DENGAN -AMILASE DARI Saccharomycopsis fibuligera Yeni Mulyani Pr!ra" S#u$i Ki"ia %r!ani& A'(#ra& Tanaman jagung (Zea mays) merupakan salah satu jenis tanaman pangan biji-bijian dari keluarga rumput-rumputan. Jagung merupakan salah satu tanaman penghasil pati. Jagung yang sedang tumbuh (berkecambah) adalah penghasil -amilase yang paling banyak, karena jagung yang sedang tumbuh memerlukan enzim -amilase untuk mengubah polisakarida menjadi glukosa untuk pertumbuhannya. Enzim -amilase dalam biji jagung merupakan sumber enzim yang dapat dimanfaatkan untuk produksi bioetanol. ioetanol adalah etanol yang dihasilkan melalui proses fermentasi oleh Saccharomyces cerevisae. Etanol dapat digunakan sebagai bahan bakar kendaraan atau dengan mencampurnya dengan bensin, yang disebut gasohol. !elain diisolasi dari biji jagung, enzim -amilase juga dapat diisolasi dari sumber mikrobial. !alah satu sumber mikrobial adalah Saccharomycopsis fibuligera. -"milase yang berasal dari tumbuhan berbeda dengan - amilase dari mikroba. #alam penelitian ini ditentukan $aktu tumbuh biji jagung dengan akti%itas -amilase maksimum kemudian dibandingkan dengan -amilase dari S. fibuligera dengan menggunakan metode !omogyi-&elson dan 'u$a. (nit akti%itas enzim )-amilase yang berasal dari S. fibuligera adalah *,+,,. -+ -. /mol0menit dengan menggunakan metode !omogyi-&elson dan +,-111 mg0m2.menit dengan menggunakan metode 'u$a. "kti%itas enzim )-amilase maksimum yang berasal dari kecambah jagung diperoleh pada $aktu 3 jam ke-- (3 jam), yaitu sebesar 4,+5*. -+ -. /mol0menit dengan metode !omogyi-&elson dan +,6-6.1 mg0m2.menit dengan metode 'u$a. Ka#a &un)i * )-amilase, bioetanol, biji jagung, Saccharomycopsis fibuligera, 7etode !omogyi-&elson, 7etode 'u$a A'(#ra)# 8orn (Zea mays) is one of the 9raminae family $hich is producing starch. :ydrolysis of starch catalysed by )-amylase resulted in a break do$n of )--,.-glicosidic linkage to produce glucose and cellulose. 9erminated corn;s seed highly produce )-amylase enzyme due to the needs of starch breaking do$n to get glucose and cellulose for plant gro$th energy. )-"mylase enzyme from germinated corn;s seed is in%ol%e in the production of bioethanol. ioethanol is produced from fermentation process by Saccharomyces cerevisae. This ethanol can be blended $ith con%entional fuel (gasoline) and used as a %ehicle fuel. )-"mylase can be isolated from microbial sources. <ne of them is Saccharomycopsis fibuligera. )-"mylase from plant is different from fungal )-amylase. =n this research, ma>imum )-amylase acti%ity from germinated corn;s seed $ith %arious har%est;s time determined and then compared $ith fungal )-amylase by !omogyi-&elson;s and 'u$a;s method. "cti%ity unit of S. fibuligera )-amylase is *,+,,. -+ -. /mol0minute measured by !omogyi-&elson;s method and +,-111 mg0m2.minute measured by 'u$a;s method. 7a>imum )-amylase acti%ity is reached out by germinated corn;s seed $ith si> hours of har%est;s time. The acti%ity unit is 4,+5*. -+ -. /mol0minute measured by !omogyi- &elson;s method and +,6-6.1 mg0m2.minute by 'u$a;s method. ?ey$ords @ )-amylase, bioethanol, corn;s seed0corn kernel, Saccharomycopsis fibuligera, !omogyi-&elson;s method, 'u$a;s method. + Pen$a,uluan ?ontinuitas penggunaan bahan bakar fosil memunculkan paling sedikit dua ancaman serius, yaitu@ (-) 'aktor ekonomi, berupa jaminan ketersediaan bahan bakar fosil untuk beberapa dekade mendatang, dan (6) Aolusi akibat emisi pembakaran bahan bakar fosil ke lingkungan. Aolusi yang ditimbulkan oleh pembakaran bahan bakar fosil memiliki dampak langsung maupun tidak langsung terhadap kesehatan manusia. Aolusi langsung bisa berupa gas-gas berbahaya, seperti 8<, dan &< > , juga unsur metalik seperti timbal (Ab). !edangkan polusi tidak langsung berupa ledakan jumlah molekul 8< 6 yang berdampak pada pemanasan global. ?esadaran terhadap ancaman serius tersebut telah mengintensifkan berbagai riset yang bertujuan menghasilkan sumber-sumber energi yang lebih terjamin keberlanjutannya dan lebih ramah lingkungan. eberapa sumber energi alternatif di antaranya adalah bioetanol, biodiesel, tenaga panas bumi, tenaga surya, mikrohidro, dan tenaga angin. Aenggunaan alkohol sebagai bahan bakar mulai diteliti dan diimplementasikan di "merika !erikat dan razil sejak terjadinya krisis bahan bakar fosil di kedua negara tersebut pada tahun -15+- an. Aemerintah =ndonesia, dalam hal ini ?ementerian &egara Biset dan Teknologi telah mentargetkan pembuatan minimal satu pabrik biodiesel dan bioetanol pada tahun 6++4-6++3. !elain itu, ditargetkan juga bah$a penggunaan bioenergi tersebut akan mencapai ,+C dari pasokan energi nasional pada tahun 6+64. (ntuk mencapai target tersebut perlu dilakukan penelitian yang mendalam tentang bioetanol. !ejauh ini, penelitian yang dilakukan adan Aengkajian dan Aenerapan Teknologi (AAT)-lah yang telah menunjukkan hasil. AAT telah berhasil meneliti penggunaan etanol sebagai campuran bahan bakar untuk berbagai kendaraan berbahan bakar bensin yang ada di =ndonesia. #alam penelitiannya, AAT melakukan uji coba campuran bahan bakar yang disebut E-+ yang merupakan campuran 1+C premium dan -+C etanol yang dihasilkan dari ubi kayu (singkong) yang banyak terdapat di =ndonesia. :asil AAT menunjukkan bah$a dengan penggunaan E-+ pada beberapa kendaraan, seperti 8he%rolet lazer, juga menunjukkan tingkat emisi gas buang yang lebih bersih. Etanol biasanya dihasilkan dari gula atau tanaman lain yang kaya akan pati, seperti ubi kayu, tebu, dan jagung. Aati termasuk ke dalam jenis polimer raksasa atau polisakarida yang tersusun atas monomer-monomer glukosa dengan ikatan glikosida. Aati jagung yang terhidrolisis akan menghasilkan maltosa atau glukosa sebagai produk akhir. Aroses hidrolisis pati secara enzimatis dapat dikatalisis oleh enzim -amilase yang berfungsi untuk memutuskan ikatan - -,.-glikosida sehingga polisakarida akan terpotong-potong menjadi polimer glukosa dengan rantai yang lebih pendek yang seringkali merupakan campuran dari maltosa dan glukosa. Jagung yang sedang tumbuh (berkecambah) adalah penghasil -amilase yang paling banyak. ?arena jagung yang sedang tumbuh memerlukan enzim -amilase untuk mengubah pati menjadi glukosa dan kemudian menjadi selulosa untuk pertumbuhannya. !elain diisolasi dari biji jagung, enzim -amilase juga dapat diisolasi dari sumber mikrobial. !alah satu sumber mikrobial adalah Saccharomycopsis fibuligera. Enzim -amilase dari tumbuhan berbeda dengan enzim - amilase dari mikroba. :al ini perlu dipelajari. - Me#$l!i Peneli#ian #alam penelitian ini, enzim - amilase diisolasi dari biji jagung yang sedang tumbuh (dengan %ariasi $aktu tumbuh) dengan menggunakan buffer pengekstraksi yaitu buffer asetat p: 4,. yang kemudian disentrifugasi dan diambil supernatannya. !upernatan ini adalah ekstrak kasar enzim -amilase dari biji jagung. =solasi enzim -amilase dari S. fibuligera dimulai dengan pengadaan kultur stok S. fibuligera dalam agar miring. ?emudian dilakukan produksi dalam kultur cair (broth). !elanjutnya S. fibuligera dalam kultur cair digoyang selama --+ jam pada suhu ,5 o 8, disaring dan diambil supernatannya. !upernatan ini adalah ekstrak kasar enzim -amilase. #alam penelitian ini ditentukan $aktu tumbuh biji jagung dengan akti%itas -amilase maksimum kemudian dibandingkan dengan -amilase dari S. fibuligera dengan menggunakan metode !omogyi-&elson dan 'u$a. 7etode !omogyi-&elson adalah metode untuk menguji akti%itas enzim - amilase dengan adanya gula pereduksi. "kti%itas enzim )-amilase ditentukan dengan mengukur nilai absorbansi sinar tampak pada panjang gelombang 33+ nm dengan menggunakan teknik spektrofotometri. :idrolisis pati oleh enzim )-amilase akan menghasilkan gula pereduksi. 9ula pereduksi ini direaksikan dengan 8u-alkalis sehingga menghasilkan endapan merah bata 8u 6 <. 8u 6 < ini direaksikan dengan arsenomolibdat dan menghasilkan $arna hijau kebiruan. 2arutan hijau kebiruan yang dihasilkan dapat mengabsorbsi sinar tampak pada panjang gelombang 33+ nm dengan serapan yang sebanding dengan konsentrasi molibdenum yang tereduksi. ?onsentrasi molibdenum yang tereduksi sebanding dengan konsentrasi 8u6<, sedangkan konsentrasi 8u 6 < sebanding dengan konsentrasi gula pereduksi. Aenentuan akti%itas enzim )-amilase dengan metode 'u$a adalah berdasarkan reaksi antara amilosa dengan iodin yang menghsilkan kompleks heliks dan memberikan $arna biru yang khas. . Ha(il $an Pe"'a,a(an ./+ En0i" -A"ila(e $ari S. fibuligera (ntuk memperoleh ekstrak enzim - amilase dari S. fibuligera diperlukan beberapa tahap. Tahap pertama dilakukan penyiapan media pertumbuhan S. fibuligera, yaitu penyiapan ekstrak taoge, penyiapan agar miring, dan pembuatan medium cair untuk inokulum a$al dan media produksi. Tahap kedua adalah menumbuhkan S. fibuligera dalam agar miring. ?ultur S. fibuligera diperoleh dari laboratorium iokimia, Ausat ioteknologi, AA"( =T dalam bentuk agar miring. ?ultur ini kemudian diinokulasi lebih lanjut ke dalam stok agar miring yang mengandung ekstrak taoge, agar bakto -,4C, dan sukrosa 3C. Aekerjaan ini menggunakan peralatan yang telah disterilkan dalam autoklaf dan dilakukan di dekat nyala api bunsen agar tidak terjadi kontaminasi. ?emudian kultur stok ini disimpan pada suhu . o 8. Tahap ketiga adalah menumbuhkan S. fibuligera dalam media inokulum a$al. 7edia inokulum a$al adalah campuran ekstrak yeast -C dan pati sagu -C dalam 4++ m2 aDuades. Aenumbuhan S. fibuligera dalam media inokulum a$al perlu dilakukan untuk mengetahui apakah pada kondisi yang diterapkan telah sesuai untuk pertumbuhan maksimum S. fibuligera. ?ondisi yang diterapkan yaitu faktor nutrisi, dan suhu pada saat dilakukan inkubasi. "pabila ternyata S. fibuligera dapat tumbuh dengan baik pada media inokulum a$al, berarti bah$a kondisi yang diterapkan pada saat proses inkubasi telah sesuai dengan kebutuhan sel-sel S. fibuligera dan dapat segera dilakukan penumbuhan pada media produksi. (ntuk mengetahui apakah sel- sel S. fibuligera telah berkembang dengan baik dalam media inokulum a$al, dapat dilihat secara %isual, yaitu terlihatnya sekumpulan sel-sel yang ber$arna putih dan berubahnya media inokulum dari coklat jernih menjadi coklat keruh. Tahap keempat adalah tahap yang terpenting, yaitu menumbuhkan S. fibuligera dalam media produksi. !etelah diketahui kondisi optimum untuk pertumbuhan S. fibuligera, maka dapat kondisi tersebut dapat kita terapkan untuk tahap produksi enzim -amilase. Enzim -amilase dari S. fibuligera adalah enzim ekstraseluler, artinya enzim tersebut dikeluarkan dari dalam sel. #i dalam media produksi, selain terdapat sel-sel S. fibuligera, juga terdapat ekstrak enzim - amilase. (ntuk memisahkan ekstrak enzim -amilase dari sel-sel S. fibuligera, dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring dan corong pisah. !upernatannya adalah ekstrak enzim -amilase dari S. fibuligera, yang selanjutnya disebut E" - . E" - yang diperoleh sebanyak 4++ m2 dan disimpan pada suhu . o 8. ./- En0i" -A"ila(e $ari Ke)a"'a, Ja!un! ./-/+ Penyia1an Ke)a"'a, Ja!un! Jagung yang digunakan pada penelitian ini adalah jagung manis (%arietas sweet corn). agian yang diteliti adalah bijinya, sedangkan bagian yang diambil adalah bagian endospermanya yang kaya akan pati. iji jagung yang kaya akan pati memerlukan akti%itas enzim amilase untuk pertumbuhannya. Aada penelitian ini, biji jagung dibiarkan tumbuh (berkecambah) dan diteliti akti%itas enzim amilasenya. (ntuk mengetahui $aktu tumbuh biji jagung yang menghasilkan akti%itas enzim yang maksimum, maka dilakukan penumbuhan biji jagung dengan %ariasi $aktu tumbuh. Eariasi $aktu tumbuh adalah setiap enam jam sekali, dengan pertimbangan kecepatan tumbuh biji jagung yang sangat cepat. !ehingga apabila dilakukan lebih dari enam jam maka pertumbuhan jagung tidak dapat diamati dengan baik. !ebelum ditumbuhkan, biji jagung terlebih dahulu direndam dalam aDuades. :al ini dimaksudkan untuk memacu agar biji jagung dapat tumbuh. !ebab biji jagung akan tumbuh apabila dalam keadaan lembab (cukup air). ?emudian disebarkan di atas kapas basah dalam ca$an petri. "kar dan daun akan tumbuh dalam beberapa hari. "kar mulai tumbuh setelah ,3 jam, sedangkan daun mulai tumbuh setelah 4. jam. Fat yang memungkinkan terjadinya pertumbuhan akar dan daun pada biji jagung adalah pati. Jaringan penyimpan endosperma dari berbagai biji mengandung banyak pati dan sebagian besar akan hilang selama pertumbuhan kecambah. iji jagung yang telah ditumbuhkan dengan berbagai %ariasi $aktu, kemudian dikupas, dan akar serta daunnya dipotong. !ehingga yang diperoleh adalah bagian endospermanya saja. ?emudian dipotong kecil-kecil, dipanaskan dalam o%en pada suhu .+ o 8 selama .* jam, dan digerus. :asil akhirnya berupa serbuk jagung. ./-/- E&(#ra&(i En0i" -A"ila(e $ari Ke)a"'a, Ja!un! !ebanyak , gram serbuk jagung (%ariasi $aktu tumbuh) dilarutkan dalam 6+ m2 buffer asetat p: 4,.. ?emudian dikocok selama ,+ menit pada suhu ,5 o 8 lalu disentrifuga pada kecepatan -+.+++ rpm selama 64 menit. #isaring dengan menggunakan kertas saring dan corong pisah, diambil filtratnya. :asilnya adalah ekstrak enzim )-amilase dari biji jagung yang sedang tumbuh yang selanjutnya disebut sebagai E" 6 masing-masing sebanyak -+ m2. E" 6 disimpan pada suhu . o 8. ./. U2i A&#i3i#a( En0i" -A"ila(e $en!an Me#$e S"!yi-Nel(n ././+ A&#i3i#a( EA + 9ula pereduksi adalah gula yang dapat dioksidasi oleh zat pengoksidasi lemah seperti reagen Tollens, reagen 'ehling, dan reagen enedict. "danya gula pereduksi ini digunakan sebagai salah satu metode untuk menentukan akti%itas enzim )-amilase, yaitu metode !omogyi-&elson. "kti%itas enzim )- amilase ditentukan dengan mengukur nilai absorbansi sinar tampak dengan menggunakan teknik spektrofotometri. :idrolisis pati oleh enzim )-amilase akan menghasilkan gula pereduksi yang konsentrasinya sebanding dengan akti%itas enzim. erikut ini merupakan akti%itas E" - yang ditentukan dengan menggunakan metode !omogyi-&elson. Tabel ,.- "kti%itas E" - EA + Uni# A&#i3i#a( En0i" 4+5 -6 7"l8"n#9 fp + (tanpa pengenceran) *+,,, fp 4+ .,-+ fp -++ -,33 fp 64+ - ?et @ fp G faktor pengenceran 'aktor pengenceran sama dengan nol maksudnya adalah ekstrak enzim tanpa dilakukan pengenceran, sedangkan faktor pengenceran 4+ maksudnya adalah ekstrak enzim diencerkan 4+ kali. Aengenceran ekstrak enzim perlu dilakukan untuk mengetahui apakah enzim masih memiliki akti%itas apabila diencerkan sampai batas tertentu. Ternyata apabila dilakukan pengenceran ekstrak enzim sampai 64+ kali, E" - sudah tidak memiliki akti%itas lagi. ././- A&#i3i#a( EA - Enzim )-amilase pada biji jagung memiliki akti%itas yang minimal. Tetapi akti%itas enzim tersebut akan bertambah dengan cepat selama proses pengecambahan dan akhirnya akti%itasnya akan berkurang seiring dengan habisnya pati di dalam biji. #engan menggunakan metode !omogyi-&elson, akti%itas E" 6 pada berbagai %ariasi $aktu tumbuh adalah sebagai berikut. Tabel ,.6 "kti%itas E" 6 :a&#u Tu"'u, 4; 2a" &e-9 Uni# A&#i3i#a( En0i" 4+5 -< 7"l8"n#9 + 6,313 - 4,+33 6 .,+31 , ,,*5 . ,,651 4 , 3 ,,.5. 5 ,,-6 * ,,+-6 1 ,,6 -+ ,,6-6 -- 6,*,3 -6 6,*5, "kti%itas enzim )-amilase yang maksimum terdapat pada biji jagung yang telah ditumbuhkan selama enam jam seperti terlihat pada kur%a di ba$ah ini. 9ambar ,.- ?ur%a (nit "kti%itas Enzim )-"milase terhadap Haktu Tumbuh ./< U2i A&#i3i#a( En0i" -A"ila(e $en!an Me#$e =u>a ./</+ Penen#uan Ka$ar Pa#i Si(a $ala" Bi2i Ja!un! Aada berbagai tanaman, termasuk tanaman jagung, karbohidrat utama yang disimpan adalah pati. Aati terbentuk dari proses fotosintesis dan berfungsi sebagai bahan makanan. erbagai tanaman rerumputan0herba dan tumbuhan dikotil menyimpan pati di akar, pangkal batang, dan di umbi lapis atau umbi ba$ah tanah. Jaringan penyimpan endosperma dari berbagai biji mengandung banyak pati dan sebagian besar akan hilang selama pertumbuhan kecambah. Aenentuan kadar pati sisa dalam biji jagung dilakukan dengan menggunakan metode 'u$a, dimana akan dihasilkan kompleks heliks yang ber$arna biru antara amilosa dan reagen iodin. erikut ini adalah kadar pati sisa dalam biji jagung. Tabel ,., ?adar Aati !isa dalam iji Jagung :a&#u Tu"'u, 4; 2a" &e-9 Ka$ar Pa#i $ala" Bi2i Ja!un! 4"!8"L9 + +,-6*+ - +,++,- 6 +,+66+ , +,+-5, . +,+-13 4 +,+-5, 3 +,+-13 :a&#u Tu"'u, 4; 2a" &e-9 Ka$ar Pa#i $ala" Bi2i Ja!un! 4"!8"L9 5 +,+.*+ * +,+.43 1 +,+,36 -+ +,+61- -- +,+-64 -6 +,++5*
9ambar ,.6 ?ur%a ?adar Aati !isa dalam iji Jagung ./</- A&#i3i#a( EA -
?adar pati sisa dalam biji jagung merupakan pati yang tidak terhidrolisis oleh enzim )-amilase. !edangkan pati yang terhidrolisis oleh enzim )-amilase adalah pati a$al dikurangi oleh pati sisa. !edangkan pati a$al adalah pati yang ditambahkan dari luar dan pati dalam biji jagung sendiri pada jam ke-+ (pati yang belum ditumbuhkan). anyaknya pati yang berhasil dihidrolisis oleh enzim )-amilase selama satu menit sebanding dengan akti%itas enzim )-amilase. Jadi, akti%itas enzim )- amilase didefinisikan sebagai jumlah enzim )-amilase yang diperlukan untuk menghidrolisis sejumlah pati dalam $aktu satu menit. erikut ini merupakan akti%itas enzim )-amilase dengan menggunkan metode 'u$a. Tabel ,.. "kti%itas E" 6
:a&#u Tu"'u, 4; 2a" &e-9 Uni# A&#i3i#a( En0i" -A"ila(e 4"!8"L/"n#9 + +,6 - +,6-64 6 +,6-+3 , +,6--- . +,6-+* 4 +,6--- 3 +,6-+* 5 +,6+* * +,6+*6 1 +,6+16 -+ +,6+11 -- +,6--3 -6 +,6-6 9ambar ,., ?ur%a (nit "kti%itas Enzim )-"milase ./</. A&#i3i#a( EA + "kti%itas E" - dengan menggunakan metode 'u$a adalah sebesar +,-111 mg0m2.menit. < Ke(i"1ulan #engan menggunakan metode !omogyi-&elson, unit akti%itas enzim )- amilase yang berasal dari S. fibuligera (E" - ) adalah sebesar *,+,,. -+ -. Imol0menit. "rtinya enzim )-amilase dari S. fibuligera dapat menghasilkan glukosa sebanyak *,+,,. -+ -. Imol per menit. !edangkan unit akti%itas enzim )- amilase yang berasal dari kecambah jagung (E" 6 ) diperoleh pada $aktu 3 jam ke-- yaitu sebesar 4,+5*. -+ -. Imol0menit. #engan menggunakan metode !omogyi-&elson, unit akti%itas enzim )- amilase yang berasal dari S. fibuligera lebih besar dari enzim )-amilase yang berasal dari kecambah jagung. #engan menggunakan metode 'u$a, unit akti%itas enzim )-amilase yang berasal dari kecambah jagung adalah pada $aktu 3 jam ke-- (-6 jam) yaitu sebesar +,6-6.1 mg0m2.menit. !edangkan unit akti%itas enzim )-amilase dari S. fibuligera adalah sebesar +,-111 mg0m2.menit. Enzim )-amilase yang berasal dari kecambah jagung memiliki unit akti%itas yang lebih besar daripada enzim )- amilase yang berasal dari S. fibuligera apabila digunakan metode 'u$a. "danya perbedaan hasil dari kedua metode tersebut antara lain disebabkan oleh perbedaan deteksi pada produk akhir. Aada metode !omogyi-&elson, produk akhir yang dideteksi adalah gula pereduksi, sedangkan pada metode 'u$a, produk akhir yang dideteksi adalah pati sisa. S. fibuligera selain memiliki enzim )-amilase juga memiliki enzim glukoamilase. Enzim glukoamilase ini mampu menghidrolisis pati menjadi glukosa. !edangkan kecambah jagung tidak memiliki enzim glukoamilase. < Da?#ar Pu(#a&a -. http@00io.ppi-jepang.org 6. 7etzler, #.E., (6++-), Biochemistry: The Chemical Reactions of Living Cells, %olume -, 6 nd edition, "cademic Aress, &e$ Jork. ,. !alisbury, '.., Boss, 8.H., (-114), isiologi Tumbuhan, Jilid 6, penerjemah@ #iah B. 2ukman, Aenerbit =T, andung. .. 2in, 2., 8hyau, 8., :su, H., (-11*), Aroduction and properties of ra$-starch-degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. T!-6,, Biotechnol. !ppl. Biochem, -@, 3--3*. 4. 'u$a, :., (-14.), " ne$ method formicrodetermination of amylase acti%ity by the use of amylase as the substrate. ". Biochem, <+, 4*,- 3+,. 3. !omogyi, 7., (-146), &otes on sugar determination, ". Biol. Chem, +A6, -1-6,.