PRCTICA No 8.

ELECTROFORESIS DE ADN EN GEL DE AGAROSA

1. INTRODUCCIN
Hoy en da es posible separar regiones determinadas de ADN, obtenerlas en cantidades
prcticamente ilimitadas y determinar su secuencia de nucletidos a una velocidad desde varios
cientos hasta miles al da. Mediante variaciones sobre estas mismas tcnicas, un gen puede ser
alterado y ser transferido a clulas en cultivo o a la lnea germinal de animales, donde el gen
modificado se incorpora como parte funcional y permanente del genoma. Una de las tcnicas que
ha hecho posible esto es la cromatografa con una de sus ms grandes variantes como lo es la
electroforesis.
La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo elctrico; estas
partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos y +, respectivamente), dependiendo de
una combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional (Fig. 1). Los mtodos
electroforticos son de alta sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como
mtodo de separacin de mezclas complejas de cidos nuclicos, protenas y otras biomolculas
(Alberts et al., 2007; Lodish et al., 2008).

Figura1. Separacin de protenas y observacin de bandas por electroforesis.
La electroforesis se realiza en cmaras que pueden ser verticales y horizontales y requieren de
dos elementos indispensables: la fase mvil y la fase estacionaria. La fase mvil es el medio
amortiguado que permite la movilidad de las molculas cargadas hacia los electrodos
correspondientes cuando se genera un campo elctrico. La fase estacionaria o soporte, es un
polmero de naturaleza gelatinosa con un tamao de poro homogneo que se haya sumergido y
embebido en la fase mvil. El polmero utilizado para el anlisis electrofortico de cidos
nucleicos de gran tamao (100pb-10kb) es la agarosa (Alberts et al., 2007; Lodish et al., 2008).
Para el caso de fragmentos menores de 500 nucletidos de largo, existen geles de poliacrilamida
especialmente diseados que permiten la separacin de molculas que se diferencien en un solo
nucletido de longitud. Los poros de los geles de poliacrilamida son demasiado pequeos para
permitir que molculas largas de ADN puedan atravesarlo. Para separar estas molculas en
funcin de su tamao, se utilizan geles con poros ms grandes, formados por soluciones diluidas
de Agarosa (Alberts et al., 2007; Lodish et al., 2008; Sambrook, Russell, 2001).
La migracin de los fragmentos de cidos nuclicos (ADN o ARN) en un gel de agarosa
sometido a un campo elctrico depende tanto del voltaje del campo, como del tamao de poro del
gel de agarosa. La separacin efectiva de los fragmentos de ADN o ARN (resolucin) depende
tanto del tamao como de la carga de los distintos fragmentos, en realidad de la relacin
carga/tamao. En los geles de Agarosa o Poliacrilamida las bandas de ADN sern invisibles a
menos que se marque o se tia de alguna manera. Transcurrida la electroforesis, la localizacin
relativa de los fragmentos se determina mediante distintos mtodos de deteccin. La tincin con
bromuro de etidio, una sonda fluorescente tras iluminacin con luz UV, es un mtodo
generalizado de deteccin de fragmentos de ADN, ya que la sonda se intercala entre su doble
hlice y emite luz. Un mtodo de deteccin ms sensible que ste, consiste en la incorporacin de
un radioistopo a la molcula de ADN antes de la electroforesis, habitualmente, se utiliza el
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P
ya que puede ser incorporado en los fosfatos del ADN y emite partculas muy energticas que
son fciles de detectar por autorradiografa (Alberts et al., 2007; Lodish et al., 2008).
La tcnica ms comnmente utilizada para la separacin del ADN es la electroforesis horizontal
sumergida entre 0.5% a 6% de Agarosa, usualmente en uno o dos Buffers de corrido (TAE, TBE
o TBX). La concentracin de Agarosa depende del tamao de los fragmentos a ser separados.
Generalmente, concentraciones altas de agarosa (mayor de 4%), podran ser usadas solo cuando
se van a separar fragmentos de ADN pequeo (<100pb) (Sambrook, Russell, 2001; Reiner,
2005).
Dentro del campo electrofortico, existen dos polos: El polo positivo y el polo negativo, dentro
de los cuales se encuentran el nodo y el ctodo respectivamente. Los cidos nuclicos son
macromolculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en su
estructura. La naturaleza del enlace fosfodister de las cadenas polinucleotdicas condiciona la
carga de un cido nuclico, que es aproximadamente igual al nmero de grupos fosfato lo que
provocar su migracin hacia el nodo (Alberts et al., 2007; Lodish et al., 2008).
Actualmente, la tcnica de la electroforesis posee algunas variantes que ayudan en la extraccin
de biomolculas (ADN, ARN, protenas) dependiendo de las necesidades que se han visto dentro
de las investigaciones cientficas como la electroforesis 2D, el isoelectroenfoque (IEF),
isotacoforesis, entre otras (Lodish et al., 2008; Westermeier, Reiner, 2005).
Soluciones Buffer
Durante la Electroforesis el agua es electrolizada, lo cual genera protones hacia el nodo, e
hidroxilos al ctodo. El extremo catdico de la cmara de electroforesis se vuelve bsico, y el
extremo del nodo es cido. Por lo tanto, se requiere el uso de soluciones Buffer para asegurar
molculas cargadas. Las soluciones Buffer ms usadas comnmente para la electroforesis de
ADN son el Tris-Acetato con EDTA pH 8.0 (TAE: Tris-acetato 40mM, EDTA 2mM) y Tris-
Borato con EDTA pH 8.0 (TBE: Tris-Borato 89mM, EDTA 1mM).
A pesar de ser similares, cada buffer tiene propiedades particulares las cuales se usan para
situaciones y necesidades diferentes. Se utiliza cualquiera de los dos cuando no interesa recuperar
el ADN y cuando este tiene menos de 12Kb a 15kb. El TBE es til cuando el ADN tiene menos
de 1kb; mientras que para ADN mayor de 12 a 15kb, se utiliza el TAE y tambin cuando se desea
purificar el ADN (Sambrook, Russell, 2001; Westermeier, Reiner, 2005).
En esta prctica de laboratorio, la electroforesis se llevar a cabo en una cmara horizontal, a
temperatura ambiente, usando buffer TBE pH 8.3 como buffer de corrida, entre 70-100 voltios.
Se dejar correr aproximadamente 30 minutos. Para visualizar el ADN, el gel se teir con
Bromuro de Etidio (concentracin final= 0.5 g/ml) y se observar en un transiluminador UV.
Como alternativa de tincin, se puede utilizar una solucin al 0.02% de Azul de Metileno. Este
tiene como ventaja la no manipulacin de sustancias carcinognicas como el Bromuro de Etidio.
2. OBJETIVOS
Realizar, mediante Electrofresis en gel de Agarosa, la separacin de diferentes fragmentos
de ADN de acuerdo con su tamao.
Visualizar el ADN separado utilizando el colorante Bromuro de Etidio (BrEt) mediante la
exposicin del gel a la luz UV.
Adquirir un adiestramiento en la preparacin de geles de Agarosa.
3. MATERIALES
Fuente de poder
Plato de Calentamiento o Parrilla Elctrica
Cmara de Electrofresis para Minigeles
Transiluminador de luz Ultravioleta
Viales de 1.5 ml
Vortex
Guantes Quirrgicos
Toallas de Papel
Marcadores Indelebles de Punta Fina
Micropipeta de 20L
Caja Pequea de Therazaki
4. REACTIVOS
Agarosa de punto de fusin normal.
Buffer TBE 10X.
Solucin Stock de Bromuro de Etidio, 10mg/ml.
ADN Genmico Humano.
ADN Amplificado por PCR.
ADN Plasmdico.
Marcador de Peso Molecular 1000pb.
Buffer de Carga (Azul de Bromofenol, Glicerol, Silencianol y Formamida).
Agua Destilada.
5. PROCEDIMIENTO
Preparacin de las muestras
En una caja de Therazaki adicionar 2 l de buffer de carga en tantos pozos como muestras tenga
(con la misma punta), ms uno adicional para el marcador de peso molecular. Adicionar y
mezclar en cada uno de estos pozos 5 l de cada muestra de ADN, utilizando puntas distintas
para cada una.
Preparar de la misma manera el ADN que se utilizar como marcador de peso molecular. Servir
en el gel y dejar correr entre 30 minutos.
Preparacin del gel de agarosa, siembra y electroforesis de las muestras
1. Armar la cmara electrofortica.
2. Diluir la agarosa en buffer TBE 1X.
3. Calentar el recipiente, con la tapa floja, en el horno microondas o en estufa, hasta que la
solucin hierva.
4. Dejar enfriar la solucin hasta aproximadamente 50C.
5. Agregar el bromuro de etidio para que quede a una concentracin final de 0.5 g/ml
Nota: El bromuro de etidio es altamente mutagnico, carcinognico y moderadamente txico.
Use guantes cuando trabaje con soluciones que contienen este colorante y use mscara
cuando trabaje con el reactivo puro.

6. Servir la solucin de agarosa en la bandeja cuando su temperatura sea ms o menos 45C.
Evite los vapores de bromuro de etidio producidos al servir caliente la solucin de agarosa.
7. Eliminar todas las burbujas.
8. Colocar los peines adecuados.
9. Dejar polimerizar la agarosa, durante 10 a 15 minutos aproximadamente.
10. Colocar el molde con el gel en la cubeta de electroforesis.
11. Cubrir el gel con buffer TBE 1X.
12. Retirar los peines cuidadosamente para que los pozos queden bien formados.

Nota: Para sacar la peineta, conviene agregar previamente buffer TBE 1X en la zona de los
pozos para soltarla mejor.

13. Sembrar las muestras correspondientes (con cuidado de no romper el gel y evitar que se
salgan del pozo).
14. Conectar la cmara a la fuente de poder con las siguientes especificaciones: 30 minutos, ~ 80
voltios, 25mA.

Nota: Para evitar que las muestras se difundan en el gel, deben servirse y correrse lo ms rpido
posible.

15. Con guantes llevar el gel hasta el transiluminador de luz ultravioleta, apagar la luz y
observarlo.

Nota: La luz ultravioleta es un agente mutagnico peligroso para la piel y ojos. Debe reducirse el
tiempo de exposicin al mnimo y usar mscara para proteger cara y ojos. Se sembrarn
muestras de ADN de distinto peso molecular, incluyendo la obtenida por cada grupo en la
prctica de extraccin de ADN.

6. PREGUNTAS DE CONSULTA
1. En qu consiste la cromatografa?
2. Cmo se determina el peso molecular de una muestra problema, corrida en un gel de
agarosa?
3. Qu son los colorantes. En qu se basa su selectividad? Mencione 5 ejemplos y que
partes tie cada uno de ellos.
4. Cmo funciona el Bromuro de Etidio?
5. En qu consiste la electroforesis en gel de poliacrilamida y cul es su uso?
6. Cmo funcionan los reactivos de las soluciones Buffer para la electroforesis?



7. BIBLIOGRAFIA
Alberts, B. Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2007). Molecular Biology of
the Cell. Fifth edition. Garland.
Joseph Sambrook, David W. Russell. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring
Harbor, N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Lehninger, A. Nelson, D., Cox, M. Principles of Biochemistry.(2000). Fourth edition. USA:
Worth Publishers.
Lodish, H., Berk, A., Kaiser, A., Krieger M., Scott M. (2008). Molecular Cell Biology. Sixth
Edition. Freeman & Company, W. H.
Promega Corporation. Protocols and Applications Guide. Promega. 3th Ed, 1996.
Westermeier, Reiner. Electrophoresis in Practice. A Guide to Methods and Applications of DNA
and Protein Separations Fourth, revised and enlarged Edition. 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH
& Co.KGaA, Weinheim.