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PRACTICA 1

FOTOCOLORIMETRA Y CURVA DE CALIBRACIN



Objetivos

1. Analizar los principios bsicos de la fotocolorimetra
2. Determinar el espectro de absorcin de un compuesto coloreado
3. Seleccionar la longitud de onda ptima o de mxima absorcin
4. Realizar la curva de calibracin para una solucin de albmina
5. Calcular concentraciones desconocidas de muestras de protenas

Aspectos Tericos

La fotocolorimetra es un mtodo que sirve para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir el
curso de una reaccin en experimentos de cintica qumica o enzimtica. La tcnica consiste en medir la
intensidad de luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solucin coloreada de uno o varios compuestos. La
absorcin mxima ocurre a una longitud de onda () caracterstica para cada compuesto y la intensidad de la
energa absorbida a esa longitud de onda, vara proporcionalmente con la concentracin del compuesto en una
solucin.

El mtodo parece estar restringido a las sustancias coloreadas, sin embargo tambin se puede extender a los
compuestos incoloros, hacindolos reaccionar con una especie que genere un producto coloreado.

Absorcin de energa por sustancias coloreadas

Una sustancia es coloreada porque absorbe y transmite radiacin electromagntica en la regin visible del
espectro, es decir entre 400 y 800 nm (). El color que se observa es una combinacin de las longitudes de
onda no absorbidas, y por lo tanto, transmitidas por la sustancia.



Espectro electromagntico

Cuando una molcula absorbe radiacin ultravioleta (U.V) o visible, lo que fundamentalmente ocurre es que se
excitan los electrones de valencia que ocupan orbitales moleculares sigma () o simples, (dobles y triples) y
(electrones no enlazados). Al absorber un fotn de energa, el electrn puede ocupar un orbital superior
denominado orbital antienlazante, (*) generndose una de las siguientes transiciones:



Estas transiciones requieren diferente energa y por lo tanto diferente longitud de onda. Para una radiacin, su
contenido energtico es inversamente proporcional a su longitud de onda:

E = h = hc/
Donde: E = cantidad de energa


= frecuencia de la radiacin
h = constante de Planck
c = velocidad de la luz en el vaco
= longitud de onda de la radiacin

Las transiciones sealadas, que son las que normalmente pueden ocurrir en los compuestos orgnicos, tienen
el siguiente orden de acuerdo con su energa o longitud de onda:



Se observa que la transicin que ocurre ms fcilmente (menor diferencia de energa) es la - *, y la que mas
difcilmente ocurre es la - *. Las transiciones - * son las que frecuentemente ocurren en compuestos
saturados y son poco tiles para fines analticos debido a que requieren mucha energa. Las transiciones - *
son las caractersticas de los compuestos insaturados (alquenos, alquinos, cetonas, aldehdos, cidos
carboxlicos, aromticos), sobre todo cuando tienen dobles enlaces conjugados. Cuando esto ocurre, la
transicin es ms fcil (menos energa) y la longitud de onda va aumentando, hasta llegar a la regin visible del
espectro (400 -800 nm), que es donde absorben las sustancias coloreadas.

Las transiciones - * y - * ocurren en las molculas que tienen pares de electrones libres y aunque son
relativamente poco energticas, su probabilidad es baja; por ello son poco tiles en el campo analtico.

En los complejos e iones coloreados de los metales de transicin (Co, Ni, Cu, Cr, Fe, Zn, etc.), los electrones de
los orbitales d de baja energa se promueven a orbitales d de alta energa cuando la molcula absorbe
radiacin visible. Estas transiciones ocurren porque las molculas que se acomplejan al ion metlico dividen a
los orbitales d del ion en dos grupos: de alta y baja energa.


Espectro de absorcin

Para saber con precisin la energa (o la ) de la transicin (o transiciones) que ha ocurrido en una molcula
cuando se irradia con luz U.V. o visible, es necesario determinar para ella una grfica que relacione la
intensidad de energa que se va absorbiendo a medida que se hace un barrido por la regin del espectro que
nos interesa (U.V. o visible, o ambos). Esta grfica se llama espectro de absorcin, y a partir de ella se puede
deducir la longitud de onda en la cual el compuesto absorbe con mayor intensidad la energa, es decir, donde
ocurre la transicin electrnica. El conocimiento de de mxima absorcin facilita la deteccin de la sustancia
ya sea para determinar su concentracin o para seguirle la huella en experimentos de tipo cintico.




Energa absorbida y concentracin (ley de Beer)



La intensidad de la energa absorbida por una especie depende del nmero de molculas que sufren la
transicin electrnica a la seleccionada, y ese nmero de molculas depende a su vez de la concentracin de
la especie y de la longitud de la celda que la contiene:

A c x l donde: A = absorcin (intensidad de la energa absorbida)
c = concentracin de la muestra en mol/L
l = longitud de la celda en cm.

Esta expresin se vuelve una igualdad cuando se introduce una constante de proporcionalidad :

A = x c x l (ley de Beer-Lambert)

Se denomina coeficiente de extincin molar o absortividad molar, con unidades M
-1
cm
-1
. Es una constante
para cada especie que absorba energa en la regin U.V.-visible, y su valor indica la probabilidad de que la
transicin electrnica ocurra.

Aplicacin de la ley de Beer-Lambert

La aplicacin ms importante de esta ley es la determinacin de concentraciones desconocidas de soluciones
de sustancias que absorben en la regin U.V.-visible. Como una primera aproximacin y suponiendo
concentraciones cercanas a la de una muestra patrn, la ecuacin de Beer-Lambert se puede usar para calcular
la concentracin de una muestra problema (igual sustancia que el patrn), midiendo la absorbancia de la
muestra patrn (A
pat.
) y de la muestra problema (A
prob.
). Si las condiciones de las dos mediciones son iguales
(temperatura, sustancia, aparato), se cumple que:

A/C = x l = constante

La expresin se puede aplicar tanto a la muestra patrn como a la muestra problema, as:

A
pat
/C
pat
= A
prob
/C
prob
luego C
prob
= C
pat
x A
prob
/A
pat


Para determinaciones ms precisas de concentraciones desconocidas y para minimizar al mximo las
desviaciones de la ley de Beer-Lambert, se acostumbra preparar una curva de calibracin, a partir de una serie
de soluciones patrn, cuyas concentraciones sean prximas a las de las muestras problema. Tanto a las
soluciones patrn como a las muestras problema se les mide la absorbancia; con los datos de las soluciones
patrn se construye la curva de calibracin (A vs. C). Las absorbancias de las muestras problema se llevan a la
curva y se deducen de ah sus concentraciones.



Cuantificacin de protenas

La cuantificacin de las protenas se puede realizar por diversos mtodos con base en algunas de sus
propiedades, como pueden ser los patrones de absorcin de las radiaciones electromagnticas de los
grupos aromticos, la reactividad del enlace peptdico, su contenido de nitrgeno, entre otras. En la
reaccin de Biuret las sustancias que contengan dos o ms enlaces peptdicos, interaccionan con sales de
cobre en soluciones alcalinas, formando un complejo prpura-violeta, como muestra la siguiente figura.
Dicho complejo se cuantifica espectroscpicamente utilizando como base una curva patrn de protena
(generalmente con albmina)



C
CH
N
N
O
R
2
Cu
2+
+
C
CH
N
N
O
R
2+
Cu
C
CH
R
O
N
N
Complejo color violeta
Cadena peptdica
+ 2 H
2
O
O
O
H H
H H


Espectrofotmetros

Los espectrofotmetros permiten determinar la absorbancia de la luz en numerosas sustancias orgnicas. Estos
equipos fueron diseados para medir directamente la intensidad de luz que es absorbida y/o transmitida por un
compuesto en una solucin. A continuacin se muestran los componentes bsicos de estos equipos:



En el espectrofotmetro la luz de una fuente continua (lmpara de tungsteno para el visible y lmpara de
deuterio para el ultravioleta), pasa a travs de un monocromador que selecciona una banda estrecha de
longitudes de onda del haz incidente. Las longitudes seleccionadas atraviesan la muestra contenida en una
cubeta de vidrio o cuarzo de espesor definido (l). Finalmente, se mide la potencia radiante de la luz que sale.

Materiales:

Fotocolormetro
Celdas del fotocolormetro
Tubos de ensayo grandes

Beaker
Frasco lavador



Reactivos:

Reactivo de Biuret
Solucin patrn de gelatina (C = 8 mg/mL)
Solucin salina al 0.9%

Muestras problema: casena, suero
sanguneo, gelatina (sin sabor) o
albumina










Seccin Experimental

A- MANEJO DEL FOTOCOLORMETRO.



Antes de empezar a tomar lecturas en el instrumento, este debe calibrarse siguiendo las recomendaciones
anotadas a continuacin:

a. Seleccione la longitud de onda.
b. Ajustar el cero en transmitancia.
c. Colocar la celda o tubo que contiene la solucin blanco, la cual se prepara mezclando 2 mL de
reactivo de Biuret con 2 mL de agua destilada.
d. Ajustar el 100% de transmitancia.
e. Retirar el tubo que contiene la solucin blanco.
f. Colocar el tubo que contiene la solucin problema.
g. Leer la absorbancia o transmitancia.

B- DETERMINAR EL ESPECTRO DE ABSORCIN DE UN COMPUESTO.

a. Coloque la longitud de onda en el instrumento a 420 nm.

b. Preparar dos celdas o tubos con suficiente solucin (aproximadamente hasta los ), utilizando en
una, agua destilada y en la otra una solucin de albmina coloreada con el reactivo de Biuret.

c. Observe que los tubos con las soluciones no tengan burbujas, lmpielos externamente con un papel
o tela adecuada.

d. Calibre el instrumento siguiendo las recomendaciones anteriores.

e. Coloque el tubo con la solucin problema y anote la absorbancia o transmitancia indicada en el
instrumento.
f. Repita los pasos anteriores pero aumentando la longitud de onda de 20 en 20 nm (contine tomando
lecturas hasta alcanzar una longitud de onda de 620 nm).

g. Recoja los datos en la siguiente tabla:

(nm) Absorbancia (nm) Absorbancia
420 540
440 560
460 580
480 600
500 620
520

h. Dibuje una grfica de absorbancia vs. longitud de onda. La curva obtenida corresponde al espectro
para la estructura del complejo protenico formado por el reactivo de Biuret. Observe que se
presentar una longitud de onda en la cual habr una mayor absorcin. Esta longitud de onda debe
ser una constante, la cual ser tenida en cuenta para posteriores anlisis de albmina.










C. CURVA DE CALIBRACIN PARA SOLUCIONES DE ALBMINA

a. Rotule 9 tubos de ensayo y colqueles las siguientes soluciones como se indica en la tabla siguiente:

TUBO BLANCO 1 2 3 4 5 6 7 8



Solucin
Patrn (mL)
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,2

Solucin
Problema
0,5 1,0

Solucin
Salina
2,0 1,9 1,7 1,5 1,3 1,1 0,8 1,5 1,0
Absorbancia
Concentracin


b. Agregue en cada tubo 4 mL del reactivo de Biuret, mezcle bien y deje en reposo durante 15 minutos.

c. Coloque en el fotocolormetro la longitud de onda de mxima absorbancia obtenida en la experiencia
sobre el espectro de absorcin (numeral B), mida la absorbancia para cada uno de los tubos y antelas
en la tabla anterior.

d. Calcule la concentracin de protena en cada uno de los tubos, aplicando la frmula de dilucin (C
1
x V
1

= C
2
x V
2
) y tabule los resultados de la absorbancia y concentracin.

e. Grafique los resultados absorbancia y concentracin tabulados en d, la lnea resultante corresponde a
la curva de calibracin.

f. Del grfico, determine la concentracin de las muestras problema.

g. Calcule las concentraciones de las muestras problema utilizando la ecuacin de Beer-Lambert y
comprelas con las obtenidas del grfico.


Todos los desechos se adicionan a residuos con metales


Preguntas

1. Qu es una curva de calibracin? Qu caractersticas debe cumplir?
2. Se puede construir una curva de calibracin con sustancias no coloreadas?
3. Cul es el objetivo de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimtricas?
4.- Cul es la protena plasmtica ms abundante?
5. Por qu no se le puede tomar un espectro de absorcin a la albmina sola?
6. Por qu razn se eligi una sola longitud de onda para hacer todas las mediciones de la curva de
absorcin?
7. Qu significado tiene la pendiente de la grfica?

















PRACTICA 2

CUANTIFICACIN DE PROTENAS

Objetivos

6. Separar en una muestra de suero sanguneo, las globulinas de las protenas totales.
7. Calcular la concentracin de protenas totales, globulinas y albminas en una muestra de suero
sanguneo.

Aspectos tericos

Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en las clulas, constituyen el 50% o ms de su
peso seco. Se encuentran en todas las partes de cada clula, ya que son fundamentales en todos los aspectos
de la estructura y funcin celular. Existen muchas clases de protenas, cada una de ellas especializada en una
funcin biolgica diferente, que van desde el transporte y almacenamiento de molculas pequeas hasta la
organizacin estructural de las clulas y los tejidos, pasando por la contraccin muscular, la respuesta
inmunitaria, la coagulacin de la sangre y la catlisis de cientos de reacciones metablicas. Adems la
informacin gentica es expresada en su mayor parte por las protenas. La estructura de las protenas, as
como su relacin con su funcin biolgica y actividad constituyen problemas centrales de la bioqumica actual.


Clasificacin de las protenas

a. Segn su composicin
Las protenas se clasifican en dos tipos importantes, de acuerdo con su composicin. Las protenas simples,
como la albmina de suero sanguneo, nada ms producen aminocidos cuando se hidrolizan; las protenas
conjugadas, producen otros compuestos adems de los aminocidos como carbohidratos, grasas o cidos
nucleicos. La porcin no aminocido de una protena conjugada se denomina grupo prosttico.

b. Segn su forma tridimensional
Otra forma de clasificar las protenas es en fibrosas o globulares, segn su forma tridimensional. Las protenas
fibrosas o filamentosas, por ejemplo las de colgeno y las de queratina, consisten en cadenas de
polipptidos, arreglados lado a lado en largos filamentos. Debido a que estas protenas son muy resistentes e
insolubles en agua, en la naturaleza sirven para construir materiales estructurales como tendones, pezuas,
cuernos y msculos. Las protenas globulares, en cambio suelen estar enrolladas en forma semiesfrica y
compacta. Estas protenas son por lo general solubles en agua y se mueven dentro de las clulas. La mayor
parte de los varios millares de enzimas conocidas son protenas globulares. Otros ejemplos, son la insulina y la
hemoglobina.



c. Segn su solubilidad
Segn este parmetro, las protenas reciben algunos de los siguientes nombres:

Albminas, cuando son solubles en agua y en soluciones acuosas salinas diluidas.


Globulinas, solubles en soluciones salinas diluidas pero poco solubles en agua. Se precipitan en
soluciones semisaturadas de sulfato de amonio.
Prolaminas, solubles en etanol entre 70 y 80% e insolubles en agua.
Histonas, solubles en soluciones salinas.
Glutelinas, insolubles en agua, etanol y soluciones salinas, pero solubles en soluciones cidas y
bsicas diluidas.


Protenas del suero sanguneo
La sangre es el tejido lquido que circula dentro de los vasos sanguneos, compuesto casi en la mitad de su
volumen por clulas como los glbulos rojos o eritrocitos, glbulos blancos o leucocitos, plaquetas y por el
plasma, que es la porcin no celular y que es el lquido que mantiene a las clulas en suspensin.

Cuando la sangre se coagula, aparece un lquido remanente que se llama suero, y que se diferencia del plasma
porque ya no contiene los factores de coagulacin como la protena fibringeno.

Aunque el plasma sanguneo contiene una compleja mezcla de sustancias solubilizadas, sus protenas
representan el 75% de ellas, y una concentracin que oscila entre 6 y 8 g por cada 100 mL de suero. Las
principales protenas del suero sanguneo son:

Albmina: con una concentracin de 3 a 4.5 g por 100 mL de suero, es el mayor contribuyente a la
presin osmtica intravascular. Su funcin principal es la de transportar cidos grasos y medicamentos.
Los cidos grasos los llevan desde los adipocitos, donde se generan por hidrlisis de los
triacilgliceroles, hasta los tejidos que los requieren para su oxidacin.

Globulinas: Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente a las
infecciones. Es un conjunto heterogneo de protenas que a veces se designan como , y -globulinas
y alcanzan una concentracin en la sangre entre 3 y 3.5 g por 100 mL.


Mtodos para aislar y purificas protenas

Con el fin de preparar extractos protenicos a partir del complejo medio celular, se han desarrollado tcnicas
que se fundamentan en las diferencias que presentan ellas en su tamao, su carga, su masa, su solubilidad y
su afinidad por otras molculas. Ests tcnicas son: la centrifugacin, la electroforesis, la cromatografa, la
dilisis, ultrafijacin y diferencias en la solubilidad en diferentes medios.

En esta prctica se pretende usar las tcnicas de centrifugacin y fotocolorimetra para separar y cuantificar la
concentracin de albmina y globulinas en el suero sanguneo, respectivamente. El empleo del reactivo de
Biuret en soluciones con concentraciones diferentes de protenas, permitir la medida de la absorbancia para
cada concentracin. La determinacin precisa de stas se podr deducir del dato de absorbancia tomado a una
solucin patrn de protena (con concentracin conocida) de la siguiente manera:

C
prob
= C
pat
x A
prob
/A
pat


Donde: A
pat.
Y C
pat.
= son la absorbancia y concentracin de la solucin patrn, respectivamente.
A
prob.
Y C
prob.
= son la absorbancia y la concentracin de la muestra problema, respectivamente.


Materiales:

Fotocolormetro
Celdas del fotocolormetro
Tubos de ensayo grandes


Beaker
Frasco lavador
Centrfuga



Reactivos:



Solucin acuosa de NaCl al 0.9%
Solucin saturada de (NH
4
)
2
SO
4
(750 gr en 1 L
de agua)
Solucin patrn de albmina o gelatina (0.45 gr
en 100 mL de solucin salina)

Solucin de biuret
Muestra de suero sanguneo
humano




Seccin Experimental

A. Separacin de las globulinas del suero.

a. Coloque en un tubo de centrfuga 1 mL de suero sanguneo y 4 mL de agua destilada.

b. Agregue a la solucin anterior 5 mL de solucin saturada de sulfato de amonio, gota a gota y agitando
suave pero constantemente.

c. Deje reposar durante 15 minutos la solucin obtenida en b. Luego centrifugue a 2000 r.p.m, por espacio
de 15 minutos. El precipitado obtenido corresponde a las globulinas.

d. Separe el lquido sobrenadante de las globulinas y disuelva este precipitado en 5 mL de una solucin
salina. Conserve esta solucin para determinar el porcentaje de globulinas.

B. Preparacin de la solucin de protenas totales.

e. Mida 1 mL de suero sanguneo en una probeta y dilyalo hasta completar 20 mL agregndole solucin
salina.

C. Medicin de la absorbancia en las soluciones que contienen protenas.

f. Disponga de 4 tubos de ensayo y prepare en cada uno de ellos las soluciones, como se indica en la
siguiente tabla:

TUBOS BLANCO (mL) PATRN (mL) GLOBULINAS
(mL)
PROTENAS
TOTALES (mL)
ABSORBANCIA
Solucin salina 1,0
Solucin
patrn
1,0
Solucin de
globulinas
1,0
Suero diluido
1:20
1,0
Solucin de
Biuret
4,0 4,0 4,0 4,0

g. Agite cada tubo y djelo reposar 30 minutos.

h. Lleve cada uno de los tubos al fotocolormetro, fijado en una longitud de onda ( ) de 540 nm. Luego de
una previa calibracin con el blanco, anote los resultados de absorbancia registrados en el instrumento.

Todos los desechos se adicionan a residuos orgnicos con metales
1







1
Los residuos de suero sanguneo se depositan en un recipiente que contenga una solucin de hipoclorito de sodio


Resultados

a. Dilucin del patrn:
Calcule la concentracin final de la solucin patrn de protenas aplicando la frmula:

C
f
= C
i
V
i
/V
f


b. Concentracin de protenas totales en el suero:
Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrn con las de protenas totales y calcule el
porcentaje de estas ltimas:

(%) protenas totales =
(%) sln patrn x Absorbancia (protenas totales)
Absorbancia (sln patrn)


Sin embargo, esta concentracin corresponde a 1 mL de solucin de suero sanguneo, el cual fue diluido
primero 20 veces y luego 5 veces de manera que el resultado final debe ser:

20 x 5 x (%)
protenas totales


c. Concentracin de las globulinas:
Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrn y de albmina obtenida con el porcentaje de
la solucin patrn y calcule el porcentaje de la solucin de globulinas:

(%) globulinas =
(%) sln patrn x Absorbancia (sln globulinas)
Absorbancia (sln patrn)


Sin embargo esta concentracin corresponde a la solucin de globulinas preparada segn la tabla 5-1, la cual
fue obtenida por dilucin 1:5:5. En esta forma la solucin original del suero sanguneo debe tener una
concentracin 25 veces mayor, o sea:

5 x (%)
sln globulinas
x 5
La dilucin con
5 mL de solucin
salina
Debido a la dilucin
1.0 + 4.0 segn la tabla



d. Concentracin de albmina de suero:
El porcentaje de albmina se determina restando de las protenas totales el resultado de las globulinas:

(%) Albmina = % Protena Total - % Globulinas


Preguntas

1. Compare los porcentajes hallados para las globulinas y la albmina, con los reportados como normales
para el suero. Existen diferencias? Por qu?

2. Consulte la funcin de las sales de sulfato de amonio y cloruro de sodio en el procedimiento de
separacin de globulinas.











PRACTICA 3

TIROSINASA I: Efecto del pH y la Temperatura sobre la Actividad Enzimtica

Objetivos

8. Extraer el enzima tirosinasa de diferentes fuentes (banano, manzana, papa).
9. Determinar la actividad de la tirosinasa utilizando como sustrato el L-DOPA.
10. Comparar los resultados de actividad de la tirosinasa a diferentes concentraciones y de diferentes
fuentes.
11. Determinar el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimtica.
12. Deducir el pH ptimo en el cual acta la enzima tirosinasa.

Aspectos tericos

Catlisis enzimtica.
Las enzimas son catalizadores biolgicos que aumentan las velocidades de las reacciones bioqumicas. Estas
son altamente especficas, esto significa que una enzima solo acta en determinadas molculas, denominadas
sustratos mientras dejan el resto del sistema sin afectar. Se ha calculado que una clula viva puede contener en
promedio alrededor de 3000 enzimas diferentes, cada una de las cuales cataliza una reaccin especfica en la
que un sustrato se convierte en los productos adecuados. La catlisis enzimtica es homognea porque el
sustrato y la enzima estn presentes en disolucin acuosa.

Una enzima es, bsicamente una protena, que contiene uno o ms sitios activos, donde se llevan a cabo las
interacciones con los sustratos; aunque se ha descubierto actividad cataltica en algunos ARN, a los cuales se
les denomina ribozimas. Estos sitios, en forma estructural, son complementarios de las molculas de un
sustrato especfico, como se muestra en la siguiente figura:



Pardeamiento enzimtico
La coloracin caf oscuro que se va formando en la superficie de algunas frutas y vegetales cuando se cortan,
se denomina pardeamiento, y se debe a la accin de la enzima tirosinasa, que es una monofenoloxidasa, sobre
el aminocido tirosina, que en presencia de oxgeno, lo va convirtiendo secuencialmente en dopa, dopaquinona
y dopacromo (caf oscuro), hasta que termina en un pigmento muy oscuro llamado melanina.

HO
COOH
NH
2
HO
COOH
NH
2
Tirosinasa
O
2
HO
O
COOH
NH
2
O
Tirosinasa
O
2
DOPA
Tirosina
Dopaquinona
O
O
N
COOH
H Dopacromo
CO2
O
O
N
H
O
O
N
H
N
O
O
H
Melanina



En esta prctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de varias fuentes vegetales (banano, manzana y
papa), y ponerla en contacto con el sustrato L-metildopa, hasta convertirlo en el compuesto L-
metildopacromo, que es de color caf oscuro; la concentracin de ste se puede seguir
fotocolorimtricamente a una de 420 nm, que es donde presenta su mxima absorbancia.

HO
COOH
NH
2
Tirosinasa
O
2
HO
L-metildopa (incolora)
O
O
N
COOH
H
L-metildopacromo
(caf oscuro)
CH
3
CH
3


La medida de la absorbancia a travs del tiempo sirve para cuantificar la velocidad de la reaccin en
trminos de la cantidad de L-metildopacromo que se va formando, o la de L-metildopa que va reaccionando:

Absorb./t = velocidad = + d [L-matildopacromo]/dt = - d[L-metildopa]/dt

Obtencin del extracto enzimtico
Se conoce como extracto enzimtico a una fraccin de material animal, vegetal o microbiano, que contiene
una mezcla de varias sustancias pero que se caracteriza por presentar actividad de una o varias enzimas

La preparacin general de un extracto enzimtico se inicia con la adicin al material seleccionado una
solucin amortiguadora, que garantice la conservacin de la actividad de la enzima objeto de la extraccin.
Luego, se tritura en un mortero, se filtra y centrifuga para separar los residuos poco solubles.

Medida de la actividad enzimtica
Las velocidades de varias reacciones enzimticas se pueden usar para comparar la eficiencia de las
enzimas involucradas cuando se expresan en trminos de la cantidad usada de stas. Ello significa que:

Actividad Enzimtica = Velocidad de la reaccin/Cantidad de enzima

Si se conoce con precisin la concentracin molar de la enzima usada, la expresin anterior se llamar
actividad molar de la enzima:

Actividad molar = Veloc./[E] = d[S]/dt x [E] =
sustrato
/
enzima
x t

Donde son moles

Este valor representa las moles de soluto que es capaz de transformar en producto un mol de enzima por
unidad de tiempo. Esto recibe el nombre de actividad molar de la enzima.

Si no se conocen las cantidades exactas de las enzimas empleadas, se puede usar como factor de
comparacin el volumen de los extractos enzimticos preparados en condiciones similares; no se podr
hablar de actividad molar, sino simplemente de actividad enzimtica:

Actividad enzimtica =
reaccin
/vol.
extracto enzimtico


= d[s]/dt x mL
extracto
= [s]
sustrato
/mL
extracto
x t

De donde [s]
sustrato
/t se puede determinar indirectamente de la pendiente de un grfico de Absorbancia
vs tiempo, ya que la concentracin de sustrato est relacionada con la absorbancia mediante la ecuacin de
Beer-Lambert.


Variables que afectan la actividad enzimtica
Las enzimas son macromolculas protenicas cuya actividad catalizadora se ve influenciada por varios factores:
concentracin del sustrato y de la enzima, la ausencia o presencia de cofactores, inhibidores y efectores, el
aumento o disminucin de la temperatura y las variaciones del pH.



Para visualizar las mejores condiciones que garanticen el ptimo funcionamiento de una enzima, se tendr que
proceder a la evaluacin de su actividad cataltica, ya sea midiendo la velocidad inicial de la reaccin enzimtica
en funcin de uno de los parmetros mencionados anteriormente, o determinando la presencia o ausencia de
un sustrato o de un producto de la reaccin, a medida que se vara uno de los parmetros.

Efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de la reaccin
La evaluacin del efecto de la concentracin de la enzima se hizo en la regin de la curva hiperblica de V
i
vs
[S], donde la cintica es de orden cero con respecto al sustrato. Ah, la enzima se encuentra completamente
saturada y habr sustrato en exceso. Al adicionar ms cantidad de enzima, se encontr un aumento lineal en la
velocidad de reaccin, proporcional a la cantidad de enzima agregada.



Efecto del pH sobre la actividad enzimtica
La mayora de las enzimas poseen un pH caracterstico al cual su actividad es mxima; por encima o por debajo
de ese pH la actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en funcin del pH de muchas
enzimas son acampanados, pueden cambiar considerablemente de forma, como se muestra en la figura
siguiente:



Del grfico podemos observar que existe un pH (o un rango de pHs) en el cual la actividad de la enzima es
mxima:

Para la tripsina, que hidroliza pptidos en el intestino, el pH ptimo est alrededor de 8.
Para las colinesterasas, que se encuentran principalmente en la sangre y en el hgado y catalizan la
hidrlisis del neurotransmisor acetilcolina, trabajan en un rango de pH entre 7.5 y 10.
Para la pepsina, que funciona en el estmago, el pH ptimo estar cercano a 2.5.
La papana, que es una peptidasa aislada de la papaya, trabaja bien en un rango de pH entre 5 y 9.


La relacin entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende principalmente del comportamiento cido-
base de la enzima y del sustrato. La forma de la curva de actividad-pH vara con la concentracin del sustrato,
ya que el valor de K
M
de muchas enzimas vara con el pH. Las mencionadas curvas son mucho ms
significativas si la enzima se mantiene saturada con el sustrato en todos los valores de pH a los que se
experimenta. En muchos estudios de cintica enzimtica, el pH se mantiene constante al pH ptimo.

El pH ptimo de una enzima no es necesariamente idntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual
puede hallarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de su curva de pH-actividad. Este hecho
sugiere que la relacin pH-actividad de una enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su
actividad.



Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica
Al igual que ocurre con la mayora de reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas se incrementa en general con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y
permanece totalmente activa. La velocidad de muchas reacciones enzimticas se duplica, aproximadamente,
por cada 10 C de aumento de la temperatura.

Aunque las reacciones catalizadas por las enzimas parecen, con frecuencia, poseer una temperatura ptima,
como muestra la figura siguiente, el pico que se observa al representar la actividad cataltica frente a la
temperatura se produce porque las enzimas, al ser protenas, se desnaturalizan por la accin del calor y se
inactivan cuando la elevacin de la temperatura sobrepasa un cierto punto. La aparente temperatura ptima es,
por lo tanto, la resultante de dos procesos:

El incremento habitual de la velocidad de reaccin con la temperatura, y,
El incremento en la velocidad de desnaturalizacin trmica de la enzima al sobrepasar una temperatura
crtica.


Aunque la mayora de enzimas se inactivan a temperaturas comprendidas entre 55 y 60 C, algunas de ellas
son completamente estables y conservan su actividad a temperaturas muy superiores; por ejemplo, las enzimas
de diversas especies de bacterias termoflicas que habitan en las termas de agua siguen siendo activas a
temperaturas superiores a los 85 C.



Materiales:

Fotocolormetro
Celdas del fotocolormetro
Tubos de ensayo grandes
Mortero
Silica gel
Bao mara
Bao de agua hirviendo
Bao de hielo
Beaker
Frasco lavador
Centrfuga
Lienzo
Tubos de ensayo grande
Pipeta







Reactivos:

Solucin buffer de fosfato 0.1M, pH = 4.0, 5.0, 7.2,
7.5.
Solucin buffer 0.1 M de borato pH= 8.0, 9.0 y
10.0
Solucin de L-metildopa 0.03M en buffer pH = 7.2

Fuente de tirosinasa (banano,
manzana y papa)
Hielo picado




Seccin Experimental

Nota: esta prctica est dividida en cuatro partes, se recomienda que la parte A y B la realice todo el grupo, y la
C y D se distribuya en dos equipos y al final se compartan los resultados.


A. Extraccin de la enzima

a. Coloque 10 g de la fruta en el mortero preenfriado y adicinele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M
(pH=7,2).

b. Adicione unos 3 gramos de silica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta slida.

c. Filtre utilizando un pao y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.

d. La solucin sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.

e. Diluya la solucin sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solucin
como extracto diluido 10 veces. El extracto de manzana no se diluye. Rotule esta solucin como
extracto enzimtico.



B. Medida de la actividad enzimtica

a. En un tubo de ensayo prepare una solucin blanco mezclando:

1 mL del extracto enzimtico
3 mL de buffer pH = 7.2
1 mL de agua destilada.

b. Calibre el fotocolormetro, utilizando la solucin anterior, a = 420 nm.

c. Mezcle en otro tubo de ensayo:

1 mL de extracto enzimtico
3 mL de buffer pH = 7.2
1 mL de solucin de L-metildopa

d. Inmediatamente despus de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colquelo en el fotocolormetro y
lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero.

e. Anote las absorbancias registradas en el fotocolormetro cada 30 segundos durante 5 minutos.

f. Repita los pasos c hasta e en otros 3 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de solucin de
extracto enzimtico de la siguiente manera:

Adicione a cada tubo, respectivamente, 1.5, 2.0 y 2.5 mL de extracto.
Complete cada tubo hasta 4 mL con buffer pH = 7.2
Agregue a cada tubo, a penas vaya a leer en el fotocolormetro, 1 mL de la solucin de L-
metildopa.

g. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

Tiempo (min)/Tubo 1 2 3 4
Absorbancia
0.5
1.0


1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0


C. Medida de la actividad enzimtica con cambio de la temperatura

a. En un tubo de ensayo adicione 2.0 mL de extracto de enzima y 3.0 mL de solucin de buffer pH = 7.2

b. Introduzca el tubo en un bao mara a 37
o
C durante 5 minutos

c. Cuando el tubo se haya enfriado, agrguele 1 mL de L-metildopa, agite y mida la absorbancia igual que
en el caso anterior.

d. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

Tiempo (min) Absorbancia 4
o
C Absorbancia 37
o
C Absorbancia 95
o
C
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0


e. Repita el procedimiento anterior pero utilice primero un bao de hielo y despus en un bao de agua
hirviendo a 95
o
C. Tabule sus resultados en la tabla anterior.













D. Efecto del pH sobre la actividad de enzimtica:

a. Marque 12 tubos de ensayo y adicione a cada uno de ellos lo que muestra la siguiente tabla:


















b. Mida el pH resultante en cada uno de los tubos

c. Incube los tubos 5 minutos en un bao a 37-40
o
C.

d. Adicione a los tubos A1 y B1 1 mL de L-metildopa y agite.

e. Calibre el fotocolormetro con la solucin B1 a = 420 nm

f. Lea la absorbancia de la solucin A1 y antela

g. Repita los pasos b hasta f para los otros tubos

h. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

Tiempo (min)/Tubo A1 A2 A3 A4
Absorbancia
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0


Todos los desechos se adicionan a residuos orgnicos no halogenados









Resultados

a. Con los resultados de las dos tablas, haga los grficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y de ellos,
calcule las pendientes de las curvas y multiplique estos valores por los factores de dilucin as:

Tubo 1: m
1
x 10/1.0 = A.E
1

Tubo 2: m
2
x 10/1.5 = A.E
2

Tubo B1 A1 B2 A2 B3 A3 B4 A4 B5 A5

Buffer pH 4.0 3 2
Buffer pH 5.0 3 2
Buffer pH 8.0 3 2
Buffer pH 9.0 3 2
Buffer pH 10.0 3 2

Extracto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

L-metildopa - 1 - 1 - 1 - 1 - 1


Tubo 3: m
3
x 10/2.0 = A.E
3

Tubo 4: m
4
x 10/2.5 = A.E
4


Donde m es la pendiente de la curva y A.E es la actividad enzimtica. La actividad enzimtica con variacin de
la temperatura y del pH se calcula igual que el tubo 3.

Absorvancia
tiempo
A
2
A
1
t
1
t
2
m =
t
2
- t
1
A
2
- A
1


b. Analice la actividad enzimtica de los tubos 1-4, cual es la explicacin?
c. Analice la actividad enzimtica del tubo 3 en la primera parte con los obtenidos con cambio de la temperatura
(haga el grafico de actividad enzimtica vs temperatura) cul es la explicacin?
d. Analice la actividad enzimtica del tubo 3 en la primera parte con los obtenidos con cambio del pH (haga el
grafico actividad enzimtica vs pH) cul es la explicacin
e. Compare sus resultados con los resultados obtenidos para otra fruta

Preguntas
1. Cuando se trabaja con manzana el extracto no es recomendable diluirlo Por qu?
2. Cul es la funcin de la tirosinasa en los animales superiores?
3. De acuerdo con los resultados obtenidos en la prctica, Cul es la interpretacin y explicacin que se le da
a la fruta o frutas que tienen una mayor concentracin de tirosinasa?
4. Qu se podr recomendar (y que no se podr recomendar), para evitar el pardeamiento de las frutas y las
papas cortadas?

Referencia
Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical Education,
54, 4, 1977, p: 257.


























PRACTICA 4

TIROSINASA II: Determinacin de la constante Michaelis-Menten y la velocidad mxima

Objetivos

13. Determinar la actividad de la tirosinasa al variar la concentracin del sustrato (L-metildopa).
14. Determinar el valor de K
M
para la tirosinasa mediante el mtodo de la curva hiperblica de Michaelis
Menten y la ecuacin de los inversos o de LineweaverBurk.

Aspectos tericos

Cintica qumica

La cintica qumica es el estudio de las velocidades de las reacciones qumicas y de los factores que influyen
en ella. La velocidad de la reaccin es una medida de la rapidez con que se forman los productos a partir de los
reactantes.

Las reacciones qumicas pueden clasificarse sobre una base cintica por el orden de reaccin, entre estas
tenemos: reacciones de orden cero, de primer orden, de segundo orden y de tercer orden, segn como resulte
influida la velocidad de la reaccin por la concentracin de los reaccionantes bajo un conjunto de condiciones
determinado como son la temperatura y la adicin de catalizadores.

Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad directamente proporcional a la
concentracin de un reaccionante. El ejemplo ms sencillo es cuando la velocidad de la reaccin:
A B

es directamente proporcional a la concentracin de A. En este caso la velocidad de la reaccin en cualquier
tiempo t, viene dada por la ecuacin:
-d [A] / dt = k [A]

en donde [A] es la concentracin molar de A y -d [A] / dt es la velocidad a que disminuye la concentracin de A.
La constante de proporcionalidad k recibe el nombre de constante de velocidad, la cual, tiene dimensiones del
recproco del tiempo, s
-1
. La forma integrada de esta ecuacin es:
ln [A] = (- k) (t) + ln [A]
0
y = m x + b
kt
=
log
[A
0
]
[A] 2.303


donde ln es el logaritmo natural, [A]
0
y [A] son las concentraciones de A a los tiempos t = 0 y t = t,
respectivamente. Debe aclararse que t = 0 no corresponde al principio del experimento; puede seleccionarse
cualquier tiempo para empezar a medir el cambio en la concentracin de A. Por lo tanto, una grfica de ln [A]
contra t es una lnea recta con una pendiente k. Este anlisis grfico permite calcular la constante de velocidad
k, como se muestra en la figura siguiente:



Para una reaccin de primer orden, el tiempo de vida media viene dado por la siguiente expresin:
t = 0.693 / k





la anterior ecuacin indica que la vida media de una reaccin de primer orden es independiente de la
concentracin inicial del reactivo.

Una reaccin de segundo orden es una reaccin cuya velocidad depende de la concentracin de uno de los
reactivos, elevada a la segunda potencia o de la concentracin de dos reactivos diferentes, cada uno elevado a
la primera potencia. El caso mas sencillo comprende solo una clase de molcula como reactivo:
2 A C

la ecuacin de velocidad de segundo orden es:

- d [A] / dt = k [A]
2

La constante de velocidad de las reacciones de segundo orden tienen unidades de 1/ M x s. Por medio del
clculo, se puede obtener la siguiente expresin para la ecuacin anterior:
1
[A]
1
[A]
0
+ kt =

por lo tanto, una grfica de 1/[A] contra t, es una lnea recta con una pendiente k:




Otro tipo de reaccin de segundo orden es:

A B
C
+

donde la ley de velocidad esta dada por:

- d [A] / dt , - d [B] / dt d [C] / dt

velocidad = k [A] [B]

la reaccin es de primer orden respecto de A y de primer orden respecto de B, por lo que tiene un orden global
de 2.

El tiempo de vida media viene dado por: t = 1 / k [A]
0


Observe que la vida media de una reaccin de segundo orden es inversamente proporcional a la concentracin
inicial del reactivo. Las mediciones de la vida media a diferentes concentraciones iniciales es una forma de
distinguir entre una reaccin de primer orden y una de segundo orden.

Las reacciones de tercer orden, que son relativamente escasas, son aquellas cuya velocidad es proporcional al
producto de tres trminos de concentracin. Algunas reacciones qumicas son independientes de la
concentracin de cualquier reactivo; son llamadas reacciones de orden cero. En este caso, la velocidad
depende de la concentracin del catalizador o de algn otro factor distinto a la concentracin de las especies
moleculares que experimentan la reaccin.

Cintica enzimtica: Ecuacin de Michaelis-Menten
Los principios generales de la cintica qumica de las reacciones qumicas son aplicables a las reacciones
catalizadas por las enzimas, pero stas muestran tambin un rasgo caracterstico, que no se observa en las
reacciones no enzimticas: la saturacin con el sustrato. En la figura siguiente vemos el efecto de la
concentracin del sustrato sobre la velocidad de la reaccin catalizada por una enzima.





A una concentracin baja de sustrato, la velocidad inicial de la reaccin
o
es casi proporcional a la
concentracin del sustrato y la reaccin, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo.
Sin embargo, a medida que la concentracin de sustrato aumenta, la velocidad inicial de la reaccin disminuye
y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentracin de sustrato; en esta zona el orden de reaccin
es mixto.

Con un aumento posterior de la concentracin del sustrato, la velocidad de la reaccin llega a ser
esencialmente independiente de la concentracin de sustrato y se aproxima asintticamente a una velocidad
constante. En este intervalo de concentraciones de sustrato la reaccin es esencialmente de orden cero con
respecto al sustrato, y se dice que la enzima se halla saturada con su sustrato. Todas las enzimas muestran el
efecto de saturacin pero varan ampliamente con respecto a la concentracin de sustrato que se necesita para
que se manifieste.

El efecto de saturacin condujo a algunos investigadores a formular la hiptesis de que la enzima y el sustrato
reaccionan reversiblemente para formar un complejo, como etapa esencial en la reaccin catalizada.

L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron una teora general acerca de la accin y cintica de las enzimas. Esta
teora que es fundamental para el anlisis cualitativo de todos los aspectos de la cintica de las enzimas y de la
inhibicin, se ha desarrollado para el caso sencillo de una reaccin en la que slo hay un sustrato.

La teora de Michaelis-Menten supone que la enzima E se combina en primer lugar con el sustrato S para
formar el complejo enzima-sustrato ES; a continuacin este ltimo se divide en una segunda etapa, para formar
la enzima libre y el producto P:
E + S ES
ES
E + P
k
+1
k
-1
k
+2
k
-2


La ecuacin de Michaelis-Menten es la ecuacin de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas
que slo actan sobre un sustrato, y se formula como sigue:

v
o
=
V
max
[ S]
K
M
+
[ S]


De donde:
o
= velocidad inicial
V
max
= velocidad mxima
[S] = concentracin del sustrato
K
M
= constante de Michaelis-Menten

De la ecuacin de Michaelis-Menten se deriva una relacin numrica en el caso especial en que la
velocidad inicial de la reaccin sea exactamente la mitad de la velocidad mxima; es decir, cuando
0
=
V
max
(ver figura anterior) K
M
= [S].



La constante de Michaelis-Menten de una enzima constituye una caracterstica til e importante, que es
fundamental no slo para la descripcin matemtica de la cintica enzimtica, sino tambin para la
determinacin cuantitativa de la actividad enzimtica en los tejidos y el anlisis de algunos mecanismos de
regulacin enzimtica.

Transformaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten
La ecuacin de Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que son ms tiles
para la expresin de los datos experimentales. Una de las transformaciones ms corrientes se obtiene
tomando los recprocos de ambos miembros de la ecuacin de Michaelis-Menten:

1
=
K
M
V
mx
1
[ S]
+
1
V
mx
v
0


La ecuacin anterior es la ecuacin de Lineweaver-Burk. Cuando 1/
0
se representa frente a 1/ [S], se
obtiene una lnea recta. La pendiente de la recta es K
M
/V
mx
, y la interseccin sobre el eje 1/
0
es 1/V
mx
; la
interseccin sobre el eje 1/ [S] es -1/K
M
, como muestra la figura siguiente:



Tal representacin doble recproca tiene la ventaja de que permite una determinacin mucho ms exacta
del valor de V
mx
, ya que en la representacin sencilla de
0
frente a [S] slo se obtiene su valor
aproximado.


Otra transformacin til de la ecuacin de Michaelis-Menten se obtiene al multiplicar esta por Vmx, y de un
posterior reagrupamiento se obtiene la siguiente ecuacin:
v
0 = - K
M
v
0
[ S]
+
V
mx


La representacin de
0
frente a
0
/ [S], llamada representacin de Eadie-Hofstee, da los valores de V
mx
y
de K
M
de una forma sencilla, como muestra la figura siguiente:





Efecto de la concentracin del sustrato sobre la actividad anzimtica
Esta relacin para un sustrato, fue estudiada por los seores Michaelis y Menten, quienes al medir la velocidad
inicial (V
i
) en numerosos experimentos donde se mantena constante la concentracin de la enzima y se iba
aumentando la concentracin del sustrato, encontraron que:

A bajas concentraciones del sustrato, la velocidad de la reaccin dependa proporcionalmente de este,
siguiendo una cintica de primer orden: V
i
= K [S]; lo que significa que como an la cantidad de enzima
presente no ha sido totalmente saturada por el sustrato, a medida que ste aumenta, la enzima acta
sobre l, y la velocidad de la reaccin se va incrementado.

A altas concentraciones del sustrato, la velocidad de la reaccin era independiente de su concentracin,
siguiendo una cintica de orden 0: V
i
= V
M
. Ello indica que en condiciones de altas concentracin del
sustrato, la enzima se halla saturada por ste, y la reaccin ya ha llegado a su mxima velocidad (V
M
).
Al adicionar ms sustrato, la velocidad no aumenta porque no hay enzima disponible para ello.

Grficamente, la relacin hallada entre la velocidad de la reaccin y la concentracin del sustrato fue de tipo
hiperblico, como describiendo una transicin desde la cintica de primer orden hasta la cintica de orden cero:













Materiales:



Fotocolormetro
Celdas del fotocolormetro
Tubos de ensayo grandes
Mortero
Silica gel

Beaker
Frasco lavador
Centrfuga
Lienzo


Reactivos:

Solucin buffer de fosfato 0.1M, pH = 7.2
Solucin buffer de fosfato 0.1M, pH = 6.0
Solucin de L-metildopa 0.03M en buffer pH =
6.0

Fuente de tirosinasa (banano,
manzana y papa)
Hielo picado



Seccin experimental

A. Extraccin de la enzima

f. Coloque 10 gramos de banano en el mortero preenfriado y adicinele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M
(pH=7,2).

g. Adicione unos 3 gramos de silica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta slida.

h. Filtre utilizando un pao y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.

i. La solucin sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.

j. Diluya la solucin sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solucin
como extracto diluido 10 veces.


B. Medida de la actividad enzimtica

a. Prepare una solucin blanco mezclando:

1.0 mL del extracto enzimtico
3.0 mL de buffer pH = 6.0
1 mL de agua destilada.

b. Calibre el fotocolormetro, utilizando la solucin anterior, a = 420 nm.

c. Mezcle en otro tubo de ensayo:

1.0 mL de extracto de enzima
3.5 mL de buffer pH = 6.0
0.5 mL de solucin de L-metildopa

d. Inmediatamente despus de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colquelo en el fotocolormetro y
lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero.

e. Anote las absorbancias registradas en el fotocolormetro cada 30 segundos durante 5 minutos.

f. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato de la
siguiente manera:

Adicione a cada tubo 1.0 mL de extracto enzimtico.


Agregue a cada tubo, respectivamente, a penas vaya a leer en el fotocolormetro, 1.0, 1.5, 2.0,
2.5 y 3.0 mL de la solucin de L-metildopa.
Complete cada tubo hasta 5 mL con buffer pH = 6.0

g. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

t(min)/ tubo 1 2 3 4 5 6
Absorbancia
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0

Todos los desechos se adicionan a residuos organicos no halogenados

Resultados

b. Con los resultados obtenidos, haga los grficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y
de ellos, calcule las pendientes de las curvas y considere este valor como la velocidad inicial
(V
i
), para cada concentracin de sustrato [S].

c. Calcule la nueva concentracin de sustrato aplicando la frmula general de dilucin:

[ S]
f
=
v
1
[ S]
i
v
2

Donde: [S]
f
= concentracin final del sustrato
[S]
i
= concentracin inicial del sustrato (0.03M)
v
2
= volumen final de la solucin (5 mL)
v
1
= volumen adicionado de sustrato

d. Con los datos obtenidos en los numerales a y b llene la siguiente tabla:

Tubo [S]
f
V
i
1/[S] 1/V
i

1
2
3
4
5
6

e. Haga una grfica de V
i
vs [S] y de 1/V
i
vs 1/ [S] y de estas determine los valores de K
M
y V
max
.

f. Compare los valores obtenidos por ambos mtodos y determine cual es el ms apropiado,
explique.

Referencia
Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical
Education, 54, 4, 1977, p: 257.







PRACTICA 5

TIROSINASA III: Efecto de un inhibidor sobre la constante Michaelis-Menten y la velocidad mxima

Objetivos

15. Determinar la actividad de la tirosinasa al variar la concentracin del sustrato (L-metildopa) en
presencia de NaCN como inhibidor.
16. Determinar el valor de K
M
para la tirosinasa mediante el mtodo de la curva hiperblica de Michaelis
Menten y la ecuacin de los inversos o de LineweaverBurk en presencia de un inhibidor.
17. Determinar el tipo del inhibidor y su constante.

Aspectos tericos

Inhibicin de las enzimas
Las enzimas catalizan todos los procesos celulares, por lo que no es sorprendente que los inhibidores
enzimticos se encuentren entre los agentes farmacuticos ms importantes. Por ejemplo, la aspirina (cido
acetilsaliclico) inhibe la enzima que cataliza el primer paso de la sntesis de prostaglandinas.

El estudio de los inhibidores enzimticos ha proporcionado informacin sobre mecanismos enzimticos y ha
ayudado a definir algunas rutas metablicas. Hay dos amplias clases de inhibidores enzimticos: reversibles e
irreversibles.

Un tipo de inhibicin reversible comn es la que se denomina competitiva, como muestra la siguiente figura:



Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima pero la reaccin no tiene lugar
cuando se ha fijado el inhibidor (I). Mientras el inhibidor ocupa el sitio activo impide la fijacin del sustrato. Los
inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen al sustrato y que se combinan con la
enzima formando el complejo EI. Debido a que el inhibidor se una de manera reversible a la enzima, se puede
cambiar el sentido de la competicin a favor del sustrato aadiendo ms de ste.

Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la probabilidad de que se fije una molcula de inhibidor por lo que la
reaccin muestra una V
mx
normal. No obstante, la [S] a la cual V
o
= V
mx
, la K
M
, aumenta en presencia del
inhibidor. Este efecto sobre la V
mx
es diagnstico de inhibicin competitiva, y se pone de manifiesto fcilmente
en una grfica de LineweaverBurk. La constante de equilibrio para la fijacin del inhibidor, K
I
, puede obtenerse
a partir de la misma grfica.




La inhibicin competitiva se utiliza en teraputica para pacientes que han ingerido metanol, un componente del
los licores adulterados y disolvente que se utiliza como anticongelante. El metanol se convierte en formaldehdo
por accin de la enzima alcohol deshidrogenada. El formaldehdo lesiona muchos tejidos, siendo la ceguera un
resultado frecuente debido a que los ojos son especialmente sensibles al mismo. El etanol compite de manera
efectiva con el metanol como sustrato de la alcohol deshidrogenada. La terapia para el envenenamiento por
metanol es la infusin intravenosa de etanol, la cual hace que la formacin de formaldehdo sea suficientemente
lenta para que la mayor parte del metanol se pueda excretar inocuamente por la orina.

Otros dos tipos de inhibicin reversible, la no competitiva y la acompetitiva, que a menudo se definen aplicados
a enzimas con un solo sustrato pero que en la prctica slo se observan con enzimas que actan con dos o
ms sustratos.

Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato, como se muestra en la
siguiente figura:


La fijacin del inhibidor no bloquea la fijacin del sustrato (y viceversa). La enzima se inactiva cuando est fijado
el inhibidor tanto si el sustrato est presente como si no lo est. El inhibidor disminuye de manera efectiva la
concentracin de la enzima activa por lo que decrece la V
mx
. Frecuentemente el efecto sobre K
M
es nulo

En la inhibicin no competitiva, representaciones similares de los datos de velocidad dan la familia de lneas
que se muestran en la figura siguiente, que tienen una interseccin comn en el eje de 1/ [S]. Esto indica que
K
M
para el sustrato no es alterada por el inhibidor no competitivo mientras que V
mx
disminuye.





En la inhibicin acompetitiva el inhibidor no se combina con la enzima libre ni afecta su reaccin con el sustrato
normal; sin embargo, el inhibidor se combina con el complejo ES para formar un complejo inactivo enzima-
sustrato-inhibidor, el cual no experimenta su transformacin posterior en el producto habitual de la reaccin:



Lo caracterstico de la inhibicin acompetitiva es que la pendiente de las rectas permanece constante al
aumentar la concentracin del inhibidor, pero la V
max
decrece.



Los inhibidores irreversibles son los que se combinan con un grupo de la enzima que es esencial para su
actividad o lo destruyen. Es frecuente la formacin de un enlace covalente entre un inhibidor irreversible y una
enzima.


En la siguiente tabla se resumen los efectos de los inhibidores sobre las representaciones de Lineweaver-Burk,
1/V
0
frente a 1/ [S].






Materiales:

Fotocolormetro
Celdas del fotocolormetro
Tubos de ensayo grandes
Mortero
Slica gel

Beaker
Frasco lavador
Centrfuga
Lienzo

Sustancias:

Solucin buffer de fosfato 0.1M, pH = 7.2
Solucin buffer de fosfato 0.1M, pH = 6.0
Solucin de L-metildopa 0.03M en buffer pH =
6.0

Fuente de tirosinasa (banano,
manzana y papa)
Hielo picado
Solucin de NaCN 0.1M


Seccin experimental

Extraccin de la enzima

k. Coloque 10 gramos de banano en el mortero preenfriado y adicinele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M
(pH=7,2).

l. Adicione unos 3 gramos de slica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta slida.

m. Filtre utilizando un pao y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM.

n. La solucin sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo.

o. Diluya la solucin sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solucin
como extracto diluido 10 veces.









Medida de la actividad enzimtica

p. Prepare una solucin blanco mezclando:



1.0 mL del extracto enzimtico
3.3 mL de buffer pH = 6.0
4 gotas (0.2 mL) de solucin de NaCN
0.5 mL de agua destilada.

q. Calibre el fotocolormetro, utilizando la solucin anterior, a = 420 nm.

r. Mezcle en otro tubo de ensayo:

1.0 mL de extracto de enzima
4 gotas de solucin de NaCN
3.3 mL de buffer pH = 6.0
0.5 mL de solucin de L-metildopa

s. Inmediatamente despus de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colquelo en el fotocolormetro y
lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero.

t. Anote las absorbancias registradas en el fotocolormetro cada 30 segundos durante 5 minutos.

u. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato de la
siguiente manera:

Adicione a cada tubo 1.0 mL de extracto enzimtico.
4 gotas de solucin de NaCN
Agregue a cada tubo, respectivamente, a penas vaya a leer en el fotocolormetro, 1.0, 1.5, 2.0,
2.5 y 3.0 mL de la solucin de L-metildopa.
Complete cada tubo hasta 5 mL con buffer pH = 6.0

v. Tabule los resultados en la siguiente tabla:

t(min)/ tubo 1 2 3 4 5 6
Absorbancia
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0


Todos los desechos se adicionan a residuos orgnicos no halogenados








Resultados

g. Con los resultados obtenidos, haga los grficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y
de ellos, calcule las pendientes de las curvas y considere este valor como la velocidad inicial
(V
i
), para cada concentracin de sustrato [S].



h. Calcule la nueva concentracin de sustrato aplicando la frmula general de dilucin:

[ S]
f
=
v
1
[ S]
i
v
2


Donde: [S]
f
= concentracin final del sustrato
[S]
i
= concentracin inicial del sustrato (0.03M)
v
2
= volumen final de la solucin (5 mL)
v
1
= volumen adicionado de sustrato

i. Con los datos obtenidos en los numerales a y b llene la siguiente tabla:

Tubo [S]
f
V
i
1/[S] 1/V
i

1
2
3
4
5
6


j. Haga una grfica de V
i
vs [S] y de 1/V
i
vs 1/[S] y de estas determine los valores de K
M
y V
max
.

k. Compare los valores obtenidos por ambos mtodos y con los obtenidos en ausencia de
inhibidor (sesin anterior); determine el tipo de inhibidor.

l. Calcule el valor de KI dependiendo del tipo de inhibidor, utilizando las ecuaciones
correspondientes (ver grficos y tabla en la parte terica).


Referencia
Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical Education,
54, 4, 1977, p: 257.



























PRACTICA 6

HIDRLISIS ENZIMTICA DE PROTENAS

Objetivo

Determinar la actividad de las proteasas al hidrolizar una solucin de protenas

Aspectos tericos
Las protenas son hidrolizadas en presencia de enzimas proteolticas o proteasas, las cuales actan sobre los
enlaces peptdicos. Esta hidrlisis puede ocurrir en diferentes sitios de la protena; cuando ocurre en las
posiciones terminales, las proteasas se denominan exopeptidasas (aminopeptidasas o carboxipeptidasas) y
endopeptidasas cuando la hidrlisis se realiza en las posiciones internas, como se muestra la siguiente figura:


H
2
N
H
N
N
H
H
N
N
H
OH
R
1
O R
2
O R
3
O R
4
O R
5
O
Aminopeptidasa
Endopeptidasas
Carboxipeptidasa
H
2
O/Proteasas
H
2
N
H
2
N
H
2
N
H
2
N
H
2
N
OH
R
1
O R
2
O R
3
O
R
4
O R
5
O
OH
OH
OH
OH
+
+
+
+


Las endopeptidasas son especficas a la clase de aminocido implicado en el enlace peptdico. Entre las
endopeptidasas ms comunes se destacan: la tripsina, la pepsina, la quimiotripsina y la termolisina (ver figura).

Escisin Especfica de Cadenas Polipeptdicas



N
H
C C N
H
R
1
O
C
H
C
R
2
H O
Aminocido 1 Aminocido 2



Mtodo


Enlaces Pptidicos escindidos
Tripsina Aminocido 1 = lisina o arginina
Quimotripsina Aminocido 1 = fenilalanina, triptfano o tirosina
Pepsina Aminocido 1 = fenilalanina, triptfano, tirosina y otros
Termolisina Aminocido 2 = leucina, isoleucina o valina
Bromuro de
ciangeno
Aminocido 1 = metionina


La tripsina es una enzima digestiva secretada por el pncreas al intestino delgado, en forma de su precursor, el
tripsingeno. La tripsina es muy especfica, slo cataliza la hidrlisis de aquellos enlaces peptdicos en que la


funcin carbonilo es aportada por el resto de lisina o por el de arginina, con independencia de la longitud o la
secuencia de aminocidos de la cadena.

La termolisina, que es una proteasa bacteriana termoestable, puede hidrolizar enlaces peptdicos en los que la
funcin amino es aportada por los aminocidos no polares, leucina, isoleucina y valina. Es especialmente til
para la hidrlisis parcial de polipptidos que no contienen arginina o lisina y son, por lo tanto, resistentes al
ataque por la tripsina.

La cuantificacin de los aminocidos liberados se realiza neutralizando previamente los grupos alfa amino libres
por adicin de formaldehdo, como se indica en la siguiente figura:

H
2
N CH
R
C
O
OH + C H H
O
HN CH
R
C
O
OH HOH
2
C
N-monometilol
N CH
R
C
O
OH H
2
C
N-metileno
N CH
R
C
O
OH HOH
2
C
N,N-dimetilol
C H H
O
CH
2
OH


Los grupos carboxilo se valoran cuantitativamente utilizando NaOH 0.05N


Materiales:

Erlenmeyers
Bureta
Bao mara

Soporte universal
Pinza y nuez


Reactivos:

Solucin de protena (gelatina 5%)
Solucin de pancreatina al 0.5% en buffer de
borato pH = 8.4
Solucin de NaOH 0.05N

Fenolftalena al 1%
Solucin concentrada de
formaldehdo


Seccin Experimental

a. Mida 25 mL de solucin de protena y colquelos en un erlenmeyer de 125 mL. Adicione 5 mL de la
solucin de pancreatina (tomar este tiempo como tiempo cero, t
0
) y ponga la mezcla en un bao mara
a 37C.

b. Transfiera 5 mL de la mezcla anterior a un erlenmeyer y caliente hasta ebullicin. Esperar 2 minutos y
enfriarla.

c. Adicione 7.5 mL de solucin de formaldehdo y 3 gotas de fenolftalena.

d. Titule esta solucin con NaOH 0.05N hasta obtener un color rosa plido permanente. Anote el volumen
utilizado.

e. A partir del tiempo cero contar 15, 30, 45 y 60 minutos y medir en cada intervalo 5 mL de la mezcla
original y repetir el procedimiento descrito en los numerales (b), (c) y (d).


Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos


Dispngalos por el desague



Resultados y preguntas

a. Grafique los equivalente-gramo de NaOH utilizados vs tiempo. La pendiente de esta grfica
corresponde a la actividad en equivalentes de aminocidos hidrolizados por minuto y por mL de
solucin proteica.

b. Compare el resultado obtenido con el dato reportado (400u, donde 1u es aquella cantidad de enzima
que cataliza la transformacin de 1mol de sustrato/minute, en condiciones estndar 25
o
C y pH optimo.

c. Cul(es) es (son) la (s) proteasa (s) contenidas en la pancreatina? Cuales enlaces peptdicos son
hidrolizados?

d. Qu otros enlaces peptdicos puede hidrolizar la pepsina fuera de aquellos que contienen los
aminocidos de Phe, Trp y Tyr?












































PRCTICA 7

ACCIN CATALITICA DE LA LIPASA PANCRETICA

Objetivos

18. Determinar la actividad enzimtica de la lipasa pancretica al catalizar por hidrlisis una muestra de
triacilglicrido.
19. Analizar el efecto activador del ion calcio (Ca
2+
), sobre la lipasa.

Aspectos tericos
La lipasa es una enzima especfica para los steres en la posicin del glicerol y prefiere cidos grasos de
cadena larga con ms de 10 tomos de carbono. La accin cataltica de la lipasa pancretica tiene lugar en la
interfase agua-lpido de las partculas emulsionadas micelas. La presencia de los cidos biliares que si bien
constituyen a la formacin de las micelas, presentan una fuerte inhibicin sobre la enzima, la cual es superada
por la adicin de una protena que forma un complejo estabilizador con la lipasa. Esta protena es denominada
colipasa. La hidrlisis de los triacilglicridos por accin de la lipasa, se presenta a continuacin:

C O CH
CH
2
CH
2
O
O C
C R
1
O
R
3
O R
2
O
+ 2 H
2
O
Lipasa
C O CH
CH
2
CH
2
OH
OH
R
2
O
HO
HO C
C R
1
O
R
3
O
+
+


Los factores que afectan la velocidad de hidrlisis son:

a. El pH: Generalmente las lipasas actan a pH alcalino.
b. La temperatura: La temperatura de accin ms efectiva est entre los 30 y 40C.
c. Activadores: El ion calcio (Ca
2+
) aumenta la estabilidad de la lipasa y produce sales de calcio, las cuales
precipitan e impulsan la reaccin en sentido directo. Los cloruros (Cl
-
) y los bromuros (Br
-
) tambin
actan como activadores.
d. Inhibidores: Algunos aniones entre ellos el nitrato (NO
3-
), el fluoruro (F
-
) y agentes oxidantes como el
agua oxigenada (H
2
O
2
) actan como inhibidores de la lipasa.

Materiales:

Tubos de ensayo
Bureta
Erlenmeyers

Soporte universal
Pinza y nuez
Bao mara

Sustancias:

Buffer de borato (pH = 8.4)
Aceite vegetal
Solucin enzimtica (utilizando 2 pastillas de
creoflat)
2



Solucin de hidrxido de sodio
(NaOH) 0.02N
Solucin de CaCl
2
10%
Fenolftalena


2
La solucin enzimtica se prepara macerando 2 pastillas de pancreoflat, que no contengan sales biliares, en 50 mL de buffer a pH = 8.4 y
conserve la solucin en bao Maria a 37C


Seccin Experimental

a. Solucin blanco: adicione a un tubo de ensayo grande los siguientes componentes:

10 mL de agua
5 gotas de aceite
5 mL de solucin enzimtica

Caliente el tubo de ensayo por 1 minuto en agua a ebullicin, deje enfriar, transvase el contenido a un
erlenmeyer, adicione 3 gotas de fenolftalena y titule con NaOH 0.02N hasta obtener un color rosado
plido.

b. Disponga de 6 tubos de ensayo y prepare en cada uno las siguientes soluciones como se indican en la
tabla siguiente:

Tubo Aceite
(gotas)
Sln. CaCl
2
(mL) H
2
O (mL) Fenolftalena
(gotas)
1 5 - 10 3
2 5 - 10 3
3 5 - 10 3
4 5 0.5 9.5 3
5 5 0.5 9.5 3
6 5 0.5 9.5 3

c. Adicione, gota a gota, NaOH 0.02N a cada uno de los tubos hasta obtener un color rosado plido igual
al blanco.

d. Coloque los tubos en un bao de agua a 37C y adicione 5 mL de solucin enzimtica a cada uno.
Anote el tiempo de inicio de la reaccin.

e. Transcurridos los primeros 15 minutos, caliente los tubos 1 y 4 en agua hirviendo durante un minuto.
Dejelos enfriar, trasvselos a un erlenmeyer, adicione 3 gotas de fenolftalena a cada uno y titule con
NaOH 0.02N. Anote los mL de NaOH utilizados.

f. Transcurridos 30 minutos, efecte con los tubos 2 y 5, el mismo procedimiento anterior.

g. Transcurridos 45 minutos, efecta con los tubos 3 y 6, el mismo procedimiento descrito en (e).


Los residuos obtenidos no son considerados
peligrosos dispngalos por el desage

















Resultados



m. Con los resultados obtenidos calcule los equivalentes-gramo de NaOH consumidos de la
siguiente manera:

Eq-g
NaOH
= 0.02 (V V
b
)

Donde: V = volumen gastado de NaOH en cada titulacin
V
b
= volumen gastado de NaOH en la titulacin del blanco

n. Tabule los resultados obtenidos en el numeral anterior y el tiempo registrado en la tabla
siguiente:

Tubo Eq-g
NaOH
Tiempo (min)
1 15
2 30
3 45
4 15
5 30
6 45

o. Haga una grfica de Eq-g
NaOH
vs tiempo para los tubos sin ion calcio, Ca
2+
(tubos: 1, 2 y 3) y
para los tubos con ion calcio (tubos: 4, 5 y 6).

p. Calcule la actividad (la pendiente de la curva) en Eq-g/min de cidos graso hidrolizados.

q. Compare las actividades sin ion calcio, con ion calcio y con el dato reportado*.

* Actividad enzimtica de la proteasa: 400u, donde 1u es aquella cantidad de enzima que
cataliza la transformacin de 1mol de sustrato/minute, en condiciones estndar 25
o
C y pH
ptimo.
































PRCTICA 8

GLICLISIS ANAEROBIA (FERMENTACIN ALCOHLICA)

Objetivos

20. Determinar las diferentes velocidades en la fermentacin de mono, di y polisacridos.
21. Determinar el efecto de la concentracin en el proceso de fermentacin.
22. Comprobar la inhibicin de la ruta metablica ocasionada por el NaF.


Aspectos tericos

El metabolismo: Es el conjunto de reacciones y procesos fsico-qumicos que ocurren en una clula. Estos
procesos complejos interrelacionados son la base de la vida a nivel molecular, y permiten las diversas
actividades de las clulas: crecer, reproducirse, mantener sus estructuras, responder a estmulos, etc.
El metabolismo se divide en dos procesos conjugados: catabolismo y anabolismo. Las reacciones catablicas
liberan energa; un ejemplo es la gluclisis, un proceso de degradacin de compuestos como la glucosa, cuya
reaccin resulta en la liberacin de la energa retenida en sus enlaces qumicos. Las reacciones anablicas, en
cambio, utilizan esta energa liberada para recomponer enlaces qumicos y construir componentes de las
clulas como lo son las protenas y los cidos nucleicos. El catabolismo y el anabolismo son procesos
acoplados que hacen al metabolismo en conjunto, puesto que cada uno depende del otro

La glucolisis: Es la va metablica encargada de oxidar la glucosa y as obtener energa para la clula. sta
consiste de 10 reacciones enzimticas que convierten a la glucosa en dos molculas de piruvato, la cual es
capaz de seguir otras vas metablicas y as continuar entregando energa al organismo.

En la gluclisis, se metaboliza la glucosa en la parte fluida del citoplasma en dos molculas de piruvato y se
generan dos molculas netas de ATP de ganancia. Durante este proceso, se activa la molcula de glucosa por
adicin de fosfatos provenientes de dos molculas de ATP para formar bisfostato de fructosa. Este compuesto
se descompone, mediante una serie de reacciones, en dos molculas de piruvato. Estas reacciones producen
cuatro molculas de ATP y dos transportadores de electrones, N ADH. Debido a que se consumieron dos ATP
en las etapas de activacin, el rendimiento neto de la gluclisis es de dos ATP y dos NADH. La gluclisis,
adems de proporcionar un pequeo rendimiento de ATP, consume NAD
+
para producir NADH. Una vez, que la
provisin de NAD
+
de la clula se ha consumido, la gluclisis se detiene.

La reaccin global de la gluclisis es:
Glucosa + 2NAD
+
+ 2ADP + 2Pi 2 Piruvato + 2NADH
+
2ATP
+ 2H
+
+
2H
2
O

Los productos de esta reaccin, mostrados arriba, son utilizados por la clula en muchas funciones:
El ATP (Adenosn trifosfato) es la fuente de energa universal de la clula.
NADH y H
+
, otorgan la capacidad de reducir otros compuestos pertenecientes a otras vas metablicas,
o bien para sintetizar ATP.
El piruvato es la molcula que seguir oxidandose en el ciclo de Krebs, como parte de la respiracin
aerbica, donde dar origen a ms molculas NADH, que podrn pasar a sintetizar ATP en la
mitocondria





La gluclisis se divide en dos partes principales y diez reacciones enzimticas, las que se describen a
continuacin.

1. La primera reaccin de la gluclisis es la fosforilacin de la glucosa, para activarla (aumentar su energa) y
as poder utilizarla en otros procesos cuando sea necesario. Esta activacin ocurre por la transferencia de un
grupo fosfato del ATP, una reaccin catalizada por la enzima hexoquinasa, la cual puede fosforilar (aadir un
grupo fosfato) a molculas similares a la glucosa, como la fructosa y manosa.


O
HO
HO
OH
OH
OH
O
HO
HO
OH
OH
OP
HO
OH
O
OP HO
OH
HO
OH
O
OP PO
OH
COH
CHOH
CH
2
OP
CH
2
OH
C
CH
2
OP
O
GA3P
D3P
COOP
CHOH
CH
2
OP
1-3PGlicerato
COOH
COP
CH
2
COOH
C
CH
3
O
ACIDO
PIRUVICO
ATP ADP
Pi 1 2
Glucosa
Glucosa 6P
Fructosa 6P
ATP ADP
Pi 3
Fructosa 1-6P
NAD
NADH.H
Pi
ADP ATP
PEP
6
9
10
Mg
2+
Mg
2+
COO
-
CHOH
CH
2
OP
ADP ATP
7
Mg
2+
COO
-
CHOP
CH
2
OH
Fosfoglicerato
mutasa
5
4
8
3PGlicerato 2PGlicerato
Enolasa
Piruvatoquinasa
Fosfogliceratoquinasa
Glicesraldehido
3P-deshidrogenasa
Aldolasa
Fosfotriosa
isomerasa
Fosfofructoquinasa
Fosfohexosa
isomerasa
Glucoquinasa



2. En esta reaccin, la glucosa-6-fosfato se isomeriza a fructosa-6-fosfato, mediante la enzima fosfohexosa
isomerasa. La isomerizacin ocurre en una reaccin de 4 pasos, que implica la apertura del anillo y un traspaso
de protones.
3. Fosforilacin de la fructosa 6-fosfato en el carbono 1, con gasto de un ATP, a travs de la enzima
fosfofructoquinasa-1 (PFK1). Tambin este fosfato tendr una baja energa de hidrlisis. Por el mismo motivo
que en la primera reaccin, el proceso es irreversible. El nuevo producto se denominar fructosa-1,6-Bisfosfato.
4. La enzima aldolasa (Fructosa-1,6-bifosfato aldolasa), mediante una condensacin aldlica reversible, rompe
la fructosa-1,6-bifosfato en dos molculas de tres carbonos (triosas): dihidroxiacetona fosfato y Gliceraldehdo-
3-fosfato.
5. Puesto que slo el gliceraldehdo-3-fosfato puede seguir los pasos restantes de la gluclisis, la otra molcula
generada por la reaccin anterior (dihidroxiacetona-fosfato) es isomerizada (convertida) en gliceraldehdo-3-
fosfato. sta reaccin posee una energa libre en condiciones estandar positiva, lo cual implicara un proceso no
favorecido, sin embargo al igual que para la reaccin 4, considerando las concentraciones intracelulares reales
del reactante y el producto, se encuentra que la Energa Libre total es negativa, por lo que la direccin
favorecida es hacia la formacin de G3P.
6. Se utiliza un fosfato inorgnico y una molcula de NAD+ para producir 1,3-bifosfoglicerato y una molcula de
NADH + H
+
. Esta reaccin la cataliza la gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa o GAP-deshidrogenasa. Llama
la atencin que el fosfato se ha introducido sin utilizar ATP, sino aprovechando la energa producida por la
reaccin redox. Ahora, el fosfato que se ha introducido tiene una alta energa por lo que se podr transferir al
ATP. Esto se conoce como fosforilacin a nivel de sustrato.
7. Se desfosforiliza el 1,3-bifosfoglicerato gracias a la fosfoglicerato quinasa, formndose una molcula de ATP
por cada una de 1,3-BPG y dando lugar al 3-fosfoglicerato.


8. Se isomeriza el 3-fosfoglicerato procedente de la reaccin anterior dando 2-fosfoglicerato, la enzima que
cataliza esta reaccin es la fosfoglicerato mutasa. Lo nico que pasa aqu es el cambio de posicin del fosfato
del C3 al C2. Son energas similares y por tanto reversibles, con una variacin de energa libre cercana a cero.
9. La enzima enolasa propicia la formacin de un doble enlace en el 2-fosfoglicerato, eliminando una molcula
de agua formada por el hidrgeno del C2 y el OH del C3. El resultado es el fosfoenolpiruvato.
10. Desfosforilacin del fosfoenolpiruvato, obtenindose piruvato y ATP. Reaccin irreversible mediada por la
Piruvato quinasa.

Destino del piruvato
El piruvato formado en la gluclisis puede tomar tres rutas catablicas alternativas como se muestra en la
siguiente figura:

En condiciones anaerbicas el piruvato se convierte a dos molculas de lactato (fermentacin lctica que se
realiza en el msculo), y en condiciones aerbicas el piruvato se convierte a dos molculas de acetil-CoA que
luego ingresa al ciclo del cido ctrico (realizado en la mitocondria) y se degrada a CO
2
y H
2
O. Siguiendo esta
va, donde el aceptor final es el oxgeno, se obtendrn 30 32 ATP, los cuales sern usados por la clula como
fuente de energa para las funciones normales de la clula, como la proliferacin, el crecimiento y metabolismo.
Por otro lado, el piruvato bajo condiciones anaerbicas se convierte en etanol y dos molculas de dixido de
carbono, ruta conocida como fermentacin alcohlica.

Fermentacin alcohlica: gluclisis anaerobia
Es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de oxgeno, originado por la actividad de algunos
microorganismos, como las levaduras, que procesan los carbohidratos para obtener como productos finales:
etanol, dixido de carbono y dos molculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su
metabolismo celular energtico anaerbico. El proceso se muestra en la siguiente figura:

Glucosa
O
-
O
CH
3
O
Piruvato
H
+
CO
2
H
CH
3
O
Acetaldehido
NADH + H
+
NAD
+
CH
3
CH
2
OH
Alcohol
deshidrogenasa
Piruvato
descarboxilasa
Glucolisis
O
HO
HO
OH
OH
OH
Etanol

Despus de la formacin del piruvato en la glucolisis, este se descarboxila (pierde CO
2
), convirtindose en
acetaldehdo por accin del enzima piruvato descarboxilasa. El proceso se complementa con la reaccin que
genera el etanol y el agente oxidante (NAD
+
), requerido por la levadura para continuar haciendo gluclisis y
disponer de ATP. Esta reaccin es promovida por la enzima etanol deshidrogenada, distribuida en todos los
organismos.
Desde el punto de vista energtico, las fermentaciones son muy poco rentables si se comparan con la
respiracin aerobia, ya que a partir de una molcula de glucosa slo se obtienen 2 molculas de ATP, mientras
que en la respiracin se producen 38. Esto se debe a la oxidacin del NADH, que en lugar de penetrar en la
cadena respiratoria, cede sus electrones a compuestos orgnicos con poco poder oxidante.


La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica proporcionar energa anaerbica a los
microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno para ello disocian las molculas de glucosa y
obtienen la energa necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO
2
como desechos consecuencia de la
fermentacin. Las levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son microorganismos muy habituales en
las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados.
El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza,
la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar tambin etanol mediante la fermentacin a
nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible.


Es necesario anotar que se denomina gluclisis al proceso que lleva desde la glucosa al piruvato, sin embargo,
en algunas reacciones intermedias de este proceso es posible el ingreso de otros monosacridos diferentes a la
glucosa, como fructosa, manosa o galactosa, casos en los cuales se habla de gliclisis.

En la prctica de laboratorio se pretende observar y cuantificar la velocidad a la cual cierto tipo de levadura es
capaz de fermentar diferentes sustratos (mono, di y polisacridos), midiendo la cantidad de CO
2
que se va
generando en el tiempo:

reaccin
= d(cant. CO
2
)/dt


Materiales:

Tubos de ensayo
Beaker
Bao mara
Regla
Tapones

Agujas de jeringa
Manguera con 0.35 cm de dimetro y
3m de largo
Solucin coloreada (azul de metileno o
violeta de genciana)


Sustancias:

Levadura fresca al 5%
3

Glucosa 1% y 10%
Fructosa al 10%
Sacarosa al 10%
Almidn 1 %
NaF 0.1M
Agua destilada



Seccin Experimental

f. Adicione a un tubo de ensayo 5mL de suspensin de levadura y 2mL de solucin de glucosa al 10%.

g. Tape el tubo de ensayo con un tapn de caucho, agite y atraviese el tapn con una aguja de jeringa
desechable.

h. Tome una manguera para fermentacin, adicinele 1mL de solucin coloreada, colquela a presin en
la boca de la aguja y fjela a la mesa de trabajo con cinta. Tanto el tapn como la manguera deben
quedar bien hermticos de tal forma que no hayan fugas. Procure que la manguera quede lo mas lineal
posible.

i. Ponga el sistema en un beaker que contenga agua entre 37-40C. Tenga cuidado que la manguera no
quede en contacto con alguna superficie caliente y la solucin coloreada no est a ms de 50 cm del
tubo.

j. Marque la manguera donde se encuentra la solucin coloreada.


3
Esta solucin se prepara en un buffer de acetato pH = 5.5


k. A penas comience a moverse la solucin coloreada cuente dos minutos y vuelva a marcar la posicin
donde se encuentra esta solucin.

l. Siga marcando cada dos minutos durante doce minutos.

m. Desconecte la manguera y mida con una regla la distancia recorrida por la solucin coloreada cada dos
minutos.

n. Repita los pasos (a) hasta (h) con: glucosa al 1%, fructosa al 10%, sacarosa al 10% y almidn al 1%.

o. Adicione a un tubo de ensayo 5mL de suspensin de levadura, 2mL de solucin de glucosa al 10% y
1mL de agua destilada.

p. Repita los pasos (b) hasta (h)

q. Por ltimo, coloque en un tubo de ensayo 5mL de suspensin de levadura, 2mL de solucin de glucosa
al 10% y 1mL de la solucin de NaF y repita los pasos (b) hasta (h).

r. Anote los datos en la siguiente tabla:


Carbohidrato Glucosa
1%
Glucosa 10%

Glucosa 10%
con NaF
Fructosa
10%
Sacarosa
10%
Almidn
1%
Tiempo (min) Longitud (cm)
2
4
6
8
10


Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos
Dispngalos por el desague


Resultados

e. Con los datos obtenidos en el numeral anterior calcule la velocidad de la reaccin para cada
carbohidrato y complete la tabla.

Carbohidrato
reaccin

Glucosa 1%
Glucosa 10%
Glucosa 10% con NaF
Fructosa 10%
Sacarosa 10%
Almidn 1%


Nota: el volumen de CO
2
producido se calcula con la frmula del volumen de un cilindro: V = r
2
h,
donde: r , es el radio de la manguera (0.17cm) y h es el promedio de las longitudes medidas (haga esta
operacin con los valores que sean ms homogneos)



a. Escriba la reaccin neta balanceada de la fermentacin de cada uno de los carbohidratos.

b. Segn las ecuaciones del numeral anterior, Dnde ocurrira la mayor produccin de CO
2
? Est ello
de acuerdo con los datos obtenidos experimentalmente?



c. Segn la experiencia cual es el orden de los carbohidratos segn la rapidez en la fermentacin? Cmo
se podra justificar?

d. Cmo interpretara el efecto del fluoruro de sodio (NaF) sobre la fermentacin?.



Preguntas

e. En que consiste la fermentacin lctica y glicrica? En que diferencian de la fermentacin etanlica?

f. El arsenato (AsO
4
2-
) es qumicamente similar al fosfato inorgnico (PO
4
2-
) y algunas enzimas que
utilizan fosfato inorgnico pueden utilizar tambin el arsenato. La produccin de ATP en la glucolisis es
inhibida por el arsenato. Identifique las enzimas que pueden ser afectadas.

g. Adems de ATP, se forman otros dos productos importantes en la glicolisis. Cules son?

h. Enumere algunos inhibidores de la gliclisis











































PRACTICA 9
DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SUERO SANGUNEO

Objetivos

1. Cuantificar el contenido de glucosa en suero sanguneo
2. Comparar el resultado obtenido con los datos reportados y determinar el estado de salud del paciente


Aspectos Tericos

Metabolismo de los glcidos.
La digestin de los polisacridos se inicia en la boca, en donde la amilasa de la saliva hidroliza el almidn para
dar dextrinas y maltosa. En el estmago, la amilasa de la saliva se inactiva por el pH. En el intestino, a pH ms
alcalino, actan las enzimas procedentes del pncreas como la amilasa pancretica. Finalmente, enzimas de la
mucosa intestinal concluyen la degradacin (disacaridasas). Posteriormente los monosacridos, principalmente
la glucosa, son absorbidos a travs de la pared intestinal hacia el torrente sanguneo y llevados al hgado por
medio de la circulacin portal.

La glucosa es la principal fuente de energa en los seres vivos. Por tal razn es un metabolito fundamental en
los procesos biolgicos. La glucosa tras su degradacin por la va glucoltica se obtiene una gran cantidad de
energa en forma de ATP. Alteraciones en el metabolismo de la glucosa conducen a estados de hipoglucemia o
hiperglucemia (diabetes) que producen unos trastornos clnicos que en algunos casos pueden resultar fatales.
La determinacin del contenido de glucosa en el suero fisiolgico es una prueba indicativa del estado de salud
del individuo y resulta necesaria en los casos de alteraciones metablicas u hormonales (deficiencia en insulina,
glucagn, etc).

Alteraciones del metabolismo glucdico, la diabetes
Aunque las patologas relacionadas con alteraciones del metabolismo glucdico son muy diversas, vamos a
centrarnos en los trastornos en la regulacin del nivel de la glucosa en sangre. Cuando la homeostasis de la
glucosa se rompe por disfuncin de cualquier elemento que la mantiene, sobrevienen los sndromes hiper o
hipoglucmicos que, como su nombre indican, conllevan el aumento (>120 mg/dL en ayunas) o la disminucin
(<45-50mg/dL) de la glucemia, respectivamente.

Diabetes mellitus
La diabetes mellitus es la causa ms frecuente y grave de hiperglucemia. Es una metabolopata crnica que
aparece como consecuencia de la deficiencia absoluta o relativa de insulina. En estas condiciones, la entrada
de glucosa en las clulas est disminuida y en consecuencia los niveles en sangre se mantienen elevados
(hiperglucemia). Esta deficiencia da lugar a una serie de complicaciones a largo plazo, lo que origina una gran
morbilidad y mortalidad.

Causas de la diabetes mellitus
La glucosa es un azcar que proviene de los alimentos que comemos, circula por la sangre y es utilizada por el
organismo para obtener la energa necesaria para desarrollar cualquier tipo de trabajo. La causa de la diabetes
es una anomala en la produccin o el funcionamiento de la insulina por el pncreas.

La insulina es una hormona que fabrica el pncreas, cuya misin es facilitar el paso de los azcares de la
sangre a las clulas. Cuando no hay insulina como en los diabticos jvenes (Tipo 1), o no funciona
correctamente, como ocurre en los adultos (Tipo 2), el azcar no pasa de la sangre a los rganos y el
funcionamiento es deficiente. Al tiempo, el azcar se acumula en la sangre en cantidades superiores a las
normales, apareciendo hiperglucemia. Cuando la glucosa en sangre es superior a 180 mg, el organismo no
puede retenerla, por lo que la elimina por la orina: Glucosuria. En un paciente mal controlado o no tratado
aparecer hiperglucemia y glucosuria.

Clasificacin: Actualmente la diabetes se clasifica en:
a. Diabetes tipo I (dficit total de insulina).
b. Diabetes tipo II (resistencia a la insulina o defecto secretor con resistencia a la insulina, los enfermos al
principio no requieren la administracin de insulina).
c. Diabetes secundaria (enfermedades pancreticas, tumores endocrinos, entre otros).
d. Diabetes gestacional (se detecta durante el embarazo).




Cmo se detecta la Diabetes?
El estudio de diabetes se realiza mediante la medicin de la glucosa en sangre y en ayunas (glucemia basal) y
se recomienda en las siguientes circunstancias:
En todos los individuos mayores de 45 aos, y repetir cada 3 aos mientras sea normal.
En poblacin ms joven cuando existan factores de riesgo.
Cuando aparezcan sntomas o signos que sugieran diabetes:
- Poliuria (orinar mucho).
- Polifagia (aumento del apetito).
- Polidipsia (beber mucho por sed).
- Prdida de peso.
- Retinopata.
- Proteinuria.
- Infecciones urinarias de repeticin.
- Infecciones cutneas de repeticin,...
Cuando el nivel de glucosa plasmtica en ayunas est entre 110 y 125, hay que repetir la glucemia y si
persiste, realizar un test de Tolerancia Oral (75g de glucosa disuelta en 300ml de agua que se ha de tomar en
3-5 minutos).
Pacientes con antecedentes de Hipertensin arterial o trastornos del colesterol.

Determinacin de glucosa: para el diagnstico de la diabetes es necesario determinar la glucemia, pero
cmo se cuantifica el nivel de glucosa en una muestra?, Los mtodos para determinar la concentracin de
glucosa se clasifican en dos grandes grupos:

a) Mtodos basados en el poder reductor de los hidratos de carbono (reaccin de Benedict, mtodo de la o-
toluidina)

b) Mtodos enzimticos: son los ms utilizados, utilizan enzimas como reactivos (ej. glucosa oxidasa,
hexoquinasa) a fin de aumentar la especificidad. Los dos mtodos que vamos a citar se pueden utilizar para
determinar la glucosa en muestras de suero, orina y lquido cefalorraqudeo.

b.1.) Mtodo de la hexoquinasa: Es el mtodo de referencia y consiste en dos reacciones acopladas:

Glucosa + ATP
Hexoquinasa, Mg++
G-6-PO
4
+ ADP
G-6-PO
4
G-6-PD
6-fosfogluconato NADPH H
+
NADP
+
+
+
+


En la primera reaccin (especfica), catalizada por la enzima hexoquinasa, se fosforila la glucosa formndose
glucosa 6-fosfato. La glucosa 6-fosfato, en una reaccin posterior (reaccin indicadora), se transforma en 6-
fosfogluconato producindose NADPH (1 mol por cada molcula de glucosa). La produccin de NADPH origina
un aumento de absorbancia a 340nm. El incremento de absorbancia a esta longitud de onda ser directamente
proporcional a la concentracin de glucosa.

b.2.) Mtodo de la glucosa oxidasa: Al igual que el anterior consiste en dos reacciones acopladas:


Glucosa + O
2
glucosa oxidasa
cido glucnico H
2
O
2
H
2
O
2
+
cromgeno reducido
peroxidasa
cromgeno oxidado H
2
O
+
+
+ H
2
O


En la primera reaccin (reaccin especfica), catalizada por la enzima glucosa oxidasa (GOD), se oxida la
glucosa y se genera H
2
O
2
. En la segunda reaccin (reaccin indicadora), la enzima peroxidasa (POD) cataliza
la descomposicin del H
2
O
2
lo que provoca oxidacin de un cromgeno que pasa de su forma reducida
(incolora) a su forma oxidada (coloreada). La aparicin del cromgeno oxidado se evala mediante un
espectrofotmetro y ser directamente proporcional a la concentracin de glucosa en la muestra. La 4-


aminoantipirina / fenol es uno de los cromgenos ms utilizados, es oxidado por el agua oxigenada en un compuesto
de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm, con un pico de mxima absorbancia a 500 nm.

Glucosa + 1/
2
O
2
glucosa oxidasa
cido glucnico H
2
O
2
2 H
2
O
2
+
peroxidasa
4 H
2
O
+
+
+ H
2
O
4-Aminoantipirina Fenol
Quinonaimina
+


Este mtodo (GOD/POD) presenta como desventaja que muchos compuestos presentes en el suero u orina
(bilirrubina, cido ascrbico y cido rico) pueden ser oxidados por el H
2
O
2
producido en la reaccin catalizada
por la enzima GOD y por tanto interfieren en el resultado (se da un resultado superior al real).

Tambin se puede cuantificar la concentracin de glucosa de la muestra utilizando slo la primera reaccin y
evaluando la cantidad de oxgeno consumido mediante un electrodo de oxgeno. La cantidad de glucosa en la
muestra es directamente proporcional a la cantidad de oxgeno consumido.

Aspectos prcticos a considerar cuando se analiza la glucemia:
1. Centrifugar la sangre lo antes posible: los eritrocitos y leucocitos consumen glucosa, por tanto, si el contacto
con las clulas es prolongado se pueden dar resultados falsamente bajos (a temperatura ambiente puede
incluso desaparecer al cabo de 6h). Actualmente, existen tubos con separador de suero que funciona como una
interfase entre las clulas y el suero despus de la centrifugacin, haciendo que no sea necesario separar el
suero en otro tubo.
2. Si no se van a analizar inmediatamente, se puede refrigerar la muestra o aadir un conservante ej. Fluoruro
sdico.
3. La concentracin de glucosa en suero refrigerado es estable durante 3 das.


Materiales, Equipos y Sustancias

Sustancias Materiales y Equipos
Suero sanguneo Tubos de ensayo
Reactivos para determinar glucosa:
A. Reactivo: Fosfatos 100 mmol/L, fenol 5 mmol/L, glucosa oxidasa > 10 U/mL,
peroxidasa > 1U/mL, 4-aminoantipirina 0,4 mmol/L, pH 7,5
S. Patrn de Glucosa/Urea/Creatinina: Glucosa 100 mg/dL (5,55 mmol/L), urea
50 mg/dL, creatinina 2 mg/dL. Patrn primario acuoso.

Micropipetas
Espectrofotmetro

Conservacin de los reactivos:
Conservar a 2-8C.
El Reactivo y el Patrn son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se
conserven bien cerrados y se evite la contaminacin durante su uso.

Indicaciones de deterioro:
Reactivo: Presencia de partculas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,150 a 500 nm (cubeta de 1
cm).
Patrn: Presencia de partculas o turbidez.

Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. El suero o plasma deben separarse de los
elementos celulares lo antes posible para evitar la glucolisis. La adicin de fluoruro sdico a la muestra de
sangre previene la glucolisis. La glucosa en suero o plasma es estable 5 das a 2-8C. Los anticoagulantes
como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.

Caractersticas metrolgicas
Lmite de deteccin: 0,23 mg/dL = 0,0126 mmol/L
Lmite de linealidad: 500 mg/dL = 27,5 mmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra
1/4 con agua destilada y repetir la medicin.
Sensibilidad: 4 mAdL/mg = 0,22 mAL/mmol


Interferencias: la hemoglobina (> 3 g/L), la lipemia (trigliceridos >1,25 g/L) y la bilirrubina (10 mg/dL)
interfieren.. Otros medicamentos y sustancias pueden interferir.




Seccin Experimental

1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.
2. Pipetear en tubos de ensayo:

Tubo 1 (blanco) Tubo 2 Tubo 3
Patrn - 10 L -
Muestra - - 10 L
Reactivo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Nota: para la conservacin y economa del reactivo se recomienda preparar solo un tubo blanco por grupo.
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos a
37C.

4. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al
menos 2 horas.

Clculos: La concentracin de glucosa en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula general:

A
Muestra
A
Patrn
x C
Patrn
C
Muestra
=


Valores de referencia:


Neonato, prematuro
Neonato, a trmino
Nios, adultos


25-80 mg/dL = 1,39-4,44 mmol/L
30-90 mg/dL = 1,67-5,00 mmol/L
70-105 mg/dL = 3,89-5,83 mmol/L


Residuos

Todos se depositan en residuos orgnicos no halogenados


Pregunta

En qu consiste el mtodo de valoracin reflectomtrica y el mtodo de sensores por capilaridad para la
determinacin de glucosa en sangre?


Referencias

1. http://www.biosystems.es/Methods/11503c.pdf
2. http://www.bganalizadores.com.ar/resultado.html?linea=4
3. http://www.insp.mx/Portal/Cuidados_salud/diabetes-INSP.pdf








PRACTICA 10

PERFIL LIPDICO

Objetivos

1. Determinacin de la concentracin de colesterol total, HDL-colesterol y triglicridos.
2. Clculo de LDL-colesterol, mediante la frmula de Friedewald.
3. Dar interpretacin diagnstica del resultado.

Aspectos Tericos

Dentro de los lpidos, los triglicridos y el colesterol y sus steres, constituyen dos grupos muy importantes. Los
primeros por su alto contenido energtico y el segundo por su papel estructural en la formacin de membranas
celulares animales en donde constituyen hasta el 25%. Existen varias tcnicas experimentales para extraer y
cuantificar lpidos. Uno de los mtodos, utilizado actualmente a nivel clnico y de investigacin, para valorar el
colesterol y los triglecridos en el plasma y/o suero sanguneos es el enzimtico calorimtrico.

Colesterol Total
El colesterol es un esteroide de alto peso molecular que contiene una estructura ciclopentanofenantreno. El
colesterol de la dieta se absorbe parcialmente y tambin se sintetiza en el hgado y otros tejidos. El colesterol se
encuentra en las membranas celulares en forma libre, en algunas clulas capaces de almacenarlo, eterificado
reversiblemente en cidos grasos y en las lipoprotenas circulantes en el plasma sanguneo, las cuales lo
transportan eterificado en el centro de la clula y libre en su capa externa. El colesterol es necesario para que
las clulas eucariticas formen nuevas membranas y es el precursor biosintetico de sales biliares, hormonas
esteroidales y vitamina D. Las concentraciones elevadas de colesterol se asocian con un riesgo
progresivamente creciente de ateroesclerosis y enfermedad de las arterias coronarias.

La cuantificacin de colesterol en el plasma y/o suero sanguneos por el mtodo enzimtico calorimtrico, se
fundamenta en una hidrlisis de los steres del colesterol catalizada por la colesterol ster hidrolasa, este
colesterol junto con el colesterol libre presente en el plasma o suero sanguneo es oxidado por la colesterol
oxidasa a
4
-colestenona (cetona) y perxido de hidrgeno, el cual en presencia de la peroxidasa, oxida al
sistema cromgeno 4-aminoantipirina/fenol a un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm con
un pico de mxima absorbancia a 500 nm.



Colesterol-HDL

Las HDL participan en la captacin del colesterol de los tejidos y en su transporte hacia el hgado donde se
elimina en forma de cidos biliares. Existe una correlacin positiva entre concentraciones bajas de HDL-
colesterol en plasma y la incidencia de aterosclerosis, base del infarto de miocardio y accidentes
cerebrovasculares. Existen diversos estados patolgicos o influencias ambientales asociados con niveles
reducidos de HDL: enfermedades hepatocelulares agudas o crnicas, hiperalimentacin intravenosa,
malnutricin severa, diabetes, anemia crnica, alteraciones mieloproliferativas, enfermedad de Tangier,
analfalipoproteinemia, estrs agudo, algunos medicamentos y el tabaco. El diagnstico clnico no debe
realizarse teniendo en cuenta el resultado de un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de
laboratorio.

El colesterol de las protenas de baja densidad (LDL), las de muy baja densidad (VLDL) y los quilomicrones es
hidrolizado por la colesterol oxidasa mediante una reaccin enzimtica acelerada no formadora de color. El
detergente presente en el reactivo B solubiliza el colesterol de las lipoprotenas de alta densidad (HDL) de la
muestra. El colesterol de HDL se cuantifica espectrofotomtricamente mediante las reacciones acopladas
descritas a continuacin.






Triglicridos
Los triglicridos son steres de glicerol y cidos grasos que provienen de la dieta o son sintetizados
principalmente en el hgado. Los triglicridos se transportan en el plasma en las lipoprotenas y son utilizados
por el tejido adiposo, msculo y otros. Su principal funcin es suministrar energa a la clula. Las
concentraciones elevadas de triglicridos en suero pueden ser debidas a alteraciones hepatobiliares, diabetes
mellitus, nefrosis, hipotiroidismo, alcoholismo, hiperlipoproteinemia familiar IV y V entre otras.

Los triglicridos presentes en la muestra son hidrolizados por la lipasa para liberar cidos grasos y glicerol, este
ltimo es fosforilado por ATP en presencia de glicerol quinasa. El glicerol resultante es oxidado por GPO a
dihidroxiacetona fosfato y perxido de hidrogeno, el cual en presencia de la peroxidasa, oxida al sistema
cromgeno 4-aminoantipirina/4-clorofenol a un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm con un
pico de mxima absorbancia a 500 nm.



Colesterol-LDL
Las LDL son las principales lipoproteinas que transportan colesterol heptico hacia los tejidos. Existe una
correlacin positiva entre concentraciones elevadas de LDL-colesterol en plasma y la incidencia de
aterosclerosis, base del infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares. Existen diversos estados
patolgicos o influencias ambientales asociados con niveles elevados de LDL: nefrosis, diabetes, obesidad,
algunos medicamentos y el tabaco. El diagnstico clnico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de
un nico ensayo, sino que debe integrar los datos clnicos y de laboratorio.


Si los triglicridos son menor de 400 mg/dl, la concentracin de colesterol LDL (LDL-C) se calcula de la
concentracin de colesterol total (COL-T), la concentracin de HDL colesterol (HDL-C) y la concentracin de los
triglicridos (TG) de acuerdo a la formula de Friedewald:

LDL-C = COL-T HDL-C (TG/5) (mg/dl)



LDL-C = COL-T HDL-C (TG/2,2) (mmol/l)


La ecuacin anterior se obtiene despus hacer el siguiente anlisis:

Colesterol total = Colesterol de VLDL + Colesterol LDL + Colesterol HDL

Por lo tanto:

Colesterol LDL = Colesterol total - Colesterol de VLDL- Colesterol HDL

De aqu, el colesterol total y el HDL-colesterol fueron medidos anteriormente, y el Colesterol de VLDL se estima
que es igual a la cantidad de Triglicridos dividido por 5.







Valores de Referencia:


Hasta 100 mg/dL (2,59 mmol/L)
100-129 mg/dL (2,59-3,34 mmol/L)
130-159 mg/dL (3,37-4,12 mmol/L)
160-189 mg/dL (4,14-4,90 mmol/L)
>190 mg/dL (>4,92 mmol/L)


Optimo
Casi optimo
Moderado
Elevado
Muy elevado



Materiales, Equipos y Sustancias

Sustancias Materiales y Equipos
Suero sanguneo Tubos de ensayo
Reacti vo para determinar colesterol: 10 x 50 mL. Pipes 35 mmol/L, colato sdico
0,5 mmol/L, fenol 28 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2 U/mL, colesterol oxidasa >
0,1 U/mL, peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L, pH 7,0.

Patrn de Colesterol. Colesterol 200 mg/dL (5,18 mmol/L)

Pipetas y micropipetas
Reacti vo para determinar triglicridos: Pipes 45 mmol/L, 4 - clorofenol 6 mmol/L,
cloruro magnsico 5 mmol/L,lipasa > 100 U/mL, glicerol quinasa > 1,5 U/mL,
glicerol-3-fosfato oxidasa > 4 U/mL,peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-aminoantipirina 0,75
mmol/L, ATP 0,9 mmol/L, pH 7,0.

Patrn de Triglicridos: Glicerol equivalente a trioleina 200 mg/dL (2,26 mmol/L).

Espectrofotmetro
Reacti vos para determinar colesterol-HDL:
A. Reactivo: 2 x 50 mL. Fosfotungstato 0,4 mmol/L, cloruro de magnesio 20
mmol/L.
B. Reactivo: 2 x 50 mL. Fosfatos 35 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2 U/mL,
colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 1 U/mL, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L,
colato sdico 0,5 mmol/L, diclorofenol-sulfonato 4 mmol/L, pH 7,0.
S. Patrn de Colesterol HDL: 1 x 5 mL. Colesterol 15 mg/dL. Patrn primario
acuoso.
Bao de agua a 37
o
C
Aguas desionizada

Conservacin de los reactivos: Conservar a 2-8C. El Reactivo es estable hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta, siempre que se conserve bien cerrado y se evite la contaminacin durante su uso.

Indicaciones de deterioro: Presencia de partculas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,200 a 500
nm (colesterol total y trigliceridos).

Caractersticas Generales de la Prueba

1. Colesterol Total

a. Metrologa
Lmite de deteccin: 0,9 mg/dL = 0,023 mmol/L
Lmite de linealidad: 1000 mg/dL = 26 mmol/L
Interferencias: La hemoglobina (>5 g/L) y la bilirrubina (>10 mg/dL) interfieren. La lipemia (triglicridos 10
g/L) no interfiere.

b. Limitaciones
Una muestra con una concentracin de colesterol que excede el lmite de linealidad debe diluirse con solucin
salina a 0.9% y volverse a analizar incorporando el factor de dilucin en el clculo del resultado. Muestras muy
ictricas, hemolticas o lipmicas requieren del uso de un blanco de muestra que puede prepararse agregando
25 L de la muestra a 2.5 mL de agua desionizada.

c. Tipo de Muestras


Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. El colesterol en suero o plasma es estable 7 das
a 2-8C. Pueden utilizarse como anticoagulantes la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro.




2. Triglicridos

a. Metrologa
Lmite de deteccin: 1,6 mg/dL = 0,018 mmol/L
Lmite de linealidad: 600 mg/dL = 6,78 mmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra
1/4 con agua destilada y repetir la medicin.
Sensibilidad analtica: 1,2 mAdL/mg = 112 mAL/mmol
Interferencias: La hemoglobina (10 g/L) no interfiere. La bilirrubina (2,5 mg/dL) interfiere.

b. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. Los triglicridos en suero o plasma son estables
5 das a 2-8C. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.

3. Colesterol-HDL

a. Metrologa
Lmite de deteccin: 3,0 mg/dL = 0,078 mmol/L
Lmite de linealidad: 150 mg/dL = 3,9 mmol/L.
Interferencias: La lipemia (triglicridos 10 g/L) no interfieren. La hemolisis (hemoglobina > 5g/L) y la bilirrubina
(> 10 mg/dL) pueden interferir.

b. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estndar. El Colesterol HDL en suero o plasma es estable
7 das a 2-8C. Como anticoagulante puede utilizarse EDTA, litio o heparina sdica.


Seccin Experimental

A. Determinacin de Colesterol Total

1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.

2. Pipetear en tubos de ensayo:

Tubo 1 (blanco) Tubo 2 (patrn) Tubo 3 (Muestra)
Patrn de
Colesterol
- 10 L -
Muestra - - 10 L
Reactivo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos
a 37C.

4. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante
al menos 2 horas.

Clculo: La concentracin de colesterol en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula general:

A
Muestra
A
Patrn
x C
Patrn
C
Muestra
=


Valores de referencia:




Hasta 200 mg/dL (5,2 mmol/L)
200-239 mg/dL (5,2-6,21 mmol/L)
>240 mg/dL (>6,24 mmol/L)


ptimo
Moderado
Elevado




B. Determinacin de Colesterol-HDL

Precipitacin

1. Pipetear en un tubo de centrfuga

Muestra 0.2 mL
Reactivo A 0.5 mL

2. Agitar bien y dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

3. Centrifugar durante 10 minutos a 5.000 r.p.m.

4. Recoger con cuidado el sobrenadante. El sobrenadante debe ser completamente claro. En caso de persistir
la turbidez o de no obtener una buena sedimentacin del precipitado, adicionar otros 0,5 mL de Reactivo A,
mezclar bien y centrifugar de nuevo. Multiplicar el resultado obtenido por 1,7 para corregir la
dilucin efectuada.

Colorimetra

5. Atemperar el Reactivo B a temperatura ambiente.

6. Pipetear en tubos de ensayo:


Blanco Patrn Muestra
Patrn Colesterol HDL - 50 L -
Sobrenadante muestra - - 50 L
Reactivo (B) 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL


7. Agitar bien e incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 10 minutos a
37C.

8. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al
menos 30 minutos.


Clculo: La concentracin de colesterol HDL se calcula a partir de la siguiente frmula general:

A
Muestra
A
Patrn
x C
Muestra
=
C
Patrn x 3.5 (Factor de dilucin)



Valores de Referencia
Las concentraciones de colesterol de HDL varan considerablemente con la edad y el sexo. El siguiente valor
discriminante ha sido recomendado para identificar individuos con elevado riesgo de enfermedad coronaria.

Hasta 35 mg/dL (0.91 mmol/L) Riesgo elevado


> 60 mg/dL (1,56 mmol/L) Riesgo bajo










C. Determinacin de Triglicridos

1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente.

2. Pipetear en tubos de ensayo:

Tubo 1 (blanco) Tubo 2 (patrn) Tubo 3 (Muestra)
Patrn de
Triglicridos
- 10 L -
Muestra - - 10 L
Reactivo 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL


3. Agitar bien e incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente (16-25C) o durante 5 minutos
a 37C.

4. Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante
al menos 2 horas.

Clculo: La concentracin de triglicridos en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula general:

A
Muestra
A
Patrn
x C
Patrn
C
Muestra
=


Valores de referencia:


Hasta 150 mg/dL (1,7 mmol/L)
150-199 mg/dL (1,70-2,25 mmol/L)
200-499 mg/dL (2,26-5,64 mmol/L)
>500 mg/dL (>5,65 mmol/L)


Bajo
Dudoso
Alto
Muy alto



Residuos

Todos se depositan en residuos orgnicos no halogenados

Consulta

Consultar sobre las familias de enzimas a las que pertenecen las enzimas empleadas en esta sesin.

Preguntas

1. A qu clase de compuestos pertenecen triglicridos y el colesterol?
2. Cul es el rol funcional de las diversas lipoprotenas?
3. Cul es el rol de las lipoprotenas en el proceso aterognico?
4. Qu es el colesterol HDL, LDL y VLDL?


5. Mencione algunas fuentes endgenas de colesterol


Referencias

1. http://www.biosystems.es/Methods/
2. http://www.labomed.com.ve
3. http://www.mediben.com/Nutsem2.htm






















































PRACTICA 11

DETERMINACION DE BILIRRUBINAS EN SUERO SANGUNEO

Objetivos

1. Cuantificar el contenido de bilirrubinas en suero sanguneo
2. Dar interpretacin diagnstica del resultado.

Aspectos Tericos

La bilirrubina es un pigmento amarillo rojizo biliar que se encuentra normalmente en el suero como resultado de
la destruccin de los eritrocitos. Es un producto de la degradacin de la hemoglobina por el sistema
reticuloendotelial y existe en dos formas. La bilirrubina no conjugada (indirecta) es transportada hacia el hgado
donde es fijada a la albmina donde luego es conjugada (directa) con cido glucurnico, se excreta en la bilis
pasando por el duodeno para ser eliminada. Las concentraciones de bilirrubina en la sangre pueden aumentar
debido a varios motivos como son: sobreproduccin de la misma, disminucin de la absorcin por parte del
hgado, disminucin de la conjugacin, disminucin de la secrecin del hgado o bloqueo de las vas biliares.

En caso de aumento de produccin, disminucin de absorcin del hgado o disminucin de la conjugacin, la
bilirrubina no conjugada, denominada bilirrubina indirecta, estar bsicamente elevada. En casos de
disminucin de secrecin del hgado u obstruccin de las vas biliares, la bilirrubina conjugada o bilirrubina
directa, estar bsicamente elevada. Existen una serie de enfermedades heredadas o adquiridas que afectan a
la produccin, captacin, metabolismo y excrecin de bilirrubina, resultando en una hiperbilirrubinemia.

Se observa hiperbilirrubinemia no conjugada en recin nacidos (ictercia fisiolgica), en un aumento de la
destruccin de eritrocitos (anemia hemoltica, hematoma extenso), en eritropoyesis defectuosa as como en
algunas enfermedades genticas poco frecuentes (sndrome de Gilbert, sndrome de Crigler-Najjar).

La hiperbilirrubinemia conjudada se asocia a una disminucin en la excrecin de bilis debida a enfermedades
hepticas (hepatitis o cirrosis) o bien a una colestasis intra o extraheptica. La ictericia es una manifestacin
clnica de la hiperbilirrubinemia, que consiste en una deposicin de los pigmentos biliares en la piel, originando
coloracin amarillenta de la piel y mucosas.


Los mtodos tradicionales para la determinacin de la bilirrubina se basan en la reaccin de sta con el reactivo
diazo para formar el compuesto colorido azo-bilirrubina. La bilirrubina directa presente en la muestra reacciona
con el cido sulfanlico diazoado formando azobilirrubina, un complejo coloreado que puede determinarse
espectrofotomtricamente. La reaccin diazo puede acelerarse mediante la adicin de varios compuestos
qumicos, tales como etanol, cafena o DMSO. Para la determinacin de la bilirrubina total se adiciona un
tensoactivo como agentes solubilizantes, como es el caso de la cetrimida, la cual solubiliza la bilirrubina
indirecta permitiendo su reaccin junto con la fraccin directa. Los trminos directa y total se refieren a las
caractersticas de reaccin en presencia o ausencia de solubilizantes (aceleradores). La bilirrubina directa e
indirecta equivale slo de forma aproximada a las fracciones conjugada y no conjugada.

Bilirrubina Total + Sal de 2,4-diclorofenil diazonio
Tensoactivo
Azobilirrubina


















Materiales, Equipos y Sustancias

Sustancias Materiales y Equipos
Suero sanguneo Tubos de ensayo

BILIRRUBINA (TOTAL)
AT. Reactivo. Acido sulfanlico 29 mmol/L, cido clorhdrico 0,2 mol/L, cetrimida 50
mmol/L.

BT. Reactivo. Nitrito sdico 11,6 mmol/L.

Pipetas y micropipetas

BILIRRUBINA (DIRECTA):
AD. Reactivo. Acido sulfanlico 35 mmol/L, cido clorhdrico 0,24 mol/L.

BD. Reactivo. Nitrito sdico 3,5 mmol/L.

Espectrofotmetro
Bao de agua a 37
o
C


Conservacin
Conservar a 15-30C.
Los Reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserven bien
cerrados y se evite la contaminacin durante su uso.

Indicaciones de deterioro: Presencia de partculas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,05 a 540 nm
(cubeta de 1 cm).

Caractersticas Metrolgicas
Lmite de deteccin (bilirrubina total): 0,03 mg/dL = 0,51 mol/L
Lmite de deteccin (bilirrubina directa): 0,02 mg/dL = 0,34 mol/L
Lmite de linealidad: 15 mg/dL = 257 mol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra 1/3
con agua destilada y repetir la medicin.
Interferencias: La hemlisis no interfiere (hemoglobina 10 g/L). La lipemia (trigliceridos > 15 g/L)

Muestras
Suero recogido mediante procedimientos estndar. La bilirrubina en suero es estable 2 das a 2-8C si se
protege de la luz.

Seccin Experimental

A. BILIRRUBINA TOTAL
1. Pipetear en tubos de ensayo:

Tubo 1 (blanco muestra) Tubo 2 (Muestra)
Muestra 100 L 100 L
Reactivo (AT) 1.0 mL 1.0 mL
Reactivo (BT) - 250 L

2. Agitar bien y dejar reaccionar durante 2 minutos a temperatura ambiente.

3. Leer la absorbancia (A
1
) de la Muestra frente al blanco de la muestra a 540 nm.


B. BILIRRUBINA DIRECTA
1. Pipetear en tubos de ensayo:

Tubo 3 (blanco muestra) Tubo 4 (Muestra)
Muestra 100 L 100 L
Reactivo (AD) 1.0 mL 1.0 mL
Reactivo (BD) - 250 L





2. Agitar bien y dejar reaccionar durante 5 minutos a 37C.

3. Leer la absorbancia (A
2
) de la Muestra frente al blanco de la muestra a 540 nm.

Clculos
La concentracin de bilirrubina en la muestra se calcula a partir de la siguiente frmula general:

Bilirrubina total = A1 x 12,5 mg/dL, este valor es el producto de la divisin 2,5/0,2 donde 2,5 es la concentracin
y 0,2 es la observancia del patrn.

Bilirrubina directa: A2 x 7,74 mg/dL, este valor es el producto de la divisin 2,5/0,2 donde 2,5 es la
concentracin y 0,2 es la observancia del patrn.


Si se desea expresar la concentracin de bilirrubina total o directa en mol/L se puede utilizar la siguiente
ecuacin:

Concentracin masa (mg/dL) x 17,1 = concentracin sustancia (mol/L)


Valores de referencia en adultos

Total Hasta 1,1 mg/dL (18,8 mol/L)
Directa Hasta 0.25 mg/dL (4,3 mol/L)


Significado Clnico
La bilirrubina se origina por la degradacin de la hemoglobina. Es transportada del bazo al hgado y se excreta
en la bilis. La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas ms
probables de la hiperbilirrubinemia: Bilirrubina Total (T): Aumento de la hemlisis, alteraciones genticas,
anemia neonatal, alteraciones eritropoyticas, presencia de drogas. Bilirrubina Directa (D): Colestasis heptica,
alteraciones genticas y alteraciones hepticas.


Residuos

Todos se depositan en residuos orgnicos no halogenados


Referencias

1. http://www.biosystems-sa.com/Methods/11515c.pdf
2. http://www.spinreact.com.mx/pdf/1001044.pdf
3. http://www.pkids.org/Spa_phrliv.pdf
4. http://www.thermo.com/eThermo/CMA/PDFs/Various/File_28459.pdf














PRACTICA 12
ANALISIS CUALITATIVO DE ORINA

Objetivos

1. Realizar un anlisis cualitativo, mediante pruebas qumicas, de algunos componentes de la orina, como
son: la urea, la creatinina, los cuerpos cetnicos, los sulfatos, la glucosa y los cloruros.

2. Comprobar en la orina algunos de los componentes mencionados mediante el uso de tiras reactivas


Aspectos Tericos

Tiras reactivas para urianlisis: Las tiras reactivas para urianlisis son tirillas de plstico firme en la cual se
encuentran sujetos algunos diferentes reactivos. Dependiendo del producto que se est usando, las tirillas
reactivas proveen pruebas para la glucosa, bilirrubina, cuerpos cetnicos (cido acetoacetico), gravedad
especfica, sangre, pH, protenas, urobilingenos, nitrito y leucocitos en orina. El resultado de la prueba podr
suministrar informacin de acuerdo con el estado del metabolismo del carbohidrato, del hgado, de la funcin
heptica, del balance cido-base y bacteriurea. Cada tirilla es estable y lista para usarse despus de removida
del bote. La tirilla reactiva en su totalidad es desechable. Los resultados son obtenidos por comparacin directa
entre la tirilla de prueba con los bloques de color impresos en la etiqueta del bote. No se requieren clculos o
instrumentos de laboratorio.

Orina: La orina es un lquido acuoso transparente y amarillento, de olor caracterstico, excretado por los riones
y eliminado al exterior por el aparato urinario. Despus de la produccin de orina por los riones, sta recorre
los urteres hasta la vejiga urinaria donde se almacena y despus es expulsada al exterior del cuerpo a travs
de la uretra, mediante la miccin.

Anlisis Fsico de Orina

Olor: La orina normal recin emitida no huele, salvo si se han ingerido determinados alimentos (esprragos). En
las infecciones por microorganismos que degradan la urea la orina huele amonaco. En los enfermos con
cetoacidosis huele a acetona. Un olor dulzn desagradable sugiere inflamacin o focos supurativos urinarios.

Hay errores congnitos del metabolismo en los que adquiere un olor peculiar (fenilcetonuria, enfermedad del
jarabe de arce, malabsorcin de metionina) con el ejemplo caracterstico del olor a pies sudados de la acidemia
isovalrica.

Aspecto (color y turbidez): La orina normal tiene color amarillo. La intensidad es inversamente proporcional a
la concentracin de solutos. La orina muy diluida es muy plida y si est concentrada adquiere un color amarillo
intenso, debido a la mayor concentracin de pigmentos excretados por el rin, como la riboflavina.

El color de la orina vara en numerosas situaciones fisiolgicas y patolgicas:

CAUSAS ENDGENAS COLOR DE LA ORINA FACTORES EXGENOS

Bilirrubina (conjugada) Amarillo intenso Antocianinas (remolacha) Roja
Hemoglobina y mioglobina Rojo-parduzco Antraquinonas (laxantes) Anaranjada (pH alcalino)
Hematuria Rojo turbio Rifampicina Anaranjada
Porfirinas y sus
precursores
Rojo Azul de metileno Verde
Melangenos Pardo negruzca L-dopa Pardusca
cido homogentsico Pardo negruzca
Quiluria Blanquecina (lctea)
Piuria Blanquecina (turbia)

Densidad: La densidad urinaria indica la capacidad de concentracin/dilucin del rin. En los adultos sanos
vara entre 1,002 y 1,035 g/ml. En situaciones de deshidratacin extrema puede alcanzar 1,040 g/ml. La
densidad urinaria es un parmetro muy variable en condiciones fisiolgicas, y por lo tanto de poco valor
diagnstico, por lo que slo hay que tenerla en cuenta si es discordante con la situacin clnica que se
sospeche:



Debe ser mayor de 1,025 en situaciones de baja perfusin renal con funcin tubular conservada:
deshidratacin, diabetes mellitus mal controlada, insuficiencia cardiaca.
Debe ser menor de 1,010 en enfermos con diabetes inspida, polidipsia o bajo tratamiento diurtico.
Es constante (alrededor de 1,010) en enfermos en la fase isostenrica de la insuficiencia renal crnica.

Hay diversos mtodos para medir la densidad urinaria, como el clsico densitmetro de vidrio. Actualmente las
tiras reactivas proporcionan una lectura aproximada. Esta prueba se basa en un intercambio inico entre los
polielectrolitos del rea de prueba y los iones en la muestra, lo que resulta en un cambio de color de un
indicador acido-base. Este color va de azul-verde en muestras con baja fuerza inica hasta marrn-amarillo en
orinas concentradas. Altas concentraciones de acido ascrbico (>700 mg/l) pueden simular una densidad
especifica alta. Un medio acido (pH<6.5) da una densidad especfica baja falsa.



La densidad medida utilizando tiras reactivas puede variar ligeramente del valor determinado por otros mtodos,
visto que no sern registrados aumentos de densidad causados por concentraciones de glucosa >1.000 mg/dL
(> 56 mmmol/L). Excrecin elevada de protena puede llevar a resultados ms altos. Orinas muy alcalinas
pueden causar lecturas bajas.


Anlisis Qumico de Orina

pH urinario: el pH es el inverso del logaritmo de la concentracin de iones hidrgeno. Valores bajos indican
acidez y valores altos alcalinidad. La orina cida se asocia con clculos de xantina, cistina, cido rico y oxalato
de calcio; en tanto que la orina alcalina se asocia con clculos de carbonato de calcio, fosfato de calcio y fosfato
de magnesio.

En adultos sanos oscila entre 4,5 y 8,0 aunque normalmente es ligeramente cido. Esta acidez se atribuye a la
presencia de fosfato cido y cidos orgnicos libres. Disminuye en situaciones de acidosis fisiolgica (ayuno) y
patolgica (salvo en las acidosis tubulares), as como si se sigue una dieta rica en protenas o si hay
deshidratacin o proliferacin en la orina de bacterias productoras de cido. Aumenta despus de las comidas,
en situaciones de alcalosis y si hay colonizacin por grmenes que degradan la urea, como Proteus (olor
amoniacal), dieta vegetariana o vmitos pertinaces.

La prueba con la tira reactiva se basa en el mtodo de doble indicacin de pH. En donde el azul de bromotimol
y el rojo de metilo dan colores distintivos sobre los rangos del pH de 5-9 el rango de los colores desde el rojo-
anaranjado hasta el amarillo y el amarillo-verde hasta el azul-verde.

El valor del pH en orina reciente de un paciente sano vara entre 5 y 6. La escala cromtica distingue
claramente valores entre pH 5 y pH 9. El valor pH siempre se debe determinar en orina recin recolectada,
evitando, de esa manera, el aumento indeseado a valores pH > 9, causado por la descomposicin bacteriana.

Protenas: la albumina urinaria es una mezcla de seroalbumina y seroglobulinas. La albuminuria se atribuye a
una lesin renal (nefrosis) o la inflamacin del rgano (nefritis). En condiciones normales el contenido en
protenas de la orina no rebasa los 150 mg/24 horas en el adulto.

La tira reactiva es altamente sensible para albmina, pero no para globulinas o hemoglobina. La sensibilidad
mnima de la tira reactiva es de 10 mg de protena/dL de orina. Los campos de referencia corresponden a las
siguientes concentraciones de albmina: negativo, 30, 100 y 500 mg/dL o 0,3, 1,0 y 5,0 g/L. Resultados falso-
positivos son posibles en orinas alcalinas (pH>9), tras la infusin con polivinilpirrolidina (sustituto sanguneo),
tras la ingestin de medicamentos conteniendo quinina y tambin por residuos de desinfectantes en el
recipiente de colecta. La coloracin de la protena se puede enmascarar por la presencia de colorantes mdicos
(azul de metileno) o pigmentos de remolacha


El significado patolgico de la proteinuria depende de su cuanta, de las caractersticas de las protenas
excretadas y de las circunstancias en que se produce. Por lo tanto, ante una proteinuria positiva, es necesario
cuantificarla y expresarla en cantidad eliminada en 24 horas y adems realizar un estudio electrofortico que
permita conocer la proporcin de las distintas protenas. En trminos cuantitativos, la proteinuria se clasifica en


4 categoras: microalbuminuria, proteinuria leve (de 150 mg a 1 g/24 horas), moderada (de 1 a 3,5 g/24 horas) y
grave o nefrtica (ms de 3,5 g/24 horas).

Glucosa: La presencia glucosa en orina es anormal y se denomina Glucosuria. Esta se da por estado de
hiperglucemia, en donde los niveles plasmticos de glucosa sobrepasan los 170 mg/dl. La hiperglucemia indica
un mal control de la diabetes mellitus o un estado transitorio de resistencia a la insulina.

Las tiras reactivas son muy especficas, basadas en el mtodo de la glucosa-oxidasa, que ha desplazado a
mtodos clsicos, como el de Benedict, que no es especfico para glucosa (otros azucares reductores como la
fructosa y la galactosa tambin dan prueba positiva).

Esta prueba est basada en un principio de una reaccin secuencial doble de una enzima. Una enzima; la
glucosa oxidasa, cataliza la formacin de cido glucnico y el perxido de hidrgeno de la oxidacin de la
glucosa. Una segunda enzima, peroxidasa, cataliza la reaccin de perxido de hidrgeno de potasio iodado a
cromgeno oxidado.
Concentraciones patolgicas de glucosa se indican por un cambio de coloracin de verde a verde azulada.
reas reactivas amarillas o verdosas se deben considerar como resultado negativo o normal. Todas las reas
que presentan un verde ms intenso que el campo de referencia negativo indican un resultado positivo. Los
campos de referencia corresponden a los siguientes rangos de concentracin de glucosa: neg. (amarillo), neg. o
normal (verdoso), 50, 150, 500 y 1000 mg/dL o neg. (amarillo), neg. o normal (verdoso), 2,8, 8,3, 27,8 y 55,5
mmol/L.

Gran cantidad de cido ascrbico presente en la orina tras la ingestin de vitamina C (p. ej., tabletas de
vitamina, antibiticos o jugos de fruta) puede llevar a resultados bajos o falsamente negativos. Adicionalmente,
un efecto inhibidor se produce por cido gentsico. Reacciones falso-positivas tambin pueden ser causados por
residuos de perxido presente en detergentes domsticos.

Cuerpos cetnicos: Derivan del metabolismo lipdico y son tres: cido acetoactico, acetona y cido 3-
hidroxibutrico.

La cetonuria (presencia de cuerpos cetnicos en orina) se da en situaciones de ayuno prolongado y se ve
facilitada por la existencia de vmitos, especialmente en nios pequeos. En la deficiencia insulnica se produce
un incremento del metabolismo de los cidos grasos, con formacin final de cuerpos cetnicos que se eliminan
por la orina. La cetonuria en un diabtico indica un control metablico muy deficiente y es anuncio de una grave
complicacin, el coma cetoacidtico.

Los cuerpos cetnicos, acetona y acetoacetato, se detectan mediante tiras reactivas impregnadas con
nitroprusiato sdico en medio alcalino dando un rango de colores que van desde el beige o rosa tenue para un
resultado negativo hasta uno rosa y rosa-prpura para una lectura positiva. La toma de aspirina o de L-
DOPA a dosis altas puede inducir falsos positivos.
Un resultado negativo del examen es normal. Los resultados de la presencia de acetona en la orina
generalmente aparecen como pequea, moderada o grande con sus valores correspondientes: Pequea: < 20
mg/dL, Moderada: 30-40 mg/dL, Grande: > 80 mg/dL

Creatinina: La creatinina (Cr) procede del metabolismo de la creatina del msculo esqueltico. La eliminacin
urinaria de creatinina es bastante constante, de 0,8 a 1,8 g/24 horas, y disminuye en la insuficiencia renal,
mientras que aumenta en situaciones de rabdomiolisis o ingesta proteica excesiva.

En solucin bsica la creatinina reacciona con acido pcrico dando un complejo de color rojo, el cual se utiliza
para su determinacin colorimtrica.

Urea: La urea es el principal metabolito de las protenas, se filtra con facilidad por el glomrulo y se reabsorbe
en un 40-50 % en el tbulo, aunque este porcentaje vara en funcin del grado de hidratacin y de la diuresis.

La excrecin urinaria de urea oscila entre lmites muy amplios: 6-20 g/da en adultos, 13-15 g/da en nios y 2-3
g/da en lactantes. Aumenta en estados de hipercatabolismo proteico y en dietas ricas en protenas y disminuye
en la insuficiencia heptica (por reduccin de la sntesis) y en la insuficiencia renal.



Cloruros: Aparte de la urea, son los cloruros las sustancias ms abundantes en la orina. El ms importante es
el de sodio y todos ellos derivan principalmente de los alimentos; por lo tanto, su expulsin fluctua segn lo
ingerido. Durante el ayuno puede desaparecer su expulsin, permitiendo asi que se mantenga durante algn
tiempo su concentracin normal en la sangre.

Su determinacin puede realizarse mediante el precipitado blanco de cloruro de plata que se forma cuando se
trata la mezcla que contiene cloruros con una solucin de nitrato de plata.

La excrecin diaria oscila normalmente entre 80 y 180 mEq/24 horas. Sus oscilaciones en condiciones
patolgicas suelen ir paralelas a las del sodio. El cual, en la insuficiencia renal prerrenal, por disminucin del
flujo sanguneo renal, as como en el sndrome hepatorrenal, el rin reabsorbe vidamente el sodio y su
concentracin en orina suele ser inferior a 10 mEq/l. En la insuficiencia renal intrnseca el tbulo pierde su
capacidad de reabsorcin de sodio y la concentracin supera los 20 mEq/l.

Bilirrubina y urobilingeno: Son los principales pigmentos biliares que pueden aparecer en la orina. La
bilirrubina es el producto final del metabolismo del hemo y el urobilingeno es su principal producto de
degradacin por las bacterias de la flora intestinal. Por lo tanto, si no hay paso de bilirrubina al intestino, no se
producir urobilingeno. Una pequea parte del urobilingeno se reabsorbe y es eliminado por la orina en forma
de urobilina. La excrecin mxima de urobilina por orina es de 5 mg/24 horas en el adulto sano.

La determinacin de bilirrubina y urobilina en orina se realiza mediante tiras reactivas, que integran el
acoplamiento de la bilirrubina con sales diazotadas estabilizadas en medio fuertemente acido. Normalmente la
bilirrubina no se detecta en la orina. Cantidades muy escasas son indicador suficiente de una enfermedad del
hgado. La reaccin no se afecta por el pH urinario. Resultados falsos bajos o negativos se observan con altas
concentraciones de acido ascrbico. La luz solar directa promueve la oxidacin de la bilirrubina y produce por
eso falsos bajos o negativos. Concentraciones de urobilinogeno superiores a 100 mol/l producen un cambio en
el color de la zona reactiva de la bilirrubina el cual vira a color naranja (realizar la lectura al cabo de los 2
minutos de haber escurrido la orina). Falsos positivos se observan con la presencia de metabolitos de drogas
que desarrollan color en pH acido, como por ejemplo las fenazopiridinas.

La sensibilidad mnima de la tira reactiva es de 0,5 a 1mg de bilirrubina/dL de orina. Los campos de referencia
corresponden a los siguientes valores: 0 (negativo), 1 (+), 2 (++), 4 (+++) mg/dL o 0 (negativo), 17 (+), 35 (++),
70 (+++) mmol/L.

NITRITO: La presencia de nitritos en orina es signo de colonizacin o infeccin bacteriana. La mayora de los
grmenes Gram negativos que suelen colonizar la orina reducen los nitratos a nitritos, y en esta propiedad se
basa la deteccin por tiras reactivas.

El Test es especfico para nitritos y no reacciona con los dems componentes de la orina. Un resultado negativo
no indica la ausencia de bacterionuria, ya que los organismos que no contienen reductasa para convertir el
nitrato en nitrito no son detectados. El test presenta una sensibilidad de 13-22 umol/L y tiene como
interferencias la elevada densidad especfica de la orina y el cido ascrbico (1,40 mmol/L), los cuales pueden
reducir la sensibilidad del mtodo.

Cualquier coloracin rosa indica una infeccin bacteriana del tracto urinario. La intensidad del color representar
la concentracin del nitrito, pero no proporciona informacin con respecto a la extensin de la infeccin. Un
resultado negativo no excluye la hiptesis de una infeccin del tracto urinario, si sta es causada por una
bacteria que no reducen los nitratos (Enterococcus spp., S. saprophyticus, Acinetobacter y Candida spp.).

Resultados falso- negativos se pueden provocar por altas dosis de cido ascrbico, por terapia con antibiticos,
o por una concentracin muy baja de nitrito como resultado de una dieta pobre en nitrato o fuerte dilucin
(diuresis). En muestras de pacientes femeninas, el flujo vaginal puede causar resultados falso-positivos. A fin de
evitar reacciones falso-positivas, antes de la colecta, se deben debidamente lavar los rganos genitales.

Esta prueba depende en la conversin de nitrato en nitrito mediante la accin de bacteria gram negativaen la
orina. En un medio cido el nitrito en la orina reacciona con cido p-arsanlico para formar un compuesto
diaznico. El compuesto diazonio forma un par con 1N-(1-naptil)-etilenediamine para producir un color rosado.

En el cuadro siguiente se resumen las enfermedades asociadas a la presencia de algunas sustancias en la orina:







Consideraciones sobre las tiras reactivas

a. Reactivos (Basados en pesos secos al momento de la impregnacin)

Reacti vo Tiempo de
Lectura
Composicin Descripcin

Acido
Ascrbico


30 Segundos

0,3% w/w 2,6-diclorofenolindofenol
99,7% w/w buffer e ingredientes no
reactivos
Detecta Acido Ascrbico tan bajo
como 5-10 mg/dl (0,28-0,56 mmol/l)

Glucosa


30 Segundos


1,5% w/w glucosa oxidasa; 0,5% w/w
peroxidasa; 10% w/w yoduro de potasio
75% w/w buffer; 13% w/w ingredientes
no reactivos.

Detecta glucosa tan bajo como 50-
100 mg/dl (2,5-5 mmol/l), Los
resultados Pueden ser ledos a los 10
segundos cualitativamente y en
treinta segundos para resultados
semi-cuantitativos.


Bilirrubina



30 Segundos
0,5% w/w 2,4-dicloroanilina sal
diaznica; 99,5% w/w buffer e
ingredientes no reactivos.

Detecta bilirrubina desde 0,4-0,8
mg/dl (6,8-13,6 mol/l).


Cuerpos
Cetnicos


40 Segundos

5% w/w Nitroprusiato de sodio, 95% w/w
buffer


Detecta cido acetoactico desde
2,5-5 mg/dl (0,25-0,5 mmol/l).


Gravedad
Especfica




45 Segundos

2,5% w/w indicador Azul de bromotimol
17,5% w/w buffer e ingredientes no
reactivos; 55% (Eter metil Vinlico
/Anhdrido maleico); 25% Hidrxido de
sodio.

Determina la gravedad Especfica
entre 1,000-1,030. Los resultados
correlativos con los valores obtenidos
por el mtodo del Index refractario
entre 0,005.

Sangre


60 Segundos

4% w/w 3,3 ,5,5Tetrametilbenzidina
(TMB); 6% w/w Hidroperxido de
Cumena; 90% w/w buffer e ingredientes
no reactivos.

Detecta Hemoglobina libre desde
0,015-0,062 mg/dl o 5-10 Ery/l en
especimenes de orina con, contenido
de Acido Ascrbico de <50 mg/dl.

0,5% w/w Rojo de metilo sal sdica, 5% Permite la diferenciacin cuantitativa


pH

60 Segundos

w/w Azul de bromotimol; 94,5% w/w de
Ingredientes no reactivos.

de valores de pH entre el Rango de
5-9.


Protenas


60 Segundos

0,3% w/w Azul de tetrabromofenol;
99,7% w/w buffer e ingredientes no
reactivos

Detecta albmina desde 7,5-20 mg/dl
(0,075-0,2 g/l).


Urobilingeno



60 Segundos
2,5% w/w p-dietilaminobenzaldehido;
97,5% w/w buffer e ingredientes no
reactivos.

Detecta el Urobilingeno desde
0,2-1,0 mg/dl (3,5-17 mol/l).


Nitritos


60 Segundos

4,5% w/w p-Acido Arsanlico; 95,5% w/w
ingredientes no reactivos.

Detecta el nitrito de sodio desde
0,05-0,1 mg/dl, en orina con una
gravedad Especfica baja y con
menos de 30 mg/dl de Acido
Ascrbico.


Leucocitos
.


120 Segundos

0,5% del derivado del ester del Acido
amino pirrol; 0,4% w/w sal diaznica;
32% w/w buffer; 67,1% w/w Ingredientes
no reactivos.

Detecta leucocitos tan bajo como 10-
25 glbulos blancos Leu/l en orinas
clnicas


b. Advertencias y precauciones: Las tiras reactivas para orina son para uso in vitro. No toque las reas
de prueba de las tirillas de orina.
c. Almacenaje: Almacene a temperatura ambiente entre 15-30c (59-59F) y fuerza de la luz directa del
sol. No las utilize despus de la fecha de expiracin.
d. Procedimiento recomendado para su menejo: Todas las tirillas no usadas debern permanecer en el
bote. l transferirlas a otro contenedor podr causar el deterioro de las tirillas y volverse no reactivas.
No tire el secante del bote. No abra el contenedor hasta que est listo para usarse. Los botes abiertos
debern ser usados dentro de los 3 siguientes meses despus de abiertos.
e. Recoleccin de la muestra y preparacin: Recolecte la muestra de orina en un contenedor limpio y
realice la prueba lo ms pronto posible. No centrifugue. No se recomienda el uso de conservadores
para orina. Si la prueba no se puede llevarse a cabo dentro de una hora despus de la recoleccin,
refrigere la muestra inmediatamente. Permita que la muestra refrigerada tome la temperatura ambiente
antes de realizar la prueba.

Sustancias y Materiales

Sustancias Materiales
Orina Tubos de ensayo
Solucion fenol-nitroprusiato de sodio: 4,7g fenol y 6mg de
nitroprusiato de sodio en 100ml de agua desionizada ( 250ml)
Un bao de agua a 40C y otro de agua
hirviendo
Nitroprusiato de sodio 0.1M Tiras reactivas para el anlisis de orina
Hipoclorito de sodio alcalino: disolver 2g de NaOH en 100ml
de agua desionizada y agregar 7,5ml de hipoclorito de sodio
comercial al 5%. Guardar en frasco ambar.

Nitrato de plata 1%
Acido pcrico 1%
Hidrxido de sodio 1M
Reactivo de Benedict
Acido actico 10%
Reactivo de Biuret



Seccin Experimental



A. Pruebas Qumicas

1. pH: Tome una tira de papel indicador, sumrjala en la orina y determine el valor del pH
2. Urea: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de la solucin fenol-nitroprusiato y 10
gotas de hipoclorito alcalino. Coloque el tubo en un bao de agua a 40 C durante 5 minutos y anote los
resultados. La aparicin de una coloracin azul-violeta es positivo para urea.
3. Creatinina: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 4 gotas de la solucin de cido pcrico y 4
gotas de hidrxido de sodio 1M. La aparicin de una coloracin naranja que se torna rojiza es prueba positiva
para creatinina.
3. Cuerpos cetnicos: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de la solucin de
nitroprusiato y 10 gotas de hidrxido de sodio 1M. Anote la aparicin de algn color. Coloque el tubo en un bao
de agua hirviendo y observe si hay algn cambio. En caliente adicione 5 gotas de cido actico al 10%.
Observe y anote los resultados. La formacin de un complejo verde-azul es prueba positiva para acetona.
4. Cloruros: Adicione 1.0 mL de orina en un tubo de ensayo y aadale 1 gota de nitrato de plata. La formacin
de un precipitado blanco es prueba positiva para cloruros.
6. Glucosa y otros azucares reductores: aada 1.0 mL de orina a un tubo de ensayo, adicinele 2 mL de
solucin de Benedict y caliente la solucin en un bao de agua hirviendo durante 5 minutos. Enfre el tubo a
temperatura ambiente. Si la solucin permanece transparente y azul, significa que no hay glucosa (o cualquier
otro azcar reductor). Si la solucin es verde, la muestra de orina contiene aproximadamente 0.25% de glucosa;
si es amarilla, 1% de glucosa; si es naranja, ms del 1% de glucosa; y si es rojo ladrillo, ms del 2% de glucosa.
7. Albmina: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de hidrxido de sodio al 25 % y 10
gotas del reactivo biuret. Observe y anote los resultados. La aparicin de una coloracin violeta es prueba
positiva para protenas.

B. Prueba con Tiras Reactivas
Notas de la prueba
1. Se recomienda usar solo orina fresca, bien homogenizada y sin centrifugar. Se recomienda usar la primera
orina de la maana por que se concentra durante la noche.
3. La recoleccin de la muestra debe realizarse en frascos limpios y libre de desinfectactes o detergentes.
4. No tocar las zonas reactivas de las tiras.
5. Inmediatamente despus de retirar el nmero de tiras necesarias, tapar correctamente el envase.
6. Retire el bote solamente de las tirillas necesarias para usarse inmediatamente y tape nuevamente el bote
bien cerrado.

Procedimiento
1. Sumerja completamente la tira reactiva en la muestra de orina por dos segundos.
2. Mientras es retirada, toque la tirilla por un lado con el borde del bote para retirar el exceso de orina.
3. Coloque la tira sobre una toalla de papel absorbente para eliminar el exceso de orina y evitar que se corra
(contaminacin de los cuadros reactivos adyacentes).
4. Compare cada rea de reaccin a su bloque de color correspondiente en la tabla y lea a los tiempos
especficos. La lectura apropiada a tiempo es crtica para obtener resultados ptimos
5. Obtenga los resultados directos por medio de la comparacin directa de colores






NOTA: Todas las reas de los reactivos a excepcin de los leucocitos debern ser ledas entre 1-2 minutos
para visin de orina positiva de orina negativa. Los cambios en el color despus de 2 min no son para valores
de diagnstico.



Bibliografa

1. http://www.mn-net.com
2. http://es.wikipedia.org/wiki/Orina
3. http://www.hsa.es/org/dmedica/centrales/bioquimica/docs/boletin/Sistematico_de_Orina.pdf
4. http://protgtstore.com/pdf/PruebaUrianalisisACON.pdf
5. http://www.spinreact.com.mx/pdf/52010.pdf
6. ftp://ftp.mn-net.com/espanol/Flyer_Catalogs/Medi-Test/Br_Medi-TestES.pdf
7. Holum, John r, Practicas de qumica general, qumica orgnica y bioqumica, Mxico, Limusa Wiley, 1972, p:
143.

































PRACTICA 13

TITULACIN DE AMINOCIDOS

Objetivos

1. Realizar la titulacin de un aminocido y hacer su correspondiente curva de titulacin
2. Determinar a partir de la curva de titulacin los valores de pKa y el punto isoelctrico
3. Determinar las posiciones de las formas inicas de los aminocidos al variar el pH.


Aspectos Tericos

Generalidades
Las protenas son biomolculas grandes que se encuentran en todo organismo viviente. Existen muchos tipos y
tienen funciones biolgicas diferentes. La queratina de la piel y las uas, la fibroina de la seda, las telas de la
araa y la mayor parte de las enzimas que catalizan las reacciones biolgicas dentro de las clulas son
protenas. Las protenas estn constituidas de muchas unidades de aminocidos enlazados en una cadena
larga (figura 1).

H
2
N C
H
R
1
C N
O H
C C
H
R
2
N
O H
C C
R
3
OH
O
H
n
Aminocido
N-terminal
Aminocido
C-terminal
Enlaces amdicos
Estructura general de una protena


Figura 1. Estructura de una protena

Los aminocidos, como su nombre lo indica, son compuestos orgnicos bifuncionales. Contienen un grupo
amino bsico y un grupo carboxilo cido (figura 2):

H
2
N
C
C
O
OH
H
R


Figura 2. Estructura general de un aminocido

La hidrlisis cida, bsica o enzimtica de las protenas de todos los seres vivos produce veinte -L-
aminocidos, los cuales se muestran en la siguiente tabla:




















Tabla nica. Aminocidos presentes en las protenas

Nombre Smbolo pK
1
(-COOH) pK
2
(-NH
3
+
) pK
3

Glicina Gly 2.4 9.8 -
Alanina Ala 2.4 9.9 -
Valina Val 2.2 9.7 -
Leucina Leu 2.3 9.7 -
Isoleucina Ile 2.3 9.8 -
Serina Ser 2.2 9.2 ~ 13
Treonina Thr 2.1 9.1 ~ 13
Cisteina Cys 1.9 10.8 8.3
Metionina Met 2.1 9.3 -
Acido aspartico Asp 2.0 9.9 3.9
Asparagina Asn 2.1 8.8 -
Acido glutmico Glu 2.1 9.5 4.1
Glutamina Gln 2.2 9.1 -
Arginina Arg 1.8 9.0 12.5
Lisina Lys 2.2 9.2 10.8
Histidina His 1.8 9.3 6.0
Fenilalanina Phe 2.2 9.2 -
Tirosina Tyr 2.2 9.1 10.1
Triptfano Trp 2.4 9.4 -
Prolina Pro 2.0 10.6 -

Definicin de cidos y bases
Un cido y una base se pueden definir segn los modelos de Lewis y Brnsted, los cuales se explican a
continuacin:

En el modelo de Lewis, un cido es una molcula que es capaz de aceptar pares de electrones y una base
es aquella molcula que tiene la capacidad de donar pares de electrones. En la siguiente ecuacin se
puede observar que el enlace, entre el nitrgeno y el aluminio, es formado por el par libre de electrones
provenientes del amoniaco.

H
3
N
+
AlCl
3
H
3
N-AlHCl
3
Base Lewis cido Lewis Complejo cido-base Lewis


En la definicin de Brnsted, las sustancias que tienen la capacidad de donar protones son clasificados
como cidos Brnsted y las sustancias que sirven como aceptores de protones se clasifican como bases
Brnsted. En la siguiente ecuacin se ejemplifica un caso general de la reaccin cido-base cuyo equilibrio
est determinado por la fuerza cida y bsica relativa de los reactivos y donde las concentraciones de
equilibrio pueden ser calculadas a travs de la constante de equilibrio, K. En esta ecuacin, igualmente, se
define lo que se conoce como cido y base conjugados.

HA + B
BH + A
K
cido Base
cido
conjugado
de B
Base
conjugada
de HA

Fuerza cida

cidos Carboxlicos: La fuerza cida es la capacidad que tiene una sustancia de donar protones. Esta se
determina por medio de la constante de acidez o constante de ionizacin cida, la cual est definida de la
siguiente manera:
RCOOH + H
2
O RCOO
-
+ H
3
O
+
[RCOOH]
[H
3
O
+
][RCOO
--
]
Ka =

Como los valores de K
a
son pequeos, es ms conveniente manejar la acidez en trminos del pK
a
, el cual est
definido igual que el pH como:



pK
a
= - Log K
a

Mientras ms bajo sea el valor del pK
a
para una sustancia ms cida ser esta.
Aminas: Las aminas son el resultado del reemplazo de uno varios tomos de hidrgeno por grupos alqulicos
o arlicos en la molcula de amoniaco. Son las bases orgnicas ms fuertes encontradas en los organismos
vivientes, aunque su fuerza bsica es moderada comparada con las bases inorgnicas; al igual que en el
amoniaco, es el par libre de electrones sobre el nitrgeno el que tiene la habilidad para enlazarse al protn.

N
R
R
1
R
2
donde R, R
1
y R
2
son
grupos alqulicos arlicos
Amina


RNH
2
+ H
2
O RNH
3
OH
+
K
b
Sal de amonio Amina


La fuerza bsica relativa de una base se determina en trminos del valor del pK
a
de su cido conjugado.
Entre ms grande sea el valor del pK
a
del el cido conjugado, ms bsica es la amina:

RNH
3
+ H
2
O H
3
O RNH
2
+
K
a


[RNH
3
+
]
[H
+
][RNH
2
]
K
a
=


Estructuras de los aminocidos
Como los aminocidos contienen un grupo cido y un grupo bsico, presentan una reaccin cido-base y se
encuentran principalmente en la forma de un ion bipolar o zwitterin (figura 3):

R C
H
NH
2
C
O
OH R C
H
NH
3
+
C
O
O
-
Forma ionizada
(zwitterin)


Figura 3. Formacin del ion dipolar de un aminocido

Los iones dipolo de los aminocidos son sales internas y por ello tienen muchas de las propiedades fsicas
asociadas con las sales. Son solubles en agua e insolubles en solventes poco o no polares y son sustancias
cristalinas de punto de fusin alto. Adems, los aminocidos son anfteros: pueden reaccionar como cidos o
bases, dependiendo del pH. En solucin acuosa cida, un ion dipolo de un aminocido se comporta como una
base que acepta un protn para formar un catin; en solucin acuosa bsica, es un cido que pierde un protn
y da lugar a un anin (figura 4).

+
H
3
N
C
C
O
O_
H
R
+
H
3
N
C
C
O
OH
H
R
H
3
O
+
H
2
O +
+
H
3
N
C
C
O
O_
H
R
H
2
N
C
C
O
O_
H
R
H
2
O +
OH
-


Figura 4. Comportamiento anftero de un aminocido



Note que es el carboxilato, -COO
-
, no el grupo amino, el que acta como sitio bsico y acepta un protn en
solucin cida. De modo similar, es el catin amonio, -NH
3
+
, y no el grupo carboxilo, el que funciona como el
sitio acdico y dona un protn en solucin bsica.


Puntos isoelctricos
En solucin cida, un aminocido se protona y se encuentra principalmente como un catin. En solucin bsica,
se desprotona y se presenta como anin. As, debe haber un pH intermedio al cual el aminocido este
equilibrado entre las formas aninica y catinica y se encuentre como el ion dipolo neutro. Este pH se llama
punto isoelctrico pI del aminocido (figura 5).

+
H
3
N
C
C
O
OH
H
R
H
3
O
+
+
H
3
N
C
C
O
O_
H
R
H
2
N
C
C
O
O_
H
R
OH
-
H
3
O
+
OH
-
pH bajo
(protonado)
pH alto
(desprotonado)
Punto i soelctrico
(ion dipolo neutro)
pH
I
II
III


Figura 5. Punto isoelctrico del aminocido

El punto isoelctrico de un aminocido depende de su estructura. Los 15 aminocidos con cadena lateral
neutras o algo cidas tienen puntos isoelctricos cercanos a la neutralidad, en el intervalo de pH de 5.0 a 6.0,
los dos aminocidos con cadenas laterales ms cidas, presentan puntos isoelctricos a un pH menor y los tres
aminocidos con cadena lateral bsica tienen puntos isoelctricos a un pH ms elevado.

Los puntos isoelctricos de los 13 aminocidos sin cadena lateral acida o bsica son el promedio de las dos
constantes de disociacin, pKa
1
y pKa
2
. La alanina, por ejemplo, tiene pKa
1
= 2.34 y pKa
2
= 9.69, de modo que
el pI de la alanina es (2.34 + 9.69)/2 6.01. Para los cuatro aminocidos con una cadena lateral muy acida, el
pI es el promedio de los dos valores ms bajos de pKa, por ltimo, para los tres aminocidos con una cadena
lateral bsica, el pI es el promedio de los dos valores ms altos de pKa.


Titulacin de un aminocido
La titulacin es un procedimiento analtico que consiste en agregar a una solucin del aminocido cantidades
sucesivas de un agente titulante (acido o base) registrando simultneamente los valores de pH que se generan.
Los datos obtenidos se grafican, ubicando los volmenes del titulante en la abscisa (eje x) y los valores de pH
en la ordenada (eje y), de la unin de estos puntos se obtiene una grfica denominada curva de titulacin, a
partir de la cual se pueden determinar los valores de pKa y el punto isoelctrico de los aminocidos. La
siguiente figura muestra los clculos y el grafico de titulacin para determinar el pI de la alanina.



Figura 6. Curva de titulacin y clculo de pI para la alanina



La forma de la curva de titulacin presenta dos regiones planas amortiguadas y una inflexin con una vertical
muy pronunciada; las regiones planas indican la mnima variacin del pH a medida que se agrega la base, ello
muestra la presencia de dos sistemas amortiguadores, el primero formado por las especies I y II, y el segundo
por las especies II y III. La mxima capacidad de ellos se obtiene a la mitad de cada semititulacin, cuando la
concentracin de las especies I y II, y II y III, son iguales; para el primer sistema el punto medio muestra un pH
= 2.3, y ese ser el pKa del equilibrio entre las especies I y II, en otro sistema el punto medio ocurre a un pH =
9.7, y ser por lo tanto el pKa del equilibrio entre las formas II y III.
La regin vertical de la curva indica una variacin brusca del pH con mnimas adiciones de NaOH, denotando la
finalizacin de la primera semititulacin y la no presencia de sistemas amortiguadores; igual situacin ocurre al
inicio y final de toda la titulacin, donde la presencia mayoritaria de una sola especie provoca esas variaciones
bruscas en el pH. Lo prctico de este hecho es que sirve para mostrar el punto final de la titulacin y para
determinar con cierta aproximacin el punto isoelctrico del aminocido, entendido como el pH correspondiente
al punto medio de la parte ms vertical de la curva de titulacin, que en este caso seria 6.0.

Las curvas de titulacin de los aminocidos con grupos en su cadena lateral que se ionizan, tales como la
histidina, la lisina y el acido glutamico, son ms complejas, puesto que son una combinacin de la curva
correspondiente a la disociacin del grupo de la cadena lateral y las curvas de valoracin de los grupos -amino
y -carboxilo. A continuacin se muestran las curvas de titulacin para la lisina y acido glutmico
respectivamente (figura 7).

H
3
N(CH
2
)
4
CHCO
2
H
NH
3
H
3
N(CH
2
)
4
CHCO
2
-
NH
3
H
3
N(CH
2
)
4
CHCO
2
-
NH
2
H
2
N(CH
2
)
4
CHCO
2
-
NH
2
OH
-
H
3
O
+
OH
-
H
3
O
+
OH
-
H
3
O
+
Forma dicatinica
pKa
1
= 2.2
Forma monocatinica
pKa
2
= 9.0
Ion dipolar
pKa
3
= 10.5
Forma aninica




OH
-
H
3
O
+
OH
-
H
3
O
+
OH
-
H
3
O
+
Forma dianinica
pKa
1
= 9.67
Forma monocatinica
pKa
2
= 2.19
Ion dipolar
pKa
3
= 4.25
Forma aninica
HO
2
CCH
2
CH
2
CHCO
2
H
NH
3
HO
2
CCH
2
CH
2
CHCO
2
-
NH
3
-O
2
CCH
2
CH
2
CHCO
2
-
NH
3
-O
2
CCH
2
CH
2
CHCO
2
-
NH
2


A
B




Figura 7. Curva de titulacin y clculo de pI para A). lisina y B). cido glutmico
Materiales, Equipos y Sustancias

Sustancias Materiales y Equipos
Solucin de aminocidos (glicina, alanina,
tirosina) 0.1M en HCl 0.05M
Beakers
Solucin de NaOH 0.1M Bureta de 25 mL
Agua destilada pH-metro

Seccin Experimental

1. Calibre el pH-metro. Siga las instrucciones del profesor para calibrar y limpiar pH-metro.

2. Adicione 10 mL de la solucin de aminocido suministrada por el profesor, a un erlenmeyer y sumerja el
electrodo indicador de pH; anote el valor.

3. Con un poco de NaOH 0.1M enjuague una bureta, bote el residuo y proceda a llenarla con la misma solucin.

4. Adicione 0.5 mL de NaOH 0.1M a la solucin de aminocido, agite, mida y anote el pH.

5. Contine agregando de a 0.5 mL de NaOH 0.1M hasta que el pH sea cercano a 12. No olvide medir y anotar
el pH despus de cada adicin de titulante.

6. Consulte con el monitor donde depositar el NaOH sobrante; proceda luego a enjuagar la bureta con
abundante agua.


Informe

Haga una grfica de pH vs mL de NaOH
De la curva anterior deduzca y justifique, para el aminocido que est titulando, los valores de pKa
1
,
pKa
2
, y pI. Comprelos con los reportados en la literatura.
Escriba la reaccin que sufre la forma dipolar del aminocido a medida que se adiciona la base.



Residuos

Todos se depositan en residuos para neutralizar


Referencias

1. Hormaza, Angelina, Manual de laboratorio de biorganica, Medellin : Universidad Nacional de Colombia,


2004, pp: 87-90.

2. Litwack, Gerard, Bioqumica experimental : un manual de laboratorio, Ed. Omega, Barcelona, 1967, pp:
157-164