EXTRACCION ADN DE MUESTRAS DE SUELO

El proceso de extraccin del ADN genmico de las muestras de suelo, agua y

sedimento acuoso objeto de estudio se llev a cabo mediante el kit comercial de extraccin
de ADN PowerMax
TM
Soil DNA Isolation Kit (Mo BIO Laboratories, INC), siguiendo el
protocolo facilitado por el fabricante, que se detalla a continuacin. Este kit aumenta el
rendimiento de la extraccin ya que parte de cantidades de muestra de 10g (10mL para las
muestras de agua). Por otra parte el mtodo empleado por el Kit facilita la eliminacin de
compuestos que inhiben la PCR, como las sustancias hmicas.
Protocolo de extraccin:
1. Aadir 15mL de la solucin PowerBead Solution en los tubos PowerBead, estos
tubos ahora se conocen como tubos de solucin PowerMax.
2. Aadir 10g de muestra (suelo, sedimento y agua)en los tubos de solucin
PowerMax y agitar vigorosamente con vrtex durante 1 minuto.
3. Aadir 1,2 mL de la solucin C1 a los tubos de solucin PowerMax y agitar
vigorosamente con vrtex durante 30 segundos.
4. Colocar los tubos de solucin PowerMax en un adaptador de vrtex y agitar
durante 10 minutos a mxima velocidad.
5. Centrifugar a 2500g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
6. Transferir el sobrenadante a un tubo de recoleccin y luego aadir 5 mL de
solucin C2. Mezclar dos veces por inversin e incubar 10 minutos a 4C.
7. Centrifugar a 2500g durante 4 minutos a temperatura ambiente.
8. Desechar el precipitado y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de
recoleccin.
9. Aadir 4 mL de solucin C3. Mezclar dos veces por inversin e incubar 10 minutos
a 4C.
10. Centrifugar a 2500g durante 4 minutos a temperatura ambiente.
11. Desechar el precipitado y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de
recoleccin.
12. Aadir 30mL de la solucin C4 al sobrenadante y mezclar dos veces por inversin;
este paso requiere tres centrifugaciones. Colocar la columna de filtracin en un
nuevo tubo recoleccin llenar con un volumen de la solucin resultante de la etapa
12. Centrifugar a 2.500g durante 2 minutos a temperatura ambiente. Desechar el
lquido y colocar de nuevo la columna en el tubo de recoleccin y agregar el
segundo volumen de la misma solucin y luego centrifugar 2.500g durante 2
minutos a temperatura ambiente. Desechar el lquido y repetir esta operacin
hasta que el volumen total se haya procesado.
13. Aplicar 10mL de la solucin C5 en la columna del filtro. Centrifugar a 2500g
durante 3 minutos a temperatura ambiente y desechar el lquido.
14. Centrifugar a 2500g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
15. Colocar cuidadosamente la columna del filtro en un nuevo tubo de recoleccin y
evitar el contacto del final de la columna con el lquido a desechar.
16. Aplicar 5mL de la solucin estril C6 directamente en el centro de la membrana en
la columna y centrifugar a 2500g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
17. Desechar la columna del filtro. Guardar el ADN a -20C para evitar su degradacin.