Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra

de la suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que determinan

un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el número de
partículas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de
partículas en la suspensión de origen.

La cámara de Neubauer es una cámara de contaje

adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste
de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en
el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la
ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve
en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una
separación entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm. Así
pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1
milimetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos
está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que
cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la
superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen
comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de
0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz debido a
partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.

Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas

de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular,
tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso
seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es
directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño
celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias
muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia)
cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes. Por esta
razón, para estimar el número de microorganismos totales o el número de
microorganismos viables de una suspensión bacteriana debe realizarse
una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo, sólo de esta
forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Óptica) con el número
de microorganismos totales o con UFC.
Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales

En este gráfico se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos

microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia,
mientras que para el mismo número de microorganismos totales la absorbancia
de cada suspensión es distinta.
OBJETIVO: Hacer una estimación poblacional de microorganismos utilizando
conteo en cámara y turbidimetría. Relacionar estas lecturas con respecto al
tiempo.
RESULTADOS:

MUESTRA TIEMPO (hr) D.O. DILUCION (1:Xmm) 1:10x * 10¨8

1 2 0,75 1 0,075 0,2965

2 3 0,906 1 0,0906 0,5615

3 4 0,548 6 0,3288 0,8101

4 5 0,348 10 0,348 0,8575

5 6 0,418 10 0,418 1,03

6 6 0,597 8 0,477 1,184

7 7 0,532 10 0,532 1,365

8 8 0,884 5 0,442 1,097

9 9 0,432 11 0,3927 0,9747

10 10 0,363 10 0,363 0,785

TABLA 1. Muestra las muestras experimentales, tomadas cada

hora, incluye su D.O. experimental a diferentes diluciones, se
calculó dicha densidad a dilusión 1:10, se elaboró un conteo en
cámara para relacionarse con la absorbancia.
 VELOCIDAD DE PRODUCCION

1,6

1,4
DENSIDAD POBLACIONAL (* 10¨4/ml)

1,2

1 La gráfica de velocidad de
crecimiento de la población
0,8
nos indica la cant. De M.O.
0,6 en la muestra a diferentes
horas, nos da un indicio de
0,4
cómo se comporta la
0,2 población en estudio.
0
2 3 4 5 6 6 7 8 9 10
TIEMPO (hr)
DISCUSION DE RESULTADOS:
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la
energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.
El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de
onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos
aquellas longitudes de onda no absorbidas.
Además, no esta de menos mencionar el hecho de que la absorción y
trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentración y de la
distancia recorrida como nos dice la ley de Lambert y la ley de Beer. Si
fusionáramos estas leyes, podríamos establecer que al hacer pasar una
cantidad de fotones o de radiaciones, hay una perdida que se expresa con la
ecuación:
It/Io=T-kdc''
Donde It , es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoeléctrica (llamada radiación o
intensidad transmitida); y Io que es la que intensidad con la que sale al atravesar la celda (radiación intensidad
incidente) y la relación entre ambas (T) es la transmitancia.
En el exponente, el signo negativo se debe a que la energía radiente decrece a medida que el recorrido aumenta.
Donde k es la capacidad de la muestra para la captación del haz del campo electromagnético, d es la longitud de la
cubeta de espectrofotometría que recorre la radiación, y c es la concentración del soluto en la muestra ya ubicada en
la cubeta.
La ecuación simplificada de la ley de Beer-Lambert
A = ε.d.c
Comprende a la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbancia de la muestra (A), el espesor recorrido
por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de calibración relaciona la concentración y la absorbancia de los
estándares.

La absorción (o absorbancia) es igual a A, la es el logaritmo del reciproco de la

transmitancia:(1)
A= log 1/T
Con lo anterior podemos deducir que al obtener valores de absorbancia o
transmitancia podemos calcular la concentración, aunque todavía nos faltaría una
incognita que seria el factor de calibración, al no tener una curva patrón, o
mediciones de soluciones estándar nos vemos obligados a utilizar factores ya
calculados los cuales se representan en las ecuaciones utilizadas, llamadas
dicromáticas, las cuales restan valores de absorbancia multiplicados por valores
establecidos y por una relación volumen/peso que nos daría el campo dimensional
de la concentración. Los factores por los que se multiplican las absorbancias son
relativos a la longitud de onda (Jeffrey 1975)
También es recomendable que las absorbancias obtenidas se les reste una
medición de la muestra a una longitud de onda más alta para evitar lectura de
impurezas.
Para las pruebas en espectro las absorbancias se miden de 0-1 en casi de
absorbancia mayor, se realiza una dilución que al final se toma en cuenta para
saber la concentración exacta de analito en la muestra, al no tener en cuanta A<1
los resultados pueden variar debido a la saturación de la muestra y las
interacciones moleculares llevadas cabo en ella.
Para construir la curva patrón se utilizó el conteo en cámara, esta técnica bien
utilizada nos puede dar valores muy cercanos a las concentraciones reales. Pero
igualmente que en la medición de Abs. Necesitamos hacer diluciones para realizar
conteos más fácilmente, ya que una mezcla saturada nos provocaría igualmente
errores.
El experimento debería repetirse varias veces para tener una curva patrón fiable, y
así estimar una mezcla problema o una estimación poblacional con más exactitud.
Para determinar la velocidad máxima de una reacción enzimática, la
concentración de sustrato ([S]) se aumenta hasta alcanzar una velocidad
constante de formación de producto. Esa es la velocidad máxima (Vmax) de
la enzima. En ese caso, los sitios activos de la enzima están saturados con
sustrato.
CONCLUSION:
El conteo en cámara es efectivo, siempre y cuando se realice con una muestra,
para no realizar este conteo con muchas muestras de concentración
desconocida podemos valernos de una curva patrón, leyendo muestras ya
contabilizadas en un espectrofotómetro, así al leer Abs. De una mezcla podemos
determinar la concentración por interpolación en la curva patrón.

Al obtener diferentes muestras en relación al tiempo con las que construimos la

curva patrón también calcular la velocidad de reproducción y así utilizar los M.O.
en procesos estandarizados.

La velocidad de producción de M.O. dependerá siempre del sustrato, pero

siempre llegará a una velocidad máxima como explica el modelo de Michaelis-
Menten
Bibliografía:
1- Robert L. Pecsok y L. Donal Shields, Métodos modernos de análisis
químicos, Editorial Limusa
2- Jeffrey S. W., New spectrophotometric equations for determining
chlorophills , Biochem, Physiol, 1975. 167-194pp