PROCEEDING SIMPOSIUM NASIONAL IATMI 2001

Yogyakarta, 3-5 Oktober 2001

IATMI 2001-59
ISOLASI BERTAHAP BAKTERI PENDEGRADASI MINYAK BUMI
DARI SUMUR BANGKO
Pingkan Aditiawati
1
, Megga R Pikoli
2
, dan Dea Indriani A
1
1
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi ITB
2
Alumni S2 Biologi Institut Teknologi Bandung
Kata kunci : bakteri; degradasi; isolasi; minyak bumi.
ABSTRAK
Telah dilakukan isolasi bakteri termofilik pendegradasi minyak bumi dari Sumur Bangko dengan cara bertahap karena
prosedur isolasi biasa belum tentu dapat mengisolasi bakteri pendegradasi secara lengkap. Isolasi tahap I dilakukan langsung dari
crude oil di dalam medium basal Stone Mineral Salt Solution ditambah ekstrak ragi (SMSSe). Isolasi tahap II dan III dilakukan
dari sumber isolat, medium basal dan kondisi kultur yang sama tetapi medium pengisolasi diperkaya dengan minyak sisa degradasi
(MSD) isolat campuran tahap sebelumnya. Pada tahap I diperoleh 4 isolat, yaitu Bacillus polymyxa, B. licheniformis, Bacillus sp.1 dan
Pseudomonas aeruginosa; pada tahap II diperoleh 3 isolat, yaitu Bacillus sp.2, B. stearothermophllus dan B. brevis; sedangkan pada
tahap III hanya diperoleh 1 isolat, yaitu B. coagulans. Kemampuan setiap isolat dalam mendegradasi minyak bumi kemudian diuji
dengan menggunakan kultur tunggal dan kultur campur. Isolat-isolat tersebut memiliki pertumbuhan yang paling baik pada minyak
pengisolasinya masing-masing, yaitu isolat-isolat tahap I memiliki pertumbuhan paling baik ketika mendegradasi crude oil, isolat-
isolat tahap II tumbuh lebih baik pada saat mendegradasi MSD I daripada saat mendegradasi crude oil, demikian pula dengan isolat
tahap III yang tumbuh paling baik pada MSD II. Hal ini menunjukkan adanya degradasi spesifik yang terjadi pada masing-masing
tahap. Persentase degradasi yang berbeda pada setiap tahap juga teramati pada data yang diperoleh dari metode gravimetri.
Degradasi total sebesar 12,5%; 37,03% dan 55,54% berturut-turut terjadi pada isolat tahap I, II dan III. Dengan demikian isolat-isolat
bakteri yang diperoleh secara bertahap harus diterapkan secara bertahap pula untuk memperoleh hasil degradasi yang lebih besar.
1. PENDAHULUAN
Penggunaan mikroba baik dalam MEOR (Microbial Enhanced
Oil Recovery) maupun bioremediasi minyak bumi,
melibatkan pengetahuan yang mendasar tentang perubahan
minyak bumi yang diperankan oleh mikroba. Mikroba yang
telah dikenal kemampuan yang tinggi dalam mendegradasi
minyak bumi adalah dari jenis bakteri. Bakteri pendegradasi
minyak bumi diisolasi dari lingkungan yang telah lama
terdedah minyak bumi, misalnya tanah dan laut yang tercemar
minyak atau dari minyak bumi itu sendiri bahkan diarahkan
pada bakteri-bakteri endogen yang terkandung di dalam
minyak bumi dalam sumur minyak yang bertemperatur tinggi.
Bakteri hidrokarbonoklastik tidak selalu mampu
mendegradasi fraksi aromatik dalam minyak bumi. Hal ini
menunjukkan bahwa kemampuan bakteri mendegradasi
fraksi-fraksi hidrokarbon tergantung pada enzim yang
dimilikinya (Fedorak et al., 1983, Harayama et al., 1995).
Sifat-sifat tersebut memungkinkan isolasi bakteri
pendegradasi minyak bumi diarahkan melalui substratnya,
yaitu dengan memperkaya medium pengisolasi dengan fraksi
tertentu di dalam minyak bumi.
Prosedur isolasi bakteri yang lazim dilakukan biasanya hanya
dapat mengisolasi bakteri pendegradasi minyak bumi yang
mendominasi kultur, yaitu bakteri yang pertama mendegradasi
minyak bumi dan mampu mencapai konsentrasi sel tinggi
dengan cepat. Bakteri yang mula-mula bekerja biasanya
merupakan pengoksidasi alkana normal karena fraksi ini
mendominasi kebanyakan minyak bumi, lebih mudah larut
dalam air dan terdifusi ke dalam membran sel bakteri (Walker
and Colwell, 1974, Horowitz et al., 1975, Sigiura et al.,
1997). Bakteri pendegradasi fraksi minyak yang lebih sulit
didegradasi tumbuh lebih lambat dan jumlahnya lebih sedikit
karena kalah bersaing dengan bakteri pendegradasi substrat
alkana yang merupakan fraksi dalam jumlah yang lebih besar,
sehingga bakteri ini sulit terisolasi. Peran bakteri ini
sebenarnya penting dalam melaksanakan degradasi fraksi
minyak lain yang sulit didegradasi (Horowitz et al., 1975).
Bakteri pendegradasi fraksi minyak yang sulit didegradasi ini
dapat diperoleh dengan memanfaatkan fraksi minyak bumi
yang masih ada setelah pertumbuhan yang lengkap bakteri
pendegradasi awal (Harayama et al., 1995). Oleh karena itu
degradasi minyak bumi yang lengkap dapat dicapai dengan
memanfaatkan bakteri-bakteri yang diisolasi secara bertahap.
Biodegradasi minyak bumi lebih sering diperkirakan oleh
kerja kultur tunggal, jarang ditentukan dengan menggunakan
kultur campuran. Pada beberapa kasus degradasi minyak bumi
ditentukan dengan mengukur metabolisme salah satu
hidrokarbon tunggal, biasanya senyawa yang cepat
dimetabolisme seperti alkana. Komunitas mikroba
pendegradasi minyak bumi di alam terdapat bersama dengan
suatu cmpuran hidrokarbon yang kompleks, yang beberapa
diantaranya mempengaruhi metabolisme hidrokarbon lainnya.
Sebagian hidrokarbon tertentu akan dioksidasi ketika mikroba
itu menggunakan fraksi lain (Atlas, 1981). Kemampuan
degradasi suatu jenis mikroba terbatas hanya pada kisaran
senyawa hidrokarbon tertentu, namun beberapa jenis mikroba
akan bekerja secara bersamaan dalam mendegradasi minyak
bumi sesuai dengan spesifisitas substrat yang dimiliki
(Harayama et al., 1995).
Pada penelitian ini akan dilakukan isolasi secara bertahap dan
membuktikan terjadinya degradasi bertahap pada minyak
bumi oleh isolat-isolat yang diperoleh, untuk selanjutnya
menggunakan isolat-isolat tersebut pada penelitian
bioremediasi dasar dan terapan.
Isolasi Bertahap Bakteri Pendegradasi Minyak Bumi Dari Sumur Bangko Pingkan Aditiawati, Megga RPikoli, Dea Indriani
IATMI 2001-59
2. METODOLOGI
Isolasi dilakukan 3 tahap, dengan menggunakan sampel
minyak bumi (crude oil) dari sumur Bangko, Sumatera
sebagai sumber isolat. Medium basal yang digunakan adalah
Stone Mineral Salt Solution (SMSS) yang terdiri dari 5 g
CaCO
3
; 2,5 g NH
4
NO
3
; 1 g Na
2
HPO
4
.7H
2
O; 0,5 g KH
2
PO
4
;
0,5 g MgSO
4
.7H
2
O dan 0,2 g MnCl
2
.7H
2
O yang dilarutkan di
dalam 1 liter akuades (Sharpley, 1966). Ekstrak ragi sebanyak
0,01% (b/v) ditambahkan ke dalam medium SMSS sebagai
sumber nitrogen tambahan. Medium SMSS yang mengandung
ekstrak ragi ini selanjutnya disebut SMSSe untuk
mempermudah penyebutannya. Medium tersebut ditambahkan
minyak bumi sebanyak 2% (b/v) sebagai sumber karbon. PH
medium ini adalah 6,8-7.
Isolasi tahap I didahului dengan pengocokan 2% (b/v) crude
oil di dalam medium SMSSe selama 7 hari dengan kecepatan
120 rpm. Untuk keperluan isolasi, pengambilan contoh
diambil setiap hari, kemudian isolasi dilakukan dengan
metode pengenceran. Contoh diambil sebanyak 1 ml untuk
dibiakkan di atas lempeng agar SMSSe yang mengandung
crude oil dengan metode cawan tuang. Setiap koloni yang
berbeda dimurnikan kembali pada medium padat yang serupa.
Isolasi tahap II dan III dilakukan dengan prosedur dan kondisi
yang sama, tetapi medium pengisolasinya (SMSSe) diperkaya
dengan minyak sisa degradasi (MSD) tahap sebelumnya.
Isolasi tahap II menggunakan MSD I, sedangkan isolasi tahap
III menggunakan MSD II. Prosedur isolasi bakteri secara
bertahap dari minyak bumi secara garis besar diperlihatkan
pada Gambar-1. Dan prosedur pemurnian bakteri tahap I, II,
dan III dapat dilihat pada Gambar-2. Isolat bakteri yang
diperoleh kemudian diidentifikasi melalui pengamatan
morfologi koloni, sel dan uji-uji biokimia (Capuccino, 1987).
Uji kemampuan degradasi minyak bumi oleh isolat bakteri
hasil isolasi tahap I, II dan III dilakukan setelah isolat
diaktivasi dalam medium SMSSe yang telah ditambah crude
oil dan minyak sisa degradasi seperti pada Gambar-3 dan
ditentukan laju pertumbuhannya. Hasil degradasi dianalisis
dengan cara menghitung berat minyak sisa degradasi
(gravimetri).
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat bakteri yang diperoleh secara bertahap dari minyak
bumi Bangko di dalam medium SMSSe dengan kecepatan
pengocokan 120 rpm berjumlah 8 isolat, yaitu 4 isolat dari
tahap I, 3 isolat dari tahap II dan 1 isolat dari tahap III. Isolat
yang diperoleh pada tahap I adalah Bacillus polymyxa (isolat
I-1), B. licheniformis (isolat I-2), Bacillus sp.1 (isolat I-3) dan
Pseudomonas aeruginosa (isolat I-4); pada tahap II Bacillus
sp.2 (isolat II-1) , B. stearothermophllus (isolat II-2) dan B.
brevis (isolat II-3); sedangkan pada tahap III hanya diperoleh
1 isolat, yaitu B. coagulans (isolat III). Karakteristik koloni
sel dan hasil uji biokimia dapat dilihat pada Tabel-1, 2 dan 3.
Kurva pertumbuhan isolat-isolat tunggal tahap I dalam crude
oil memperlihatkan bahwa pada umumnya isolat tahap I
menunjukkan pola pertumbuhan yang relatif baik pada kultur
tunggal di dalam medium SMSSe yang mengandung crude
oil pada temperatur 50
o
C dan kecepatan pengocokkan 120
rpm (Gambar-4). Isolat I-4 (Pseudomonas aeruginosa)
memiliki pertumbuhan yang paling baik dengan
menggunakan crude oil sebagai sumber karbon,
dibandingkan dengan tiga isolat tahap I lainnya. Pertumbuhan
isolat I-4 langsung mengalami fase eksponensial mulai dari
jam ke-0 hingga jumlah sel maksimumnya tercapai pada jam
ke-36.
Genus Pseudomonas telah dikenal luas sebagai salah satu
kelompok mikroba yang memiliki kemampuan yang tinggi
dalam mendegradasi minyak bumi. Bakteri ini memiliki
kemampuan mendegradasi fraksi alifatik, aromatik dan resin
(Harayama et al., 1995). Pertumbuhan P. aeruginosa pada
temperatur tinggi ini disebabkan bakteri ini memiliki kisaran
toleransi temperatur yang luas. Selain itu, pertumbuhan P.
aeruginosa yang baik pada minyak bumi dalam lingkungan
bertemperatur tinggi menunjukkan bahwa bakteri ini telah
sangat lama teradaptasi dalam lingkungan tersebut. Hal ini
juga membuktikan bahwa P. aeruginosa yang biasanya
tumbuh pada temperatur sedang benar-benar terisolasi dari
crude oil.
Ketiga isolat tahap I lain tampaknya tidak langsung
mengalami fase eksponensial, melainkan didahului oleh fase
adaptasi. Isolat I-1 (Bacillus polymyxa) baru mengalami fase
eksponensial pada jam ke-12 dan peningkatan jumlah selnya
tidak terlalu tajam. Demikian pula dengan isolat I-3 (Bacillus
sp.1), baru tampak mengalami fase eksponensial yang nyata
mulai jam ke-12. Isolat ini paling dahulu mencapai jumlah sel
maksimum, yaitu pada jam ke-24, lebih cepat daripada kultur
tunggal lainnya. Pada pola pertumbuhan isolat I-2 (Bacillus
licheniformis) fase adaptasi tampaknya masih terjadi sampai
jam ke-24, meskipun kemudian mampu mencapai jumlah sel
maksimum yang lebih tinggi daripada isolat I-3 dan I-1. Isolat
I-2 juga memiliki fase stasioner yang lebih lama daripada
isolat lainnya. Isolat I-1 memiliki pola pertumbuhan yang
paling pendek dibandingkan dengan ketiga isolat lainnya.
Berbagai spesies Bacillus telah diketahui dapat tumbuh
dengan baik pada temperatur termofilik. Di dalam crude oil
diduga pertumbuhannya terhambat karena tidak terpenuhinya
sumber nutrisi yang lain, seperti nitrogen dan fosfor (Leahy
and Colwell, 1990). Jumlah kedua unsur ini sangat sedikit di
dalam crude oil (Neumann et al., 1981). Oleh karena itu,
setelah crude oil dikocok di dalam medium SMSSe yang
mengandung senyawa nitrogen dan fosfor Bacillus sp. yang
terdapat di dalam crude oil menjadi aktif. Bacillus sp. yang
menggunakan fraksi terbanyak dalam crude oil mencapai
jumlah yang mendominasi kultur, sehingga dapat dengan
mudah diisolasi. Hal inilah yang menyebabkan Bacillus sp.1,
B. polymyxa, dan B. licheniformis, mudah diisolasi pada tahap
I dan memiliki pertumbuhan yang relatif baik dengan
menggunakan crude oil sebagai sumber karbon.
Biodegradasi minyak bumi di alam sebenarnya melibatkan
konsorsium dari berbagai kultur campur mikroba. Interaksi
diantara populasi bakteri yang diisolasi pada tahap I dapat
diketahui melalui kultur campur isolat-isolat tahap I. Pola
pertumbuhan kultur campur tahap I dapat dilihat pada
Gambar-5.
Pertumbuhan isolat I-4 (Pseudomonas aeruginosa) masih
mengungguli isolat lainnya (Gambar-5). Bahkan jumlah sel
maksimumnya dicapai pada jam ke-12, lebih cepat
dibandingkan dengan kultur tunggalnya (pada jam ke-36).
Demikian pula dengan isolat I-1 (Bacillus polymyxa) dan I-2
(Bacillus licheniformis), jumlah sel maksimum dicapai lebih
cepat dalam kultur campur, yaitu pada jam ke-24, daripada
Isolasi Bertahap Bakteri Pendegradasi Minyak Bumi Dari Sumur Bangko Pingkan Aditiawati, Megga RPikoli, Dea Indriani
IATMI 2001-59
dalam kultur tunggal (pada jam ke-48). Pada saat isolat I-4
telah mencapai fase stasioner menuju fase kematian, isolat I-1
dan I-2 sedang mengalami fase eksponensial yang pesat dan
keduanya mencapai maksimum pada jam ke-24. Isolat I-1 dan
I-2 tampaknya berinteraksi secara simbiosis mutualistik.
Kedua isolat dapat mencapai jumlah sel maksimum secara
hampir bersamaan dan pola pertumbuhan keduanya dalam
kultur campur lebih baik daripada dalam kultur tunggal
masing-masing.
Interaksi antara isolat I-4 dengan I-2 dan I-1 tampaknya
merupakan interaksi sinergisme, karena jika dibandingkan
dengan pertumbuhan ketiga isolat pada masing-masing kultur
tunggalnya, pertumbuhan dalam kultur campur ini lebih baik.
Pada interaksi sinergisme kecepatan degradasi suatu senyawa
berlangsung lambat oleh masing-masing populasi, tetapi
apabila populasi-populasi yang berbeda dicampur, kecepatan
degradasi menjadi meningkat. Hal ini disebabkan karena
mikroba berinteraksi membutuhkan senyawa produk yang
sama untuk pertumbuhannya (Bushell and Slater, 1981).
Isolat I-3 (Bacillus sp.1) tumbuh tidak begitu baik di dalam
kultur campur bersama dengan isolat tahap I lainnya.
Pertumbuhannya tidak sebaik pada kultur tunggal yang
mampu dengan cepat mencapai jumlah sel maksimum, yaitu
pada jam ke-24. Pada kultur campur ini isolat I-3 mengalami
penurunan jumlah sel tidak lama setelah inokulasi, dan baru
mencapai jumlah sel maksimum pada jam ke-48 dengan
kenaikan jumlah sel yang tidak terlalu besar. Pertumbuhan
isolat I-3 cenderung lambat ketika isolat lainya sedang
mencapai maksimum. Isolat I-3 mencapai pertumbuhan yang
lebih baik dengan jumlah sel maksimum dicapai ketika ketiga
isolat lainnya telah menuju fase kematian. Hal ini
menunjukkan adanya interaksi negatif antara isolat I-3 dengan
ketiga isolat lainnya dalam mendegradasi crude oil.
Interaksi negatif dapat disebabkan oleh adanya senyawa
toksik yang dihasilkan oleh anggota campuran populasi. Pada
kultur campur berkepadatan tinggi, metabolit toksik dapat
terakumulasi sehingga membatasi pertumbuhan (Atlas, 1981).
Dalam hal ini senyawa toksik bagi isolat I-3 mungkin
dihasilkan dari metabolisme oleh salah satu dari isolat I-1, I-2,
dan I-4 atau interaksi di antara isolat-isolat tersebut.
Perbedaan pertumbuhan antara isolat-isolat tahap I dalam
kultur tunggal dan kultur campur dalam mendegradasi crude
oil terlihat lebih jelas dari data jumlah sel maksimum isolat-
isolat tersebut (Gambar-6). Laju pertumbuhan spesifik isolat-
isolat tahap I tersebut dapat dilihat pada Gambar-7. Pada
isolat I-4 dan I-2 laju pertumbuhan spesifik dalam kultur
campur lebih tinggi 7 kali dibandingkan dalam kultur
murninya masing-masing. Bahkan pada Isolat I-1
perbedaannya mencapai 12 kali. Perbedaan laju pertumbuhan
spesifik pada isolat I-3 yang ditumbuhkan dalam kultur
campur dan kultur murni tidak terlalu besar jika dibandingkan
dengan perbedaan pada isolat lainya. Seperti halnya pada
jumlah sel maksimum, isolat I-4 meiliki laju pertumbuhan
spesifik yang paling tinggi, baik dalam kultur tunggal maupun
dalam kultur campur, kemudian diikuti dengan isolat I-2, I-1,
dan I-3.
Bila dilihat dari pola pertumbuhannya, terutama pada jumlah
sel maksimum dan laju pertumbuhan spesifik, dapat
disimpulkan bahwa isolat I-4 (P. aeruginosa) merupakan
isolat yang paling unggul di antara isolat tahap I lainnya.
Berdasarkan hal tersebut P. aeruginosa merupakan bakteri
yang dominan dalam konsorsium bakteri pengguna
hidrokarbon pada tahap I, yang ditumbuhkan pada temperatur
50
o
C.
Isolasi pada tahap I bertujuan untuk memperoleh
pendegradasi fraksi paling mudah didegradasi dalam crude
oil. Fraksi yang paling mudah didegradasi adalah fraksi
alifatik, terutama alkana normal (Atlas, 1981). Oleh krena itu
P. aeruginosa yang diisolasi pada tahap I ini diduga kuat
merupakan pengguna alkana sebagai substratnya.
Pola pertumbuhan Isolat tahap II dan III baik dalam kultur
tunggal maupun kultur campur relatif sama dengan pola
pertumbuhan Isolat tahap I. Namun ada perbedaan jumlah sel
maksimum dan laju pertumbuhan spesifik isolat-isolat tahap II
dan III dalam kultur tunggal dan kultur campur, baik dalam
mendegradasi crude oil maupun MSD I (Tabel-4).
Pembahasan tentang pola pertumbuhan isolat tahap II dan III
tidak akan diterangkan dengan rinci, tetapi dari pola
pertumbuhan tersebut diketahui bahwa secara umum
pertumbuhan ketiga isolat tahap II yaitu, isolat II-1 (Bacillus
sp.2), II-2 (B. stearothermophilus) dan II-3 (B. brevis) lebih
baik menggunkan MSD I daripada crude oil. Hal ini
disebabkan isolat-isolat tahap II diisolasi dengan
menggunakan MSD I. Hal ini berarti isolat-isolat pada tahap
II ini telah menemukan substrat yang spesifik bagi enzim-
enzim yang dimilikinya (Sigiura et al., 1997). MSD I yang
digunakan sebagai substrat adalah fraksi-fraksi minyak (crude
oil) yang tidak didegradasi oleh isolat-isolat tahap I dan
fraksi-fraksi minyak yang terbentuk sebagai hasil dari
degradasi minyak (crude oil). Substrat ini kemudian
digunakan sebagai sumber karbon untuk pertumbuhannya.
Jadi dapat disimpulkan bahwa ketiga isolat tahap II ini benar-
benar merupakan isolat pengguna MSD I di dalam medium
SMSSe karena secara umum pertumbuhannya paling baik
menggunakan MSD I.
Demikian pula dengan isolat tahap III (Bacillus coagulans)
yang diisolasi dengan menggunakan MSD II, dapat tumbuh
lebih baik pada MSD II daripada crude oil dan MSD I
(Gambar-8). Pertumbuhan isolat III pada ketiga macam
minyak tersebut menunjukkan urutan tahap degradasi, yaitu
mulai dari crude oil, MSD I dan MSD II. MSD II merupakan
minyak yang telah didegradasi secara berurutan, yaitu mulai
dari crude oil yang didegradasi oleh isolat-isolat tahap I
menjadi MSD I, dan didegradasi lagi oleh isolat-isolat tahap II
menjadi MSD II. Hal ini berarti isolat tahap III menggunakan
fraksi minyak sisa yang tidak didegradasi oleh isolat tahap I
dan II atau senyawa-senyawa hidrokarbon yang terbentuk
sebagai hasil degradasi isolat tahap I dan II.
Degradasi minyak bumi secara bertahap dengan
menggunakan beberapa kultur campur bakteri dapat
menghasilkan degradasi yang lebih besar dibandingkan
dengan degradasi dengan inokulasi secara bersamaan. Hal ini
disebabkan karena senyawa-senyawa hidrokarbon yang lebih
ringan dan lebih sederhana dapat didegradasi dahulu pada
tahap awal oleh suatu kultur campur mikroba, kemudian
senyawa yang tidak didegradasi pada tahap awal didegradasi
oleh kultur campur kedua dan seterusnya (Horowitz et al.,
1975). Setiap jenis bakteri pendegradasi minyak hanya
mendegradasi substrat hidrokarbon dalam kisaran yang
terbatas. Oleh karena itu, setelah diketahui kemampuan
degradasi setiap mikroba melalui evaluasi kultur tunggalnya,
suatu kultur campur pendegradasi minyak bumi secara
Isolasi Bertahap Bakteri Pendegradasi Minyak Bumi Dari Sumur Bangko Pingkan Aditiawati, Megga RPikoli, Dea Indriani
IATMI 2001-59
bertahap dapat menghasilkan degradasi yang lebih lengkap
dan efisien, dibandingkan dengan penggunaan kultur campur
(Harayama et al., 1995).
Biodegradasi minyak bumi selain dapat diketahui melalui
pertumbuhan mikroba yang mendegradasinya, dapat pula
diketahui cara menghitung berat minyak sisa degradasi
(gravimetri). Histogram pada Gambar-9 menunjukkan bahwa
secara gravimetri persentase degradasi crude oil yang paling
besar dilakukan oleh kultur tunggal isolat I-4 (Pseudomonas
aeruginosa), yaitu lebih dari 25,58%. Degradasi crude oil
yang cukup besar ini disebabkan oleh isolat I-4 diisolasi dari
crude oil, sehingga merupakan isolat yang terspesialisasi
menggunakan crude oil yang belum didegradasi
sebelumnya. P. aeruginosa telah diketahui tidak saja memiliki
kemampuan yang tinggi dalam mendegradasi fraksi alifatik,
tetapi juga dapat mendegradasi PAHs, yaitu senyawa
aromatik yang tahan terhadap degradasi, di samping
menghasilkan biosurfaktan rhamnolipid (Deziel et al., 1996).
Persentase degradasi crude oil oleh kultur campur tahap I
secara gravimetri tidak sebesar yang dilakukan oleh kultur
tunggal isolat I-4. Hal ini mungkin disebabkan oleh perbedaan
pola pertumbuhan isolat I-4 di dalam kultur tunggal dengan
pertumbuhannnya di dalam kultur campur. Isolat I-4 di dalam
kultur campur bertahan tidak lama (fase eksponensialnya
hanya sampai jam ke-12), sedangkan pada kultur tunggal fase
eksponensial sampai jam ke-36. Menurut Horowitz et al.
(1975) bahan pengemulsi dihasilkan selama fase eksponensial
atau fase stasioner pada sebagian bakteri yang menggunakan
crude oil sebagai substrat pertumbuhannya. Biosurfaktan yang
dihasilkan pada kultur campur isolat tahap I diduga tidak
sebanyak pada kultur tunggal isolat I-4, minyak bumi tidak
teremulsi lebih banyak dan hasil kerja biosurfaktan tidak
dapat dimanfaatkan secara optimal oleh isolat lain dalam
kultur campur isolat tahap I.
Pada Gambar-9 juga dapat dilihat bahwa semua isolat tahap
I, baik dalam kultur tunggal maupun kultur campur
menghasilkan persentase degradasi yang lebih besar
dibandingkan dengan crude oil steril (kontrol) dan isolat tahap
lain, kecuali isolat I-3. Hal ini membuktikan kesesuaian antara
pertumbuhan bakteri dengan besarnya degradasi minyak yang
dihasilkan. Menurut Jobson et al. (1972) penggunaan crude
oil ditunjukkan oleh peningkatan jumlah sel mikroba yang
menggunakannya.
Persentase degradasi crude oil yang dilakukan oleh kultur
tunggal isolat II-1, II-2, III dan kultur campur tahap II lebih
kecil bila dibandingkan dengan kontrol. Hal ini menunjukkan
bahwa isolat-isolat tersebut tidak dapat mendegradasi crude
oil dengan optimal karena untuk pertumbuhannya lebih
dibutuhkan substrat berupa MSD I.
Persentase degradasi MSD I oleh bakteri selalu lebih tinggi
daripada kontrol, baik kontrol berupa MSD I maupun crude
oil (Gambar-10). Hal ini menunjukkan adanya peran yang
besar dari bakteri dalam mendegradasi MSD I yang
sebelumnya telah terdegradasi sendiri. Persentase degradasi
yang dibandingkan terhadap kontrol crude oil juga selalu
lebih tinggi daripada bila dibandingkan terhadap kontrol
MSD I. Hal ini menunjukkan bahwa isolat-isolat tahap II dan
III berhasil melanjutkan kerja isolat tahap I dalam
mendegradasi crude oil. Hasil penelitian Harayama et al.
(1995) juga menyimpulkan bahwa suatu konsorsium bakteri
pendegradasi minyak bumi yang disusun secara buatan efektif
mendegradasi crude oil. Crude oil merupakan campuran
kompleks dari senyawa-senyawa hidrokarbon, sedangkan tiap
bakteri hanya memiliki kemampuan yang terbatas dalam
mendegradasinya.
Pengukuran secara gravimetri dilakukan pula pada MSD II
untuk mengetahui persentase degradasi MSD II oleh isolat
tahap III (Bacillus coagulans). Persentase ini dibandingkan
dengan tiga kontrol yaitu, crude oil, MSD I dan MSD II
steril (Gambar-11). Histogram pada Gambar-11
memperlihatkan urutan persentase kontrol dari yang paling
kecil ke yang paling besar yaitu, kontrol MSD II, kontrol
MSD I dan kontrol crude oil. Persentase degradasi yang
yang terjadi pada ketiga kontrol lebih rendah daripada yang
dilakukan oleh isolat III.
Persentase degradasi MSD II oleh isolat tahap III memiliki
nilai yang berurutan sesuai dengan urutan kontrol, yaitu
paling tinggi jika dihitung terhadap kontrol crude oil, yaitu
sebesar 55,54%, kemudian 43,04% jika dihitung terhadap
kontrol MSD I, dan paling rendah jika dihitung terhadap
kontrol MSD II, yaitu 18,52%. Hal ini membuktikan bahwa
isolat III yang diisolasi dengan menggunakan MSD II dapat
meneruskan degradasi fraksi di dalam crude oil yang tidak
didegradasi oleh isolat-isolat tahap sebelumnya. Senyawa
tersebut diduga merupakan senyawa yang tahan terhadap
degradasi, seperti senyawa yang memilki percabangan dan
struktur cincin, seperti sikloalkana dan aromatik. Hanya
sedikit mikroba yang dapat mendegradasi hidrokarbon yang
memilki percanagan atau strukltur cincin. Hal ini disebabkan
oleh senyawa hidrokarbon yang memiliki struktur seperti itu
sukar untuk masuk ke dalam sel (Atlas, 1981).
Urutan persentase degradasi crude oil secara bertahap
dirangkum pada histogram Gambar-12. Persentase degradasi
crude oil memiliki urutan dari yang paling kecil ke yang
paling besar, sesuai dengan tahapan isolasi bakteri, mulai dari
kontrol crude oil yang tidak didegradasi oleh bakteri, isolat
tahap I, isolat tahap II, dan isolat tahap III. Urutan tersebut
menunjukkan bahwa degradasi yang dilakukan secara
bertahap menghasilkan hasil akhir degradasi yang lebih besar
dibandingkan dengan jika degradasi itu dilakukan oleh isolat
tahap I saja, yang diperoleh melalui prosedur isolasi biasa
(Harayama, 1997).
4. KESIMPULAN
Isolat bakteri yang diperoleh dari minyak sumur Bangko
secara bertahap dengan menggunakan medium SMSSe (Stone
Mineral Salt Sollution yang mengandung 0,01% ekstrak ragi)
pada temperatur 50
o
C adalah Bacillus polymyxa, B.
licheniformis, Bacillus sp.1 dan Pseudomonas aeruginosa
dari tahap I; Bacillus sp.2, B. stearothermophllus dan B.
brevis dari tahap II; dan B. coagulans dari tahap III.
Isolat bakteri yang diperoleh secara bertahap dapat
mendegradasi crude oil secara bertahap pula sesuai dengan
urutan tahap isolasinya, dilihat dari pertumbuhan isolat-isolat
bakteri dan persentase degradasi secara gravimetri. Hasil
degradasi oleh kultur campur tahap I, II, dan III secara
berturut-turut yaitu sebesar 12,5%, 37,03% dan 55,54%.
Isolasi Bertahap Bakteri Pendegradasi Minyak Bumi Dari Sumur Bangko Pingkan Aditiawati, Megga RPikoli, Dea Indriani
IATMI 2001-59
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada URGE dan Center
Grant Departemen Biologi ITB 1997/1998 atas bantuan biaya
penelitian
DAFTAR PUSTAKA
1. Atlas, R.M. (1981) Microbial degradation of petroleum
hydrocarbons : an environmental perspective,
Microbiological Reviews, 45(1), 180-209.
2. Buchanan, R.E. & Gibbons, N.E. (1974) Bergeys Manual
of Determinative Bacteriology, The William and Wilkins
Co., Baltimore, page 529-550.
3. Bushell, M.E. and Slater, J.H. (1981) Mixed Culture
Fermentation, Academic Press, 1-20.
4. Capuccino, J.G. and Sherman N. (1987) Microbiology: A
Laboratory Manual, The Benjamin/ Cummings
Publishing Co. ,Inc., California, page 19-179.
5. Fedorak, P.M., Foght, J.M., and Westlake, D.W.S. (1983)
Comparative studies on microbial degradation of
aromatics and saturates in crude oil dalam Zajic et al.
(eds), Microbial Enhanced Oil Recovery. PenWell
Publishing Co., Oklahoma, 162-171.
6. Harayama, S., Sigiura K., Asaumi M., Shimauchi T., Goto
M., Sasaki S. and Ishihara M. (1995) Biodegradation of
Crude Oil, dalam Program and Abstratcs in the First
Asia-Pasific Marine Biotechnology Conference, Shimizu,
Shizuoka, Japan, page 19-24.
7. Horowitz, A., Gutnick D. and Rosenberg E. (1975)
Sequential Growth of Bacteria on Crude Oil, Applied
Microbiology 30(1), 10-19
8. Jobson, A., Cook, F.D., Westlake, D.W.S. (1972)
Microbial utilization of crude oil, Appl. Microbiol., 23(6),
1082-1089.
9. Leahy, J.G. and Colwell, R.R. (1990) Microbial
degradation of hydrocarbons in the environment,
Microbiological Reviews, 54(3), 305-315.
10. Neumann, H.J., Paczynska-Lahme, B., dan Severin, D.
(1981) Composition and Properties of Petroleum. Halsted
Press. New York. 1-10, 121-126.
11. Sharpley, J.M. (1966) Elementary Petroleum
Microbiology, Gulf Publishing Company, Texas, page 65-
95, 115-117.
12. Sigiura, K., Ishihara M., Shimauchi T. and Harayama S.
(1997) Physicochemical Properties and Biodegradability
of Crude Oil, Environ. Sci. Technol 31, 45-51
13. Walker, J.D. and R.R. Colwell (1974) Microbial
Petroleum Degradation: Use of Mixed Hydrocarbon
Substrates, Appl. Microbiol 27(6), 1053-1060.
Tabel-1
Karakteristik Koloni Isolat Bakteri
Isolat Bentuk Tepi Elevasi Warna Permukaan
I-1 Irregular Lobate Raised Kuning Kasar
I-2 Irregular Lobate Raised Kuning Kasar
I-3 Circular Entire Pulvinate Bening Mengkilap
I-4 Circular Serrate Flat Hijau Kasar
II-1 Circular Undulate Raised Putih Mengkilap
II-2 Circular Undulate Convex Putih Mengkilap
II-3 Irregular Lobate Raised Krem Kasar
III Circular Entire Convex
Coklat
muda
Mengkilap
Keterangan : Koloni yang diamati adalah koloni yang ditumbuhkan
pada agar nutrisi pada temperatur 40C selama 24 jam..
Tabel-2
Karakteristik Sel Isolat Bakteri
Isola
t
Bentuk
Panjang
(m)
Gram
Letak
endospora
Bentuk
endospora
I-1 Batang 2 2.5 Positif Terminal Elips
I-2 Batang 1,5 2,3 Positif Sentral Elips
I-3 Batang 3 Negatif Terminal Elips
I-4
Batang
pendek
0,5 1 Negatif Tidak ada
II-1 Batang 2 2,5 Positif Sentral Elips-bulat
II-2 Batang 3 Positif Terminal Elips
II-3 Batang 1,5 2,3 Positif Subterminal Elips-bulat
III Batang 2 2,5 Positif Terminal Elips
Keterangan : Sel yang diwarnai berumur 24 jam; terminal = di ujung
sel; subterminal = di antara ujung dan tengah sel; sentral = di tengah
sel; elips = bulat telur.
Tabel-4
Jumlah sel maksimum dan laju pertumbuhan spesifik isolat-
isolat tahap II dalam kultur tunggal dan kultur campur pada
medium SMSSe yang mengandung crude oil atau MSD I
Kultur Isolat medium Jumlah sel
maks (sel/mL)
Laju
(/jam)
c.oil 2,94 x 10
8
0,069 II-1
MSD I 2,73 x 10
10
0,122
c.oil 2,04 x 10
7
0,047 II-2
MSD I 2,56 x 10
8
0,073
c.oil 1,06 x 10
9
0,135
Tunggal
II-3
MSD I 1,28 x 10
10
0,174
c.oil 2,86 x 10
6
0,043 II-1
MSD I 2,37 x 10
7
0,049
c.oil 2,55 x 10
9
0,211 II-2
MSD I 9,05 x 10
8
0,183
c.oil 4,17 x 10
7
0,097
Campur
II-3
MSD I 1,19 x 10
8
0,096
Isolasi Bertahap Bakteri Pendegradasi Minyak Bumi Dari Sumur Bangko Pingkan Aditiawati, Megga RPikoli, Dea Indriani
IATMI 2001-59
Tabel-3
Hasil uji-uji biokimia pada isolat bakteri
Isolat-isolat bakteri hasil isolasi pada temperatur 50C Uji Biokimia
I-1 I-2 I-3 I-4 II-1 II-2 II-3 III
Glukosa + + + _ _ + _ +
Laktosa + + + _ _ + _ +
Dekstrosa _ _ _ _ _ _ _ _
Pati + + + _ + + _ +
Lemak + + _ + _ _ + _
Kasein + + _ + _ _ + _
Gelatin _ + _ + + _ _ +
TSIA Asam Asam Asam Alkali Alkali Asam Alkali Asam
Indol _ _ _ _ _ _ _ _
MR _ + _ _ _ _ _ _
VP _ _ _ _ _ _ + _
S. Citrate _ _ _ + _ _ _ _
H
2
S _ _ _ _ _ _ _ _
Motilitas + _ _ + _ + + _
Nitrat + + _ + _ _ + _
Reaksi Litmus Asam Reduksi
litmus
Asam, gas,
reduksi dan
curd
Proteolisis Asam Tidak
berubah
Reduksi
litmus
Asam, gas,
reduksi dan
curd
Keterangan : Temperatur pengujian 40C selama 24-48 jam; + = hasil reaksi positif; - = hasil reaksi negatif sesuai dengan
prosedur uji biokimia secara mikrobiologis (2). Curd = dadih yang terbentuk karena presipitasi kasein di
dalam susu.
Gambar-1.
Bagan prosedur isolasi bakteri secara bertahap
dari minyak bumi
Gambar-2
Prosedur isolasi dan pemurnian bakteri tahap I, II, dan III
Crude oil
ISOLASI TAHAP I Isolat Tahap
I
Degradasi crude oil oleh Isolat Tahap
I
Minyak Sisa Degradasi Tahap I (MSD
I)
Degradasi MSD I oleh Isolat Tahap II
Minyak Sisa Degradasi Tahap II (MSD
II)
Isolat Tahap III
Isolat Tahap
II
Crude oil
Crude oil
ISOLASI TAHAP
III
ISOLASI TAHAP
II
Isolasi Bertahap Bakteri Pendegradasi Minyak Bumi Dari Sumur Bangko Pingkan Aditiawati, Megga RPikoli, Dea Indriani
IATMI 2001-59
Gambar-3
Prosedur aktivasi isolat bakteri
Gambar-4
Kurva pertumbuhan isolat-isolat tunggal tahap I
dalam crude oil
Gambar-5
Kurva pertumbuhan kultur campur tahap I dalam crude oil
Gambar-6
Jumlah sel maksimum isolat-isolat tahap I dalam crude oil
Gambar-7
Laju pertumbuhan spesifik isolat-isolat tahap I
dalam crude oil
Gambar -8
Jumlah sel maksimum isolat tahap III
Gambar-9
Persentase degradasi crude oil
yang diukur secara gravimetri
Gambar-10
Persentase degradasi MSD I yang diukur secara gravimetri
6
7
8
9
10
0 12 24 36 48 60 72
Waktu (jam)
l
o
g

j
u
m
l
a
h

s
e
l
/
m
L
I-1
I-2
I-3
I-4
6
8
1 0
1 2
1 4
1 6
0 1 2 2 4 3 6 4 8 6 0 7 2
Wakt u ( j am)
l
o
g

j
u
m
l
a
h

s
e
l
/
m
L
I-1
I-2
I-3
I-4
6
7
8
9
1 0
1 1
1 2
1 3
1 4
I-1 I-2 I-3 I-4
Isol at
l
o
g

j
u
m
l
a
h

s
e
l
/
m
L
k.tunggal
k. campur
9,75
13,95
10,63
16,42
25,58
9,67
5,67
16,17
4,92
12,5
6,67
0
5
10
15
20
25
30
K I-1 I-2 I-3 I-4 II-1 II-2 II-3 III C-I C-II
Kultur dalam "crude oil"
%

d
e
g
r
a
d
a
s
i

"
c
r
u
d
e

o
i
l
"
5, 25
16, 12
19, 92
30, 75
24, 52
9, 37 9, 75
28, 62
32, 4
43, 25
37, 03
21, 87
0
10
20
30
40
50
K II-1 II-2 II-3 C III
Kultur dalam "crude oil"
%

d
e
g
r
a
d
a
s
i

M
S
D

I
Terhadap kont rol MSD I Ter hadap kont r ol c. o
Agar SMSSe
& c.oil/MSD
5 mL SMSSe
& c.oil/MSD
inkubasi 3 hr
5 mL SMSSe
& c.oil/MSD
kocok 24 jam
40 mL SMSSe
& c.oil/MSD
kocok 24 jam
Aktivasi I Aktivasi III Aktivasi II
1 ose 5 mL
(semua)
10 mL
(semua)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
I-1 I-2 I-3 I-4
Isolat
L
a
j
u

p
e
r
t
u
m
b
u
h
a
n

(
/
j
a
m
)
k.tunggal
k.campur
5
6
7
8
9
c.o MSD I MSD II
Minyak bumi
l
o
g

j
u
m
l
a
h

s
e
l
/
m
L
Isolasi Bertahap Bakteri Pendegradasi Minyak Bumi Dari Sumur Bangko Pingkan Aditiawati, Megga RPikoli, Dea Indriani
IATMI 2001-59
Gambar -11
Persentase degradasi MSD II oleh isolat tahap III
yang diukur secara gravimetri
Gambar-12
Persentase degradasi crude oil secara bertahap
yang diukur secara gravimetri
0, 85
5, 25
9, 75
18, 52
43, 04
55, 54
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
MSD II MSD I c.o
MSD III terhadap berbagai kontrol
%

d
e
g
r
a
d
a
s
i

M
S
D

I
I
Kont r ol III
9,75
12,5
37,03
55,54
0
10
20
30
40
50
60
K (c.o) Tahap I Tahap II Tahap III
%

d
e
g
r
a
d
a
s
i

"
c
r
u
d
e

o
i
l
"