Dossage et Bradford protocol

1) Extraction des proteins:

a. Lyse buffer : en 50ml PBS 1x pH7.4
i. 1% NP40= 0.25g
ii. 0.5% Sodium Deoxychlolate 0.05g
iii. 0.1% SDS 0.002gr
iv. 40mg/l PMSF 0.5mg
v. 1.1mmol/l EDTA 20.47mg
vi. 1 tablette protease cocktail inhibitor = dans le frigo le
complete mini
b. Ajouter 500l de Lyse Buffer ton chantillon
c. Utiliser le potter lectrique pour homogniser
d. Centrifuguger 3 minutes 10000g
e. Recuperer le surnageant avec une pippette et jeter le reste.
2) Bradford protocol :
a. 1) Prparer la curve de calibration : BSA stock
i. Point 4g : 20 l stock + 980 l H20
ii. Point 2g : 500 l du point 4 + 500 l H20
iii. Point 1g : 500 l du point 2 + 500 l H20
iv. Point 0.2g : 100 l du point 1 + 500 l H20
v. Point 0.8g : 100 l du point 4 + 400 l H20
vi. Point 0.4g : 100 l du point 2 + 400 l H20
vii. Point 3g : 10 l du stock + 656 l H20
viii. Point 2g : 100 l du point 3 + 400 l H20
b. 2) Prparer les chantillons :
i. 1/500
ii. 1/750
iii. 1/1000
iv. 1/1250
v. 1/1500
c. 3) Designer et rparer la plaque de 96 puits
i. 100 l des echantillons, BSA et blancs par triplicat
ii. De la dose plus petite la plus grande
iii. Ajouter 50 l deau
iv. Ajouter 150 l de Commasie Blue / Bradford reagent
d. Attendre 5 minutes et prparer les donnnes dans lordinateur.
i. Programme : Accent Software
ii. Dfinir la zone scannner
iii. Layout : dfinir les calibrateurs, les echantillons et ses
dilutions et les blancs.
iv. Mesures filtre 580nm
v. Start !
3) Analyse des donnes :
a. Copier et enregistrer sur excel
b. La graphique montre le endroit o la curve est plus continu, les valeurs
doivent tre prs de ce point l.
c. Voir exemples de rsultat