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10/3/2008

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TP N 5
Pruebas Bioqumicas
T.P. N 5
q
10/3/2008
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l i d t i d d t bl difi
Especie bacteriana:
coleccin de cepas que comparten propiedades estables y difieren
significativamente de otros grupos de cepas.
Especie bacteriana:
Asociacin DNA-DNA (>70%)
Porcentaje de similitud rRNA 16S (>97%)
IDENTIFICACION DE UN MICROORGANISMO
Ensayos que ponen de manifiesto caractersticas metablicas
de los microorganismos.
Pruebas bioqumicas:
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Catalasa
Oxidasa
Hidrlisis de almidn
Motilidad Motilidad
Sensibilidad a antibiticos
IMViC
Agar Hierro-Dos azcares de Kligler
API 20E
Pruebas bioqumicas para la
identificacin de
enterobacterias API 20E enterobacterias
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Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)
Vibrio
Aeromonas Aeromonas
Pseudomonas
Escherichia coli
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Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)
Se utiliza un donor de
electronesartificial (tetrametil electrones artificial (tetrametil-
p-fenilenediamina).
Reaccin +
Reaccin
Vibrio
Aeromonas
Enterobacterias
Reaccin +
Reaccin -
Pseudomonas
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Prueba de la Catalasa
i i
Compuestoproducidoenpequeascantidades
Perxido de hidrgeno
Compuesto producido en pequeas cantidades
durante la respiracin aerbica. Su produccin
est mediada por flavoprotenas.
Radical hidroxilo
Radical libre altamente reactivo. Agente
oxidante capaz de atacar cualquier molcula
orgnica presente en la clula.
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Prueba de la Catalasa
Enzimas que actan sobre Catalasa Enzimas que actan sobre
los derivados txicos del
oxgeno:
Catalasa
Peroxidasa
Enzimas que destruyen el perxido de
hidrgeno.
Superxido dismutasa
Enzima que destruye el anin
superxido ( ). p ( )
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Prueba de la Catalasa
+
-
Bacillus
Reaccin +
Staphylococcus
Enterobacterias
Ensayo:
Se toman bacterias de un cultivo
slidoyseesparcenconansasobre
Aerobios estrictos o
facultativos
Clostridium
S
Reaccin -
slido y se esparcen con ansa sobre
una gota de perxido de hidrgeno
30%.
Streptococcus
Lactobacillus
Anaerobios estrictos o
microaerfilos
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Hidrlisis de almidn
-amilasa:
Enzima que hidroliza los enlaces (1-4)
amilasa:
q ( )
de polmeros de glucosa.
+
-
Agregado de
B ill
Reaccin +
(Halo transparente)
Agregado de
Lugol
Bacillus
Agar - almidn
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Motilidad
Se detecta la presencia de flagelo bacteriano.
Se cultivan las bacterias por puncin en
placas de agar blando.
Seobservamigracincomounhalodesde Se observa migracin como un halo desde
el punto de siembra.
Staphylococcus Pseudomonas
Bacterias mviles Bacterias no mviles
Bacillus
Enterobacter
Vibrio
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Sensibilidad a antibiticos
Mecanismos de accin
Inhibicin de la sntesis de la pared (Penicilina, Ampicilina, Carbenicilina,
Cefalosporinas, Vancomicina, etc.)
Inhibicin de la sntesis de protenas (Streptomicina, Gentamicina,
Cloranfenicol, Tetraciclina, etc.)
Inhibicin de la snteis de cidos nuclicos (Ciprofloxacina, Rifampicina, etc.)
Disrupcin de la membrana (Polimixina B)
Antagonistas metablicos (Sulfonamida, Trimetoprima)
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Sensibilidad a antibiticos
Anlisis de
MIC (concentracin inhibitoria mnima)
Anlisis de
sensibilidad a
antibiticos
MLC (concentracin letal mnima)
Anlisis de difusin en agar
(sistema de discos)
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Sensibilidad a antibiticos
Se crecen cultivos en medio lquido.
Metodologa de trabajo:
Se mezcla el cultivo con agar blando (0,7%) y se vuelca sobre una placa de agar nutritivo.
Se depositan discos con diferentes antibiticos.
Se mide el diametro del halo de inhibicin.
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Pruebas bioquimicas para la Pruebas bioquimicas para la
identificacin de Enterobacterias
Cocobacilos Gram negativos
Aerobios facultativos (Catalasa positivos)
Fermentadores de Glucosa
Oxidasa negativos Oxidasa negativos
1) IMViC
a) Prueba del Indol )
b) Rojo Metilo
c) Voges Proskauer
d) Prueba del citrato
2) Agar Hierro Dos Azcares de Kligler
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IMViC
1)
a) Prueba del Indol
Indol: Subproducto de la degradacin del aminocido Triptofano
por laenzimatriptofanasa.
)
por la enzima triptofanasa.
Cultivar la bacteria en caldo de peptonas
Reaccin +
Formacindeunafase
Reaccin
Formacindeunafase
(alto contenido de Triptofano ) por 48 h.
Agregar al cultivo cinco gotas de reactivo
de Kovacs (dimetilaminobenzaldehdo).
Formacin de una fase
orgnica roja
Formacin de una fase
orgnica amarilla
El reactivo de Kovacs reacciona con el
indol dando un producto de color rojo.
E. coli
Salmonella
Proteus
Enterobacter
Klebsiella
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Fermentacion:
Tipos de Fermentacin Tipos de Fermentacin
1) Lctica
2) Alcohlica
3) Propinica
4) Butilengliclica
5) cido Mixta
6) Aceto-Butrica
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F t i B til li li Fermentacin Butilengliclica
Enterobacter
Serratia Serratia
Erwinia
Bacillus
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Fermentacin cido
Mixta
Escherichia, Salmonella,
Proteus, etc.
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IMViC
1)
b) Rojo de Metilo
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de realizar
f i id i
)
fermentacin cido-mixta.
Rojo de Metilo: Indicador de pH que vira al rojo por debajo de 4,3
SeinoculamedioRM-VP
Reaccin + Reaccin
Se inocula medio RM VP
Incubacin 48h a 37C
Se agregan 3 gotas de Rojo de
Reaccin +
(Rojo)
Reaccin
(Amarillo)
Metilo 0,1%.
E. coli
Enterobacter
E. coli
Klebsiella
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IMViC
1)
c) Voges Proskauer
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de producir
il il bi l ( ) i d l f i b il li li d l
)
acetilmetilcarbinol (acetona) a partir de la frementacin butilengliclica de la
glucosa.
Se inocula medio RM-VP
Reaccin + Reaccin
Incubacin 48h a 37C
Se agregan 0,6 ml de reactivo de Barrit
( f l i l j l i l
Reaccin + Reaccin
(-naftol, vira al rojo al reaccionar con la
acetona) y 0,2 ml de KOH 40%.
E. coli Enterobacter
Klebsiella
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IMViC
1)
d) Prueba del Citrato
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de utilizar
citratocomonicafuentedecarbono
)
citrato como nica fuente de carbono.
Estriar agar citrato de Simmons (contiene Azul de
b ti l i di d d H) bromotimol como indicador de pH).
Incubacin 48h a 37C
Reaccin + Reaccin
Sin cambio (medio de
color verde).
Crecimiento y viraje al
azul (la eliminacin del
citrato alcaliniza el
medio).
E. coli
Shigella
Salmonella
Enterobacter
g
Klebsiella
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IMViC
1)
I M V C
)
I M V C
+ +
_
+
Escherichia coli
_
Proteus mirabilis
+
_ _
+
_
_
+ +
Salmonella
Enterobacter
_
Kl b i ll
+
_
Klebsiella
_ _
+ +
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2) Agar Hierro-Dos azcares de Kligler ) g g
Medio de cultivo para la diferenciacin de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir cido sulfhdrico.
d
A partir del consumodepeptonasseliberaNH3produciendo
Peptona de carne
Lactosa y Glucosa
(10:1)
A partir del consumo de peptonas se libera NH3 produciendo
una alcalinizacin del medio.
La fermentacin de estos sustratos produce compuestos
cidos.
Tiosulfato de sodio.
Citrato de hierro y amonio.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de
hidrgeno, el cual reacciona con la sal de hierro
produciendo sulfuro de hierro (precipitado negro) .
Rojo fenol
Vira al amarillo en medio cido.
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2) Agar Hierro-Dos azcares de Kligler ) g g
Medio de cultivo para la diferenciacin de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir cido sulfhdrico.
Se inocula el medio por
puncin y estra en
superficie superficie.
Incubacin 24h a 37C
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2) Agar Hierro-Dos azcares de Kligler ) g g
Medio de cultivo para la diferenciacin de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir cido sulfhdrico.
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API 20E
Sistema para la identificacin rpida de enterobacterias. p p
Dispositivo plstico con tubos que contienen medios deshidratados.
Se inocula cada minitubo con una suspensin del microorganismo a analizar y se
incuba 24 hs a 37C en una atmsfera hmeda.
Al cada resultado se le asigna un cdigo que da como resultado un nmero de 7
cifras que se compara con tablas o bases de datos para la identificacin de la q p p
especie..
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API 20E