UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARABA

CENTRO DE CINCIAS E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA SANITRIA E AMBIENTAL
COMPONENTE: MICROBIOLOGIA EXPERIMENTAL - 2014.1
TURMA: 2012.1
ALUNOS: CAROLINA CAVALCANTE DE MIRANDA -121010171
CINTHIA SANY FRANA XAVIER 121013529
THIAGO SANTOS DE ALMEIDA LOPES - 131013068
PROFESSOR: HLVIA ARAJO


Relatrio referente prtica da I Unidade Temtica
da componente curricular Microbiologia
Experimental. Ministrada pela Prof Hlvia Arajo.

1. PRESENA DE MICRORGANISMOS NO AMBIENTE

1.1. INTRODUO

Os microrganismos so encontrados nos mais diversos ambientes, podendo estar em
suspenso ou depositados com a poeira em vrias superfcies, entre elas e as mucosas do homem.
O meio aqutico foi, provavelmente, o ambiente primordial para os diversos microrganismos, os
quais se diversificam e colonizaram outros ambientes. Nas partculas de poeira, os
microrganismos esto presentes em grandes quantidades e, portanto, so passveis de entrar em
nosso organismo atravs de diversos mecanismos. Os microrganismos presentes no ar
depositam-se na superfcie de nosso corpo, cabelos, pele e mucosas, bem como nos alimentos e
bebidas.
Vivemos, portanto, em completa interao com os microrganismos e precisamos aprender
a conviver com eles. Felizmente, a maioria das espcies microbianas benfica ou incua e uma
baixa proporo de microrganismos causa prejuzos ao homem.
As atividades no laboratrio de microbiologia consistem no isolamento, conservao e
manipulao de culturas de microrganismos A prtica assptica de fundamental importncia
para prevenir que microrganismos contaminantes venham a crescer nos meios artificiais de
estudo. Atravs de tcnicas simples, possvel demonstrar a presena de microrganismos em
diversos locais do ambiente onde nos encontramos.

1.2. OBJETIVOS

Esse experimento tem como objetivos reconhecer os materiais, equipamentos e normas
do laboratrio de microbiologia, averiguar a presena de microrganismos no ambiente de
trabalho e na pele e averiguar o efeito da higienizao das mos

1.3. MATERIAIS

Meios e Solues: gar nutriente, caldo nutriente.
Equipamentos: Placas de Petri, tubos de ensaio, bico de Bunsen.

1.4. DESCRIO DO EXPERIMENTO

Para verificarmos a contaminao ambiental expomos pela universidade algumas placas
de Petri contendo o gar nutriente e mantemos a placa aberta por aproximadamente 15 minutos
at que acontecesse a contaminao da mesma. Alm disso, fizemos a contaminao pela pele e
pela saliva, onde no primeiro tocamos os dedos sobre a placa com o gar e no segundo,
utilizamos um basto de aste longa com um algodo na ponta semelhante a um cotonete
umedecendo-o com saliva e em seguida passamos sobre o gar nutriente contido da placa.
Por fim, identificamos as placas, anotando na tampa o tipo de exposio a que foram
submetidas, a data e o nome do aluno e incubamos as placas na posio invertida uma
temperatura de 35C durante 48 horas.

2. OBSERVAES E PREPARAES MICROSCPICAS

2.1. INTRODUO

Na Microbiologia estudam-se organismos muito pequenos para serem vistos e
individualizados claramente a olho n. Para a visualizao desses microrganismos, faz-se
necessria uma aproximao que conseguida atravs de um microscpio. O termo microscpio
deriva do latim, micro, que significa pequeno; e, do grego Skopos, que significa olhar.
O microscpio rotineiramente utilizado no laboratrio o microscpio ptico composto.
Seu princpio de funcionamento baseia-se no aumento da imagem por um conjunto de lentes
convergentes, associado a uma forte iluminao do campo de observao, fornecendo uma
imagem translcida dos microrganismos.
O microscpio desse tipo utilizado na microscopia de campo claro. A imagem
produzida por esse instrumento a mais clssica na microscopia, pois a luz passa atravs do
espcime, fazendo com que a rea observada apresente-se bem iluminada. A dificuldade
principal nesta microscopia luminosa est na possibilidade de obter uma maior ampliao, sem
prejuzo na nitidez da imagem.
J a microscopia de campo escuro baseada no efeito Tyndall, segundo o qual a poeira
existente no ar invisvel a olho nu, tornando-se visveis como pontos brilhantes. Os
microscpios de campo escuro tm um condensador especial que impede a penetrao dos raios
luminosos na objetiva, mais deixa passar a luz refratada por um objeto presente na lmina. Assim
a imagem do objeto surge luminosa e brilhante. Sua utilizao recomendada para a
visualizao de preparados a fresco, como a gota pendente, em que o objeto a ser observado tem
ndices de refrao muito prximos aos do ambiente e que seria invisvel, ou quase, com a
microscopia de campo claro. Ex: espiroquetas.
A microscopia de luz ultravioleta permite observar objetos menores do que os
observados em microscopia com luz visvel. No entanto, como o comprimento de onda no
muito menor, o aumento obtido de apenas duas vezes. Como a luz ultravioleta no visvel a
olho nu e no atravessa o vidro, h a necessidade de lentes de quartzo e de mquina fotogrfica.
Isso torna o custo elevado, por isso um mtodo pouco utilizado. Entretanto, algumas
modificaes tornaram esse tipo de microscopia bastante til na identificao de
microrganismos.
A microscopia de contraste de fase usa objetiva e condensador especial que tm por
objetivo permitir uma observao mais ntida sem o aumento da imagem. Os ndices de refrao
no so mudados, mas acentuam-se as diferenas existentes. Ela utilizada no estudo de clulas
vivas, particularmente das estruturas celulares, em que o ndice de refrao pouco diferente do
ndice do ambiente e no seria possvel a observao com microscpio comum.
J na microscopia eletrnica usa-se feixe de eltrons, o que permite conseguir aumento
de at 250.000 vezes. Isso permite a visualizao de partculas virais e avaliao da ultraestrutura
das clulas. No entanto, o procedimento sofre limitaes devido necessidade de preparo do
material (dessecao, congelamento etc.) os quais podem afetar a morfologia e impedir a
visualizao dos microrganismos vivos.
A perfeita visualizao dos microrganismos e/ou de suas estruturas s possvel se, alm
da escolha do tipo mais eficiente de microscopia, a preparao estiver adequada. A escolha do
tipo de preparao depende da informao desejada e do microrganismo a ser avaliado.
As preparaes a fresco permitem o exame de organismos nas condies normais de
vida.
As preparaes fixadas e coradas so usadas para verificar as caractersticas
morfolgicas dos microrganismos, sendo bastante utilizadas na identificao, pois tornam mais
fcil a visualizao das formas e permitem a verificao do comportamento tintorial do
organismo em relao s coloraes diferenciais. As etapas dessas preparaes so preparo do
esfregao, fixao e colorao.

2.2. OBJETIVOS

Este experimento tem como objetivos identificar as diferentes partes do microscpio e
manuse-lo adequadamente; aprender a focalizar preparados no microscpio; compreender o
princpio do funcionamento do microscpio ptico composto; aprender a utilizar a tcnica de
preparao microscpica a fresco entre lmina e lamnula; preparar e fixar esfregaos de culturas
em meios slidos e lquidos.



2.3. MATERIAIS

Cultura de microalgas em meio lquido; lminas para microscopia; ala de platina;
microscpio ptico; leo de imerso e Bico de Bunsen.

2.4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Para Preparao a Fresco:

1. Coloca-se uma ou duas gotas no centro da lmina de cultivo de microalgas,
recobrindo-se em seguida com uma lamnula e levando-se ao microscpio para a focalizao;

2. Coloca-se a lmina preparada a fresco sobre a platina, fix-la e, com o auxlio do
charriot, ajustar o campo a ser observado sobre a abertura que existe na platina;

3. Focalizar, com o auxlio do macromtrico, aproximando a objetiva de menor aumento
o mximo possvel da lmina. Observa-se, atravs da ocular, a imagem obtida e, a partir deste
ponto, usa-se o macromtrico afastando-se a objetiva da lmina at a observao da imagem
procurada. Em seguida, usa-se o micromtrico para focalizar e obter melhor nitidez da imagem.
Necessitando-se de um aumento maior, gira-se o revlver para a objetiva seguinte e torna-se a
focalizar com micromtrico, e assim sucessivamente.

4. Para observar a preparao com objetiva de imerso, colocar uma gota de leo de
cedro sobre a lmina e girar o revolver para colocar a objetiva de imerso em foco;

5. Olhando pelo lado, fazer descer o canho como parafuso macromtrico, at que a lente
frontal da objetiva fique encostada no leo de imerso;

6. Mover o parafuso micromtrico at conseguir uma boa focalizao.
Para preparo e fixao de esfregao:

a) Culturas em meio lquido: Retirar uma gotcula da cultura com ala de platina
esterilizada e colocar no centro da lmina, tomando cuidado para no atingir as bordas.
Esterilizar a ala de platina na chama. Secar o esfregao ao ar. Fixar o esfregao passando a
lmina, com o lado do esfregao virado para cima, trs vezes sobre a chama do bico de Bunsen.
Aps resfriamento, procede-se colorao.

b) Culturas em meio slido: Colocar uma gotcula de gua esterilizada na lmina;
Retirar uma pequena quantidade da cultura e misturar com gua; Espalhar o material no centro
da lmina, tomando cuidado para no atingir as bordas. Esterilizar a ala de platina na chama.
Fixar o esfregao passando a lmina, com o lado do esfregao virado para cima, trs vezes sobre
a chama do bico de Bunsen.

3. PREPARAO E ESTERILIZAO DE MEIOS DE CULTURA

Os microorganismos eram cultivados em meios lquidos e naturais (como o caldo de
pimenta, o leite) at cerca de 1880, quando Robert Koch introduziu os meios de cultura slidos,
que permitiram o estudo de espcies isoladas (culturas puras).
Meios de cultura consistem da associao qualitativa e quantitativa de substncias que
fornecem os substratos necessrios ao desenvolvimento dos microorganismos fora do seu meio
natural. Como h uma grande diversidade metbolica dos microorganismos, existem vrios tipos
de meios de cultura para satisfazerem as diferentes necessidades nutricionais. Alm de nutrir os
microorganismos, necessrio fornecer condies ambientais favorveis ao seu
desenvolvimento, como pH, presso osmtica, umidade, temperatura, dentre outras.
Os meios de cultura so classificados:
- Quanto ao estado fsico:
a) Slidos: So meios que j existem na natureza no estado slido, ou que foram tornados
slidos pela adio de uma substncia solidificante como o gar (cerca de 1 a 2%);.
b) Semi-slidos: quando a quantidade de gar e/ou gelatina de 0,075 a 0,5%, o que d
uma consistncia intermediria, o que permite o crescimento de mecroorganismos em tenses
variadas de oxignio;
c) Lquidos: no possuem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo,
permitem obter maior concentrao celular em menor tempo.
- Quanto origem:
a) Naturais ou complexos: aqueles que j existem prontos na natureza e no apresentam
uma composio qumica definida;
b) Artificiais ou sintticos: aqueles que so elaborados e tm a composio qumica
definida.
- Quanto a finalidade:
a) Bsicos: aqueles que permitem o crescimento die um grande nmero de espcies
microbiana, sem satisfazer contudo nenhuma exigncia em especial;
b) Especiais: quando cumprem com as exigncias vitais de determinados
microorganismos, como meio de infuso de crebro e corao, gar suco de tomate, gar sangue,
entre outros.
De acordo com a finalidade bacteriolgica ou micolgica os meios especiais podem ser
classificados em:
- Meios enriquecidos:: meios de cultura adicionados de misturas complexas e naturais;
- Meios seletivos: aqueles que possuem uma composio ou uma ou mais condies que
seleciona o tipo de microorganismos que vai crescer.
- Meios indicadores:so aqueles que indicam determinadas caractersticas metablicas do
microorganismos;
- Meios de enriquecimento: aqueles que permitem o desenvolvimento diferenciado de
microorganismos;
- Meios de dosagem: so empregados na dosagem de substncias, como a vitamina;
- Meios de transporte, estocagem ou manuteno: mantm a viabilidade dos microorganismos
por mais tempo.
A esterilizao do meio de cultura efetuada aps a sua preparao, para assim eliminar
os microrganismos contaminantes. Conseguido geralmente por esterilizao na autoclave. A
autoclave um aparelho utilizado para esterilizar artigos atravs do calor mido sob presso,
formado por um cilindro metlico resistente, vertical ou horizontal e com uma tampa que permite
fechar hermeticamente o autoclave. Essa tampa apresenta parafusos de orelhas e uma anilha de
amianto que impedem a existncia de fugas de presso. A temperatura do processo a vapor
varia conforme os materiais a serem esterilizados situando-se entre 121 e 134 C. A presso
para esterilizao situa-se entre 1,2 kgf/cm (121 C) e 2,2 kgf/cm (134 C).

3.1. OBJETIVOS
Familiarizar o aluno com o preparo e esterilizao de meios de cultura, bem como
conhecer e discutir a aplicao dos diversos tipos de meios de cultura.

3.2. MATERIAIS E REAGENTES UTILIZADOS
- Bquer;
- Erlenmeyer;
- Bico de bunsen;
- Autoclave;
- Estufa;
- Tubo de ensaio com rosca;
- Pera;

3.3. DESCRIO DO EXPERIMENTO

3.3.1. MEIO LQUIDO

Primeiro pesamos o gar indicado pela professora em um vidro de relgio e transferimos
para um becker, em seguida colocamos a quantidade de gua necessria e dissolvemos a soluo
na chapa de aquecimento. Medimos o pH e distribuimos a soluo em tubos na proporo de 5
ml. Em seguida esterelizamos na autoclave a 121 C por 15 minutos.

3.3.2. MEIO SLIDO

Pesamos o gar indicado pela professora em um vidro de relgio e transferimos para um
Erlenmeyer, colocamos a quantidade de gua de acordo com o meio a ser preparado.
Dissolvemos a soluo na chapa de aquecimento at a dissoluo ser completa. Medimos o pH e
colocamos a tampa. E esterelizamos na autoclave a 121 C por 15 minutos.

3.4. CONCLUSO

Aps a realizao dessa atividade prtica percebemos que o uso das culturas serve para
conseguir um elevado nmero de microorganismos de modo que seja possvel estudar suas
caractersticas.

4. COLORAO DE GRAM

A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista holands Hans
Cristian Gram, onde era utilizada em laboratrios de microbiologia com frequncia e consiste em
preparaes histolgicas para observao ao microscpio ptico, utilizada para corar
diferencialmente microorganismos com base na composio qumica da sua parede celular sendo
que a integridade destatambm interfere na colorao.
As coloraes podem ser simples (azul de metileno, Giemsa) ou diferenciais (Gram,
Ziehl-Neelsen). As simples so efetuadas pela aplicao de um nico corante, sendo as clulas
geralmente coloridas de maneira uniforme. Nas diferenciais entre elas ou entre estruturas de uma
mesma clula.
uma tcnica de colorao para diferenciao de microorganismos atravs das cores,
para serem observados em microscpio ptico. As bactrias Gram positivas adquirem uma cor
roxa e as Gram negativas, uma cor vermelha.
Os microrganismos diferem qumica e fisicamente entre si, reagindo de modo diferente s
operaes de colorao. Este o princpio bsico da colorao diferencial. Ento, designa-se
colorao diferencial o mtodo que permite distinguir tipos de bactrias.

Bactrias Gram-negativa Bactrias Gram-positiva

A parede celular de bactrias Gram- positivas composta basicamente por
peptdeoglicano, que constitui uma espessa camada ao redor da clula. Imersos nesta camada,
podem estar presentes outros polmeros, como cidos lipoteicicos e polissacardeos. Nas
bactrias Gram negativas o peptideoglicano constitui uma camada basal delgada, sobre a qual
se encontra uma outra camada, composta por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e
lipopossacardeos, denominada membrana externa.
O mecanismo da colorao de Gram est baseado na diferena de permeabilidade da
parede celular. As bactrias gram negativas apresentam uma elevada concentrao de lipdeos e
uma delgada parede celular quando comparadas com as bactrias gram positivas. Sugere-se que
quando h o tratamento com lcool, os lipdeos das bactrias gram negativas so retirados da
parede celular, aumentando a permeabilidade da mesma e fazendo com que estas bactrias
percam o primeiro corante (cristal violeta). As bactrias gram positivas, por possurem uma
menor concentrao de lipdeos, se tornam desidratadas com o tratamento pelo lcool,
diminuindo a permeabilidade da parede celular e retendo o primeiro corante.
A diferena de comportamento das bactrias frente colorao de Gram significa a
existncia de diferenas marcantes e fundamentais entre as bactrias Gram- positivas e negativas:
Na permeabilidade da parede celular;
Na composio qumica e estrutura bacteriana;
No metabolismo.

4.1. OBJETIVOS
Esse experimento teve como objetivos desenvolver habilidades para executar o mtodo de
colorao de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactrias de acordo com a colorao obtida.
Desenvolver a habilidade, tambm, para utilizar o microscpio ptico, observando as bactrias aps a
colorao de Gram.
4.2. MATERIAIS E REAGENTES UTILIZADOS
Lmina;
Bico de Bunsen;
Estufa;
Microscpio;
Cristal violeta;
Lugol;
Safranina;
lcool.

4.3. DESCRIO DO EXPERIMENTO

Aps a coletar das amostras de microrganismos no ambiente, esperou-se alguns dias at o
desenvolvimento da colnia de bactrias, em seguida, utilizamos uma lmina esterilizada que
com o auxlio de uma ala flambada colocamos uma colnia na lmina. Passamos o esfregao 3
vezes sobre a chama do bico de Bunsen para fixao do mesmo e deixamos o mesmo secar na
estufa. Adicionamos o Cristal violeta e aps aguardarmos 1 minuto aplicamos soluo de Lugol
e aguardamos por mais 1 minutos. Por fim, lavamos com gua e descoramos com lcool absoluto
at que todo o corante seja removido.
Coramos a lmina com safranina e esperamos por mais 30 segundos, aps isso a lmina
foi lavada, seca e examinamos no microscpio com a objetiva de imerso.

4.4. CONCLUSO

Aps aplicarmos os testes de colorao de Gram, observamos que as colnias
apresentavam uma colorao avermelhada o que consiste em classificar-la em Gram-negativa, j
que as Gram-positivas apresentam colorao azulada, o que no o caso.
Tambm foi possvel classificar nossa colnia em Bacilo, j que aps a observao da lmina
em microscpio percebemos que a mesma possuia forma de bastes alongados.

5. PREPARO DE DILUIO

5.1. INTRODUO

Para utilizar os mtodos para efetuar a contagem de microrganismos geralmente utiliza-se
diluio em srie por ser difcil realizar a contagem de milhares ou centenas de colnias. Assim
sendo, efetua-se a diluio da cultura que se pretende contar antes de plaquear (transferir) um
volume conhecido de cultura para a placa slida.
Para se fazer uma diluio em srie, comea-se com organismos em meio lquido.
Acrescentando 1 ml deste meio a 9ml de gua diluio, cria-se uma diluio de 1:10;
acrescentando 1 ml da diluio 1:10 a 9ml de gua de diluio , cria-se uma diluio de 1:100, e
assim por diante. O nmero de bactrias por mililitro de fluido reduzido em 9/10 a cada
diluio.
Para se determinar o nmero de unidades formadoras de colnias na cultura original,
deve-se multiplicar o nmero de colnias encontradas na placa pelo o fator de diluio; se esta
for uma frao deve-se usar o denominador. Um fator de diluio de 1000 seria expresso por
1:1000.

5.2. OBJETIVOS

Familiarizar o estudante coma tcnica de diluio, para utilizar nas tcnicas de contagem
de microrganismos.

5.3. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

1. Preparar uma srie de tubos estries contendo 9 mL de liquido de diluio estril.
2. Com uma pipeta estril, transferir 1 mL da amostra ao primeiro tubo contendo 9mL do
liquido de diluio estril, esta diluio 1/10. Etiquetar o tubo com a diluio correspondente.
3. Agitar a amostra energicamente para obter uma boa distribuio das bactrias na massa
liquida.
4. Descartar a pipeta usada
5. Usando nova pipeta estril, transferir assepticamente 1 mL da diluio 1/10, esta a
diluio 1/100. Etiquetar o tubo.
6. Descartar a pipeta usada.
7. Agitar o tubo de diluio 1/100
8. Usando nova pipeta estril, transferir assepticamente 1 mL da diluio 1/100 a outro
tubo de diluio com 9 mL diluio, esta a diluio 1/1000. Etiquetar o tubo.
9. Da mesma forma, segue-se preparando maiores diluies 1/10.000; 1/100,000 quantas
forem precisas.

OBSERVAES:

Todo material usado deve ser esterilizado.
Em cada diluio, deve-se descartar a pipeta usada. O uso da mesma pipeta no preparo de
duas diluies consecutivas implica incorporar diluio maior, bactrias provenientes de
diluio anterior que, por exemplo ficaram nas pipetas. O erro assim causado altamente
significativo e a contagem final no ter validade.




REFERNCIAS

Apostila de Microbiologia Experimental. 2011
Colorao de Gram: disponvel em: http://pt.scribd.com/doc/23341096/Aula-Pratica-de-
coloracao-de-Gram
Colorao de Gram. Disponvel em: www.prof2000.pt/users/biologia/tcolgram.htm
HARVEY, Richard A.; CHAMPE, Pamela C. e FISHER, Bruce D.: Microbiologia
Ilustrada, 2 Ed., Editora Artmed, 2008.
Microscopia de campo claro. Disponvel em:
http://microscoptica.blogspot.com.br/2013/04/microscopio-de-campo-claro.html