PRÁCTICO 8-9

Electroforesis en gel de
poliacrilamida al 12%, con
tinción Nitrato de plata

Integrantes: Docentes:

Felipe Cayumil Dr. Reginaldo

del Pozo, PhD

Jaime Hernández Bq. Javier

Grandón

Karol González Bq. Mirna

Muñoz

Javiera León QA. Germán

Rotter

Patricia Lobos

Mitchel Manterola
Muestra problema n°2

Fecha de realización: 19/08/2009 Fecha de entrega:

24/09/2009

26/08/2009

Introducción

Dentro de las técnicas de laboratorio utilizadas con mayor frecuencia, se

encuentra la electroforesis, técnica basada en la utilización de una corriente
eléctrica, controlada a diferentes voltajes con el fin de lograr la separación
de biomoléculas. La separación puede realizarse sobre la superficie
hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato
de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o
bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se
use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las
moléculas y a su masa.

Esta técnica fue inventada por el bioquímico sueco Arne Wilhelm Kaurin
Tiselius, quien sometió a corriente eléctrica en un tubo de cuarzo una
solución proteica y observó que en el tubo se diferenciaban distintas
bandas, de distintos grosores. En ese momento no utilizo ningún tipo de
soporte, pero más adelante se descubriría que al utilizar soporte se notan
zonas mucho mas delimitadas.

Actualmente los instrumentos utilizados para la realización de esta técnica

bioquímica son primero una fuente de tensión la que realizara los cambios
de voltaje para que corra la muestra, electrodos, cubetas, un soporte
electroforético y un tampón. La existencia de distintos tipos de soportes nos
posibilita a clasificar las electroforesis dentro de 2 grandes grupos,
dependiendo de la ausencia o presencia de impedimento al paso de
moléculas. Si no oponen resistencia, es un soporte no restrictivo y si lo hace
hablaríamos de un soporte restrictivo.
Dentro del grupo de soportes restrictivos, el más representante de estos por
excelencia es la electroforesis en gel de poliacrilamida, una de las más
utilizadas para la caracterización de mezclas proteicas de gran complejidad,
lo cual se debe a sus múltiples ventajas. Es rápido, se necesita poca
muestra para poder analizar, el gel es químicamente inerte, es
transparente, por lo que facilita la visibilidad de las bandas, el gel también
es resistente a agentes desnaturalizantes como la urea y detergentes,
mecánicamente son estables, lo que posibilita su deshidratación para
reducirlos a una capa fina que facilita su almacenamiento, también son
estable a variados pH y a temperaturas variadas.

En el práctico utilizamos el método electroforético en gel de poliacrilamida.

El proceso de separación de este gel se basa en la porosidad del mismo, el
cual obtuvimos mezclando distintas concentraciones de poliacrilamida y bis-
acrilamida (dependiendo de el porcentaje que buscábamos, en nuestro caso
de 12%) siendo menor el poro cuanta más bis-acrilamida usemos en
comparación a ala archilamida. También se puede controlar los tamaños de
los poros variando los tiempos de polimerización. Esta polimerización se
lleva a cabo iniciando un sistema generalizador de radicales libres, se
comienza con la adición de TEMED (tetrametiletilendiamina) y persulfato de
amonio. TEMED acelera la velocidad de formación de radicales libres a partir
del persulfato, estos radicales libres convierte a los monómeros de
acrilamida en radicales libres que activan a otros monómeros iniciando la
polimerización, los enlaces entrecruzados están dados por la polimerización
de la bis-acrilamida es por eso que cuanto más concentración de bis-
acrilamida adicionemos menor será el tamaño del poro. Esta técnica se
combina con la adición a la muestra de sodio dodecil sulfato (SDS) el cual es
un detergente que se une a las proteínas proporcional a la masa molecular
de estas, las somete a desnaturalización, cargándolas negativamente así la
distancia que avancen las proteínas estará dado exclusivamente por el
tamaño y no por la forma. Además al cargarlas negativamente asegura que
la migración será de cátodo a ánodo.

Habitualmente, se utilizan 2 geles de distinta porosidad. El segundo gel es

el llamado “stacking gel” con poros mas grandes generalmente 4% que
permite concentrar la muestra aplicada, antes de ingresar al gel de
separación. En el práctico también se utilizo este gel.

En el siguiente informe se entregara el análisis de la electroforesis teñida

con nitrato de plata, incluida el análisis de nuestra muestra problema, se
comparara con la tinción de Coomassie Blue G250. Comprobando la
superioridad de la tinción de nitrato de plata desde el punto de vista de
resolución en la electroforesis.

Una aplicación clínica de esta técnica es el análisis de proteínas

plasmáticas, hay que recordar que en plasma hay más de 120 proteínas
solubles que pueden ser identificadas bioquímicamente, y separadas y
cuantificadas electroforéticamente según sus respectivas características
físico-químicas.
Alteraciones en sus concentraciones normales no pueden ser identificadas
como patologías ya que la electroforesis no es una no aporta resultados
patognomónicos y, en consecuencia, las alteraciones que en ella se
encuentren deben ser confirmadas por métodos de mayor sensibilidad y
especificidad, para así, conocer cuál es la patología.

OBJETIVOS

• Comprender la técnica SDS-Page en una cámara mini-gel vertical por

su esencial participación en la corrida electroforética
• Elaborar geles de poliacrilamida, paso que se debe saber en la teoría
y en la practica
• Elaborar de “stacking gel”, y su porque en la técnica, es importante
de entender
• Comprender principios físicos y químicos en una corrida
electroforética.
• Conocer procesamientos con el gel, luego de la separación
electroforética, saber requisitos para reciclar, ya que, recordemos el
gel es reutilizable.
• Comparar nuestra tinción de Nitrato de plata con la tinción de
Coomassie blue G250, de un gel con el mismo porcentaje que el
nuestro (12%), para así determinar diferencias y similitudes en el
análisis de proteínas.
• Y por último, analizar las bandas proteicas obtenidas tras la
separación electroforética. Conocer de que proteínas está compuesto
cierto líquido biológico o en el caso de la muestra problema, poder
llegar a inferir de que liquido se habla con la composición proteica
correspondiente.

Materiales y métodos
 Cámara de electroforesis Mini- Protean III:
 2 placas de vidrio -Unidad ensambladora
 Vaso precipitado (vaso 100 ml)
 Mechero
 Microcentrífuga
 Jeringa Hamilton
 Gradilla
 Mechero, rejilla y trípode
 Tubos de microcentrífuga Eppendorf
 Agitador
 Fuente de Poder
 Recipiente Plástico (guardar el gel)
 Cámara Fotográfica
 Kit de reactivos para tinción con nitrato de plata
 Agua destilada
 Toalla Absorbente
 Matraz Erlenmeyer

 Gel de separación y Stacking Gel:

 Agua desionizada.
 Tris HCl 1.5M pH 8.8
 Acrilamida Bis/30%
 SDS 10%
 Persulfato de amonio 20%
 TEMED

 Buffer de muestra (buffer SDS-reductor):

 Tris-Hcl 0.5M pH 6.8
 Glicerol
 SDS 10%
 2-mercaptoetanol
 1% azul de bromofenol
 Agua desionizada

 Buffer de Corrida:
 Tris-base
 Glicina
 SDS
 Agua destilada

 Estándares:
 Caleidoscópico
 Real
 Preteñido

Método

1.- Preparación de geles de separación:

• Ensamblado de cámara de electroforesis:

• Preparación de geles de separación 12%:

2.- Preparación “Stacking Gel”:

3.- Preparación de la muestra y el estándar:

Las preparaciones de las muestras se hicieron según la siguiente

tabla:

N° Muestra Volumen de carga (ul) Dilución

1 Estándar 15 ---

2 Suero 5 1:50

3 Muestra problema N°2 15 ---

4 L.C.R. 15 1:2

5 Estándar real 5 1:20

6 Liquido Ascítico 10 1:25

7 BSA 7 1:5

8 Bilis 10 1:10

9 Liquido pleural 10 1:50

10 Estándar pre teñido 10 ---

Las muestras fueron diluidas con el buffer de muestra (SDS- Reductor)

compuesto por:

 Tris-Hcl 0.5M pH 6.8

 Glicerol
 SDS 10%
 2-mercaptoetanol
 1% azul de bromofenol
 Agua desionizada
La etapa de dilución fue realizada por los profesores encargados.

4.- Corrida Electroforética:

Observaciones de la corrida electroforética:

(1): Cada cámara electroforética sirve para 2 geles

(2): es importante saber la cantidad de proteína aplicada para que la
intensidad de la línea al momento de revelar la corrida no sea tan intensa o
muy débil.

(3): La muestra se debe aplicar lentamente y a la mitad del pocillo del gel
(no se debe tocar el gel)

(4): no se debe aplicar más de este voltaje ya que el gel o la cámara de

electroforesis puede sufrir algún daño.

(5): Detener el voltaje y desensamblar la cámara electroforética (paso

realizado por el profesor)

(6): No tocar el gel, solo desprender con ayuda del buffer y agua destilada
(paso realizado con ayuda del profesor). Solo dejar el gel de corrida;
eliminar stacking gel.

5.- Tinción de muestras:

(*) observaciones de la tinción de muestras

(1): Sacar fotos sin flash mientras se esté revelando el gel

Tinción con azul de Coomassie:

Las técnicas más utilizadas para teñir geles de

poliacrilamida son la tinción con nitrato de plata y con
azul de Coomassie. Las dos técnicas tienen ventajas y
desventajas, la ventaja de la tinción con nitrato de plata
es su gran sensibilidad, y la del azul de Coomassie es su limpieza al trabajar
con él.

El azul de Coomassie tiñe todo el gel de

poliacrilamida, es por esto que se debe realizar
un lavado para reconocer las bandas. Esta
tinción se une más fuerte a las proteínas que al
gel, lo que hace posible que luego del lavado
solo queden visualizadas las bandas.

El azul de Coomassie se debe disolver en metanol, acido acético glacial y

agua, y luego filtrar. El gel ya fijado se tiñe con azul de Coomassie por 30 a
45 minutos aproximadamente (dejándolo en el agitador). Luego de esto, se
debe retirar el colorante utilizando la solución decolorante (metanol/acido
acético glacial/agua), esperar unos 20 minutos hasta que se visualicen las
bandas proteicas.

Migración de las proteínas

Las proteínas al tener todas las

mismas cargas (carga negativa y
además estar en forma lineal)
migraran hacia el polo negativo, no siendo su carga neta una variante al
momento de la migración. La única variante será su masa molecular. Esto
es útil para realizar una estimación aproximada de esta variante. El gel
ofrece resistencia a las proteínas de mayor tamaño ya que se le hace más
difícil el paso por los poros de este, mientras que las más pequeñas
migraran de forma más libre llegando más abajo en su carril. A mayor
concentración del gel, las proteínas pasaran más lento, y la electroforesis
demorará mas.

SDS (dodecil-sulfato sódico)

El SDS es un detergente con capacidad

desnaturalizante (deja a la proteína en su
estructura primaria) que al unirse a las cadenas
polipeptídicas les otorga carga neta negativa.
Gracias a esta propiedad la carga neta de las
proteínas no es una variante a considerar,
dejando solo como variante la masa molecular.

Polimerización de la acrilamida

 Persulfato de amonio: Cataliza la polimerización de la acrilamida por

los radicales libres que forma los cuales reaccionan con el monómero
inactivo.
 TEMED ( tetrametiletilendiamina): acelera la velocidad de formación
de radicales libres a partir del persulfato de amonio.
 Metilenbisacrilamida: Permite la formación de enlaces entrecruzados
de la acrilamida, lo cual le dará la porosidad al gel.
RESULTADOS

Tal como lo hemos planteado anteriormente, el último objetivo de este

práctico es analizar las bandas proteicas con el fin de conocer los
componentes de los diferentes fluidos biológicos. Para esto es necesaria una
serie de procesos.

Se obtienen las mejores fotografías, donde las bandas se puedan ver

nítidamente.

Se puede usar el estándar Real para la identificación del orden de los

carriles, en este caso el estándar Real que fue sembrada en el carril 5 se
encuentra también en el carril 5 por lo que sabemos que la fotografía está
“al derecho” (los carriles están en el mismo orden que fueron sembrados.

De izquierda a derecha se lee en ambas fotografías:

1.- Estándar Caleidoscópico

2.- Suero

3.- Muestra Problema

4.- Líquido Cefalorraquídeo (LCR)

5.- Estándar Real

6.- Líquido Ascítico (o Líquido Peritoneal)

7.- BSA (Albúmina de Suero Bovino)

8.- Bilis

9.- Líquido Pleural

10.- Estándar Preteñido

Para crear la gráfica de la curva es necesario calcular la Movilidad Relativa

de cada banda de los estándares, pero para esto primero se requiere
identificar dichas bandas.

Para identificar las bandas en nuestro gel, que al ser teñido con Nitrato de
Plata, el cual es mucho más sensible, revela hasta las bandas más ínfimas,
tuvimos que compararlo con el gel análogo teñido con Azul de Coomassie
(mismo porcentaje: 12%)

Estándar Caleidoscópico

El gel teñido con Azul de Coomassie nos indica las

proteínas más importantes que debemos tomar para crear
nuestra curva.

Luego se calculamos la movilidad relativa de cada una de

estas bandas.

Movilidad Relativa (Rf) = Distancia recorrida de la

banda

Medida total del gel

Luego de esto se relacionaron las bandas encontradas con

su correspondiente peso molecular.
Nota: aunque en los 3 estándares estén las mismas proteínas, los pesos
moleculares son diferentes pues la adhesión de la tinción (de diferentes
pesos) los hace variar.

Los Rf están relacionados de manera inversamente proporcional con el

logaritmo del Peso molecular, por lo que ocupamos esta propiedad para
construir una línea recta con pendiente negativa.

Std. Caleidoscópico

Proteína PM (KDa) Log PM Rf Rf

Miosina 195,115 2,29 0,08 0,08

B-Galactosidasa 131,025 2,12 0,25 0,24

Albúmina 85,006 1,93 0,46 0,45

Inhibidor Tripsina 31,528 1,5 0,75 -

Lisosima 17,251 1,24 0,89 0,9

Se repite lo mismo con todos los estándares.

Estándar Real

Std. Real

Log
Proteína PM (KDa) PM Rf Rf

B-Galactosidasa 116,25 2,07 0,31 0,32

Albúmina 66,2 1,82 0,5 0,49

Anhidrasa Carbónica 31 1,5 0,74 0,72

Estándar Preteñido

Std. Preteñido

Proteína PM (KDa) Log PM Rf Rf

Miosina 202 2,31 0,08 0,09

B-galactosidasa 117 2,07 0,35 0,33

Ovoalbúmina 93 1,7 0,76 0,7

Lisosima 19 1,28 - 0,94

 Una vez tenido estos datos se puede construir la gráfica de la
relación Log PM v/s Rf

Gel teñido con Nitrato de Plata

Gráfica de la relación log PM v/s Rf

2,5

2
log PM (KDa)

1,5

0,5
y = -1,1993x + 2,4318
R2 = 0,9509
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Rf

Todos Std. Caleidoscópico Std. Real Std. Preteñido Lineal (Todos)

Gel teñido con Azul de Coomassie

 Gráfica de la relación log PM v/s Rf

2,5

2
log PM (KDa)

1,5

0,5
y = -1,2342x + 2,4384
R 2 = 0,9763
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Rf

Todos Std. Caleidoscópico Std. Real Std. Preteñido Lineal (Todos)

Teniendo la curva de los estándares, con la Ecuación de la Recta se

interpolan los Rf de las bandas para obtener el PM al que corresponden:

Ej.:

Ec. de la Recta del gráfico de Nitrato de Plata:

y = -1,1993x + 2,4318

Se reemplazó la “x” por el Rf de la albúmina del mismo estándar Real para

comprobar que la pendiente estaba bien.

y = -1,1993 · 0,5 + 2,4318

= -0,59965 + 2,4318

= 1,832

A este resultado se le saca la función inversa al “Log”, Exp base 10 para

obtener el PM en KDa

PM= 67,920 KDa

Para obtener el resultado en Da sólo basta con multiplicar el resultado por

“1.000”.

PM= 67.920 Da

Suero
 SUERO

PM
Proteína (Da)

850.00
Ig M 0

725.00
α-2-Macroglobulina 0

380.00
β-Lipoproteína 0

340.00
C3 0

180.00
Ig E 0

180.00
Ig D 0

160.00
Ig A 0

150.00
Ig G 0

100.00
Haptoglobina-1 0

Transferrina 80.000

Albúmina 66.200

Prealbúmina 62.000

Fosfatasa Alcalina 56.800

α-1-Antitripsina 54.000

α-1-Glicoproteína El suero es el componente de la sangre (de un

Ácida 44.000 color amarillo, un poco más intenso que el
plasma) libre de factores de coagulación y
Eritropoyetina 30.000
células sanguíneas. Contiene numerosas
proteínas, efectores biológicos, como el factor
de crecimiento derivado de plaquetas o anticuerpos que se formar como
respuesta inmunitaria.

Es útil en la identificación de algunos analitos en los que no se requiere de

la intervención de un anticoagulante, ya que este podría interferir en el
resultado alterándolo.

Banda 1: Banda 1:
Banda delgada, difusa y bien teñida. Banda delgada, difusa y mal teñida.
Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a
una tensión deficiente.

Rf= 0,44 Rf= 0,43

PM= 80.169 Da PM= 80.910 Da

Posible Proteína= Transferrina Posible Proteína= Transferrina

Banda 2: Banda 2:

Banda gruesa, nítida y bien teñida. Banda gruesa nítida y bien teñida.

Rf= 0,52 Rf= 0,51

PM= 64.269 Da PM= 64.417 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Posible Proteína= Albúmina Sérica

Banda 3: Banda 3:

Banda gruesa, nítida y bien teñida. Banda gruesa nítida y bien teñida.

Rf= 0,65 Rf= 0,63

PM= 44.875 Da PM= 45.814 Da

Posible Proteína= α-1-glicoproteína Posible Proteína= α-1-glicoproteína

ácida ácida

Banda 4:

Banda delgada, difusa y mal teñida.

Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a
una tensión deficiente.

Rf= 0,71

PM= 38.019 Da

Posible Proteína= α-1-glicoproteína

ácida o degradación de proteínas

Banda 5: Banda 4:
Banda delgada, difusa y mal teñida. Banda delgada, difusa y mal teñida.
Esta banda no es representativa ni Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a aporta mayor
LCRinformación debido a
una tensión deficiente. una tensión deficiente.
PM
Rf= 0,76 Proteína Rf= 0,75 (Da)

PM= 33.113 Da PM= 32.584 Da 850.00

Ig M 0

725.00
Posible Proteína= Eritropoyetina o Posible Proteína= Eritropoyetina
α-2-Macroglobulina 0o
degradación de proteínas degradación de proteínas
380.00
β-Lipoproteína 0

LCR 340.00
Fibrinógeno 0

160.00
Ig A 0

150.00
Ig G 0

140.00
Enzima convertidora de Angiotensina 0

135.00
Lactato Deshidrogenasa (LDH) 0

132.00
Ceruloplasmina 0

131.00
Proteína C reactiva 0

Aspartato aminotransferasa (ASAT) 93.000

Transferrina 80.000

Creatinquinasa (CK) 78.500

Albúmina 66.200

Prealbúmina 62.000

Fosfatasa Alcalina 56.800

Globulina Gc 51.000
El líquido cerebroespinal o
Glutamato-oxalacetato transaminasa
cefalorraquídeo es un líquido
(GOT) 47.478
con un volumen entre 100 y
150 ml de color Ovoalbúmina 45.000
transparente, que baña el
α-1-Glicoproteína Ácida 44.000
cerebro y la médula espinal.
Proteína mielínica básica 18.500

Lisosima 14.400

Cistatina 13.000

α-2-Microglobulina 11.818
Se encuentra circulando por el espacio subaracnoideo, los ventrículos
cerebrales.

Puede enturbiarse por la presencia de leucocitos o la presencia de

pigmentos biliares. Numerosas enfermedades alteran su composición y su
estudio es importante y con frecuencia determinante en las
infecciones meníngeas, carcinomatosis y hemorragias.

Banda 1: Banda 1:

Banda gruesa, nítida y bien teñida. Banda gruesa, nítida y bien teñida.

Rf= 0,51 Rf= 0,5

PM= 66.069 Da PM= 66.223 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Posible Proteína= Albúmina Sérica

Banda 2: Banda 2:

Banda gruesa, nítida y bien teñida. Banda gruesa, nítida y bien teñida.

Rf= 0,63 Rf= 0,62

PM= 47.424 Da PM= 47.098 Da

Posible Proteína= GOT, Subunidad α Posible Proteína= GOT, Subunidad α

de la proteína G, α-1-Glicoproteína de la proteína, α-1-Glicoproteína ácida
ácida u Ovoalbúmina, globulina Gc u Ovoalbúmina.
(PM: 51.000 da)

Banda 3:

Banda delgada, difusa y mal teñida.

Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a
una tensión deficiente.

Rf= 0,75

PM= 34,041 Da

Posible Proteína= degradación de

proteínas

Líquido Ascítico
 LIQ. ASCÍTICO
El espacio
Proteína PM (Da) peritoneal
Lactato Deshidrogenasa
contiene
(LDH) 135.000 normalmente
una cantidad
Albúmina Sérica 66.200 inferior a 50 ml
Fosfatasa Alcalina 56.800 de un líquido
claro y
Amilasa 45.000 transparente,
Anhidrasa Carbónica 31.000 de color
amarillo pálido,
que se mantiene en equilibrio
dinámico por fuerzas que regulan su
formación y reabsorción, cuya función es la de lubricar y
proteger esta cavidad, recubriendo todos los órganos del
abdomen. En diversas situaciones patológicas, este
líquido se altera y se produce una acumulación anormal
de fluido. La ascitis es una gran acumulación de líquido
intersticial o extracelular en la cavidad peritoneal,
análoga a la que se produce en el tejido celular
subcutáneo en caso de edema.

Banda 1:

Banda no muy gruesa,

nítida y bien teñida.

Rf= 0,4

PM= 89.536 Da

Posible Proteína= En
patología puede ser
Transferrina,
Haptoglobina,
Protrombina o
Colinesterasa.

Fisiológicamente
puede ser:
degradación de alguna
proteína como la LDH

Banda 2: Banda 1:
Banda no muy gruesa, Banda delgada, nítida y
no muy nítida y bien no muy bien teñida.
teñida.

Rf=0,45 Rf= 0,45

PM= 77,983 PM= 76.884 Da

Posible Proteína= En Posible Proteína= En

patología puede ser patología puede ser
Protrombina o Protrombina o
Transferrina, o sino Transferrina, o sino
sólo es una sólo es una
degradación proteica. degradación proteica.

Banda 3: Banda 2:

Banda gruesa, nítida y Banda gruesa, nítida y

bien teñida. bien teñida.

Rf= 0,51 Rf= 0,52

PM= 66.069 Da PM= 62.661 Da

Posible Proteína= Posible Proteína=

Albúmina Sérica Albúmina Sérica

Banda 4:

Banda delgada, difusa

y mal teñida. Esta
banda no es
representativa ni
aporta mayor
información debido a
una tensión deficiente.

Rf= 0,57

PM= 55.976 Da

Posible Proteína=
Fosfatasa Alcalina

Banda 5: Banda 3:
Banda gruesa, nítida y Banda gruesa, nítida y
bien teñida. no muy bien teñida.

Rf= 0,62 Rf= 0,63

PM= 48.753 Da PM= 45.814 Da

Posible Proteína= Posible Proteína=

Amilasa, degradación Amilasa, degradación
de proteínas de proteínas
glicoproteína ácida, glicoproteína ácida o
fibronectina (PM: fibronectina.
45000), interferón
gamma (45.000
-50.000 da)

Banda 6: Banda 4:

Banda gruesa, no muy Banda no muy gruesa,

nítida y bien teñida. nítida y no muy bien
teñida.

Rf= 0,73 Rf= 0,76

PM= 35.975 Da PM= 31.623 Da

Posible Proteína= Posible Proteína=

Anhidrasa Carbónica, Anhidrasa Carbónica o
Adenosina Desaminasa proteínas degradadas
(PM: 35.000 da) a o
proteínas degradadas

Banda 7:

Banda delgada, difusa

y mal teñida. Esta
banda no es
representativa ni
aporta mayor
información debido a
una tensión deficiente.

Rf= 0,8

PM= 29.648 Da

Posible Proteína=
Anhidrasa Carbónica o
degradación de
proteínas

BSA

La albúmina se encuentra en gran proporción en el plasma

sanguíneo conforma la proteína más importante del mismo.
Sus funciones son tales como el transporte de ácidos grasos,
calcio, cobre, algunas hormonas esteroidales y una gran
variedad de fármacos, a parte de mantener la presión
oncótica necesaria para la distribución correcta de los
líquidos corporales entre el compartimente intravascular y el
extracelular.

La albúmina es sintetizada en del hígado y tiene carga

eléctrica negativa, lo que impide la filtración glomerular a la
orina

Actualmente la albúmina de suero bovino (BSA) es una de

las proteínas más ampliamente utilizadas en la industria médica (es un
componente de drogas terapéuticas y de pruebas diagnósticas, sirve como
estándar y diluyente, puede servir como buffer para estabilizar proteínas,
anticuerpos y conjugados, entre otros). BSA

PM
Proteína (Da)

Albúmina
Sérica 66.200

Prealbúmina 62.000
Banda 1: Banda 1:

Banda gruesa, nítida y bien teñida. Banda gruesa, nítida y bien teñida.

Rf= 0,51 Rf= 0,50

PM= 66.069 Da PM= 66,221 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica y Posible Proteína= Albúmina Sérica y

puede que también Prealbúmina puede que también Prealbúmina

Banda 2: Banda 2:

Banda delgada, no muy nítida y bien Banda delgada, no muy nítida y bien
teñida. teñida.
Rf= 0,6 Rf= 0,59

PM= 51.523 Da PM= 51.861 Da

Posible Proteína= proteínas Posible Proteína= proteínas

degradadas, posible contaminación o degradadas, posible contaminación o
quizás Prealbúmina quizás Prealbúmina

Banda 3: Banda 3:

Banda delgada, no muy nítida y bien Banda delgada, no muy nítida y bien
teñida. teñida.

Rf= 0,65 Rf= 0,66

PM= 44.875 Da PM= 42.073 Da

Posible Proteína= proteínas Posible Proteína= proteínas

degradadas o posible contaminación degradadas o posible contaminación

Banda 4: Banda 4:

Banda delgada, difusa y mal teñida. Banda delgada, difusa y mal teñida.
Esta banda no es representativa ni Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a aporta mayor información debido a
una tensión deficiente. una tensión deficiente.

Rf= 0,72 Rf= 0,72

PM= 36.983 Da PM= 35.481 Da

Posible Proteína= degradación de Posible Proteína= degradación de

proteínas proteínas

Banda 5: Banda 5:

Banda delgada, difusa y mal teñida. Banda delgada, difusa y mal teñida.
Esta banda no es representativa ni Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a aporta mayor información debido a
una tensión deficiente. una tensión deficiente.

Rf= 0,77 Rf= 0,75

PM= 32.211 Da PM= 32.584 Da

Posible Proteína= degradación de Posible Proteína= degradación de

proteínas proteínas
Banda 6:

Banda delgada, difusa y mal teñida.

Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a
una tensión deficiente.

Rf= 0,81

PM= 28.840 Da

Posible Proteína= degradación de

proteínas

Banda 7:

Banda delgada, difusa y mal teñida.

Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a
una tensión deficiente.

Rf= 0,87

PM= 24.434 Da

Posible Proteína= degradación de

proteínas

BILIS

Proteína PM (Da)

Ig M 850.000

Ig A 160.000

Ig G 150.000
Bilis
Mucina 122.078

Aminopeptidasa
N 109.517

Haptoglobina 100.000

Transferrina 80.000

Hemopexina 80.000

Albúmina Sérica 66.200

Glicoproteína
Ácida 44.000

7.000-
APF 12.000
 La bilis es una sustancia
líquida alcalina,
amarillenta, de sabor
amargo producida por los
hepatocitos del hígado que
interviene en los procesos
de digestión. Su función es
emulsionar los ácidos
grasos (convertirlos en
gotitas muy pequeñas que
pueden ser atacadas con
más facilidad por los jugos
digestivos). Se almacena
en la vesícula biliar, y se
libera al duodeno tras la
ingesta de alimentos.
Cuando comemos, la

bilis sale de la vesícula por las vías biliares al intestino y se

mezcla con las grasas de los alimentos y estas son disueltas
en el contenido acuoso del intestino. Después de este
proceso, las enzimas del páncreas y de la mucosa intestinal
las digieren.

Banda 1:

Banda delgada, difusa y mal teñida.

Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a
una tensión deficiente.

Rf= 0,36

PM= 100.000 Da

Posible Proteína= Aminopeptidasa N

Banda 2: Banda 1:

Banda delgada, no muy nítida y bien Banda delgada, no muy nítida y no

teñida. muy bien teñida.

Rf= 0,44 Rf= 0,45

PM= 80.069 Da PM= 76.384 Da

Posible Proteína= Aminopeptidasa N, Posible Proteína= Aminopeptidasa N,
Transferrina, Haptoglobina o Transferrina, Haptoglobina o
Hemopexina. Hemopexina.

Banda 3: Banda 2:

Banda gruesa, nítida y bien teñida. Banda gruesa, nítida y bien teñida.

Rf= 0,52 Rf= 0,52

PM= 64.269 Da PM= 62.661 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Posible Proteína= Albúmina Sérica

Banda 4: Banda 3:

Banda gruesa, no muy nítida y bien Banda gruesa, nítida y bien teñida.
teñida.

Rf= 0,64 Rf= 0,65

PM= 46.132 Da PM= 43.251 Da

Posible Proteína= Subunidad de la Posible Proteína= Subunidad de la

Haptoglobina (40 KDa) o Glicoproteína Haptoglobina (40 KDa) o Glicoproteína
Ácida (que es sintetizada por el Ácida ( sintetizada por el Hígado)
Hígado)

Banda 5: Banda 4:

Banda delgada, difusa y mal teñida. Banda delgada, difusa y mal teñida.
Esta banda no es representativa ni Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a aporta mayor información debido a
una tensión deficiente. una tensión deficiente.

Rf=0,72 Rf= 0,73

PM= 36.983 Da PM= 34.435 Da

Posible Proteína= degradación de Posible Proteína= degradación de

proteínas proteínas

Banda 6: Banda 5:

Banda delgada, difusa y mal teñida. Banda delgada, difusa y mal teñida.
Esta banda no es representativa ni Esta banda no es representativa ni
aporta mayor información debido a aporta mayor información debido a
una tensión deficiente. una tensión deficiente.

Rf= 0,87 Rf= 0,88

PM= 24.434 Da PM= 22.491 Da

Posible Proteína= degradación de Posible Proteína= degradación de

proteínas proteínas

Líquido Pleural

LIQ. PLEURAL

Las dos capas de la Proteína (PM (Da)

pleura suelen estar
Inmunoglobulina M 850.000
separadas por una
pequeña cantidad de B-Lipoproteína 380.000
líquido (1 a 15 ml)
Fibrinógeno 340.000
que facilita el
movimiento de una Inmunoglobulina A 160.000
contra la otra. Este
Inmunoglobulina G 150.000
líquido es producido
por la pleura parietal Lactato Deshidrogenasa (LDH) 135.000
y absorbido por la
PCR 118.000
visceral según un
proceso continuo. Se B-Globulina 90.000
forma por filtración del plasma a
Transferrina 80.000
través del endotelio capilar, a una
velocidad controlada por la presión Albúmina 66.200
capilar. La reabsorción se efectúa a α-1-Antitripsina 52.000
través de los capilares y de los
linfáticos en la pleura visceral. Las Amilasa 45.000
proteínas no se reabsorben a través
Glicoproteína ácida 44.000
de los capilares vasculares, sino a
través de los linfáticos. Trifosfato isomerasa 32.500

Apo-D 32.375

Anhidrasa carbónica 31.000

Apo-Al 28.300
Banda 1: Banda 1:
Lisosima 16.538
Banda gruesa, nítida y bien teñida Banda gruesa, nítida y bien teñida

Rf= 0,52 Rf= 0,51

PM= 64.269 Da PM= 64.417 Da

Posible Proteína= Albúmina Sérica Posible Proteína= Albúmina Sérica

Banda 2: Banda 2:
Banda gruesa, nítida y bien teñida Banda gruesa, nítida y bien teñida

Rf= 0,65 Rf= 0,65

PM= 44.875 Da PM= 43.251 Da

Posible Proteína= Amilasa o Posible Proteína= Amilasa o

Glicoproteína Ácida Glicoproteína Ácida

Muestra Problema

MUESTRA PROBLEMA

Nº Banda Rf Log PM PM (Da)

1 0,29 2,084 121.339

2 0,33 2,036 108.643

3 0,51 1,82 66.069

4 0,58 1,736 54.450

5 0,6 1,712 51.523

6 0,67 1,628 42.462

La Muestra Problema por definición corresponde a una sola

proteína con un peso molecular específico.

Nuestra labor es encontrar el valor de dicho peso molecular para deducir

cuál podría ser nuestra Muestra problema.

Al analizar el carril de podemos ver varias bandas, pero sólo una de ellas es
la que nos sirve, en este caso la primera pues es la más voluminosa, nítida y
mayormente teñida.
Su peso molecular corresponde a 121.339 Da por lo que podemos inferir
que se trata de:

 Mucina de 122.078 Da
 β-Globulina PCR de 118.000 Da
 α-Galactosidasa de 116.250 Da

De todas estas la más probable es la α-Galactosidasa ya que se encontraba

en los estándares y por lo tanto es conocida por nosotros.

Las otras 2 son menos probables porque al ser proteínas encontradas por
cada grupo son en cierto sentido “subjetivas”, aunque claro, no son menos
válidas.

También cabe la posibilidad que no sea ninguna de las proteínas

mencionadas pues existen un sin número de proteínas con pesos
moleculares de 120 KDa aproximadamente el cual es el único dato que
tenemos para la identificación de nuestra muestra problema.

Las otras bandas probablemente sean proteínas contaminantes o

subunidades de nuestra muestra problema.

Discusión

Eficacia de la electroforesis

A pesar de que la electroforesis nos permite separar proteínas, no es la

mejor técnica para este fin.

Para esto, la Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) es la técnica más

usada para realizar la separación de proteínas. Esta técnica logra una
separación de alta resolución; asimismo es una técnica muy específica y
muy sensible. En ella, los materiales de las columnas están mucho más
finamente divididos que en las otras técnicas cromatográficas y, como
consecuencia, hay más centros de interacción y, por lo tanto, mayor poder
de resolución. Dado que la columna se construye de material más fino, se
debe aplicar presión para obtener las velocidades de flujo adecuadas. El
resultado es una alta resolución y velocidad.

También se pudiera utilizar la Cromatografía de Afinidad, la cual es

específica para cierta proteína y nos permite obtener una separación de
gran pureza. Para esto es necesario saber con anterioridad la composición
de la mezcla proteica.

Ahora, ¿cómo podemos afirmar que una técnica está purificando de forma
adecuada nuestra mezcla proteica? Para esto podemos utilizar la
electroforesis, ya que nos permite visualizar las proteínas que se ubican
dentro de una mezcla según su tamaño, por lo tanto podemos identificar la
pureza de una mezcla proteica y sus pesos moleculares, pudiendo visualizar
si la técnica utilizada, como la HPLC, está trabajando de forma correcta.

También la electroforesis nos permite determinar la composición de una

mezcla proteica de la cual no sabemos por cuales proteínas está
compuesta. Para esto se realiza lo mismo que se hizo durante este
laboratorio.

Aplicación clínica de la electroforesis

La electroforesis (EF) es una buena técnica para determinar las proteínas

que conforman una mezcla proteica según sus pesos moleculares, por lo
que se puede determinar la presencia o ausencia de alguna proteína de una
muestra de algún fluido. De esta manera podemos ver la presencia de
signos de inflamación, proteínas y enzimas que se presentan en los fluidos
en ciertas patologías, etc.

Ejemplo:

LCR

El líquido cefalorraquídeo tiene una concentración muy baja para efectuar

electroforesis y se debe concentrar 50 a 150 veces para poderla verificar. La
cantidad total de proteínas depende del sitio de donde se toma la punción.
De 5 a 15 mg/dL si es ventricular.

De 15 a 25 mg/dL si es cisternal y de 15 a 45 mg/dL si es lumbar.

La EF es de gran utilidad en la esclerosis múltiple, en la meningitis por

criptococcus, en el síndrome de Guillain Barre y en el lupus eritematoso
sistémico.

De forma normal se encuentra una pre-albúmina en concentración del 2.3 a

6.9 % de la totalidad. De 5.2 a 8.7 % de albúmina. De Alfa1, 3.7 a 8.1 %.
Alfa2 de 4.2 a 8.8 %.Beta de 7.3 a 14.5 % y Gamma de 3.0 a 9.0 %.En la
esclerosis múltiple el 90 % presenta bandas oligoclonales de IgG y pueden
establecer un pronóstico, pues la esclerosis se disemina más a menudo en
los pacientes que tienen bandas muy definidas.

Proteínas plasmáticas

Con el nombre de proteínas, se engloban casi el 100% de las sustancias

sólidas que
tiene el suero sanguíneo. Están integradas por la albúmina, molécula
proteica pequeña importante para mantener la presión oncótica y
transportar fármacos, hormonas, lípidos, etc. Y por las globulinas moléculas
más grandes que se reconocen como alfa, beta y gamma. La electroforesis
permite separarlas, dirigiéndose las partículas cargadas negativamente al
ánodo o polo positivo y las positivas al negativo o cátodo.

Para esto, la EF tiene una amplia aplicación clínica en multitud de

afecciones.

Normalmente se encuentran gráficamente representadas por la Albúmina,

globulinas Alfa1 (HDL-alfa feto-proteina-alfa 1 antitripsina) Alfa 2 globulina
(Haptoglobinas-Ceruloplasmina-Alfa 2 lipoproteinas VLDL-Alfa2
macroglobulinas-) Beta globulinas (Transferrina-Lipoproteina B-LDL-
Complemento-Hemopexina- Fibrinogeno) Gama globulinas (IgG-IgA-IgM-IgD-
IgE). Se obtienen patrones bien definidos en desnutrición -síndrome
nefrótico - con niveles disminuidos de albúmina. Con niveles aumentados de
alfa1 globulinas en enfermedad maligna crónica y neoplasias. Niveles
disminuidos en enfisema pulmonar. Niveles aumentados de alfa2 globulinas
en inflamación aguda y síndrome nefrótico. Niveles disminuidos en
hemólisis. Niveles aumentados de beta1 globulinas, en trastorno
lipoproteico y niveles disminuidos en desnutrición e hipoproteinemia.
Además, gráficamente, se pueden apreciar patrones típicos de hepatitis
severa - cirrosis - inflamación crónica - inflamación aguda -
agamaglobulinemia - alfa 1 antitripsina - gamapatia polinoclonal -
monoclonal - mieloma.

Gammaglobulinas

En la electroforesis de proteínas, se identifican 4 tipos de globulinas y una

de ellas es la gammaglobulina integrada por anticuerpos que se llaman
inmunoglobulinas. Se reconocen las inmunoglobulinas IgG- IgA- IgM- IgD-
IgE cada una de ellas con papeles específicos. Colocando el suero en una
placa que contenga gel de agar y haciendo pasar una corriente a través del
medio, las inmunoglobulinas se separan de acuerdo a su carga eléctrica. Se
colocan anticuerpos específicos a lo largo de la placa y se identifican los
diferentes tipos de inmunoglobulinas presentes, procedimiento que se
denomina inmuno electroforesis. Esta es de utilidad extraordinaria en
múltiples enfermedades e indicadoras del pronóstico de la
lesión, en muchas ocasiones.
En sus valores normales La inmunoglobulina IgG comprende el 75 % de la
totalidad de ellas. La IgA constituye el 15 % y las restantes en proporción
menor, según la capacidad antigénica del paciente. La IgG integra la mayor
parte de los anticuerpos circulantes. La IgA se encuentra principalmente en
las secreciones del tracto gastrointestinal, saliva y lágrimas. La IgM es la
encargada fundamentalmente de los grupos sanguíneos ABO y del factor
reumatoide. La IgE interviene en la respuesta alérgica. La IgD es la fracción
más pequeña y rara vez se evalúa o se detecta.

La inmuno electroforesis se utiliza para detectar enfermedades de

hipersensibilidad, deficiencias inmunes, enfermedades autoinmunes,
infecciones crónicas, mieloma múltiple, infecciones virales crónicas e
infecciones fetales intrauterinas.

CONCLUSIÓN

Aspectos generales

En este práctico realizamos electroforesis en gel de poliacrilamida,

aplicando el sistema de SDS - PAGE, con distintos líquidos orgánicos.

La técnica electroforética en sí es bastante simple de realizar y altamente

sensible para el análisis de proteínas, sin embargo, hay que tener presente
ciertas condiciones para el desarrollo de este método, como por ejemplo, el
pH del medio y su correspondiente tampón, el tiempo de electroforesis, el
voltaje del campo electrico, la manipulación y elaboración de geles, el
sembrado de las muestras, etc. Además, es necesario tener algunas
precauciones con respecto a uso de la algunos reactivos, ya que utilizamos
algunas sustancias neurotóxicas y se requería emplear sustancias frescas
para la preparación de geles.

Es necesario destacar que el proceso de polimerización de los geles de

poliacrilamida se puede manipular experimentalmente, de manera que
obtenemos un entrecruzamiento variable entre las fibras del polímero,
obteniéndose así geles con distinto tamaño de poro. Esto me permite
escoger el tipo de entramado tridimensional según el peso molecular de las
proteínas que deseo separar para esta técnica.

Para la preparación de los distintos fluidos orgánicos, utilizamos el sistema

SDS – PAGE (electroforesis en poliacrilamida en presencia del detergente
SDS). Esta técnica es una variante de la electroforesis y es un método
sumamente ventajoso para la separación de las proteínas en un campo
eléctrico, ya que el desplazamiento de éstas es independiente de su carga
neta y su conformación tridimensional, separándose exclusivamente en
función de su masa. Esto es debido a que el detergente SDS, junto con otros
agentes reductores, desnaturaliza las proteínas e incorpora carga neta
negativa. De esta manera todas las proteínas presentes en la preparación
serán atraídas por igual hacia el polo positivo, pero su desplazamiento será
obstaculizado por el efecto del tamiz molecular del gel de poliacrilamida
(tamaño de los poros).

Para la detección de los distintos fluidos corporales utilizamos dos tinciones,

azul de Coomassie y nitrato de plata. Durante el desarrollo experimental
observamos que la tinción del gel con azul de Coomassie presenta algunas
diferencias con respecto a la tinción con sales de plata, que es necesario
mencionar. La tinción con azul de Coomassie no requiere de tanto
procesamiento en comparación con la tinción argéntica, es decir, no
necesita de tantos lavados del gel y su visualización es relativamente
rápida. La tinción con este colorante no es específica hacia las proteínas,
por lo tanto se une también al gel de poliacrilamida; sin embargo, la unión
con las proteínas es mucho más fuerte observándose discretas bandas
azules y un leve background en el gel. Una de las ventajas al utilizar esta
tinción es que puede decolorarse y volver a teñir el gel con otro colorante si
uno lo desea, es decir, su unión con las proteínas es reversible (no
covalente).

La tinción argéntica, aunque es mucho más dificultosa para realizar, es

significativamente más sensible, ya que pueden distinguirse bandas
claramente en el gel teñido con solución argéntica en comparación con el
gel teñido con azul de Coomassie donde se hace un poco más dificultoso y
en ocasiones casi no pueden distinguirse aquellas bandas más fina0073.
Esto es a causa de que el nitrato de plata permite la detección de proteínas
en un gel a concentraciones aproximadamente 100 veces más baja que
aquellas teñidas con azul de Coomassie. La identificación de proteínas con
este colorante está basado en la reducción diferencial de iones de plata a
plata metálica, en donde la plata metálica se adsorbe sobre las cadenas de
aminoácidos de las proteínas. Esta unión es irreversible, por lo tanto el gel
no puede decolorarse, lo que constituye una desventaja al momento de
querer realizar otro procedimiento. Es necesario destacar que, a diferencia
del azul de Coomassie, se observó un background mucho mayor con la
tinción argéntica, dificultándose relativamente la detección de las bandas
proteicas.

Muestras de fluidos orgánicos

Suero. Las proteínas plasmáticas presentan diferentes roles fisiológicos,

como por ejemplo cumplen un papel nutritivo, son agentes de trasporte de
metabolitos, hormonas, lípidos; son catalizadores, anticuerpos, proteínas de
la coagulación, etc., y además mantienen la presión oncótica de la sangre y
el balance ácido – básico de la sangre.

En la electroforesis pudimos detectar diversas proteínas que se encuentran

normalmente en la sangre (transferrina, albúmina), aunque es necesario
destacar que la albúmina es la proteína más abundante del plasma (39-51
g/l) y esto se observa claramente en la banda que corresponde a la
albúmina. Tanto con la tinción con azul de Comassie como con la tinción
argéntica, se distingue una banda gruesa y marcada. El déficit de albúmina
da resultado de un grave desequilibrio en la presión oncótica vascular y se
observa en enfermedades como la ascitis, nefropatía o enteropatía.

La transferrina es la beta globulina principal y transporta iones férricos y es

captada por receptores de eritrocitos y otras células. En el suero normal, la
transferrina se halla en concentraciones de 200 – 400 mg/dl. Su disminución
es a causa de déficit de fierro y su saturación crónica indica
hemocromatosis y hemosiderosis.

La alfa-1-glucoproteína ácida se encuentra en el suero aproximadamente

entre 40 y 105 mg/dl, y suele estar aumentada en procesos inflamatorios y
neoplasias.

Aparentemente ambas muestras de suero serían normales, sin embargo es

necesario conocer más datos clínicos del paciente, ya que existen proteínas
que varían según edad, sexo o gestación, para lograr realizar un diagnóstico
definitivo.

Líquido cefalorraquídeo. Es un fluido que se forma en los plexos coroideos

ventriculares y su volumen aproximado es de 90 a 150 ml. La mayoría de
las proteínas séricas pueden encontrarse en el LCR, aunque las
concentraciones de prealbúmina y transferrina en el LCR son relativamente
elevadas, comparadas con las del plasma. El aumento en la concentración
de proteínas es indicador de meningitis supurada, hemorragia cerebral y
procesos que cursan con obstrucción aracnoidea. La proteinorraquia se
observa en casos de tumores, encefalitis, neumonia, meningitis, etc.

En el caso de la albúmina su aumento puede ser indicador de tumores

medulares y en general en todos los síndromes de comprensión medular.

En los geles de electroforésis se encontró, además de la albúmina, una

banda bien marcada cercana a los 48 Kda y podría corresponder a las
siguientes proteínas:

- La globulina Gc cumple la función de fijar la vitamina D, que migra

como alfa-1-globulina.
- Alfa-1-globulina, que corresponde a una proteína que se encuentra
normalmente en es suero y se carateriza en amentar su
concenrtración en procesos de inflamación aguda. Sin embargo su
funcionalidad exacta se desconoce.
- GOT o AST es una transaminasa cuya concentración suele estar
alterada en la ictericia, infartos al miocardio, en metástasis al
miocardio, embolias, trombosis y en diversas afecciones musculares
Aunque el aumento en la concentración de proteínas tiene valor diagnóstico
para detectar procesos infecciosos, hemorrágicos, endocrinos, metabólicos,
tóxicos, etc., es necesario realizar un método cuantitativo para la medición
de sus componentes, además de una observación macro y microscópica de
esta muestra junto con las características del paciente (edad, sexo, etc). Por
lo tanto, la electroforesis no sería el método principal para detectar
patologías en este líquido.

Es necesario enfatizar, que todas las proteínas de la sangre atraviesan las

paredes de los capilares cerebrales por difusión pasiva (difusión molecular)
hacia el líquido cefalorraquídeo. De acuerdo con las leyes de la difusión, las
moléculas más grandes, difunden más lentamente en el intercambio y
subsecuentemente forman un gradiente de concentración sangre al LCR
más amplio que las moléculas más pequeñas.

Líquido ascítico. Normalmente la cavidad peritoneal contiene 75-100 ml de

líquido claro de color pajizo, que facilita la función lubricante normal de la
membrana. La ascítis es la acumulación del líquido libre por ultrafiltración
del plasma, en el interior de la cavidad peritoneal, y aparece formando
parte de algunas enfermedades, como la cirrosis, la insuficiencia cardiaca
congestiva, la nefrosis o una carcinomatosis diseminada. Los valores
normales de proteínas son de 1-2 g/dl, pero en algunas enfermedades esta
concentración de proteínas puede verse alterada, pudiendo adquirir
caracteres de trasudado (<2,5 g/dl, es considerado trasudado y se presenta
en algunas enfermedades como la cirrosis), o exudado, como la peritonitis.

Observando nuestra muestra de líquido ascítico, existen algunas bandas

proteicas que podrían orientarnos a un diagnóstico, y son las siguientes:

- La fibronectina aumenta en la ascítis maligna, y se puede observar

que la banda en los geles es bastante gruesa con la tinción de nitrato
de plata (aunque es necesario comparar la muestra con un control)
- El interferón gamma se detecta en procesos de inflamación crónica
- colinesterasa desciende en los trastornos hepáticos y se incrementa
en la tuberculosos o en los casos de neoplasias o tuberculosis
- El incremento de amilasa sugiere de alteraciones extrapancreáticos,
como por ejemplo neoplasias ginecológicas, quiste ovárico,
carcinoma pulmomar,etc
- La Haptoglobina normalmente se combina con la hemoglobina por la
lisis de los eritrocitos, para mantener el hierro corporal y los
depósitos proteicos. Sin embargo, su concentración puede se
aumentada en estrés, infección, inflamación aguda, y disminuida en
procesos hemolíticos.
- La adenosina desaminasa (ADA) cuando se encuentra elevada es muy
útil para el diagnóstico de peritonitis tuberculosa.
- Alfa-1-glucoproteína ácida es una proteína reactante de la fase
aguda, aunque se encuentra normalmente en el suero (40 – 105
 mg/dl), en elevadas concentraciones es signo de una respuesta al
estrés o estados inflamatorios.
- Anhidrasa carbónica. En la naturaleza se encuentran varias formas de
anhidrasa carbónica. En la más estudiada, anhidrasa carbónica-tipo α,
presente en animales. La función primaria de la enzima en animales es
interconvertir el dióxido de carbono y el bicarbonato para mantener el
equilibrio ácido-base en la sangre.
- Fosfatasa alcalina se encuentra diseminada normalmente en el suero,
procedente fundamentalmente de los huesos y el hígado, aunque también
está presente en otros tejidos. Esta proteína puede aumentar su
concentración en el embarazo, en los niños en crecimiento, en cánceres
(metástasis osteoblásticas y hepáticas), ictericia obstructiva, cirrosis biliar,
hematomas, diabetes con degeneración hepática, pudiendo encontrarse
algunos niveles aumentados en el líquido ascítico.
- Amilasa, enzima cuyo valor diagnóstico está relacionado con
enfermedades hepáticas (pancreatitis, tumores y traumatismos) y
extrahepáticos (neoplasias ginecológicas, quiste ovárico, carcinoma
pulmonar)

Es importante destacar que muchas de estas proteínas se encuentran

normalmente en el líquido ascítico, pero las alteraciones de sus
concentraciones pueden orientarnos al diagnóstico. Podemos inferir, que
esta muestra puede ser patológica afectada por un proceso inflamatorio o
infeccioso. Sin embargo, faltan muchos más datos para poder orientar a un
diagnóstico definitivo y además necesitamos comparar este fluido con un
control negativo y positivo. Debemos, en conclusión, medir las
concentraciones proteicas de estos fluidos, para distinguir si hubo un
aumento o disminución de estas sustancias en el líquido ascítico.

Bilis. La bilis corresponde a un líquido digestivo espeso, secretado por

el hígado y almacenado en la vesícula biliar. Este líquido realiza dos
funciones importantes: Desempeña un papel importante en la
digestión y absorción de grasas gracias a los ácidos grasos. Estos
ayudan a emulsionar las grandes partículas de grasa de los alimentos,
a las que convierten en partículas que son atacadas por las lipasas.
Los ácidos grasos también favorecen la absorción de los productos
finales de la digestión de grasas a través de la mucosa intestinal.
Además, la bilis sirve como medio para la excreción de varios
productos de desecho importantes procedentes de la sangre, entre
los que se encuentran la bilirrubina y el exceso de colesterol. Los
componentes principales de la bilis corresponden a sales biliares,
bilirrubina, colesterol, lecitina y los electrolitos habituales del plasma.

En el gel de electroforesis pueden observarse las siguientes bandas

que corresponderían posiblemente a las siguientes proteínas:

- la haptoglobina , cuya función es combinarse con la

hemoglobina liberada por la lisis de los eritrocitos. La
 haptoglobina aumente en respuesta al estrés, a la infeccion,
inflamación aguda o la necrosis mística. Disminuye en
enfermedad hepática, anemia hemolítica y anemia
megaloblástica.
- La hemopexina es una proteína que se encarga del transporte
de grupos hemo. Es muy similar a la haptoglobina en cuanto a
su diagnóstico en procesos patológicos, pero la haptoglobina
puede diagnosticar la hemólisis en un estado precoz.
- Albúmina, que corresponde al principal componente de la bilis
normalmente. Sin embargo puede disminuir en enfermedades
hepáticas como la cirrosis.
- La glicoproteína ácida es una proteína cuya síntesis primitiva es
en el hígado y cumple muchísimas funciones, entre ellas
corresponde a una reactante de la fase aguda (mencionada
anteriormente), pero también cumple funciones de transporte y
metabolismo de la progesterona; además fija algunos
fármacos. También puede ser que esta banda corresponda a
proteínas degradadas, ya que algunos agentes utilizados para
el procesamiento de las muestras son agentes
desnaturalizantes.
- Aminopeptidasa N. se secreta en la bilis y se incrementa en la
obstrucción biliar en la obstrucción biliar, en patologías
hepáticas y pancreáticas, incluyendo tumores de estas
localizaciones.

Líquido pleural. Se clasifica el líquido pleural según sea un ultrafiltrado

plasmático en una pleura sana (trasudado) o un componente con similares
características al plasma en una pleura enferma, con permeabilidad o
drenaje linfático alterados (exudado). Podemos observar que en ambos
geles se observa muy pocas bandas, lo que podría inferirse que la muestra
está pura y correspondería a un trasudado.

Muestra problema (MP ). De acuerdo a nuestras observaciones, esta

muestra correspondería a una solución purificada de la solución estándar,
ya que se observan muy pocas bandas, y las más destacable es aquella que
coincide con la beta- galactosidasa. La beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es
una enzima que hidroliza la lactosa en sus monómeros glucosa y galactosa,
al escindir el enlace b 1-4 del azucar. Se conoce que la leche, por su alto
contenido en lactosa, no puede ser asimilada por cierto grupo de personas,
pues les ocasiona trastornos digestivos a causa de que no sintetizan beta-
galactosidasa (Bayless et al., 1971).

Pueden hacerserse algunas observaciones con respencto a las bandas

(además de aquellas mencionadas en resultados):
 - La primera banda podría corresponder a la proteína C reactiva del
suero (118.000-144.000 da) y es reconocida dada a que su
concentración aumenta en fase aguda.
- Se observa una segunda banda que podría corresponder a albúmina
- La ultima banda, de menor peso molecular, podría corresponder a
alfa -1 – antitripsina, la cual también es una reactante de la fase
aguda.

Resúmen

1. La técnica SDS- PAGE es un método de análisis de proteínas que nos

permite comprobar la pureza de una solución proteica y determinar el tipo
de proteína. Como todo instrumento científico, posee ciertas limitantes
(manipulación y elaboración de los geles, sembrado correcto, con la
aplicación del voltaje, tinción etc.), por lo tanto requiere también de
experiencia es su manejo para disminuir los los falsos positivos y negativos.

2. Es posible obtener información de interés clínico a través de esta

técnica, mediante la observación de bandas en las distintas sustancias y su
posterior comparación con un estándar, todo esto con el objetivo de calcular
su peso molecular mediante la fórmula Rf.

3. Las diferentes tinciones presentan ventajas y desventajas, a partir de

las cuales evaluar el uso de una u otra tinción de acuerdo a las necesidades
experimentales. Es decir, por ejemplo, una tinción argéntica me permite
detectar aquellas muestras proteicas poco concentradas o purificadas.

4. La muestra problema estándar es similar al estándar real, aunque

purificada.

5. La electroforesis entrega la presencia o no de proteínas en diferentes

soluciones proteicas, pero es necesario complementar con técnicas
cuantitativas para poder orientar el diagnóstico de una patología. Esto es,
porque existen proteínas que se encuentran normalmente en los fluidos,
pero su alteración en su concentración orientan a un diagnóstico más
certero.

6. Se pueden sacar inferencias sobre los tipos de proteínas en los fluidos

estudiados, o también deducir que la muestra estaba contaminada,
proteínas degradadas o patológica. En el último caso, si bien es posible
intentar hacer un diagnóstico, hay que recordar que el diagnóstico parte por
el examen del paciente, por lo que un diagnóstico certero. Generalmente
esta clase de estudio se pide cuando hay una sospecha de patología.

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