Cap 12

12.1 TIPOS DE CULTIVO DE CLULAS PRIMARIAS

Un cultivo primario ! "u la tapa # cultivo #!pu$! # ai!laminto # la! c$lula!%
pro ant! # "u l primr !u&cultivo. 'a( cuatro tapa! a con!i#rar) *1+ la
a#"ui!ici,n # la mu!tra% *2+ # ai!laminto # lo! t-i#o!% *.+ # #i!cci,n ( / o
#!a0r0aci,n% ( *1+ la cultura #!pu$! # la !im&ra n l rcipint # cultivo.
D!pu$! #l ai!laminto% un cultivo clular primario ! pu# o&tnr (a !a por
prmitin#o "u la! c$lula! mi0rn a ca&o a partir # 2ra0mnto! # t-i#o a#3ri#o a
un !u!trato a#cua#o o m#iant la #!a0r0aci,n #l t-i#o mc4nicamnt o
n5im4ticamnt para pro#ucir una !u!pn!i,n # c$lula!% al0una! # la! cual! va a
a#-untar n 6ltima in!tancia al !u!trato . S parc !r !ncial para la ma(or7a # la!
c$lula! no tran!2orma#a! normal!% con la 8cpci,n # la! c$lula! 3matopo($tica!%
para 2i-ar a una !upr2ici plana con l 2in # !o&rvivir ( proli2rar con la m48ima
2icincia. La! c$lula! tran!2orma#a! *vr Scci,n 19.:.1+% por otro la#o%
particularmnt c$lula! # tumor! tra!planta&l! animal!% a mnu#o !on capac! #
proli2rar n !u!pn!i,n.
La! n5ima! utili5a#a! con ma(or 2rcuncia para la #i!0r0aci,n #l t-i#o !on
prparacion! cru#a! # trip!ina % cola0na!a % la!ta!a% prona!a % #i!pa!a % AD;a!a
( 3ialuroni#a!a % !olo
o n #ivr!a! com&inacion! % por -mplo % la la!ta!a ( la D;a!a para l tipo II #
ai!laminto # c$lula! alvolar! < Do&&! ( =on54l5 % 2>>2 ? % cola0na!a con
#i!pa!a < ca&ina ( O@S3a % 2>>2 ? % ( la cola0na!a con 3ialuroni#a!a < Arr( ( Brin#%
1CDC E S0ln % 1CF: ? . 'a( otra! % la! n5ima! no mam72ro! % como Tr(p5an *Si0ma
+ % un rcom&inant % ma75 #riva#o % trip!ina % Tr(pLE * Invitro0n +% micro&iana
rcom&inant ( Accuta! ( Accuma8 * Innovativ Cll Tc3nolo0i! +% tam&i$n
#i!poni&l! para la #i!0r0aci,n primaria. Prparacion! cru#a! !on a mnu#o m4!
$8ito "u la! prparacion! # n5ima! puri2ica#a! % por"u lo! primro! continn
otra! prota!a! como contaminant! % aun"u !to! 6ltimo! !on 0nralmnt mno!
t,8ico! ( m4! !pc72ico! n !u acci,n . La trip!ina ( prona!a #an la #!a0r0aci,n
m4! complta % pro pu#n #aGar la! c$lula!. La cola0na!a ( #i!pa!a % por otro la#o
% #an #!a0r0aci,n incomplta % pro !on mno! nocivo! . La 3ialuroni#a!a pu#
!r utili5a#o n con-unci,n con cola0na!a para #i0rir la matri5 intraclular % ( D;a!a
! utili5a para #i!pr!ar l AD; li&ra#o # la! c$lula! li!a#a! E AD; tin# a
#triorar la prot,li!i! ( promovr ra0r0aci,n * v$a! la Ta&la 1..1+.
Aun"u ca#a t-i#o pu# r"urir un con-unto #i2rnt # con#icion!% cirto!
r"ui!ito! !on comparti#a! por la ma(or7a # llo!)
*1+ La 0ra!a ( l t-i#o ncr,tico ! liminan m-or #urant la #i!cci,n.
*2+ El t-i#o #& !r corta#a 2inamnt con 2urt in!trumnto! "u cau!n l m7nimo
#aGo.
*.+ La! n5ima! utili5a#a! para la #i!0r0aci,n ! #& "uitar po!triormnt por
cntri2u0aci,n !uav.
*1+ La concntraci,n # c$lula! n l cultivo primario #& !r muc3o ma(or "u la
u!a#a normalmnt para l !u&cultivo% por"u la proporci,n # la! c$lula! #l t-i#o
"u
!o&rviv n cultivo primario pu# !r &a!tant &a-o.
*:+ Un m#io rico% tal! como B12 # 'am% ! pr2ri&l a una m#io !impl% tal como
MEM # Ea0l% (% !i l !uro S r"uir% &ovino 2tal a mnu#o #a una m-or
!uprvivncia "u lo!
3ac pantorrilla o l ca&allo. Ai!laminto # tipo! clular! !pc72ico! !
pro&a&lmnt r"uirn m#io! !lctivo! *vr !cci,n 1>.2.1 ( Cap7tulo 2.+.
*D+ #!a0r0a m&rionaria! # t-i#o con ma(or 2acili#a#% #a m4! c$lula! via&l!% (
proli2ra m4! r4pi#amnt n primaria cultura "u l t-i#o a#ulto.
12%2 AISLAMIE;TO DEL TEHIDO
Ant! # tratar # tra&a-ar con l t-i#o 3umano o animal % a!06r! # "u !u
tra&a-o ! a-u!ta a la! norma! # $tica m$#ica o la l0i!laci,n vi0nt n la
8primntaci,n con animal! * v$a! la Scci,n F.C.1 + . Por -mplo% n l Rino
Uni#o% l u!o # m&rion! o 2to! m4! all4 # :> I # 0!taci,n o incu&aci,n !t4
r0ula#o n lo! E8primnto! con Animal! *Proc#iminto! Cint72ico!+ # la L( #
1C9D . Tra&a-ar con &iop!ia! 3umana! o matrial 2tal por lo 0nral r"uir l
con!ntiminto #l comit$ # $tica local ( l pacint ( / o !u! 2amiliar! * v$a! la
Scci,n F.C.2 + .
;ota J S0uri#a# . Tra&a-ar con lo! t-i#o! 3umano! #& llvar! a ca&o a nivl #
contnci,n 2 n una ca&ina # !0uri#a# &iol,0ica # cla! II * v$a! la Scci,n
F.9.. + .
Un intnto ! #& 3acr para !trili5ar l !itio # la r!cci,n con alco3ol al F>I !i
l !itio ! pro&a&l "u !t$n contamina#o! *por -mplo % la pil+ . Rtir l t-i#o #
2orma a!$ptica ( tran!2rirlo al la&oratorio # cultivo # t-i#o! n ASS #i!cci,n
* DASS + o m#io # tran!port *v$a! l Ap$n#ic I+ tan pronto como !a po!i&l. ;o
#i!ccionar animal! n l la&oratorio # cultivo # t-i#o! % (a "u lo! animal!
pu#n llvar a la contaminaci,n micro&iana. Si la #mora n la tran!2rncia # t-i#o
! invita&l% pu# mantnr! a 1 K C #urant F2 3 % a p!ar # un m-or
rn#iminto !ul !r l r!ulta#o # una tran!2rncia m4! r4pi#a .
12.2.2 m&ri,n # pollo
Lo! m&rion! # pollo !on m4! 24cil! # #i!ccionar% (a "u !on m4! 0ran#! "u
lo! m&rion! # rat,n n la 2a! # #!arrollo "uivalnt. Al i0ual "u lo! m&rion!
# rat,n% m&rion! # pollo ! utili5an para proporcionar cultivo! primario! # c$lula!
m!n"uimal! pr#ominantmnt para l an4li!i! # la proli2raci,n clular% para
proporcionar capa! # alimntaci,n% ( como un !u!trato para la propa0aci,n viral.
D&i#o a !u tamaGo m4! 0ran#% ! m4! 24cil para #i!ccionar ,r0ano! in#ivi#ual!
para 0nrar tipo! !pc72ico! # c$lula!% tal! como 3patocito!% m6!culo car#7aco% (
l pitlio pulmonar. Al i0ual "u con m&rion! # rat,n% la utili5aci,n # m&rion!
# pollo pu# !tar !u-to a la l0i!laci,n # lo! animal! *por -mplo% n l Rino
Uni#o+ ( l tra&a-o con lo! m&rion! "u !on m4! # m#io pla5o pu# r"urir una
licncia.
12.2.. 'umano matrial # &iop!ia
Man-o # matrial # &iop!ia 3umana pr!nta cirto! pro&lma! "u no !
ncuntran con l t-i#o animal. Por lo 0nral% ! nc!ario o&tnr l con!ntiminto
* 1 + #!# l comit$ # $tica #l 3o!pital % * 2 + por part #l m$#ico o ciru-ano a car0o
% ( *. + #l #onant o #l pacint o 2amiliar! #l pacint * vr !cci,n F.C.2 + .
A#m4! % l mu!tro # &iop!ia ! rali5a 0nralmnt para 2in! # #ia0n,!tico % (
por lo tanto la! nc!i#a#! # la pat,lo0o #& cumplir! primro . E!t 2actor ! un
pro&lma mnor !i la r!cci,n "uir6r0ica 8tn!a o t-i#o no patol,0ico *por -mplo %
la placnta o l cor#,n um&ilical+ !t4 involucra#o .
La opraci,n ! rali5a a mnu#o por un mim&ro #l pr!onal r!i#nt n un
momnto n "u no !impr ! convnint para l la&oratorio # cultivo # t-i#o! %
por lo "u al06n !i!tma # rco0i#a o almacnaminto 2ormal #& !r mpla#o
para lo! momnto! n "u u!t# o al0uin n !u pr!onal no pu# !tar all7 . Si la
ntr0a # !u la&oratorio !t4 #i!pu!to % ntonc! #& 3a&r un !i!tma #
rcpci,n # mu!tra! % r0i!tran#o lo! #tall! # la 2unt % l t-i#o # ori0n %
patolo07a% tc * vr Scci,n 12...11 + % ( alrtan#o a la pr!ona "u llvar4 a ca&o la
cultura "u lo! !pc7mn! 3an ll0a#o E # lo contrario % matrial valio!o ! pu#
pr#r o !tropa#o .
;ota J S0uri#a# . Matrial # &iop!ia 3umana conllva un ri!0o # in2cci,n * v$a!
la Scci,n F.9.. + % por lo "u #& !r man-a#o &a-o nivl # contnci,n 2 n un
0a&int # ri!0o &iol,0ico # Cla! II% ( to#o! lo! m#io! # comunicaci,n (
aparato! #&n !r #!in2cta#o! #!pu$! # !u u!o n autoclav o inmr!i,n n un
#!in2ctant a#cua#o * v$a! la Scci,n F.9.: + . El t-i#o #& !r 8amina#o para
in2ccion! a#vnticia! como la 3patiti! % l VI' ( la tu&rculo!i! < n lo! E!ta#o!
Uni#o! % l Dpartamnto # Salu# ( Srvicio! 'umano!% 1CC. EE.UU. E n l Rino
Uni#o % l Comit$ a!!or !o&r pat,0no! pli0ro!o! % 1CC:& ? a mno! "u l
pacint (a 3a !i#o pro&a#o para !ta! in2ccion! .
12%. cultivo primario
Varia! t$cnica! ! 3an #i!Ga#o para la #!a0r0aci,n # lo! t-i#o! ai!la#o! #
cultivo primario. E!ta! t$cnica! ! pu#n #ivi#ir n *1+ la! t$cnica! puramnt
mc4nico!% "u implica la #i!cci,n con o !in al0una 2orma # macraci,n% ( *2+ la
utili5aci,n # la! t$cnica! # #!a0r0aci,n n5im4tica *2i0. 12.:+. E8plant! primario!
!on a#cua#o! para canti#a#! mu( p"uGa! # t-i#oE #!a0r0aci,n n5im4tica #a
un m-or rn#iminto cuan#o m4! t-i#o !t4 #i!poni&l% ( #!a0r0aci,n mc4nica
2unciona &in con lo! t-i#o! &lan#o!% ( al0uno! t-i#o! m4! 2irm! cuan#o l tamaGo
#l rn#iminto via&l no ! important.
12...1 8plant primario
La t$cnica # 8plant primario 2u l m$to#o ori0inal #!arrolla#o por 'arri!on <1C>F?%
Carrl <1C12?% ( otro! para iniciar un cultivo # t-i#o!. Como rali5a#o ori0inalmnt%
un 2ra0mnto # t-i#o ! m&&i, n l pla!ma !an0u7no o lin24tico% m5cla#o con
!uro 3tr,lo0o ( 8tracto # m&ri,n% ( ! coloca n un cu&ro&-to! "u ! invirti,
!o&r un portao&-to! # concavi#a#. El pla!ma coa0ula#o llv, a ca&o l t-i#o n !u
lu0ar% ( l 8plant ! po#r7a 8aminar con un micro!copio convncional. El !uro
3tr,lo0o in#uci#a coa0ulaci,n #l pla!ma% ( l 8tracto # m&ri,n ( l !uro% -unto
con l pla!ma% ! !umini!tra nutrint! ( 2actor! # crciminto ( !timula#o la
mi0raci,n # c$lula! #l 8plant. E!ta t$cnica ! to#av7a ! utili5a% pro 3a !i#o
rmpla5a#o n 0ran m#i#a por l m$to#o !impli2ica#o #!crito n l Protocolo #
12%1
E!ta t$cnica ! particularmnt 6til para p"uGa! canti#a#! # t-i#o % como
&iop!ia! # la pil % para lo! "u 8i!t un ri!0o # pr#r c$lula! #urant la
#!a0r0aci,n mc4nica o n5im4tica . Su! #!vnta-a! ra#ican n la mala
a#3!ivi#a# # al0uno! t-i#o! ( la !lcci,n # la! c$lula! n la con!cuncia . En la
pr4ctica % !in m&ar0o % la ma(or7a # la! c$lula! % n particular m&rionario% mi0ran a
ca&o con $8ito.
Colocaci,n # 8plant! . Tanto la a#3!i,n ( la mi0raci,n pu#n !r !timula#a!
m#iant la colocaci,n # un cu&ro&-to! # vi#rio n la part !uprior #l 8plant %
con l 8plant crca #l &or# #l cu&ro&-to! % o l plato # pl4!tico pu# !r
ra(a#o a trav$! #l 8plant para 2i-ar l t-i#o al matra5 < Elli0t ( Lc3nr % 1CC2 ?
* v$a! l Protocolo 2.%C + . A#-unto tam&i$n pu# !r promovi#a por l trataminto
# la # pl4!tico con polili!ina o 2i&ronctina * v$an! la! Sccion! 9.1.11 % 1>.1.: %
11.2.1 + % la matri5 8traclular * v$a! l protocolo 9.1 + % o capa! # alimntaci,n * vr
Protocolo 11%. + . 'i!t,ricamnt % co40ulo! # pla!ma ! 3an u!a#o para promovr la
uni,n . Colo"u una 0ota # pla!ma n la !upr2ici # pl4!tico % incru!tar l
8plant n lla. E!to #&r7a in#ucir a la !an0r coa0ular! n uno! poco! minuto! %
! pu# aGa#ir #!pu$! # lo cual m#io. Altrnativamnt % l 2i&rin,0no ( trom&ina
puri2ica#a ! pu# utili5ar < ;ico!ia ( Ottintti % 1CC> ?
12...2 La #!a0r0aci,n n5im4tica
La a#3!i,n c$lulaL c$lula n lo! t-i#o! !t4 m#ia#o por una vari#a# #
0licop$pti#o! 3omot7pico! "u intract6an *mol$cula! # a#3!i,n clular% o CAM +
* v$a! la Scci,n ..2.1 + % al0uno! # lo! cual! !on #pn#int! # calcio
* ca#3rina! + ( por lo tanto !on !n!i&l! a lo! a0nt! "ulant! tal! como EDTA o
E=TA . La! int0rina! % "u ! unn al motivo # amino4ci#o! ar0inina L 0licina L
a!p4rtico * R=D + n la matri5 8traclular % tam&i$n tinn #ominio! # uni,n a Ca2 M
( ! vn a2cta#o! por l a0otaminto # Ca2 M . Mm&rana! # matri5 ( !,tano
intrclular! continn otra! 0licoprot7na! % tal! como la 2i&ronctina ( la laminina %
"u !on !n!i&l a la prota!a % ( proto0licano! % "u !on mno!% pro a vc!
pu#n !r #0ra#a#o! por 0licana!a! % tal! como 3ialuroni#a!a o 3parina!a . El
n2o"u m4! !ncillo ! para proc#r a partir # una !oluci,n # #!a0r0aci,n
!impl a una !oluci,n m4! compl-a * v$a! la Ta&la 1..1 + con trip!ina !olo o
trip!ina / EDTA como un punto # parti#a % la a#ici,n # otra! prota!a! para m-orar
la #!a0r0aci,n % ( liminaci,n # trip!ina !i ! nc!ario para aumntar la
via&ili#a# . En 0nral % l aumnto # la pur5a # una n5ima #ar4 un m-or control
( mno! to8ici#a# con ma(or !pci2ici#a# % pro pu# r!ultar n una mnor
activi#a# #!a0r0aci,n .
D!a0r0aci,n mc4nica ( n5im4tica #l t-i#o vita lo! pro&lma! # !lcci,n por
la mi0raci,n ( ! o&tin un ma(or n6mro # c$lula! "u !on m4! rpr!ntativo! #
to#o l t-i#o n un timpo m4! corto . Sin m&ar0o % al i0ual "u la t$cnica #
8plant primario !lcciona !o&r la &a! # la mi0raci,n # c$lula! % la! t$cnica! #
#i!ociaci,n !lccionar4n la! c$lula! r!i!tnt! al !tr$! mc4nico! prota!a L ( .
T-i#o m&rionario ! #i!pr!a m4! 24cilmnt ( #a un rn#iminto m4! alto # c$lula!
proli2rant! "u l t-i#o rci$n naci#o o un a#ulto . El aumnto # #i2iculta# n la
o&tnci,n # c$lula! proli2rant! via&l! con l aumnto # la #a# ! #& a vario!
2actor!% inclu(n#o l inicio # la #i2rnciaci,n % un aumnto n l t-i#o conctivo
2i&ro!o ( matri5 8traclular % ( una r#ucci,n # la pi!cina # c$lula! proli2rant!
in#i2rncia#a . Cuan#o ! r"uirn proc#iminto! # ma(or !vri#a# #
#!a0r0ar l t-i#o *por -mplo % trip!ina m4! lar0o o aumnto # la a0itaci,n + % lo!
componnt! m4! 2r40il! #l t-i#o pu#n !r #!trui#o! . En lo! tumor! 2i&ro!o! %
por -mplo % ! mu( #i27cil o&tnr la #i!ociaci,n complta con trip!ina al timpo "u
con!rva la! c$lula! # carcinoma via&l! .
La lcci,n # "u$ 0ra#o trip!ina utili5ar !impr 3a !i#o #i27cil% (a "u 3a( #o!
tn#ncia! opu!ta! ) * 1 + El m4! pura! # la trip!ina% l mno! t,8ico ! vulv% (
cuanto m4! pr#ci&l !u acci,nE * 2 + la m4! cru#a la trip!ina % la m4! 2ica5 pu#
!r % a cau!a # otra! prota!a! . En la pr4ctica % pu# !r nc!ario un 8primnto
# pru&a prliminar para #trminar l 0ra#o ,ptimo para l rn#iminto # c$lula!
via&l! % como l "uili&rio ntr la !n!i&ili#a# a lo! 2cto! t,8ico! ( la capaci#a# #
#!a0r0aci,n pu# !r #i27cil # pr#cir.
Trip!ina cru#o ! % con muc3o% la n5ima m4! com6n utili5a#o n la #!a0r0aci,n
ti!ular < Na(mout3 % 1CF1 ? % (a "u ! tolra mu( &in por muc3a! c$lula! ( ! 2ica5
para muc3o! t-i#o! . Activi#a# r!i#ual "u "u#a #!pu$! #l lava#o ! nutrali5a
por l !uro #l m#io # cultivo % o por un in3i&i#or # trip!ina * por -mplo % in3i&i#or
# trip!ina # 3a&a # !o-a + cuan#o ! utili5a m#io li&r # !uro
12.... La trip!ina calint
E! important r#ucir al m7nimo la 8po!ici,n # la! c$lula! a la trip!ina activa con l
2in # pr!rvar la via&ili#a# m48ima. Por lo tanto% cuan#o to#o l t-i#o !t4 !in#o
trip!ina a .F K C% la! c$lula! #i!ocia#a! ! #&n rco0r ca#a m#ia 3ora% ( la
trip!ina #&n !r rmovi#o! por cntri2u0aci,n ( ! nutrali5aron con !uro n l
m#io.
E!ta t$cnica ! 6til para la #!a0r0aci,n # 0ran#! canti#a#! # t-i#o n un
timpo rlativamnt corto% n particular para lo! m&rion! # rat,n ntra! o
m&rion! # pollo. ;o 2unciona tan &in con l t-i#o a#ulto% n l "u 3a( una 0ran
canti#a# # t-i#o conctivo 2i&ro!o% ( la a0itaci,n mc4nica pu# !r pr-u#icial para
al0uno! # lo! tipo! # c$lula! m4! !n!i&l!% como l pitlio. Si ra0r0aci,n !
ncuntra #!pu$! # la cntri2u0aci,n ( r!u!pn!i,n% incu&ar n D;a!a% 1>L2> m0 /
ml% #urant 1>L2> min% ( a cntri2u0ar..
12...1 trip!ini5aci,n con pr8po!ici,n Br7a
Una # la! #!vnta-a! #l u!o # trip!ina para #!a0r0ar l t-i#o ! l #aGo "u
pu# r!ultar # la 8po!ici,n prolon0a#a al t-i#o a la trip!ina a .F K C E # a37 la
nc!i#a# # co!c3ar la! c$lula! #!pu$! # incu&acion! # .> minuto! n l
m$to#o # trip!ina calint n lu0ar # 3acr "u ! 8pu!iron #urant l timpo
complto *! #cir % .L1 3 + nc!aria para #!0lo!ar to#o l t-i#o. Un m$to#o !impl
# r#ucir al m7nimo l #aGo a la! c$lula! #urant la 8po!ici,n ! mpapar l t-i#o
n trip!ina a 1 K C #urant DL19 3 para prmitir la pntraci,n # la n5ima con poca
activi#a# tr7ptica * Ta&la 12.1 + . D!pu$! # !t proc#iminto % l t-i#o !,lo
r"urir4 2>L.> min a .F K C #urant #!a0r0aci,n < Col O Paul % 1CDD ? .
El m$to#o # la trip!ina 2r7a por lo 0nral #a un rn#iminto m4! alto # c$lula!
via&l! % con una m-or !uprvivncia #!pu$! # 21 3 # cultivo * vr Bi0!. 12.1 %
12.1> ( Ta&la 12.1 + % ( pr!rva m4! #i2rnt! tipo! # c$lula! "u l m$to#o #
calntaminto *vr placa! 2# % % ( . + . Lo! cultivo! # m&rion! # rat,n continn
m4! c$lula! pitlial! cuan#o ! prpararon por l m$to#o 2r7o ( cultura! ritroi#! #
1. #7a! # 370a#o 2tal # rat,n r!pon#n a la ritropo(tina #!pu$! # !t
trataminto % pro no #!pu$! # "u l m$to#o # trip!ina calint o #!a0r0aci,n
mc4nica < Col O Paul % 1CDD E ConPi % comunicaci,n pr!onal ? . El m$to#o #
trip!ina # 2r7o tam&i$n ! convnint% (a "u no ! r"uir a0itaci,n o
cntri2u0aci,n ( la incu&aci,n a 1 K C ! pu#n rali5ar #urant la noc3.
12...:
Em&ri,n # pollo ru#imnto! # ,r0ano!
El m$to#o # trip!ina 2r7a ! particularmnt a#cua#a para p"uGa! canti#a#! #
t-i#o% tal! como ,r0ano! m&rionario!. Protocolo 12%F #a &uno! cultura!
rpro#uci&l! # 1> L a lo! m&rion! # pollo # 1. #7a! con pru&a! # vario! tipo!
# c$lula! #i2rnt! caractr7!tica! #l t-i#o # ori0n. E!t protocolo con!titu( un
&un -rcicio para 2in! #i#4ctico!.
An4li!i!. D!pu$! # .L: #7a!% la! c$lula! # contrataci,n po#r4n !r vi!to! n la!
cultura! #l cora5,n% la! colonia! # c$lula! pi0mnta#a! n la cultura rtina
pi0mnta#a% ( l comin5o # miotu&o! n cultivo # m6!culo !"ul$tico. La cultura
pu# !r 2i-a ( manc3a#a *v$a! l Protocolo 1D%2+ para l 8amn 2uturo.
12...D Otro! proc#iminto! n5im4tico!
D!a0r0aci,n n trip!ina pu# !r pr-u#icial * por -mplo % a al0una! c$lula!
pitlial!+ o in2icac! * por -mplo % para l t-i#o mu( 2i&ro!o % tal como t-i#o
conctivo 2i&ro!o + % por lo "u ! 3an 3c3o intnto! # utili5ar otra! n5ima! . D&i#o
a "u la matri5 8traclular a mnu#o contin col40no % n particular n l t-i#o
conctivo ( mu!cular % la cola0na!a 3a !i#o la opci,n o&via < Br!3n( % 1CF2
* carcinoma # colon + E . Spir! t al % 1CCD * carcinoma # mama + E . C3n t al %
1C9C *riG,n + E Ca&ina ( O@S3a% 2>>2 * int!tino+ E 'al# t al. % 1CC1 *c$lula! # lo!
i!lot! pancr4tico! + ? * v$an! la! Sccion! 12...D % 2..2.DL2..2.9 + . Otra!
prota!a! &actriana! % tal! como prona!a < Sc3a22r t al % 1CCF . E . =lavin t al %
1CCD ? ( #i!pa!a * Ao3rin0r L Mann3im + < Compton t al % 1CC9 . E Inamat!u t al. %
1CC9 ? % tam&i$n ! 3an utili5a#o con #ivr!o! 0ra#o! # $8ito. La participaci,n # lo!
3i#rato! # car&ono n la a#3!i,n intraclular 3a llva#o a la utili5aci,n #
3ialuroni#a!a < Arr( ( Brin#% 1CDC ? ( la nuramini#a!a n con-unci,n con
cola0na!a . Otra! prota!a! !i0un aparcin#o n l mrca#o * v$a! la Scci,n
12.1+. Con la !lcci,n (a !t4 #i!poni&l % la !lcci,n # mu!tra! #i!poni&l! ! la
6nica opci,n !i la trip!ina% cola0na!a% #i!pa!a % prona!a % 3ialuroni#a!a% ( D;a!a %
!olo! ( n com&inacion! % no ll0ar a !r 8ito!o.
12...F cola0na!a
E!ta t$cnica ! mu( !impl ( 2ica5 para muc3o! t-i#o!) m&rionario% a#ulto% normal (
mali0no. E! # ma(or &n2icio cuan#o l t-i#o ! #ma!ia#o 2i&ro!o o #ma!ia#o
!n!i&l para prmitir l u!o con $8ito # trip!ina. Cola0na!a &ruta ! # u!o
2rcunt ( pu# #pn#r% para al0uno! # !u acci,n% !o&r la contaminaci,n con
otra! prota!a! no !pc72ica!. =ra#o! m4! altamnt puri2ica#a! !t4n #i!poni&l! !i
la activi#a# protol7tica no !pc72ica no ! #!a&l% pro no pu# !r tan 2ica5
como la cola0na!a cru#o.
Al0una! c$lula!% particularmnt macr,2a0o! % pu#n a#3rir! a la primra matra5
#urant la incu&aci,n con cola0na!a . Tran!2rir la! c$lula! a un matra5 # 2r!co
#!pu$! # trataminto con cola0na!a * ( la po!trior liminaci,n # la cola0na!a +
limina muc3o! # lo! macr,2a0o! # la cultura . El primr 2ra!co pu# cultivar!
tam&i$n% !i ! nc!ario. Trip!ini5aci,n Lu5 liminar4 cual"uir a#3rnt c$lula!
#i!tinta! # lo! macr,2a0o!. D!a0r0aci,n # cola0na!a 3a #mo!tra#o !r
particularmnt a#cua#o para l cultivo # lo! tumor! 3umano! < P2ra0nr (
Br!3n( % 2>>1 ? % rnal! rat,n% 3umano a#ulto ( #l cr&ro #l 2to % l 370a#o *vr
Protocolo 2.%D + % pulmonar!% ( muc3o! otro! t-i#o! % n particular #l pitlio
< Br!3n( ( Br!3n( % 2>>2 ? . El proc!o ! !uav ( no r"uir a0itaci,n mc4nica
o "uipo !pcial . Con m4! # 1 0 # t-i#o % !in m&ar0o % ! vulv t#io!o n la
tapa # #i!cci,n ( pu# !r co!to!o % #&i#o a la canti#a# # cola0na!a r"uri#o
. Tam&i$n #ar4 a conocr la ma(or part # la! c$lula! #l t-i#o conctivo % lo "u
acnt6a l pro&lma #l crciminto # 2i&ro&la!to! % por lo "u pu# "u tn0a "u
!r !0ui#o por cultivo !lctivo * v$a! la !cci,n 1>.2.1 + o !paraci,n # c$lula!
* v$a! l cap7tulo 1: + . Lo! 0rupo! #i!crto! # c$lula! pitlial! pro#uci#a! por la
#!a0r0aci,n n cola0na!a * vr Pa!o C # Protocolo # 12%9 + ( por l m$to#o #
trip!ina 2r7a * V$a! la! l4mina! 2 % . + pu#n !r !lcciona#a! &a-o un micro!copio
# #i!cci,n ( ! tran!2iriron a pocillo! in#ivi#ual! n una placa # microtitulaci,n %
!olo o con c$lula! alimnta#ora! irra#ia#o! o mitomicina C trata#o! * v$an! la!
Sccion! 11.2.. % 2..1.1 % 2..1.1 + .
12...9 La #!a0r0aci,n mc4nica
La #rivaci,n # c$lula! # 8plant! primario! ! un proc!o rlativamnt lnto (
pu# !r altamnt !lctiva . La #i0!ti,n n5im4tica ! &a!tant m4! mano # o&ra
% aun"u % potncialmnt % #a una cultura "u ! m4! rpr!ntativo #l t-i#o. Como
3a( un ri!0o # #aGo a la! c$lula! protol7tica #urant la #i0!ti,n n5im4tica %
muc3a! pr!ona! 3an opta#o por utili5ar la altrnativa # #!a0r0aci,n mc4nica %
por -mplo % la rco0i#a # la! c$lula! "u ! #rraman 3acia 2ura cuan#o l t-i#o
! corta cui#a#o!amnt < La!2ar0u! % 1CF. ? % al pul!ar l t-i#o #i!cciona#o a
trav$! # una !ri # tamic! para l "u la malla ! r#uc 0ra#ualmnt n
tamaGo % o % altrnativamnt% o&li0an#o a lo! 2ra0mnto! # t-i#o a trav$! # una
-rin0a * con o !in una a0u-a # cali&r L amplio + < Qaro22 t al . % 1CD1 ? o !implmnt
piptan#o rpti#amnt * vr . Bi0. 12%1. + . E!t proc#iminto #a una !u!pn!i,n
clular m4! r4pi#amnt # lo "u lo 3ac la #i0!ti,n n5im4tica % pro pu# cau!ar
#aGo! mc4nico! . Ra!par * #rram @@ @@ + * 2i0. 12.1.a + ( l tami5a#o * 2i0. 12.1.& +
!on pro&a&lmnt lo! m$to#o! mc4nico! m4! !uav! #urant l pipta#o * 2i0.
12.1.# + ( % n particular % con -rin0a * 2i0. 12.1.c + % !on m4! !u!cpti&l! # 0nrar
ci5alla. Protocolo # 12%C ! un m$to#o # #!a0r0aci,n mc4nica "u ! 3a
ncontra#o para !r un $8ito mo#ra#o con lo! t-i#o! &lan#o! % tal! como l
cr&ro .
Solamnt lo! t-i#o! &lan#o!% como l &a5o % l 370a#o m&rionario % l cr&ro
m&rionario ( a#ulto% ( al0uno! tumor! &lan#o! 3umano! ( animal!% r!pon#n &in
a !ta t$cnica. Inclu!o con l cr&ro % para lo! "u la #!a0r0aci,n &a!tant
complto ! pu# o&tnr 24cilmnt % la via&ili#a# # la !u!pn!i,n r!ultant !
mnor "u l alcan5a#o con la #i0!ti,n n5im4tica % aun"u l timpo mpla#o
pu# !r muc3o mnor . Cuan#o la #i!poni&ili#a# # t-i#o no ! una limitaci,n ( la
2icincia #l rn#iminto no ! important % pu# !r po!i&l pro#ucir % n un corto
pr7o#o # timpo % como muc3a! c$lula! via&l! con #!a0r0aci,n mc4nica como
con la #i0!ti,n n5im4tica % pro a 8pn!a! # mu( muc3o m4! t-i#o .
12...C Sparaci,n # Via&l ( c$lula! no via&l!
Cuan#o ! prpara un cultivo primario a#3rnt # c$lula! #i!ocia#a!% la! c$lula! no
via&l! !on limina#o! n l primr cam&io # m#io. Con cultivo! primario!
mantni#o! n !u!pn!i,n% la! c$lula! no via&l! ! #ilu(n 0ra#ualmnt cuan#o !
inicia la proli2raci,n clular. Si ! nc!ario% !in m&ar0o% la! c$lula! no via&l!
pu#n !r rtira#o! # la #!a0r0a#o primaria m#iant la cntri2u0aci,n # la!
c$lula! n una m5cla # Bicoll ( mtri5oato # !o#io *por -mplo% '(pa"u o Trio!il+
<Vri! t al.% 1CF.?.
E!ta t$cnica ! !imilar a la prparaci,n # lin2ocito! # !an0r pri2$rica *v$a! l
Protocolo 2F%1+. La! c$lula! via&l! ! acumulan n la intr2a5 ntr l m#io ( l
Bicoll / mtri5oato% ( la! c$lula! murta! # 2ormar un !#imnto n la part in2rior #l
tu&o.
12... 1> cultivo primario n l r!umn
In#pn#intmnt # la t$cnica utili5a#a para pro#ucir un cultivo% ! important
mantnr r0i!tro! a#cua#o! # ori0n # la cultura ( #rivaci,n% inclu(n#o la
!pci% l !8o% ( l t-i#o
#l "u ! #rivan% cual"uir patolo07a rlvant% ( lo! proc#iminto! utili5a#o! para
la #i!0r0aci,n ( primaria cultura *Ta&la 12.2+. Si !t4 tra&a-an#o &a-o &una!
pr4ctica! # la&oratorio *APL. NRR.oc#.or0/#partmnt/>% 2D99% n 2D 1C .1.91 1 1
1 1 1%>> 3tml+ la! con#icion!% ntonc! !o! r0i!tro! no !on !,lo #!a&l!% !ino
o&li0atorio <A#mini!traci,n # Alimnto! ( Dro0a! # 1CC2% l Dpartamnto #
Sani#a# ( S0uri#a# Social% 1C9D% Or0ani5aci,n para la EconomicCo # Coopraci,n
( D!arrollo% 2>>1?. Lo! r0i!tro! ! pu#n mantnr n un &loc # nota! u otro
arc3ivo # copia # 3o-a! # r0i!tro% pro ! m-or n !t momnto para iniciar un
r0i!tro n una &a! # #ato! in2orm4ticaE !t #i!co ! convirt n l primr pa!o
para mantnr la proc#ncia # la l7na clular. El r0i!tro # &a! # #ato! no
pu# proc#r m4! all4 # la 2a! # cultivo primario% pro% miran#o l 8trmo
opu!to% po#r7a !r la primra tapa n la craci,n # un r0i!tro 8acto # lo "u !
convrtir4 n una l7na clular valio!o. Si l r0i!tro ! convirt n irrlvant%
!impr ! pu#n liminar% pro no pu#% con cirta prci!i,n% ! crar4 m4!
a#lant% !i la l7na clular a#"uir cirta importancia.
Como pu# !r nc!ario para autnticar l ori0n # una l7na clular n una tapa
po!trior n !u ciclo # vi#a% n particular !i ! !o!pc3a # contaminaci,n cru5a#a%
! important "u 0uar# una mu!tra # t-i#o% !an0r% o # AD; #l mi!mo
in#ivi#uo n l momnto # ai!laminto # t-i#o para l cultivo primario. E!ta mu!tra
pu# !r utili5a#a como matrial # r2rncia para la 3ulla #actilar # AD; *v$a!
la Scci,n 1D.D.2+ o # AD; *v$a! la Scci,n 1D.D..+.