1

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Jenis Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan menguji objek
penelitian yaitu ekstrak daun salam dengan tiga macam pelarut yaitu etanol, etil
asetat, dan n-heksana dalam berbagai konsentrasi untuk mendapatkan diameter
zona hambat dan konsentrasi hambatan minimum.

3.2. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan Laboratorium Mikrobiologi, UPTD Balai
Laboratorium Kesehatan Propinsi Lampung Jalan Dr. Sam Ratulangi No 103
Penengahan Bandar Lampung pada bulan Januari 2013.

3.3. Objek penelitian
Objek penelitian digunakan dalam penelitian ini adalah Daun salam.
3.4. Besar Sampel
Penelitian ini dilakukan dengan 5 kelompok konsentrasi dari tiap peralut
(12,5%, 15%, 17,5%, 20%, dan 22,5%). Banyaknya jumlah pengulangan
ditentukan menggunakan rumus federer:




( )( )
2

Keterangan :
n : banyak pengulangan
k : banyak perlakuan
Penelitian menggunakan enam kelompok yaitu satu kelompok kontrol dan
lima kelompok perlakuan sehingga :
diketahui : k =5
(n- 1) (5-1)
(n-1) 4
4n-4
4n +4
4n 19
n 4,7
Maka diperoleh nilai n 4,75 dibulatkan menjadi 5, dengan perlakuan antara lain:
K
1
= Disc blank yang diberi aquadest steril sebagai kontrol positif (+)
K
2
= Disc blank yang diberi bahan uji ekstrak bawang bombai dengan
konsentrasi 12,5%
K
3
= Disc blank yang diberi bahan uji ekstrak bawang bombai dengan
konsentrasi 15%
K
4
= Disc blank yang diberi bahan uji ekstrak bawang bombai dengan
konsentrasi 17,5%

K
5
= Disc blank yang diberi bahan uji ekstrak bawang bombai dengan
konsentrasi 20%
3

K
6
= Disc blank yang diberi bahan uji ekstrak bawang bombai dengan
konsentrasi 22,5%
Berdasarkan perhitungan tersebut, maka jumlah pengulangan minimal
yang diperlukan adalah 5 kali pengulangan.

3.5. Variabel Penelitian
3.5.1. Variabel bebas:
Variabel independent merupakan variabel resiko atau sebab yang
mempengaruhi variabel terikat (variabe dependent).
16
Dalam penelitian ini yang
menjadi variabel independent adalah ekstrak bawang bombai (Allium cepa L.)
dengan konsentrasi 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, dan 22,5% .

3.5.2. Variabel Terikat
Variabel dependent merupakan variabel efek atau akibat yang dipengaruhi
oleh Variabel independent.
16
Dalam penelitian ini yang menjadi variabel
dependent adalah bakteri Staphylococcus aureus.






3.6. Definisi Operasional Penelitian
Tabel 3.1 Definisi Operasional
4

No
.
Variabel Definisi Alat ukur Hasil ukur Skala ukur
1. Ekstrak
Bawang
bombai
(Allium cepa
L.)

Bawang
Bombay
yang telah
diekstrak
dengan
konsentrasi
12,5%, 15%,
17,5%, 20%,
22,5%.
Timbangan Massa bawang
bombai dalam
gram
Rasio
2. Diameter
Zona hambat
perumbuhan
Staphylococc
us aureus
Diameter
yang
terbentuk
karena
adanya daya
antibakteri
dari hasil
ekstrasi
bawang
bombai
(Allium cepa
L.) dengan
pelarut
dalam
berbagai
konsentrasi
terhadap
pertumbuha
n
Staphylococ
cus aureus
Jangka
sorong
Hasil
pengukuran
diameter
dinyatakan
dalam satuan
milimeter
Rasio



3.7. Alat dan Bahan
3.7.1. Alat uji
5

Pinset, sonde, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas ukur,
labu erlenmeyer, bunsen, mikropipet,pipet serologis, jangka sorong, kertas
cakram, jarum ose, botol fial, botol selai, botol hitam, rotavapor, laminar air flow,
penanganan air, timbangan analitik, kulkas. Alat-alat ini disterilisasi dalam
autoclave selama 30 menit.
3.7.2. Bahan Penelitian
3.7.2.1. Bahan Uji
Bahan penelitian adalah bawang bombai (Allium cepa L.) dengan
konsentrasi 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, dan 22,5% aquades, larutan n-heksana,
larutan etil asetat dan larutan metanol, Bawang bombai (Allium cepa L.), aquades,
larutan Mac Farland, Larutan Fisiologis, alkohol, alumunium foil, kapas, kertas
filter whatman.
3.7.2.2. Bakteri Uji
Bakteri uji digunakan adalah biakan murni S. aureus, yang diperoleh dari
Laboratorium Daerah Provinsi Lampung, yang dibiakkan selama 24 jam sebelum
penelitian.


3.7.2.3. Media yang digunakan
6

Media yang digunakan Media Muller Hilton untuk menguji sensitivitas
bawang Bombay ( Allium cepa L.) , aquadest sebagai kontrol.
3.8. Cara Kerja
3.8.1. Persiapan Simplisia
Prosedur kerja persiapan simplisia adalah sebagai berikut:
1. Bawang bombai dikupas dulu lalu dibersihkan dengan air dengan pelarut
yang akan digunakan.
2. Setelah itu bawang bombai ditimbang sebanyak 300 gram.
3. Selanjutnya bawang bombai dihaluskan dengan blender.
3.8.2. Ekstraksi Bawang bombai (Allium cepa L.)
Bawang bombai diperoleh dari pasar Rajabasa, Ekstraksi bawang bombai
(Allium cepa L.) diperoleh dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol, etil
asetat, n-heksana. Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut:
42

1. Simplisia itu dimasukkan dalam bejana yang tidak tembus cahaya.
2. Ditambah pelarut n-heksana sebanyak 1 L.
3. Diendapkan selama 2 hari dan sesekali dikocok.
4. Dihari ketiga, campuran disaring utnuk mendapatkan filtrat.
5. Filtrat pelarut n-heksana dievaporasi untuk mendapatkan ekstrak n-heksana.
6. Ampas sisa dari hasil filtrasi pelarut n-heksana, dilarutkan kembali
menggunakan pelarut etil asetat sebanyak 1 L.
7. Ulangi langkah no. 5 sampai no. 7 pada pelarut etil asetat dan etanol untuk
memperoleh ekstrak etil asetat dan ekstrak etanol.
7

Dari ketiga ekstrak ini akan didapat perbandingan pelarut yang paling
signifikan dalam menghasilkan efek antibakteri dari zat terlarut akan dipilih
sebagai larutan yang digunakan untuk menentukan Konsentrasi Hambat Minimum
(KHM) pada tahapan percobaan selanjutnya.

3.8.3. Pembuatan Agar NA (Nutrient Agar)
43
Agar NA mengandung campuran yang terdiri dari :
NA 1 gram
Aquades 125 ml
Cara Pembuatan:
1. 1 gram NA serbuk dilarutkan dalam 125 ml aquades dalam erlenyemer dan
didihkan diatas penangas sambil terus diaduk.
2. Siapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah.
3. Masukkan agar NA yang telah dipanaskan kedalam tabung reaksi dengan
komposisi 10 ml tiap satu tabung reaksi.
4. Tabung tersebut kemudian distreilisasi dengan menggunakan autoklaf pada
suhu 121
o
C dan tekanan 2 atm selama 15-20 menit.




3.8.4. Pembuatan Suspensi Standar Mc. Farland
44

8

Suspensi Standar Mc. Farland adalah suspensi yang menunjukkan
konsentrasi kekeruhan bakteri sama dengan 10
8
CFU/ml.
Komposisi:
Larutan Asam sulfat 15b/v 9,5 ml
Lartan Barium klorida v/v 0,5 ml
Cara Pembuatan:
Dicampur kedua larutan tersebut dalam tabung reaksi dikocok dan
dihomogenkan. Apabila kekeruhan suspensi bakteri uji adalah sama dengan
kekeruhan suspensi standar berarti konsentrasi suspensi bakteri adalah 10
8

CFU/ml

3.8.5. Pembuatan Biakan Staphylococcus aureus
45
1. Bakteri ditumbuhkan pada agar miring dalam tabung reaksi, kemudian
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C.
2. Bakteri yang telah ditumbuhkan diambil dengan jarum ose steril dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi NaCI 0,9% yang dilarutkan
dengan aquadest 100 ml, yang sebelumnya sudah disterilkan dalam autoclave
selama 15 menit pada suhu 121
o
C tekanan 1 atm, sampai didapatkan kekeruhan
yang disesuaikan dengan standar kekeruhan Mc Farland 0,5 untuk
mendapatkan bakteri sebanyak 10
8
cfu/ml.



3.8.6. Uji Sensitivitas Antibakteri Bawang Bombai (Allium cepa L.)
9

Penentuan uji daya hambat dari ekstrak bawang bombai (Allium cepa L.)
menggunakan metode difusi agar dengan Cakram Kirby-Bauer untuk bakteri
Staphylococcus aureus. Metode difusi untuk bakteri Staphylococcus aureus
dilakukan dengan cara:
37

1. Setelah bakteri Staphylococcus aureus dibiakan dan diinokulasi pada cawan
petri siapkan sediaan ekstrak (n-heksana, etil asetat, dan etanol) dalam botol-
botol fial. Larutkan masing-masing ekstrak dengan konsentrasi 10% sebagai
konsentrasi awal untuk uji aktivitas antibakteri. Lalu larutkan sehingga
menghasilkan konsentrasi 12,5%, 15%, 17,5%, 20%, dan 22,5% .
2. Ekstrak etil asetat bawang bombai (Allium cepa L.) diteteskan pada masing-
masing cakram dengan konsentrasi berturut-turut 12,5%, 15%, 17,5%, 20%,
dan 22,5% sebanyak 10L dan satu cakram lagi sebagai kontrol negatif.
34

3. Kemudian, ke dalam medium yang berisi bakteri ditempatkan enam kertas
cakram pada setiap cawan petri. Sebanyak lima kertas cakram untuk kontrol
negatif. Pemasangan kertas cakram pada cawan petri diatur jaraknya satu
sama lainnya+ 20-25 mm.
4. Semua cawan petri yang telah diletakkan kertas cakram yang berisi ekstrak
bawang bombai lalu di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C.
5. Mengulangi uji sensitivitas antibakteri sebanyak lima kali pengulangan untuk
tiap-tiap konsentrasi dalam masing-masing pelarut.
6. Hitung luas zona hambat yang terbentuk menggunakan jangka sorong.
Setelah disimpan selama 24 jam suhu 37
o
C, diukur diameter hambatan
yang terbentuk. Pengujian aktivitas antibakteri dikatakan positif bila disekitar
10

kertas cakram terdapat zona bening yang bebas dari pertumbuhan bakteri.
Pengukuran dapat dilakukan dengan menggunakan jangka sorong. Cara
pengukuran tampak pada gambar di bawah ini:




Gambar 3.6. Cara Pengukuran Diameter Zona Daya Hambat
Sumber. Anonim
46
Keterangan:
Garis Tebal(1) : Kertas cakram
Garis Tipis(2) : Zona inhibisi yang terbentuk
Pengukuran I (mm) : (A-B)
Pengukuran II(mm) : (C-D)
Pengukuran III(mm) : (E-F)
Zona daya hambat (mm) : ( pengukuran I+II+III/3)

3.9. Cara Pengumpulan Data
Setelah dilakukan penelitian secara laboratorium terhadap materi yang
diujikan dengan uji sensitivitas bawang bombai (Allium cepa L.) terhadap bakteri
Stahphylococcus aureus menggunakan metode difusi agar memakai kertas
cakram, maka dilakukan :
D
E
B
A
F
C
11

a. Diameter zona hambatan (wilayah jernih) diukur dengan cara melewati
tengah kertas cakram dengan satuan milimeter.
b. Menghitung rata-rata diameter zona hambatan untuk setiap konsentrasi
bawang bombai (Allium cepa L.).
c. Analisis data menggunakan RAL (Rancangan Acak Lengkap)
3.10. Alur Penelitian











Gambar 3.7. Alur Penelitian.


Penelusuran kepustaka
Penyusunan proposal
Peninjauan proposal
Persiapan bahan dan alat
Melakukan penelitian
Pengolahan hasil penelitian
Penyajian hasil penelitian
Hasil penelitian