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MANUAL DE
PRCTICAS DE
HISTOTECNOLOGA
En la vejez la ciencia es para nosotros un cmodo refugio; y si no la
plantamos de jvenes, no nos dar sombra cuando seremos viejos.




















2011


Perteneciente a:
..

LIMA - PER
UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL
FACULTAD DE TECNOLOGA MDICA
Escuela de Laboratorio y de Anatoma Patolgica
2
Edicin de la gua de prctica



Cuarta edicin 2011 Profesor Eduardo Sedano Gelvet
Profesor Carlos Neira Montoya


La edicin de la presente gua de prctica, fue posible gracias a la experiencia
acumulada de los docentes y colaboradores durante los ltimos aos.


Asignatura de Histotecnologa
Ao Acadmico 2011

1. Profesor responsable de la asignatura:
Eduardo Eulogio Sedano Gelvet. Categora: Auxiliar. Clase: Tiempo parcial 12
horas.
2. Profesores de la asignatura:
Carlos Ricardo Neira Montoya. Categora: Auxiliar. Clase: Tiempo parcial 12
horas.



Universidad Nacional Federico Villarreal.
Facultad de Tecnologa Mdica.
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE LABORATORIO Y DE ANATOMA
PATOLGICA.
J r. Ro Chepen 290, El Agustino, Lima-Per.
Correo electrnico: esedanog@hotmail.com
cneiram2@hotmail.com



2010 Derechos Reservados.
Prohibida la reproduccin parcial o total sin autorizacin escrita de los autores.



Nuestra constante misin es buscar
nuevas tecnologas,..... nuevas formas de procedimientos.
Y avanzar osadamente, a donde no ha llegado ningn otro.......histotecnlogo
Eduardo Sedano G.
3
CONTENIDO


Prologo Pg. 6

Modificaciones sugeridas Pg. 8

Declogo del estudiante Pg. 9

Test de estilos de aprendizaje Pg. 10

El proceso de estudio Pg. 13

Mapas conceptuales Pg. 15

Formato de desarrollo y de presentacin de un proyecto de
Investigacin Pg. 17

Departamento de patologa del Hospital de Apoyo
Mara Auxiliadora Pg. 21

Laboratorio de procedimientos histolgicos del departamento
de patologa Pg. 23

Factores de riesgo ocupacional en el laboratorio de
procedimientos histolgicos Pg. 33

Medidas generales de seguridad Pg. 34

Clasificacin de materiales peligrosos Pg. 36

Procedimientos a seguir en caso de accidente Pg. 37

Recomendaciones de seguridad en caso de sismo Pg. 38

Un programa de garanta de la calidad Pg. 41

Eleccin de un mtodo histolgico o histoqumico Pg. 42

Mtodos de estudio en histologa Pg. 43

Pasos de las tcnicas microscpicas Pg. 44

Tabla de tejidos y fijadores Pg. 49

Deshidratacin e inclusin en parafina Pg. 50

Obtencin de los cortes Pg. 50

4
Coloracin Pg. 51

Montaje Pg. 53

Recomendaciones tiles Pg. 53

Mtodo de coloracin de hematoxilina y eosina Pg. 55

Reaccin del cido perydico de Schiff (mtodo de P.A.S.) Pg. 57

Reaccin de P.A.S (para demostrar glucgeno) Pg. 60

Mtodo del carmn de Best (modificado por Lillie) Pg. 63
Mtodo del hierro coloidal de Hale (mtodo modificado) Pg. 65

Mtodo del azul alciano (mtodo del alcian blue) Pg. 67

Coloracin metacromtica con azul de toluidina Pg. 69

Observacin metacromtica de glucosaminoglicanos cidos
con azul de toluidina Pg. 69

Mtodo de Feulgen (Feulgen-Rossenbeck) Pg. 70

Mtodo del verde de metilo-pironina (Unna-Pappenhein) Pg. 73

Mtodo del rojo Congo de Bennhold Pg. 75

Mtodo de coloracin con Sudan III o IV Pg. 77

Mtodo de Sudn Black B (Sudan negro) Pg. 79

Mtodo de Perls (azul de Prusia, azul de Berln) Pg. 81

Mtodo de von Kossa Pg. 83

Mtodo de Masson Fontana Pg. 85

Panel de tamizado primario y secundario Pg. 87

Procedimiento del complejo streptavidina-biotina fosfatasa
alcalina (mtodo del H.A.M.A) Pg. 90

Mtodo de coloracin con luxol fast blue para mitocondrias Pg. 96

Mtodo de hematoxilina frrica de Weigert para ergastoplasma Pg. 98

Mtodo de impregnacin argntica directa de Da Fano
para el aparato de Golgi Pg. 99
5

Coloracin de van Gieson para fibras colgenas Pg. 101

Coloracin tricrmica de Masson Pg. 103

Impregnacin argntica de Gomori para de reticulina Pg. 106

Coloracin de Verhoeff para fibras elsticas Pg. 108

Coloracin de Giemsa (modificacin de Wolbach) Pg. 110

Mtodo de Schmorl para demostracin de lagunas y
Canalculos seos Pg. 112

Coloracin de azul de toluidina para colorear sustancia
fundamental de tejido cartilaginoso. Pg. 114

Mtodo de coloracin con luxol fast blue para bandas de mielina Pg. 115

Coloracin de Ziehl-Neelsen para microorganismos
cido-alcohol resistentes. Pg. 117

Coloracin de Wayson para Helicobacter pylori Pg. 119

Impregnacin argntica de Warthin-Starry para
Helicobacter pylori Pg. 120

Impregnacin de nitrato de plata-metanamine de Gomori
(aplicacin de Grocott para hongos) Pg. 122

















6
PROLOGO

Esta gua de prctica de Histoqumica dedicada al estudiante de Tecnologa Mdica
intenta exponer cada mtodo en forma sinttica y a la vez completa, suficiente en
extensin y con la profundidad necesaria.
Presentar, un Test de Estilos de Aprendizaje porqu es preciso tener una idea
de como aprenden los alumnos para poder ayudarlos, luego de una introduccin de lo
que es el Departamento de Patologa y el Laboratorio de Procedimientos Histolgicos del
mismo, las cinco etapas principales de las Tcnicas Histolgicas, que permiten la
obtencin de preparaciones histolgicas permanentes (lminas) para el estudio al
microscopio ptico y, adems, Histoqumica; cada uno de estos dos ltimos tpicos
presentar algunos de los mtodos ms comnmente utilizados en el estudio de clulas y
tejidos. Los principios en que se basan estos mtodos sern explicados sumariamente a
fin de que se puedan evaluar debidamente los resultados con ellos obtenidos.
Como es lgico suponer, lo que se desea es llevar al microscopio una preparacin
en que los tejidos ya sean normales o patolgicos estn perfectamente conservados,
presentando la misma estructura y composicin qumica que posean cuando estaban
vivos. Sin embargo, a pesar de las medidas adoptadas, este ideal no se alcanza,
observndose en todas las preparaciones histolgicas ciertos artefactos consecuentes del
procesado que sufrieron.
Todas las caractersticas que presenta esta gua de prctica han sido elaboradas
acorde con la experiencia acumulada durante 20 aos en la enseanza de pre-grado en
Tcnicas Histolgicas e Histoqumica, as como en la investigacin y en el trabajo diario
realizado en el Laboratorio de Procedimientos Histolgicos del Departamento de
Patologa del Hospital de Apoyo "Mara Auxiliadora"; que sirven para transmitir destrezas
eminentemente prcticas y aplicadas que permitan al alumno: 1) correlacionar el
conocimiento histolgico con los mtodos que permiten su estudio, y 2) el conocimiento de
mtodos que posee actualmente la histologa, para aplicarlos y coadyuvar as, al
diagnstico histopatolgico.
Cabe mencionar, que esta gua de prctica est sujeta a las correcciones sugeridas
por colegas y alumnos.
Por ltimo, que sirvan estas lneas para agradecer a quienes contribuyeron en
nuestro desarrollo en las Tcnicas Histolgicas, Histoqumica y en la docencia, porque
nos ensearon que los conocimientos no tienen barreras profesionales.
A los doctores MARCOS COPAIRA BELTRN y CSAR EDUARDO MONTALVO
ARENAS nuestro eterno agradecimiento.

CARLOS RICARDO NEIRA MONTOYA
EDUARDO EULOGIO SEDANO GELVET

7



























Esta gua de prctica ha tenido modificaciones sugeridas por:
Interno T.M. J UAN AUQUI SULCA
Interno T.M. LUIS CAPCHA
Alumna de Biologa: NANCY ODILE CHANCO APARICIO
Interno T.M. CESAR EDUARDO ROJ AS NARVAEZ
Interno T.M. MOISS SALDAA OREJ N
Interno T.M. LUIS VALLEJ OS SNCHEZ
Interno T.M. J AFFET VARGAS VITTORINO
Alumno de T.M. EDUARDO MANUEL CORNEJ O RUIZ.
Doctor ALFREDO GUILLEN ONEGLIO

En todo tecnlogo mdico ha de haber una primavera de dudas, un verano de
reposo, un otoo de conocimientos y un invierno de sabidura.
Eduardo Sedano Gelvet

8
REGULACIONES

INFORMACION GENERAL
Antes de cada sesin de trabajo se debe leer la gua de prctica y planificar el trabajo
cuidadosamente.
No empezar el trabajo hasta haber recibido las instrucciones. La sesin de trabajo se
iniciar con las instrucciones del profesor de prcticas. Si la informacin del instructor o del
manual no estn claras, realice las preguntas adecuadas.
Anote las observaciones cuando las realice. El examen prctico incluir la informacin que
el profesor de prcticas le brindar, la del manual y la de sus propias observaciones y
conclusiones.
Responda y discuta las preguntas de la gua con su profesor de prctica, estas sern
consideradas en el examen prctico.

REGLAS DEL LABORATORIO
Debe usar un mandil blanco o chaqueta, limpios cuando este en el laboratorio. Este debe
ser lavado por lo menos una vez a la semana utilizando agua caliente y leja. No se permitir
el ingreso o la permanencia de alumnos sin mandil o chaqueta.
Antes de empezar y despus de trabajar limpie la mesa del laboratorio y cada vez que sea
necesario (derrame de material contaminado).
Coloque slo el material indispensable sobre las mesas de laboratorio. No colocar bolsas, ni
mochilas u otro material que no sea del curso.
Nunca utilice la boca para pipetear, el material puede ser txico o infeccioso.
Est PROHIBIDO comer, fumar o aplicarse cosmticos en el laboratorio.
Lvese las manos con agua y jabn antes de retirarse del laboratorio.
Colocar el material usado desechable en envases apropiados al terminar las prcticas,
siendo de responsabilidad del alumno N 1 correspondiente de acuerdo al cronograma.
Algunos de los reactivos con que se trabajan son peligrosos. Use guantes o mascarillas
descartables cuando sea necesario y siga las instrucciones del profesor de prcticas.
Reporte todos los accidentes o derrames, incluso los menores, al instructor. Estos reportes
no sern tomados en cuenta para la nota pero son importantes para tomar medidas de
bioseguridad para todos y evitar la repeticin de los accidentes.

MATERIAL NECESARIO (para todas las prcticas)
El alumno debe contar con el siguiente material para el desarrollo de las prcticas:
Gua de prcticas (obligatorio)
Desinfectantes: Alcohol 70%, fenol al 5%
J abn lquido y toallas de papel
Material de escritorio: Marcador de tinta indeleble, lpiz de cera, caja de colores, papel kraft.
Material de limpieza: detergente, escobillas.
Material de laboratorio: lminas portaobjetos y cubreobjetos, asa de siembra y aguja de
cultivo.
Equipos: microscopio compuesto, estufa, balanza y refrigeradora.
Set de colorantes del mtodo de coloracin de hematoxilina eosina, agua destilada
9
DECLOGO DEL ALUMNO


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Test de Estilos de Aprendizaje
Por favor, rodee con un crculo el nmero (del 1 a 6) que corresponde ms a
cmo usted se ve o cmo se describira usted:


1. Yo me describira como
imparcial (de mentalidad
abierta)


1 2 3 4 5 6

Yo me describira como
explcito (tajante)

2. Yo me describira como
reflexivo


1 2 3 4 5 6

Yo me describira como
orientado a la accin

3. Me gusta permanecer
flexible

1 2 3 4 5 6

Me gusta ser especfico

4. Valoro la paciencia

1 2 3 4 5 6

Valoro lograr hacer cosas

5. Me gusta que las cosas
sean variadas y tengan
colorido


1 2 3 4 5 6

Me gusta que las cosas
sean exactas y precisas

6. Yo me describira como
observador

1 2 3 4 5 6

Yo me describira como
activo

7. Tomo un enfoque creativo e
imaginativo para resolver
problemas


1 2 3 4 5 6


Tomo un enfoque preciso
y calculado para resolver
problemas

8. Me siento bien cuando
entiendo las cosas


1 2 3 4 5 6

Me siento bien cuando
logro un impacto en las
cosas

9. Me gusta permanecer
flexible (no ser tan
especfico)


1 2 3 4 5 6

Me gusta ser lo ms
preciso posible

10.Soy bueno mirando las
cosas bajo diversas
perspectivas


1 2 3 4 5 6

Soy bueno logrando
hacer cosas

11.Yo me describira como
receptivo y complaciente


1 2 3 4 5 6

Yo me describira como
evaluativo y lgico

12.Me gusta mirar lo que pasa
a mi alrededor


1 2 3 4 5 6

Me gusta ver los
resultados de mis
acciones

13.Lucho por ser verstil

1 2 3 4 5 6

Lucho por ser preciso

14.Me considero reservado y
lgico

1 2 3 4 5 6

Estoy preparado para
actuar
11
Instrucciones.- Los items impares miden la dimensin EC/CA (Sentir/Pensar).
Los items pares miden la dimensin EA/OR (Actuar/Observar). Por favor, sume los
items que correspondan a cada dimensin, tal como se indica a continuacin:

EC/CA (Sentir/Pensar)

Item

1

3

5

7

9

11

13

Total

Puntos

















EA/OR (Actuar/Observar)

Item

2

4

6

8

10

12

14

Total

Puntos

















Coloque el Total EC/AC (Sentir/Pensar) en el eje vertical de la figura a
continuacin. Despus coloque el Total EA/OR (Actuar/Observar) en el eje horizontal.
Luego, coloque una cruz en el lugar de interseccin de los dos puntajes. Esta cruz
reflejar su modo adaptativo.
EC
- 7
8-
- 9
10- -
- 11
ABEJ A 12- - DELF N
- 13
14- -
- 15
16- -
- 17
18- -
- 19
20- -
- 21
22-
EA - 23 OR
42 40 38 36 34 32 30 28 26 22 20 18 16 14 12 10 8
41 39 37 35 33 31 29 27 23 21 19 17 15 13 11 9 7
- 26
27 -
- 28
29 -
- 30
31 -
- 32
33 -
- 34
35 -
- 36
CASTOR 37 - BHO
- 38
39 -
- 40
41 -
- 42
CA
12
El di agr ama a cont i nuaci n seal a l as f uer zas y debi l i dades
de cada est i l o de apr endi zaj e con not as par a mej or ar

Exper i enci a concr et a
Acomodador (Abeja) ( Sent i r ) Divergente (Delfn

)
Fuer zas: Logr ar hacer l as cosas Fuer zas: Habi l i dades i magi nat i vas.
Li der azgo Compr ender a l a gent e.
Toma de r i esgos Reconocer pr obl emas.
Tor ment a de i deas.
Debi l i dades: Mej or as t r i vi al es. Debi l i dades: Par al i zado por l as
Act i vi dad si n sent i do. al t er nat i vas.
No puede t omar
deci si ones.

Rasgos t pi cos: Tr abaj o t er mi nado a Rasgos t pi cos: Tener i deas.
t i empo. Reconocer pr obl emas y
Pl anes pr ct i cos. opor t uni dades.
Di r i gi do a met as.

Par a desar r ol l ar sus habi l i dades Par a desar r ol l ar sus habi l i dades
de
de apr endi zaj e acomodador , pr act i que: apr endi zaj e di ver gent e, pr act i que:
*Compr omet er se con obj et i vos. *Ser sensi bl e a l os sent i mi ent os de
*Buscar nuevas opor t uni dades. l a gent e.
*I nf l ui r y di r i gi r a ot r os. *Ser sensi bl e a val or es.
*I nvol ucr ar se en f or ma per sonal . *Escuchar con ment e abi er t a.
*Tr at ar a gent e. *Reuni r i nf or maci n.
*I magi nar se l as i mpl i caci ones de
si t uaci ones i nci er t as.

Exper i ment aci n Obser vaci n
Act i va ( Act uar ) Ref l exi va ( Obser var )

Convergente (Castor) Asimilador (Bho

)
Fuer zas: Sol uci n de pr obl emas. Fuer zas: Pl ani f i caci n.
Tomar deci si ones. Cr eaci n de model os.
Razonami ent o deduct i vo. Def i ni r pr obl emas.
Def i ni r pr obl emas. Desar r ol l o de t eor as.

Debi l i dades: Resol ver el pr obl ema Debi l i dades: Cast i l l os en el ai r e.
er r neo. Fal t a de apl i caci ones
Deci si ones apr esur adas. pr ct i cas.

Rasgos t pi cos: Pr esenci a de f oco. Rasgos t pi cos: Capaz de apr ender
Pr obar l as i deas. de l os er r or es.
Pensami ent os cent r ados Base sl i da par a el
t r abaj o.
Enf oque si st emt i co.

Par a desar r ol l ar sus habi l i dades de Par a desar r ol l ar sus habi l i dades de
apr endi zaj e conver gent e, pr act i que: apr endi zaj e asi mi l ador , pr act i que:
*Cr ear nuevas f or mas de pensar y *Or gani zar i nf or maci n.
act uar . *Const r ui r model os concept ual es.
*Exper i ment ar con nuevas i deas. *Pr obar t eor as e i deas.
*Escoger l a mej or sol uci n. *Di sear exper i ment os.
*Est abl ecer met as. *Anal i zar dat os cuant i t at i vos.
*Tomar deci si ones.
Concept ual i zaci n abst r act a
(Pensar)
13
EL PROCESO DEL ESTUDIO
Para concluir con los desagregados referidos al mtodo del estudio, debemos sealar
tanto cuanto secuencia el proceso del estudio:
1. Prepara y examina la temtica que ha de exponerse durante la clase inmediata
posterior.
2. Estudia y analiza el o los temas de las materias que se expusieron en la clase
anterior.
3. Busca uno o varios motivos que comprometan el estudio.
4. Precisa una nocin clara de los objetivos que debes lograr.
5. Empieza el mapa conceptual siguiente lo antes posible, a fin de repasar con
detenimiento y en forma crtica la leccin anterior.
6. A travs de la prctica, descubre y determina qu te es mejor, si empiezas por la
tarea ms difcil o por la ms fcil cuando te encuentres frente a varios deberes
de dificultad desigual.
7. Evala y valora diariamente el grado de importancia de los temas que te son
presentados, a fin de dedicar tus mayores esfuerzos y fijar permanentemente
aquellos que son vitales y fundamentales.
8. Comienza a trabajar tu mapa conceptual lo ms pronto posible.
9. Durante tu trabajo, desarrllalo intensamente y mantente concentrado.
10. Cuida que tu atencin no se desve o confunda cuando ests trabajando.
11. Trata de actuar t mismo sin pedir ayuda mientras no te sea imprescindible.
12. Elabora tus propios ejemplos concretos y con tus palabras sobre los temas,
principios y reglas que analizas.
13. Subraya y resalta las ideas esenciales en tus libros o toma notas fichadas.
14. Haz un mapa conceptual a fin de dominar el material que se te presente extenso
y complejo. Utiliza tu memoria en forma inteligente.
15. Acostmbrate a estudiar en forma razonada repasando mentalmente cada
prrafo, tan pronto lo hayas ledo.
16. Al encontrarte con trminos tcnicos, frmulas, definiciones, fechas y bosquejos
trata de memorizarlas una vez que las hayas comprendido.
17. Si debes aprender algo de memoria es mejor leer en voz alta que
silenciosamente, y es mejor leer rpidamente que despacio.
18. Toma un descanso y deja divagar tu mente antes de empezar otra tarea,
despus que hayas realizado un estudio intenso de un material difcil y
complicado.
14
19. Aplica tus conocimientos en todo trabajo que puedas, a fin de reafirmarlos.
20. Toma apuntes y mantente activo durante tus clases a las que debieras asistir.









































BLANCO Lourdes; CSPEDES Pablo: Metodologa del estudio. El trabajo
intelectual. En: Monografas.com, Newsletter #181,. Visto 25 de Noviembre de 2004.
http://www.monografias.com/trabajos15/trabajo-intelectual/trabajo-intelectual.shtml


15

16
17
UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL


FACULTAD DE TECNOLOGA MDICA


DEPARTAMENTO ACADMICO DE TECNOLOGA MDICA


LABORATORIO CLNICO Y DE ANATOMIA PATOLGICA

















PROYECTO DE INVESTIGACIN


TEMA:



ALUMNO:





LIMA-PER

2010
18
INDICE
CAPITULO I
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Pagina
1.1 Descripcin de la realidad
1.2 Delimitaciones y definicin del problema
1.2.1 Delimitaciones
a. Delimitacin temporal
b. Delimitacin espacial
c. Delimitacin social
d. Delimitacin conceptual
1.2.2 Definicin del problema
1.3 Planteamiento del problema
1.3.1 Problema principal
1.3.2 Problemas secundarios
1.4 Objetivos de la Investigacin
1.4.1 Objetivo principal
1.4.2 Objetivos especficos
1.5 J ustificacin e importancia
1.6 Limitaciones


19
CAPITULO II

MARCO TEORICO

2.1 Antecedentes de la Investigacin
2.2 Marco histrico
2.2.1 Sobre .........
2.2.2 Sobre ..........
2.3 Marco conceptual
2.3.1 Relacionado con ..........
2.3.2 Relacionado con ..........
2.3.3 Relacionado con ..........
2.4 Hiptesis de la Investigacin
2.4.1 Hiptesis general
2.4.2 Hiptesis especficas
2.5 Variables e indicadores
2.5.1 Variable independiente
2.5.2 Variable dependiente
2.6 Definicin de trminos






20
CAPITULO III

METODOLOGIA

3.1 Tipo y Nivel de la Investigacin
3.1.1 Tipo de Investigacin
3.1.2 Nivel de Investigacin
3.2 Mtodo y Diseo de Investigacin
3.2.1 Mtodo
3.2.2 Diseo
3.3 Cobertura de Estudio
3.3.1 Poblacin
3.3.2 Muestra
3.4 Tcnicas e Instrumentacin
3.5 Programa de Actividades y Presupuesto
3.5.1 Cronograma de Actividades
3.5.2 Presupuesto


Addendum









21
DEPARTAMENTO DE PATOLOGA DEL HOSPITAL DE APOYO " MARA
AUXILIADORA"

Definicin del Departamento
El Departamento de Patologa, es el rgano operativo de lnea encargado de
brindar diagnstico patolgico integral de la ms alta calidad a la poblacin usuaria,
mediante el estudio macroscpico y microscpico de las piezas quirrgicas, biopsias y
necropsias; y del estudio a nivel citolgico y citogentico de exudados, lquidos corporales
y clulas exfoliantes.
Esta integrado por Mdicos Especialistas, Tecnlogos Mdicos Especialistas,
Tcnicos y Auxiliares de las Ciencias de la Salud, as como personal de Apoyo
Administrativo y de Servicio.

Posicin estructural y dependencia.
El Departamento de Patologa, es un rgano de Lnea de los Servicios Intermedios
de Apoyo al Diagnstico del Hospital de Apoyo "Mara Auxiliadora", que depende en lo
administrativo y funcional de.................. y en lo tcnico-normativo de .....

Principales funciones y atribuciones:
a) Desarrollar actividades de Apoyo al Diagnstico para la proteccin,
recuperacin y rehabilitacin del paciente, en el contexto de la familia y su
comunidad.
b) Contribuir en la proteccin de la salud del usuario y de la comunidad a
travs de programas de despistaje y prevencin de cncer.
c) Brindar atencin y servicios con criterios de calidad y calidez a la poblacin
usuaria, en todos los sectores de trabajo del Departamento: J efatura,
Secretaria, Servicios, Laboratorio de Procedimientos Histolgicos, y en
especial el Servicio de Mortuorio y Necropsias.
d) Promover el desarrollo de los recursos humanos del Departamento de
Patologa, destinados a lograr la calidad y competitividad en el desempeo
de sus funciones, mediante la implementacin de programas de
capacitacin y educacin contina, utilizando metodologa de
problematizacin y solucin de casos.
e) Promover y desarrollar la investigacin cientfica en los diferentes campos
de la patologa y de la histotecnologa.
f) Brindar apoyo tcnico y de asesora especializada a los directivos de la
Institucin y a los establecimientos de menor complejidad, interactuando
con equipos multidisciplinarios.
g) Desarrollar actividades de docencia universitaria de pre y post grado en
patologa e histotecnologa, segn convenios establecidos con las
Universidades y las normas Institucionales vigentes.
22
h) Otras funciones afines que le asigne la Institucin.

Ubicacin y reas fsicas del Departamento de Patologa.
El Departamento de Patologa se encuentra ubicado en el primer piso al costado
del Servicio de Emergencia.
Las reas fsicas con que cuenta el Departamento de Patologa son:
- Oficina de la J efatura del Departamento
- Servicio de Citologa Exfoliativa
- Servicio de Patologa Quirrgica
- Servicio de Mortuorio y Necropsia
- Laboratorio de Procedimientos Histolgicos.

Todo Departamento de Patologa debe contar con un manual de organizaciones y
funciones (MOF), Manual de Normas y Procedimientos (MNP), donde se especifica en
forma detallada lo que debe hacer cada persona del Departamento, facilitndose el trabajo
en equipo y con un Plan Operativo Anual. De igual forma debe existir un fluxograma en el
cual se consigna en forma grfica la organizacin en relacin al movimiento de las
muestras en el Departamento.
La organizacin del Departamento est conformada por: J efe de Departamento,
J efe de Seccin, Patlogo Asistente, J efe de Laboratorio ( Tecnlogo Mdico) que puede
ser jefe de seccin en caso de que no se encuentre presente un patlogo; Tecnlogo
Mdico Asistente, Bilogo; Tcnico y Auxiliar de laboratorio; empleado de servicio de
morgue y limpieza.













" El hombre encuentra a Dios detrs de cada puerta que la ciencia logra
abrir."
Albert Einstein

23
LABORATORIO DE PROCEDIMIENTOS HISTOLGICOS DEL DEPARTAMENTO
DE PATOLOGA

Definicin del Laboratorio de procedimientos histolgicos del departamento
de patologa.
El Laboratorio de procedimientos Histolgicos del Departamento de Patologa, es el
rgano tecnolgico de lnea encargado de brindar el servicio de elaboracin de preparados
histolgicos, histoqumicos e inmunohistoqumicos de la ms alta calidad al patlogo
(usuario), mediante el procesamiento de las piezas quirrgicas, biopsias y necropsias por
el mtodo de la parafina u obtenidas por congelacin.
Esta integrado por Tecnlogos Mdicos Especialistas, Tcnicos y Auxiliares de las
Ciencias de la Salud, as como personal de Apoyo Administrativo y de Servicio.

Posicin estructural y dependencia.
El Laboratorio de Procedimientos Histolgicos, es un rgano Tecnolgico de Lnea
de los Servicios Intermedios de Apoyo al Diagnstico Histopatolgico, que depende en lo
administrativo y funcional del Departamento de Patologa y en lo tcnico-normativo del
J efe de Laboratorio.

Principales funciones y atribuciones:
a) Desarrollar actividades de Apoyo al Diagnstico Histopatolgico con la
finalidad de satisfacer las necesidades diagnsticas del patlogo.
b) Coadyuvar el diagnostico histopatolgico a travs de mtodos histolgicos,
reacciones histoqumicas e inmunohistoqumicas.
c) Brindar el servicio de elaboracin de preparados histolgicos, histoqumicos
e inmunohistoqumicos con criterios de calidad y calidez al usuario.
d) Promover el desarrollo de los recursos humanos del Laboratorio de
Procedimientos histolgicos, destinados a lograr la calidad y competitividad
en el desempeo de sus funciones, mediante la implementacin de
programas de capacitacin y educacin continua.
e) Promover y desarrollar la investigacin cientfica en los diferentes campos
de la histotecnologa.
f) Brindar apoyo tcnico y de asesora especializada a los Laboratorios de
Procedimientos Histolgicos Perifricos.
g) Desarrollar actividades de docencia universitaria de pre y post grado en
Histotecnologa, segn convenios establecidos con las Universidades y las
normas Institucionales vigentes.
h) Otras funciones afines que le asigne la Institucin.



24
Ubicacin y reas fsicas del Laboratorio de Procedimientos Histolgicos.
El Laboratorio de Procedimientos Histolgicos se encuentra ubicado dentro del
Departamento de Patologa.
Las reas fsicas con que cuenta el Laboratorio de Procedimientos Histolgicos
son:
Tcnicas Histolgicas
Histoqumica.
Laboratorio de Inmunohistoqumica.

A continuacin mostramos un grfico en el que se refleja un modelo organizativo
propio del Laboratorio de Procedimientos Histolgicos del Departamento de Patologa del
Hospital de Apoyo "Mara Auxiliadora":






















" Nunca consideres el estudio como una obligacin sino como una
oportunidad para penetrar en el bello y maravillosos mundo del saber."
Albert Einstein

25
+----------+ +-------------+ +------------------+
|LABORATORIOS| |TAREAS ASIGNADAS| | MTODOS REALIZADOS |
+----------+ +-------------+ +------------------+


Procedimiento Procesamiento de: Tecnicas histolgicas Histoqumica
histolgicos
Biopsias Hematoxilina-eosina Reaccin de P.A.S
Piezas quirrgicas Tricromico de Masson Col.de alcian blue
Material de autopsias Impreg. de Gomori Hierro coloidal de Hale
Biopsias por congelacin Color. de Verhoeef Col.metacromtica
Coloracin de Gram Col.de carmn Best
Col.de Ziehl Neelsen Reaccin de Feulgen
Coloracin de Waysson Coloracin de sudan
Impreg. argtca.de Grocott Reaccin de Von Kossa
Coloracin de Wolbach Reaccin de Perls

Inmunohistoqumica Procesamiento de:

Biopsias
Piezas quirrgicas
Material de autopsias Anticuerpos ligados a enzims: Mtodo de
Biopsias por congelacin inmunofosfatasa alcalina.
para estudio con sueros
policlonales y anticuerpos
monoclonales.
26
Del Jefe del Laboratorio
Denominacin del cargo:
J efe del Laboratorio de Procedimientos Histolgicos.

Naturaleza del trabajo:
Encargado de dirigir eficaz y eficientemente la planificacin, organizacin,
control y mejora, de las actividades y desempeo del Laboratorio de
Procedimientos Histolgicos; orientados al logro de la misin asignada y el cabal
cumplimiento de los objetivos y metas establecidas por el Departamento y la
Institucin.
El J efe del Laboratorio de Procedimientos Histolgicos, depende
administrativa y funcionalmente del J efe del Departamento de Patologa, ejerce
autoridad sobre los Tecnlogos Mdicos, personal profesional, Internos de
Tecnologa Mdica, personal tcnico y auxiliar asignado al Laboratorio; as como
sobre el personal que desarrolla funciones administrativas.

Principales funciones y responsabilidades:
1. Coordinar efectiva y permanentemente con el J efe del Departamento de
Patologa la planificacin, organizacin, control y mejora de las actividades
del Laboratorio.
2. Dirigir la organizacin y funcionamiento del Laboratorio de Procedimientos
Histolgicos, en concordancia a las necesidades y expectativas de los
usuarios; as como el cumplimiento de los objetivos del Departamento y las
metas operativas del Laboratorio.
3. Cumplir y hacer cumplir las normas, disposiciones, directivas y manuales
vigentes del Departamento y de la Institucin.
4. Cumplir y hacer cumplir las normas, manuales y procedimientos vigentes de
Bioseguridad en el Laboratorio.
5. Participar activamente en la formulacin del Plan Operativo y el Plan de
Capacitacin Anual del Laboratorio.
6. Implementar y dirigir la ejecucin del Programa Total de Control de Calidad.
7. Coordinar efectiva y permanentemente con los Tecnlogos Mdicos
Asistentes, Tcnicos y Auxiliares la planificacin, organizacin, control y
mejora de las actividades del Laboratorio, segn competencias y
responsabilidades del personal.
8. Supervisar, monitorear y evaluar las actividades, tareas, procedimientos,
resultados y tendencias del Laboratorio.
9. Realizar y participar en el desarrollo de actividades de Docencia e
Investigacin programadas por el Departamento, los Servicios o el
Laboratorio.
10. Otras funciones afines que le sean encargadas por el J efe del
27
Departamento de Patologa.

Perfil del cargo
Para ocupar el cargo de J efe de Laboratorio de Procedimientos Histolgicos,
los requisitos mnimos son:
- Ser Tecnlogo Mdico, Especialidad Laboratorio Clnico y de Anatoma
Patolgica.
- Estar debidamente registrado en el Colegio Tecnlogo Mdico del Per.
- Tener Grado Acadmico de Magster o estudios de Maestra.
- Tener experiencia mnima de 5 aos en Laboratorio de Procedimientos
Histolgicos.
- Tener capacitacin en sistemas de informtica bsica.

Rgimen laboral
Tecnlogo Mdico nombrado.


Del Tecnlogo Mdico
Denominacin del cargo:
Tecnlogo Mdico Asistente.

Funciones y responsabilidades:

Tcnicas:
1. Es responsable de la pieza quirrgica, biopsia o muestras de necropsias
desde su entrada al Laboratorio de Tcnicas Histolgicas hasta obtener el
preparado histolgico (lmina) en un lapso de 24-48 horas, adems de
verificar que las solicitudes anatomopatolgicas tengan todos los datos
requeridos.
2. Es responsable del control de calidad de las lminas histolgicas,
verificando siempre que el nmero de cortes corresponda a la descripcin
hecha en el estudio macroscpico.
3. Es responsable de los procedimientos histolgicos, histoqumicos e
inmunohistoqumicos.
4. Es responsable de la preparacin y del control de calidad de colorantes
y reactivos, para los procedimientos nombrados en el punto 4.
5. Es responsable de implementar procedimientos histolgicos, e
histoqumicos eficaces y eficientes para coadyuvar el diagnstico.
6. Responsable de la preparacin de piezas para museo y de material
didctico (microfotografas y slide).
7. Responsable de los equipos, materiales, reactivos y colorantes depositados
28
en el almacn del servicio.
8. Es responsable de evaluar el trabajo de su personal a cargo (tcnico y
auxiliar) en quien puede designar funciones bajo su responsabilidad.

Administrativas:
1. Cumplir y hacer cumplir en el Laboratorio los reglamentos, normas y
procedimientos vigentes en el Hospital.
2. Cumplir y hacer cumplir en el Laboratorio las normas y procedimientos
vigentes de bioseguridad.
3. Poner a consideracin del J efe de Laboratorio las necesidades de personal,
equipos, materiales y reactivos del Laboratorio de Procedimientos
Histolgicos.
4. Colaborar y coordinar con el J efe del Laboratorio en la organizacin,
funcionamiento del Laboratorio de Procedimientos Histolgicos y adems
en la confeccin de normas que permitan mejorar el trabajo.
5. Colaborar con el J efe del Laboratorio en la elaboracin del Plan Estratgico.
6. Cuidar que las instalaciones, mobiliarios, equipos y materiales se conserven
en buen estado.
7. Informar al J efe del Laboratorio de los problemas que se susciten por
indisciplina, irresponsabilidad o deficiencia del personal a cargo.

Docentes:
1. Participar activamente en el proceso de enseanza-aprendizaje.
2. Organizar y/o participar en reuniones cientficas con las diferentes
secciones de Laboratorio Central, de Emergencia y el de la U.C.I.
3. Asistir y/o participar en cursos y congresos nacionales e internacionales.
4. Participar activamente en los programas de capacitacin y formacin
profesional.
5. Capacitar peridicamente al personal a cargo.

Investigacin:
1. Realizar investigacin, participar en los proyectos que tengan propsito de
efectuarlos y alentar esta actividad.
2. Presentar cuando menos un trabajo cientfico cada 2 aos.

Perfil del cargo
Para ocupar el cargo de Tecnlogo Mdico Asistente, los requisitos mnimos
son:
- Ser Tecnlogo Mdico, Especialidad Laboratorio Clnico y de Anatoma
Patolgica.
- Estar debidamente registrado en el Colegio Tecnlogo Mdico del Per.
29
- Tener cursos o capacitacin en Laboratorio de Procedimientos Histolgicos
o en Histotecnologa.
- Tener capacitacin en sistemas de informtica bsica.

Rgimen laboral:
Tecnlogo Mdico nombrado o contratado.


































Atender a los pacientes que vienen al laboratorio de procedimientos histolgicos
no es un trabajo ni una obligacin, sino algo que
Eduardo Sedano G. y Ricardo Neira M.
yo debo hacer.
30
EQUIPOS DE UN LABORATORIO DE HISTOTECNOLOGA

En un laboratorio de procedimientos histolgicos, es necesaria la utilizacin de ciertos
instrumentos para llevar a cabo su normal funcionamiento. Los instrumentos ms
comunes en un laboratorio de procedimientos histolgicos son: micrtomo, microscopio,
estufa, refrigeradora, bao Mara, balanza, potencimetro.
EL MICROSCOPIO Y SUS PARTES
El microscopio, es el instrumento ms importante utilizado por los histotecnlogos, de
los cuidados y correcto uso dependern el xito de las observaciones. Es funcin del
microscopio hacer visible aquellas cosas tan pequeas que el ojo humano no puede
hacerlo, est compuesto de un sistema de lentes de suficiente magnificacin y poder
de resolucin que aquellos elementos que estn muy juntos entre s, se puedan
distinguir separados dando una imagen clara y detallada cuando se utiliza suficiente
iluminacin.
El aumento total de un microscopio se determina multiplicando el aumento que
proporciona el ocular por el aumento que proporciona el objetivo.
Parte mecnica esta constituida por: Soporte, Cuerpo con el revlver porta-objetivos,
Platina, Reguladores de enfoque: tornillos macromtrico y micromtrico.
Parte ptica, constituida por: oculares, con diferentes aumentos 5X, 10X o 15X,
puede ser monocular o binocular, Objetivos secos, bajo poder 10X, alto poder 45X,
Objetivo de inmersin de gran definicin 96X 100X
Sistema de iluminacin, constituido por: condensador, diafragma, Fuente de
iluminacin interna o externa con un espejo plano/cncavo.
INDIQUE LAS PARTE DEL MICROSCOPIO


31






























Centro de inclusin
Centro de enfriamiento
Afilador de cuchilla
Microtomo de rotacin tipo Minott
Microscopio ptico
Bao de flotacin
32

Refrigeradora
Estufa
Microondas
Cocinilla elctrica
Microondas
Criostato
Procesador automtico de tejidos
33

FACTORES DE RIESGO OCUPACIONAL EN EL LABORATORIO DE
PROCEDIMIENTOS HISTOLGICOS

Qumicos:
1. Colorantes:
a. Naturales: Hematoxilina, carmn
b. Artificiales: Escarlata de biebrich, eosina
2. Reactivos:
a. cidos: cido clorhdrico, cido ntrico, cido sulfrico
b. Alcalis: Hidrxido de sodio, hidrxido de amonio
c. Solventes orgnicos: Xilol, alcohol, metanol
d. Gaseosos: Formaldehdo, amoniaco
e. Sales: Nitrato de plata

Fsicos:
a. Mecnicos:
b. Campos electromagnticos:
c. Temperaturas extremas:
d. Electricidad

Biolgicos:
a. Parsitos:
b. Bacterias: Mycobacterium tuberculosis
c. Virus: HIV, hepatitis B
d. Hongos:

Ergonmicos:

Psicosocial:
a. Relaciones interpersonales
b. Estrs
c. Madures emocional











34

MEDIDAS GENERALES DE SEGURIDAD

En la manipulacin de productos qumicos deberan observarse siempre las medidas
de seguridad descritas a continuacin, incluso en el caso que en la etiqueta del
producto qumico no haya ninguna caracterizacin de sustancia peligrosa.
En todos los trabajos llevar gafas protectoras y si es posible guantes protectores.
Pipetear y medir los volmenes de sustancias voltiles o de cidos bajo una
campana extractora y protegido con una mascara antigases, como mnimo
realizarlo en locales bien ventilados.
Evitar en cualquier caso el contacto con la piel, ojos y mucosas.
Lavar con agua fra abundantemente y de forma inmediata las salpicaduras
sobre la piel, lavar con polietilenglicol las sustancias lipfilicas. No utilizar nunca
disolventes orgnicos debido al peligro de reabsorcin.
Los ojos que hayan entrado en contacto con sustancias custicas se lavan con
un chorro suave de agua ( con una ducha especial para ojos) poniendo a la
persona afectada en posicin horizontal y protegiendo el ojo no afectado. Abrir
ampliamente los prpados y mover el ojo daado en todas direcciones. A
continuacin consultar inmediatamente al oculista indicando la sustancia
custica.
Quitarse inmediatamente las prendas de vestir que estn impregnadas de la
sustancia corrosiva.
En caso de accidente o de malestar consultar inmediatamente al mdico.
No comer, beber fumar en el laboratorio de procedimientos histolgicos.
Proteccin preventiva del trabajo en el caso de sustancias y preparaciones
cancergenas y mutgenas.




















El primer deber que tenemos como persona y como profesional es para con la
verdad, ya sea verdad cientfica, histrica o filosfica.
Eduardo Sedano Gelvet y Carlos Neira Montoya
35


36
37

38
RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD EN CASO DE SISMO

Todos debemos estar prevenidos y entrenados frente a la ocurrencia de un
desastre natural, y saber cual debe ser nuestra participacin para protegernos, proteger a
nuestra familia, a nuestros compaeros o a nuestros pacientes.
Por eso es importante que participemos solidaria y activamente en cumplir las
normas establecidas por el comit de defensa civil nacional, y podamos apreciar cual ser
nuestro accionar y como coordinar con nuestros compaeros, la conducta a desarrollar
frente a un siniestro.
Las siguientes son recomendaciones que el personal de salud, el pblico en
general y usted seor alumno deben de seguir en caso de desastres naturales
(terremotos), de tal forma que se evitara la mayor cantidad de daos en usted y los que los
rodean.

Qu hacer antes de un sismo?:
1. Prepare un plan de proteccin y seguridad con tus compaeros de seccin, crea
una conciencia de preparacin,
2. Cuando ingrese al Departamento de Patologa, localice las zonas de seguridad
sealizadas, as como tambin cuales son las salidas y escaleras de emergencia
que tiene el Departamento.
3. En el Laboratorio de Procedimientos histolgicos identifica que zonas corren
peligro,
4. Reconoce las zonas de seguridad que deben estar sealizadas, generalmente
junto a las columnas y vigas de construccin, debajo del marco de la puerta y
alejado de las ventanas o puertas de vidrio.
5. Verifica que objetos pesados no estn colocados encima de muebles cuya cada
pueda ocasionar daos.
6. Si hay balones de oxgeno, estos deben estar en un ambiente donde no puedan
caerse y de preferencia sujetos a las paredes por bridas.
7. Reconoce los lugares de la llave de luz, donde puede cortarse el suministro,
igualmente donde esta el ducto que contiene las llaves de agua del servicio.
8. Elabora una ruta de salida, reconociendo las vas que puedan llevarte a un lugar
seguro, en cada piso hay tres escaleras de salida que deben estar libres o cuyas
llaves deben de estar disponibles. Las zonas ms seguras de cada piso se
encuentran en el pasillo entre los ascensores.
9. Ubica donde estn los extintores y como se usan.
10. En el hogar, deben de tener cerca de la salida y en lugar visible, una radio porttil,
pilas o bateras, linterna, galonera de agua y mantas. Todo esto en una bolsa que
pueda ser transportada en forma rpida.

Qu hacer durante el sismo?:
1. Cuando se inicie algn desastre, mantenga la calma, solo con eso habr
conseguido mucho, y tendr ms oportunidad para asegurar su integridad.
2. Recuerde que cuando se inicia un desastre, se debe de proceder a desconectar
39
todos los artefactos elctricos que se encuentren encendidos, tambin si fuera el
caso desconectar las conexiones de gas.
3. Conserva la calma, ubcate en un lugar seguro: colquese debajo de las seales
de seguridad o de las columnas del edificio.
4. Protgete de los objetos pesados
5. Proceda a alejarse de las ventanas, por los vidrios que puedan caer,
6. Colcate debajo de mesas, escritorios o camas fuertes, zonas seguras son los
encuentros de columnas y vigas, no salgas del edificio.
7. Durante el sismo los ascensores y escaleras son sumamente peligrosos. Por
ningn caso use los ascensores, ya que estos posiblemente no funcionaran, y se
pueden convertir en una trampa.
8. Si el movimiento persiste proceda a dirigirse hacia las escaleras de manera
ordenada, manteniendo siempre la calma.
9. El personal de salud, debe de proceder a realizar el apoyo de los pacientes que
pueden valerse por si mismo para la evacuacin, y realizar el apoyo del transporte
en los pacientes que no lo pueden hacer.
10. La evacuacin del local, debe de realizarse en forma ordenada, recuerde que si el
pnico se apodera de usted perder una gran oportunidad de ponerse a salvo.
11. Cuando este fuera del local, dirjase a lugares abiertos, o aquellos que estn
debidamente sealizados, haga un crculo y mantenga la calma.
12. Recuerde que sus familiares donde estn si siguen estas mismas
recomendaciones estarn a salvo, de tal forma que cuando se inicie algn desastre
PIENSE EN SU SEGURIDAD Y EN LA DE LOS QUE ESTN A SU ALREDEDOR,
ya que en ese momento no podr hacer nada efectivo por sus familiares que se
encuentren lejos de usted.

Qu hacer despus del sismo?
1. Luego de pasado el desastre, ayude a las brigadas de rescate, y piense que
pueden existir replicas del sismo, as que no ingrese a locales con peligro de
caerse.
2. Si te encuentras atrapado llama o haz ruido para recibir ayuda, en caso contrario
calma a los dems. Preprate para temblores secundarios o rplicas que ocurren
luego del sismo mayor.
3. Haz una rpida inspeccin inicial por si hay incendios, escape de gas, heridos o
gente atrapada, establece las prioridades de acuerdo a las circunstancias,
4. Si hubiese fuego trata de controlarlo, debes saber donde estn los extintores y
como usarlos, de no ser posible ayuda a los heridos y pacientes a salir,
abandonando rpidamente el edificio por rutas seguras, que ya conoces.
5. No tocar cables, desconecta el sistema elctrico de tu seccin, ya sabes donde
esta la llave.
6. No abras puertas de armarios o reposteros ya que los objetos te pueden caer
encima.
7. Presta atencin prioritariamente a los que ms lo necesitan, impedidos fsicos,
nios, ancianos.
40
8. Organiza las evacuaciones de pacientes y personal, as como la reanimacin,
clasificacin y atencin de heridos.

Es importante leer con detenimiento estas recomendaciones y prepararnos para
participar. No olvidemos que esto puede ocurrir en cualquier momento y a cualquier hora,
debiendo todos participar con responsabilidad y solidaridad.




































Todo ser viviente proviene de un huevo (Omne vivum ex ovo)
William Harvey Fisilogo ingls (1578-1657)
41
UN PROGRAMA DE GARANTIA DE LA CALIDAD

Para obtener los mejores resultados posibles en los preparados histolgicos, un
programa de garanta de la calidad deber incluir distintos aspectos del funcionamiento
adecuado del laboratorio de procedimientos histolgicos del departamento de patologa.
Un programa de este tipo debe tener tres sistemas, que se resumen a continuacin:

1. Sistema de Mejoramiento continuo de la calidad

A. Creacin de crculos de calidad
B. Eleccin del mtodo histolgico, histoqumico o inmunohistoqumico.
C. Desarrollo de un manual de procedimientos estndar
D. Programas de entrenamiento y actualizacin permanente para el personal del
laboratorio de procedimientos histolgicos del Departamento de Patologa.
E. Recepcin adecuada de la muestra y de las solicitudes de estudio
anatomopatolgico.

2. Sistema de control de calidad interno

A. Adquisicin de equipos, de productos qumicos y colorantes de calidad para el
laboratorio.
B. Procedimientos para la deteccin de errores, tales como lmina problema, lmina
patrn, lmina testigo, lmina blanco y sueros negativos en caso de mtodos
inmunohistoqumicos.
C. Mantenimiento preventivo de instrumentos y equipos.
D. Decisiones a tomar cuando se presentan resultados fuera de control.

3. Sistema de control de calidad externo.

4. Documentacin de la ejecucin y resultados del programa de garanta de
calidad.













42
ELECCIN DE UN MTODO HISTOLGICO O HISTOQUMICO

Para implementar un mtodo histolgico o histoqumico, es necesario que se
estandarice al mximo posible, es cuestin de probar los mtodos ms asequibles a
nuestra realidad para determinar el que tenga precisin en condiciones ptimas y
normales de trabajo. A continuacin representamos los diversos factores que influyen en
la seleccin de un mtodo:

Interferencias

Costo de materiales Cantidad de personal

Desembolso de capital Exactitud

Flexibilidad Utilidades

Colegas Decisin final Precisin

Linealidad Entrenamiento

Lminas/hora Reparaciones

Espacio requerido Tipo de mtodo

Velocidad del procedimiento Indicaciones del fabricante

Todos estos factores se pueden resumir en los siguientes:
1. Debe ser tcnicamente simple y de buen rendimiento.
2. Los reactivos deben ser inicuos para el operador.
3. Debe ser de bajo costo.
4. Debe ser sensible, es decir, que tenga capacidad para detectar cantidades
pequeas de la muestra o sustancia que se quiere demostrar.
5. Debe tener precisin.
6. Debe tener exactitud.
7. Debe ser rpido.

Estos siete factores son los ms importantes para la eleccin de un mtodo "ideal".



REFERENCIA: SNCHEZ DE ROMERO, Doris.: TCNICAS INSTRUMENTALES DE
USO MS FRECUENTES EN EL LABORATORIO CLNICO Y DE INVESTIGACIN.
Imprenta IMPOFFOT L.T. Lima-Per, 1992. pp 39-40
43


44
PASOS DE LAS TCNICAS MICROSCPICAS

Los pasos de las tcnicas microscpicas para obtener un preparado histolgico
permanente (lminas) son:
1. Toma de la muestra.
2. Fijacin.
3. Inclusin.
4. Microtoma.
5. Coloracin.

1. TOMA DE LA MUESTRA

OBTENCIN DE LA PIEZA
El material a utilizar puede ser extrado de los diversos animales de
laboratorio, o bien puede tratarse de material humano. Entre los animales de
observacin se eligen aquellos que por su semejanza con el ser humano
pueden sustituirlo sin grandes diferencias, y cuya obtencin y crianza puede
ser fcilmente efectuada en el laboratorio.
- Muerte del animal: podemos producirla valindonos de un traumatismo
brusco, o por la intoxicacin a causa de una dosis exagerada de narctico.
Fases en la obtencin de material animal:
- Extraccin de los rganos: conociendo la anatoma del animal, debemos
dirigirnos directamente a los rganos que nos interesan estudiar. En el caso
de que estos sean varios, es conveniente extraer primero los que ms
fcilmente se descomponen, estos son el pncreas y la porcin inferior del
tubo digestivo.
- Reduccin a piezas: teniendo en cuenta que para el tamao de las piezas
debemos considerar muy especialmente las cualidades del fijador a usar,
hablaremos de este asunto cuando tratemos la fijacin.
Una condicin indispensable para la buena confeccin de preparaciones es el
hacer correctamente la toma de tejidos. Para ello hay que observar lo siguiente: el
tejido debe ser removido del conejo y colocado en el fijador lo ms rpido que sea
posible. La velocidad es esencial. Hay que tener el equipo de diseccin listo y a la
mano. Planificar antes; tener las soluciones preparadas antes de matar al conejo.
Tener la suficiente cantidad de fijador de modo que cada pieza de tejido quede
cubierta por lo menos con una cantidad de lquido cerca a 10 veces su propio
volumen (cerca de 100,00 mL de cada fijador). Marcar muy bien todos los
recipientes (o cpsulas, si se usan) con lpiz o tinta indeleble.
El conejo debe ser muerto tan rpido como humanamente posible. Colocarlo en un
recipiente grande con una tapa ajustada dentro de la cual se habr colocado antes
45
papel toalla empapada con ter o cloroformo. Poner una toalla seca encima de las
otras para prevenir que el conejo entre en contacto con estos lquidos. Tan pronto
como el conejo deje de respirar, cortar y sacarle la mdula espinal justo debajo de
la cabeza. Si Ud. no esta familiarizado con la anatoma interna del ratn, debe
trabajar con un compaero que pueda disecar al animal rpidamente. Poner el
cuerpo de espaldas en una base de madera, estirar sus miembros y clavar pies y
manos sobre la base. Humedecer la piel a lo largo de la lnea ventral con agua.
Pinzar la piel del abdomen con frceps. Cortar a travs de la piel y de los msculos
abdominales con unas tijeras. Con la punta de las tijeras hacer un corte longitudinal
anterior a lo largo de la lnea ventral media, hacia y a travs de la parrilla costal.
Conservar la punta de las tijeras cerca de los msculos abdominales para prevenir
el cortar accidentalmente los rganos abdominales.
Las clulas germinales y las clulas con alto contenido enzimtico degeneran
notoriamente rpido con la muerte. Por lo tanto es necesario disecar los tejidos en
el orden siguiente:
a. Hgado. Cortar piezas no mayores de 5 mm de dimetro del borde del hgado.
Enjuagar rpidamente estas con solucin salina (cloruro de sodio al 0.7%) y
colocar cada uno en su propio fijador.
b. Duodeno. Retirar el hgado a un lado, jalar el estmago y cortar el duodeno
longitudinalmente en piezas de no ms de 3 mm de largo. Enjugarlas rpidamente
en la solucin salina. Limpiar gentilmente el lumen a chorro con una pipeta llena de
solucin salina y colocar cada pieza en su propio fijador.
c. Testculos. Rasgar los sacos escrotales con un par de tijeras. Remover los
testculos completos y dejarlos caer directamente en el fijador. Este no es el
momento de darse cuenta que uno mato a un conejo hembra.
d. Corazn. Retirar el corazn, cortarlo por la mitad longitudinalmente y enjugarlo
vigorosamente con solucin salina para retirar los cogulos de sangre. Colocar
cada pieza en su propio fijador.

Cuando corten los tejidos manipularlos cuidadosamente. No pincharlos o daarlos
con la pinza. Cortarlos con una navaja de afeitar o con unas tijeras filudas. Permitir
que solo herramientas de acero inoxidable entren en contacto con los fijadores a
base de cloruro de mercurio, pues son muy corrosivos. Ningn tejido debe tener un
dimetro mayor de 5 mm Cuando el testculo ha sido endurecido ligeramente por el
fijador (cerca de 5 minutos), rebanarlo cuidadosamente con una navaja de afeitar
filuda. El testculo es un tejido sumamente blando y se quiebra fcilmente.
El etiquetar cada tejido es muy importante debido a la necesidad de identificarlos
durante los muchos pasos. Etiquetar cada envase con el nombre del tejido y el
fijador usado. Conservar los tejidos por separado en viales marcados. Tejidos que
van a ser lavados luego con agua corriente deben ser puestos en paquetes o en
cpsulas disponibles comercialmente. Cuando mucho, mientras ms tejidos van a
46
ser procesados se necesitan gran cantidad de envases adecuados. Frascos de
comida de beb son disponibles, tienen tapas rosca resistentes a cidos y son
descartables (especialmente los recipientes que contienen soluciones de cloruro de
mercurio. Instrumentos y material de vidrio no deben entrar en contacto con el
tejido viviente.

El hombre no es sujeto de experimentacin, esta verdad indiscutible hace que
slo en casos excepcionales se pueda obtener material humano en condiciones
de ser estudiado histolgicamente. De tres fuentes puede provenir el material
humano: las necropsias, las biopsias y las piezas operadas. De stas, slo la
primera puede darnos material normal; las dos ltimas proporcionarn tejidos
patolgicos.
Obtencin de material humano:
- Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadver. Para histologa
normal es necesario que se trate de un cadver fresco y que no haya sido
atacado por ninguna lesin, por lo menos el rgano que se quiere estudiar.
- Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el
objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnstico histopatolgico.
- Piezas operadas: los tejidos que han sido extrados de las intervenciones
quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados, tambin pueden
darnos material de investigacin pero, como en el caso anterior, slo servirn
para anatoma patolgica.

2. FIJACIN
A fin de evitar la destruccin de las clulas por sus propias enzimas (autlisis), o
por bacterias, los tejidos separados del cuerpo de un animal (especimenes) deben
ser fijados, inmediatamente despus de ser cortados. Este tratamiento
denominado fijacin tiene por finalidad endurecer los tejidos, volvindolos ms
resistentes para las etapas subsiguientes de las tcnicas microscpicas.

PREPARACIN DE SOLUCIONES FIJADORAS

Procedimiento general para preparar una solucin fijadora:
1. Identificar las sustancias qumicas a emplearse teniendo en cuenta su peso
molecular o peso formula, densidad, peso especfico, grado de pureza, presencia
de contaminantes, ndices de solubilidad, reacciones y su bioseguridad en su
manejo.
2. Realizar los clculos matemticos, encontrando los pesos o volmenes necesarios
para su preparacin.
3. Contar con el material y equipo necesario para pesar como esptulas, vasijas,
balanza con sensibilidad adecuada.
47
4. Tener el material volumtrico necesario a usar como fiolas, pipetas, probetas, etc.
Verificar su limpieza y resistencia.
5. Preparar la solucin agregando cantidades crecientes del soluto ya medido sobre
una parte del volumen total (1/3 a ) con agitacin constante. Concluir la
preparacin enrazando con el solvente en una fiola de volumen adecuado.
6. Las soluciones pueden guardarse en frascos de plsticos o de vidrio, este ultimo de
preferencia de color caramelo. Las tapas pueden ser de rosca o esmeriladas, no
usar tapas de presin por la peligrosidad que originan cuando se destapan las
soluciones fijadoras, ni tapas de metal por la oxidacin y corrosin que sufren.
7. Las soluciones fijadoras una vez preparadas, deben ser apropiadamente
identificados y las etiquetas deben contener la siguiente informacin:
a. Nombre del fijador.
b. Concentracin de la solucin fijadora.
c. Requerimiento de almacenamiento (medio ambiente o refrigeracin).
d. Iniciales de la persona que preparo la solucin fijadora.
e. Fecha de preparacin.
f. Expectativa de duracin y fecha de expiracin.
g. Peligros potenciales de la solucin fijadora.
h. pH si se trata de una solucin fijadora bufferada.

Prctica

Se encargara a cada dos alumnos la preparacin de las siguientes soluciones fijadoras:

Fijador simple

Solucin de formol al 10%
Formol comercial al 37-40% 1 vol.
Agua corriente 9 vol.

Fijadores compuestos o mezclas fijadoras

Lquido de Zenker
Dicloruro de mercurio 5.0 g
Dicromato de potasio 2.5 g
Agua corriente 100.0 mL
cido actico glacial 5.0 mL

Despus que los tejidos son fijados en Zenker, es necesario eliminar el precipitado
de mercurio tratando los cortes, primero, con lugol y posteriormente, con tiosulfato de
sodio.
48

Lquido de Bouin
Solucin acuosa de cido pcrico saturada 15 vol.
Formol comercial al 37-40% 5 vol.
cido actico glacial 1 vol.

Lquido de Regaud
Dicromato de potasio al 3% 80.0 mL
Formol comercial al 37-40% 20.0 mL

Liquido de Da Fano
Nitrato de cobalto 1,0 g
Agua destilada 100,0 mL
Formol comercial 15,0 mL

Para lo cual tendrn que realizar los clculos respectivos, teniendo en cuenta el
volumen indicado por sus profesores adems, de la informacin tcnica inscrita en los
reactivos



















Lo peor no es cometer un error, sino tratar de justificarlo, en vez de aprovecharlo
como aviso providencial de nuestra ligereza o ignorancia.
Santiago Ramn y Cajal

49
Tabla de tejidos y fijadores

(Anotar el nmero de piezas de tejido que ponga en cada fijador)

rgano

Lquido de
Zenker

Lquido de
Bouin

Lquido de
Regaud

Lquido de
DaFano

Formol al
10%

Cerebro











Cerebelo











Corazn











Aorta











Tiroides











Pulmn











Hgado











Bazo











Pncreas











Rin











Glndula adrenal











Prstata











Testculo











Lengua











Esfago











Estmago











Intestino delgado











Intestino grueso











Glndula partida











Glndula sublingual











Glndula submaxilar
























50
DESHIDRATACIN E INCLUSIN EN PARAFINA
Las piezas al ser retiradas del fijador, o despus de haberlas lavado, estn
embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo
tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergindolos en
lquidos anhidros, vidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una
deshidratacin brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando,
preferentemente, alcohol etlico de graduacin creciente.
Deshidratacin
Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o
toluol (este ltimo es el que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe
aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratacin
no ha sido bien lograda y debemos repetir el bao de alcohol absoluto
cerciorndonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml
de toluol no debe enturbiarlo.
Impregnacin por un disolvente de la parafina (aclaracin)
Se sumergen las piezas en parafina (56-58 de punto de fusin), mantenida
lquida en la estufa a no ms de 62C. Despus de 1 a 2 horas se renueva la
parafina.
Penetracin de la parafina
En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina
fundida, del mismo punto de fusin de la que ha servido para la penetracin. Se
colocan las piezas orientndolas y luego se pone el molde en heladera.
Inclusin definitiva o formacin del bloque
A los 15-30 minutos la parafina se habr solidificado completamente, recortamos
los bloques en forma de pirmide cuadrangular truncada, lo adherimos a un
taquito de madera mediante una esptula calentada con la llama de un mechero
y ya podemos realizar los cortes con el micrtomo.
OBTENCIN DE CORTES
El objeto de la inclusin que hemos descripto anteriormente es hacer posible la
reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el
paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrtomos son instrumentos
de gran precisin que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor
graduable. Los cortes ms corrientes son los de 4-6 micrones.
Consideraremos cuatro tipos de micrtomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el
de congelacin, y el cristato o critomo.
- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se
desliza por unas guas especiales merced a un soporte al que se sujeta la
cuchilla con unos tornillos.
51
- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza
sujeta a una platina, sta se desliza verticalmente cuando se hace girar una
manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.
- Tipo congelacin: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en
lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza
por tener un sistema de congelacin colocado debajo de la platina que utiliza la
expansin brusca del anhdrido carbnico contenido en un cilindro con el cual se
comunica.
- Cristato: consta de un micrtomo tipo Minot incluido en una cmara de
congelacin. El volante de inercia que controla la realizacin del corte
permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance
estn situados dentro de la cmara fra (normalmente a -20 C). Pese a la
disposicin horizontal de la cuchilla, la obtencin de secciones seriadas es
posible gracias a la existencia de un sistema anti-enrollamiento que obliga al
corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los modelos ms
modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, as como enfriar
rpidamente la muestra a -60 C gracias a la existencia de una placa de
congelacin instantnea. Frente al micrtomo convencional de congelacin, el
cristato posee la gran ventaja de permitir la obtencin de cortes mucho ms
delgados (por lo general de 4 m y, en manos experimentadas, hasta 2 m).
Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrtomo, en agua tibia
contenida en un cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos,
previamente desengrasados, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y,
con la ayuda de una aguja histolgica, se colocan los cortes sobre el
portaobjetos y a continuacin se lo levanta.
COLORACIN
Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloracin.
Colorantes: reciben esta denominacin las sustancias que pueden conferir color
a otros cuerpos.
Coloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teido por una sustancia
colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al
preparar la solucin colorante.
Segn su origen se clasifican en:
Clasificacin de los colorantes:
COLORANTES NATURALES:
- Animales (carmn)
- Vegetales (hematoxilina, orcena, azafrn)


52
COLORANTES ARTIFICIALES O SINTTICOS (COLORES DE ANILINA):
- cidos: sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina o
eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmticos.
- Bsicos: sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul de
metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: sales en las que tanto el cido como la base son coloreados.
Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: no forman sales. Tien aquellas sustancias que tienen un
poder disolvente superior al del lquido que ha servido para preparar la
solucin colorante (Sudn lll, rojo escarlata).
Por otro lado, las coloraciones pueden ser:
- Ortocromticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solucin
colorante empleada.
- Metacromticas: una sustancia o un componente celular se tie con un
color diferente al del colorante empleado.
- Coloracin directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el
objeto.
Mtodos de coloracin:
- Coloracin indirecta: requiere la intervencin de intermediarios o
mordientes para que la coloracin tenga lugar.
- Coloracin progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su
punto ptimo.
- Coloracin regresiva: se realiza primero una sobrecoloracin y luego se
elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores. A este
proceso se lo denomina diferenciacin.
- Coloracin simple: se colorean solamente algunos elementos del
preparado (ncleo, fibras elsticas, etc.).
- Coloracin combinada: se tien los elementos nucleares y citoplasmticos
recurrindose, generalmente, al empleo sucesivo de colores bsicos y
cidos que contrastan por sus colores.
- Coloracin panptica: es una coloracin combinada realizada
sucesivamente por colorantes neutros (May-Grnwald-Giemsa).
- Coloracin pancrmica: en un solo bao colorante actan todos los
colorantes neutros que se necesiten.
HEMATOXILINA:
Colorantes ms utilizados en histologa humana:
53
- Es una materia prima para elaborar un colorante.
- Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes
pueden ser: el aire (varios meses de exposicin) u oxidantes artificiales
(xido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.)
- Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utiliza en forma de lacas
hematoxilnicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente
para preparar la solucin colorante), comportndose en este caso como
un colorante indirecto.
EOSINA:
- Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixantnicos
halogenados con tres grupos arilo).
- Presenta autofluorescencia espontnea.
- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas.
Para colorear se emplea generalmente una batera de coloracin.
MONTAJE
Luego de la coloracin, se deshidrata el corte y se procede a la aclaracin y
montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en
condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro.
La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.
La aclaracin se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es
impregnar el corte con un disolvente del Blsamo de Canad, que al mismo
tiempo le confiere un ndice de refraccin semejante al del vidrio.
Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre
el mismo una gota de Blsamo de Canad disuelto en xilol y se cubre con un
cubreobjeto.
Se deja secar unas horas antes de su observacin al microscopio.
RECOMENDACIONES TILES
- Las tcnicas histolgicas pertenecen al tipo denominado "tcnicas
contrarreloj". Si Ud. est apurado no las empiece, djelas para cuando su
trabajo le permita dedicarse solo a esa actividad.
- Mantenga su laboratorio en orden, con todos los elementos de vidrio que
va a utilizar perfectamente limpios.
- Rotule todos los frascos inmediatamente luego de preparar cualquier
solucin.
- Guarde siempre las soluciones en frascos de color caramelo.
54
- Mantenga los recipientes que contienen xilol, toluol y alcohol 100 siempre
tapados.
- Nunca coloque xilol o toluol en recipientes plsticos porque resultan
atacados por estas sustancias.
- Si debe trabajar con cidos hgalo bajo campana. Si se derraman o
salpican la piel, lave inmediatamente con abundante agua con
bicarbonato de sodio.
- Cuando coloree prepare primero todas las soluciones, solo despus
comience con los pasajes del material.
- Si debe realizar simultneamente varios procesos de inclusin,
confeccione planillas de tiempos para cada uno de los materiales. Esto
evitar confusiones.
- Controle cuidadosamente los tiempos establecidos para cada tcnica. Es
muy importante respetarlos para obtener resultados satisfactorios.
- Antes de iniciar cualquier tcnica, primero lala atentamente. Prepare el
material de vidrio necesario, rena los reactivos y colorantes, haga las
diluciones, determine los tiempos, y despus comience el proceso.
- Tenga mucha paciencia y voluntad. Sea perseverante, si durante las
primeras experiencias sus resultados no son lo que Ud. esperaba,
verifique cada paso y repita tantas veces como sea necesario.












REFERENCIA: http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/modtecni.htm

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MTODO DE COLORACIN DE HEMATOXILINA Y EOSINA

FIJACIN: Puede usarse cualquier fijador.

MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 3 a 4 micrmetros de grosor. Cortar
secciones en el crostato o en el micrtomo de congelacin de 6 a 7 micrmetros de
grosor.

SOLUCIONES:

Solucin colorante de hematoxilina de Harris o hemalumbre de Harris
Hematoxilina (C.I. 75290) 5,0 g
Sulfato doble de aluminio y potasio o sulfato doble de aluminio y amonio 100,0 g
Agua corriente 1000,0 mL
Oxido mercrico rojo o amarillo 2,0 g

Disolver el alumbre (sulfato doble) en el agua con ayuda del calor. Luego agregar
la hematoxilina. Mezclar. Llevar la mezcla a ebullicin tan rpido como sea posible,
luego sacarla del calor y adicionar el xido mercrico. Recalentar la mezcla, hasta que
tenga un color prpura oscuro, cerca de 1 minuto. Luego retirar del calor y enfriar
rpidamente. La solucin est lista para ser usada.

Solucin de alcohol cido al 1%
Alcohol al 70% c.s.p. 100,0 mL
cido clorhdrico 1,0 mL

Solucin de agua amoniacal al 3
Agua corriente c.s.p 1000,0 mL
Amonaco o hidrxido amnico 3,0 mL

Solucin stock de eosina acuosa al 1%
Eosina amarilla (C.I. 45380) 10,0 g
Agua corriente 1000,0 mL
Disolver y adicionar:
cido actico glacial 2,0 mL

Solucin colorante de trabajo de eosina
Solucin stock de eosina acuosa al 1% 1 vol.
Alcohol al 80% 3 vol.
Adicionar 0,5 mL de cido actico glacial por cada 100,0 mL de solucin colorante.
56
PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos.
2. Desparafinar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos.
3. Tratar los cortes en alcohol absoluto 1 durante 5 minutos.
4. Tratar los cortes en alcohol absoluto 2 durante 5 minutos.
5. Tratar los cortes en el alcohol corriente 1 durante 5 minutos.
6. Tratar los cortes en el alcohol corriente 2 durante 5 minutos.
7. Si las secciones fueron fijadas con algn fijador mercurial, desenkerizar.
8. Lavar en agua corriente durante 5 minutos.
9. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 5 minutos.
10. Lavar en agua corriente durante 2 minutos.
11. Sumergir los cortes, rpidamente, 3 veces en el alcohol cido al 1%.
12. Lavar inmediatamente con agua corriente.
13. Sumergir los cortes, rpidamente 3 veces en solucin de agua amoniacal al 1%.
14. Lavar inmediatamente con agua corriente y verificar si los ncleos estn bien
teidos observando al microscopio.
15. Colorear con la solucin de trabajo de eosina, durante 4 minutos.
16. Lavar en agua corriente durante 2 minutos.
17. Tratar los cortes, rpidamente 5 veces en el alcohol corriente 1.
18. Tratar los cortes, rpidamente 5 veces en el alcohol corriente 2.
19. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 1 durante 5 minutos.
20. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 2 durante 5 minutos.
21. Tratar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos.
22. Tratar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos.
23. Montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Las estructuras basfilas se observan de color azul y las estructuras
eosinfilas de color rosado.

REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, W.B. Saunders
Company, 1942, p 86.
57
REACCIN DEL CIDO PERYDICO DE SCHIFF (MTODO DE P.A.S)

OBJ ETIVO: Determinar sustancias P.A.S. positivas

FIJ ACIN: Los tejidos fijados en formol dan buenos resultados, as mismo aquellos que
han sido fijados en lquidos a base de cido pcrico o alcohol.

MICROTOMA: Hacer cortes en parafina de 5 micrmetros de grosor. De la muestra objeto
de estudio se harn dos lminas, una de ellas seguir el procedimiento completo (lmina
problema) y la otra (la lmina blanco), no seguir el paso de la oxidacin.
Simultneamente se correr una lmina patrn para conocer la validez de la prueba, para
este ltimo se puede usar un corte de duodeno.

FUNDAMENTO: La reaccin de P.A.S. tiene dos pasos fundamentales; el primero
consiste en la formacin de grupos aldehdos, esto se logra gracias a la accin oxidante
del cido perydico que actan rompiendo y oxidando los grupos alfa glicol. El segundo
paso consiste en la deteccin de los grupos aldehdos usando el reactivo de Schiff.

REACTIVOS:
Solucin de cido clorhdrico 1N
cido clorhdrico concentrado de peso especfico 1,19 8,35 mL
Agua destilada c.s.p. 100,00 mL

Reactivo de Schiff
Fucsina bsica (C.I. 42510) 0,5 g
cido Clorhdrico 1N 10,0 mL
Metabisulfito de sodio o de potasio disulfito de sodio o de potasio 0,5 g
Agua destilada 100,00 mL
Carbn activado 0,25 g
Disolver la fucsina bsica en el agua destilada caliente. Llevar a punto de ebullicin.
Enfriar y agregar el disulfito de sodio y agitar la mezcla; luego aadir el cido clorhdrico
1N y agitar constantemente por espacio de 20 minutos. Dejar en la oscuridad en frasco
hermticamente cerrado hasta el da siguiente. Despus de este tiempo la solucin ha
adquirido una ligera coloracin amarillenta, se recomienda entonces aadir el carbn
activado y agitar. Finalmente se filtra y se guarda en frascos color caramelo y de cierre
hermtico.

Solucin acuosa de cido perydico al 0.5%
Cristales de cido peridico 0,5 g
Agua destilada c.s.p 100,0 mL

58
Solucin de agua sulfurosa (opcional)
Metabisulfito de sodio o de potasio al 10% 5,0 mL
cido clorhdrico 1 N 5,0 mL
Esta mezcla es utilizable mientras tiene olor a anhdrido sulfuroso, en caso contrario
deber desecharse.

Solucin colorante de Hematoxilina de Harris.

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar las secciones hasta agua corriente.
2. Tratar la lmina problema y el patrn con cido perydico durante 10 minutos; la
lmina blanco se dejar en agua corriente por el mismo tiempo.
3. Lavar con agua destilada.
4. Tratar con el reactivo de Schiff de 5 a 10 minutos.
5. Lavar con agua sulfurosa por 3 cambios de 2 minutos cada uno, o con chorros de
agua destilada por 1 minuto.
6. Colocar en hematoxilina de Harris durante 2 minutos
7. Lavar en agua corriente.
3. Deshidratar rpidamente
4. Aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Sustancias P.A.S. positivas de color rojo magenta, ncleos de color azul.

OBSERVACIONES:
Los lugares con reaccin positiva en la muestra problema, debern ser negativos
en la muestra blanco.
La muestra blanco deber ser totalmente negativa a la reaccin, si hubiera alguna
positividad esta se debe a grupos aldehdos propios del tejido, y esto no debe
considerarse como reaccin P.A.S. positiva.

PRECAUCIONES:
El reactivo de Schiff debe ser cuidadosamente preparado y reunir una serie de
caractersticas que permitan confiar en los resultados obtenidos. La base de este reactivo
es el Clorhidrato de p-rosanilina, que es un componente de la fucsina bsica, la cual debe
ser de la mejor calidad. Dentro de las recomendaciones tenemos:
a) Evitar la disolucin (ni an con agua destilada) ya que ello lleva como
consecuencia la ruptura del equilibrio inico del reactivo.
b) Debe evitarse la prdida del anhdrido sulfuroso, por esta razn el reactivo se
almacena en frascos pequeos completamente llenos y hermticamente
cerrados, conservndolos en refrigeracin cuando no estn en uso.
c) Evitar la aireacin excesiva al tener los frascos del reactivo destapados o
59
agitndolos innecesariamente.
d) Cuando el reactivo va a ser usado debe sacarse con anticipacin del
refrigerador para que tome la Temperatura del medio ambiente, debe evitarse
la elevacin de la temperatura por medios artificiales.
e) La recoloracin espontnea o la presencia de precipitados en el reactivo son
signos suficientes para desecharlo.
f) Si despus de la preparacin del reactivo este conserva un color rosado, esto
es debido a que la p-rosanilina usada no es de buena calidad.
g) El reactivo de Schiff se prueba tomando una alcuota de l, al que se le
adiciona unas gotas de formol se formar entonces una solucin de color rojo
prpura.

APLICACIONES: Dentro de las sustancias P.A.S. positivas tenemos las siguientes:
Glucgeno, reticulina, mucina, membrana basal, glucoclix, glndulas mucosas. Tambin
son positivas a esta reaccin el Histoplasma capsulatum, Criptococcus neoformans,
Cndida albicans, entre otros.
























REFERENCIA: Mac Manus, J .F.A.: Stain Technology, 23: 99, 1948 (AFIP Modificado).
60
REACCIN DE P.A.S.

OBJ ETIVO: Demostrar la presencia de glucgeno

FIJ ACIN: Para el estudio ordinario del glucgeno, los mejores fijadores son: el cido
actico - alcohol- formol (5-85-10), el de lquido de Bouin y el alcohol etlico.

MICROTOMA: Se pueden obtener secciones por congelacin de tejido fresco, los cuales
debern ser fijados en cualquiera de las soluciones mencionadas durante 5-10 minutos.
Los cortes en parafina sern de 4 micrmetros. De la muestra problema se corrern
dos lminas una de las cuales sufrir previamente digestin con amilasa salival (lmina
testigo).

FUNDAMENTO: La reaccin de P.A.S. tiene dos pasos fundamentales; el primero
consiste en la formacin de grupos aldehdos, esto se logra gracias a la accin oxidante
del cido perydico que actan rompiendo y oxidando los grupos alfa glicol. El segundo
paso consiste en la deteccin de los grupos aldehdos usando el reactivo de Schiff.

REACTIVOS:
Solucin de cido clorhdrico 1N
cido clorhdrico concentrado de peso especfico 1,19 8,35 mL
Agua destilada c.s.p. 100,00 mL

Reactivo de Schiff
Fucsina bsica (C.I. 42510) 0,5 g
cido Clorhdrico 1N 10,0 mL
Metabisulfito de sodio o de potasio disulfito de sodio o de potasio 0,5 g
Agua destilada 100,00 mL
Carbn activado 0,25 g
Disolver la fucsina bsica en el agua destilada caliente. Llevar a punto de ebullicin.
Enfriar y agregar el disulfito de sodio y agitar la mezcla; luego aadir el cido clorhdrico
1N y agitar constantemente por espacio de 20 minutos. Dejar en la oscuridad en frasco
hermticamente cerrado hasta el da siguiente. Despus de este tiempo la solucin ha
adquirido una ligera coloracin amarillenta, se recomienda entonces aadir el carbn
activado y agitar. Finalmente se filtra y se guarda en frascos color caramelo y de cierre
hermtico.

Solucin acuosa de cido perydico al 0.5%
Cristales de cido peridico 0,5 g
Agua destilada c.s.p 100,0 mL

61
Solucin de agua sulfurosa (opcional)
Metabisulfito de sodio o de potasio al 10% 5,0 mL
cido clorhdrico 1 N 5,0 mL
Esta mezcla es utilizable mientras tiene olor a anhdrido sulfuroso, en caso contrario
deber desecharse.

Solucin colorante de Hematoxilina de Harris.

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente.
2. La lmina testigo se somete a la digestin salival, en estufa a 37 C durante 15
minutos. La saliva debe ser abundante y se evitar que ella se seque sobre el porta
objetos (colocar la lmina en cmara hmeda). La lmina problema, patrn y la
lmina blanco se dejar en agua corriente por el mismo tiempo.
3. Lavar en agua corriente.
4. Tratar la lmina problema, patrn y la lmina testigo con cido perydico durante
10 minutos, mientras que la lmina blanco se dejar en agua corriente por el
mismo tiempo.
5. Lavar todas las lminas con agua destilada.
6. Tratar todas las lminas con el reactivo de Schiff de 5 a 10 minutos.
7. Lavar con agua sulfurosa por 3 cambios de 2 minutos cada uno o con agua
destilada por 3 a 5 minutos.
8. Colocar en hematoxilina de Harris durante 2 minutos
9. Lavar en agua corriente.
5. Deshidratar rpidamente, aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Las sustancias que dan reaccin P.A.S. positiva en la lmina problema y
que dan reaccin negativa en la lmina con digestin salival (lmina testigo) corresponden
al glucgeno; aquellas sustancias que mantienen positividad en esta ltima lmina no
corresponden a glucgeno, ncleos de color azul.
Lmina problema pr obl ema Lmina testigo
62
OBSERVACIONES: Una reaccin histoqumica de rutina muy til es la reaccin del cido
perydico - Schiff (P.A.S. del ingls periodic acid- Schiff) para glucgeno.
Esta reaccin como ya se vio es fcil de llevar a cabo y de interpretar, aunque debe
recordarse que se pierde glucgeno en tejidos pobremente preservados y que est
aumentado en las clulas que rodean reas de necrosis.



































REFERENCIA: Mac Manus, J .F.A.: Stain Technology, 23: 99, 1948 (AFIP Modificado).
63
MTODO DEL CARMN DE BEST (Modificado por Lillie)

OBJ ETIVO: Demostrar la presencia de glucgeno

FIJ ACIN: Para el estudio ordinario del glucgeno, los mejores fijadores son: el cido
actico - alcohol- formol (5-85-10), el de lquido de Bouin y el alcohol etlico.

MICROTOMA: Se pueden obtener secciones por congelacin de tejido fresco, los cuales
debern ser fijados en cualquiera de las soluciones mencionadas durante 5-10 minutos.
Los cortes en parafina sern de 4 micrmetros. De la muestra problema se
corrern dos lminas una de las cuales sufrir previamente digestin con amilasa salival
(lmina testigo) y la otra no (lmina problema)..

FUNDAMENTO: Es un mtodo de coloracin emprico.

SOLUCIONES:
Solucin stock de Carmn de Best

Carbonato de potasio 1,0 g
Carmn (C.I. 75470) 2,0 g
Cloruro de potasio 5,0 g
Agua corriente 60,0 mL
Mezclar los componentes en un beaker, hervir suave y con cuidado durante 5
minutos (evitar la formacin de espuma. Enfriar y adicionar 20 ml de amonaco
concentrado de peso especfico 0.88 20 mL de hidrxido de amonio). La solucin puede
conservarse durante 3 meses en refrigeracin.

Solucin de trabajo de Carmn de Best
Solucin madre filtrada recientemente 2 vol
Amonaco concentrado o hidrxido de amonio 3 vol
Metanol 3 vol
El metanol se agrega lentamente y con agitacin constante. Esta solucin dura de 2
a 3 semanas.

Solucin diferenciadora
Etanol absoluto 4 vol.
Metanol 2 vol
Agua destilada 5 vol

Solucin colorante de Hematoxilina de Harris.

64
PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente.
2. Teir con Hematoxilina de Harris durante 15 minutos.
3. Lavar en agua corriente y luego en agua destilada.
4. Colocar en la solucin de trabajo de Carmn de Best durante 20 minutos. Agitar
constantemente.
5. Sacudir y transferir directamente a la solucin diferenciadora, 2 cambios.
6. Deshidratar rpidamente
7. Aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: El glucgeno se observa de color rojo; la lmina sometida a digestin con
amilasa salival no debe presentar coloracin positiva, ncleos de color azul.

OBSERVACIONES: Las amebas se tien bien en los cortes, sobresaliendo por su brillante
coloracin de los tejidos circundantes.









REFERENCIA: Mallory, F. B.: Pathological Technica, Philadelphia, W. B. Saunders Co.,
1942, p 127.
65
MTODO DEL HIERRO COLOIDAL DE HALE (mtodo modificado)

OBJ ETIVO: Demostrar la presencia de glucosaminoglicanos cidos.

FIJ ACIN: Es preferible el uso de fijadores a base de dicromatos y los metlicos (como el
subacetato de plomo). Tambin se obtiene buenos resultados con formol en solucin
salina, formol neutro y formol - alcohol.

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina de 4 micrmetros de grosor. Deber correrse
una lmina patrn que bien puede ser traquea, y dos secciones del tejido problema uno de
los cuales no ser sometido a la solucin de hierro coloidal (lmina blanco).

FUNDAMENTO: Los grupos aninicos de los glucosaminoglicanos cidos en particular los
radicales sulfatos (-SO4) y carboxilo (-COOH), poseen una gran afinidad por los iones
metlicos; esta propiedad se utiliza para fijar el hierro, el cual se encuentra bajo la forma
de hierro coloidal. Este hierro ligado as, es posteriormente reconocido por el mtodo de
Perls (azul de Prusia).

REACTIVOS:
Solucin acuosa de cloruro frrico al 10%
Cloruro frrico 5,0 g
Agua destilada c.s.p. 100,0 mL
Solucin stock de hierro coloidal
Solucin acuosa de cloruro frrico al 10% 4,5 mL
Agua destilada 250,0 mL
Hervir el agua y aadir el cloruro frrico agitando constantemente, la solucin toma
un color pardo rojizo.

Solucin de trabajo de hierro coloidal
Solucin stock de hierro coloidal 20,0 mL
Agua destilada 15,0 mL
cido actico 5,0 mL

Solucin acuosa de cido actico al 12 %

Solucin acuosa de ferrocianuro de potasio al 2 %

Solucin acuosa de cido clorhdrico al 2 %



66
PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente.
2. Colocar el cido actico al 12 % por 30 segundos.
3. Tratar la lmina problema y el patrn con solucin de trabajo de hierro coloidal.
Tratar la lmina blanco con agua destilada. Tiempo de exposicin una hora.
4. Lavar en agua destilada varias veces para quitar el exceso de hierro coloidal.
5. Agregar a todas las lminas un volumen de ferrocianuro de potasio y dejar actuar
durante un minuto.
6. Sobre el ferrocianuro agregar un volumen igual de cido clorhdrico y hacer una
mezcla homognea. Dejar que acte durante hasta que el tejido tome una
coloracin azul.
7. Lavar en agua corriente durante 5 minutos.
8. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos.
9. Lavar en agua corriente durante 1 minuto
10. Colorear con la eosina durante 15 segundos
11. Lavar en agua corriente durante 20 segundos
12. Deshidratar, aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Los glucosaminoglicanos cidos sulfatados y no sulfatados se observan
de color azul turquesa intenso (azul de Prusia), ncleos de color azul y citoplasma de color
rosado.


















REFERENCIA: McManus and Mowry: Stainig Methods-Histologic and Histochemical; pp
135-136, 1960.
67
MTODO DEL AZUL ALCIANO (Alcian Blue)

OBJ ETIVO: Demostrar la presencia de glucosaminoglicanos cidos sulfatados y
glucosaminoglicanos cidos no sulfatados

FIJ ACIN: El fijador de eleccin es el Carnoy. Los fijadores Zenker y Bouin tienden a
suprimir la coloracin.

MICROTOMIA: Cortes secciones de parafina de 5 micrmetros. Utilizar como patrn de
glucosaminoglicanos cidos traquea; y como patrn de glucosaminoglicanos neutros,
mucosa gstrica.

FUNDAMENTO: El azul Alciano es un colorante que pertenece al grupo de las
ftalocianinas o pigmentos pirrlicos, cuyo principio coloreador es la ftalocianina de cobre.
Este colorante tiene gran afinidad por los grupos cidos de los glucosaminoglicanos,
dando una coloracin especfica con los glucosaminoglicanos cidos sulfatados cuando se
le usa a pH de 0.5 a 1; mientras que su especificicidad vara hacia los
glucosaminoglicanos cidos no sulfatados y sulfatados cuando se le usa a pH de 2.5.

SOLUCIONES:
Solucin acuosa de cido actico al 3%
cido actico glacial 3.0 mL
Agua destilada c.s.p. 100.0 mL

Solucin colorante de azul Alciano

Error!
Marcador no
definido.
Autor

Azul Alciano 8GX
(C.I. 74240)

cido
actico

cido
clorhdrico

Agua
destilada

pH

Spicer

1,0 g

1,0 mL

0

100,0 mL

2

Lev et Spicer

1,0 g

3,0 mL

0

100,0 mL

2,5

Lev et Spicer

0,5%

0

0,5 N

0

0,5

Lev et Spicer

0,5%

0

0,1 N

0

1

La solucin de azul Alciano debe filtrarse antes de su uso; no es estable y cuando
se forma un precipitado debe desecharse.

Solucin colorante de hematoxilina de Harris

68
Solucin colorante de eosina

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente.
2. Tratar los cortes en solucin acuosa de cido actico al 3% durante 3 minutos.
3. Colocar los cortes con la solucin colorante de azul Alciano durante 30 minutos.
4. Lavar en agua destilada por 2 minutos.
5. Colorear con hematoxilina-eosina.
6. Deshidratar, aclarar y montar con blsamo de Canad.

RESULTADOS:
pH =0,5 - 1 Los glucosaminoglicanos cidos sulfatados se observan de color azul
verdoso (cartlago y mayora de mucinas epiteliales), ncleos de color
morado

pH =2.5 Los glucosaminoglicanos cidos no sulfatados y sulfatados se observan de
color azul verdoso (glucocalix, cido hialurnico, sialomucinas, cpsula
mucoide de Cryptococus neoformans), ncleos de color morado.

OBSERVACIONES: Tanto el pH as como el tiempo de exposicin son de importancia
para asegurar la especificidad del mtodo. pH igual a 2.8 o mayores disminuyen la
especificidad; mientras que tiempos de exposicin prolongados terminan por colorear con
mayor o menor intensidad todos los componentes histolgicos.

















REFERENCIA: J ohnson,F. B.: Armed Forces Institute of Pathology.
69
COLORACIN METACROMTICA CON AZUL DE TOLUIDINA

FIJ ACIN: Formol al 10%

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina 5 micrmetros de grosor. Se recomienda
usar como lmina patrn secciones de traquea.

SOLUCIONES:
Solucin colorante de azul de toluidina
Azul de toluidina (C.I. 52040) 0,1 g.
Agua destilada c.p.s. 100,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada
2. Colorear con solucin de azul de toluidina entre 30 segundos a 1 minuto.
3. Enjuagar en agua destilada.
4. Cubrir las secciones con un cubreobjeto.
5. Sellar el borde del cubreobjeto con esmalte de ua presionando la laminilla con la
ua.
6. Examinar las secciones tan pronto como sea posible despus de la preparacin.

RESULTADOS: La metacromasia se observa de color azul por ejemplo ncleos. La
metacromasia se observa de color azul violceo por ejemplo glucosaminoglucanos
cidos no sulfatados (cido hialurnico) del cordn umbilical. La metacromasia se
observa de color rojo violceo por ejemplo glucosaminoglucanos cidos sulfatados (cido
condroitin sulfato) del cartlago hialino de la traquea. La metacromasia se observa de
color rojo, por ejemplo hongos.


OBSERVACIN METACROMTICA DE MUCOPOLISACRIDOS CIDOS CON
AZUL DE TOLUIDINA

1) Glucosaminoglucanos cidos no sulfatados

muestran metacromasia con
azul de Toluidina a pH=3, pero no a pH=1.5
2) Glucosaminoglucanos cidos sulfatados muestran metacromasia a pH=1.5
con Azul de Toluidina.


REFERENCIA: J ohnson, F. B.: Available in mimeographed form from Armed Forces
Institute of Pathology.
70
MTODO DE FEULGEN (Feulgen-Rossenbeck)

OBJ ETIVO: cido Desoxirribonucleico

FIJ ACIN: La formalina no es un buen fijador para los cidos nucleicos porque bloquean
un nmero considerable de grupos reactivos, de tal manera que se reduce
considerablemente la reaccin. Los fijadores ms recomendables son los lquidos a base
de alcohol y cido actico, el fijador de Carnoy es el ms popular; sin embargo, hay que
tener presente que la permanencia prolongada en soluciones cidas tienden a extraer a
los cidos nucleicos, primero al ARN y luego al ADN.

MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina o por congelacin de 4 micrmetros de
grosor. Simultneamente se correr una lmina blanco.

FUNDAMENTO: El mtodo de Feulgen presenta dos pasos fundamentales, el primero de
ellos consiste en la formacin de grupos aldehdos; esto se logra gracias a la accin de
una hidrlisis cida suave con HCl 1 N, el cual permite la liberacin de las bases purnicas
del ADN con la consiguiente formacin de grupos -CHO. El segundo paso es el
reconocimiento de estos grupos por el reactivo de Schiff.

REACTIVOS:
Solucin de cido clorhdrico 1N
cido clorhdrico concentrado de peso especfico 1,19 8,35 mL
Agua destilada c.s.p. 100,00 mL

Reactivo de Schiff
Fucsina bsica (C.I. 42510) 0,5 g
cido Clorhdrico 1N 10,0 mL
Metabisulfito de sodio o de potasio disulfito de sodio o de potasio 0,5 g
Agua destilada 100,00 mL
Carbn activado 0,25 g
Disolver la fucsina bsica en el agua destilada caliente. Llevar a punto de ebullicin.
Enfriar y agregar el disulfito de sodio y agitar la mezcla; luego aadir el cido clorhdrico
1N y agitar constantemente por espacio de 20 minutos. Dejar en la oscuridad en frasco
hermticamente cerrado hasta el da siguiente. Despus de este tiempo la solucin ha
adquirido una ligera coloracin amarillenta, se recomienda entonces aadir el carbn
activado y agitar. Finalmente se filtra y se guarda en frascos color caramelo y de cierre
hermtico.

Solucin de agua sulfurosa (opcional)
Metabisulfito de sodio o de potasio al 10% 5,0 mL
71
cido clorhdrico 1 N 5,0 mL
Esta mezcla es utilizable mientras tiene olor a anhdrido sulfuroso, en caso contrario
deber desecharse.

Solucin stock de light green sf yellowish
Light green sf yellowish (C.I. 42095) 0,2 g
Agua destilada 100,0 mL
cido actico glacial 0,2 mL

Solucin de trabajo de light green sf yellowish
Solucin stock de light green sf yellowish 10,0 mL
Agua destilada 50,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente; los cortes por congelacin se fijarn y
se llevarn tambin hasta agua.
2. Colocar los cortes en el cido clorhdrico 1 N a 60C, para realizar la hidrlisis. El
tiempo de permanencia en el cido depender del fijador que se haya utilizado (ver
tabla adjunta)


FIJ ADOR TIEMPO FIJ ADOR TIEMPO

Carnoy 6:3:1 8' Gendre 5'
Carnoy 3:1 6' Helly 8'
Fleming 16' Regaud 14'
Susa 18' Zenker 5'
Etanol 5' Formol 8'

La lmina blanco se colocar en agua destilada a 60C por el mismo tiempo que la
lmina problema.
3. Lavar en agua destilada varios cambios.
4. Colocar en el reactivo de Schiff durante 20 a 30 minutos.
5. Lavar en agua sulfurosa o agua destilada varios cambios.
6. Lavar en agua corriente.
7. Colorear con el verde luz durante 30 segundos.
8. Lavar en agua corriente.
9. Deshidratar, aclarar y montar.

RESULTADOS: El cido cido del ncleo se observa de color rojo prpura y el citoplasma
de color verde.
72

OBSERVACIONES: Las preparaciones de Feulgen se conservan indefinidamente. La
prdida del color es insignificante (alrededor del 3 a 4 %, durante el primer ao, medido
con espectrofotometra). Los cortes teidos y no montados se pueden guardar en cido
actico al 45% de -14 a -35C, sin que se produzca ninguna prdida de color.
La intensidad del color producido es proporcional a la concentracin de la sustancia
analizada (ADN). En este caso podemos aplicar la ley de Lambert-Beer que nos permite
con el auxilio del histofotmetro, microfotmetro o en el microespectrofotmetro, medir la
sustancia cuantitativamente en los tejidos.




























REFERENCIA: Lillie, R. D.: Histopathologic Technic and Practical Histochemistry, 3 Ed.,
pp 148-155, 1965.
REFERENCIA DE TABLA DE TIEMPO DE HIDRLISIS: Pearse, A. G. E.: Histochemistry-
Theorical and Applied. Little, Brown & Co. p 823. 1961.
73
MTODO DEL VERDE DE METILO PIRONINA (Unna-Pappenhein)

OBJ ETIVO: cido desoxirribonucleico y cido ribonucleico

FIJ ACIN: El fijador de Carnoy da los mejores resultados, pero se puede usar los fijadores
habituales como el formol al 10%.

MICROTOMIA: Realizar cortes en parafina o por congelacin de 4 micrmetros de grosor,
simultneamente se correr una lmina testigo.

FUNDAMENTO: Tanto al verde de metilo (un trifenil metano) como la pironina (un
xanteno), son colorantes bsicos cuyas afinidades de coloracin varan segn el pH de la
solucin colorante. Cuando se aplica la mezcla de ambos a pH 9, la pironina tiene poca
actividad y solo colorea el verde de metilo; ocurre lo contrario en un pH cido donde slo
se fija la pironina y no el verde de metilo. Sin embargo, cuando la mezcla de ambos
colorantes se aplica a pH de 4,8 se produce una coloracin selectiva, donde el verde de
metilo colorea el ADN mientras que la pironina tie al ARN. Para darle mayor confiabilidad
al procedimiento es conveniente correr cortes controles (lmina testigo), las cuales sern
sometidas a digestin enzimtica (DNAasa y RNAasa) antes de la coloracin.

REACTIVOS:
Solucin concentrada de verde metil-pironina
Verde metil (C.I. 42585) 4,0 g
Pironina (C.I. 45005) 5,0 g
Agua destilada 100,0 mL
Cloroformo (aprox.) 150,0 mL
Disolver el verde metil en el agua destilada, colocarlo en una pera de decantacin y
realizar extracciones sucesivas con el cloroformo, con la finalidad de eliminar el violeta de
metilo (generalmente contaminante del verde metil). El proceso se repetir tantas veces
sea necesaria hasta que el cloroformo quede transparente. Por ltimo agregar la pironina y
disolverla. Esta solucin es estable.

Amortiguador de acetato pH 4.8
cido actico 0.1 M 40.0 mL
Acetato sdico 0.1 M 60.0 mL
Verificar el pH y guardar en refrigeracin.

Solucin diluida de verde metil-pironina.
Solucin concentrada de verde metil-pironina 1 vol.
Amortiguador de acetato pH 4.8 1 vol.
Esta solucin es estable por una o dos semanas.
74
PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
2. Colorear con la solucin diluida de verde metil-pironina durante 10 minutos a 24
horas.
3. Retirar el exceso de colorante con papel de filtro. Algunos autores recomiendan
lavar rpidamente en agua.
4. Deshidratar rpidamente en acetona absoluta.
5. Pasar a una mezcla de acetona-xilol 1:1
6. Pasar a una mezcla de acetona xilol 1:10
7. Aclarar en xilol y montar.

RESULTADOS: El cido desoxirribonucleico del ncleo se observa de color verde y el
cido ribonucleico del ergastoplasma se observa de color rojo a rosado.

OBSERVACIONES: Para que esta coloracin tenga un real valor histoqumico es
necesario teir al mismo tiempo una lmina testigo tratada previamente con la
ribonucleasa o con un mtodo de extraccin qumica. El cido ribonucleico se puede
demostrar en los tejidos gracias a su acentuada afinidad con colorantes bsicos (basofilia)
como el azul de metileno y el azul de toluidina. Por tanto, las reas de citoplasma que se
tien con estos colorantes son generalmente ricas en ribosomas. Pero como el ARN no es
la nica sustancia basfila de los tejidos, es necesario incubar una lmina testigo antes de
su coloracin con la enzima ribonucleasa (Test de Brachett) que digerir el ARN presente.
Cualquier estructura que pierda su basofilia debido al tratamiento previo con la
ribonucleasa se considera que contiene ARN.















REFERENCIA: Pearse, A. G. E.: Histochemistry-Theorical and Applied. Little, Brown & Co.
p 825. 1961.
75
MTODO DE ROJO CONGO DE BENNHOLD

OBJ ETIVO: Demostracin de Amiloide

FIJ ACIN: Los fijadores alcohlicos son los de eleccin. De preferencia emplear el lquido
de Carnoy o el alcohol de 95 %. La fijacin prolongada en formol al 10 % tiende a
disminuir la tincin con el rojo Congo, ya que los grupos oxidrilos del amiloide y los grupos
aldehdos del formol interactan formando acetales y hemiacetales. Los fijadores con
dicromato o cido crmico tambin disminuyen la intensidad de la coloracin con este
mtodo, porque se producen complejos Cr-O-Cr con los grupos oxidrilos del amiloide.

MICROTOMIA: Cortar secciones en parafina de 6 - 7 micrmetros de grosor .

FUNDAMENTO: Este mtodo se basa en que este colorante diazoico se dispone
paralelamente a las fibrillas de amiloide para luego unirse mediante puentes de hidrgeno
entre los grupos oxidrilos de las fibrillas y los grupos amino laterales del colorante.

SOLUCIONES:
Solucin de rojo Congo
Rojo Congo (C.I. 22120) 1.0 g
Agua destilada 100.0 mL

Solucin acuosa saturada de carbonato de litio

Solucin colorante de hematoxilina de Harris.

PROCEDIMIENTO
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente.
2. Colorear con la solucin de rojo Congo por 30 minutos.
3. Tratar los cortes con la solucin saturada de carbonato de litio por 15 segundos.
4. Lavar con agua corriente durante 15 minutos.
5. Colorear con hematoxilina de Harris por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente durante 1 minuto
7. Deshidratar ,aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Observadas las lminas con luz convencional, los depsitos de amiloide
varan de color naranja a rojo. Otros componentes como el tejido elstico, fibras de
celulosa, las paredes de variedades de hongos y grnulos eosinfilos tambin adquieren
esta coloracin. Cuando se observa con luz polarizada, los depsitos de amiloide exhiben
una birrefringencia verde; una birrefringencia similar muestran los derivados de la celulosa
y las paredes de algunos hongos, sin embargo, estos ltimos materiales pueden
76
distinguirse del amiloide por caractersticas morfolgicas o por otras coloraciones. Los
grnulos de los eosinfilos y el tejido elstico no exhibe birrefringencia.
El amiloide teido con Rojo Congo muestra fluorescencia roja bajo luz ultravioleta.

OBSERVACIONES: El xito de esta coloracin requiere de una solucin de rojo Congo
recin preparada.

VARIANTE : Coloracin de rojo Congo con permanganato de potasio.

REACTIVOS :
Solucin de permanganato cido de potasio
Solucin acuosa de permanganato de potasio al 0.5%. 47.5 mL
Solucin acuosa de cido sulfrico al 3 % 2.5 mL

Solucin acuosa de cido oxlico al 1%

PROCEDIMIENTO:
1.- Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada. Secar bien la lmina.
2.- Tratar con permanganato cido de potasio por 30 segundos a 3 minutos. Lavar con
agua destilada.
3.- Tratar los cortes con cido oxlico 1% hasta que el tejido se blanquee. Lavar con
agua destilada.
4. Colorear con la solucin de rojo Congo por 30 minutos.
5. Tratar los cortes con la solucin saturada de carbonato de litio por 15 segundos.
6. Lavar con agua corriente durante 15 minutos.
7. Colorear con hematoxilina de Harris por 2 minutos.
8. Lavar con agua corriente durante 1 minuto
9. Deshidratar ,aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS:
Amiloidosis Primaria Amarilla.
Amiloidosis Secundaria Negativa al color Amarillo.







REFERENCIA: Lillie, R. D.: Histopathologic Technic, and Practical Histochemistry, New
York, The Blakiston Company, Inc., 1954, p 293.
77
MTODO DE COLORACIN CON SUDAN III O IV

OBJ ETIVOS: Demostracin de grasas neutras.

FIJ ACIN: Los tejidos objeto de estudio pueden ser frescos o fijados el fijador de eleccin
es el lquido de Baker (Formol-calcio), lquido en el que los tejidos se pueden conservar.

MICROTOMA: Para hacer el estudio de grasas se tendr que recurrir siempre a seccionar
los tejidos por micrtomo de congelacin o por criostato, ya que los mtodos habituales de
procesamiento histolgico extraen estas sustancias. Realizar cortes por micrtomo de
congelacin o criostato de 7 a 8 micrmetros de grosor. Pueden montarse en lminas o
procesarse por flotacin.

FUNDAMENTO: Los diazocolorantes del tipo Sudan son colorantes indiferentes, y tienen
la propiedad de solubilizarse fcilmente en los lpidos, tambin se disuelven en solventes
orgnicos (alcohol, acetona) pero en menor proporcin. Cuando estos colorantes en
solucin alcohlica se enfrentan a tejidos que contienen grasas, el colorante difunde hacia
su interior porque aqu su grado de disolucin es mayor confirindole por tanto su color.
Como se notar aqu no hay ningn tipo de reaccin qumica ni de unin electrosttica,
sino un simple fenmeno fsico.

SOLUCIONES:
Solucin colorante de Sudn
Sudan III o IV (C.I. 26100 o C.I. 26105) 0.2 g
Acetona 50,0 mL
Alcohol al 70% 50,0 mL
Disolver el Sudn III o IV en una mezcla a partes iguales de acetona y etanol al 70%
(solucin de Herxheimer). Se deja en reposo por lo menos 2 das y se debe filtrar antes
de usar.

Alcohol de 70%

Alcohol al 50 %

Solucin colorante de Hematoxilina de Harris.

Gelatina glicerinada
Gelatina 1,0 g
Agua destilada caliente 6,0 mL
Agregar la gelatina al agua caliente y mover hasta que se disuelva. Adicionar:
Glicerina 7,0 mL
Fenol 0,1 mL
78
PROCEDIMIENTO:
1. Las secciones se llevan a alcohol de 70 % por 3 minutos.
2. Colocar las secciones en la solucin de Sudn por 1 minuto.
3. Eliminar el exceso de colorantes en alcohol de 50 % durante 2 minutos.
4. Lavar los cortes en agua durante 3 minutos.
5. Colorear con hematoxilina de Harris durante 1 minuto.
6. Lavar en agua corriente.
7. Montar en gelatina.

RESULTADOS: Las grasas neutras se observan de color naranja con el sudn III o de
color rojo con el sudn IV y los ncleos de color azul.

OBSERVACIONES: El mtodo tiene algn inconveniente y es el de extraer total o
parcialmente las finas partculas lipdicas a causa del solvente del colorante; este
inconveniente se puede evitar usando como disolvente al polietilenglicol, el cual es un
solvente muy bueno para el Sudn pero es un psimo disolvente de las grasas.























REFERENCIA: Clark, A. E.: J . Path. & Bact. 59: 337. 1947. (Permission of Oliver and
Boyd, Ltd., London, England.)
79
MTODO DE SUDN BLACK B (SUDAN NEGRO)

OBJ ETIVO: Demostrar la presencia de fosfolpidos

FIJ ACIN: Se puede trabajar con tejidos frescos y seccionados por micrtomo de
congelacin o criostato. Para fijar los tejidos debe de usarse el lquido de Baker, pues lo
cationes evitan que los fosfolpidos pasen a la solucin, con la misma finalidad se pueden
agregar a la solucin de formol iones de cadmio o de cobalto. Posteriormente con paso
ptimo se hace el cromado durante 24 a 48 horas en dicromato de Potasio al 3 %; la
cromatacin produce la oxidacin de los fosfolpidos, hacindolos insolubles a los
solventes orgnicos utilizados en la inclusin en parafina.

MICROTOMIA: Los cortes sern de 5 a 6 micrmetros de grosor, si se tratan de bloques
de parafina y de 10 micrmetros de grosor si son por congelacin o por criostato.

FUNDAMENTO: El principio de la coloracin estriba en que ste diazocolorante tiene un
alto grado de solubilidad en fosfolpidos; es un colorante indiferente, por tanto no forma
sales y la coloracin se da por un simple fenmeno fsico.

SOLUCIONES:
Solucin colorante de Sudn black b
Sudn black b (C.I. 26150) 1,0 g
Alcohol al 70% 40,0 mL
Dejar reposar por 2 das y filtrar antes de usar.

Alcohol al 70 %

Alcohol al 50 %

Solucin colorante de rojo neutro al 0.1 %
Rojo neutro 0,1 g
Agua destilada 100,0 mL

Gelatina glicerinada
Gelatina 1,0 g
Agua destilada caliente 6,0 mL
Agregar la gelatina al agua caliente y mover hasta que se disuelva. Adicionar:
Glicerina 7,0 mL
Fenol 0,1 mL

PROCEDIMIENTO:
80
1. Desparafinar y llevar los cortes hasta el alcohol de 70%; o, si son cortes por
congelacin. llevarlos hasta el alcohol de 50%.
2. Colorear con el Sudn black b durante 30 minutos en un recipiente hermticamente
cerrado.
3. Eliminar el exceso de colorante con alcohol de 70 %, o en alcohol de 50 % para los
cortes por congelacin.
4. Lavar en agua corriente.
5. Colorear con rojo neutro durante 30 segundos.
6. Lavar con agua corriente.
7. Montar en gelatina.

RESULTADOS: Las porciones de tejido que contengan fosfolpidos se observaran de color
negro y los ncleos de color rojo.

OBSERVACIONES: La saturacin y filtracin de la solucin de Sudn a baja temperatura
disminuye la formacin de precipitados.
El Sudn Negro se descompone en solucin cida, esto se produce rpidamente a
pH por debajo de 4. El producto de descomposicin contiene un colorante bsico con
apetencia por los cidos nuclecos y los glucosaminoglicanos cidos.





















REFERENCIA: Chifelle, T. L., and Putt, F. A.: Stain Technology, 26: 51, 1951.
81
MTODO DE PERLS (Azul de Prusia, Azul de Berln)

OBJ ETIVO: Demostracin de hierro trivalente. El hierro demostrable por este mtodo, es
el que se encuentra bajo la forma de hemosiderina, Este compuesto visto en una lmina
coloreada con el mtodo de hematoxilina-eosina suele presentarse como un pigmento
granular intracitoplasmtico de color marrn, el cual debe necesariamente de diferenciarse
de otros pigmentos marrones.

FIJ ACIN: El mejor fijador para este fin es la formalina neutra al 10% este preserva ms
hierro con menos difusin que con otros fijadores como por ejemplo los alcohlicos. No
deben usarse fijadores que contengan cidos, porque estos disuelven los depsitos de
hierro de los tejidos.

MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 4 micrmetros de grosor.

FUNDAMENTO: El hierro trivalente al enfrentarse al ferrocianuro de potasio o de sodio
forma in situ un complejo fuertemente coloreado de azul turquesa, el ferrocianuro frrico;
este complejo precipita a manera de sustancia amorfa o microgranulosa que es atrado
electrostticamente por ciertas estructuras citoplasmticas. El cido clorhdrico interviene
en la liberacin del hierro, ya que ste se encuentra almacenado en las clulas unido a
protenas en cuya forma no puede interactuar con el ferrocianuro de potasio.

REACTIVOS:
Solucin acuosa de ferrocianuro de potasio al 2%
Ferrocianuro de potasio o de sodio 2,0 g
Agua destilada 100,0 mL

Solucin acuosa de cido clorhdrico al 2%
cido clorhdrico 2,0 mL
Agua destilada 100,0 mL

Soluciones colorantes de hematoxilina de Harris y eosina

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar las secciones hasta agua destilada.
2. Agregar a la lmina un volumen conocido de ferrocianuro de potasio y dejar actuar
durante 1 minuto.
3. Sobre el ferrocianuro agregar un volumen igual de cido clorhdrico y hacer una
mezcla homognea. Dejar que acte durante 15 a 20 minutos o hasta que el tejido
tome una coloracin azul.
4. Lavar con agua corriente por 2 minutos.
82
5. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos.
6. Lavar en agua corriente durante 1 minuto
7. Colorear con la eosina durante 15 segundos
8. Lavar en agua corriente durante 20 segundos
9. Deshidratar, aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Los depsitos de hierro trivalente se observan de color azul turquesa
(azul de Prusia), ncleos de color morado y citoplasma rosado.

OBSERVACIONES: Los colorantes de contraste (colorantes nucleares) debern ser
usados por breves perodos de tiempo, para evitar que ellos se adhieran a las partculas
de ferrocianuro frrico y por tanto enmascaren la reaccin. Este mtodo permite, por
ejemplo, no slo localizar las clulas del organismo que catabolizan la hemoglobina, sino
tambin diagnosticar enfermedades en las cuales se produce un depsito de hierro en los
tejidos.
La hemosiderina es una forma parcialmente desnaturalizada de ferritina que se
aglomera con facilidad y se reconoce en el examen microscpico como unos grnulos
pardo-amarillentos en el citoplasma que debido a la reaccin de Perls, se tien de color
azul turquesa (presencia de hierro trivalente). Normalmente existe hemosiderina en el
bazo, mdula sea y clulas de Kupffer del hgado.



















REFERENCIA: Mallory, F. B. and Wright, J . H.: Pathological Technique, ed. 8,
Philadelphia, W. B. Saunders Co., 1924, p 207. (A.F.I.P. modification).
83
MTODO DE VON KOSSA

OBJ ETIVO: Demostracin de depsitos insolubles de calcio. Los depsitos anormales de
las sales de calcio pueden tener diferentes causas, pero todas ellas estn bajo la forma de
fosfatos y/o carbonatos, y segn la naturaleza de su origen se les denomina calcificacin
metastsica, calcificacin patolgica, etc.

FIJ ACIN: Los fijadores alcohlicos son los que dan los mejores resultados, se debern
evitar los fijadores que contengan cidos porque disuelven las sales de calcio.

MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 5 micrmetros de grosor.

FUNDAMENTO: Este mtodo realmente demuestra la presencia de fosfatos y carbonatos
insolubles, como en el organismo todos los fosfatos y carbonatos insolubles son de calcio,
es que se le considera como un mtodo especfico para este elemento. Se basa en el
reemplazo de la sal clcica del tejido (mtodo de sustitucin) por una sal de plata. Luego
esta plata es reconocida por reduccin a plata metlica negra.

REACTIVOS:
Solucin acuosa de nitrato de plata al 5%

Solucin acuosa de tiosulfato de sodio al 5%

Soluciones colorantes de hematoxilina de Harris y eosina

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
2. Someter los cortes a la solucin de nitrato de plata por 25 a 40 minutos, expuesto a
la luz directa del sol o de una lmpara de 100 w.
3. Lavar en varios cambios de agua destilada.
4. Colocar en tiosulfato de sodio por 1 minuto.
5. Lavar en agua corriente por 1 minuto.
6. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos.
7. Lavar en agua corriente durante 1 minuto
8. Colorear con la eosina durante 15 segundos
9. Lavar en agua corriente durante 20 segundos
10. Deshidratar, aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Los depsitos de calcio se observan de color nego o marrn oscuro,
ncleos de color morado y citoplasma rosado.

84
OBSERVACIONES: Despus del paso 3 podra ser necesario el uso de Cloruro de Oro,
esto con la finalidad de acentuar la coloracin.
Es importante que siempre que se trabaja con plata el agua sea destilada, para
evitar cualquier reduccin de plata inespecfica.















REFERENCIA: Mallory, F. B.: Pathological Technique, Philadelphia, W. B. Saunders
Co.,1942, p 144 (A.F.I.P. modification)

85
MTODO DE MASSON FONTANA

OBJ ETIVO: Pigmentos melnicos. Estos pigmentos estn ampliamente distribuidos,
variando del negro al amarillo claro, y son notables por su insolubilidad en la mayora de
los solventes y por su resistencia a los cidos. No obstante las bases fuertes los disuelven
y diversos oxidantes llegan a decolorarlos, entre ellos el agua oxigenada.

FIJ ACIN: Los fijadores recomendados son el formol al 10% o el Bouin, no debe usarse
fijadores crmicos por ser oxidantes.

MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 4 micrmetros de grosor.

FUNDAMENTO: Las impregnaciones argnticas del tipo argentafin, ponen de manifiesto
estas estructuras sin necesidad de un agente reductor (formol o hidroquinona), la
reduccin de las sales de plata es producida espontneamente por la o las sustancias
presentes en los tejidos (polifenoles, aldehdos, etc). Los pigmentos melnicos son
derivados metablicos de la tirosina y de la fenilalanina y como estos poseen ncleos
fenlicos, se produce una reduccin de la plata a plata metlica negra.

REACTIVOS:
Solucin de nitrato de plata amoniacal
Antes de comenzar a trabajar, todo material de vidrio se debe de dejar en mezcla
sulfocrmica durante 5 a 10 minutos, luego lavar con chorros de agua corriente y por
ltimo enjuagar con agua destilada.
A 65 mL de nitrato de plata al 10% agregar, gota a gota, amonaco concentrado, se
producir entonces un precipitado grumoso; seguir agregando el amonaco hasta que la
solucin se vuelva transparente. Adicionar 5 mL de nitrato de plata lentamente y con
agitacin constante, el producto final ser una solucin clara. Dejar reposar toda la noche
en frasco hermtico y en lugar oscuro. Para trabajar diluir 25 mL de esta solucin en 75
mL de agua destilada.

Solucin acuosa de cloruro de oro al 0.1 %

Solucin acuosa de tiosulfato de sodio al 5 %

Soluciones colorantes de hematoxilina de Harris y eosina

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente
2. Lavar en agua destilada rigurosamente
3. Colocar en la solucin de nitrato de plata amoniacal por 1 hora a 56C
86
4. Lavar en agua destilada varios cambios
5. Colocar en el cloruro de oro durante 10 minutos
6. Lavar en agua destilada
7. Colocar en el tiosulfato de sodio por 5 minutos
8. Lavar en agua corriente por 1 minuto.
9. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos.
10. Lavar en agua corriente durante 1 minuto
11. Colorear con la eosina durante 15 segundos
13. Lavar en agua corriente durante 15 segundos
14. Deshidratar, aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Los pigmentos melnicos y sustancias argentafines se observan de color
negro, los ncleos de color morado y el citoplasma rosado.


























REFERENCIA: Lillie, R. D.: Histopathology Technic, Philadelphia, Blakiston Co., 1948, p
102.
87
DEMOSTRACION DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE
PEROXIDASA

OBJ ETIVO: Demostracin de actividad de la enzima peroxidasa

FIJ ACION: Los frotices sanguneos y los cortes por congelacin pueden ser fijados en
alcohol-formol (10:1); los tejidos fijados en formol e incluidos en parafina tambin sirven
ya que la enzima peroxidasa , resiste estos procedimientos.

MICROTOMIA: Secciones de parafina de 4 micras, o secciones por congelacin de 5 o 6
micras.

FUNDAMENTO: La peroxidasa es capaz de activar oxgeno de perxidos. El oxgeno
liberado tiene accin oxidante sobre substratos adecuados. Utilizando bencidina la
oxidacin tiene como resultado la formacin de un producto de color azul o pardo.

REACTIVOS:

SOLUCION ACUOSA SATURADA DE BENCIDINA

Disolver 50 mg de bencidina en 200 ml de agua destilada a 80 C, dejar enfriar a
temperatura ambiente y filtrar antes de usar.

SOLUCION DE PEROXIDO DE HIDROGENO AL 3 %

SOLUCION ACUOSA SATURADA DE CLORURO AMONICO

Disolver 40 g de cloruro amnico en 100 ml de agua destilada.

ETILENDIAMINO TETRAACETICO AL 5 %

Ajustar el pH a 6,0 con Hidrxido de sodio.

MEZCLA DE INCUBACION

Mezclar 1 ml de cloruro amnico con 1 ml de EDTA y aadir 9 ml de bencidina.
Finalmente agregar unas gotas de perxido de hidrgeno.

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente. Fijar los frotices en alcohol-formol y
llevarlos hasta agua corriente.
88
2. Someter los tejidos al bao de incubacin durante 5 10 minutos a temperatura
ambiente.
3. Lavar los tejidos con agua corriente durante 2 minutos
4. Contrastar los tejidos con Hematoxilina de Harris durante 1 - 3 minutos.
5. Lavar con agua corriente.
6. Deshidratar aclarar y montar

RESULTADOS:
Los sitos que demuestran actividad enzimtica de la peroxidasa se ven de color marrn
oscuro, ncleos de color azul.


REFERENCIA: SPANNHOF, Ludwig.: Histoqumica Prctica, Zaragoza, Edit. Acribia,
1966, p 195.



























89
INMUNOHISTOQUMICA


90
PROCEDIMIENTO DEL COMPLEJO STREPTAVIDINA-BIOTINA FOSFATASA
ALCALINA MTODO DEL H.A.M.A.

FIJ ACIN: Formol-zinc, formol neutro al 10% o en su defecto formol al 10%

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina de 3 a 4 micrmetros de grosor y recogerlas
del bao mara sobre lminas con poli L-lysina, inmediatamente se coloca en la estufa a
70C durante 15 minutos o 37-40C hasta el da siguiente.

SOLUCIONES:
Solucin de buffer ctrato pH=6.0
Solucin de cido citrico 0.1M (Solucin A):
cido citrico monohidratado (C
6
H
8
O
7
.H
2
Agua destilada c.s.p. 1000.00 mL
O) 21.01 g

Solucin de citrato de sodio 0.1M (Solucin B):
Citrato trisodico dihidratado (C
6
H
5
Na
3
O
7
.2H
2
Agua destilada c.s.p. 1000.00 mL
O) 29.41 g

Solucin de trabajo:
Solucin A 9.00 mL
Solucin B 41.00 mL
Agua destilada 450.00 mL
El pH de esta solucin debe ser 6.0 +/- 0.1

Solucin de buffer fosfato salino
Fosfato de sodio, dibsico, anhidro 1.48 g
Fosfato de sodio, monobsico, anhidro 0.43 g
Cloruro de sodio 7.20 g
Agua destilada c.s.p. 1000.00 mL
pH final 7.0 a 7.6

Solucin de pepsina
Pepsina 0.4 g
Solucin acuosa de cido clorhdrico pH=2.5 100.0 mL

Protena bloqueadora
Suero normal de la misma especie del anticuerpo primario.

Solucin de anticuerpo primario

91
Solucin de anticuerpo secundario biotinilado

Solucin del conjugado enzimtico Streptavidina-fosfatasa alcalina

Solucin del cromgeno-substrato

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos.
2. Desparafinar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos.
3. Tratar los cortes en alcohol absoluto 1 durante 5 minutos.
4. Tratar los cortes en alcohol absoluto 2 durante 5 minutos.
5. Tratar los cortes en el alcohol corriente 1 durante 5 minutos.
6. Tratar los cortes en el alcohol corriente 2 durante 5 minutos.
Si las secciones fueron fijadas con algn fijador mercurial, desenkerizar y luego
lavar en agua corriente durante 3 minutos.
Despigmentacin de tejidos ricos en melanina:
Tratar los cortes con solucin acuosa de permanganato de potasio al 0.25%
durante 1-4 horas.
Lavar con agua corriente.
Tratar los cortes con solucin acuosa de cido oxlico al 5% hasta que el
tejido se aclare.
Lavar en agua corriente durante 10 minutos.
7. Lavar en agua destilada 3 veces (dejar el agua en contacto con el tejido por 2
minutos cada vez).
8. Recuperacin del antgeno. Colocar los portaobjetos con los cortes de tejido
desparafinado en un recipiente de plstico.
Usar un microondas y efectuar los siguientes pasos:


Error!
Marcador
no definido.
PASO N 1

Llenar el recipiente de plstico con
solucin de cido ctrico pH=6.
Colocar en el microondas

Marcar 15 minutos. Ponga en
funcionamiento el microondas y
observar. Cuando el lquido
comience a hervir, parar el
microondas.
Error!
Marcador
no definido.
PASO N 2

Completar el volumen del recipiente con solucin de cido ctrico
pH=6.
Error!
Marcador
no definido.
PASO N 3

Colocar nuevamente en el
microondas

Ponga nuevamente en
funcionamiento el microondas y
observar. Cuando el lquido
comience a hervir parar el
92
microondas.
Error!
Marcador
no definido.
PASO N 4

Sacar el recipiente de plstico del
microondas y repetir los pasos 2
y 3, hasta completar los 10
minutos marcados.

Por ltimo dejar a temperatura
ambiente durante 5 minutos.
Error!
Marcador
no definido.
PASO N 5

Lavar en solucin de cido ctrico pH=6 fra

El nmero de tratamientos en el microondas y la ptima dilucin del anticuerpo,
debe ser determinada por cada Laboratorio.
9. Sacar las lminas del recipiente de plstico, colocarlas sobre un puente y, si el
anticuerpo primario lo requiere, digerir las secciones con una solucin fresca de
pepsina durante 10 minutos a 37C.(efectuar este paso dentro de una cmara
hmeda).
10. Sacar las lminas de la estufa y lavar en solucin buffer fosfato salino 3 veces
(dejar la solucin buffer fosfato salino en contacto con el tejido por 2 minutos cada
vez).
11. Escurrir y secar los bordes de la seccin con papel de filtro.
12. Tratar los cortes con la protena bloqueadora, durante 20 minutos, escurrir y secar
los bordes de la seccin con papel de filtro. No enjuagar, no lavar.
13. Tratar los cortes con la solucin de anticuerpo primario, durante 60 minutos.

14. Descartar la solucin anterior y lavar en solucin buffer fosfato salino 3 veces (dejar
la solucin buffer fosfato salino en contacto con el tejido por 2 minutos cada vez).
Escurrir y secar los bordes de la seccin con papel de filtro.
15. Tratar los cortes con la solucin de anticuerpo secundario biotinilado, durante 20
minutos.
16. Descartar la solucin anterior y lavar en solucin buffer fosfato salino 3 veces (dejar
la solucin buffer fosfato salino en contacto con el tejido por 2 minutos cada vez).
Escurrir y secar los bordes de la seccin con papel de filtro.
17. Tratar los cortes con la solucin del conjugado enzimtico
Streptavidina-fosfatasa alcalina, durante 20 minutos.
18. Descartar la solucin anterior y lavar en solucin buffer fosfato salino 3 veces (dejar
la solucin buffer fosfato salino en contacto con el tejido por 2 minutos cada vez).
Escurrir y secar los bordes de la seccin con papel de filtro.
19. Tratar los cortes con la solucin del cromgeno-substrato, durante 20 minutos.
20. Descartar la solucin anterior y lavar en solucin buffer fosfato salino 3 veces (dejar
la solucin buffer fosfato salino en contacto con el tejido por 2 minutos cada vez),
continuar el enjuague con agua destilada.
21. Colorear con hematoxilina de Harris diluida a la mitad, durante 2 minutos.
22. Lavar con agua corriente durante 3 minutos. Escurrir y secar los bordes de la
93
seccin con papel de filtro.
23. Montar en resina sinttica miscible con agua.

RESULTADOS:
Reaccin antgeno-anticuerpo positiva de color rojo, los ncleos de color azul.
















PROCEDIMIENTO DEL COMPLEJ O STREPTAVIDINA-BIOTINA PEROXIDASA
MTODO DEL H.A.M.A.

1. Preparar lminas con Poli-L- lisina
2. Cortar la muestra problema y la muestra control con el Micrtomo unos 3
micrmetros de grosor; recogerla en la lmina preparada con Poli- L- lisina, e
inmediatamente se coloca en la estufa a 70 C durante un tiempo de 10 minutos.
3. Desparafinar
Xilol 01 por 5 minutos
Xilol 02 por 5 minutos
4. Rehidratar
Alcohol absoluto 01 por 5 minutos
Alcohol absoluto 02 por 5 minutos
Alcohol corriente 01 por 5 minutos
Alcohol corriente 02 por 5 minutos
Agua corriente por 3 minutos.
5. Recuperacin Antignica: se colocan las lminas en un envase plstico
resistente al calor del horno microondas (coplin), se llena el recipiente con Buffer
Citrato pH 6, colocar en el horno microondas por 10 minutos, hasta que se inicie
la ebullicin, sacar y agregar ms buffer citrato, colocar nuevamente en el horno
microondas y as sucesivamente hasta cumplir los 10 minutos.
Culminado los 10 minutos se agrega una solucin detergente (12,5 ml de pinesol
+1 litro de agua) al envase plstico, colocar en el horno microondas por 10
94
minutos, igual que el anterior. Terminado dejar las lminas en el envase plstico
con la solucin detergente a temperatura ambiente hasta enfriar.
6. Lavado de lminas: colocar en un puente todas las lminas, lavar estas 3 veces
con agua destilada y eliminar el sobrenadante.
7. Agregar el perxido de hidrgeno (que cubra todo el tejido), dejar reposar por 20
minutos.
8. Eliminar el perxido de hidrgeno y enjuagar 3 veces con agua destilada.
Inmediatamente lavar con Buffer Fosfato 3 veces y dejar reposar por 2 minutos,
repetir 3 veces este procedimiento.
9. Secado de lminas con papel blanco, sin tocar las muestras.
10. Aplicar protena bloqueadora, dejar reposar por 20 minutos.
11. Secar el excedente con papel blanco, sin tocar las muestras.
12. Agregar 1 2 gotas del Anticuerpo Primario cubriendo todo el tejido problema,
incubar por 60 minutos a T ambiente.
13. Lavar con Buffer Fosfato 3 veces y dejar reposar por 2 minutos, repetir 3 veces
este procedimiento.
14. Secado de lminas con papel blanco, sin tocar las muestras.
15. Agregar 1 2 gotas de Anticuerpo Secundario Biotinilizado, incubar por 20
minutos a T ambiente.
16. Lavar con Buffer Fosfato 3 veces y dejar reposar por 2 minutos, repetir 3 veces
este procedimiento.
17. Secado de lminas con papel blanco, sin tocar las muestras.
18. Agregar la Enzima Conjugada (Streptavidina +Peroxidasa) de 1 a 2 gotas,
incubar por 20 minutos a T ambiente.
19. Lavar con Buffer Fosfato 3 veces y dejar reposar por 2 minutos, repetir 3 veces
este procedimiento.
20. Secado de lminas con papel blanco sin tocar las muestras.
21. Agregar el Sustrato con el Cromgeno (1ml de sustrato cromgeno +1 gota de
solucin cromgena (DAB)), por 10 minutos. Lavar con agua destilada.
22. Alcohol corriente 01 (6 sumergidas)
Alcohol corriente 02 (6 sumergidas)
Alcohol absoluto 01 (5 minutos)
Alcohol absoluto 02 (5 minutos)
Xilol 01 (5 minutos)
Xilol 02 (5 minutos)
Montaje.
23. Las muestras positivas mostrarn una coloracin marrn en la zona donde se
encuentren los respectivos receptores.


OBSERVACIONES:
FALSOS NEGATIVOS
La fijacin inadecuada, congelacin, descongelacin, lavados, secados,
calentamiento pueden producir artefactos, atrapamientos de anticuerpos.

FALSOS POSITIVOS
Los falsos positivos pueden igualmente observarse a consecuencia de la reaccin
95
cruzada de otros reactivos empleados en la coloracin, como por ejemplo:
fosfatasa alcalina endgena o peroxidasa endgena, respectivamente, o por
reacciones inespecficas con clulas necrosadas o degeneradas
1

.



..mientras ms dura la tarea ms dulce ser la victoria..









































1 DAKO RECEPTOR ESTROGNI CO DAKO- ER I D5 ( Cd. N M7047)
96
MTODO DE COLORACIN CON LUXOL FAST BLUE PARA MITOCONDRIAS

FIJACIN: Fijar piezas pequeas y delgadas en lquido de Regaud.

MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 3 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin colorante de luxol fast blue al 0.1%.
Luxol fast blue MBS, MBSN (C.I. ) 0,1 g
Alcohol de 95% 100,0 mL
Disolver el colorante en el alcohol. Adicionar 5,0 mL de cido actico glacial por
cada 1000,0 mL de solucin colorante.

Solucin de carbonato de litio al 0,05%
Carbonato de litio 0,05 g
Agua destilada c.s.p 100,0 mL

Solucin colorante de hematoxilina de Harris o hemalumbre de Harris
Hematoxilina (C.I. 75290) 5,0 g
Alcohol corriente 95% 50,0 mL
Sulfato doble de aluminio y potasio o sulfato doble de aluminio y amonio 100,0 g
Agua corriente 1000,0 mL
Oxido mercrico rojo o amarillo 2,0 g
Disolver la hematoxilina en el alcohol, el alumbre (sulfato doble) en el agua con
ayuda del calor. Mezclar las dos soluciones. Llevar la mezcla a ebullicin tan rpido
como sea posible, luego sacarla del calor y adicionar el xido mercrico. Recalentar la
mezcla, hasta que tenga un color prpura oscuro, cerca de 1 minuto. Luego retirar del
calor y enfriar rpidamente. La solucin est lista para ser usada.

Solucin stock de eosina acuosa al 1%
Eosina amarilla (C.I. 45380) 10,0 g
Agua destilada 1000,0 mL
Disolver y adicionar:
cido actico glacial 2,0 mL

Solucin colorante de trabajo de eosina
Solucin stock de eosina acuosa al 1% 1 vol.
Alcohol al 80% 3 vol.
Adicionar 0,5 mL de cido actico glacial por cada 100,0 mL de solucin colorante.

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar los cortes e hidratar hasta agua corriente.
2. Poner las lminas en un coplin y agregar solucin colorante de luxol fast blue, tapar
97
y colocar en una estufa a 57C durante 24 horas.
4. Lavar los cortes en el alcohol corriente.
5. Lavar en agua corriente.
5. Diferenciar los cortes en la solucin de carbonato de litio al 0,05%.
6. Sumergir los cortes, rpidamente, en agua corriente.
7. Repetir los pasos 3,4 y 5 hasta que el corte se ponga claro.
8. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos.
9. Lavar en agua corriente durante 2 minutos.
10. Colorear con la solucin de trabajo de eosina, durante 10 segundos.
11. Lavar en agua corriente durante 1 minuto.
12. Tratar los cortes, rpidamente 5 veces en el alcohol corriente 1.
13. Tratar los cortes, rpidamente 5 veces en el alcohol corriente 2.
14. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 1 durante 3 minutos.
15. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 2 durante 3 minutos.
16. Tratar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos.
17. Tratar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos.
18. Montar en blsamo de Canad.
19. Montar con blsamo de Canad.

RESULTADOS: Las mitocondrias se observan de color azul turquesa, ncleos morados
y citoplasma rosado.


















REFERENCIA: Kluver, H., and Barrera, E.: J ournal of Neuropathology and Exper. Neurol.
12: 400-403, 1953.
98
MTODO DE HEMATOXILINA FRRICA DE WEIGERT PARA ERGASTOPLASMA

FIJACIN: Fijar piezas frescas de mdula espinal en alcohol de 95%.

MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 3 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin A de hematoxilina frrica de Weigert
Hematoxilina (C.I. 75290) 1,0 g
Alcohol absoluto 100,0 mL

Solucin B de hematoxilina frrica de Weigert
Cloruro frrico 29% 4,0 mL
Agua destilada 95,0 mL
cido clorhdrico concentrado 1,0 mL

Solucin de trabajo de hematoxilina frrica de Weigert
Solucin A 1 vol.
Solucin B 1 vol.

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar, hidratar y enjuagar con agua corriente.
2. Colorear en solucin de hematoxilina de Weigerth por 10 minutos.
3. Lavar en agua corriente.
4. Deshidratar, aclarar y montar con blsamo de Canad.

RESULTADOS: Las sustancias basfilas como ncleo y ergastoplasma (retculo
endoplsmico rugoso) se observan de color negro.











REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, W.B. Saunders
Company, 1942, pgina 86.
99
MTODO DE IMPREGNACIN ARGNTICA DIRECTA DE DA FANO
PARA EL APARATO DE GOLGI

FIJACIN: Fijar pequeas piezas frescas durante 3 horas en la siguiente mezcla fijadora:
Formol comercial 15,0 mL
Agua destilada 100,0 mL
Nitrato de cobalto 1,0 g

SOLUCIONES:
Solucin reductora de Cajal
Formol neutro 7,5 mL
Agua destilada 50,0 mL
Hidroquinona 1,0 g
Sulfito de sodio 0,25 g

Solucin acuosa de nitrato de plata al 1,5%
Nitrato de plata 1,5 g
Agua destilada 100,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Despus de fijar, lavar inmediatamente con agua destilada durante 30 minutos.
2. Tratar los tejidos con solucin acuosa de nitrato de plata al 1,5%, durante 16 a 24
horas y en oscuridad.
3. Lavar con agua destilada durante 4 minutos.
4. Tratar los bloques de tejidos con la solucin reductora de Cajal durante 8, 16 y 24
horas.
5. Lavar en agua destilada durante 2 minutos.
6. Tratar las piezas con alcoholes de 70%, 80%, 90%, 96% y 96% cada uno, una hora
respectivamente.
7. Tratar las piezas con 3 alcoholes absolutos y 2 xiloles, cada uno 2 horas
respectivamente.
8. Tratar los tejidos con 2 cambios de parafina, cada uno de 1 hora, respectivamente.
9. Cortar con el micrtomo de Minot, secciones de parafina de 3 micrmetros de
grosor. Recoger los cortes con una lmina portaobjeto con albmina.
10. Desparafinar los cortes e hidratar hasta agua corriente.
11. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 5 minutos.
12. Lavar en agua corriente durante 2 minutos.
13. Sumergir los cortes, rpidamente, 3 veces en el alcohol cido al 1%.
14. Lavar inmediatamente con agua corriente.
15. Sumergir los cortes, rpidamente 3 veces en solucin de agua amoniacal al 1%.
16. Lavar inmediatamente con agua corriente y verificar si los ncleos estn bien
100
teidos observando al microscopio.
17. Colorear con la solucin de trabajo de eosina, durante 4 minutos.
18. Lavar en agua corriente durante 10 segundos.
19. Deshidratar, aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: El aparato de Golgi se observa de color negro, ncleos azules y
citoplasma rosado.
































REFERENCIA: Martoja, R. Martoja-Pierson, M.: Initiation aux techniques de l' histologie
animale. Masson ET C
ie
,diteurs 120, bd St-Germain, Paris-VI. 1967, pp 106-107.
101
COLORACIN DE VAN GIESON PARA FIBRAS COLGENAS

FIJACIN: Lquido de Bouin, formol al 10%.

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina de 6 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin A de hematoxilina frrica de Weigert
Hematoxilina (C.I. 75290) 1,0 g
Alcohol absoluto 100,0 mL

Solucin B de hematoxilina frrica de Weigert
Cloruro frrico 29% 4,0 mL
Agua destilada 95,0 mL
cido clorhdrico concentrado 1,0 mL

Solucin de trabajo de hematoxilina frrica de Weigert
Solucin A 1 vol.
Solucin B 1 vol.

Solucin de picrofucsina de Van Gieson
Fucsina cida (C.I. 42685) solucin acuosa 1% 5,0 mL
Solucin acuosa saturada de cido pcrico (C.I. 10305) 100,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar, hidratar y enjuagar con agua corriente.
2. Colorear con solucin de trabajo de hematoxilina de Weigerth por 10 minutos.
3. Lavar en agua corriente durante 5 minutos y luego enjuagar con agua destilada.
4. Contracolorear en solucin de Van Gieson por 5 minutos.
5. Diferenciar en alcohol de 95%.
6. Tratar los cortes, rpidamente 5 veces en el alcohol absoluto 1.
7. Tratar los cortes, rpidamente 5 veces en el alcohol absoluto 2.
8. Tratar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos.
9. Tratar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos.
10. Montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Las fibras colgenas se observan de color rojo; msculo, epitelio
cornificado de color amarillo y ncleo de color azul o negro.

NOTA:
- El agua de alta dureza puede remover la fucsina cida de la solucin de Van
102
Gieson, el cual se forma fucsinatos alcalinos que son incoloros.
- La solucin B puede remover la hematoxilina de Weigert.
- Los rganos duros como el tero quedan relativamente suaves despus de la
fijacin con Bouin al igual que el corazn.
- Montar en Permount o blsamo. Se puede aadir 3 gotas de solucin alcohlica
saturada con cido pcrico para cada 50 mL de xilol usado como aclarador. Montar
en xilol acidificado. Esto intensifica el fondo y evita que las secciones se decoloren.
































REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological techniques, Philadelphia, W.B. Saunders, 1942,
pgina 152.
103
COLORACIN TRICRMICA DE MASSON

FIJACIN: Lquido de Bouin o formol al 10%.

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina de 6 micrmetro de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin de Bouin
Solucin acuosa saturada de cido pcrico (C.I. 10305) 75,0 mL
Formaldehdo comercial (37-40%) 25,0 mL
cido actico glacial 5,0 mL

Solucin A de hematoxilina frrica de Weigert
Hematoxilina (C.I. 75290) 1,0 g
Alcohol absoluto 100,0 mL

Solucin B de hematoxilina frrica de Weigert
Cloruro frrico 29% 4,0 mL
Agua destilada 95,0 mL
cido clorhdrico concentrado 1,0 mL

Solucin de trabajo de hematoxilina frrica de Weigert
Solucin A 1 vol.
Solucin B 1 vol.

Solucin de fucsina cida - escarlata de Biebrich
Solucin acuosa de escarlata de Biebrich (C.I. 26905) al 1% 90,0 mL
Solucin acuosa de fucsina cida (C.I. 17200) al 1% 10,0 mL
cido actico glacial 1,0 mL

Solucin de cido fosfomolbdico - cido fosfotngstico
cido fosfomolbdico 5,0 g
cido fosfotngstico 5,0 g
Agua destilada 200,0 mL

O

Solucin de cido fosfotngstico 5%
cido fosfotngstico 5,0 g
Agua destilada 100,0 mL

104
Solucin de azul de anilina
Azul anilina (C.I. 707) 2,5 g
cido actico 2,0 mL
Agua destilada 100,0 mL

O

Solucin de light green sf yellowish
Light green sf yellowish (C.I. 42095) 5,0 g
Agua destilada 250,0 mL
cido actico glacial 2,0 mL
Calentar el agua, disolver el verde brillante, enfriar, filtrar y adicionar el cido
actico.

Solucin de cido actico al 1%
cido actico glacial 1,0 mL
Agua destilada c.s.p 100,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente.
2. Mordentar en fijador de Bouin por 1 hora a 56C, o durante toda la noche a
temperatura ambiente.
3. Enfriar y lavar en agua corriente hasta que desaparezca el color amarillento.
4. Solucin de hematoxilina frrica de Weigert por 10 minutos. Lavar en agua
corriente por 10 minutos.
5. Enjuagar en agua destilada.
6. Solucin Escarlata de Biebrich - Fucsina cida por 15 minutos. Regresar la
solucin al frasco.
7. Enjuagar con agua destilada.
8. Solucin de cido fosfomolbdico-cido fosfotngstico por 10 a 15 minutos antes de
la solucin de azul de anilina. O tambin se puede usar cido fosfotngstico en
solucin acuosa al 5% por 15 minutos antes del colorante light green. Descartar la
solucin.
9. Solucin azul de anilina por 5 a 10 minutos o solucin de light green por 4 a 8
minutos. Regresar la solucin al frasco.
10. Lavar en agua destilada.
11. Agua actica al 1% por 3 a 5 minutos. Descartar la solucin.
12. Alcohol al 95%.
13. Alcohol absoluto - 2 cambios.
14. Xilol - 2 cambios.
15. Montar en Permount o blsamo.
105
RESULTADOS: Ncleos de color negro, citoplasma, queratina, fibras musculares de color
rojo y fibras colgenas y moco de color azul si se uso azul de anilina o verde si se uso light
green sf.

NOTA:
B. Para secciones del sistema nervioso central ( SCN), cambiar el tiempo
establecido en los siguientes pasos:
7. Escarlata de Biebrich - fucsina cida por 1 a 2 minutos.
9. Solucin de cido fosfomolbdico - cido fosfotngstico por 10 a
30 minutos.
10. Solucin de azul de anilina por 15 a 20 minutos.
C. La deshidratacin y aclaramiento tiene que ser rpidamente para evitar la
prdida de colorante en este proceso.










REFERENCIA: Masson, P.J .: J . Tech. Methods 12:75-90, 1929, y Lillie, R.D.:
Histopathological Technique, Philadelphia, Blakiston Co., 1948, pgina 196. [Modificacin
de la A.F.I.P.]
106
IMPREGNACIN ARGNTICA DE GOMORI PARA RETICULINA

FIJ ACIN: De preferencia fijar tejido fresco en alcohol de 95% o en su defecto usar formol
al 10%.

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina de 6 a 8 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin de plata amoniacal
Antes de comenzar a trabajar, todo material de vidrio se debe de dejar en mezcla
sulfocrmica durante 5 a 10 minutos, luego lavar con chorros de agua corriente y por
ltimo enjuagar con agua destilada.
A 10 mL de solucin acuosa de nitrato de plata al 10%, agregar de 2,0 a 2,5 mL de
solucin acuosa de hidrxido de potasio al 10%, luego aadir hidrxido de amonio, gota a
gota, mientras se va agitando el recipiente constantemente, hasta que el precipitado este
disuelto completamente. Aadir otra vez, con cuidado, solucin de nitrato de plata, gota a
gota, hasta que el precipitado resultante desaparezca con cierta dificultad al agitar la
solucin. Llevar la solucin con agua destilada hasta dos veces su volumen.

Solucin de permanganato de potasio al 0,5 %
Permanganato de potasio 0,5 g
Agua destilada c.s.p 100,0 mL

Solucin de disulfito de potasio al 2%
Disulfito de potasio o de sodio 2,0 g
Agua destilada c.s.p 100,0 mL

Solucin de sulfato de amonio frrico
Sulfato de amonio frrico 2,0 g
Agua destilada 100,0 mL

Solucin de formol
Solucin de formaldehido 20,0 mL
Agua destilada 80,0 mL

Solucin de cloruro de oro
Solucin stock de cloruro de oro 20,0 mL
Agua destilada 80,0 mL


107
Solucin de tiosulfato de sodio
Tiosulfato de sodio 2,0 g
Agua destilada 100,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente.
2. Oxidar en solucin acuosa de permanganato de potasio al 0,5% por 1 minuto.
3. Lavar en agua corriente por 2 minutos.
4. Diferenciar con solucin acuosa de disulfito de potasio por 1 minuto.
5. Lavar en agua corriente por 2 minutos.
6. Sensibilizar en solucin de sulfato de amonio frrico al 2% por 1 minuto.
7. Lavar en agua corriente por 2 minutos; seguido con 2 cambios de agua destilada
30 segundos cada vez.
8. Impregnar en la solucin de plata por 1 minuto.
9. Enjuagar en agua destilada por 20 segundos.
10. Reducir por 3 minutos en formol al 20%.
11. Lavar en agua corriente por 3 minutos.
12. Tonificar con solucin de cloruro de oro al 0,2% por 10 minutos.
13. Enjuagar en agua destilada.
14. Reducir la tonificacin en una solucin de metabisulfito de potasio al 2% por 1
minuto.
15. Fijar en solucin de tiosulfato de sodio al 2% por 1 minuto.
16. Lavar en agua corriente por 2 minutos.
17. Deshidratar y montar en Permount.

RESULTADOS: Fibras reticulares de color negro.


REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, W.B. Saunders Co.,
1938, pgina 164.
108
COLORACIN DE VERHOEFF PARA FIBRAS ELSTICAS

FIJ ACIN: Se puede utilizar cualquier buen fijador tisular.

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina de 6 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin colorante de tejido elstico
Disolver 1,0 g de hematoxilina (C.I. 75290) en 22 mL de alcohol absoluto en un
recipiente abierto sobre una plancha caliente. Enfriar, filtrar y aadir 8 mL de solucin
acuosa de cloruro frrico al 10% y 8 mL de solucin de Iodo (iodo 2 g, yoduro de potasio 4
g disueltos en 100 mL de agua destilada).
Nota: Para mejores resultados, hacer la solucin momentos antes de colorear.

Solucin de cloruro frrico
Cloruro frrico 2,0 g
Agua destilada 100,0 mL

Solucin colorante de picrofucsina de van Gieson
Fucsina cida (C.I. 42685) solucin acuosa 1% 5,0 mL
Solucin acuosa saturada de cido pcrico (C.I. 10305) 100,0 mL

Solucin de tiosulfato de sodio al 5%
Tiosulfato de sodio 5,0 g
Agua destilada c.s.p 100,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
2. Coloracin de tejido elstico de Verhoeff por 15 minutos.
3. Lavar en agua corriente.
4. Diferenciar en cloruro frrico al 2%, solo unos cuantos minutos. Chequear bajo el
microscopio y si se sobrediferencia recolorear.
5. Colocar en tiosulfato de sodio al 5% por 1 minuto.
6. Lavar en agua corriente por 5 minutos y luego enjuagar en agua destilada.
7. Contracolorear en colorante de van Gieson por 1 minuto.
8. Diferenciar en alcohol 95%.
9. Alcohol absoluto - 2 cambios.
10. Xilol - 2 cambios.
11. Montar en blsamo de Canada.


109
RESULTADOS: Fibras elsticas de color azul negruzco a negro, ncleo de color azul a
negro, fibras colgenas de color rojo y otros elementos tisulares de color amarillo.







REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, W.B. Saunders Co.,
1942, pgina 170.
110
COLORACIN DE GIEMSA (MODIFICACIN DE WOLBACH)

FIJ ACIN: Los tejidos fijados en Zenker dan muy buenos resultados, pero pueden ser
usados otros fijadores tisulares.

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina de 4 a 5 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin stock de Giemsa
Giemsa en polvo 1,0 g
Alcohol metlico 66,0 mL
Glicerina 66,0 mL
Aadir la glicerina al Giemsa en polvo y colocarlo a la estufa a 60C por a 2
horas. Luego aadir el alcohol metlico.

Solucin de trabajo
Giemsa stock 1,25 mL
Alcohol metlico 1,50 mL
Agua destilada 50,00 mL

Solucin stock de rosina
Rosina pura 10,0 g
Alcohol absoluto 100,0 mL

Solucin de trabajo de rosina
Solucin stock de rosina 5,0 a 10,0 mL
Alcohol 95% 40,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta alcohol de 95%.
2. Remover los precipitados de mercurio por medio del iodo y tiosulfato de sodio 5%
si la muestra fue fijada en Zenker.
3. Lavar bien en agua corriente.
4. Enjuagar en agua destilada.
5. Colocar en solucin de trabajo de Giemsa. Toda la noche.
6. Diferenciar en alcohol rosina hasta que las secciones asuman un color rosado
prpura. Chequear bajo el microscopio.
7. Alcohol absoluto. 2 cambios.
8. Xilol. 2 cambios.
9. Montar en Permount.

111
RESULTADOS: Ncleo de color azul, citoplasma, colgeno y otros elementos tisulares de
color rosado
















OBSERVACIONES:
A. El mtodo de coloracin de Giemsa colorea mucho mejor si el tejido ha estado en
pH cido. Si el tejido no ha sido acidificado por la descalcificacin, etc., colocar en
alcohol-cido, lavar bien, empezar la coloracin.
B. Se puede preparar una solucin de trabajo modificada de la siguiente manera: se
diluye la solucin stock 1:20 con agua destilada o con solucin buffer fosfato pH
6,8-7,2. debe ser una solucin fresca y se prepara momentos antes de usar.
7. Colocar en solucin de trabajo Giemsa por 30 minutos.
8. Enjuagar con agua destilada el exceso de colorante.
9. Diferenciar con cido actico al 1 uno por mil en agua destilada pasando
rpidamente y enjugando inmediatamente con agua destilada cuando se llegue al
punto deseado, sea, cuando los eritrocitos tomen un color rosa rojizo plido. En
todo caso, los cortes deben chequearse en el microscopio o cuando tomen un color
rosado prpura.
10. Enjuagar en agua destilada abundante.
11. Dejar secar los cortes histolgicos a medio ambiente.
12. Montar en blsamo de Canad.




REFERENCIA: Lillie, R.D.: Histopathological Technique and Practical Histochemistry,
New York, Blakiston Co., 1954, pgina 385.
112
MTODO DE SCHMORL PARA DEMOSTRACIN DE
LAGUNAS Y CANALCULOS SEOS

FIJ ACIN: Lquido de Orth y luego lavar en agua y descalcificar en solucin de Ebner.

MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 4 a 5 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Lquido de Ebner
Solucin acuosa saturada de cloruro de sodio 100,0 mL
cido clorhdrico 4,0 mL
Agua destilada 100,0 mL
Aadir 1 2 mL de HCl cada da hasta que el hueso este suave.

Solucin de Nicolle
Solucin saturada de tinina (C.I. 52000) en alcohol al 50% 10,0 mL
Solucin acuosa de cido carblico al 1% 100,0 mL

o

Solucin de tionina
Solucin saturada de tinina (C.I. 52000) en alcohol al 50% 2,0 mL
Agua destilada 10,0 mL

Solucin de cido fosfotngstico
cido fosfotngstico para saturar
Agua destilada 20,0 mL

Agua amoniacal diluida
Hidrxido de amonio 10,0 mL
Agua destilada 100,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Colorear en carbol-tionina de Nicolle 3 minutos o solucin de tionina con 1 a 2
gotas de agua amniacal diluida.
2. Llevar a la solucin de cido fosfotngstico por unos pocos segundos hasta que las
secciones quedan de color azul, verde o gris.
3. Lavar en agua 5 a 10 minutos hasta que las secciones queden azul claro.
4. Colocar en agua amoniacal diluida, 3 a 5 minutos. Si la sustancia de fondo est
coloreada demasiado intenso, tratar con alcohol-cido por 5 minutos y lavar en
agua antes de deshidratar.
113
5. Lavar en alcohol 90%, varios cambios.
6. Deshidratar rpidamente, aclarar y montar.

RESULTADOS: Los bordes de lagunas y canalculos seos de color negro azulado,
sustancia de fondo de color azul verdoso y otros elementos celulares de color azul difuso.














REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, W.B. Saunders Co.,
1938, pgina 173.
114
COLORACIN DE AZUL DE TOLUIDINA PARA COLOREAR SUSTANCIA
FUNDAMENTAL DE TEJIDO CARTILAGINOSO

FIJ ACIN: Formol al 10% neutro.

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina en 6 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin de azul de toluidina
Azul de toluidina (C.I. 52040) 0,1 g
Agua destilada 100,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.
2. Colorear en solucin azul de toluidina por 1 a 2 minutos.
3. Enjuagar en agua destilada.
4. Cubrir las secciones con un cubreobjeto.
5. Sellar el borde del cubreobjeto presionando con la ua.
6. Examinar las secciones tan pronto como sea posible despus de la preparacin.

RESULTADOS: Cartlago de color rojo violceo y ncleos de color azul .


















REFERENCIA: J ohnson, F. B.: Available in mimeographed form Armed Forces Institute of
Pathology.
115
MTODO DE COLORACIN CON LUXOL FAST BLUE PARA BANDAS DE
MIELINA

FIJ ACIN: Fijar en lquido de Regaud o en formol al 10%.

MICROTOMIA: Cortar secciones de parafina de 5 a 6 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin colorante de luxol fast blue al 0.1%.
Luxol fast blue MBS, MBSN (C.I.) 0,1 g
Alcohol de 95% 100,0 mL
Disolver el colorante en el alcohol. Adicionar 5,0 mL de cido actico glacial por
cada 1000,0 mL de solucin colorante.

Solucin de carbonato de litio al 0,05%
Carbonato de litio 0,05 g
Agua destilada c.s.p 100,0 mL

Solucin colorante de hematoxilina de Harris o hemalumbre de Harris
Hematoxilina (C.I. 75290) 5,0 g
Alcohol corriente 95% 50,0 mL
Sulfato doble de aluminio y potasio o sulfato doble de aluminio y amonio 100,0 g
Agua corriente 1000,0 mL
Oxido mercrico rojo o amarillo 2,0 g
Disolver la hematoxilina en el alcohol, el alumbre (sulfato doble) en el agua con
ayuda del calor. Mezclar las dos soluciones. Llevar la mezcla a ebullicin tan rpido
como sea posible, luego sacarla del calor y adicionar el xido mercrico. Recalentar la
mezcla, hasta que tenga un color prpura oscuro, cerca de 1 minuto. Luego retirar del
calor y enfriar rpidamente. La solucin est lista para ser usada.

Solucin stock de eosina acuosa al 1%
Eosina amarilla (C.I. 45380) 10,0 g
Agua destilada 1 000,0 mL
Disolver y adicionar:
cido actico glacial 2,0 mL

Solucin colorante de trabajo de eosina
Solucin stock de eosina acuosa al 1% 1 vol.
Alcohol al 80% 3 vol.
Adicionar 0,5 mL de cido actico glacial por cada 100,0 mL de solucin colorante.



116
PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar los cortes e hidratar hasta agua corriente.
2. Poner las lminas en un coplin y agregar solucin colorante de luxol fast blue, tapar
y colocar en una estufa a 57C durante 24 horas.
3. Lavar los cortes en el alcohol corriente.
4. Lavar en agua corriente.
5. Diferenciar los cortes en la solucin de carbonato de litio al 0,05%.
6. Sumergir los cortes, rpidamente, en agua corriente.
7. Repetir los pasos 3,4 y 5 hasta que el corte se ponga claro.
8. Colorear con la hematoxilina de Harris durante 2 minutos.
9. Lavar en agua corriente durante 2 minutos.
10. Colorear con la solucin de trabajo de eosina, durante 10 segundos.
11. Lavar en agua corriente durante 1 minuto.
12. Tratar los cortes, rpidamente 5 veces en el alcohol corriente 1.
13. Tratar los cortes, rpidamente 5 veces en el alcohol corriente 2.
14. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 1 durante 3 minutos.
15. Tratar los cortes en el alcohol absoluto 2 durante 3 minutos.
16. Tratar los cortes en el xilol 1 durante 5 minutos.
17. Tratar los cortes en el xilol 2 durante 5 minutos.
18. Montar en blsamo de Canad.
19. Montar con blsamo de Canad.

RESULTADOS: Las bandas de mielina se observan de color azul turquesa, ncleos
morados y citoplasma rosado.















REFERENCIA: Kluver, H., and Barrera, E.: J ournal of Neuropathology and Exper. Neurol.
12: 400-403, 1953.
117
COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN PARA MICROORGANISMOS
CIDO-ALCOHOL RESISTENTES

FIJ ACIN: Se puede usar cualquier buen fijador tisular.

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina de 4 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin de carbol-fucsina
cido carblico (fenol, cido fnico) 2,5 mL
Alcohol absoluto 5,0 mL
Fucsina bsica (C.I. 42510) 0,5 g
Agua destilada 50,0 mL
Nota: Guardar a temperatura ambiente. Filtrar antes de usar.

Alcohol cido al 1%
cido clorhdrico concentrado 1,0 mL
Alcohol 70% 99,0 mL

Solucin de trabajo de azul de metileno
Azul de metileno (C.I. 52015) 0,5 g
cido actico glacial concentrado 0,5 mL
Agua corriente 100,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente.
2. Colorear las lminas con solucin de carbol-fucsina durante 10 minutos. Filtrar la
solucin antes de usar.
3. Enjuagar bien en agua corriente.
4. Decolorar con alcohol-cido al 1% o cido sulfrico 1%, hasta que las lminas
estn de color rosa plido.
5. Lavar con agua corriente 8 minutos.
6. Contra colorear por un zambullida de la lmina a un tiempo en la solucin de
trabajo de azul de metileno. Las lminas deben de quedar de un color azul plido.
La sobre coloracin puede enmascarar a los bacilos.
7. Lavar con agua corriente.
8. Secar en la estufa, aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Organismos cido-alcohol resistentes (mycobacterium, Criptosporidium
sp., Actynomices sp.) de color rojo brillante, eritrocitos de color naranja amarillento, otros
elementos tisulares de color azul plido.
118




































REFERENCIA: Mallory, F.B.: Pathological Technique, Philadelphia, Pa., W.B. Saunders
Co. 1942, pgina 275 (Modificacin de A.F.I.P.)



119
COLORACIN DE WAYSON PARA Helicobacter pylori

FIJ ACIN: Se puede utilizar cualquier buen fijador tisular.

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina de 4 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin A
Fucsina bsica (C.I. 42510) 0,2 g
Alcohol etlico absoluto 20,0 mL
Azul de metileno (C.I. 52015) 0,75 g

Solucin B
cido carblico (fenol, cido fnico) 5,0 g
Agua destilada 100,0 mL

Solucin de trabajo
Solucin A 1 vol.
Solucin B 2 vol.
Nota: Filtrar antes de usar, esta solucin puede durar hasta seis meses.

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua corriente.
2. Colorear durante 5 minutos en la solucin de trabajo recin filtrada.
3. Deshidratar rpidamente, aclarar y montar.

RESULTADOS: Helicobacter pilorico de color azul oscuro, fondo de color azul plido.












REFERENCIA: Sonnenwirth, Alex C.: Mtodo y Diagnstico del Laboratorio Clnico.
Editorial Panamericana, Buenos Aires. Argentina. pp 97-98, 1983.
120
IMPREGNACIN ARGNTICA DE WARTHIN-STARRY PARA Helicobacter pylori

FIJ ACIN: Formol al 10%. No utilizar fijadores con cido crmico

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina 3 a 4 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin tampn
Acetato sdico 1,64 g
cido actico 2,5 mL
Agua destilada 200,0 mL

Solucin de nitrato de plata
Nitrato de plata 0,5 g
Solucin tampn 50,0 mL

Solucin 1
Hidroquinona 0,3 g
Solucin tampn 10,0 mL
Se toma 1,0 mL de esta solucin y se mezcla con 15,0 mL de solucin de
gelatina al 5% a 37C (5,0 g de gelatina en 100,0 mL de solucin tampn). Almacenar a
37C

Solucin 2
Solucin acuosa de nitrato de plata al 2% a 60C 3,0 mL

Solucin de trabajo
Mezclar las soluciones 1 y 2 inmediatamente antes de usar.

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. Las lminas previamente coloreadas
con otros colorantes pueden ser usados removiendo el cubreobjeto en xilol y corriendo
a travs de alcoholes hasta agua.
2. Lavar bien en solucin tampn.
6. Colocar en la solucin de nitrato de plata al 1% en la estufa a 58 a 60 C por 30 a 60
minutos. Usar pinzas cubiertas con parafina para poder remover las lminas de esta
solucin. Lavar en la solucin tampn.
7. Desarrollar las secciones en la solucin de trabajo durante 3 minutos a 60C
8. Enjuagar en agua corriente a 60C.
9. Lavar los cortes en la solucin tampn.
10. Deshidratar, aclarar y montar en blsamo de Canad.
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RESULTADOS: Helicobacter pilorico de color negro, fondo amarillo parduzco.





































REFERENCIA: Garca del Moral, Raimundo: Laboratorio de anatoma patolgica. Primera
edicin. Interamericana. McGraw-Hill, Madrid, Espaa. 1993, pp 286-287.
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IMPREGNACIN DE NITRATO DE PLATA-METANAMINE DE GOMORI
(APLICACIN DE GROCOTT PARA HONGOS)

FIJ ACIN: Formol al 10%.

MICROTOMA: Cortar secciones de parafina de 5 micrmetros de grosor.

SOLUCIONES:
Solucin de cido crmico al 5%
cido crmico 5,0 g
Agua destilada 100,0 mL

Solucin de nitrato de plata al 5%
Nitrato de plata 5,0 g
Agua destilada c.s.p. 100,0 mL

Solucin de metenamine al 3%
Hexametilenotetramino 3,0 g
Agua destilada 100,0 mL

Solucin de borax al 5%
Borax 5,0 g
Agua destilada 100,0 mL

Solucin stock de nitrato de plata-metanamine
Solucin de nitrato de plata al 5% 5,0 mL
Solucin de metenamine al 3% 100,0 mL
Se forma un precipitado blanco, pero inmediatamente agitar para disolverlo.

Solucin de trabajo de nitrato de plata-metanamine
Solucin de borax al 5% 2,0 mL
Agua destilada 25,0 mL
Combinar y aadir:
Solucin stock de nitrato de plata-metanamine 25,0 mL

Solucin de disulfito de sodio al 1%
Disulfito de sodio 1,0 g
Agua destilada 100,0 mL

Cloruro de oro al 0,1%
Solucin de cloruro de oro 1% 10,0 mL
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Agua destilada 90,0 mL
Esta solucin puede ser usada repetidamente.

Solucin de tiosulfato de sodio al 2%
Tiosulfato de sodio 2,0 g
Agua destilada 100,0 mL

Solucin stock de light green sf yellowish
Light green sf yellowish (C.I. 42095) 0,2 g
Agua destilada 100,0 mL
cido actico glacial 0,2 mL

Solucin de trabajo de light green sf yellowish
Solucin stock de light green sf yellowish 10,0 mL
Agua destilada 50,0 mL

PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. Las lminas previamente coloreadas
con otros colorantes pueden ser usados removiendo el cubreobjeto en xilol y
corriendo a travs de alcoholes hasta agua.
2. Oxidar en solucin de cido crmico al 5% por una hora.
3. Lavar en agua corriente por pocos segundos.
4. Enjuagar en disulfito de sodio al 1% por 1 minuto para remover cualquier residuo
de cido crmico. Lavar en agua corriente por 5 a 10 minutos.
5. Lavar con 3 4 cambios de agua destilada.
6. Colocar en solucin de trabajo de nitrato de plata-metanamine en la estufa a 58 a
60 C por 30 a 60 minutos hasta que los tejidos se tornen de color marrn
amarillento. Usar pinzas cubiertas con parafina para poder remover las lminas de
esta solucin. Lavar en agua destilada y chequear bajo el microscopio. Los hongos
pueden estar marrn oscuro en este estado.
7. Enjuagar en seis cambios de agua destilada.
8. Dar tono en solucin de cloruro de oro 0,1% por 2 a 5 minutos.
9. Enjuagar en agua destilada.
10. Remover la plata no reducida con solucin de tiosulfato de sodio al 2% por 2 a 5
minutos. Lavar en agua corriente.
11. Contrastar con solucin de trabajo de light green sf yellowish por 30 a 45 segundos.
12. Lavar en agua corriente. Deshidratar, aclarar y montar en blsamo de Canad.

RESULTADOS: Los hongos se observan de color negro, la mucina de color gris oscuro y
el fondo de color verde plido.

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REFERENCIA: Grocott, R.G.: Am. J . Clin. Path. 25: 975-979, 1955.