SISTEMAS EXPERIMENTALES INTRODUCCIN La utilizacin de la reaccin in vitro entre antgenos y anticuerpos sricos (serologa) sirve de base para muchos ensayos inmunes. Debido a la notable especificidad de la respuesta inmune, la interaccin entre antgeno y anticuerpo in vitro se utiliza ampliamente con propsitos diagnsticos, para la deteccin bien sea de antgenos o de anticuerpos. Ejemplo serotipificacin de diversos microorganismos utilizando antisueros especficos. La interaccin de antgenos multivalentes con anticuerpos con al menos sitios de combinacin por molcula, que generan ligamiento cruzado (ver Figura), puede resultar en: - precipitacin (si el antgeno es soluble) - aglutinacin (si el antgeno es particulado) - activacin del complemento Se utilizan otros ensayos inmunes en la evaluacin y el estudio de los componentes celulares del sistema inmune, como son: - mtodos de rutina para medir la funcin linfocitaria (mtodos para medir la inmunocompetencia humoral y de clulas T). - sistemas de cultivo celular - tcnicas de ADN recombinante 1. Interacciones Primarias Entre Antgeno y Anticuerpo Las fuerzas de unin entre un anticuerpo y un eptope son por enlaces no-covalentes y por tanto relativamente dbiles. Involucran fuerzas de van der Waals, electrostticas e hidrofbicas. Los complejos antgeno-anticuerpo se pueden disociar fcilmente por: - Cambio de pH - Concentraciones salinas altas - iones caotrpicos (cianatos que interfieren con los puentes de hidrgeno de las molculas de agua) 1.1 Constante de Asociacin, Afinidad y Avidez Es una medida de afinidad de un anticuerpo monovalente por un eptope del antgeno o un hapteno. La afinidad de unin de un anticuerpo anti-A con un antgeno multivalente A puede ser varias veces mayor que la afinidad con un antgeno univalente A (ver Figura). La asociacin entre un antgeno y anticuerpos depende de: - la afinidad de cada eptope y su anticuerpo correspondiente - la suma de las afinidades de todos los eptopes involucrados.
El termino avidez se utiliza para denotar la energa de unin promedio entre anticuerpos y un antgeno multivalente. En general, anticuerpos IgM tienen mayor avidez que anticuerpos IgG, aunque la unin de cada Fab en el anticuerpo IgM puede tener la misma afinidad que el Fab de un IgG. 2. Interacciones Secundarias entre Antgeno y Anticuerpo 2.1 Reacciones de Aglutinacin La reaccin de un anticuerpo con un antgeno multivalente que es particulado (ejemplo, una partcula insoluble) resulta en el ligamiento cruzado de varias partculas antgenos por los anticuerpos. El ligamiento cruzado resulta eventualmente en la aglutinacin de los antgenos por los anticuerpos. Aglutinacin 2.1.1 Ttulo. El ensayo de aglutinacin. - es un mtodo que algunas veces se utiliza para medir el nivel de un anticuerpo srico especifico para un antgeno particulado. - El ttulo aglutinante de un suero determinado es una expresin semicuantitativa de los anticuerpos presentes en el suero. - se realiza mezclando diluciones sricas con una concentracin fija de antgeno. Diluciones altas no causan aglutinacin del antgeno. La dilucin ms alta de un suero que alcanza aglutinacin visible del antgeno se denomina ttulo.
Tubos con altas concentraciones de suero que no causan aglutinacin representan una prozona. Por qu no aglutina? por exceso de anticuerpos, cada eptope de una partcula se une nicamente a una sola molcula de anticuerpo, por lo que se previene el ligamiento cruzado entre diferentes partculas. Debido al fenmeno de prozona es imperativo que el antisuero se pruebe en diferentes diluciones. 2.1.2 Potencial Zeta. Ciertos antgenos partculados pueden poseer una carga elctrica, ejemplo, carga neta negativa de eritrocitos debido al cido silico. Partculas cargadas suspendidas en solucin salina generan un potencial elctrico llamado potencial zeta, que impide estn muy cerca la una de la otra. Debido al potencial zeta, anticuerpos con brazos Fab cortos (IgG) puede que no aglutinen antgenos, mientras que anticuerpos como IgM con Fab ms largos y pentavalentes si lo pueden hacer. Cmo aglutinar antgenos de eritrocitos con anticuerpos IgG? 2.1.3 El Test de Coombs El termino denota, la deteccin usando anti- inmunoglobulinas, de cualquier Ig unida a un antgeno - Emplea anticuerpos contra inmunoglobulinas (por eso tambin se llama el test anti-inmunoglobulina). - Se basa en dos hechos importantes: i) inmunoglobulinas de una especie son inmunognicas cuando se inyectan en otra especie ii) muchas de las anti-inmunoglobulinas (ejemplo, IgG de conejo anti-humano) se unen a la porcin Fc del anticuerpo, dejando libre las porciones Fab para que reaccionen con el antgeno. Cuando se utiliza por ejemplo, IgG humano contra antgenos de eritrocitos exhibiendo potencial zeta no hay aglutinacin, pero al adicionar IgG de conejo contra IgG humano ste se une a Fc y puede hacer ligamiento cruzado de IgG humanos sobre eritrocitos relativamente distantes (ver Figura). Incluso la adicin de anti-inmunoglobulina puede causar aglutinacin en caso de concentracin alta de anticuerpos dirigidos contra eritrocitos (fenmeno de prozona). Hay dos versiones del Test de Coombs. 1. Test directo. Detecta anticuerpos unidos. - se adicionan anti-inmunoglbulinas a las partculas (ejemplo, eritrocitos) que se sospecha tienen anticuerpos unidos a antgenos sobre sus superficies. - Ejemplo: recin nacido con sospecha de enfermedad hemoltica. Si el Test de Coombs utilizando una suspensin con eritrocitos de un beb aglutina significa que presenta la enfermedad. 2. Test indirecto. Detecta anticuerpos en suero. - se utiliza para detectar la presencia, en el suero, de anticuerpos especficos contra antgenos particulados. - anticuerpos sricos si se adicionan a partculas puede que no las aglutinen debido al potencial zeta. La adicin subsiguiente de anti-Ig causar aglutinacin. - Ejemplo: deteccin de anticuerpos IgG anti-Rh en la sangre de mujeres Rh-negativas. 2.1.4 Aglutinacin Pasiva. Si el antgeno es un constituyente natural de una partcula, la reaccin de aglutinacin se conoce como aglutinacin directa. Si la reaccin de aglutinacin ocurre entre anticuerpos y antgenos solubles que se han adherido a una partcula insoluble, se conoce como aglutinacin pasiva. La reaccin de aglutinacin (directa o pasiva, sin o con el Test de Coombs) se utiliza ampliamente en clnica. Ejemplos: - tipificacin de eritrocitos en bancos de sangre - diagnstico de diversas enfermedades hemolticas mediadas inmunolgicamente (anemia auto-hemoltica inducida por droga) - tests para el factor reumatoide (IgM humana contra IgG humana) - test confirmatorio para sfilis - test ltex de embarazo (deteccin de HCG en la orina de una mujer embarazada) ENSAYOS DE AGLUTINACIN Hemaglutinacin de Isoantgenos En la tipificacin sangunea, los anticuerpos se adicionan a clulas sanguneas rojas dando una reaccin positiva cuando se amontonan las clulas o "hemaglutinacin". Los reactivos se preparan en una solucin coloreada para observar ms facilmente los agregados RBC. De la misma manera, en un suero de paciente, se le puede probar al anticuerpo, la capacidad de generar hemaglutinacin de RBCs debido a la presencia del anticuerpo que reconoce isoantgenos que no estn presentes en los RBCs del propio paciente. - Personas con el tipo de sangre A tienen anticuerpos anti-B; -Personas con el tipo de sangre B tienen anticuerpos anti-A; - Personas con el tipo de sangre O tienen anticuerpos anti-A y anti-B; - Personas con el tipo de sangre AB no tienen anticuerpos que reconozcan ningn isoantgeno. Por tanto, la prueba es un mtodo rpido para determinar si un paciete tiene niveles normales de anticuerpos tpicos basados en el tipo de sangre sanguneo Prueba de Aglutinacin en Ltex El test de aglutinacin en ltex es uno de los diversos tipos de aglutinacin por anticuerpos que detectan antgenos en una muestra utilizando anticuerpos unidos a una cama u otro material visible. Detecta la presencia de antgenos bacterianos que estn presentes como reactivos en el sistema, unidos a la superficie de camas azules de ltex. Una reaccin positiva causa la agrupacin de las camas. Las camas agrupadas se pueden ver a simple vista. Una reaccin negativa deja las camas de ltex en solucin y de aspecto azul lechoso. 2.2 Reacciones de Precipitacin 2.2.1 Reacciones en soluciones. Ocurren cuando se mezclan anticuerpos y antgenos solubles. La precipitacin de complejos antgeno- anticuerpo ocurre debido a que anticuerpos divalentes cruzan ligadamente antgenos multivalentes formando un enrejado, que cuando alcanza un determinado tamao precipita (reaccin de precipitina). Precipitacin Una reaccin de precipitacin ocurre como resultado de la combinacin de anticuerpos en solucin con sustancias solubles con las que los anticuerpos reaccionan. Si ocurre in vivo una reaccin de precipitacin en las articulaciones o en el rin, ocasiona inflamacin debido a que los complejos inmunes en esas reas son filtrados hacia afuera causando irritacin.
Precipitacin (continuacin) En un test de precipitina srica, se combinan las diluciones del antgeno el anticuerpo en solucin acuosa hasta que ocurre una reaccin de precipitacion y particulas visibles se acumulan. Con un nefelometro se puede medir la cantidad de "flocculation, midiendo las propiedades de dispersin de la luz de particulas en agregacin. La prueba "Gold Standard" para la sfilis tiene como base una reaccin inmunolgica de floculacin.
Precipitacin en Solucin
Es dificil de lograr la Zona de Equivalencia precisa donde hay una concentracin perfecta tanto de antgeno como de anticuerpo en solucin. Se requeriran preparar muchos tubos con diversas concentraciones de anticuerpos y antgenos para lograr justo la cantidad apropiada. nicamente despus de la centrifugacin el anillo delgado se hace ms visible. En la prctica, las reacciones de precipitacin se preparan generalmente, como reacciones de difusin en agar, para hacer ms visible el precipitado. Inmunodifusin en Geles de Agar Se utiliza un gel de agarosa como matrix para combinar difusin con precipitacin. Los reactivos difunden a travs del gel resultando en precipitacin cuando se alcanzan los puntos de equivalencia. Un solo antgeno puede dar lugar a una sola lnea de precipitacin en la presencia de su anticuerpo homlogo. Cuando hay dos antgenos presentes en un sistema, cada uno se comporta independientemente. Por lo tanto, si se detectan varias bandas de precipitacin, equivalen al menos a un nmero igual de combinaciones antgeno-anticuerpo. Los anticuerpos sricos no son homogneos(uno tiene anticuerpos que reconocen todo tipo de organismos infecciosos y de alergnos). Es dificil obtener un solo antgeno aun en las preparaciones ms puras, de modo que hay diversas reacciones posibles antgeno-anticuerpo en una sola mezcla. La difusin en gel permite examinar dichos sistemas mltiples debido a que la tcnica permite la separacin de las reacciones. Como los componentes individuales en un sistema reaccionan independientemente, los tests de precipitacin en agar se denominan "inmunodifusin doble " o simplemente inmunodifusin (anteriormente se denominaba de Ouchterlon). El color blanco espeso de la matrix slida de agar permite visualizar la reaccin de precipitacin. El mtodo se utiliza clinicamente en inmunologa/reumatologa. Esta tcnica tiene diversas y diferentes aplicaciones; ejemplos incluyen: - Determinacin de la homogeneidad de sistemas antgeno-anticuerpo. - Diagnosticar enfermedades autoinmunes especificas. - Despus de la purificacin de una mezcla de antgenos. - Elucidar las reacciones entre antgenos relacionados serolgicamente.
La precipitacin aparece como una lnea continua en la forma de un ngulo entre los dos pozos y el pozo 3. Esta banda sin ninguna proyeccin en el angulo se denomina banda de identidad. Si se coloca en el pozo 1 una solucin con antgenos X y Y, en el pozo 2 una solucin con solo antgeno X, y en el pozo 3 antisuero con anticuerpos especificos tanto para X como para Y, se observa una reaccin similar a la de la Fig. Note que hay una proyeccin de reaccin hacia el pozo XY, lo que indica que estn relacionados los dos materiales antignicos de los pozos 1 y 2, pero que el material en el pozo 1 posee una especificidad antignica que no posee el material en el pozo 2. esto indica una identidad parcial. Si el material en los pozos 1 y 2 no poseen antgenos en comn y el antisuero en el pozo 3 posee especificidades para ambos materiales, la reaccin aparece como dos lneas que se cruzan. Inmunoelectroforesis (IEP) La (IEP) es un procedimiento que combina la separacin de antgenos por electroforesis de zona con la difusion de anticuerpos precipitantes en angulos rectos hacia la direccin de la migracin del antgeno. La extensin de la migracin de cualquier protena depende del buffer de electroforesis, tiempo, voltaje, y punto isoelctrico de la protena. En especial, el pH determina la separacin de una protena de otra. La diferencia neta entre el punto isoelctrico de una determinada protena y el pH del buffer de electroforesis determina la extensin de la migracin hacia el catodo o el anodo. Este mtodo inmunolgico se utiliza para detectar anormalidades en protenas sricas especificas y para identificar inmunoglobulinas especificas utilizando reactivos anticuerpos anti- humanos. Los reactivos anticuerpos anti-humanos se han preparado contra fracciones purificadas de globulinas humanas y se obtienen comercialmente para propsitos de investigacin o biomdicos.
WESTERN BLOT RADIOINMUNOENSAYO ELISA CLASIFICADOR DE CELULAS ACTIVADO POR FLUORESCENCIA Anticuerpos Monoclonales Mtodo de Inmunofluorescencia Su propsito es detectar la localizacin y la abundancia relativa de cualquier protena para la cual se tiene un anticuerpo. Utilizando anticuerpos para la protena, puede conocer donde esa protena se localiza. Por ejemplo, si va a utilizar anticuerpos para la bomba calcio ATPasa, que se localiza en el reticulo endoplasmtico de la clula debe tener presente: - que el anticuerpo utilizado reconoce la calcio ATPasa de gallina. - la inmunofluorescencia se puede utilizar para cualquier protena.
La clave para ste mtodo es la habilidad para visualizar el anticuerpo cuando se mira a travs de un microscopio. Como los anticuerpos son ms pequeos que las calcio ATPasas, el anticuerpo no se puede ver directamente. Por lo que se usa un marcador fluorescente unido covalentemente al anticuerpo. Cuando una luz ilumina el marcador fluorecente, este absorve la luz y emite una luz de color diferente que es visible para el investigador y se puede fotografiar. Figure. Illustration of the direct and indirect methods for immunofluorescence. Figura. In most immunofluorescence experiments, two antibodies are employed. The first one, called the primary antibody, is typically generated in a mouse and binds to your favorite protein, which in this case is the chicken calcium ATPase (shown as a series undulating striped line that zigzags through the ER membrane 10 times). The secondary antibody was purchased from a company that sells antibodies that bind to mouse antibodies and have a fluorescent dye covalently attached to it. As illustrated here, the secondary antibodies can bind to multiple sites on the primary antibody and thus produce a brighter signal since more dyes are brought to a single location. Figura. This immunofluorescence micrograph shows the ER being labeled with a monoclonal antibody against the chicken calcium ATPase. This chicken cell was fixed, permeablilized, and processed for immunofluorescence. White indicates the location of the fluorescent antibody and thus the calcium ATPase to which the antibody was bound. Immunofluorescence image of the eukaryotic cytoskeleton. Actin filaments are shown in red, microtubules in green, and the nuclei in blue. Immunofluorescence - Axons of the Drosophila CNS antibody [BP102] (ab12455)
RATONES TRANSGNICOS Genes responsible for particular traits or disease susceptibility are chosen and extracted. Next they are injected into fertilized mouse eggs. Embryos are implanted in the uterus of a surrogate mother. The selected genes will be expressed by some of the offspring. Since the first gene transfers into mice were successfully executed in 1980, transgenic mice have allowed researchers to observe experimentally what happens to an entire organism during the progression of a disease. Transgenic mice have become models for studying human diseases and their treatments. The image shows transgenic mice that carry the piggyBac transposon that has caused their cells to express red fluorescent protein. (Credit: Howard Hughes Medical Institute (HHMI), Yale University). Transgenic mouse lines expressing GFP, known as "green mice." FEBS Lett, 407, 313-9 (1997) RATONES KNOCKOUT N2KO mice created by the PI in 1997, that contain a targeted deletion of the Nhlh2 transcription factor (Good et al, 1997). These animals develop an adult onset overweight phenotype, characterized by increased body weight and body fat after 7 (females) to 12 (males) weeks of age. Weight gain is not due to increased food intake but due, rather, to failure to partake in high levels of physical activity. Thus, failure to exercise leads to adult- onset obesity in N2KO mice (Coyle et al., 2002). This problem extends directly to humans, as being overweight is a worldwide problem that affects nearly 60% of the U.S. adult population, due in part to sedentary lifestyles.