LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014

LEMBAR KERJA MAHASISWA

(LKM)
PRAKTIKUM DASAR-DASAR GENETIKA
Laboratorium Genetika dan Pembenihan Ikan
Jurusan Perikanan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada

Tanggal : 20 Mei 2014

Nama : Asterina Wulan Sari
NIM/Prodi : 13030 / THP
Asisten : Bagash Prawira Kurniadi
Aprilia Ratri Kumalasari

A. ACARA
Preparasi Kromosom

B. TUJUAN
1. Untuk mengetahui sedang memasuki fase apa pembelahan sel pada sampel ikan.
2. Untuk mengetahui cara kerja preparasi kromosom

C. TINJAUAN PUSTAKA
Preparasi kromosom adalah metode yang paling tepat untuk menentukan poliploidi
menyediakan untuk menentukan nomor kromosom yang benar-benar dan informasi
kebutuhan penting untuk penelitian sitogenetika (Shao dkk., 2010). Laser capture
microdissection (LCM) adalah proses untuk melindungi mengumpulkan populasi sel
murni untuk DNA berikutnya dan ekstraksi RNA. Meskipun LCM umumnya digunakan
untuk mengisolasi sel-sel tertentu dari bagian jaringan tetap, telah juga efektif untuk
isolasi kromosom individu. Preparation chromosome paint, FISH hibridisasi dan DOP-
PCR dikombinasikan dengan LCM. Salah satu tantangan microdissecting kromosom
adalah sampel diameterof minimal dikumpulkan. Transfer Non kontak LCM pengadaan
cepat spesimen homogen hanya 0,5 mikrometer dengan diameter tanpa gangguan ke
daerah yang berdekatan (CFIM, 2014).
Preparasi kromosom dan banding (pemitaan kromosom) dapat dianggap sebagai
seni serta ilmu. Kromosom yang divisualisasikan secara individual hanya selama mitosis
dan teknik kemudian telah dikembangkan untuk merangsang sejumlah besar sel untuk
memulai divisi melalui penggunaan mitogens seperti phytohaemagglutinin dan pokeweed


LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014

dan mengumpulkan sel pada metafase menggunakan spindel inhibitor seperti colcemid.
Banyak metode yang sekarang tersedia untuk mengidentifikasi kromosom dan
mempersiapkan kariotipe untuk tujuan klinis dan penelitian, meskipun kemampuan untuk
menganalisa kromosom dan seberapa baik mereka tetap, menyebar dan bernoda (Moore
dan Best, 2001).
Tanggal 22 Desember 1955, seorang ilmuwan Cina bernama Tjio, mengadakan
pengamatan "kultur fibroblast paru-paru embrio manusia, tumbuh dalam cairan ketuban
sapi" yang menunjukkan tingginya jumlah sel dalam mitosis di lakukan oleh Provesor
Levan di Laboratorium Genetika di University of Lound ( Denmark ) dilakukan oleh
Profesor Levan. Preparasi kromosom dibuat oleh Tjio sesuai dengan Protokol disarankan
oleh Hsu ( seorang ilmuwan Amerika yang bekerja di University of Galveston, Texas
USA), sedikit dimodifikasi, yaitu setelah penggunaan dengan kolkisin (12 - 20 jam)
untuk menghentikan siklus sel, sel yang terkena larutan hipotonik tetapi
mengurangiwaktu total hanya 1-2 menit. Dia kemudian melanjutkan untuk "fiksasi dalam
60 % asam asetat dengan dua kali penggantian dalam rangka untuk membersihkan garam
yang tersisa dari medium kultur dan dari solusi hipotonik". Akhirnya ia diaplikasikan
dengan teknik "squashing", diikuti dengan perwarnaan (Euroclone, 2014).
Preparasi kromosom memiliki hubungan dengan karyotiping. Menurut Chourrout dan
Happe (1986), kurangnya variasi intra individu dalam jumlah kromosom diperoleh dari
penyebaran yang baik disebabkan oleh perlakuan hipotonik yang lebih baik. Variasi
jumlah kromosom dapat disebabkan kesalahan perhitungan sebagai akibat adanya
penyimpangan dari teknik preparasi kromosom, hilangnya kromosom pada proses
pembuatan preparat atau selnya aneuploid. Untuk memperoleh metaphase yang
memuaskan, yaitu dengan menggunakan hewan yang sehat dan usianya mudah. Pada
ikan teleostei jumlah metaphase lebih banyak diperoleh pada ikan muda dan aktif.
Selain beberapa hal diatas masih banyak faktor yang harus diperhatikan untuk
memperoleh hasil preparasi kromosom yang baik. Adapun faktor-faktor tersebut antara
lain medium kultur, ketepatan dalam pemberian dosis kolkhisin, lama perendaman dalam
larutan hipotonik, pemberian fiksatif, pewarnaan dan sterilisasi semua alat yang
digunakan (Pudjirahaju dkk., 2008)






LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014

D. ALAT DAN BAHAN
Alat :
1. Section set
2. Piring preparat
3. Pipet tetes
4. Silde (object glass)
5. Centrifuge
6. Mikroskop
Bahan :
1. Sampel ikan
2. Akuades
3. NaCl 0,5%
4. Kolkhisin 0,01%
5. KCl 0,36%
6. Carnoy (3 methanol : 1 asam glasial)
7. Giemsa 3%
8. Label
9. Tissue


















LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014

E. CARA KERJA





Catat dan gambar fase yang terjadi
Amati dibawah mikroskop
Cuci dengan aquadest dan kering anginkan
Warnai dengan larutan giemsa 20% keringkan 5 menit
Suspensi diambil ,oleskan di atas gelas obyek
Supernatan dibuang diganti dengan larutan Carnoy (2kali)
Sentrifuge dengan kcepatan 800 rpm 5 menit
Rendam dlm larutan KCL 0,36 % & cacah selama 30 menit
Rendam dalam larutan kolkhisin 0,01 %selama 5 menit
Rendam dalam larutan NaCl 0,5% 0,5 ml selama 15 menit
Ambil jaringan insang 2 lembar


LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014

F. HASIL DAN PEMBAHASAN
Tabel Hasil Pengamatan

Kelompok Sampel I Sampel II
I Metafase Profase
II Profase, Interfase Profase
III Profase, Metafase Profase, Metafase
IV Metafase Interfase, Anafase, Telofase
V Telofase Interfase, Profase
VI Telofase I Profase

Langkah pertama yang dilakukan dalam preparasi kromosom adalah mengambil
jaringan insang dan direndam dalam larutan NaCl 0,5 % 0,5 ml selama 15 menit.
Perendaman dengan larutan NaCl ini berfungsi sebagai desinfektan agar lamella-lamela
bersih dari kotoran. Kemudian direndam dalam larutan kolkhisin 0,01 % 0,5 ml selama 5
menit. Larutan kolkisin ini berfungsi untuk menghentikan proses mitosis agar didapatkan
kondisi metafase kromosom kemudian direndam dalam KCl 0.036 selama 5 menit.
Perendaman dengan KCl atau larutan hipotonik bertujuan menggelembungkan ukuran sel
sehingga kromosom memiliki ruang yang lebih luas untuk diamati. Setelah itu, dilakukan
pencacahan selama 30 menit agar selnya berpencar dan ukurannya lebih kecil.
Langkah selanjutnya adalah jaringan difiksasi dengan larutan Carnoy selama 5 menit,
setelah itu supernatant dibuang dan diganti dengan larutan Carnoy. Setalah supernatant
diganti, dilakukan sentrifuge pada kecepatan 800 rpm selama 5 menit sebanyak 2 kali.
Larutan Carnoy diganti dengan yang baru setiap 5 menit. Sentrifuge bertujuan untuk
memisahkan molekul berdasarkan berat molekulnya. Fiksasi merupakan perlakuan untuk
mematikan sel tanpa merusak bentuk dan kandungannya. Larutan fiksatif yang paling
sering digunakan adalah campuran methanol dengan asam asetat glacial dengan
perbandingan 3:1. Larutan ini harus dalam keadaan segar jika akan digunakan Fiksasi
dilakukan menggunakan Carnoy sedangkan pewarnaan kromosom dengan Giemsa.
Pewarnaan dilakukan agar kromosom mudah diamati di bawah mikroskop. Giemsa
merupakan pewarna yang paling sering digunakan untuk mewarnai kromosom, setelah
diwarnai kemudian dialiri aquadest sampai bersih dan dikering anginkan kemudian
diamati dengan mikroskop perbesaran 100x.
Pada praktikum preparasi kromosom ini menggunakan sampel insang dari ikan nila.
Insang dipilih karena pada jaringan ini memiliki aktivitas pembelahan sel. Insang sebagai
tempat difusi O2 dan CO2, sehingga aktivitas bekerjanya sangat tinggi dan perlu kondisi


LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014

yang optimal. Apabila pada insang ada kerusakan, maka perbaikan akan cepat
berlangsung karena aktivitasnya sangat penting sekali bagi kehidupan ikan dan
perbaikannya itu melalui pembelahan sel.
Hasil pengamatan pada preparasi kromosom kali ini didapat fase interfase, profase,
metaphase, anaphase dan telofase. Berikut ini adalah gambar hasil pengamatan dan
penjelasannya:


1. Interfase
Hasil pengamatan pada interfase dapat
dilihat belum ada kromosom yang terlihat.
Periode interfase ialah periode antara dua
pembelahan disebut juga periode istirahat
karena pada periode ini tidak terjadi
pembelahan kromosom atau sitoplasma. Akan
tetapipada nucleus dan sitoplasma terjadi
peningkatan aktivitas metabolism, akibatnya
volume nucleus dan sitoplasma bertambah
(Winatasasmita, 1986). Selanjutnya interfase dibagi ke dalam fase gap-1 (G1), fase
sintesis (S) dan fase gap-2 (G2). Pada fase G1 sel-sel belum mengaakan replikasi
sehingga DNA masih berjumlah 1 salinan. Pada fase S, DNA dalam inti mengalami
replikasi sehingga pada fase sistesis akhirnya menghasilkan 2 salinan DNA dan
diploid. Pada fase G2 replikasi DNA telah selesai, dan sel bersiap-siap mengadakan
pembelahan (Aryulina dkk.,2007). Menurut Suryo (1998), pada fase Interfase ini
keseluruhan waktu yang dibutuhkan yaitu 18-20 jam.











LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014


2. Profase
Gambar disamping menunjukkan
adanya kromosom yang terlihat jelas, karena
pada fase ini kromosom mulai mengalami
penebalan. Pada fase profase kromosom
belum tampak tetapi pada fase profase
kromosom mulai tampak karena terjadi proses
kondensasi. Kromosom membelah
memanjang membentuk dua kromatid.
Kromosom memendek dan bertambah tebal
(Winatasasmita, 1986). Profase ditandai oleh pembentukan spiral benang kromosom menjadi
kumparan untuk membentuk kromosom yang dapat diidentifikasi secara mikroskopik;
membrane inti dan nucleolus menghilang dan benang mitosis berbentuk kumparan (Behrman
dkk.,2010). Tahap profase membutuhkan waktu 60 menit (Yatim, 1996).


3. Metafase
Gambar disamping menunjukkan
adanya kromosom yang bergerak ke bidang
ekuator benang spindel dan kromosom terikat
pada benng spindel melalui sentromer. Pada
fase metaphase, kromosom berkumpul pada
bidang equatorial. Kromosom yang kecil
biasanya terletak pada bagian sebelah dalam.
Nukelolus hilang (Winatasasmita, 1986). Pada
metafase kromosom memudar dan mampak
jelas sebagai struktur tersendiri. Sentromer kromosom menempel pada pipamikro kumparan
mitosis dan kromosom lurus di tengal sel sepanjang kumparan tersebut (Behrman dkk.,2010).
Pada fase ini dibutuhkan waktu sekitar 2-6 menit( Suryo, 1998).


LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014


4. Anafase
Fase anaphase pada gambar disamping
ditunjukkan dengan adanya kromosom yang
terbagi menjadi dua dan menuju ke kutub
pembelahan. Menurut Winatasasmita (1986),
sentromer membelah dan kedua kromatid
masing-masing memisahkan diri kemudian
bergerak meuju kutub sel yang berlawanan.
Anafase ditandai oleh pembelahan kromosom
sepanjang sumbe longitudinan membentuk
dua
kromatid anakan dan perpindahan setiap kromatik pasangan menuju ujung sel yang
berlawanan (Behrman dkk.,2010).






5. Telofase
Gambar telofase disamping ditunjukkan
dengan mulai terbentuknya membran inti dan
nucleolus kembali muncul. Dapat dilihat pula
bahwa sel akan akan membelah namun masih
bergandengan. Menurut Winatasasmita (1986),
membran nukleus terbentuk mengelilingi
nukleus, gelendong menghilang dan nucleoli terbentuk kembali. Telofase yang megakhiri
mitosis, ditandai oleh pembentukan kembali membrane inti dan nucleolus, dan duplikasi
sentriolus serta pembelahan sitoplasma dan membentuk 2 sel anakan (Behrman dkk.,2010).
Menurut Suryo(1998), fase ini membutuhkan waktu sekitar 30-60 menit.



LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014


G. KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
1. Pada hasil pengamatan preparasi kromosom pada sampel ikan didapatkan fase
profase, metapase, anaphase, telofase dan interfase
2. Jaringan insang direndam dalam larutan NaCl 0,5 selama 15 menit, kemudian
direndam dalam larutan kolkhisin 0,01 % selama 5 menit. Rendam dalam larutan
KCL 0,36 % 0,5 ml sembari dilakukan pencacahan selama 30 menit. Selanjutnya,
jaringan difiksasi dengan larutan Carnoy selama 5 menit dan disentrifuge pada
kecepatan 800 rpm selama 5 menit sebanyak dua kali pencucian. Terakhir,
pewarnaan kromosom dengan Giemsa dan diamati di bawah mikroskop.
Saran
Diharapkan pada praktikum berikutnya, sampel yang digunakan dalam preparasi
kromosom tidak hanya jaringan insang saja, sehingga praktikan dapat mengetahui
jaringan mana yang terbaik untuk preparasi kromosom dalam memudahkan karyotiping
dan mengetahui sedang memasuki fase apa sel tersebut dalam pembelahan.




















LKM Praktikum Dasar-Dasar Genetika 2014

H. DAFTAR PUSTAKA
Aryulina, D., Choirul M., Syalfinat M. dan Endang W. W. 2007. Biologi. Erlangga.
Jakarta
Behrman, kliegman dan Arvin. 2010. Ilmu Kesehatan Anak. Penerbit Buku Kedokteran
EGC. Jakarta
CFIM. 2013. http://www.cfim.ku.dk/equipment/light_microscopy/palm/1298664_ZEISS
_LabProtocol_Chromosomes.pdf chromosome preparation PALM. diunduh pada hari
Selasa tanggal 27 Mei 2014 pukul 14.36 WIB
Chourrout, D. dan Happe A. 1986. Improved Methode of Direct Chromosome
Preparation in Rainbow trout, Salmo gairdneri. Aquaculture 52:255-261
Euroclone. 2014. http://www.euroclonegroup.it/allegati/prodotti/documenti/Milestones-
Bibliography_3323_.pdf levan methods chromosome preparation. Diunduh pada hari
Selasa tanggal 27 Mei 2014 pukul 15.04 WIB
Moore, C.M. dan Best R.G. 2001. Chromosome Preparation of Banding. Encyclopedia of
Life Sciences. www.els.net. Diunduh pada hari Selasa tanggal 27 Mei 2014 pukul
15.57 WIB
Pudjirahaju, A., Rustidja dan Sutiman B.S. 2008. Penelusuran Genotipe Ikan Mas
(Cyprinus carpio L.) Strain Punten Gynogenetik. Ilmu-ilmu Perairan dan Perikanan
Indonesia XV(1): 13-19
Shao, C.W., Wu, P.F., Wang X.L., Tian, Y.S. dan Chen, S.L. 2010. Compison of
Chromosome Preparation Method for the Different Developmental Stages of the Half-
Smooth Tongue Sole Cynoglossus semilaevis. Micron 41:47-50
Suryo. 1998. Genetika Strata 1.Gadjah Mada University Press.Yogyakarta
Winatasasmita, D. 1986. Biologi Sel. Departemen Pendidikan Dan Kebudayaan
Universitas Terbuka. Jakarta
Yatim, Wildan. 1996. Genetika. Tarsito. Bandung