos casos resulta ser mu# 0itot67ico! # da como resultado un 1orcentaje mu# *ajo de
iniciaci6n de retoos o crecimiento estancado (=eed 9 -*delnour?4s3uivel! ;..;N "einers
et al.! $%%C). 'a e0icacia de la hormona de1ende de la interacci6n entre el genoti1o # la
citoFinina 1ero! al com1arar entre hormonas! la 2eatina usualmente resulta su1erior al $i(
1ara la introducci6n de #emas (De*nath! $%%JN "einers et al.! $%%CN =eed 9 -*delnour?
4s3uivel! ;..;).
4n un estudio de introducci6n de #emas! de ;$ genoti1os de V. corymbosum! la
ma#ora res1ondi6 mejor con Jmg>l de 2eatina 3ue con ;% 6 ;A mg>l de $i(. =econociendo la
alta varia*ilidad del g+nero ,accinium! 1ara la iniciaci6n de cultivos in-vitro! los autores
recomiendan usar 1reliminarmente Jmg>l de 2eatina # *aja intensidad de lu2 a $ARC 1ara
luego ajustar las condiciones segMn la es1ecie o genoti1o (=eed 9 -*delnour?4s3uivel!
;..;).

;.$.$.J. 4nrai2amiento # aclimataci6n

Durante el cultivo de 1lantas in vitro! las 1lantas crecen *ajo condiciones 3ue son
61timas 1ara su crecimiento 1ero 3ue conducen al desarrollo de anatoma! 0isiologa #
mor0ologa anormales. 4l sitio donde crecen generalmente tiene una humedad alta! *aja
cantidad de CK
$
e irradiaci6n *aja en com1araci6n al cam1o. Una de las consecuencias es
3ue las 1lantas no tienen estomas 0uncionales o su0iciente cera e1icuticular 3ue 1ermitan una
regulaci6n e0iciente de la trans1iraci6n (@o+ 9 Bonini! ;..B). -dem5s! el medio a menudo
tiene reguladores de crecimiento # sucrosa como 0uente de energa 1ara la 1lanta
((os1Silov5! ;...). 4n un estudio reali2ado en el *lue*err#! se vio 3ue las hojas
desarrolladas in vitro eran m5s 1e3ueas # delgadas! tenan una 1+rdida de agua m5s r51ida #
tenan 0orma di0erente a hojas de 1lantas de *lue*err# del cam1o (@o+ 9 Bonini! ;..B).
(ara el enrai2amiento de 1lantas de Vaccinium se utili2a m+todos 1ara enrai2ar in
vitro # ex vitro. (ara el m+todo in vitro! el 1rocedimiento m5s comMn es colocar las 1lantas
en medio *asal sin hormonas durante $ a D meses! logrando enrai2amiento # elongaci6n a la
ve2 (De*nath 9 "c=ae An efficient! $%%;N (ereira! $%%BN Tetsumura! $%%&).
Cuando se enra2a a las 1lantas de Vaccinium 1or m+todos ex vitro! el 1rocedimiento
usual es sumergir la *ase de la 1lanta en una soluci6n de EB-! 5cido indol?D?*utrico! 1ara
luego colocar la 1lanta en un sustrato. Tste generalmente contiene tur*a! 1erlita! #>o
vermiculita # se coloca a la 1lanta dentro de una c5mara de humedad durante ; a J meses
hasta 3ue enracen las 1lantas (@o+ 9 4ccher! ;..JN De*nath 9 "c=ae In Vitro! $%%;). Ua
3ue generalmente se o*tiene un alto 1orcentaje de enrai2amiento ex vitro (hasta .BO des1u+s
de & semanas) algunos autores lo 1re0ieren a enrai2amiento in vitro! 1or ra2ones econ6micas
# 1r5cticas (De*nath 9 "c=ae In Vitro! $%%;N PaaFola et al.! $%%;N (ereira! $%%B).
Des1u+s del enrai2amiento se 1rosigue a la aclimataci6n! *ajando la humedad durante
un 1erodo de $ semanas hasta $ meses (De*nath 9 "c=ae In Vitro! $%%;N @o+ 9 4ccher!
;..J). 4n la aclimataci6n de Vaccinium! es comMn o*servar un 1orcentaje de so*revivencia
mu# elevado en las 1lantas 3ue tienen ra2. 4n algunos casos! este 1orcentaje alcan2a casi el
;%%O (PaaFola et al.! $%%;N De*nath 9 "c=ae In Vitro! $%%;). 4n el cam1o # en el
invernadero! se o*serva un desarrollo normal de las 1lantas de Vaccinium 1ro1agadas in vitro
(De*nath 9 "c=ae In Vitro! $%%;N De*nath 9 "c=ae An efficient! $%%;).

;.$.$.A. =egeneraci6n a 1artir de e71lantes

'a regeneraci6n se re0iere a la 0ormaci6n de 6rganos adventicios 3ue no esta*an
1resentes en el e71lante desde un inicio ((ieriF! ;.&C). 'a regeneraci6n de em*riones! races
o retoos consiste en tres 0asesQ de?di0erenciaci6n! inducci6n # el desarrollo de la estructura.
4n la de?di0erenciaci6n! el tejido se vuelve com1etente! generalmente 1or la 1resencia de una
au7ina. Si las c+lulas se vuelven com1etentes sin 3ue ocurra divisi6n celular se trata de
regeneraci6n directa mientras 3ue si ocurre 0ormaci6n de callo se trata de regeneraci6n
indirecta. 4n la segunda 0ase! de inducci6n! las c+lulas suelen reci*ir un estmulo hormonal
es1ec0ico 3ue determine su va de desarrollo. Finalmente! en la tercera 0ase! se em1ie2a a
desarrollar el 6rgano o em*ri6n en ausencia o 1oca cantidad de hormonas (KlerF et al.!
;..C).
'a regeneraci6n de retoos 1uede servir 1ara la 1roducci6n de 1lantas modi0icadas
gen+ticamente! 1ara o*tener variantes somaclonales # como un m+todo de multi1licar
es1ecies de di0cil 1ro1agaci6n (De*nath! $%%B). 4n es1ecial! el mejoramiento de 1lantas
mediante la ingeniera gen+tica de1ende de 3ue se tenga un 1rotocolo esta*lecido de
regeneraci6n de retoos! #a sea 1or organog+nesis o 1or em*riog+nesis som5tica (Cao 9
Lammerschlag! $%%%).
De*nath 9 "c=ae (In Vitro! $%%;) o*servaron regeneraci6n indirecta de retoos
adventicios en callos 3ue se 0ormaron en la *ase de 1lantas siendo 1ro1agadas en medios con
$i( o 2eatina. (or otro lado! tam*i+n se ha usado TD< (tidia2uron)! el cual tiene e0ectos de
cito3uinina # au7ina! 1ara inducir un callo altamente regenerativo (De*nath! $%%D). Sin
em*argo! es recomenda*le 3ue los 1rotocolos de regeneraci6n de Vaccinium se dirijan 1or la
regeneraci6n directa! sin 1asar 1rimero 1or una 0ase de callo ("einers! $%%CN Qu et al. $%%%)
1ara evitar una inesta*ilidad gen+tica 3ue 1uede llevar a variaci6n somaclonal ((ieriF! ;.&C).
(ara la regeneraci6n directa en Vaccinium! ha# re1ortes en los 3ue se utili2an
cito3uininas como TD<! 2eatina! 2eatina ri*6side # $i(! sin la adici6n de au7inas al medio
(Cao 9 Lammerschlag! $%%%N De*nath! $%%B) # 1ocos en los 3ue se aade au7ina ("einers!
$%%C). Con TD<! se ha visto 3ue medios con %.$ mg>l en *lue*err# o ; mg>l en lingon*err#
son e0icientes 1ara la regeneraci6n directa en e71lantes de hojas (Cao 9 Lammerschlag!
$%%%N De*nath! $%%B). Un rango de J.J hasta B.B mg>l de 2eatina 1rodujo regeneraci6n en el
lingon*err# (De*nath! $%%B) # C.C mg>l de 2eatina ri*6side en el *lue*err# (Cao 9
Lammerschlag! $%%%). 4n cuanto al $i(! se ha utili2ado concentraciones de ; a A mg>l con
+7ito (De*nath! $%%B).
4n este estudio se investig6 la 1ro1agaci6n in vitro del mortio. Se llev6 a ca*o la
germinaci6n de semillas # luego se hi2o ensa#os de multi1licaci6n! elongaci6n!
enrai2amiento # aclimataci6n de las 1lantas de mortio. 4n otros e71erimentos! se llev6 a
ca*o la introducci6n in vitro de #emas a7ilares a 1artir de tallos de mortio recogidos en
2onas de 15ramo # se 1ro*6 medios 1ara la regeneraci6n de retoos a 1artir de hojas # tallos.


3, Ob4etivo general

4l o*jetivo de este estudio 0ue desarrollar 1rotocolos de germinaci6n de semillas in
vitro! de introducci6n in vitro de #emas a7ilares # regeneraci6n de retoos a 1artir de
e71lantes de mortio.


-, Ob4etivos es6ec72icos

? Desarrollar un 1rotocolo 1ara el esta*lecimiento de cultivos de mortio in vitro!
1artiendo de semillas o de #emas a7ilares
? Determinar los medios de cultivo 61timos 1ara lograr una multi1licaci6n r51ida!
elongamiento # enrai2amiento del mortio.
? Determinar un m+todo de aclimataci6n de 1lantas de mortio o*tenidas in vitro.
? Edenti0icar las condiciones 61timas 1ara la regeneraci6n de 1lantas va organog+nesis
a 1artir de diversos e71lantes.


9, :rea de estudio

4ste estudio se llev6 a ca*o en la Universidad San Francisco de Quito! cam1us
Cum*a#5! en el 'a*oratorio de Biotecnologa ,egetal! del Colegio de Ciencias Biol6gicas #
-m*ientales. 'as semillas se tomaron de 0rutos de mortio ad3uiridos en un mercado local #
los tallos de mortio se recolectaron en (asochoa (%R$BVS! C&R$.V8N (ichincha) #
Quinticusig (%RJ$VS! C&RADV8N Coto1a7i).


;, Justi2icacin

4l mortio # el *lue*err#! 3ue es comerciali2ado a nivel mundial! son dos es1ecies
di0erentes. Sin em*argo! el mortio tiene el 1otencial de ser cultivado # comerciali2ado de
una 0orma 1arecida al *lue*err# 1or tener usos similares a +ste. Encluso! en el 4cuador se est5
1romocionando al mortio con el nom*re Andean blueberry (-sturi2aga et al! $%%B).
(osi*lemente se 1ueda crear un nicho en el mercado 1ara genoti1os su1eriores de esta
es1ecie! 1ero 1rimero es necesario o1timi2ar la 1ro1agaci6n de la 1lanta.
4l mortio ha reci*ido 1oca atenci6n # no se ha hecho intentos de mejorar el cultivo!
de manera 3ue sus 0rutos son mu# varia*les en tamao! calidad # en sa*or! 1udiendo ser mu#
agrio hasta mu# dulce. 4s una es1ecie 3ue aMn no se domestica 1or lo 3ue sera necesaria m5s
investigaci6n antes de 1oder comerciali2arla m5s am1liamente. Tam*i+n es necesaria una
evaluaci6n del 1otencial del mortio junto con las 1osi*les di0icultades 3ue en0rentar5 su
comerciali2aci6n (@ational =esearch Council! ;.&.).
4l *lue*err# de 4stados Unidos es cultivado Mnicamente en la 1rimavera # no ha# una
o0erta 3ue satis0aga la demanda de este 0ruto a lo largo de todo el ao (@ational =esearch
Council! ;.&.). 4ste es el caso tam*i+n del lingon*err#! #a 3ue este 0ruto tiene tantos usos
3ue su 1roducci6n no es su0iciente 1ara su1lir la demanda (De*nath! $%%D). Como
consecuencia! esta es1ecie! 3ue hasta hace 1oco creca Mnicamente de 0orma silvestre! en los
Mltimos aos se ha domesticado a trav+s de 1rogramas de mejoramiento # de 1ro1agaci6n
vegetativa (De*nath 9 "c=ae In Vitro! $%%;). Sera necesario mejorar la calidad del 0rutos
del mortio! 1osi*lemente 1roduciendo un mortio con 0ruto m5s grande # m5s dulce! 1ara
3ue tenga acogida a nivel internacional! es1ecialmente en las +1ocas de escase2 del *lue*err#
(@ational =esearch Council! ;.&.).
'a t+cnica de 1ro1agaci6n a trav+s del cultivo in vitro o0rece algunas ventajas 0rente a
la 1ro1agaci6n vegetativa tradicional. 4n 1rimer lugar! una a1licaci6n 3ue 1uede tener el
cultivo in vitro es 1ara mantener colecciones de germo1lasma de res1aldo de Vaccinium
(=eed 9 -*delnour?4s3uivel! ;..;). (or otro lado! la micro1ro1agaci6n 1ermite 1roducir
1lantas li*res de 1at6genos # a lo largo de todo el ao (Ionale2 et al.! $%%%N KstrolucF5 et. al!
$%%J).
Si se desarrolla un genoti1o de mortio con caractersticas 0avora*les 1ara el
consumidor # 3ue tenga acogida en el mercado! la 1ro1agaci6n in vitro 1odra ser un 1unto
clave en la multi1licaci6n r51ida de estos genoti1os desea*les # en la generaci6n de ma#ores
ganancias 1ara el 1roductor. 'as es1ecies de Vaccinium son altamente heterocigotas # las
caractersticas 0avora*les de los 1rogenitores generalmente no se conservan al 1ro1agar 1or
semillas (De*nath Propagation! $%%B). Si se tiene una variedad de mortio de inter+s
comercial! 1roducir 1lantas gen+ticamente id+nticas a la 1lanta 1rogenitora 1or medio de
cultivo in vitro sera una ventaja. -dicionalmente! el mortio es una es1ecie leosa con
crecimiento lento! # se ha visto 3ue la micro1ro1agaci6n es m5s r51ida 3ue la 1ro1agaci6n
1or cortes de estacas! 1or lo 3ue es Mtil 1ara la introducci6n a gran escala de nuevos
genoti1os de inter+s (De*nath # "c=ae! $%%A). Desarrollar un 1rotocolo 1ara la 1ro1agaci6n
in vitro del mortio 1odra ser una estrategia im1ortante 1ara em1e2ar a a1rovechar el gran
1otencial 3ue tiene esta es1ecie.


=, .ateriales

B.;. "aterial ,egetal

'as semillas de mortio se o*tuvieron de 0rutos com1rados en mercados locales de
Quito. 'as semillas desin0ectadas se sem*raron en medio de cultivo sin hormonas 1ara su
germinaci6n. 'as 1l5ntulas o*tenidas se su*cultivaron en medios con reguladores de
crecimiento 1ara los ensa#os de 1ro1agaci6n # de regeneraci6n (,er secci6n C.; # C.J).
'os tallos de mortio se recolectaron de 1lantas del (asochoa (%R$BVS! C&R$.V8) o
Quinticusig (%RJ$VS! C&RADV8). -m*as localidades son 2onas de 15ramo dentro de las
1rovincias de (ichincha # Coto1a7i! res1ectivamente! donde el mortio crece de 0orma
silvestre. 4n el (asochoa! la recolecci6n de material se reali26 a alrededor de D&%% m.s.n.m.!
donde em1ie2a una 2ona de 1asti2ales en la 3ue crecen los ar*ustos de mortio (Stern! ;..A).
4n Quinticusig! la recolecci6n se hi2o a alrededor de $&C% m.s.n.m. ("unici1io de Sigchos!
s0.). 'os tallos desin0ectados se utili2aron en ensa#os de esta*lecimiento de cultivo in vitro a
1artir de #emas a7ilares (,er secci6n C.$). 'as hojas desin0ectadas se utili2aron en ensa#os
de regeneraci6n (,er secci6n C.J).

B.$. Desin0ecci6n de semillas # tallos de mortio

C5mara de 0lujo laminar ('-BCK@CK (uri0ier Clean Bench)
-lcohol etlico W C% O
Li1oclorito de sodio W $.AO
T:een $%
-gua destilada est+ril

B.D. (ro1agaci6n in vitro del mortio

Frascos de vidrio de JCC cc
"edio m8(" (8ood# (lant "edium modi0icadoN Ta*la ;)Q $%g>l sacarosa! A.&g>l
agar # 1L A.$
"edio 8("?BB! 8ood# (lant "edium modi0icado 1ara *lue*erries (=o:land 9
Kgden ;..$)Q $%g>l sacarosa! A.&g>l agar # 1L A.$
"edio "S ("urashige 9 SFoog! ;.B$)Q $%g>l sacarosa! A.&g>l agar # 1L A.$
"edio ;>$ "S ("urashige 9 SFoog! ;.B$)Q $%g>l sacarosa! A.&g>l agar # 1L A.$
=eguladores de crecimientoQ
o T<= ? Trans 2eatina ri*6side (Sigma)
o @-- ? Xcido?na0talenac+tico (Sigma)
o $i( ? B?(gamma!gamma?dimetilalilamino)1urina (Caisson 'a*oratories)
o B-( ? B?*encilamino1urina (Sigma)
o I-D ? Xcido gi*er+lico (Sigma)
o KE@ ? Kinetina (Sigma)
o EB- ? Xcido indol?D?*utrico (Sigma)
"icrosco1io 61tico 'eica

B.J. -climataci6n

-gua destilada est+ril
Tierra -groterra
Tierra ti1o E de "ulti0lor
Tierra 1roveniente de la 2ona de 1asti2ales del (asochoa
Tur*a Y (erlitaQ Sunshine -ll (ur1ose (lanting "i7
,asijas de *arro
Frasco de vidrio
Fundas de 1l5stico

B.A. 4nsa#os de regeneraci6n

4stereomicrosco1io (8ardVs)
"edio m8("
Car*6n activado
Xcido ctrico
=eguladores de crecimientoQ
o T<= ? Trans 2eatina ri*6side (Sigma)
o @-- ? Xcido?na0talenac+tico (Sigma)
o $i( ? B?(gamma!gamma?dimetilalilamino)1urina (Caisson 'a*oratories)
o B-( ? B?*encilamino1urina (Sigma)
o KE@ ? Kinetina (Sigma)
o $!J?D ? Xcido $!J?Dicloro0eno7iacetico (Sigma)
o TD< ? Tidia2uron (Caisson 'a*oratories)


>, .etodolog7a

-l menos 3ue se indi3ue di0erente! las 1lantas se mantuvieron *ajo lu2 *lanca de
0ocos 0luorescentes # *ajo un 0oto1erodo de ;B horas de lu2! & horas de oscuridad.

C.;. Ierminaci6n in vitro semillas de mortio

4l medio de cultivo usado en la ma#ora de ensa#os 0ue m8("! un medio
modi0icado de 8ood# (lant "edium ('lo#d 9 "cCo:n ;.&%)! 0ormulado en *ase a medios
usados en otros estudios 1ara Vaccinium (Ta*la ;). Tam*i+n se reali26 ensa#os usando medio
"S ("urashige 9 SFoog! ;.B$)! ;>$ "S (con la mitad de concentraci6n de sales "S) o
medio 8(" modi0icado 1ara blueberries (=o:land 9 Kgden! ;..$), denominado 8("?BB
en este estudio. 'a com1osici6n de estos cuatro medios se detalla en la Ta*la ;.
'os medios se re1artieron en 0rascos de vidrio de JCC cc # se autoclavaron 1or ;A
minutos a ;$;RC! luego de lo cual se dejaron en0riar. (ara la 1re1araci6n de medios con
hormonas termol5*iles (trans?2eatina ri*6side! $i(! TD< # 5cido gi*er+lico! I-
D
)! se
esterili26 la hormona a trav+s de 0iltros de %.$$ m # +sta se aadi6 al medio autoclavado
antes de 3ue se solidi0i3ue! dentro de la c5mara de 0lujo laminar. 'as hormonas
termoresistentes (B-(! @--! EB-! Finetina # 5cido $!J?Dicloro0eno7iacetico! $!J?D) 0ueron
aadidas al medio antes de autoclavar.

>,/,/, Obtencin de semillas de morti&o

'os 0rutos de mortio se cortaron 1or la mitad # se e7trajo las semillas con la a#uda
de una cuchara 1e3uea. Se coloc6 a +stas en un tami2 # se las lav6 con agua de la llave. Se
dej6 secar las semillas so*re 1a1el a*sor*ente # luego 0ueron guardadas en un 0rasco de
vidrio 1e3ueo hasta su utili2aci6n.

>,/,3, Desin2eccin de las semillas

Se hi2o un ensa#o 1reliminar de esterili2aci6n de semillas 1ro*ando A! &! ;% 6 ;A
minutos en hi1oclorito de sodio (@aClK) al $.A O. 4n ensa#os 1osteriores! el 1rotocolo de
desin0ecci6n utili2ado consisti6 en sumergir las semillas en alcohol al C%O 1or tres minutos!
lavarlas con agua destilada est+ril # desin0ectarlas 1or ;% minutos en hi1oclorito de sodio al
$.AO # J gotas de T:een $%. Des1u+s de la desin0ecci6n! se lav6 A veces con agua destilada
est+ril # se sem*r6 en 0rascos con medio de cultivo *asal sin hormonas.

>,/,-, 5erminacin de semillas de morti&o

Se 3uiso o*servar la in0luencia del ti1o de medio en el 1orcentaje de germinaci6n!
1ara lo cual se 1ro*6 los medios *asales ;>$ "S # m8(". Tam*i+n se 3uiso o*servar la
di0erencia entre el 1orcentaje de germinaci6n de semillas mantenidas en oscuridad vs.
semillas mantenidas en lu2. Finalmente! se 3uiso determinar si un tratamiento en 0ro de las
semillas (ARC 1or dos semanas) in0lu#e so*re este 1orcentaje. 4l diseo de estos ensa#os se
detalla en la Ta*la $.

>,/,9, ro6agacin de 6lantas de morti&o

(ara las 1rue*as de 1ro1agaci6n del mortio! se us6 el medio *asal m8(". 4n
1rimera instancia! se intent6 su*cultivar las 1l5ntulas germinadas directamente a medio *asal
sin hormonas. De*ido a 3ue no se o*serv6 rami0icaci6n ni elongaci6n de las 1lantas
germinadas se 1rosigui6 a hacer 1rue*as en medios con di0erentes com*inaciones #
concentraciones de hormonas. (ara 1romover elongaci6n de las 1lantas germinadas! se 1ro*6
concentraciones desde ; hasta ;% mg>l de I-
D
# una com*inaci6n de @--! %.%$ mg>l con
I-
D
a A 6 $% mg>l.
Con el 1ro16sito de determinar si es 1osi*le mejorar el as1ecto de las 1l5ntulas de
mortio! es decir! 1ara 3ue cre2can m5s ro*ustas! 1ara el resto de los ensa#os se us6 siem1re
una cito3uinina ($i(! B-(! T<=) sola o en com*inaci6n con una au7ina o gi*erelina.
(ara los ensa#os de 1ro1agaci6n iniciales! se 1ro*6 B-( (; mg>l)! B-( (; mg>l) en
com*inaci6n con I-
D
(A # ;% mg>l)! B-( (; hasta ;% mg>l) en com*inaci6n con @-- (%.%;
a %.%A mg>l) # B-( (%.A a D mg>l) en com*inaci6n con I-
D
(A # ;% mg>l) # @-- (%.%; a
%.%J mg>l). 4stos ensa#os se hicieron a 1artir de semillas germinadas (Ta*la D).
Tam*i+n se hi2o ensa#os de *rotaci6n de #emas! usando tallos de 1lantas 3ue ha*an
elongado en medio *asal. 4n este caso! se cort6 los tallos en segmentos con tres nudos en
cada uno 1ara ver *rotaci6n de #emas en medio de cultivo con B-( (; a ;% mg>l)! @--
(%.%; # %.%A mg>l) # ;O de car*6n activado. 'a mitad de +stos 0ueron 1uestos aleatoriamente
en oscuridad 1or las 1rimeras cuatro semanas. 4n un segundo ensa#o de *rotaci6n de #emas!
se 1ro*6 concentraciones de D a A mg>l de B-( # %.%; a %.%A mg>l de @--.
- 0in de determinar el e0ecto de T<= so*re la 1ro1agaci6n del mortio! se 1ro*6 T<=
con 1l5ntulas germinadas (%.A mg>l) o con segmentos de tallo (%.A # C mg>l). Tam*i+n se
com*in6 ; # $ mg>l de T<= con ;% mg>l de I-
D
! usando 1lantas germinadas! # ; mg>l de
T<= con %.%A mg>l de @-- usando segmentos de tallo # 1lantas #a 1ro1agadas
anteriormente en T<= (Ta*la D). 'a com*inaci6n de T<= (; mg>l) # @-- (%.%A mg>l) se us6
durante el resto de la investigaci6n 1ara una 1ro1agaci6n continua de material vegetal 3ue
1ueda ser usado en otros ensa#os.
Finalmente! se 3uiso ver el e0ecto del $i( 1ara la 1ro1agaci6n! a 1artir de 1lantas 3ue
ha*an sido 1ro1agadas en T<= # @--. Se us6 $i( s6lo (; a A mg>l)! o en com*inaci6n con
@-- (%.%A # %.; mg>l). Tam*i+n se us6 $i( (; a A mg>l) en com*inaci6n con T<= (; mg>l) #
en com*inaci6n con T<= (; mg>l) # @-- (%.%A mg>l). (ara re0erencia! se descri*en todas las
com*inaciones de hormonas # los rangos de concentraciones de +stas en la Ta*la D.

C.$. Entroducci6n in vitro de #emas a7ilares de mortio

>,3,/, Obtencin de los tallos de morti&o

Se us6 e71lantes de tallos de mortio silvestre recogidos en $ localidades! (asochoa #
Sigchos. Se escogi6 1lantas de mortio en las 3ue 0uera visi*le crecimiento reciente 1or su
color verde claro # tejido suave. Se cort6 alrededor de & cm del e7tremo del tallo! se remoj6
en agua # se coloc6 en *otellas de 1l5stico hasta el da siguiente.

>,3,3, Desin2eccin de los segmentos de tallos

'os tallos se lavaron *ajo agua de la llave 1or tres a cinco minutos! # de +stos se
removi6 todas las hojas! cort5ndoles con una tijera. Se cort6 los tallos en segmentos de A cm
de largo! se los sumergi6 1or tres minutos en alcohol al C%O # luego se los lav6 con agua
destilada est+ril. Se hi2o una 1rue*a de desin0ecci6n en hi1oclorito de sodio (@aClK) al $.AO
con D 6 J gotas de T:een $% # se 1ro*6 A! ;%! ;A # $% minutos de desin0ecci6n. Tam*i+n se
1ro*6 ;%! ;A! $% # $A minutos en @aClK al ;.A O. Se introdujo los tallos desin0ectados en
0rascos con medio *asal m8(".
4n e71erimentos 1osteriores! se us6 Mnicamente tallos recogidos en (asochoa. 4n
estos e71erimentos se escogi6 tallos con #emas verdes visi*les # se us6 un tiem1o de
desin0ecci6n de ;% a ;$ minutos en @aClK al $.AO. Se reali26 los cortes de tallo dentro de
una soluci6n est+ril de 5cido ctrico de ;%% mg>l antes de introducirlos en el medio de cultivo.
4n ciertos e71erimentos se mantuvo los e71lantes en 0rascos con medio *asal sin hormonas
1or ; a D semanas (1ara o*servar contaminaci6n) antes de tras1asarlos al medio con
hormonas. 4n otros e71erimentos se introdujo los e71lantes directamente a medios con
hormonas. Se llev6 a ca*o varios e71erimentos 1ro*ando di0erentes ti1os # com*inaciones de
hormonas! como se descri*e en la Ta*la J.

>,3,-, "niciacin de cultivo in vitro de morti&o a 6artir de yemas a@ilares

(ara 1rue*as con B-( #>o @--! se mantuvo los e71lantes en medio *asal 1or dos a
tres semanas antes de tras1asarlos a medios con hormonas. Se 1ro*6 @-- solo a una
concentraci6n de D mg>l # B-( en un rango de ; a A mg>l. Tam*i+n se hi2o una 1rue*a
com*inando A mg>l de B-( # %.%$ mg>l de @--. 4n este e71erimento no se tom6 en cuenta
de 3u+ 1arte del tallo se e7trajo el e71lante.
4n el resto de e71erimentos de introducci6n de #emas! s se tom6 en cuenta de d6nde
se e7trajo el e71lante! es decir! si el e71lante 1rovena del 51ice (SU() del tallo o de la 1arte
in0erior m5s alejada del 51ice (E@F). 'os e71lantes E@F contenan D #emas en segmentos de ;
cm de largo! mientras los e71lantes SU( contenan mMlti1les #emas en segmentos del mismo
tamao. (ara las 1rue*as iniciales de esta*lecimiento de cultivo in vitro usando T<=! con o
sin @--! en el caso de com*inaciones de hormonas 3ue incluan @--! la introducci6n se
hi2o en medio *asal con la concentraci6n corres1ondiente de @-- # se mantuvo en este
medio 1or ; a D semanas antes de 1asar los tallos individuales a 0rascos de J ml 3ue
contenan medio con T<= Y @--. Se 1ro*6 la introducci6n de #emas a7ilares en %.A mg>l de
T<=. -l com*inar con @--! las concentraciones de T<= 3ue se 1ro*aron variaron desde ;
hasta C mg>l # las de @--! desde %.%A hasta %.; mg>l! utili2ando un e71lante 1roveniente del
e7tremo del tallo (SU()! # cuatro o m5s e71lantes de la 1arte in0erior (E@F). Se hi2o una
1rue*a con A mg>l de T<= # %.A mg>l de @--! 1ero solamente utili2ando tallos E@F. 4n
algunos casos en 3ue se vio *rotaci6n de #emas en los medios con T<= Y @--! se hi2o otro
su*cultivo a medio con $i( s6lo (D mg>l) o $i( (D a A mg>l) con @-- (%.; mg>l).
4n *ase a los resultados o*tenidos con los ensa#os iniciales con T<= # @--! se llev6
a ca*o otro ensa#o utili2ando un ma#or nMmero de tallos SU(. Se 1ro*6 ; # C mg>l de T<=
en com*inaci6n con %.; mg>l de @--. 4n este caso! se introdujo e71lantes individuales en
0rascos de J ml 3ue contenan T<= Y @-- con el o*jetivo de 1oder introducir los e71lantes
directamente a medios con hormonas # evitar 3ue la contaminaci6n de algunos e71lantes se
e7tienda a los dem5s. De esta introducci6n en T<= Y @--! los tallos con #emas verdes o
con *rotes 3ue esta*an creciendo se su*cultivaron en los siguientes medios con $i( s6lo (D #
A mg>l) # $i( (A mg>l) en com*inaci6n con @-- (%.; mg>l). 'as 1lantas 1ro1agadas en $i(!
con o sin @--! se su*cultivaron a medio m8("! ;>$ "S # "S 1ara ver elongaci6n #
enrai2amiento de las 1lantas.
4n 1rue*as de introducci6n de #emas usando $i( s6lo (; a A mg>l) o com*inado con
@-- (%.%A # %.; mg>l)! se introdujo los segmentos de tallo directamente al medio *asal con
hormonas. (ara cada com*inaci6n de hormonas se us6 D segmentos de tallo SU( # D
segmentos E@F. 4n la Ta*la J se descri*en todas las com*inaciones de hormonas # rangos de
concentraciones usados 1ara el esta*lecimiento de cultivo in vitro a 1artir de #emas a7ilares.

C.D. 4longamiento! enrai2amiento # aclimataci6n

>,-,/, Elongacin y enraiAamiento de 6lantas de morti&o in vitro

-ntes de aclimatar las 1lantas de mortio 1ro1agadas in vitro! se hi2o varias 1rue*as
1ara enrai2amiento # elongaci6n de +stas. Se 1ro*6 tanto com*inaciones de hormonas como
di0erentes medios *asales.
(artiendo de 1lantas 3ue ha*an sido 1ro1agadas en T<= (%.A mg>l)! se hi2o
su*cultivo de +stas en di0erentes concentraciones de I-
D
(; a A mg>l) o en B-( (D mg>l) en
com*inaci6n con @-- (%.%$ mg>l)! con el o*jetivo de o*servar elongaci6n.
(artiendo de 1lantas 1ro1agadas en B-( con @-- # I-
D
! se 1ro*6 varias
concentraciones de EB- (; a A mg>l) 1ara inducir enrai2amiento. Con este mismo 1ro16sito!
se hi2o su*cultivos en varias concentraciones de @-- (%.%$ a A mg>l)! a 1artir de 1lantas
1ro1agadas en T<=?%.A mg>l.
'os medios *asales 1ro*ados 1ara elongaci6n # enrai2amiento de las 1lantas 0ueron
m8("! ;>$ "S # 8("?BB. Se us6 1lantas 3ue ha*an sido 1ro1agadas en T<= s6lo (%.A
mg>l)! T<= (; mg>l) com*inado con @-- (%.%A 6 %.%C mg>l) o en $i( (; 6 D mg>l) m5s T<=
(; mg>l) con o sin @-- (%.%A mg>l)!
'os medios usados 1ara 1rue*as de elongaci6n # enrai2amiento se detallan en la
Ta*la A.

>,-,3, Observacin al microsco6io de cortes de tallo y ra7ces

'a ma#ora de 1lantas 3ue enrai2aron desarrollaron races a+reas o cerca de la *ase de
la 1lanta! 1ero no se origina*an directamente de la *ase. (or esta ra26n! se 3uiso o*servar si
estas races 3ue salan a lo largo del tallo tenan cone7iones vasculares. Usando 1lantas 3ue
ha*an enrai2ado en medio m8(" sin hormonas! se hi2o cortes de tallo a la altura del las
races adventicias 1ara o*servar el origen de +stas races en un microsco1io 61tico.
Tam*i+n se 3uiso ver la conductividad de las races! utili2ando colorantes de comida.
Se coloc6 las races de 1lantas de mortio elongadas # enra2adas en m8(" en una soluci6n
de agua con colorante a2ul o en agua destilada sin colorante como un control negativo. Se
reali26 cortes de tallo cerca del e7tremo su1erior de los tallos de la 1lanta # se o*serv6 *ajo
un microsco1io 61tico.

>,-,-, Aclimatacin de 6lantas de morti&o introducidas in vitro 6or semillas

(ara 1asar a tierra las 1lantas 3ue crecieron in vitro! se de*i6 someter +stas a un
1roceso de aclimataci6n. Se reali26 varios e71erimentos usando 1lantas 3ue 1rovenan de
di0erentes medios de cultivo o utili2ando di0erentes ti1os de tierra! 1ero el 1rocedimiento en
general 1ara la aclimataci6n 0ue similar en todos los e71erimentos.
Se 1re1ar6 0rascos de aclimataci6n en los 3ue se 1uso vasijas de cer5mica rellenas de
tierra! agua 1ara remojar la tierra # los 0rascos se ta1aron con 1a1el aluminio # 0ueron
autoclavados. De las 1lantas 1ro1agadas # elongadas in vitro se escogi6 las de mejor as1ecto
# 3ue tenan un sistema de races *ien desarrollado. Se las e7trajo con cuidado # se removi6
todo el agar 3ue esta*a 1egado a las races as como todas las hojas ca0+s #>o callo en la *ase
de las 1lantas. Se coloc6 las 1lantas dentro de la tierra a una 1ro0undidad su0iciente 1ara
cu*rir las races! 3ue muchas veces eran a+reas.
'os 0rascos de aclimataci6n! 3ue se ta1aron con 1l5stico! no se mantuvieron
directamente *ajo lu2 0luorescente! 1ara evitar 3ue las 1lantas se secaran demasiado r51ido.
Se em1e26 a hacer huecos en el 1l5stico! usando la 1unta de un es0erogr50ico! des1u+s de ;
hasta J semanas. Se sigui6 haciendo m5s huecos durante las siguiente J a B semanas hasta
3ue el 1l5stico tuviera de ;% a ;A huecos. -lrededor de tres das des1u+s! el 1l5stico se
removi6 1or com1leto. 4n este 1unto! las 1lantas 3ue so*revivieron esta*an listas 1ara ser
1asadas a 0undas con tierra.
4n ensa#os iniciales! se us6 1lantas germinadas 1rovenientes de medio *asal! 3ue
tenan un 1romedio de DB mm # ha*an desarrollado a*undantes races desde la *ase de la
1lanta. 'a tierra 3ue se us6 0ue Tierra ti1o E de "ulti0lor. Se es1er6 una semana 1ara hacer
los 1rimeros huecos en el 1l5stico! # se 3uit6 el 1l5stico 1or com1leto cuatro semanas
des1u+s.
4n otros ensa#os! se us6 1lantas 3ue ha*an sido 1ro1agadas! elongadas # enrai2adas
en B-( m5s @--. 'a tierra 3ue se us6 0ue Tierra ti1o E de "ulti0lor o -groterra. Se es1er6
alrededor de una a dos semanas 1ara hacer los 1rimeros huecos en el 1l5stico! # se 3uit6 el
1l5stico 1or com1leto dos semanas des1u+s.
Se us6 1lantas 1rovenientes de medios con @-- (A mg>l). Se aclimataron 1lantas en
-groterra! en una me2cla de -groterra con tierra 3ue se trajo de (asochoa! de la misma
localidad de donde se hi2o recolecci6n de las 1lantas de mortio! # otras 1lantas se
aclimataron en tierra del (asochoa. Se es1er6 cuatro semanas hasta hacer los 1rimeros huecos
en el 1l5stico! # se 3uit6 el 1l5stico 1or com1leto cuatro semanas des1u+s.
(or otro lado! se us6 1lantas 3ue ha*an sido elongadas # ha*an desarrollado
a*undantes races en medio *asal m8(" o ;>$ "S o medios con $i( (; 6 D mg>l) # @--
(%.%A 6 %.; mg>l). Se us6 tierra del (asochoa o una me2cla de tur*a Y 1erlita comercial
(Sunshine -ll (ur1ose (lanting "i7). Se es1er6 cuatro semanas hasta hacer los 1rimeros
huecos en el 1l5stico! # cuatro a seis semanas hasta 3uitar todo el 1l5stico.

C.J. 4nsa#os de regeneraci6n # 0ormaci6n de callo a 1artir de e71lantes de hoja
o tallo

'as 1rue*as de regeneraci6n se llevaron a ca*o tanto en hojas # tallos de mortio
trados del (asochoa! como en hojas 1rovenientes de 1lantas in vitro. Se llev6 a ca*o varios
ensa#os en los 3ue se vari6 el ti1o de e71lante (hoja o tallo) # la com*inaci6n de hormonas
(Ta*la B). -lgunas veces los cortes se reali2aron dentro de una soluci6n de 5cido ctrico de
A% a ;A% mg>l #! adicionalmente! algunos de los medios contenan ;O de car*6n activado
1ara evitar 3ue los e71lantes se o7iden.
4n los e71erimentos de regeneraci6n se us6 el medio *asal m8(" con la
com*inaci6n de hormonas adecuada (o medio m8(" sin hormonas en el caso de la 1rue*a
de desin0ecci6n) en cajas 1etri de 1l5stico. 'as hojas 3ue se introdujeron in vitro tenan un
tamao de C a ;$ mm de largo # se coloc6 A a B de estas hojas en cada caja 1etri. 'as hojas
de 1lantas in vitro tenan un largo de hasta A mm! de manera 3ue se coloc6 A a ;% de estas
hojas en cada caja.

>,9,/, Desin2eccin de )o4as y tallos de 6lantas de morti&o recogidas en el cam6o

(ara introducir las hojas in vitro! se llev6 a ca*o un ensa#o de desin0ecci6n. Se lav6
todo el tallo de mortio usando agua de la llave # luego las hojas se cortaron cerca del tallo
con tijeras! teniendo cuidado de no daar a la hoja. Se us6 Mnicamente hojas j6venes e
intactas # sin rasguos. Tra*ajando dentro de la c5mara de 0lujo laminar! las hojas se
sumergieron 1or tres minutos en alcohol al C%O # se lavaron una ve2 con agua destilada
est+ril 1ara remover el alcohol. 'as hojas se desin0ectaron con hi1oclorito de sodio (@aClK)
al $.A O Y T:een $%! seguido 1or tres lavados en agua destilada est+ril. 4n el ensa#o de
desin0ecci6n se 1ro*6 A! ;%! ;A # $% minutos! # en ensa#os 1osteriores se us6 entre C a ;$
minutos de desin0ecci6n en @aClK.
(ara estos ensa#os con hojas introducidas! tam*i+n se hi2o un ensa#o 1reliminar
usando concentraciones de A%! ;%%! ;A% # $%% mg>l de 5cido ctrico! manteniendo las hojas
cortadas en este medio 1or ;! D 6 $J horas antes de 1onerlas en medio m8("! 1ara ver si el
tratamiento evitara la muerte de los e71lantes. Des1u+s de $ # J semanas se o*serv6 si los
*ordes cortados de estas hojas seguan verdes # el estado del e71lante.

>,9,3, ruebas de regeneracin y 2ormacin de callo

'os 1rimeros ensa#os se reali2aron 1ara lograr regeneraci6n directa o indirecta de
retoos adventicios a 1artir de hojas # tallos introducidos u hojas de 1lantas in vitro.
(osteriormente! se en0oc6 los ensa#os en la inducci6n de callo # el mantenimiento de +ste
mediante su*cultivos en com*inaciones de hormonas adecuadas.

7..!.". #o$as y tallos introducidos in vitro

(ara las 1rue*as con hojas introducidas in vitro se hi2o un ensa#o con B-( (; W ;%
mg>l) # @-- (%.%; W %.%A mg>l) en medios con ;O de car*6n activado. Tam*i+n se 1ro*6
concentraciones iguales de B-( # @-- # concentraciones iguales de KE@ # @-- desde ;
hasta C mg>l! as como @-- s6lo (; a C mg>l)! usando hojas # tallos introducidos! sin car*6n
activado. Con T<= solo! se us6 Mnicamente e71lantes de hojas con concentraciones de $ a J
mg>l! sin car*6n activado # concentraciones de A a . mg>l con ;O de car*6n activado! # se
1ro*6 T<= ($ a J mg >l) en com*inaci6n con @-- (%.%$ mg>l) so*re hojas # tallos.

7..!.!. #o$as de plantas in vitro

Se hi2o tam*i+n 1rue*as con hojas de 1lantas in vitro. Con ;O de car*6n activado! se
us6 ; a ;% mg>l de B-( en com*inaci6n con %.%; a D mg>l de @-- #! en medio sin car*6n
activado! se us6 ; a ;% mg>l de B-( com*inado con ; a . mg>l de @--. Se 1ro*6 ; a & mg>l
de KE@ solo! o en com*inaci6n con %.%; a C mg>l de @-- # %.A a & mg>l de KE@ en
com*inaci6n con %.; a A mg>l de $!J?D. Usando ;O de car*6n activado! se 1ro*6 C mg>l de
T<= 6 ; a & mg>l de T<= en com*inaci6n con %.%D a %.A mg>l de @-- en medios sin car*6n
activado. Se 1ro*6 TD< solo (%.; W $ mg>l) o en com*inaci6n con @-- (%.$ # %.A mg>l)! as
como $i( solo (; W . mg>l)! @-- solo (; W C mg>l) # $!J?D solo (%.%A W ;% mg>l).

7..!.%. &ubcultivo de callos

4n las 1rue*as de su*cultivos de callos! se us6 callos 3ue ha*an sido o*tenidos en los
ensa#os anteriores o a 1artir de callos generados en las *ases de 1lantas de mortio in vitro.
Se 1ro*6 concentraciones de ; a . mg>l de B-( en com*inaci6n con %.%; a %.%D mg>l de
@--. Tam*i+n se us6 KE@ solo (; W & mg>l)! o en com*inaci6n con @-- (%.%; W %.%A mg>l)
# T<= (; W & mg>l) en com*inaci6n con @-- (%.%D W %.A mg>l). Se us6 tam*i+n TD< solo
(%.; W $ mg>l) o en com*inaci6n con @-- (%.$ # %.A mg>l)! as como $i( solo (; W . mg>l) #
@-- solo (D mg>l).
'as com*inaciones de hormonas utili2adas en las 1rue*as de regeneraci6n se
encuentran descritas en la Ta*la B.
?, !esultados

&.;. Ierminaci6n in vitro de semillas de mortio

?,/,/, Desin2eccin de las semillas

4n el e71erimento 1reliminar de desin0ecci6n de semillas se o*serv6 contaminaci6n
Mnicamente en el tratamiento con A minutos de esterili2aci6n en @aClK. Con &! ;% # ;A
minutos de desin0ecci6n no se o*serv6 contaminaci6n ni di0erencia en los tiem1os de
germinaci6n! de manera 3ue en e71erimentos 1osteriores se us6 un 1rotocolo de ;% minutos
de esterili2aci6n en @aClK al $.AO.

?,/,3, 5erminacin de semillas de morti&o

Se o*serv6 di0erencias en los 1orcentajes de germinaci6n entre los di0erentes
tratamientos. 4l 1orcentaje de germinaci6n m5s alto! B%.CO! se dio en semillas en m8("
mantenidas en lu2 # con tratamiento de 0ro (Ta*la C). 'os 1orcentajes de germinaci6n m5s
*ajos se dieron en semillas germinadas en medio m8(" mantenidas en oscuridad # con
tratamiento de 0ro # semillas germinadas en medio ;>$ "S mantenidas en lu2 # sin
tratamiento de 0ro (J%.$O # J$.&O res1ectivamente).
Sin im1ortar el tratamiento! las semillas germinaron a1ro7imadamente $% das
des1u+s de ser introducidas in vitro # se vio la a1arici6n de las 1rimeras hojas alrededor de
D% das des1u+s. 4n general no se o*serv6 elongaci6n de las 1lantas germinadas hasta los A%
das. (asados los C% das! en 1ocas 1lantas se em1e26 a o*servar una elongaci6n moderada de
unos 1ocos milmetros! sin em*argo! estas 1lantas tenan un as1ecto delgado # d+*il. Se
tras1as6 las 1lantas germinadas a medio 0resco! 1ero se o*serv6 una altura m57ima de A% mm
a los $A% das de ha*er sido introducidas las semillas en medio m8(". 4n ninguna 1lanta se
o*serv6 rami0icaci6n (Figura ;).

?,/,-, ro6agacin de 6lantas de morti&o

'as 1lantas su*cultivadas a m8(" sin hormonas no crecieron signi0icativamente.
"5s de J% das des1u+s del su*cultivo! +stas tenan a1enas B mm de altura! # tenan as1ecto
delgado! 1or lo 3ue en las siguientes 1rue*as se us6 reguladores de crecimiento 1ara intentar
mejorar el as1ecto de la 1lanta.
Usando concentraciones de D! A # ;% mg>l de I-
D
se o*serv6 una elongaci6n m5s
r51ida de las 1lantas 3ue con ; mg>l de I-
D
. Sin em*argo! en las cuatro concentraciones! las
1lantas crecieron demasiado delgadas # d+*iles. 4n los su*cultivos su*siguientes! las
1l5ntulas alcan2aron un m57imo de D%mm de altura a los $C% das del su*cultivo en I-
D
a
1artir de 1lantas germinadas. 'as 1lantas 1ermanecieron delgadas # las 1untas de +stas se
tornaron rojas o ca0+! lo cual les im1idi6 3ue sigan creciendo.
'as 1lantas su*cultivadas en B-( (; mg>l)! tuvieron un crecimiento mu# lento con las
hojas su1eriores torn5ndose rojas 1rogresivamente. 'a altura m57ima 3ue alcan2aron 0ue
;A mm des1u+s de ;A% das de ha*er sido su*cultivadas a medio con B-(. (ocas 1lantas se
rami0icaron # el nMmero de rami0icaciones en estas varia*a desde $ a C rami0icaciones. 'as
1lantas su*cultivadas en B-( Y @-- o en B-( Y @-- Y I-
D
tuvieron un crecimiento m5s
r51ido 3ue las 3ue se su*cultivaron en B-( s6lo. 4n este caso! tam*i+n se o*serv6 3ue las
hojas su1eriores se tornaron rojas o amarillentas! aun3ue las 1lantas siguieron creciendo a
1esar de esto. Todas las 1lantas se elongaron 1ero eran delgadas # d+*iles! con mu# 1oca
rami0icaci6n. -lgunas 1lantas tuvieron 0ormaci6n de un callo verde roji2o en la *ase # en
otras se o*serv6 races a+reas des1u+s de un tiem1o 1rolongado en B-( Y @--. 4l as1ecto
de las 1lantas en general no era *ueno (Figura $).
Se vio 3ue los mejores medios 1ara la *rotaci6n de #emas contenan D 6 A mg>l de
B-( # %.%; mg>l de @-- (Ta*la &). 4l nMmero de *rotes 3ue se o*tuvo en estos medios 0ue
mucho ma#or! # +stos eran de un tamao m5s grande. -dicionalmente! los *rotes tenan un
*uen as1ecto! es decir tenan hojas verdes # saluda*les (Figura D). Sin em*argo! en ninguno
de los medios se vio elongaci6n de los *rotes. 4stos 1ermanecieron 1e3ueos #
eventualmente murieron. 4n el segundo ensa#o! con D! J 6 A mg>l de B-( # %.%;! %.%D! 6
%.%A mg>l de @--! se o*serv6 medios con un alto nMmero de *rotes verdes # de as1ecto
saluda*le! # con elongaci6n de +stos (Ta*la .). 4n su*cultivos 1osteriores de estas 1lantas!
las hojas su1eriores se tornaron rojas # no continuaron desarroll5ndose.
'as 1lantas 1uestas en T<= en com*inaci6n con I-
D
desarrollaron 1ocas
rami0icaciones 1or 1lanta # se vio una elongaci6n de hasta $A mm! ;$C das des1u+s de ha*er
sido 1uestas en I-
D
.4n tres de cinco 0rascos con T<= (%.A mg>l)! las 1lantas desarrollaron
1ocas rami0icaciones # las hojas su1eriores tenan color rojo. 4n dos de cinco 0rascos con
s6lo T<=! las 1lantas desarrollaron muchas rami0icaciones # 0ue 1osi*le utili2arlas 1ara
e71erimentos 1osteriores con reguladores de crecimiento! o como material 1ara seguir
1ro1agando en %.A mg>l de T<=. Se em1e26 a ver rami0icaci6n des1u+s de a1ro7imadamente
A% das. Des1u+s de varios su*cultivos! la ra1ide2 de rami0icaci6n # de 1ro1agaci6n aument6
# en algunos casos el as1ecto de la 1lanta mejor6 (Figura J). Sin em*argo! tam*i+n se vio
3ue! desde el segundo su*cultivo en T<=! algunas 1lantas! en ve2 de 1ro1agarse!
desarrolla*an hojas ca0+s # se moran.
Tanto en el tratamiento de T<= s6lo # T<= en com*inaci6n con @-- usando
segmentos de tallo! se em1e26 a ver *rotaci6n de #emas inmediatamente! tan solo ;D das
des1u+s de ha*er sido colocados en el medio. 4n algunos segmentos de tallo en T<= (%.A
mg>l) se vio a*undante rami0icaci6n mientras en otros s6lo se vio moderada rami0icaci6n. 4n
T<= (C mg>l) se vio *rotaci6n en todos los tallos # estos *rotes crecieron con as1ecto
saluda*le en algunos mientras 3ue otros se tornaron ca0+s. 4n T<= (; mg>l) Y @-- (%.%A
mg>l)! en cam*io! se vio a*undante rami0icaci6n # un *uen as1ecto en la ma#ora de 1lantas.
4n ninguno de los medios se vio elongaci6n. 4n cinco de los seis su*cultivos 3ue se hi2o en
T<=?; Y @--?%.%A a 1artir de 1lantas 1ro1agadas anteriormente en T<=?%.A mg>l! las
1lantas em1e2aron a rami0icarse a*undantemente # tuvieron un as1ecto Z*ush#V (Figura A).
4stas 1l5ntulas no elongaron ni desarrollaron races. 4n su*cultivos 1osteriores! +stas
desarrollaron rami0icaciones aMn m5s com1actas sin so*re1asar una altura de $A mm.
4n los ensa#os con $i(! se vio una tendencia de ma#or elongaci6n en las 1lantas 3ue
se mantuvieron en menores concentraciones de $i(. 4n ; mg>l de $i(! las 1l5ntulas tenan
*uena elongaci6n # un tamao de hojas 1e3ueo ($ mm) o mediano (Dmm). 4l as1ecto de las
hojas vari6 entre verde o amarillento. 'as 1lantas en D mg>l de $i( tuvieron moderada
elongaci6n # el tamao de las hojas era mediano o grande (Jmm) # de color verde. Se vio
claramente 3ue las 1lantas en A mg>l de $i( 0ueron las m5s 1e3ueas # com1actas. 4n $i(?A
mg>l se o*serv6 moderada rami0icaci6n de las 1lantas # +stas tenan hojas 1e3ueas de $ mm
# de color verde. 4n los medios 3ue tenan @-- se vio ma#or elongaci6n # enrai2amiento
(Figura B). 4n todas las com*inaciones de hormonas 1or lo general se vio un desarrollo de
races a+reas! e7ce1to en A mg>l de $i(! donde s6lo una 1lanta desarroll6 races (Ta*la ;%).
4n todas las com*inaciones de $i( # T<=! con o sin @--! se o*tuvo 1lantas de
as1ecto Z*ush#V # en todos los 0rascos se vio el desarrollo de races a+reas en la ma#ora de
1lantas. Se o*serv6 1oca elongaci6n de las 1lantas! # el tamao de las 1lantas varia*a entre
;& # $A mm! segMn el medio (Ta*la ;;).

&.$. Entroducci6n in vitro de #emas a7ilares de mortio

?,3,/, Desin2eccin de los segmentos de tallos

@o se encontr6 un 1rotocolo 3ue 1ermita erradicar totalmente la contaminaci6n de los
tallos 3ue se introdujeron in vitro. Tanto con $.AO de @aClK # ;.AO de @aClK en todos los
tiem1os 3ue se 1ro*aronN se o*serv6 contaminaci6n de uno o m5s tallos dentro de cada
0rasco. -l mismo tiem1o! se vio 3ue muchos tallos se torna*an ca0+s des1u+s de algunas
semanas en el medio.
(ara minimi2ar el dao a los e71lantes! se escogi6 una desin0ecci6n de ;% a ;$
minutos en @aClK al $.AO! # se hi2o los cortes de segmentos de tallo en una soluci6n de
5cido ctrico antes de 1onerlos en el medio de cultivo. Ua 3ue esta desin0ecci6n no era
totalmente e0iciente! la estrategia 3ue se sigui6 1ara algunos e71erimentos 0ue introducir los
tallos en 0rascos con medio *asal 1ara o*servar si e7ista contaminaci6n antes de 1asarlos a
medio con hormonas. Ktra estrategia 0ue colocarlos individualmente en 0rascos de J ml! lo
cual 1ermiti6 1oner los e71lantes en medio con hormonas inmediatamente des1u+s de su
desin0ecci6n.

?,3,3, "niciacin de cultivo in vitro de morti&o a 6artir de yemas a@ilares

4n @--?D mg>l! se vio crecimiento de las #emas 1ero las hojas nuevas crecan en mal
estado. Lu*o 0ormaci6n de callo a lo largo del e71lante hasta 3ue las hojas nuevas moran #
creca callo en su lugar. 4n las di0erentes concentraciones de B-( (;! D # A mg>l) o B-( (A
mg>l) Y @-- (%.%$ mg>l)! se o*serv6 3ue a los AJ das del su*cultivo en estas
concentraciones! las #emas no ha*an crecido # todos los e71lantes se ha*an tornado ca0+s.
Usando T<= (%.A mg>l)! se o*serv6 3ue *rot6 una #ema en uno de los tallos E@F a los
$$ das en el medio. Sin em*argo! a los BJ das! +sta no ha*a crecido m5s # se torn6 ca0+ el
tallo # la #ema.
4n las com*inaciones con T<= # @--! al usar %.%A mg>l de @-- no se o*tuvo
*uenos resultados. Solamente se vio crecimiento de #emas de tallos E@F a los ;A?;C das en ;
mg>l de T<= # %.%A mg>l de @--. 4l tamao m57imo 3ue alcan2aron algunas 0ue de A mm a
los AC das! 1ero eventualmente todas las #emas # tallos se hicieron ca0+s.
Usando %.; mg>l de @-- en com*inaci6n con T<=! se vio *rotaci6n de las #emas
Mnicamente en los tallos SU(! en concentraciones de ;! A # C mg>l de T<=. @inguno de los
tallos E@F *rot6 #! eventualmente! las #emas # tallos se hicieron ca0+s. 4n el caso de tallos
SU( 3ue *rotaron! se dio crecimiento de una sola #ema o de varias #emas en un mismo tallo.
4l medio con C mg>l de T<= # %.; mg>l de @-- en tallos SU( dio los mejores resultados! #a
3ue 1ermiti6 3ue *roten m5s de $A #emas en un mismo tallo (Figura C). 4l nuevo medio al
3ue se tras1asaron las #emas *rotadas contena $i(! con o sin @--.
De los *rotes 3ue se 1asaron a $i(! con o sin @--! so*revivieron la ma#ora # se
siguieron rami0icando # creciendo hasta una altura de alrededor de ;D mm a los ;%J das de
su*cultivo en este medio. 4n D mg>l de $i(! las hojas tenan un color verde de as1ecto
saluda*le (Figura &). 4n $i( (D mg>l) con @-- (%.; mg>l) se rami0icaron en menor cantidad #
se elongaron m5s! 1ero las hojas tenan un color verde amarillento # se 0orm6 callo ca0+ en la
*ase de algunas 1l5ntulas. 4n $i( (A mg>l) con @-- (%.; mg>l) se vio ma#or rami0icaci6n #
menor elongaci6n en este medio 3ue en los anteriores 1ero las hojas su1eriores eran 1e3ueas
# amarillentas en algunas 1lantas.
4n el segundo ensa#o con T<= # @--! introduciendo los tallos desin0ectados
directamente al medio con hormonas! se vio nuevamente 3ue los tallos SU( 0ueron los
mejores e71lantes 1ara la *rotaci6n de #emas. 4n T<= (; mg>l) con @-- (%.; mg >l)! s6lo ;
de ;% segmentos de tallo SU( 1resent6 crecimiento en las #emas. 'os *rotes eran de color
verde # tenan un tamao de $ a B mm. J de ;% segmentos de tallo E@F 1resenta*an #emas
verdes de ; mm. 4n T<= (C mg>l) con @-- (%.; mg >l)! D de B segmentos de tallo SU(
1resenta*an *rotes verdes de $ a ;% mm. 4n los tallos E@F! $ de B segmentos de tallo tenan
#emas verdes de ; a $ mm. Sin em*argo al su*cultivar en $i(! solamente los *rotes de tallos
SU( siguieron creciendo mientras 3ue las #emas de tallos E@F murieron.
4n el caso de tallos SU(! se tuvo una ma#or 1ro1agaci6n # rami0icaci6n con $i( W D
mg>l # $i( W A mg>l! en los 3ue las 1lantas alcan2aron una altura de ;A # ;& mm. 4n $i( W A
mg>l Y @-- W %.; mg>l! las 1lantas tenan una altura de ;A mm 1ero no esta*an mu#
rami0icadas # tenan 1eor as1ecto 1or el color de las hojas. Todas las #emas *rotadas de
tallos E@F ha*an muerto a los A& das de su*cultivo en $i( con o sin @--. De las 1lantas
su*cultivadas a medios de cultivo ;>$ "S! "S # m8("! se o*serv6 3ue el medio "S 0ue el
menos 61timo! #a 3ue las 1lantas de mortio se tornaron rojas # no crecieron. 4n los medios
;>$ "S # m8("! en cam*io! se dio elongaci6n de las 1lantas 1ero se o*serv6 1oco
enrai2amiento de las mismas.
-l introducir #emas directamente a $i( con o sin @--! se o*serv6 3ue a los $J das
en el medio con hormonas! los tallos SU( tenan #emas 3ue aMn no esta*an creciendo!
mientras 3ue los tallos E@F tenan #emas verdes 3ue esta*an em1e2ando a *rotar. Tam*i+n se
vio un cam*io de color del medio 1or 0enoles 3ue e7uda*an las 1lantas. - los CD das en el
medio! se o*serv6 3ue los e71lantes SU( e E@F de la ma#ora de com*inaciones de
hormonas se ha*an tornado ca0+ # ha*an muerto. 'a Mnica e7ce1ci6n 0ue el 0rasco con $i( W
A mg>l! en el 3ue $ de los D tallos SU( tenan #emas verdes 3ue esta*an *rotando. - los ;%D
das en $i( W A mg>l! los *rotes tenan un tamao de ; a $ mm # seguan verdes.

&.D. 4longamiento! enrai2amiento # aclimataci6n

?,-,/, Elongacin y enraiAamiento de 6lantas de morti&o in vitro

4n tres de los cuatro 0rascos en los 3ue se hi2o su*cultivo a B-( Y @--! los
e71lantes se hicieron ca0+s en menos de B% das # eventualmente murieron. Solamente en un
0rasco se o*serv6 elongaci6n de las 1lantas # crecimiento de races a+reas en C de & 1lantas.
Tras varios su*cultivos! muchas 1lantas alcan2aron un tamao 1romedio de J%mm! aun3ue
algunas 1lantas alcan2aron B%mm.
4n cuatro de los cinco su*cultivos en D mg>l de I-
D
las 1lantas em1e2aron a tornarse
ca0+s a los D% das en el medio. Sin em*argo! en uno de los su*cultivos en D mg>l de I-
D
#
en am*os su*cultivos en ; mg>l de I-
D
# A mg>l de I-
D
! las 1lantas so*revivieron # se
elongaron. 4n I-
D
! la ma#or altura 3ue alcan2aron las 1lantas 0ue! en 1romedio! JJ mm. Sin
em*argo! en todas +stas! las hojas su1eriores de las 1lantas eventualmente se secaron # se
hicieron ca0+s.
Se em1e26 a ver ra2 en algunos 0rascos a 1artir de los J% das del su*cultivo en EB-.
- los .C das del su*cultivo en EB-! el 1orcentaje de enrai2amiento varia*a desde D%O hasta
B%O (Ta*la ;$). 4stas races eran a+reas # 1ara una misma 1lanta! se desarrollaron 1ocas
races 1or 1lanta. 4n algunas 1lantas! tam*i+n se o*serv6 un enrojecimiento de las hojas
su1eriores (Figura .).
4n concentraciones menores o igual a ; mg>l de @--! las 1lantas no desarrollaron
races #! eventualmente! se tornaron ca0+s # murieron. 4n concentraciones ma#ores o igual a
$ mg>l de @--! se em1e26 a ver enrai2amiento a 1artir de los $; das del su*cultivo en la
hormona! # la ra2 se desarroll6 desde el tallo de las 1lantas. - los B% das! la ma#ora de
1lantas ha*an desarrollado races *lancas! gruesas # 1e3ueas! sin em*argo! tam*i+n se
0orm6 un callo *lanco o ca0+ en la *ase de la 1lanta.
-l su*cultivar en m8(" a 1artir de 1lantas 1ro1agadas en T<= solo! T<= Y @-- o
T<= Y $i( con o sin @--! las 1lantas crecieron considera*lemente! alcan2ando una altura de
hasta &A mm # muchas tenan races a+reas o de la *ase de la 1lanta. 4stas 1lantas tenan un
as1ecto ro*usto! con hojas de D mm de tamao. Todas las 1lantas su*cultivadas en medio ;>$
"S a 1artir de 1lantas 1ro1agadas en T<= Y @-- o T<= Y $i( con o sin @-- tuvieron una
elongaci6n r51idaN alcan2ando una altura de hasta &% mm. Todas +stas desarrollaron races
a+reas # algunas tam*i+n desarrollaron races gruesas # largas desde la *ase (Figura ;%). 4n
com1araci6n con m8(" # ;>$ "S! el medio 8("?BB! 1ermiti6 ma#or elongaci6n de las
1lantas 3ue el medio ;>$ "S # menor elongaci6n 3ue en m8(". 4n 8("?BB hu*o escasa
0ormaci6n de races.

?,-,3, Observacin al microsco6io de cortes de tallo y ra7ces

-l o*servar los cortes de tallo con races a+reas en el microsco1io 61tico! se 1udo ver
3ue las races s tenan una cone7i6n vascular directa con los tejidos conductores del tallo
(Figura ;;). 4n las 1rue*as de tinci6n con colorante a2ul! no se vio una di0erencia
signi0icativa entre 1lantas con races sumergidas en colorante # 1lantas con races sumergidas
en agua. 4sto 1arecera indicar 3ue la 1lanta no a*sor*i6 el colorante # 3ue! 1osi*lemente! las
races no sean 0uncionales a 1esar de 3ue tengan cone7iones vasculares (Figura ;$ # ;D).

?,-,-, Aclimatacin de 6lantas de morti&o introducidas in vitro 6or semillas

De las 1lantas aclimatadas a 1artir de 1lantas germinadas! la ma#ora so*revivieron
JA das hasta ser 1asadas a 0undas de 1l5stico con tierra # en este tiem1o crecieron entre A #
D% mm. Sin em*argo! al 1asarlas a 0unda! no se vio crecimiento de ninguna de las 1lantas! #
todas murieron entre B # D% das des1u+s.
De las 1lantas 1rovenientes de medios con B-( # @--! la mitad muri6 durante el
1roceso de aclimataci6n antes de 1asarles a 0unda. -lgunas 1lantas se secaron durante la
aclimataci6n mientras otras se contaminaron # murieron. 4n este tiem1o las 3ue
so*revivieron crecieron entre A # $% mm. Sin em*argo! al 1asarlas a 0unda! murieron
enseguida o hasta D% das des1u+s.
De las 1lantas sem*radas en tierra del (asochoa! a 1artir de 1lantas enrai2adas en
@--! $ 1lantas so*revivieron hasta ser 1asadas a 0unda # en ese tiem1o crecieron A # ;B
mm. So*revivieron alrededor de $D das en 0unda antes de secarse com1letamente.
Usando tierra del (asochoa o una me2cla de tur*a # 1erlita! se aclimat6 1lantas 3ue
ha*an sido elongadas # enra2adas en $i( Y @--! en m8(" sin hormonas 6 ;>$ "S sin
hormonas. 'as 1lantas en estos medios tenan a*undantes races a+reas # un as1ecto ro*usto
# elongado (Figura ;J). Sin em*argo! hu*o una alta contaminaci6n de las 1lantas durante el
1roceso de aclimataci6n! # s6lo J de ;$ 1lantas so*revivieron hasta 1oder ser trans1lantadas
a 0undas de 1l5stico con tierra. Una ve2 colocadas en las 0undas de 1l5stico! +stas murieron
en el transcurso de las siguientes tres semanas.

&.J. 4nsa#os de regeneraci6n # 0ormaci6n de callo a 1artir de e71lantes de hoja
o tallo

?,9,/, Desin2eccin de )o4as y tallos de 6lantas de morti&o ex vitro

4n la 1rue*a de desin0ecci6n de los e71lantes! no se vio contaminaci6n en ninguno de
los C e71lantes 3ue se usaron 1ara cada tiem1o de desin0ecci6n (A! ;%! ;A 6 $% minutos). Sin
em*argo! en los e71erimentos 1osteriores! se vio un alto 1orcentaje de contaminaci6n con A
minutos de desin0ecci6n 1ero tam*i+n se o*serv6 3ue! incluso con un tiem1o de A minutos!
las hojas se hacan ca0+s 1ocos das des1u+s. 4n e71erimentos 1osteriores se us6 un tiem1o
de desin0ecci6n de ;% minutos.
Tam*i+n se intent6 evitar 3ue los e71lantes se hagan ca0+s reali2ando los cortes de los
e71lantes dentro de 5cido ctrico. - las dos semanas! se o*serv6 3ue con A% # con ;A% mg>l
de 5cido ctrico ha*a un ma#or nMmero de hojas 3ue todava tenan un *orde verde 3ue con
las otras concentraciones de 5cido ctrico. Sin em*argo! a las J semanas! la ma#ora de hojas
3ue ha*an sido tratadas con A% # ;A% mg>l de 5cido ctrico ha*an desarrollado un *orde
ca0+. @o se o*serv6 una correlaci6n entre los *ordes verdes>ca0+s # el uso de medios con
car*6n activado.

?,9,3, ruebas de regeneracin y 2ormacin de callo

'..!.". #o$as y tallos introducidos in vitro

4n las com*inaciones de B-( # @-- 3ue se 1ro*6 en hojas introducidas! con
concentraciones *ajas de @-- (%.%; 6 %.%A mg>l)! se o*serv6 3ue todas las hojas se ha*an
tornado ca0+s entre D% # BA das des1u+s de ser introducidas in vitro. 4n medios con
concentraciones iguales de B-( # @-- (;! D! A 6 C mg>l)! se o*serv6 3ue las hojas
desarrollaron un callo verde o verde oscuro de alrededor de D mm en los *ordes de las hojas #
3ue 1odan tener *uen o mal as1ecto.
'as hojas # tallos colocados en medios su1lementados con KE@ # @-- desarrollaron
callo en casi todas las concentraciones. 4l mejor medio 1ara hojas 0ue KE@! A mg>l! # @--! A
mg>l! donde se 0orm6 callo 3ue esta*a en *uen estado # tena J mm. 4n los tallos
introducidos! KE@ (A 6 C mg>l) con @-- (A 6 C mg>l) tuvieron callo verde o verde con *lanco
en *uen estado de J a A mm a los C. das. - los ;AD das! todos los tallos en KE@ (A mg>l) #
@-- (A mg>l) 0ormaron callos de . mm # luego se su*cultivaron en medios con TD< #
@--.
'as hojas # los tallos 1or lo general no reaccionaron al ser 1uestas en medio con s6lo
@--. 'os e71lantes 3ue s reaccionaron tuvieron un crecimiento de callo mnimo de ; mm a
los C& das en el medio. 4n T<= con o sin @--! no se o*serv6 reacci6n en las hojas
introducidas en ninguna de las com*inaciones 3ue se 1ro*6. 'a ma#ora de hojas se ha*an
hecho ca0+s entre JJ # BA das des1u+s de ha*er sido introducidas in vitro.

'..!.!. #o$as de plantas in vitro

4n las 1rue*as de B-( # @-- con car*6n activado! en las 3ue se us6
concentraciones de @-- de %.%; # %.%A mg>l! se o*serv6 3ue a los JA das todos los
e71lantes de hoja se ha*an hecho ca0+s. 4n las 1rue*as con concentraciones de @-- m5s
altas! de %.; a . mg>l! en cam*io! se o*serv6 3ue en la ma#ora de cajas esta*a creciendo
callo. 4l color de este callo varia*a entre amarillo! verde! rojo o *lanco. De manera general!
una concentraci6n alta de @-- (; a . mg>l) induce la 0ormaci6n de callos grandes ([& mm)
en m5s de la mitad de los e71lantes.
4n todas las concentraciones de Finetina sin @-- o con concentraciones *ajas de
@-- (%.%; a %.; mg>l)! las hojas no 1rodujeron callo o se 0orm6 callo en 1ocas hojas. 'os
medios 3ue contenan KE@ # %.A mg>l de @-- dieron un ma#or nMmero de callos 3ue los
medios anteriores! 1ero s6lo KE@ W $ mg>l Y @-- W %.A mg>l 1ermiti6 la 0ormaci6n de callos
de color verde oscuro # de . mm a los &J das en el medio. 4n los medios con KE@ # @--
en concentraciones iguales (; 6 D mg>l) tam*i+n se 0orm6 callo verde oscuro 1ero de menor
tamao (\ A mm). 4n general! con KE@ # $!J?D! a los $A das se vio 0ormaci6n de callo en
todos los medios 3ue se 1ro*6. Sin em*argo! 1asado este tiem1o! muchos callos en las
concentraciones altas de $!J?D (ma#or a ; mg>l)! em1e2aron a tornarse ca0+. 4n
com*inaciones de Finetina a $!J # B mg>l con $!J?D a %.; # %.A mg>l se vio un ma#or
1orcentaje de 0ormaci6n de callo # +stos eran de color *lanco # tenan *uen as1ecto.
@o se o*serv6 ninguna reacci6n en las hojas al ser colocadas en medio con T<= con
o sin @--. Se vio 3ue estas hojas se hacan ca0+s entre $; # DA das des1u+s de ha*er sido
colocadas en el medio.
'as hojas colocadas en medio con $i(! no tuvieron 0ormaci6n de callo! &C das
des1u+s de ha*er sido colocados en el medio.
'as hojas colocadas en medio con TD< s6lo o con %.$ mg>l de @-- 1or lo general se
tornaron ca0+s sin 0ormar callo o se 0orm6 callo en 1ocas hojas. 4n todos los medios con %.A
mg>l de @-- se vio 0ormaci6n de callo en la ma#ora de e71lantes. Sin em*argo! s6lo se
o*serv6 0ormaci6n de callo verde en medios 3ue contenan ;.A 6 $ mg>l de TD< en
com*inaci6n con %.A mg>l de @--. 4ste callo tena entre ; # $ mm de tamao a los &C das
en el medio.
S6lo las hojas 3ue se colocaron en medio con ; # D mg>l de @-- em1e2aron a 0ormar
un callo 1e3ueo de color ca0+ o amarillo! res1ectivamente. 4n medios con $!J?D solo! se vio
0ormaci6n de callo 1e3ueo de color *lanco o amarillo en menos de la mitad de los
e71lantes. 4l medio con ma#or 1orcentaje de 0ormaci6n de callos (A de ;% e71lantes) 0ue con
%.A mg>l de $!J?D # los callos de ma#or tamao se dieron en $!J?D W $.A mg>l.

'..!.%. &ubcultivo de callos

4n los su*cultivos de callos en B-( # @--! se vio 3ue +stos 1rogresivamente se
tornaron rojos o ca0+s # 0inalmente murieron. Solamente en B-( ; mg>l Y @-- W %.%$ mg>l
se vio crecimiento de nuevo callo *lanco en los *ordes de los callos. Todos los callos en KE@
Y @-- crecieron hasta un tamao de ;J mm! 1ero em1e2aron a tornarse ca0+s des1u+s de los
B& das en el medio. 4n los callos 3ue se su*cultivaron a T<= con @-- se vio 3ue! aun3ue
crecieran levemente (A mm)! se 0ueron tornando ca0+s 1rogresivamente.
4n medios con TD< # @--! hu*o varias com*inaciones de hormonas en las 3ue se
1rodujo callos de tamao grande (m5s de ;A mm) # de un color verde saluda*le. 'os medios
en los 3ue se 0orm6 callos de tamao m5s grande 0ueron %.; # ; mg>l de TD< en
com*inaci6n con %.$ mg>l de @--! los cuales tenan ;& mm de di5metro a los &C das en el
medio. - estos callos 0ue 1osi*le su*cultivar # seguir 1ro1agando en el mismo medio (Figura
;A).
4n todas las concentraciones de $i(! los callos crecieron hasta un tamao de & a ;A
mm. 4l medio en 3ue mejor as1ecto tenan 0ue $i( W A mg>l! donde crecieron hasta un tamao
de ;J mm # tenan un color verde saluda*le. -l hacer su*cultivos de callos verdes en medio
con D mg>l de @--! la mitad de +stos crecieron 1oco # en mal estado! mientras 3ue otros
crecieron verdes # en *uen estado.















8, Discusin

..;. Ierminaci6n in vitro de semillas de mortio

Se vio 3ue el mejor tratamiento 1ara germinaci6n de semillas! 0ue m8(" sin
tratamiento de oscuridad # con un tratamiento en 0ro de las semillas! a JRC 1or dos semanas.
(or otro lado! las semillas tratadas en 0ro! sem*radas en m8(" # con tratamiento de
oscuridad tuvieron el 1orcentaje de geminaci6n m5s *ajo. Tam*i+n se o*serv6 3ue en el
medio ;>$ "S! el cual tiene un contenido de iones di0erente al m8(" (Ta*la ;D)! tuvo un
1orcentaje de germinaci6n m5s *ajo en relaci6n al m8(".
4l tratamiento 3ue reci*ieron las semillas no in0lu#6 so*re el tiem1o 3ue demoraron
en germinar! el cual 0ue alrededor de $% das. 4l 1rocedimiento esta*lecido 1ara la
desin0ecci6n de semillas 0ue e0ica2 # se o*tuvo un m57imo de B%.CO de germinaci6n. 4l
tiem1o de germinaci6n de este estudio es m5s largo en com1araci6n con otro estudio en
lingon*err#! donde las semillas se remojaron en agua destilada antes de ser sem*radas en el
medio # demoraron J a B das en germinar (De*nath! $%%D). 4n com1araci6n! en un estudio
de PaaFola et al. ($%%;) con lingon*err# # mil*err#! en el 3ue usan un 1rotocolo de
desin0ecci6n similar al 3ue se us6 con el mortio! se o*tuvo un .%O de germinaci6n de
semillas des1u+s de $ semanas.
4l medio de cultivo 3ue se utili26 en la ma#ora de e71erimentos 0ue el m8("
(8ood# (lant "edium modi0icado). 4ste medio se 0ormul6 en *ase al medio 8ood# (lant
"edium modi0icado 1ara 1ro1agaci6n de blueberries (denominado 8("?BB en este
estudio) de =o:land 9 Kgden (;..$)! #a 3ue se utili2a comMnmente 1ara la 1ro1agaci6n del
blueberry (De*nath 9 "c=ae In Vitro! $%%;). Se calcul6 las cantidades de macronutrientes
del m8(" 3ue dieran el contenido de iones m5s 1arecido al de 8("?BB. 'a
concentraci6n de iones de los cuatro medios usados en este estudio se descri*e en la Ta*la
;D.
4l contenido de iones del medio "S es el m5s alto de los cuatro. "S! en com1araci6n
al medio 8("?BB # m8("! tiene igual concentraci6n de algunos iones mientras 3ue 1ara
otros tiene una concentraci6n hasta seis veces ma#or. 4l medio 0ormulado 1ara este estudio
tiene similares concentraciones de iones del 8("?BB! con la e7ce1ci6n de los iones cloruro
# 1otasio. -dem5s! aun3ue la concentraci6n de nitr6geno total es 1arecida! el *alance entre
nitrato # amonio es di0erente 1ara am*os medios. (or otro lado! se trat6 de emular
Mnicamente la com1osici6n de macronutrientes de 8("?BB! sin tomar en cuenta la
com1osici6n de micronutrientes # otros aditivos como la glicina. - 1esar de las di0erencias!
el medio m8(" 0ue adecuado 1ara la germinaci6n # 1ro1agacaci6n su*siguiente de las
1lantas de mortio.
4n esta investigaci6n se utili26 un 1L *ajo (A.$) # una concentraci6n de sucrosa de $%
g>l #a 3ue son 1ar5metros 3ue se utili2an comMnmente en varias es1ecies de Vaccinium
(Ion2ale2 et. al! $%%%N Tetsumura! $%%&N Cao et. al! $%%D). @o se reali26 un estudio 1ro0undo
en el 3ue se determine el e0ecto del 1L o la cantidad de a2Mcar del medio so*re la
1ro1agaci6n # crecimiento del mortio! de manera 3ue aMn no se ha determinado si estos
1ar5metros 3ue 0ueron utili2ados son los adecuados 1ara el mortio.
(ara lograr la 1ro1agaci6n del mortio se 1ro*6 di0erentes concentraciones #
com*inaciones de hormonas #a 3ue se vio 3ue no sera 1osi*le 1ro1agar las 1lantas
germinadas en medio *asal sin hormonas. Se o*serv6 3ue muchas 1lantas 3ue se
mantuvieron en este medio no crecieron # 0inalmente murieron. Se encontr6 3ue la mejor
o1ci6n 1ara incrementar el nMmero de 1lantas # esta*lecer el cultivo in vitro a 1artir de
semillas 0ue usar ; mg>l de trans?2eatina ri*6side (T<=) o en com*inaci6n con %.%A mg>l de
@--.
4n ensa#os iniciales! se 1ro*6 com*inaciones de B-(! @--! I-
D
o T<= con I-
D
a
1artir de semillas germinadas. Con estas com*inaciones de hormonas! aun3ue s se hu*o
1lantas de mortio 3ue se elongaron o 3ue se rami0icaron! +stas no tenan un as1ecto
saluda*le. 4n algunos casos! las 1lantas desarrollaron hojas su1eriores de color rojo # no
continu6 el crecimiento. 4n otros casos se o*tuvo elongaci6n! 1ero 1oca rami0icaci6n #
crecimiento de 1lantas demasiado delgadas. 4n un estudio con Vaccinium no se logr6
esta*lecer cultivos a 1artir de semillas utili2ando B-( # @-- (PaaFola et al.! $%%;).
Ion2ale2 et al. ($%%%) o*servaron 3ue el I-
D
tiene un e0ecto negativo 1ara la multi1licaci6n
de Vaccinium. Con el mortio! s ocurri6 una multi1licaci6n moderada o *rotaci6n de #emas
con estas hormonas 1ero no un *uen crecimiento de las 1lantas.
4n este estudio se 1ro*6 T<= 1ara la 1ro1agaci6n de 1lantas germinadas! en ve2 de
$i( como lo hi2o (ereira ($%%B) con V. cylandraceum # PaaFola et al. ($%%;) con el
lingon*err# # mil*err#. Sin em*argo! tanto $i( como T<= son cito3uininas 3ue
1ro*a*lemente tienen un e0ecto de reducir la dominancia a1ical 0uerte 3ue es caracterstica de
varias es1ecies de Vaccinium! 1ermitiendo as el desarrollo de las #emas a7ilares (De*nath #
"c=ae In Vitro! $%%;N De*nath # "c=ae An (fficient! $%%;).
4ntre los 1rotocolos 1ara 1ro1agar es1ecies de Vaccinium generalmente se utili2a
s6lo 2eatina (De*nath Influence of! $%%BN Tetsumura et al.! $%%&)! s6lo $i( (De*nath 9
"c=ae In Vitro! $%%;N @o+ 9 4ccher! ;..JN @o+ et al.! ;..&) o una com*inaci6n de los dos
(Cao et al.! ;..&N Cao 9 Lammerschlag! $%%%). La# 1ocos autores 3ue em1leen tam*i+n una
au7ina como 1arte del 1rotocolo de la 1ro1agaci6n de Vaccinium ("einers! $%%C). 'os
1rotocolos de otros estudios con Vaccinium no son totalmente a1lica*les al mortio # 0ue
necesario o1timi2ar el medio # hormonas usados 1ara su 1ro1agaci6n. Con el mortio! se vio
una 1ro1agaci6n 61tima # r51ida al usar medios 3ue contenan T<= # @--. 4n estos medios
se o*tuvo menor elongaci6n 3ue en medios con $i(. Ion2ale2 ($%%%)! o*serv6 resultados
similaresQ a*undante 1ro1agaci6n en Vaccinium 1ero inhi*ici6n de elongaci6n al utili2ar
2eatina.
'a ra1ide2 de multi1licaci6n de 1lantas de mortio en $i( aumenta*a a medida 3ue se
aument6 la concentraci6n de la hormona hasta A mg>l! 1ero se o*tuvo una menor elongaci6n
en esta concentraci6n. -un3ue eran menos rami0icadas 3ue 1lantas en T<= Y @--! las
1lantas en D mg>l de $i(! se elongaron m5s # tenan mejor as1ecto en general #a 3ue
crecieron ro*ustas # con hojas verdes de ma#or tamao. 4sto concuerda con resultados en
lingon*err# # cran*err# en los 3ue se vio ma#or tamao # vigor de las 1lantas mantenidas en
medios con $i( (De*nath 9 "c=ae In vitro! $%%;N De*nath 9 "c=ae! $%%A).

..$. Entroducci6n in vitro de #emas a7ilares de mortio

Con el 1rotocolo de desin0ecci6n 3ue se us6 en este estudio! se o*serv6 un 1orcentaje
de contaminaci6n alto. Una estrategia 1ara manejar este 1ro*lema 0ue colocar los segmentos
de tallo en 0rascos de J ml se1arados 1ara aislar a los contaminados. Tetsumura et al. ($%%&)
tam*i+n o*servaron un 1orcentaje de contaminaci6n alto de hasta J%O! utili2ando e71lantes
de 1lantas mantenidas en un es1acio a*ierto. Ktros autores o*servaron un 1orcentaje de
contaminaci6n de hasta ;%O! 1ero utili2aron 1lantas mantenidas en el invernadero (De*nath
9 "c=ae In Vitro! $%%;). 'os e71lantes de mortio se o*tuvieron de 1lantas silvestres
creciendo en su h5*itat natural! lo cual 1odra e71licar el alto 1orcentaje de contaminaci6n
3ue se o*serv6.
4n esta investigaci6n se estudi6 la in0luencia de la 1arte del tallo de donde se e7trajo
el e71lante # de reguladores de crecimiento so*re el 1orcentaje de esta*lecimiento de
cultivos in vitro a 1artir de #emas a7ilares de mortio. Se vio 3ue solo 0ue e7itosa la
introducci6n de #emas a7ilares al usar los segmentos e7trados de la 1arte su1erior del tallo!
los cuales contienen mMlti1les #emas en un e71lante de ; cm. 4n los e71lantes 3ue no
corres1ondan al e7tremo su1erior de la estaca! no se o*serv6 crecimiento! o se dio un
crecimiento estancado! 3ue no su1er6 los Amm de largo! sin im1ortar el tratamiento usado.
'os tallos en los 3ue no se o*serv6 crecimiento se tornaron ca0+s 1rogresivamente!
1resumi*lemente 1or la o7idaci6n de com1uestos 0en6licos 3ue li*eran los tejidos heridos
(De*nath! $%%&).
4n este estudio se vio 3ue de DB e71lantes introducidos con $i( con o sin @--! s6lo
en $ e71lantes en $i( (A mg>l) se o*serv6 crecimiento de las #emas. 'os dem5s e71lantes
murieron antes de los C% das des1u+s de ha*er sido introducidos in vitro. 4n cam*io! usando
T<= (;mg>l # Cmg>l) en com*inaci6n con @-- (%.; mg>l) se o*serv6 a*undante *rotaci6n
de #emas 3ue! al ser su*cultivadas a medios con $i( (D 6 A mg>l)! comen2aron a multi1licarse
r51idamente. La# varios estudios con Vaccinium en los 3ue el cultivo se esta*leci6 en
medios con 2eatina # 1osteriormente se 1as6 a medios con $i( 1ara la multi1licaci6n
(De*nath 9 "c=ae In Vitro! $%%;N Ionale2 et al.! $%%%N =eed 9 -*delnour?4s3uivel! ;..;).
-lgunos autores recomiendan utili2ar $i( en el esta*lecimiento # en la 1ro1agaci6n
de es1ecies de Vaccinium! mientras otros recomiendan usar 2eatina en las 1rimeras 0ases de
iniciaci6n o multi1licaci6n # luego 1asar a medios con $i( antes de enrai2ar. 'a ra26n 1or
esto es 3ue la 2eatina es una hormona mu# cara como 1ara usarla regularmente # el $i(
1uede mejorar el as1ecto de las 1lantas 3ue se han 1ro1agado en 2eatina (PaaFola et al.! $%%;!
De*nath 9 "c=ae In Vitro, $%%;). Con el mortio 0ue necesaria la utili2aci6n de trans
2eatina ri*6side 1ara la 0ase de iniciaci6n! de*ido a 3ue el 1orcentaje de iniciaci6n utili2ando
s6lo $i( 0ue mu# *ajo. Como un segundo 1aso en el esta*lecimiento del cultivo! 0ue
necesario 1asar las #emas 3ue *rotaron en T<= Y @-- a medios con $i( 1ara 1ermitir una
elongaci6n de las 1lantas.

..D. 4longamiento! enrai2amiento # aclimataci6n

4n la literatura! 1ara varios cultivos de Vaccinium! se lleva a ca*o un 1roceso de
aclimataci6n 3ue dura entre $ semanas a $ meses (De*nath 9 "c=ae In Vitro! $%%;N @o+ 9
4ccher! ;..J). 4n los e71erimentos llevados a ca*o con el mortio! se demor6 un mes #
medio hasta casi tres meses en aclimatar las 1lantas. Durante este tiem1o! muchas 1lantas
murieron 1or3ue se secaron # otras 1or contaminaci6n de la tierra al hacer huecos en el
1l5stico. 4sta contaminaci6n a0ect6 a varias 1lantas 3ue tenan *uen as1ecto durante el
1roceso de aclimataci6n. 'as 3ue so*revivieron el 1roceso de aclimataci6n! al 1asarlas a
0undas 1l5sticas con tierra murieron enseguida o so*revivieron hasta D% das des1u+s.
Se logr6 una 1ro1agaci6n e0ica2 del mortio en el medio m8(" al utili2ar las
hormanas adecuadas. 4s 1osi*le 3ue las condiciones del cultivo in vitro no sean las
adecuadas aMn #a 3ue la 1lantas o*tenidas no se 1udieron aclimatar. 'as 1l5ntulas o*tenidas
in vitro eran mu# delgadas # con hojas 1e3ueas! con una mor0ologa di0erente a las 1lantas
de mortio 3ue crecen en la naturale2a. -l o*servar cortes de tallos con races adventicias
*ajo un microsco1io 61tico! se 1udo ver 3ue las races s tienen cone7iones vasculares. Sin
em*rago! no se distingui6 alguna di0erencia entre cortes de tallo de 1lantas cu#as races
ha*an sido sumergidas en colorante a2ul # el control negativo! 1osi*lemente sugiriendo 3ue
las races no son 0uncionales.
Se ha re1ortado 3ue las 1lantas cultivadas in vitro tienen una mala conductividad
hdrica en las races! # 3ue no ha# cone7iones adecuadas entre la ra2 # el tallo. 4l mal
trans1orte de agua! junto a una mala retenci6n de agua de las hojas! 1uede llevar a 3ue +stas
se se3uen r51idamente ((os1Silov5! ;...). 4n varios re1ortes! se logra el enrai2amiento #
aclimataci6n de 1lantas en un mismo sustrato (Ionale2 et al.! $%%%)! 1ero en esta
investigaci6n con el mortio! se reali26 el enrai2amiento in-vitro # aclimataci6n en 0ases
se1aradas. Sin em*argo! es 1osi*le 3ue el m+todo usado 1ara enrai2ar las 1lantas de mortio
no sea adecuado! #a 3ue no se ha o*tenido ningMn resultado 1ositivo en la aclimataci6n hasta
el momento.

..J. 4nsa#os de regeneraci6n # 0ormaci6n de callo a 1artir de e71lantes de hoja
o tallo

La# re1ortes de regeneraci6n directa en e71lantes de hoja en medios con 2eatina!
2eatina ri*6side! $i( o TD< (De*nath! $%%B) #! con la 0inalidad de o*servar regeneraci6n
adventicia! se tom6 en cuenta las di0erentes concentraciones de hormonas 3ue 1ermitieron
regeneraci6n en otras es1ecies de Vaccinium. -s! en el mortio se 1ro*6 concentraciones de
; a . mg>l de T<=! ; a . mg>l de $i( # %.; a $ mg>l de TD< en e71lantes de hojas #>o tallos!
en *ase a los rangos de hormonas usados 1or otros autores (Cao 9 Lammerschlag! $%%%N
De*nath! $%%B). Tam*i+n se 1ro*6 varias com*inaciones de @-- con T<= o TD< # otras
hormonas no re1ortadas en la literatura como la Finetina o el $!J?D. Sin em*argo! no se
o*tuvo los resultados es1erados en estos ensa#os! # las hojas se torna*an ca0+s o 0orma*an
callo! 1ero no regeneraron retoos adventicios.
'os ensa#os de regeneraci6n con hojas o tallos introducidos in vitro no dieron
resultados *uenos #a 3ue +stos se murieron enseguida! o des1u+s de varias semanas. 4sto
1resumi*lemente se de*e a 3ue el 1aso de desin0ecci6n era demasiado 0uerte 1ara el e71lante!
a 1esar de 3ue no se logr6 eliminar 1or com1leto la contaminaci6n. Se us6 5cido ctrico #
medios con car*6n activado 1ara tratar de evitar 3ue los e71lantes se hagan ca0+s! # se vio
0ormaci6n de callo en los *ordes de los e71lantes! 1ero no se o*serv6 regeneraci6n de
retoos.
@o ha# estudios 3ue investiguen es1ec0icamente la inducci6n de callo o su*cultivo
de +ste en es1ecies de Vaccinium. Se re1orta 3ue! al usar concentraciones altas de
cito3uininas 1ara la 1ro1agaci6n! A mg>l de $i( 6 $.A mg>l de 2eatina en el caso del
lingon*err# (De*nath 9 "c=ae! In Vitro $%%;)! 6 %.&& mg>l de 2eatina en el caso del
*lue*err# (De*nath! $%%J)! se 1uede 0ormar callos con *rotes adventicios en la *ase de los
retoos. 4n los ensa#os de 1ro1agaci6n del mortio! se o*serv6 0ormaci6n de callo 1ero no
regeneraci6n de retoos en las *ases de las 1lantas en medios 3ue contenan @--. Se re1orta
tam*i+n 3ue la 1resencia de TD< o de au7inas causa 0ormaci6n de callo en e71lantes de hoja
(Denath! $%%BN "einers $%%C). 4n e71lantes de mortio! en cam*io! los medios 3ue dieron
altos 1orcentajes de inducci6n de callo 0ueronQ B-( Y @--! KE@ Y $!J?D! KE@ Y @-- #
TD< Y @--.
/<, Conclusiones

4n este tra*ajo se 1ro1one varias estrategias 3ue 1ueden ser utili2adas 1ara el
esta*lecimiento de cultivos in vitro del mortio. (or un lado! se demostr6 3ue es 1osi*le
introducir semillas in vitro #! a trav+s de su*cultivos en medios con reguladores de
crecimiento! lograr 3ue las 1lantas se multi1li3uen r51idamente. Tam*i+n se descri*e un
m+todo 1ara la introducci6n in vitro de #emas a7ilares! donde es necesario una alta
concentraci6n de cito3uininas 1ara iniciar el crecimiento.
Se determin6 3ue un tratamiento adecuado 1ara la germinaci6n de semillas 0ue
mantenerlas en 0ro 1or dos semanas! sem*rarlas en el medio m8(" # mantenerlas *ajo lu2.
Un medio 3ue contena ; mg>l de T<= # %.%A mg>l de @-- 0ue el adecuado 1ara *rotaci6n
de #emas # 1ara mantener una 1ro1agaci6n continua del mortio en su*cultivos 1osteriores.
(ara el elongamiento # enrai2amiento de 1lantas 1ro1agadas en T<= Y @--! se las
su*cultiv6 a medios con D mg>l de $i( o a un medio *asal m8(" o ;>$ "S sin hormonas.
Lasta el momento! no se ha logrado estandari2ar un 1rotocolo e0iciente 1ara la aclimataci6n
de las 1lantas de mortio. 4n las 1rue*as de aclimataci6n! muchas 1lantas se hicieron ca0+s #
murieron enseguida! otras murieron 1or contaminaci6n de la tierra! # otras so*revivieron el
1roceso de aclimataci6n 1ero se secaron des1u+s de ser 1asadas a 0undas.
Se logr6 esta*lecer un 1rotocolo 1ara la introducci6n in vitro de #emas a7ilares de
mortio. Fue necesario usar Mnicamente e71lantes 1rovenientes del e7tremo su1erior de los
tallos en crecimiento en los 3ue se vea claramente 3ue ha# crecimiento a1ical. 'as #emas
a7ilares *rotaron al colocar el e71lante en medio con C mg>l de T<= # %.; mg>l de @-- # se
su*cultivaron a medios con D 6 A mg>l de $i(! los cuales 1ermitieron un desarrollo #
multi1licaci6n 1osterior de las #emas.
@o se 1udo determinar un m+todo 3ue 1ermita la regeneraci6n de retoos adventicios.
4n algunas com*inaciones de hormonas utili2adas! se dio 0ormaci6n de callo 1ero no se
o*serv6 regeneraci6n de *rotes adventicios. 4l color del callo varia*a entre *lanco! amarillo!
rojo # verde. Un medio con $ mg>l de KE@ Y %.A mg>l de @-- o con ;.A 6 $ mg>l de TD< Y
%.A mg>l de @-- 1ermiti6 la inducci6n de callo. (ara el su*cultivo de callos! un medio con A
mg>l de $i( o con %.; 6 ; mg>l de TD< Y %.$ mg>l de @-- 1ermiti6 el crecimiento de callos
verdes con *uen as1ecto.
//, !ecomendaciones

'os resultados o*tenidos en esta investigaci6n 1ueden servir como una *ase 1ara el
esta*lecimiento de un 1rotocolo de 1ro1agaci6n del mortio 1or cultivo in vitro. Sin
em*argo! a 1esar de 3ue se logr6 esta*lecer el cultivo in vitro! es necesario mejorar algunos
as1ectos de la t+cnica! en es1ecial en lo 3ue se re0iere al as1ecto general de las 1lantas. De lo
1osi*le! sera 61timo encontrar las condiciones 3ue 1ermitan el crecimiento de una 1lanta
m5s ro*usta # menos delgada! con hojas m5s grandes # un sistema de races m5s gruesas 3ue
salgan desde la *ase de la 1lanta! con el o*jetivo de lograr su aclimataci6n.
-lgunas estrategias 3ue se 1odra 1ro*ar 1ara lograr este o*jetivo sera variar la
concentraci6n de sucrosa o el 1L del medio! as como continuar investigando di0erentes
medios *asales 3ue 1odran mejorar el as1ecto general de la 1lanta. 4sto es necesario #a 3ue
las 1lantas de mortio! 3ue crecen *ien in vitro! no se ada1tan nuevamente a condiciones ex
vitro en la 0ase de aclimataci6n. Se recomendara tam*i+n *uscar di0erentes m+todos de
enrai2amiento de las 1lantas! #a 3ue es 1osi*le 3ue +stas no tengan una cone7i6n ra2?tallo
adecuada! lo cual im1edira la toma de agua # nutrientes del suelo.
4n la introducci6n in vitro de #emas a7ilares! se 1odra 1ro*ar varias concentraciones
alrededor de C mg>l de 2eatina! con el 0in de mejorar el 1orcentaje de *rotaci6n de #emas
a7ilares.
Ua 3ue las 1rue*as de regeneraci6n no dieron *uenos resultados! sera 1osi*le
investigar si 1lantas de di0erentes localidades del 1as tendran di0erentes resultados. Ktra
estrategia sera desarrollar un m+todo de 1ro1agaci6n in vitro en el 3ue las 1lantas tengan
hojas m5s grandes # m5s adecuadas 1ara 1rue*as de regeneraci6n # luego 1ro*ar otros
medios o 1retratamientos descritos en la literatura en la regeneraci6n de es1ecies de
Vaccinium (Cao 9 Lammerschlag! $%%$).




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